【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物が形成するバイオフィルムの形成抑制効果、分解促進効果に優れ、バイオフィルムが原因となり引き起こされるう蝕、口臭、歯周疾患等の予防に有効な口腔用組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
微生物は自然界でいわゆるバイオフィルムを形成して環境に適応し、病原性を発揮しており、バイオフィルムの形成が原因で各種疾病が引き起こされることが明らかになっており、歯周疾患等の疾病の予防にバイオフィルム抑制が有効であるとして注目されている。
【０００３】
細菌が産生するバイオフィルムの抑制剤として、従来から抗生物質や抗菌、殺菌剤は多数が知られている。また、バイオフィルム中の構造物である菌体外マトリックスを形成する多糖類の分解酵素等も利用されている。しかし、抗生物質は耐性菌出現の問題などで利用分野が限定されており、抗菌、殺菌剤は多くが化学合成品であり、人体への使用や食品への配合、また環境中への放出等を考慮すると好ましくないものが多い。また、酵素類に関しては、安定化が難しく配合に限定が生じてしまうことや、反応特異性の高さから有効性が限定されるという問題点があった。
【０００４】
一方、細菌由来のバイオフィルム抑制物質として、ホモセリンラクトン誘導体をはじめとする油溶性物質等の海洋微生物や病原微生物由来物質（特許文献１：特表２００２−５１４０９２号公報、非特許文献１：Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｑｕｏｒｕｍ−ｓｅｎｓｉｎｇ ｓｉｇｎａｌ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｂｏｌｏｎ：Ｎａｔｕｒｅ，４１５，５４５−５４９，２００２参照）、発酵工業で利用されている乳酸菌由来物質（特許文献２：特表２００２−５２２４６４号公報、特許文献３：特開２００２−２３４８２５号公報参照）が知られている。
【０００５】
また、ストレプトマイセス属に属する微生物（土壌放線菌）が産生する虫歯菌細胞溶解酵素を配合した口腔用組成物（特許文献４：特開昭４９−７４３９号公報参照）、ストレプトコッカス属の菌の変異株由来の蛋白質抗菌性物質を配合した口腔衛生用組成物（特許文献５：特開昭５２−４４２４６号公報参照）が提案されている。
【０００６】
しかしながら、上記細菌由来のバイオフィルム抑制物質は、抗生物質等に比較して安全性が高いものではあるが、より安全性が高く、更に優れたバイオフィルム抑制効果を安定に発揮し、口腔疾患の予防に有効な口腔用組成物が望まれる。
【０００７】
【特許文献１】
特表２００２−５１４０９２号公報
【特許文献２】
特表２００２−５２２４６４号公報
【特許文献３】
特開２００２−２３４８２５号公報
【特許文献４】
特開昭４９−７４３９号公報
【特許文献５】
特開昭５２−４４２４６号公報
【非特許文献１】
Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｑｕｏｒｕｍ−ｓｅｎｓｉｎｇ ｓｉｇｎａｌｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｂｏｌｏｎ：Ｎａｔｕｒｅ，４１５，５４５−５４９，２００２
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記事情に鑑みなされたもので、安全性が高く、優れたバイオフィルム抑制作用を示し、バイオフィルムが原因となる疾患の予防効果に優れた口腔用組成物を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段及び発明の実施の形態】
本発明者は、上記目的を達成するため、バイオフィルム抑制剤について鋭意検討した結果、口腔細菌が産生する菌体外水溶性低分子物質にバイオフィルム形成抑制効果や分解促進効果などの、バイオフィルム抑制作用があり、かかる菌体外水溶性低分子物質を配合した口腔用組成物が、バイオフィルム形成が原因となって生じる歯垢形成等を防止し得て、バイオフィルムが原因となるう蝕予防、口臭予防、歯周疾患予防に有用であることを見出した。
【００１０】
即ち、本出願人は、口腔細菌である歯垢構成微生物の培養上清より有機溶媒抽出される分子量５，０００以下の物質が細菌間情報伝達機構を制御し、この物質を配合した口腔用組成物が歯垢抑制に有効であることを提案した（特願２００１−３２１７８５号参照）。本発明者は、ヒト口腔内に生息する口腔細菌が産生する菌体外物質について更に検討を重ねた結果、ヒト口腔内に生息する口腔細菌が産生する菌体外物質のバイオフィルム形成抑制効果や分解促進効果などのバイオフィルム抑制作用が、その菌体外物質における通常酵素活性などが期待される高分子画分ではなく、低分子画分にあり、更にこの低分子画分の水溶性画分に活性があることを突き止め、この菌体外水溶性低分子物質を口腔用組成物に配合することにより、より安全性が高く、更に優れたバイオフィルム抑制作用を安定に発揮する口腔用組成物が得られることを知見し、本発明をなすに至った。
【００１１】
なお、本発明にかかわる菌体外水溶性低分子物質は口腔細菌由来であることを特徴とし、特許文献１や非特許文献１で言及されている海洋微生物や病原微生物、特許文献２，３のような発酵工業で利用されている乳酸菌や、特許文献４の土壌放線菌、特許文献５の特定の変異株由来物質とは根本的に異なり、口腔細菌由来で水溶性低分子物質であり、微生物によるバイオフィルム形成を抑制できる点において前述の技術とは全く異なる。なお、特許文献４の酵素と同等物質の分子量が２万以上であることも公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｅｉｋａｇａｋｕ−ｈｉｔ．ｃｏｍ／ｓｅｉｋａｇａｋｕ／ｐｒｏ／ｐｒｏ＿０８．ｈｔｍｌ参照）。
【００１２】
従って、本発明は、口腔細菌の菌体外水溶性低分子物質を含有してなることを特徴とする口腔用組成物を提供する。
【００１３】
