JP2005272471A

JP2005272471A - 新規な没食子酸共役リノール酸脂肪エステル、その製造方法及びそれを含む組成物

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Publication number: JP2005272471A
Application number: JP2005088064A
Authority: JP
Inventors: Myeong Woo Byeon; ウー・ビュンミュン; Jo Chorun; チョルン・ジョ
Original assignee: Korea Atomic Energy Research Institute KAERI
Current assignee: Korea Atomic Energy Research Institute KAERI
Priority date: 2004-03-25
Filing date: 2005-03-25
Publication date: 2005-10-06
Anticipated expiration: 2025-03-25
Also published as: JP4201779B2

Abstract

【課題】新規な没食子酸共役リノール酸脂肪エステル、その製造方法及び、それを含む組成物を提供する。
【解決手段】
本発明の没食子酸共役リノール酸脂肪エステルは、没食子酸と共役リノール酸を１：３モル比率で有機溶媒に溶解させた後、塩基を添加して反応させる工程、及び前記反応液にエチルアセテートを添加して層分離をさせた後、上層液を集めて濃縮する工程で製造され、電子供与能力に優れ、過酸化物価が低く、脂肪酸変敗度が低いので優れた抗酸化効果を有する。また、カビと細菌に対して優れた抗菌活性を有し、ＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２阻害作用に優れることから、抗炎症効果に優れるとともに、高いチロシナーゼ阻害作用を有するので肌美白効果にも優れる。したがって、本発明の組成物は、抗酸化、抗菌、抗炎症及び肌美白に有用に使用できる。
【選択図】図２

Description

本発明は、新規な没食子酸共役リノール酸脂肪エステル、その製造方法及びそれを含む組成物に関するものである。

共役リノール酸(conjugated linoleic acid；ＣＬＡ）は、必須脂肪酸であるリノール酸の幾何学異性体で、リノール酸を含んでいる中性脂質が水素化される時に微量に生成し、反芻動物の胃の中に生息する嫌気性細菌によってリノール酸からも少量生成し、反芻動物由来の肉製品及び乳製品（牛乳、チーズなど）にも少量含有されている。ＣＬＡは、韓国ではまだ販売許可が出ていない物質で、１９８７年にアメリカのウィスコンシン大学のパリジャ教授によって初めて効能が明らかにされて以後、２００２年には１０００以上の論文が発表されるなど高い関心が持たれている物質である。特に、ＣＬＡの主要構成物質であるトランス−１０,シス−１２異性体が体脂肪を減少させる物質として知られている。ＣＬＡは、吸収された脂肪が脂肪細胞に蓄積されることを防いで、筋肉細胞でエネルギーに使われるように誘導することから、このようなメカニズムを通じて体脂肪が減少する効果を有し、さらに、運動を共に行なう場合には、体重減量及び健康増進にもさまざまな効果があることが明らかにされている。

ＣＬＡの生理的機能は、肥満抑制、血中コレステロール降下、血中ＬＤＬ−コレステロール酸化を防ぐ抗酸化効果、糖尿病予防及び治療効果、乳癌、皮膚癌、胃癌に対する抗癌効果、飼料に使う場合の飼料効率改善、家畜の体脂肪減少、脂肉率増加、肉質改善、食肉の脂肪酸化抑制効果など非常に多様である。
しかし、ＣＬＡ自体は共役（conjugation）の状態であることから、脂肪酸化が急速に進む可能性が大きい。

したがって、本発明の課題は、ＣＬＡ自体の脂肪酸化を減少させることができる物質を提供することにある。

本発明者らは、ＣＬＡ自体の脂肪酸化を減少させることができる優れた物質を開発すべく鋭意検討を行う中で、没食子酸とＣＬＡを結合させて製造した脂肪エステルが、抗酸化、抗菌、抗炎症及び肌美白効果が極めて優れていることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、下記化学式１で示される新規な没食子酸共役リノール酸脂肪エステルに関する。

前記式中、Ｒ_１ないしＲ_４はそれぞれ独立して、水素または共役リノール酸であり、ここで、共役リノール酸は、９−シス,１１−トランスオクタデセン酸（octadecenoic acid）；９−トランス,１１−シスオクタデセン酸；１０−シス,１２−トランスオクタデセン酸；または、１０−トランス,１２−シスオクタデセン酸である（但し、Ｒ_１ないしＲ_４がすべて水素の場合は除く）。

また、本発明は、
１）没食子酸と共役リノール酸をモル比率１：３で有機溶媒に溶解させた後、塩基を添加して反応させる工程、及び
２）前記工程１）で得られた反応混合物にエチルアセテートを添加して層分離をさせた後、上層液を集めて濃縮する工程
を含む、没食子酸共役リノール酸脂肪エステルの製造方法に関する。

また、本発明は、前記工程１）において、有機溶媒が、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、アセトニトリルからなる群から選択されることを特徴とする、前記方法に関する。本発明においては、前記有機溶媒はテトラヒドロフランであることが好ましい。

