JP2002306164A - エボラウイルスを認識するモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 エボラウイルスを特異的に認識するモノクロ
ーナル抗体を提供すること。 【解決手段】 エボラウイルスの核タンパク質を認識す
るモノクローナル抗体またはその断片。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、エボラウイルスを
認識するモノクローナル抗体に関する。より詳細には、
本発明は、エボラウイルスの核タンパク質を認識するモ
ノクローナル抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ、
並びに該抗体を用いるエボラウイルスの検出及び／又は
定量のための方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】エボラウイルスへの感染は、高い致死率
を伴う出血熱を発症する原因となる（World Health Org
anization. 1997. Part One: Background informatio
n on the organisms and the disease, p.1-3. In WHO
recommended guidelines forepidemic preparedness a
nd response: Ebola Haemorrhagic Fever(EHF)）。エボ
ラウイルスが現存する地域は限定されているが、国際的
な交通や取引の増加に伴なって、他の地域におけるヒト
及び動物への感染の危険は増加している。エボラウイル
スは、医療関係者や家庭内におけるヒトからヒトへの二
次的感染を生じるので（Dowell, S. F. 他 1999. Trans
mission of Ebola hemorrhagic fever:a study of risk
factors in family members, Kikwit, Democratic Rep
ublic of the Congo, 1995. J. Infect. Dis. 179 Supp
l. 1: S87-91；及びWorld Health Organization. 199
7. Part One: Background information on the organi
sms and the disease, p.1-3. In WHO recommended gu
idelines for epidemic preparedness and response: E
bola Haemorrhagic Fever(EHF)）、感染の初期の段階で
診断し、社会に注意を喚起することが重要である。

【０００３】遺伝的分岐に基づいて、エボラウイルスに
は、ザイール、スーダン、コートジボアール及びレスト
ンと称される４サブタイプに分類されている（Feldman
n, H.他 1999. Classification, Structure, and Repli
cation of Filoviruses, p.1-5. In H. ？D. Klenk(e
d.), Marburg and Ebola viruses. Current Topics inM
icrobiology and Immunology. 235. Springer-Verlag,
Berlin Heidelberg；Georges-Courbot, M.C.他. 1997.
Isolation and phylogenetic characterization of Ebo
la viruses causing different outbreaks in Gabon.
Emerg. Infect.Dis. 3: 59-62；及びPeters, C.J. 他 1
999. An introduction to Ebola: Thevirus and the di
sease. J. Infect. Dis. 179 Suppl. 1: iv-xvi）。ザ
イール株、スーダン株、及びコートジボアール株はヒト
及びサルにおいて重篤な臨床症状を呈するが、レストン
株はサルでのみ症状を呈する（Fisher-Hoch, S. P. 他1
992. Pathogenic potential of filoviruses: Role of
geographic origin ofprimate host and virus strain.
J. Infect. Dis. 166: 753-763；Miller,R.K. 他 199
0. Filovirus infections among persons with occupa
tional exposure to nonhuman primates. MMWR. 39: 2
66-267, 273；及びMiller, R.K. 他 1990. Filovirus i
nfections in animal handlers. MMWR. 39: 221）。エ
ボラウイルス感染による発症は急性であり、臨床症状の
開始時点には抗体の産生は見られないことが多い（Baiz
e, S. 他 1999. Defective humoral responses and ext
ensive intravascular apoptosis are associated with
fatal outcome in Ebolavirus-infected patients. Na
t. Med. 5: 423-426；及びKsiazek, T.G. 他 1999. Cli
nical virology of Ebola hemorrhagic fever(EHF): vi
rus, virus antigen, and IgG and IgM antibody findi
ngs among EHF patients in Kikwit, Democratic Repub
lic of the Congo, 1995. J. Infect. Dis. 179 Suppl.
1: S177-187）。一方、患者の血液及び組織（肝臓等）
におけるウイルス量は非常に高い（Ksiazek, T.G. 他 1
999. Clinical virology of Ebola hemorrhagic fever
(EHF):virus, virus antigen, and IgG and IgM antibo
dy findings among EHF patients in Kikwit, Democrat
ic Republic of the Congo, 1995. J. Infect. Dis. 17
9 Suppl. 1: S177-187）。従って、特異的抗体よりはウ
イルス抗原を検出することによって、エボラウイルス感
染の迅速かつ正確な一次スクリーニングを行うことがで
きる（Peters, C.J. 他 1999. An introduction to Ebo
la: The virusand the disease. J. Infect. Dis. 179
Suppl. 1: iv-xvi）。

【０００４】エボラウイルス感染の抗原検出系は既に報
告があり、利用されている（Ksiazek, T.G. 他 1992. E
nzyme immunosorbent assay for Ebola virus antigens
intissues of infected primates. J. Clin. Microbi
ol. 30: 947-950）。しかしながら、酵素結合免疫吸収
アッセイ（ＥＬＩＳＡ）についての情報は非常に少な
く、例えば、この系で使用されるモノクローナル抗体の
報告は、分子の特異性の点についてもなされていない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、エボラウイ
ルスを特異的に認識するモノクローナル抗体を提供する
ことを解決すべき課題とした。本発明はまた、上記モノ
クローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ法により血清及び臓
器中のエボラウイルスを特異的に検出する方法を提供す
ることを解決すべき課題とした。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するために鋭意検討した結果、組み換えエボラウイ
ルス核タンパク質（ｒＮＰ）に対するモノクローナル抗
体を作製し、この抗体を用いてサンドイッチＥＬＩＳＡ
法により試料中のエボラウイルス核タンパク質を検出す
ることを試みた結果、この抗体により高感度でエボラウ
イルス核タンパク質を検出できることを見出した。本発
明はこれらの知見に基づいて完成したものである。

【０００７】即ち、本発明によれば、エボラウイルスの
核タンパク質を認識するモノクローナル抗体またはその
断片が提供される。本発明の好ましい態様によれば、エ
ボラウイルスのザイール株、スーダン株およびレストン
株の核タンパク質を認識するモノクローナル抗体または
その断片；エボラウイルスザイール株の核タンパク質の
631から739番目のアミノ酸から成るエピトープを認識す
るモノクローナル抗体またはその断片；エボラウイルス
ザイール株の核タンパク質の648番目から673番目のアミ
ノ酸から成る２６アミノ酸から成るエピトープを認識す
るモノクローナル抗体またはその断片；及び受託番号Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１８２７９を有するハイブリドーマが産生
するモノクローナル抗体またはその断片：が提供され
る。