以下、本発明について更に詳細に説明する。本発明の口腔用組成物に配合される口腔細菌の菌体外水溶性低分子物質は、口腔細菌の培養上清より得られるものである。ここで、本発明に利用される口腔細菌としては、通常、口腔細菌として分類されている口腔内分離細菌種を用いることができるが、例えばストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ），アクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙ ｃｅｓ），ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ），ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ），フゾバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ），ベイヨネラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ），ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ），アクチノバシラス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ），ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ），プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ），バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ），トレポネマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）等の属から選ばれる細菌が好適に使用される。
【００１４】
本発明組成物には、これら細菌の１種又は２種以上の細菌由来の低分子水溶性物質を配合することができる。低分子物質の採取法は通常用いられている方法でよいが、例えば細菌の培養液から濾過又は遠心分離で菌体を除去したものを出発物質とし、限外濾過、透析、塩析や、イオン交換、疎水性相互作用、逆相などの各種カラムクロマトグラフィーなどを単独又は組み合わせて分画できる。
【００１５】
例えば、これら口腔細菌の培養上清は、通常使用される培地で対数増殖期から定常期まで培養した後、培養上清を０．２２μｍのフィルター等で濾過、あるいは遠心分離することにより、混在する菌体を完全に除去したものを用いることができる。更に、通常は混在する培地由来物質及び微生物が産生する高分子物質を必要に応じて除去し、更に精製したものが好適に使用できる。
【００１６】
即ち、培養上清からの高分子物質の除去法としては、凍結乾燥後、ゲル濾過あるいは限外濾過を好適に使用することができ、目的物質の抽出、脱塩法としてはイオン交換クロマト、疎水クロマト、溶媒抽出を適宜組み合わせて行うことができる。なお、ここで目的物質の抽出に用いることができる溶媒は、蒸留水等の水溶性溶媒である。
【００１７】
本発明における菌体外水溶性低分子物質は、このようにして培養上清から得られる分子量１万以下、特に８００〜８，０００のものであることが好ましい。分子量が大きすぎると十分な配合効果が得られない場合がある。
【００１８】
本発明の口腔用組成物は、練歯磨等の歯磨剤、洗口剤、マウスウォッシュ、口腔用パスタ、歯肉マッサージクリーム、トローチ剤、チューイングガム、タブレット、カプセル等の様々な剤型に応用することが可能である。本発明の組成物における上記菌体外水溶性低分子物質の配合量は、組成物全体の０．０００１〜１０％（質量百分率、以下同様）、特に０．００１〜２％が好ましい。配合量が少なすぎると満足な配合効果が得られない場合があり、多すぎると製剤の着色・変色の原因となる場合がある。
【００１９】
この場合、本発明の口腔用組成物は、上述した成分以外にも通常の口腔用組成物に使用される各種基剤成分を配合することができる。例えば、各種研磨剤、粘稠剤、粘結剤、界面活性剤、甘味剤、香料、着色剤、防腐剤、更には殺菌剤、酵素、抗炎症剤、フッ素等の公知の有効成分などを本発明の効果を妨げない範囲で配合できる。
【００２０】
研磨剤としては、沈降性シリカ、シリカゲル、アルミノシリケート、ジルコノシリケート等のシリカ系研磨剤、第２リン酸カルシウム・２水和物及び無水物、ピロリン酸カルシウム、炭酸カルシウム、水酸化アルミニウム、アルミナ、炭酸マグネシウム、第３リン酸マグネシウム、不溶性メタリン酸ナトリウム、不溶性メタリン酸カリウム、酸化チタン、ゼオライト、ケイ酸アルミニウム、ケイ酸ジルコニウム、合成樹脂系研磨剤等が挙げられる。
【００２１】
粘稠剤としては、グリセリン、ソルビトール、キシリトール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等が挙げられる。
【００２２】
粘結剤としては、カラギーナン、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸プロピレングリコール、キサンタンガム、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸ナトリウム、カルボキシビニルポリマー、トラガントガム、グアガム、ローカストビーンガム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ジェランガム、ゼラチン、カードラン、アラビアガム、寒天、ペクチン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、プルラン等が挙げられる。
【００２３】
