JP2004097030A - Drug promoting transcellular membrane substance transport - Google Patents
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Abstract
Description
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、微生物の細胞膜間の物質輸送を促進する薬剤、該薬剤を使用した微生物活性増加方法及び該薬剤と微生物を用いた難分解性物質の分解方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
メッキ産業、プリント基板製造業、繊維産業、製紙産業、金属加工産業、半導体産業、クリーニング産業、印刷・写真産業、産業廃棄物処理産業等の事業所や上下水道事業施設においては、工業用廃水を伴うことが不可欠である。このような廃水に含まれる難分解性物質、特に多環芳香族化合物や窒素化合物の環境中での分解は極めて悪く、環境中で非常に安定であり、そのまま河川等に放出すると環境を汚染するため、大きな社会問題とされている。
【０００３】
このようなことから、難分解性物質の除去、分解による地下水等の浄化は、環境保全の視点から重要な課題であり、浄化に必要な技術の開発が行われてきている。例えば、活性炭による吸着処理、光や熱による分解処理等が検討されてきたが、コストや操作性の面からかならずしも実用的であるとはいえない。
【０００４】
これに対し、近年微生物による分解が報告され、その実用化に向けた研究がなされ始めている。微生物による難分解性物質の分解浄化技術は、多種多様なものが報告されているが、一般にその処理効率は低く、何らかの人為的な処理を加えなければ十分な効果が得られないのが実情である。例えば、処理しようとする環境に微生物の栄養源となる物質を別途添加する方法、酵素を供給する方法、界面活性剤を添加する方法などが知られている。
【０００５】
しかし、それぞれで限界又は問題を有している。微生物の栄養源となる物質を別途添加する場合、その添加物の二次汚染が問題となることが多い。さらに、その栄養源の添加が生物分解を妨害するといった報告もある。また、酵素を供給する方法においては、微生物の分解活性は基質が存在する環境の通気性に依存する。さらに、基質の置換基の位置が酸化に影響を及ぼすことが明らかにされており、この方法の限界を示している。
【０００６】
一方、ヒト病原菌を包含する細菌に広く用いられている基本的な制御薬として、ホモセリンラクトン類又はアシル化ホモセリンラクトン類が知られている。この制御系は、生物発光細菌について最初に発見されたものであるが、多数の他の微生物に見いだされており、微生物の多種多様な活性に関与している。これらの活性としては、植物病原菌であるエルウィニア・カロトボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）及び嚢胞性繊維症の起因菌である緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）における細胞外酵素の産生、及びアグロバクテリウム・チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）から植物へのＴｉプラスミドの導入が知られている。しかし、微生物の細胞膜間における物質輸送を促進するという活性については、知られていなかった。
【０００７】
また、近年、耐性菌の耐性機構の解析研究によって、薬剤排出機構として薬剤排出ポンプの存在が認知されてきた。古くは１９８０年にＬｅｖｙのグループによってテトラサイクリン系の抗菌薬を特異的に菌体外に排出するポンプが同定され（非特許文献１参照）、テトラサイクリン耐性の主たる要因として注目された。さらに最近の研究によって、大腸菌、緑膿菌、枯草菌、ブドウ球菌、肺炎球菌並びに淋菌における多剤排出型の排出ポンプの存在が報告された。なかでも、相同性を有する緑膿菌の薬剤排出ポンプとして現在までに４種の多剤排出型ポンプが報告されており、最近では、緑膿菌の全ゲノム配列が明らかになっており、その配列からさらに５〜６種類の新規多剤排出ポンプ、計１０種の存在が確認されている。しかし、これらの排出ポンプが微生物の活性に関与していることについては知られていなかった。
【０００８】
【非特許文献１】
Ｌ． ＭｃＭｕｒｒｙ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ７７， ３９７４， １９８０
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、効率的かつ環境に優しい、多環芳香族化合物や窒素化合物等の難分解性物質の微生物による分解浄化方法を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、従来の手法にとらわれることなく、微生物の細胞膜間物質輸送に着目し、鋭意研究を進めたところ、細胞膜間の物質輸送に関与するタンパク質が微生物の活性に関与すること、及びアシル化ホモセリンラクトン類が微生物の活性を制御する物質であり、特に細胞膜間の物質輸送に関与するタンパク質の発現を促進し、その結果、微生物による難分解性物質、特に多環芳香族化合物や窒素化合物の分解を促進する効果を有することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
すなわち本発明は、以下の発明を包含する。
（１）式Ｉ：
【化２】
で表される化合物を含む、微生物の細胞膜間の物質輸送を促進する薬剤。
（２）（１）に記載の薬剤を用いて、微生物の細胞膜間の物質輸送を促進することにより微生物の活性を増加させる方法。
（３）（１）に記載の薬剤と微生物とを用いて難分解性物質を分解する方法。
（４）微生物が、排出ポンプをコードする遺伝子が導入されたものである、（２）又は（３）に記載の方法。
（５）排出ポンプをコードする遺伝子が導入された微生物を用いて難分解性物質を分解する方法。
（６）（４）又は（５）に記載の方法に使用するための、遺伝子組換えにより排出ポンプをコードする遺伝子が導入された微生物。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、排出ポンプ遺伝子を導入した組換え微生物を用いて難分解性物質である亜硝酸の分解を試みたところ、野生型に比べて分解活性が向上することを見出した。すなわち、排出ポンプが微生物の代謝を向上させる機能を有し、そして微生物による難分解性物質の分解作用に関与していることを見出した。
【００１３】
また、アシル化ホモセリンラクトン類が微生物の代謝に対して制御活性を有する可能性が示唆されていたが、その具体的な作用については十分解明されていなかった。本発明者らは、さらに、アシル化ホモセリンラクトン類が微生物の排出ポンプの発現に関与する物質であることを、以下に記載するような方法により見出した。
【００１４】
すなわち、排出ポンプをコードする遺伝子にレポーター遺伝子を導入し、そのレポーター遺伝子の活性を測定することで簡易的に排出ポンプの発現の状況をモニタリングした。相同組換えにより緑膿菌染色体上のｍｅｘＡ−ｍｅｘＢ−ｏｐｒＭ遺伝子上にカテコール２，３ジオキシゲナーゼ遺伝子をコードするレポーター遺伝子（ｘｙｌＥ）を導入し、レポーター遺伝子導入株ＰＡＯ１−Ｘｙｌを構築した。その株を用いてアシル化ホモセリンラクトン類による排出ポンプの誘導効果を測定したところ、アシル化ホモセリンラクトン類の濃度を上昇させていくと、約２５μＭまでは濃度依存的に排出ポンプが誘導され、それ以降一定に保たれることを見出した。以上から、アシル化ホモセリンラクトン類が細菌の排出ポンプの発現を誘導していることが明らかとなった。
【００１５】
本発明のアシル化ホモセリンラクトン類は、微生物における排出ポンプの発現を促進することにより、結果として微生物における細胞膜間の物質輸送を促進する。従って、本発明のアシル化ホモセリンラクトン類は、微生物の細胞膜間の物質輸送を促進する薬剤として使用することができる。
【００１６】
アシル化ホモセリンラクトン類はオートインデューサーとして機能し、その濃度又は物性を変化させることにより、細胞内に存在するか又は膜に結合している調節タンパク質と結合し、その調節タンパク質により制御している一群の遺伝子の発現を制御する。オートインデューサーとは、生物内で産生され、細胞それ自身又は周辺の細胞に作用し、比較的低濃度で遺伝子の発現に影響を与える低分子の物質を意味する。
【００１７】
本発明における、式Ｉ：
【化３】
【００１８】
式Ｉにおける、Ｒは、炭素数２〜１４、好ましくは４〜１２の直鎖状又は分枝状の置換されていてもよいアシル基であり、置換基としては、ヒドロキシル基、オキソ基等が挙げられる。非置換の飽和脂肪族アシル基、並びに３位にオキソ基を有する飽和脂肪族アシル基が好ましい。
【００１９】
Ｒの具体例としては、特に限定されないが、例えば、アセチル基、プロピオニル基、３−オキソプロピオニル基、ブチリル基、３−オキソブチリル基、イソブチリル基、ヘプタノイル基、３−オキソヘプタノイル基、バレリル基、３−オキソバレリル基、イソバレリル基、３−オキソイソバレリル基、ノナノイル基、３−オキソノナノイル基、ピバロイル基、ヘキサノイル基、３−オキソヘキサノイル基、オクタノイル基、３−オキソオクタノイル基、ラウロイル基、３−オキソドデカノイル基、パルミトイル基、３−オキソパルミトイル基、ステアロイル基、３−オキソステアロイル基、ミリストイル基、３−オキソミリストイル基等が挙げられる。
【００２０】
式Ｉで表されるアシル化ホモセリンラクトン類の具体例としては、特に限定されないが、例えば、Ｎ−ブチリル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−ヒドロキシブチリル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ヘキサノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソヘキサノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−オクタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソオクタノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−デカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（７−システトラデカノイル）−ホモセリンラクトン又はＮ−（３−ヒドロキシ−７−システトラデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン等を挙げることができ、Ｎ−ブチリル−Ｌ−ホモセリンラクトンが好ましい。
【００２１】
