JP2004528801A - 増加的切断短縮化核酸及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

多数の修飾核酸及びハイブリッドポリペプチドを創作するために、核酸の増加的短縮化を利用する一連の方法が記載される。所定核酸配列の複数の実質的にすべての可能な単一塩基対の欠失が引き起こされる。核酸配列相同性と無関係なシャッフルされた増加的短縮化核酸の製造方法も記載され、図１にも示される。これら方法は、タンパク質操作、タンパク質折りたたみ、タンパク質進化、及び新規なハイブリッドタンパク質及びポリペプチドの化学合成に使用できる。

Description

【０００１】
（関連出願に対するクロスレファレンス）
この出願は、仮出願第６０／１３５，４２９号（１９９９年５月２１日出願）及び仮出願第６０／１７２，２５号（１９９９年１２月１７日出願）の優先権を主張し、かつ２０００年５月１９日出願の米国特許出願第０９／５７５，３４５号の一部継続出願であり、これらはすべて参照によって本明細書に取り込まれる。
（政府の権利についての陳述）
この発明は、国立保健研究所から認可番号ＧＭ２４１２９及び国立保健研究所の博士号取得後特別奨学金認可番号ＧＭ１８５６０という形で米国政府の支援によって為された。米国政府は、この発明に特定の権利を有する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般的に核酸及びポリペプチド混合物に係り、さらに詳細には、ハイブリッド核酸及びハイブリッドポリペプチド製造のために増加的に核酸を短縮化（ｔｒｕｎｃａｔｅ）する方法、並びにそのハイブリッド核酸及びポリペプチド自体に関する。
【０００３】
（発明の背景）
タンパク質突然変異導入は、長くタンパク質の構造／機能研究のための手段として使用されてきた。タンパク質構造決定における最近のＤＮＡ操作技術及び進歩の到来により、多数のタンパク質配列及び構造が入手可能であり、構造の類似に基づいてグループ又はスーパーファミリーに分類することができる。このようなグループ化は、構造的に類似するタンパク質は、同様の反応を触媒し、かつ共通のアミノ酸残基を有する活性部位を持つことが多いことを示している。さらに、これらグループ化は、結合性及び触媒作用に重要である側鎖残基の同定を容易にし、かつ改変された特性を有するタンパク質を生成するような改変を可能とする。
【０００４】
点突然変異の導入、二次構造要素の交換、及び全ドメイン又はサブユニットの交換を通じた、このような構造に基づくタンパク質工学への合理的アプローチは、基質特異性、触媒特性及びオリゴマー状態を変えた酵素を生じさせた。ほとんどタンパク質工学の失敗は公表されていないが、合理的に酵素を操作して特異的機能を示すことの難しさは広く認識されている。野生型タンパク質に導入されるいずれの変更も、自然が達成してきた繊細なバランスを、しばしば予想外の方法で破壊してしまい、結果として不安定で、正しく折りたためず、触媒活性を失ってしまうようなタンパク質を生じさせる。厳密な合理的設計アプローチによって遭遇する困難性の結果として、進化プロセスを模倣する分子生物学戦略の使用を指向する傾向が高まっている。この戦略は、“定方向進化”として知られている。
【０００５】
ほとんどの定方向進化戦略は、ランダムな突然変異を遺伝子に導入した後、所望の特性のスクリーニング又は選択を行う。そして、所望特性が達成されるか又はさらなるサイクルが所望特性に何の改善も引き起こさなくなるまでサイクルを数回繰り返す。初期の方法論は、誤りがちなＰＣＲ、化学的突然変異又は大腸菌のミューテーター株によって引き起こされる点突然変異を利用した。このタイプのアプローチは、固定されつつある有益でない及び有益な突然変異による無性進化プロセスにいくらか似ている。このような戦略は、熱安定性の改善を達成すること、基質特異性を変更すること、及び有機溶媒中での活性を高めることで特に成功している。しかし、定方向進化は段階的なプロセスなので、配列空間において比較的小さい段階だけが生じうる。従って、新規な触媒部位を進化させるためには、おそらく配列空間における広範囲の探索を必要とし、現在の定方向進化方法論の有用性には限界がある。
【０００６】
自然の進化プロセスにより密接に近づく組換えの方法の到来は、定方向進化に非常に大きな影響を及ぼした。ＤＮＡシャッフリングのような種々の組換え法では、親遺伝子が断片化され、次いでＰＣＲによって再び集められて全長遺伝子が再構成される。この再集合プロセスの際、新しい点突然変異と一緒に親遺伝子の新規な組合せが生じる。この組換え又はシャッフリングアプローチは、変異遺伝子の大きなライブラリーを生成し、適切な選択又はスクリーニング系を使用することによって所望機能を示す遺伝子を得ることができる。
【０００７】
ＤＮＡ相同性を有する遺伝子ファミリーのシャッフリングが新しい特性を持ったハイブリッドタンパク質を製造できることは真実であるが、このような分子育種は、十分な遺伝的相同性を有する遺伝子だけにしか実現可能でなく、この理由のため、全く新規な機能を進化させそうもない。遺伝子ファミリーのシャッフリングで成功するための主要な理論的根拠は、ＤＮＡ相同性の度合ではなく、それらがコードするタンパク質の三次元構造の類似であると認めることが重要である。相同ファミリーについて成功する定方向進化は、同様に又はそれ以上に、ほとんど又は全く遺伝的相同性のない領域におけるファミリーメンバー間に交差を有する遺伝子の作製によって供されるかもしれない。しかし、現在のＤＮＡシャッフリング方法論は、十分に相同性のある領域内及び有意な同一性の延長範囲内でのみ交差を生じる。さらに、交差は最高の同一性の領域に向かって偏ってしまう。
【０００８】
入手可能なタンパク質構造の数が増え、かつ酵素の構造的ファミリーの研究により、ほとんど又は全くＤＮＡ相同性のない多くのタンパク質が高いタンパク質の構造的相同性を持ち得ることが分かってきた。このような構造的相同性のハイブリッドの構築は、たぶん新規な活性を操作するための重要な戦略だろう；しかし、このようなハイブリッド構築の組合せのアプローチは報告されていない。
【０００９】
何人かの発明者による研究は、ホルミルテトラヒドロ葉酸を用いた酵素の内部変換に焦点を当てた。別個のベクター上で発現される、全体としてほんの少ししか遺伝的相同性を持たない２つの酵素由来のドメインを融合することで機能性ハイブリッド酵素を操作することによって、活性なハイブリッドが作製された。別々のドメイン融合は、大腸菌ｐｕｒＮ遺伝子（ＧＡＲトランスホルミラーゼ）のグリシンアミドリボヌクレオチド（ＧＡＲ）結合ドメインと、大腸菌ｐｕｒＵ遺伝子（ホルミルテトラヒドロ−葉酸ヒドロラーゼ）のホルミル−テトラヒドロ葉酸結合及び触媒ドメインとの間で行われた。所望の特性（ＧＡＲトランスホルミラーゼ活性）を有するハイブリッド酵素が作製されたが、この活性は低かった。（Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒ，Ｎｉｘｏｎ，Ｓｈｉｍ，及びＢｅｎｋｏｖｉｃ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：３５６２−３５６７（１９９９）、参照によってその全体が本明細書に取り込まれる。）
【００１０】
従って、配列相同性を問わずにハイブリッド遺伝子を製造する方法が要望されている。核酸の単一塩基切断短縮化（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）の簡単で、わかりやすい生成法に対する要求がある。可能な切断短縮化部分のすべてではないにしても、その大部分にわたるハイブリッド遺伝子を作製する制御可能な方法も要望されている。このようなハイブリッド遺伝子形成を用いて、特徴又は機能性が改変された新規なハイブリッドタンパク質を作製する新しい方法を開発することも強く要望されている。
本発明は、このような方法を提供する。本発明は、配列相同性を問わない核酸ハイブリッドの作製を可能にする。本発明は、個々の及び複数のハイブリッド切断短縮化核酸、及び随伴する個々及び多数のハイブリッドポリペプチドのわかりやすい、制御可能な製造方法をも提供し、これらハイブリッドは、塩基の可能な組合せの実質的にすべてではないにしても、大部分をカバーする。
さらなる利益及び利点は、以下の開示から当業者には明かだろう。
【００１１】
（発明の簡単な要旨）
本発明は、増加的切断短縮化により修飾した核酸の製造方法に関する。この増加的切断短縮化修飾された核酸は、発現され、又は終止コドン、インテイン、組換えやすい部位、二量体化ドメイン、及び／又は他の増加的切断短縮化修飾核酸のような他の核酸配列に結合されて、新規なハイブリッドポリペプチドをコードする核酸配列を生成することができる。
【００１２】
一局面では、本発明は、以下の工程を含む増加的切断短縮化核酸の複数の発現産物の製造方法に関する。まず、親核酸が供給される。そして、その長さが時間と共に増加的に短くなるような切断短縮化親核酸が形成されるように、親核酸の一又は両末端から連続的にヌクレオチドが除去される。連続的ヌクレオチド除去が複数の異なる時間で停止され、複数の増加的切断短縮化核酸が形成される。そして、複数の増加的切断短縮化核酸が適切な宿主内で発現されて、複数の切断短縮化核酸発現産物が形成される。
本発明は、さらに上記プロセスによって製造される個々の増加的切断短縮化核酸に関する。本発明は、さらに上記プロセスで製造される個々の切断短縮化核酸発現産物にも関する。
【００１３】
他の局面では、本発明は、以下の工程を含む複数の増加的切断短縮化ハイブリッド核酸を製造する方法に関する。まず、第１及び第２親核酸が供給される。そして、第１及び第２親核酸の一又は両末端からヌクレオチドが連続的に除去され、その長さが経時的に徐々に短くなる、切断短縮化された第１及び第２親核酸が形成される。連続的ヌクレオチド除去が複数の異なった時間で停止され、複数の増加的切断短縮化された第１及び第２核酸が形成される。そして、個々の増加的切断短縮化された第１核酸が、個々の増加的切断短縮化された第２核酸に連結されて、複数の増加的切断短縮化ハイブリッド核酸が形成される。
【００１４】
増加的切断短縮化第１核酸が増加的切断短縮化第２核酸に連結される順序は、変えることができる。従って、例えば、増加的切断短縮化第１核酸は、それが、増加的切断短縮化ハイブリッド核酸発現産物のＮ末端部分をコードするように連結することができる。この場合、増加的切断短縮化第２核酸は、該発現産物のＣ末端部分をコードする。このように形成された増加的切断短縮化ハイブリッド核酸は、本明細書では第１変異型増加的切断短縮化ハイブリッド核酸と呼ばれる。
あるいは、増加的切断短縮化第２核酸は、それが増加的切断短縮化ハイブリッド核酸発現産物のＮ末端部分をコードするように連結されうる。この別法では、増加的切断短縮化第１核酸は、該発現産物のＣ末端部分をコードする。このようにして形成された増加的切断短縮化ハイブリッド核酸は、本明細書では第２変異型増加的切断短縮化ハイブリッド核酸と呼ばれる。
【００１５】
本発明は、さらに複数の形質転換された増加的切断短縮化ハイブリッド核酸の製造方法であって、複数の増加的切断短縮化ハイブリッド核酸を複数の宿主に形質転換して、複数の形質転換された増加的切断短縮化ハイブリッド核酸を形成する工程を含む前記方法に関する。本発明は、さらに上記プロセスで製造される個々の増加的切断短縮化ハイブリッド核酸に関する。本発明は、さらに上記プロセスで製造される個々の増加的切断短縮化ハイブリッド核酸にも関する。
【００１６】
さらに別の局面では、本発明は、複数のシャッフルされた増加的切断短縮化核酸の製造方法であって、以下の工程を含む方法に関する。まず、複数の増加的切断短縮化修飾核酸の単離核酸挿入断片が供給される。この単離核酸挿入断片が、複数のシャッフルされた増加的切断短縮化核酸を形成するのに適した時間及び条件下で再結合される。
好ましい実施形態では、この再結合は、単離核酸挿入断片を核酸断片化酵素と、複数の増加的切断短縮化修飾遺伝子の核酸フラグメントの混合物を形成するのに適した時間及び条件下で混合する工程を含む。そして、該混合物の核酸フラグメントが核酸連結酵素で連結される。
好ましくは、この核酸断片化酵素はエンドヌクレアーゼである。好ましいエンドヌクレアーゼはＤＮａｓｅ（ＤＮＡ分解酵素）である。ＤＮａｓｅは、好ましくはＤＮａｓｅＩである。好ましくは、核酸連結酵素はリガーゼである。好ましいリガーゼはＤＮＡリガーゼである。
【００１７】
本発明は、さらに、複数の形質転換された、シャッフルされた増加的切断短縮化核酸の製造方法であって、複数のシャッフルされた増加的切断短縮化核酸を複数の宿主に形質転換させて、複数の形質転換された、シャッフルされた増加的切断短縮化核酸を製造する工程を含む方法に関する。本発明は、さらに上記プロセスに従って製造される個々のシャッフルされた増加的切断短縮化核酸に関する。本発明は、さらになお上記プロセスに従って製造される個々の形質転換された、シャッフルされた増加的切断短縮化核酸に関する。
【００１８】
さらなる局面では、本発明は、複数の類似体含有増加的切断短縮化核酸の製造方法であって、以下の工程を含む方法に関する。まず、複数のヌクレオチド類似体含有親核酸が供給される。その複数のヌクレオチド類似体含有親核酸から、核酸内に組み込まれたヌクレオチド類似体を解重合しないヌクレアーゼ酵素によって、複数の類似体含有切断短縮化核酸を形成するのに十分な条件下及び時間、ヌクレオチドが除去される。
好ましくは、複数のヌクレオチド類似体含有親核酸は、複数のヌクレオチド類似体含有増加的切断短縮化修飾核酸である。好ましい複数のヌクレオチド類似体含有増加的切断短縮化修飾核酸は、複数のヌクレオチド類似体を含有するシャッフルされた増加的切断短縮化ハイブリッド核酸である。
好ましくは、組み込まれたヌクレオチド類似体を解重合しないヌクレアーゼ酵素は、エキソヌクレアーゼである。好ましいエキソヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼＩＩＩである。好ましくは、ヌクレオチド類似体は、ホスホロチオエート含有ヌクレオチドである。
【００１９】
本発明は、さらに、複数の形質転換されたヌクレオチド類似体含有切断短縮化核酸の製造方法であって、複数のヌクレオチド類似体含有切断短縮化核酸を複数の宿主に形質転換させて、複数の形質転換されたヌクレオチド類似体含有切断短縮化核酸を形成する工程を含む方法に関する。
さらに別の局面では、本発明は、円順列増加的切断短縮化ハイブリッド核酸の製造方法であって、以下の工程を含む方法に関する。第１及び第２核酸が供給される。ランダムに位置する制限酵素部位を含有する複数の円順列的に並べ替えられた核酸フラグメントが第１及び第２核酸の間に挿入されて、複数の円順列ハイブリッドを形成する。複数の円順列ハイブリッドは、ランダムに位置する制限酵素部位を認識して特異的に加水分解する制限酵素と、複数の円順列増加的切断短縮化基質を形成するのに十分な時間及び条件下で反応させられる。その制限酵素部位の両端からヌクレオチドが除去されて、複数の円順列増加的切断短縮化ハイブリッド核酸が形成される。ヌクレオチド除去が停止されて、ギャップを有する複数の円順列増加的切断短縮化ハイブリッド核酸が形成される。そして、そのギャップが閉じられて、複数の円順列増加的切断短縮化ハイブリッド核酸が形成される。
【００２０】
本発明は、さらに、複数の形質転換された円順列増加的切断短縮化ハイブリッド核酸の製造方法であって、複数の円順列増加的切断短縮化ハイブリッド核酸を複数の宿主に形質転換させて、複数の形質転換された円順列増加的切断短縮化ハイブリッド核酸を形成する工程を含む方法に関する。
本明細書で使用される場合、フレーズ“増加的切断短縮化修飾核酸”は、増加的に切断短縮された核酸、増加的に切断短縮されたハイブリッド核酸、シャッフルされた増加的に切断短縮された核酸、ヌクレオチド類似体含有の増加的に切断短縮された核酸、及び円順列増加的切断短縮化ハイブリッド核酸を意味する。
【００２１】
さらに別の局面では、本発明は、複数の切断短縮された親核酸の発現産物に関する。
他の局面では、本発明は、複数の増加的切断短縮化ハイブリッド核酸に関する。
さらなる局面では、本発明は、複数の第１変異型増加的切断短縮化ハイブリッド核酸に関する。
さらに別の局面では、本発明は、複数の第２変異型増加的切断短縮化ハイブリッド核酸に関する。
さらに別の局面では、本発明は、複数のシャッフルされた増加的切断短縮化核酸に関する。
さらなる局面では、本発明は、複数の類似体含有増加的切断短縮化核酸に関する。
さらに別の局面では、本発明は、複数の環状並べ換え増加的切断短縮化ハイブリッド核酸に関する。
【００２２】
（発明の詳細な説明）
本発明の方法によって、遺伝子、遺伝子フラグメント、ＰＣＲ産物、ｍＲＮＡｓ、又はｃＤＮＡｓのような２つの核酸の、実質的にすべての異なる長さの組合せの融合が作製されうる。しかし、これらの生物学的な系は、関心のある種々の長さの核酸の全組合せが常に作製されると保証できないことを理解すべきである。それにもかかわらず、本発明の方法によって作製できる種々のハイブリッド数のため、理論上の融合の大多数が作製されうる。
重要なことに、本発明の一局面は、配列相同性に関係なく核酸を再配列することによって、核酸組換え法の相同性制限を回避する種々の方法を包含する。これら再配列された核酸配列は、本明細書ではハイブリッド核酸と呼ばれることがあり、新規な機能又は触媒特性を有するハイブリッドポリペプチドをコードすることができる。当然に、本発明は、高度の配列相同性を有する核酸からハイブリッドポリペプチドを作製するのにも有用である。本発明は、核酸配列相同性とは無関係なので、ハイブリッドポリペプチドの作製に可能性のあるいずれの所望遺伝子、遺伝子フラグメント、ＰＣＲ産物等にも適用できる。
【００２３】
一局面では、本発明は、増加的切断短縮化親核酸の複数の発現産物の製造方法であって、以下の工程を含む方法を熟考する。まず、親核酸が供給される。該核酸の一又は両末端から連続的にヌクレオチドが除去され、その長さが徐々に短くなる切断短縮された親核酸が形成される。そして、複数の異なる時間で連続的なヌクレオチド除去が停止され、複数の増加的切断短縮化親核酸が形成される。複数の増加的切断短縮化親核酸が発現させられて、複数の発現切断短縮化された親核酸が形成される。
【００２４】
本発明の種々の実施形態で供給される場合、親核酸は、遺伝子、遺伝子の一部、遺伝子フラグメント、ＰＣＲ産物、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、及び／又は遺伝子の突然変異体から成る群より選択されうる。核酸がＤＮＡ又はＲＮＡで構成されうることは理解されるはずである。さらに、核酸は、一本鎖か二本鎖のいずれかでよい。さらに、本発明のいくつかの実施形態では、説明のために核酸が遺伝子のコード領域であるが、核酸は遺伝子のコード領域由来である必要はない。
さらに、本発明の種々の実施形態の親核酸は、複数の又はライブラリーの遺伝子、遺伝子の一部、遺伝子フラグメント、ＰＣＲ産物、ｍＲＮＡｓ、ｃＤＮＡｓ、又は遺伝子突然変異体のような複数の又はライブラリーの核酸でありうる。
【００２５】
本発明の特定の実施形態では、特定の修飾又は切断短縮した核酸を形成するための特定の親核酸からの連続的な除去は、約１〜約４８０秒間持続する切断短縮の間隔を有することが好ましいが、好ましくは２４０秒未満、さらに好ましくは１２０秒未満、さらになお好ましくは６０秒未満、最も好ましくは切断短縮の間隔は３０秒持続する。
また、本発明の特定の実施形態では、修飾核酸は、所定速度でヌクレオチドの減少を確実にするのに適した条件下で親核酸の増加的切断短縮化によって形成されることが好ましい。この所定速度は、１分当たり約５０ヌクレオチド未満が好ましく、さらに好ましくは１分当たり１０ヌクレオチド未満である。親核酸の“進行性の切断短縮”又は“連続的なヌクレオチド除去”は、切断短縮化プロセスにおけるヌクレオチドの引き続く除去活性を含む。
【００２６】
本発明の特定の実施形態の切断短縮化工程では、ヌクレオチドの連続的な減少は、進行性かつ制御された様式で起こり、すなわち、相対的に小グループのヌクレオチドが切断短縮化プロセス時に除去される。
増加的切断短縮化は、ある核酸の一又は両末端で進行しうる。従って、ある線状核酸では、一又は両末端が、親核酸からヌクレオチドを除去するのに使用される特定の酵素に適した基質でありうる。従って、例えば、その特定の酵素がエキソヌクレアーゼＩＩＩ（Ｅｘｏ ＩＩＩ）ならば、二本鎖ＤＮＡが平滑末端又は５’−オーバーハングを有する場合のみ、ヌクレオチドが二本鎖ＤＮＡの３’−ヒドロキシル末端から除去される。一般的に、短い（１〜３ヌクレオチド）の３’−オーバーハングを有する二本鎖ＤＮＡは、この酵素に対しては不適切な、または受け入れられない基質である。
【００２７】