界面活性剤としては、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤等が挙げられ、具体的にはラウリル硫酸ナトリウム、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム、α−オレフィンスルホン酸ナトリウム、Ｎ−アシルグルタメート、２−アルキル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン、Ｎ−アシルタウレート、ショ糖脂肪酸エステル、アルキロールアマイド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリグリセリン脂肪酸エステル、プルロニック、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート等が挙げられる。
【００２４】
甘味剤としては、サッカリンナトリウム、ステビオサイド、ステビアエキス、パラメトキシシンナミックアルデヒド、ネオヘスペリジルジヒドロカルコン、ペリラルチン等が挙げられる。
【００２５】
香料としては、ｌ−メントール、カルボン、アネトール、リモネン等のテルペン類又はその誘導体などが挙げられる。着色剤としては、青色１号、黄色４号、二酸化チタン等が挙げられる。
【００２６】
更に、本発明には、クロルヘキシジン、塩化ベンゼトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化デカリニウム等の陽イオン性殺菌剤、トリクロサン、ヒノキチオール、イソプロピルメチルフェノール等のフェノール性化合物、デキストラナーゼ、ムタナーゼ、リゾチーム、アミラーゼ、プロテアーゼ、溶菌酵素、スーパーオキシドディムスターゼ（ＳＯＤ）等の酵素、モノフルオロリン酸ナトリウム、モノフルオロリン酸カリウムなどのアルカリ金属モノフルオロフォスフェート、フッ化ナトリウム、フッ化第一錫などのフッ化物、トラネキサム酸、イプシロンアミノカプロン酸、アラントイン、ジヒドロコレスタノール、グリチルリチン酸類、グリチルレチン酸、グリセロフォスフェート、クロロフィル、塩化ナトリウム、塩化亜鉛、水溶性無機リン酸化合物、ビタミンＡ、ビタミンＢ群、ビタミンＣ、ビタミンＥ等のビタミン類及びそれらの誘導体等、公知の有効成分を１種又は２種以上併用することができる。
【００２７】
【発明の効果】
本発明の口腔用組成物は、微生物が形成するバイオフィルム抑制作用に優れ、バイオフィルムが原因となり引き起こされるう蝕、口臭、歯周疾患等の予防に有効なものである。
【００２８】
【実施例】
以下、実験例及び実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。
【００２９】
［実験例１］
細菌低分子画分のバイオフィルム傷害効果：
ストレプトコッカス ソブライナス ６７１５株（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ ６７１５株）を１％ショ糖を含むトッドヒューイット培地（Ｔｏｄｄ Ｈｅｗｉｔｔ ｂｒｏｔｈ：Ｄｉｆｃｏ社製）１ｍｌでガラス試験管を斜めにして一晩嫌気培養し、試験管壁面にバイオフィルムを形成させた。このバイオフィルムに対して、下記方法で調製された５種類の口腔細菌の低分子画分（分子量１万以下）、高分子画分（分子量１万超）を画分の採取培養時の濃度換算で５倍濃度となるように添加し、一晩作用させた。作用後、試験管を試験管ミキサー「ボルテックスジェニーＩＩ（商標登録）」の撹拌力最大目盛で５秒間撹拌し、撹拌後に試験管壁に残る強固に付着したバイオフィルムの量を測定した。また、対照として生理食塩水を用いた場合のバイオフィルム量を同様に測定した。なお、バイオフィルム量の測定は、バイオフィルムに直接物理的刺激が加わらないように試験管を蒸留水１ｍｌで２回洗浄後、３ｍｌの蒸留水を加えてから超音波処理装置で均一に分散した後、分光光度計で５５０ｎｍの吸光度を測定することで行った。各細菌画分のバイオフィルム残存量を図１に示す。
【００３０】
口腔細菌の低分子画分の調製：
低分子画分の由来細菌として、
（ｉ）ストレプトコッカス サンギニス ＡＴＣＣ１０５５６
（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｉｓ ＡＴＣＣ１０５５６）
（ｉｉ）ストレプトコッカス ミュータンス ＡＴＣＣ２５１７５
（Ｓｔｒｅｐｔｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ ＡＴＣＣ２５１７５）
（ｉｉｉ）アクチノマイセス ナエスランディ ＡＴＣＣ５１６５５
（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ ＡＴＣＣ５１６５５）
（ｉｖ）ベイヨネラ パルビュラ ＡＴＣＣ１７７４５
（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ ｐａｒｖｕｌａ ＡＴＣＣ１７７４５）
（ｖ）フゾバクテリウム ヌクレアタム ＡＴＣＣ１０９５
（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ ＡＴＣＣ１０９５）
を使用し、これらの菌をそれぞれトッドヒューイット培地（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａのみ同培地に乳酸ナトリウムを１．５％添加）で培養後、遠心分離にて除菌した培養上清を、酸性を示したものについては１Ｍ ＮａＯＨで中和し、排除分子量１万の限外濾過膜を用いて濾過して、低分子画分と高分子画分に分画した。得られた低分子画分は凍結乾燥し、実験時に適宜濃度となるように蒸留水に再溶解して用いた。また、高分子画分は比較品として用いた。
【００３１】
上記実験の結果、高分子画分ではバイオフィルム残存量が対照（生理食塩水作用）と変わらなかったのに対し、低分子画分ではバイオフィルム残存量が低下した（図１）。
【００３２】
細菌低分子画分の油−水分配後のバイオフィルム障害効果：
上記細菌画分のそれぞれを画分採取培養時の濃度換算で１５倍濃度となるよう蒸留水４ｍｌに溶解後、ジクロロメタンを２ｍｌ添加、撹拌し、油−水分配を行った。油相の画分は減圧乾燥した後にジメチルホルムアミド０．２ｍｌで溶解してから蒸留水で４ｍｌとした。これら油相と水相をそれぞれ上記試験と同様の方法でＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓが産生したバイオフィルムに作用させ、上記と同様にバイオフィルム残存量を測定した。結果を図２に示す。
