JP2004505601A - 分子内シャペロン様配列を含有するキメラタンパク質およびインスリン製造へのその適用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、標的タンパク質、好ましくはインスリン前駆体に連結した分子内シャペロン（ＩＭＣ）様配列を含有するキメラタンパク質に関する。本発明は、正確に畳まれたインスリン前駆体含有キメラタンパク質の生成方法であって、特に、インスリン前駆体に連結したＩＭＣ様配列を含有する不正確に畳まれたキメラタンパク質を、少なくとも１つのカオトロピック補助剤と接触することを包含する方法にも関する。本発明はさらに、インスリン前駆体と連結したＩＭＣ様配列を含有するキメラタンパク質を用いてインスリン前駆体のフォールディングを改良する能力に関してアミノ酸配列をスクリーニングするための検定方法に関する。
Description
【０００１】
１．発明の背景
１．１．技術分野
本発明は、標的タンパク質に連結した分子内シャペロン（ＩＭＣ）様配列を含有するキメラタンパク質に関する。特に、本発明は、インスリン前駆体に連結したＩＭＣ様配列を含有するキメラタンパク質に関する。本発明は、正確に畳まれたインスリン前駆体含有キメラタンパク質の生成方法であって、特に、インスリン前駆体に連結したＩＭＣ様配列を含有する不正確に畳まれたキメラタンパク質を、少なくとも１つのカオトロピック補助剤と接触することを包含する方法にも関する。本発明はさらに、インスリン前駆体と連結したＩＭＣ様配列を含有するキメラタンパク質を用いてインスリン前駆体のフォールディングを改良する能力に関してアミノ酸配列をスクリーニングするための検定に関する。
【０００２】
１．２．背景技術
１．２．１．分子内シャペロンおよびタンパク質フォールディング
分子シャペロンは、他のポリペプチドの正確なフォールディングを助けるが、しかし機能的集成構造の構成成分ではないタンパク質の一種と定義される（Ｓｈｉｎｄｅ ａｎｄ Ｉｎｏｕｙｅ， ＴＩＢＳ， １９９３， １８：４４２−４４６）。分子内シャペロン（ＩＭＣ）は、折り畳まれる標的タンパク質の前駆体の一部であり、それらの不存在下では、標的タンパク質分子は適正な自己フォールディングに関する十分な情報を有さない（Ｉｎｏｕｙｅ， Ｅｎｚｙｍｅ， １９９１， ４５：３１４−３２１）。ＩＭＣの独特の特徴としては、以下のものが挙げられる：ａ）ＩＭＣおよび標的タンパク質はペプチジル結合により連結されて単一ポリペプチドを形成する；ｂ）ＩＭＣは標的タンパク質の活性立体配座の形成には絶対に必要であるが、しかし標的タンパク質の機能のためには必要ではない；ｃ）タンパク質フォールディングの完了時に、ＩＭＣは自己プロセシングにより、または別のエンドペプチダーゼによって除去される；ｄ）ＩＭＣは触媒としては機能せず、即ち、一ＩＭＣ分子は標的タンパク質の一分子のみを再折り畳み出来る；そしてｅ）ＩＭＣは標的タンパク質に対してのみ作用する高度特異的「あつらえ」ポリペプチドである（Ｉｎｏｕｙｅ， Ｅｎｚｙｍｅ， １９９１， ４５：３１４−３２１）。
【０００３】
近年、ＩＭＣまたはプロペプチドはペプチジル結合を介して連結されないが、しかしむしろ別個のペプチドとしてフォールディング反応に付加される、ということが示された（米国特許第５，７１９，０２１号）。しかしながら、米国特許第５，７１９，０２１号に用いられたプロペプチドは標的タンパク質の天然プロペプチドであるか、または標的タンパク質の同一機能を有するポリペプチドのプロペプチドであり、ポリペプチドは標的タンパク質と同様のアミノ酸配列も有する、ということは注目に値する。さらに、米国特許第５，７１９，０２１号に記載された分子間反応は、疎水性相互作用に有利な緩衝化イオン性水性媒質中で実行されねばならない。
【０００４】
ＩＭＣの例としては、ズブチリシン、α−溶解性プロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼＹおよびユビキチンのプロペプチドが挙げられる（Ｓｈｉｎｄｅ ａｎｄ Ｉｎｏｕｙｅ， ＴＩＢＳ， １９９３， １８：４４２−４４６）。ズブチリシンのＩＭＣ配列の一定の特徴としては、ａ）ＩＭＣは、標的タンパク質より高いパーセンテージの荷電アミノ酸残基を含有する；ｂ）ＩＭＣ内のこれらの荷電アミノ酸の分布は非常に不均等であり、即ち、Ｎ末端半分は負荷電残基より多い正荷電残基を含有し、そしてＣ末端半分は正荷電残基より多い負荷電残基を含有する；ｃ）ＩＭＣ内のＳｅｒおよびＴｈｒ残基も不均等に分布する；ｄ）ＩＭＣは作用的高含量の芳香族残基を含有する；そしてｅ）ＩＭＣは９残基の疎水性配列を含有する、ということが挙げられる（Ｉｎｏｕｙｅ， Ｅｎｚｙｍｅ， １９９１， ４５：３１４−３２１）。荷電残基に対する同様の偏りは、α−溶解性プロテアーゼおよびカルボキシペプチダーゼＹにおいても観察される（ Ｉｎｏｕｙｅ， Ｅｎｚｙｍｅ， １９９１， ４５：３１４−３２１）。
【０００５】
１．２．２．成熟ヒト成長ホルモンのアミノ酸配列
成熟ヒト成長ホルモンのアミノ酸配列は、Ｉｋｅｈａｒａ ｅｔ ａｌ．「Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ」１９８４， ８１：５９５６−５９６０に開示されている。成熟ｈＧＨまたはその任意の部分がＩＭＣまたはプロペプチドとして機能し得る、ということは当業界では示唆されていない。実際、定義により、あらゆるプレ、プロまたはプレプロ配列は成熟配列から除去されるため、成熟ｈＧＨまたはその任意の部分は、全くプロペプチドとは考えられ得ない。
【０００６】
１．２．３．ヒトインスリン構造
インスリンは、既知のアミノ酸配列および構造特徴を有する明瞭なペプチドである（Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ− Ａ Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｓｅ； Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ Ｃｏ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８３， ｐｐ． ２３１−２３５； Ｎｏｒｍａｎ ａｎｄ Ｌｉｔｗａｃｋ， Ｉｎ Ｈｏｒｍｏｎｅｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８７， ｐｐ． ２６４−３１７）。このホルモンは、図１Ｂに示したようなジスルフィド架橋により連結されるＡ鎖（２１アミノ酸）とＢ鎖（３０アミノ酸）である２つの別個のペプチド鎖から成る。プロインスリンはインスリンの生物学的前駆体であり、そしてＡおよびＢ鎖がＣペプチドにより接続される場合に形成される単一ペプチド鎖である（図１Ａ）。
【０００７】
１．２．４．組換え法により産生されるヒトインスリン
ヒトインスリンは、ヒト膵臓ペプチドの配列と同一の配列で細菌中に作製された最初の動物タンパク質であった（ Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ− Ａ Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｓｅ； Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ Ｃｏ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８３， ｐｐ． ２３１−２３５）。実験室におけるヒトインスリンの最初の発現の成功は１９７８年に発表され、ヒトインスリンは１９８２年に治療薬として承認された（Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９８３， ２１９：６３２−６３７）。
【０００８】
１．２．４．１．二鎖法
この方法によって、各インスリン鎖は、それぞれヒトインスリンのＡまたはＢ鎖をコードするＤＮＡ配列を含有するプラスミドで形質転換された大腸菌を用いて、別個の発酵において、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）融合タンパク質として生成される。生成物は細胞内であり、顕著な細胞質封入体中に出現する（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９８２， ２１５（５）：６８７−６８９）。大腸菌中で産生される組換えタンパク質は、通常は、総タンパク質の１０〜４０％に相当する（Ｂｕｒｇｅｓｓ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ； Ｏｘｅｎｄｅｒ， Ｄ．Ｌ．， Ｆｏｘ， Ｃ．Ｆ．， Ｅｄｓ．； Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．； Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８７； ｐｐ．７１−８２）。
【０００９】
封入体から取り出されると、β−ガラクトシダーゼとＡまたはＢ鎖との間のＭｅｔ残基でのＣＮＢｒによる化学的切断、その後の精製により、別個のＡおよびＢタンパク質が得られる。次にペプチドは併合され、活性ホルモンを得るために、限定量のメルカプタンの存在下で２：１のＡ−Ｂ鎖比（Ｓ−スルホン化形態）で折り畳まるよう誘導される（Ｃｈａｎｃｅ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｆｕｎｃｔｉｏｎ， Ｒｉｃｈ Ｄ．Ｍ． Ｇｒｏｓｓ， Ｅ．， Ｅｄｓ．， Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＩ １９８１， ＰＰ． ７２１−７２８； Ｆｒａｎｋ ａｎｄ Ｃｈａｎｃｅ， Ｉｎ Ｑｕｏ Ｖａｄｉｓ？ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｊｏｙｅｓｕｋ ｅｔ ａｌ．， Ｅｄｓ．， Ｓａｎｏｆｆ Ｇｒｏｕｐ， Ｔｏｕｌｏｕｓｅ−Ｌａｂｅｇｅ， Ｆｒａｎｃｅ， １９８５， ｐｐ．１３７−１４８）。２４時間後、収率は、用いられたＢ鎖の量を基礎にして、約６０％である（Ｃｈａｎｃｅ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎ Ｉｎｓｕｌｉｎｓ， Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ ａｎｄ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８１， ｐｐ．７１−８５； Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｆｌｕｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｅｑｕｉｌｉｂ．， １９８６， ２９：１０９−１２３）。Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， １９７９， ７６（１）：１０６−１１０は、ＡまたはＢ鎖融合タンパク質として発現された総細胞タンパク質の２０％で、同様の結果を得た。その後のＳ−スルホン化鎖のフォールディングは、５０〜８０％の正確なフォールディングを生じる。
【００１０】
β−ｇａｌ（約１０００アミノ酸）とインスリンＡまたはＢ鎖（それぞれ２１または３０アミノ酸）との融合タンパク質は細胞のリボソームから分離するようになり（翻訳中の未成熟鎖末端）、したがって不完全インスリンペプチドを産生するために、大型のβ−ｇａｌ融合タンパク質は、収率を制限する（Ｂｕｒｎｅｔｔ， Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， Ｉｎｏｕｙｅ， Ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８３， ｐｐ．２５９−２７７； Ｈａｌｌ， Ｉｎｖｉｓｉｂｌｅ Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ−− Ｔｈｅ Ｒａｃｅ ｔｏ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅ ａ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ， Ａｔｌａｎｔｉｃ Ｍｏｎｔｈｌｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８７）。このアプローチの主な改良点は、より小さい融合タンパク質を生成するためにｌａｃオペロン（β−ｇａｌ系）の代わりにトリプトファン（Ｔｒｐ）オペロンを用いることである。Ｔｒｐオペロンは、トリプトファンの同化に関与する酵素を順次合成する一連の５つの細菌遺伝子から成る。これらの酵素ＴｒｐＥのうちの１つは、β−ｇａｌの１０００アミノ酸と比較して、１９０アミノ酸しか有さない。Ｔｒｐプロモーターは大腸菌中では強力なプロモーターであるため、インスリンのＡまたはＢ鎖に関する遺伝子を従えるＴｒｐＥは、総タンパク質の５〜１０％から２０〜３０％に融合タンパク質生成を増強するという付加利点を有する（Ｈａｌｌ， Ｉｎｖｉｓｉｂｌｅ Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ−− Ｔｈｅ Ｒａｃｅ ｔｏ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅ ａ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ， Ａｔｌａｎｔｉｃ Ｍｏｎｔｈｌｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８７）。これは、ｌａｃ（即ちβ−ｇａｌ）系と比較した場合、少なくとも１０倍以上のポリペプチド発現をもたらす（Ｂｕｒｎｅｔｔ， Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， Ｉｎｏｕｙｅ， Ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８３， ｐｐ．２５９−２７７）。大腸菌がトリプトファンを使い尽した時、Ｔｒｐオペロンは作動される（Ｈａｌｌ， Ｉｎｖｉｓｉｂｌｅ Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ−− Ｔｈｅ Ｒａｃｅ ｔｏ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅ ａ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ， Ａｔｌａｎｔｉｃ Ｍｏｎｔｈｌｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８７： Ｅｔｉｅｎｎｅ−Ｄｅｃｅｎｔ， Ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ： Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ， Ｅｌｌｉｓ Ｈｏｒｗｏｏｄ Ｌｉｍｉｔｅｄ， Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ， Ｕ．Ｋ．， １９８８， ｐｐ．１２５−１２７）。細胞質量が先ず最大化され得るため、この特徴は、発酵中は有益である。次に、適切な場合には、細胞のインスリン産生系は、発酵媒質がＴｒｐを欠失するようにさせることにより、作動され得る。
【００１１】
発酵完了後、細胞は回収され、破裂される。次に細胞屑が封入体から分離され、封入体は溶媒中に溶解されるが、しかし詳細は不明である（Ｗｈｅｅｌｗｒｉｇｈｔ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ； Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９１， ｐ．２１７）。封入体は、時としては、６ ＭグアニジンＨＣｌおよび０．１ ｍＭジチオトレイトール中に溶解される（ Ｂｕｒｇｅｓｓ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ； Ｏｘｅｎｄｅｒ， Ｄ．Ｌ．， Ｆｏｘ， Ｃ．Ｆ．， Ｅｄｓ．； Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．； Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８７； ｐｐ．７１−８２）。次に、Ｔｒｐ−ＬＥ−Ｍｅｔ−Ａ鎖およびＴｒｐ−ＬＥ−Ｍｅｔ−Ｂ鎖はＣＮＢｒ切断を施されて、ＡおよびＢインスリン鎖を放出する。ＡおよびＢ鎖のさらなる修飾には、粗製インスリンを産生するための酸化的亜硫酸分解、精製および組合せが含まれる。この粗製インスリンは、イオン交換、サイズ排除および逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ ＨＰＬＣ）処理を施されて、精製組換えヒトインスリンを生じる（Ｆｒａｎｋ ａｎｄ Ｃｈａｎｃｅ， Ｍｕｎｃｈ Ｍｅｄ． Ｗｓｈｒ， １９８３， １２５ （ Ｓｕｐｐｌ．１ ）：５１４−５２０）。
【００１２】
１．２．４．２．プロインスリン法（細胞内）
ヒトインスリンは、個々にＡまたはＢ鎖の代わりに無傷プロインスリンを産生する組換え微生物を用いても製造し得る（Ｋｒｏｅｆｆ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． １９８９， ４８１：４５−６１）。最初に、ｍＲＮＡがｃＤＮＡにコピーされ、メチオニンコドンが化学的に合成され、プロインスリンｃＤＮＡの５’末端に付着される。ｃＤＮＡは、導入されるプラスミドベクター中の細菌遺伝子中に挿入され、次に、大腸菌中で増殖される。プロインスリンは、メチオニンリンカーを破壊することにより細菌酵素（β−ｇａｌ）断片から（あるいはＴｒｐ−ＬＥ／Ｍｅｔプロインスリン（Ｔｒｐプロインスリン）から）放出させ得る。プロインスリンは、フォールディング処理を施されて、正確な分子内ジスルフィド架橋を形成し、そして次にＣペプチドが酵素により切断されて、ヒトインスリンを産生する（ Ｆｒａｎｋ ａｎｄ Ｃｈａｎｃｅ， Ｍｕｎｃｈ Ｍｅｄ． Ｗｓｈｒ， １９８３， １２５ （ Ｓｕｐｐｌ．１ ）：５１４−５２０）。比較すると、前記の二鎖法はより複雑である。
【００１３】
Ｄｏｒｓｈｕｇ等は、ミニプロインスリン（Ｂ−Ａｒｇ−Ａ）を含有する融合タンパク質をコードする組換えプラスミドを構築し、大腸菌（封入体）および酵母菌（分泌型）中で融合タンパク質を発現し、ＢｒＣＮ切断および酸化的亜硫酸分解により正確に折り畳まれたミニプロインスリンを調製し、そしてトリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢを用いた処理により正確に折り畳まれたミニプロインスリンをヒトインスリンに転化した（ＥＰ ０，３４７，７８１ Ｂ１； ＩＬ ９，５６２，５１１ ＢおよびＡＵ ６１１，３０３ Ｂ２）。
【００１４】
Ｔｏｔｔｒｕｐ およびＣａｒｌｓｅｎ「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ．」１９９０， ３５：３３９−３４８は、最適化バッチ−供給発酵において酵母菌系を用い、スーパーオキシドジムスターゼ−ヒトプロインスリン（ＳＯＤ−ＰＩ）は１５００ ｍｇ／ｌであると報告した。ＳＯＤ−ＰＩは、組換えヒトインスリンの精製のための出発物質である。最終生成物の収率は報告されていない。
【００１５】
近年、Ｃａｓｔｅｌｌａｎｏｓ−Ｓｅｒｒａ 等「ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ」１９９６， ３７８：１７１−１７６は、リシン残基によりプロインスリンのＮ末端に連結された修飾化インターロイキン−２ Ｎ末端ペプチド（１〜２２アミノ酸残基）を保有するプロインスリン融合タンパク質を大腸菌中で発現した。キメラプロインスリンが封入体から単離され、酸化的亜硫酸分解により再フォールディングされ、次に、トリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢとの長時間反応により正しく折り畳まれた融合タンパク質に転化された。ＩＬ−２−プロインスリン融合物は、ＩＬ−２断片を先ず除去することなしに、正しく折り畳まれ、したがって、臭化シアンおよび関連精製工程を排除することができる。しかしながら、酸化的亜硫酸分解および関連精製工程は、ＩＬ２−プロインスリン融合タンパク質の使用により回避され得ない。
【００１６】
１．２．４．３．プロインスリン法（分泌型）
Ｖｉｌｌａ−Ｋｏｍａｒｏｆｆ 等「Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．」１９７８， ７５（８）：３７２７−３７３１は、大腸菌におけるヒトプロインスリンに関する分泌系を最初に記載したものであった。Ｔｈｉｍ等 は、修飾化酵母菌交配因子α１リーダー配列およびインスリン前駆体を含有する融合タンパク質をコードする組換えプラスミドを構築した（Ｔｈｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １９８６， ８３：６７６６−６７７０）。リーダー配列は、酵母細胞の分泌経路に融合タンパク質を向け、そしてＬｙｓ−Ａｒｇプロセシング酵素系に融合タンパク質を曝露するのに役立つ。部分的プロセシングも、プロインスリンおよびＣペプチドの変わりに短スペーサーペプチド（６以上のアミノ酸残基を含有）を含有するその他のインスリン前駆体内のＢおよびＡ鎖間の二塩基配列の一方または両方で起こる。これに対比して、インスリン前駆体分子、例えばＢ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａ（ここで、ＡおよびＢは、それぞれヒトプロインスリンのＡおよびＢ鎖である）中のスペーサーペプチドの不存在下では、プロセシングは観察されなかった。この型の一本鎖インスリン前駆体は、トリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢを用いた処理により、酵素的にインスリンに転化し得る。Ｄｉｅｒｓ 等「Ｄｒｕｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｂａｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）」Ｃｈｉｕ およびＧｕｅｒｉｇｕｉａｎ編， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９１， ｐｐ．１６７−１７７は、リーダーまたはプロセグメント、次にＬｙｓ−Ａｒｇ配列、Ｂ鎖（アミノ酸１−２９）、短ペプチド架橋、その後のＡ鎖（アミノ酸１−２１）として非折り畳み化ペプチドを記載する。この前駆体においては、インスリンのＢ鎖のアミノ酸２９は、Ａ鎖に隣接する１つの塩基性アミノ酸を含有する短接続ペプチドによりＡ鎖のアミノ酸１と接続される。ヒトインスリンは、ペプチド転移とその後の形成されたエステル結合の加水分解により生成される。さらなる精製のためにいくつかのクロマトグラフィー段階が続く。