一本鎖若しくは二本鎖核酸、ＲＮＡ若しくはＤＮＡ、５’−オーバーハング、３’−オーバーハング、平滑末端、及びそれらの組合せのような種々の核酸基質を利用できる他の酵素が知られている。典型的な酵素としては、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、ＤＮａｓｅＩ、ヌクレアーゼＢＡＬ−３１、Ｓ１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、及びリボヌクレアーゼＨが挙げられる。
核酸の制御された消化のプロセスによる増加的切断短縮化は、新規な融合ポリペプチドの最終的な作製に利用される。例えば、本発明のいくつかの方法におけるこの消化の際、小アリコートが頻繁に除去され、該消化がクエンチされる。このうように、複数の異なる時間にわたって多数の試料を取ることによって、核酸の所定断片の可能な単一ヌクレオチド又は塩基対欠失の実質的にすべてでないとしても、好ましくは大部分を含有する複数の切断短縮化核酸が形成される。これら増加的切断短縮化修飾核酸が新規な融合ポリペプチドをコードするために用いられる。
【００２８】
平均サイズの遺伝子について、すべての可能な１ヌクレオチド切断の別々の構成は、数百個のプラスミドの構築、すなわち労力及び時間が非常にかかる仕事を必要とするだろう。本発明は、図１に示されるような一実験で、遺伝子、遺伝子フラグメント、関心のある遺伝子の一部、ＰＣＲ産物、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、前記関心のある遺伝子の突然変異体等の可能な切断短縮体の実質的にすべてでないとしても、その大部分を含有する複数の増加的切断短縮化修飾核酸の構成を可能にする。
図１は、増加的切断短縮化の一般化手順を示す。本発明の一実施形態では、増加的切断短縮化は、一端（末端）が消化から保護され、かつ他端（末端）が消化に感受性である遺伝子を含有する線状ＤＮＡのようなエキソヌクレアーゼ感受性ＤＮＡについて実施される。本発明の他の実施形態では、核酸からのヌクレオチドの連続的除去による増加的切断短縮化が、該核酸の両端（末端）から進行する。本明細書の他の個所で述べられるように、核酸の末端からのヌクレオチドの連続的除去は、主として、特定の末端が、ヌクレオチドを連続的に除去するヌクレアーゼ酵素用の適切な基質かどうかによって決まる。
【００２９】
本技術の研究者は、本発明に包含される多くの技法が、本発明の構成物の製造方法でクローニング媒体及び遺伝子工学の他の手段を用いる、組換え核酸技術を利用することを理解するだろう。これら基礎技法の多くは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：実験室マニュアル；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒａｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒａｂｏｒ，ＮＹ，１９８２のＭａｎｉｔａｔｉｓ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋに記載されており、この文献は参照によってその全体が本明細書に取り込まれる。
【００３０】
図１を参照すると、１つの遺伝子末端からのヌクレオチドの連続的除去は、例えば、２つの制限酵素を有するプラスミドＤＮＡの消化によって（工程１で示されるように）達成される。第１制限酵素は３’オーバーハング（ＲＥ３’；Ｅｘｏ ＩＩＩ消化に耐性である）を生成し、第２制限酵素は５’オーバーハング（ＲＥ５’；Ｅｘｏ ＩＩＩ消化に感受性、すなわちＥｘｏ ＩＩＩの適切な基質である）を生成する。
工程２は、消化速度が、頻繁にアリコートを取り出すことが逐次的な１ヌクレオチド欠失による複数の増加的に切断短縮された親核酸という結果を生じさせるように十分ゆっくりであるような条件下で、エキソヌクレアーゼＩＩＩによる消化が進行する一態様を示している。
【００３１】
工程３では、ＤＮＡの末端が一本鎖ヌクレアーゼ（Ｓ１ヌクレアーゼ又はマングビーンヌクレアーゼのような）及びＫｌｅｎｏｗ断片による処理によって平滑末端化されるので、単分子連結の結果、所望の複数の増加的切断短縮化遺伝子を生じさせる。いくつかの適用では、ベクターを再環状化する前にさらにＤＮＡ操作が必要とされる。
ここで述べる方法論では、制御可能な方向性様式で核酸を消化できるいずれの酵素も利用できる。以下の実施例では、Ｅｘｏ ＩＩＩが使用され、所望特性を示している。以前に、線状ＤＮＡの大きな切断短縮の作製において、また大きな遺伝子の配列決定の技法にとって、Ｅｘｏ ＩＩＩが有用であることが示されている。しかし、従前の技法は、３７℃におけるＥｘｏ ＩＩＩの消化速度を使用しており（１分当たり約５００塩基）、増加的切断短縮化の結果１つのヌクレアーゼ塩基欠失が望まれる本発明のいくつかの実施形態では非常に速すぎる。
【００３２】
特定のヌクレアーゼ酵素の消化速度が、インキュベーション温度を下げること、消化緩衝液組成を変えること、ヌクレアーゼインヒビターを含めるか又は核酸に対する酵素の割合を低くすることのような種々の方法及び条件によって影響されうるという事実は、本発明にとって有利である。本発明の実施形態は、分解が遅くなり、ひいては潜在的に全ての各ヌクレオチド塩基が欠失されうる増加的切断短縮化を可能にするように、特定のヌクレアーゼ酵素の消化速度に影響する条件を調節する。ヌクレアーゼ酵素活性の調節は、当業者には周知である。
【００３３】
複数の増加的切断短縮化核酸、及び他の増加的切断短縮化修飾核酸は、技術的に周知の方法によって発現させることができる。例えば、切断短縮化核酸によってコードされるポリペプチドの発現は、インビトロ転写／翻訳系によって達成されうる。他の実施形態では、増加的切断短縮化核酸を含有するベクターが、インビボ発現に適する宿主に形質転換させられる。
発現させられる核酸は、インビトロ又はインビボ発現に必要な制御配列を含むことができる。例えば、特定の発現ベクター中には、本発明の方法によって作られた特定の切断短縮化核酸の性質に基づいて、プロモーター配列、開始コドン、終止コドン、及び他の同様の制御配列が含まれる。
【００３４】
ベクターの適切な宿主への形質転換は、技術的に周知である。宿主細胞中にベクターを導入するための種々の方法が知られており、ＣａＣｌ_２コンピテント細胞中への導入、エレクトロポレーション、直接注入等が挙げられる。これら方法のいずれも、複数の増加的切断短縮化修飾核酸を複数の特定の宿主に形質転換するのに好適である。
１つより多くの構成物が同一宿主に形質転換されることがあり得る。この可能性は、例えば、限界希釈、ファジミドのような適切なベクターの使用、又は適切な選択法の使用のような周知の方法によって最小化される。
【００３５】
形質転換体の選択及び／又はスクリーニングの方法は技術的に周知である。本明細書で選択と言う場合、スクリーニング法の使用も除外されず、逆もまた同様であることは理解されるだろう。一般的に、選択及びスクリーニングの両方法を使用して、本発明の特定構成物を同定する。しかし、用語“選択”、又はその変形が言及されるだけで、当業者は、“選択”が“スクリーニング”を必要とすることが多く、かつ“スクリーニング”は“選択”を必要とすることが多いことを了解するだろう。
例えば、特定のベクターは、カナマイシン耐性遺伝子を有することができる。このようなベクターがカナマイシン感受性宿主に形質転換されると、該ベクターを保有するそれら宿主細胞は、該形質転換体をカナマイシン含有増殖培地上にプレーティングすることによって選択されうる。
【００３６】
特定の増加的切断短縮化修飾核酸の発現を検出することは、その選択された形質転換体を特定の活性又は機能性についてスクリーニングすることを必要とする。このようなスクリーニングは、求められる活性又は機能性に深く依存する。従って、増加的切断短縮化核酸が、ある特定の酵素活性をコードすべき場合は、当該酵素活性の適切なスクリーニングが行われる。複数の形質転換された宿主の選択及びスクリーニングの例は、後述される。
種々の切断短縮化核酸を用いて、複数の示差的に修飾された親核酸に由来する複数のポリペプチドを形成できる。この複数の示差的に修飾された親核酸又はポリペプチドは、時にライブラリーと呼ばれるが、用語“複数”は、それより広い意味であり、かつ用語“ライブラリー”を包含する。本明細書では、特定の典型的な実施形態において、複数の増加的切断短縮化修飾核酸は、増加的切断短縮化ライブラリー、又はＩＴＬと呼ばれることがある。
【００３７】
一般的に、ライブラリーのメンバーは、特定の共通特性を有する。従って、例えば、増加的切断短縮化修飾核酸のライブラリーは、共通の核酸配列を共有する複数の構築物で構成される。ライブラリーのメンバー間の相異は、各構築物の長さである。
複数の増加的切断短縮化修飾核酸は、必ずしも共通特性を有しないので、必ずしもライブラリーでない。
同様に、本発明のハイブリッドポリペプチドのライブラリーは、共通のアミノ酸残基配列を共有する複数のポリペプチドで構成され、ライブラリーメンバー間の相異はポリペプチドの長さである。
【００３８】
ある場合に、ポリペプチドのライブラリーの各メンバーは、所定の特性を有している。この実施形態では、好ましくは所望活性を捜すためにライブラリーがスクリーニング又は検定される。
本発明の複数のポリペプチド又はハイブリッドポリペプチドは、機能類似の配列類似のような共通特性を必ずしも所有しないので、必ずしもライブラリーでない。
本発明の特定の増加的切断短縮化修飾核酸構築物を選択及びスクリーニングすると、その構築物をさらに特徴づけできる。例えば、技術的に周知の方法によって増加的切断短縮化修飾核酸を宿主細胞から単離し、配列決定することができる。同様に、技術的に周知の方法によって、増加的切断短縮化修飾核酸構築物によって発現したポリペプチドを単離し、配列決定することができる。
【００３９】
他の局面では、本発明は、以下の工程を有する複数の増加的切断短縮化ハイブリッド核酸の製造方法に関する。第１及び第２親核酸が供給される。第１及び第２親核酸の一又は両末端からヌクレオチドが連続的に除去され、その長さが経時的に増加的に短くなる切断短縮化された第１及び第２親核酸が形成される。連続的なヌクレオチド除去が複数の異なる時間で停止されて、複数の増加的切断短縮化第１及び第２親核酸が形成される。個々の増加的切断短縮化第１親核酸が個々の増加的切断短縮化第２親核酸に連結されて、複数の増加的切断短縮化ハイブリッド核酸が形成される。
【００４０】
第１及び第２親核酸は、相同性と無関係に選択することができる。用語“相同性と無関係”は、出発親核酸を選択するプロセスが、核酸間の相同性に依存しないことを意味する。すなわち、このプロセスは、実質的な度合の相同性が存在しようが不在であろうが、成功しうる。しかし、相同遺伝子のような高度の相同性を有する核酸も使用でき、これは、フレーズ“相同性と無関係”によって除外されない。
結合工程は、本明細書で述べるような融合及び／又は連結する工程を含むことができる。切断短縮化は、時間及び／又は温度依存的に制御する様式で、又は本明細書の他の箇所で述べられるように他の方法で調節して行われるべきである。
【００４１】
複数の増加的切断短縮化ハイブリッド核酸は、後で異なる特性を有するポリペプチドを発現させるために使用できる複数の異なった組合せの増加的切断短縮化第１及び第２核酸を含む。従って、本明細書の他の箇所で述べられるように、複数の増加的切断短縮化ハイブリッド核酸を複数の適切な宿主に形質転換させて、複数の形質転換された増加的切断短縮化ハイブリッド核酸を形成することができる。この複数の形質転換された増加的切断短縮化ハイブリッド核酸は、形質転換された増加的切断短縮化ハイブリッド核酸のライブラリーを含むことができる。
複数の増加的切断短縮化核酸を用いて、所定の特性又は活性を有しうるポリペプチド（本明細書では、ハイブリッドポリペプチドと呼ばれることがある）を発現させる。技術的に周知のように、特定の核酸配列のインビボ発現は、適切な宿主に形質転換させられる適切な発現ベクターの使用によって決まる。ある構築物のインビトロ発現に好適な条件も技術的に周知である。
【００４２】
従って、本発明の構築物によって産生されるポリペプチドを選択及び／又はスクリーニングして、所定の特性又は活性の存在又は非存在を決定することができる。選択された構築物は、所定の特性についてのみならず活性についてもスクリーニングされることが、本実施形態の好ましい局面である。
本発明の重要な局面は、形成されるハイブリッドポリペプチドが、タンパク質又はポリペプチドのインテイン又は他の開裂生成部分を取り込むように設計されることである。これら開裂部位は、タンパク質又はポリペプチドがスプライシングされ、結合され、好適な活性を有しうるさらに修飾されたハイブリッドポリペプチドを形成することを可能にする。
【００４３】
本明細書で用いられる場合、所望の特性又は所望の機能性は、以下の特色のいずれをも包含しうる：特性、機能又は性質の非存在；既知及び／又は未知の機能；活性の増加又は減少；及び新規又は予想外の活性。
酵素の進化に関する１つの理論は、触媒機能は、究極的に単一の遺伝子産物に凝縮されてしまうタンパク質フラグメントの相互作用から生じると仮定する。このプロセス（タンパク質フラグメント相補とも呼ばれる）の逆は、既存のモノマー酵素をその機能的なヘテロダイマーに変換することである。栄養要求性宿主若しくは抗菌性選択を利用するような適切なスクリーニング又は選択と共に、複数の増加的切断短縮化核酸ハイブリッド、又は増加的切断短縮化ライブラリー（ＩＴＬ）を使用すると、骨格ポリペプチド鎖内の破壊されうる点を決定できる。結果の２つのタンパク質フラグメントは、機能選択機構が利用される時、折りたたまれて活性なヘテロダイマーに結合する能力を未だ保持している。重要なことに、本発明のいくつかの実施形態は、この逆進化のプロセスが妥当な時間でインビトロ遂行されるのを可能にする。
【００４４】
図２に、増加的切断短縮化の処理に利用される典型的なベクターの種々の特徴が示されている。この図に示されるように、プラスミドＮとＣは、異なる府不和合性群に属する複製起点を有する２つの和合性ベクターであり、異なる抗生物質抵抗性をコードする遺伝子を担持する。いくつの処理では、２つのベクターがファージ粒子中に詰め込むためのファジミドであること（例えば、それらはファージ起源の複製をも含むこと）が有利である。
切断短縮化されるべき核酸配列（図２にＡとＢとして示される）は、プロモーターから下流に置かれる。
【００４５】
典型的なベクターのいくつかの特徴のアイデンティティが図１に示されており、本方法の具体的な応用例によって決まる。Ｘ１及びＸ２セグメント（使用する場合）は、Ａ又はＢのＩＴＬｓが単分子連結工程で融合されるＤＮＡの断片を表す。‘ＲＥ’は、一カ所だけある（ｕｎｉｑｕｅ）制限酵素部位を表す。ＲＥ５’及びＲＥ３’は、制限酵素による消化によって、それぞれ５’又は３’オーバーハングが生じることを示している。５’オーバーハングは、Ｅｘｏ ＩＩＩ消化に感受性であるのに対し、３’オーバーハングは感受性でない。
図２に示される原理の適用の説明図は、タンパク質（Ｐ）の遺伝子を２つの不活性な重複フラグメント：Ａ（ＰのＮ末端を含有する）及びＢ（ＰのＣ末端を含有する）に分け、増加的切断短縮化に適したベクターにクローン化される工程を含む。
この説明図では、Ｘ１は全３フレーム内の一連の終止コドンであり、Ｘ２は、開始コドンＡＴＧであり、かつＴはＢを有するフレーム内の終止コドンである。制限酵素ＲＥ３’及びＲＥ５’によるベクターの線状化、続く増加的切断短縮化後に、単分子連結の結果、ＡのＩＴＬの３’末端が全３フレーム内の一連の終止コドンに融合され、かつＢのＩＴＬライブラリーの５’末端が開始コドンに融合される。
【００４６】
ＡのＩＴＬライブラリーの３分の２は、その末端上に１〜３個の外来性アミノ酸を有し、ＢのＩＴＬライブラリーの３分の２はフレーム外であるが、各ライブラリーの３分の１はインフレームであり、かつ如何なる外来性アミノ酸もコードしない。Ａ及びＢのＩＴＬライブラリーを、例えば、ライブラリー構築物が発現させられる適切な大腸菌細胞に両ライブラリーを形質転換させることによって交差させると、各細胞は、元のタンパク質Ｐの異なる組合せのＮ末端フラグメントとＣ末端フラグメントを産生する。
この交差ＩＴＬライブラリーの活性メンバーは、スクリーニング又は選択によって同定することができる。この方法論は、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：３５６２−３５６７（１９９９）でＯｓｔｅｒｍｅｉｄｅｒらによって報告されているように、大腸菌グリシンアミドリボヌクレオチドトランスホルミラーゼに適用されている。上記開示は、参照によってその全体が本明細書に取り込まれる。
【００４７】
酵素の機能的な二等分点を同定することは、このような二等分点は可能性のある先祖の融合点及び独立なフォールディング単位を同定するので、酵素の進化及びタンパク質の折りたたみに適用がある。このような、より小さいフラグメントに酵素を解体することも、酵素の化学合成における障害をくつがえし：モノマーとして化学的に合成するには大きすぎる酵素は、フラグメントとして合成することができ、ひいては固有の側鎖機能の導入を可能にする。さらに、機能的な構造モチーフ、サブドメイン、又はドメインの同定は、ハイブリッドタンパク質の構築及び新規な活性を有するタンパク質の作製（例えば、有効性が改良された抗生物質）を容易にする。
タンパク質構造相同体の交差ＩＴＬｓの構築は、本発明の方法によって実施可能なドメイン交換への１つの組合せアプローチを明らかにする。
【００４８】
上記方法のンパク質の二等分は、２つのフラグメントの会合の問題、特に構造相同体間の問題を潜在的に惹起しうる。この２つのタンパク質フラグメントは、会合できないか、又は会合する傾向がほとんどない。二量体化モチーフを使用することによって、強固に結合する二量体化ドメインを加えると、この問題を回避できる。
このタイプのタンパク質フラグメントの促進性会合は、構造相同性ヘテロダイマーの作製を可能にする。ある酵素（Ａ）の触媒機構のＩＴＬが、１つの二量体化ドメイン（Ｘ１）に融合され、かつ基質結合ドメイン（Ｂ）のＩＴＬが、第２二量体化ドメイン（Ｘ２）に融合されるようなハイブリッドタンパク質を作製することができる。そして、このようなＡ−Ｘ１及びＢ−Ｘ２融合ライブラリーを、該融合ライブラリー構築物が発現させられる適切な大腸菌内で交差させることができ、上述したように、例えば２つのサブユニットＡとＢの機能的連関は、Ｘ１とＸ２の二量体化によって促進される。必要ではないが、Ｘ１とＸ２は、好ましくは異なり（例えば、それらはヘテロダイマーを形成する）、ヘテロ二量体化（Ａ−Ｘ１：Ｘ２−Ｂ）の代わりにＡ−Ｘ１：Ｘ１−Ａ及びＢ−Ｘ２：Ｘ２−Ｂのホモ二量体化を避けるべきである。
【００４９】
逆平行ヘリックス、平行ヘリックス−ターン−ヘリックス及び不活性インテインドメインのような構造も、長いリンカーの必要性を回避するのに好ましい。このタイプのアプローチは、ＡとＢが別個の遺伝子である必要はないが、ファミリーメンバーからなるライブラリーであるか、又は複数の核酸でありうるので、一実験でタンパク質のファミリーを越えて新規な活性を走査することを可能にする。
このアプローチの１つの利点は、ベクターＮ及びＣがファジミドであり、ファージ粒子内に充填されうる場合、非常に大きいライブラリー（約１０^１１）にアクセスすることがてきる点である。ファージ感染は、大腸菌中にベクターを導入する非常に効率的な方法なので、ライブラリーの大きさは、主に培養中の大腸菌細胞の数によって制限される。例えば、各個々のＡ−Ｘ１及びＢ−Ｘ２ライブラリーが２×１０^６の大きさを有する場合、これら２つの交差ライブラリーは、４×１０^１２という最大ライブラリーサイズを有する。１リットルの１０^１１個の大腸菌細胞が、ＩＴＬダイマーライブラリーをそれぞれ含有するファジミドで感染され、その細胞の３０％が両ベクターによって感染されると、その交差ライブラリーの大きさは３×１０^１０である。このような大きいライブラリーについて選抜を行う能力は問題となり得るが、このような方法論は、より小さな扱いやすいライブラリーの作製をさらに容易にする。
【００５０】
ドメイン交換によって作製されたハイブリッドポリペプチドでは、どの融合点が所望特性を有するポリペプチドを産生するかを正確に予測することは困難である。ハイブリッドポリペプチドライブラリーの作製で増加的切断短縮化を使用すると、確率論的な方法によってこの問題を解決する。