【０００８】本発明の別の側面によれば、上記した本発
明のモノクローナル抗体またはその断片をコードする遺
伝子が提供される。本発明のさらに別の側面によれば、
上記した本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブ
リドーマが提供される。本発明の好ましい態様によれ
ば、エボラウイルスの核タンパク質を含む免疫原で免疫
された哺乳動物の免疫細胞と哺乳動物のミエローマ細胞
とを融合して得られる、本発明のモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマ；及び受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−
１８２７９を有するハイブリドーマが提供される。

【０００９】本発明のさらに別の側面によれば、上記し
た本発明のハイブリドーマを培養する工程、及び該ハイ
ブリドーマが産生するモノクローナル抗体を採取する工
程を含む、本発明のモノクローナル抗体の製造方法が提
供される。

【００１０】本発明のさらに別の側面によれば、上記し
た本発明のモノクローナル抗体またはその断片を用いて
免疫アッセイを行うことを特徴とする、エボラウイルス
の核タンパク質の検出及び／又は定量のための方法が提
供される。本発明の好ましい態様によれば、少なくとも
下記（ａ）及び（ｂ）の工程を含む、エボラウイルスの
核タンパク質の検出及び／又は定量のための方法が提供
される。 （ａ）本発明によるエボラウイルスの核タンパク質を認
識するモノクローナル抗体またはその断片と試料とを反
応させる工程；及び（ｂ）工程（１）で形成した抗原抗
体複合体と、検出のための標識抗体とを反応させる工
程；

【００１１】本発明のさらに別の側面によれば、本発明
によるエボラウイルスの核タンパク質を認識するモノク
ローナル抗体を含むことを特徴とする、エボラウイルス
の核タンパク質の検出及び／又は定量のためのキットが
提供される。

【００１２】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施態様及び実施
方法について説明する。１．本発明のモノクローナル抗体 本発明のモノクローナル抗体は、エボラウイルスの核タ
ンパク質を認識することを特徴とする。エボラウイルス
の種類は特に限定されず、ザイール株、スーダン株、コ
ートジボアール株及びレストン株の何れでもよい。本発
明のモノクローナル抗体は、これら４種の株の全てを認
識するものでもよいし、これらのうちの一部（例えば、
上記４種のうちの３種、２種又は１種）のみを認識する
ものでもよい。本発明のモノクローナル抗体は、目的に
応じて適宜好ましい抗体を選択して使用することができ
る。即ち、エボラウイルスの全般的な検出や定量を目的
とする場合には、上記４種の株の全てを認識するモノク
ローナル抗体を用いることが好ましく、また特定の株を
特異的に検出したい場合には、他の株を交差反応しない
特定の株に特異的なモノクローナル抗体を用いることが
好ましい。

【００１３】本発明のモノクローナル抗体としては、例
えば、エボラウイルスザイール株の核タンパク質の631
から739番目のアミノ酸から成るエピトープを認識する
ものが挙げられ、より具体的には、エボラウイルスザイ
ール株の核タンパク質の648番目から673番目のアミノ酸
から成る２６アミノ酸から成るエピトープを認識するも
のが挙げられる。このようなモノクローナル抗体の一例
としては、本明細書の実施例に記載したモノクローナル
抗体３−３Ｄが挙げられる。モノクローナル抗体３−３
Ｄを産生するハイブリドーマは、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ
−１８２７９として、平成１３年３月２８日付けで経済
産業省 産業技術総合研究所 生命工学工業技術研究所
特許微生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東一
丁目１番３号）に寄託されている。

【００１４】本明細書で抗体と言う場合、全長の抗体だ
けではなく抗体の断片も包含する意味で使用される。即
ち、本発明によれば、エボラウイルスの核タンパク質を
認識するモノクローナル抗体の断片が提供される。抗体
の断片とは、機能性の断片であることが好ましく、例え
ば、Ｆ（ａｂ’）₂、Ｆａｂ’などが挙げられる。Ｆ
（ａｂ’）₂、Ｆａｂ’とは、イムノグロブリンを、蛋
白分解酵素（例えば、ペプシン又はパパイン等）で処理
することにより製造されるもので、ヒンジ領域中の２本
のＨ鎖間に存在するジスルフィド結合の前後で消化され
て生成される抗体断片である。さらに、本明細書で抗体
の断片と言う場合には、該抗体をコードする遺伝子由来
の抗原結合部位を含む蛋白質も包含するものとする。

【００１５】例えば、ＩｇＧ１をパパインで処理する
と、ヒンジ領域中の２本のＨ鎖間に存在するジスルフィ
ド結合の上流で切断されてＶL（Ｌ鎖可変領域）とＣL
（Ｌ鎖定常領域）からなるＬ鎖、及びＶH（Ｈ鎖可変領
域）とＣHγ1（Ｈ鎖定常領域中のγ1領域）とからなる
Ｈ鎖フラグメントがＣ末端領域でジスルフィド結合によ
り結合した相同な２つの抗体フラグメントを製造するこ
とができる。これら２つの相同な抗体フラグメントを各
々Ｆａｂ’という。またＩｇＧをペプシンで処理する
と、ヒンジ領域中の２本のＨ鎖間に存在するジスルフィ
ド結合の下流で切断されて前記２つのＦａｂ’がヒンジ
領域でつながったものよりやや大きい抗体フラグメント
を製造することができる。この抗体フラグメントをＦ
（ａｂ’）₂という。

【００１６】また、本発明のモノクローナル抗体は、固
相担体などの不溶性担体上に固定された固定化抗体とし
て使用したり、標識物質で標識した標識抗体として使用
することができる。このような固定化抗体や標識抗体は
全て本発明の範囲内である。

【００１７】固定化抗体とは、不溶性担体に物理的吸着
あるいは化学的結合等によって坦持された状態にある抗
体を言う。これらの固定化抗体は、試料（例えば、血漿
等の体液試料、培養上清あるいは遠心上清等）中に含ま
れる抗原（即ち、エボラウイルスの核タンパク質）を検
出、定量、分離または精製するために用いることができ
る。抗体を固定化するのに使用できる不溶性担体として
は、例えば、（１）ポリスチレン樹脂、ポリカーボネー
ト樹脂、シリコン樹脂あるいはナイロン樹脂等からなる
プラスチックや、ガラス等に代表されるような水に不溶
性の物質からなるプレート、試験管若しくはチューブ等
の内容積を有するもの、ビーズ、ボール、フィルター、
あるいはメンブレン等、並びに（２）セルロース系担
体、アガロース系担体、ポリアクリルアミド系担体、デ
キストラン系担体、ポリスチレン系担体、ポリビニルア
ルコール系担体、ポリアミノ酸系担体あるいは多孔性シ
リカ系担体等のようなアフィニティークロマトグラフィ
ーに用いられる不溶性担体を挙げることができる。