【００１７】
１．２．５．インスリン前駆体のフォールディング
ヒトインスリンは、全部で５１個のアミノ酸残基の２つのアミノ酸鎖を保有するタンパク質である。２つのアミノ酸鎖には６個のシステイン残基が存在し、各場合、２個のシステイン残基はジスルフィド結合を介して各々に連結される。統計的に、１個のヒトインスリン分子内でジスルフィド架橋を形成するには１５通りの可能性がある。しかしながら、以下のジスルフィド架橋：１）Ａ６−Ａ１１；２）Ａ７−Ｂ７および３）Ａ２０−Ｂ１９を有する生物学的に活性なヒトインスリンにおいては、１５の可能性のうちの１つだけが存在する。
【００１８】
ヒトインスリン中に存在するジスルフィド架橋の形成は、中間体により影響を及ぼされ、ヒトインスリンのシステイン残基は硫黄保護基を、例えばＳ−スルホネート（−Ｓ−ＳＯ３）基を装備される（欧州特許第０．０３７，２５５号）。さらに、システイン残基がチオ残基（−ＳＨ）として存在するブタプロインスリンは、正しく連結されたシステイン架橋を保有するプロインスリンを生成するために用いられてきた（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９６８， ６０：６２２−６２９）。Ｏｂｅｒｍｅｉｅｒ等は、メルカプタン、カオトロピック補助剤および疎水性吸収性樹脂の存在下での、０．０５〜０．３ ｇ／ｌの濃度での対応するプロインスリンアミノ酸鎖からの正しく連結されたシステイン架橋を保有するプロインスリンの製造方法を記載した（米国特許第５，４７３，０４９号）。酸化的亜硫酸分解の工程は、米国特許第５，４７３，０４９号に記載された方法では排除される。しかしながら、インスリンタンパク質は、低濃度で折り畳まれ得るだけであり、このことがこの方法の商業的価値を大いに縮小する。さらに、大量のメルカプタンおよび疎水性吸収性樹脂の使用は、処理複雑性および下流精製コストを増大する。米国特許第５，４７３，０４９号の開示からは、酸化的亜硫酸分解工程の工程を排除することの利点が下流精製コスト増大よりまさるか否かは不明である。
【００１９】
本明細書中の前記の参考文献の引用は、このような参考文献が本発明に対する従来技術であることの承認と解釈されるものではない。
２．発明の要約
本発明は、Ｎ末端からＣ末端に、ａ）ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）タンパク質の少なくとも最初の２０個のＮ−末端アミノ酸を含有するドメインと少なくとも４０％の同一性を有するアミノ酸配列から成る第一ペプチジル断片であって、この場合、同一性パーセンテージがｈＧＨのドメインと同一サイズのアミノ酸配列全体で確定される断片；ｂ）Ａｒｇ残基またはＬｙｓ残基、あるいはほとんどのＣ末端アミノ酸残基がＡｒｇまたはＬｙｓであるペプチジル断片中の少なくとも２個のアミノ酸から成る第二ペプチジル断片；ならびにｃ）ペプチジル断片がｈＧＨタンパク質の一部でない２個より多いシステイン（Ｃｙｓ）残基を含有するアミノ酸配列から成る第三ペプチジル断片を包含するキメラタンパク質に関する。特に、本発明は、第三ペプチジル断片がインスリン前駆体であるキメラタンパク質に関する。
【００２０】
本発明は、第一の正確に畳まれたインスリン前駆体含有キメラタンパク質の生成方法であって、１以上の切断可能アミノ酸残基によりインスリン前駆体から分離された分子内シャペロン（ＩＭＣ）様ペプチジル断片から成る不正確に折り畳まれた第二インスリン前駆体含有キメラタンパク質を、水性媒質中の少なくとも１つのカオトロピック補助剤と接触することを包含する方法であって、前記のＩＭＣ様ペプチジル断片が：ａ）約２０〜約２００アミノ酸残基を含有し；ｂ）インスリン前駆体またはその一部ではなく、そしてｃ）不正確に畳まれた第二インスリン前駆体含有キメラタンパク質がカオトロピック補助剤と接触される場合の正確に畳まれた第一インスリン前駆体含有キメラタンパク質の収率が、前記のＩＭＣ様ペプチジル断片を含有しない不正確に畳まれたインスリン前駆体が同一カオトロピック補助剤と接触される場合の正確に畳まれたインスリン前駆体の収率より高いように、インスリン前駆体フォールディングを改良する方法にも関する。
【００２１】
本発明はさらに、インスリン前駆体のフォールディングを改良する能力に関してアミノ酸配列をスクリーニングするための検定であって、（ａ）インスリン前駆体を含有する、４．２項に開示されたキメラタンパク質の第一ペプチジル断片のアミノ酸配列を変えて、前記の変化を有する前記のキメラタンパク質を生成し、前記のキメラタンパク質が正確に折り畳まるような条件下で、そしてそれに十分な時間、前記の変化を有する前記のキメラタンパク質を水性媒質中の少なくとも１つのカオトロピック補助剤と接触させ、そして前記の変化を有する前記のキメラタンパク質のフォールディング収率を測定し；（ｂ）工程（ａ）に用いられるがしかし工程（ａ）に記載されたいかなるアミノ酸配列変化も伴わないキメラタンパク質を生成し、工程（ａ）に記載されたいかなるアミノ酸配列変化も伴わないキメラタンパク質を、工程（ａ）で用いられた同一カオトロピック補助剤と水性媒質中で同一条件下で、そして工程（ａ）で用いられたのと同一時間接触させて、そしてキメラタンパク質のフォールディング収率を測定し；そして（ｃ）それぞれ工程（ａ）および（ｂ）で測定されたキメラタンパク質のフォールディング収率を比較することを包含する検定に関するが、この場合、工程（ａ）で測定される収率は実質的に工程（ｂ）で測定される収率と等しいかまたはそれより大きく、このことはアミノ酸配列がインスリン前駆体のフォールディングを改良することを示す。
【００２２】
４．発明の詳細な説明
組換え法は、微生物におけるヒトプロインスリン、あるいは天然ヒトインスリンのものとは異なるアミノ酸配列および／またはアミノ酸鎖長を有するプロインスリンを生成するのを可能にする。大腸菌のような微生物中でのヒトプロインスリンまたはその誘導体の産生における際だった一問題は、細胞内分解である（Ｌａｄｉｓｃｈ ａｎｄ Ｋｏｈｌｍａｎ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇ．， １９９２， ２：４６９４７８）。さらに、微生物中で組換え的に産生されたヒトプロインスリンまたはその誘導体は、正確に連結されたシステイン架橋を保有しない（米国特許第５，４７３，０４９号）。
【００２３】
本発明に先立って、ヒトインスリンを組換え的に生成するための既知の方法は、以下の手法を基礎にしている：１）ヒトプロインスリンまたはその誘導体を含有する融合タンパク質を発現するベクターで形質転換された微生物の発酵；２）細胞破壊；３）融合タンパク質の単離；４）臭化シアンによる融合タンパク質の切断；５）プロインスリン配列を有する切断物質の単離；６）酸化的亜硫酸分解；７）正確に連結されたシステイン架橋の形成；８）プロインスリンの脱塩；９）正確に連結されたシステイン架橋を保有するプロインスリンのクロマトグラフィー的精製；９）プロインスリン溶液の濃縮；１０）濃縮プロインスリン溶液のクロマトグラフィー的精製；１１）ヒトインスリンを生成するためのプロインスリンの酵素的切断；および１２）その結果生じたヒトインスリンのクロマトグラフィー的精製（ＥＰ０，０５５，９４５）。この方法の欠点は多数の操作工程と、インスリンの低収率をもたらす、精製工程におけるプロインスリンの損失である。臭化シアン切断、亜硫酸分解及びプロインスリンの精製を経る単離融合タンパク質の工程からは、４０％までのプロインスリンの損失が予期される（ＥＰ０，０５５，９４５）。一方、インスリンまたはその誘導体の組換え的産生の収率は、必要な操作工程数が有意に低減される場合には、有意に増大され得る。
【００２４】
本発明の一目的は、より少ない必要操作工程を用いて、それで、より高い収率のヒトインスリンを生じるための組換え法を開発することであった。本発明の別の目的は、前記の方法に用い得るインスリン前駆体含有キメラタンパク質を開発することであった。本発明のさらに別の目的は、ペプチジル結合を介してインスリン前駆体が連結される場合に、インスリン前駆体のフォールディングを改良するアミノ酸配列をスクリーニングするための検定を開発することであった。
【００２５】
本出願人は、微生物宿主による細胞内分解からインスリン配列を保護するだけでなく、既存のヒトインスリン発現系と比較して、ペプチジル結合を介してインスリン前駆体に連結される場合に、以下の：１）融合インスリン前駆体のフォールディングを促し；２）融合タンパク質の溶解性を助長し、融合タンパク質中の分子間相互作用を低減し、したがって商業的有意の高濃度での融合インスリン前駆体のフォールディングを可能にし；３）臭化シアン切断、酸化的亜硫酸分解および関連精製工程の操作工程を排除し、そして；４）高濃度のメルカプタンの使用または疎水性吸収性樹脂の使用を排除する利点も有するペプチド配列を探索してきた。
【００２６】
出願人は、１以上の切断可能アミノ酸残基を介したインスリン前駆体とのＩＭＣ様配列の連結は、本発明の目的を達成する、ということを意外にも見出した。ＩＭＣ様配列は、標的タンパク質フォールディングを助け、標的タンパク質より高いパーセンテージの荷電アミノ酸残基を含有し、荷電アミノ酸残基の分極化分布を有し、そして標的タンパク質のための「あつらえ」であると思われる配列を有するといったような、ＩＭＣ配列の一定の特徴を有する。しかしながら、本発明に用いられるＩＭＣ様配列は、いくつかの重要な局面において、ＩＭＣ配列とは異なる。第一に、ＩＭＣ様配列は、標的タンパク質とは異質であり、即ち標的タンパク質のプロペプチドでない。例えば、インスリン前駆体が折り畳まれる標的タンパク質である場合、ＩＭＣ様配列はインスリン前駆体またはその一部ではない。さらに、ＩＭＣ様配列のサイズは、約２０〜２００アミノ酸残基である。
【００２７】
さらに、先行技術における教示（Ｃａｓｔｅｌｌａｎｏｓ−Ｓｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ， １９９６， ３７８：１７１−１７６）とは逆に、出願人は、ＩＭＣ様配列内では、ＩＭＣ様配列とインスリン前駆体を分離する１以上の切断可能アミノ酸残基と同一である１以上の切断可能アミノ酸残基が、フォールディング後のＩＭＣ様配列の断片化除去を可能にし、それゆえ下流精製工程を簡素化する、ということを意外にも見出した。
【００２８】
限定のためではないが、開示を分かり易くするために、本発明の詳細な説明は以下の亜項に分けられる。
４．１．第４．２．項に開示されるキメラタンパク質をコードする核酸
本発明は、４．２．項に開示されるキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を包含する単離核酸を提供する。
【００２９】
特定の態様では、本発明は、配列番号６のアミノ酸配列を有するキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を包含する単離核酸を提供する。
別の特定の態様では、本発明は、配列番号７のアミノ酸配列を有するキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を包含する単離核酸を提供する。
好ましい態様では、本発明は、４．２．項に開示されるキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を包含する単離ＤＮＡ分子を提供する。
【００３０】
別の好ましい態様では、本発明は、４．２．項に開示されるキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を包含する単離核酸を提供する。
さらに別の特定の態様では、本発明は、４．２．項に開示されるキメラタンパク質をコードするＤＮＡの第一、第二および第三ペプチジル断片をコードするヌクレオチド配列とハイブリダイズ可能な単離核酸を提供する。
【００３１】
４．２．項に開示されるキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、あるいはそのあらゆる断片、類似体または誘導体を包含する核酸は、当業界で既知のあらゆる方法（単数または複数）により生成させることができる。核酸は、完全に、化学的に合成することができる。あるいは、キメラタンパク質の各断片、即ち第一、第二または第三ペプチジル断片をコードする核酸は、分子クローニングにより生成させるか、あるいは所望の細胞から精製し得る。キメラタンパク質の各断片をコードする核酸は、次に、化学的または酵素的に一緒に結合されて、４．２．項に開示されるキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、あるいはその断片、類似体または誘導体を包含する核酸を生成する。
【００３２】
あらゆるヒト細胞は、潜在的に、ｈＧＨ核酸の単離のための核酸源として役立ち得る。あらゆる哺乳類細胞は、潜在的に、インスリン核酸の単離のための核酸源として役立ち得る。インスリンをコードする核酸配列は、哺乳類、ヒト、ブタ、ウシ、ネコ、トリ、ウマ、イヌ、ならびに付加的齧歯類または霊長類供給源などから単離し得る。
【００３３】
ＤＮＡは、所望の細胞から精製されるゲノムＤＮＡまたはその断片の化学的合成により、ｃＤＮＡクローニングにより、またはクローニングにより、クローン化ＤＮＡ（例えばＤＮＡ「ライブラリー」）から、当業界で既知の標準手法により生成され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｄ Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； Ｇｌｏｖｅｒ， Ｄ．Ｍ．（ｅｄ．），１９８５， ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＭＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｔｄ．， Ｏｘｆｏｒｄ， Ｕ．Ｋ． Ｖｏｌ． Ｉ，ＩＩ参照）。ゲノムＤＮＡ由来のクローンは、コード領域の他に、調節およびイントロンＤＮＡ領域を含有し得る；ｃＤＮＡ由来のクローンは、エキソン配列のみを含有する。供給源が何であれ、遺伝子は、遺伝子の増殖のために適切なベクター中に分子的にクローン化される必要がある。
【００３４】
ｃＤＮＡからの遺伝子の分子クローニングでは、ｃＤＮＡは、当業界で周知の方法により、全体的に細胞ＲＮＡまたはｍＲＮＡから生成される。遺伝子はゲノムＤＮＡからも生成し得るが、この場合、ＤＮＡ断片が生成され（例えば制限酵素を用いて、または機械的剪断により）、このうちのいくつかが所望の遺伝子をコードする。線状ＤＮＡ断片は、次に、標準技法により、例えばアガロースおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動およびカラムクロマトグラフィーにより（これらに限定されない）、サイズによって分離し得る。
【００３５】
４．２．項に開示されるキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列またはそのあらゆる断片、類似体または誘導体を包含する核酸が生成されたら、その同一性が、核酸シーケンシング（と業界で周知のあらゆる方法により）および既知の配列との比較によって確証し得る。ＤＮＡ配列分析は、当業界で既知のあらゆる技法により、例えばＭａｘａｍとＧｉｌｂｅｒｔの方法（Ｍａｘａｍ ａｎｄ Ｇｉｌｂｅｒｔ， １９８０， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．， ６５：４９９−５６０）、Ｓａｎｇｅｒジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９７７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ７４：５４６３）、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼの使用（Ｔａｂｏｒ ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，米国特許第４，７９５，６９９号）、自動ＤＮＡシーケンサーの使用（例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）またはＰＣＴ公開ＷＯ９７／１５６９０に記載された方法により実施し得るが、これらに限定されない。
【００３６】
４．２．項に開示されるキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、あるいはそのあらゆる断片、類似体または誘導体を包含する核酸とハイブリダイズ可能な核酸は、低、高または中等度緊縮条件下で、核酸ハイブリダイゼーションにより単離し得る（Ｓｈｉｌｏ ａｎｄ Ｗｅｉｎｂｅｒｇ， １９８１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７８：６７８９−６７９２も参照）。
【００３７】
４．２．キメラタンパク質
本発明は、Ｎ末端からＣ末端に：ａ）ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）タンパク質の少なくとも最初の２０個のＮ−末端アミノ酸を含有するドメインと少なくとも４０％の同一性を有するアミノ酸配列から成る第一ペプチジル断片であって、この場合、同一性パーセンテージがｈＧＨのドメインと同一サイズのアミノ酸配列全体で確定される断片；ｂ）Ａｒｇ残基またはＬｙｓ残基、あるいはほとんどのＣ末端アミノ酸残基がＡｒｇまたはＬｙｓであるペプチジル断片中の少なくとも２個のアミノ酸から成る第二ペプチジル断片；ならびにｃ）ペプチジル断片がｈＧＨタンパク質の一部でない２個より多いシステイン（Ｃｙｓ）残基を含有するアミノ酸配列から成る第三ペプチジル断片を包含するキメラタンパク質を提供する。
【００３８】
好ましい態様では、本発明は、第一ペプチジル断片がｈＧＨタンパク質のドメインと少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列から成る前記のキメラタンパク質を提供する。
別の好ましい態様では、本発明は、第一ペプチジル断片が抗ｈＧＨ抗体により結合し得る前記のキメラタンパク質を提供する。
【００３９】
さらに好ましい態様では、本発明は、第一ペプチジル断片が配列番号１のアミノ酸配列から成る前記のキメラタンパク質を提供する。
別のさらに好ましい態様では、本発明は、第一ペプチジル断片が配列番号２のアミノ酸配列から成る前記のキメラタンパク質を提供する。
好ましい態様では、本発明は、第二ペプチジル断片が配列番号３のアミノ酸配列から成る前記のキメラタンパク質を提供する。
【００４０】
特定の態様では、本発明は、第三ペプチジル断片がインスリン前駆体である前記のキメラタンパク質を提供する。
好ましい態様では、本発明は、インスリン前駆体がヒト起源である前記のキメラタンパク質を提供する。
さらに好ましい態様では、本発明は、ヒトインスリン前駆体が抗ヒトインスリン抗体に結合し得る前記のキメラタンパク質を提供する。
【００４１】
さらに別のより好ましい態様では、本発明は、ヒトインスリン前駆体が配列番号４のアミノ酸配列から成る前記のキメラタンパク質を提供する。
さらに別のより好ましい態様では、本発明は、ヒトインスリン前駆体中で、ヒトインスリン前駆体のＢ鎖およびＡ鎖が、１つのアミノ酸残基により、あるいは２〜３４個のアミノ酸残基から成るペプチジル断片により分離される前記のキメラタンパク質を提供する。
【００４２】
さらに別のより好ましい態様では、本発明は、ヒトインスリン前駆体が配列番号５のアミノ酸配列から成る前記のキメラタンパク質を提供する。
最も好ましい態様では、本発明は、配列番号６のアミノ酸配列から成るキメラタンパク質を提供する。
別の最も好ましい態様では、本発明は、配列番号７のアミノ酸配列から成るキメラタンパク質を提供する。
【００４３】
４．３．第４．２．項に開示されたキメラの生成
４．２．項で開示されたキメラタンパク質、ならびにその誘導体、類似体および断片は、当業界で既知の方法により、例えば組換え発現法、天然供給源からの精製および化学的合成により生成させ得るが、これらに限定されない。
例えば、４．２．項に開示されたキメラタンパク質は、組換えタンパク質発現技法により生成させ得る。組換え発現に関しては、４．２．項に開示されたキメラタンパク質をコードする遺伝子またはその一部は、特定の宿主細胞中での発現のために、適切なクローニングベクターに挿入される。当業界で既知の多数のベクター−宿主系を用いる。考え得るベクターとしては、プラスミドまたは修飾化ウイルスが挙げられる（これらに限定されない）が、しかしベクター系は、用いられる宿主細胞に適合性でなければならない。このようなベクターとしては、バクテリオファージ、例えばラムダ誘導体、あるいはプラスミド、例えばｐＢＲ３２２またはｐＵＣプラスミド誘導体、あるいはＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）が挙げられるが、これらに限定されない。クローニングベクターへの挿入は、例えば、相補的付着末端を有するクローニングベクターへのＤＮＡ断片の結合により成し遂げ得る。しかしながら、ＤＮＡを断片化するために用いられる相補的制限部位クローニングベクター中に存在しない場合、ＤＮＡ分子の末端を酵素的に修飾し得る。あるいは、望ましいあらゆる部位が、ＤＮＡ末端にヌクレオチド配列（リンカー）を結合させることにより生成し得る；これらの結合化リンカーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする特定の化学的合成オリゴヌクレオチドを包含し得る。遺伝子の多数のコピーが生成されるように、組換え分子は、形質転換、トランスフェクション、感染、電気穿孔等により宿主細胞中に導入される。
【００４４】
代替的方法では、所望の遺伝子は、「ショットガン」アプローチにおいて、適切なクローニングベクター中への挿入後に、同定し、単離し得る。例えばサイズ分別による所望の遺伝子の濃厚化は、クローニングベクター中への挿入前に実行し得る。
特定の態様では、４．２．項に開示されたキメラタンパク質をコードする単離遺伝子、ｃＤＮＡまたは合成ＤＮＡ配列を組み入れる組換えＤＮＡ分子による宿主細胞の形質転換は、遺伝子の多数のコピーの生成を可能にする。したがって、遺伝子は、形質転換体を増殖させ、形質転換体から組換えＤＮＡ分子を単離し、そして、必要な場合には、単離組換えＤＮＡから挿入遺伝子を回収することにより、多量に生成し得る。
【００４５】
４．２．項に開示されたキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、ならびにその誘導体、類似体および断片は、適切な発現ベクター、即ち挿入タンパク質コード配列の転写および翻訳に必要な素子を含有するベクターに挿入し得る。種々の宿主−ベクター系を、タンパク質コード配列を発現するために利用し得る。これらの例としては、ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルス等）に感染した哺乳類細胞系；ウイルス（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；微生物、例えば酵母菌ベクターを含有する酵母菌、あるいはバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡで形質転換された細菌が挙げられるが、これらに限定されない。ベクターの発現要素は、それらの強度および特異性が変化する。用いられる宿主−ベクター系によって、多数の適切な転写および翻訳要素のいずれかを用い得る。
