JP2005539009A - 新規の効力のあるタキサンを含む細胞毒性物質、および、それらの治療用途 - Google Patents

Abstract

本発明の範囲は、結合基を含む効力のあるタキサンを含む。また、細胞結合性物質に結合した１以上のタキサンを含む細胞毒性物質も含む。選択された細胞集団において細胞死を誘導するための治療用組成物もまた含まれ、本組成物は、（Ａ）細胞毒性を起こす量の、細胞結合性物質に結合基を介して共有結合した１以上のタキサン、および、（Ｂ）製薬上許容できるキャリアー、希釈剤、または、賦形剤を含む。同様に、選択された細胞集団において細胞死を誘導する方法も含まれ、本方法は、標的細胞または標的細胞を含む組織と、有効量の、細胞結合性物質に結合した１以上のタキサンを含む細胞毒性物質とを接触させることを含む。

Description

発明の詳細な説明

本願は、２００２年８月２日付で出願された米国出願第１０／２１０，１１２号の一部継続出願であり、この参照により開示に含まれる。

発明の分野
本発明は、新規の細胞毒性物質およびそれらの治療用途に関する。より特定には、本発明は、新規のタキサン、新規のタキサンを含む新規の細胞毒性物質、および、それらの治療用途に関する。選択された細胞集団を標的とすることが可能な細胞結合性物質にタキサンを化学的に結合させることによって、タキサンを選択された細胞集団に標的化様式で送達するため、これら新規の細胞毒性物質は治療用途を有する。

発明の背景
細胞毒性物質の特異性は、細胞毒性物質を細胞結合性物質に結合させることによる標的化送達で大いに改善することができる。

多くの報告に、モノクローナル抗体−薬物結合体を用いた計画された腫瘍細胞の特異的標的化が記載されている（Ｓｅｌａ等の、Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ １８９〜２１６（Ｃ．Ｖｏｇｅｌ編集，１９８７年）；Ｇｈｏｓｅ等の、Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｒｕｇｓ １〜２２（Ｅ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇ編集，１９８３）；Ｄｉｅｎｅｒ等の、Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓ １〜２３（Ｊ．Ｒｏｄｗｅｌｌ編集，１９８８年）；Ｐｉｅｔｅｒｓｚ等の、Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒ ｓｙｓｔｅｍｓ ２５〜５３（Ｊ．Ｒｏｄｗｅｌｌ編集，１９８８年）；Ｂｕｍｏｌ等の、Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓ ５５〜７９（Ｊ．Ｒｏｄｗｅｌｌ編集，１９８８年））。本発明において引用される全ての参考文献および特許はこの参照により開示に含まれる。

細胞毒性薬物、例えばメトトレキセート、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メルファラン、マイトマイシンＣ、および、クロラムブシルを、多種多様なマウスのモノクローナル抗体に結合させている。いくつかの場合において、薬物分子は、血清アルブミンのような仲介的なキャリアー分子を介して抗体分子に結合させている（Ｇａｒｎｅｔｔ等，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４６：−２４１２（１９８６年）；Ｏｈｋａｗａ等，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２３：８６（１９８６年）；Ｅｎｄｏ等，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７：１０７６〜１０８０（１９８０年））、デキストラン（Ｈｕｒｗｉｔｚ等，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２：２５〜３５（１９８０年）；Ｍａｎａｂｉ等，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３４：２８９〜２９１（１９８５年）；Ｄｉｌｌｍａｎ等，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４６：４８８６〜４８９１（１９８６年）；Ｓｈｏｖａｌ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｉｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：８２７６〜８２８０（１９８８年））、または、ポリグルタミン酸（Ｔｓｕｋａｄａ等，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃ．Ｉｎｓｔ．７３：７２１〜７２９（１９８４年）；Ｋａｔｏ等，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２７：１６０２〜１６０７（１９８４年）；Ｔｓｕｋａｄａ等，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ５２：１１１〜１１６（１９８５年））。

このような免疫結合体の製造には多様なリンカー技術が用いられており、切断可能および切断不可能なリンカーの両方が研究されている。しかしながら、ほとんどの場合、標的部位が修飾されていない形態で薬物分子が結合体から放出され得る場合しか、十分な薬物の細胞毒性ポテンシャルが観察されていない。

抗体−薬物結合体の製造に用いられている切断可能なリンカーの一種は、シス−アコニット酸に基づく酸不安定性のリンカーであり、これは、受容体を介したエンドサイトーシスの際に遭遇するエンドソームやリソソームのような、様々な細胞内区画の酸性環境をうまく利用したものである。ＳｈｅｎおよびＲｙｓｅｒは、この方法を、ダウノルビシンと高分子キャリアーとの結合体の製造に導入している（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１０２：１０４８〜１０５４（１９８１年））。ＹａｎｇおよびＲｅｉｓｆｅｌｄは、同じ技術を、ダウノルビシンと抗−黒色腫抗体とを結合するのに用いている（Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃ．Ｉｎｓｔ．８０：１１５４〜１１５９（１９８８年））。Ｄｉｌｌｍａｎ等はまた、酸不安定性のリンカーを、類似の様式で、ダウノルビシンと抗−Ｔ細胞抗体との結合体を製造するのに用いている（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４８：６０９７〜６１０２（１９８８年））。

ペプチドスペーサーアームを介したダウノルビシンと抗体との結合に関する代替アプローチが、Ｔｒｏｕｅｔ等により研究されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７９：６２６〜６２９（１９８２年））。これは、遊離の薬物が、このような結合体から、リソソームペプチダーゼの作用によ放出され得るという前提下でなされている。しかしながら、インビトロでの細胞毒性試験によれば、抗体−薬物結合体は、遊離の結合していない薬物と同じ細胞毒性効力をまれにしか達成しないことを明らかにしている。これは、薬物分子が抗体から放出されるメカニズムは極めて非効率的であることを示唆している。

免疫毒素の分野において、モノクローナル抗体と触媒活性タンパク質毒素とのジスルフィド架橋により形成された結合体が、その他のリンカーを含む結合体より高い細胞毒性を有することが示されている。Ｌａｍｂｅｒｔ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：１２０３５〜１２０４１（１９８５年）；Ｌａｍｂｅｒｔ等の、Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ １７５〜２０９（Ａ．Ｆｒａｎｋｅｌ編集，１９８８年）；Ｇｈｅｔｉｅ等，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４８：２６１０〜２６１７（１９８８年）を参照。これは、抗体分子と毒素との間のジスルフィド結合の効率的な切断に役立つグルタチオンの細胞内濃度が高いためである。それにもかかわらず、薬物と高分子との結合の製造にジスルフィド架橋を使用した例はほんのわずかしか報告されていない。Ｓｈｅｎ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：１０９０５〜１０９０８（１９８５年）では、メトトレキセートのメルカプトエチルアミド誘導体への変換、それに続く、ジスルフィド結合を介したポリ−Ｄ−リシンとの結合が説明されている。その他の報告では、トリスルフィド含有毒性薬物カリケアマイシンと抗体との結合体の製造が説明されている（Ｈｉｎｍａｎ等，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：３３３６〜３３４２（１９９３年））。

ジスルフィド結合した抗体−薬物結合体が不足している一つの理由は、ジスルフィド架橋を介して薬物を抗体に結合させるのに容易に使用可能な硫黄原子含有成分を有する細胞毒性薬物が入手できないことである。その上、それらの細胞毒性ポテンシャルを減少させなければ、現存の薬物の化学修飾は困難である。

現存の抗体−薬物結合体が有するその他の主要な欠点は、それらが十分な濃度の薬物を標的部位に送達できないことであり、これは、標的抗原の数が限られており、メトトレキセート、ダウノルビシン、および、ビンクリスチンのような抗ガン性薬物の細胞毒性は比較的穏かであることによる。顕著な細胞毒性を達成するためには、抗体への直接的な、または、ポリマーキャリアー分子を介した多数の薬物分子の結合が必要となる。しかしながら、このような大いに修飾された抗体はしばしば、標的抗原への結合の障害、および、インビボでの血流からの速いクリアランスを示す。

上述の難点にもかかわらず、細胞結合成分を含む有用な細胞毒性物質、および、メイタンシノイドとして知られる細胞毒性薬物群が報告されている（米国特許第５，２０８，０２０号、米国特許第５，４１６，０６４号、および、Ｒ．Ｖ．Ｊ．Ｃｈａｒｉ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒ Ｒｅｖｉｅｗｓ ３１：８９〜１０４（１９９８年））。同様に、細胞結合成分を含む有用な細胞毒性物質、ならびに、効能のある抗腫瘍抗生物質ＣＣ−１０６５の類似体および誘導体も報告されている（米国特許第５，４７５，０９２号、および、米国特許第５，５８５，４９９号）。

また、ジスルフィド結合のような切断可能な結合を用いた高度に細胞毒性の薬物の抗体への結合により、十分な活性を有する薬物を細胞内で放出することを確実にし、このような結合体は、抗原特異的な方法で細胞毒性であることも示されている（Ｒ．Ｖ．Ｊ．Ｃｈａｒｉ等，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：１２７〜１３１（１９９２年）；米国特許第５，４７５，０９２号；および、米国特許第５，４１６，０６４号）。

タキサンは、細胞毒性天然産物のパクリタキセル（タキソールを含む）、および、半合成誘導体のドセタキセル（タキソテール）化合物ファミリーであり（図１および４を参照）、この２種の化合物は、ガン治療に広く用いられている（Ｅ．Ｂａｌｏｇｌｕ、および、Ｄ．Ｇ．Ｉ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．６２：１４４８〜１４７２（１９９９年））。タキサンは、チューブリンの脱重合を阻害し、細胞死を引き起こす紡錘体毒である。ドセタキセルおよびパクリタキセルはガン治療に有用な物質であるが、これらは正常な細胞に対して非特異的な毒性を有するため、その抗腫瘍活性は限定されている。さらに、パクリタキセルおよびドセタキセル様化合物は、それ自体、細胞結合性物質の結合体で用いるには効力が十分ではない。

近年、ドセタキセルまたはパクリタキセルのいずれかより大きい効力を有する新規のドセタキセル類似体がいくつか説明されている（Ｉ．Ｏｊｉｍａ等，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３９：３８８９〜３８９６（１９９６年））。しかしながら、これら化合物は、切断可能な結合を介した細胞結合性物質への結合を可能にする適切な官能性がない（図１）。

近年、高い細胞毒性を維持し、効果的に細胞結合性物質に結合させることが可能な新規のタキサンの合成が説明されている（米国特許第６，３４０，７０１号、米国特許第６，３７２，７３８号、および、米国特許第６，４３６，９３１号、ならびに、図２および４）。これらの開示において、タキサンは、化学成分で修飾されており、特に、適切な細胞結合性物質が結合可能なチオールまたはジスルフィド基を含む。その結果として、これら新規のタキサンは、既知のタキサンの細胞毒性効力を保持し、場合によっては高めることもある。

上述の特許で説明されたタキサンにおいて、その結合基は、タキサンのＣ−１０、Ｃ−７またはＣ−２’位に導入された。
結合基がＣ−７にある場合、Ｃ−１０位は、遊離のヒドロキシル置換基ではなく、むしろエステル、エーテルまたはカルバメート置換基を有する。Ｃ−１０にエステルまたはカルバメート置換基が存在すると、高い効力のタキソイドが生産されることがこれまでに示されている（Ｉ．Ｏｊｉｍａ等，Ｊ．Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．，３９：３８８９〜３８９６（１９９６年））。しかしながら、Ｃ−１０に遊離のヒドロキシル基、Ｃ−７に結合基を有するタキサンの効力に関する研究はなされていない。

本明細書中で説明するように、Ｃ−１０に遊離のヒドロキシル基、Ｃ−７に結合基を有するタキサンの効力は、Ｃ−１０にエステル、エーテルまたはカルバメート置換基、Ｃ−７に結合基を有するタキサンの効力と同等またはそれ以上であることがわかった。従って、第一の態様において、本発明は、このようなＣ−１０に遊離のヒドロキシル基、Ｃ−７に結合基を有し、効力のある細胞毒性活性を有する新規のタキサンを提供する。

さらに、上述の特許で説明されたタキサンにおいて、その結合基は、タキサンのＣ−１０、Ｃ−７またはＣ−２’位に導入されている。全てのタキサンにおいて、Ｃ−３’ＮおよびＣ−３’の置換基はそれぞれ、−ＮＨＣＯＲ_４およびＲ_３と名付けられている。その上、Ｃ−３’Ｎの置換基である−ＮＨＣＯＲ_４は、ベンズアミド基（Ｒ_４＝フェニル）（パクリタキセルに相当する）、または、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルアミノ成分（−ＮＨ−ｔ−ＢＯＣ，Ｒ_４＝ｔ−ブトキシ）（ドセタキセルに類似）のいずれかである。公開データに基づいて、これら置換基を改変することにより、効力の損失が起こることが推測される。Ｃ−３’（Ｒ_３）の置換基は、アリール、または、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖状、分岐状または環状アルキル基のいずれかである。公開データに基づいて、Ｃ−３’ＮおよびＣ−３’の置換基は、薬物活性を損なうことなく改変が可能であり、結合基は、常にタキサンの異なる位置、すなわちＣ−７、Ｃ−１０またはＣ−２’に導入されることが考えられる。また、Ｃ−３’またはＣ−３’Ｎの置換基を変化できないことは、合成可能なジスルフィド含有タキサンの多様性を大いに限定する。

第二の態様において、本発明はまた、Ｃ−３’およびＣ−３’Ｎの置換基はいずれも、既知のタキサンに存在する置換基に制限されることはない、という予想外の知見に基づいている。本明細書中で説明するように、多種多様な異なる置換基をＣ−３’Ｎに有するタキサンの効力は、この位置にベンズアミドまたは−ＮＨ−ｔ−ＢＯＣ置換基を有するタキサンの効力と同等またはそれ以上である。Ｃ−３’またはＣ−３’Ｎにおける新規の置換基はまた、細胞結合性物質への結合を可能にする結合基も含み得る。本発明は、これら新規の、高い効能を有する、Ｃ−３’およびＣ−３’Ｎに多種多様な異なる置換基を有するタキサンを開示する。ここで、前記結合基は、５つの位置：Ｃ−３’、Ｃ−３’Ｎ、Ｃ−１０、Ｃ−７、または、Ｃ−２’のいずれか一つに取り込ませることができる。

本発明の概要
本発明の一実施態様において、高い細胞毒性を有し、依然として多くの病気の治療に効果的に用いることができる新規のタキサンが開示される。

本発明の第二の実施態様において、Ｃ−１０位に遊離のヒドロキシル基、Ｃ−７に結合基を有し、それでも依然として高い効力を維持する新規のタキサンが開示される。
本発明の第三の実施態様において、Ｃ−３’ＮまたはＣ−３’に多種多様な異なる置換基、Ｃ−７、Ｃ−１０、Ｃ−２’またはＣ−３’ＮもしくはＣ−３’に結合基を有し、それでも依然として高い効力を維持する新規のタキサンが開示される。

本発明の第四の実施態様において、結合基を介して細胞結合性物質に共有結合した１以上の新規のタキサンを含む細胞毒性物質が開示される。
本発明の第五の実施態様において：
（ａ）細胞結合性物質に結合した治療上有効な量の１以上の新規のタキサン、および、
（ｂ）製薬上許容できるキャリアー、希釈剤、または、賦形剤、
を含む治療用組成物が開示される。

本発明の第六の実施態様において、標的細胞または標的細胞を含む組織と、細胞結合性物質に結合した１以上の新規のタキサンを含む細胞毒性物質の有効量とを接触させることを含む、選択された細胞集団において細胞死を誘導する方法が開示される。

図面の簡単な説明
図１は、様々なタキサンの構造を示す化学式であり、上記のＯｊｉｍａ等により説明されたより効能のあるタキサンのうちいくつかを示す。

図２は、本発明に係る、Ｃ−１０位に遊離のヒドロキシル基、Ｃ−７に結合基を有するジスルフィド含有タキサンのいくつかの構造を示す化学式である。
図３は、３種のタキサンの構造を示す。タキサン１は、Ｃ−１０にエステル基、Ｃ−７に結合基を有する。タキサン２’およびタキサン３’はいずれも、Ｃ−１０に遊離のヒドロキシ基、Ｃ−７に結合基を有する。