本発明のアシル化ホモセリンラクトン類は、例えば、脂肪族カルボン酸又はそのエステルと環状アミノ酸との間にアミド結合を形成させることによって合成することができる。また、アシル化ホモセリンラクトン類は、例えば、Ｃｈｈａｂｒａ， Ｓ． Ｒ．， Ｐ． Ｓｔｅａｄ， Ｎ． Ｊ． Ｂａｉｎｔｏｎ， Ｇ． Ｐ． Ｃ． Ｓａｌｍｏｎｄ， Ｇ． Ｓ． Ａ． Ｂ． Ｓｔｅｗａｒｔ， Ｐ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ， ａｎｄ Ｂ． Ｗ． Ｂｙｃｒｏｆｔ， Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔ．， ４６， ４４１−４５４， １９９３、Ｚｈａｎｇ， Ｌ．， Ｐ． Ｊ． Ｍｕｒｐｈｙ，Ａ． Ｋｅｒｒ， ａｎｄ Ｍ． Ｅ． Ｔａｔｅ， Ｎａｔｕｒｅ， ３６２， ４４６−４４８， １９９３、Ｓｃｈａｅｆｅｒ Ａ．Ｌ．， Ｂ． Ｌ． Ｈａｎｚｅｌｋａ， Ａ． Ｅｂｅｒｈａｒｄ， ａｎｄ Ｅ． Ｐ． Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １７８， ２８９７−２９０１， １９９６、Ｇａｏ， Ｊ．−Ｇ． ａｎｄ Ｅ． Ａ． Ｍｅｉｇｈｅｎ． Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １７５， ３８５６−３８６２， １９９３などに記載された方法によって合成できる。
【００２２】
また、本発明のアシル化ホモセリンラクトン類は微生物によって生合成されるため、微生物を培養した培養物から当技術分野において通常用いられる方法によって分離精製することもできる。
【００２３】
本発明の薬剤によって細胞膜間の物質輸送を促進できる微生物としては、特に限定されないが、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ） 属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）属、クレブシエラ （Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ） 属、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属、モルガネラ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）属、プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）属、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、エルジニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）属、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）属、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）属、ブランハメラ（Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ）属、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）属、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）属、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）属、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）属、ガードネレラ（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、ミコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレノトロホモナス（Ｓｔｒｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）属、ブルコホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属、フランキセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）属、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）属、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属等に属するグラム陽性菌及びグラム陰性菌を含む広範囲の各種細菌が挙げられる。特に、難分解性物質を分解する活性を有するものが好ましい。
【００２４】
具体的には、緑膿菌、シュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・アシドボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ）、シュードモナス・アルカリジェネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、ストレノトロホモナス・マルトフィリア（Ｓｔｒｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）、ブルコホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ）、アエロモナス・ヒドロフィリア（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉａ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、シトロバクター・フロインディイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、腸チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、パラチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｐａｒａｔｙｐｈｉ）、腸炎菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、志賀赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ）、ゾンネ赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ）、エンテロバクター・クロアケエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）、エンテロバクター・アエロジェネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、肺炎杆菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）、霊菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、モルガネラ・モルガニイ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓｖｕｌｇａｒｉｓ）、プロビデンシア・アルカリファシエンス（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ａｌｃａｌｉｆａｃｉｅｎｓ）、プロビデンシア・レットゲリ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｒｅｔｔｇｅｒｉ）、プロビデンシア・スツアルティイ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｓｔｕａｒｔｉｉ）、アシネトバクター・カルコアセティクス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）、アシネトバクター・ヘモリティクス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、エルジニア・エンテロコリティカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）、偽結核エルジニア菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、エルジニア・インターメディア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、パラ百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、気管支敗血症菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、パラインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィルス・ヘモリティクス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、ヘモフィルス・パラヘモリティクス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、デュクレー菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ）、パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、パスツレラ・ヘモリティカ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）、カタル球菌（Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）、カタル球菌（Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、カンピロバクター・フィータス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｔｕｓ）、カンピロバクター・ジジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、カンピロバクター・コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ）、ボレリア・バーグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ビブリオ・パラヘモリテイクス（Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ガードネレラ・バジナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、バクテロイデス・ディスタソニス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）３４５２Ａ同族群、バクテロイデス・ブルガトゥス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｖｕｌｇａｔｕｓ）、バクテロイデス・オバルス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｏｖａｌｕｓ）、バクテロイデス・テタイオタオミクロン（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）、バクテロイデス・ユニフォルミス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