【００４６】
ベクター中へのＤＮＡ断片の挿入のための前記の方法のいずれかを用いて、適切な転写／翻訳制御信号およびタンパク質コード配列から成るキメラ遺伝子を含有する発現ベクターを構築し得る。これらの方法としては、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡおよび合成技法、ならびにｉｎ ｖｉｖｏ組換え（遺伝子組換え）法が挙げられる。
４．２．項に開示されたキメラタンパク質をコードする核酸配列ならびにその誘導体、類似体および断片の発現は、４．２．項に開示されたキメラタンパク質が、組換えＤＮＡ分子で形質転換された宿主中で発現されるように、二次核酸配列により調節し得る。例えば、４．２．項に開示されたキメラタンパク質の発現は、当業界で既知のあらゆるプロモーター／エンハンサーにより制御し得る。
【００４７】
４．２．項に開示されたキメラタンパク質の発現を制御するために用い得るプロモーターとしては、ＳＶ４０初期プロモーター領域（Ｂｅｒｎｏｉｓｔ ａｎｄ Ｃｈａｍｂｏｎ， １９８１， Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４−３１０）、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復に含入されるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ， ｅｔ ａｌ．， １９８０， Ｃｅｌｌ ２２：７８７−７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ７８：１４４１−１４４５）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８２， Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２）；原核生物発現ベクター、例えばβ−ラクタマーゼプロモーター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ， ｅｔ ａｌ．， １９７８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ７５：３７２７−３７３１）、ｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ， ｅｔ ａｌ．， １９８３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ８０：２１−２５）；あるいはＴｒｐ Ｅプロモーター（Ｈａｌｌ， Ｉｎｖｉｓｉｂｌｅ Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ−− Ｔｈｅ Ｒａｃｅ ｔｏ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅ ａ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ， Ａｔｌａｎｔｉｃ Ｍｏｎｔｈｌｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８７）（”Ｕｓｅｆｕｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａ” ｉｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ， １９８０， ２４２：７４−９４も参照）；酵母菌またはその他の真菌からのプロモーター要素、例えばＧａｌ ４プロモーター、ＡＤＣ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリ性ホスファターゼプロモーター、ならびに組織特異性を示し、トランスジェニック動物で用いられてきた以下の動物転写制御領域：膵臓腺房細胞中で活性であるエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔ ｅｔ ａｌ．， １９８４， Ｃｅｌｌ ３８：６３９−６４６； Ｏｒｎｉｔｚ ｅｔ ａｌ．， １９８６， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ． Ｑｕａｎｔ． Ｂｉｏｌ． ５０：３９９−４０９； ＭａｃＤｏｎａｌｄ， １９８７， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ７：４２５−５１５）；膵臓β細胞中で活性であるインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１５：１１５−１２２）、リンパ様細胞中で活性であるイムノグロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ ｅｔ ａｌ．， １９８４， Ｃｅｌｌ ３８：６４７−６５８； Ａｄａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１８：５３３−５３８； Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ７：１４３６−１４４４）、精巣、乳腺、リンパ様およびマスト細胞中で活性であるマウス乳癌ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８６， Ｃｅｌｌ ４５：４８５−４９５）、肝臓中で活性であるアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ． １：２６８−２７６）；肝臓中で活性であるα−フェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆ ｅｔ ａｌ．， １９８５， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ５：１６３９−１６４８； Ｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：５３−５８）、肝臓中で活性であるα１−抗トリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ． １：１６１−１７１）、骨髄細胞中で活性であるβ−グロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１５：３３８−３４０； Ｋｏｌｌｉａｓ ｅｔ ａｌ．， １９８６， Ｃｅｌｌ ４６：８９−９４）、脳の稀突起膠細胞中で活性であるミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．，１９８７， Ｃｅｌｌ ４８：７０３−７１２）、骨格筋中で活性であるミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２８３−２８６）および視床下部で活性である性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８６， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：１３７２−１３７８）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
例えば、４．２．項に開示されたキメラタンパク質をコードする核酸に操作可能的に連結されるプロモーター、複製の１以上のオリジン、ならびに任意に、１以上の選択可能マーカー（例えば抗生物質耐性遺伝子）を包含するベクターを用い得る。
４．２．項に開示されたキメラタンパク質をコードする遺伝子挿入物、あるいはその断片、類似体または誘導体を含有する発現ベクターは、３つの一般的アプローチ：（ａ）核酸ハイブリダイゼーション、（ｂ）「マーカー」遺伝子機能の存在または不存在、ならびに（ｃ）挿入配列の発現により同定し得る。第一のアプローチでは、発現ベクターに挿入された４．２．項に開示されたキメラタンパク質をコードする遺伝子の存在が、４．２．項に開示されたキメラタンパク質をコードする挿入遺伝子と相同である配列を包含するプローブを用いて、核酸ハイブリダイゼーションにより検出し得る。第二のアプローチでは、ベクター中の４．２．項に開示されたキメラタンパク質をコードする遺伝子の挿入により引き起こされるある種の「マーカー」遺伝子機能（例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質に対する耐性、トランスフェクション表現型、曝露ウイルス中の封入体形成等）の存在または不存在を基礎にして、組換えベクター／宿主系を同定し、選択し得る。例えば、４．２．項に開示されたキメラタンパク質をコードする遺伝子がベクターのマーカー遺伝子内に挿入されると、４．２．項に開示されたキメラタンパク質をコードする挿入物を含有する組換え体を、マーカー遺伝子機能の不存在により同定し得る。第三のアプローチでは、組換え体により発現されるキメラタンパク質生成物を検定することにより、組換え発現ベクターを同定し得る。このような検定は、例えば、、ｉｎ ｖｉｔｒｏ検定における４．２．項に開示されたキメラタンパク質の物理的または機能的特性、例えば抗ｈＧＨまたは抗インスリン抗体との結合を基礎にしている。
【００４９】
特定の組換えＤＮＡ分子が同定され、単離されると、それを増殖するために、当業界で既知のいくつかの方法を用い得る。適切な宿主系および増殖条件が確立されると、組換え発現ベクターを増殖し、多量に調製し得る。前記で説明したように、用い得る発現ベクターとしては以下のベクターまたはそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない：酵母菌ベクター；バクテリオファージベクター（例えばラムダ）、ならびにプラスミドおよびコスミドＤＮＡベクター等。
【００５０】
さらに、挿入配列の発現を調節し、あるいは所望の特定の様式で遺伝子生成物を修飾し、そしてプロセシングする宿主細胞株を選択し得る。ある種のプロモーターからの発現は、ある種のインヂューサーの存在下で上昇し得る。したがって、４．２．項で開示された遺伝子操作キメラタンパク質の発現を制御し得る。さらに、異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳および翻訳後プロセシングおよび修飾（例えば、グリコシル化、リン酸化）のための特徴的および特異的メカニズムを有する。発現される外来タンパク質の所望の修飾およびプロセシングを保証するために適切な細胞株または宿主系を選択し得る。例えば、細菌系における発現は、非グリコシル化コアタンパク質生成物を生成するために用い得る。酵母菌中での発現は、グリコシル化生成物を生成する。哺乳類細胞中での発現は、異種タンパク質の「ネイティブ」グリコシル化を保証するために用い得る。さらに、異なるベクター／宿主発現系は、異なる程度にプロセシング反応に作用し得る。
【００５１】
ｃＤＮＡおよびゲノム配列はともに、クローン化し、発現し得る。
４．２．項に開示されたキメラタンパク質、あるいはその断片、類似体または誘導体は、標準方法、例えばクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティーおよびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、示差的溶解度により、あるいはタンパク質の精製のためのあらゆるその他の標準技法によっても、単離し、精製し得る。機能特性は、あらゆる適切な検定を用いて評価し得る。
【００５２】
４．２．項に開示されたキメラタンパク質あるいはその断片、類似体または誘導体をコードする核酸配列は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで突然変異化されて、翻訳、開始および／または終止配列を作製および／または破壊し、あるいはコード領域に変異を作製し得る。当業界で既知の突然変異誘発のためのあらゆる技法が用いられ、その例としては、ｉｎ ｖｉｔｒｏ特定部位の突然変異誘発（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９７８， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５３：６５５１）、ＴＡＢリンカー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の使用、突然変異含有ＰＣＲプライマー等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５３】
突然変異誘発に関与する実験は、主に特定部位の突然変異誘発とその後の変更遺伝子生成物の表現型検査で構成される。さらに一般的に用いられる特定部位の突然変異誘発プロトコールのいくつかは、必要な場合に、一本鎖ならびに二本鎖ＤＮＡを提供し得るベクターの利点を用いる。一般に、このようなベクターを用いる突然変異誘発プロトコールは以下の通りである。突然変異誘発性プライマー、即ち、変更される配列と相補的であるが、しかし１つまたは少数の変更、付加または欠失化塩基から成るプライマーが合成される。プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼにより、そしていくつかの付加的操作後にｉｎ ｖｉｔｒｏで延長され、目下の二本鎖ＤＮＡが細菌細胞中にトランスフェクトされる。次に、種々の方法により、所望の突然変異化ＤＮＡが同定され、そして所望のタンパク質が、突然変異化配列を含有するクローンから精製される。より長い配列に関しては、長挿入物（２キロベースより長い）はそれらのベクター中で不安定であるため、付加的クローニング工程がしばしば必要とされる。プロトコールは当業者には既知であり、特定部位の突然変異誘発のためのキットは、バイオテクノロジー供給会社から、例えばＡｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｉｎｃ．（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ， ＩＬ）およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）から広範に入手可能である。
【００５４】
さらに、４．２．項に開示されたキメラタンパク質、あるいはその断片、類似体または誘導体は、キメラ合成し得る（例えば、Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３０：３１２８−３１３５およびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， １９６３， Ｊ． Ａｍｅｒ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ８５：２１４９−２１５６参照）。例えば、４．２．項に開示されたキメラタンパク質あるいはその断片、誘導体または類似体は、固相法により合成され、樹脂から切断されて、分離用高速液体クロマトグラフィーにより精製し得る（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， １９８３， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ， Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．， Ｎ．Ｙ．， ｐｐ．５０−６０参照）。４．２．項に開示されたキメラタンパク質あるいはその断片、誘導体または類似体は、ペプチド合成機の使用によっても合成し得る。合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析またはシーケンシングにより確証し得る（例えば、ｔｈｅ Ｅｄｍａｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ；Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， １９８３， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．， Ｎ．Ｙ．， ｐｐ．３４−４９参照）。
【００５５】
４．２．項に開示されたキメラタンパク質あるいはその断片、誘導体または類似体は、アミノ酸残基の逐次付加によりそれらの全体で、あるいは当業界で周知の技法、例えば断片濃縮を用いて併合し得る断片亜構成成分として合成し得る（Ｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５６：４０４−４０８； Ｎｙｆｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｐｅｐｔｉｄｅｓ， Ｐｒｏｃ． １２ｔｈ Ａｍｅｒ． Ｐｅｐ． Ｓｏｃ．， Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｒｉｖｉｅｒ（ｅｄｓ）， Ｌｅｉｄｅｎ， ｐｐ６６１−６６３； Ｎｏｋｉｋａｒａ ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ， Ｙａｎａｉｈａｒａ（ｅｄ）， Ｏｓａｋａ， ｐｐ３１５−３２０）。
【００５６】
少し好ましい態様では、４．２．項に開示されたキメラタンパク質あるいはその断片、誘導体または類似体は、そのタンパク質のタンパク質分解とその後の前記で記載されたような標準方法（例えば、イムノアフィニティー精製）を用いた精製により生成することができる。
４．４．正確に折り畳まれたインスリン前駆体の生成
本発明は、正確に畳まれた第一インスリン前駆体含有キメラタンパク質の生成方法であって、１以上の切断可能アミノ酸残基によりインスリン前駆体から分離された分子内シャペロン（ＩＭＣ）様ペプチジル断片から成る不正確に折り畳まれた第二インスリン前駆体含有キメラタンパク質を、水性媒質中の少なくとも１つのカオトロピック補助剤と接触することを包含する方法であって、前記のＩＭＣ様ペプチジル断片が：ａ）約２０〜約２００アミノ酸残基を含有し；ｂ）インスリン前駆体またはその一部ではなく、そしてｃ）不正確に畳まれた第二インスリン前駆体含有キメラタンパク質がカオトロピック補助剤と接触される場合の正確に畳まれた第一インスリン前駆体含有キメラタンパク質の収率が、前記のＩＭＣ様ペプチジル断片を含有しない不正確に畳まれたインスリン前駆体が同一カオトロピック補助剤と接触される場合の正確に畳まれたインスリン前駆体の収率より高いように、インスリン前駆体フォールディングを改良する方法を提供する。
【００５７】
本明細書中で用いる場合、「ヒトインスリン前駆体」とは、１）ヒトインスリンＡ鎖およびＢ鎖またはその類似体、誘導体および断片を含有し、２）６個のシステイン残基を含有し、３）インスリンＡ鎖およびＢ鎖に結合される除去可能接続部分を有し、そして４）抗ヒトインスリン抗体と結合し得る分子を指す。ヒトインスリン前駆体の例としては、Ｌａｄｉｓｃｈ ａｎｄ Ｋｏｈｌｍａｎｎ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇ．， １９９２， ８：４６９−４７８； Ｔｈｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １９８６， ８３：６７６６−６７７０； 米国特許第５，４７３，０４９号；米国特許第５，４５７，０６６号およびＥＰ０，３４７，７８１ Ｂ１に開示されたものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５８】
「正確に折り畳まれた」ヒトインスリン前駆体またはインスリン前駆体含有キメラタンパク質という用語は、ヒトインスリン前駆体が天然の生物学的に活性なヒトインスリンに見出されるような立体配座およびジスルフィド架橋を有する、即ちａ）Ａ−６およびＡ−１１、ｂ）Ａ−７およびＢ−７、ｃ）Ａ−２０およびＢ−１９間にジスルフィド架橋が形成される分子を指す。「不正確に折り畳まれた」ヒトインスリン前駆体またはインスリン前駆体含有キメラタンパク質とは、ヒトインスリン前駆体が天然の生物学的に活性なヒトインスリンに見出されるような立体配座、ジスルフィド架橋またはその両方を欠いた分子を指す。
【００５９】
好ましい態様では、本発明は、前記の正確に折り畳まれたインスリン前駆体含有キメラタンパク質の生成方法であって、インスリン前駆体がヒト起源である方法を提供する。ヒトインスリン前駆体が抗ヒトインスリン抗体に結合し得るものも好ましい。さらに好ましくは、ヒトインスリン前駆体は、配列番号４のアミノ酸配列から成る。さらに好ましくは、ヒトインスリン前駆体において、ヒトインスリン前駆体のＢ鎖およびＡ鎖は、１個のアミノ酸残基、または２〜３４個のアミノ酸残基から成るペプチジル断片により分離される。さらに好ましくは、ヒトインスリン前駆体は、配列番号５のアミノ酸配列から成る。
【００６０】
好ましい態様では、本発明は、前記の正確に折り畳まれたインスリン前駆体含有キメラタンパク質の生成方法であって、ＩＭＣ様ペプチジル断片がインスリン前駆体より高いパーセンテージの荷電アミノ酸残基を含有する方法を提供する。さらに好ましくは、ＩＭＣ様ペプチジル断片において、Ｎ末端半分は、負荷電アミノ酸残基より多い正荷電アミノ酸残基を含有し、そしてＣ末端半分は正荷電アミノ酸残基より多い負荷電アミノ酸残基を含有する。さらに好ましくは、ＩＭＣ様ペプチジル断片は、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）タンパク質の少なくとも最初の２０個のＮ末端アミノ酸を含有するドメインと少なくとも４０％の同一性を有するアミノ酸配列から成るが、この場合、同一性パーセンテージは、ｈＧＨのドメインと同一サイズのアミノ酸配列全体で確定される。さらに好ましくは、ＩＭＣ様ペプチジル断片は、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）タンパク質の少なくとも最初の２０個のＮ末端アミノ酸を含有するドメインと少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列から成る。さらに好ましくは、ＩＭＣ様ペプチジル断片は、抗ｈＧＨ抗体に結合し得る。さらに好ましくは、ＩＭＣ様ペプチジル断片は、配列番号１のアミノ酸配列から成る。さらにより好ましくは、ＩＭＣ様ペプチジル断片は、配列番号２のアミノ酸配列から成る。
【００６１】
好ましい態様では、本発明は、前記の正確に折り畳まれたインスリン前駆体含有キメラタンパク質の生成方法であって、切断可能アミノ酸残基がＡｒｇまたはＬｙｓ残基である方法を提供する。さらに好ましくは、切断可能アミノ酸残基は、配列番号３のアミノ酸配列から成る。