この方法の新規な特徴は、それが、核酸レベルについての相同性又は酵素（若しくはタンパク質）の構造についての如何なる知識にも依存しないことである。理論的に、２つの遺伝子又は２つの異なる核酸配列のすべての可能な組合せを作製することができ、かつ適切なスクリーニング又は選択によって、活性ハイブリッドを同定することができる。ここで、この方法論は本明細書ではハイブリッド酵素作製のための増加的切断短縮化（Ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃｒｅａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｙｂｒｉｄ ｅｎｚＹｍｅｓ）、又は“ＩＴＣＨＹ”と呼ぶことがあり、その変形又は実施形態について概要を述べる。
【００５１】
継ぎ合わせＩＴＣＨＹライブラリーは、例えば、図２に示されるように作製され、Ｘ１とＸ２は同一の制限酵素部位（ＲＥ２）であり、かつＴはＢとインフレームにある終止コドンである。ＡとＢの個々のＩＴＬｓは、上述のタンパク質フラグメント相補性におけるように構築される（例えば、ＲＥ３’及びＲＥ５’によるプラスミドＤＮＡの線状化、次いで増加的切断短縮化及び再環状化）。
次に、プラスミドＣ上の同一の制限酵素を用いて、ＲＥ２とＲＥ１部位との間ＩＴＬ Ａを保有するプラスミドＮにＩＴＬ Ｂがクローン化される。その結果のＩＴＣＨＹライブラリーは、２つの遺伝子フラグメントの接合部に制限酵素部位ＲＥ２（継ぎ目）を含み、ひいては外来性アミノ酸をコードするので、継ぎ合わされる。このライブラリーの３分の１はＡとインフレームにあるＢを有する。２つの遺伝子間にリンカーが望まれる場合、それがＲＥ２と、短縮された遺伝子との間にあるようにＸ１又はＸ２のどちらかに含めることができる。
継ぎ目なしＩＴＣＨＹライブラリーは、２つの切断短縮核酸間の界面の継ぎ目を回避するのに有用である。しかし、この方法は、１つの平滑末端を有するフラグメントのクローニングに依存するので、ライブラリーサイズは継ぎ合わせＩＴＣＨＹより小さいだろう。
【００５２】
例えば、図２のベクターＮ及びＣの線状化バージョンは、図３の工程１に示されるように、ＲＥ３’及びＲＥ５’による消化によって調製される。増加的切断短縮化は図１におけるように進行する。図３の工程２では、線状ＩＴＬｓがＲＥ１で消化され、その必要なフラグメントが単離される。図３の工程３では、ＢのＩＴＬを含有するフラグメントの、ＡのＩＴＬを含有するベクター中への連結が、アスタリスクの部位における粘着末端連結と、切断短縮化遺伝子間の平滑末端連結によって進行する。
一般的に、増加的切断短縮化は、ベクターが再環状化される前に、プラスミドＮとＣがＲＥ１で消化されることを除き（図３）、上記のタンパク質フラグメント相補におけるように進行する。ベクターＮ（ＡのＩＴＬを含有する）は、フラグメントＸ１から単離され、かつＢのＩＴＬはベクターＣの残部から単離される。そして、ＢのＩＴＬが、粘着／平滑連結によってベクターＮ（ＡのＩＴＬを含有する）に連結される。
【００５３】
平滑末端連結は、２つの増加的切断短縮化遺伝子又は核酸配列の継ぎ目なし融合を生成する連結である。粘着末端連結（ＲＥ１における）は、方向性及び改良されたクローニング効率（平滑末端連結と比較して）を与える。継ぎ合わせＩＴＣＨＹにおけるように、ライブラリーの３分の１は、ＡとインフレームでＢを有する。
継ぎ合わせＩＴＣＨＹと異なり、継ぎ目なしＩＴＣＨＹは、リンカー組込みに容易には適用できない。例えば、継ぎ目なしＩＴＣＨＹライブラリーは、２つの遺伝子の増加的切断短縮化ライブラリー間の７，６００，０００個までの融合（２，５３０，０００インフレーム融合）から成って作製されている。このライブラリーサイズは、そのメンバーが０〜２，７５７個の欠失塩基を含む２つのＩＴＬｓ間のすべての可能な融合を持つのに必要な理論的な最小サイズである。
【００５４】
この方法の別の局面では、２つの遺伝子又は核酸配列が結合される順序が変えられる。第１変形では、複数の第１増加的切断短縮化核酸（本明細書では、ＡのＩＴＬと呼ばれることもある）が、その発現ハイブリッドタンパク質又はポリペプチドのＮ末端のコード領域を形成する。第２変形では、複数の第２増加的切断短縮化核酸（本明細書では、ＢのＩＴＬと呼ばれることもある）が、その発現ハイブリッドタンパク質又はポリペプチドのＮ末端のコード領域を形成する。
この方法では、継ぎ合わせ又は継ぎ目なしの複数の増加的切断短縮化ハイブリッド遺伝子は、Ｎ末端として第１又は第２増加的切断短縮化核酸のどちらかを持つことができる。増加的切断短縮化ハイブリッド核酸の増加的切断短縮化核酸部分の互換性が、作製できる潜在的な核酸の組合せ数を増加させる。
【００５５】
翻訳後のタンパク質組換え事象は、本発明の方法で作製できる可能性のあるハイブリッドポリペプチドの数をさらに増加させることができる。タンパク質スプライシングは、前駆体タンパク質配列からのインテインフラグメントの正確な切除を含む翻訳後事象である。現在までに記述された大部分のインテインはシス−インテイン（１つのポリペプチド上にコードされる）であったが、最近、操作された、および、天然に存在するトランス−インテインについて記述がなされている。
トランス−インテインの潜在的にいずれの２つのポリペプチドも融合させる能力は、ハイブリッド酵素又はタンパク質ライブラリーの作製に好都合である。融合例は、図４に示される。
【００５６】
図４では、ＡのＩＴＬとＮ−インテイン（Ｉ_Ｎ）の融合タンパク質と、ＢのＩＴＬとＣ−インテイン（Ｉ_Ｃ）の融合タンパク質とが、Ｉ_ＮとＩ_Ｃの相互作用を介して溶液中で会合する。インテインヘテロダイマー（Ｉ_Ｎ：Ｉ_Ｃ）は、スプライシング反応を指令し、その結果天然のペプチド結合によるＡのＢへの結合と、Ｉ_Ｎ：Ｉ_Ｃの放出をもたらす。
一般的に、この実施形態では、増加的切断短縮化は、上述のタンパク質フラグメント相補におけるように遂行され、その結果トランス−インテイン（Ｉ_Ｎ）の半分にＡのＩＴＬが融合し、トランス−インテイン（Ｉ_Ｃ）の残りの半分にＢのＩＴＬが融合する。所望により、リンカーを組み込んで、Ａ若しくはＢのどちらか又は両方を増加的切断短縮化後にリンカーに融合させることができる。そして、両ベクター（インテイン又はリンカー−インテインに融合したＩＴＬを含有する）を同一細胞中に導入し、かつインテインの活性の結果としてハイブリッドポリペプチドをインビボ作製できる。トランス−インテインを用いて産生されるすべてのハイブリッドポリペプチド産物は、必然的に融合点に該インテイン由来の１つの残基を持っている。
【００５７】
上述したタンパク質フラグメント相補のための二量体化ドメインの使用と同様に、トランス−インテインの使用における１つの利点は、非常に大きいハイブリッド酵素ライブラリーを調製できることである。これらライブラリーは、理論的には上記遺伝子融合で作られるライブラリー（ＩＴＣＨＹライブラリー）よりもずっと大きい。
２つ以上の遺伝子間の機能性ハイブリッド作製の成功は、歴史的にはＤＮＡレベルについて十分な度合の相同性を要求すると考えられた。遺伝子のインビトロ及びインビボ組換え（ＤＮＡシャッフリングのような）の現在の方法は、十分な度合の相同性を有する遺伝子に依存する。しかし、多くの種間相同体は、伝統的なインビトロ及びインビボ組換え法を効率的に遂行できるよりも低い配列相同性を有している。すなわち、ヌクレオチドレベルについては、約３０〜４０パーセントの配列同一性である。
【００５８】
しかし、ほとんど又は全く配列同一性の無いタンパク質が、強力な構造相同性を有することがある。このような例えばフォールディングスーパーファミリー内の遺伝子の組換えは、興味深くかつ有用な特性を有するハイブリッドタンパク質をもたらす。さらに、ほとんど又は全く相同性でない座における高い相同性を有する遺伝子間の組換えは、結果として興味深くかつ有用な特性を有するハイブリッドタンパク質となりうる。
従って、本発明の他の局面では、如何なる配列同一性をも必要としない核酸の組換え方法が提供される。この局面では、複数のシャッフルされた増加的切断短縮化核酸の製造方法であって、以下の工程を含む方法が提供される。好ましくは、ほぼ同一長さの単離核酸挿入断片が、複数の増加的切断短縮化修飾核酸から供給される。これら単離核酸挿入断片が、複数のシャッフルされた増加的切断短縮化核酸を形成するのに適した時間及び条件下で組再結合される。
【００５９】
好ましい実施形態では、組換え工程は、単離核酸挿入断片を、複数の増加的切断短縮化修飾遺伝子の核酸フラグメントの混合物を形成するのに適した時間及び条件下で、核酸断片化酵素と混合する工程を含む。この混合物の核酸フラグメントが、複数のシャッフルされた増加的切断短縮化核酸を形成するのに適した時間及び条件下で核酸連結酵素で結合される。
このシャッフリング法は、好ましい開始点として、上で概要を述べたような継ぎ合わせ又は（好ましくは）継ぎ目なしＩＴＣＨＹライブラリーのどちらかを用いる。さらに好ましくは、開始点は複数の第１変異型増加的切断短縮化ハイブリッド核酸及び複数の第２変異型増加的切断短縮化ハイブリッド核酸である。他の好ましい実施形態では、開始点は複数の類似体含有増加的切断短縮化核酸、又は複数の環状並べ換え増加的切断短縮化ハイブリッド核酸である。
【００６０】
伝統的なＤＮＡシャッフリングにおける遺伝子間の交差点が同一性の領域によって定義かつ限定されるのに対し、シャッフルされたＩＴＣＨＹライブラリーの交差点は融合点によって定義される。実質的にすべての可能な交差点でないにしても、ＩＴＣＨＹライブラリーは理論的に多くの交差点を有し；従って、その結果のハイブリッド酵素ライブラリー内の交差点の位置について理論的な制限はない。その結果として、高い同一性の核酸のシャッフルされたＩＴＣＨＹライブラリー（本明細書ではＳＣＲＡＴＣＨＹライブラリーと呼ばれることがある）は、伝統的なＤＮＡ組換え法よりも多様なライブラリーを作製することができる。
図５を参照すると、２つのＩＴＣＨＹライブラリー：Ａ−Ｂ融合を生じるＮ末端上の遺伝子Ａによって形成される１つのライブラリーと、Ｂ−Ａ融合を生じるＮ末端上の遺伝子Ｂによって形成される１つのライブラリーとを作ることによって、ＳＣＲＡＴＣＨＹライブラリーを作製することができる。
【００６１】
次に、Ａ−Ｂ及びＢ−Ａ融合のそれぞれのＤＮＡフラグメントが単離される。これらＤＮＡフラグメントは必ずしも必要ではないが、好ましくは元の遺伝子とほぼ同一の大きさである。これは、制限酵素消化（及び制限部位の思慮深い位置の選定）後、又は融合遺伝子の末端の近傍若しくはすぐ外側でのプライマーによるＰＣＲ後、ゲル電気泳動法又はキャピラリー電気泳動法によって行うことができる。この工程は、シャッフルされるべきＤＮＡのプールが、相互に近い一次構造の三次元構造上の点における融合を含むことを確実にしようとするものである（すなわち、交差点を‘インテリジェント’な位置に制限する）。
従って、ＳＣＲＡＴＣＨＹライブラリー方法論は、好ましくは概略同サイズの遺伝子ＡとＢついて行われる。この“インテリジェント”交差点を有するＤＮＡをＰＣＲによって増幅し、ＤＮＡ組換え、又はシャッフリングを行うのに十分な試料を得ることができる。２つのライブラリー（元の遺伝子とほぼ同サイズのＡ−ＢとＢ−Ａ ＰＣＲ産物を含む）を混合してから、引き続きＤＮアーゼＩで消化させ、その後にインビトロ又はインビボ組換えの方法を行うことができる。
【００６２】
インビトロ又はインビボ組換えのためのこのような方法としては以下の方法が挙げられる。ＤＮＡシャッフリングは、Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１０７４７−１０７５１（１９９４）によって例証されており、この開示は参照によってその全体が本明細書に取り込まれる。
ファミリーＤＮＡシャッフリング又は有性ＰＣＲとしても知られる分子育種は、Ｃｒａｍｅｒｉら，Ｎａｔｕｒｅ ３９１：２８８−２９１（１９９８）によって例証されており、この開示は参照によってその全体が本明細書に取り込まれる。
スタガード伸長法（Ｓｔａｇｇｅｒｅｄ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ）（ＳｔＥＰ）は、Ｚｈａｏら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １６：２５８−２６１（１９９８）によって例証されており、この開示は参照によってその全体が本明細書に取り込まれる。
【００６３】
ランダムプライミングインビトロ組換は、Ｓｈａｏら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２６（２）：６８１−６８３（１９９８）によって例証されており、この開示は参照によってその全体が本明細書に取り込まれる。
合成を妨害することによるＤＮＡ再構築は、１９９９年１０月１２日にＳｈｏｒｔに発行された米国特許第５，９６５，４０８号で例証されており、この開示は参照によってその全体が本明細書に取り込まれる。
一次的な鋳型上のランダムキメラ生成（ＲＡＴＣＨＩＴＴ^ＴＭ）（Ｅｎｃｈｉｒａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ．；Ｔｈｅ Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）は、Ｗ．Ｍ．Ｃｏｃｏらによって、工業微生物学会２０００年会、７月２３〜２７日、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡで提示された“Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｆａｍｉｌｙ Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ Ｒｅｌｉｅｖｅｓ Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｂｏｔｔｌｅｎｅｃｋｓ ｉｎ ａ Ｈｉｇｈｌｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｐａｔｈｗａｙ”に例証されており、この開示は参照によってその全体が本明細書に取り込まれる。
ＰＣＲ媒介組換えは、Ｊｕｄｏら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２６（７）：１８１９−１８２５（１９９８）によって例証されている。
【００６４】
組換えは、技術的に周知のインビボ組換え法によっても起こりうる。
図５は、ＩＴＣＨＹライブラリーの非相同性シャッフリング又は組換えの例を示しており、工程１は、個々のＡ−Ｂ及びＢ−Ａ ＩＴＣＨＹライブラリーが、例えば図３に示されるように構築されることを図解する。
工程２は、外側の制限酵素又は外側のＰＣＲプライマーのどちらかによって、元の遺伝子とほぼ同一サイズであるＩＴＣＨＹライブラリーのメンバーが、ゲル又はキャピラリー電気泳動法によって単離されることを図解する。工程３では、これら選択されたＩＴＣＨＹライブラリーのメンバーが、伝統的なＤＮＡ組換え法におけるのと同様に混合され、ＤＮアーゼＩによる消化で断片化される。工程４では、ランダムなフラグメントの再構築が鋳型スイッチングによって進行し、その結果複数の交差点を有する全長遺伝子となりうる。
【００６５】
“インフレーム”に現れるハイブリッドの数は、交差点の総数に伴って指数関数的に減少する。例えば、元のＩＴＣＨＹライブラリーは、ハイブリッドの３分の１しかインフレームに持っていない。２つの交差点を有するＳＣＲＡＴＣＨＹライブラリーの結果のメンバーは、完全にインフレームである９の機会のうち１しか持っていない。３つの交差点では、２７の完全なインフレームのうち１しか持っていない。
この状況は、インフレームのハイブリッドのために最初のＩＴＣＨＹライブラリーを予備選択することによって処理することができる。例えば、遺伝子Ｂが、選べる表現型を有するリポーター遺伝子にインフレーム融合される場合、インフレーム交差点を有するすべてのインフレームＩＴＣＨＹライブラリーメンバーを選択できる。リポーター遺伝子は、ＤＮアーゼＩ消化の前にＰＣＲ工程で簡単に除去できるので、最終のＳＣＲＡＴＣＨＹライブラリーの一部である必要はない。この方法により、リポーター遺伝子としてネオマイシン耐性遺伝子を用いて、２つの異なるＩＴＣＨＹライブラリー内でインフレーム融合が選択された。
【００６６】
本発明の別の実施形態は、（ａ）核酸ポリメラーゼによって二本鎖核酸中にランダムに組み込まれうるリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドの類似体（本明細書ではヌクレオチド類似体と呼ばれることがある）と、（ｂ）その組み込まれたヌクレオチド類似体を切除できない３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素との対合を含む。
この局面では、本発明は、複数の類似体含有増加的切断短縮化ハイブリッド核酸の製造方法であって、以下の工程を含む方法を提供する。複数のヌクレオチド類似体含有親核酸が供給される。その複数のヌクレオチド類似体含有親核酸から、核酸中に組み込まれたヌクレオチド類似体を解重合しないヌクレアーゼ酵素によってヌクレオチドが除去される。このヌクレアーゼ酵素は、複数の類似体含有切断短縮化核酸を形成するのに十分な時間及び条件下で使用される。
【００６７】
その複数のヌクレオチド類似体含有親核酸は、好ましくは複数のヌクレオチド類似体含有増加的切断短縮化修飾核酸を含む。さらに好ましくは、その複数のヌクレオチド類似体含有親核酸は、複数のヌクレオチド類似体含有シャッフル増加的切断短縮化核酸を含む。
述べたように、ヌクレオチド類似体は、ＤＮＡポリメラーゼ又はＲＮＡポリメラーゼのような核酸ポリメラーゼを用いて新生核酸鎖内に取り込むことが出来る。例えば、親核酸が供給され、その親核酸の一又は両末端からヌクレオチドが除去されて、切断短縮化親核酸が形成される。その切断短縮化親核酸上に、ヌクレオシドトリホスフェート（ＮＴＰｓ又はｄＮＴＰｓ）及びヌクレオチド類似体の存在下、複数のヌクレオチド類似体含有親核酸を形成するのに十分な時間及び条件下で、核酸重合酵素によって相補核酸鎖が再合成される。
【００６８】
核酸中へのヌクレオチド類似体取り込みの別の例では、親核酸が周知のＰＣＲ法によって増幅されうる。ＰＣＲ増幅は、ヌクレオシドトリホスフェート（ＮＴＰｓ又はｄＮＴＰｓ）及びヌクレオチド類似体の存在下、複数のヌクレオチド類似体含有親核酸を形成するのに十分な時間及び条件下で行われる。
ヌクレオチド類似体が組み込まれる親核酸は、増加的切断短縮化修飾核酸を含み、それによって複数のヌクレオチド類似体含有増加的切断短縮化修飾核酸を形成することができる。
このヌクレオチド類似体は、エキソヌクレアーゼのような、核酸を解重合する酵素による解重合に耐性である。ヌクレオチド類似体は、エキソヌクレアーゼによって認識されず、又は実質的にエキソヌクレアーゼによる切断に耐性であるヌクレオチド間結合を形成するので、解重合に耐性である。例えば、ヌクレオチド類似体は、エキソヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼ切断に耐性であるが、なお新生核酸鎖中への取り込みを許容する偽ホスフェート結合を有しうる。
【００６９】
このようなヌクレオチド類似体は技術的に周知である。典型的な偽ホスフェート結合としては、限定するものではないが、メチルホスホネート、ホスホモルフォリデート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート及びホスホロセレノエート結合が挙げられる。
さらに、エキソヌクレアーゼ−及び／又はエンドヌクレアーゼ−耐性ポリヌクレオチドは、技術的に周知の通り、アクリジンのような置換基、５−メチルグアノシン若しくはポリ（Ａ）尾部のようなキャップで３’−及び／又は５’−末端ヌクレオチドを遮断することで得られる。例えば、Ｃｏｈｅｎ（ｅｄ．），Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８９）；Ｇａｉｔ（ｅｄ．），Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＰＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ（１９８４）を参照せよ。
【００７０】
好ましい偽ホスフェート結合は、ホスホロチオエート結合である。
好ましいヌクレオチド類似体はホスホロチオエート含有ヌクレオチドである。
本発明のこの実施形態は、以下を提供する：（ｉ）エキソヌクレアーゼ消化時にアリコートを定期的に採取するという労働集中性で時間のかかるプロセスを必要としない増加的切断短縮化ライブラリーの作製；（ｉｉ）所望フラグメントの精製を回避する単一ベクター上のＩＴＣＨＹライブラリーの作製；（ｉｉｉ）ポリメラーゼ触媒フィルイン反応時の増加的切断短縮化又はＩＴＣＨＹライブラリー中への点突然変異の制御された導入；（ｉｖ）従前に議論されてきた他の実施形態固有の切断短縮の長さの偏りの最小化；及び（ｖ）増加的切断短縮化又はＩＴＣＨＹライブラリーを構築するのに必要な工程及び時間の最小化。
