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JP2003528570A - ワクチンおよび遺伝子療法用の組換えインフルエンザウイルス - Google Patents

ワクチンおよび遺伝子療法用の組換えインフルエンザウイルス

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JP2003528570A
JP2003528570A JP2000609542A JP2000609542A JP2003528570A JP 2003528570 A JP2003528570 A JP 2003528570A JP 2000609542 A JP2000609542 A JP 2000609542A JP 2000609542 A JP2000609542 A JP 2000609542A JP 2003528570 A JP2003528570 A JP 2003528570A
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vector
virus
rna polymerase
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JP5543048B2 (ja
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ヨシヒロ カワオカ
ニユーマン，ガブリール
Original Assignee
ウイスコンシン・アルムニ・リサーチ・フアンデーシヨン
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、インフルエンザＡ型ウイルスを例えばヘルパーウイルスの不存在下で調製するために有用な組成物を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 政府の権利の声明 本発明は、アメリカ合衆国政府の補助でなされた（国立アレルギーおよび感染
症公衆衛生総局からの交付AI−29599）。政府は本発明に一定の権利を有するこ
とができる。
【０００２】 発明の背景 クローン化したcDNAから感染性のRNAウイルスを作成する能力は、このような
病原体に生物学的解明、したがって疾患の制御の改善法に大きく寄与ししてきた
（Palese et al.,1996）。しかしこの過程は、ゲノムウイルスRNA（vRNA）も（
−）−センスRNAウイルスのアンチゲノミック相補的RNA（cRNA）も、タンパク質
合成の直接の鋳型として役立つことができないので、（＋）−センスRNAウイル
スに比べて（−）−センスは比較的限定されてきた。それどころかvRNAはウイル
ス核タンパク質（NP）によるカプシド化の後に、ウイルスRNAポリメラーゼ複合
体により（＋）−センスmRNAに転写されなければならない。すなわち最小複製単
位は、NPおよびポリメラーゼタンパク質と複合化したゲノムvRNAにより形成され
る。このような障害物にもかかわらず、非分離（−）センスRNAウイルスを生産
するために、狂犬病ウイルス（Snell et al.,1994）、水疱性口内炎ウイルス（L
awson et al.,1995)；Whelan et al.,1995)、はしかウイルス（Radecke et al.,
1995)、ＲＳウイルス（respiratory syncytial virus）（Collins et al.,1995
）、センダイウイルス（Garcin et al.,1995；Kato et al.,1996）、牛疫ウイル
ス（Baron et al.,1997）、ヒトパラインフルエンザウイルス３型（Hoffman et
al.,1997）およびＳＶ５（He et al.,1997）を含む逆の遺伝法が確立された。
オルトミクソウイルス科（Orthomyxoviridae）、アレナウイルス科（Arenavirid ae ）およびブニヤウイルス科（Bunyaviridae）のファミリーは、分離した（−）
鎖RNAゲノムを含み、そして数種のヒトおよび動物病原体、例えばインフルエン
ザウイルスＡ、ＢおよびＣ型（オルトミクソウイルス科（Orthomyxoviridae））
、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（LCMV）（アレナウイルス科（Arenaviridae）
）、および脳炎および出血性熱ウイルス（ブニヤウイルス科（Bunyaviridae）、
アレナウイルス科（Arenaviridae））を含む。それらのゲノムは２つ（アレナウ
イルス科（Arenaviridae））、３つ（ブニヤウイルス科（Bunyaviridae））、ま
たは６〜８つ（オルトミクソウイルス科（Orthomyxoviridae））の負の極性の１
本鎖RNA分子から成る（mRNAに相補的）。vRNAはNPおよびウイルスRNA-依存的RNA
-ポリメラーゼと相互作用して、リボ核タンパク質複合体（RNP)を形成する。こ
のRNPは宿主細胞に由来する脂質二重層に囲まれている。このエンベロップに挿
入されているのが糖タンパク質であり、これらはレセプターの結合および宿主細
胞への侵入に必須である。このように分離された（−）−センスRNAウイルスを
クローン化されたcDNAから生成することは、各遺伝子セグメントについて分離し
たvRNAを生成しなければならないので、おそろしく難しい問題を提起する。
【０００３】 Bridgen および Elliott（1996）は、アンチゲノムな（＋）−センスRNAの３
つのセグメントをコードするクローン化cDNAからブニアムベラウイルス（ブニヤ
ウイルス科（Bunyaviridae）)を生産した。しかしウイルス回収の効率は低かっ
た。（−）−センスRNAの６つ（トゴトウイルス：thogotovirus）、７つ（イン
フルエンザＣ型ウイルス）または８つ（インフルエンザＡおよびＢ型ウイルス）
のセグメントを含むオルトミクソウイルスのいずれも、クローン化されたcDNAか
ら完全に生産されなかった。この進行におけるずれが、インフルエンザウイルス
感染を制御するための努力の中で最も急がれている。
【０００４】 Paleseおよび共同研究者は（Enami et al.,1990）、インフルエンザＡ型ウイ
ルスに関する逆遺伝のヘルパーウイルス−依存的系の開拓した（図１Ａ）。彼ら
の取り組みでは、RNP複合体を精製されたポリメラーゼおよびNPタンパク質の存
在下でインビトロvRNA合成により生成し、そして次いでそれらを使用して真核細
胞を感染させる。続いてインフルエンザＡ型ヘルパーウイルスの感染により、ク
ローン化cDNAから誘導された遺伝子を保有するウイルスの作成をもたらす。Neum
ann et al.,(1994)により開発された第２の方法は、RNAポリメラーゼI（5'キャ
ップおよび3'ポリAテイルの両方を欠くリボゾームRNAを転写する細胞性酵素）に
よるvRNAのインビトロ合成に基づく。インフルエンザウイルスに感染し、そして
クローン化されたインフルエンザウイルスcDNA（マウスRNAポリメラーゼIプロモ
ーターおよび終結配列に挟まれている）を含むプラスミドでトランスフェクトさ
れた細胞は、トランスフェクション体ウイルスの生産を導いた。しかし両方法と
も、トランスフェクション体は膨大な数のヘルパーウイルスのバックグラウンド
から選択されなければならず、これは強力な選択系を必要とし、そして成長−欠
損性ウイルスの作成を複雑にする。
【０００５】 複製−できない（incompetent）ウイルス様粒子(VLP)を生成するための系は、
Mena et al.(1996)により開発され、ここでレポータ遺伝子をコードするインフ
ルエンザウイルス−様vRNAがインビトロで転写され、そして真核細胞中にトラン
スフェクトされる。すべての１０個のインフルエンザウイルスタンパク質は、T7
RNAポリメラーゼプロモーターの制御下でプラスミドから発現する。トランスフ
ェクトされた細胞を、T7 RNAポリメラーゼを発現した組換えワクシニアウイルス
に感染させる時、細胞はインフルエンザVLPを生産した。しかしこの系の効率は
低く；実験の25％で、研究者はレポーター遺伝子発現を検出できなかった。さら
に、ワクシニアウイルスは80以上のタンパク質を発現し、そのいずれもがインフ
ルエンザウイルスの生活環に影響を及ぼし得る。
【０００６】 このように、必要とされているのは分離された（−）鎖RNAウイルス、例えば
インフルエンザＡ型ウイルスのようなオルトミクソウイルスを、クローン化され
たcDNAから完全に調製するための方法である。
【０００７】 発明の要約 本発明は、少なくとも１つの以下の単離され、そして精製されたベクターを提
供する：転写終結配列に連結されたインフルエンザ ウイルスPA cDNAに操作可能
に連結されたプロモーターを含んで成るベクター、転写終結配列に連結されたイ
ンフルエンザ ウイルスPB1 cDNAに操作可能に連結されたプロモーターを含んで
成るベクター、転写終結配列に連結されたインフルエンザ ウイルスPB2 cDNAに
操作可能に連結されたプロモーターを含んで成るベクター、転写終結配列に連結
されたインフルエンザ ウイルスHA cDNAに操作可能に連結されたプロモーターを
含んで成るベクター、転写終結配列に連結されたインフルエンザ ウイルスNP cD
NAに操作可能に連結されたプロモーターを含んで成るベクター、転写終結配列に
連結されたインフルエンザ ウイルスNA cDNAに操作可能に連結されたプロモータ
ーを含んで成るベクター、転写終結配列に連結されたインフルエンザ ウイルスM