本発明はまた、前記工程１）において、塩基が、トリエチルアミン及びＷＳＣＤ（1,3−ジシクロヘキシルカルボジイミド）であることを特徴とする、前記方法に関する。

さらに本発明は、前記の没食子酸共役リノール酸脂肪エステルを含む、抗酸化用組成物に関する。
また本発明は、前記の没食子酸共役リノール酸脂肪エステルを含む、抗菌用組成物に関する。

さらにまた本発明は、前記の没食子酸共役リノール酸脂肪エステルを含む、抗炎症用組成物に関する。また、本発明は、組成物がリューマチ関節炎または骨関節炎の予防及び治療に有用であることを特徴とする、前記の抗炎症用組成物にも関する。
本発明はまた、前記の没食子酸共役リノール酸脂肪エステルを含む、肌美白用組成物に関する。

よって、本発明は、新規な没食子酸共役リノール酸脂肪エステルを提供する。
また、本発明は、前記没食子酸共役リノール酸脂肪エステルの製造方法を提供する。

また、本発明は、前記没食子酸共役リノール酸脂肪エステルを有効成分として含む、抗酸化、抗菌、抗炎症及び肌美白用組成物を提供する。

本発明の没食子酸共役リノール酸脂肪エステルは、電子供与能（ラジカル消去）に優れ、過酸化物価が低く、また脂肪酸の変敗度も低いため、極めて優れた抗酸化効果を有する。

また、本発明の没食子酸共役リノール酸脂肪エステルは、１１種類の微生物のうち、４種類のカビ、アスペルギルス・フラバス（Aspergillus flavus）、アスペルギルス・ウサミ（Aspergillus usami）、ムコ・ヒエマリス（Mucor hiemalis）およびペニシリウム・ベルコサム（Penicillium verrucosum）、乳酸菌、ロイコノストク・メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）、ならびに細菌、リステリア・イバノバ（Listeria ivanova）に対して優れた抗菌活性を発揮する。

また、本発明の没食子酸共役リノール酸脂肪エステルは、ＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２阻害率が高いため、リューマチ関節炎、骨関節炎及びその他炎症に対して優れた抗炎症効果を有する。

また、本発明の没食子酸共役リノール酸脂肪エステルは、チロシナーゼ阻害率が高いことから、肌美白効果に優れている。

したがって、本発明の組成物は、抗酸化、抗菌、抗炎症及び肌美白に有用に使用できる。

本発明の組成物は、前記没食子酸共役リノール酸脂肪エステルの他に、さらに同一または類似の機能を有する有効成分を１種以上含むことができる。

本発明の組成物は、投与のために前記の有効成分以外にさらに薬剤学的に許容可能な担体を１種以上含んで製造することができる。薬剤学的に許容可能な担体は、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エチルアルコール及びこれら成分のうち１成分以上を混合して使うことができ、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、抗菌剤など他の通常の添加剤を添加することができる。

また、稀釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑剤を付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。さらに当分野の適正な方法で、またはレミントン製薬科学（Remington’s Pharmaceutical Science）（最近版）、マック出版社（Mack Publishing Company, Easton PA）に開示されている方法を使用して、各疾患に応じ、または成分に応じて好ましく製剤化することができる。

本発明の組成物は、目的とする方法によって非経口投与（例えば静脈内、皮下、腹腔内または局所に適用）または経口投与することができ、投与量は患者の体重、年齢、性別、健康状態、食事、投与時間、投与方法、排泄率及び疾患の重症度等によりその範囲が多様である。一日投与量としては、化学式１の没食子酸共役リノール酸脂肪エステルを約２０〜３００ｍｇ／ｋｇで、好ましくは５０〜１２０ｍｇ／ｋｇで、一日一回ないし数回に分けて投与するのがより好ましい。

また、本発明の組成物は、抗酸化、抗菌、抗炎症及び肌美白の改善を目的に健康食品に添加することができる。本発明の没食子酸共役リノール酸脂肪エステルを食品添加物に使う場合、前記没食子酸共役リノール酸脂肪エステルをそのまま添加したり他の食品または食品成分とともに使用したりすることができ、通常の方法によって適切に使用することができる。有効成分の混合量は、使用目的（予防、健康または治療的処置）に応じて決めることができる。一般的に、食品または飲料の製造時、本発明の没食子酸共役リノール酸脂肪エステルは、原料に対して１〜２０重量％、好ましくは５〜１０重量％の量で添加する。しかし、健康及び衛生を目的としてまたは健康調節を目的として長期間摂取する場合には、前記量は前記範囲以下であってもよい。安全性面で如何なる問題もないので有効成分は前記範囲以上の量でも使用可能である。

前記食品の種類には、特別な制限はない。本発明の没食子酸共役リノール酸脂肪エステルを添加することができる食品の例としては、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンデー類、スナック類、菓子類、ピザ、ラーメン、その他麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料、お茶、ドリンク剤、アルコール飲料及びビタミン複合剤などがあり、一般的な意味での健康食品をすべて含む。

本発明の健康飲料組成物は、通常の飲料と一緒にさまざまな香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含むことができる。上述した天然炭水化物は、ブドウ糖、果糖のようなモノサッカライド、マルトース、スクロースのようなジサッカライド、及びデキストリン、シクロデキストリンのようなポリサッカライド、ザイリトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールである。甘味剤としては、タウマチン、ステビア抽出物のような天然甘味剤や、サッカリン、アスパルテームのような合成甘味剤などを使うことができる。前記天然炭水化物の割合は、本発明の組成物１００ｍｌ当り一般的に約０．０１〜０．０４ｇ、好ましくは約０．０２〜０．０３ｇである。