【００７１】
図６を参照すれば、親ＩＴＣＨＹプラスミドが、該プラスミド内の一カ所を切断する一対の制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）で消化されて線状化され、それによって短縮化すべき末端に３’リセッシブ末端（または平滑末端）（Ｙ）が生成され、他方の末端に、リセッシブ５’−末端（限定するものではないが）を含む加水分解耐性末端（ＲＥ２）が生成される。
最初のヌクレアーゼ処理は、限定するものではないが、Ｅｘｏ ＩＩＩを含む３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素によって行うことができる。同一酵素を用いて、線状化されたプラスミドの最初の消化を行うことができる。反応条件（温度及び塩濃度のような）は、反応速度を調整するように用いられる。例えば、２２℃かつ塩濃度１００ミリモルＮａＣｌでは、エキソヌクレアーゼＩＩＩについて約１０核酸塩基／分の消化速度となる。
【００７２】
線状化プラスミドが３’→５’エキソヌクレアーゼと共にインキュベートされて、一本鎖オーバーハングが生じる。図６ＣにＸとして示されるように、短縮化される領域及び消化の長さ又はカットバック速度が（上述したように）、必要なインキュベーション時間を決定する。本明細書で述べられる増加的切断短縮化ライブラリーを生成するための他の方法と対照的に、全範囲の切断短縮化産物を得るためにたった１つのタイムポイントしか必要でない。
ヌクレアーゼ処理によって生じたプラスミドの一本鎖部分は、相補ＤＮＡ鎖の再合成用鋳型として使用される。一実施形態では、この反応は５’−３’重合活性を有する酵素、適宜の金属イオン、及びヌクレオシドトリホスフェートを必要とする。この反応のヌクレオシドトリホスフェートは、好ましくは天然のデオキシリボヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）又はリボヌクレオチド（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ）及びヌクレオチド類似体（図６ＤでＳとして示される）の混合物であり、反応をスパイクすると言われる。図６Ｄに３つの代表的な配列によって示されるように、相補鎖の合成時にヌクレオチド類似体がランダムに組み込まれる。
【００７３】
重合は、例えば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ^ＴＭ ＤＮＡポリメラーゼ、及びＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼのようなＤＮＡポリメラーゼによって触媒されうる。好ましくは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠いているポリメラーゼが使用される。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼのような熱安定性酵素を使用すると、一本鎖配列内におけるプライマー伸長を妨げうる二次構造の形成を減少させるという利点がある。
相補鎖伸長反応では、好ましくは、マグネシウム及びマンガンを含む適宜の金属イオンが存在するが、これに限定されるものではない。単一金属イオン又は２種以上の金属イオンの混合物を反応混合物に添加して、技術的に公知の方法による伸長の忠実度を変えることができる。
【００７４】
その後、すべての４つの天然デオキシリボヌクレオシドトリホスフェート（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、及びｄＴＴＰ）又はリボヌクレオシドトリホスフェート（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ）、及びヌクレオチド類似体（限定するものではないが、α−ホスホロチオエートデオキシヌクレオシドトリホスフェートを含む）が、平均して、再合成された相補鎖の全長にわたって単一のヌクレオチド類似体を組み込むように、最初のヌクレアーゼ処理の長さ（図６ＣにＸとして示される）によって決定される濃度比で混合される。類似体に対するヌクレオチドトリホスフェートの比は、下記式によって計算できる。
（１） （１／Ｘ）δ［Ｃ］＝［Ｓ］
Ｘ＝ 最初のヌクレアーゼ消化の長さ
δ＝ 補正因子
［Ｃ］＝ｄＮＴＰｓの濃度
［Ｓ］＝α−Ｓ−ｄＮＴＰｓの濃度
【００７５】
補正因子δは、反応をスパイクする工程で使用される個々のヌクレオチド類似体について実験的に簡単に決定される。補正因子は、天然のヌクレオシドトリホスフェートと比較した、該ヌクレオチド類似体がポリメラーゼによって利用される能力を反映する。
上式を説明すると、Ｅｘｏ ＩＩＩによる約３００ヌクレオチド（Ｘ＝３００）に及ぶ最初の消化は、反応物の濃度を以下のように設定する：各ｄＮＴＰの濃度（［Ｃ］）を２００ミリモルでδ＝１では、各α−Ｓ−ｄＮＴＰｓの濃度（［Ｓ］）を０．６７ミリモルである。
そして、該酵素による二本鎖合成に適した温度で反応混合物をインキュベートする。温度は、製造業者推奨の活性最適値に設定することができ（必ずしも必要でない）、最適以下の反応条件下でさらにランダム突然変異へのアクセスを与えることができる。
【００７６】
上述したように、ＰＣＲ増幅を利用して、核酸中にヌクレオチド類似体を組み込んで、ヌクレオチド類似体含有親核酸を形成することができる。ここでもプライマー伸長の文脈で述べたのと同様の考慮が当てはまる。しかし、ＰＣＲ増幅は特定の利点を与える。例えば、ＰＣＲ増幅にはナノグラム量の開始核酸しか必要ない。さらに、ＰＣＲ操作は、“実地での”時間が短い。
さらに、開始核酸の長さ及び増幅されるＤＮＡ全体にわたって点突然変異を導入する可能性に対して考慮を払わなければならない。これら点突然変異は、開始親核酸及び同時に最終の切断短縮産物の多様性を増やすので望ましい。これら点突然変異は、開始核酸上の他の機能要素を破壊又は調節することもある。従って、ある場合には、切断短縮ライブラリーの別個の発現系へのサブクローニングが必要である。
【００７７】
ＰＣＲ増幅で、さらに突然変異の多様性が望まれる場合、マンガンでマグネシウムを部分置換することで、プライマー伸長（及び増幅）時のポリメラーゼの忠実度を変えることができる。反応緩衝液組成及び反応温度を調節して、突然変異頻度を所望レベルに高めることもできる。Ｃａｄｗｅｌｌ及びＪｏｙｃｅ，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，３：Ｓ１３６−Ｓ１４０（１９９４）を参照せよ。
【００７８】
図６Ｄに示されるような二本鎖合成（又は上述したようなＰＣＲ増幅）の完了後、その類似体スパイクド線状化プラスミドは、例えば、Ｅｘｏ ＩＩＩのような、該類似体を超えて核酸を加水分解できない３’→５’エキソヌクレアーゼ活性（第２ヌクレアーゼ処理を遂行する）を有する酵素と共にインキュベートされる。以前の相補核酸鎖再合成時の該類似体のランダムな取り込みに基づき、例えば、図６Ｅに示される３つの代表的な配列によって示されるように、Ｘの全長にわたってヌクレオチド類似体の位置で加水分解が終結する
第２ヌクレアーゼ処理の反応条件は、第１ヌクレアーゼ処理よりもあまり重要でない。ＲＥ２−部位は加水分解から保護され、かつ３’→５’エキソヌクレアーゼによる消化は、核酸鎖内でヌクレオチド類似体に遭遇すると自動的に終結する。
【００７９】
図６Ｆを参照すると、第２ヌクレアーゼ処理後、特異的に一本鎖核酸を加水分解するヌクレアーゼ、例えばＳ１ヌクレアーゼ又はマングビーンヌクレアーゼを添加すると、プラスミドの一本鎖部分が分解され、それによって平滑末端が生じる。
環化効率を高めるため、周知のように、プラスミドを核酸ポリメラーゼ、優先的には大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントと共に、適宜の金属イオン及び天然のデオキシリボヌクレオシド又はリボヌクレオシドトリホスフェートの存在下で短時間インキュベートすることができる。
そして、平滑末端化した切断短縮ライブラリーは、図６Ｇに示されるように、例えばＴ４ ＤＮＡリガーゼのような核酸リガーゼを含む化学的又は酵素的方法によって、製造業者によって推奨される条件で再利用することができる。
【００８０】
以下の議論は、図７Ａに示されるように、単一のプラスミド上に位置する２つの核酸配列（例えば、別個の遺伝子又は遺伝子フラグメント）間の、同時増加的切断短縮化による融合ラタンパク質ライブラリーの構成をさらに説明する。
これら特有条件下では、図７Ｂで“Ｙ”という記号で表されるようなリセッシブ３’末端又は平滑末端化末端を生じる単一の制限エンドヌクレアーゼによって線状化を達成することができる。
３’→５’エキソヌクレアーゼ（例えばＥｘｏ ＩＩＩ）と共にインキュベートすると、遺伝子又は遺伝子フラグメントＡ及びＢが、ある長さの一本鎖核酸を生じる距離Ｘにわたって同時に加水分解される。長さＸは、限定するものではないが、酵素としての該要素、反応緩衝液の組成、反応温度、及びインキュベーション時間を含む反応条件によって制御することができる。
【００８１】
適切な金属イオン、および天然デオキシリボヌクレオシド又はリボヌクレオシドトリホスフェート及び適切な比率のヌクレオチド類似体（Ｓと表示される）（必要なヌクレオチド類似体濃度の計算を決定するための指針用の上式（１）参照）の混合物との存在下における相補核酸鎖の核酸ポリメラーゼ（例えば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、又はＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）による再合成は、図７Ｄに示されるように、その再合成される相補核酸鎖の全長（Ｘ）に及ぶ両方向にヌクレオチド類似体のランダムな取り込みを生じさせる。本明細書の他の箇所で言及されるように、核酸ポリメラーゼのタイプ、反応緩衝液組成、反応混合物中に存在する金属イオン、及び一般的な反応条件のような要素を含む一連の変量を用いて、この段階で核酸をさらにランダム化できる。
【００８２】
二本鎖合成の完了後（図７Ｄ）、そのヌクレオチド類似体スパイクド線状化プラスミドが、ヌクレオチド類似体以上には核酸を解重合できない３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素（例えば、Ｅｘｏ ＩＩＩ）と共にインキュベートされる。以前の相補核酸鎖再合成時の該類似体のランダムな取り込みに基づき、図７Ｄに示される３つの代表的な配列によって示されるように、ヌクレオチド類似体のランダムな位置で、両方向の同時加水分解が終結する
図７Ｅで示される第２ヌクレアーゼ処理の反応条件は、あまり重要でない。３’→５’エキソヌクレアーゼによる消化は、核酸鎖内で核酸類似体に遭遇すると自動的に終結する。
【００８３】
第２ヌクレアーゼ処理後、Ｓ１ヌクレアーゼ又はマングビーンヌクレアーゼのような、特異的に一本鎖核酸を加水分解するヌクレアーゼを添加すると、プラスミドのすべての一本鎖部分が分解される（図７Ｆ）。
環化効率を高めるため、プラスミドを核酸ポリメラーゼ、優先的には大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントと共に、適宜の金属イオン及び天然のデオキシリボヌクレオシド又はリボヌクレオシドトリホスフェートの存在下で短時間インキュベートすることができる。
平滑末端化した切断短縮ライブラリーは、核酸リガーゼ、優先的にはＴ４ ＤＮＡリガーゼを含む化学的又は酵素的方法によって、製造業者によって推奨される条件で再環化される（図７Ｇ）。
【００８４】
さらなる実施形態では、上述したように、ヌクレオチド類似体によるスパイク工程をＰＣＲ増幅によって行うことができる。親核酸（ＤＮＡのような）標的が、ＮＴＰｓ又はｄＮＴＰｓ及び１種以上のヌクレオチド類似体の存在下、好ましくはエキソヌクレアーゼ活性のない核酸ポリメラーゼ（限定するものではないが、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを含む）を用いて、５’及び３’外側プライマーによって増幅される。天然塩基及び類似体間の割合は、平均して、短縮される領域当たり単一の類似体のみが取り込まれるような割合である。反応条件（例えば反応緩衝液組成、反応温度、金属イオン（例えばマグネシウム及びマンガン））を変えて、プライマー伸長のフ忠実度に影響を及ぼし、かつ技術的に公知の方法による増幅の際にランダムな突然変異導入をカスタマイズできるレベルに導くことが出来る。
【００８５】
切断短縮化から保護する一カ所の制限部位は、ＰＣＲ産物の切断短縮すべきでない末端に位置する。この制限酵素による制限消化の後、類似体を越えては核酸を加水分解できない３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素（例えばエキソヌクレアーゼＩＩＩ）と共に、増幅産物をインキュベートする。代わりに、例えば制限酵素消化が省略される場合は、切断短縮は両端から同時に行われることが望ましいかもしれない。
特異的に一本鎖核酸を加水分解するヌクレアーゼ、例えばＳ１ヌクレアーゼ又はマングビーンヌクレアーゼによって、増幅産物の一本鎖部分が分解されて、平滑末端が生じる。さらに平滑末端の割合を増やすため、核酸ポリメラーゼ、優先的には大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントと共に、適宜の金属イオン及び天然ヌクレオチドの存在下で、増幅産物が短時間インキュベートされる。
そして、技術的に公知の方法によって、そのフラグメント核酸ライブラリーを、先に調製した核酸ライブラリーを含むか又は含まない適切なベクター中にクローン化することができる。
【００８６】
他の局面では、本発明は、円順列増加的切断短縮化ハイブリッド核酸の作製方法であって、以下の工程を含む方法を提供する。単離された第１及び第２核酸が供給される。それぞれランダムに位置する制限酵素部位を含有する、複数の環円順列核酸フラグメントが、第１及び第２核酸間に挿入されて、複数の円順列ハイブリッドが形成される。この複数の円順列ハイブリッドを、複数の円順列増加的切断短縮化基質を形成するのに十分な時間及び条件下で、そのランダムに位置する制限酵素部位を認識して特異的に加水分解する制限酵素と反応させる。そして、制限酵素部位の両端からヌクレオチドが除去されて、複数の円順列増加的切断短縮化ハイブリッドが形成される。ヌクレオチド除去が停止され、ギャップを有する複数の円順列増加的切断短縮化ハイブリッド核酸が形成される。そして、ギャップが閉じられて、複数の円順列増加的切断短縮化ハイブリッド核酸が形成される。
【００８７】
この方法は、本明細書では円順列（ｃｉｒｃｕｌａｒ ｐｅｒｍｕｔａｔｅｄ）ＩＴＣＨＹ（ＣＰ−ＩＴＣＨＹ）と呼ばれることがある。ＣＰ−ＩＴＣＨＹは、以前に述べた方法の変形であり、多くの利点を提供する。この方法の一般的原理は、図８に示されている。２つの核酸（例えば、遺伝子１と遺伝子２と呼ばれる２つの遺伝子）は、好ましくはほぼ同一長さ（Ｎ）である。
この実施形態では、遺伝子１のＮ末端フラグメントと遺伝子２のＣ末端フラグメントとの間で、好ましくは２つの遺伝子がアラインメントされる所又はその近傍において、複数の可能な融合又は可能な融合のライブラリーを作製することが望まれる。従って、融合を引き起こすように選択される領域は、好ましくは位置Ａと位置Ａ＋ｘの間である。
【００８８】
２つの核酸配列（例えば、２つの遺伝子）の示したフラグメント、遺伝子１の位置１から位置Ａ＋ｘ及び遺伝子２の位置Ａから位置Ｎを含むベクターが構築される。これら２つの核酸フラグメント間に、ＤＮＡの断片（ＣＰ−挿入断片、本明細書では円順列挿入断片又は円順列核酸フラグメントと呼ばれることもある）が挿入される。この挿入される核酸フラグメントは長さがｘであり、遺伝子１のフラグメント由来の一カ所だけある制限部位ｙ塩基を有する。
ベクターが、この唯一の（ｕｎｉｑｕｅ）制限部位で開かれ、かつ核酸が、Ｅｘｏ ＩＩＩによって両方向に、ｘ塩基の切断短縮をするのに必要な量の時間切断される場合、切断短縮は、遺伝子１の位置（Ａ＋ｘ＋ｙ）−ｘ＝Ａ＋ｙ及び遺伝子２の位置（Ａ−（ｘ−ｙ））＋ｘ＝Ａ＋ｙに到達するだろう。長さｘのＤＮＡが、ｙ＝０とｙ＝ｘの間にランダムに位置するこの制限部位を含有する複数の核酸フラグメントである場合、このベクターの各方向のｘ塩基についての短縮化は、２つの遺伝子がアラインメントされる所又はその近傍のＡとＡ＋ｘとの間における遺伝子１及び遺伝子２間の可能な融合の実質的にすべてでないにしても、大部分となるだろう。
【００８９】
述べたように、融合されるべき２つの核酸配列の２つの（好ましくは重なっている）フラグメント間に、その２つのフラグメント内の重なりに等しい長さのＤＮＡのフラグメント（ＣＰ−挿入断片）が位置する。ＣＰ−挿入断片は、その中にランダムに位置する一カ所だけある制限部位を有する。この制限部位は、両方向の切断短縮化の発端である。
ＣＰ−ＩＴＣＨＹライブラリー作製用の試料ベクターは、図９ａに示されている。このベクターは、抗生物質耐性遺伝子（アンピシリン；Ａｐ）及び適切なプロモーター（ｌａｃ Ｐ／Ｏ）の下流にクローン化された２つの核酸配列（この例では、遺伝子フラグメントＰｕｒＮ［１−２０２］及びＧＡＲＴ［２０−２０３］）を有する。２つの遺伝子フラグメント間には、平滑末端を生成する制限酵素部位（ＥｃｏＲＶ）が唯一カ所位置する。これは、環状並べ換え核酸フラグメントの挿入部位である。
【００９０】
ＣＰ−挿入断片及びＣＰ−ＩＴＣＨＹライブラリーを作製するための方法論は、図９ｂに記述されている。ＣＰ−ＩＴＣＨＹライブラリーは、ＰＣＲで、又はより単純な技法、すなわち２つの遺伝子フラグメント間の重なりと等しい長さのＤＮＡの断片を増幅し、両端に固有の制限酵素（この場合はＸｂａＩ）を作製し、かつこのＤＮＡフラグメントをｐＵＣ１９のような適切なベクター中にクローン化することによって調製される。ＤＮＡは増やされ、かつＸｂａＩでｐＵＣ１９から切除され、かつ有意量の閉環状ＤＮＡが形成されるような希釈条件下でリガーゼによって処理される。
非常に希薄量のＤＮアーゼＩによる消化によって、その閉環状ＤＮＡがランダムな部位で線状化される。結果のランダムに線状化されたＤＮＡのギャップ、ニック及び／又は末端は、ＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡリガーゼを用いて修復され、かつ平滑末端連結によってｐＤＩＭ−Ｎ５のＥｃｏＲＶ部位内にクローン化される。その結果、２つの遺伝子フラグメント間にランダムに位置するＸｂａＩ部位を有する複数の円順列ハイブリッドが生成される。この複数の円順列ハイブリッドは、増加的切断短縮化用の原料ＤＮＡである。
【００９１】
複数の円順列ハイブリッドは、ＸｂａＩで消化されてベクターが線状化され、かつ図８に描かれる長さの時間Ｅｘｏ ＩＩＩで消化される。この消化後、ギャップで分離された２つの末端が残される。一本鎖オーバーハングがマングビーンヌクレアーゼによって除去され、その末端がクレノウフラグメントで平滑末端化され、その処理末端が末端間のギャップを閉じるための希釈条件下で連結されて、ＣＰ−ＩＴＣＨＹライブラリー（又は複数の環状並べ換え増加的切断短縮化ハイブリッド核酸）となる。
ＣＰ−ＩＴＣＨＹの主要な利点は、（ａ）１つのベクターしか必要でなく、（ｂ）切断短縮化が両方向同時に起こり、（ｃ）広範な時間点におけるサンプリングを必要とせず、（ｄ）ライブラリーを、配列がアラインメントされる（すなわち、活性融合をもっとも生じやすい）所又はその近傍における融合にかなり偏らせ、かつ（ｅ）この方法は、ＤＮＡをアガロース電気泳動ゲルから抽出するような時間がかかるある種の操作を必要としない。
【００９２】
本明細書では、本発明の方法によって製造される、特定の増加的切断短縮化修飾核酸、又は増加的切断短縮化ポリペプチド若しくはタンパク質、又はハイブリッドポリペプチド若しくはタンパク質も熟考される。従って、本発明の方法に従って特定の増加的切断短縮化修飾核酸が製造されると、このような構築物をさらに操作するために適切な宿主に形質転換させることが考慮される。
従って、形質転換された構成物自体が本発明の一局面を構成する。形質転換された構成物は、本明細書の他の箇所で述べられるように、選択又はスクリーニングされて、所望の特徴を有する特定の増加的切断短縮化修飾核酸を生じる。この特定の形質転換された増加的切断短縮化修飾核酸は、本発明の一局面で熟考される。
【００９３】
構築物自体は、一度選択又はスクリーニングされると、切断短縮ポリペプチド又はハイブリッドポリペプチドとして発現させることができる。切断短縮ポリペプチド又はハイブリッドポリペプチドのインビボ又はインビトロ発現は、本明細書の他の箇所で議論される。特定の発現した切断短縮化ポリペプチド又はハイブリッドポリペプチドも、本発明の一局面として熟考される。