cDNAに操作可能に連結されたプロモーターを含んで成るベクターおよび転写終
結配列に連結されたインフルエンザ ウイルスNS cDNAに操作可能に連結されたプ
ロモーターを含んで成るベクター。cDNAはプロモーターに対してセンスまたはア
ンチセンス方向でよい。すなわち本発明のベクターは、オルトミクソウイルスタ
ンパク質（センス）またはvRNA（アンチセンス）をコードすることができる。ウ
イルスタンパク質を発現するために任意のプロモーターを使用することができる
。vRNAをコードするベクターに好適なプロモーターは限定するわけではないが、
RNAポリメラーゼIプロモーター、RNAポリメラーゼIIプロモーター、RNAポリメラ
ーゼIIIプロモーター、Ｔ７プロモーターおよびＴ３プロモーターである。さら
にRNAポリメラーゼIプロモーターはヒトRNAポリメラーゼIプロモーターが好まし
い。vRNAをコードするベクターに好適な転写終結配列は限定するわけではないが
、RNAポリメラーゼI転写終結配列、RNAポリメラーゼII転写終結配列またはRNAポ
リメラーゼIII転写終結配列、あるいはリボザイムである。好ましくはベクター
はインフルエンザcDNA、例えばインフルエンザＡ型（例えば15HAまたは9NAサブ
タイプを含む任意のインフルエンザＡ型遺伝子）、ＢまたはＣ型 DNA（Fieldsの Virology ( et al.,(編集)、リッピンコット−ラベン出版（Lippincott-Raven Pu
bl.)、フィラデルフィア、ペンシルバニア州(1996)第45および46章を参照にされ
たい。これは引用により本明細書に編入する）を含むが、任意のウイルスの遺伝
子（１つまたは複数）を本発明のベクターまたは方法に使用できると想定される
。
【０００８】 本発明は、本発明の複数のオルトミクソウイルスベクターを含んで成る組成物
を提供する。本発明の１つの態様では、組成物は：ａ）転写終結配列に連結され
たインフルエンザ ウイルスPA cDNAに操作可能に連結されたプロモーターを含ん
で成るベクター、転写終結配列に連結されたインフルエンザ ウイルスPB1 cDNA
に操作可能に連結されたプロモーターを含んで成るベクター、転写終結配列に連
結されたインフルエンザ ウイルスPB2 cDNAに操作可能に連結されたプロモータ
ーを含んで成るベクター、転写終結配列に連結されたインフルエンザ ウイルスH
A cDNAに操作可能に連結されたプロモーターを含んで成るベクター、転写終結配
列に連結されたインフルエンザ ウイルスNP cDNAに操作可能に連結されたプロモ
ーターを含んで成るベクター、転写終結配列に連結されたインフルエンザ ウイ
ルスNA cDNAに操作可能に連結されたプロモーターを含んで成るベクター、転写
終結配列に連結されたインフルエンザ ウイルスM cDNAに操作可能に連結された
プロモーターを含んで成るベクターおよび転写終結配列に連結されたインフルエ
ンザ ウイルスNS cDNAに操作可能に連結されたプロモーターを含んで成るベクタ
ーから選択される少なくとも２つのベクター；およびｂ）インフルエンザ ウイ
ルスPAをコードするベクター、インフルエンザ ウイルスPB1をコードするベクタ
ーおよびインフルエンザ ウイルスPB2をコードするベクターおよびインフルエン
ザ ウイルスNPをコードするベクターから選択される少なくとも２つのベクター
、を含んで成る。好ましくはウイルスタンパク質をコードするベクターはさらに
、転写終結配列を含んで成る。インフルエンザウイルスcDNAを含んで成るベクタ
ー用のプロモーターは、RNAポリメラーゼIプロモーター、RNAポリメラーゼIIプ
ロモーター、RNAポリメラーゼIIIプロモーター、Ｔ７プロモーターおよびＴ３プ
ロモーターを含むことが好ましい。またインフルエンザウイルスcDNAを含んで成
る各ベクターは、RNAポリメラーゼI転写終結配列、RNAポリメラーゼII転写終結
配列またはRNAポリメラーゼIII転写終結配列、あるいはリボザイムのような転写
終結配列を含んで成ることが好ましい。好ましくはベクターはインフルエンザDN
A、例えばインフルエンザＡ型、Ｂ型またはＣ型 DNAを含んで成る。
【０００９】 より好ましくは、組成物は：ａ）RNA ポリメラーゼI転写終結配列に連結され
たインフルエンザ ウイルスPA cDNAに操作可能に連結されたRNA ポリメラーゼI
プロモーターを含んで成るベクター、RNA ポリメラーゼI転写終結配列に連結さ
れたインフルエンザ ウイルスPB1 cDNAに操作可能に連結されたRNA ポリメラー
ゼIプロモーターを含んで成るベクター、RNA ポリメラーゼI転写終結配列に連結
されたインフルエンザ ウイルスPB2 cDNAに操作可能に連結されたRNA ポリメラ
ーゼIプロモーターを含んで成るベクター、RNA ポリメラーゼI転写終結配列に連
結されたインフルエンザ ウイルスHA cDNAに操作可能に連結されたRNA ポリメラ
ーゼIプロモーターを含んで成るベクター、RNA ポリメラーゼI転写終結配列に連
結されたインフルエンザ ウイルスNP cDNAに操作可能に連結されたRNA ポリメラ
ーゼIプロモーターを含んで成るベクター、RNA ポリメラーゼI転写終結配列に連
結されたインフルエンザ ウイルスNA cDNAに操作可能に連結されたRNA ポリメラ
ーゼIプロモーターを含んで成るベクター、RNA ポリメラーゼI転写終結配列に連
結されたインフルエンザ ウイルスM cDNAに操作可能に連結されたRNA ポリメラ
ーゼIプロモーターを含んで成るベクター、およびRNA ポリメラーゼI転写終結配
列に連結されたインフルエンザ ウイルスNS cDNAに操作可能に連結されたRNA ポ
リメラーゼIプロモーターを含んで成るベクターから選択される少なくとも２つ
のベクター；およびｂ）インフルエンザ ウイルスPAをコードするベクター、イ
ンフルエンザ ウイルスPB1をコードするベクター、インフルエンザ ウイルスPB2
をコードするベクター、インフルエンザ ウイルスNPをコードするベクター、イ
ンフルエンザ ウイルスHAをコードするベクター、インフルエンザ ウイルスNAを
コードするベクター、インフルエンザ ウイルスM1をコードするベクター、イン
フルエンザ ウイルスM2をコードするベクターおよびインフルエンザ ウイルスNS
2をコードするベクターから選択される少なくとも２つのベクター、を含んで成
る複数のオルトミクソウイルス ベクターを含んで成る。
【００１０】 本発明の別の態様は、転写終結配列に連結された3'オルトミクソウイルス非-
コード配列に所望する連結された5'オルトミクソウイルス非-コード配列に連結
されたプロモーターを含んで成るベクターをさらに含んで成る上記の本発明の組
成物を含んで成る。そのような組成物のオルトミクソウイルス複製を許容する宿
主細胞への導入は、3'オルトミクソウイルス非-コード配列に連結されたcDNAに
連結された5'オルトミクソウイルス非-コード配列を含んで成るベクターの配列
に対応するvRNAを含んで成る組換えウイルスをもたらす。好ましくはcDNAはアン
チセンス方向である。また好ましくは、プロモーターはRNAポリメラーゼIプロモ
ーター、RNAポリメラーゼIIプロモーター、RNAポリメラーゼIIIプロモーター、
Ｔ７プロモーターおよびＴ３プロモーターである。また転写終結配列は、RNAポ
リメラーゼI転写終結配列、RNAポリメラーゼII転写終結配列またはRNAポリメラ
ーゼIII転写終結配列、またはリボザイムである。例えばcDNAは、ガン治療また
はワクチンに有用なエピトープのような免疫原性エピトープをコードすることが
できる。
【００１１】 本発明の複数のベクターは物理的に結合しているか、あるいは各ベクターは個
々のプラスミド上、あるいは他の例えば直線状の核酸送達媒介物上に存在するこ
とができる。
【００１２】 本発明はまた、インフルエンザウイルスの調製法を提供する。この方法は、細
胞を本発明の複数のベクターと、例えば連続的または同時に、例えば本発明の組
成物を使用して、感染性インフルエンザウイルスを生産するために効果的な量で
接触させることを含んで成る。本発明はまた、組成物と接触した細胞からウイル
スを単離することを含む。すなわち本発明は、単離されたウイルスならびに本発
明の組成物または単離されたウイルスと接触した宿主細胞をさらに提供する。
【００１３】 これから記載するように、インフルエンザＡウイルスはクローン化されたcDNA
から完全に調製された。本明細書に記載する逆遺伝法は高度に効率的であり、そ
して突然変異を任意の遺伝子セグメントに導入し、そしてインフルエンザウイル
スに基づいた遺伝子送達系を開発するために使用することができる。例えばヒト
の胚性腎細胞（293Ｔ）を、ヒトRNAポリメラーゼIプロモーターおよびマウスRNA
ポリメラーゼターミネーターで挟まれた各々がA/WSN/33(HIN)またはA/PR/8/34(H
1N1)ウイルスのウイルスRNAをコードする８つのプラスミドで、ウイルス核タン
パク質およびPB2、PB1およびPAウイルスポリメラーゼをコードするプラスミドと
一緒にトランスフェクトした。この方法はトランスフェクションから48時間後の
上清１mlあたり、１×103より高いウイルスのプラーク形成単位（pfu）を生じる
。作成されたウイルスに依存して、残りのすべてのウイルス構造タンパク質を発
現するプラスミドを加えることにより、ウイルス生産に実質的な増加＞３×104p
fu/mlを導いた。逆遺伝は、A/WSN/33を表すすべての他の遺伝子を持つA/PR/8/34
ウイルスのPB1遺伝子を含む再集合(reassortant）ウイルスを作成するためにも
使用した。さらに本発明の方法により生産されたウイルスは、PA遺伝子に突然変