バクテロイデス・エガーチイ（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｅｇｇｅｒｔｈｉｉ）、バクテロイデス・スプランクニクス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｐｌａｎｃｈｎｉｃｕｓ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、鳥型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）、ミコバクテリウム・イントラセルレア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、らい菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、コリネバクテリウム・ウルセランス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、スタフィロコッカス・サプロフィティクス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）、スタフィロコッカス・インターメディウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）、スタフィロコッカス・ハイイクス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈｙｉｃｕｓ）、スタフィロコッカス・シムランス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｉｍｕｌａｎｓ）、スタフィロコッカス・ヘモリティクス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、スタフィロコッカス・ホミニス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｍｉｎｉｓ）、スタフィロコッカス・サッカロリティクス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）、エルウィニア・カルトボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）、リゾビウム・レグミノサルム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）等を挙げることができる。
【００２５】
本発明の薬剤は、シュードモナス属、特に緑膿菌、ブルコホルデリア属、特にＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ、エルウィニア属、特にＥｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ、エシェリキア属、特に大腸菌、リゾビウム属、特にＲｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ、ビブリオ属、特にＶｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉの細胞膜間物質輸送の促進において好適に使用できる。さらに、緑膿菌における細胞膜間物質輸送を促進する場合は、ＰＡＯ１株、Ｎ１３５株、ｎａｌＢ株、ｎｆｘＢ株、ｎｆｘＣ株等の株を使用するのが好ましい。
【００２６】
本発明のアシル化ホモセリンラクトン類は、遺伝子組換えにより、排出ポンプ遺伝子が導入された微生物の細胞膜間物質輸送を促進する薬剤としても使用できる。
【００２７】
本発明において「排出ポンプ」とは、細胞の細胞質又は周辺細胞質から、糖、アミノ酸をはじめとする様々な化合物をエネルギー依存様式で輸出するタンパク質集合を意味する。したがって、排出ポンプは、典型的に、細胞の細胞膜中に位置している。グラム陰性細菌において、排出ポンプは周辺腔の範囲にわたることができ、外膜の範囲にわたる排出ポンプの部分も存在しうる。
【００２８】
緑膿菌に存在する排出ポンプには、緑膿菌ＭｅｘＡ−ＭｅｘＢ−ＯｐｒＭ排出ポンプ又は緑膿菌株Ｋ３８５によって過発現される排出ポンプ又は緑膿菌株ＰＡＯ４０９８Ｅによって過発現される排出ポンプの一部分であるポリペプチドと少なくとも３０％のアミノ酸配列類似性を有するポリペプチドが含まれる。
【００２９】
ＭｅｘＡ−ＭｅｘＢ−ＯｐｒＭ排出ポンプは、緑膿菌野生株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＰＡＯ１）で構成的に発現しているＲＮＤファミリーの膜タンパク質である。ＭｅｘＡは、内膜にアンカリングしているペリフェラルタンパク質であり、ＭｅｘＢは、内膜を１２回貫通した内膜タンパク質であり、ＯｐｒＭは外膜に存在するチャンネルタンパク質である。これら３つのサブユニットでＭｅｘＡ−ｍｅｘＢ−ＯｐｒＭ排出ポンプは構成されている。この排出ポンプの基質として、現在までに各種の抗生物質、例えば、βラクタム剤、キノロン剤、クロラムフェニコールなど、有機溶媒、オートインデューサーの１つである３ｏｘｏＣ−１２ＨＳＬが知られている。また、この排出ポンプは、抗生物質や有機溶媒に対する耐性、さらには緑膿菌の二次代謝産物（毒素、プロテアーゼ、色素など）の産生に深く関わっていることも知られている。ＭｅｘＡ−ｍｅｘＢ−ＯｐｒＭ排出ポンプ、及びその塩基配列については、Ｐｏｏｌｅ， Ｋ．ら、 Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １０（３）， ５２９−５４４， １９９３及びＰｏｏｌｅ， Ｋ．ら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７５（２２）， ７３６３−７３７２， １９９３等に記載されている。
【００３０】
その他の排出ポンプとしては、ＲＮＤファミリー、ＭＦＳファミリー、ＳＭＲファミリー、ＡＢＣファミリー、ＭＡＴＥファミリーに属するタンパク質が挙げられる。具体的には、ＲＮＤファミリーに属するものとしては、緑膿菌のＭｅｘＥ−ＭｅｘＦ−ＯｐｒＮ排出ポンプ（Ｋｏｈｌｅｒ， Ｔ．ら、Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２３， ３４５−３５４， １９９７）、ＭｅｘＸ−ＭｅｘＹ排出ポンプ（Ｍｉｎｅ． Ｔ．ら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４３， ４１５−４１７， １９９９）、ＭｅｘＣ−ＭｅｘＤ−ＯｐｒＪ排出ポンプ（Ｐｏｏｌｅ， Ｋ．ら、Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２１ （４）， ７１３−７２４， １９９６）、ＭＦＳファミリーに属するものとしては、大腸菌のＭｄｆＡ排出ポンプ（Ｅｄｇａｒ Ｒ．ら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉａｌ． １７９， ２２７４−２２８０， １９９７）、ＭＡＴＥファミリーに属するものとしては、大腸菌のＹｄｈＥ排出ポンプ（Ｍｏｒｉｔａ Ｙ．ら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４２， １７７８−１７８２， １９９８）、ＡＢＣファミリーに属するものとしては、大腸菌のＨｌｙＢＤ排出ポンプ（Ｄｉｎｈ Ｔ．ら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７６， ３８２５−３８３１， １９９４）が挙げることができる。
【００３１】
緑膿菌においては、Ｎ−ドデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトンはＬａｓＲタンパク質と、Ｎ−ブチリル−Ｌ−ホモセリンラクトンはＲｈＩＲと結合して、下流の遺伝子群の調節を行っていると考えられる。そして、ＲｈＩＲとアシル化ホモセリンラクトン類の複合体が排出ポンプを発現させると考えられる。この複合体は、直接に排出ポンプの転写を促進する、排出ポンプ調節遺伝子の発現量を変化させて排出ポンプ遺伝子の発現を促す、又は排出ポンプの調節遺伝子の質的変化を促すことによって排出ポンプ遺伝子の発現を促すものと考えられる。
【００３２】
本発明のアシル化ホモセリンラクトン類は、微生物における物質排出を促進することにより、微生物における代謝機能をスイッチさせる機能を有する。従って、本発明のアシル化ホモセリンラクトン類を用いて、微生物の活性を増加させることができる。本発明において、「微生物の活性」とは、特に限定されないが、微生物の増殖活性、微生物の代謝活性、微生物が難分解性物質等を分解する活性、微生物の溶媒耐性能及び微生物の感染能などを意味する。
【００３３】
アシル化ホモセリンラクトン類による物質排出機構は、微生物による環境浄化へ応用できる。難分解性物質の微生物による分解における問題は、分解に関与する遺伝子の多くが二次代謝の遺伝子、すなわち微生物の増殖が定常期になるまで発現しない遺伝子であること、分解生成物が細胞内に蓄積することによって分解速度の低下が起こることにある。本発明のアシル化ホモセリンラクトン類を添加すれば、分解活性を有する微生物の代謝をスイッチし、早い段階で分解遺伝子を発現させることができる。従って、本発明のアシル化ホモセリンラクトン類を微生物とともに用いることにより、難分解性物質を効率的に分解することができる。しかも、本発明の方法は、排出ポンプの発現を促し、微生物の物質排出機構を促進するものであるため、分解過程で生じた生成物を微生物体外へ効率よく排出でき、汚染物質の分解浄化の効率をさらに向上させることができる。また、アシル化ホモセリンラクトン類は脂肪酸とアミノ酸からできており、易分解性と考えられるため、環境にも優しく、大量散布が可能である。
【００３４】
本発明において、「難分解性物質」とは、例えば高ＣＯＤＭｎ値（例えば公害防止法に基づいて定められた基準値以上）の廃水中の有機物をいう。難分解性物質の具体例としては、例えば、フェノール類、シアン類、芳香族ニトロ化合物、クロロ化合物、ニトリル、アルキルベンゼンスルホン酸、ポリ塩化ビニル、ポリビニルアルコール、脂肪酸ポリエステル、ポリエチレングリコール、フタル酸エステル、石油に含まれるベンゾチオフェンをはじめとする多環芳香族類、亜硝酸、硝酸が挙げられるが、本発明は、特に亜硝酸や硝酸といった窒素化合物の分解に有効である。
全ての分解対象物に対してシュードモナス属が好ましく使用される。
【００３５】
本発明の難分解性物質を分解する方法における、微生物及びアシル化ホモセリンラクトン類を用いた処理法は、特に限定されず、当技術分野の当業者であれば、使用する微生物及びアシル化ホモセリンラクトン類の種類によって、適宜選択することができる。好気的処理法として、例えば、生物膜法（散水ろ床法及び回転円板法）、活性汚泥法及び酸化池法等が挙げられ、嫌気的処理法として、中温法及び高温法等が挙げられる。本発明の一態様においては、アシル化ホモセリンラクトン類の存在下で微生物を培養し、培養液に対象となる難分解性物質を含む廃液等を添加し、さらに培養することによって難分解性物質を効率的に分解することができる。アシル化ホモセリンラクトン類は、培地に予め添加しておいてもよく、又は培養している微生物が適当な濃度に達した時点で培養液に添加してもよい。培養液におけるアシル化ホモセリンラクトン類の濃度は、特に限定されないが、２０μＭ〜１０ｍＭ、好ましくは４０μＭ〜１ｍＭである。培養のための培地は、当業者であれば使用する微生物により適宜選択することができ、特に限定されない。すなわち、炭素源、窒素源、無機塩類、ビタミン、その他の栄養因子を適宜含有する培地であれば、天然培地でも合成培地でも使用できる。