図４は、様々なタキサンの構造を示す化学式であり、米国特許第６，３４０，７０１号、米国特許第６，３７２，７３８号、および、米国特許第６，４３６，９３１号で説明されたより効力のあるタキサンのいくつかを示す。

図５は、以前に説明されていない、Ｒ_３および／またはＲ_４に置換基を有する本発明に係る新規のタキサンのいくつかの構造を示す化学式である。
図６は、以前に説明されていない、Ｒ_３および／またはＲ_４に置換基を有する本発明に係る新規のジスルフィド含有タキサンのいくつかの構造を示す化学式である。

図７は、タキサンを製造するための出発原料である１０-デアセチルバッカチンＩＩＩの構造を示す。
図８は、タキサン２’製造における合成工程を示す。

図９は、タキサン３’製造における合成工程を示す。
図１０は、タキサン１および２’のＡ４３１細胞に対するインビトロでの効力の比較を示す。

図１１は、Ａ５４９およびＭＣＦ−７細胞に対するタキサン３’のインビトロでの細胞毒性を示す。
図１２は、ＳＣＩＤマウスにおける、抗−ＥＧＦ受容体と抗体−タキサンとの結合体の、ヒト扁平上皮ガン（Ａ４３１）異種移植片に対する抗腫瘍作用を示す。

図１３は、実施例８で説明される実験で用いられたＳＣＩＤマウスの体重変化を示す。
図１４は、標的抗原陽性細胞系Ａ４３１に対する抗ＥＧＦ受容体−タキサン結合体の細胞毒性決定の結果と、標的抗原を発現しないＡ４３１細胞系に対するＮ９０１−タキサン結合体の細胞毒性決定の結果を示す。

図１５は、標的抗原陽性細胞系ＳＫ−ＢＲ−３、および、非標的抗原陰性細胞系Ａ４３１における、ＴＡ１−タキサン結合体の細胞毒性効力と選択性を示す。
図１６ａ、１６ｂおよび１６ｃは、本発明の第二の態様に係る新規のタキサンの製造における合成工程を示す。

図１７ａおよび１７ｂは、本発明の第二の態様に係る新規のジスルフィド含有タキサンの製造における合成工程を示す。
図１８は、本発明の第二の態様に係る新規のタキサンのインビトロでの細胞毒性を示す。

図１９ａおよび１９ｂは、本発明の第二の態様に係るジスルフィド含有タキサンのインビトロでの細胞毒性を示す。

発明の詳細な記述
本発明は、高い細胞毒性を保持し、細胞結合性物質に効果的に結合可能な新規のタキサンを説明する。これまでに、Ｃ−１０に保護されたヒドロキシル基を有するタキサンが高い効力を有することが示されている（米国特許第６，３４０，７０１号、米国特許第６，３７２，７３８号、および、米国特許第６，４３６，９３１号）。本発明の第一の態様は、Ｃ−１０位が保護されていなくても高い効力を達成することができるという予想外の発見に基づいている。Ｃ−１０に遊離のヒドロキシ基を有するタキサンは、それでも依然として、Ｃ−７に保護されたヒドロキシ基（例えば結合基）が存在する限り、高い効力を維持する。

本発明はさらに、Ｃ−１０に遊離のヒドロキシル基、Ｃ−７に結合基を有するタキサンの合成およびインビトロでの評価を説明する。
また、これまでに、Ｃ−３’Ｎ位にベンズアミドまたはｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルアミノ（−ＮＨ−ｔ−ＢＯＣ）置換基を、その他の置換基（アリールまたは直鎖状、分岐状もしくは環状アルキル基）と共に有するタキサンが、高い効力を有することが示されている。本発明の第二の態様は、Ｃ−３’Ｎの位置にベンズアミドまたは−ＮＨ−ｔ−ＢＯＣ基を有さなくても、高い効力を達成することができるという予想外の知見に基づいている。アルキル、アルケニルまたは複素環式側鎖を有する多数の様々なアミドまたはカルバメート置換基を、効力を少しも失うことなく用いることができる。結合基は、Ｃ−３’、Ｃ−３’Ｎの側鎖に、または、Ｃ−１０、Ｃ−７またはＣ−２’位に導入することができる。

タキサンを合成するための前駆体は、天然に存在する化合物１０−デアセチルバッカチンＩＩＩ（１０−ＤＡＢ）（図７）である。多種多様な結合基を有するタキサンを製造することができる。さらに、この化合物は、Ｃ−１０位に遊離のヒドロキシル基を有する。それゆえに、本発明の第一の態様に係る細胞毒性タキサンの製造に必要な合成工程数は、ヒドロキシル基をエステル、エーテルまたはカルバメートに変換させなくてもよいため減らすことができる。結合基を有するタキサンの収率を高めることもできる。

本発明はさらに、Ｃ−３’またはＣ−３’Ｎに新規の置換基を有する代表的なタキサン（Ｃ−７、Ｃ−１０、Ｃ−２’に、または、Ｃ−３’、Ｃ−３’Ｎに結合基を含む、または、含まない）の合成およびインビトロでの評価を説明する。

当業界において、現存の薬物を、それらの細胞毒性ポテンシャルを減少させることなく修飾することは極めて難しいということがわかっている。開示された発明は、開示されたタキサンを化学成分で修飾することによりこの問題を克服しており、例えば、適切な細胞結合性物質が結合可能なチオールまたはジスルフィド基含有タキサンである。その結果として、開示された新規のタキサンは、既知のタキサンの細胞毒性効力を保持し、場合によっては高めることもできる。細胞結合性物質−タキサン複合体は、標的化様式で適用され得るタキサンの最大限の細胞毒性作用を、不必要な細胞に対してのみに与え、それゆえに、非標的の健康な細胞に損傷を与えることによる副作用を回避する。本発明において、タキサンは、これまで不可能であった部位特異的な標的化が可能になる。従って、本発明は、殺すか、または溶解させるべき病気の細胞または異常な細胞、例えば腫瘍細胞（特に充実性腫瘍細胞）、ウイルス感染細胞、微生物感染細胞、寄生体感染細胞、自己免疫細胞（自己抗体を生産する細胞、または、自己抗体生産を調節する細胞）、活性化細胞（移植片拒絶反応または移植片対宿主疾患に関与する細胞）、または、その他のあらゆるタイプの病気の細胞または異常な細胞を除去し、一方で最小の副作用を示す有用な物質を提供する。

本発明に係る細胞毒性物質は、結合基を介して細胞結合性物質に結合した１以上のタキサンを含む。この結合基は、従来の方法によってタキサンに共有結合した化学成分の一部である。好ましい実施態様において、細胞結合性物質は、ジスルフィドまたはチオエーテル結合を介して、タキサンに共有結合していてもよい。

以下の実施態様（１）〜（９）の説明において、以下の通り適用する：
用語「アルキル」は、特に他の規定がない限り、直鎖状、分岐状または環状であることを意味する。

直鎖状アルキルの例としては、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、および、ヘキシルが挙げられる。
分岐状アルキルの例としては、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソペンチル、および、２−エチル−プロピルが挙げられる。

環状アルキルの例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、および、シクロヘキシルが挙げられる。
アルケニルおよびシクロアルケニルの例としては、イソブテニル、ヘキセニル、シクロペンテニル、およびシクロヘキセニルが挙げられる。

単純アリールの例としては、フェニル、および、ナフチルが挙げられる。
置換アリールの例としては、例えば、上述したような、アルキル基、ハロゲン（例えばＣｌ、ＢｒもしくはＦ）、ニトロ基、アミノ基、スルホン酸基、カルボン酸基、ヒドロキシ基、または、アルコキシ基で置換されたアリールが挙げられる。

複素環式は、ヘテロ原子がＯ、Ｎ、およびＳから選択される化合物であって、例えば、モルホリノ、ピペリジノ、ピペラジノ、Ｎ−メチルピペラジノ、ピロリル、ピリジル、フリル、イミダゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、チオフェンイル、インドリル、ベンゾフラニル、およびベンゾチオフェンイルが挙げられる。

カルバメートの例としては、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルおよびアリール成分（例えばメチル、エチル、クロトニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、およびフェニル）から形成されたもの、ならびに、窒素含有複素環（例えばモルホリノ、ピペリジノ、ピペラジノ、およびＮ−メチルピペラジノ）から形成されたものが挙げられる。

アリールエステル、エーテル、および、カルバメートの例としては、フェニル、および、ナフチル、エーテル、エステル、および、カルバメートが挙げられる。
直鎖状、分岐状または環状アルキルまたはアルケニルエステルの例としては、メチル、エチル、イソプロピル、アリル、クロトニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニルエステルが挙げられる。

直鎖状、分岐状または環状アルキルまたはアルケニルエーテルの例としては、メチル、エチル、イソプロピル、アリル、クロトニル、および、シクロヘキシルエーテルが挙げられる。

本発明において有用なタキサンは、下記の式（I）で示される：

これら新規のタキサンは、（１）〜（９）で示される９つの実施態様に分けることができる。実施態様（１）〜（４）の例を図２に示す。実施態様（５）〜（９）の例を図６に示す。

実施態様（１）〜（４）
実施態様（１）〜（４）において、Ｒ_１は、Ｈ、電子求引基、例えばＦ、ＮＯ_２、ＣＮ、Ｃｌ、ＣＨＦ_２およびＣＦ_３であるか、または、電子供与基、例えば−ＯＣＨ_３、−ＯＣＨ_２ＣＨ_３、−ＮＲ_７Ｒ_８および−ＯＲ_９である。Ｒ_１’およびＲ_１”は、同一または異なって、Ｈ、電子求引基、例えばＦ、ＮＯ_２、ＣＮ、Ｃｌ、ＣＨＦ_２、および、ＣＦ_３であるか、または、電子供与基、例えば−ＯＣＨ_３、−ＯＣＨ_２ＣＨ_３、−ＮＲ_７Ｒ_８および−ＯＲ_９である。

Ｒ_７およびＲ_８は、同一または異なって、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖状、分岐状または環状アルキル基、または、単純または置換アリールである。好ましくは、Ｒ_７およびＲ_８の炭素原子の数は、１〜４である。また、好ましくは、Ｒ_７およびＲ_８は同一である。好ましい−ＮＲ_７Ｒ_８基の例としては、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジ−イソプロピルアミノ、および、ジブチルアミノが挙げられ、ここでブチル成分は、第一ブチル、第二ブチル、第三ブチルまたはイソブチルのいずれかである。

Ｒ_９は、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖状、分岐状または環状アルキルである。Ｒ_１は、好ましくは−ＯＣＨ_３、Ｃｌ、Ｆ、ＮＯ_２、および、ＣＦ_３である。
より好ましくは、Ｒ_１は−ＯＣＨ_３であり、メタ位に存在し、Ｒ_１’およびＲ_１”の一方は−ＯＣＨ_３であり、他方はＨである。

実施態様（１）、（２）および（４）において、Ｒ_２はＨ、Ｃ−１０位において酸素原子と一緒になって複素環式エーテルもしくはアリールエーテル、複素環式エステルもしくはアリールエステル、複素環式カルバメートもしくはアリール、または、アルキル中に１〜１０個の炭素原子を有するアルキル、アルケニル中に２〜１０個の炭素原子を有する直鎖状、分岐状もしくは環状アルケニルエステル、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖状、分岐状もしくは環状アルケニルエーテル、式−ＯＣＯＸで示されるカルバメート（式中、Ｘは、窒素含有複素環であり、例えばピペリジノ、モルホリノ、ピペラジノおよびＮ−メチル−ピペラジノである）、または、式−ＯＣＯＮＲ_１０Ｒ_１１で示されるカルバメート（式中、Ｒ_１０およびＲ_１１は、同一または異なって、Ｈ、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖状、分岐状もしくは環状アルキル、または、単純アリールもしくは置換アリールである）である。

アリールエーテル、エステルおよびカルバメートの好ましい例としては、フェニルならびにナフチルエーテル、エステルおよびカルバメートが挙げられる。
アルキルおよびアルケニルエステルの好ましい例としては、−ＯＣＯＣＨ_３，−ＯＣＯＣＨ_２ＣＨ_３、クロトニル、および、ジメチルアクリロイルが挙げられる。アルキルおよびアルケニルエーテルの好ましい例としては、メチル、エチル、アリル、プロピル、プロペニル、および、イソブテニルエーテルが挙げられる。カルバメートの好ましい例としては、−ＯＣＯＮＨＣＨ_２ＣＨ_３、−ＯＣＯＮＨＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３、−ＯＣＯ−モルホリノ、−ＯＣＯ−ピペラジノ、−ＯＣＯ−ピペリジノ、−ＯＣＯ−Ｎ−メチルピペラジノが挙げられる。好ましくは、Ｒ_２はＨである。

実施態様（３）において、Ｒ_２は結合基である。
実施態様（１）、（３）および（４）において、Ｒ_３は、１〜１０個の炭素原子を有するアルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有するシクロアルキルもしくはシクロアルケニル、アリール、または、複素環式基である。

好ましくは、Ｒ_３は、プロペニル、イソブテニル、ヘキセニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、フリル、ピロリル、チオフェンイル、チアゾリル、イミダゾリル、ピリジル、モルホリノ、ピペリジノ、ピペラジノ、オキサゾリル、インドリル、ベンゾフラニル、または、ベンゾチオフェンイルである。

より好ましくは、Ｒ_３は、ｔ−ＢＯＣ、イソ−ブテニル、プロペニル、チオフェニル、チアゾリル、または、フリルである。
実施態様（２）において、Ｒ_３は、−ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ_３）_２である。

実施態様（１）〜（４）において、Ｒ_４は、１〜１０個の炭素原子を有するアルキルまたはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有するシクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、複素環、−ＯＣ（ＣＨ_３）_３、または、前記アルキル、アルケニル、シクロアルキルもしくはシクロアルケニルのいずれかから形成されたカルバメート、アリール、または、窒素含有複素環である。

好ましくは、Ｒ_４は、クロトニル、ジメチルアクリロイル、イソブテニル、ヘキセニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、フリル、ピロリル、チオフェンイル、チアゾリル、イミダゾリル、ピリジル、モルホリノ、ピペリジノ、ピペラジノ、オキサゾリル、インドリル、ベンゾフラニル、または、ベンゾチオフェンイルである。

より好ましくは、Ｒ_４は、ｔ−ＢＯＣ、イソ−ブテニル、クロトニル、ジメチルアクリロイル、チオフェニル、チアゾリル、または、フリルである。
実施態様（１）および（２）において、Ｒ_５は結合基であり、Ｒ_６は、上記の実施態様（１）、（２）および（４）に関するＲ_２と同じ定義を有する。

実施態様（３）において、Ｒ_５は、上記の実施態様（１）、（２）および（４）に関するＲ_２と同じ定義を有する。
実施態様（３）において、Ｒ_６は、上記の実施態様（１）、（２）および（４）に関するＲ_２と同じ定義を有する。

実施態様（４）において、Ｒ_６は結合基であり、Ｒ_５は、上記の実施態様（１）、（２）および（４）に関するＲ_２と同じ定義を有する。
適切な結合基は当業界周知であり、例えば、ジスルフィド結合、チオエーテル結合、酸不安定性結合、光不安定性結合、ペプチダーゼ不安定性結合、および、エステラーゼ不安定性結合を形成し得る結合基が挙げられる。好ましくは、ジスルフィド基、および、チオエーテル基である。

結合基がチオール−またはジスルフィド含有基である場合、チオールまたはジスルフィド基を有する側鎖は、直鎖状または分岐状、芳香族または複素環式が可能である。当業者であれば、容易に適切な側鎖を同定することができる。