異を持つか、またはノイラミニダーゼタンパク質の頭に外来エピトープを保有し
た。
【００１４】 さらに非分離（−）鎖RNAウイルス（すなわちパラミクソウイルス科：Paramyx
oviridae、ラブドウイルス科：Rhabdoviridae、およびフィロウイルス科：Filov
iridae）、または他の分離（−）鎖RNAウイルス、例えばアレナウイルス科（Are
naviridae）およびブニヤウイルス科（Bunyaviridae）をクローン化cDNAから完
全に生成するために、同じ方法を他のウイルスに使用することができる。さらに
vRNAの代わりに細胞中のcRNAの発現は、ウイルス生成の効率を向上させることが
できる。
【００１５】 本発明の方法は、例えば弱毒化突然変異のウイルスゲノムへの導入によりイン
フルエンザウイルスの容易な操作を可能とする。さらにインフルエンザウイルス
は強力な体液性および細胞性免疫を誘導するので、本発明はウイルスの自然な変
異体の利用可能性といった観点からワクチンベクターとしてこのようなウイルス
を大いに強化し、これは連続して遺伝子療法のために繰り返し利用することを可
能とする。
【００１６】 すなわち本発明は、インフルエンザウイルスタンパク質を発現またはコードす
る、あるいはインフルエンザvRNA、天然または組換えvRNAの両方を発現またはコ
ードする、単離され、そして精製されたベクターまたはプラスミドを提供する。
すなわち本発明のベクターまたはプラスミドは、目的の遺伝子またはオープンリ
ーディングフレイム、例えばワクチンとして有用な免疫原性ペプチドまたはタン
パク質をコードする外来遺伝子を含んで成ることができる。好ましくはインフル
エンザvRNAを発現するベクターまたはプラスミドは、特定の宿主細胞、例えば鳥
類またはイヌ、ネコ、ウマ、ヒツジのような哺乳動物またはヒトの細胞を含む霊
長類細胞での発現に適するプロモーター、例えばRNAポリメラーゼIを含んで成る
。また好ましくは、インフルエンザvRNAを調製するために有用なDNAを含んで成
るベクターまたはプラスミドは、RNAポリメラーゼI転写終結配列を含んで成る。
目的の遺伝子またはオープンリーディングフレイムを含んで成るベクターまたは
プラスミドには、遺伝子またはオープンリーディングフレイムがインフルエンザ
ウイルスの5'および3'非コード配列により挟まれていることが好ましく、そして
遺伝子またはオープンリーディングフレイムがRNAポリメラーゼIプロモーターお
よびRNAポリメラーゼI転写終結配列に操作可能に連結されていることがさらに一
層好ましい。
【００１７】 これから記載するように、293ＴはインフルエンザウイルスＡ型構造タンパク
質をコードするプラスミドで、RNAポリメラーゼIプロモーターおよびターミネー
ターで挟まれた緑色の蛍光タンパク質（GFP）レポーター遺伝子を含むプラスミ
ドと一緒にトランスフェクトした。RNAポリメラーゼIによる後者の構築物の細胞
内の転写は、インフルエンザウイルス-様粒子にパッケージングされるGFP vRNA
を生成した。上清１mlあたり104以上の感染粒子を生産するこの系は、インフル
エンザウイルスの複製および粒子形成の研究に有用となり得る。またワクチン生
産および改善された遺伝子療法用ベクターの開発にも有益な試みとなるかもしれ
ない。
【００１８】 したがって本発明は、ゲノムに少なくとも１つの組換えDNA分子が安定に加え
られた宿主細胞も提供する。組換えDNA分子は、少なくとも１つの以下の：イン
フルエンザウイルスHA コード領域に連結された第２lox部位に連結された転写停
止（stop）または終結配列を含んで成るDNAセグメントに連結された第１lox部位
に連結された、宿主細胞中で機能的なプロモーターを含んで成る組換えDNA分子
；インフルエンザウイルスNA コード領域に連結された第２lox部位に連結された
転写停止または終結配列を含んで成るDNAセグメントに連結された第１lox部位に
連結された、宿主細胞中で機能的なプロモーターを含んで成る組換えDNA分子；
インフルエンザウイルスM1 コード領域に連結された第２lox部位に連結された転
写停止または終結配列を含んで成るDNAセグメントに連結された第１lox部位に連
結された、宿主細胞中で機能的なプロモーターを含んで成る組換えDNA分子；イ
ンフルエンザウイルスNS2 コード領域に連結された第２lox部位に連結された転
写停止または終結配列を含んで成るDNAセグメントに連結された第１lox部位に連
結された、宿主細胞中で機能的なプロモーターを含んで成る組換えDNA分子；イ
ンフルエンザウイルスM2 コード領域に連結された第２lox部位に連結された転写
停止または終結配列を含んで成るDNAセグメントに連結された第１lox部位に連結
された、宿主細胞中で機能的なプロモーターを含んで成る組換えDNA分子；イン
フルエンザウイルスPA コード領域に連結された第２lox部位に連結された転写停
止または終結配列を含んで成るDNAセグメントに連結された第１lox部位に連結さ
れた、宿主細胞中で機能的なプロモーターを含んで成る組換えDNA分子；インフ
ルエンザウイルスPB1 コード領域に連結された第２lox部位に連結された転写停
止または終結配列を含んで成るDNAセグメントに連結された第１lox部位に連結さ
れた、宿主細胞中で機能的なプロモーターを含んで成る組換えDNA分子；インフ
ルエンザウイルスPB2 コード領域に連結された第２lox部位に連結された転写停
止または終結配列を含んで成るDNAセグメントに連結された第１lox部位に連結さ
れた、宿主細胞中で機能的なプロモーターを含んで成る組換えDNA分子；または
インフルエンザウイルスNP コード領域に連結された第２lox部位に連結された転
写停止または終結配列を含んで成るDNAセグメントに連結された第１lox部位に連
結された、宿主細胞中で機能的なプロモーターを含んで成る組換えDNA分子、を
含む。
【００１９】 好ましくは宿主細胞は、インフルエンザウイルスHA コード領域に連結された
第２lox部位に連結された転写停止配列を含んで成るDNAセグメントに連結された
第１lox部位に連結された、宿主細胞中で機能的なプロモーターを含んで成る組
換えDNA分子；インフルエンザウイルスNA コード領域に連結された第２lox部位
に連結された転写停止配列を含んで成るDNAセグメントに連結された第１lox部位
に連結された、宿主細胞中で機能的なプロモーターを含んで成る組換えDNA分子
；インフルエンザウイルスM1 コード領域に連結された第２lox部位に連結された
転写停止配列を含んで成るDNAセグメントに連結された第１lox部位に連結された
、宿主細胞中で機能的なプロモーターを含んで成る組換えDNA分子；インフルエ
ンザウイルスNS2 コード領域に連結された第２lox部位に連結された転写停止配
列を含んで成るDNAセグメントに連結された第１lox部位に連結された、宿主細胞
中で機能的なプロモーターを含んで成る組換えDNA分子；およびインフルエンザ
ウイルスM2 コード領域に連結された第２lox部位に連結された転写停止配列を含
んで成るDNAセグメントに連結された第１lox部位に連結された、宿主細胞中で機
能的なプロモーターを含んで成る組換えDNA分子が加えられている。好ましくはl ox 部位はloxP部位である。
【００２０】 本発明は、感染性の複製欠損性インフルエンザウイルスの調製法も提供する。
この方法は、例えばHA、NA、M1、M2、NS2、PA、PB1、PB2またはNPをコードする
本発明の組換えDNA分子の少なくとも１つが加えられた宿主細胞を；Creオープン
リーディングフレイムを含んで成るvRNAおよび宿主細胞により発現されないイン
フルエンザ遺伝子を含んで成るvRNAを含んで成る組換えインフルエンザウイルス
と接触させることを含んで成る。ウイルスは次に接触した宿主細胞から回収する
。好ましくは、組換えウイルスはさらに、所望のオープンリーディングフレイム
を含んで成るvRNAを含んで成る。あるいは加えられた宿主細胞は、Creをコード
するDNAセグメントに操作可能に連結された、宿主細胞中で機能的なプロモータ
ーを含んで成るベクター、および各々が宿主細胞中には存在しないインフルエン
ザウイルスcDNAに操作可能に連結されたプロモーターを含んで成る複数のベクタ
ーと接触させる。次いでベクターを回収する。
【００２１】 本発明はまた、ゲノムに、宿主細胞表面結合タンパク質コード領域に連結され
た第２lox部位に連結された転写停止配列を含んで成るDNAセグメントに連結され
た第１lox部位に連結された、宿主細胞中で機能的なプロモーターを含んで成る
組換えDNA分子；融合タンパク質 コード領域に連結された第２lox部位に連結さ
れた転写停止配列を含んで成るDNAセグメントに連結された第１lox部位に連結さ
れた、宿主細胞中で機能的なプロモーターを含んで成る組換えDNA分子；インフ
ルエンザウイルスM1 コード領域に連結された第２lox部位に連結された転写停止
配列を含んで成るDNAセグメントに連結された第１lox部位に連結された、宿主細
胞中で機能的なプロモーターを含んで成る組換えDNA分子；インフルエンザウイ
ルスNS2 コード領域に連結された第２lox部位に連結された転写停止配列を含ん
で成るDNAセグメントに連結された第１lox部位に連結された、宿主細胞中で機能
的なプロモーターを含んで成る組換えDNA分子；およびインフルエンザウイルスM
2 コード領域に連結された第２lox部位に連結された転写停止配列を含んで成るD
NAセグメントに連結された第１lox部位に連結された、宿主細胞中で機能的なプ
ロモーターを含んで成る組換えDNA分子が加えられた宿主細胞を提供する。好ま
しくはlox部位はloxP部位である。
