CN111593138A

CN111593138A - 一种鸭乙型肝炎病毒重组聚合酶等温扩增检测方法

Info

Publication number: CN111593138A
Application number: CN201910894805.8A
Authority: CN
Inventors: 马秀丽; 朱蕴暖; 刘娜; 黄兵; 刘存霞; 胡峰; 郭效珍; 李玉峰; 于可响; 宋敏训; 艾武; 亓丽红
Original assignee: Jiangsu Institute Poultry Sciences
Current assignee: Jiangsu Institute Poultry Sciences
Priority date: 2019-09-20
Filing date: 2019-09-20
Publication date: 2020-08-28

Abstract

本发明公开了一种鸭乙型肝炎病毒重组聚合酶等温扩增检测方法，以及专用的RPA引物对(如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示)、试剂盒。本发明根据鸭乙型肝炎病毒的基因序列设计特异性引物，进一步优化建立了用于快速准确进行鸭乙型肝炎病毒检测的重组酶聚合酶等温扩增方法。该方法可特异性地检测出鸭乙型肝炎病毒，其最低检出模板量为146pg，灵敏度与传统PCR相当。由于整个基因扩增只需一个温度，不需要特殊的仪器设备，操作更简单、快速，适用于生产中鸭乙型肝炎病毒的现场快速检测。

Description

一种鸭乙型肝炎病毒重组聚合酶等温扩增检测方法

技术领域

本发明涉及一种鸭乙型肝炎病毒重组聚合酶等温扩增检测方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术

乙型肝炎病毒(HBV)感染是全球性的一个主要公共卫生问题。由于HBV宿主范围狭窄，有明显嗜肝性和种属特异性，人工培养HBV尚未成功，建立较理想的HBV感染细胞及动物模型也很困难，已成为限制抗HBV药物开发和评价的主要障碍。而鸭乙型肝炎病毒(DHBV)与HBV同属嗜肝DNA病毒科，两者在形态结构、核酸组成、生物学特性、发病机理和相对嗜肝性等方面有众多相似之处，同时鸭对DHBV易感，且来源丰富，价格低廉，易于饲养，常被用作抗HBV药物筛选及HBV致病机理研究的理想动物模型。因此，及时掌握鸭群乙型肝炎的流行现状及感染情况是十分必要的。

目前对DHBV DNA进行检测的方法较多，其中Southern blot杂交、斑点杂交等方法灵敏性较低、稳定性差、操作复杂，已不常用。聚合酶链式反应(PCR)、实时荧光定量PCR等技术应用广泛，但这些技术需依赖于控温准确的热循环仪器，限制了其在临床现场检测中的应用。而核酸恒温扩增技术不需反复热变性，无需特殊仪器，反应速度更快，适合现场快速检测，在生命科学研究领域已被广泛应用。

重组酶聚合酶扩增技术(RPA)是一种新型恒温扩增技术，它具有操作简单、特异性强、灵敏度高、检测时间短等优点，并且可以在非实验室的条件下完成核酸扩增。利用RPA技术可以对核酸拷贝数进行绝对定量并且可以同时检测多个靶标核酸序列，目前在病原学检测领域应用特别广泛。但迄今尚未见采用RPA技术检测鸭乙型肝炎病毒的报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种鸭乙型肝炎病毒重组聚合酶等温扩增检测方法，以及所用到的特异性引物、检测试剂盒。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种检测鸭乙型肝炎病毒的RPA引物对，包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列如下所示，如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；其所特异性扩增的遗传标记物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

上游引物F：5’-GCCTTAGCCAATGTGTATGA-3’(SEQ ID NO.1)；

下游引物R：5’-GGTGGAACAGGAGTAGTAGT-3’(SEQ ID NO.2)。

上述RPA引物对在制备检测鸭乙型肝炎病毒的试剂盒中的应用。

遗传标记物在制备检测鸭乙型肝炎病毒的试剂盒中的应用，所述遗传标记物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

一种检测鸭乙型肝炎病毒的试剂盒，包括上述RPA引物对，以及检测所必须的试剂，如Rehydration Buffer、ddH₂O和MgAc。

一种鸭乙型肝炎病毒重组聚合酶等温扩增检测方法，包括以下步骤：

(1)提取待测物的基因组DNA(参照EasyPure@ViralDNA/RNA Kit试剂盒说明书)，利用RPA引物对进行重组聚合酶等温扩增，所述RPA引物对包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列如如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，其所特异性扩增的遗传标记物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