チオール−またはジスルフィド含有置換基の特定の例としては、以下が挙げられる：
−（ＣＲ_１３Ｒ_１４）ｍ（ＣＲ_１５Ｒ_１６）_ｎ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｙＳＺ、−ＣＯ（ＣＲ_１３Ｒ_１４）_ｍ（ＣＲ_１５Ｒ_１６）_ｎ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｙＳＺ、−（ＣＲ_１３Ｒ_１４）_ｍ（ＣＲ_１７＝ＣＲ_１８）（ＣＲ_１５Ｒ_１６）_ｍ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｙＳＺ、−ＣＯ−（ＣＲ_１３Ｒ_１４）_ｍ（ＣＲ_１７＝ＣＲ_１８）（ＣＲ_１５Ｒ_１６）_ｍ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｙＳＺ、−ＣＯＮＲ_１２（ＣＲ_１３Ｒ_１４）_ｍ（ＣＲ_１５Ｒ_１６）_ｎ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｙＳＺ、フリル−ＸＳＺ、オキサゾリル−ＸＳＺ、チアゾリル−ＸＳＺ、チオフェンイル−ＸＳＺ、イミダゾリル−ＸＳＺ、モルホリノ−ＸＳＺ、−ピペラジノ−ＸＳＺ、ピペリジノ−ＸＳＺ、ＣＯ−フリル−ＸＳＺ、ＣＯ−チオフェンイル−ＸＳＺ、ＣＯ−チアゾリル−ＸＳＺ、および、−ＣＯ−Ｎ−メチルピペラジノ−ＸＳＺ、−ＣＯ−モルホリノ−ＸＳＺ、−ＣＯ−ピペラジノ−ＸＳＺ、−ＣＯ−ピペリジノ−ＸＳＺおよび−ＣＯ−Ｎ−メチルピペラジノ−ＸＳＺであり、式中：
Ｚは、ＨまたはＳＲであり、
Ｘは、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖状アルキルまたは分岐状アルキル、または、２〜２０個の繰り返しエチレンオキシ単位を有するポリエチレングリコールスペーサーであり；
ＲおよびＲ_１２は、同一または異なって、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖状アルキル、分岐状アルキルまたは環状アルキル、または、単純または置換アリール、または、複素環式であり、加えてＲ_１２は、Ｈも可能であり、
Ｒ_１３、Ｒ_１４、Ｒ_１５、および、Ｒ_１６は、同一または異なって、Ｈ、または、１〜４個の炭素原子を有する直鎖状または分岐状アルキルであり、
Ｒ_１７およびＲ_１８は、Ｈ、または、メチルであり、
ｎは、１〜１０の整数であり、
ｍは、１〜１０の整数であり、また、０でもよく、
ｙは、１〜２０の整数であり、また、０でもよい。

本発明の第一の態様の好ましいタキサンは、Ｃ−１０（すなわちＲ_２）に遊離のヒドロキシル基、Ｃ−７（すなわちＲ_５）に結合基を有するタキサンである。本発明の最も好ましいタキサンは、図３に示すタキサン２’および３’である。

実施態様（５）〜（９）
実施態様（５）〜（９）において、Ｒ_１は、Ｈ、電子求引基、例えばＦ、ＮＯ_２、ＣＮ、Ｃｌ、ＣＨＦ_２、および、ＣＦ_３、または、電子供与基、例えば−ＯＣＨ_３、−ＯＣＨ_２ＣＨ_３、−ＮＲ_７Ｒ_８および−ＯＲ_９であり、Ｒ_１’およびＲ_１”は、同一または異なって、Ｈ、電子求引基、例えばＦ、ＮＯ_２、ＣＮ、Ｃｌ、ＣＨＦ_２、および、ＣＦ_３、または、電子供与基、例えば−ＯＣＨ_３、−ＯＣＨ_２ＣＨ_３、−ＮＲ_７Ｒ_８および−ＯＲ_９である。

Ｒ_７およびＲ_８は、同一または異なって、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖状、分岐状または環状アルキル基、または、単純または置換アリールである。好ましくは、Ｒ_７およびＲ_８の炭素原子の数は１〜４である。また、好ましくは、Ｒ_７およびＲ_８は同一である。好ましい−ＮＲ_７Ｒ_８基の例としては、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジプロピルアミノ、ジ−イソプロピルアミノ、および、ジブチルアミノが挙げられ、ここで、ブチル成分は、第一ブチル、第二ブチル、第三ブチルおよびイソブチルのいずれかである。

Ｒ_９は、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖状、分岐状または環状アルキルである。
好ましくは、Ｒ_１は、−ＯＣＨ_３、Ｃｌ、Ｆ、ＮＯ_２、および、ＣＦ_３である。
より好ましくは、Ｒ_１は、−ＯＣＨ_３であり、メタ位に存在し、Ｒ_１’およびＲ_１”の一方は−ＯＣＨ_３であり、他方はＨである。

実施態様（５）、（６）および（７）において、Ｒ_３およびＲ_４は、同一または異なって、１〜１０個の炭素原子を有するアルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有するシクロアルキルもしくはシクロアルケニル、アリール、または、複素環式基であり、Ｒ_４はさらに、−ＯＣ（ＣＨ_３）_３、または、Ｃ−３’位の−ＣＯＮＨ−と一緒になって前記アルキル、アルケニル、シクロアルキルまたはシクロアルケニル、アリール、または、窒素含有複素環式基のいずれかおよび酸素原子から形成されるカルバメートである。

好ましくは、Ｒ_３およびＲ_４の一方または両方は、プロペニル、イソブテニル、ヘキセニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、フリル、ピロリル、チオフェンイル、チアゾリル、イミダゾリル、ピリジル、モルホリノ、ピペリジノ、ピペラジノ、オキサゾリル、インドリル、ベンゾフラニル、または、ベンゾチオフェンイルである。

より好ましくは、Ｒ_３およびＲ_４の一方または両方は、ｔ−ＢＯＣ、イソ−ブテニル、プロペニル、チオフェニル、チアゾリル、または、フリルである。
実施態様（８）および（９）において、Ｒ_２、Ｒ_５およびＲ_６は、同一または異なって、Ｈ、またはそれぞれＣ−１０、Ｃ−７およびＣ−２’位の酸素原子と一緒になって複素環式エーテルもしくはアリールエーテル、複素環式エステルもしくはアリールエステル、または、複素環式カルバメートもしくはアリールカルバメート、アルキル基中に１〜１０個の炭素原子を有する直鎖状、分岐状もしくは環状アルキルエステル、アルケニル中に２〜１０個の炭素原子を有する直鎖状、分岐状もしくは環状アルケニルエステル、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖状、分岐状もしくは環状アルキルエーテル、２〜１０個の炭素原子を有する直鎖状、分岐状もしくは環状アルケニルエーテル、または、式−ＯＣＯＸで示されるカルバメート（式中、Ｘは、窒素含有複素環式基であり、例えばピペリジノ、モルホリノ、ピペラジノおよびＮ−メチルピペラジノである）、または、式−ＯＣＯＮＲ_１０Ｒ_１１で示されるカルバメート（式中、Ｒ_１０およびＲ_１１は、同一または異なって、Ｈ、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖状、分岐状もしくは環状アルキル、または、単純アリールもしくは置換アリールである）である。

アリールエーテル、エステルおよびカルバメートの好ましい例としては、フェニルおよびナフチルエーテル、エステルおよびカルバメートが挙げられる。
アルキルおよびアルケニルエステルの好ましい例としては、−ＯＣＯＣＨ_３、−ＯＣＯＣＨ_２ＣＨ_３、クロトニル、および、ジメチルアクリロイルが挙げられる。アルキルおよびアルケニルエーテルの好ましい例としては、メチル、エチル、アリル、プロピル、プロペニルおよびイソブチルエーテルが挙げられる。カルバメートの好ましい例としては、−ＯＣＯＮＨＣＨ_２ＣＨ_３、−ＯＣＯ−モルホリノ、−ＯＣＯ−ピペラジノ、または−ＯＣＯ−Ｎ−メチルピペラジノが挙げられる。

好ましくは、Ｒ_６はＨであり、Ｒ_２およびＲ_５の１つはＨである。
実施態様（５）において、Ｒ_２は結合基であり、Ｒ_５およびＲ_６は、実施態様（８）および（９）と同じ定義を有する。

実施態様（６）において、Ｒ_５は結合基であり、Ｒ_２およびＲ_６は、実施態様（８）および（９）と同じ定義を有する。
実施態様（７）において、Ｒ_６は、結合基またはＨであり、Ｒ_２およびＲ_５は、実施態様（８）および（９）と同じ定義を有する。

実施態様（８）において、Ｒ_３は結合基であり、Ｒ_４は、実施態様（５）、（６）および（７）と同じ定義を有する。
実施態様（９）において、Ｒ_４は結合基であり、Ｒ_３は、実施態様（５）、（６）および（７）と同じ定義を有する。

適切な結合基は当業界周知であり、例えば、ジスルフィド結合、チオエーテル結合、酸不安定性結合、光不安定性結合、ペプチダーゼ不安定性結合およびエステラーゼ不安定性結合を形成し得る結合基が挙げられる。好ましくは、ジスルフィド結合およびチオエーテル結合を形成し得る結合基が挙げられる。結合基がチオール−またはジスルフィド含有基の場合、チオールまたはジスルフィド基を有する側鎖は、直鎖状または分岐状アルキル、アルケニル、シクロアルケニル、芳香族または複素環式、または、ポリエチレングリコールが可能である。当業者であれば、容易に適切な側鎖を同定することができる。

チオール−またはジスルフィド含有置換基の特定の例としては、以下が挙げられる：
−（ＣＲ_１３Ｒ_１４）_ｍ（ＣＲ_１５Ｒ_１６）_ｎ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｙＳＺ、−ＣＯ（ＣＲ_１３Ｒ_１４）_ｍ（ＣＲ_１５Ｒ_１６）_ｎ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｙＳＺ、−（ＣＲ_１３Ｒ_１４）_ｍ（ＣＲ_１７＝ＣＲ_１８）（ＣＲ_１５Ｒ_１６）_ｍ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｙＳＺ、−ＣＯ−（ＣＲ_１３Ｒ_１４）_ｍ（ＣＲ_１７＝ＣＲ_１８）（ＣＲ_１５Ｒ_１６）_ｍ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｙＳＺ、−ＣＯＮＲ_１２（ＣＲ_１３Ｒ_１４）_ｍ（ＣＲ_１５Ｒ_１６）_ｎ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｙＳＺ、フリル−ＸＳＺ、オキサゾリル−ＸＳＺ、チアゾリル−ＸＳＺ、チオフェンイル−ＸＳＺ、イミダゾリル−ＸＳＺ、モルホリノ−ＸＳＺ、−ピペラジノ−ＸＳＺ、ピペリジノ−ＸＳＺ、ＣＯ−フリル−ＸＳＺ、ＣＯ−チオフェンイル−ＸＳＺ、ＣＯ−チアゾリル−ＸＳＺ、および、−ＣＯ−Ｎ−メチルピペラジノ−ＸＳＺ、−ＣＯ−モルホリノ−ＸＳＺ、−ＣＯ−ピペラジノ−ＸＳＺ、−ＣＯ−ピペリジノ−ＸＳＺ、および−ＣＯ−Ｎ−メチルピペラジノ−ＸＳＺであり、
式中：
Ｚは、ＨまたはＳＲであり、
Ｘは、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖状アルキルまたは分岐状アルキル、または、２〜２０個の繰り返しエチレンオキシ単位を有するポリエチレングリコールスペーサーであり；
ＲおよびＲ_１２は、同一または異なって、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖状アルキル、分岐状アルキルまたは環状アルキル、または、単純または置換アリール、または、複素環式であり、加えてＲ_１２は、Ｈも可能であり、
Ｒ_１３、Ｒ_１４、Ｒ_１５、および、Ｒ_１６は、同一または異なって、Ｈ、または、１〜４個の炭素原子を有する直鎖状または分岐状アルキルであり、
Ｒ_１７およびＲ_１８は、Ｈ、または、メチルであり、
ｎは、１〜１０の整数であり、
ｍは、１〜１０の整数であり、また、０でもよく、
ｙは、１〜２０の整数であり、また、０でもよい。

本発明のタキサンは、既知の方法に従って合成することができる。合成の出発原料は、図７に示す市販の１０−デアセチルバッカチンＩＩＩである。様々な置換基を導入する化学的方法は、数種の出版物で説明されている（Ｏｊｉｍａ等，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９：３８８９〜３８９６（１９９６年），Ｏｊｉｍａ等，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４０：２６７〜２７８（１９９７年）；Ｉ．Ｏｊｉｍａ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９６：４２５６〜４２６１（１９９９年）；Ｉ．Ｏｊｉｍａ等の、米国特許第５，４７５，０１１号、および、米国特許第５，８１１，４５２号）。本発明の代表的なタキサンの製造は、以下の実施例で説明される。

フェニル環上の置換基Ｒ_１と、置換基Ｒ_１の位置は、望ましい毒性を有する化合物が得られるまで、変動できる。その上、フェニル環の置換度を様々に変えて、望ましい毒性を達成することができる。すなわち、フェニル環は、望ましい毒性を達成するためのその他の手段を提供する１以上の置換基を有し得る（例えば、フェニル環の一置換、二置換または三置換）。高い細胞毒性とは、インビトロで培養ガン細胞を７２時間薬物に晒して測定した場合、ＩＣ_５０が１×１０^−１２〜３×１０^−９Ｍの範囲である毒性を示すこと、と定義される。当業者であれば、日常的な実験のみを使用してＲ_１に適した化学成分とＲ_１の適切な位置を決定することができる。

例えば、メタ位の電子供与基は、細胞毒性効力を増加させること期待されるが、パラ位の置換は、親となるタキサンと比較して効力を増加させることは期待されない。典型的には、異なる位置（オルソ、メタおよびパラ）に置換基を有する代表的なタキサンを先ず少量製造し、インビトロでの細胞毒性を評価する。

図５および１６に記載の新規のタキソイドは、β−ラクタムシントン方法（Ｏｊｉｍａ，Ｉ．；Ｈａｂｕｓ，Ｉ．；Ｚｈａｏ，Ｍ．；Ｚｕｃｃｏ，Ｍ．；Ｐａｒｋ，Ｙ．Ｈ．；Ｓｕｎ，Ｃ．Ｍ．；Ｂｒｉｇａｕｄ，Ｔ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４８：６９８５（１９９２年）；Ｈｏｌｔｏｎ，Ｒ．Ａ．；Ｂｉｅｄｉｇｅｒ，Ｒ．Ｊ．；Ｂｏａｔｍａｎ，Ｐ．Ｄ．の、Ｔａｘｏｌ：Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ；Ｓｕｆｆｎｅｓｓ，Ｍ．，Ｅｄ．；ＣＲＣ：Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９５年，９７頁）で、出発原料として適切に誘導体化されたバッカチンＩＩＩ類似体（７）およびβ−ラクタムを用いて製造することができる。β−ラクタム４−６ｄ、１９−２５、および、３８−４４は、前述した方法で製造することができる（Ｂｒｉｅｖａ，Ｒ．Ｃｒｉｃｈ，Ｊ．Ｚ．；Ｓｉｈ，Ｃ．Ｊ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５８：１０６８（１９９３年）；Ｐａｌｏｍｏ，Ｃ．；Ａｒｒｉｅｔａ，Ａ．；Ｃｏｓｓｉｏ，Ｆ．；Ａｉｚｐｕｒｕａ，Ｊ．Ｍ．；Ｍｉｅｌｇｏ，Ａ．；Ａｕｒｒｅｋｏｅｔｘｅａ，Ｎ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９０年，３１．６４２９）。バッカチンＩＩＩ類似体（７）は、出発原料として市販の１０−デアセチルバッカチンＩＩＩ（１０−ＤＡＢ）（図７）を用いて製造することができる。

β−ラクタム６ａ−ｄ、２１−２５、および、４０−４４は、ＮａＨまたはＬｉＨＭＤＳの存在下でバッカチンＩＩＩ類似体（７）とカップリングさせ、保護されたタキソイド８−１１，２６−３０、および、４５−４９を得ることができる。最終的に、シリル保護基を、ＨＦ−ピリジンの存在下で脱保護し、望ましいタキサン１２−１５、３１−３５、および、５０−５４（図１６ａ、１６ｂおよび１６ｃ）を得ることができる。