【００３６】
本発明の方法は、物理・化学的な処理法、例えば、オゾン酸化、過酸化水素−紫外線照射、オゾン−紫外線照射、フェントン酸化、湿式酸化、活性炭吸着等の方法とを組み合わせることもできる。
【００３７】
上記の微生物活性化方法及び難分解性物質分解方法においては、遺伝子組換えによって排出ポンプをコードする遺伝子を導入した微生物を使用することもできる。このような微生物は、本来排出ポンプを発現していないものであっても、アシル化ホモセリンラクトン類によって物質排出が促進され、活性が増加するとともに、難分解性物質を効率的に分解することが可能となるからである。従って、遺伝子組換えによって排出ポンプをコードする遺伝子を導入した微生物であって、排出ポンプを多く発現している微生物を使用する場合には、アシル化ホモセリンラクトン類を使用しない場合にも、難分解性物質を効率的に分解できる。その排出ポンプが由来する種と同種の微生物、又は細菌であれば同属に属する細菌に、排出ポンプ遺伝子を導入するのが好ましい。
【００３８】
微生物への排出ポンプ遺伝子の導入は、当業者に公知の方法で実施することができる。例えば、排出ポンプ遺伝子を宿主微生物中で発現させるために、モレキュラー・クローニング 第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー サプルメント１〜３４等に記載された方法等を用いることができる。
【００３９】
即ち、排出ポンプ遺伝子を適当な発現ベクターのプロモーター下流に挿入した組換え体ベクターを作成し、該ベクターを、対象とする宿主微生物に導入することにより、排出ポンプ遺伝子を発現する組換え体を取得することができる。
【００４０】
発現ベクターとしては、遺伝子を導入する微生物において自立複製が可能なもの、又は染色体中への組込みが可能なものが用いられる。細菌等の原核生物に遺伝子を導入する場合、発現ベクターは、プロモーター、リボソーム結合配列、排出ポンプ遺伝子、転写終結配列等により構成されていることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００４１】
発現ベクターとしては、特に限定されないが、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社より市販）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ｐＱＥ−８（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００（Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ４８， ６６９， １９８４）、ｐＬＳＡ１（Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ５３， ２７７， １９８９）、ｐＧＥＬ１（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ， ８２， ４３０６， １９８５）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（−）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）、ｐＭＭＢ６７ＥＨ（Ｍａｓｅｄａら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４４（３）， ６５８−６４， ２０００）等を例示することができる。
【００４２】
プロモーターとしては、例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰｌｅｔＩプロモーター等の大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。またｔｒｐプロモーターを２つ直列させたプロモーター、ｔａｃプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。シャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
【００４３】
組換えベクターの導入方法としては、宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ６９， ２１１０， １９７２）、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４）、Ｇｅｎｅ， １７， １０７， １９８２やＭｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， １６８， １１１， １９７９に記載の方法等をあげることができる。
【００４４】
本発明の形質転換体が大腸菌等の原核生物、酵母菌等の真核生物である場合、これら生物を培養する培地は、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。
【００４５】
また培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。
【００４６】
なお、排出ポンプに関連するタンパク質は、それら自体にシグナルペプチドを有している。従って、効率的に膜に局在し、膜タンパク質として機能する。また、排出ポンプ遺伝子のみを高発現させても機能することが示されている（Ｍａｓｅｄａら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４４（３）， ６５８−６４， ２０００）。
【００４７】
【実施例】
実施例１．アシル化ホモセリンラクトン類による排出ポンプ発現促進
緑膿菌の排出ポンプであるＭｅｘＡ−ＭｅｘＢ−ＯｐｒＭ排出ポンプをコードする遺伝子ｍｅｘＡ−ｍｅｘＢ−ｏｐｒＭオペロン内にレポーター遺伝子であるｘｙｌＥ遺伝子を導入した株ＰＡＯ１−Ｘｙｌを、ＬＢ培地（１％ トリプトン、０．５％ 酵母エキス、１％ ＮａＣｌ）中、３７℃にて一晩培養した。その培養液２０μｌを新たなＬＢ培地４ｍｌに植菌し、３時間培養した。続いて、Ｎ−ブチリル−Ｌ−ホモセリンラクトンを最終濃度が０、６．２５、１２．５、２５、５０、１００、２００μＭの濃度になるように培養液に添加した。その後、さらに３時間培養した後に集菌した。得られた菌体をｐＨ７．５の５０ｍＭリン酸カリウム溶液に懸濁し、超音波により菌体を破砕し、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心することで未破壊菌体及び菌体残渣を除き、粗酵素溶液を調製した。この粗酵素溶液を適宜５０ｍＭリン酸カリウム溶液で希釈し、９９０μｌに対し１０μｌの１００ｍＭカテコール溶液を添加し、カテコールの分解に伴う３７５ｎｍの吸光の増加を測定することでカテコール２，３ジオキシゲナーゼ活性を測定した。その結果、Ｎ−ブチリル−Ｌ−ホモセリンラクトンの濃度が２５μＭになるまでは、Ｎ−ブチリル−Ｌ−ホモセリンラクトンの濃度に依存してｘｙｌＥ遺伝子産物であるカテコール２，３ジオキシゲナーゼの活性が上昇し、それ以上の濃度では、一定の高い活性値のままであった。結果を図１に示す。
【００４８】
実施例２ 排出ポンプ遺伝子導入組換え菌による環境常在難分解性物質である亜硝酸の分解
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＰＡＯ１由来のｍｅｘＥＦＮ遺伝子をシュードモナス属用発現ベクターであるｐＭＭＢ６７ＥＨに組み込みｐＭＥＦＮを作成した。このｐＭＥＦＮをＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ ＮＨ−１７に導入し、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ ＮＨ１７／ｐＭＥＦＮとした。
【００４９】
ＲＮＤファミリーに属する排出ポンプの一種であるｍｅｘＥＦＮ遺伝子を導入した組換え脱窒菌を利用した培養においては、通常の細菌の培養法を用いた。培養にはＮＮ培地（１ｌ当たり、亜硝酸ナトリウム０．０６ｇ、グルコース１０ｇ、ペプトン１０ｇ、７水和硫酸マグネシウム０．１ｇ、リン酸１水素２カリウム２．０ｇ、酵母エキス１．０ｇ、ｐＨ７．２）を使用した。ブチルゴム栓によって密閉した密閉型培養フラスコに、亜硝酸を５ｍＭとなるように添加した上記培地を３０ｍｌ入れ、膜透過性を強化した組換え脱窒菌Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ ＮＨ１７／ｐＭＥＦＮを１白金耳とり添加した後、３０℃で振盪培養し、その後Ｎ２Ｏを測定した。Ｎ２Ｏは、ガスクロマトグラフＧＣ−１４Ｂ（ＳＨＩＭＡＤＺＵ）で測定した。
【００５０】
その結果、膜透過性を強化した菌株において、亜硝酸の分解促進と約１０倍の脱窒量が確認された（表１）。
【００５１】
【表１】
これまで、脱窒菌の育種による脱窒能強化の報告はない。この実施例によって示された微生物の膜透過能の強化による約１０倍の脱窒効果は、本発明が、効率的な亜硝酸、硝酸の分解を可能とすることを示している。また、実施例１によってこの排出ポンプ遺伝子の発現がアシル化ホモセリンラクトン類によって誘導されることが明らかとなっているので、その誘導によって同様の分解促進効果が得られると考えられる。
【００５３】
【発明の効果】
本発明により、微生物における物質排出を促進し、微生物における代謝をスイッチさせることによって、微生物の活性を増加させることができる。また、分解活性を有する微生物の代謝をスイッチさせることによって、早い段階で微生物の分解遺伝子を発現させ、難分解性物質を効率的に分解することができる。しかも、本発明の分解方法は、排出ポンプの発現を促し微生物の物質排出機構を促進するものであるため、分解過程で生じた生成物を微生物体外へ効率よく排出できるとともに、環境に優しく大量散布が可能であることから、汚染物質の分解浄化の効率をさらに向上させることができる。そして、汚水処理の効率及び高速化等が見込めるともに、コストダウンが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１におけるレポーター遺伝子導入株（ＰＡＯ１−Ｘｙｌ株）とＮ−ブチリル−Ｌ−ホモセリンラクトンとを培養したときの、Ｎ−ブチリル−Ｌ−ホモセリンラクトンの濃度とカテコール２，３ジオキシゲナーゼ活性の関係を表すグラフである。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a drug that promotes substance transport between cell membranes of microorganisms, a method for increasing microbial activity using the drug, and a method for decomposing hardly decomposable substances using the drug and a microorganism.