【００２２】 さらに宿主細胞の別の態様は、そのゲノムに宿主細胞表面結合タンパク質およ
び融合タンパク質 コード領域に連結された第２lox部位に連結された転写停止配
列を含んで成るDNAセグメントに連結された第１lox部位に連結された、宿主細胞
中で機能的なプロモーターを含んで成る組換えDNA分子；インフルエンザウイル
スM1 コード領域に連結された第２loxP部位に連結された転写終結配列を含んで
成るDNAセグメントに連結された第１lox部位に連結された、宿主細胞中で機能的
なプロモーターを含んで成る組換えDNA分子；インフルエンザウイルスNS2 コー
ド領域に連結された第２lox部位に連結された転写停止配列を含んで成るDNAセグ
メントに連結された第１lox部位に連結された、宿主細胞中で機能的なプロモー
ターを含んで成る組換えDNA分子；およびインフルエンザウイルスM2 コード領域
に連結された第２lox部位に連結された転写停止配列を含んで成るDNAセグメント
に連結された第１lox部位に連結された、宿主細胞中で機能的なプロモーターを
含んで成る組換えDNA分子が加えられた宿主細胞である。好ましくはlox部位はlo xP 部位である。
【００２３】 上記の組換えDNA分子が加えられた宿主細胞は、感染性の複製欠損性インフル
エンザウイルスの調製法に有用である。例えば、HA、NA、M1、M2およびNSをコー
ドする組換えDNA分子で安定に形質転換した宿主細胞を、複数のベクター、すな
わちCreオープンリーディングフレイムを含んで成るvRNA、PAを含んで成るvRNA
、NPを含んで成るvRNA、PB1を含んで成るvRNA、PB2を含んで成るvRNA、および場
合により目的遺伝子を含んで成るvRNAを発現するベクター；そしてPA、PB1、PB2
およびNPをコードするベクターと接触させる。
【００２４】 ヘルパーウイルスの感染を必要としない本明細書に記載するウイルスの生産法
は、ウイルスの突然変異誘発法に有用であり、そしてワクチン（例えばAIDS、イ
ンフルエンザ、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ライノウイルス、フィロウイルス、マラリ
ア、ヘルペスおよび脚および口の疾患用に）および遺伝子療法ベクター（例えば
、ガン、AIDS、アデノシンデアミナーゼ、筋ジストロフィー、オルニチントラン
スカルバミラーゼおよび中枢神経系の腫瘍）に有用である。
【００２５】 すなわち、医学療法（例えば、ワクチンまたは遺伝子療法）に使用するための
ウイルスが提供される。例えば本発明は、病原体、例えばバクテリアまたは寄生
体または悪性腫瘍に対して個体を免疫感作するための方法を提供する。この方法
は、個体に個体を免疫感作するための量で本発明の少なくとも１つの単離された
ウイルスを、場合によりアジュバントと組み合わせて投与することを含んで成る
。ウイルスは病原体または腫瘍に特異的なポリペプチドによりコードされるポリ
ペプチドを含んで成るvRNAを含んで成る。
【００２６】 また、内因性タンパク質の量の低下または欠失が特徴である指標または疾患を
有する哺乳動物における内因性タンパク質の発現を加えるか、または増すための
方法を提供する。この方法は、哺乳動物の内因性タンパク質の量を加えるか、ま
たは増加するために、効果的な量の本発明の単離されたウイルスを哺乳動物に投
与することを含んで成る。好ましくは哺乳動物はヒトである。
【００２７】 本発明はまた、（＋）鎖ウイルス、例えば（＋）センスRNAウイルスの組換え
生産のためのベクターおよび方法を提供する。すなわち本発明は、場合によりRN
AポリメラーゼI転写終結配列を含んで成る第３DNAセグメントに操作可能に連結
された、（＋）−センスRNAウイルスからの配列を含んで成る第２DNAセグメント
に操作可能に連結されたRNAポリメラーゼI転写開始配列を含んで成るDNAセグメ
ントを含んで成るベクターを提供する。また組換えウイルスを調製するために、
ベクター（１つまたは複数）の使用法も提供する。この方法は、クローン化DNA
およびトランスフェクション法を使用する時に得に有用であり、すなわちRNAの
取り扱いを包含する。さらにRNAポリメラーゼI転写は高度に効率的であり、そし
て高い忠実度を有する。ゲノムRNAがキャップ形成していない（＋）−センスRNA
ウイルス（例えばペスチウイルス；Ｃ型肝炎ウイルス；およびポリオウイルス、
リノウイルス、Ａ型肝炎ウイルスを含むピコナウイルス、および脚および口の疾
患）について、完全長のゲノムをコードするcDNAをゲノムのセンス方向で、RNA
ポリメラーゼIプロモーターとターミネーター配列との間に挿入する。生成した
プラスミドの許容宿主細胞へのトランスフェクションにより、ウイルス複製のた
めのゲノムRNAを生じる。多数の（＋）−センスRNAウイルスがキャップ形成され
たゲノムRNA（例えばデング熱ウイルスおよび数種の脳炎ウイルスを含むフラビ
ウイルス）を含む。RNAポリメラーゼI転写物はキャップ形成されていないが、キ
ャップ形成したゲノムRNAを有するRNAウイルスの完全長ゲノムをコードするcDNA
は、アンチゲノム−センス方向でRNAポリメラーゼI転写ベクターに導入される。
生成したプラスミドのトランスフェクション後、細胞性RNAポリメラーゼIはアン
チゲノム（キャップ形成されていない）RNAを転写する。さらに複製に必要なタ
ンパク質用のタンパク質発現プラスミドとのコートランスフェクション（cotran
sfection）により、アンチゲノムRNAの複製をもたらし、すなわちゲノムRNAおよ
び最終的には感染性ウイルスを生産する。
【００２８】 発明の詳細な記述 定義 本明細書で使用する用語「単離および／または精製された」とは、インビボの
物質を付随しないか、またはインビトロの物質から実質的に精製されるように、
本発明のウイルスまたはプラスミドのインビトロの調製、単離および／または精
製を称する。本明細書で使用する用語「組換え核酸」または「組換えDNA配列ま
たはセグメント」とは、その配列が自然には存在しないか、または天然のゲノム
に位置するようには配置されていない自然に存在する配列に相当するように、イ
ンビトロで後に化学的に改変された、供給源から誘導または単離された核酸、例
えばDNAを称する。供給源から「誘導された」DNAの例は、有用なフラグメントで
あると確認され、そして次いで本質的に純粋な形態に化学的に合成されるDNA配
列である。そのような供給源から「単離」されたDNAの例は、遺伝子工学の方法
論により本発明の方法に使用するためにさらに操作、例えば増幅できるように、
該供給源から化学的手段、例えば制限エンドヌクレアーゼを使用することにより
切り出されるか、または取り出される有用なDNA配列である。
【００２９】 本明細書で使用する「部位特異的組換え」は、以下の３つの事象を含むことを
意図する：１）部位特異的組換え部位または配列、例えばloxP部位により挟まれ
た標的DNAセグメントの欠失；２）部位特異的組換え部位または配列、例えばlox 部位により挟まれた標的DNAセグメントのヌクレオチド配列の逆転；および３）
異なるDNA分子に位置する部位特異的組換え部位または配列、例えばlox部位に近
い標的DNAセグメントの相互交換。部位特異的組換え酵素系には限定する訳では
ないが、バクテリオファージP1のCre/loxP系を含む（米国特許第5,658,772号明
細書）。
【００３０】 部位特異的組換え反応の可逆性を改善するために、組換え系の構造を改変する
ことができる。この部位特異的組換え配列は、組換え反応の生成物が逆反応の基
質としてもはや認識されず、これにより組込みまたは切り出しの事象を安定化さ
せる様式で突然変異させることができる。例えば望ましくない配列を除去するた
めに、同じ方向のlox部位は、望ましくない配列を挟むように配置される。
【００３１】 他のlox部位は、大腸菌（E.coli）から単離されたヌクレオチド配列であるlox B、loxLおよびloxR部位を含む（Hoess et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79,3398
(1982))。lox部位は、当該技術分野で知られている種々の合成法により生成する
こともできる。例えばlox部位を生成するための合成法は、Ito et al.によりNuc .Acids Res .10,1755(1982)およびOgilvie et al.,Science,214、270(1981)に記載
されている。
【００３２】 本明細書で使用する表現「lox部位」は、cre遺伝子の遺伝子産物が部位特異的
組換えを触媒できるヌクレオチド配列を意味する。LoxPはバクテリオファージP1
から当該技術分野で既知の方法により単離することができる34塩基対の配列であ
る（例えばHoess et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79,3398(1982)を参照にされ
たい）。LoxPは、８塩基対のスペーサー領域により分けられた２つの13塩基対の
逆方向反復配列から成る。
【００３３】 本明細書で使用するように発現「cre遺伝子」とは、lox部位で真核細胞中のDNA
の部位特異的組換えを行う酵素的遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を意
味する。cre遺伝子はクテリオファージP1から当該技術分野で既知の方法により
単離することができる（Abremaid et al.,Cell,32,1301-1311(1983)を参照にさ
れたい）。インフルエンザウイルスの複製 インフルエンザＡ型ウイルスは、全部で10種のタンパク質をコードする８つの