【００１８】標識抗体とは、標識物質で標識された抗体
を意味し、これらの標識抗体は、試料（例えば、血漿等
の体液試料、培養上清あるいは遠心上清等）中に含まれ
る抗原（即ち、エボラウイルスの核タンパク質）を検出
または定量するために用いることができる。本発明で用
いることができる標識物質は、抗体にに物理的結合又は
化学的結合等により結合させることによりそれらの存在
を検出可能にするものであれば特に限定されない。標識
物質の具体例としては、酵素、蛍光物質、化学発光物
質、ビオチン、アビジンあるいは放射性同位体等が挙げ
られ、より具体的には、ペルオキシダーゼ、アルカリフ
ォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコー
スオキシダーゼ、グルコ−ス−６−ホスフェートデヒド
ロゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵
素、ペニシリナーゼ、カタラーゼ、アポグルコースオキ
シダーゼ、ウレアーゼ、ルシフェラーゼ若しくはアセチ
ルコリンエステラーゼ等の酵素、フルオレスセインイソ
チオシアネート、フィコビリタンパク、希土類金属キレ
ート、ダンシルクロライド若しくはテトラメチルローダ
ミンイソチオシアネート等の蛍光物質、³Ｈ、¹⁴Ｃ、¹²⁵
Ｉ若しくは¹³¹Ｉ等の放射性同位体、ビオチン、アビジ
ン、または化学発光物質が挙げられる。標識物質と抗体
との結合法は、グルタルアルデヒド法、マレイミド法、
ピリジルジスルフィド法又は過ヨウ素酸法等の公知の方
法を用いることができる。

【００１９】ここで、放射性同位体及び蛍光物質は単独
で検出可能なシグナルをもたらすことができるが、酵
素、化学発光物質、ビオチン及びアビジンは、単独では
検出可能なシグナルをもたらすことができないため、さ
らに１種以上の他の物質と反応することにより検出可能
なシグナルを生じる。例えば、酵素の場合には少なくと
も基質が必要であり、酵素活性を測定する方法（比色
法、蛍光法、生物発光法あるいは化学発光法等）に依存
して種々の基質が用いられる。また、ビオチンの場合に
は少なくともアビジンあるいは酵素修飾アビジンを反応
させるのが一般的である。必要に応じてさらに該基質に
依存する種々の発色物質が用いられる。

【００２０】２．本発明のモノクローナル抗体を産生す
るハイブリドーマ 本発明は、上記したエボラウイルスの核タンパク質を認
識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマに
も関する。本発明のモノクローナル抗体は当該ハイブリ
ドーマを用いて製造することができる。以下、本発明の
エボラウイルスの核タンパク質を認識するモノクローナ
ル抗体を産生するハイブリドーマの作製方法を説明す
る。

【００２１】先ず、哺乳動物をエボラウイルスの核タン
パク質で免疫することによって、動物体内で抗体産生細
胞を調製する。哺乳動物の種類は特に限定されないが、
一般的にはマウス、ラット、ウシ、ウサギ、ヤギ、ヒツ
ジ等が挙げられ、好ましくはマウス、ラット、ウサギ等
のげっ歯類であり、より好ましくはマウスである。マウ
スの例として、Ａ／Ｊ系統、ＢＡＬＢ／Ｃ系統、ＤＢＡ
／２系統、Ｃ５７ＢＬ／６系統、Ｃ３Ｈ／Ｈｅ系統、Ｓ
ＪＬ系統、ＮＺＢ系統、ＣＢＡ／ＪＮＣｒｊ系統のマウ
スが挙げられる。ＢＡＬＢ／Ｃ系統のマウスは、ハイブ
リドーマ作製時に同系統の骨髄腫由来細胞株が確立して
いるので好ましい。

【００２２】免疫に用いるエボラウイルスの核タンパク
質（ＮＰ）は、天然のＮＰでも組み換え体ＮＰでもよ
く、化学合成したＮＰでもよく、またそれらの断片でも
よい。好ましくは、組み換え体のＮＰを用いる。免疫前
に、ＮＰは、免疫応答を増強させるためにアジュバント
と混合してもよい。アジュバントの例としては、油中水
型乳剤（例えば、不完全フロイントアジュバント）、水
中油中水型乳剤、水中油型乳剤、リポソーム、水酸化ア
ルミニウムゲル、シリカアジュバント、粉末ベントナイ
ト、およびタピオカアジュバントの他に、ＢＣＧ、Ｐｒ
ｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓなどの菌
体、細胞壁およびトレハロースダイコレート（ＴＤＭ）
などの菌体成分；グラム陰性菌の内毒素であるリポ多糖
体（ＬＰＳ）およびリピドＡ画分；β−グルカン（多糖
体）；ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）；ベスタチン；レ
バミゾールなどの合成化合物；胸腺ホルモン、胸腺ホル
モン液性因子およびタフトシンなどの生体成分由来のタ
ンパク質またはペプチド性物質；ならびにそれらの混合
物（例えば、完全フロイントアジュバント）などが挙げ
られる。これらのアジュバントは、投与経路、投与量、
投与時期などに依存して免疫応答の増強または抑制に効
果を示す。さらにアジュバントの種類によって、抗原に
対する血中抗体産生、細胞性免疫の誘導、免疫グロブリ
ンのクラスなどに差が認められる。それゆえ、目的とす
る免疫応答に応じて、アジュバントを適切に選択するこ
とが好ましい。アジュバンドによる処理方法は当該分野
で公知である。

【００２３】哺乳動物の免疫は、当該分野で公知の方法
に従って行われる。例えば、抗原であるＮＰは、哺乳動
物の皮下、皮内、静脈、または腹腔内に注射する。免疫
応答は、免疫される哺乳動物の種類および系統によって
異なるので、免疫スケジュールは、使用される動物に合
わせて適宜設定する。抗原投与は、最初の免疫後に、何
回か繰り返し行う。追加免疫は、例えば、最初の免疫か
ら４週間後、６週間後、および半年後に行うことができ
る。