[0002]
[Prior art]
Industrial wastewater is used in business establishments such as the plating industry, printed circuit board manufacturing industry, textile industry, paper industry, metalworking industry, semiconductor industry, cleaning industry, printing / photography industry, industrial waste treatment industry, and water and sewage business facilities. Accompanying is essential. The decomposition of hardly decomposable substances, particularly polycyclic aromatic compounds and nitrogen compounds, contained in such wastewater in the environment is extremely poor, is very stable in the environment, and pollutes the environment if released directly into rivers. Therefore, it is a major social problem.
[0003]
Therefore, purification of groundwater and the like by removing and decomposing hardly decomposable substances is an important issue from the viewpoint of environmental conservation, and technologies required for purification have been developed. For example, adsorption treatment with activated carbon, decomposition treatment with light or heat, and the like have been studied, but are not always practical in terms of cost and operability.
[0004]
On the other hand, in recent years, degradation by microorganisms has been reported, and research for practical use thereof has begun. A wide variety of techniques for decomposing and purifying hard-to-decompose substances by microorganisms have been reported, but the processing efficiency is generally low, and sufficient effects cannot be obtained unless some artificial treatment is added. is there. For example, a method of separately adding a substance serving as a nutrient source of microorganisms to an environment to be treated, a method of supplying an enzyme, a method of adding a surfactant, and the like are known.
[0005]
However, each has limitations or problems. When a substance serving as a nutrient source for microorganisms is separately added, secondary contamination of the additive often poses a problem. In addition, there are reports that the addition of such nutrients interferes with biodegradation. In the method of supplying the enzyme, the activity of decomposing the microorganism depends on the permeability of the environment where the substrate is present. Furthermore, it has been shown that the position of the substituents on the substrate influences the oxidation, indicating the limitations of this method.
[0006]
On the other hand, homoserine lactones or acylated homoserine lactones are known as basic regulators widely used for bacteria including human pathogenic bacteria. This control system was first discovered for bioluminescent bacteria, but has been found in many other microorganisms and is involved in a wide variety of microbial activities. These activities include the production of extracellular enzymes in the plant pathogens Erwinia carotovora and the causative agent of cystic fibrosis Pseudomonas aeruginosa, and Agrobacterium tumefaciens (Agrobacterium @ tumefaciens) is known to introduce a Ti plasmid into a plant. However, the activity of promoting substance transport between cell membranes of microorganisms has not been known.
[0007]
In recent years, the existence of a drug efflux pump as a drug efflux mechanism has been recognized through analysis and research on the resistance mechanism of resistant bacteria. In 1980, a pump that specifically excretes a tetracycline-based antibacterial drug out of cells was identified by the Levy group in 1980 (see Non-Patent Document 1), and it was noted as a main factor of tetracycline resistance. More recent studies have reported the presence of multidrug efflux pumps in Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, staphylococci, pneumococci and gonococci. Among them, four types of multidrug efflux pumps have been reported as drug efflux pumps of Pseudomonas aeruginosa having homology, and recently the entire genome sequence of Pseudomonas aeruginosa has been elucidated. The sequence confirms the presence of a further 5 to 6 new multidrug discharge pumps, a total of 10 types. However, it was not known that these efflux pumps were involved in the activity of microorganisms.
[0008]
[Non-patent document 1]
L. {McMurry,} Proc. {Natl. {Acad. {Sci. U. S. A. , $ 77, $ 3974, $ 1980
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide an efficient and environmentally friendly method for decomposing and purifying microorganisms of hardly decomposable substances such as polycyclic aromatic compounds and nitrogen compounds.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors are not limited to the conventional method, paying attention to intercellular substance transport of microorganisms and conducting intensive research, it has been found that proteins involved in substance transport between cell membranes are involved in the activity of microorganisms, and Acylated homoserine lactones are substances that control the activity of microorganisms, and in particular promote the expression of proteins involved in the transport of substances between cell membranes, and as a result, are difficult to decompose by microorganisms, especially polycyclic aromatic compounds and nitrogen. The inventors have found that the compound has an effect of accelerating the decomposition of the compound, and have completed the present invention.
[0011]
That is, the present invention includes the following inventions.
(1) Formula I:
Embedded image
An agent which promotes substance transport between cell membranes of microorganisms, comprising a compound represented by the formula:
(2) A method for increasing the activity of a microorganism by promoting the substance transport between cell membranes of the microorganism using the agent according to (1).
(3) A method for decomposing a hardly decomposable substance using the drug and the microorganism according to (1).
(4) The method according to (2) or (3), wherein the microorganism is one into which a gene encoding an efflux pump has been introduced.
(5) A method of decomposing a hardly decomposable substance using a microorganism into which a gene encoding an efflux pump has been introduced.
(6) A microorganism into which a gene encoding an efflux pump has been introduced by genetic recombination for use in the method according to (4) or (5).
[0012]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The present inventors have attempted to decompose nitrite, which is a hardly decomposable substance, using a recombinant microorganism into which an efflux pump gene has been introduced. As a result, they have found that the decomposition activity is improved as compared with the wild type. That is, they found that the discharge pump had a function of improving the metabolism of microorganisms, and was involved in the decomposition of hardly decomposable substances by microorganisms.
[0013]
In addition, it has been suggested that acylated homoserine lactones may have a controlling activity on the metabolism of microorganisms, but the specific action has not been sufficiently elucidated. The present inventors have further found that acylated homoserine lactones are substances involved in the expression of an efflux pump of a microorganism by a method as described below.
[0014]
That is, a reporter gene was introduced into a gene encoding an efflux pump, and the activity of the reporter gene was measured to easily monitor the expression status of the efflux pump. A reporter gene (xylE) encoding a catechol 2,3 dioxygenase gene was introduced into the mexA-mexB-oprM gene on the P. aeruginosa chromosome by homologous recombination to construct a reporter gene-introduced strain PAO1-Xyl. The strain was used to measure the effect of inducing the efflux pump by acylated homoserine lactones. As the concentration of the acylated homoserine lactone was increased, the efflux pump was induced in a concentration-dependent manner up to about 25 μM. Since then, I have found that it is kept constant. From the above, it was revealed that acylated homoserine lactones induced the expression of bacterial efflux pump.
[0015]
The acylated homoserine lactones of the present invention promote the expression of efflux pumps in microorganisms, and consequently promote the transport of substances between cell membranes in microorganisms. Therefore, the acylated homoserine lactone of the present invention can be used as an agent for promoting the transport of substances between cell membranes of microorganisms.
[0016]
Acylated homoserine lactones function as autoinducers, and by changing their concentration or physical properties, bind to regulatory proteins present in cells or bound to membranes and are controlled by the regulatory proteins Controls the expression of a group of genes. An autoinducer means a small molecule substance that is produced in an organism, acts on the cell itself or surrounding cells, and affects gene expression at a relatively low concentration.
[0017]
In the present invention, formula I:
Embedded image
[0018]
In the formula I, R is a linear or branched optionally substituted acyl group having 2 to 14 carbon atoms, preferably 4 to 12 carbon atoms. Examples of the substituent include a hydroxyl group and an oxo group. No. An unsubstituted saturated aliphatic acyl group and a saturated aliphatic acyl group having an oxo group at the 3-position are preferred.
[0019]
Specific examples of R include, but are not particularly limited to, for example, acetyl, propionyl, 3-oxopropionyl, butyryl, 3-oxobutyryl, isobutyryl, heptanoyl, 3-oxoheptanoyl, valeryl, 3-oxovaleryl group, isovaleryl group, 3-oxoisovaleryl group, nonanoyl group, 3-oxononanoyl group, pivaloyl group, hexanoyl group, 3-oxohexanoyl group, octanoyl group, 3-oxooctanoyl group, lauroyl group, Examples thereof include a 3-oxododecanoyl group, a palmitoyl group, a 3-oxopalmitoyl group, a stearoyl group, a 3-oxostearoyl group, a myristoyl group, and a 3-oxomyristoyl group.