１本鎖（−）−センスウイルスRNA（vRNA）のゲノムを保有する。このインフル
エンザウイルスの生活環は、赤血球凝集素（HA)の宿主細胞の表面上のシアル酸
を含有するレセプターへの結合から始まり、レセプターが媒介するエンドサイト
ーシスが続く。後期エンドソーム内の低pHがHAの構造的ずれを誘発し、これによ
りHA2サブユニットのN-末端が露出する（いわゆる融合ペプチド）。融合タンパ
ク質はウイルスおよびエンドソーム膜の融合を開始し、そしてマトリックスタン
パク質（M1）およびRNP複合体が細胞質に放出される。RNPはvRNAをカプシド化す
る核タンパク質(NP)およびウイルスポリメラーゼ複合体（PA、PB1およびPB2タン
パク質により形成される）から成る。RNPは核に輸送され、ここで転写および複
製が起こる。RNAポリメラーゼ複合体は３つの異なる反応を触媒する：5'キャッ
プおよび3'ポリA構造を持つmRNAの合成、完全長の相補的RNA（cRNA）の合成およ
び鋳型としてcDNAを使用したゲノムvRNAの合成。新たに合成されたvRNA、NPおよ
びポリメラーゼタンパク質は次いでRNAに集成され、核から輸出され、そして細
胞質膜へ輸送され、ここで子孫ウイルス粒子の分離（budding）が起こる。ノイ
ラミニダーゼ(NA)タンパク質は、シアリルオリゴ糖からシアル酸の除去により感
染の後期に重要な役割を演じ、これにより新たに集成されたビリオンが細胞表面
から放出されウイルス粒子自体の凝集を防ぐ。ウイルス集成体はタンパク質−タ
ンパク質およびタンパク質−vRNA相互作用に関与するが、このような相互作用の
性質は、大部分が未知である。トゴソウイルス（thogotovirus） トゴソウイルス（THOV）は、オルソミクソウイルス科（Orthomyxoviridae）の
ファミリーの新らしい属である。それらはダニにより伝播し、そしてラクダ、ヤ
ギおよび家禽のような家畜動物で見いだされた。この結果、THOVはダニおよび脊
椎動物の細胞中で複製できる。THOVのゲノムは１本鎖の（−）−センスRNAの６
セグメントから成る。３つの最大セグメントによりコードされるタンパク質は、
インフルエンザウイルスのポリメラーゼタンパク質PB2、PB2およびPAと有意な相
同性を示す。セグメント５はインフルエンザウイルスNPに関連するタンパク質を
コードする。セグメント４によりコードされるTHOVの糖タンパク質は、インフル
エンザHAまたはNAとも相同的ではないが、バキュロウイルスの糖タンパク質と類
似する配列を表す。最小のセグメントはマトリックスタンパク質をコードすると
考えられ、そしてインフルエンザウイルスのタンパク質のいずれにも似ていない
。インフルエンザウイルスのように、vRNAの3'および5'末端の両方がプロモータ
ー活性に必要であり、そしてこの活性はvRNAの3'および5'末端の末端14および15
ヌクレオチドにそれぞれ位置する。
【００３４】 THOVのmRNA合成は、宿主細胞に由来するキャップ構造により始められる(prime
d）。しかしインフルエンザウイルスとは対照的に、キャップ構造のみ（さらな
るヌクレオチド無し）で細胞性mRNAから開裂される（Albo et al.,1996;Leahy e
t al.,1997;Weber et al.,1996)。インビトロの開裂アッセイでは、vRNAの5'お
よび3'の両方にエンドヌクレアーゼ活性が必要であることが明らかとなったが（
Leahy et al.,1998）、インフルエンザウイルスで示されたように（Cianci et a
l.,1995;Hagen et al.,1994）、モデルcRNAプロモーターの付加はエンドヌクレ
アーゼ活性を刺激しない（Leahy et al.,1998)。THOVについては「ホック」構造
が提案され（Leahy et al.,1997;Weber et al.,1997)、これはインフルエンザウ
イルスについて提案されたコルクスクリュー構造に類似する（Fick et al.,1996
)。しかしこの「ホック」構造は、THOV vRNAプロモーターでのみ見いだされる。
cRNAプロモーター配列はcRNAの5'末端で２と９位との間、および３と８位との間
の塩基対を形成させない。代わりの３または８位ではこのようなヌクレオチド間
の塩基対を可能とし、エンドヌクレアーゼ活性を刺激し、これは提案された「ホ
ック」構造の証拠を強力に支持している（Leahy et al.,1998)。さらにこの構造
はTHOVの生活環の調節に重要であるかもしれない；「ホック」構造を形成するvRN
Aプロモーターは、PB2エンドヌクレアーゼ活性を刺激し、これにより転写を可能
とする。対照的にcRNAプロモーターは「ホック」構造を形成できず、したがって
エンドヌクレアーゼ活性を刺激することができず、すなわち複製をもたらす。ブニヤウイルス科（Bunyavirisae) ブニヤウイルス科（Bunyavirisae)ファミリーには、ヒトの出血性および脳炎
熱（例えば、リフトバレー、ハンターン(Hantaan)、ラクロス（La Crosse）およ
びクリミア−コンゴ出血性熱）を引き起こす数種のウイルスが含まれる。球状で
、しかもエンベロープに包まれたビリオンは、１本鎖の（−）−センスRNA（Ell
iot,1997を参照にされたい）の３つのセグメントを含む。最大のセグメント（Ｌ
）はウイルスRNAポリメラーゼタンパク質（Ｌタンパク質）をコードし、Ｍセグ
メントは２つのウイルス糖タンパク質G1およびG2、および非構造タンパク質（NS
m)をコードする。最小のセグメント（Ｓ）は、ヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ
）および第２非構造タンパク質（NSs)をコードする。ウイルスの複製および転写
は細胞質で起こり、そして新しく集成したビリオンは、ゴルジ装置の膜を通って
出芽する（bud）。
【００３５】 Bridgen & Elliott(1996)は、クローン化されたcDNAから感染性のブニアムベ
ラウイルスを完全に作成するための逆遺伝系を確立した。彼らは最初に、狂犬病
ウイルスに関してSchnell et al.(1994）により記載された方法に従った；（＋
）−センスアンチゲノムRNA（（−）−センスゲノムRNAではなく）をコードする
cDNAの、ウイルスポリメラーゼおよび核タンパク質を発現している細胞中での細
胞内転写。Bridgen & Elliott(1996)は、HeLaT4+細胞を、Ｔ７ポリメラーゼを発
現するワクシニアウイルスで感染させ、そしてこれらの細胞をＳ、ＭおよびＬセ
グメントによりコードされるタンパク質を発現しているプラスミドを用いてトラ
ンスフェクトした。次いで彼らはこれらの細胞を、Ｔ７ポリメラーゼプロモータ
ーおよびデルタ肝炎ウイルスリボザイムにより挟まれた完全長のアンチ−ゲノム
cDNAをコードする３つのプラスミドで感染させた。ワクシニアウイルス粒子数に
対してブニヤウイルス粒子数を増すために、著者らはブニアムベラは複製するが
ワクシニアウイルスはしない蚊の細胞を使用した。このプロトコールはブニヤウ
イルス科（Bunyaviridae)を遺伝子的に操作するだけでなく、異なるブニヤウイ
ルス科（Bunyaviridae)の株で細胞を混合感染させる事によっては容易に得るこ
とができない再集合（reassortant)ウイルスを生成するためにも使用することが
できる。
【００３６】 転写および複製に必要なブニヤウイルスのプロモーター要素およびウイルスタ
ンパク質を研究するために、Dunn et al.,(1995)はブニアムベラ S RNAセグメン
トの5'と3'非翻訳領域の間に（−）−センス方向でCAT遺伝子をクローン化した
。細胞はＬおよびＳセグメントによりコードされたタンパク質を発現する構築物
でトランスフェクトし、そして次いでインビトロにてCAT活性をもたらす転写さ
れたRNAでトランスフェクトした。ブニヤウイルスＳセグメントは重複するリー
ディングフレイムにある２つのタンパク質、ＮおよびNSsをコードする。これら
のタンパク質の両方が転写および複製に必要であるのかどうかを決定するために
、ＮまたはNSsのみを発現している構築物を、CAT活性について試験した。Ｎタン
パク質発現はＬタンパク質と一緒にCAT活性を生じるが、CAT活性はNSs発現構築
物では検出されなかった。すなわちＬおよびＮタンパク質は、ブニヤウイルス−
様RNAの転写および複製に十分である。
【００３７】 インフルエンザウイルスのように、ブニヤウイルスRNAの末端配列は相補的で
あり、しかも高度に保存されている。したがってこれらの配列セグメント要素が
ブニヤウイルスのプロモーターを定め、そしてプロモーター活性に決定的である
と推測された。ウイルスRNAの3'末端での５個のヌクレオチドの欠失で、CAT発現
は劇的に減少する（Dunn et al.,1995）。対照的に、5'末端に２個のヌクレオチ
ドを、または3'末端に11または35個のヌクレオチドを付加しても、CAT発現が廃
止されない（Dunn et al.,1995）。したがってインフルエンザウイルスポリメラ
ーゼ複合体のように、 ブニヤウイルスポリメラーゼタンパク質は、明らかに転
写および／または複製を内部で開始することができる。
【００３８】 本発明を以下の実施例によりさらに記載する。
【００３９】
【実施例】
実施例１ 材料および方法 細胞およびウイルス 293Tヒト胚性腎細胞およびMadin-Darbyイヌ腎細胞（MDC
K）は、10％ウシ胎児血清を補充したダルベッコの改良イーグル培地（DMEM）お
よび５％ウシ新生児血清を含む改良イーグル培地でそれぞれ維持した。すべての
細胞は５％CO2中にて37℃で維持した。インフルエンザウイルスA/WSN/33(H1N1)