前記以外に本発明の組成物は、さまざまな栄養剤、ビタミン、電解質、風味剤、着色剤、ペクチン酸(pectic acid)及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調整剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使われる炭酸化剤などを含むことができる。その他に本発明の組成物は、天然果物ジュース、果物ジュース飲料及び野菜飲料の製造のための果肉を含むことができる。このような成分は、単独でまたは組み合わせて使うことができる。このような添加剤の割合は、限定されないが、本発明の組成物１００重量部当り０．０１〜０．１重量部の範囲であるのが一般的である。

また、本発明の組成物は、没食子酸共役リノール酸脂肪エステル以外に化粧料組成物分野で通常的に使われる添加剤を配合して製造することができ、その剤形において特別に限定されない。すなわち、本発明による化粧料組成物は、ソフトナー、アストリンゼン、栄養化粧水、アイクリーム、栄養クリーム、マッサージクリーム、クレンジングクリーム、クレンジングポム、クレンジングウォーター、パウダー、パックまたはエッセンスなどの形態であってもよい。

以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例及び実験例を提示する。しかし、下記の実施例及び実験例は本発明をより易しく理解するために提供するだけであり、実施例及び実験例によって本発明の範囲が限定されるものではない。
実施例

没食子酸共役リノール酸脂肪エステルの製造
本実施例に使用した没食子酸は、シグマ社（アメリカ）から購入した製品を使用し、共役リノール酸（純度８０％、ＣＬＡ）は、（株）リポゼン社から提供を受けて実験に使用した。

没食子酸及びＣＬＡをモル比１：３でテトラヒドロフランに溶解させた後、トリエチルアミン及びＷＳＣＤ（1,3−ジシクロヘキシルカルボジイミド）を添加して２４時間撹拌しながら反応させた。反応が終わった後、蒸留水を添加して洗浄した。、洗浄は２回繰り返した。エチルアセテートを添加して層分離をさせた後、上層液を回収して、回収した上層液を薄膜クロマトグラフィー（シリカ薄膜クロマトグラフィー；25DC-Platten、Kiesel gel、60F254、Merk、ドイツ、20x20cm）に展開し、本発明の脂肪エステルの合成の有無を確認した。ここで、展開溶媒にはエチルアルコール：ヘキサンを１：８の割合で使用し、リンモリブデン酸（phosphomolybdic acid;PMA、ＰＭＡ１０ｇとエチルアルコール１２０ｍｌを混合）を染色試薬として用いることにより発色させた。

本発明の脂肪エステルの合成が確認された上層液に、Ｎａ_２ＳＯ_４を添加して乾燥した後、窒素気流下で濃縮した。濃縮した没食子酸共役リノール酸脂肪エステル原液３ｍｌを試料固定台に挿入し、赤外線分光光度計（FT IR/FT NIR Spectrophotometer, Tensor 37, Bruker OPTIK GmbH）とＯＰＵＳ分光法ソフトウェア（バージョン４）を使用して、合成された没食子酸共役リノール酸脂肪エステルの生成を確認した。

薄膜クロマトグラフィーに展開された結果は、図１に示した。赤外線分光光度計の測定結果は、図２に示した。

図１に示したように、出発物質であるＡ（没食子酸）とＢ（共役リノール酸）は、最終生成物であるＣ（没食子酸共役リノール酸脂肪エステル）と異なる形態に展開されることが分かる。出発物質であるＡ（没食子酸）の発色点は、最終生成物であるＣ（没食子酸共役リノール酸脂肪エステル）においては観察されず、最終生成物であるＣでは新しく形成された発色点が観察された。

また、図２に示したように、エステル基によるピークである１７５２．６５cm^−１においてピークが確認されたことにより、没食子酸と共役リノール酸が結合して没食子酸共役リノール酸脂肪エステルを形成していることが分かる。

実験例１：本発明の没食子酸共役リノール酸脂肪エステルの抗酸化効果
本発明の没食子酸共役リノール酸脂肪エステルが、人体内の胃酸条件下で抗酸化能を有するかどうかを調べるために、下記の実験を遂行した。

１．抗酸化試験用試料製造
人体内の胃酸条件とするために、０．１Ｍ没食子酸、０．３Ｍ共役リノール酸及び前記実施例で製造した没食子酸共役リノール酸脂肪エステルを、０．１ＭＨＣｌを使用してｐＨ２に調節されたエチルアルコールに溶解し、３７℃で１時間反応させた後、抗酸化活性を測定した。

２．電子供与能（1,1−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル、ＤＰＰＨ）測定
試料は、エチルアルコールに１０００ｐｐｍの濃度になるように希釈した後、分析用試料として使用した。試料１ｍｌに０．２ｍＭＤＰＰＨラジカル１ｍｌを入れて撹拌して、３０分間室温で反応させた後、分光光度計（ＵＶ−１６００ＰＣ、シマズ、東京、日本）を使用して５１７ｎｍにおける吸光度を測定した。
結果は、表１に示した。