【００３３】
図２の結果より、口腔細菌由来の菌体外低分子水溶性画分を添加することにより、試験管ミキサーによる水流程度の力でそれまで除去できなかったバイオフィルムが除去されるようになり、上記菌体外低分子水溶性画分にバイオフィルム傷害性があることが示された。
【００３４】
次に、上記と同様の方法で作製した各細菌由来の低分子画分（分子量１万以下）、更には、各低分子画分を常法により精製して得られた低分子物質を使用して、下記組成の口腔用組成物を常法により調製した。なお、下記例において、％はいずれも質量百分率である。
【００３５】
［実施例１］ 歯磨剤
Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ ｐａｒｖｕｌａ由来低分子画分 ２％
プロピレングリコール ３
カルボキシメチルセルロース ２．２
ソルビトール（７０％） ２５
モノフルオロリン酸ナトリウム ０．７３
無水ケイ酸 ２５
香料 ０．９
パラベン ０．０７
ラウリル硫酸ナトリウム １．３
精製水 残
計 １００％
【００３６】
［実施例２］ 歯磨剤
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ由来低分子物質 ０．０２％
プロピレングリコール ３
アルギン酸ナトリウム ０．５
キサンタンガム １
グリセリン（８５％） ２２
トリクロサン ０．０２
リン酸カルシウム ４０
サッカリンナトリウム ０．０３
香料 ０．９
パラベン ０．０７
ラウリル硫酸ナトリウム １．３
精製水 残
計 １００％
【００３７】
［実施例３］ 歯磨剤
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ由来低分子画分 ０．３％
プロピレングリコール ３
アルギン酸ナトリウム ０．５
キサンタンガム １
トリクロサン ０．０２
リン酸カルシウム ４０
サッカリンナトリウム ０．０３
香料 ０．９
パラベン ０．０７
ラウリル硫酸ナトリウム １．３
精製水 残
計 １００％
【００３８】
［実施例４］ 歯磨剤
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｓｉｃｃａ由来低分子画分 １．５％
プロピレングリコール ３
カルボキシメチルセルロース ２．２
ソルビトール（７０％） ２５
モノフルオロリン酸ナトリウム ０．７３
無水ケイ酸 ２５
香料 ０．９
パラベン ０．０７
ラウリル硫酸ナトリウム １．３
精製水 残
計 １００％
【００３９】
［実施例５］ 歯磨剤
Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ由来低分子物質 ０．１％
プロピレングリコール ３
カルボキシメチルセルロース ２．１
グリセリン（８５％） ２２
塩化ナトリウム １４
リン酸カルシウム ４０
サッカリンナトリウム ０．０３
香料 ０．９
パラベン ０．０７
ラウリル硫酸ナトリウム １．３
精製水 残
計 １００％
【００４０】
［実施例６］ 歯磨剤
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｏｒｔｈｙｓｕｓ由来低分子画分 ０．０３％
プロピレングリコール ３
アルギン酸ナトリウム ０．５
キサンタンガム １
トリクロサン ０．０２
リン酸カルシウム ４０
サッカリンナトリウム ０．０３
香料 ０．９
パラベン ０．０７
ラウリル硫酸ナトリウム １．３
精製水 残
計 １００％
【００４１】
【００４２】
【００４３】
【００４４】
［実施例１０］ 口腔用パスタ
ヒドロキシエチルセルロース ３％
カラギーナン １
ソルビトール（７０％） ４０
ショ糖パルミチン酸モノエステル ２
ラウロイルサルコシンナトリウム ０．３
乳酸アルミニウム ０．８
サッカリンナトリウム ０．１
Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ由来低分子物質 ０．０５
香料 １
精製水 残
計 １００％
【００４５】
［実施例１１］ 洗口剤
エタノール １０％
Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ由来低分子物質 ０．５
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 ０．５
モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン ０．５
サッカリンナトリウム ０．２
香料 ０．８
精製水 残
計 １００％
【００４６】
［実施例１２］ チューインガム
ガムベース ２０％
Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ ｄｉｓｐａｒ由来低分子画分 ２
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ由来低分子画分 ２
砂糖 １５
キシリトール ２０
コーンシロップ １２
水飴 ２９
計 １００％
【図面の簡単な説明】
【図１】各細菌画分におけるバイオフィルム残存量を示すグラフである。
【図２】油−水分配後の各細菌画分におけるバイオフィルム残存量を示すグラフである。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a composition for oral cavity that is excellent in the effect of suppressing the formation of biofilms formed by microorganisms and the effect of promoting degradation, and is effective in preventing caries, bad breath, periodontal diseases and the like caused by biofilms.