(2)将上述扩增产物进行电泳，观察是否出现239bp条带；若出现239bp条带，则判断为鸭乙型肝炎病毒阳性，若未出现239bp条带，则判断为鸭乙型肝炎病毒阴性。

进一步地，所述步骤(1)中，重组聚合酶等温扩增的反应体系包括：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的RPA引物各1.2μL，Rehydration Buffer 29.5μL，模板3μL，ddH₂O 12.6μL，MgAc 2.5μL。

进一步地，所述步骤(1)中，重组聚合酶等温扩增的条件为：40℃反应25min。

进一步地，所述步骤(2)中，进行电泳的具体方式为：取5μL重组聚合酶等温扩增的产物，加入2％琼脂糖凝胶中进行电泳。

本发明的检测鸭乙型肝炎病毒的方法，不仅可以用于鸭乙型肝炎病毒的检测，还可以用于流行病学的调查、鸭乙型肝炎病毒治疗药物的筛选等。

本发明提供了用于检测鸭乙型肝炎病毒的遗传标记物，并根据该遗传标记物设计了RPA引物对，具有非常好的特异性。利用本发明的RPA引物对，本发明进一步优化建立了适于快速准确进行鸭乙型肝炎病毒检测的等温扩增检测方法，最低检出模板量为146pg，灵敏度与传统PCR相当。该方法操作简单、快速，适用于临床生产和实验室的快速诊断。

本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。

附图说明

图1：鸭乙型肝炎病毒重酶聚合酶等温扩增检测方法特异性试验电泳结果(引物对1)；其中，M-标准DNA分子量2000；1、鸭乙型肝炎病毒；2、1型鸭甲肝病毒(DHAV-1)；3、3型鸭甲肝病毒(DHAV-3)；4鸭瘟病毒(DPV)；5、鸭源大肠杆菌(E.coli)；6、鸭源新城疫病毒(NDV)；7、鸭源H9亚型禽流感病毒(AIV-H9)；8、鸭疫里默氏杆菌(RA)。

图2：鸭乙型肝炎病毒重酶聚合酶等温扩增检测方法灵敏度试验电泳结果；其中，M：标准DNA分子量2000；1：14.6ng；2：1.46ng；3：146pg；4：14.6pg；5：1.46pg。

图3：鸭乙型肝炎病毒重酶聚合酶等温扩增检测方法特异性试验电泳结果(引物对2)；其中，M-标准DNA分子量2000；1、鸭乙型肝炎病毒；2、1型鸭甲肝病毒(DHAV-1)；3、3型鸭甲肝病毒(DHAV-3)。

图4：鸭乙型肝炎病毒重酶聚合酶等温扩增检测方法特异性试验电泳结果(引物对3)；其中，M-标准DNA分子量2000；1、鸭乙型肝炎病毒；2、1型鸭甲肝病毒(DHAV-1)；3、3型鸭甲肝病毒(DHAV-3)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。

本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。

正如背景技术部分所介绍的，对于鸭乙型肝炎病毒的检测，传统方法稳定性差，灵敏度低，且费时费力，常规PCR或荧光定量PCR方法的整个过程大概需要2～4个小时出结果，而且需要精密昂贵的仪器和试剂，不利于条件相对落后的基层开展简便、快速的分子诊断。基于此，本发明提供了一种鸭乙型肝炎病毒重组聚合酶等温扩增检测方法，以实现基层对鸭乙型肝炎病毒的快速、灵敏检测。

RPA扩增的关键在于引物的设计，但RPA不同于常规的PCR反应，目前尚无用于引物设计的软件或成熟的设计原则，也没有大量的数据为其引物设计提供依据，因此，本发明设计了3对引物，通过优化筛选出一对最佳引物。

另外，在进行RPA引物设计时，靶标区域的选择也非常关键，靶标区域的长度直接影响鸭乙型肝炎病毒检测的特异性，若靶标区域过短，则会导致特异性不足，无法将鸭乙型肝炎病毒与鸭的其他病原区分开；若靶标区域过长，虽然特异性好，但设计能够扩增长片段的引物的难度较大，而且，长片段的扩增过程中容易出现差错。本发明通过对NCBI中已报道的40株鸭乙型肝炎病毒的C、S基因序列进行比对，分别选取核心抗原基因C和表面抗原基因S作为靶基因设计引物,经多次试验验证发现，以SEQ ID NO.3所示的序列作为靶标区域，其特异性好，片段长度适中，方便进行引物设计，其余靶基因设计的引物特异性差些(图3和图4)。最终确定了鸭乙型肝炎病毒特异性的保守靶序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，该靶序列是检测鸭乙型肝炎病毒的遗传性标记物，具体如下：