複数の種々のハイブリッド核酸及びハイブリッドポリペプチド及びそれらのライブラリーは、本発明のさらなる局面として熟考される。従って、本発明は複数の発現した切断短縮化親核酸産物を考慮する。他の局面では、本発明は、複数の増加的切断短縮化ハイブリッド核酸を考慮する。さらに別の局面では、本発明は複数の第１変異型増加的切断短縮化ハイブリッド核酸を考慮する。さらに別の局面では、本発明は、複数の第２変異型増加的切断短縮化ハイブリッド核酸を考慮する。さらに別の局面では、本発明は、複数のシャッフルされた増加的切断短縮化ハイブリッド核酸を考慮する。さらに別の局面では、本発明は、複数の類似体含有増加的切断短縮化核酸を考慮する。さらに別の局面では、本発明は、複数の円順列増加的切断短縮化ハイブリッド核酸を考慮する。
【００９４】
本明細書で述べる種々の増加的切断短縮化修飾核酸及び／又はハイブリッドポリペプチドを生産又は構築するのに一般的に有用な種々のキットも考慮される。付加キットは、増加的切断短縮化ライブラリーの製造及び／又は複数の切断短縮組換えプラスミドの生産に有用である。このようなキットの有用な構成要素としては、以下の構成要素が挙げられる：
（ａ）標的核酸フラグメント内のヌクレオチド塩基を除去する精製エキソヌクレアーゼ試薬（Ｅｘｏ ＩＩＩのような）；
（ｂ）プラスミド又はバクテリオファージベクターのような組換えベクター分子（特に有用なものとしては、参照によってその全体が本明細書に取り込まれる、Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒ Ｍ，Ｓｈｉｍ ＪＨ，及びＢｅｎｋｏｖｉｃ ＳＪ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１７（１２）：１２０５−９（１９９９）に記載されているいくつかのｐＤＩＭＮ２、ｐＤＩＭＣ８、ｐＤＩＭＮ５、ｐＤＩＭＮ６、ｐＤＩＭＣ９が挙げられ）［上記（ｂ）に記載されるような組換えベクター分子のさらなる有用な特徴としては、制限部位、潜在的シーケンシング用プライマー結合部位、マルチクローニング部位、抗生物質耐性マーカー、及び／又は調節プロモーターが挙げられる］；
（ｃ）マングビーンヌクレアーゼ又はＳ１ヌクレアーゼのような一本鎖特異性ヌクレアーゼ酵素
（ｄ）キット内で有用な緩衝溶液としては、エキソヌクレアーゼ消化緩衝液、一本鎖特異性ヌクレアーゼ消化緩衝液、一本鎖特異性ヌクレアーゼ終結（停止）緩衝液、エキソヌクレアーゼ終結（停止）緩衝液、核酸ポリメラーゼ緩衝液及び／又は核酸リガーゼ緩衝液が挙げられ；
（ｅ）キット内で有用な核酸ポリメラーゼとしては、クレノウフラグメン若しくはＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼのようなＤＮＡポリメラーゼ又はＲＮＡポリメラーゼが挙げられ；
（ｆ）キットのさらなる要素としては、特有濃度のＮＴＰｓ又はｄＮＴＰｓの混合物；ヌクレオチド類似体；Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ又は他の適切なリガーゼのような核酸リガーゼ；及び所望の機能性のタンパク質を選択するのに好適な宿主が挙げられる。
このようなキットは、本発明のいずれの方法にも有用であることは理解されるだろう。特定の構成要素の選択は、そのキットが設計されて実施される特定の方法によって決まる。
【００９５】
特に好ましい実施形態では、本発明の方法を実施するための説明書を含む単一の封入物内にキットが梱包される。いくつかの実施形態では、試薬は容器に入れて供給され、直接使用又は希釈後使用に適した強度のものである。
１つの好ましい実施形態では、キットは精製エキソヌクレアーゼ試薬、ベクター、及び適宜の緩衝液を含む。好ましい緩衝液は、エキソヌクレアーゼ消化緩衝液である。さらに好ましい緩衝液は、エキソヌクレアーゼ終結緩衝液である。
さらに好ましい実施形態では、キットは精製エキソヌクレアーゼ試薬、ベクター、一本鎖特異性ヌクレアーゼ、及び適宜の緩衝液を含む。好ましい緩衝液としては、エキソヌクレアーゼ消化緩衝液及び一本鎖特異性ヌクレアーゼ消化緩衝液が挙げられる。さらに好ましい緩衝液としては、エキソヌクレアーゼ終結緩衝液及び一本鎖特異性ヌクレアーゼ終結緩衝液が挙げられる。
さらになお好ましい実施形態では、キットは精製エキソヌクレアーゼ試薬、ポリメラーゼ、ヌクレオチド類似体、及び適宜の緩衝液を含む。好ましい緩衝液はエキソヌクレアーゼ消化緩衝液である。さらに好ましい緩衝液は、エキソヌクレアーゼ終結緩衝液である。さらになお好ましい緩衝液は、ポリメラーゼ緩衝液である。好ましいヌクレオチド類似体は、ホスホロチオエート含有ヌクレオチド類似体である。キットは、さらに任意にＮＴＰｓ又はｄＮＴＰｓの混合物を含有する。
【００９６】
（実施例）
実施例１： 増加的切断短縮化によるタンパク質フラグメント相補性
大腸菌ｐｕｒＮ遺伝子（グリシンアミドリボヌクレオチドホルミルトランスフェラーゼをコードする）の重複フラグメントを和合性ベクターｐＤＩＭ−Ｎ２及びｐＤＩＭ−Ｃ６中にクローン化した。Ｎ末端フラグメント（ｐｕｒＮ［１−１４４］）は、残基１−１４４をコードするＤＮＡから成り、かつＣ末端フラグメント（ｐｕｒＮ［６３−２１２］）は、残基６３−２１２をコードするＤＮＡから成る。
ファジミドｐＤＩＭ−Ｎ２及びｐＤＩＭ−Ｃ６は、非常に大きなＦａｂ抗体ライブラリー作製用に設計された、ベクターｐＭＯｐｅｌＢ．Ｈ及びｐＭＯｐｅｌＢ．Ｌ中への一連のオリゴ置換によって構築されたものである。これら抗体ベクターは、それぞれｐＢＰ１０７（Ｐｏｓｎｅｒら，Ｇｅｎｅ １２８：１１１−１１７（１９９３））及びｐＴＣ０１（Ｃｏｌｌｅｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１００２６−１００３０（１９９２））に由来する。
【００９７】
２マイクログラムのＰｓｔＩ／ＸｂａＩ消化ｐＤＩＭ−Ｎ２又はＳａｃＩ／ＸｈｏＩ消化ｐＤＩＭ−Ｃ６を、１２℃で、６０ミリリットルの６６ミリモルトリス，ｐＨ８．０／０．６６ミリモルのＭｇＣｌ_２内で平衡にした。時間ゼロで、２００単位のエキソヌクレアーゼＩＩＩを添加した。その後３０分間１マイクロリットルの試料を３０秒毎に取り出し、４℃でインキュベートしている１８０マイクロリットルのＳ１ヌクレアーゼ緩衝液（４１ミリモルＫ−アセテート，ｐＨ４．６／３６５ミリモルＮａＣｌ／１．４ミリモルＺｎＳＯ_４／６．８パーセントグリセロール）と、２５単位のＳ１ヌクレアーゼを含有するチューブに添加した。
【００９８】
全試料を収集後、チューブを室温で３０分間インキュベートした。引き続き２４マイクロリットルのＳ１停止緩衝液（０．３モルトリス／５０ミリモルＥＤＴＡ）を添加し、かつチューブを７２℃で２０分間インキュベートして、Ｓ１ヌクレアーゼ及びＥｘｏ ＩＩＩを完全に不活性化した。酢酸アンモニウムによるエタノール沈殿後、ＤＮＡを８８マイクロリットルの水中に再懸濁させ、ＮｓｉＩ（ｐＤＩＭ−Ｎ２）又はＮｃｏＩ（ｐＤＩＭ−Ｃ６）のどちらかで消化した。２回目のエタノール沈殿後、ｐＤＩＭ−Ｃ６ ＤＮＡを２．５単位のクレノウフラグメント（０．１２５ミリモルの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰを含有する２ミリモルのトリス，ｐＨ８．０／１０ミリモルのＭｇＣｌ_２中）と共に５分間３７℃でインキュベートした。
【００９９】
ｐＤＩＭ−Ｎ２については、まずＤＮＡをｄＮＴＰｓと共に同一緩衝液内で３分間３７℃でインキュベートし、クレノウフラグメントの３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を用いて、ＮｓｉＩ消化によって残された３’オーバーハングを平滑末端化した。引き続きｐＤＩＭ−Ｎ２ ＤＮＡをｄＮＴＰｓと共にインキュベートした。
７５℃における２０分間のインキュベーションによるクレノウフラグメントの加熱不活性化後、一晩中室温での単分子平滑末端連結のため、１５単位のＤＮＡリガーゼを含有する４００マイクロリットルのリガーゼミックス（５０ミリモルトリス・ＨＣｌ，ｐＨ７．６／１０ミリモルＭｇＣｌ_２／１ミリモルＡＴＰ／５パーセントＰＥＧ−８００／１ミリモルＤＴＴ）を添加した。３０マイクロリットルの水中へのエタノール沈殿によってＤＮＡを濃縮し、５マイクロリットルの各ＤＮＡの６回のエレクトロポレーションによって、ＪＳ５細胞（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）中にエレクトロポレートした。２パーセントのグルコースを含有する６ミリリットルのＳＯＢ培地（２パーセントＢａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎｅ／０．５パーセントＢａｃｔｏ−Ｙｅａｓｔ抽出物／１０ミリモルＮａＣｌ／２．５ミリモルＫＣｌ／１０ミリモルＭｇＳＯ_４）内で１時間３７℃で回復後、その細胞を、２パーセントグルコースと、アンピシリン（１００マイクログラム／ミリリットル）又はクロラムフェニコール（５０マイクログラム／ミリリットル）のどちらかを含有する２４３×２４３ミリメートルのＴＹ培地プレート（０．８パーセントＢａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎｅ／０．５パーセントＢａｃｔｏ−Ｙｅａｓｔ抽出物／０．５パーセントＮａＣｌ／１．５パーセント寒天）上に塗布した。一晩中（約１６時間）３７℃で増殖後、プレートからライブラリーを２０ミリリットルの２Ｘ ＴＹ／２パーセントグルコース／１５パーセントグリセロール中に回収し、遠心分離で濃縮し、小分けして凍結した。
【０１００】
Ｎ末端およびＣ末端の切断短縮化ライブラリーを、ヘルパーファージを用いてファージ粒子中に充填し、対数増殖期の大腸菌株ＴＸ６８０’（ＴＸ６８０のＸＬ−１ブルーとの交配によって構成された）の１０ミリリットルの培養中に、約１〜５パーセントの細胞が両プラスミドで感染されるような力価で感染させた。感染は浸透せずに３７℃にて３０分間行った。
そして、細胞を遠心分離し、１０ミリリットルの選択培地（Ｍ９塩、０．２パーセントグルコース、０．０６パーセントカゼイン、２マイクログラム／ミリリットルのチアミン、４０マイクログラム／ミリリットルのカナマイシン）で１回洗浄し、かつ２ミリリットルの選択培地内に再懸濁させた。培養を３７℃で２時間振とう後、希釈物を０．３ミリモルのイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシドを有する選択プレート上に塗布した。プレートを３７℃で４８時間までインキュベートした。
【０１０１】
２８時間以内に現れたランダムに選ばれたコロニーを選択プレート上で再びストリーク培養して、相補性を確認し、かつ単一ポジティブの単離を保証した。これらプレートから、アンピシリン及びクロラムフェニコールを含有するリッチプレート（ＴＹ）上でポジティブを再びストリーク培養した。このリッチプレートからのコロニーを、ＰｕｒＮ遺伝子の開始及び末端用プライマーを用いてＰＣＲスクリーニングによってＰｕｒＮ組換えについて試験した。組換え体でないそれらポジティブからプラスミドＤＮＡを単離し、２つのプラスミドを単離して配列決定できるように非常に希薄濃度で大腸菌株ＤＨ５αに形質転換した。これらＤＨ５α形質転換体由来のプラスミドＤＮＡを、該栄養要求体に戻して再び形質転換して（別個及び一緒の両方）、ＰｕｒＮヘテロダイマーに原因する相補性を確認した。相補性を確認後、その切断短縮化された遺伝子の配列決定をペンシルバニア州立大学のＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｆａｃｉｌｉｔｙで行った。
【０１０２】
ＬＢ培地（２パーセントのグルコース、１００マイクログラム／ミリリットルのアンピシリン、５０マイクログラム／ミリリットルのクロラムフェニコール、及び１２．５マイクログラム／ミリリットルのテトラサイクリンで補充された）内の一晩（約１６時間）培養からの細胞を、５容量の最小増殖培地［Ｍ９塩、０．２パーセントグルコース、２マイクログラム／ミリリットルのチアミン、全２０種の推奨レベルのアミノ酸（Ｇｅｒｈａｒｄｔら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９４））、４０マイクログラム／ミリリットルのカナマイシン、１２．５マイクログラム／ミリリットルのテトラサイクリン、及び０．３ミリモルのイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド］内で１回洗浄し、２５０ミリリットルのフラスコ内の５０ミリリットルの最小増殖培地中に１，０００倍希釈した。培養を３７℃で２００回転／分で揺り動かし、種々の時間で１ミリリットルの試料を取り出して６００ナノメートルにおけるＯＤを測定することによって増殖を監視した。対数期初期（ＯＤ_６００＝０．０２−０．１０）の倍加時間を計算した。野生型モノマーＰｕｒＮ又はヘテロダイマーのを発現する栄養要求性細胞の遅延時間は本質的に同一なので（約２．５時間）、測定される成長速度は組換え事象の結果ではあり得ない。
【０１０３】
実施例２： ハイブリッド酵素作製のための増加的切断短縮化
ファジミドｐＤＩＭ−Ｎ２とｐＤＩＭ−Ｃ６については、本明細書の他の箇所で記述されている。ファジミドｐＤＩＭ−Ｃ８は、ＢａｌＩＩ部位のＢａｍＨＩ部位との置換及びＮｓｉＩ部位のＳｐｅＩ部位から１０塩基対下流のＰｓｔＩ部位との置換を除き、ｐＤＩＭ−Ｃ６と同一である。
増加的切断短縮化：
増加的切断短縮化は、以下の修正をして、基本的に実施例１で述べたように行った。超コイルｐＤＩＭ−Ｎ２及びｐＤＩＭ−Ｃ８は、それぞれＸｂａＩ／ＰｓｔＩ及びＳａｃＩ／ＸｈｏＩによる消化によって線状化した。６０マイクロリットルの６６ミリモルトリス（ｐＨ８．０）、０．６６ミリモルＭｇＣｌ_２、１００ミリモルＮａＣｌ中２２℃でＥｘｏ ＩＩＩ消化を行った。Ｅｘｏ ＩＩＩ及びＳ１ヌクレアーゼの不活性化後、エタノール沈殿されたＤＮＡを７０マイクロリットルの水中に再懸濁させた。０．１２５マイクロモルの各ｄＮＴＰを１０マイクロリットル添加後、２．５単位のクレノウフラグメント（２ミリモルのトリス・ＨＣｌ、１０ミリモルＭｇＣｌ_２、ｐＨ８．０中）を添加し、その混合物を５分間３７℃でインキュベートし、次いで７２℃で２０分間クレノウフラグメントを加熱不活性化した。
【０１０４】
ＤＮＡをＮｓｉＩ（１５単位）によって３７℃で２時間消化させ、所望のフラグメントをＥｌｕｔｒａｐ（登録商標）（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ；Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）を用いてゲル電気泳動法で単離し、混ぜ、かつエタノール沈殿によって濃縮した。６Ｗｅｉｓｓ単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて全容量２０マイクロリットル内において１５℃で一晩（約１６時間）連結を行った。連結されたＤＮＡを３０マイクロリットルの水中へエタノール沈殿して脱塩し、各ＤＮＡ５マイクロリットルの６回のエレクトロポレーションによってＤＨ５α細胞中に、又はそれぞれ４マイクロリットルの２回のエレクトロポレーションによってＤＨ５α−Ｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）中にエレクトロポレートした。ライブラリーを回収して実施例１と同様に貯蔵した。
【０１０５】
活性なハイブリッドの選抜：
ＩＴＣＨＹの及びＤＮＡシャッフリングライブラリーのプラスミドＤＮＡをＴＸ６８０Ｆ’に形質転換し、回収し、かつ上述したように凍結した。２５０マイクロリットルの振とうフラスコ内で、５０マイクロリットルの２Ｘ ＴＹ／Ａｍｐ／Ｋａｎ／０．２パーセントグルコースに、１０マイクロリットルの凍結ライブラリーを接種して（１０^８より多いコロニー形成単位）３７℃でＯＤ_{６００ｎｍ}＝０．２まで増殖させた。１０ミリリットルの培養からの細胞を遠心分離によってペレット化し、１０ミリリットルの選択培地で１回洗浄し、かつ２ミリリットルの選択培地中で再懸濁させた。３７℃で２時間振とう後、約０．５×１０^６コロニー形成単位（リッチ培地）を０．３ミリモルのイソプロピルチオガラクトシドを含有する選択プレート上に塗布した。プレートを３７℃で４８時間までインキュベートした。ランダムに選ばれたコロニーを処理して配列決定し、上述したように相補性検証した。
【０１０６】
動力学的特徴づけ：
ＧＡＲ及びｆＤＤＦを用いた動力学的特徴づけは、Ｓｈｉｍ ＆ Ｂｅｎｋｏｖｉｃ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７：８７７６−８７８２（１９９８）に記載されているように行った。野生型大腸菌ＰｕｒＮは、Ａｌｍａｓｓｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６１１４−６１１８（１９９２）に記載されているように調製した。ＰｕｒＮ−ＧＡＲＴ融合は、ポジティブ（ｐＤＩＭ−Ｎ２）及びＴＸ６８０Ｆ’細胞から単離されたベクターを用いて同一の方法で調製した。融合濃度は、最も活性なゲルろ過フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離のデンシトメトリーによって評価した。精製ＧＡＲＳ−ＡＩＲＳ−ＧＡＲＴは、Ｌ．Ｔ．Ｇｏｏｌｊａｒｓｉｎｇｈからの寄贈だった（ペンシルバニア州立大学、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐａｒｋ，ＰＡ）。
【０１０７】
実施例３： 円順列増加的切断短縮化ハイブリッドライブラリーの作製
（材料及び方法）
使用するすべての酵素は、特に言及しない限り、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｅｙ，ＭＡ）から入手した。
プラスミド構築物：
ファジミドｐＤＩＭ−Ｎ５は、図９に示されるように、ｐＤＩＭ−Ｎ２の短いＢａｍＨＩ−ＮｓｉＩフラグメントをオリゴヌクレオチドと置換することによって作製した。ファジミドｐＤＩＭ−Ｎ５−ＰｕｒＮ［１−２０２^＊］／ＧＡＲＴ［２０−２０３］は、ｐＤＩＭ−Ｎ５のＮｄｅＩとＢａｍＨＩ部位との間のアミノ酸残基１−２０２（突然変異Ｄ１４４Ａを有する）をコードする大腸菌ｐｕｒＮ遺伝子のフラグメントと、ｐＤＩＭ−Ｎ５のＢｇｌＩＩとＳｐｅＩ部位との間のアミノ酸残基２０−２０３をコードするヒトＧＡＲＴ遺伝子のフラグメントとを含む。
【０１０８】
環状並べ換え挿入断片の作製：
大腸菌ｐｕｒＫ遺伝子の５２８塩基対フラグメントは、オリゴＸｂａ−ｆｏｒ
（５’−ＴＴＡＧＧＣＣＧＴＣＴＡＧＡＧＣＧＴＣＡＧＧＣＡＧＧＣＧＡＡＣＣＧ−３’）（配列番号：１）
及びＸｂａ−５２８
（５’−ＧＣＧＧＡＡＡＡＴＣＴＡＧＡＣＴＧＧＴＧＣＧＣＡＡＡＡＴＡＣＣＧ−３’）（配列番号：２）
を用いて、それがＸｂａＩ部位（下線を引いた）と隣接するようにＰＣＲによって増幅した。このフラグメントをＸｂａＩで消化させ、ｐＵＣ１９の唯一の（ｕｎｉｑｕｅ）ＸｂａＩ部位中にクローン化してｐＵＣ１９−Ｘｂａ５２８を作製した。７マイクログラムのｐＵＣ１９−Ｘｂａ５２８を１５００単位のＸｂａＩで消化させ、より短いフラグメントをＱＩＡＥＸ（登録商標）ＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ；Ｖａｌｅｎｉｃｉａ，ＣＡ）を用いてゲル電気泳動法によって単離した。このフラグメント６マイクログラムを、全容量１．７ミリリットルのリガーゼ緩衝液（５０ミリモルトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ミリモルＭｇＣｌ_２、１０ミリモルジチオスレイトール、１ミリモルＡＴＰ、２５マイクログラム／ミリリットルのウシ血清アルブミン）中１８時間１６℃で、２００Ｗｅｉｓｓ単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼで処理した。この連結混合物を４ミリリットルまでの水で希釈し、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−３０^ＴＭスピンカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いて約５０倍に濃縮した。そして、そのＤＮＡを、２００マイクロリットル容量のＥｘｏ ＩＩＩ緩衝液（６６ミリモルトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８，０．６６ミリモルＭｇＣｌ_２）中、３７℃で３０分間６００単位のＥｘｏ ＩＩＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって消化させて、いずれの未連結線状ＤＮＡをも除去した。Ｅｘｏ ＩＩＩを７２℃における２０分間のインキュベーションによって不活性化した。この環状ＤＮＡをＱＩＡＥＸ（登録商標）ＩＩを用いて脱塩し、最終容量５０マイクロリットルのＥＢ緩衝液（１０ミリモルトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５）とした。