【００２４】免疫後、哺乳動物から採血し、得られた血
液をＮＰ結合活性の存在についてアッセイすることによ
り、哺乳動物の体内でＮＰに対する抗体が産生されてい
ることを確認する。アッセイ法としては、酵素免疫測定
法（ＥＬＩＳＡ法）、放射免疫アッセイ法（ＲＩＡ）、
蛍光抗体法等の公知の方法が挙げられる。

【００２５】ＮＰ結合性抗体の産生を確認後、特異抗体
産生能のある免疫細胞を細胞融合に適した状態にするた
めに、ブースト（免疫原の追加注射）を行うことができ
る。ブーストで投与するＮＰの量は特には限定されない
が、最初に免疫したＮＰの量の約４〜５倍程度が好まし
い。ブーストは、一般的には、ＮＰと不完全フロイント
アジュバントとのエマルジョンを用いて行うことができ
る。投与経路は、皮下、皮内、静脈、または腹腔内等か
ら適宜選択される。

【００２６】最終免疫後、免疫した哺乳動物から脾臓細
胞を摘出し、骨髄腫由来の細胞株と細胞融合する。細胞
融合には、増殖能力の高い細胞株を用いることが好まし
く、また骨髄腫由来の細胞株は、融合する脾臓細胞の由
来する哺乳動物と適合性があることが好ましい。マウス
の骨髄腫由来の細胞株としては、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．
６５３、Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４、ＦＯ・１、Ｓ１９４／
５．ＸＸ０ ＢＵ．l、Ｐ３／ＮＳ１／１−Ａｇ４−１な
どが挙げられる。細胞融合は、当該分野で公知の方法に
従って行われる。細胞融合法の例として、例えば、ポリ
エチレングリコール法、センダイウイルスを用いた方
法、電流を利用する方法などが挙げられる。得られた融
合細胞は、当該分野で公知の条件に従って増殖させるこ
とができる。産生される抗体の結合能に基づいて、所望
の融合細胞を選択する。

【００２７】融合細胞から産生される抗体の結合能は、
当該分野で公知の方法に基づいてアッセイすることがで
きる。本発明においては、ＮＰに特異的かつ高い結合能
を有する抗体を産生する融合細胞を得るために、ＮＰに
対する結合能に基づく選別を利用して、目的の細胞株を
クローニングする。抗体の結合能は、抗体産生の確認に
関して上述したのと同様に、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、
蛍光抗体法などの方法を用いてアッセイすることができ
る。簡便で感度が高いことから、ＥＬＩＳＡ法が好まし
い。

【００２８】融合細胞のクローニングは、当該分野で公
知の方法を用いて行うことができる。クローニング法と
しては、限界希釈法、軟寒天法などが挙げられ、操作が
容易で再現性が高いことから、限界希釈法が好ましい。
細胞融合により得られた多くの融合細胞の中から、効率
よく有用な細胞を選択するために、細胞選別は、クロー
ニングの初期の段階から行うことが好ましい。このよう
にして、望ましい結合能を有する抗体を産生する融合細
胞株を最終的に選別することができる。

【００２９】上記のようにして選別されたモノクローナ
ル抗体産生細胞株を大量培養することにより、ＮＰに対
して特異的なモノクローナル抗体を大量に産生すること
ができる。モノクローナル抗体産生細胞株の大量培養方
法として、インビボおよびインビトロでの培養が挙げら
れる。インビボでの大量培養の例としては、哺乳動物の
腹腔内に融合細胞を注射して増殖させ、腹水中に抗体を
産生させる方法が挙げられる。インビトロでの培養で
は、融合細胞を培地中で培養し、抗体を培地中に産生さ
せる。

【００３０】大量培養により得られた腹水または培養上
清から、当該分野で公知の方法を用いて、本発明のモノ
クローナル抗体を精製することができる。精製のために
は、例えば、ＤＥＡＥ陰イオン交換クロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィー、硫安分画法、
ＰＥＧ分画法、エタノール分画法などが適宜組み合わせ
て用いられる。本発明の抗体は、好ましくは、約９０％
の純度、好ましくは約９５％の純度、より好ましくは約
９８％の純度となるように精製することができる。

【００３１】３．本発明のモノクローナル抗体を用いた
エボラウイルスの核タンパク質の検出及び／又は定量 本発明はさらに、本発明のモノクローナル抗体またはそ
の断片を用いて免疫アッセイを行うことを特徴とする、
エボラウイルスの核タンパク質の検出及び／又は定量の
ための方法にも関する。この方法は、好ましくは、少な
くとも下記（ａ）及び（ｂ）の工程を含む。 （ａ）本発明のモノクローナル抗体またはその断片と試
料とを反応させる工程；及び（ｂ）工程（１）で形成し
た抗原抗体複合体と、検出のための標識抗体とを反応さ
せる工程；

【００３２】本発明の検出及び／又は定量法は、抗体を
用いるアッセイ、即ち免疫アッセイであれば、いずれの
方法でもよく、例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳ
Ａ）、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、発
光免疫測定法、酵素抗体法、蛍光抗体法、免疫比濁法、
ラテックス凝集反応、ラテックス比濁法、赤血球凝集反
応、粒子凝集反応又はウエスタンブロット法等が挙げら
れる。

【００３３】本発明の検出及び／又は定量法に供される
試料としては、血液、血清、血漿、リンパ球培養上清、
尿、髄液、唾液、汗、腹水、羊水、又は細胞あるいは臓
器の抽出液等、エボラウイルスの核タンパク質が含まれ
る可能性のある生体試料であれば特に限定されない。本
発明の検出及び／又は定量法を酵素免疫測定法、蛍光免
疫測定法、放射免疫測定法又は発光免疫測定法等の標識
抗体を用いた免疫測定法により実施する場合には、サン
ドイッチ法又は競合法により行うこともでき、サンドイ
ッチ法の場合には固相化抗体及び標識抗体のうち少なく
とも１種が本発明のモノクローナル抗体であればよい。

【００３４】固相担体としては、固定化抗体に関連して
不溶性担体の具体例として本明細書中上記したものを使
用できる。また、標識物質も標識抗体に関連して本明細
書中上記したものを使用できる。