5’-gccttagccaatgtgtatgatctaccagatgatttctttccaaaaatagatgatcttgttagagatgctaaa gacgctttagagccttattggaaatcagattcaataaagaaacatgttttgattgcaactcactttgtggatcttattga agacttttggcagactacacagggcatgcatgaaatagccgaatcattaagagctgttatacc tcccactactactcctg ttccacc-3’(SEQ ID NO.3)。

根据本发明优选的靶标区域，本发明进行了RPA引物设计，在本发明的一个优选的实施方案中，所设计的RPA引物对如下：

上游引物F：5’-GCCTTAGCCAATGTGTATGA-3’(SEQ ID NO.1)；

下游引物R：5’-GGTGGAACAGGAGTAGTAGT-3’(SEQ ID NO.2)。

上述RPA引物对的特异性好，所扩增的片段位于鸭乙型肝炎病毒C基因的第22-260位点之间，大小为239bp。

基于上述RPA引物对构建的RPA体系可以实现对鸭乙型肝炎病毒的快速、灵敏检测。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，其中，DNA MarkerDL2000、TRIZOL、DEPC均购自TaKaRa公司(大连)；HiscripIIOne Step RT-PCR Kit购自Vazyme公司；TwistAmp DNA Amplification Kits购自TwistDX公司。其他未进行具体说明的均可通过商业渠道购买得到。

本发明实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规的条件，或按照仪器或试剂制造厂商所建议的条件进行操作。

实施例1：引物的设计与优化

1.引物的设计：

本实施例通过对NCBI中已报道的40株鸭乙型肝炎病毒的C、S基因序列进行比对，选取鸭乙型肝炎病毒C、S基因的保守区设计了一系列的RPA引物，具体见表1。

表1：针对鸭乙型肝炎病毒C、S基因的保守区设计的RPA引物

利用RPA扩增反应对表1中的引物进行筛选，选择标准鸭乙型肝炎病毒血清样品，提取病毒DNA作为模板，进行RPA检测，具体步骤如下：

参照EasyPure@ViralDNA/RNA Kit试剂盒说明书提取鸭乙肝肝炎病毒样品的DNA模板，按照TwistAmp DNA Amplification Kits试剂盒操作说明进行RPA反应体系：上、下游引物(20μmol/μL)各1.2μL，Rehydration Buffer 29.5μL，Template 3μL，ddH₂O 12.6μL。漩涡混匀，离心。加入2.5μL 280mM MgAc，混匀。放入水浴锅，40℃作用25min。反应结束后于2％琼脂糖凝胶电泳，120V，30min，观察结果。

2.引物的优选结果：

采用表1中所设计的RPA引物对进行RPA扩增后，通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果发现，引物对1(F1/R1)的扩增效果最好，条带特异性好，没有非特异性扩增。而其他的引物对出现非特异性扩增、引物的扩增效率低等问题(图3和图4)。因此，选择引物对1(F1/R1)进行后续的RPA反应条件优化、特异性和敏感性试验。

实施例2：RPA反应条件的优化

分别对引物对1中引物F1和R1的使用量进行优化，优化结果表明，引物F1和R1的浓度均为20μmol/μL，使用量均为1.2μL时，其效果最好。另外，还针对MgAc的使用量设置了6个浓度梯度，在RPA体系中加入浓度为280mM MgAc的量分别为0.5μL、1μL、1.5μL、2μL、2.5μL和3μL，结果显示，MgAc用量过少将导致扩增的失败，反应体系中加入1.5μL、2μL、2.5μL和3μLMgAc时可以得到扩增产物，当MgAc用量为2.5μL时扩增效果最佳。

经优化后的RPA反应体系为：上、下游引物(20μmol/μL)各1.2μL，RehydrationBuffer29.5μL，Template 3μL，ddH₂O 12.6μL，280mM MgAc 2.5μL。

另外，还对RPA反应时间和反应温度进行优化，结果发现，反应温度为40℃，作用25min时，RPA扩增效率最高。

本发明优化后的RPA反应条件，其整个基因扩增过程只需一个温度，不需要特殊的仪器设备，操作更简单，适用于生产中鸭乙型肝炎病毒的现场快速检测。

实施例3：特异性试验

分别用鸭乙型肝炎病毒、1型鸭甲肝病毒(DHAV-1)、3型鸭甲肝病毒(DHAV-3)、鸭瘟病毒(DPV)、鸭源大肠杆菌(E.coli)、鸭源新城疫病毒(NDV)、鸭源H9亚型禽流感病毒(AIV-H9)和鸭疫里默氏杆菌(RA)的DNA/cDNA模板，按实施例2优化后的反应条件进行RPA，通过凝胶电泳检测。实验结果如图1所示，只有鸭乙型肝炎病毒为阳性，其他的均为阴性，说明本发明的RPA检测体系特异性良好。