[0002]
[Prior art]
Microorganisms form so-called biofilms in nature, adapt to the environment, exhibit pathogenicity, and it has been clarified that various diseases are caused by the formation of biofilms. Diseases such as periodontal diseases Biofilm suppression is attracting attention for its prevention.
[0003]
Many antibiotics, antibacterials, and bactericides have been known as inhibitors for biofilms produced by bacteria. In addition, a polysaccharide degrading enzyme that forms an extracellular matrix, which is a structure in a biofilm, is also used. However, antibiotics are limited in the field of use due to the emergence of resistant bacteria, etc. Antibacterials and bactericides are mostly chemically synthesized products, used in the human body, formulated into foods, and released into the environment. Many things are not preferable considering Moreover, regarding enzymes, there are problems that stabilization is difficult and limitation is imposed on blending, and effectiveness is limited due to high reaction specificity.
[0004]
On the other hand, as a biofilm-inhibiting substance derived from bacteria, marine microorganisms such as oil-soluble substances such as homoserine lactone derivatives and substances derived from pathogenic microorganisms (Patent Document 1: Japanese Translation of PCT International Publication No. 2002-514092, Non-Patent Document 1: Structural identification) of a bacterial quorum-sensing signal contining bolon: Nature, 415, 545-549, 2002), a substance derived from lactic acid bacteria used in the fermentation industry (Patent Document 2: Special Table 2002-522464, Patent Document 3: Special No. 2002-234825) is known.
[0005]
In addition, a composition for oral cavity containing caries lytic enzymes produced by microorganisms belonging to the genus Streptomyces (soil actinomycetes) (see Patent Document 4: Japanese Patent Laid-Open No. 49-7439), and a bacterium belonging to the genus Streptococcus A composition for oral hygiene containing a protein antibacterial substance derived from a mutant strain (see Patent Document 5: Japanese Patent Laid-Open No. 52-44246) is proposed.
[0006]
However, the above biofilm-inhibiting substance derived from bacteria is higher in safety than antibiotics and the like, but it is safer and exhibits a superior biofilm-inhibiting effect stably, thus preventing oral disease. An oral composition effective for prevention is desired.
[0007]
[Patent Document 1]
Japanese translation of PCT publication No. 2002-514092 [Patent Document 2]
JP 2002-522464 A [Patent Document 3]
JP 2002-234825 A [Patent Document 4]
JP 49-7439 A [Patent Document 5]
JP 52-44246 A [Non-Patent Document 1]
Structural identification of a bacterial quorum-sensing signal constraining bolon: Nature, 415, 545-549, 2002
[0008]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention has been made in view of the above circumstances, and an object thereof is to provide an oral composition that is highly safe, exhibits an excellent biofilm inhibitory action, and has an excellent preventive effect on diseases caused by biofilms. And
[0009]
Means for Solving the Problem and Embodiment of the Invention
In order to achieve the above-mentioned object, the present inventor has intensively studied a biofilm inhibitor. As a result, the biofilm formation-inhibiting effect and degradation-promoting effect can be added to the extracellular water-soluble low-molecular substance produced by oral bacteria. An oral composition containing such an extracellular water-soluble low molecular weight substance that has an inhibitory action can prevent plaque formation caused by biofilm formation and caries caused by biofilm It was found useful for prevention, prevention of bad breath, and periodontal disease.
[0010]
That is, the applicant of the present invention is that a substance having a molecular weight of 5,000 or less extracted from the culture supernatant of plaque-constituting microorganisms, which are oral bacteria, controls the inter-bacterial information transmission mechanism, and the oral composition containing this substance It has been proposed that the product is effective in suppressing plaque (see Japanese Patent Application No. 2001-321785). As a result of further examination of the extracellular material produced by oral bacteria living in the human oral cavity, the present inventor has found that the biofilm formation inhibitory effect of the extracellular material produced by oral bacteria living in the human oral cavity and Biofilm inhibitory action such as degradation promotion effect is not in the high molecular fraction that is normally expected to have enzyme activity in the extracellular material, but in the low molecular fraction, and the water soluble fraction of this low molecular fraction The composition for oral cavity which is more safe and stably exhibits excellent biofilm suppression action by blending this extracellular water-soluble low molecular weight substance into the oral composition. Has been found to yield the present invention.