本発明のジスルフィド含有タキソイド（図６および１７）は、前述した中間体（８−１１，２６−３０，４５−４９）から合成することができる。Ｃ−１０アセテートは、ヒドラジン一水和物を用いてうまく除去することができる。次に、Ｃ−１０位の再エステル化は、ＥＤＣ（１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル−３−エチルカルボジイミド塩酸塩］）の存在下で、必要なカルボン酸のジスルフィド誘導体を用いたカルボジイミドベースのカップリングプロトコールを用いて行うことができる。カップリングされた生成物をＨＦ−ピリジンで脱保護し、望ましいジスルフィド含有タキソイド（図１７ａおよび１７ｂ）を得ることができる。

ジスルフィドまたはチオール含有置換基はまた、ヒドロキシル基がすでに存在するその他の位置のうちの１ヶ所に導入することもできる。様々なヒドロキシル基を保護し、その間に望ましいヒドロキシ基を反応させる化学は、前で記載した（例えば、上掲で引用した参考文献を参照）。置換基は、遊離のヒドロキシル基を、ジスルフィド含有エーテル、ジスルフィド含有エステル、または、ジスルフィド含有カルバメートに単に変換することにより導入される。あるいは、ジスルフィドまたはチオール置換基と、誘導体化されているヒドロキシ基との間にポリエチレングリコールスペーサーを導入してもよい（例えば、２００２年５月１４日付で出願された米国出願第１０／１４４，０４２号を参照）。このトランスフォーメーションは、以下のように達成される。上掲のＩ．Ｏｊｉｍａ等に記載されているように、テトラヒドロフラン中で、−４０℃で、市販の試薬のリチウムヘキサメチルジシラザン（１．２当量）で処理することによって、望ましいヒドロキシル基を脱プロトン化する。次に、得られたアルコキシドアニオンを過量のジハロ化合物（例えばジブロモエタン）と反応させ、ハロエーテルを得る。ハロゲンのチオールでの置換（チオ酢酸カリウムとの反応、および、弱塩基(mild base)またはヒドロキシルアミンでの処理による）は、望ましいチオール含有タキサンを提供し得る。チオール基は、チオスルホン酸メチルメタンまたはジチオジピリジンとの反応により、それぞれメチルまたはピリジルジスルフィドに変換することができる。この方法は、米国特許第５，４１６，０６４号に記載されている。

望ましいヒドロキシル基はまた、３−ブロモプロピオニル塩化物のようなアシルハライドとの反応により直接エステル化し、ブロモエステルを得ることもできる。チオ酢酸カリウムでの処理によるブロモ基の置換と、上述のようなさらなる加工により、チオールまたはジスルフィド含有タキサンエステルが提供され得る。ジスルフィド含有カルバメートを製造するために、ヒドロキシル基をパラ−ニトロフェニルクロロホルメートのような商業的に入手できるクロロホルメートと反応させ、続いて、アミノアルキルジスルフィド（例えば、メチルジチオシステアミン）と反応させてもよい。

あるいは、チオールまたはジスルフィド置換基は、β−ラクタムサブユニットに取り込ませることもでき、次に、これを、適切に保護された１０−デアセチルバッカチンＩＩＩと反応させ、Ｃ−３’位にチオールまたはジスルフィド結合基を有する望ましいタキサンを得ることができる。

本発明の新規のタキサン、および、ジスルフィド含有タキサン薬物を、インビトロでヒト腫瘍細胞系の増殖を抑制するそれらの能力に関して評価することができる。ヒト腫瘍細胞系Ａ−５４９（ヒト肺ガン）、および、ＭＣＦ−７（ヒト乳房腫瘍）が、これら化合物の細胞毒性の判断に用いられる。細胞を化合物に７２時間晒し、生存する細胞フラクションを直接プレート効率分析で前述した通りに測定し（Ｇｏｌｄｍａｃｈｅｒ等，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０２：１３１２〜１３１９（１９８６年））、次に、ＩＣ_５０値をこのデータから計算する。

本発明に係るの第二の態様によるタキソイドおよびジスルフィド含有タキソイドのインビトロでの細胞毒性測定の結果を図１８および１９に示す。図１８は、本発明の１２種の新規のタキサンの細胞毒性決定の結果を示す。Ｒ_４にフェニル置換基を有するタキサン５２を除き、その他全ての新規のタキサンは、Ａ−５４９およびＭＣＦ−７細胞系両方に対して極めて高い効力を有していた（ＩＣ_５０値は１０^−１０〜１０^−１１Ｍの範囲）。タキサン５２の試験した両方の細胞系に対する細胞毒性は低かった（ＩＣ_５０値は３×１０^−９Ｍ）。同様に、本発明のジスルフィド含有タキソイドもまた、Ａ−５４９およびＭＣＦ−７細胞両方に対して極めて高い効力を有しており、急勾配の死滅曲線を示した（図１９）。

本発明の化合物の治療剤としての有効性は、適切な細胞結合性物質の慎重な選択に依存する。細胞結合性物質としては、これまで知られている、または、知られるようになるあらゆる種類のものが可能であり、例えば、ペプチドおよび非ペプチドが挙げられる。一般的に、これらは、抗体、またはそれらのフラグメント（特にモノクローナル抗体）、リンフォカイン、ホルモン、成長因子，ビタミン、栄養輸送分子（例えばトランスフェリン）、または、その他のあらゆる細胞結合分子または物質であり得る。

使用可能な細胞結合性物質のより特定の例としては、以下が挙げられる：
−抗体フラグメント、例えばｓＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、および、Ｆ（ａｂ’）_２（Ｐａｒｈａｍ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３１：２８９５〜２９０２（１９８３年）；Ｓｐｒｉｎｇ等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１３：４７０〜４７８（１９７４）；Ｎｉｓｏｎｏｆｆ等，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．８９：２３０〜２４４（１９６０年））；
−インターフェロン（例えばα、β、γ）；
−リンフォカイン、例えばＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６；
−ホルモン、例えばインスリン、ＴＲＨ（甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン），ＭＳＨ（メラニン細胞刺激ホルモン）、ステロイドホルモン、例えばアンドロゲンおよびエストロゲン；
−ビタミン、例えば葉酸；
−成長因子、および、コロニー刺激因子、例えばＥＧＰ、ＴＧＦ−α、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、および、ＧＭ−ＣＳＦ（Ｂｕｒｇｅｓｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ５：１５５〜１５８（１９８４年））；および、
−トランスフェリン（Ｏ’Ｋｅｅｆｅ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：９３２〜９３７（１９８５年））等である。

モノクローナル抗体技術により、特異的モノクローナル抗体またはそれらのフラグメントの態様の極めて特異的な細胞結合性物質の製造が可能である。特に、マウス、ラット、ハムスターまたはその他のあらゆる哺乳動物を、対象の抗原、例えば無傷標的細胞、無傷標的細胞から単離された抗原、ウイルス全体、弱毒化したウイルス全体、および、ウイルスコートタンパク質のようなウイルスタンパク質で免疫化することによって、モノクローナル抗体またはそれらのフラグメントを作製する技術が、当業界周知である。ヒト感作細胞を用いてもよい。モノクローナル抗体またはそれらのフラグメントを作製するその他の方法は、ｓＦｖ（単鎖可変領域）のファージライブラリー、特定にはヒトｓＦｖのファージライブラリーの使用である。（例えば、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ等、米国特許第５，８８５，７９３号；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ等，ＷＯ９２／０１０４７；Ｌｉｍｉｎｇ等，ＷＯ９９／０６５８７を参照）。

適切な細胞結合性物質の選択は、標的となり得る特定の細胞集団に応じた選択の問題であるが、一般的に、適切なモノクローナル抗体が入手できる場合は、モノクローナル抗体が好ましい。

例えば、モノクローナル抗体ＭＹ９は、ＣＤ３３抗原に特異的に結合するマウスＩｇＧ_１抗体であり（Ｊ．Ｄ．Ｇｒｉｆｆｉｎ等，Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｒｅｓ．，８：５２１（１９８４年））、この抗体は、例えば急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）において標的細胞がＣＤ３３を発現する場合に用いることができる。同様に、モノクローナル抗体の抗−Ｂ４は、Ｂ細胞上でＣＤ１９抗原に結合するマウスＩｇＧ_１であり（Ｎａｄｌｅｒ等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３１：２４４〜２５０（１９８３））、例えば非ホジキンリンパ腫または慢性リンパ芽球性リンパ腫において標的細胞がＢ細胞であるか、または、この抗原を発現する病気の細胞である場合に用いることができる。同様に、抗体Ｎ９０１は、小細胞肺ガン細胞や神経内分泌由来のその他の腫瘍細胞上で見出されるＣＤ５６に結合するマウスモノクローナルＩｇＧ_１抗体である（Ｒｏｙ等，Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８８：１１３６〜１１４５（１９９６年））。

固形腫瘍を標的とする抗体も有用であり、例えば以下が挙げられる：Ｃ２４２抗体、これは、膵臓および結腸直腸の腫瘍に存在するＭＵＣ１で見出される炭水化物抗原に結合する（米国特許第５，５５２，２９３号）；抗体Ｊ５９１，これは、前立腺ガン細胞におよび腫瘍の新生血管系の内皮細胞に発現されるＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）に結合する（米国特許第６，１０７，０９０号，Ｈｅ Ｌｉｕ等，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：３６２９〜３６３４（１９９７年）；および、ＨＥＲ−２に対する抗体、これは、特定の乳房腫瘍で過剰発現される。抗ＨＥＲ−２抗体の例は、ＴＡ１抗体（Ｌ．Ａ．Ｍａｉｅｒ等，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１：５３６１〜５３６９（１９９１年））、および、４Ｄ５抗体（米国特許第６，３８７，３７１号、および、第６，３９９，０６３号）である。

加えて、ＧＭ−ＣＳＦは、骨髄細胞に結合するものであるが、急性骨髄性白血病由来の病気の細胞に対する細胞結合性物質として用いることができる。ＩＬ−２は、活性化Ｔ細胞に結合するものであるが、移植片拒絶反応の予防、移植片対宿主疾患の治療および予防、および、急性Ｔ細胞性白血病の治療に用いることができる。ＭＳＨは、メラニン細胞に結合するものであるが、黒色腫の治療用いることができる。また葉酸は、卵巣ガンおよびその他のガンで発現される葉酸受容体を標的とするものであるが、適切な細胞結合性物質でもある。

乳房ガンおよび精巣ガンは、細胞結合性物質として、エストロゲン（または、エストロゲン類似体）またはアンドロゲン（またはアンドロゲン類似体）それぞれを用いてうまく標的化することができる。

本発明のタキサンと細胞結合性物質との結合体は、これまでに知られている、または、今後開発されるあらゆる技術を用いて形成することができる。多数の結合方法が、米国特許第５，４１６，０６４号、および、米国特許第５，４７５，０９２号で教示されている。遊離のアミノ基を得るようにタキサンエステルを修飾し、次に、抗体またはその他の細胞結合性物質に酸不安定性のリンカーまたは光不安定性のリンカーを介して結合させることができる。タキサンエステルをペプチドと縮合し、続いて細胞結合性物質に結合させ、ペプチダーゼ不安定性のリンカーを製造することもできる。タキサンエステル上のヒドロキシル基をサクシニル化し、細胞結合性物質に結合させ、細胞内エステラーゼにより切断されて遊離の薬物を解放することができる結合体を製造することもできる。最も好ましくは、タキサンエーテル、エステル、または、カルバメートを、遊離または保護チオール基を生成するように処理し、次に、ジスルフィド−またはチオール含有タキサンを、ジスルフィド結合を介して細胞結合性物質に結合させる。

本発明の代表的な結合体は、抗体−タキサン、抗体フラグメント−タキサン上皮成長因子（ＥＧＦ）−タキサン、メラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）−タキサン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）−タキサン、エストロゲン−タキサン、エストロゲン類似体−タキサン、アンドロゲン−タキサン、アンドロゲン類似体−タキサン、および、葉酸−タキサンである。

抗体、抗体フラグメント、タンパク質またはペプチドホルモン、タンパク質またはペプチド成長因子およびその他のタンパク質のタキサン結合体は、既知の方法による同じ方法で作製される。例えば、ペプチドと抗体は、架橋用試薬、例えばＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、４−スクシンイミジル−オキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジル ジチオ）−トルエン（ＳＭＰＴ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）ブチレート（ＳＤＰＢ）、２−イミノチオラン、または、Ｓ−アセチル無水コハク酸と、既知の方法により修飾することができる。Ｃａｒｌｓｓｏｎ等，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１７３：７２３〜７３７（１９７８）；Ｂｌａｔｔｌｅｒ等，Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４：１５１７〜１５２４（１９８５年）；Ｌａｍｂｅｒｔ等，Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２：３９１３〜３９２０（１９８３）；Ｋｌｏｔｚ等，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．９６：６０５（１９６２年）；および、Ｌｉｕ等，Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８：６９０（１９７９年），Ｂｌａｋｅｙ ａｎｄ Ｔｈｏｒｐｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ＆ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，１：１〜１６（１９８８年），Ｗｏｒｒｅｌｌ等，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ １：１７９〜１８４（１９８６年）を参照。次に、このようにして誘導された遊離または保護されたチオールを含む細胞結合性物質を、ジスルフィド−またはチオール含有タキサンと反応させ、結合体を生産することができる。このような結合体は、ＨＰＬＣまたはゲルろ過で精製することができる。

同様に、例えば、エストラジオールおよびアンドロスタンジオールのようなエストロゲンおよびアンドロゲン細胞結合性物質は、Ｃ−１７のヒドロキシ基で、適切なジスルフィド含有カルボン酸と、縮合剤として例えばジシクロヘキシルカルボジイミドを用いてエステル化することができる。使用可能なこのようなカルボン酸の例は、３−（２−ピリジルジチオ）プロパン酸、３−メチルジチオプロパン酸、４−（２−ピリジルジチオ）ペンタン酸、および、３−フェニルジチオプロパン酸である。Ｃ−１７のヒドロキシ基のエステル化はまた、適切に保護されたチオール基を含むカルボン酸の塩化物（例えば３−Ｓ−アセチルプロパノイル塩化物）と反応させることによって達成することもできる。その他のエステル化方法を、文献に記載されている通りに用いてもよい（Ｈａｓｌａｍ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３６：２４０９〜２４３３（１９８０年））。次に、保護された、または遊離のチオール含有アンドロゲンまたはエストロゲンは、ジスルフィド−またはチオール含有タキサンと反応させ、結合体を生産することができる。結合体は、シリカゲルでのカラムクロマトグラフィーまたはＨＰＬＣで精製することができる。葉酸を、縮合剤（例えばジシクロヘキシルカルボジイミド）の存在下で、適切なヒドラジド（例えば４−（２−ピリジルジチオ）ペンタン酸ヒドラジド）と縮合し、活性ジスルフィド含有ヒドラゾンを得ることができる。次に、ジスルフィド含有葉酸を、チオール含有タキサンと反応させ、結合体を生産することができ、このような結合体は、シリカゲルでのカラムクロマトグラフィーまたはＨＰＬＣで精製することができる。

好ましくは、モノクローナル抗体−または細胞結合性物質−タキサン結合体は、タキサン分子を送達可能な、上述のようにジスルフィド結合を介して結合した結合体である。このような細胞結合結合体は、既知の方法で製造され、例えば、モノクローナル抗体をスクシンイミジルピリジル−ジチオプロピオネート（ＳＰＤＰ）で修飾することによって製造される（Ｃａｒｌｓｓｏｎ等，Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｊ．１７３：７２３〜７３７（１９７８年））。次に、得られたチオピリジル基を、チオール含有タキサンを用いた処理で置換し、ジスルフィドが結合した結合体を生産することができる。あるいは、アリールジチオ−タキサンの場合、細胞結合結合体の形成は、タキサンのアリール−チオールを、予め抗体分子に導入されたスルフヒドリル基で直接置換することによって達成される。ジスルフィド架橋を介して結合した１〜１０個のタキサン薬物を含む結合体は、どちらかの方法によって容易に製造される。