※ ＧＡ：没食子酸、ＣＬＡ：共役リノール酸、
ＧＡ−ＣＬＡ：没食子酸共役リノール酸脂肪エステル

表１に示されたように、本発明の没食子酸共役リノール酸脂肪エステル（ＧＡ−ＣＬＡ）の電子供与能は、０．１モル没食子酸、０．３モル共役リノール酸よりもラジカル消去能が優れていることが分かる。しかし、本発明の没食子酸共役リノール酸脂肪エステルを胃酸の条件下で反応させた場合は、ラジカル消去能が低下することが分かった。

３．過酸化物価（ＰＯＶ）測定
過酸化物価は、ＡＯＡＣ方法によって測定した。試料は、豆油に１０００ｐｐｍの濃度になるように希釈した後、分析用試料として使用した。

試料１ｍｌにクロロホルムと酢酸の（２：３、ｖ／ｖ）混合溶液３５ｍｌを添加して溶解させた後、飽和ヨウ化カリウム（ＫＩ）０．５ｍｌを添加して撹拌した後、５分間暗所に保管して反応させた。反応させたサンプルに蒸留水７５ｍｌを添加した後、１％澱粉溶液１ｍｌを添加して０．００５ＮＮａ_２Ｓ_２Ｏ_３（チオ硫酸ナトリウム）溶液で滴定した。過酸化物価は、澱粉による着色が消失する時を終結点にして、数式１によって求めた。結果は、表２に示した。

過酸化物価＝（Ａ−Ｂ）×Ｎ×１０００／Ｓ（数式１）
※ Ａ：試料に対する０．０１ＮＮａ_２Ｓ_２Ｏ_３標準溶液使用量（ｍｌ）
Ｂ：空試験群に対する０．０１ＮＮａ_２Ｓ_２Ｏ_３標準溶液使用量（ｍｌ）
Ｎ：０．００５ＮＮａ_２Ｓ_２Ｏ_３標準溶液の力価
Ｓ：試料採取量（ｍｌ）

表２に示されたように、本発明の没食子酸共役リノール酸脂肪エステルは、保存初期（４．４０）から保存期間にわたって終始低い過酸化物価を示した。しかし、本発明の没食子酸共役リノール酸脂肪エステルを胃酸の条件下で反応させた場合は、保存期間の経過によって過酸化物価が急激に増加することが分かった。

４．脂肪酸変敗度測定（2-Thiobarbituric acid reactive substances, TBARS）
脂肪酸変敗度は、ＴＢＡＲＳ値で測定した。試料は、油硫化物に１０００ｐｐｍの濃度になるように希釈した後、分析用試料として使用した。

油硫化物は、蒸溜水に大豆油（２％）及びTritonX-100（０．２％）を添加した後に試料を添加してホモジナイザーで均質化した後、実験に使用した。試料５ｍｌに蒸溜水１５ｍｌ及びブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）（７．２％）５０μｌを添加した後、ホモジナイザー（ＤＩＡＸ９００、Ｈｅｉｄｏｌｐｈ社、ドイツ）を使用して均質化した。均質化した試料２ｍｌにチオバルビツール酸／卜リクロロ酢酸（thiobarbituric acid/trichloroacetic acid；ＴＢＳ／ＴＣＡ）４ｍｌを添加した後、混合した。混合した試料を沸騰した湯で１５分間反応させた後、氷水で１０分間冷却して遠心分離（６９８．７５ｘｇ、１５分）した。遠心分離した上清の５３２ｎｍにおける吸光度を測定した。結果は、表３に示した。

表３に示されたように、本発明の没食子酸共役リノール酸脂肪エステルのＴＢＡＲＳ値が最も低く、保存期間の経過による酸化進行速度も最も遅いことが分かった。しかし、本発明の没食子酸共役リノール酸脂肪エステルを胃酸の条件下で反応させた場合、保存初期にはＴＢＡＲＳ値が比較的高く測定されたが保存期間の経過に従い酸化進行速度が遅くなることが分かった。０．１モル没食子酸及び０．３モル共役リノール酸の場合、保存６日以後に変敗が急速に進行した。

以上のように、本発明の没食子酸共役リノール酸脂肪エステルは、０．１モル没食子酸、０．３モル共役リノール酸よりラジカル消去能に優れ、過酸化物価が低く、脂肪酸変敗度が低いことから、極めて優れた抗酸化効果を有することが理解される。

また、本発明の没食子酸共役リノール酸脂肪エステルは、人体の胃の環境でも抗酸化活性を完全に消失しないので、抗酸化効果に優れたものであることが分かる。

実験例２：本発明の没食子酸共役リノール酸脂肪エステルの抗菌効果
本発明の没食子酸共役リノール酸脂肪エステルの抗菌効果を調べるために、下記のような実験を遂行した。

１．菌株活性
本実験例においては、カビ（４種類）、酵母（１種類）、乳酸菌（１種類）及び病原性微生物（５種類）の計１１種類の微生物を使用した。

微生物のうち、細菌は、接種された斜面培地で１イノキュレーションループを取って、同じ液体培地１０ｍｌに接種して２４時間培養した培養液０．１ｍｌを取り、新しい培地１０ｍｌに接種して１８時間２次培養を行い、その培養液を実験に使用した。