【０１０９】
一連の試験消化を行って、最高収率の線状産物を与えるＤＮアーゼＩの濃度を決定した。ＤＮアーゼＩ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮからのＲＮアーゼ−フリー）は、５０ミリモルのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５と５０パーセントのグリセロール中に１マイクロリットル当たり１単位の−２０℃で貯蔵される作業ストックを作製することによって調製した。使用する日に、その作業ストックを５０ミリモルのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ミリモルのＭｎＣｌ_２及び５０マイクログラム／ミリリットルのウシ血清アルブミン中に希釈した。この研究では、３０マイクロリットルの環状ＤＮＡを、４００マイクロリットル容量の５０ミリモルのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）と１ミリモルのＭｎＣｌ_２中、０．８３ミリ単位のＤＮアーゼＩによって、２２℃で１５分間消化させた。２０マイクロリットルの５０ミリモルＥＤＴＡ，ｐＨ８．０を添加して消化を停止させ、ＱＩＡｑｕｉｃｋ^ＴＭカラム（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて５０マイクロリットルのＥＢ緩衝液に脱塩した。この線状化されたＤＮＡを、３単位のＴ４ ＤＮＡポリメラーゼと、１２５マイクロモルの各ｄＮＴＰを含むリガーゼ緩衝液中の６Ｗｅｉｓｓ単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて修復した。この修復された線状化ＤＮＡ（すなわち、環状に並べ換えられた挿入断片）を、ＱＩＡＥＸ（登録商標）ＩＩを用いたアガロースゲル電気泳動法によって、２０マイクロリットルのＥＢ緩衝液に単離した。
【０１１０】
１００マイクロリットル中５０単位のＥｃｏＲＶで、１０マイクログラムのｐＤＩＭ−Ｎ５−ＰｕｒＮ［１−２０２^＊］／ＧＡＲＴ［２０−２０３］を２．５時間消化させてベクターを調製した。引き続き、９０マイクロリットルの水、１０マイクロリットルのＣＩＡＰ緩衝液（５００ミリモルのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．３）、１０ミリモルのＭｇＣｌ_２、１ミリモルのＺｎＣｌ_２、１０ミリモルのスペルミジン）と、７単位の子ウシ腸管アルカリホスファターゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加し、その溶液を３７℃でさらに１時間インキュベートした。アルカリホスファターゼを不活性化するため、２マイクロリットルの５００ミリモルＥＤＴＡ，ｐＨ８．０を添加し、ＤＮＡを７２℃で１５分間インキュベートした。ＤＮＡをＱＩＡＥＸ（登録商標）ＩＩを用いてアガロースゲル電気泳動法によって全容量５０マイクロリットルのＥＢ緩衝液に精製した。
【０１１１】
１００ナノグラムのＥｃｏＲＶ処理した脱リン酸ベクターを、容量１５マイクロリットルの３０Ｗｅｉｓｓ単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼによって、２２℃で約２０時間、１０マイクロリットルの環状に並べ換えられた挿入断片に連結した。１マイクロリットルの連結ミックスの５０マイクロリットルのＤＨ５α−Ｅ電気形質転換受容性細胞中への８回のエレクトロポレーション（１マイクログラムのＤＮＡ当たり約１０^１０形質転換体と見積もられる）の結果、２４３×２４３ｍｍプレート上に１．１×１０^６形質転換体のライブラリーとなった。以前に記載されているように、このライブラリーを回収して貯蔵した。Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒ，Ｍ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：３５６２−３５６７（１９９９）。
【０１１２】
円順列挿入断片のＰＣＲ特徴づけ：
凍結ライブラリーの希釈物のプレーティング物から生じた個々のコロニーをＰＣＲで分析して、ライブラリーの個々のメンバー内のＸｂａＩ部位の位置を決定した。ある特定のコロニーにとって円順列挿入断片がどの方向で存在しているか分からないので、ＰＣＲ反応には３つのオリゴ：Ｘｂａ−ｆｏｒ、Ｘｂａ−５２５及び
ＰｕｒＮ−ｆｏｒ：（５’−ＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＡＴＡＴＴＧＴＧＧＴＧＣＴＴＡＴＴＴＣＣ−３’）、（配列番号：３）、すなわち、ｐｕｒＮ遺伝子の始まりにアニールするオリゴを用いた。円順列挿入断片が連結された方向に依存して、（ＰｕｒＮ−ｆｏｒとＸｂａ−５２８）又は（ＰｕｒＮ−ｆｏｒとＸｂａ−ｆｏｒ）のどちらかが指数関数的な増幅を生じるだろう。ＰＣＲ産物の大きさは、アガロースゲル電気泳動法で決定し、ｐｕｒＮ［１−２０２^＊］の大きさを減じることによって、ＸｂａＩ部位の位置を決定した。
【０１１３】
増加的切断短縮化：
凍結ライブラリーの４０パーセントに対するプラスミド調製（ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）Ｍｉｄｉｐｒｅｐ；ＱＩＡＧＥＮ）により、５４マイクログラムの超コイルプラスミドが産生された。プラスミドＤＮＡ（２０マイクログラム）を４０単位のＸｂａＩによって３７℃で１．５時間消化させた。ＱＩＡＥＸ（登録商標）ＩＩを用いたアガロースゲル電気泳動法によって切らないベクターおよび円順列挿入断片を含有しないベクターから線状化ベクターを単離した。
４マイクログラムの線状化ベクターについて、２２℃で１２０マイクロリットルの６６ミリモルトリス（ｐＨ８．０）／０．６６ミリモルＭｇＣｌ_２／５０ミリモルＮａＣｌ中、８００単位のＥｘｏ ＩＩＩを用いてＥｘｏ ＩＩＩ消化を行った。２４マイクロリットルアリコートを２４、２５、２６、２７及び２８分で取り出し、７２マイクロリットルの４０．５ミリモル酢酸カリウム（ｐＨ４．６）、３３８ミリモルＮａＣｌ、１．３５ミリモルＺｎＳＯ_４、６．７６パーセントのグリセロールに、４℃で添加して消化をクエンチングさせた。全試料をクエンチングした後、０．５ミリリットルのＱＩＡｑｕｉｃｋ^ＴＭ緩衝液ＰＢ（ＱＩＡＧＥＮ）を添加し、１つの修正（洗浄ＰＥ緩衝液の添加後、如何なる塩をも確実に除去するために回転させる前に、試料を５分間室温でインキュベートすること）を加えて、ＱＩＡｑｕｉｃｋ^ＴＭ手順によってＤＮＡを精製した。
【０１１４】
４７マイクロリットルのＥＢ緩衝液を用い、ＤＮＡをＱＩＡｑｕｉｃｋ^ＴＭカラムから溶離した。この溶離液に、５マイクロリットルの１０ｘマングビーン緩衝液（５００ミリモル酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）、３００ミリモルＮａＣｌ、１０ミリモルＺｎＣｌ_２）と、０．４単位のマングビーンヌクレアーゼを添加し、その溶液を３０℃で３０分間インキュベートした。次に、０．２５ミリリットルのＱＩＡｑｕｉｃｋ^ＴＭ緩衝液ＰＢ（ＱＩＡＧＥＮ）を添加し、上記修正を加えてＱＩＡｑｕｉｃｋ^ＴＭ手順によってＤＮＡを精製した。
【０１１５】
４７マイクロリットルの緩衝液ＥＢを用い、ＤＮＡをＱＩＡｑｕｉｃｋＴＭカラムから溶離した。この溶離液に、５マイクロリットルのｄＮＴＰミックス（０．１２５ミリモルの各ｄＮＴＰ）と、５マイクロリットルの１０ｘ ＥｃｏＰｏｌ緩衝液（１００ミリモルトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ミリモルＭｇＣｌ_２、７５ミリモルのジチオスレイトール）を添加し、その溶液を３７℃に平衡化した。次に、１単位のクレノウＤＮＡポリメラーゼを添加した。５分の３７℃インキュベーション後、クレノウ含有組成物を７５℃で２０分間加熱不活性化した。この溶液に、９８．７マイクロリットルの水、２０マイクロリットルの１０ｘ連結緩衝液、２０マイクロリットルの５０パーセントＰＥＧ及び１．３３マイクロリットルのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（８Ｗｅｉｓｓ単位）を添加し、その溶液を室温で一晩（約１６時間）インキュベートした。
ＤＮＡをエタノール沈殿（塩として酢酸アンモニウムを有する）によって、１０マイクロリットルの水中に濃縮した。３マイクロリットルのＤＮＡの５０マイクロリットルのＴＸ６８０Ｆ’電気形質転換受容性細胞中への１回のエレクトロポレーション（１マイクログラムのｐＵＣ１９当たり１×１０^８形質転換体と見積もられる）の結果、各時間点について約１×１０^６のライブラリーが作製された。
【０１１６】
活性融合の選択：
活性なＰｕｒＮ−ＧＡＲＴ融合は、前述したようなＧＡＲトランスホルミラーゼ栄養要求性大腸菌株（ＴＸ６８０Ｆ’）の相補性によって同定した。
（結果）
円順列ＩＴＣＨＹ（ＣＰ−ＩＴＣＨＹ）の塩基の数学的解説は、図８に示される。この方法では、切断短縮化される両遺伝子フラグメントが単一のベクター上に位置し（図９）、その間に、ランダムに位置する制限部位（ＸｂａＩ）を唯一カ所有し、かつ好ましくはその２つの遺伝子フラグメント間の重なりの長さに等しい長さのＤＮＡ断片が挿入される。ランダムに位置する制限酵素部位を含有する構築物のライブラリーは、ＤＮＡ断片の円順列化を含む方法によって構築される（図９Ｂ）。本発明の他の方法において、ＤＮＡ上の固定点から種々の長さの時間で切断短縮化することにより、切断短縮化の長さの変化が作られる。この方法では、切断短縮化の長さの変化は、ＤＮＡ上の種々の点から１種の長さの時間、切断短縮化を行うことで作製される。
【０１１７】
モデルシステムの説明：
他の箇所で示されるように、本発明の方法を用いて、ＰｕｒＮ（大腸菌グリシンアミドリボヌクレオチドホルミルトランスフェラーゼ）のＮ末端フラグメントと、ＧＡＲＴ（ヒトグリシンアミドリボヌクレオチドホルミルトランスフェラーゼ）のＣ末端フラグメントとの間の活性な融合体を同定できる。Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒ，Ｍ．ら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１２０５−１２０９（１９９９）。この研究は、アミノ酸残基５４と１４４の間のどこかで融合される活性なハイブリッドを検索するために設計されたが、すべての活性ハイブリッドはアミノ酸残基１００と１４４の間でのみ融合され、ほどんどすべての活性ハイブリッドはちょうど配列がアラインメントされるところで融合されることが分かった。
【０１１８】
このモデルシステムは、複数の円順列増加的切断短縮化ハイブリッド（本明細書では、ＣＰ−ＩＴＣＨＹと呼ばれることがある）の製造方法を試し、かつ同時に検索範囲をアミノ酸残基２０と１４４の間に拡大するために使用した。増加的切断短縮化の拡大された範囲を求めて、２７０塩基対から５００塩基対を超えるまで拡大された。しかし、ＰｕｒＮ［１−１４４］より長いＰｕｒＮのフラグメントは、それ自体で活性であろう。単にＰｕｒＮ残基があることによって活性なＰｕｒＮとＧＡＲＴとの融合を得ることなく、切断短縮化の範囲を拡大するため、残基１４４がアスパラギン酸からアラニンに突然変異、すなわちＰｕｒＮを不活性化する突然変異を導入されたＰｕｒＮのフラグメントを用いた。Ｓｈｉｍ，Ｊ．Ｈ．及びＢｅｎｋｏｖｉｃ，Ｓ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３８：１００２４−１００３１（１９９９）。従って、使用したフラグメントはＧＡＲＴ［２０−２０３］及びＰｕｒＮ［１−２０２^＊］であり、星は突然変異の印である。これは、１８２アミノ酸残基（５４６塩基対）の２つのフラグメント間の重なり範囲を与え、２つの遺伝子のほとんど全長である。しかし、ＰｕｒＮ［１−２０２^＊］内のＤ１４４Ａ突然変異のため、１４５と２０２との間に活性な融合が見られることは予期されなかった。
【０１１９】
円順列ハイブリッドのライブラリー：
フラグメントｐｕｒＮ［１−２０２^＊］とＧＡＲＴ［２０−２０３］を図９Ａに示されるようにファジミドｐＤＩＭ−Ｎ５中にクローン化した。円順列化挿入断片中にクローニングするための調製において、このファジミドを２つの遺伝子フラグメント間のＥｃｏＲＶ消化によって線状化し、アルカリホスファターゼで処理し、アガロースゲル電気泳動法で精製した。
ｐｕｒＫ遺伝子のフラグメントを、それがＸｂａＩ部位と隣接するように増幅した。ｐｕｒＫフラグメントの長さは、それが環状に並べ換えられ、かつｐＤＩＭ−Ｎ５中にクローン化されると、ＰｕｒＮ［１−２０２＊］の末端と、ＧＡＲＴ［２０−２０３］の最初との間の距離が、配列アラインメント内におけるＰｕｒＮ［１−２０２＊］とＧＡＲＴ［２０−２０３］との間の重なりに等しくなるような長さだった。
【０１２０】
原理的には、ＰＣＲ産物を直接円順列化スキームで使用することができるが、より良い結果は、まずそれをｐＵＣ１９のＸｂａＩ部位中にクローニングし、それをＸｂａＩで消化し、かつそのフラグメントをアガロースゲル電気泳動法で単離することによって得られた。ＸｂａＩオーバーハングを有するｐｕｒＫのフラグメントは、ＤＮＡの希薄濃度下で連結して環状にされたので、主要産物は閉じた環状ＤＮＡだった。
時には環状化後に少量の線状出発原料が見られることがあるので、リガーゼ処理ＤＮＡをＥｘｏ ＩＩＩでインキュベートして、増加的切断短縮化ライブラリーを非生産的に偏らせるであろう線状ＤＮＡを除去した。次に、最高収率の線状ＤＮＡを与える量（例えば、平均して、環状ＤＮＡ中に１つの二本鎖ブレイクを生成するのに必要なＤＮアーゼＩの量）のＤＮアーゼＩで環状ＤＮＡを消化させた。このＤＮアーゼＩ消化されたＤＮＡを、ｄＮＴＰｓの存在下でＴ４ ＤＮＡリガーゼとＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理し、線状産物中のギャップ及びニックを修復して平滑末端を生成した。この平滑末端、環状に並べ換えられたＤＮＡを、ＥｃｏＲＶとアルカリホスファターゼによる処理によって２２℃で連結されているｐＤＩＭ−Ｎ５中に挿入した。
【０１２１】
ＤＨ５α−Ｅ中へのエレクトロポレーションの結果１．１×１０^６形質転換体のライブラリーとなり、すべてではないが、約５００の可能な円順列が存在することを確かめた。ライブラリー内のＸｂａＩ部位のランダム分布を確証するため、ランダムに選択したコロニーについてＰＣＲを行った。予想通り、ＸｂａＩ部位の位置は基本的にランダムだった。
【０１２２】
増加的切断短縮化に対する一般的な改良：
先の実施例に対する２つの変更について述べる。第１に、Ｅｘｏ ＩＩＩ消化後の一本鎖尾部を除去するためにＳ１ヌクレアーゼに代えてマングビーンヌクレアーゼを用いた。Ｓ１ヌクレアーゼは、全ＤＮＡ分子からの一本鎖尾部の除去に時々失敗し、これが前述した短い切断短縮物への偏りの主な理由となることが分かった。この時折の失敗は、大部分は切断短縮化されるＤＮＡに相関するようであり、かつＳ１ヌクレアーゼはプラスミドＤＮＡ調製物中の何らかの不純物に敏感に反応しやすい。
第２の改良は、加熱不活性化とエタノール沈殿を、ＤＮＡアフィニティカラム（ＱＩＡｑｕｉｃｋ^ＴＭ）に置き換えてＤＮＡをＥｘｏ ＩＩＩ及び一本鎖ヌクレアーゼから精製することである。これは、切断短縮化されたＤＮＡの収率と品質をかなり改善した。
【０１２３】
ＣＰ−ＩＴＣＨＹライブラリー：
切断短縮用調製において、円順列ハイブリッドライブラリー由来のプラスミドをＸｂａＩで消化させ、アガロースゲル電気泳動法で精製した。このＤＮＡについて対照消化を用い、使用条件下（８００単位のＥｘｏ ＩＩＩを有する１２０マイクロリットルの６６ミリモルトリス（ｐＨ８．０）／０．６６ミリモルＭｇＣｌ_２／５０ミリモルＮａＣｌ中４マイクログラムのＤＮＡ）では、Ｅｘｏ ＩＩＩ消化の速度は、各方向に１分当たり約２１塩基対であることが分かった。従って、各方向に５４６塩基対を消化するためには、２６分の消化時間が必要である。
ＸｂａＩ消化されたＤＮＡを、Ｅｘｏ ＩＩＩで、２４、２５、２６、２７又は２８分間消化させた後、高い塩、低ｐＨ緩衝液中でクエンチングした。これら５つのライブラリーは、以後ＣＰ−２４、ＣＰ−２５等と呼ばれる。ＤＮＡを脱塩し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ^ＴＭアフィニティカラムを用いてＥｘｏ ＩＩＩから精製した。マングビーンヌクレアーゼで処理して一本鎖尾部を除去した後、ＤＮＡをクレノウフラグメントで処理して平滑末端化を確実にした。希薄条件下における２２℃での連結により、切断短縮化ＤＮＡライブラリーを環状化した。
【０１２４】
ＤＮＡをエタノール沈殿によって１０マイクロリットルに濃縮し、このうちの３マイクロリットルを５０マイクロリットルのエレクトロコンピテントＴＸ６８０Ｆ’細胞中（１マイクログラム毎に１×１０^８形質転換体でｐＵＣ１９によって形質転換するように決定）にエレクトロポレーションした。５つのライブラリーサイズ（形質転換体の数）は、９×１０^５〜１．１×１０^６の範囲だった。
５つのライブラリーのサイズ分布は、ＰｕｒＮ順方向及びＧＡＲＴ逆方向プライマーを用いて、５つのライブラリーのランダムに選択された５５のメンバーについてのＰＣＲ反応をアガロースゲル電気泳動することによって決定した。この方法は、本発明の他の方法がよりフラットな分布を提供するのに対し、元の遺伝子とほぼ同サイズの融合物に偏ったライブラリーを創る。
【０１２５】
活性な融合物の選択：
５つのライブラリーの活性なメンバーは、前述したように３７℃で増殖した大腸菌栄養要求株の相補性によって同定した。Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒ，Ｍ．ら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１２０５−１２０９（１９９９）。予想通り、最高頻度の活性融合がＣＰ−２６で見られた。しかし、切断短縮化された１００塩基対当たり２２塩基対という、切断短縮化の長さと共に直線的に増加する切断短縮長の標準偏差（Ｈｏｈｅｉｓｅｌ，Ｊ．Ｄ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０９：２３８−２４６（１９９３））のサイズのため、活性融合は他の４つのライブラリーでも見られた。ＣＰ−２６における融合の頻度は、複数の増加的切断短縮化ハイブリッド遺伝子の製造方法で予想される頻度よりほぼ４倍高い。このような同サイズ範囲にわたるいわゆるＴＶ−ＩＴＣＨＹライブラリーで予想されるポジティブの頻度は、２７０塩基対にわたって切断短縮が起こる、より小さいライブラリーの頻度の記録を取り（Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒ，Ｍ．ら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１２０５−１２０９（１９９９））、かつ切断短縮化の範囲が５４６塩基対であるときは、このライブラリーの範囲外には何も新しい融合が見られないことを知った上で（以下参照）、５４６と２７０塩基対の切断短縮の理論的なライブラリーサイズの比（５４６^２／２７０^２）で除して見積もった。
【０１２６】
２０個のランダムな活性融合を配列決定した。ＴＶ−ＩＴＣＨＹライブラリーＩＴ−Ｂの２０個のランダムに選択された活性メンバーと同様に（１１個の異なるＤＮＡ配列及び７個の異なるタンパク質を同定した）（Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒ，Ｍ．ら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１２０５−１２０９（１９９９））、ＣＰ−ＩＴＣＨＹは、相同性及び非相同性位置で種々の異なる融合点（１０個の異なるＤＮＡ配列及び６個の異なるタンパク質）を同定する。ＣＰ−ＩＴＣＨＹで同定された６タンパク質のうちの３つは、新規に同定された活性融合である。
【０１２７】
温度感受性融合：