およびA/PR/8/34(H1N1)を、10日齢の卵中で増殖させた。
【００４０】 プラスミドの構築 RNAポリメラーゼI構築物を作成するために、A/WSN/33(H1N
1)またはA/PR/8/34ウイルスRNAに由来するクローン化したcDNAを、RNAポリメラ
ーゼIのプロモーターとターミネータ配列との間に導入した。簡単に説明すると
、クローン化したcDNAはBsmBIで消化したBsmBI部位を含むプライマーを用いてPC
Rにより増幅し、そしてBsmBI部位により分けられたヒトRNAポリメラーゼIプロモ
ーターおよびマウスRNAポリメラーゼIターミネーターを含むpHH21ベクターのBsm B I部位にクローン化した（図２）。A/WSN/33株のPB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M
およびNS遺伝子は、以下のプラスミドを使用することによりPCR増幅した：それ
ぞれpSCWPB2、pGW-PB1およびpSCWPA（すべてカリフォルニア大学ロサンゼルス校
のDebi Nayak博士から得た)、およびpWH17、pWNP152、pT3WNA15(Castrucci et a
l.,1992）、pGT3WMおよびpWNS1。インフルエンザA/PR/8/34ウイルスのPB1遺伝子
は、鋳型としてpcDNA774(PB1)を使用することにより増幅させた（Perez et al.,
1998)。プライマーの配列に関しては図６を参照にされたい。遺伝子に望ましく
ない突然変異が無いことを確認するために、PCRで誘導したフラグメントを自動
シークエンサーを用いて製造元により推薦されるプロトコールに従い配列決定し
た(アプライドバイオシステムズ社(Applied Biosystems Inc.、カリフォルニア
州、米国）。A/WSN/33ウイルスのHA、NP、NAおよびM1遺伝子を記載されているよ
うにクローン化し（Huddleston et al.,1982)、そして真核細胞発現ベクターpCA
GGS/MCS（ニワトリβ-アクチンプロモーターにより制御される)にサブクローン
化し(Niwa et al.,1991）、それぞれpEWSN-HA、pCAGGS-WSN-NPO-14、pCAGGS-WNA
15およびpCAGGS-WSN-M1-2/1を得た。A/PR/8/34ウイルスからのM2およびNS2遺伝
子をPCRにより増幅し、そしてpCAGGS/MCSにクローン化し、pEP24cおよびpCA-NS2
を得た。最後にpcDNA774(PB1）、pcDNA762(PB2）およびpcDNA787(PA）を使用し
て、サイトメガロウイルスプロモーターの制御下にPB2、PB1およびPAタンパク質
を発現させた（Perez et al.,1998)。感染性インフルエンザ粒子の作成 293T細胞(1×106)を、製造元の指示に従いTr
ans IT LT-1（パンベラ:Panvera，マジソン、ウィスコンシン州）を使用して、
異なる量で最大17個のプラスミドでトランスフェクトした。簡単に説明すると、
DNAおよびトランスフェクション試薬を混合し（１μgのDNAあたり２μlのTrans
IT-LT-1）、室温で45分間インキューベーションし、そして細胞に加えた。６時
間後、DNA−トランスフェクション試薬混合物を0.3％のウシ血清アルブミンおよ
び0.01％ウシ胎児血清を含有するOpi-MEM（ギブコ（Gibco)/BRL、ゲチスバーグ
、メリーランド州）と交換した。トランスフェクションから様々な時間で、ウイ
ルスを上清から回収し、そしてMDCK細胞上で滴定した。ヘルパーウイルスにはこ
の手順が必要ではないので、回収したトランスフェクション体ウイルスはプラー
ク形成無しで分析した。ウイルスを生産するプラスミド−トランスフェクト細胞の割合の決定 トランス
フェクションから24時間後、293T細胞を0.02％EDTAを用いて単一細胞に分散させ
た。次いで細胞懸濁液を10倍に希釈し、そして24-ウェルプレート中でMDCK細胞
のコンフルエントな単層に移した。ウイルスは赤血球凝集アッセイにより検出し
た。免疫染色アッセイ インフルエンザウイルスの感染から９時間後、細胞をリン酸
緩衝化生理食塩水（PBS)で２回洗浄し、そして3.7％パラホルムアルデヒド（PBS
中)で室温にて20分間固定した。次いで細胞を0.1％ Triton X-100で処理し、そ
してNeumann et al.,(1997)に記載されているように処理した。結果 ウイルスRNAセグメント、３つのポリメラーゼサブユニットおよびNPタンパク質
のプラスミド-駆動発現による感染性ウイルスの作成 精製したビリオンから抽
出したRNPの混合物を用いた細胞のトランスフェクションは感染性のインフルエ
ンザ粒子を生じたが、この方法はインビトロで生成された８種の異なるRNPを用
いて使用した時に効率的ではないようである。cDNAから感染性インフルエンザウ
イルスを完全に生産するために、８つのウイルスRNPsをインビボで作成した。す
なわちヒトRNAポリメラーゼIプロモーターおよびマウスRNAポリメラーゼIターミ
ネータにより挟まれたA/WSN/33ウイルスの完全長ウイルスRNAに関するcDNAを含
むプラスミドを調製した。原理的にはこのような８つのプラスミドの真核細胞へ
のトランスフェクションは、８つのインフルエンザvRNAの合成をもたらすはずで
ある。タンパク質発現プラスミドのコートランスフェクションにより生成したPB
2、PB1、PAおよびNPタンパク質は、次いで複製し、そして転写され、最終的には
感染性インフルエンザウイルスを形成する機能的vRNAに集成するはずである（図
３）。１×106の293T細胞をタンパク質発現プラスミド（１μgのpcDNA762(PB2)
、１μgのpcDNA774(PB1)、0.1μgのpcDNA787(PA)および１μgのpCAGGS-WSN-NP0/
14)および各１μgの以下のRNAポリメラーゼIプラスミド（pPo1I-WSN-PB2、pPo1I
-WSN-PB1、Po1I-WSN-PA、Po1I-WSN-HA、Po1I-WSN-NP、Po1I-WSN-NA、Po1I-WSN-M
およびPo1I-WSN-NS)を用いてトランスフェクトした。pcDNA787(PA)の量を下げて
使用することの決定はこれまでの考察（Mena et al.,1996)およびウイルス−様
粒子（VLPs)の作成に関する最適条件に関するデータ(データは示さず)に基づい
た。293T細胞のトランスフェクションから24時間後、１mlあたり７×103pfuウイ
ルスが上清に見いだされ（実験１、表１）、初めてインフルエンザＡ型ウイルス
を完全にプラスミドから生産するための逆遺伝の能力が示された。
【００４１】
【表１】
【００４２】 ＊293T細胞は示したプラスミドでトランスフェクトした。24時間（実験１および
２）または48時間（実験３〜８）後、上清のウイルス力価をMDCK細胞を用いて測
定した。 †特に示さない限り、プラスミドはA/WSN/33ウイルスのRNAを表すcDNAを用いて
構築した。すべてのウイルス構造タンパク質の同時発現（coexpression）を用いたインフル エンザウイルス生産の効率 ウイルスNPおよびポリメラーゼタンパク質の発現は
プラスミドが駆動するウイルスの作成に十分であるが、効率を改善し得ることが
可能であった。これまでの研究では、すべてのインフルエンザウイルスの構造タ
ンパク質（PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1、M2およびNS2）の発現は、レポータ
ーのクロラムフェニコール−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子をコードする人
工的vRNAを含んだVLPをもたらした（Mena et al.,1996）。すなわちウイルスRNA
の複製および転写に必要なタンパク質だけに代わり、構造タンパク質の全補完物
の利用性がウイルス生産の効率を改善するかもしれない。このために、293T細胞
を最適な量のウイルスタンパク質発現プラスミド（VLP生産により判定；非公開
データ）を用いてトランスフェクトした：１μgのpcDNA762(PB2)およびpcDNA774
(PB1)；0.1μgのpcDNA787(PA)；１μgのpEWSN-HA、pCAGGS-WSN-NP0/14およびpCA
GGS-WNA-15；２μgのpCAGGS-WSN-M1-2/1；0.3μgのpCA-NS2；および0.03μgのpE
P24c(M2用)を、各１μgのRNAポリメラーゼIプラスミドと一緒に用いてトランス
フェクトした（実験２、表１）。第２組の細胞は、PB1遺伝子については再集合
ウイルスを生成するためにpPo1I-PR/8/34-PB1に代えて、PA、PB1、PB2およびNP
のみを発現するプラスミドと一緒に（実験３、表１）またはすべてのインフルエ
ンザ構造タンパク質を発現するプラスミドと一緒に（実験４、表１）用いて、同
じRNAポリメラーゼIプラスミドの組でトランスフェクトした。WSNウイルスの収
率、トランスフェクションから24時間後（実験１および２、表１）または36時間
後（データは示さず)でそれほど変わらなかった。しかしすべてのインフルエン
ザウイルス構造タンパク質が提供された時、PR/8/34-PB1を含むウイルスの収率
は10倍以上増加することが分かった（実験３および４、表１）。NPタンパク質の
PA、PB1、PB2の発現について１つのプラスミドが欠けている陰性対照は、いかな
るウイルスも生じなかった（実験５〜８、表１）。すなわち生成するウイルスに
依存して、すべてのインフルエンザＡ型ウイルスの構造タンパク質の発現は逆遺