实施例4：灵敏度试验

选择标准鸭乙型肝炎病毒血清样品，参照EasyPure@ViralDNA/RNA Kit试剂盒说明书提取待测样品的DNA模板，进行10^-1～10^-5倍梯度稀释，按实施例2优化后的反应条件进行RPA检测。结果为：本发明RPA方法最低检出模板量为146pg(图2)；与常规PCR方法的灵敏度一致，但显然，本发明的检测方法更为简单简单、快速，尤其适于现场检测，对实验条件的要求更宽松。

实施例5：临床样品检测

1.样本处理：

收集临床鸭血清样品，参照EasyPure@ViralDNA/RNA Kit试剂盒说明书提取待测样品的DNA模板。

2.重组酶聚合酶扩增：

按照TwistAmp DNA Amplification Kits试剂盒操作说明进行，RPA反应体系：上、下游引物(20μmol/μL)各1.2μL(上、下游引物的序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示)，Rehydration Buffer 29.5μL，Template 3μL，ddH₂O 12.6μL。漩涡混匀，离心。加入2.5μL 280mM MgAc，混匀。放入水浴锅，40℃作用25min。反应结束后于2％琼脂糖凝胶电泳，120V，30min，观察结果。

3.结果判断：

检测样品中若出现239bp条带，则判断为鸭乙型肝炎病毒阳性，若未出现239bp条带，则判断为鸭乙型肝炎病毒阴性。

收集不同地方不同年份的临床样品75份，同时用RPA方法与常规RT-PCR方法进行检测比较，结果两种方法检出共同阳性数19份，共同阴性数56份，两者符合率100％。试验结果见表2。

表2不同方法用于临床样品检测的符合率比较

由表2可以看出，采用本发明的RPA方法检测鸭乙型肝炎病毒，具有很高的灵敏度、特异性，与常规RT-PCR方法的符合率达100％；该方法无需特殊仪器，反应速度更快，更适合现场快速检测。

给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。

序列表

<110> 山东省农业科学院家禽研究所

<120> 一种鸭乙型肝炎病毒重组聚合酶等温扩增检测方法

<140> 2019108948058

<141> 2019-09-20

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

gccttagcca atgtgtatga 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

ggtggaacag gagtagtagt 20

<210> 3

<211> 239

<212> DNA

<213> Hepatitis B virus

<400> 3

gccttagcca atgtgtatga tctaccagat gatttctttc caaaaataga tgatcttgtt 60

agagatgcta aagacgcttt agagccttat tggaaatcag attcaataaa gaaacatgtt 120

ttgattgcaa ctcactttgt ggatcttatt gaagactttt ggcagactac acagggcatg 180

catgaaatag ccgaatcatt aagagctgtt atacctccca ctactactcc tgttccacc 239

Claims

1.一种检测鸭乙型肝炎病毒的RPA引物对，包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列如下所示，如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；

上游引物F：5’-GCCTTAGCCAATGTGTATGA-3’；

下游引物R：5’-GGTGGAACAGGAGTAGTAGT-3’。

2.权利要求1所述的RPA引物对在制备检测鸭乙型肝炎病毒的试剂盒中的应用。

3.遗传标记物在制备检测鸭乙型肝炎病毒的试剂盒中的应用，所述遗传标记物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.一种检测鸭乙型肝炎病毒的试剂盒，包括权利要求1所述的RPA引物对，以及检测所必须的试剂。

5.根据权利要求4所述的检测鸭乙型肝炎病毒的试剂盒，其特征在于：所述检测所必须的试剂包括：Rehydration Buffer、模板、ddH₂O和MgAc。

6.权利要求5所述的试剂盒在检测鸭乙型肝炎病毒中的应用。

7.一种鸭乙型肝炎病毒重组聚合酶等温扩增检测方法，包括以下步骤：

(1)提取待测物的基因组DNA，利用RPA引物对进行重组聚合酶等温扩增，所述RPA引物对包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列如如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；

8.根据权利要求7所述的鸭乙型肝炎病毒重组聚合酶等温扩增检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中，重组聚合酶等温扩增的反应体系包括：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的RPA引物各1.2μL，Rehydration Buffer 29.5μL，模板3μL，ddH₂O 12.6μL，MgAc 2.5μL。

9.根据权利要求7所述的鸭乙型肝炎病毒重组聚合酶等温扩增检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中，重组聚合酶等温扩增的条件为：40℃反应25min。

10.根据权利要求7所述的鸭乙型肝炎病毒重组聚合酶等温扩增检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中，进行电泳的具体方式为：取5μL重组聚合酶等温扩增的产物，加入2％琼脂糖凝胶中进行电泳。