【００３５】測定の操作法は公知の方法（日本臨床病理
学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号 臨床検査のた
めのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行
会，１９８３年，石川榮治ら編「酵素免疫測定法」，第
３版，医学書院，１９８７年,北川常廣ら編「蛋白質核
酸酵素別冊Ｎｏ．３１ 酵素免疫測定法」，共立出版，
１９８７年）により行うことができる。例えば、固相化
抗体と試料を反応させ、同時に標識抗体を反応させる
か、又は洗浄の後に標識抗体を反応させて、固相化抗体
−抗原−標識抗体の複合体を形成させる。そして未結合
の標識抗体を洗浄分離して、結合標識抗体の量より試料
中の抗原量を測定することができる。具体的には、酵素
免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）の場合は標識酵素にその至適
条件下で基質を反応させ、その反応生成物の量を光学的
方法等により測定する。蛍光免疫測定法の場合には蛍光
物質標識による蛍光強度を、放射免疫測定法の場合には
放射性物質標識による放射線量を測定する。発光免疫測
定法の場合は発光反応系による発光量を測定する。

【００３６】本発明の検出及び／又は定量法を免疫比濁
法、ラテックス凝集反応、ラテックス比濁法、赤血球凝
集反応又は粒子凝集反応等の免疫複合体凝集物の生成
を、その透過光や散乱光を光学的方法により測るか、目
視的に測る測定法により実施する場合には、溶媒として
リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液又はグッ
ド緩衝液等を用いることができ、更にポリエチレングリ
コール等の反応促進剤や非特異的反応抑制剤を含ませて
もよい。

【００３７】抗体を固相担体に感作させて用いる場合に
は、固相担体としては、ポリスチレン、スチレン−ブタ
ジエン共重合体、（メタ）アクリル酸エステル類ポリマ
ー、ラテックス、ゼラチン、リポソーム、マイクロカプ
セル、赤血球、シリカ、アルミナ、カーボンブラック、
金属化合物、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よ
りなる粒子を使用することができる。

【００３８】この感作の方法としては、物理的吸着法、
化学的結合法又はこれらの方法の併用等の公知の方法を
使うことができる。測定の操作法は公知の方法により行
うことができるが、例えば、光学的方法により測定する
場合には、試料と抗体、又は試料と固相担体に感作させ
た抗体を反応させ、エンドポイント法又はレート法によ
り、透過光や散乱光を測定する。

【００３９】また、目視的に測定する場合には、プレー
トやマイクロタイタープレート等の容器中で、試料と固
相担体に感作させた抗体を反応させ、凝集の状態を目視
的に判定する。なお、目視的に測定する代わりにマイク
ロプレートリーダー等の機器を用いて測定を行ってもよ
い。

【００４０】４．本発明のモノクローナル抗体を用いる
エボラウイルスの核タンパク質の検出及び／又は定量の
ためのキット 本発明のキットは、本発明により提供されるエボラウイ
ルスの核タンパク質を認識するモノクローナル抗体また
はその断片を含むものである。ここで言うモノクローナ
ル抗体またはその断片としては、本明細書中上記した固
定化抗体とや標識抗体でもよい。例えば、本発明により
提供されるエボラウイルスの核タンパク質を認識するモ
ノクローナル抗体を一次抗体として使用する場合、本発
明のキットには、抗原抗体結合反応により形成された複
合体を検出するための二次抗体を含めてもよい。本発明
のキットには、該キットを効率的かつ簡便に利用できる
ようにするために、これら抗体以外に種々の補助剤を含
めてもよい。補助剤としては、例えば固体状の二次抗体
を溶解させるための溶解剤、不溶化担体を洗浄するため
に使用される洗浄剤、抗体の標識物質として酵素を使用
した場合に酵素活性を測定するための基質、その反応停
止剤などの免疫学的測定試薬のキットとして通常使用さ
れるものが挙げられる。以下の実施例により本発明を具
体的に説明するが、本発明は実施例によって限定される
ことはない。

【００４１】

【実施例】（Ａ）材料及び方法 （１）細胞培養 ハイブリドーマ、及びその親細胞株であるＰ３／Ａｇ５
６８は、１０％牛胎児血清（FBS）、非必須アミノ酸（G
ibco BRL）及び抗生物質（ストレプトマイシン及びペニ
シリン、Gibco BRL）を補充したRPMI1640（Gibco BRL）
で培養した。HATサプルメント（Gibco BRL）をハイブリ
ドーマの選択中に培地に添加した。Tn5細胞は、１０％F
BS、２％トリプトースホスフェートブロス（Difco）及
びカナマイシンを添加したTC100（Gibco BRL）で培養し
た。

【００４２】（２）組み換えＮＰ エボラウイルスザイール株の組み換え核タンパク質（ｒ
ＮＰ）をＮ末端にヒスチジンタグを付してバキュロウイ
ルス発現系により発現させた。即ち、ザイール株のｃＤ
ＮＡ断片の完全オープンリーディングフレーム（Sanche
z,A. 他 1989.The nucleoprotein gene of Ebola viru
s: cloning, sequencing, and in vitroexpression. V
irology. 170: 81-91）をＰＣＲで増幅し、ＮＰのＮ末
端にインフレームでヒスチジンタグを付加するｐＱＥ３
１プラスミド（Qiagen）に挿入した。次いで、ｃＤＮＡ
をヒスチジンタグごと、トランスファーベクター（ｐＡ
ｃＹＭ１）（Matsuura, Y. 他 1987. Baculovirus expr
ession vectors: the requirements for high level ex
pression of proteins, including glycoproteins. J.
Gen. Virol. 68: 1233-1250）に組み込んだ。組み換え
バキュロウイルスを、トランスファープラスミド及びウ
イルスＤＮＡの同時トランスフェクションによって生成
した。ｒＮＰをＮｉアガロース（Qiagen）によって組み
換えバキュロウイルスを感染させたＴｎ５細胞ライセー
トから精製した。タンパク質濃度をプロテインアッセイ
キット（Bio-Rad, Hercules, CA）によって測定した。
ＰＣＲ増幅後、ＮＰの異なる部分に相当するポリペプチ
ドを、ｐＧＥＸ２Ｔベクター（Amersham Pharmacia, Li
ttle Chalfont, U.K.）を用いて大腸菌中でＧＳＴとの
融合タンパク質として発現させた。この実験で用いたプ
ライマーを表1に示す。スーダン株及びレストン株の２
６アミノ酸を発現させるために、プライマーSNP8EF及び
SNP8ERまたはRNP8EF又はRNP8ERをアニーリングし、ＰＣ
Ｒ反応で埋め、ｐＧＥＸ２Ｔにクローニングした。より
長いペプチドを作成するために、これらの断片を連続す
るＰＣＲ反応によって順番に伸長させた。ヌクレオチド
配列を自動シークエンサー（Applied Biosystems. Fost
er City, CA）を用いて確認した。部分ＮＰポリペプチ
ドをグルタチオンセファロース４Ｂ（Amersham Pharmac
ia）を用いて精製した。