[0011]
The extracellular water-soluble low molecular weight substance according to the present invention is derived from oral bacteria, and marine microorganisms and pathogenic microorganisms mentioned in Patent Document 1 and Non-Patent Document 1, Patent Documents 2 and 3 These are fundamentally different from lactic acid bacteria used in the fermentation industry, soil actinomycetes of Patent Document 4, and specific mutant-derived substances of Patent Document 5, and are water-soluble low-molecular substances derived from oral bacteria. This is completely different from the above-described technique in that the formation of biofilms due to can be suppressed. In addition, it is also known that the molecular weight of an enzyme equivalent to the enzyme of Patent Document 4 is 20,000 or more (see http://www.seikagaku-hit.com/seikagaku/pro/pro_08.html).
[0012]
Accordingly, the present invention provides an oral composition characterized by containing an extracellular bacterial water-soluble low molecular weight substance of oral bacteria.
[0013]
Hereinafter, the present invention will be described in more detail. The extracellular water-soluble low molecular weight substance of oral bacteria blended in the oral composition of the present invention is obtained from the culture supernatant of oral bacteria. Examples of the oral bacteria to be used in the present invention, typically, can be used oral bacteria isolated species are classified as oral bacteria, e.g., Streptococcus (Streptococcus), Actinomyces (Actinomy ces), lacto Bacillus (Lactobacillus), Lactococcus (Lactococcus), Fusobacterium (Fusobacterium), Veillonella (Veillonella), Neisseria (Neisseria), Actinobacillus (Actinobacillus), Porphyromonas (Porphyromonas), Prevotella (Prevotella), Bacteroides (Bacteroides), Toreponema Selected from the genus such as ( Treponema ) Are preferably used.
[0014]
The composition of the present invention may contain a low-molecular water-soluble substance derived from one or more of these bacteria. The collection method of low molecular weight substances may be a commonly used method. For example, starting from a bacterial culture solution obtained by removing cells by filtration or centrifugation, ultrafiltration, dialysis, salting out, ion Various column chromatography such as exchange, hydrophobic interaction and reverse phase can be fractionated alone or in combination.
[0015]
For example, these oral bacterial culture supernatants are mixed by culturing from a logarithmic growth phase to a stationary phase in a commonly used medium, and then filtering or centrifuging the culture supernatant with a 0.22 μm filter or the like. What removed the microbial cell completely can be used. In addition, normally purified medium-derived materials and polymer materials produced by microorganisms can be suitably used after removing them as necessary.
[0016]
That is, as a method for removing a macromolecular substance from a culture supernatant, gel filtration or ultrafiltration can be preferably used after lyophilization, and as a target substance extraction or desalting method, ion exchange chromatography, hydrophobicity can be used. Chromatography and solvent extraction can be combined as appropriate. Here, the solvent that can be used for extraction of the target substance is a water-soluble solvent such as distilled water.
[0017]
The extracellular water-soluble low molecular weight substance in the present invention preferably has a molecular weight of 10,000 or less, particularly 800 to 8,000, obtained from the culture supernatant as described above. If the molecular weight is too large, a sufficient blending effect may not be obtained.
[0018]
The composition for oral cavity of the present invention can be applied to various dosage forms such as dentifrice such as toothpaste, mouthwash, mouthwash, pasta for oral cavity, gum massage cream, troche, chewing gum, tablet, capsule and the like. Is possible. The blending amount of the extracellular water-soluble low molecular weight substance in the composition of the present invention is preferably 0.0001 to 10% (mass percentage, the same applies hereinafter), particularly 0.001 to 2% of the whole composition. If the blending amount is too small, a satisfactory blending effect may not be obtained, and if it is too large, it may cause coloring or discoloration of the preparation.
[0019]
In this case, the oral composition of this invention can mix | blend the various base components used for a normal oral composition other than the component mentioned above. For example, various kinds of abrasives, thickeners, binders, surfactants, sweeteners, fragrances, coloring agents, preservatives, and further known active ingredients such as bactericides, enzymes, anti-inflammatory agents, fluorine, etc. It can mix | blend in the range which does not prevent the effect of invention.
[0020]
As abrasives, silica-based abrasives such as precipitated silica, silica gel, aluminosilicate, zirconosilicate, dicalcium phosphate dihydrate and anhydride, calcium pyrophosphate, calcium carbonate, aluminum hydroxide, alumina, magnesium carbonate , Tertiary magnesium phosphate, insoluble sodium metaphosphate, insoluble potassium metaphosphate, titanium oxide, zeolite, aluminum silicate, zirconium silicate, synthetic resin abrasive and the like.
[0021]
Examples of the thickener include glycerin, sorbitol, xylitol, propylene glycol, polyethylene glycol and the like.
[0022]
As binder, carrageenan, sodium alginate, propylene glycol alginate, xanthan gum, polyacrylic acid, sodium polyacrylate, carboxyvinyl polymer, tragacanth gum, guar gum, locust bean gum, sodium carboxymethylcellulose, hydroxyethylcellulose, hydroxypropylcellulose, methylcellulose , Gellan gum, gelatin, curdlan, gum arabic, agar, pectin, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, pullulan and the like.