より具体的には、１ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）中、１ｍｇ／ｍｌの濃度のジチオピリジルで修飾された抗体溶液を、チオール含有タキサン（１．２５モル当量／ジチオピリジル基）で処理する。修飾された抗体からのチオピリジンの放出を分光光度法により３４３ｎｍでモニターし、約２０時間で完了する。抗体−タキサン結合体は、精製し、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５カラムまたはセファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）Ｓ３００カラムを用いたゲルろ過して未反応の薬物およびその他の低分子量材料を除去する。抗体分子１つあたりに結合するタキサン成分の数は、２３０ｎｍでの吸光度と２７５ｎｍでの吸光度との割合を測定することにより決定することができる。平均１〜１０個のタキサン分子／抗体分子が、この方法によってジスルフィド結合を介して結合することができる。

また、切断不可能な結合を有する抗体−タキサン結合体を製造することもできる。このような抗体は、Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、スルホ−ＳＭＣＣ、Ｎ−スクシンイミジル４−マレイミドブチレート（ＳＭＢ）、スルホ−ＳＭＢ、Ｎ−スクシンイミジル６−マレイミドカプロエート（ＳＭＣ）、スルホ−ＳＭＣ、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、スルホ−ＭＢＳ、または、スクシンイミジル−ヨード酢酸のような架橋試薬で、文献に記載されているように修飾して、１〜１０個の反応性基を導入することができる。Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ等，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０１：３９５〜３９９（１９７９年）；Ｈａｓｈｉｄａ等，Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．６：５６〜６３（１９８４年）；および、Ｌｉｕ等，Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８：６９０〜６９７（１９７９年）を参照。次に、修飾された抗体をチオール含有タキサン誘導体と反応させ、結合体を生産することができる。このような結合体は、セファデックスＧ−２５カラムを用いたゲルろ過によりを通過させてで精製することができる。

修飾された抗体またはそれらのフラグメントは、チオール含有タキサン（１．２５モル当量／マレイミド基）で処理される。この混合物を、約４℃で一晩インキュベートした。抗体−タキサン結合体を、セファデックスＧ−２５カラムを用いたゲルろ過により精製する。典型的には、抗体１つあたり平均１〜１０個のタキサンが結合する。

好ましい方法は、抗体またはそれらのフラグメントを、スクシンイミジル−４−（マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）で修飾して、マレイミド基を導入し、続いて、修飾された抗体またはフラグメントとチオール含有タキサンとを反応させて、チオエーテルが結合した結合体を得ることである。再度、抗体分子１つあたりに１〜１０個の薬物分子を有する結合体が生じる。

抗体とこれらタキソイドとの結合体の、非接着細胞系に対する（例えばＮｅｍａｌｗａおよびＨＬ−６０）細胞毒性は、Ｇｏｌｄｍａｃｈｅｒ等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５：３６４８〜３６５１（１９８５年）に記載されているように、細胞増殖曲線を自動補正(back-extrapolation)することによって測定することができる。これら化合物の、接着細胞系（例えばＳＫＢＲ３およびＡ４３１）に対する細胞毒性は、Ｇｏｌｄｍａｃｈｅｒ等，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０２：１３１２〜１３１９（１９８６年）に記載されているようなクローン形成分析で決定することができる。

本発明は：
（ａ）有効量の、細胞結合性物質に結合した１以上のタキサン、および、
（ｂ）製薬上許容できるキャリアー、希釈剤、または、賦形剤
を含む治療用組成物も提供する。

同様に、本発明は、選択された細胞集団において細胞死を誘導する方法を提供し、本方法は、標的細胞または標的細胞を含む組織と、有効量の、細胞結合性物質に結合した１以上のタキサンを含む細胞毒性物質とを接触させることを含む。

この細胞毒性物質は、上述のように製造される。
適切な製薬上許容できるキャリアー、希釈剤、および、賦形剤は周知であり、当業者によって、臨床的な状況の根拠に基づき決定することができる。

適切なキャリアー、希釈剤および／または賦形剤の例としては：（１）ダルベッコリン酸緩衝塩類溶液（ｐＨ約７．４）、約１ｍｇ／ｍｌ〜２５ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミンを含む、または、含まない、（２）０．９％塩類溶液（０．９％ｗ／ｖのＮａＣｌ）、および、（３）５％（ｗ／ｖ）デキストロース挙げられ、トリプタミンのような抗酸化剤や、トウィーン（Ｔｗｅｅｎ）２０のような安定剤を含んでもよい。

選択された細胞集団において細胞死を誘導する方法は、インビトロ，インビボ、またはエクスビボで実施することができる。
インビトロでの使用例としては、自家骨髄を処理し、その後の同じ患者にそれらを移植することにより、病気の細胞または悪性細胞を殺すこと：骨髄を処理し、その後それらを移植することにより、コンピテントＴ細胞を殺して移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）を防ぐこと；細胞培養を処理することにより、標的抗原を発現しない望ましい変異体を除く全ての細胞を殺すこと；または、望ましくない抗原を発現する変異体を殺すこと、が挙げられる。

非臨床的なインビトロでの使用の条件は、当業者により容易に決定することができる。
臨床的なエクスビボでの使用の例は、ガン治療における自家移植もしくは自己免疫疾患における治療の前に、腫瘍細胞または骨髄由来のリンパ系細胞を除去すること、または、移植の前に、Ｔ細胞およびその他の自己由来のリンパ系細胞または同種骨髄もしくは組織を除去することによりＧＶＨＤを防ぐこと、である。治療は、以下のように行うことができる。骨髄を患者またはその他の個体から回収し、次に、本発明の細胞毒性物質を濃度約１０μＭ〜１ｐＭの範囲で添加した血清含有培地で、約３７℃で約３０分間〜約４８時間インキュベートする。インキュベーション濃度および時間の正確な条件、すなわち投与量は、当業者により容易に決定される。インキュベーションの後、骨髄細胞を血清含有培地で洗浄し、既知の方法に従って患者の静脈内に戻す。患者が、その他の治療（例えば骨髄回収時と、処理した細胞の自己輸血との間の外科的化学療法または全身照射の過程）を受けているような環境では、処理した骨髄細胞は、標準的な医療器具を用いて液体窒素中で凍結保存される。

臨床的なインビボでの使用に関しては、本発明の細胞毒性物質を、溶液または凍結乾燥粉末として供給し、その無菌と内毒素のレベルを試験することができる。結合体投与の適切なプロトコールの例は以下の通りである。結合体は、４週間の間、毎週１回、静脈内ボーラスとして投与される。ボーラス投与量は、５０〜１００ｍｌの通常の塩類溶液中に添加され、そこに５〜１０ｍｌのヒト血清アルブミンを加えてもよい。用量は、１回の静脈内投与あたり１０μｇ〜２０００ｍｇであり得る（１日あたり１００ｎｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲）。処理後４週間で、患者は、週単位で治療を受け続けることができる。投与経路、賦形剤、希釈剤、用量、時間などに関する特定の臨床的なプロトコールは、臨床的な状況の根拠に基づき、当業者により決定することができる。

インビボまたはエクスビボでの、選択された細胞集団において細胞死を誘導する方法に従って処理することができる医学的な状態の例としては、以下が挙げられる：あらゆるタイプの悪性病変、例えば、肺、乳房、結腸、前立腺、腎臓、膵臓、卵巣およびリンパ系臓器のガン；自己免疫疾患、例えば全身性ループス、リウマチ様関節炎、および、多発性硬化症；移植片拒絶反応、例えば、腎臓移植拒絶反応、肝臓移植拒絶反応、肺移植拒絶反応、心臓移植拒絶反応、および、骨髄移植拒絶反応；移植片対宿主疾患；ウイルス感染、例えばＣＭＶ感染、ＨＩＶ感染、ＡＤＤＳなど；および、寄生体感染、例えばランブル鞭毛虫症、アメーバ症，住血吸虫症およびその他の当業者により決定されたものがある。

実施例
以下、本発明を非限定的な実施例を参照して説明する。特に指定がない限り、全てのパーセント、割合、部などは、重量で示される。

実施例１
タキサン２’の製造
タキサン２’（３’−デフェニル−３’−（イソブテニル）−７−（メチルジスルホニル−プロパノイル）−ドセタキセル）を、市販の１０−デアセチルバッカチンＩＩＩ（図７）から、図８に示すスキームに従って製造した。

化合物４〜６’を、Ｇｒｅｅｎｅ等の、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：５９１７〜５９１９（１９８８年）、および、Ｏｊｉｍａ等，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９：３８８９〜３８９６（１９９６年）、および、本明細書に引用される参考文献に記載されているようにして製造した。

化合物７’（７−（トリエチルシリル）−２’−（トリイソプロピルシリルオキシ）−３’−デフェニル−３’−（イソブテニル）−ドセタキセル）を、室温で、ヒドラジン一水和物（１ｍＬ）を、６’（６５ｍｇ，０．０５９ｍｍｏｌ）のエタノール（２ｍＬ）溶液に加えることによりで製造した。この反応液を室温で撹拌し、ヘキサン中の４０％酢酸エチルを用いた薄層クロマトグラフィーでモニターした。１時間後、この反応を薄層クロマトグラフィーで完了させ、飽和塩化アンモニウム水溶液（１０ｍＬ）で急冷した。水層を酢酸エチル（１０ｍｌ×３）で抽出した。合わせた抽出物を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、真空中で濃縮した。残留物を、シリカゲルカラムで溶離液としてヘキサン中の４０％酢酸エチルを用いて精製し、生成物７’を白色固体として得た（４２ｍｇ，６９％）：

化合物８’（２’−（トリイソプロピルシリルオキシ）−３’−デフェニル−３’−（イソブテニル）−ドセタキセル）を以下の工程で製造した。化合物７’（３５ｍｇ，０．０２９ｍｍｏｌ）溶液を、０．１Ｎ ＨＣｌのエタノール（５ｍＬ）溶液を０℃で加えることにより作製した。この溶液をゆるやかに室温に温めながら撹拌し、１６時間撹拌を続けた。この反応液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１０ｍＬ）で急冷し、水層を酢酸エチル（１５ｍｌ×３）で抽出した。合わせた抽出物を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、真空中で濃縮した。残留物を、シリカゲルカラムで溶離液としてヘキサン中の５０％酢酸エチルを用いて精製し、生成物８’を白色固体として得た（２０ｍｇ，６４％）：

化合物９’（２’−（トリイソプロピルシリルオキシ）−３’−デフェニル−３’−（イソブテニル）−７−（メチルジスルファミル−プロパノイル）−ドセタキセル）を以下の工程で製造した。８’（２０ｍｇ，０．０２０ｍｍｏｌ）の塩化メチレン（３ｍＬ）溶液に、ＤＭＡＰ（３ｍｇ，０．０２ｍｍｏｌ）、ジチオ酸（３ｍｇ，０．０１８ｍｍｏｌ）、および、ＥＤＣ（８ｍｇ，０．０４２ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を一晩撹拌した。ヘキサン中の２５％酢酸エチルを用いた薄層クロマトグラフィー分析により、実質的に全ての出発原料が消費され、新しいスポットが生じたことが明らかになった。この反応液を飽和塩化アンモニウム水溶液（１０ｍＬ）で急冷し、塩化メチレン（１０ｍｌ×３）に抽出した。合わせた抽出物を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、真空中で濃縮した。残留物をシリカゲルカラムで溶離液としてヘキサン中の２５％酢酸エチルを用いて精製し、９’を白色固体として得た（９ｍｇ，４１％）：

タキサン２’（３’−デフェニル−３’−（イソブテニル）−７−（メチルジスルホニル−プロパノイル）−ドセタキセル）を以下の工程で製造した。９’（９ｍｇ，０．００８ｍｍｏｌ）のピリジン−アセトニトリル（１／１，２ｍＬ）溶液に、ＨＦ／ピリジン（７０：３０，０．１ｍＬ）を０℃加え、この混合物を室温に温めながら２４時間撹拌した。この反応液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で急冷した。次に、この反応混合物を酢酸エチル（５ｍｌ×２）で希釈した。合わせた有機層を水（５ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、真空中で濃縮した。残留物を、シリカゲルカラムで溶離液としてヘキサン中の６０％酢酸エチルを用いて精製し、最終生成物２’を白色固体として得た（５ｍｇ，６４％）：

実施例２
タキサン３’の製造
タキサン３’（３’−デフェニル−３’−（イソブテニル）−２−デベンゾイル−２−（２，５−ジメトキシベンゾイル）−７−（メチルジスルホニル−プロパノイル）−ドセタキセル）を、化合物１０’から図９に示すスキームに従って製造した。

化合物１０’（７−（トリエチルシリル）−２’−（トリイソプロピルシリルオキシ）−３’−デフェニル−３’−（イソブテニル）−２−デベンゾイル−２−（２，５−ジメトキシベンゾイル）−ドセタキセル）を以下の工程で製造した。９’（３６ｍｇ，０．０３１ｍｍｏｌ）のエタノール（１．５ｍＬ）溶液に、ヒドラジン一水和物（１ｍＬ）を室温で加えた。この反応液を室温で撹拌し、薄層クロマトグラフィーでヘキサン中の４０％酢酸エチルを用いて（２回展開させた）モニターした。１時間後、反応を薄層クロマトグラフィーで完了させ、飽和塩化アンモニウム水溶液（１０ｍＬ）で急冷した。水層を酢酸エチル（１０ｍｌ×３）で抽出した。合わせた抽出物を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、真空中で濃縮した。残留物を、シリカゲルカラムで溶離液としてヘキサン中の３５％酢酸エチルを用いて精製し、脱アセチル化した生成物１０’を白色固体としてを得た（１９ｍｇ，５７％）：

化合物１１’（２’−（トリイソプロピルシリルオキシ）−３’−デフェニル−３’−（イソブテニル）−２−デベンゾイル−２−（２，５−ジメトキシベンゾイル）−ドセタキセル）を以下の工程で製造した。５％塩酸エタノール（９．０ｍＬ）溶液を、１０’（８６．４ｍｇ，０．０７７４ｍｍｏｌ）に０℃で加えた。この混合物を、Ｎ_２下で室温に温めながら撹拌した。５時間後、この反応液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で急冷し、酢酸エチル（２５ｍｌ×２）に抽出した。次に、合わせた酢酸エチル層を水（２５ｍｌ×２）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、真空中で濃縮した。粗残留物を、シリカゲルカラムで溶離液としてヘキサン中の５０％酢酸エチルを用いて精製した。生成物１１’を白色固体として単離した（６１．５ｍｇ，７９％）：

化合物１２’（２’−（トリイソプロピルシリルオキシ）−３’−デフェニル−３’−（イソブテニル）−２−デベンゾイル−２−（２，５−ジメトキシベンゾイル）−７−（メチルジスルホニル−プロパノイル）−ドセタキセル）を以下の工程で製造した。１１’（２５ｍｇ，０．０２５ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（１０ｍｇ，０．０５ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（３ｍｇ，０．０２５ｍｍｏｌ）の塩化メチレン（０．８ｍＬ）の溶液に、メチルジチオジチオプロピオン酸（３．６ｍｇ，０．０２４ｍｍｏｌ）の塩化メチレン（４．０ｍＬ）溶液を加えた。この反応液を、Ｎ_２下で、室温で５時間撹拌した。この反応液を飽和塩化アンモニウム水溶液で急冷し、塩化メチレン（２５ｍｌ×２）に抽出した。合わせた有機層を水（１５ｍｌ×１）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、真空中で濃縮した。残留物を、シリカゲルカラムで溶離液としてヘキサン中の３０％酢酸エチルを用いて精製し、生成物１２’（２１．３ｍｇ，７５％）を得た：

タキサン３’（３’−デフェニル−３’−（イソブテニル）−２−デベンゾイル−２−（２，５−ジメトキシベンゾイル）−７−（メチルジスルホニル−プロパノイル）−ドセタキセル）を以下の工程で製造した。Ｎ_２下で、化合物１２’（２７．６ｍｇ，０．０２４３ｍｍｏｌ）をピリジン−アセトニトリル（１／１，２．０ｍＬ）に溶解させた。ＨＦ／ピリジン（７０：３０，０．２８ｍＬ）を０℃で加え、この反応液を室温に温めながら２４時間撹拌した。この反応液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で急冷し、酢酸エチル（３０ｍｌ×３）に抽出した。合わせた有機層をさらなる飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２５ｍｌ×１）で洗浄し、続いて飽和硫酸銅水溶液（２５ｍｌ×３）で洗浄した。合わせた有機層を水（２５ｍｌ×１）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、真空中で濃縮した。粗残留物を、シリカゲルカラムで溶離液としてヘキサン中の５０％酢酸エチルを用いて精製し、３’（１９．７ｍｇ，８２．８％）を得た：