【００４３】

【表１】

【００４４】（３）ＥＬＩＳＡ マイクロウエルイムノプレート（Falcon, Franklin Lak
es, NJ）に、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中の１００ｎｇ／
ウエルの精製ｒＮＰ又は部分ＮＰを４℃で一晩コート
し、５％スキムミルクでブロッキングした。試料（１０
０μｌ）を各ウエルに添加し、結合した抗体を西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ（HRPO）標識抗マウスＩｇＧ（Zyme
d, San Francisco, CA）及びＡＢＴＳ基質溶液（Boehri
nger Mannheim, Germany）により検出した。

【００４５】（４）モノクローナル抗体の樹立 ＢＡＬＢ／ｃマウスに精製ｒＮＰを３又は４回免疫し
た。最後の免疫の３日後に脾臓細胞を採取し、ＰＥＧ
（Gibco BRL）によりＰ３／Ａｇ５６８細胞に融合し
た。ハイブリドーマ細胞の培養上清を抗原として精製ｒ
ＮＰを用いてＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。モ
ノクローナル抗体をMAb Trap GII抗体精製キット（Amer
sham Pharmacia）を用いて培養上清から精製した。モノ
クローナル抗体のアイソタイプはマウスモノクローナル
抗体アイソタイピングキット（Gibco BRL）を用いて決
定した。

【００４６】（５）ポリクローナル抗体 ウサギポリクローナル抗体は、アルミニウムアジュバン
ド（Pierce, Rockford, IL）中に乳化した精製ｒＮＰを
皮下注射することによって作製した。この抗血清の力価
は、抗原としてｒＮＰ発現細胞を用いる免疫蛍光アッセ
イにおいて、＞１：１０，０００であった。

【００４７】（６）抗原捕捉ＥＬＩＳＡ 精製したモノクローナル抗体を室温で２時間、１００μ
ｌのＰＢＳ中において１００ｎｇ／ウエルの濃度でマイ
クロウエルイムノプレート（Falcon）にコートした後、
ＰＢＳ中の５％スキムミルクで室温で１時間ブロッキン
グした。プレートを０．５％Tween 20を含有するＰＢＳ
（ＰＢＳＴ）で洗浄した後、１００μｌのｒＮＰ含有試
料又は臨床試料を添加し、室温で１時間インキュベート
した。プレートをＰＢＳＴで洗浄し、０．５％スキムミ
ルク中に１：１０００に希釈した１００μｌのウサギポ
リクローナル抗体を各ウエルに添加した。室温で１時間
インキュベートした後、プレートをＰＢＳＴで洗浄し、
HRPO標識抗ウサギＩｇＧ（Zymed）を添加した。プレー
トを室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴでさら
に洗浄後、１００μｌのＡＢＴＳ基質溶液（Boehringe
r）を添加し、室温で30分間インキュベーションした
後、光学濃度（ＯＤ）を４０５ｎｍで測定した。

【００４８】（７）臨床試料 フィリピンでエボラウイルスレストン株に天然で感染し
たカニクイザル（Macaca fascicularis）由来の組織お
よび血清を臨床試料として使用した。これらの試料は−
８０℃又は液体窒素中で保管した。これらの動物におけ
るレストン感染の状態は既に確立している（Miranda,
M.E. 他 1999. Epidemiology of Ebola(Subtype Resto
n) virus in the Philippines, 1996. J. Infect. Di
s. 179 Suppl. 1: S115-119）。肝臓及び脾臓組織（約
１０％ｗ／ｖｏｌ）を、0.05% Tween20，1% Triton X10
0及び5%スキムミルクを含むＰＢＳ中でホモジナイズし
た。遠心後、上清を出発物質として使用した。血清は１
％Tritonを添加して不活化し、５％スキムミルク中に希
釈した。

【００４９】（８）ウエスタンブロット SDS-PAGE及びウエスタンブロット分析は、１０％アクリ
ルアミドゲル及びImmobilon ナイロンメンブレン（Mili
pore, Bedford, MA）を用いて行った。モノクローナル
抗体を含有する腹水液を１：１０００に希釈して使用し
た。結合した抗体は、HRPO標識抗マウスＩｇＧ（Zyme
d）およびＰＯＤ基質（和光純薬）を用いて検出した。
ＧＳＴに対するポリクローナル抗体はAmersham Pharmac
iaから購入した。

【００５０】（Ｂ）結果 （１）モノクローナル抗体の樹立 ｒＮＰ反応性ＩｇＧ抗体を分泌する１２のハイブリドー
マ株を樹立した。これらの抗体を精製後、抗原捕捉ＥＬ
ＩＳＡで試験した。図１に示すように、２つの抗体３−
３Ｄ及び２−１１Ｇがこの試験では反応性であった。他
のモノクローナル抗体は、ｒＮＰの濃度を上げても、抗
体３−３Ｄ及び２−１１Ｇのような特異的反応を示さな
かった。抗体３−３Ｄ及び２−１１Ｇのアイソタイプは
ＩｇＧ１であった。なお、抗体３−３Ｄを産生するハイ
ブリドーマは、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８２７９とし
て、平成１３年３月２８日付けで経済産業省 産業技術
総合研究所生命工学工業技術研究所 特許微生物寄託セ
ンター（日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に寄
託されている。

【００５１】（２）抗原捕捉ＥＬＩＳＡ 抗体３−３Ｄ及び２−１１Ｇを用いる抗原捕捉ＥＬＩＳ
Ａの感度を調べた。このＥＬＩＳＡで検出できたｒＮＰ
の最小量はいずれの抗体でも、約３３ｎｇ／ウエルであ
った（図１）。天然のＮＰと抗体３−３Ｄ及び２−１１
Ｇとの反応性を確認するために、エボラウイルスレスト
ン株に感染したサルからの臨床試料を使用した。図２に
示す通り、抗体３−３Ｄを用いる抗原捕捉ＥＬＩＳＡに
よりレストン陽性組織（Ａ）及び血清（Ｂ）試料におい
てエボラＮＰを検出することができた。２つの動物から
の２つの肝臓試料（肝臓1及び肝臓２）において、１：
１６０又は１：３２０の希釈倍率まで陽性反応が示され
た。脾臓試料は１：１６０の希釈倍率まで陽性反応を示
し、血清試料は１：１６０の希釈倍率まで陽性であっ
た。未感染のサル由来の同様に処理した組織において
は、組織試料では１：１０、血清試料では１：２０とい
う低い希釈倍率においても結果は陰性であった。これら
の結果は、抗体３−３Ｄを使用する抗原捕捉ＥＬＩＳＡ
法は感度が高く、エボラウイルスレストンに感染したサ
ル由来の臨床試料に応用できることを示している。