[0023]
Examples of the surfactant include anionic surfactants, cationic surfactants, nonionic surfactants, and the like. Specifically, sodium lauryl sulfate, sodium N-lauroyl sarcosine, sodium α-olefin sulfonate, N-acyl glutamate, 2-alkyl-N-carboxymethyl-N-hydroxyethylimidazolinium betaine, N-acyl taurate, sucrose fatty acid ester, alkylol amide, polyoxyethylene hydrogenated castor oil, polyglycerin fatty acid ester, Pluronic, polyoxyethylene sorbitan monostearate, etc. are mentioned.
[0024]
Examples of the sweetening agent include saccharin sodium, stevioside, stevia extract, paramethoxycinnamic aldehyde, neohesperidyl dihydrochalcone, and perilartin.
[0025]
Examples of the fragrances include terpenes such as l-menthol, carvone, anethole and limonene, and derivatives thereof. Examples of the colorant include blue No. 1, yellow No. 4, titanium dioxide and the like.
[0026]
Furthermore, the present invention includes cationic fungicides such as chlorhexidine, benzethonium chloride, benzalkonium chloride, cetylpyridinium chloride, decalinium chloride, phenolic compounds such as triclosan, hinokitiol, isopropylmethylphenol, dextranase, mutanase, Enzymes such as lysozyme, amylase, protease, lytic enzyme, superoxide dimutase (SOD), alkali metal monofluorophosphates such as sodium monofluorophosphate and potassium monofluorophosphate, sodium fluoride, stannous fluoride, etc. Fluoride, tranexamic acid, epsilon aminocaproic acid, allantoin, dihydrocholestanol, glycyrrhizic acids, glycyrrhetinic acid, glycerophosphate, chlorophyll, sodium chloride Well known active ingredients such as vitamins, zinc chloride, water-soluble inorganic phosphate compounds, vitamin A, vitamin B group, vitamin C, vitamin E and their derivatives can be used in combination of one or more. .
[0027]
【The invention's effect】
The composition for oral cavity of the present invention is excellent in the action of suppressing biofilms formed by microorganisms, and is effective in preventing caries, bad breath, periodontal diseases and the like caused by biofilms.
[0028]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, although an experiment example and an Example are shown and this invention is demonstrated concretely, this invention is not restrict | limited to the following Example.
[0029]
[Experimental Example 1]
Biofilm injury effect of bacterial low molecular fraction:
Streptococcus sobrinas strain 6715 ( Streptococcus sobrinus strain 6715) was anaerobically cultured overnight with a 1 ml sucrose-containing Todd Hewitt medium (Todd Hewitt broth: manufactured by Difco) at an angle in a glass test tube on the wall of the test tube. Formed. For this biofilm, the low molecular fraction (molecular weight of 10,000 or less) and the high molecular fraction (molecular weight of more than 10,000) of five types of oral bacteria prepared by the following method are converted to the concentration at the time of collecting and culturing the fraction. Was added to a concentration of 5 times and allowed to act overnight. After the action, the test tube was stirred for 5 seconds at the maximum stirring force scale of the test tube mixer “Vortex Jenny II (registered trademark)”, and the amount of the biofilm adhered firmly on the test tube wall after stirring was measured. In addition, the amount of biofilm when physiological saline was used as a control was similarly measured. The measurement of the amount of biofilm was performed by washing the test tube twice with 1 ml of distilled water and adding 3 ml of distilled water and then uniformly dispersing with an ultrasonic treatment device so that physical stimulation was not directly applied to the biofilm. Thereafter, the absorbance at 550 nm was measured with a spectrophotometer. The amount of biofilm remaining in each bacterial fraction is shown in FIG.
[0030]
Preparation of low molecular fraction of oral bacteria:
As a bacterium derived from the low molecular fraction,
(I) Streptococcus sanguinis ATCC 10556
( Streptococcus sanguinis ATCC 10556)
(Ii) Streptococcus mutans ATCC 25175
(Streptcoccus mutans ATCC25175)
(Iii) Actinomyces Naeslandi ATCC 51655
( Actinomyces naeslundii ATCC 51655)
(Iv) Bayonella Parbula ATCC17745
( Veillonella parvula ATCC17745)
(V) Fusobacterium nucleatum ATCC 1095
( Fusobacterium nucleatum ATCC 1095)
The culture supernatants that were cultivated in Todd Hewitt medium (1.5% sodium lactate added to the same medium only for Veillonella) and then sterilized by centrifugation were used for The mixture was neutralized with 1M NaOH, filtered through an ultrafiltration membrane having an excluded molecular weight of 10,000, and fractionated into a low molecular fraction and a high molecular fraction. The obtained low molecular weight fraction was lyophilized and redissolved in distilled water so as to have an appropriate concentration during the experiment. The polymer fraction was used as a comparative product.
[0031]
As a result of the above experiment, the biofilm residual amount was not different from the control (saline effect) in the polymer fraction, whereas the biofilm residual amount was decreased in the low molecular fraction (FIG. 1).