ＣＰ−ＩＴＣＨＹライブラリーＣＰ−２４及びＣＰ−２７も、２２℃で栄養要求体の相補性について試験した。２２℃におけるポジティブの頻度は、３７℃におけるポジティブの頻度より、それぞれ８．０倍及び５．４倍高いことが分かった。２２℃で選択されたＣＰ−２４の１０個のランダムに選択したポジティブのうち、５個は３７℃では成長できないことが分かった。全１０個のポジティブ由来の遺伝子融合を配列決定した。５個の温度感受性融合は、アミノ酸残基８０と９０の間の領域、すなわち以前には活性融合が同定されていない領域内で融合された。５つの非温度感受性融合は、３７℃における選択によって以前に同定された領域内で融合された。
【０１２８】
実施例４： シャッフルされた増加的切断短縮化遺伝子ライブラリーの作製。 Ａ．概要：
大腸菌ＰｕｒＮ及びＦＭＴタンパク質は、両方ともホルミルテトラヒドロ葉酸由来のホルミル基をそれらの基質に伝達するホルミルトランスフェラーゼである。ＰｕｒＮに対する基質は、グリシンアミドリボヌクレオチドであり、かつＦＭＴに対する基質はメチオニル−ｔＲＮＡである。ＦＭＴのＮ末端ドメインは構造的にＰｕｒＮと相同性であり、かつＰｕｒＮとＦＭＴは両方とも同一の主要な活性部位残基（ＰｕｒＮについてはＮ１０６、Ｈ１０８及びＤ１４４、またＦＭＴについてはＮ１０９、Ｈ１１１及びＤ１４７）を含むことが示された。これは、共通祖先のタンパク質を示唆している。しかし、この二者間のＤＮＡ配列相同性は非常に低く（アラインメントがどのように遂行されるかによって左右されるが、約３０〜３５パーセント）、二者間でインビトロ組換えを行うには低すぎる。ＰｕｒＮとＦＭＴを用いて、１つより多くの交差を有するＰｕｒＮ−ＦＭＴハイブリッドのシャッフルされた増加的切断短縮化ハイブリッド遺伝子（本明細書ではＳＣＲＡＴＣＨＹと呼ばれることがある）ライブラリーを作製した。
【０１２９】
Ｂ．ＩＴＣＨＹライブラリーの作製：
ＳＣＲＡＴＣＨＹライブラリー作製用のベクターは、図１０に示される。ｐｕｒＮとＦＭＴのフラグメント間でＴＶ−ＩＴＣＨＹ法によって２つのＩＴＣＨＹライブラリーを作った。第１ライブラリーでは（Ｎ−Ｆ）、開始Ｎ末端遺伝子フラグメントはＰｕｒＮ［１−１６４］であり、開始Ｃ末端遺伝子フラグメントはＦＭＴ［８９−２１４］だった。第２ライブラリーでは（Ｆ−Ｎ）、開始Ｎ末端遺伝子フラグメントはＦＭＴ［１−１６７］であり、開始Ｃ末端遺伝子フラグメントはＰｕｒＮ［８６−２１２］だった。両ライブラリーにおいて、３つの主要な活性部位残基内に以下の点突然変異を含んでいた：Ｎ１０６Ｗ、Ｈ１０８Ｒ及びＤ１４４Ｌ。診断目的のため、コドン１０６〜１０８内にＢａｍＨＩ制限部位が創られるように、コドン１０７でサイレント突然変異を生じさせた。これらフラグメント間の重なりの領域内のＤＮＡ相同性は３４パーセントである。Ｎ−Ｆ及びＦ−Ｎ ＩＴＣＨＹライブラリーを両方とも、上述した各フラグメントから０〜３００塩基が欠失されるように消化させた。形質転換体の数に基づいて、ライブラリーＮ−Ｆは３．７×１０^５メンバーを有し、ライブラリーＦ−Ｎは５．５×１０^５メンバーを有していた。
【０１３０】
Ｃ．インフレーム融合の選択：
各ライブラリーにおいて、Ｃ末端遺伝子フラグメントをネオマイシン耐性遺伝子にインフレーム融合した。従って、各ＩＴＣＨＹライブラリーメンバーは、そのＣ末端にネオマイシン耐性遺伝子が融合されているＰｕｒＮのフラグメントとＦＭＴのフラグメントの融合を有する。インフレームであるＰｕｒＮ及びＦＭＴフラグメントのそれら融合のみが、ネオマイシン耐性タンパク質を含有する三融合タンパク質を生じさせるだろう。従って、ＰｕｒＮとＦＭＴフラグメントのインフレーム融合は、カナマイシン上に該ライブラリーを塗布することによって選択することができる。これは、２０マイクログラム／ミリリットルのカナマイシンを含有する２４３×２４３ｍｍ ＴＹプレート上に、ライブラリーＮ−Ｆ及びＦ−Ｎの２．５×１０^７コロニー形成単位を塗布することによって行った。これらカナマイシン選択ライブラリーは、それぞれＮ−Ｆ−ｋ及びＦ−Ｎ−ｋと呼ばれる。コロニーの芝生をこれらプレートから回収し、配列決定すると、１５個のランダムに選択したライブラリーメンバーのうち１４個がインフレーム融合されていることが分かった。この結果を８メンバーのうち８個がインフレームである２つの他のＰｕｒＮ−ＦＭＴライブラリーの結果と合わせると、本方法がライブラリー内のインフレーム融合のパーセンテージを３３パーセントから９６パーセントに高めることを示している。このような強化の値は、カナマイシン選択ライブラリーのシャッフリングからの４つのＩＴＣＨＹ交差を有する仮想的なＳＣＲＡＴＣＨＹライブラリーメンバーの値と、選択されないライブラリーの値を比較すると明かである。前者は（０．９６）^４＝８５パーセント及び後者は（０．３３）^４＝１パーセントの全体的にインフレームである機会を有する。Ｎ−Ｆ−ｋ及びＦ−Ｎ−ｋライブラリーは、非常に多様セットの融合点を示す。
【０１３１】
Ｄ．所望サイズの融合の選択：
インフレーム融合の選択後、以下のようにライブラリーをサイズについて選択した。Ｎ−Ｆ−ｋ及びＦ−Ｎ−ｋ由来のプラスミドＤＮＡをＳａｃＩ及びＳｐｅＩで消化させた。所望サイズの（すなわち、ｐｕｒＮとＦＭＴの融合がＰｕｒＮ遺伝子とほぼ同サイズであるような）ＤＮＡは、各消化プラスミド４マイクログラムのアガロースゲル電気泳動によって単離した。ゲル電気泳動は、１５×２５センチメートルゲル上で、低電圧で８時間行って、分離を最大にした。ゲルスライスのサイズに基づき、ゲルから回収されたＤＮＡは、６３６塩基対（Ｎ−Ｆ−ｋ）又は６４８（Ｆ−Ｎ−ｋ）プラスマイナス１０−１５塩基対のＰｕｒＮとＦＭＴの融合を含むと見積もった。
【０１３２】
Ｅ．インビトロ組換え：
インビトロ組換えを行い、かつＰｕｒＮ−ＦＭＴ及びＦＭＴ−ＰｕｒＮ融合のＣ末端に停止コドンを再導入するのに十分な原料を得るため、アガロースゲルから回収されたＤＮＡについてＰＣＲを行った。これと次のＰＣＲ反応では、ＴａｑとＰｆｕポリメラーゼの１：１ミックスを用いて、点突然変異の数を１遺伝子当たり約１個に制御した。増幅ＤＮＡは、確立した手順（Ｚｈａｏ，Ｈ．及びＡｒｎｏｌｄ，Ｆ．Ｈ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：１３０７−０３０８（１９９７））により、４つの異なるＤＮアーゼＩ希釈度を用い、かつ再構成工程時には５０℃のアニーリング温度でインビトロ組換えした。外側プライマーによる増幅では、ｐｕｒＮ由来のようなシャッフルされた遺伝子の５’及び３’末端でＤＮＡを固定した。従って、ライブラリーは、主に０、２、４、６個等の交差を有する遺伝子から成る。このシャッフルされた遺伝子をベクターｐＤＩＭ−Ｎ５のＮｄｅＩとＳｐｅＩ部位との間にクローン化して、４つのライブラリー、４つのＤＮアーゼＩ消化物のそれぞれについて１つを作製した。これらのライブラリーサイズは、２．０×１０^６〜２．８×１０^６に変化した。
【０１３３】
ライブラリーの１つから２０個のランダムなメンバーを配列決定した。１５個は交差（活性部位の突然変異によって再構成されたＰｕｒＮ）を持たず、１個は単一の交差を持っていた（すなわち、それはＦＭＴ−ＰｕｒＮ融合だった）。２０メンバーのうち４個は２つの交差を有しており、このライブラリーが、ＦＭＴの断片がＰｕｒＮ内に挿入されている約４００，０００メンバーを有することを示している。これら４つのＦＭＴ断片のサイズは、３６〜１６０塩基対の範囲だった。この８個の交差はそれぞれユニークかつ低相同性の領域内にあり、それらが元のＩＴＣＨＹライブラリー内に存在していることに原因しており、組換え由来でない可能性を極めて大きくしている。交差は、所望サイズより８塩基対大きいものと、所望サイズより９塩基対小さいものとの間にあるサイズ選択範囲を示した。１遺伝子当たりの点突然変異の数は、０と２の間の範囲であり、１遺伝子当たり平均０．８だった。
【０１３４】
実施例５：類似体含有増加的切断短縮化ハイブリッド遺伝子ライブラリーの作製
（材料及び方法）
使用したすべての酵素は、特に言及しない限りＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）から購入した。本研究で使用したα−ホスホロチオエートヌクレオチド（ラセミ混合物、及びＳ−立体異性体）は、以前に合成されている（Ｃｈｅｎ及びＢｅｎｋｏｖｉｃ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１：３７３７−３７５１（１９８３））。α−Ｓ ｄＮＴＰｓのラセミ混合物もＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）及びＡｍｅｒｓｈａｍ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から商業的に入手可能である。ＤＮＡ試料は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ゲル及びＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ：Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。必要なところで、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ＰＣＲ精製キットで供給されるＰＢ緩衝液の添加によって反応をクエンチした。ＤＮＡは、５０マイクロリットルの提供ＥＢ−緩衝液（１０ミリモルトリス（ｐＨ８．５））を用いて、スピンカラムから溶離した。
【０１３５】
プラスミド構築：
プラスミドｐＤＩＭ−ＰＧＸ（図１１）をｐＤＩＭ−Ｎ２（ＰｕｒＮ［１−１４４］）から構築した。最初に、ｐＤＩＭ−Ｎ２（ＰｕｒＮ［１−１４４］）中のｆ１領域をＫｐｎＩ及びＮａｅＩによる制限消化で除去した。オーバーハングをクレノウ処理によって充填し、プラスミドを環状化して、ｐＤＩＭ−Ｎ２（Δｆ１，ＰｕｒＮ［１−１４４］）を生成した。次に、５’−オーバーハングとして２８−ヌクレオチドリンカー領域を保有し、ＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩＩ部位に隣接するヒトＧＡＲトランスホルミラーゼフラグメント［５４−２０３］を調製した（図１１）。ＢａｍＨＩ／ＳｐｅＩで消化した後、ｈＧＡＲＴフラグメントをｐＤＩＭ−Ｎ２（Δｆ１，ＰｕｒＮ［１−１４４］）中に連結し、大腸菌ＤＨ５α−Ｅ（Ｇｉｂｃｏ−Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）に形質転換した。生成したプラスミドｐＤＩＭ−ＰＧＸを大規模プラスミド調製（ＱＩＡＧＥＮ；Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）によって単離し、制限解析及びＤＮＡ配列決定によって特徴づけした。２００マイクロリットルのＮＥＢ−緩衝液＃２中２０マイクログラムのｐＤＩＭ−ＰＧＸをＨｉｎｄＩＩＩ（６０単位）による制限消化で線状化し、アガロースゲル電気泳動法で精製した。
【０１３６】
エキソヌクレアーゼ／クレノウ処理によるＤＮＡスパイキング：
３マイクログラムの線状ＤＮＡを６マイクロリットルのエキソＩＩＩ緩衝液（１０ｘ；Ｐｒｏｍｅｇａ）と混合し、体積を水で６０マイクロリットルに調整した。その溶液を２２℃で１５分間予備インキュベートし、次いでエキソヌクレアーゼＩＩＩ（２６０単位；Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加し、室温で６分間インキュベートした。記載した条件下での平均カットバック速度は５０塩基／分だった。反応をＥＤＴＡ（１マイクロリットルの０．５モル原料、ｐＨ８）でクエンチし、ＤＮＡをＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）−精製した。
【０１３７】
エキソヌクレアーゼ処理プラスミド（５０マイクロリットル）の相補性ＤＮＡ鎖の再合成は、ｄＮＴＰｓ（それぞれ１９９マイクロモル）とαＳ−ｄＮＴＰｓ（それぞれ５マイクロモル；Ｓ−異性体又はラセミ混合物のどちらか）を含有するトリス−ＨＣｌ（１０ミリモル、ｐＨ７．５）、ＭｇＣｌ_２（５ミリモル）中のクレノウフラグメント（ｅｘｏ⁻）（３．７５単位）と共に、最終体積１５０マイクロリットル、３７℃で１０分間のインキュベーションによって遂行した。ＰＢ−緩衝液の添加によって反応混合物をクエンチし、ＤＮＡをＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）−精製した。
【０１３８】
ＰＣＲによるＤＮＡスパイキング：
線状ｐＤＩＭ−ＰＧＸのＰＣＲ増幅の際に、α−ホスホロチオエートヌクレオチドを直接取り込んだ。１０ナノグラムの線状プラスミドを、５０マイクロリットルの反応混合物（ＭｇＣｌ_２（１ミリモル）、ｄＮＴＰｓ（それぞれ１８０マイクロモル）、αＳ−ｄＮＴＰｓ（それぞれ２０マイクロモル）、及び２．５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で補充されたＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ））中、プライマーＡ：
（５’−ＴＣＣＧＧＡＧＣＴＴＣＴＡＧＡＴＡＴＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＴＣＣ−３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）
及びＢ：
（５’−ＡＧＧＣＣＴＣＴＧＣＡＧＣＧＣＴＣＧＡＧＡＴＡＴＣＡＧ−３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）
（それぞれ１マイクロモル）で増幅した。ＰＣＲプログラム：５分，９４℃；次いで３０秒，９４℃３０サイクル；３０秒，５６℃；４分及び３０秒，７２℃；次いで１０分，７２℃。ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）キットによる精製後、以下の工程でエキソヌクレアーゼの量を調整するためＯＤ_２６０によりＤＮＡの量を計った。
【０１３９】
増加的切断短縮化ライブラリーの作製：
いずれかの手順（ＰＣＲ増幅又はエキソヌクレアーゼ／クレノウ処理）からのスパイクＤＮＡの溶液（５０マイクロリットル）を、製造業者の緩衝液（５．５マイクロリットル、１０ｘ；Ｐｒｏｍｅｇａ）中エキソヌクレアーゼＩＩＩ（１マイクログラムの５’末端ＤＮＡ当たり１２０単位；Ｐｒｏｍｅｇａ）と混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。ＰＢ−緩衝液による反応のクエンチ及びＤＮＡのＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）精製後、製造業者の緩衝液中マングビーンヌクレアーゼ（１マイクログラムのＤＮＡ当たり２．３単位）と共にインキュベーション（３０℃で３０分間）すると、一本鎖５’−オーバーハングが除去された。再びＤＮＡをＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）精製した。
【０１４０】
連結効率を高めるため、プラスミドライブラリーを６マイクロリットルのクレノウ緩衝液（トリス−ＨＣｌ（１００ミリモル，ｐＨ７．５） ，ＭｇＣｌ_２（５０ミリモル））及びｄＮＴＰｓ（１ヌクレオチド当たり１４０マイクロモルの最終濃度）中クレノウフラグメント（４．５単位）によって１０分間３７℃で平滑末端化した。そのＤＮＡをＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）精製した。
最終工程で、プラスミドライブラリーを、製造業者の緩衝液と３６マイクロリットルのＰＥＧ（５０パーセント）（最終体積：４００マイクロリットル）中４℃で一晩中（約１６時間）Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いた分子内連結によって環状化した。大腸菌ＤＨ５α−Ｅ中への形質転換の前に（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ；１マイクログラムのＤＮＡ当たり１０^１０形質転換体）、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）スピンカラムを用いてＤＮＡを濃縮かつ脱塩した。
【０１４１】
ＴＨＩＯ−ＩＴＣＨＹライブラリーの選択：
ＤＨ５α−Ｅ内の増加的切断短縮化ライブラリーを回収し、本明細書の他の箇所で述べたように貯蔵した。栄養要求性大腸菌株ＴＸ６８０Ｆ’への形質転換後、本明細書の他の箇所で述べたように活性ハイブリッドの選択を行った。
【０１４２】
（結果）
ヌクレオチド類似体含有増加的切断短縮化ハイブリッド遺伝子ライブラリーの作製は、大腸菌グリシンアミドリボヌクレオチドトランスホルミラーゼ（ＰｕｒＮ［１−１４４］）のＮ末端遺伝子フラグメントと、ヒトグリシンアミドリボヌクレオチドトランスホルミラーゼ（ｈＧＡＲＴ［５４−２０３］）のＣ末端遺伝子フラグメントを用いて示した。両酵素は、デノボプリン生合成経路でホルミル基の転移を触媒する。その高い全体的な構造相同性にもかかわらず、この２つの配列は、ＤＮＡレベルに基づいて、たった５０パーセントの同一性しか共有しない。
ＴＨＩＯ−ＩＴＣＨＹライブラリーの作製：
α−チオホスフェートヌクレオチドの使用は、親遺伝子フラグメントを含有するベクターの設計にいくつかの変化を導入する。例えば、２つの遺伝子は、本発明の他の実施形態におけるように２つの別個のプラスミド上ではなく、同一ベクター内に順次クローン化される（図１１）。この変化は、切断短縮化ライブラリーのフラグメントサイズ分布が、もはやエキソヌクレアーゼ消化の長さ又は時間間隔に左右されないので、両遺伝子フラグメントの同時切断短縮化を可能にする。さらに、複数の、戦略的に配置される制限部位の必要性が排除された。標的ＤＮＡのクローニング部位のような、２遺伝子フラグメント間のたった１つのユニークな切断部位だけが要求される。結果として、その単一のベクター設計が、手順の最終工程におけるライブラリー構築を単純にし、単一の分子内連結がその増加的切断短縮化ライブラリーを再環状化するのを可能にする。
【０１４３】
述べたように、ＴＨＩＯ−ＩＴＣＨＹ手順は、以下の基本工程から成る。本方法は、親遺伝子フラグメント間の一カ所だけある制限部位を用いた親ベクターの線状化で始まる。その消化産物のゲル精製は、そうでなければ残りの手順を通して運ばれ、かつ形質転換によってライブラリーに偏りを惹起する痕跡量の不完全消化ベクターを除去するために好ましいことが分かった。
次工程は、ホスホロチオエート含有類似体のようなヌクレオチド類似体の標的核酸配列中へのランダムな取り込みを含む。ヌクレオチド類似体は、例えば、プライマー伸長（本明細書では、エキソヌクレアーゼ／クレノウ処理と呼ばれることがある）又はＰＣＲ増幅によって、標的配列中に取り込むことができる。
【０１４４】
ヌクレオチド類似体のプライマー伸長による取り込み
エキソヌクレアーゼＩＩＩを用い、ＰｕｒＮ及びｈＧＡＲＴのアミノ酸位置５４と１４４の間（２７０塩基対）の重なり領域をコードする線状化プラスミドの２つの末端を一本鎖ＤＮＡに変換した。注意深く選択した反応条件下では、エキソヌクレアーゼＩＩＩは、二本鎖ＤＮＡの制御された３’→５’加水分解を許容する。２２℃で低塩緩衝液中、この酵素は、１分当たり約５０塩基対を加水分解する。この加水分解は、ＥＤＴＡを添加するとすぐに効率的にクエンチングされた。タンパク質とＥＤＴＡからのＤＮＡ中間体を精製するためにＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）スピンカラムを適用すると、簡単かつ非常に効率的であることが判った。
【０１４５】
そして、その一本鎖ＤＮＡタンパク質を、相補ＤＮＡ鎖のポリメラーゼ触媒再合成用の鋳型として供した。αＳ−ｄＮＴＰｓのような少量のｄＮＴＰ類似体でスパイクされた４つの標準ｄＮＴＰｓの混合物を使用すると、再合成されたＤＮＡの全長にわたってヌクレオチド類似体のランダムな取り込みをもたらす。クレノウフラグメント、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ^ＴＭ ＤＮＡポリメラーゼ、及びＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを含め、いくつかのＤＮＡポリメラーゼは、鋳型−定方向ＤＮＡ合成の際にチオホスフェート類似体をうまく利用することが示されている（Ｎａｋａｍａｙｅら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：９９４７−９９５９（１９９８）；Ｂｕｒｇｅｒｓ及びＥｐｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４：６８８９−６８９３（１９７９））。しかし、クレノウ、Ｔ４、Ｖｅｎｔ^ＴＭ、及びＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性はどれもチオホスフェート結合を加水分解できない。プライマー伸長反応時におけるポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性の結果としては何も起こらないので、再合成された鎖の３’末端におけるチオホスフェートの蓄積の原因となり、生成するライブラリーを全長フラグメントサイズに偏らせる。それゆえに、これらポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ欠損変異体が、相補鎖の合成時に優先的に利用される。