酵母は、細菌と同じ方法で７２時間培養して実験に使用し、カビは平板培地に接種した後、７２時間培養して実験に使用した。
実験に使用した菌株と培地を表４に示した。

※ ＰＤＢ＆ＰＤＡ：ポテトデキストロースブロス＆ポテトデキストロース寒天培地（Difco）
ＭＲＳＢ＆ＭＲＳＡ：ラクトバシラスＭＲＳブロス＆ラクトバシラスＭＲＳ寒天培地（Difco）
ＴＳＢ＆ＴＳＡ：トリプティックソイブロス＆トリプティックソイ寒天培地（Difco）
ＮＢ＆ＮＡ：ニュートリエントブロス＆ニュートリエント寒天培地（Difco）

２．抗菌活性試験
本発明の没食子酸共役リノール酸脂肪エステルの抗菌活性試験は、ディスク拡散法（disc diffusion method）を使用した。

細菌及び酵母は、活性化させた培養液０．１ｍｌを、室温で一晩乾燥した寒天プレートに落とした後、均一に塗布した。カビは培地で７２時間培養して胞子を充分に形成させた後、滅菌された０．１％Tween８０溶液を使用して胞子懸濁液を製造した後、懸濁液０．１ｍｌを培地板に均一に塗布した。

本実験に使用した微生物は、各菌株による最適培地を使用し、実験に使用した菌株の初期濃度は、１０^７〜１０^８ＣＦＵ／ｍｌのレベルであった。

各試験菌株が接種された平板上に前記実施例で製造した没食子酸共役リノール酸脂肪エステル２０ｕｌを吸収させたろ紙（直径８．０ｍｍ）をおいて菌株に合った最適温度で７２時間培養した後、ディスク周囲に形成された透明地帯の大きさ（ｍｍ）で抗菌活性を測定した。
結果は、表５に示した。

表５に示されたように、本発明の没食子酸共役リノール酸脂肪エステルの抗菌効果は、カビ（アスペルギルス・フラバス、アスペルギルス・ウサミ、ムコ・ヒエマリス、ペニシリウム・ベルコサム）、乳酸菌（ロイコノストク・メセンテロイデス）及び細菌（リステリア・イバノバ）等、６種類の菌株で抗菌活性が見られ、その中でカビ及び一部細菌に対して抗菌活性が非常に優れていることが分かった。

３．本発明の没食子酸共役リノール酸脂肪エステルの濃度による抗菌効果
本発明の没食子酸共役リノール酸脂肪エステルの濃度による抗菌効果は、前記２のディスク拡散法を使用した抗菌活性試験で没食子酸共役リノール酸脂肪エステルに対して抗菌活性が観察された菌株のみを対象にして測定した。

滅菌された培地に一定濃度の０．１モル没食子酸、０．３モル共役リノール酸及び前記実施例で製造した没食子酸共役リノール酸脂肪エステルを添加した後、活性化させた微生物培養液をそれぞれの培地に１％（ｖ／ｖ）ずつ接種し、７２時間培養して標準寒天培養法を使用して測定した。

酵母、カビ及び細菌の生菌数は、各菌株の最適培地及び最適温度で７２時間培養した後、コロニーを計数し、試料１ｍｌ当りのコロニー形成単位（colony forming unit；ＣＦＵ）で現わした。ここで、没食子酸共役リノール酸脂肪エステルを溶解するために使用したエチルアルコール自体の抗菌力を排除するために、処理濃度と同じ濃度でエチルアルコールのみを添加したものを対照群にし、検出のための最小計数限界サイズは、１０１ＣＦＵ／ｍｌであった。
結果は、表６に示した。

表６に示されたように、本発明の没食子酸共役リノール酸脂肪エステルは、１０００ｐｐｍ添加した場合、カビに対して１〜２log程度増殖を抑制し、１００００ｐｐｍ添加した場合、アスペルギルス・ウサミ及びムコ・ヒエマリスに対して増殖を完全に抑制した。また、乳酸菌ロイコノストク・メセンテロイデスに対しては、１０００ｐｐｍ及び１００００ｐｐｍ添加して培養した結果、増殖を完全に抑制した。また、細菌（リステリア・イバノバ）に対しては、１００００ｐｐｍ添加して培養した時、増殖を完全に抑制した。