[0020]
Specific examples of the acylated homoserine lactone represented by the formula I include, but are not particularly limited to, N-butyryl-L-homoserine lactone, N- (3-hydroxybutyryl) -L-homoserine lactone, N- Hexanoyl-L-homoserine lactone, N- (3-oxohexanoyl) -L-homoserine lactone, N-octanoyl-L-homoserine lactone, N- (3-oxooctanoyl) -L-homoserine lactone, N-decanoyl- L-homoserine lactone, N- (3-oxodecanoyl) -L-homoserine lactone, N- (3-oxododecanoyl) -L-homoserine lactone, N- (7-cistetradecanoyl) -homoserine lactone or N- ( 3-hydroxy-7-cistetradecanoyl) -L-homoserine lactone and the like Bets can be, N- butyryl -L- homoserine lactone are preferred.
[0021]
The acylated homoserine lactone of the present invention can be synthesized, for example, by forming an amide bond between an aliphatic carboxylic acid or an ester thereof and a cyclic amino acid. Acylated homoserine lactones are described, for example, in Chhabra, S. R. , P. Stead, N. {J. Bainton, G. P. C. Salmond, G. S. A. B. Stewart, P. Williams, {and} B. W. Bycroft, J. {Antibiot. , $ 46, $ 441-454, $ 1993, Zhang, $ L. , P. {J. {Murphy, A .; Kerr, and M. E. {Tate, @Nature, $ 362, $ 446-448, $ 1993, Schaeffer} A. L. , B. L. Hanzelka, A. Eberhard, and E. P. Greenberg, J. {Bacteriol. 178, 2897-2901, 1996, Gao, JJ. -G. {And} E. A. {Meighen. {J. {Bacteriol. , 175, 3856-3862, 1993, and the like.
[0022]
Further, since the acylated homoserine lactone of the present invention is biosynthesized by a microorganism, it can be separated and purified from a culture obtained by culturing the microorganism by a method generally used in the art.
[0023]
Microorganisms capable of promoting mass transport between cell membranes by the agent of the present invention are not particularly limited, but Pseudomonas, Escherichia II, Salmonella, Shigella, and Klebsiella II. Genus, genus Proteus, genus Morganella, genus Providencia, genus Citrobacter, genus Bacteroides, genus Streptococcus, Staphylococcus, Staphylococcus Enterobacter, genus Serrati ) Genus, Acinetobacter, Yersinia, Haemophilus, Pasteurella, Branhamella, Helicobacter, Helicobacter, Rep. , Vibrio, Legionella, Listeria, Neisseria, Gardnerella, Clostridium, Mycobacterium (Mycobacterium), Mycobacterium (Mycobacterium) ), Enterococcus, Strenotrophomonas, Burkholderia, Aeromonas, Francisella, Bordetella, Bordetella and Bordetella A wide variety of bacteria including Gram-positive bacteria and Gram-negative bacteria belonging to the genus Rhizobium and the like. In particular, those having an activity of decomposing hardly decomposable substances are preferable.
[0024]
More specifically, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas acidovorans, Pseudomonas alcaligenes, Pseudomonas phosmonad phosmonad phosmonad phosmonad phosmonad phosmonas phosmonad phosmonad phosmonad phosmonas phomonas phosmonad phosmonas phosmonas phosmonad phosmonas phosmonad phosmonas phosmonas phosmonas phosmonas phos. Philia (Strenotrophomonas maltophilia), Burkholderia cepacia, Aeromonas hydrophilia, Escherichia coli, Citrobacter acter freundii, Salmonella typhimurium, Salmonella typhi, Salmonella paratyphi, Salmonella enterigeris germ, and Shigella s. (Shigella sonei), Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca iella @ oxytoca, Serratia @ marcescens, F. serrata (Francisella @ tularensis), Morganella moriganii (Morganellaeni morisiis, Proteus milaviris, Proteus milaviris, Proteus milaviris, Proteus milaviris) ), Providencia lettgeri, Providencia stuartii, Acinetobacter calcoaceticus, Acinetto Bacter haemolytics (Acinetobacter @ haemolyticus), Erzinia enterolytica (Yersinia @ enterocolitica), Yersinia @ pestis, Pseudotuberculosis eruginia (Yersinia @ pseudoercinia) B. pertussis (Bordetella @ parapertussis), B. bronchiseptica (B. bronchiseptica), H. influenzae (Haemophilus @ influenzae), H. parainfluenzae (Haemophilus @ par) influenzae), Haemophilus Hemoritikusu (Haemophilus haemolyticus), Haemophilus para f Mori Politics (Haemophilus parahaemolyticus), Haemophilus ducreyi (Haemophilus ducreyi), Pasteurella multocida (Pasteurella multocida), Pasteurella haemolytica (Pasteurella haemolytica), catarrh aureus (Branhamella haemolytica ), Catharcoccus (Branhamella catarrhalis), Helicobacter pylori, Campylobacter fetus, Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Borrelia burgdorferi, Vibrio choleraeio lipeio variegio lipeio variego lipeio variego lipoergioe lipoergioe lipo phiero gioe phia oleo gio phiero gioerre gio phiero gioe phia eo phierio tyre Ｖ ヘ ｊ ン ピ ロ ピ ロ ン ン. pneumophila, Listeria monocytogenes, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Gardnerella vaginalis, Gardnerella vaginalis Fragilis (Bacteroides fragilis), Bacteroides Disutasonisu (Bacteroides distasonis), Bacteroides (Bacteroides) 3452A cognate group, Bacteroides Burugatusu (Bacteroides vulgatus), Bacteroides Obarusu (Bacteroides ovalus), Bacteroides thetaiotaomicron (Bacteroides thetaiotaomicron), Bacteroides Uniformis (Bacteroides @ uniformis), Bacteroides @ eggerthiii, Bacteroides @ splannicics ), Clostridium difficile, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium erium bacterium, Mycobacterium erium bacterium, Mycobacterium erium bacterium, Mycobacterium erium bacterium, and the like. diphtheriae), Corynebacterium ulcerans (Corynebacterium ulcerans), Streptococcus pneumoniae (Streptococcus pneumoniae), Streptococcus agalactiae Streptococcus pyogenes (Streptococcus pyogenes), Enterococcus faecalis (Enterococcus faecalis), Enterococcus faecium (Enterococcus faecium), Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus), Staphylococcus epidermidis (Staphylococcus epidermidis), Staphylococcus support profilin Genetics (Staphylococcus saprophyticus ), Staphylococcus intermedius, Staphylococcus hyycus, Staphylococcus simulans (Stapyl) ococcus simulans), Staphylococcus Hemoritikusu (Staphylococcus haemolyticus), Staphylococcus hominis (Staphylococcus hominis), Staphylococcus Sacca Lori Genetics (Staphylococcus saccharolyticus), Erwinia Karutobora (Erwinia carotovora), Rhizobium leguminosarum (Rhizobium leguminosarum ) And the like.
[0025]
The medicament of the present invention may be a Pseudomonas spp., Especially Pseudomonas aeruginosa, Burcoholderia spp., Especially Burkholderia cepacia, Erwinia spp., Especially Erwinia ｖ carotovora, Escherichia spp. It can be suitably used in promoting mass transport. Furthermore, when promoting the transport of substances between cell membranes in Pseudomonas aeruginosa, it is preferable to use strains such as PAO1, N135, nalB, nfxB, and nfxC.
[0026]
The acylated homoserine lactone of the present invention can also be used as a drug for promoting the transmembrane substance transfer of a microorganism into which an efflux pump gene has been introduced by genetic recombination.
[0027]
In the present invention, the “efflux pump” means a set of proteins that export various compounds including sugars and amino acids in an energy-dependent manner from the cytoplasm or peripheral cytoplasm of a cell. Thus, efflux pumps are typically located in the cell's cell membrane. In Gram-negative bacteria, the efflux pump can span the peripheral cavity, and there can also be a portion of the efflux pump that spans the outer membrane.