実施例３
インビトロでの細胞毒性分析
本発明のスルフィド、ジスルフィドおよびスルフヒドリル含有タキサン薬物を、インビトロで様々なヒト腫瘍細胞系の増殖を抑制するそれらの能力に関して評価することができる。４種の接着細胞系、Ａ４３１（ヒト類表皮ガン）、ＳＫＢＲ３（ヒト乳房腫瘍）、Ａ５４９（ヒト肺ガン）、および、ＭＣＦ−７（ヒト乳房腫瘍）、ならびに、非接着細胞系、Ｎｅｍａｌｗａ（バーキットリンパ腫）がこれら化合物の細胞毒性の判断に用いられる。細胞を化合物に７２時間晒し、生存する細胞フラクションを直接的な分析で測定する。Ａ４３１、ＳＫＢＲ３、Ａ５４９、および、ＭＣＦ−７を、プレート効率に関して分析し（Ｇｏｌｄｍａｃｈｅｒ等，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０２：１３１２〜１３１９（１９８６年））、さらに、Ｎｅｍａｌｗａを分析は、成長を自動補正することによってなされる（Ｇｏｌｄｍａｃｈｅｒ等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５：３６４８〜３６５１（１９８５年）。次に、このデータからＩＣ_５０値を計算する。

タキサン２’および３’の細胞毒性を以下のように測定した。
Ａ４３１、Ａ５４９およびＭＣＦ−７細胞を、６−ウェル組織培養プレート中で、１０％ウシ胎仔血清が添加されたＤＭＥＭ培地中で、様々な密度でプレーティングした。タキサン２’を、様々な濃度で加え、３７℃、６％ＣＯ_２の加湿した雰囲気で約２０細胞またはそれ以上のコロニーが形成されるまで（６〜１０日間）細胞を維持した。コントロールプレートには、タキサンを加えなかった。次に、細胞をホルムアルデヒドで固定し、クリスタルバイオレットで染色し、低倍率顕微鏡下でカウントした。次に、プレート効率をコロニー数から決定し、生存細胞フラクションを、処理したサンプルのプレート効率と、コントロールのプレート効率との割合として計算した。

図１０は、細胞毒性決定の結果を示す。Ｃ−１０に遊離のヒドロキシ基、Ｃ−７に結合基を有するタキサン２’は、Ａ４３１細胞に対して高い効力を有する（ＩＣ_５０値は８×１０^−１０Ｍ）。それに対して、対応するＣ−１０にエステル基を有するタキサン１’（図３）は、３×１０^−９Ｍであっても、これら細胞に対して非毒性である。これらの結果は、タキサンのＣ−１０位は、保護されていなくても高い効力を維持することができることを示す。

同様に、タキサン３’の細胞毒性効力を確認した。Ａ５４９およびＭＣＦ−７細胞を、６−ウェル組織培養プレート中で、１０％ウシ胎仔血清が添加されたＤＭＥＭ培地中で、様々な密度でプレーティングした。タキサン２’を様々な濃度で加え、３７℃、６％ＣＯ_２の加湿した雰囲気で約２０細胞またはそれ以上のコロニーが形成されるまで（６〜１０日間）細胞を維持した。コントロールプレートには、タキサンを加えなかった。次に、細胞をホルムアルデヒドで固定し、クリスタルバイオレットで染色し、低倍率顕微鏡下でカウントした。次に、プレート効率をコロニー数から決定し、生存細胞フラクションを、処理したサンプルのプレート効率と、コントロールのプレート効率との割合として計算した。

図１１は、細胞毒性決定の結果を示す。Ｃ−１０に遊離のヒドロキシ基、Ｃ−７に結合基を有するタキサン３’は、試験された２種の腫瘍細胞系に対してより高い効力を示し、ＩＣ_５０値は、Ａ５４９およびＭＣＦ−７細胞それぞれに対して、１．８×１０^−１０Ｍ、および、６．３×１０^−１１Ｍである。これらの結果により、タキサンのＣ−１０位が保護されていなくても、高い効力を維持することができることが確認される。

実施例４
抗体への結合
チオール含有タキサンの抗体へのジスルフィド結合を介した結合
チオール含有タキサンの、抗体またはそれらのフラグメントへの、ジスルフィド結合を介した結合は、２段階で行われる。第一工程において、Ｃａｒｌｓｓｏｎ等で説明されたように、スクシンイミジルピリジルジチオペンタノエート（ＳＰＰ）を用いて、ジチオピリジル基が抗体または抗体フラグメントに導入される。次に、チオール含有タキサンとの反応によりチオピリジル基を置換し、結合体を生成する。

抗体−ＳＳ−タキサン結合体の製造
抗体抗−Ｂ４、抗−ＥＧＦ受容体、および、Ｎ９０１またはそれらのフラグメントを、文献に記載されているようにＳＰＤＰまたはＳＰＰで修飾する。抗体分子１個あたり平均１〜１０個のジチオピリジル基を導入する。

２５℃で、１ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）中、濃度１ｍｇ／ｍｌの、ジチオピリジルで修飾された抗体の溶液を、チオール含有タキサン（１．２５モル当量／ジチオピリジル基）で処理する。修飾された抗体またはそれらのフラグメントからのチオピリジンの放出を、３４３ｎｍでの分光光度法によりモニターし、約２０時間で完了することを見出す。抗体−タキサン結合体を精製し、未反応の薬物およびその他の低分子量材料をセファデックスＧ−２５カラムを用いたゲルろ過により除去する。抗体分子１個あたりに結合するタキサン分子の数を、２３０ｎｍの吸光度と２７５ｎｍの吸光度との比率を測定することにより決定する。この方法により、抗体分子１個あたり平均１〜１０個のタキサン分子を、ジスルフィド結合を介して結合させることができる。

チオール含有タキサンの、抗体への、切断不可能なチオエーテル結合を介した結合
チオール含有タキサンの結合は、２段階で行われる。まず、抗体またはそれらのフラグメントを、スクシンイミジルマレイミドメチルシクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）と反応させ、マレイミド基を導入する。次に、修飾された抗体をチオール含有タキサンと反応させ、チオエーテル結合を形成する。

抗体−タキサン結合体（切断不可能）の製造
抗体、抗−Ｂ４、抗−ＥＧＰ受容体、および、Ｎ９０１またはそれらのフラグメントを、文献で説明されたようにＳＭＣＣで修飾する。

修飾された抗体または抗体フラグメントを、チオール含有タキサン（１．２５モル当量／マレイミド基）で処理する。この混合物を、４℃で一晩インキュベートする。抗体−タキサン結合体を上述のように精製する。典型的には、抗体分子１個あたり平均１〜１０個のタキサン分子が結合する。

実施例５
抗体−タキサン結合体の特定の製造
ヒトＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）に対して作られたマウスのモノクローナル抗体を製造した。ＥＧＦ受容体は、数種のヒト扁平上皮細胞ガン（例えば、頭および首、肺および乳房のガン）において過剰発現されることがわかっている。４種の異なる抗体、ＫＳ−６１（ＩｇＧ２ａ）、ＫＳ−７７（ＩｇＧ１）、ＫＳ−７８（Ｉｇ２ａ）、および、ＫＳ−６２（ＩｇＧ２ａ）を、ジスルフィド結合を介してタキサンに結合させた。ヒト乳房および卵巣ガンで過剰発現されるｎｅｕガン遺伝子に対して作られたマウスのモノクローナル抗体ＴＡ１をＴＡ１−タキサン結合体の製造に用いた。これら特定の結合体の製造を以下で説明する。

抗−ＥＧＦＲ抗体ＫＳ−６１−タキサン結合体の製造
まず、抗−ＥＧＦＲ抗体ＫＳ−６１をＮ−スクシンイミジル−４−［２−ピリジルジチオ］ペンタノエート（ＳＰＰ）で修飾し、ジチオピリジル基を導入した。ＮａＣｌ（５０ｍＭ）およびＥＤＴＡ（２ｍＭ）を含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）中の抗体（２．３ｍｇ／ｍＬ）を、ＳＰＰ（１１モル当量，エタノール中）で処理した。最終エタノール濃度は、１．４％（ｖ／ｖ）であった。周囲温度で９０分間後、リシン（５０ｍＭ）を加え、全ての非共有結合で結合したＳＰＰの除去を促進した。反応を２時間進行させ、次に、上記緩衝液中で平衡化したセファデックスＧ２５カラムを用いたゲルろ過で精製した。抗体含有フラクションをプールし、サンプルをジチオスレイトールで処理し、３４３ｎｍでの吸光度変化を測定することにより修飾度を決定した（ピリジン−２−チオンの放出は、ε３４３＝８，０８０Ｍ^−１ｃｍ^−１）。抗体分子１個あたり５．０個のピリジルジチオ基が結合した抗体の回収率は約９０％であった。

修飾された抗体を、ＮａＣｌ（５０ｍＭ）およびＥＤＴＡ（２ｍＭ）を含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で希釈し、最終濃度を１．２８ｍｇ／ｍＬにした。次に、タキサン−ＳＨ（ジチオピリジル基あたり１．７当量）のエタノール溶液（最終反応混合物中、１０％ｖ／ｖ）を、修飾された抗体溶液に加えた。周囲温度で、アルゴン下で２４時間反応を進行させた。３４３ｎｍでの分光光度法で、抗体上のタキサン−ＳＨとジチオピリジル基との間のジスルフィド交換により生じたピリジン−２−チオンの放出に関して反応の進行をモニターした。３４３ｎｍでの吸光度の増加は、タキサンが抗体に結合したことを示した。次に、反応混合物を、２０％プロピレングリコールを含むリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ，ｐＨ６．５）平衡化したセファデックスＧ２５ＳＰゲルろ過カラムに添加した。主要なピークは、単量体ＫＳ−６１−タキサンを含んでいた。２８０ｎｍでの吸光度を測定することにより、結合体の濃度を決定した。この結合体を、トウィーン８０（０．０５％）と、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ，１ｍｇ／ｍＬ）と共に配合した。

抗−ＥＧＦＲ抗体ＫＳ−７７−タキサン結合体の製造
抗−ＥＧＦＲ抗体ＫＳ−７７を、Ｎ−スクシンイミジル４−［２−ピリジルジチオ］ペンタノエート（ＳＰＰ）で修飾し、ジチオピリジル基を導入した。抗体（５．０ｍｇ／ｍＬ）の５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）溶液を、ＳＰＰ（１１モル当量，エタノール中）で処理した。最終エタノール濃度は、２％（ｖ／ｖ）であった。周囲温度で９０分間後、リシン（５０ｍＭ）を加えて、全ての非共有結合で結合したＳＰＰの除去を促進した。反応混合物を２時間インキュベートし、次に、上記緩衝液中で平衡化したセファデックスＧ２５カラムを用いたゲルろ過で精製した。抗体を含むフラクションをプールし、サンプルをジチオスレイトールで処理し、３４３ｎｍでの吸光度変化を測定することにより修飾度を決定した（２−メルカプトピリジンの放出は、ε３４３＝８，０８０Ｍ^−１ｃｍ^−１）。抗体分子１個あたり４．２４個のピリジルジチオ基が結合した抗体の回収率は約９０％であった。

修飾された抗体を、ＮａＣｌ（５０ｍＭ）およびＥＤＴＡ（２ｍＭ）を含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で希釈し、最終濃度を１．４ｍｇ／ｍＬにした。次に、タキサン−ＳＨ（ジチオピリジル基あたり１．７当量）のエタノール溶液（最終反応混合物中、１０％ｖ／ｖ）を修飾された抗体溶液に加えた。周囲温度で、アルゴン下で２４時間反応を進行させた。３４３ｎｍでの吸光度の増加を記録したところ、ピリジン−２−チオンが放出され、タキサンが抗体に結合していることが示された。次に、反応混合物を、リン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ，ｐＨ６．５）で平衡化したセファクリルＳ３００ＨＲゲルろ過カラムに添加した。主要なピークは、単量体ＫＳ−７７−タキサンを含んでいた。２８０ｎｍでの吸光度を測定することにより、抗体ＫＳ−７７の濃度を決定した。この結合体を、トウィーン８０（０．０６％）と、ＨＳＡ（１ｍｇ／ｍＬ）と共に配合した。

抗−ＥＧＦＲ抗体ＫＳ−６２−タキサン結合体の製造
抗ＥＧＦ抗体−タキサン結合体（ＫＳ−６２−タキサン）を、上記の抗ＥＧＰＲ抗体ＫＳ−７７−タキサン結合体の製造に関して記載されているのと類似した方法で製造した。修飾した抗体を、ＮａＣｌ（５０ｍＭ）およびＥＤＴＡ（２ｍＭ）を含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で希釈し、最終濃度を２．５ｍｇ／ｍＬにした。抗体を、ＳＰＰで修飾し、抗体分子１個あたりに５．２５個のピリジルジチオ基を導入した。次に、タキサン−ＳＨ（１．７当量）のエタノール溶液（最終反応混合物中、１０％ｖ／ｖ）を、修飾された抗体溶液に加えた。周囲温度で、アルゴン下で２４時間反応を進行させた。この結合体を、リン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ，ｐＨ６．５）で平衡化したセファクリルＳ３００ＨＲゲルろ過カラムを通過させて精製した。主要なピークは、単量体ＫＳ−６２−タキサンを含んでいた。この結合体を、トウィーン８０（０．０１％，ｗ／ｖ）、および、ＨＳＡ（１ｍｇ／ｍＬ）を含むＰＢＳに配合した。

抗ＥＧＦＲ抗体ＫＳ−７８−タキサン結合体の製造
抗ＥＧＦＲ抗体−タキサン結合体、ＫＳ−７８−タキサンを、上記の抗ＥＧＰＲ抗体ＫＳ−７７−タキサン結合体の製造に関して記載されているのと類似した方法で製造した。修飾した抗体を、ＮａＣｌ（５０ｍＭ）およびＥＤＴＡ（２ｍＭ）を含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で希釈し、最終濃度を１．６ｍｇ／ｍＬにした。抗体をＳＰＰで修飾し、抗体分子１個あたり４．０個のピリジルジチオ基を導入した。次に、タキサン−ＳＨ（１．７当量）のエタノール溶液（最終反応混合物中、１５％ｖ／ｖ）を、修飾した抗体溶液に加えた。周囲温度で、アルゴン下で２４時間反応を進行させた。次に、この溶液を２つのバッチ（バッチＡおよびバッチＢ）に分け、これらを別々に処理した。バッチＡを、２ｍＭ ＣＨＡＰＳ（３−［（コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート）、および、２０％（ｖ／ｖ）プロピレングリコールを含むＰＢＳ（ｐＨ６．５）に対して透析した。最終溶液のｐＨは６．０であった。バッチＢを、２０％（ｖ／ｖ）プロピレングリコールを含むＰＢＳ（ｐＨ６．５）に透析した。透析の後、ＨＳＡ（１ｍｇ／ｍＬ）を、両方のバッチに加えた。バッチＢをさらに、トウィーン８０（０．０５％，ｗ／ｖ）で処理した。

ＴＡ１−タキサン結合体の製造
乳房および卵巣腫瘍で発現されたｎｅｕガン遺伝子に結合するマウスのモノクローナル抗体ＴＡ１を、タキサン結合体の製造に用いた。ＴＡ１（３．２ｍｇ／ｍＬ）の、ＮａＣｌ（５０ｍＭ）およびＥＤＴＡ（２ｍＭ）を含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）の溶液を、ＳＰＰ（８．０モル当量、エタノール中）で処理した。最終エタノール濃度は、５％（ｖ／ｖ）であった。周囲温度で９０分間後、リシン（５０ｍＭ）を加えて、全ての非共有結合で結合したＳＰＰの除去を促進した。反応混合物を２時間インキュベートし、次に、上記緩衝液中で平衡化したセファデックスＧ２５カラムを用いてゲルろ過した。抗体含有フラクションをプールし、サンプルをジチオスレイトールで処理し、３４３ｎｍでの吸光度変化を測定することにより修飾度を決定した（ピリジン−２−チオンの放出は、ε３４３＝８，０８０Ｍ^−１ｃｍ^−１）。抗体分子１個あたり４．９個のピリジルジチオ基が結合した抗体の回収率は約９０％であった。