したがって、本発明の没食子酸共役リノール酸脂肪エステルは、０．１モル没食子酸及び０．３モル共役リノール酸より抗菌効果が優れていることが分かる。

実験例３：本発明の没食子酸共役リノール酸脂肪エステルの抗炎症効果
本発明の没食子酸共役リノール酸脂肪エステルの抗炎症効果を調べるために、下記の実験を遂行した。

シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）酵素は、アラキドン酸を基質にしてプロスタグラジンを生合成する一番目及び二番目の過程に存在する。本酵素には、二つの形態が存在する。まず、ＣＯＸ−１は、組織的に発現して正常生理機能を維持する役目をし、この酵素によって生産されたプロスタグランジンは保護の役割を果たす。ＣＯＸ−２は、マイトジェン（mitogen）、癌遺伝子、腫瘍プロモーター、成長因子等、外部刺激によって影響を受けて発現する。ＣＯＸ−２は、炎症に関与するアイソフォームで、ＣＯＸ−２の誘導は炎症が発生する部位においてプロスタグランジンの産生を惹起する。したがって、ＣＯＸ−２に対する選択的抑制は、非ステロイド系抗炎症薬のような治療効果をもたらす。セレブレックス（商品名）（Celecoxib）、バルデコキシブ（Valdecoxib）、パレコキシブ（Parecoxib）、ロフェコキシブ（Rofecoxib）、エトリコキシブ（Etoricoxib）、ルミラコキシブ（Lumiracoxib）等のようないくつかの選択的ＣＯＸ−２抑制剤が臨床で使われている。これらは主にリューマチ関節炎または骨関節炎の炎症抑制剤として使われている。また、ＣＯＸ−２抑制剤は、癌防止及び治療剤またはアルツハイマーやパーキンソン病の危険を抑制するのにも使われることがある。しかし、このようなＣＯＸ−２抑制剤を使用した市販の薬物は多くの副作用を引き起こす。また、ＣＯＸ−２発現遺伝子を欠損させたマウス（ＣＯＸ−２ノックアウトマウス）も炎症を発現すると報告されていて（Buttar,N.S., Wang,K.K. The "aspirin" of the new millennium: cyclooxygenase-2 inhibitors. Mayo. Clin. Proc. 2000年, 第75巻, P.1027-1038）、また、ＣＯＸ−１とＣＯＸ−２の二つの酵素がどちらも炎症作用に関与していて、いずれのＣＯＸ酵素がこの作用にさらに寄与するかは、炎症の形態、発現部位そして炎症発現刺激によって変わると報告されている（Hu, K.O. Cyclooxygenase-2(COX-2)-prostanoid pathway and liver diseases. Prostaglandins,Leukotrienes and Essential Fatty acids, 2003年, 第69巻, P.329-337）。

ＣＯＸ−１とＣＯＸ−２の抑制効果は、ＣＯＸ阻害剤スクリーニングキット（Catalog No.560131, Cayman Chemicals, Ann Arbor, ミシガン、アメリカ）を使用してプロスタグラジンＥ_２（ＰＧＥ_２）を測定することにより求めた。

１００ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液［ｐＨ8.0、１μＭヘム及びＣＯＸ−１（ヒツジ）または、ＣＯＸ−２（ヒト組換え）含有］を１０分間３７℃恒温水槽で予めインキュベートした後、１０μｌのアラキドン酸を注入することにより反応を開始させた。ここで、反応溶液の最終濃度は、１００μＭであった。２分後、１ＭＨＣｌを注入して反応を終了させ、ＰＧＥ_２をＥＬＩＳＡ法によって定量した。試料は、ＤＭＳＯと蒸留水に溶解した後、１００ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）を使用して濃度を調整した。マウス反応溶液を、抗ウサギＩｇＧがコーティングされた９６ウェルプレートに移した後、プロスタグランジンアセチルコリンエステラーゼトレーサーと１次抗体（マウス抗ＰＧＥ_２）を添加した。プレートを室温で１２時間放置した後、反応溶液を除去して０．０５％Tween２０を含んだ１０ｍＭリン酸塩緩衝液で洗浄した。エルマン試薬（Ellman’s reagent、２００μｌ）を各ウェルに添加した後、遮光した状態で室温で６０分間放置して対照群ウェルの４１２ｎｍにおけるＯＤ値が０．３〜０．８になるようにした。ＰＧＥ_２を使用した標準曲線を描いた後、試料が添加されたウェルを使用して定量分析した。結果は、抑制効果として対照群（溶媒だけを含んだ試料）に対する処理群の百分率で示した。また、ＩＣ_５０値も下記の数式２によって求めた。
結果は、表７に示した。

ＣＯＸ−１（またはＣＯＸ−２）阻害率（％）＝［（Ｉｃ−Ｓｃ）／Ｉｃ］×１００
（数式２）
※ Ｉｃ：試料処理前ＰＧｓ（プロスタグラジン）の濃度
Ｓｃ：試料処理後ＰＧｓ（プロスタグラジン）の濃度
ＣＯＸ−１に対する試料処理の前ＰＧｓの濃度（Ｉｃ）＝３．４４
ＣＯＸ−２に対する試料処理の前ＰＧｓの濃度（Ｉｃ）＝２．１８

本発明の没食子酸共役リノール酸脂肪エステルのシクロオキシゲナーゼ阻害効果（抗炎症効果）

表７に示されたように、本発明の没食子酸共役リノール酸脂肪エステルは、１０μＭの低い濃度でＣＯＸ−１酵素阻害率が７４％であり、またＣＯＸ−２酵素阻害率も３２％であり、高い抗炎症効果を有することが明らかになった。このような抗炎症効果は、現在抗炎症剤として使われているセレブレックスより高い効果である。