【００５２】（３）モノクローナル抗体３−３Ｄのエピ
トープマッピング モノクローナル抗体３−３Ｄを用いたＥＬＩＳＡ法が、
レストン株及びサイール株以外のエボラウイルスのＮＰ
の場合にも適用可能かどうかを調べるために、モノクロ
ーナル抗体３−３Ｄによって認識されるエピトープのマ
ッピングを行った。ザイール株ＮＰの全アミノ酸配列を
包含するように各々約100アミノ酸から成る8個のオーバ
ーラップするペプチドを作成した。モノクローナル抗体
３−３Ｄは、ウエスタンブロット及びＥＬＩＳＡにおい
て631から739番目のアミノ酸残基に対応するペプチドと
反応性を示した。最小のエピトープを特定するために、
抗体の認識に必要なＣ末端のアミノ酸残基をまず決定し
た。図３Ａに示す通り、ウエスタンブロットで十分な反
応性を示すためには、673番目のアミノ酸は必要であっ
た。十分な反応性を示すためには、Ｃ末端の673番目の
アミノ酸から始まって上流の26アミノ酸が必要であり、
23アミノ酸では反応は弱かった（図３Ｂ）。これらの結
果は、モノクローナル抗体３−３ＤはＮＰの648番目か
ら673番目のアミノ酸から成る２６アミノ酸によって形
成される立体エピトープを認識していることを示す。

【００５３】（４）モノクローナル抗体３−３Ｄとエボ
ラウイルスの他の株との交差反応性ザイール株において
抗体の認識に必要であった２６アミノ酸を含むＣ末端の
１０９アミノ酸（ザイール株及びレストン株）又は１０
６アミノ酸（スーダン株）から成る長いペプチドで試験
した場合、モノクローナル抗体３−３Ｄはウエスタンブ
ロット及びＥＬＩＳＡ（図４）でこれら３種のペプチド
と反応した。これらの結果は、モノクローナル抗体３−
３Ｄを用いるＥＬＩＳＡは、スーダン株、ザイール株お
よびレストン株のＮＰを検出できることを示す。

【００５４】

【発明の効果】本発明のモノクローナル抗体は、エボラ
ウイルスを特異的に認識することができる。また、本発
明のモノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ法により血
清及び臓器中のエボラウイルスを特異的に検出する方法
が提供される。また、本発明のＥＬＩＳＡシステムで
は、臨床試料以外には生ウイルスは含まれていないの
で、高度のセキュリティー封じ込めが不要であり、通常
の実験室で本システムを再生産することができ、非感染
性組み換えタンパク質により調製することができる二次
ポリクローナル抗体を入手することも可能である。

【００５５】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Kokuritsu Kansensyo Kenkyusyocho <120> A monoclonal antibody recognizing Ebola virus <130> A11166A <160> 26

【００５６】 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Synthetic DNA <400> 1 caaggatccg agtatggatt ctcg 24

【００５７】 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Synthetic DNA <400> 2 atggatccat gctcattcac tgat 24

【００５８】 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Synthetic DNA <400> 3 ccgggatcca ctcaagaggc ca 22

【００５９】 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Synthetic DNA <400> 4 tgcgaattca ctgatgatgt tgc 23

【００６０】 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Synthetic DNA <400> 5 aaaagaattc actcatcctt catca 25

【００６１】 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Synthetic DNA <400> 6 ctagaattca atccttcatc atatgataat 30

【００６２】 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Synthetic DNA <400> 7 caggaattca cttcatcata tgataatac 29

【００６３】 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Synthetic DNA <400> 8 ctgaattcac atcatatgat aatacaaaac 30

【００６４】 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Synthetic DNA <400> 9 ggatccatgt atcgccacat tc

【００６５】 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Synthetic DNA <400> 10 ggatccgaga tgtatcgcca c 21

【００６６】 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Synthetic DNA <400> 11 ggatccgagg agatgtatcg c 21

【００６７】 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Synthetic DNA <400> 12 ggatcctttg aggagatg 18

【００６８】 <210> 13 <211> 55 <212> DNA <213> Synthetic DNA <400> 18 cgcggatccc tagaagaaac atattatcat ctcctaaaaa cacagggtcc atttg 55

【００６９】 <210> 14 <211> 57 <212> DNA <213> Synthetic DNA <400> 14 gctgaattca atcactcatt aggtgataat aattgattgc ctcaaatgga ccctgtg 57

【００７０】 <210> 15 <211> 55 <212> DNA <213> Synthetic DNA <400> 15 cgcggatcct taggagagac atatcaccat ctgctgagaa ctcaaggtcc atttg 55

【００７１】 <210> 16 <211> 57 <212> DNA <213> Synthetic DNA <400> 16 gctgaattca atccttcatc atgtgataat aattgatagc ttcaaatgga ccttgag 57

【００７２】 <210> 17 <211> 58 <212> DNA <213> Synthetic DNA <400> 17 ggatccctcc caatcaactc taaaaagagt tccgcactag aagaaacata ttatcatc 58

【００７３】 <210> 18 <211> 62 <212> DNA <213> Synthetic DNA <400> 18 gaattcagcc actttcagtg ctaaaagcaa tgggttcatc actcattagg tgataataat 60 tg

【００７４】 <210> 19 <211> 37 <212> DNA <213> Synthetic DNA <400> 19 ggatcctctg aaagtgaagc tctcccaatc aactcta 37

【００７５】 <210> 20 <211> 40 <212> DNA <213> Synthetic DNA <400> 20 gaattctcaa agatatattc cttgccactt tcagtgctaa 40

【００７６】 <210> 21 <211> 40 <212> DNA <213> Synthetic DNA <400> 21 gaattcattc aagggagtct ggaaagatat attccttgcc 40

【００７７】 <210> 22 <211> 73 <212> DNA <213> Synthetic DNA <400> 22 gaattcactt ctctaaggcc tccttctcac tcaaccacgg cgggtaggct tcttcaaggg 60 agtctggaaa gat 73

【００７８】 <210> 23 <211> 73 <212> DNA <213> Synthetic DNA <400> 23 gaattcatac cggccagagg aattgctggc catcaatgac cagataacga ttttccttct 60 ctaaggcctc ctt 73