伝法の効率をかなり改善する。
【００４３】 次に細胞のトランスフェクション後のウイルス生産の動力学を、A/PR/8/34-PB
1遺伝子を含むウイルスを生産するために使用したプラスミドの組を使用して測
定した。３つのうちの２つの実験で、ウイルスは最初にトランスフェクションか
ら24時間後に検出された。この時点で測定した力価＞103pfuは、トランスフェク
ションから48時間後までに＞106pfuに上昇した（表２）。ウイルス生産するプラ
スミド−トランスフェクト細胞の割合を予測するために、293T細胞をEDTA(0.02
％)でトランスフェクションから24時間後に処理して細胞を分散させ、そして次
いで限界希釈実験を行った。この実験では、この時点で培養上清中に遊離ウイル
スが見られなかった。この結果は、103.3細胞中１つが感染性のウイルス粒子を
生成していることを示した。
【００４４】
【表２】
【００４５】 ＊293T細胞は、PB1遺伝子を除き(これはA/PR/8/34ウイルスに由来する)、A/WSN/
33ウイルス遺伝子をコードする８つのRNAポリメラーゼIプラスミド、および９つ
のタンパク質発現プラスミドを用いて、明細書中に記載したようにトランスフェ
クトした。異なる時点で、MDCK細胞における培養上清中のウイルスを滴定した。
ＮＤ＝行わず。NAタンパク質中にFLAGエピトープを含むインフルエンザウイルスの回収 新規な
逆遺伝系がインフルエンザＡ型ウイルスのゲノムに突然変異の導入を可能とした
ことを確認するために、NAタンパク質にFLAGエピトープ（Castrucci et al.,199
2）を含有するウイルスを作成した。293T細胞を、NAタンパク質およびFLAGエピ
トープの両方をタンパク質ヘッドの底にコードするcDNAを含むRNAポリメラーゼI
プラスミド（Po1I-WSN-NA/FL79）で、必要なRNAポリメラーゼIおよびタンパク質
発現プラスミドと一緒にトランスフェクトした。回収したウイルス（PR8-WSN-FL
79)が実際にNA-FLAGタンパク質を発現したことを確認するために、PR8-WSN-FL79
またはA/WSN/33野生型ウイルスに感染した細胞の免疫染色アッセイを行った。FL
AGエピトープに対するモノクローナル抗体はPR8-WSN-FL79に感染した細胞を検出
したが、野生型ウイルスに感染した細胞を検出しなかった（図４）。PR8-WSN-FL
79ウイルスの回収は、標識していない野生型ウイルスの回収と同程度に効率的で
あった（データは示さず）。このような結果は、新たな逆遺伝系がインフルエン
ザＡ型ウイルスのゲノムに突然変異を導入することを可能にすることを示す。PA遺伝子中に突然変異を含む感染性インフルエンザウイルスの作成 PA遺伝子中
に突然変異を保有する感染性ウイルスを生産するために、２つのサイレント突然
変異を導入して、制限エンドヌクレアーゼに関する新規認識配列を作成した（mR
NAの846位でBsp120Iおよび1284位でPvuII)。これまでは信頼できる選択系が無か
ったので、逆遺伝によりこの遺伝子を修飾することは可能ではなかった。トラン
スフェクション体ウイルス、PA-T846CおよびPA-A1284が回収された。回収された
トランスフェクション体ウイルスは、２つの連続する限界希釈により生物学的に
クローン化した。回収したウイルスが正にPA遺伝子に突然変異を有するトランス
フェクション体であることを確認するために、PA遺伝子のcDNAを逆転写酵素-PCR
により得た。図５に示すように、新たに導入された制限部位の存在により示され
るように、PA-T846CおよびPA-A1284CウイルスはPA遺伝子中に期待された突然変
異を有した。逆転写工程が無い同じウイルスサンプルおよびプライマーのPCRは
、いかなる生成物も生産できず（テータは示さず）、PAcDNAがウイルスを作成す
るために使用したプラスミドに代わり正にvRNAに由来することを示している。こ
のような結果は、突然変異した遺伝子をもつウイルスがヘルパーウイルスを使用
することなくどのように生産でき、そして回収できるのかを具体的に説明してい
る。考察 本明細書に記載した逆遺伝系は、インフルエンザＡ型ウイルスを完全にクロー
ン化cDNAから効率よく生産することを可能にする。Bridgen および Elliott(199
6)も、ブニアンベラウイルスを作成するための逆遺伝を使用したが（ブニアウイ
ルス科(Bunyaviridae)のファミリー）、それは（−）−センスRNAのわずか３セ
グメントを含み、その生産の効率は低かった（102pfu/107細胞）。ウイルスの収
率は実験間で異なったが、一環して＞103pfu/106細胞がインフルエンザウイルス
については観察され、これらは８つのセグメント含む。上記の高い効率の逆遺伝
系については、いくつかの説明がある。インビトロでRNPを生産する代わりに（L
uytjes et al.,1989）、RNPはRNAポリメラーゼIを使用したvRNAの細胞内合成を
通して、およびウイルスポリメラーゼタンパク質およびNPのプラスミドが駆動す
る発現を通してインビボで生成された。またプラスミドで容易にトランスフェク
トされる293T細胞（Goto et al.,1997）の使用により、確実に大多数の細胞群が
ウイルス生産に必要なすべてのプラスミドを受容した。さらに成長している細胞
の中でも最も豊富に発現されるRNAポリメラーゼIにより生成される多数の転写物
が、系の全体的な効率に貢献しているようである。このような特徴は、対応して
豊富な数のvRNA転写物およびvRNAのカプシド化に十分な量のウイルスタンパク質
、核内のRNPの形成および細胞膜へのこれらの複合体の輸出（ここで新規ウイル
スが集成され、そして放出される）を導いた。
【００４６】 これまでに確立された逆遺伝系（Enami et al.,1990；Neumann et al.,1994
；Luytjes et al.,1989；Pleschka et al.,1996）はヘルパーウイルスの感染、
したがって膨大な数のヘルパーウイルスから少数のトランスフェクション体を回
収することを可能とする選択法を必要とする。そのような方法は以下のcDNA−由
来遺伝子の１つを保有するインフルエンザウイルスを生成するために使用された
：pB2（Subbarao et al.,1993)、HA（Enami et al.,1991;Horimoto et al.,1994
)、NP（Li et al.,1995)、NA（Enami et al.,1990)、M(Castrucci et al.,1995:
Yasuda et al.,1994）およびNS(Enami et al.,1991）。HAおよびNA遺伝子に応用
できるものを除きほとんどの選択法が、生育温度、宿主域の制限または薬剤感受
性に依存し、すなわち遺伝子産物の機能的分析に関して逆遺伝の用途を限定する
。たとえ信頼性のある抗体−駆動選択系を利用することが可能なHAおよびNA遺伝
子を用いても、顕著な成長欠損を持つウイルスを生産することは難しい。対照的
に本明細書に記載する逆遺伝系は、ヘルパーウイルスを必要とせず、そして突然
変異を任意の遺伝子セグメントに持つ、または重度の成長欠損を持つトランスフ
ェクション体を生成することを可能とする。この利点を図５に示し、これは突然
変異したPA遺伝子を持つトランスフェクション体ウイルスの回収を示す。任意の
実施可能な（viable）突然変異をインフルエンザＡ型ウイルスゲノムへ導入する
ための技法を有することにより、研究者達はウイルスゲノムの非翻訳領域中の調
節配列の性質、ウイルスタンパク質の構造−機能の関係および宿主域の制限およ
びウイルスの病原性の分子学的基礎のような多数の長い間存在した問題に取り組
むことを可能とするだろう。
【００４７】 不活性化されたインフルエンザワクチンは利用可能であり、それらの効力は部
分的には局所的なIgAおよび細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導する限られた能力によ
り最適には及ばない。現在進行中の風邪に適合した生のインフルエンザワクチン
の臨床試験では、ワクチンがインフルエンザの症状を引き起こさず、しかし防御
免疫を誘導するように、そのようなワクチンが最適に弱毒化されることを示唆し
ている（Keitel & Piedra、1998を参照にされたい）。しかし予備的な結果では
、このような生のウイルスワクチンは最高に不活性化されたワクチンよりも有意
に効果的ではなく（Keitel & Piedra、1998を参照にされたい）、さらなる改善
の余地を残す。１つの可能性は、上記の逆遺伝系を用いて風邪に適合したワクチ
ンを修飾することである。あるいは内部タンパク質をコードする遺伝子中に多数
の弱毒化突然変異を含む「マスター」インフルエンザＡ型株を作成するために、
逆遺伝を使用することによるスクラッチ（scratch)から始めることができる。本
明細書に記載する逆遺伝系の最も興味のある応用は、インフルエンザウイルスの
新たなHAまたはNAサブタイプが関与する流行が疑われる場合に、弱毒化した生の
ウイルスワクチンの迅速な生産にある。
【００４８】 この新規な逆遺伝系は、ワクチンベクターとしてインフルエンザウイルスの使
用を強化するだろう。ウイルスはインフルエンザウイルスタンパク質に加えて、
外来タンパク質または免疫原性エピトープを発現するように操作することができ
る。例えば第９番目のセグメントとして外来タンパク質を含むウイルスを生成し
（Enami et al.,1991）、そしてそれらを生ワクチンとして使用することができ
る。インフルエンザウイルスは強力な細胞性および体液性免疫応答を刺激するだ