特定の態様では、本発明は、前記の正確に折り畳まれたインスリン前駆体含有キメラタンパク質の生成方法であって、不正確に折り畳まれた第二インスリン前駆体含有キメラタンパク質において、ＩＭＣ様ペプチジル断片が前記のキメラタンパク質のＮ末端に位置する方法を提供する。別のこのような特定の態様では、ＩＭＣ様ペプチジル断片は、前記のキメラタンパク質のＣ末端に位置する。さらに別のこのような特定の態様では、ＩＭＣ様ペプチジル断片は、インスリン前駆体のＢ鎖およびＡ鎖の間に位置する。
【００６２】
好ましい態様では、本発明は、前記の正確に折り畳まれたインスリン前駆体含有キメラタンパク質の生成方法であって、ＩＭＣ様ペプチジル断片が、第二インスリン前駆体含有キメラタンパク質中のＩＭＣ様ペプチジル断片およびインスリン前駆体を分離する１以上の切断可能アミノ酸残基と同一である１以上の切断可能アミノ酸残基を含有する方法を提供する。さらに好ましくは、切断可能アミノ酸残基は、ＡｒｇまたはＬｙｓ残基である。
【００６３】
最も好ましい態様では、本発明は、前記の正確に折り畳まれたインスリン前駆体含有キメラタンパク質の生成方法であって、不正確に折り畳まれた第二インスリン前駆体含有キメラタンパク質が配列番号６のアミノ酸配列から成る方法を提供する。さらに最も好ましくは、不正確に折り畳まれた第二インスリン前駆体含有キメラタンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列から成る。
【００６４】
カオトロピック補助剤は、水性溶液中で水素結合を破壊する化合物である。特定の態様では、本発明は、前記の正確に折り畳まれたインスリン前駆体含有キメラタンパク質の生成方法であって、カオトロピック補助剤が塩酸グアニジン、炭酸エチレン、チオシアネート、ジメチルスルホキシドおよび尿素から成る群から選択される方法を提供する。好ましくは、カオトロピック補助剤は、尿素である。さらに好ましくは、尿素は約２．０〜約８．０ Ｍの濃度で存在する。最も好ましくは、尿素は約３．０〜約６．０ Ｍの濃度で存在する。
【００６５】
別の特定の態様では、本発明は、前記の正確に折り畳まれたインスリン前駆体含有キメラタンパク質の生成方法であって、不正確に折り畳まれた第二インスリン前駆体含有キメラタンパク質が、ｐＨ約８．０〜約１０．５で、約０．０５〜約１５．０ｇ／ｌの不正確に折り畳まれた第二インスリン前駆体含有キメラタンパク質の濃度で、水性溶媒中の少なくとも１つのカオトロピック補助剤と接触される方法を提供する。好ましくは、ｐＨは、約９．０〜約１０．０に保持される。不正確に折り畳まれた第二インスリン前駆体含有キメラタンパク質が約０．５〜約５．０ｇ／ｌで存在するのも好ましい。さらに好ましくは、不正確に折り畳まれた第二インスリン前駆体含有キメラタンパク質は、約２．０〜約３．０ｇ／ｌで存在する。
【００６６】
メルカプタンは、水中で可溶性であり、そして少なくとも１個の−ＳＨ基を含有する化合物である。さらに別の態様では、本発明は、前記の正確に折り畳まれたインスリン前駆体含有キメラタンパク質の生成方法であって、不正確に折り畳まれた第二インスリン前駆体含有キメラタンパク質を、不正確に折り畳まれた第二インスリン前駆体含有キメラタンパク質のシステイン残基当たりのメルカプタンの−ＳＨ基が５より少なく生じるような量のメルカプタンと接触させることをさらに包含する方法を提供する。さらに別の特定の態様では、不正確に折り畳まれた第二インスリン前駆体含有キメラタンパク質を、メルカプタンおよびカオトロピック補助剤と同時に接触させる。さらに別の特定の態様では、不正確に折り畳まれた第二インスリン前駆体含有キメラタンパク質は、メルカプタンおよびカオトロピック補助剤と順次接触させる。好ましくは、メルカプタンの量は、不正確に折り畳まれた第二インスリン前駆体含有キメラタンパク質のシステイン残基当たりメルカプタンの約０．０７〜約１．０の−ＳＨ基を生じる。メルカプタンが、ジチオトレイトール、ジチオエリトロール、２−メルカプトエタノール、システイン、メチルチオグリコレート、３−メルカプト−１，２−プロパンジオールおよび３−メルカプトプロピオン酸から成る群から選択されるのも好ましい。さらに好ましくは、メルカプタンは２−メルカプトエタノールである。
【００６７】
さらに別の特定の態様では、本発明は、前記の正確に折り畳まれたインスリン前駆体含有キメラタンパク質の生成方法であって、不正確に折り畳まれた第二インスリン前駆体含有キメラタンパク質から正確に折り畳まれた第一インスリン前駆体含有キメラタンパク質を分離することをさらに包含する方法を提供する。好ましくは、第一インスリン前駆体含有キメラタンパク質は、限外濾過により第二インスリン前駆体含有キメラタンパク質から分離される。さらに好ましくは、限外濾過は、ｐＨ約８．０〜約１１．０で実行される。最も好ましくは、限外濾過は、ｐＨ約９．０〜約１０．０で実行される。
【００６８】
さらに別の特定の態様では、本発明は、前記の方法により生成される正確に折り畳まれたインスリン前駆体含有キメラタンパク質を提供する。
４．５．インスリン前駆体のフォールディングを改良するアミノ酸配列のスクリーニング
本発明は、インスリン前駆体のフォールディングを改良する能力に関してアミノ酸配列をスクリーニングするための検定であって、以下の：（ａ）４．２項に開示されたキメラタンパク質の第一ペプチジル断片のアミノ酸配列を変えて、前記の変化を有する前記のキメラタンパク質を生成し、前記のキメラタンパク質が正確に折り畳まるような条件下で、そしてそれに十分な時間、前記の変化を有する前記のキメラタンパク質を水性媒質中の少なくとも１つのカオトロピック補助剤と接触させ、そして前記の変化を有する前記のキメラタンパク質のフォールディング収率を測定し；（ｂ）工程（ａ）に用いられるがしかし工程（ａ）に記載されたいかなるアミノ酸配列変化も伴わないキメラタンパク質を生成し、工程（ａ）に記載されたいかなるアミノ酸配列変化も伴わないキメラタンパク質を、工程（ａ）で用いられた同一カオトロピック補助剤と水性媒質中で同一条件下で、そして工程（ａ）で用いられたのと同一時間接触させて、そしてキメラタンパク質のフォールディング収率を測定し；そして（ｃ）それぞれ工程（ａ）および（ｂ）で測定されたキメラタンパク質のフォールディング収率を比較することを包含する検定であって、工程（ａ）で測定される収率が実質的に工程（ｂ）で測定される収率と等しいかまたはそれより大きく、このことがアミノ酸配列がインスリン前駆体のフォールディングを改良することを示す検定を提供する。
【００６９】
４．２．項に開示されたキメラタンパク質の第一ペプチジル断片のアミノ酸配列は、当業界で既知のあらゆる突然変異誘発技法により、好ましくは４．３．項に記載された突然変異誘発技法により、変え得る。
前記の検定の好ましい態様では、キメラタンパク質は、配列番号６のアミノ酸配列から成る。
【００７０】
前記の検定の別の好ましい態様では、キメラタンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列から成る。
前記の検定のさらに別の好ましい態様では、カオトロピック補助剤は、尿素である。
前記の検定のさらに別の好ましい態様では、検定は、それぞれ工程（ａ）および（ｂ）において、キメラタンパク質を、キメラタンパク質のシステイン当たりのメルカプタンの５個未満の−ＳＨ基を生じる量のメルカプタンと接触させることをさらに包含する。さらに好ましくは、メルカプタンは２−メルカプトエタノールである。
【００７１】
特定の態様では、前記の検定の生成物が提供される。
５．実施例
配列番号６のアミノ酸配列から成るｈＧＨ−ミニプロインスリンをコードするＤＮＡ断片を、化学的に合成した。Ｔｒｐプロモーターの制御下で、ＤＮＡ断片を細菌発現ベクター中にクローン化した。ｈＧＨ−ミニプロインスリンを含有する発現ベクターを、大腸菌ＰＲ１株中にトランスフェクトして、微量元素の存在下で、Ｍ９−ＣＡ培地中で組換え細胞を培養した。ｈＧＨ−ミニプロインスリン融合タンパク質を封入体から回収し、ジスルフィド架橋が正確に折り畳まれたヒトプロインスリン中で形成される、即ち、Ａ６−Ａ１１、Ａ７−Ｂ７およびＡ２０−Ｂ１９のジスルフィド架橋が形成されるのと同様に、折り畳まれたｈＧＨ−ミニプロインスリン融合タンパク質内で、ジスルフィド架橋が形成されるような条件下で折り畳んだ。折り畳まれたｈＧＨ−ミニプロインスリン融合タンパク質を、１００Ｋ限外濾過により非折り畳み融合タンパク質から分離した。単離された正確に折り畳まれたｈＧＨ−ミニプロインスリン融合タンパク質をトリプシンで消化して、正確に折り畳まれたＡｒｇ（Ｂ３１）−ヒトインスリンを生成した。陽イオン交換クロマトグラフィーにより、Ａｒｇ（Ｂ３１）−ヒトインスリンを、少なくとも９０％の純度に精製した。精製Ａｒｇ（Ｂ３１）−ヒトインスリンを次にカルボキシペプチダーゼＢで消化して、正確に折り畳まれたヒトインスリンを生成し、これを次に逆相ＨＰＬＣにより精製した。このようにして生成した純ヒトインスリンを、Ｎ−末端配列分析、分子量確定およびペプチドマッピングにより特性化した。
【００７２】
５．１．ｈＧＨ−ミニ−プロインスリン発現ベクターの構築
配列番号６のアミノ酸配列から成るｈＧＨ−ミニ−プロインスリンをコードするＤＮＡ断片を、Ｇａｎ ｅｔ ａｌ．「Ｇｅｎｅ」１９８９， ７９：１５９−１６６に開示された手法により、化学的に合成した。５’Ｃｌａ Ｉ部位および３’Ｈｉｎｄ ＩＩＩ部位が合成ＤＮＡ断片中に含まれた。要するに、配列番号６のアミノ酸残基５１および５２をコードするヌクレオチド配列を切断する５’Ｃｌａ Ｉから３’Ｋｐｎ Ｉまでの断片、および５’Ｋｐｎ Ｉから３’Ｈｉｎｄ ＩＩＩまでの断片を化学的に合成し、それぞれ、ｐＵＣ１８ベクター中にサブクローニングした。その後、ｈＧＨ−ミニ−プロインスリンの配列がＴｒｐプロモーターおよびＳＤ配列の制御下にあるように、配列番号６の全アミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を修飾化ｐＡＴＨ２ベクター中にサブクローニングした。その結果生じたベクターｐＺＲｈｉ−１（図２）を用いて、ｈＧＨ−ミニ−プロインスリン融合タンパク質を発現した。
【００７３】
５．２．ｈＧＨ−ミニ−プロインスリン融合タンパク質の発現
ｈＧＨ−ミニ−プロインスリン融合タンパク質発現ベクターを、大腸菌ＲＲ１またはＫ１２Ｗ３１１０株に形質転換した。形質転換化大腸菌を、微量元素の存在下でＭ９−ＣＡ培地中で培養した。振盪フラスコおよび発酵器の両方で、ｈＧＨ−ミニ−プロインスリン融合タンパク質の発現レベルを確定した。両方の場合で、総大腸菌タンパク質の２０〜２５％という高レベルの発現が観察された。
【００７４】
５．３． ｈＧＨ−ミニ−プロインスリン融合タンパク質の再フォールディング
ｈＧＨ−ミニ−プロインスリン融合タンパク質を、「封入体」と呼ばれる不溶性形態として発現させた。封入体を放出するために、８×１０７Ｐａ（８００ ｂａｒ）での高圧ホモジナイザーにより大腸菌細胞を破壊した。細胞破砕屑および可溶性大腸菌タンパク質を、１０，０００ ｇでの遠心分離により除去した。ｈＧＨ−ミニ−プロインスリン融合タンパク質を含有する封入体ペレットを、水で３回洗浄した。その結果生じた、 ｈＧＨ−ミニ−プロインスリン融合タンパク質が約９０％の純度で含まれる封入体ペレットを、フォールディングのための出発物質として用いた。２〜６ ｍＭのメルカプトエタノールの存在下で、２０〜３０ ｍｇ／ｍｌのｈＧＨ−ミニ−プロインスリン融合タンパク質濃度で、封入体を８ Ｍの尿素、ｐＨ１０．４中に溶解した。遠心分離により、不溶性物質を除去した。上清を、低濃度尿素で１０倍に稀釈して、尿素の最終濃度を３〜６ Ｍ、ｐＨ９〜１０、ならびにメルカプトエタノールの最終濃度を０．２〜０．６ ｍＭとした。４℃で、３．２ Ｍ、ｐＨ９．３の尿素濃度で、ルーチンフォールディングを実行した。０．１％リン酸塩緩衝液中の３０〜４７％のアセトニトリル勾配を用いて、Ｃ４逆相ＨＰＬＣにより、フォールディング工程をモニタリングした。このようなクロマトグラフィー条件下で、正確に折り畳まれたｈＧＨ−ミニ−プロインスリンの保持時間は、約２３分であった。フォールディングは、２４時間以内に終了し得る。再フォールディング収率は約７０％であった。
【００７５】
１００ Ｋ限外濾過により、フォールディング混合物を分別した。ろ液分画中に見出された正確に折り畳まれたｈＧＨ−ミニ−プロインスリン融合タンパク質を、１０ Ｋ限外濾過系により濃縮した。ｐＨ３．５で、水を用いて尿素を除去した。限外濾過工程の収率は、８５％を上回った。
５．４．正確に再び折り畳まれたｈＧＨ−ミニ−プロインスリンのトリプシン切断
トリプシン切断のためには、正確に折り畳まれたｈＧＨ−ミニ−プロインスリン融合タンパク質の濃度は、約１０〜１２ ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１０ ｍｇ／ｍｌである。トリプシンとｈＧＨ−ミニ−プロインスリン融合タンパク質との間の比は、約１：６０〜約１：２５０の範囲、好ましくは１：１００であった。ｐＨは、約１０〜約１１、好ましくは約１０．８に保持した。切断は、４℃で約１〜約５時間で進行させ、好ましくは約３．５時間実行した。切断反応は、リン酸塩緩衝液を用いてｐＨを３．５に調整することにより停止した。逆相ＨＰＬＣ分析は、この切断工程に関する収率が９５％より高いことを示した。１０より高いｐＨでは、トリプシンは以下のＡｒｇ残基に作用する：ヒトミニ−プロインスリンＢおよびＡ鎖間のＡｒｇ残基、ｈＧＨ断片とミニ−プロインスリン断片との間のＡｒｇ残基、ｈＧＨ断片内のＡｒｇ残基。トリプシン消化は、ｈＧＨ断片からのいくつかの小片、ならびにＡｒｇ（Ｂ３１）−ヒトインスリンと呼ばれる、Ｂ鎖のＣ末端に余分のＡｒｇを有するヒトインスリンを生じた。ヒトインスリンのＡｒｇ（Ｂ２２）は、おそらくは三次元構造による妨害のために、前記の条件下では切断されなかった。
【００７６】
１０ ｍＭのクエン酸塩緩衝液の存在下で溶離液としてＮａＣｌを用いて、陽イオン交換クロマトグラフィーにより、Ａｒｇ（Ｂ３１）−ヒトインスリンを精製した。精製Ａｒｇ（Ｂ３１）−ヒトインスリンは、純度が９０％より高かった。
５．５．Ａｒｇ（Ｂ３１）−ヒトインスリンのヒトインスリンへの転化
カルボキシペプチダーゼＢにより、Ａｒｇ（Ｂ３１）−ヒトインスリンのＣ末端のＡｒｇ（Ｂ３１）を除去した。正確に畳まれたＡｒｇ（Ｂ３１）−ヒトインスリンの濃度は、約１０ ｍｇ／ｍｌであった。カルボキシペプチダーゼＢとＡｒｇ（Ｂ３１）−ヒトインスリンとの間の比を、約１：１０００に保持した。５０ ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０中で、３７℃で約１時間、切断を進行させた。リン酸塩緩衝液を用いてｐＨを３．５に調整することにより、切断反応を停止した。ヒトインスリンの収率は、９９％より高かった。
【００７７】
５．６．ヒトインスリンの精製
カルボキシペプチダーゼＢ消化から生成されたヒトインスリンを、０．１％のリン酸塩緩衝液、ｐＨ３．０で平衡させておいたＣ８逆相ＨＰＬＣカラムに投入した。０．１％のリン酸塩緩衝液、ｐＨ３．０中の１７％〜３５％のアセトニトリル勾配により、ヒトインスリンを溶離した。インスリン分画をプールし、酢酸を付加して濃度を０．１２５〜０．２ Ｍ、ｐＨ６．０とした。このようにして生成したインスリンを、４℃で結晶化した。ヒトインスリンの純度は、９９％を上回った。
【００７８】
５．７．精製ヒトインスリンの特性化
精製ヒトインスリンおよびＷＨＯ標準ヒトインスリンの最初の１５個のＮ末端アミノ酸を、標準エドマン分解により確定した。精製ヒトインスリンのＡおよびＢ鎖の両方のＮ末端配列は、ＷＨＯ標準ヒトインスリンのものと同一である。
精製ヒトインスリンの分子量およびＷＨＯ標準ヒトインスリンの分離量を、ＶＧプラットホーム質量分析により確定した。両標本が、５８０７．７のＭ／Ｚを生じた。
【００７９】
精製ヒトインスリンおよびＷＨＯ標準ヒトインスリンをともに、Ｖ８プロテアーゼで消化した。Ｃ１８逆相ＨＰＬＣにより、消化断片を分析した。両標本が、同一ペプチドマッピングパターンを示した（Ｔｈｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ， Ｈｅｒｓｈｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｅｄ． Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， １９８９， ｐ３２２−３２８参照）。
【００８０】
本発明は、寄託された微生物または本明細書中に記載した特定の態様により、その範囲を限定されない。実際、本明細書中に記載したものに加えて、種々の修正を成し得ることは、前記の説明および添付の図面から、当業者には明らかになる。このような集成は、添付の請求の範囲の範囲内であるよう意図される。
種々の参考文献を本明細書中に引用したが、これらの記載内容は、参照により完全に本明細書中に含まれる。
【００８１】
【表１】
【００８２】
【表２】
【００８３】
【表３】
【００８４】
【表４】
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
プロインスリンの構造を示す。
【図１Ｂ】
正確に形成されたジスルフィド架橋を有する成熟インスリンの構造を示す。
【図２】
ｈＧＨ−ミニプロインスリン（配列番号６）発現ベクター（ｐＺＲｈｉ−１）のマップ。
１．発明の背景
１．１．技術分野
本発明は、標的タンパク質に連結した分子内シャペロン（ＩＭＣ）様配列を含有するキメラタンパク質に関する。特に、本発明は、インスリン前駆体に連結したＩＭＣ様配列を含有するキメラタンパク質に関する。本発明は、正確に畳まれたインスリン前駆体含有キメラタンパク質の生成方法であって、特に、インスリン前駆体に連結したＩＭＣ様配列を含有する不正確に畳まれたキメラタンパク質を、少なくとも１つのカオトロピック補助剤と接触することを包含する方法にも関する。本発明はさらに、インスリン前駆体と連結したＩＭＣ様配列を含有するキメラタンパク質を用いてインスリン前駆体のフォールディングを改良する能力に関してアミノ酸配列をスクリーニングするための検定に関する。
【０００２】
１．２．背景技術
１．２．１．分子内シャペロンおよびタンパク質フォールディング
分子シャペロンは、他のポリペプチドの正確なフォールディングを助けるが、しかし機能的集成構造の構成成分ではないタンパク質の一種と定義される（Ｓｈｉｎｄｅ ａｎｄ Ｉｎｏｕｙｅ， ＴＩＢＳ， １９９３， １８：４４２−４４６）。分子内シャペロン（ＩＭＣ）は、折り畳まれる標的タンパク質の前駆体の一部であり、それらの不存在下では、標的タンパク質分子は適正な自己フォールディングに関する十分な情報を有さない（Ｉｎｏｕｙｅ， Ｅｎｚｙｍｅ， １９９１， ４５：３１４−３２１）。ＩＭＣの独特の特徴としては、以下のものが挙げられる：ａ）ＩＭＣおよび標的タンパク質はペプチジル結合により連結されて単一ポリペプチドを形成する；ｂ）ＩＭＣは標的タンパク質の活性立体配座の形成には絶対に必要であるが、しかし標的タンパク質の機能のためには必要ではない；ｃ）タンパク質フォールディングの完了時に、ＩＭＣは自己プロセシングにより、または別のエンドペプチダーゼによって除去される；ｄ）ＩＭＣは触媒としては機能せず、即ち、一ＩＭＣ分子は標的タンパク質の一分子のみを再折り畳み出来る；そしてｅ）ＩＭＣは標的タンパク質に対してのみ作用する高度特異的「あつらえ」ポリペプチドである（Ｉｎｏｕｙｅ， Ｅｎｚｙｍｅ， １９９１， ４５：３１４−３２１）。
【０００３】
近年、ＩＭＣまたはプロペプチドはペプチジル結合を介して連結されないが、しかしむしろ別個のペプチドとしてフォールディング反応に付加される、ということが示された（米国特許第５，７１９，０２１号）。しかしながら、米国特許第５，７１９，０２１号に用いられたプロペプチドは標的タンパク質の天然プロペプチドであるか、または標的タンパク質の同一機能を有するポリペプチドのプロペプチドであり、ポリペプチドは標的タンパク質と同様のアミノ酸配列も有する、ということは注目に値する。さらに、米国特許第５，７１９，０２１号に記載された分子間反応は、疎水性相互作用に有利な緩衝化イオン性水性媒質中で実行されねばならない。
【０００４】
ＩＭＣの例としては、ズブチリシン、α−溶解性プロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼＹおよびユビキチンのプロペプチドが挙げられる（Ｓｈｉｎｄｅ ａｎｄ Ｉｎｏｕｙｅ， ＴＩＢＳ， １９９３， １８：４４２−４４６）。ズブチリシンのＩＭＣ配列の一定の特徴としては、ａ）ＩＭＣは、標的タンパク質より高いパーセンテージの荷電アミノ酸残基を含有する；ｂ）ＩＭＣ内のこれらの荷電アミノ酸の分布は非常に不均等であり、即ち、Ｎ末端半分は負荷電残基より多い正荷電残基を含有し、そしてＣ末端半分は正荷電残基より多い負荷電残基を含有する；ｃ）ＩＭＣ内のＳｅｒおよびＴｈｒ残基も不均等に分布する；ｄ）ＩＭＣは作用的高含量の芳香族残基を含有する；そしてｅ）ＩＭＣは９残基の疎水性配列を含有する、ということが挙げられる（Ｉｎｏｕｙｅ， Ｅｎｚｙｍｅ， １９９１， ４５：３１４−３２１）。荷電残基に対する同様の偏りは、α−溶解性プロテアーゼおよびカルボキシペプチダーゼＹにおいても観察される（ Ｉｎｏｕｙｅ， Ｅｎｚｙｍｅ， １９９１， ４５：３１４−３２１）。
【０００５】
１．２．２．成熟ヒト成長ホルモンのアミノ酸配列
成熟ヒト成長ホルモンのアミノ酸配列は、Ｉｋｅｈａｒａ ｅｔ ａｌ．「Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ」１９８４， ８１：５９５６−５９６０に開示されている。成熟ｈＧＨまたはその任意の部分がＩＭＣまたはプロペプチドとして機能し得る、ということは当業界では示唆されていない。実際、定義により、あらゆるプレ、プロまたはプレプロ配列は成熟配列から除去されるため、成熟ｈＧＨまたはその任意の部分は、全くプロペプチドとは考えられ得ない。
【０００６】
１．２．３．ヒトインスリン構造
インスリンは、既知のアミノ酸配列および構造特徴を有する明瞭なペプチドである（Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ− Ａ Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｓｅ； Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ Ｃｏ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８３， ｐｐ． ２３１−２３５； Ｎｏｒｍａｎ ａｎｄ Ｌｉｔｗａｃｋ， Ｉｎ Ｈｏｒｍｏｎｅｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８７， ｐｐ． ２６４−３１７）。このホルモンは、図１Ｂに示したようなジスルフィド架橋により連結されるＡ鎖（２１アミノ酸）とＢ鎖（３０アミノ酸）である２つの別個のペプチド鎖から成る。プロインスリンはインスリンの生物学的前駆体であり、そしてＡおよびＢ鎖がＣペプチドにより接続される場合に形成される単一ペプチド鎖である（図１Ａ）。
【０００７】
１．２．４．組換え法により産生されるヒトインスリン