【００７９】 <210> 24 <211> 67 <212> DNA <213> Synthetic DNA <400> 24 gaattcagtc atgttgaaga acggcaagga acttgtcccg taggctcatt accggccaga 60 ggaattg 67

【００８０】 <210> 25 <211> 28 <212> DNA <213> Synthetic DNA <400> 25 gctggatcct cacaattgaa tgaagacc 28

【００８１】 <210> 26 <211> 27 <212> DNA <213> Synthetic DNA <400> 26 gtggaattct tactgatggt gctgcaa 27

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、抗原捕捉ＥＬＩＳＡでの各モノクロー
ナル抗体の反応性を示す図である。精製モノクローナル
抗体（●；３−３Ｄ、■；２−１１Ｇ、△；２−１Ｇ、
×；３−３Ｄ）を１００ｎｇ／ウエルの濃度でマイクロ
プレートにコートし、ｒＮＰの捕捉能を、抗原捕捉ＥＬ
ＩＳＡでｒＮＰの量を変化させて調べた。

【図２】図２は、抗原捕捉ＥＬＩＳＡでのレストン株に
感染した臨床試料の反応性を示す図である。 （Ａ）２頭の感染したサルからの２種の肝臓（◆及び
●）及び脾臓（▲）を捕捉ＥＬＩＳＡで調べた。未感染
のサルからの肝臓（×）及び脾臓（□）を使用して反応
の特性を示す。 （Ｂ）感染（■）及び２頭の未感染（○及び△）のサル
からの血清を捕捉ＥＬＩＳＡで調べた。

【図３】図３は、ウエスタンブロットによるモノクロー
ナル抗体３−３Ｄのエピトープのマッピングを示す。 （Ａ）各々ＮＰ（ザイール株）のアミノ酸位置６３１−
６７１、６７２、６７３又は６７４に対応するＧＳＴ融
合ペプチドを含む細菌ライセートを、モノクローナル抗
体３−３Ｄとの反応性について調べた。 （Ｂ）各々ＮＰ（ザイール株）のアミノ酸位置６４８、
６４９、６５０及び６５１から６７３に対応するＧＳＴ
融合ペプチドを含む細菌ライセートを、モノクローナル
抗体３−３Ｄとの反応性について調べた。各融合ペプチ
ドの同様の発現レベルを示すために、同時に同様に調製
した膜を抗ＧＳＴ抗体で染色した。

【図４】図４は、エボラウイルスの３種の株由来のＮＰ
上のエピトープ領域に対するモノクローナル抗体３−３
Ｄの反応性を示す図である。ザイール株（■）及びレス
トン株（●）のアミノ酸位置６３１−７３９、又はスー
ダン株（▲）のアミノ酸位置６３３−７３８に対応する
ＧＳＴ融合ペプチド（１００ｎｇ／ウエル）をマイクロ
プレートにコートし、ＥＬＩＳＡにおいてモノクローナ
ル抗体３−３Ｄとの反応性について調べた。無関係のＧ
ＳＴ融合ペプチド（◇）を陰性コントロールとして用い
た。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者 池上 徹郎 東京都武蔵村山市学園４−７−１ 国立感 染症研究所ウイルス第１部外来性ウイルス 室 (72)発明者 西條 政幸 東京都武蔵村山市学園４−７−１ 国立感 染症研究所ウイルス第１部外来性ウイルス 室 (72)発明者 森川 茂 東京都武蔵村山市学園４−７−１ 国立感 染症研究所ウイルス第１部外来性ウイルス 室 (72)発明者 倉根 一郎 東京都新宿区戸山１−23−１ 国立感染症 研究所ウイルス第１部 Ｆターム(参考） 4B024 AA14 BA32 GA03 HA15 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA15 4B065 AA91X AB05 BA08 CA25 CA46 4H045 AA11 AA30 CA01 DA76 EA52 FA72

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 エボラウイルスの核タンパク質を認識す
   るモノクローナル抗体またはその断片。
2. 【請求項２】 エボラウイルスのザイール株、スーダン
   株およびレストン株の核タンパク質を認識する、請求項
   １に記載のモノクローナル抗体またはその断片。
3. 【請求項３】 エボラウイルスザイール株の核タンパク
   質の631から739番目のアミノ酸から成るエピトープを認
   識する、請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体ま
   たはその断片。
4. 【請求項４】 エボラウイルスザイール株の核タンパク
   質の648番目から673番目のアミノ酸から成る２６アミノ
   酸から成るエピトープを認識する、請求項１から３の何
   れかに記載のモノクローナル抗体またはその断片。
5. 【請求項５】 受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８２７９を有
   するハイブリドーマが産生する、モノクローナル抗体ま
   たはその断片。
6. 【請求項６】 請求項１から５の何れかに記載のモノク
   ローナル抗体またはその断片をコードする遺伝子。
7. 【請求項７】 請求項１から５の何れかに記載のモノク
   ローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
8. 【請求項８】 エボラウイルスの核タンパク質を含む免
   疫原で免疫された哺乳動物の免疫細胞と哺乳動物のミエ
   ローマ細胞とを融合して得られる、請求項７に記載のハ
   イブリドーマ。
9. 【請求項９】 受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８２７９を有
   するハイブリドーマ。
10. 【請求項１０】 請求項７から９の何れかに記載のハ
    イブリドーマを培養する工程、及び該ハイブリドーマが
    産生するモノクローナル抗体を採取する工程を含む、請
    求項１から５の何れかに記載のモノクローナル抗体の製
    造方法。
11. 【請求項１１】 請求項１から５の何れかに記載のモノ
    クローナル抗体またはその断片を用いて免疫アッセイを
    行うことを特徴とする、エボラウイルスの核タンパク質
    の検出及び／又は定量のための方法。
12. 【請求項１２】 少なくとも下記（ａ）及び（ｂ）の工
    程を含む、請求項１０に記載のエボラウイルスの核タン
    パク質の検出及び／又は定量のための方法。 （ａ）請求項１から５の何れかに記載のモノクローナル
    抗体またはその断片と試料とを反応させる工程；及び （ｂ）工程（１）で形成した抗原抗体複合体と、検出の
    ための標識抗体とを反応させる工程；
13. 【請求項１３】 請求項１から５の何れかに記載のモノ
    クローナル抗体を含むことを特徴とする、エボラウイル
    スの核タンパク質の検出及び／又は定量のためのキッ
    ト。