修飾された抗体を、ＮａＣｌ（５０ｍＭ）およびＥＤＴＡ（２ｍＭ）を含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で希釈し、最終濃度を１．０ｍｇ／ｍＬにした。タキサン−ＳＨ（取り込まれたピリジルジチオ基あたり１．７当量）のエタノール溶液（最終反応混合物中、１０％ｖ／ｖ）を、次に、修飾された抗体溶液に加えた。周囲温度で、アルゴン下で２４時間反応を進行させた。ピリジン−２−チオンの放出（３４３ｎｍでモニターした）により、抗体上のタキサン−ＳＨとピリジルジチオ置換基とのジスルフィド交換が完了したことが示された。次に、反応混合物の一部（４．０ｍｇ）を、リン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ，ｐＨ６．５）で平衡化したセファクリルＳ３００ＨＲゲルろ過カラムに添加した。主要なピークは、単量体ＴＡ１−タキサンを含んでいた。残存した結合体を０．５ｍｇ／ｍＬに希釈し、ＮａＣｌ（５０ｍＭ）、ＥＤＴＡ（２ｍＭ）および２０％プロピレングリコールを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）に透析した。抗体ＴＡ１の濃度を、２８０ｎｍでの吸光度を測定することにより両方の種類で決定した。この結合体を、トウィーン８０（０．０１％）、および、ＨＳＡ（１ｍｇ／ｍＬ）を含むＰＢＳに配合した。

実施例６
タキサンと酸不安定性のリンカーとを結合させるその他の方法
タキサンは、ジシクロヘキシル−カルボジイミドとジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）の存在下で、化学文献に記載されている標準的な方法で、Ｎ−保護アミノ酸（例えばＮ−ｔｂｏｃ−１−アラニン）でエステル化することができる。ｔ−ｂｏｃ保護基のトリフルオロ酢酸での切断により、末端アミノ基含有タキサンエステルを得ることができる。このアミノ基含有タキサンは、前に記載した通り、抗体またはそれらのフラグメントおよびその他の細胞結合性物質へ、酸不安定性のリンカーを介して結合させることができる（Ｂｌaｔｔｌｅｒ等，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２４：１５１７〜１５２４（１９８５年）、米国特許第４，５４２，２２５号、第４，５６９，７８９号および第４，７６４，３６８号）。

光不安定性のリンカー
上述したアミノ基含有タキサン誘導体は、前に記載した通り、細胞結合性物質に、光不安定性のリンカーを介して結合させることができる。（Ｓｅｎｔｅｒ等，Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ，４２：２３１〜２３７（１９８５年）、米国特許第４，６２５，０１４号）。

ペプチダーゼ不安定性のリンカー
上述したアミノ基含有タキサンはまた、細胞結合性物質に、ペプチドスペーサーリンカーを介して結合させることもできる。これまでに、薬物と高分子タンパク質キャリアーとの間の短いペプチドスペーサーが血清中で安定であるが、細胞内リソソームペプチダーゼにより容易に加水分解されることが示されている（Ｔｒｏｕｅｔ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，７９：６２６〜６２９（１９８２年））。アミノ基含有タキサンは、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド−ＨＣｌのような縮合剤を用いて、Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＬｅｕまたはＡｌａ−Ｌｅｕの二量体のようなペプチドと縮合し、タキサンのペプチド誘導体を得ることができ、次に、これを細胞結合性物質に結合させることができる。

エステラーゼ不安定性のリンカー
タキサンは、ヒドロキシル基と無水コハク酸との反応でエステル化し、次に、細胞結合性物質に結合させ、細胞内エステラーゼにより切断され遊離の薬物を解放することができる結合体を製造することができる。（例えば：Ａｂｏｕｄ−Ｐｉｒａｋ等，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，３８：６４１〜６４８（１９８９年），Ｌａｇｕｚｚａ等，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３２：５４９〜５５５（１９８９年）を参照）。

実施例７
インビボでの抗腫瘍活性
ＳＣＩＤマウスにおけるヒト扁平上皮ガン（Ａ４３１）異種移植片に対する抗ＥＧＦ受容体と抗体−タキサンとの結合体の抗腫瘍作用を以下のように確立した。２種の異なる抗−ヒト上皮成長因子受容体−タキサン結合体（抗ＥＧＦＲ−タキサン結合体）、ＫＳ−６１−タキサン、および、ＫＳ−７７−タキサンの抗腫瘍作用を、ＳＣＩＤマウスで、ヒト腫瘍の異種移植片モデルを用いて評価した。

５週齢の雌ＳＣＩＤマウス（２５匹）の右脇腹の皮下に、０．１ｍＬの無血清培地中のＡ−４３１ヒト扁平上皮ガン細胞（１．５×１０^６細胞／マウス）を接種させた。腫瘍を、平均サイズが１００．０ｍｍ^３（５４−１４５ｍｍ^３の範囲）になるまで１１日間増殖させた。次に、これらの動物を、それらの腫瘍サイズに従って、ランダムに４つの群に分けた（１群あたり３〜５匹の動物）。第一群には、ＫＳ−６１−タキサン結合体（１０ｍｇ／ｋｇ，１日５回）を静脈内投与した。第二群には、ＫＳ−７７−タキサン結合体（１０ｍｇ／ｋｇ，１日５回）を静脈内投与した。第三群には、無（結合していない）タキサン（０．２４ｍｇ／ｋｇ，１日５回，静脈内に）を、結合体に存在する量と同じ投与量で投与した。第四群（コントロール動物群）には、第一群〜第三群と同じ治療スケジュールを用いてＰＢＳを投与した。

腫瘍サイズを毎週２回測定し、腫瘍の容積を、式：１／２（長さ×幅×高さ） を用いて計算した。動物の重量も毎週２回測定した。結果を図１２、および、１３に示す。コントロールマウス群の腫瘍は、３１日で、ほぼ１０００ｍｍ^３のサイズに成長した。遊離のタキサンでの処理は治療効果を示さず、この群の腫瘍は、ＰＢＳを投与されたコントロール動物群と実質的に同じ速度で成長した。

対照的に、抗ＥＧＦＲ−タキサン結合体はいずれも、顕著な抗腫瘍活性を示し、実験期間中（ＫＳ−６１−タキサン結合体は３４日間、ＫＳ−７７−タキサン結合体は２７日間）、全ての処理動物で腫瘍成長の完全な阻害が起こった。また、このデータによれば、このモデルにおいて、腫瘍特異的抗体を用いたタキサンの標的化送達は、結合していないタキサンを同等の投与量で用いても抗腫瘍効果が示されなかったため、抗腫瘍活性にとって極めて重要であることも示される。重要なことは、体重損失が少しも起こらなかったことで実証されたように、用いられた抗体−タキサン結合体の投与量は、動物に対して非毒性であったことである（図１３を参照）。

実施例８
抗体−タキサン結合体のインビトロでの細胞毒性
抗ＥＧＦＲ−タキサン結合体、ＫＳ−７８−タキサンの細胞毒性を、ＥＧＦ−受容体陽性ヒトＡ４３１細胞系（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５５５）を用いたクローン形成分析で測定した。Ｎ９０１−タキサン結合体（ヒトＣＤ５６に対するマウスモノクローナル抗体Ｎ９０１で作製された類似の結合体）は、Ａ４３１細胞がその標的抗原であるＣＤ５６を発現しないため、特異性コントロールとして試験された。ＴＡ１−タキサン結合体（ヒトＮｅｕ抗原に対するマウスモノクローナル抗体ＴＡ１を用いて作製された結合体）の細胞毒性を、抗原陽性ヒト細胞系ＳＫ−ＢＲ−３（ＡＴＣＣ ＨＴＢ３０）、および、抗原陰性Ａ４３１細胞系で測定した。細胞を、６−ウェル組織培養プレート中で、１０％ウシ胎仔血清が添加されたＤＭＥＭ培地中で、様々な密度でプレーティングした。免疫結合体を様々な濃度で加え、３７℃、６％ＣＯ_２の加湿した雰囲気で約２０細胞またはそれ以上のコロニーが形成されるまで（６〜１０日間）細胞を維持した。コントロールプレートには、免疫結合体を加えなかった。次に、細胞をホルムアルデヒドで固定し、クリスタルバイオレットで染色し、低倍率顕微鏡下でカウントした。次に、プレート効率をコロニー数から決定し、生存細胞フラクションを、処理したサンプルのプレート効率と、コントロールのプレート効率との割合として計算した。

図１４は、標的抗原陽性細胞系Ａ４３１における、ＫＳ−７８−タキサン結合体の２つのバッチに関する細胞毒性決定の結果を示す。両方のバッチからの結合体は、標的細胞に対して類似の毒性を示す；濃度１０^−８Ｍでの６日間の処理により、１０^−２未満（１％未満の生存細胞）の生存するフラクションが達成された。コントロール結合体であるＮ９０１−タキサンは（Ａ４３１細胞の表面にその抗原が存在しない）、３×１０^−８Ｍまでの濃度では細胞毒性を示さない。また、結合していないＫＳ−７８抗体も、極めてわずかな細胞毒性効果しか示さない。これらの結果は、ＫＳ−７８−タキサン結合体の標的抗原特異的細胞毒性を実証している。

ＴＡ１−タキサン結合体の細胞毒性効力と選択性を、標的抗原陽性細胞系ＳＫ−ＢＲ−３、および、標的抗原陰性の細胞系Ａ４３１を用いて分析した。結果を図１５に示す。１０^−９Ｍの結合体濃度で、９０％超の標的ＳＫ−ＢＲ−３細胞が死滅した（生存するフラクションは０．１未満）、同時に、非標的Ａ４３１細胞に対する毒性は観察されなかった。これらの結果は、抗原陽性細胞を選択的に死滅させること、および、結合体の細胞毒性効果は、その抗体成分を介した特異的結合に依存することを実証している。

実施例９および１０
一般的な方法：
化学物質は、アルドリッチ・ケミカル社（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）またはその他の市販先から得て、特に他の規定がない限り、それ以上精製しないで用いた。全ての無水の反応は、アルゴン下で、オーブンで乾燥したガラス製品中で行われた。テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）をナトリウム／ベンゾフェノンで蒸留した。全ての反応を、Ｅ．メルク（Ｅ．Ｍｅｒｃｋ）の分析用薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）プレート（シリカゲル６０ＧＦ，アルミニウム板上）でモニターし、２５４ｎｍのＵＶ光、および／または、バニリン／硫酸噴霧、および／または、リンモリブデン酸／エタノール噴霧で分析した。カラムクロマトグラフィー用のシリカゲルをＥ．メルクから購入した（２３０〜４００メッシュ）。分離用薄層クロマトグラフィー（ＰＴＬＣ）プレート（シリカゲル６０ＧＰ）を、アナルテック（Ａｎａｌｔｅｃｈ）から購入した。^１Ｈおよび^１３ＣＮＭＲスペクトルを、ブルカー（Ｂｒｕｋｅｒ）４００ＭＨｚスペクトロメーターでのＣＤＣｌ_３で得て、化学シフトとカップリング定数を関連化合物のものと比較することによって割り当てた。化学シフトはδ値で報告され、カップリング定数ヘルツで報告される。アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）のエスクワイア（Ｅｓｑｕｉｒｅ）３０００エレクトロスプレーマススペクトロメーターで、マススペクトルを得た。成句「通常の方法で得た(worked-up in the usual way)」とは、特に他の規定がない限り、反応混合物を過量の有機溶媒で希釈し、水とブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空中で溶媒を蒸発させることを意味する。β−ラクタム４，１９、および、３８、バッカチンＩＩＩ誘導体７を、文献で報告された方法に従って製造した（Ｂｒｉｅｖａ，Ｒ．Ｃｒｉｃｈ，Ｊ．Ｚ．；Ｓｉｈ，Ｃ．Ｊ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５８：１０６８〜１０７５（１９９３年）；Ｈｏｌｔｏｎ，Ｒ．Ａ．；Ｚｈａｎｇ，Ｚ．；Ｃｌａｒｋｅ，Ｐ．Ａ．；Ｎａｄｉｚａｄｅｈ，Ｈ．；Ｐｒｏｃｔｅｒ，Ｊ．Ｄ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３９：２８８３〜２８８６（１９９８年）；Ｃｈｅｎ，Ｓ−Ｈ．；Ｖｉｔｔｏｒｉｏ，Ｆ．；Ｗｅｉ，Ｊ−Ｍ．；Ｌｏｎｇ，Ｂ．；Ｆａｉｒｃｈｉｌｄ，Ｃ．；Ｍａｍｂｅｒ，Ｓ．Ｗ．；Ｋａｄｏｗ，Ｊ．Ｆ．；Ｖｙａｓ，Ｄ．；Ｄｏｙｌｅ，Ｔ．Ｗ．Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ，４（３）：４７９〜４８２（１９９４年））。これら化合物のＮＭＲデータは文献に記載のデータと同一であった。

実施例９
本発明の新規のタキソイド１２−１５、３１−３５、および、５０−５４の合成（図５および１６）を以下に説明する。

バッカチンＩＩＩ誘導体７と、β−ラクタム６ａ−ｄ、２１−２５および４０−４４とのカップリングの一般的な方法。
シリルで保護されたタキソイド８−１１、２６−３０、および、４５−４９の合成である。バッカチン誘導体７（０．０４ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２ｍＬ）の撹拌溶液に、ＮａＨ（２ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を１５分間撹拌し、β−ラクタム（例えば６ａ−ｄ、２１−２５、または、４０−４４；０．０８ｍｍｏｌ）を導入し、反応混合物をさらに４〜６時間撹拌した。この反応液をＥｔＯＡｃで希釈し、酢酸で急冷し、通常の方法で得た。最終的に、粗生成物をＰＴＬＣプレートにアプライし（３０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）、目的生成物を単離した。

シリル保護基の除去の一般的な方法；タキソイド１２−１５、３１−３５、および、５０−５４の合成
それぞれ１０ｍｇの保護されたタキソイド８−１１、２６−３０、または、４５−４９）のＴＨＦ（０．５ｍＬ）の撹拌溶液に、０．１５ｍＬのピリジンを０℃で加えた。次に、５分にわたり、この撹拌溶液に０．１５ｍＬのＨＦ−ピリジンを導入した。反応混合物を室温にし、さらに２４時間撹拌した。次に、反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液で洗浄し、通常の方法で得た。最終的に、粗生成物をＰＴＬＣプレートにアプライし（６０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）、目的生成物を単離した。

本発明の代表的なジスルフィド含有タキソイド（図６，１７）の合成
Ｃ−１０アセテート基の除去。１６の合成。
タキソイド１０（〜７０ｍｇ）の、エタノール（１．５ｍＬ）の撹拌溶液に、ヒドラジン一水和物（０．６ｍＬ）を室温で加えた。反応混合物を室温で１時間撹拌し、次に、酢酸エチルで希釈し、飽和塩化アンモニウム水溶液で洗浄し、通常の方法で得た。粗生成物をＰＴＬＣプレートにアプライし（１０％のＥｔＯＡｃ／ＣＨ_２Ｃｌ_２）、目的生成物を単離した。

タキソイドのＣ−１０ヒドロキシル基のエステル化。１７および３６の合成。
カルボン酸のジクロロメタン（酸３０ｍｇごとに２ｍＬ）の撹拌溶液に、室温で、ＥＤＣ（ｌ−［３−（ジメチルアミノ）プロピル−３−エチルカルボジイミド塩酸塩］（１当量）を加え、反応混合物を１５分間撹拌した。次に、ＤＭＡＰ（４−（ジメチルアミノ）ピリジン）（触媒的な量）を加え、反応混合物をさらに５分間撹拌した。次に、Ｃ−１０脱アセチルタキソイド１６（１／１５当量）を室温で導入し、反応混合物をさらに４時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、水、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液で洗浄し、通常の方法で得た。最終的に、粗生成物をＰＴＬＣプレートにアプライし（１０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）、目的生成物を単離した。