ヒトインスリンは、ヒト膵臓ペプチドの配列と同一の配列で細菌中に作製された最初の動物タンパク質であった（ Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ− Ａ Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｓｅ； Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ Ｃｏ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８３， ｐｐ． ２３１−２３５）。実験室におけるヒトインスリンの最初の発現の成功は１９７８年に発表され、ヒトインスリンは１９８２年に治療薬として承認された（Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９８３， ２１９：６３２−６３７）。
【０００８】
１．２．４．１．二鎖法
この方法によって、各インスリン鎖は、それぞれヒトインスリンのＡまたはＢ鎖をコードするＤＮＡ配列を含有するプラスミドで形質転換された大腸菌を用いて、別個の発酵において、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）融合タンパク質として生成される。生成物は細胞内であり、顕著な細胞質封入体中に出現する（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９８２， ２１５（５）：６８７−６８９）。大腸菌中で産生される組換えタンパク質は、通常は、総タンパク質の１０〜４０％に相当する（Ｂｕｒｇｅｓｓ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ； Ｏｘｅｎｄｅｒ， Ｄ．Ｌ．， Ｆｏｘ， Ｃ．Ｆ．， Ｅｄｓ．； Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．； Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８７； ｐｐ．７１−８２）。
【０００９】
封入体から取り出されると、β−ガラクトシダーゼとＡまたはＢ鎖との間のＭｅｔ残基でのＣＮＢｒによる化学的切断、その後の精製により、別個のＡおよびＢタンパク質が得られる。次にペプチドは併合され、活性ホルモンを得るために、限定量のメルカプタンの存在下で２：１のＡ−Ｂ鎖比（Ｓ−スルホン化形態）で折り畳まるよう誘導される（Ｃｈａｎｃｅ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｆｕｎｃｔｉｏｎ， Ｒｉｃｈ Ｄ．Ｍ． Ｇｒｏｓｓ， Ｅ．， Ｅｄｓ．， Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＩ １９８１， ＰＰ． ７２１−７２８； Ｆｒａｎｋ ａｎｄ Ｃｈａｎｃｅ， Ｉｎ Ｑｕｏ Ｖａｄｉｓ？ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｊｏｙｅｓｕｋ ｅｔ ａｌ．， Ｅｄｓ．， Ｓａｎｏｆｆ Ｇｒｏｕｐ， Ｔｏｕｌｏｕｓｅ−Ｌａｂｅｇｅ， Ｆｒａｎｃｅ， １９８５， ｐｐ．１３７−１４８）。２４時間後、収率は、用いられたＢ鎖の量を基礎にして、約６０％である（Ｃｈａｎｃｅ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎ Ｉｎｓｕｌｉｎｓ， Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ ａｎｄ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８１， ｐｐ．７１−８５； Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｆｌｕｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｅｑｕｉｌｉｂ．， １９８６， ２９：１０９−１２３）。Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， １９７９， ７６（１）：１０６−１１０は、ＡまたはＢ鎖融合タンパク質として発現された総細胞タンパク質の２０％で、同様の結果を得た。その後のＳ−スルホン化鎖のフォールディングは、５０〜８０％の正確なフォールディングを生じる。
【００１０】
β−ｇａｌ（約１０００アミノ酸）とインスリンＡまたはＢ鎖（それぞれ２１または３０アミノ酸）との融合タンパク質は細胞のリボソームから分離するようになり（翻訳中の未成熟鎖末端）、したがって不完全インスリンペプチドを産生するために、大型のβ−ｇａｌ融合タンパク質は、収率を制限する（Ｂｕｒｎｅｔｔ， Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， Ｉｎｏｕｙｅ， Ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８３， ｐｐ．２５９−２７７； Ｈａｌｌ， Ｉｎｖｉｓｉｂｌｅ Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ−− Ｔｈｅ Ｒａｃｅ ｔｏ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅ ａ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ， Ａｔｌａｎｔｉｃ Ｍｏｎｔｈｌｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８７）。このアプローチの主な改良点は、より小さい融合タンパク質を生成するためにｌａｃオペロン（β−ｇａｌ系）の代わりにトリプトファン（Ｔｒｐ）オペロンを用いることである。Ｔｒｐオペロンは、トリプトファンの同化に関与する酵素を順次合成する一連の５つの細菌遺伝子から成る。これらの酵素ＴｒｐＥのうちの１つは、β−ｇａｌの１０００アミノ酸と比較して、１９０アミノ酸しか有さない。Ｔｒｐプロモーターは大腸菌中では強力なプロモーターであるため、インスリンのＡまたはＢ鎖に関する遺伝子を従えるＴｒｐＥは、総タンパク質の５〜１０％から２０〜３０％に融合タンパク質生成を増強するという付加利点を有する（Ｈａｌｌ， Ｉｎｖｉｓｉｂｌｅ Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ−− Ｔｈｅ Ｒａｃｅ ｔｏ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅ ａ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ， Ａｔｌａｎｔｉｃ Ｍｏｎｔｈｌｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８７）。これは、ｌａｃ（即ちβ−ｇａｌ）系と比較した場合、少なくとも１０倍以上のポリペプチド発現をもたらす（Ｂｕｒｎｅｔｔ， Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， Ｉｎｏｕｙｅ， Ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８３， ｐｐ．２５９−２７７）。大腸菌がトリプトファンを使い尽した時、Ｔｒｐオペロンは作動される（Ｈａｌｌ， Ｉｎｖｉｓｉｂｌｅ Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ−− Ｔｈｅ Ｒａｃｅ ｔｏ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅ ａ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ， Ａｔｌａｎｔｉｃ Ｍｏｎｔｈｌｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８７： Ｅｔｉｅｎｎｅ−Ｄｅｃｅｎｔ， Ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ： Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ， Ｅｌｌｉｓ Ｈｏｒｗｏｏｄ Ｌｉｍｉｔｅｄ， Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ， Ｕ．Ｋ．， １９８８， ｐｐ．１２５−１２７）。細胞質量が先ず最大化され得るため、この特徴は、発酵中は有益である。次に、適切な場合には、細胞のインスリン産生系は、発酵媒質がＴｒｐを欠失するようにさせることにより、作動され得る。
【００１１】
発酵完了後、細胞は回収され、破裂される。次に細胞屑が封入体から分離され、封入体は溶媒中に溶解されるが、しかし詳細は不明である（Ｗｈｅｅｌｗｒｉｇｈｔ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ； Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９１， ｐ．２１７）。封入体は、時としては、６ ＭグアニジンＨＣｌおよび０．１ ｍＭジチオトレイトール中に溶解される（ Ｂｕｒｇｅｓｓ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ； Ｏｘｅｎｄｅｒ， Ｄ．Ｌ．， Ｆｏｘ， Ｃ．Ｆ．， Ｅｄｓ．； Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．； Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８７； ｐｐ．７１−８２）。次に、Ｔｒｐ−ＬＥ−Ｍｅｔ−Ａ鎖およびＴｒｐ−ＬＥ−Ｍｅｔ−Ｂ鎖はＣＮＢｒ切断を施されて、ＡおよびＢインスリン鎖を放出する。ＡおよびＢ鎖のさらなる修飾には、粗製インスリンを産生するための酸化的亜硫酸分解、精製および組合せが含まれる。この粗製インスリンは、イオン交換、サイズ排除および逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ ＨＰＬＣ）処理を施されて、精製組換えヒトインスリンを生じる（Ｆｒａｎｋ ａｎｄ Ｃｈａｎｃｅ， Ｍｕｎｃｈ Ｍｅｄ． Ｗｓｈｒ， １９８３， １２５ （ Ｓｕｐｐｌ．１ ）：５１４−５２０）。
【００１２】
１．２．４．２．プロインスリン法（細胞内）
ヒトインスリンは、個々にＡまたはＢ鎖の代わりに無傷プロインスリンを産生する組換え微生物を用いても製造し得る（Ｋｒｏｅｆｆ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． １９８９， ４８１：４５−６１）。最初に、ｍＲＮＡがｃＤＮＡにコピーされ、メチオニンコドンが化学的に合成され、プロインスリンｃＤＮＡの５’末端に付着される。ｃＤＮＡは、導入されるプラスミドベクター中の細菌遺伝子中に挿入され、次に、大腸菌中で増殖される。プロインスリンは、メチオニンリンカーを破壊することにより細菌酵素（β−ｇａｌ）断片から（あるいはＴｒｐ−ＬＥ／Ｍｅｔプロインスリン（Ｔｒｐプロインスリン）から）放出させ得る。プロインスリンは、フォールディング処理を施されて、正確な分子内ジスルフィド架橋を形成し、そして次にＣペプチドが酵素により切断されて、ヒトインスリンを産生する（ Ｆｒａｎｋ ａｎｄ Ｃｈａｎｃｅ， Ｍｕｎｃｈ Ｍｅｄ． Ｗｓｈｒ， １９８３， １２５ （ Ｓｕｐｐｌ．１ ）：５１４−５２０）。比較すると、前記の二鎖法はより複雑である。
【００１３】
Ｄｏｒｓｈｕｇ等は、ミニプロインスリン（Ｂ−Ａｒｇ−Ａ）を含有する融合タンパク質をコードする組換えプラスミドを構築し、大腸菌（封入体）および酵母菌（分泌型）中で融合タンパク質を発現し、ＢｒＣＮ切断および酸化的亜硫酸分解により正確に折り畳まれたミニプロインスリンを調製し、そしてトリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢを用いた処理により正確に折り畳まれたミニプロインスリンをヒトインスリンに転化した（ＥＰ ０，３４７，７８１ Ｂ１； ＩＬ ９，５６２，５１１ ＢおよびＡＵ ６１１，３０３ Ｂ２）。
【００１４】
Ｔｏｔｔｒｕｐ およびＣａｒｌｓｅｎ「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ．」１９９０， ３５：３３９−３４８は、最適化バッチ−供給発酵において酵母菌系を用い、スーパーオキシドジムスターゼ−ヒトプロインスリン（ＳＯＤ−ＰＩ）は１５００ ｍｇ／ｌであると報告した。ＳＯＤ−ＰＩは、組換えヒトインスリンの精製のための出発物質である。最終生成物の収率は報告されていない。
【００１５】
近年、Ｃａｓｔｅｌｌａｎｏｓ−Ｓｅｒｒａ 等「ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ」１９９６， ３７８：１７１−１７６は、リシン残基によりプロインスリンのＮ末端に連結された修飾化インターロイキン−２ Ｎ末端ペプチド（１〜２２アミノ酸残基）を保有するプロインスリン融合タンパク質を大腸菌中で発現した。キメラプロインスリンが封入体から単離され、酸化的亜硫酸分解により再フォールディングされ、次に、トリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢとの長時間反応により正しく折り畳まれた融合タンパク質に転化された。ＩＬ−２−プロインスリン融合物は、ＩＬ−２断片を先ず除去することなしに、正しく折り畳まれ、したがって、臭化シアンおよび関連精製工程を排除することができる。しかしながら、酸化的亜硫酸分解および関連精製工程は、ＩＬ２−プロインスリン融合タンパク質の使用により回避され得ない。
【００１６】
１．２．４．３．プロインスリン法（分泌型）
Ｖｉｌｌａ−Ｋｏｍａｒｏｆｆ 等「Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．」１９７８， ７５（８）：３７２７−３７３１は、大腸菌におけるヒトプロインスリンに関する分泌系を最初に記載したものであった。Ｔｈｉｍ等 は、修飾化酵母菌交配因子α１リーダー配列およびインスリン前駆体を含有する融合タンパク質をコードする組換えプラスミドを構築した（Ｔｈｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １９８６， ８３：６７６６−６７７０）。リーダー配列は、酵母細胞の分泌経路に融合タンパク質を向け、そしてＬｙｓ−Ａｒｇプロセシング酵素系に融合タンパク質を曝露するのに役立つ。部分的プロセシングも、プロインスリンおよびＣペプチドの変わりに短スペーサーペプチド（６以上のアミノ酸残基を含有）を含有するその他のインスリン前駆体内のＢおよびＡ鎖間の二塩基配列の一方または両方で起こる。これに対比して、インスリン前駆体分子、例えばＢ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａ（ここで、ＡおよびＢは、それぞれヒトプロインスリンのＡおよびＢ鎖である）中のスペーサーペプチドの不存在下では、プロセシングは観察されなかった。この型の一本鎖インスリン前駆体は、トリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢを用いた処理により、酵素的にインスリンに転化し得る。Ｄｉｅｒｓ 等「Ｄｒｕｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｂａｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）」Ｃｈｉｕ およびＧｕｅｒｉｇｕｉａｎ編， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９１， ｐｐ．１６７−１７７は、リーダーまたはプロセグメント、次にＬｙｓ−Ａｒｇ配列、Ｂ鎖（アミノ酸１−２９）、短ペプチド架橋、その後のＡ鎖（アミノ酸１−２１）として非折り畳み化ペプチドを記載する。この前駆体においては、インスリンのＢ鎖のアミノ酸２９は、Ａ鎖に隣接する１つの塩基性アミノ酸を含有する短接続ペプチドによりＡ鎖のアミノ酸１と接続される。ヒトインスリンは、ペプチド転移とその後の形成されたエステル結合の加水分解により生成される。さらなる精製のためにいくつかのクロマトグラフィー段階が続く。
【００１７】
１．２．５．インスリン前駆体のフォールディング
ヒトインスリンは、全部で５１個のアミノ酸残基の２つのアミノ酸鎖を保有するタンパク質である。２つのアミノ酸鎖には６個のシステイン残基が存在し、各場合、２個のシステイン残基はジスルフィド結合を介して各々に連結される。統計的に、１個のヒトインスリン分子内でジスルフィド架橋を形成するには１５通りの可能性がある。しかしながら、以下のジスルフィド架橋：１）Ａ６−Ａ１１；２）Ａ７−Ｂ７および３）Ａ２０−Ｂ１９を有する生物学的に活性なヒトインスリンにおいては、１５の可能性のうちの１つだけが存在する。
【００１８】
ヒトインスリン中に存在するジスルフィド架橋の形成は、中間体により影響を及ぼされ、ヒトインスリンのシステイン残基は硫黄保護基を、例えばＳ−スルホネート（−Ｓ−ＳＯ３）基を装備される（欧州特許第０．０３７，２５５号）。さらに、システイン残基がチオ残基（−ＳＨ）として存在するブタプロインスリンは、正しく連結されたシステイン架橋を保有するプロインスリンを生成するために用いられてきた（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９６８， ６０：６２２−６２９）。Ｏｂｅｒｍｅｉｅｒ等は、メルカプタン、カオトロピック補助剤および疎水性吸収性樹脂の存在下での、０．０５〜０．３ ｇ／ｌの濃度での対応するプロインスリンアミノ酸鎖からの正しく連結されたシステイン架橋を保有するプロインスリンの製造方法を記載した（米国特許第５，４７３，０４９号）。酸化的亜硫酸分解の工程は、米国特許第５，４７３，０４９号に記載された方法では排除される。しかしながら、インスリンタンパク質は、低濃度で折り畳まれ得るだけであり、このことがこの方法の商業的価値を大いに縮小する。さらに、大量のメルカプタンおよび疎水性吸収性樹脂の使用は、処理複雑性および下流精製コストを増大する。米国特許第５，４７３，０４９号の開示からは、酸化的亜硫酸分解工程の工程を排除することの利点が下流精製コスト増大よりまさるか否かは不明である。
【００１９】
本明細書中の前記の参考文献の引用は、このような参考文献が本発明に対する従来技術であることの承認と解釈されるものではない。
２．発明の要約
本発明は、Ｎ末端からＣ末端に、ａ）ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）タンパク質の少なくとも最初の２０個のＮ−末端アミノ酸を含有するドメインと少なくとも４０％の同一性を有するアミノ酸配列から成る第一ペプチジル断片であって、この場合、同一性パーセンテージがｈＧＨのドメインと同一サイズのアミノ酸配列全体で確定される断片；ｂ）Ａｒｇ残基またはＬｙｓ残基、あるいはほとんどのＣ末端アミノ酸残基がＡｒｇまたはＬｙｓであるペプチジル断片中の少なくとも２個のアミノ酸から成る第二ペプチジル断片；ならびにｃ）ペプチジル断片がｈＧＨタンパク質の一部でない２個より多いシステイン（Ｃｙｓ）残基を含有するアミノ酸配列から成る第三ペプチジル断片を包含するキメラタンパク質に関する。特に、本発明は、第三ペプチジル断片がインスリン前駆体であるキメラタンパク質に関する。
【００２０】
本発明は、第一の正確に畳まれたインスリン前駆体含有キメラタンパク質の生成方法であって、１以上の切断可能アミノ酸残基によりインスリン前駆体から分離された分子内シャペロン（ＩＭＣ）様ペプチジル断片から成る不正確に折り畳まれた第二インスリン前駆体含有キメラタンパク質を、水性媒質中の少なくとも１つのカオトロピック補助剤と接触することを包含する方法であって、前記のＩＭＣ様ペプチジル断片が：ａ）約２０〜約２００アミノ酸残基を含有し；ｂ）インスリン前駆体またはその一部ではなく、そしてｃ）不正確に畳まれた第二インスリン前駆体含有キメラタンパク質がカオトロピック補助剤と接触される場合の正確に畳まれた第一インスリン前駆体含有キメラタンパク質の収率が、前記のＩＭＣ様ペプチジル断片を含有しない不正確に畳まれたインスリン前駆体が同一カオトロピック補助剤と接触される場合の正確に畳まれたインスリン前駆体の収率より高いように、インスリン前駆体フォールディングを改良する方法にも関する。
【００２１】
本発明はさらに、インスリン前駆体のフォールディングを改良する能力に関してアミノ酸配列をスクリーニングするための検定であって、（ａ）インスリン前駆体を含有する、４．２項に開示されたキメラタンパク質の第一ペプチジル断片のアミノ酸配列を変えて、前記の変化を有する前記のキメラタンパク質を生成し、前記のキメラタンパク質が正確に折り畳まるような条件下で、そしてそれに十分な時間、前記の変化を有する前記のキメラタンパク質を水性媒質中の少なくとも１つのカオトロピック補助剤と接触させ、そして前記の変化を有する前記のキメラタンパク質のフォールディング収率を測定し；（ｂ）工程（ａ）に用いられるがしかし工程（ａ）に記載されたいかなるアミノ酸配列変化も伴わないキメラタンパク質を生成し、工程（ａ）に記載されたいかなるアミノ酸配列変化も伴わないキメラタンパク質を、工程（ａ）で用いられた同一カオトロピック補助剤と水性媒質中で同一条件下で、そして工程（ａ）で用いられたのと同一時間接触させて、そしてキメラタンパク質のフォールディング収率を測定し；そして（ｃ）それぞれ工程（ａ）および（ｂ）で測定されたキメラタンパク質のフォールディング収率を比較することを包含する検定に関するが、この場合、工程（ａ）で測定される収率は実質的に工程（ｂ）で測定される収率と等しいかまたはそれより大きく、このことはアミノ酸配列がインスリン前駆体のフォールディングを改良することを示す。
【００２２】
４．発明の詳細な説明
組換え法は、微生物におけるヒトプロインスリン、あるいは天然ヒトインスリンのものとは異なるアミノ酸配列および／またはアミノ酸鎖長を有するプロインスリンを生成するのを可能にする。大腸菌のような微生物中でのヒトプロインスリンまたはその誘導体の産生における際だった一問題は、細胞内分解である（Ｌａｄｉｓｃｈ ａｎｄ Ｋｏｈｌｍａｎ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇ．， １９９２， ２：４６９４７８）。さらに、微生物中で組換え的に産生されたヒトプロインスリンまたはその誘導体は、正確に連結されたシステイン架橋を保有しない（米国特許第５，４７３，０４９号）。
【００２３】