【０１４６】
フィルイン反応時の別の重要な考慮すべき事柄は、究極的に増加的切断短縮化ライブラリーの多様性の原因である、ｄＮＴＰｓ及びｄＮＴＰ類似体間の割合である。理論上、一本鎖ＤＮＡセグメントの長さにわたって単一のｄＮＭＰ類似体を取り込むことが望ましい。数学的に言うと、αＳ−ｄＮＴＰのｄＮＴＰに対する濃度比は、補正因子δによって測られる一本鎖ＤＮＡセグメントの長さＸに反比例する（本明細書の他の箇所の式を参照せよ）。補正因子は、ｄＮＴＰｓとαＳ−ｄＮＴＰｓの相対的な取り込み割合を表す。第１近似にとって、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ及びＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼによる天然のヌクレオチドに対する匹敵するホスホロチオエートの取り込み効率は、何らの明白な区別を示さない（δ＝１）。
【０１４７】
しかし、初期の研究は、αＳ−ｄＮＴＰｓのＳ−異性体のみがＤＮＡポリメラーゼに利用され、Ｒ−異性体は該酵素の平均的な（ｍｅｄｉｏｃｒｅ）競合インヒビターとして作用することを示した。Ｂｕｒｇｅｒｓ及びＥｐｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４：６８８９−６８９３（１９７９）。従って、天然のｄＮＴＰｓと比較した場合、ＤＮＡポリメラーゼによるホスホロチオエートヌクレオチドの全体的な低い取り込み効率を考慮しなければならない。これは、他の非特異的効果と同様に、実験的に決定したクレノウフラグメント（ｅｘｏ⁻）に対する補正因子（δ＝７．５）につながった。
【０１４８】
ＰＣＲ増幅によるヌクレオチド類似体の取り込み
これとは別に、全ベクター配列のＰＣＲ増幅によるヌクレオチド類似体の導入も示された。プライマー伸長のために本明細書の他の箇所で述べたようなｄＮＴＰｓ／αＳ−ｄＮＴＰ比に対するのと同じ指針に従うが、ＰＣＲ増幅は、ナノグラム量の初期構築物しか必要とせず、より短い現場での時間しか必要でない。
【０１４９】
プラスミドのサイズ及び使用するＤＮＡポリメラーゼのエラー頻度も考慮すべき因子である。標的ＤＮＡ内でのランダムな突然変異誘発が望ましいが、そのアプローチは、プラスミドの他の本質的な機能を破壊するか、そうでなくても変え得るプラスミドの全長にわたる点突然変異を不可避的に導入する。結果として、特により大きな構築物について、又は慎重に選択した高突然変異環境下では、別の発現系への該切断短縮化ライブラリーのサブクローニングを行うことができる。
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼは商業的に入手可能な既知の最も低いエラー頻度を有するエキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼであり、これを利用して線状化ｐＤＩＭ−ＰＧＸを増幅し、スパイクした。観察されたエラー頻度は、機能性ハイブリッドからの配列決定データに基づけば、５×１０^−４だった。
【０１５０】
ヌクレオチド類似体スパイクドＤＮＡからの切断短縮化ライブラリーの作製
そして、ヌクレオチド類似体が組み込まれるＤＮＡを最大活性の条件下で（１分当たり約４５０塩基対）エキソヌクレアーゼＩＩＩと共にもう一度インキュベートする。エキソヌクレアーゼＩＩＩのようなヌクレアーゼと共にインキュベートすると、ランダムに取り込まれたヌクレオチド間チオホスフェート結合だけが分解を停止し、かつ残りのプラスミドをさらなる加水分解から保護する。対照実験では、標準ヌクレオチドのみを含有するプラスミドＤＮＡは、これら試料の連結及び形質転換によって形成されたコロニー数に基づいて９９パーセントより高い効率で除去された。
【０１５１】
エキソヌクレアーゼ処理後に残る一本鎖５’−オーバーハングは、マングビーンヌクレアーゼとのインキュベーションによって除去された。Ｓ１ヌクレアーゼによる初期の研究（矛盾するデータを与えた）とは対照的に、マングビーンヌクレアーゼの使用は、非常に効率的かつ信頼できることが判った。マングビーンヌクレアーゼ処理ＤＮＡの直接連結はうまく行われたが、さらにクレノウフラグメントによる平滑末端化工程を行うと形質転換体の数が７倍に増えた。
【０１５２】
述べた手順に従い、約２〜８×１０^５個の独立メンバーから成るＰｕｒＮ／ｈＧＡＲＴハイブリッド酵素のＴＨＩＯ−ＩＴＣＨＹライブラリーが生成した。ランダムに選択したライブラリーメンバーの遺伝子融合産物のＰＣＲ解析は、切断短縮化の予想範囲に及ぶ線形サイズ分布を示した。さらに、ランダムに選択したコロニー由来のいくつかのプラスミドのＤＡＮ配列決定によって、親遺伝子フラグメント間の交差の分布、及び未処置ライブラリー内のフラグメントサイズの変化を調査した。それらＰｕｒＮ／ｈＧＡＲＴフラグメントサイズ及び交差点を確証してプロットした。特徴づけした配列のうちの７つは、アミノ酸残基５４と１４４との間の所望配列スペース内に位置することがわかり、２つのライブラリーメンバーは、最初のエキソヌクレアーゼ消化の標準偏差の範囲内だった。２つの試料は、予想した配列空間外で見られた。サンプリングした配列空間にわたるランダムな分布は、遺伝子フラグメント内の特定領域への明らかな偏りがなく、最も重要なことに、等しいサイズのフラグメントで構成される構築物への明白な偏りもないことを示す。このような事は、エキソヌクレアーゼによる両５’末端の同期加水分解の結果として最初のエキソヌクレアーゼ処理から持ち越されたプラスミドを示唆するものであろう。このデータは、ヌクレオチド類似体のランダムな取り込み、およびそれに続くエキソヌクレアーゼ工程の結果、２つの遺伝子間のランダムなフラグメントサイズの組換えが生じることを示している。
【０１５３】
機能性ハイブリッド酵素の選択
触媒的に活性なハイブリッド酵素の選択のため、プラスミドライブラリーを回収し、栄養要求性大腸菌株ＴＸ６８０Ｆ’に形質転換させた。形質転換体を最少培地プレート上に塗布すると、発現されたハイブリッド酵素が破壊された宿主−ＧＡＲトランスホルミラーゼを相補できる細菌だけが成長する。プレートを３７℃で、並びに、より低ストリンジェント選択条件下室温でインキュベートすることによって選択を行った。より低いインキュベーション温度は、３７℃で見られるコロニー数の約４倍のコロニーを生じさせた。室温プレート由来の構築物の大多数も３７℃で成長するが、さらに温度感受性ハイブリッド酵素が見られた。本明細書の他の箇所で述べたように、温度感受性ハイブリッドの融合点は、アミノ酸８０と１００の間の領域内に排他的に位置した。さらに、未処置ライブラリーの配列解析によって、低い重なり領域（アミノ酸残基５５−８０）内のインフレーム融合構築物（ＰｕｒＮ １−７２／ＧＡＲＴ ７３−２０３）が明らかにされた。当該領域内に機能性ハイブリッド酵素が存在しないことを考慮すると、この結果は当該特定領域の構造的な柔軟性の無さを示しているだろう。
【０１５４】
機能性ハイブリッド酵素を発現している３１個のコロニーを精選し、ＰＣＲ及びＤＮＡ配列決定によって解析した。１つを除いて全構築物は、正確に整列した融合だった。親遺伝子フラグメント間の交差は、種々のレベルの相同性の領域内に生じた。配列解析により１４個の別個のＤＮＡ融合構築物が同定されたが、そのうちの４個はこれまで未知だった。ヌクレオチド類似体取り込みのためのプライマー伸長によって作製された遺伝子融合内では突然変異は確認されなかった。対照的に、ＰＣＲ増幅によるヌクレオチド類似体取り込みを用いて作製された１０個の機能性ハイブリッドのＤＮＡ配列解析は、該配列の３つで４個の点突然変異を示した。この突然変異のうちの２つはサイレントであり（Ｅ４４、Ｒ１６８）、他の２つは同一構築物内に生じた（ＰｕｒＮ １−１１０／ＧＡＲ １１１−２０３；Ａ１４５Ｔ／Ｋ１５７Ｒ）。
解析した３１個の配列では、アミノ酸残基位置８０〜１４４由来の機能性交差の全範囲が提示され、かつ一様にライブラリー内に分布している。ライブラリーサイズ当たりの機能性ハイブリッドの頻度は、本発明の他の実施形態と同様である。
【０１５５】
前記内容はかなり詳細に述べられているが、実施例は、限定のためでなく説明のために提示されている。本技術の範囲及び当業者の能力内である、上で開示された技術の均等物を含む変形及び改良は、特許請求の範囲内に包含される。当業者にとって、本明細書で述べた発明概念から逸脱することなく、上記説明の特質について多くの変形、変更及び変化を構成できることは容易にわかるだろう。従って、このような変化はすべて特許請求の範囲に記載する本発明の範囲内であるとみなすべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
増加的切断短縮化ライブラリーの作製を概略的に示す。
【図２】
増加的切断短縮化に使用される典型的なベクターの図解である。
【図３】
継ぎ目なしＩＴＣＨＹライブラリーの作製を概略的に示す。
【図４】
トランス−インテインを用いた融合ペプチドの調製を概略的に示す。
【図５】
（２つのＩＴＣＨＹライブラリーをシャッフルすることによって作製される）ＳＣＲＡＴＣＨＹライブラリーの作製を概略的に示す。
【図６Ａ】
親増加的切断短縮化プラスミド及びヌクレオチド類似体を用いた増加的切断短縮化ライブラリーの構成の記載である。
【図６Ｂ】
親増加的切断短縮化プラスミド及びヌクレオチド類似体を用いた増加的切断短縮化ライブラリーの構成の記載である。
【図７Ａ】
ＴＨＩＯ−ＩＴＣＨＹと呼ばれる方法によって、ヌクレオチド類似体を用いた同時増加的切断短縮化による、単一プラスミド上に位置する２つの個々の遺伝子又は遺伝子フラグメント間のＩＴＣＨＹライブラリーの構成を示す。
【図７Ｂ】
ＴＨＩＯ−ＩＴＣＨＹと呼ばれる方法によって、ヌクレオチド類似体を用いた同時増加的切断短縮化による、単一プラスミド上に位置する２つの個々の遺伝子又は遺伝子フラグメント間のＩＴＣＨＹライブラリーの構成を示す。
【図８】
ＣＰ−ＩＴＣＨＹ原理の説明図である。
【図９】
ＣＰ−ＩＴＣＨＹライブラリーの作製を示しす。９ＡはＣＰ−ＩＴＣＨＹライブラリー作製用ベクター（ｐＤＩＭ−Ｎ５）の記述であり、同時に以下のＤＮＡ配列：配列番号：６ ａａｇｇａｇａｃａｇｔｃｃａｔａｔｇ、配列番号：７ ｇｇａｔｃｃｇａｔａｔｃａｇａｔｃｔ及び配列番号：８ ａｃｔａｇｔｇｃｔを含み；９Ｂは、ＣＰ挿入断片及びＣＰ−ＩＴＣＨＹライブラリー構成の例である。
【図１０】
ＳＣＲＡＴＣＨＹライブラリー作製用の典型的なベクターの描写であり、同時に以下のＤＮＡ配列：配列番号：９ ｇａｇｃｔｃａｔｃｇａｃｔｃｇａｇａｃａｃｔａｔａｇｃｔａａｃｔａａｇａｔｃｔ、配列番号：１０ ｇｇａａｃｔａｇｔａｔｔ及び配列番号：１１ ａｔｇｃａｔを含む。
【図１１】
ＴＨＩＯ−ＩＴＣＨＹライブラリー作製用の典型的なベクターの描写であり、同時に以下のＤＮＡ配列：配列番号：６ ａａｇｇａｇａｃａｇｔｃｃａｔａｔｇ、配列番号：１２ ｇｇａｔｃｃｇａｔａｔｃｔａｇａａｇｃｔｔａｃｔｇｃａｇｃｇｃｔｃｇａｇａｔａｔｃａｇａｔｃｔ、及び配列番号：１３ ａｃｔａｇｔｇｃｔａｃｃを含む。

Claims (37)

1. 増加的切断短縮化核酸の複数の発現産物の製造方法であって、以下の工程を含む方法：
   ａ）親核酸を供給する工程；
   ｂ）前記核酸の一又は両末端から連続的にヌクレオチドを除去して、その長さが経時的に増加的に短くなる切断短縮化親核酸を形成する工程；
   ｃ）前記連続的ヌクレオチド除去を複数の異なる時間で停止して、複数の増加的切断短縮化核酸を形成する工程；及び
   ｄ）前記複数の増加的切断短縮化核酸を発現させて、複数の切断短縮化核酸発現産物を形成する工程。
2. 請求項１に記載の工程で製造される増加的切断短縮化核酸。
3. 請求項１に記載の方法で製造される切断短縮化核酸発現産物。
4. 親核酸が核酸のライブラリーを含む、請求項１に記載の方法。
5. 複数の増加的切断短縮化ハイブリッド核酸の製造方法であって、以下の工程を含む方法：
   ａ）第１及び第２親核酸を供給する工程；
   ｂ）前記第１及び第２親核酸の一又は両末端から連続的にヌクレオチドを除去して、その長さが経時的に増加的に短くなる切断短縮化された第１及び第２親核酸を形成する工程；
   ｃ）前記連続的ヌクレオチド除去を複数の異なる時間で停止して、複数の増加的切断短縮化された第１及び第２親核酸を形成する工程；及び
   ｄ）個々の増加的切断短縮化された第１親核酸を、個々の増加的切断短縮化された第２親核酸に連結して、複数の増加的切断短縮化ハイブリッド核酸を形成する工程。
6. 複数の形質転換された増加的切断短縮化ハイブリッド核酸の製造方法であって、請求項５に記載の複数の増加的切断短縮化ハイブリッド核酸を、複数の宿主に形質転換させて、複数の形質転換された増加的切断短縮化ハイブリッド核酸を形成する工程を含む方法。
7. 請求項５に記載の工程で製造される増加的切断短縮化ハイブリッド核酸。
8. 請求項６に記載の方法で製造される形質転換された増加的切断短縮化ハイブリッド核酸。
9. 親核酸が核酸のライブラリーを含む、請求項５に記載の方法。
10. 複数の第１変異型増加的切断短縮化ハイブリッド核酸の製造方法であって、以下の工程を含む方法：
    ａ）第１及び第２親核酸を供給する工程；
    ｂ）前記第１及び第２親核酸の一又は両末端から連続的にヌクレオチドを除去して、その長さが経時的に増加的に短くなる切断短縮化された第１及び第２親核酸を形成する工程；
    ｃ）前記連続的ヌクレオチド除去を複数の異なる時間で停止して、複数の増加的切断短縮化された第１及び第２親核酸を形成する工程；
    ｄ）個々の増加的切断短縮化された第１親核酸を、個々の増加的切断短縮化された第２親核酸に連結して、複数の第１変異型増加的切断短縮化ハイブリッド核酸を形成する工程であって、前記増加的切断短縮化された第１核酸は、前記第１変異型増加的切断短縮化ハイブリッド遺伝子のそれぞれのＮ末端コード配列を形成するものである前記工程。
11. 複数の形質転換された第１変異型増加的切断短縮化ハイブリッド核酸の製造方法であって、請求項１０に記載の前記第１変異型増加的切断短縮化ハイブリッド核酸を、複数の宿主に形質転換させて、複数の形質転換された第１変異型増加的切断短縮化ハイブリッド核酸を形成する工程を含む方法。
12. 請求項１０に記載の方法に従って製造される第１変異型増加的切断短縮化ハイブリッド核酸。
13. 請求項１１に記載の方法に従って製造される形質転換された第１変異型増加的切断短縮化ハイブリッド核酸。
14. 親核酸が核酸のライブラリーを含む、請求項１０に記載の方法。
15. 複数の第２変異型増加的切断短縮化ハイブリッド核酸の製造方法であって、以下の工程を含む方法：
    ａ）第１及び第２親核酸を供給する工程；
    ｂ）前記第１及び第２親核酸の一又は両末端から連続的にヌクレオチドを除去して、その長さが経時的に増加的に短くなる切断短縮化された第１及び第２親核酸を形成する工程；
    ｃ）前記連続的ヌクレオチド除去を複数の異なる時間で停止して、複数の増加的切断短縮化された第１及び第２親核酸を形成する工程；
    ｄ）個々の増加的切断短縮化された第１親核酸を、個々の増加的切断短縮化された第２親核酸に連結して、複数の第２変異型増加的切断短縮化ハイブリッド核酸を形成する工程であって、前記増加的切断短縮化された第２核酸は、前記第２変異型増加的切断短縮化ハイブリッド遺伝子のそれぞれのＮ末端コード配列を形成するものである前記工程。
16. 複数の形質転換された第２変異型増加的切断短縮化ハイブリッド核酸の製造方法であって、請求項１５に記載の前記第２変異型増加的切断短縮化ハイブリッド核酸を、複数の宿主に形質転換させて、複数の形質転換された第２変異型増加的切断短縮化ハイブリッド核酸を形成する工程を含む方法。
17. 請求項１５に記載の方法に従って製造される第２変異型増加的切断短縮化ハイブリッド核酸。
18. 請求項１６に記載の方法に従って製造される形質転換された第２変異型増加的切断短縮化ハイブリッド核酸。
19. 親核酸が核酸のライブラリーを含む、請求項１５に記載の方法。
20. 複数のシャッフルされた増加的切断短縮化核酸の製造方法であって、以下の工程を含む方法：
    ａ）複数の増加的切断短縮化修飾核酸由来の単離核酸挿入断片を供給する工程；
    ｂ）前記単離核酸挿入断片を、複数のシャッフルされた増加的切断短縮化ハイブリッド核酸を形成するのに適した時間及び条件下で再結合させる工程。
21. 複数の、形質転換され、シャッフルされた増加的切断短縮化核酸の製造方法であって、請求項２０に記載の複数のシャッフルされた増加的切断短縮化核酸を、複数の宿主に形質転換させて、複数の形質転換されシャッフルされた増加的切断短縮化核酸を製造する工程を含む方法。
22. 請求項２０に記載の方法に従って製造されるシャッフルされた増加的切断短縮化核酸。
23. 請求項２１に記載の方法に従って製造される、形質転換されシャッフルされた増加的切断短縮化核酸。
24. 複数の類似体含有増加的切断短縮化核酸の製造方法であって、以下の工程を含む方法：
    ａ）複数のヌクレオチド類似体含有親核酸を供給する工程；及び
    ｂ）前記複数のヌクレオチド類似体含有親核酸から、核酸中に取り込まれたヌクレオチド類似体を解重合しないヌクレアーゼ酵素によって、複数の類似体含有増加的切断短縮化核酸を形成するのに十分な条件下及び時間、ヌクレオチドを除去する工程。
25. 複数の形質転換された、類似体含有増加的切断短縮化核酸の製造方法であって、請求項２４に記載の複数の類似体含有増加的切断短縮化核酸を、複数の宿主に形質転換させて、複数の形質転換された、類似体含有増加的切断短縮化核酸を形成する工程を含む方法。
26. 複数のヌクレオチド類似体含有親核酸が、複数のヌクレオチド類似体含有増加的切断短縮化修飾核酸を含む、請求項２４に記載の方法。
27. 複数のヌクレオチド類似体含有増加的切断短縮化修飾核酸が、ヌクレオチド類似体を含有するシャッフルされた複数の増加的切断短縮化ハイブリッド核酸を含む、請求項２６に記載の方法。
28. 核酸中に組み込まれたヌクレオチド類似体を解重合しないヌクレアーゼ酵素が、エキソヌクレアーゼＩＩＩである、請求項２４に記載の方法。
29. 複数の円順列増加的切断短縮化ハイブリッド核酸の製造方法であって、以下の工程を含む方法：
    ａ）第１及び第２核酸を供給する工程；
    ｂ）前記第１及び第２核酸間に、ランダムに位置する制限酵素部位を含有する複数の円順列核酸フラグメントを挿入して、複数の円順列ハイブリッドを形成する工程；
    ｃ）前記複数の円順列ハイブリッドを、前記ランダムに位置する制限酵素部位を認識して特異的に加水分解する制限酵素と反応させて、複数の円順列増加的切断短縮化基質を形成する工程；
    ｄ）前記制限酵素部位の両端からヌクレオチドを除去して、複数の円順列増加的切断短縮化ハイブリッド核酸を形成する工程；
    ｅ）前記連続的ヌクレオチド除去を停止して、ギャップを有する複数の円順列増加的切断短縮化ハイブリッド核酸を形成する工程；及び
    ｆ）前記ギャップを閉じて、複数の円順列増加的切断短縮化ハイブリッド核酸を形成する工程。
30. 複数の形質転換された円順列増加的切断短縮化ハイブリッド核酸の製造方法であって、請求項２９に記載の複数の円順列増加的切断短縮化ハイブリッド核酸を、複数の宿主に形質転換させて、複数の形質転換された円順列増加的切断短縮化ハイブリッド核酸を形成する工程を含む方法。
31. 複数の切断短縮化核酸発現産物。
32. 複数の増加的切断短縮化ハイブリッド核酸。
33. 複数の第１変異型増加的切断短縮化ハイブリッド核酸。
34. 複数の第２変異型増加的切断短縮化ハイブリッド核酸。
35. 複数のシャッフルされた増加的切断短縮化ハイブリッド核酸。
36. 複数のヌクレオチド類似体含有増加的切断短縮化核酸。
37. 複数の円順列増加的切断短縮化ハイブリッド核酸。

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