[0032]
Biofilm damage effect after oil-water partitioning of bacterial low molecular fraction:
Each of the above bacterial fractions was dissolved in 4 ml of distilled water so that the concentration was 15 times as high as the concentration at the time of fraction collection and culture, and then 2 ml of dichloromethane was added and stirred to perform oil-water partition. The oil phase fraction was dried under reduced pressure, dissolved in 0.2 ml of dimethylformamide, and adjusted to 4 ml with distilled water. These oil phase and aqueous phase were each allowed to act on the biofilm produced by Streptococcus sobrinus in the same manner as in the above test, and the biofilm residual amount was measured in the same manner as described above. The results are shown in FIG.
[0033]
From the result of FIG. 2, by adding the extra-cellular low molecular weight water-soluble fraction derived from oral bacteria, the biofilm that could not be removed by the force of the water flow by the test tube mixer can be removed. It was shown that the above-mentioned extracellular low-molecular water-soluble fraction has biofilm damage.
[0034]
Next, low molecular fractions (molecular weight of 10,000 or less) derived from each bacterium produced by the same method as described above, and low molecular substances obtained by purifying each low molecular fraction by a conventional method are used. Then, an oral composition having the following composition was prepared by a conventional method. In the following examples,% is a mass percentage.
[0035]
[Example 1] Dentifrice
Low molecular fraction derived from Veillonella parvula 2%
Propylene glycol 3
Carboxymethylcellulose 2.2
Sorbitol (70%) 25
Sodium monofluorophosphate 0.73
Silicic anhydride 25
Fragrance 0.9
Paraben 0.07
Sodium lauryl sulfate 1.3
Purified water remaining
Total 100%
[0036]
[Example 2] Dentifrice
Streptococcus mutans low molecular weight substance 0.02%
Propylene glycol 3
Sodium alginate 0.5
Xanthan gum 1
Glycerin (85%) 22
Triclosan 0.02
Calcium phosphate 40
Saccharin sodium 0.03
Fragrance 0.9
Paraben 0.07
Sodium lauryl sulfate 1.3
Purified water remaining
Total 100%
[0037]
[Example 3] Dentifrice
Streptococcus mutans- derived low molecular fraction 0.3%
Propylene glycol 3
Sodium alginate 0.5
Xanthan gum 1
Triclosan 0.02
Calcium phosphate 40
Saccharin sodium 0.03
Fragrance 0.9
Paraben 0.07
Sodium lauryl sulfate 1.3
Purified water remaining
Total 100%
[0038]
[Example 4] Dentifrice
Neisseria sicca- derived low molecular fraction 1.5%
Propylene glycol 3
Carboxymethylcellulose 2.2
Sorbitol (70%) 25
Sodium monofluorophosphate 0.73
Silicic anhydride 25
Fragrance 0.9
Paraben 0.07
Sodium lauryl sulfate 1.3
Purified water remaining
Total 100%
[0039]
[Example 5] Dentifrice
Treponema denticola- derived low molecular weight substance 0.1%
Propylene glycol 3
Carboxymethylcellulose 2.1
Glycerin (85%) 22
Sodium chloride 14
Calcium phosphate 40
Saccharin sodium 0.03
Fragrance 0.9
Paraben 0.07
Sodium lauryl sulfate 1.3
Purified water remaining
Total 100%
[0040]
[Example 6] Dentifrice
Bacteroides fortysus- derived low molecular fraction 0.03%
Propylene glycol 3
Sodium alginate 0.5
Xanthan gum 1
Triclosan 0.02
Calcium phosphate 40
Saccharin sodium 0.03
Fragrance 0.9
Paraben 0.07
Sodium lauryl sulfate 1.3
Purified water remaining
Total 100%
[0041]
[0042]
[0043]
[0044]
Example 10 Oral Pasta Hydroxyethyl Cellulose 3%
Carrageenan 1
Sorbitol (70%) 40
Sucrose palmitic acid monoester 2
Lauroyl sarcosine sodium 0.3
Aluminum lactate 0.8
Saccharin sodium 0.1
Low molecular weight substance derived from Prevotella intermedia 0.05
Fragrance 1
Purified water remaining
Total 100%
[0045]
[Example 11] Mouthwash ethanol 10%
Low molecular weight substance derived from Prevotella intermedia 0.5
Polyoxyethylene hydrogenated castor oil 0.5
Polyoxyethylene sorbitan monooleate 0.5
Saccharin sodium 0.2
Fragrance 0.8
Purified water remaining
Total 100%
[0046]
[Example 12] Chewing gum gum base 20%
Low molecular fraction derived from Veillonella dispar 2
Streptococcus mutans- derived low molecular fraction 2
Sugar 15
Xylitol 20
Corn syrup 12
Minamata 29
Total 100%
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing the amount of remaining biofilm in each bacterial fraction.
FIG. 2 is a graph showing biofilm residue in each bacterial fraction after oil-water partitioning.