本発明に先立って、ヒトインスリンを組換え的に生成するための既知の方法は、以下の手法を基礎にしている：１）ヒトプロインスリンまたはその誘導体を含有する融合タンパク質を発現するベクターで形質転換された微生物の発酵；２）細胞破壊；３）融合タンパク質の単離；４）臭化シアンによる融合タンパク質の切断；５）プロインスリン配列を有する切断物質の単離；６）酸化的亜硫酸分解；７）正確に連結されたシステイン架橋の形成；８）プロインスリンの脱塩；９）正確に連結されたシステイン架橋を保有するプロインスリンのクロマトグラフィー的精製；９）プロインスリン溶液の濃縮；１０）濃縮プロインスリン溶液のクロマトグラフィー的精製；１１）ヒトインスリンを生成するためのプロインスリンの酵素的切断；および１２）その結果生じたヒトインスリンのクロマトグラフィー的精製（ＥＰ０，０５５，９４５）。この方法の欠点は多数の操作工程と、インスリンの低収率をもたらす、精製工程におけるプロインスリンの損失である。臭化シアン切断、亜硫酸分解及びプロインスリンの精製を経る単離融合タンパク質の工程からは、４０％までのプロインスリンの損失が予期される（ＥＰ０，０５５，９４５）。一方、インスリンまたはその誘導体の組換え的産生の収率は、必要な操作工程数が有意に低減される場合には、有意に増大され得る。
【００２４】
本発明の一目的は、より少ない必要操作工程を用いて、それで、より高い収率のヒトインスリンを生じるための組換え法を開発することであった。本発明の別の目的は、前記の方法に用い得るインスリン前駆体含有キメラタンパク質を開発することであった。本発明のさらに別の目的は、ペプチジル結合を介してインスリン前駆体が連結される場合に、インスリン前駆体のフォールディングを改良するアミノ酸配列をスクリーニングするための検定を開発することであった。
【００２５】
本出願人は、微生物宿主による細胞内分解からインスリン配列を保護するだけでなく、既存のヒトインスリン発現系と比較して、ペプチジル結合を介してインスリン前駆体に連結される場合に、以下の：１）融合インスリン前駆体のフォールディングを促し；２）融合タンパク質の溶解性を助長し、融合タンパク質中の分子間相互作用を低減し、したがって商業的有意の高濃度での融合インスリン前駆体のフォールディングを可能にし；３）臭化シアン切断、酸化的亜硫酸分解および関連精製工程の操作工程を排除し、そして；４）高濃度のメルカプタンの使用または疎水性吸収性樹脂の使用を排除する利点も有するペプチド配列を探索してきた。
【００２６】
出願人は、１以上の切断可能アミノ酸残基を介したインスリン前駆体とのＩＭＣ様配列の連結は、本発明の目的を達成する、ということを意外にも見出した。ＩＭＣ様配列は、標的タンパク質フォールディングを助け、標的タンパク質より高いパーセンテージの荷電アミノ酸残基を含有し、荷電アミノ酸残基の分極化分布を有し、そして標的タンパク質のための「あつらえ」であると思われる配列を有するといったような、ＩＭＣ配列の一定の特徴を有する。しかしながら、本発明に用いられるＩＭＣ様配列は、いくつかの重要な局面において、ＩＭＣ配列とは異なる。第一に、ＩＭＣ様配列は、標的タンパク質とは異質であり、即ち標的タンパク質のプロペプチドでない。例えば、インスリン前駆体が折り畳まれる標的タンパク質である場合、ＩＭＣ様配列はインスリン前駆体またはその一部ではない。さらに、ＩＭＣ様配列のサイズは、約２０〜２００アミノ酸残基である。
【００２７】
さらに、先行技術における教示（Ｃａｓｔｅｌｌａｎｏｓ−Ｓｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ， １９９６， ３７８：１７１−１７６）とは逆に、出願人は、ＩＭＣ様配列内では、ＩＭＣ様配列とインスリン前駆体を分離する１以上の切断可能アミノ酸残基と同一である１以上の切断可能アミノ酸残基が、フォールディング後のＩＭＣ様配列の断片化除去を可能にし、それゆえ下流精製工程を簡素化する、ということを意外にも見出した。
【００２８】
限定のためではないが、開示を分かり易くするために、本発明の詳細な説明は以下の亜項に分けられる。
４．１．第４．２．項に開示されるキメラタンパク質をコードする核酸
本発明は、４．２．項に開示されるキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を包含する単離核酸を提供する。
【００２９】
特定の態様では、本発明は、配列番号６のアミノ酸配列を有するキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を包含する単離核酸を提供する。
別の特定の態様では、本発明は、配列番号７のアミノ酸配列を有するキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を包含する単離核酸を提供する。
好ましい態様では、本発明は、４．２．項に開示されるキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を包含する単離ＤＮＡ分子を提供する。
【００３０】
別の好ましい態様では、本発明は、４．２．項に開示されるキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を包含する単離核酸を提供する。
さらに別の特定の態様では、本発明は、４．２．項に開示されるキメラタンパク質をコードするＤＮＡの第一、第二および第三ペプチジル断片をコードするヌクレオチド配列とハイブリダイズ可能な単離核酸を提供する。
【００３１】
４．２．項に開示されるキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、あるいはそのあらゆる断片、類似体または誘導体を包含する核酸は、当業界で既知のあらゆる方法（単数または複数）により生成させることができる。核酸は、完全に、化学的に合成することができる。あるいは、キメラタンパク質の各断片、即ち第一、第二または第三ペプチジル断片をコードする核酸は、分子クローニングにより生成させるか、あるいは所望の細胞から精製し得る。キメラタンパク質の各断片をコードする核酸は、次に、化学的または酵素的に一緒に結合されて、４．２．項に開示されるキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、あるいはその断片、類似体または誘導体を包含する核酸を生成する。
【００３２】
あらゆるヒト細胞は、潜在的に、ｈＧＨ核酸の単離のための核酸源として役立ち得る。あらゆる哺乳類細胞は、潜在的に、インスリン核酸の単離のための核酸源として役立ち得る。インスリンをコードする核酸配列は、哺乳類、ヒト、ブタ、ウシ、ネコ、トリ、ウマ、イヌ、ならびに付加的齧歯類または霊長類供給源などから単離し得る。
【００３３】
ＤＮＡは、所望の細胞から精製されるゲノムＤＮＡまたはその断片の化学的合成により、ｃＤＮＡクローニングにより、またはクローニングにより、クローン化ＤＮＡ（例えばＤＮＡ「ライブラリー」）から、当業界で既知の標準手法により生成され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｄ Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； Ｇｌｏｖｅｒ， Ｄ．Ｍ．（ｅｄ．），１９８５， ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＭＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｔｄ．， Ｏｘｆｏｒｄ， Ｕ．Ｋ． Ｖｏｌ． Ｉ，ＩＩ参照）。ゲノムＤＮＡ由来のクローンは、コード領域の他に、調節およびイントロンＤＮＡ領域を含有し得る；ｃＤＮＡ由来のクローンは、エキソン配列のみを含有する。供給源が何であれ、遺伝子は、遺伝子の増殖のために適切なベクター中に分子的にクローン化される必要がある。
【００３４】
ｃＤＮＡからの遺伝子の分子クローニングでは、ｃＤＮＡは、当業界で周知の方法により、全体的に細胞ＲＮＡまたはｍＲＮＡから生成される。遺伝子はゲノムＤＮＡからも生成し得るが、この場合、ＤＮＡ断片が生成され（例えば制限酵素を用いて、または機械的剪断により）、このうちのいくつかが所望の遺伝子をコードする。線状ＤＮＡ断片は、次に、標準技法により、例えばアガロースおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動およびカラムクロマトグラフィーにより（これらに限定されない）、サイズによって分離し得る。
【００３５】
４．２．項に開示されるキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列またはそのあらゆる断片、類似体または誘導体を包含する核酸が生成されたら、その同一性が、核酸シーケンシング（と業界で周知のあらゆる方法により）および既知の配列との比較によって確証し得る。ＤＮＡ配列分析は、当業界で既知のあらゆる技法により、例えばＭａｘａｍとＧｉｌｂｅｒｔの方法（Ｍａｘａｍ ａｎｄ Ｇｉｌｂｅｒｔ， １９８０， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．， ６５：４９９−５６０）、Ｓａｎｇｅｒジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９７７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ７４：５４６３）、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼの使用（Ｔａｂｏｒ ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，米国特許第４，７９５，６９９号）、自動ＤＮＡシーケンサーの使用（例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）またはＰＣＴ公開ＷＯ９７／１５６９０に記載された方法により実施し得るが、これらに限定されない。
【００３６】
４．２．項に開示されるキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、あるいはそのあらゆる断片、類似体または誘導体を包含する核酸とハイブリダイズ可能な核酸は、低、高または中等度緊縮条件下で、核酸ハイブリダイゼーションにより単離し得る（Ｓｈｉｌｏ ａｎｄ Ｗｅｉｎｂｅｒｇ， １９８１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７８：６７８９−６７９２も参照）。
【００３７】
４．２．キメラタンパク質
本発明は、Ｎ末端からＣ末端に：ａ）ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）タンパク質の少なくとも最初の２０個のＮ−末端アミノ酸を含有するドメインと少なくとも４０％の同一性を有するアミノ酸配列から成る第一ペプチジル断片であって、この場合、同一性パーセンテージがｈＧＨのドメインと同一サイズのアミノ酸配列全体で確定される断片；ｂ）Ａｒｇ残基またはＬｙｓ残基、あるいはほとんどのＣ末端アミノ酸残基がＡｒｇまたはＬｙｓであるペプチジル断片中の少なくとも２個のアミノ酸から成る第二ペプチジル断片；ならびにｃ）ペプチジル断片がｈＧＨタンパク質の一部でない２個より多いシステイン（Ｃｙｓ）残基を含有するアミノ酸配列から成る第三ペプチジル断片を包含するキメラタンパク質を提供する。
【００３８】
好ましい態様では、本発明は、第一ペプチジル断片がｈＧＨタンパク質のドメインと少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列から成る前記のキメラタンパク質を提供する。
別の好ましい態様では、本発明は、第一ペプチジル断片が抗ｈＧＨ抗体により結合し得る前記のキメラタンパク質を提供する。
【００３９】
さらに好ましい態様では、本発明は、第一ペプチジル断片が配列番号１のアミノ酸配列から成る前記のキメラタンパク質を提供する。
別のさらに好ましい態様では、本発明は、第一ペプチジル断片が配列番号２のアミノ酸配列から成る前記のキメラタンパク質を提供する。
好ましい態様では、本発明は、第二ペプチジル断片が配列番号３のアミノ酸配列から成る前記のキメラタンパク質を提供する。
【００４０】
特定の態様では、本発明は、第三ペプチジル断片がインスリン前駆体である前記のキメラタンパク質を提供する。
好ましい態様では、本発明は、インスリン前駆体がヒト起源である前記のキメラタンパク質を提供する。
さらに好ましい態様では、本発明は、ヒトインスリン前駆体が抗ヒトインスリン抗体に結合し得る前記のキメラタンパク質を提供する。
【００４１】
さらに別のより好ましい態様では、本発明は、ヒトインスリン前駆体が配列番号４のアミノ酸配列から成る前記のキメラタンパク質を提供する。
さらに別のより好ましい態様では、本発明は、ヒトインスリン前駆体中で、ヒトインスリン前駆体のＢ鎖およびＡ鎖が、１つのアミノ酸残基により、あるいは２〜３４個のアミノ酸残基から成るペプチジル断片により分離される前記のキメラタンパク質を提供する。
【００４２】
さらに別のより好ましい態様では、本発明は、ヒトインスリン前駆体が配列番号５のアミノ酸配列から成る前記のキメラタンパク質を提供する。
最も好ましい態様では、本発明は、配列番号６のアミノ酸配列から成るキメラタンパク質を提供する。
別の最も好ましい態様では、本発明は、配列番号７のアミノ酸配列から成るキメラタンパク質を提供する。
【００４３】
４．３．第４．２．項に開示されたキメラの生成
４．２．項で開示されたキメラタンパク質、ならびにその誘導体、類似体および断片は、当業界で既知の方法により、例えば組換え発現法、天然供給源からの精製および化学的合成により生成させ得るが、これらに限定されない。
例えば、４．２．項に開示されたキメラタンパク質は、組換えタンパク質発現技法により生成させ得る。組換え発現に関しては、４．２．項に開示されたキメラタンパク質をコードする遺伝子またはその一部は、特定の宿主細胞中での発現のために、適切なクローニングベクターに挿入される。当業界で既知の多数のベクター−宿主系を用いる。考え得るベクターとしては、プラスミドまたは修飾化ウイルスが挙げられる（これらに限定されない）が、しかしベクター系は、用いられる宿主細胞に適合性でなければならない。このようなベクターとしては、バクテリオファージ、例えばラムダ誘導体、あるいはプラスミド、例えばｐＢＲ３２２またはｐＵＣプラスミド誘導体、あるいはＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）が挙げられるが、これらに限定されない。クローニングベクターへの挿入は、例えば、相補的付着末端を有するクローニングベクターへのＤＮＡ断片の結合により成し遂げ得る。しかしながら、ＤＮＡを断片化するために用いられる相補的制限部位クローニングベクター中に存在しない場合、ＤＮＡ分子の末端を酵素的に修飾し得る。あるいは、望ましいあらゆる部位が、ＤＮＡ末端にヌクレオチド配列（リンカー）を結合させることにより生成し得る；これらの結合化リンカーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする特定の化学的合成オリゴヌクレオチドを包含し得る。遺伝子の多数のコピーが生成されるように、組換え分子は、形質転換、トランスフェクション、感染、電気穿孔等により宿主細胞中に導入される。
【００４４】
代替的方法では、所望の遺伝子は、「ショットガン」アプローチにおいて、適切なクローニングベクター中への挿入後に、同定し、単離し得る。例えばサイズ分別による所望の遺伝子の濃厚化は、クローニングベクター中への挿入前に実行し得る。
特定の態様では、４．２．項に開示されたキメラタンパク質をコードする単離遺伝子、ｃＤＮＡまたは合成ＤＮＡ配列を組み入れる組換えＤＮＡ分子による宿主細胞の形質転換は、遺伝子の多数のコピーの生成を可能にする。したがって、遺伝子は、形質転換体を増殖させ、形質転換体から組換えＤＮＡ分子を単離し、そして、必要な場合には、単離組換えＤＮＡから挿入遺伝子を回収することにより、多量に生成し得る。
【００４５】
４．２．項に開示されたキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、ならびにその誘導体、類似体および断片は、適切な発現ベクター、即ち挿入タンパク質コード配列の転写および翻訳に必要な素子を含有するベクターに挿入し得る。種々の宿主−ベクター系を、タンパク質コード配列を発現するために利用し得る。これらの例としては、ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルス等）に感染した哺乳類細胞系；ウイルス（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；微生物、例えば酵母菌ベクターを含有する酵母菌、あるいはバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡで形質転換された細菌が挙げられるが、これらに限定されない。ベクターの発現要素は、それらの強度および特異性が変化する。用いられる宿主−ベクター系によって、多数の適切な転写および翻訳要素のいずれかを用い得る。
【００４６】
ベクター中へのＤＮＡ断片の挿入のための前記の方法のいずれかを用いて、適切な転写／翻訳制御信号およびタンパク質コード配列から成るキメラ遺伝子を含有する発現ベクターを構築し得る。これらの方法としては、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡおよび合成技法、ならびにｉｎ ｖｉｖｏ組換え（遺伝子組換え）法が挙げられる。
４．２．項に開示されたキメラタンパク質をコードする核酸配列ならびにその誘導体、類似体および断片の発現は、４．２．項に開示されたキメラタンパク質が、組換えＤＮＡ分子で形質転換された宿主中で発現されるように、二次核酸配列により調節し得る。例えば、４．２．項に開示されたキメラタンパク質の発現は、当業界で既知のあらゆるプロモーター／エンハンサーにより制御し得る。
【００４７】
４．２．項に開示されたキメラタンパク質の発現を制御するために用い得るプロモーターとしては、ＳＶ４０初期プロモーター領域（Ｂｅｒｎｏｉｓｔ ａｎｄ Ｃｈａｍｂｏｎ， １９８１， Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４−３１０）、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復に含入されるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ， ｅｔ ａｌ．， １９８０， Ｃｅｌｌ ２２：７８７−７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ７８：１４４１−１４４５）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８２， Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２）；原核生物発現ベクター、例えばβ−ラクタマーゼプロモーター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ， ｅｔ ａｌ．， １９７８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ７５：３７２７−３７３１）、ｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ， ｅｔ ａｌ．， １９８３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ８０：２１−２５）；あるいはＴｒｐ Ｅプロモーター（Ｈａｌｌ， Ｉｎｖｉｓｉｂｌｅ Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ−− Ｔｈｅ Ｒａｃｅ ｔｏ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅ ａ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ， Ａｔｌａｎｔｉｃ Ｍｏｎｔｈｌｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８７）（”Ｕｓｅｆｕｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａ” ｉｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ， １９８０， ２４２：７４−９４も参照）；酵母菌またはその他の真菌からのプロモーター要素、例えばＧａｌ ４プロモーター、ＡＤＣ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリ性ホスファターゼプロモーター、ならびに組織特異性を示し、トランスジェニック動物で用いられてきた以下の動物転写制御領域：膵臓腺房細胞中で活性であるエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔ ｅｔ ａｌ．， １９８４， Ｃｅｌｌ ３８：６３９−６４６； Ｏｒｎｉｔｚ ｅｔ ａｌ．， １９８６， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ． Ｑｕａｎｔ． Ｂｉｏｌ． ５０：３９９−４０９； ＭａｃＤｏｎａｌｄ， １９８７， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ７：４２５−５１５）；膵臓β細胞中で活性であるインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１５：１１５−１２２）、リンパ様細胞中で活性であるイムノグロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ ｅｔ ａｌ．， １９８４， Ｃｅｌｌ ３８：６４７−６５８； Ａｄａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１８：５３３−５３８； Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ７：１４３６−１４４４）、精巣、乳腺、リンパ様およびマスト細胞中で活性であるマウス乳癌ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８６， Ｃｅｌｌ ４５：４８５−４９５）、肝臓中で活性であるアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ． １：２６８−２７６）；肝臓中で活性であるα−フェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆ ｅｔ ａｌ．， １９８５， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ５：１６３９−１６４８； Ｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：５３−５８）、肝臓中で活性であるα１−抗トリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ． １：１６１−１７１）、骨髄細胞中で活性であるβ−グロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１５：３３８−３４０； Ｋｏｌｌｉａｓ ｅｔ ａｌ．， １９８６， Ｃｅｌｌ ４６：８９−９４）、脳の稀突起膠細胞中で活性であるミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．，１９８７， Ｃｅｌｌ ４８：７０３−７１２）、骨格筋中で活性であるミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２８３−２８６）および視床下部で活性である性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８６， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：１３７２−１３７８）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