ムリア（Ｍｕｒｉａｓ）等によれば、セレブレックスはＣＯＸ−１阻害率が５０％（ＩＣ_５０）になるために１９μＭ、ＣＯＸ−２の場合には３５ｎＭの濃度が必要だと記載している［Murias et al., Resveratrol analogues as selective cycloxygenase-2 inhibitors: synthesis and structure-activity relationship. Bioorganic & Medical Chemistry、2004年、第12巻、 P.5571-5578］。前記セレブレックスのＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２のＩＣ_５０と本発明の没食子酸共役リノール酸脂肪エステルのＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２のＩＣ_５０とを比べると、セレブレックスのＣＯＸ−１のＩＣ_５０は１９μＭであるのに比べて、本発明の没食子酸共役リノール酸脂肪エステルのＣＯＸ−１のＩＣ_５０は１０ｎＭ（０．０１μＭ）であり、９００倍以上高い阻害率を示した。また、セレブレックスのＣＯＸ−２のＩＣ_５０は３５ｎＭ、一方、本発明の没食子酸共役リノール酸脂肪エステルのＣＯＸ−２のＩＣ_５０は６．２μＭで、９００倍以上高い阻害率を示した。

したがって、本発明の新規な没食子酸リノール酸脂肪エステルは、ＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２阻害作用に優れているため、リューマチ関節炎、骨関節炎及びその他炎症に効果的であることが分かる。

実験例４：本発明の没食子酸共役リノール酸脂肪エステルの肌美白効果
本発明の没食子酸共役リノール酸脂肪エステルの肌美白効果を調べるために、チロシナーゼ阻害率を測定した。

チロシナーゼ阻害実験は、１００ｕｎｉｔ／ｍｌのキノコチロシナーゼ０．２ｍｌ、基質として１０ｍＭのＤＯＰＡ（Ｌ−3,4−ジヒドロキシフェニルアラニン）０．４ｍｌ、リン酸塩緩衝液（０．０７Ｍ、ｐＨ６．８）０．２ｍｌの混合液に試料溶液０．２ｍｌを添加して、３７℃、３０分間反応させて４７５ｎｍにおける吸光度を測定した。ドーパクロムの変化を試料溶液無添加群及び試料溶液添加群の吸光度の差から阻害率に換算して表８に示した。

表８に示されたのように、本発明の没食子酸共役リノール酸脂肪エステルのチロシナーゼ阻害率は６３．５％と高いことが明らかになった。したがって、本発明の没食子酸共役リノール酸脂肪エステルは、肌美白用化粧品の成分として有用である。

本発明の組成物の製剤例を下記に例示する。
製剤例１：薬学的製剤の製造

１．散剤
化学式１の没食子酸共役リノール酸脂肪エステル２ｇ
乳糖１ｇ
前記の成分を混合して気密容器に充填して散剤を製造した。

２．錠剤
化学式１の没食子酸共役リノール酸脂肪エステル５００ｍｇ
とうもろこし澱粉１００ｍｇ
乳糖１００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム２ｍｇ
前記の成分を混合した後、通常の錠剤の製造方法にしたがって打錠して錠剤を製造した。

３．カプセル剤
化学式１の没食子酸共役リノール酸脂肪エステル５００ｍｇ
とうもろこし澱粉１００ｍｇ
乳糖１００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム２ｍｇ
前記の成分を混合した後、通常のカプセル剤の製造方法にしたがってゼラチンカプセルに充填してカプセル剤を製造した。

４．注射製剤
化学式１の没食子酸共役リノール酸脂肪エステル５００ｍｇ
クエン酸塩緩衝液ｐＨ３．５に維持
デキストロースアイソトニック
滅菌処理された２０ｍｌ注射用バイアルに前記実施例で製造した没食子酸共役リノール酸脂肪エステル、クエン酸ナトリウム、クエン酸およびデキストロースを充填した後、アルミキャップを使って密封した。使用時、注射用蒸留水を使用して上の混合物を溶解した後、適当な体積の注射用水溶液になるよう希釈して製造した。

製剤例２：飲料の製造
１．炭酸飲料
砂糖５〜１０重量％、クエン酸０．０５〜０．３重量％、カラメル０．００５〜０．０２重量％、ビタミンＣ０．１〜１重量％の添加物を混合して、ここに７９〜９４重量％の精製水を混ぜてシロップを作り、前記シロップを化学式１の没食子酸共役リノール酸脂肪エステルと混合し、８５〜９８℃で２０〜１８０秒間殺菌して、冷却水と１：４の割合で混合した後、炭酸ガスを０．５〜０．８２重量％注入して炭酸飲料を製造した。

２．健康飲料
液状果糖（０．５重量％）、オリゴ糖（２重量％）、砂糖（２重量％）、食塩（０．５重量％）、および水（７５重量％）と化学式１の没食子酸共役リノール酸脂肪エステルを均一に配合して瞬間殺菌をした後、これをガラス瓶、ペットボトル等の小包装容器に包装して健康飲料を製造した。