[0028]
The efflux pumps present in Pseudomonas aeruginosa include those that are part of the efflux pump overexpressed by Pseudomonas aeruginosa MexA-MexB-OprM or Pseudomonas aeruginosa strain K385 or efflux pump overexpressed by Pseudomonas aeruginosa strain PAO4098E. Polypeptides having at least 30% amino acid sequence similarity to the peptide are included.
[0029]
The MexA-MexB-OprM efflux pump is a membrane protein of the RND family that is constitutively expressed in the Pseudomonas aeruginosa wild type strain (Pseudomonas aeruginosa PAO1). MexA is a peripheral protein anchoring to the inner membrane, MexB is an inner membrane protein that has penetrated the inner membrane 12 times, and OprM is a channel protein present in the outer membrane. These three subunits constitute the MexA-mexB-OprM discharge pump. To date, various antibiotics, such as β-lactam agents, quinolone agents, chloramphenicol, and other organic solvents, and 3oxoC-12HSL, which is one of the autoinducers, have been known as substrates for this efflux pump. It is also known that this efflux pump is deeply involved in the resistance to antibiotics and organic solvents, and the production of secondary metabolites (toxins, proteases, pigments, etc.) of Pseudomonas aeruginosa. For the MexA-mexB-OprM efflux pump and its base sequence, see Poole, K. Et al., {Mol. {Microbiol. $ 10 (3), $ 529-544, $ 1993 and Poole, $ K. J. et al. {Bacteriol. No. 175 (22), No. 7363-7372, No. 1993 and the like.
[0030]
Other efflux pumps include proteins belonging to the RND family, MFS family, SMR family, ABC family, MATE family. Specifically, as those belonging to the RND family, Pexobacterium aeruginosa MexE-MexF-OprN efflux pump (Kohler, T. et al., Mol. Microbiol. 23, 345-354, 1997), MexX-MexY efflux pump ( M. T. et al., Antimicrob. Agents Chemother. 43, 415-417, 1999), MexC-MexD-OprJ discharge pump (Poole, K. et al., Mol. Microbiol. 21 (4), 713-724, 1996). As members belonging to the MFS family, E. coli MdfA efflux pumps (Edgar R. et al., J. Bacterial. 179, 2274-2280, 1997) and those belonging to the MATE family As a member of the ABC family, Escherichia coli HlyBD efflux pumps (Dinh T. et al., J. Bacteriol) include Escherichia coli YdhE efflux pump (Morita Y. et al., Antimicrob. Agents ｏ chemother. $ 176, $ 3825-3831, $ 1994).
[0031]
In Pseudomonas aeruginosa, it is considered that N-dodecanoyl-L-homoserine lactone binds to the LasR protein and N-butyryl-L-homoserine lactone binds to RhIR to regulate downstream genes. Then, it is considered that the complex of RhIR and the acylated homoserine lactone expresses an efflux pump. This complex can directly promote the transcription of the efflux pump, change the expression level of the efflux pump regulatory gene to promote the expression of the efflux pump gene, or promote the qualitative change of the efflux pump regulatory gene to thereby increase the efflux pump. It is thought to promote gene expression.
[0032]
The acylated homoserine lactone of the present invention has a function of switching the metabolic function of a microorganism by promoting the excretion of substances in the microorganism. Therefore, the activity of a microorganism can be increased by using the acylated homoserine lactone of the present invention. In the present invention, “activity of a microorganism” is not particularly limited, but includes a growth activity of a microorganism, a metabolic activity of a microorganism, an activity of decomposing microorganisms that are hardly decomposable, and the like, a solvent resistance performance of a microorganism and an infectivity of a microorganism. Means
[0033]
The substance discharge mechanism by acylated homoserine lactones can be applied to environmental purification by microorganisms. The problem with microbial degradation of hard-to-degrade substances is that many of the genes involved in degradation are secondary metabolism genes, that is, genes that are not expressed until the growth of microorganisms reaches a stationary phase, and that degradation products The accumulation may result in a reduction in the decomposition rate. When the acylated homoserine lactone of the present invention is added, the metabolism of a microorganism having a decomposition activity can be switched, and the decomposition gene can be expressed at an early stage. Therefore, by using the acylated homoserine lactone of the present invention together with a microorganism, a hardly decomposable substance can be efficiently decomposed. Moreover, since the method of the present invention promotes the expression of a discharge pump and promotes the mechanism of discharging the substances of microorganisms, the products generated in the decomposition process can be efficiently discharged outside the microorganisms, and the decomposition and purification of pollutants can be performed. Efficiency can be further improved. In addition, acylated homoserine lactones are made of fatty acids and amino acids and are considered to be easily decomposable, so they are environmentally friendly and can be applied in large quantities.
[0034]
In the present invention, “refractory substance” means, for example, high CODMnRefers to organic matter in wastewater of a value (for example, a reference value or more determined based on the Pollution Control Act). Specific examples of the hardly decomposable substance include, for example, phenols, cyanides, aromatic nitro compounds, chloro compounds, nitriles, alkylbenzene sulfonic acids, polyvinyl chloride, polyvinyl alcohol, fatty acid polyesters, polyethylene glycol, phthalate esters, petroleum esters And polycyclic aromatics such as benzothiophene, nitrous acid, and nitric acid. The present invention is particularly effective for decomposing nitrogen compounds such as nitrous acid and nitric acid.
Pseudomonas is preferably used for all decomposition objects.
[0035]
In the method for decomposing a hardly decomposable substance of the present invention, a treatment method using microorganisms and acylated homoserine lactones is not particularly limited, and those skilled in the art can use microorganisms and acylated homoserine lactones. It can be appropriately selected depending on the kind of the class. The aerobic treatment method includes, for example, a biofilm method (a trickling filter method and a rotating disk method), an activated sludge method and an oxidation pond method, and the anaerobic treatment method includes a medium temperature method and a high temperature method. Can be In one embodiment of the present invention, a microorganism is cultured in the presence of an acylated homoserine lactone, a waste liquid containing the target insoluble substance is added to the culture solution, and the culture is further performed to remove the insoluble substance. It can be decomposed efficiently. The acylated homoserine lactone may be added to the medium in advance, or may be added to the culture solution when the cultivated microorganism reaches an appropriate concentration. The concentration of the acylated homoserine lactone in the culture solution is not particularly limited, but is 20 μM to 10 mM, preferably 40 μM to 1 mM. The culture medium for culture can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the microorganism used, and is not particularly limited. That is, a natural medium or a synthetic medium can be used as long as the medium appropriately contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, vitamins, and other nutrient factors.
[0036]
The method of the present invention can be combined with physical / chemical treatment methods such as ozone oxidation, hydrogen peroxide-ultraviolet irradiation, ozone-ultraviolet irradiation, Fenton oxidation, wet oxidation, activated carbon adsorption and the like.
[0037]
In the method for activating microorganisms and the method for decomposing hardly decomposable substances, a microorganism into which a gene encoding an efflux pump has been introduced by genetic recombination can also be used. Even if such a microorganism does not originally express an efflux pump, acylated homoserine lactones can promote the excretion of the substance, increase its activity, and efficiently decompose hardly decomposable substances. This is because it becomes possible. Therefore, when a microorganism into which a gene encoding an efflux pump has been introduced by genetic recombination and a microorganism that expresses a large number of efflux pumps is used, even when an acylated homoserine lactone is not used, it is hardly degraded. Active substances can be decomposed efficiently. It is preferable to introduce the efflux pump gene into a microorganism of the same species as the species from which the efflux pump is derived, or a bacterium belonging to the genus if it is a bacterium.
[0038]
Introduction of an efflux pump gene into a microorganism can be performed by a method known to those skilled in the art. For example, the method described in Molecular Cloning {Second Edition, Current Protocols in Molecular Biology} Supplements 1-34, etc. can be used to express the efflux pump gene in a host microorganism.