例えば、４．２．項に開示されたキメラタンパク質をコードする核酸に操作可能的に連結されるプロモーター、複製の１以上のオリジン、ならびに任意に、１以上の選択可能マーカー（例えば抗生物質耐性遺伝子）を包含するベクターを用い得る。
４．２．項に開示されたキメラタンパク質をコードする遺伝子挿入物、あるいはその断片、類似体または誘導体を含有する発現ベクターは、３つの一般的アプローチ：（ａ）核酸ハイブリダイゼーション、（ｂ）「マーカー」遺伝子機能の存在または不存在、ならびに（ｃ）挿入配列の発現により同定し得る。第一のアプローチでは、発現ベクターに挿入された４．２．項に開示されたキメラタンパク質をコードする遺伝子の存在が、４．２．項に開示されたキメラタンパク質をコードする挿入遺伝子と相同である配列を包含するプローブを用いて、核酸ハイブリダイゼーションにより検出し得る。第二のアプローチでは、ベクター中の４．２．項に開示されたキメラタンパク質をコードする遺伝子の挿入により引き起こされるある種の「マーカー」遺伝子機能（例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質に対する耐性、トランスフェクション表現型、曝露ウイルス中の封入体形成等）の存在または不存在を基礎にして、組換えベクター／宿主系を同定し、選択し得る。例えば、４．２．項に開示されたキメラタンパク質をコードする遺伝子がベクターのマーカー遺伝子内に挿入されると、４．２．項に開示されたキメラタンパク質をコードする挿入物を含有する組換え体を、マーカー遺伝子機能の不存在により同定し得る。第三のアプローチでは、組換え体により発現されるキメラタンパク質生成物を検定することにより、組換え発現ベクターを同定し得る。このような検定は、例えば、、ｉｎ ｖｉｔｒｏ検定における４．２．項に開示されたキメラタンパク質の物理的または機能的特性、例えば抗ｈＧＨまたは抗インスリン抗体との結合を基礎にしている。
【００４９】
特定の組換えＤＮＡ分子が同定され、単離されると、それを増殖するために、当業界で既知のいくつかの方法を用い得る。適切な宿主系および増殖条件が確立されると、組換え発現ベクターを増殖し、多量に調製し得る。前記で説明したように、用い得る発現ベクターとしては以下のベクターまたはそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない：酵母菌ベクター；バクテリオファージベクター（例えばラムダ）、ならびにプラスミドおよびコスミドＤＮＡベクター等。
【００５０】
さらに、挿入配列の発現を調節し、あるいは所望の特定の様式で遺伝子生成物を修飾し、そしてプロセシングする宿主細胞株を選択し得る。ある種のプロモーターからの発現は、ある種のインヂューサーの存在下で上昇し得る。したがって、４．２．項で開示された遺伝子操作キメラタンパク質の発現を制御し得る。さらに、異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳および翻訳後プロセシングおよび修飾（例えば、グリコシル化、リン酸化）のための特徴的および特異的メカニズムを有する。発現される外来タンパク質の所望の修飾およびプロセシングを保証するために適切な細胞株または宿主系を選択し得る。例えば、細菌系における発現は、非グリコシル化コアタンパク質生成物を生成するために用い得る。酵母菌中での発現は、グリコシル化生成物を生成する。哺乳類細胞中での発現は、異種タンパク質の「ネイティブ」グリコシル化を保証するために用い得る。さらに、異なるベクター／宿主発現系は、異なる程度にプロセシング反応に作用し得る。
【００５１】
ｃＤＮＡおよびゲノム配列はともに、クローン化し、発現し得る。
４．２．項に開示されたキメラタンパク質、あるいはその断片、類似体または誘導体は、標準方法、例えばクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティーおよびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、示差的溶解度により、あるいはタンパク質の精製のためのあらゆるその他の標準技法によっても、単離し、精製し得る。機能特性は、あらゆる適切な検定を用いて評価し得る。
【００５２】
４．２．項に開示されたキメラタンパク質あるいはその断片、類似体または誘導体をコードする核酸配列は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで突然変異化されて、翻訳、開始および／または終止配列を作製および／または破壊し、あるいはコード領域に変異を作製し得る。当業界で既知の突然変異誘発のためのあらゆる技法が用いられ、その例としては、ｉｎ ｖｉｔｒｏ特定部位の突然変異誘発（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９７８， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５３：６５５１）、ＴＡＢリンカー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の使用、突然変異含有ＰＣＲプライマー等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５３】
突然変異誘発に関与する実験は、主に特定部位の突然変異誘発とその後の変更遺伝子生成物の表現型検査で構成される。さらに一般的に用いられる特定部位の突然変異誘発プロトコールのいくつかは、必要な場合に、一本鎖ならびに二本鎖ＤＮＡを提供し得るベクターの利点を用いる。一般に、このようなベクターを用いる突然変異誘発プロトコールは以下の通りである。突然変異誘発性プライマー、即ち、変更される配列と相補的であるが、しかし１つまたは少数の変更、付加または欠失化塩基から成るプライマーが合成される。プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼにより、そしていくつかの付加的操作後にｉｎ ｖｉｔｒｏで延長され、目下の二本鎖ＤＮＡが細菌細胞中にトランスフェクトされる。次に、種々の方法により、所望の突然変異化ＤＮＡが同定され、そして所望のタンパク質が、突然変異化配列を含有するクローンから精製される。より長い配列に関しては、長挿入物（２キロベースより長い）はそれらのベクター中で不安定であるため、付加的クローニング工程がしばしば必要とされる。プロトコールは当業者には既知であり、特定部位の突然変異誘発のためのキットは、バイオテクノロジー供給会社から、例えばＡｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｉｎｃ．（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ， ＩＬ）およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）から広範に入手可能である。
【００５４】
さらに、４．２．項に開示されたキメラタンパク質、あるいはその断片、類似体または誘導体は、キメラ合成し得る（例えば、Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３０：３１２８−３１３５およびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， １９６３， Ｊ． Ａｍｅｒ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ８５：２１４９−２１５６参照）。例えば、４．２．項に開示されたキメラタンパク質あるいはその断片、誘導体または類似体は、固相法により合成され、樹脂から切断されて、分離用高速液体クロマトグラフィーにより精製し得る（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， １９８３， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ， Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．， Ｎ．Ｙ．， ｐｐ．５０−６０参照）。４．２．項に開示されたキメラタンパク質あるいはその断片、誘導体または類似体は、ペプチド合成機の使用によっても合成し得る。合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析またはシーケンシングにより確証し得る（例えば、ｔｈｅ Ｅｄｍａｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ；Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， １９８３， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．， Ｎ．Ｙ．， ｐｐ．３４−４９参照）。
【００５５】
４．２．項に開示されたキメラタンパク質あるいはその断片、誘導体または類似体は、アミノ酸残基の逐次付加によりそれらの全体で、あるいは当業界で周知の技法、例えば断片濃縮を用いて併合し得る断片亜構成成分として合成し得る（Ｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５６：４０４−４０８； Ｎｙｆｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｐｅｐｔｉｄｅｓ， Ｐｒｏｃ． １２ｔｈ Ａｍｅｒ． Ｐｅｐ． Ｓｏｃ．， Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｒｉｖｉｅｒ（ｅｄｓ）， Ｌｅｉｄｅｎ， ｐｐ６６１−６６３； Ｎｏｋｉｋａｒａ ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ， Ｙａｎａｉｈａｒａ（ｅｄ）， Ｏｓａｋａ， ｐｐ３１５−３２０）。
【００５６】
少し好ましい態様では、４．２．項に開示されたキメラタンパク質あるいはその断片、誘導体または類似体は、そのタンパク質のタンパク質分解とその後の前記で記載されたような標準方法（例えば、イムノアフィニティー精製）を用いた精製により生成することができる。
４．４．正確に折り畳まれたインスリン前駆体の生成
本発明は、正確に畳まれた第一インスリン前駆体含有キメラタンパク質の生成方法であって、１以上の切断可能アミノ酸残基によりインスリン前駆体から分離された分子内シャペロン（ＩＭＣ）様ペプチジル断片から成る不正確に折り畳まれた第二インスリン前駆体含有キメラタンパク質を、水性媒質中の少なくとも１つのカオトロピック補助剤と接触することを包含する方法であって、前記のＩＭＣ様ペプチジル断片が：ａ）約２０〜約２００アミノ酸残基を含有し；ｂ）インスリン前駆体またはその一部ではなく、そしてｃ）不正確に畳まれた第二インスリン前駆体含有キメラタンパク質がカオトロピック補助剤と接触される場合の正確に畳まれた第一インスリン前駆体含有キメラタンパク質の収率が、前記のＩＭＣ様ペプチジル断片を含有しない不正確に畳まれたインスリン前駆体が同一カオトロピック補助剤と接触される場合の正確に畳まれたインスリン前駆体の収率より高いように、インスリン前駆体フォールディングを改良する方法を提供する。
【００５７】
本明細書中で用いる場合、「ヒトインスリン前駆体」とは、１）ヒトインスリンＡ鎖およびＢ鎖またはその類似体、誘導体および断片を含有し、２）６個のシステイン残基を含有し、３）インスリンＡ鎖およびＢ鎖に結合される除去可能接続部分を有し、そして４）抗ヒトインスリン抗体と結合し得る分子を指す。ヒトインスリン前駆体の例としては、Ｌａｄｉｓｃｈ ａｎｄ Ｋｏｈｌｍａｎｎ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇ．， １９９２， ８：４６９−４７８； Ｔｈｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １９８６， ８３：６７６６−６７７０； 米国特許第５，４７３，０４９号；米国特許第５，４５７，０６６号およびＥＰ０，３４７，７８１ Ｂ１に開示されたものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５８】
「正確に折り畳まれた」ヒトインスリン前駆体またはインスリン前駆体含有キメラタンパク質という用語は、ヒトインスリン前駆体が天然の生物学的に活性なヒトインスリンに見出されるような立体配座およびジスルフィド架橋を有する、即ちａ）Ａ−６およびＡ−１１、ｂ）Ａ−７およびＢ−７、ｃ）Ａ−２０およびＢ−１９間にジスルフィド架橋が形成される分子を指す。「不正確に折り畳まれた」ヒトインスリン前駆体またはインスリン前駆体含有キメラタンパク質とは、ヒトインスリン前駆体が天然の生物学的に活性なヒトインスリンに見出されるような立体配座、ジスルフィド架橋またはその両方を欠いた分子を指す。
【００５９】
好ましい態様では、本発明は、前記の正確に折り畳まれたインスリン前駆体含有キメラタンパク質の生成方法であって、インスリン前駆体がヒト起源である方法を提供する。ヒトインスリン前駆体が抗ヒトインスリン抗体に結合し得るものも好ましい。さらに好ましくは、ヒトインスリン前駆体は、配列番号４のアミノ酸配列から成る。さらに好ましくは、ヒトインスリン前駆体において、ヒトインスリン前駆体のＢ鎖およびＡ鎖は、１個のアミノ酸残基、または２〜３４個のアミノ酸残基から成るペプチジル断片により分離される。さらに好ましくは、ヒトインスリン前駆体は、配列番号５のアミノ酸配列から成る。
【００６０】
好ましい態様では、本発明は、前記の正確に折り畳まれたインスリン前駆体含有キメラタンパク質の生成方法であって、ＩＭＣ様ペプチジル断片がインスリン前駆体より高いパーセンテージの荷電アミノ酸残基を含有する方法を提供する。さらに好ましくは、ＩＭＣ様ペプチジル断片において、Ｎ末端半分は、負荷電アミノ酸残基より多い正荷電アミノ酸残基を含有し、そしてＣ末端半分は正荷電アミノ酸残基より多い負荷電アミノ酸残基を含有する。さらに好ましくは、ＩＭＣ様ペプチジル断片は、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）タンパク質の少なくとも最初の２０個のＮ末端アミノ酸を含有するドメインと少なくとも４０％の同一性を有するアミノ酸配列から成るが、この場合、同一性パーセンテージは、ｈＧＨのドメインと同一サイズのアミノ酸配列全体で確定される。さらに好ましくは、ＩＭＣ様ペプチジル断片は、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）タンパク質の少なくとも最初の２０個のＮ末端アミノ酸を含有するドメインと少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列から成る。さらに好ましくは、ＩＭＣ様ペプチジル断片は、抗ｈＧＨ抗体に結合し得る。さらに好ましくは、ＩＭＣ様ペプチジル断片は、配列番号１のアミノ酸配列から成る。さらにより好ましくは、ＩＭＣ様ペプチジル断片は、配列番号２のアミノ酸配列から成る。
【００６１】
好ましい態様では、本発明は、前記の正確に折り畳まれたインスリン前駆体含有キメラタンパク質の生成方法であって、切断可能アミノ酸残基がＡｒｇまたはＬｙｓ残基である方法を提供する。さらに好ましくは、切断可能アミノ酸残基は、配列番号３のアミノ酸配列から成る。
特定の態様では、本発明は、前記の正確に折り畳まれたインスリン前駆体含有キメラタンパク質の生成方法であって、不正確に折り畳まれた第二インスリン前駆体含有キメラタンパク質において、ＩＭＣ様ペプチジル断片が前記のキメラタンパク質のＮ末端に位置する方法を提供する。別のこのような特定の態様では、ＩＭＣ様ペプチジル断片は、前記のキメラタンパク質のＣ末端に位置する。さらに別のこのような特定の態様では、ＩＭＣ様ペプチジル断片は、インスリン前駆体のＢ鎖およびＡ鎖の間に位置する。
【００６２】
好ましい態様では、本発明は、前記の正確に折り畳まれたインスリン前駆体含有キメラタンパク質の生成方法であって、ＩＭＣ様ペプチジル断片が、第二インスリン前駆体含有キメラタンパク質中のＩＭＣ様ペプチジル断片およびインスリン前駆体を分離する１以上の切断可能アミノ酸残基と同一である１以上の切断可能アミノ酸残基を含有する方法を提供する。さらに好ましくは、切断可能アミノ酸残基は、ＡｒｇまたはＬｙｓ残基である。
【００６３】
最も好ましい態様では、本発明は、前記の正確に折り畳まれたインスリン前駆体含有キメラタンパク質の生成方法であって、不正確に折り畳まれた第二インスリン前駆体含有キメラタンパク質が配列番号６のアミノ酸配列から成る方法を提供する。さらに最も好ましくは、不正確に折り畳まれた第二インスリン前駆体含有キメラタンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列から成る。
【００６４】
カオトロピック補助剤は、水性溶液中で水素結合を破壊する化合物である。特定の態様では、本発明は、前記の正確に折り畳まれたインスリン前駆体含有キメラタンパク質の生成方法であって、カオトロピック補助剤が塩酸グアニジン、炭酸エチレン、チオシアネート、ジメチルスルホキシドおよび尿素から成る群から選択される方法を提供する。好ましくは、カオトロピック補助剤は、尿素である。さらに好ましくは、尿素は約２．０〜約８．０ Ｍの濃度で存在する。最も好ましくは、尿素は約３．０〜約６．０ Ｍの濃度で存在する。
【００６５】
別の特定の態様では、本発明は、前記の正確に折り畳まれたインスリン前駆体含有キメラタンパク質の生成方法であって、不正確に折り畳まれた第二インスリン前駆体含有キメラタンパク質が、ｐＨ約８．０〜約１０．５で、約０．０５〜約１５．０ｇ／ｌの不正確に折り畳まれた第二インスリン前駆体含有キメラタンパク質の濃度で、水性溶媒中の少なくとも１つのカオトロピック補助剤と接触される方法を提供する。好ましくは、ｐＨは、約９．０〜約１０．０に保持される。不正確に折り畳まれた第二インスリン前駆体含有キメラタンパク質が約０．５〜約５．０ｇ／ｌで存在するのも好ましい。さらに好ましくは、不正確に折り畳まれた第二インスリン前駆体含有キメラタンパク質は、約２．０〜約３．０ｇ／ｌで存在する。
【００６６】
メルカプタンは、水中で可溶性であり、そして少なくとも１個の−ＳＨ基を含有する化合物である。さらに別の態様では、本発明は、前記の正確に折り畳まれたインスリン前駆体含有キメラタンパク質の生成方法であって、不正確に折り畳まれた第二インスリン前駆体含有キメラタンパク質を、不正確に折り畳まれた第二インスリン前駆体含有キメラタンパク質のシステイン残基当たりのメルカプタンの−ＳＨ基が５より少なく生じるような量のメルカプタンと接触させることをさらに包含する方法を提供する。さらに別の特定の態様では、不正確に折り畳まれた第二インスリン前駆体含有キメラタンパク質を、メルカプタンおよびカオトロピック補助剤と同時に接触させる。さらに別の特定の態様では、不正確に折り畳まれた第二インスリン前駆体含有キメラタンパク質は、メルカプタンおよびカオトロピック補助剤と順次接触させる。好ましくは、メルカプタンの量は、不正確に折り畳まれた第二インスリン前駆体含有キメラタンパク質のシステイン残基当たりメルカプタンの約０．０７〜約１．０の−ＳＨ基を生じる。メルカプタンが、ジチオトレイトール、ジチオエリトロール、２−メルカプトエタノール、システイン、メチルチオグリコレート、３−メルカプト−１，２−プロパンジオールおよび３−メルカプトプロピオン酸から成る群から選択されるのも好ましい。さらに好ましくは、メルカプタンは２−メルカプトエタノールである。
【００６７】
さらに別の特定の態様では、本発明は、前記の正確に折り畳まれたインスリン前駆体含有キメラタンパク質の生成方法であって、不正確に折り畳まれた第二インスリン前駆体含有キメラタンパク質から正確に折り畳まれた第一インスリン前駆体含有キメラタンパク質を分離することをさらに包含する方法を提供する。好ましくは、第一インスリン前駆体含有キメラタンパク質は、限外濾過により第二インスリン前駆体含有キメラタンパク質から分離される。さらに好ましくは、限外濾過は、ｐＨ約８．０〜約１１．０で実行される。最も好ましくは、限外濾過は、ｐＨ約９．０〜約１０．０で実行される。
【００６８】
さらに別の特定の態様では、本発明は、前記の方法により生成される正確に折り畳まれたインスリン前駆体含有キメラタンパク質を提供する。
４．５．インスリン前駆体のフォールディングを改良するアミノ酸配列のスクリーニング
本発明は、インスリン前駆体のフォールディングを改良する能力に関してアミノ酸配列をスクリーニングするための検定であって、以下の：（ａ）４．２項に開示されたキメラタンパク質の第一ペプチジル断片のアミノ酸配列を変えて、前記の変化を有する前記のキメラタンパク質を生成し、前記のキメラタンパク質が正確に折り畳まるような条件下で、そしてそれに十分な時間、前記の変化を有する前記のキメラタンパク質を水性媒質中の少なくとも１つのカオトロピック補助剤と接触させ、そして前記の変化を有する前記のキメラタンパク質のフォールディング収率を測定し；（ｂ）工程（ａ）に用いられるがしかし工程（ａ）に記載されたいかなるアミノ酸配列変化も伴わないキメラタンパク質を生成し、工程（ａ）に記載されたいかなるアミノ酸配列変化も伴わないキメラタンパク質を、工程（ａ）で用いられた同一カオトロピック補助剤と水性媒質中で同一条件下で、そして工程（ａ）で用いられたのと同一時間接触させて、そしてキメラタンパク質のフォールディング収率を測定し；そして（ｃ）それぞれ工程（ａ）および（ｂ）で測定されたキメラタンパク質のフォールディング収率を比較することを包含する検定であって、工程（ａ）で測定される収率が実質的に工程（ｂ）で測定される収率と等しいかまたはそれより大きく、このことがアミノ酸配列がインスリン前駆体のフォールディングを改良することを示す検定を提供する。
【００６９】
４．２．項に開示されたキメラタンパク質の第一ペプチジル断片のアミノ酸配列は、当業界で既知のあらゆる突然変異誘発技法により、好ましくは４．３．項に記載された突然変異誘発技法により、変え得る。
前記の検定の好ましい態様では、キメラタンパク質は、配列番号６のアミノ酸配列から成る。
【００７０】
前記の検定の別の好ましい態様では、キメラタンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列から成る。
前記の検定のさらに別の好ましい態様では、カオトロピック補助剤は、尿素である。