３．野菜ジュース
化学式１の没食子酸共役リノール酸脂肪エステル０．５ｇをトマトまたはニンジンジュース１０００ｍｌに加えて健康増進用野菜ジュースを製造した。

４．果物ジュース
化学式１の没食子酸共役リノール酸脂肪エステル０．１ｇをリンゴまたはブドウジュース１０００ｍｌに加えて健康増進用果物ジュースを製造した。

製剤例３：化粧料組成物の製造
１．ソフトナー（含量：重量％）
化学式１の没食子酸共役リノール酸脂肪エステル０．０１
グリセリン３．０
ブチレルグリコール２．０
プロピレングリコール２．０
カルボキシビニルポリマー０．１
エチルアルコール１０．０
トリエチルアルコールアミン０．１
防腐剤、微量色素、微量香料、微量精製水残液合計１００．０

２．栄養化粧水（含量：重量％）
化学式１の没食子酸共役リノール酸脂肪エステル０．０１
蜜蝋４．０
ポリソルベート６０１．５
セスキオレイン酸ソルビタン０．５
流動パラフィン５．０
スクアレン５．０
トリ（カプリル酸／カプリン酸）グリセリル５．０
グリセリン３．０
ブチレングリコール３．０
プロピレングリコール３．０
カルボキシビニルポリマー０．１
トリエチルアルコールアミン０．２
防腐剤、微量色素、微量香料、微量精製水残液合計１００．０

３．栄養クリーム（含量：重量％）
化学式１の没食子酸共役リノール酸脂肪エステル０．００５
蜜蝋１０．０
ポリソルベート６０１．５
セスキオレイン酸ソルビタン０．５
流動パラフィン１０．０
スクアレン５．０
トリ（カプリル酸／カプリン酸）グリセリル５．０
グリセリン５．０
ブチレングリコール３．０
プロピレングリコール３．０
トリエチルアルコールアミン０．２
防腐剤、微量色素、微量香料、微量精製水残液合計１００．０

４．マッサージクリーム（含量：重量％）
化学式１の没食子酸共役リノール酸脂肪エステル０．００５
蜜蝋１０．０
ポリソルベート６０１．５
セスキオレイン酸ソルビタン０．８
流動パラフィン４０．０
スクアレン５．０
トリ（カプリル酸／カプリン酸）グリセリル４．０
グリセリン５．０
ブチレングリコール３．０
プロピレングリコール３．０
トリエチルアルコールアミン０．２
防腐剤、微量色素、微量香料、微量精製水残液合計１００．０

５．パック（含量：重量％）
化学式１の没食子酸共役リノール酸脂肪エステル０．００５
ポリビニルアルコール１３．０
カルボキシメチルセルロースナトリウム０．２
アラントイン０．１
エチルアルコール５．０
ノニルフェニルエーテル０．３
防腐剤、微量色素、微量香料、微量精製水残液合計１００．０

本発明の没食子酸共役リノール酸脂肪エステルは、電子供与能（ラジカル消去）に優れ、過酸化物価が低く、脂肪酸変敗度が低いので、優れた抗酸化効果を有する。また、カビと細菌に対して抗菌活性が優れており、ＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２阻害作用に優れているため、優れた抗炎症効果を有するとともに、、さらに、高いチロシナーゼ阻害作用を有するので肌美白効果にも優れている。
したがって、本発明の組成物は、抗酸化、抗菌、抗炎症及び肌美白に有用に使用できることから、化粧料や医薬品として応用が期待される。

本発明の没食子酸共役リノール酸脂肪エステルの薄膜クロマトグラフィーに展開した結果を示した図である。本発明の没食子酸共役リノール酸脂肪エステルの赤外線分光光度計測定結果を示した図である。

Claims

下記化学式１
式中、
Ｒ_１ないしＲ_４は、それぞれ独立に水素または共役リノール酸であり、
ここで、共役リノール酸は、９−シス,１１−トランスオクタデセン酸；９−トランス,１１−シスオクタデセン酸；１０−シス,１２−トランスオクタデセン酸；または、１０−トランス,１２−シスオクタデセン酸である（但し、Ｒ_１ないしＲ_４がすべて水素の場合は除く）、
で表される、没食子酸共役リノール酸脂肪エステル。
１）没食子酸と共役リノール酸を１：３のモル比で有機溶媒に溶解させた後、塩基を添加して反応させる工程、及び
２）工程１）で得られた反応混合物にエチルアセテートを添加して層分離をさせた後、上層液を回収して濃縮する工程
を含む、請求項１に記載の没食子酸共役リノール酸脂肪エステルを製造する方法。
工程１）において、有機溶媒が、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミドおよびアセトニトリルからなる群から選択されることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
工程１）において、塩基が、トリエチルアミン及び1,3−ジシクロヘキシルカルボジイミドであることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
請求項１に記載の没食子酸共役リノール酸脂肪エステルを含む、抗酸化用組成物。
請求項１に記載の没食子酸共役リノール酸脂肪エステルを含む、抗菌用組成物。
請求項１に記載の没食子酸共役リノール酸脂肪エステルを含む、抗炎症用組成物。
組成物がリューマチ関節炎または骨関節炎の予防及び治療に有用であることを特徴とする、請求項７に記載の抗炎症用組成物。
請求項１に記載の没食子酸共役リノール酸脂肪エステルを含む、肌美白用組成物。