[0039]
That is, a recombinant vector in which the efflux pump gene is inserted downstream of the promoter of an appropriate expression vector is prepared, and the vector is introduced into a target host microorganism to obtain a recombinant expressing the efflux pump gene. can do.
[0040]
As the expression vector, a vector capable of autonomous replication in a microorganism into which a gene is introduced or a vector capable of integration into a chromosome is used. When introducing a gene into a prokaryote such as a bacterium, the expression vector is preferably composed of a promoter, a ribosome binding sequence, an efflux pump gene, a transcription termination sequence, and the like. A gene that controls the promoter may be included.
[0041]
The expression vector is not particularly limited. For example, pBTrp2, pBTac1, pBTac2 (all commercially available from Boehringer Mannheim), pSE280 (Invitrogen), pGEMEX-1 (Promega), pQE-8 (QIAGEN) ), PKYP10 (JP-A-58-110600), pKYP200 (Agric. Biol. Chem., 48, 669, 1984), pLSA1 (Agric. Biol. Chem., 53, 277, 1989), pGEL1 (Proc. Nat. Acad. @ Sci., USA, 82, 4306, 1985), pBluescript II SK (-) (Stratagene), pBluescript II SK (+) STRATAGENE Co.), pMMB67EH (Maseda et, Antimicrob. Agents Chemother. 44 (3), 658-64, may be exemplified 2000) and the like.
[0042]
Examples of the promoter include trp promoter, lac promoter, PLPromoter, PRExamples of the promoter include a promoter derived from Escherichia coli and a phage such as a PletI promoter, an SPO1 promoter, an SPO2 promoter, a penP promoter and the like. Further, a promoter in which two trp promoters are connected in series, a promoter artificially designed and modified such as a tac promoter, and the like can be used. It is preferable to use a plasmid in which the distance between the Shine-Dalgarno sequence and the initiation codon is adjusted to an appropriate distance (for example, 6 to 18 bases).
[0043]
As a method for introducing a recombinant vector, any method for introducing DNA into a host cell can be used. For example, a method using calcium ions (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110, 1972) ), The protoplast method (JP-A-63-248394), and the methods described in Gene, No. 17, No. 107, No. 1982, and Molecular & General Genetics, No. 168, No. 111, No. 1979, and the like.
[0044]
When the transformant of the present invention is a prokaryote such as Escherichia coli or a eukaryote such as yeast, the medium for culturing these organisms contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like that can be used by the organism. Any of a natural medium and a synthetic medium may be used as long as the medium can efficiently culture the transformant.
[0045]
If necessary, an antibiotic such as ampicillin or tetracycline may be added to the medium during the culture. When culturing a microorganism transformed with an expression vector using an inducible promoter as a promoter, an inducer may be added to the medium as necessary. For example, when culturing a microorganism transformed with an expression vector using a lac promoter, culturing a microorganism transformed with isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) or the like using an expression vector using a trp promoter. In some cases, indole acrylic acid (IAA) or the like may be added to the medium.
[0046]
In addition, proteins related to the efflux pump have their own signal peptide. Therefore, it is efficiently localized on the membrane and functions as a membrane protein. In addition, it has been shown that high expression of only the efflux pump gene functions (Maseda et al., Antimicrob. Agents Chemother. $ 44 (3), $ 658-64, $ 2000).
[0047]
【Example】
Embodiment 1 FIG. Enhanced efflux pump expression by acylated homoserine lactones
A gene PAO1-Xyl, in which a reporter gene xylE gene was introduced into a mexA-mexB-oprM operon encoding a MexA-MexB-OprM efflux pump, which is an efflux pump for Pseudomonas aeruginosa, was transformed into an LB medium (1% @ tryptone, 0%). The cells were cultured overnight at 37 ° C. in 0.5% yeast extract, 1% NaCl). 20 μl of the culture was inoculated into 4 ml of a new LB medium and cultured for 3 hours. Subsequently, N-butyryl-L-homoserine lactone was added to the culture solution to a final concentration of 0, 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200 μM. Then, after further culturing for 3 hours, the cells were collected. The obtained cells were suspended in a 50 mM potassium phosphate solution having a pH of 7.5, the cells were disrupted by ultrasonication, and centrifuged at 15,000 rpm for 5 minutes to remove undestructed cells and cell residues, thereby obtaining crude cells. An enzyme solution was prepared. The crude enzyme solution was appropriately diluted with a 50 mM potassium phosphate solution, 10 μl of a 100 mM catechol solution was added to 990 μl, and the increase in absorbance at 375 nm due to the decomposition of catechol was measured to determine the catechol 2,3 dioxygenase activity. It was measured. As a result, until the concentration of N-butyryl-L-homoserine lactone becomes 25 μM, the activity of xylE gene product, catechol 2,3 dioxygenase, increases depending on the concentration of N-butyryl-L-homoserine lactone. At higher concentrations, it remained at a constant high activity value. The results are shown in FIG.
[0048]
Example 2 Degradation of nitrite, an environmentally persistent and hardly degradable substance, by a recombinant bacterium transfected with an efflux pump
The mexEFN gene derived from Pseudomonas aeruginosa PAO1 was incorporated into pMMB67EH, an expression vector for Pseudomonas, to produce pMEFN. This pMEFN was introduced into Burkholderia \ cepacia \ NH-17 to obtain Burkholderia \ cepacia \ NH17 / pMEFN.
[0049]
In the culture using the recombinant denitrifying bacterium into which the mexEFN gene, which is one of the efflux pumps belonging to the RND family, was introduced, the usual bacterial culture method was used. For culturing, NN medium (per liter, 0.06 g of sodium nitrite, 10 g of glucose, 10 g of peptone, 0.1 g of magnesium heptahydrate, 2.0 g of dipotassium monohydrogen phosphate, 1.0 g of yeast extract, pH 7.2) )It was used. 30 ml of the above medium to which nitrous acid was added to a concentration of 5 mM was placed in a closed culture flask sealed with a butyl rubber stopper, and a platinum loop of a recombinant denitrifying bacterium Burkholderia cepacia NH17 / pMEFN with enhanced membrane permeability was added. And cultured at 30 ° C. with shaking.2O was measured. N2O was measured with a gas chromatograph GC-14B (SHIMADZU).
[0050]
As a result, in the strain with enhanced membrane permeability, it was confirmed that the decomposition of nitrite was promoted and the amount of denitrification was about 10 times (Table 1).
[0051]
[Table 1]
So far, there has been no report on enhancing the denitrification capacity by breeding denitrifying bacteria. The denitrification effect of about 10 times due to the enhancement of the membrane permeability of microorganisms shown by this example indicates that the present invention enables efficient decomposition of nitrous acid and nitric acid. Further, since it is clear from Example 1 that the expression of this efflux pump gene is induced by acylated homoserine lactones, it is considered that the induction has the same effect of promoting degradation.
[0053]
【The invention's effect】
According to the present invention, the activity of microorganisms can be increased by promoting the excretion of substances in microorganisms and switching metabolism in microorganisms. In addition, by switching the metabolism of a microorganism having a decomposition activity, a decomposition gene of the microorganism can be expressed at an early stage, and a hardly decomposable substance can be efficiently decomposed. In addition, since the decomposition method of the present invention promotes the expression of the discharge pump and promotes the substance discharge mechanism of the microorganisms, the products generated in the decomposition process can be efficiently discharged out of the microorganisms, and the method is environmentally friendly and sprays a large amount. Is possible, the efficiency of decomposition and purification of pollutants can be further improved. Further, the efficiency and speed of the sewage treatment can be expected, and the cost can be reduced.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the concentration of N-butyryl-L-homoserine lactone and the concentration of catechol 2,3 di when a reporter gene-introduced strain (PAO1-Xyl strain) and N-butyryl-L-homoserine lactone in Example 1 were cultured. It is a graph showing the relationship of oxygenase activity.
Claims (6)
で表される化合物を含む、微生物の細胞膜間の物質輸送を促進する薬剤。Formula I:
An agent which promotes substance transport between cell membranes of microorganisms, comprising a compound represented by the formula:
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