前記の検定のさらに別の好ましい態様では、検定は、それぞれ工程（ａ）および（ｂ）において、キメラタンパク質を、キメラタンパク質のシステイン当たりのメルカプタンの５個未満の−ＳＨ基を生じる量のメルカプタンと接触させることをさらに包含する。さらに好ましくは、メルカプタンは２−メルカプトエタノールである。
【００７１】
特定の態様では、前記の検定の生成物が提供される。
５．実施例
配列番号６のアミノ酸配列から成るｈＧＨ−ミニプロインスリンをコードするＤＮＡ断片を、化学的に合成した。Ｔｒｐプロモーターの制御下で、ＤＮＡ断片を細菌発現ベクター中にクローン化した。ｈＧＨ−ミニプロインスリンを含有する発現ベクターを、大腸菌ＰＲ１株中にトランスフェクトして、微量元素の存在下で、Ｍ９−ＣＡ培地中で組換え細胞を培養した。ｈＧＨ−ミニプロインスリン融合タンパク質を封入体から回収し、ジスルフィド架橋が正確に折り畳まれたヒトプロインスリン中で形成される、即ち、Ａ６−Ａ１１、Ａ７−Ｂ７およびＡ２０−Ｂ１９のジスルフィド架橋が形成されるのと同様に、折り畳まれたｈＧＨ−ミニプロインスリン融合タンパク質内で、ジスルフィド架橋が形成されるような条件下で折り畳んだ。折り畳まれたｈＧＨ−ミニプロインスリン融合タンパク質を、１００Ｋ限外濾過により非折り畳み融合タンパク質から分離した。単離された正確に折り畳まれたｈＧＨ−ミニプロインスリン融合タンパク質をトリプシンで消化して、正確に折り畳まれたＡｒｇ（Ｂ３１）−ヒトインスリンを生成した。陽イオン交換クロマトグラフィーにより、Ａｒｇ（Ｂ３１）−ヒトインスリンを、少なくとも９０％の純度に精製した。精製Ａｒｇ（Ｂ３１）−ヒトインスリンを次にカルボキシペプチダーゼＢで消化して、正確に折り畳まれたヒトインスリンを生成し、これを次に逆相ＨＰＬＣにより精製した。このようにして生成した純ヒトインスリンを、Ｎ−末端配列分析、分子量確定およびペプチドマッピングにより特性化した。
【００７２】
５．１．ｈＧＨ−ミニ−プロインスリン発現ベクターの構築
配列番号６のアミノ酸配列から成るｈＧＨ−ミニ−プロインスリンをコードするＤＮＡ断片を、Ｇａｎ ｅｔ ａｌ．「Ｇｅｎｅ」１９８９， ７９：１５９−１６６に開示された手法により、化学的に合成した。５’Ｃｌａ Ｉ部位および３’Ｈｉｎｄ ＩＩＩ部位が合成ＤＮＡ断片中に含まれた。要するに、配列番号６のアミノ酸残基５１および５２をコードするヌクレオチド配列を切断する５’Ｃｌａ Ｉから３’Ｋｐｎ Ｉまでの断片、および５’Ｋｐｎ Ｉから３’Ｈｉｎｄ ＩＩＩまでの断片を化学的に合成し、それぞれ、ｐＵＣ１８ベクター中にサブクローニングした。その後、ｈＧＨ−ミニ−プロインスリンの配列がＴｒｐプロモーターおよびＳＤ配列の制御下にあるように、配列番号６の全アミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を修飾化ｐＡＴＨ２ベクター中にサブクローニングした。その結果生じたベクターｐＺＲｈｉ−１（図２）を用いて、ｈＧＨ−ミニ−プロインスリン融合タンパク質を発現した。
【００７３】
５．２．ｈＧＨ−ミニ−プロインスリン融合タンパク質の発現
ｈＧＨ−ミニ−プロインスリン融合タンパク質発現ベクターを、大腸菌ＲＲ１またはＫ１２Ｗ３１１０株に形質転換した。形質転換化大腸菌を、微量元素の存在下でＭ９−ＣＡ培地中で培養した。振盪フラスコおよび発酵器の両方で、ｈＧＨ−ミニ−プロインスリン融合タンパク質の発現レベルを確定した。両方の場合で、総大腸菌タンパク質の２０〜２５％という高レベルの発現が観察された。
【００７４】
５．３． ｈＧＨ−ミニ−プロインスリン融合タンパク質の再フォールディング
ｈＧＨ−ミニ−プロインスリン融合タンパク質を、「封入体」と呼ばれる不溶性形態として発現させた。封入体を放出するために、８×１０７Ｐａ（８００ ｂａｒ）での高圧ホモジナイザーにより大腸菌細胞を破壊した。細胞破砕屑および可溶性大腸菌タンパク質を、１０，０００ ｇでの遠心分離により除去した。ｈＧＨ−ミニ−プロインスリン融合タンパク質を含有する封入体ペレットを、水で３回洗浄した。その結果生じた、 ｈＧＨ−ミニ−プロインスリン融合タンパク質が約９０％の純度で含まれる封入体ペレットを、フォールディングのための出発物質として用いた。２〜６ ｍＭのメルカプトエタノールの存在下で、２０〜３０ ｍｇ／ｍｌのｈＧＨ−ミニ−プロインスリン融合タンパク質濃度で、封入体を８ Ｍの尿素、ｐＨ１０．４中に溶解した。遠心分離により、不溶性物質を除去した。上清を、低濃度尿素で１０倍に稀釈して、尿素の最終濃度を３〜６ Ｍ、ｐＨ９〜１０、ならびにメルカプトエタノールの最終濃度を０．２〜０．６ ｍＭとした。４℃で、３．２ Ｍ、ｐＨ９．３の尿素濃度で、ルーチンフォールディングを実行した。０．１％リン酸塩緩衝液中の３０〜４７％のアセトニトリル勾配を用いて、Ｃ４逆相ＨＰＬＣにより、フォールディング工程をモニタリングした。このようなクロマトグラフィー条件下で、正確に折り畳まれたｈＧＨ−ミニ−プロインスリンの保持時間は、約２３分であった。フォールディングは、２４時間以内に終了し得る。再フォールディング収率は約７０％であった。
【００７５】
１００ Ｋ限外濾過により、フォールディング混合物を分別した。ろ液分画中に見出された正確に折り畳まれたｈＧＨ−ミニ−プロインスリン融合タンパク質を、１０ Ｋ限外濾過系により濃縮した。ｐＨ３．５で、水を用いて尿素を除去した。限外濾過工程の収率は、８５％を上回った。
５．４．正確に再び折り畳まれたｈＧＨ−ミニ−プロインスリンのトリプシン切断
トリプシン切断のためには、正確に折り畳まれたｈＧＨ−ミニ−プロインスリン融合タンパク質の濃度は、約１０〜１２ ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１０ ｍｇ／ｍｌである。トリプシンとｈＧＨ−ミニ−プロインスリン融合タンパク質との間の比は、約１：６０〜約１：２５０の範囲、好ましくは１：１００であった。ｐＨは、約１０〜約１１、好ましくは約１０．８に保持した。切断は、４℃で約１〜約５時間で進行させ、好ましくは約３．５時間実行した。切断反応は、リン酸塩緩衝液を用いてｐＨを３．５に調整することにより停止した。逆相ＨＰＬＣ分析は、この切断工程に関する収率が９５％より高いことを示した。１０より高いｐＨでは、トリプシンは以下のＡｒｇ残基に作用する：ヒトミニ−プロインスリンＢおよびＡ鎖間のＡｒｇ残基、ｈＧＨ断片とミニ−プロインスリン断片との間のＡｒｇ残基、ｈＧＨ断片内のＡｒｇ残基。トリプシン消化は、ｈＧＨ断片からのいくつかの小片、ならびにＡｒｇ（Ｂ３１）−ヒトインスリンと呼ばれる、Ｂ鎖のＣ末端に余分のＡｒｇを有するヒトインスリンを生じた。ヒトインスリンのＡｒｇ（Ｂ２２）は、おそらくは三次元構造による妨害のために、前記の条件下では切断されなかった。
【００７６】
１０ ｍＭのクエン酸塩緩衝液の存在下で溶離液としてＮａＣｌを用いて、陽イオン交換クロマトグラフィーにより、Ａｒｇ（Ｂ３１）−ヒトインスリンを精製した。精製Ａｒｇ（Ｂ３１）−ヒトインスリンは、純度が９０％より高かった。
５．５．Ａｒｇ（Ｂ３１）−ヒトインスリンのヒトインスリンへの転化
カルボキシペプチダーゼＢにより、Ａｒｇ（Ｂ３１）−ヒトインスリンのＣ末端のＡｒｇ（Ｂ３１）を除去した。正確に畳まれたＡｒｇ（Ｂ３１）−ヒトインスリンの濃度は、約１０ ｍｇ／ｍｌであった。カルボキシペプチダーゼＢとＡｒｇ（Ｂ３１）−ヒトインスリンとの間の比を、約１：１０００に保持した。５０ ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０中で、３７℃で約１時間、切断を進行させた。リン酸塩緩衝液を用いてｐＨを３．５に調整することにより、切断反応を停止した。ヒトインスリンの収率は、９９％より高かった。
【００７７】
５．６．ヒトインスリンの精製
カルボキシペプチダーゼＢ消化から生成されたヒトインスリンを、０．１％のリン酸塩緩衝液、ｐＨ３．０で平衡させておいたＣ８逆相ＨＰＬＣカラムに投入した。０．１％のリン酸塩緩衝液、ｐＨ３．０中の１７％〜３５％のアセトニトリル勾配により、ヒトインスリンを溶離した。インスリン分画をプールし、酢酸を付加して濃度を０．１２５〜０．２ Ｍ、ｐＨ６．０とした。このようにして生成したインスリンを、４℃で結晶化した。ヒトインスリンの純度は、９９％を上回った。
【００７８】
５．７．精製ヒトインスリンの特性化
精製ヒトインスリンおよびＷＨＯ標準ヒトインスリンの最初の１５個のＮ末端アミノ酸を、標準エドマン分解により確定した。精製ヒトインスリンのＡおよびＢ鎖の両方のＮ末端配列は、ＷＨＯ標準ヒトインスリンのものと同一である。
精製ヒトインスリンの分子量およびＷＨＯ標準ヒトインスリンの分離量を、ＶＧプラットホーム質量分析により確定した。両標本が、５８０７．７のＭ／Ｚを生じた。
【００７９】
精製ヒトインスリンおよびＷＨＯ標準ヒトインスリンをともに、Ｖ８プロテアーゼで消化した。Ｃ１８逆相ＨＰＬＣにより、消化断片を分析した。両標本が、同一ペプチドマッピングパターンを示した（Ｔｈｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ， Ｈｅｒｓｈｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｅｄ． Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， １９８９， ｐ３２２−３２８参照）。
【００８０】
本発明は、寄託された微生物または本明細書中に記載した特定の態様により、その範囲を限定されない。実際、本明細書中に記載したものに加えて、種々の修正を成し得ることは、前記の説明および添付の図面から、当業者には明らかになる。このような集成は、添付の請求の範囲の範囲内であるよう意図される。
種々の参考文献を本明細書中に引用したが、これらの記載内容は、参照により完全に本明細書中に含まれる。
【００８１】
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【図１Ａ】
プロインスリンの構造を示す。
【図１Ｂ】
正確に形成されたジスルフィド架橋を有する成熟インスリンの構造を示す。
【図２】
ｈＧＨ−ミニプロインスリン（配列番号６）発現ベクター（ｐＺＲｈｉ−１）のマップ。
Claims (77)
- Ｎ末端からＣ末端に：
ａ）ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）タンパク質の少なくとも最初の２０個のＮ−末端アミノ酸を含有するドメインと少なくとも４０％の同一性を有するアミノ酸配列から成る第一ペプチジル断片であって、この場合、同一性パーセンテージがｈＧＨのドメインと同一サイズのアミノ酸配列全体で確定される断片；
ｂ）Ａｒｇ残基またはＬｙｓ残基、あるいはほとんどのＣ末端アミノ酸残基がＡｒｇまたはＬｙｓであるペプチジル断片中の少なくとも２個のアミノ酸から成る第二ペプチジル断片；ならびに
ｃ）ペプチジル断片がｈＧＨタンパク質の一部でない２個より多いシステイン（Ｃｙｓ）残基を含有するアミノ酸配列から成る第三ペプチジル断片
を包含するキメラタンパク質。 - 第一ペプチジル断片がｈＧＨタンパク質のドメインと少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列から成る請求項１のキメラタンパク質。
- 第一ペプチジル断片が抗ｈＧＨ抗体に結合し得るものである請求項１のキメラタンパク質。
- 第一ペプチジル断片が配列番号１のアミノ酸配列から成る請求項１のキメラタンパク質。
- 第一ペプチジル断片が配列番号２のアミノ酸配列から成る請求項１のキメラタンパク質。
- 第二ペプチジル断片が配列番号３のアミノ酸配列から成る請求項１のキメラタンパク質。
- 第三ペプチジル断片がインスリン前駆体である請求項１のキメラタンパク質。
- インスリン前駆体がヒト起源である請求項７のキメラタンパク質。
- ヒトインスリン前駆体が抗ヒトインスリン抗体に結合し得るものである請求項８のキメラタンパク質。
- ヒトインスリン前駆体が配列番号４のアミノ酸配列から成る請求項８のキメラタンパク質。
- ヒトインスリン前駆体中で、ヒトインスリン前駆体のＢ鎖およびＡ鎖が、１つのアミノ酸残基により、あるいは２〜３４個のアミノ酸残基から成るペプチジル断片により分離される請求項８のキメラタンパク質。
- ヒトインスリン前駆体が配列番号５のアミノ酸配列から成る請求項８のキメラタンパク質。
- 配列番号６のアミノ酸配列から成るキメラタンパク質。
- 配列番号７のアミノ酸配列から成るキメラタンパク質。
- 請求項１のキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を包含する単離核酸。
- 請求項１３のキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を包含する単離核酸。
- 請求項１４のキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を包含する単離核酸。
- 前記核酸がＤＮＡである請求項１５の核酸。
- 請求項１５のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を包含する単離核酸。
- 請求項１８のＤＮＡの第一、第二および第三ペプチジル断片をコードするヌクレオチド配列とハイブリダイズ可能な単離核酸。
- 請求項１５の核酸を含有する組換え細胞。
- 請求項１６の核酸を含有する組換え細胞。
- 請求項１７の核酸を含有する組換え細胞。
- コード化キメラタンパク質が細胞により発現されるように請求項１５の核酸を含有する組換え細胞を増殖させて、発現されたキメラタンパク質を回収することを包含するキメラタンパク質の生成方法。
- コード化キメラタンパク質が細胞により発現されるように請求項１６の核酸を含有する組換え細胞を増殖させて、発現されたキメラタンパク質を回収することを包含するキメラタンパク質の生成方法。
- コード化キメラタンパク質が細胞により発現されるように請求項１７の核酸を含有する組換え細胞を増殖させて、発現されたキメラタンパク質を回収することを包含するキメラタンパク質の生成方法。
- 請求項２４の方法の生成物。
- 請求項２５の方法の生成物。
- 請求項２６の方法の生成物。
- 正確に畳まれた第一インスリン前駆体含有キメラタンパク質の生成方法であって、１以上の切断可能アミノ酸残基によりインスリン前駆体から分離された分子内シャペロン（ＩＭＣ）様ペプチジル断片から成る不正確に折り畳まれた第二インスリン前駆体含有キメラタンパク質を、水性媒質中の少なくとも１つのカオトロピック補助剤と接触することを包含する方法であって、前記ＩＭＣ様ペプチジル断片が：
ａ）約２０〜約２００アミノ酸残基を含有し；
ｂ）インスリン前駆体またはその一部ではなく、そして
ｃ）不正確に畳まれた第二インスリン前駆体含有キメラタンパク質がカオトロピック補助剤と接触される場合の正確に畳まれた第一インスリン前駆体含有キメラタンパク質の収率が、前記ＩＭＣ様ペプチジル断片を含有しない不正確に畳まれたインスリン前駆体が同一カオトロピック補助剤と接触される場合の正確に畳まれたインスリン前駆体の収率より高いように、インスリン前駆体フォールディングを改良する
方法。 - インスリン前駆体がヒト起源のものである請求項３０の方法。
- ヒトインスリン前駆体が抗ヒトインスリン抗体に結合し得るものである請求項３１の方法。
- ヒトインスリン前駆体が配列番号４のアミノ酸配列から成る請求項３１の方法。
- ヒトインスリン前駆体中で、ヒトインスリン前駆体のＢ鎖およびＡ鎖が、１つのアミノ酸残基により、あるいは２〜３４個のアミノ酸残基から成るペプチジル断片により分離される請求項３１の方法。
- ヒトインスリン前駆体が配列番号５のアミノ酸配列から成る請求項３１の方法。
- ＩＭＣ様ペプチジル断片がインスリン前駆体より高いパーセンテージの荷電アミノ酸残基を含有する請求項３０の方法。
- ＩＭＣ様ペプチジル断片において、Ｎ末端半分が、負荷電アミノ酸残基より多い正荷電アミノ酸残基を含有し、そしてＣ末端半分が正荷電アミノ酸残基より多い負荷電アミノ酸残基を含有する請求項３０の方法。
- ＩＭＣ様ペプチジル断片が、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）タンパク質の少なくとも最初の２０個のＮ末端アミノ酸を含有するドメインと少なくとも４０％の同一性を有するアミノ酸配列から成る請求項３０の方法であって、同一性パーセンテージが、ｈＧＨのドメインと同一サイズのアミノ酸配列全体で確定される方法。
- ＩＭＣ様ペプチジル断片が、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）タンパク質の少なくとも最初の２０個のＮ末端アミノ酸を含有するドメインと少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列から成る請求項３８の方法。
- ＩＭＣ様ペプチジル断片が抗ｈＧＨ抗体に結合し得るものである請求項３０の方法。
- ＩＭＣ様ペプチジル断片が配列番号１のアミノ酸配列から成る請求項３８の方法。
- ＩＭＣ様ペプチジル断片が配列番号２のアミノ酸配列から成る請求項３８の方法。
- 切断可能アミノ酸残基がＡｒｇまたはＬｙｓ残基である請求項３０の方法。
- 切断可能アミノ酸残基が配列番号３のアミノ酸配列から成る請求項３０の方法。
- 不正確に折り畳まれた第二インスリン前駆体含有キメラタンパク質において、ＩＭＣ様ペプチジル断片が前記キメラタンパク質のＮ末端に位置する請求項３０の方法。
- 不正確に折り畳まれた第二インスリン前駆体含有キメラタンパク質において、ＩＭＣ様ペプチジル断片が前記キメラタンパク質のＣ末端に位置する請求項３０の方法。
- 不正確に折り畳まれた第二インスリン前駆体含有キメラタンパク質において、ＩＭＣ様ペプチジル断片がインスリン前駆体のＢ鎖とＡ鎖との間に位置する請求項３０の方法。
- ＩＭＣ様ペプチジル断片が、第二インスリン前駆体含有キメラタンパク質中のＩＭＣ様ペプチジル断片およびインスリン前駆体を分離する１以上の切断可能アミノ酸残基と同一である１以上の切断可能アミノ酸残基を含有する請求項３０の方法。
- 切断可能アミノ酸残基がＡｒｇまたはＬｙｓ残基である請求項４８の方法。
- 不正確に折り畳まれた第二インスリン前駆体含有キメラタンパク質が配列番号６のアミノ酸配列から成る請求項３０の方法。
- 不正確に折り畳まれた第二インスリン前駆体含有キメラタンパク質が配列番号７のアミノ酸配列から成る請求項３０の方法。
- カオトロピック補助剤が塩酸グアニジン、炭酸エチレン、チオシアネート、ジメチルスルホキシドおよび尿素から成る群から選択される請求項３０の方法。
- カオトロピック補助剤が尿素である請求項５２の方法。
- 尿素が約２．０〜約８．０ Ｍの濃度で存在する請求項５３の方法。
- 尿素が約３．０〜約６．０ Ｍの濃度で存在する請求項５４の方法。
- 不正確に折り畳まれた第二インスリン前駆体含有キメラタンパク質が、ｐＨ約８．０〜約１０．５で、約０．０５〜約１５．０ｇ／ｌの不正確に折り畳まれた第二インスリン前駆体含有キメラタンパク質の濃度で、水性溶媒中の少なくとも１つのカオトロピック補助剤と接触される請求項３０の方法。
- ｐＨが約９．０〜約１０．０に保持される請求項５６の方法。
- 不正確に折り畳まれた第二インスリン前駆体含有キメラタンパク質が約０．５〜約５．０ｇ／ｌで存在する請求項５６の方法。
- 不正確に折り畳まれた第二インスリン前駆体含有キメラタンパク質が約２．０〜約３．０ｇ／ｌで存在する請求項５８の方法。
- 不正確に折り畳まれた第二インスリン前駆体含有キメラタンパク質を、不正確に折り畳まれた第二インスリン前駆体含有キメラタンパク質のシステイン残基当たりのメルカプタンの−ＳＨ基が５未満生じる量のメルカプタンと接触させることをさらに包含する請求項３０の方法。
- 不正確に折り畳まれた第二インスリン前駆体含有キメラタンパク質をメルカプタンおよびカオトロピック補助剤と同時に接触させる請求項６０の方法。
- 不正確に折り畳まれた第二インスリン前駆体含有キメラタンパク質をメルカプタンおよびカオトロピック補助剤と順次接触させる請求項６０の方法。
- メルカプタンの量が、不正確に折り畳まれた第二インスリン前駆体含有キメラタンパク質のシステイン残基当たりメルカプタンの約０．０７〜約１．０の−ＳＨ基を生じる量である請求項６０の方法。
- メルカプタンが、ジチオトレイトール、ジチオエリトロール、２−メルカプトエタノール、システイン、メチルチオグリコレート、３−メルカプト−１，２−プロパンジオールおよび３−メルカプトプロピオン酸から成る群から選択される請求項６０の方法。
- メルカプタンが２−メルカプトエタノールである請求項６４の方法。
- 不正確に折り畳まれた第二インスリン前駆体含有キメラタンパク質から正確に折り畳まれた第一インスリン前駆体含有キメラタンパク質を分離することをさらに包含する請求項３０の方法。
- 正確に折り畳まれた第一インスリン前駆体含有キメラタンパク質が限外濾過により不正確に折り畳まれた第二インスリン前駆体含有キメラタンパク質から分離される請求項６６の方法。
- 限外濾過がｐＨ約８．０〜約１１．０で実行される請求項６７の方法。
- 限外濾過がｐＨ約９．０〜約１０．０で実行される請求項６８の方法。
- 請求項３０の方法の生成物。
- インスリン前駆体のフォールディングを改良する能力に関してアミノ酸配列をスクリーニングするための検定方法であって、以下の：
（ａ）請求項１のキメラタンパク質の第一ペプチジル断片のアミノ酸配列を変えて、前記変化を有する前記キメラタンパク質を生成し、前記キメラタンパク質が正確に折り畳まるような条件下で、そしてそれに十分な時間、前記変化を有する前記キメラタンパク質を水性媒質中の少なくとも１つのカオトロピック補助剤と接触させ、そして前記変化を有する前記キメラタンパク質のフォールディング収率を測定し；
（ｂ）工程（ａ）に用いられるがしかし工程（ａ）に記載されたいかなるアミノ酸配列変化も伴わないキメラタンパク質を生成し、工程（ａ）に記載されたいかなるアミノ酸配列変化も伴わないキメラタンパク質を、工程（ａ）で用いられた同一カオトロピック補助剤と水性媒質中で同一条件下で、そして工程（ａ）で用いられたのと同一時間接触させて、そしてキメラタンパク質のフォールディング収率を測定し；そして
（ｃ）それぞれ工程（ａ）および（ｂ）で測定されたキメラタンパク質のフォールディング収率を比較することを包含する検定であって、
工程（ａ）で測定される収率が実質的に工程（ｂ）で測定される収率と等しいかまたはそれより大きく、このことがアミノ酸配列がインスリン前駆体のフォールディングを改良することを示す検定方法。 - キメラタンパク質が配列番号６のアミノ酸配列から成る請求項７１の検定方法。
- キメラタンパク質が配列番号７のアミノ酸配列から成る請求項７１の検定方法。
- カオトロピック補助剤が尿素である請求項７１の検定方法。
- キメラタンパク質を、それぞれ工程（ａ）および（ｂ）において、キメラタンパク質のシステイン残基当たり５未満の−ＳＨ基を生じる量のメルカプタンと接触させることをさらに包含する請求項７１の検定方法。
- メルカプタンが２−メルカプトエタノールである請求項７５の方法。
- 請求項７１の検定方法の生成物。
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