ビスルフィド含有タキソイド１８および３７の合成
それぞれ１０ｍｇの保護されたタキソイド１７または３６のＴＨＦ（０．５ｍＬ）の撹拌溶液に、０℃で、０．１５ｍＬのピリジンを加えた。次に、５分間にわたって、０．１５ｍＬのＨＦ−ピリジンを撹拌溶液に導入した。反応混合物を室温にし、さらに２４時間撹拌した。次に、反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液で洗浄し、通常の方法で得た。最終的に、粗生成物をＰＴＬＣプレートにアプライし（６０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）、目的生成物１８および３７を得た。

化合物６ａ．

化合物６ｂ．

化合物６ｃ．

化合物６ｄ．

化合物８．

化合物９．

化合物１０．

化合物１１．

化合物１２．

化合物１３．

化合物１４．

化合物１５．

化合物１６．

化合物１７．

化合物１８．

化合物１９．

化合物２０．

化合物２１．

化合物２２．

化合物２３．

化合物２４．

化合物２５．

化合物２６．

化合物２７．

化合物２８．

化合物２９．

化合物３０．

化合物３１．

化合物３２．

化合物３３．

化合物３４．

化合物３５．

化合物３６．

化合物３７．

化合物３８．

化合物４０．

化合物４１

化合物４２．

化合物４３．

化合物４４．

化合物４５．

化合物４６．

化合物４７．

化合物４８．

化合物４９．

化合物５０．

化合物５１．

化合物５２．

化合物５３．

化合物５４．

実施例１０
インビトロでの細胞毒性分析
本発明の新規のタキソイド、および、ジスルフィド含有タキサン薬物を、インビトロでヒト腫瘍細胞系の増殖を抑制するそれらの能力に関して評価した。これら化合物の細胞毒性の判断に、ヒト腫瘍細胞系Ａ−５４９（ヒト肺ガン）、および、ＭＣＦ−７（ヒト乳房腫瘍）を用いる。細胞をこれら化合物に７２時間晒し、直接的な分析で生存する細胞フラクションを測定する。Ａ５４９およびＭＣＦ−７を、プレート効率に関して分析し（Ｇｏｌｄｍａｃｈｅｒ等，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０２：１３１２〜１３１９（１９８６年）、次に、このデータからＩＣ_５０値を計算する。

タキソイド１４、１５、３１-３５、５０-５４、および、ジスルフィド含有タキソイドの細胞毒性
１８および３７を以下のように測定した。Ａ５４９およびＭＣＦ−７細胞を、６−ウェル組織培養プレート中で、１０％ウシ胎仔血清が添加されたＤＭＥＭ培地中で、様々な密度でプレーティングした。タキサンを様々な濃度で加え、３７℃、６％ＣＯ_２の加湿した雰囲気で約２０細胞またはそれ以上のコロニーが形成されるまで（６〜１０日間）細胞を維持した。コントロールプレートには、タキサンを加えなかった。次に、細胞をホルムアルデヒドで固定し、クリスタルバイオレットで染色し、低倍率顕微鏡下でカウントした。次に、プレート効率をコロニー数から決定し、生存細胞フラクションを、処理したサンプルのプレート効率と、コントロールのプレート効率との割合として計算した。

図１０は、本発明の１２種の新規のタキソイドの細胞毒性決定の結果を示す。フェニル置換基をＲ_４に有するタキサン５２を除き、その他全ての新規のタキソイドは、Ａ−５４９およびＭＣＦ−７細胞系両方に対して極めて高い効力を有していた（ＩＣ_５０値は、１０^−１０〜１０^−１１Ｍの範囲）。タキサン５２の試験された両方の細胞系に対する細胞毒性は、より低かった（ＩＣ_５０値は、３×１０^−９Ｍ）。

図１１は、本発明の代表的なジスルフィド含有タキソイドに関する細胞毒性曲線を示す。ビスルフィド含有タキソイド１８および３７はいずれも、Ａ−５４９およびＭＣＦ−７細胞の両方に対して極めて高い効能を有し、急勾配の死滅曲線を示す。

様々なタキサンの構造を示す化学式であり、上記のＯｊｉｍａ等により説明されたより効能のあるタキサンのうちいくつかを示す。 本発明に係る、Ｃ−１０位に遊離のヒドロキシル基、Ｃ−７に結合基を有するジスルフィド含有タキサンのいくつかの構造を示す化学式である。 ３種のタキサンの構造を示す。タキサン１は、Ｃ−１０にエステル基、Ｃ−７に結合基を有する。タキサン２’およびタキサン３’はいずれも、Ｃ−１０に遊離のヒドロキシ基、Ｃ−７に結合基を有する。 様々なタキサンの構造を示す化学式であり、米国特許第６，３４０，７０１号、米国特許第６，３７２，７３８号、および、米国特許第６，４３６，９３１号で説明されたより効力のあるタキサンのいくつかを示す。 以前に説明されていない、Ｒ_３および／またはＲ_４に置換基を有する本発明に係る新規のタキサンのいくつかの構造を示す化学式である。 以前に説明されていない、Ｒ_３および／またはＲ_４に置換基を有する本発明に係る新規のジスルフィド含有タキサンのいくつかの構造を示す化学式である。 タキサンを製造するための出発原料である１０-デアセチルバッカチンＩＩＩの構造を示す。 タキサン２’製造における合成工程を示す。 タキサン３’製造における合成工程を示す。 タキサン１および２’のＡ４３１細胞に対するインビトロでの効力の比較を示す。 Ａ５４９およびＭＣＦ−７細胞に対するタキサン３’のインビトロでの細胞毒性を示す。 ＳＣＩＤマウスにおける、抗−ＥＧＦ受容体と抗体−タキサンとの結合体の、ヒト扁平上皮ガン（Ａ４３１）異種移植片に対する抗腫瘍作用を示す。 実施例８で説明された実験で用いられたＳＣＩＤマウスの体重変化を示す。 標的抗原陽性細胞系Ａ４３１に対する抗ＥＧＦ受容体−タキサン結合体の細胞毒性決定の結果と、標的抗原を発現しないＡ４３１細胞系に対するＮ９０１−タキサン結合体の細胞毒性決定の結果を示す。 標的抗原陽性細胞系ＳＫ−ＢＲ−３、および、非標的抗原陰性細胞系Ａ４３１における、ＴＡ１−タキサン結合体の細胞毒性効力と選択性を示す。 本発明の第二の態様に係る新規のタキサンの製造における合成工程を示す。 本発明の第二の態様に係る新規のタキサンの製造における合成工程を示す。 本発明の第二の態様に係る新規のタキサンの製造における合成工程を示す。 本発明の第二の態様に係る新規のジスルフィド含有タキサンの製造における合成工程を示す。 本発明の第二の態様に係る新規のジスルフィド含有タキサンの製造における合成工程を示す。 本発明の第二の態様に係る新規のタキサンのインビトロでの細胞毒性を示す。 本発明の第二の態様に係るジスルフィド含有タキサンのインビトロでの細胞毒性を示す。 本発明の第二の態様に係るジスルフィド含有タキサンのインビトロでの細胞毒性を示す。

Claims (7)

1. 式（Ｉ）で示される化合物：
   

   

   式中：
   Ｒ_１は、Ｈ、電子求引基、または、電子供与基であり；
   Ｒ_１’およびＲ_１”は、同一または異なって、Ｈ、電子求引基、または、電子供与基であり；
   Ｒ_２は、Ｈであり；
   Ｒ_３は、１〜１０個の炭素原子を有するアルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有するシクロアルキルもしくはシクロアルケニル、アリール、または、複素環式基であり；
   Ｒ_４は、１〜１０個の炭素原子を有するアルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有するシクロアルキルもしくはシクロアルケニル、アリール、複素環式基、−ＯＣ（ＣＨ_３）_３、または、３〜１０個の炭素原子を有する前記アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、または、複素環のいずれかから形成されたカルバメートであり；
   Ｒ_５は、結合基であり；および、
   Ｒ_６は、Ｈ、複素環式基もしくはアリールエーテル、エステルもしくはカルバメート、または、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖状、分岐状もしくは環状アルキルもしくはアルケニルエステルもしくはエーテル、または、式−ＣＯＸで示されるカルバメート（式中、Ｘは窒素含有複素環式基である）、または、式−ＣＯＮＲ_１０Ｒ_１１で示されるカルバメート（式中、Ｒ_１０およびＲ_１１は、同一または異なって、Ｈ、１〜１０個の原子を有する直鎖状、分岐状もしくは環状アルキル、または、１〜１０個の炭素原子を有する単純アリールもしくは置換アリールである）である。
2. Ｒ_３は、−ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ_３）_２である、請求項１に記載の化合物。
3. 式（Ｉ）で示される化合物：
   

   

   式中：
   Ｒ_２は、結合基であり；
   Ｒ_１は、Ｈ、電子求引基、または、電子供与基であり；
   Ｒ_１’およびＲ_１”は、同一または異なって、Ｈ、電子求引基、または、電子供与基であり；
   Ｒ_３およびＲ_４は、同一または異なって、１〜１０個の炭素原子を有するアルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有するシクロアルキルもしくはシクロアルケニル、アリール、または、複素環であり、Ｒ_４はさらに、−ＯＣ（ＣＨ_３）_３、または、３〜１０個の炭素原子を有する前記アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリールもしくは複素環のいずれかから形成されたカルバメートであり；
   Ｒ_５およびＲ_６は、同一または異なって、Ｈ、複素環式もしくはアリールエーテル、エステルもしくはカルバメート、または、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖状、分岐状もしくは環状アルキルもしくはアルケニルエステルもしくはエーテル、または、式−ＣＯＸで示されるカルバメート（式中、Ｘは窒素含有複素環である）、または、式−ＣＯＮＲ_１０Ｒ_１１で示されるカルバメート（式中、Ｒ_１０およびＲ_１１は、同一または異なって、Ｈ、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖状、分岐状もしくは環状アルキル、または、１〜１０個の炭素原子を有する単純アリールもしくは置換アリールである）である。
4. 式（Ｉ）で示される化合物；
   

   

   式中：
   Ｒ_５は、結合基であり；
   Ｒ_１は、Ｈ、電子求引基、または、電子供与基であり；
   Ｒ_１’およびＲ_１”は、同一または異なって、Ｈ、電子求引基、または、電子供与基であり；
   Ｒ_３およびＲ_４は、同一または異なって、１〜１０個の炭素原子を有するアルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有するシクロアルキルもしくはシクロアルケニル、アリール、または、複素環であり、Ｒ_４はさらに、−ＯＣ（ＣＨ_３）_３、または、３〜１０個の炭素原子を有する前記アルキル、アルケニル、シクロアルキルもしくはシクロアルケニル、アリールもしくは複素環式基のいずれかから形成されたカルバメートであり；
   Ｒ_２およびＲ_６は、同一または異なって、Ｈ、複素環式もしくはアリールエーテル、エステルもしくはカルバメート、または、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖状、分岐状もしくは環状アルキルもしくはアルケニルエステルもしくはエーテル、または、式−ＣＯＸで示されるカルバメート（式中、Ｘは窒素含有複素環である）、または、式−ＣＯＮＲ_１０Ｒ_１１で示されるカルバメート（式中、Ｒ_１０およびＲ_１１は、同一または異なって、Ｈ、１〜１０個の原子を有する直鎖状、分岐状もしくは環状アルキル、または、１〜１０個の炭素原子を有する単純アリールもしくは置換アリールである）である。
5. 式（Ｉ）で示される化合物：
   

   

   式中：
   Ｒ_６は、結合基であり；
   Ｒ_１は、Ｈ、電子求引基、または、電子供与基であり；
   Ｒ_１’およびＲ_１”は、同一または異なって、Ｈ、電子求引基、または、電子供与基であり；
   Ｒ_３およびＲ_４は、同一または異なって、１〜１０個の炭素原子を有するアルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有するシクロアルキルもしくはシクロアルケニル、アリール、または、複素環式基であり、Ｒ_４はさらに、−ＯＣ（ＣＨ_３）_３、または、３〜１０個の炭素原子を有する前記アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、または、複素環式基のいずれかから形成されたカルバメートであり；
   Ｒ_２およびＲ_５は、同一または異なって、Ｈ、複素環式基もしくはアリールエーテル、エステルもしくはカルバメート、または、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖状、分岐状もしくは環状アルキルもしくはアルケニルエステルもしくはエーテル、または、式−ＣＯＸで示されるカルバメート（式中、Ｘは、窒素含有複素環式基であり、例えばピペリジノ、モルホリノ、ピペラジノ、Ｎ−メチルピペラジノである）、または、式−ＣＯＮＲ_１０Ｒ_１１で示されるカルバメート（式中、Ｒ_１０およびＲ_１１は、同一または異なって、Ｈ、１〜１０個の原子を有する直鎖状、分岐状もしくは環状アルキル、または、１〜１０個の炭素原子を有する単純アリールもしくは置換アリールである）である。
6. 式（Ｉ）で示される化合物：
   

   

   式中：
   Ｒ_３は、結合基であり；
   Ｒ_１は、Ｈ、電子求引基、または、電子供与基であり；
   Ｒ_１’およびＲ_１”は、同一または異なって、Ｈ、電子求引基、または、電子供与基であり；
   Ｒ_４は、１〜１０個の炭素原子を有するアルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有するシクロアルキルもしくはシクロアルケニル、アリール、または、複素環式基であり、Ｒ_４はさらに、−ＯＣ（ＣＨ３）_３、または、３〜１０個の炭素原子を有する前記アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、または、複素環のいずれかから形成されたカルバメートであり；
   Ｒ_２、Ｒ_５およびＲ_６は、同一または異なって、Ｈ、複素環式基もしくはアリールエーテル、エステルもしくはカルバメート、または、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖状、分岐状または環状アルキルまたはアルケニルエステルもしくはエーテル、または、式−ＣＯＸで示されるカルバメート（式中、Ｘは、窒素含有複素環であり、例えばピペリジノ、モルホリノ、ピペラジノ、Ｎ−メチルピペラジノである）、または、式−ＣＯＮＲ_１０Ｒ_１１で示されるカルバメート（式中、Ｒ_１０およびＲ_１１は、同一または異なって、Ｈ、１〜１０個の原子を有する直鎖状、分岐状もしくは環状アルキル、または、１〜１０個の炭素原子を有する単純アリールもしくは置換アリールである）である。
7. 式（Ｉ）で示される化合物：
   

   

   式中：
   Ｒ_４は、結合基であり；
   Ｒ_１は、Ｈ、電子求引基、または、電子供与基であり；
   Ｒ_１’およびＲ_１”は、同一または異なって、Ｈ、電子求引基、または、電子供与基であり；
   Ｒ_３は、１〜１０個の炭素原子を有するアルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有するシクロアルキルもしくはシクロアルケニル、アリール、または、複素環式基であり、Ｒ_４はさらに、−ＯＣ（ＣＨ_３）_３、または、３〜１０個の炭素原子を有する前記アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、または、複素環のいずれかから形成されたカルバメートであり；
   Ｒ_２、Ｒ_５およびＲ_６は、同一または異なって、Ｈ、複素環式基もしくははアリールエーテル、エステルもしくはカルバメート、または、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖状、分岐状もしくは環状アルキルもしくはアルケニルエステルもしくはエーテル、または、式−ＣＯＸで示されるカルバメート（式中、Ｘは、窒素含有複素環式基であり、例えばピペリジノ、モルホリノ、ピペラジノ、Ｎ−メチルピペラジノである）、または、式−ＣＯＮＲ_１０Ｒ_１１で示されるカルバメート（式中、Ｒ_１０およびＲ_１１は、同一または異なって、Ｈ、１〜１０個の原子を有する直鎖状、分岐状もしくは環状アルキル、または、１〜１０個の炭素原子を有する単純アリールまたは置換アリールである）である。

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