けでなく、それらはビリオン表面のHAおよびNAタンパク質の広い配列も可能であ
り（例えば、15HAおよび9NAサブタイプおよびそれらの疫学的変異体)、同じ標的
群の反復免疫感作を可能とする。
【００４９】 レポーター遺伝子をコードする人工的vRNAを保有するインフルエンザVLPは、
ウイルスの構造タンパク質およびワクシニア−T7ポリメラーゼ系を持つvRNAによ
り生産された（Mena et al.,1996)。今、逆遺伝を使用して、vRNA転写および複
製に必要なタンパク質（すなわちPA、PB1、PB2およびNP）コードするvRNAを、な
らびに目的のタンパク質をコードするvRNAを含むVLPを作成することができる。
そのようなVLPは遺伝子療法の媒介物として有用となる。重要なことは、ウイル
ス構造タンパク質をコードする遺伝子の欠失が、VLP−遺伝子療法の後に感染性
のウイルスを確実に生産しないことである。インフルエンザウイルスのゲノムは
宿主の染色体に組込まれないので、VLP系は細胞の短期の遺伝子導入（例えば、
ガンの処置）のみが必要な状況において、遺伝子療法として適するだろう。アデ
ノウイルスベクターとは対照的に（Kovesdi et al.,1997)、インフルエンザVLP
はHAおよびNA変異体の両方を含むので、標的群の反復処置を可能とする。
【００５０】 オルソミクソウイルス科（Orthomyxoviridae）のファミリーは、インフルエン
ザＡ、ＢおよびＣ型ウイルス、ならびに最近分類されたソゴトウイルスを含んで
成る。本明細書に記載したクローン化cDNAからの完全な感染性のインフルエンザ
Ａ型ウイルスの作成法は、オルソミクソウイルス、そして恐らく他の分離した（
−）−センスRNAウイルス（例えばブニヤウイルス科（Bunyaviridae)、アレナウ
イルス科（Arenaviridae）にも応用できるだろう。技術的な限界無しでウイルス
ゲノムを操作する能力は、ウイルスの生活環およびそれらの調節、ウイルスタン
パク質の機能およびウイルスの病原性の分子的機作の研究と深く関係する。
【００５１】 実施例２ インフルエンザウイルスのタンパク質PB2、PB1、PAおよびNPの発現は、人工的ウ イルスRNAの複製および転写を導く インフルエンザVLPを生成するために、イン
フルエンザウイルスRNAのインビボの細胞内合成にRNAポリメラーゼI系を使用し
た（図７）。この系では、レポーター遺伝子をアンチセンス方向にコードするcD
NAが、インフルエンザウイルスRNAの5'および3'非翻訳領域により挟まれている
。このカセットをRNAポリメラーゼIプロモーターとターミネーターとの間に挿入
する。そのような構築物の真核細胞中へのトランスフェクションは、細胞性RNA
ポリメラーゼIによるレポーター遺伝子の転写を導き、これによりインフルエン
ザウイルス−様RNAを生成する（Neumann et al.,1994）。インフルエンザウイル
スの感染で、この人工的vRNAはウイルスポリメラーゼ複合体により複製し、そし
て転写され、レポーター遺伝子の発現を導く。
【００５２】 PB2、PB1、PAおよびNPタンパク質の発現がRNAポーターI−由来転写物によりコ
ードされるレポーター遺伝子の発現を導くのかどうかを決定するために、ニワト
リβ-アクチンプロモーター(pCAGGS-WSN-NP0/14)の制御下のA/WSN/33(H1N1)ウイ
ルスのNPタンパク質を発現するプラスミド(各１μg)、サイトメガロウイルスプ
ロモーター[pcDNA762(PB2)、pcDNA774(PB1)およびpcDNA787(PA)]の制御下のA/PR
/8/34ウイルスのポリメラーゼタンパク質、およびRNAポリメラーゼIレポーター
遺伝子構築物（pPo1I-GFP)を、ヒトの胚性腎（293T）細胞にトランスフェクトし
た。48時間後、細胞の30％〜40％がGFPを発現していた（図９）。対照的にGFP発
現はポリメラーゼまたはNPタンパク質を欠くトランスフェクト細胞では検出でき
なかった。これらの結果は、NPおよび３つのインフルエンザウイルスポリメラー
ゼタンパク質が、複製し、そしてRNAポリメラーゼI−由来GFP vRNAを転写する機
能的複合体を形成したことを示していた。最適なvRNA転写および複製 最適なレポーターGFP発現に必要なプラスミドDNAの
量を決定するために、ポリメラーゼタンパク質およびNPの発現をモジュレートし
た。これまでの研究では、大量のPAが転写／複製系においてレポーター遺伝子発
現の程度を下げたことを示した(Mena et al.,1996)。したがって段階的様式で、
プラスミドからのPAの発現を減少させ、鋳型の量として0.1μgのpcDNA787(PA)が
最強のGFP発現を生じることを確認した。RNP複合体の主要な構造成分であるNPを
用いると、高量のタンパク質発現プラスミドが必要となるかもしれない。しかし
高量のプラスミドはGFP-陽性293T細胞の数にそれほど影響を与えなかった。さら
に様々な量のPB2およびPB1タンパク質発現プラスミド（1.0から0.03μgの範囲）
では、293T細胞中のGFP発現に影響を与えなかった。したがってすべての後の実
験では、0.1μgのpcDNA787(PA)および1.0μgのpcDNA774(PB1)、pcDNA762(PB2)お
よびpCAGGS-WSN-NP0/14を使用した。クローン化したcDNAからのインフルエンザVLPの形成 ワクシニアウイルスT7 ポ
リメラーゼ系を用いたこれまでの研究では、インフルエンザVLPの形成に９つの
インフルエン ザウイルスタンパク質:PB2、PB1、PA、HA、NA、NP、M1、M2および
NS2が必要であることが示された（Mena et al.,1996）。対照的にNS1タンパク質
は粒子形成に必須ではない（Mena et al.,1996）。VLP作成のために効率的なプ
ラスミド-駆動系を確立するために、HA、NA、M1、M2およびNS2遺伝子をコードす
るcDNAを作成した。このcDNAを真核発現ベクターpCAGGS/MCS（ニワトリβ-アク
チンプロモーターにより制御される)にクローン化し、それぞれpEWSN-HA、pCAGG
S-WNA-15、pCAGGS-WSN-M1-2/4を、pEp24cおよびpCA-NS2を生成した。各タンパク
質の発現は、ウエスタンブロット分析により確認した。
【００５３】 VLPを生成するために、106の293T細胞を各1.0μgのタンパク質発現プラスミド
（0.1μgを使用したpcDNA787(PA)を除く)、および１μgのレポーター遺伝子構築
物pPo1I-GFPでトランスフェクトした。培養上清をトランスフェクションから48
時間後に回収し、そしてA/WSN/33ウイルスと混合してGFP vRNAの複製および転写
に必要なインフルエンザウイルスタンパク質を提供した。次いで混合物をMDCK細
胞に接種した。10時間のインキューベーション後、GFP−陽性MDCK細胞を検出し
、これは450粒子／上清(ml)に相当した（表３）。このように、すべてのインフ
ルエンザウイルスの構造タンパク質のプラスミド−駆動発現が、GFP vRNAを含む
感染性インフルエンザVLPの形成をもたらした。さらにGFP vRNAはMDCK細胞に送
達された。インフルエンザウイルスの最適な集成体 VLP形成も、異なる量のRNAポリメラー
ゼIレポーター遺伝子構築物ならびにHA、NA、M1、M2およびNS2プラスミドDNAを
発現する細胞で実験した。pPo1I-GFPを用いた実験では、1.0μgのプラスミドDNA
がVLPの生成に高度に効率的であるが、2.0μgまたは3.0μgに関する効率は有意
に低下した。NS2およびM2タンパク質は感染の後期に低量で発現されるので、比
較的少量の発現プラスミドが最適なVLP形成には必要であると思われた。M2発現
構築物の1.0μgから0.3μgへの減少は、GFP−陽性MDCK細胞の数に10倍以上の増
加をもたらした（表３）。さらにプラスミドを0.03μgに減少させると、VLPの数
は増加しなかった。NS2に関しては、試験した低量のプラスミド（0.1μg）がVLP
のより低い効率的形成と関連した（表３）。
【００５４】 M1タンパク質はビリオンの主構造成分である。すなわち高レベルのM1発現はVL
Pの効率的形成に必要なようである。この予測は1.0μgまたは2.0μgのM1プラス
ミドDNAを用いてトランスフェクトした細胞中のVLP形成を比較する実験で試験し
た。表３に示すように、より高量のプラスミドでGFP-陽性MDCK細胞の数に10倍以
上の増加をもたらした。HAおよびNAタンパク質を発現する２種類の量（１μg対
２μg）のプラスミドを比較すると、VLP形成に認められる差異を表さず、１μg
の各プラスミド(pEWSN-HA、pCAGGS-WNA15）を後の実験に使用する選択が導かれ
た。総じてこれらの実験はVLP形成の効率に100倍より多くの増加をもたらし、最
終的には上清１mlあたり104より多くの感染性インフルエンザウイルス粒子の生
産を導いた（図１０）。
【００５５】
【表３】
【００５６】 ＊293T細胞は、９つのインフルエンザウイルス構造タンパク質用の発現プラスミ
ドおよびRNAポリメラーゼI-GFP遺伝子プラスミドでトランスフェクトした。トラ
ンスフェクションから48時間後、VLPを含有する上清を集め、A/WSN/33ヘルパー
ウイルスと混合し、そしてMDCK細胞に接種した。細胞は感染から10時間後に固定
し、そしてGFP発現を蛍光顕微鏡で測定した。MDCK細胞中のGFP発現について、M1
、M2およびNS2プラスミドの最適な量を決定するために、それらプラスミドの量
のみを変動させた（太字)。 †VLP形成の相対的効率は、５つの顕微鏡視野でGFP-陽性細胞の数を計数するこ
とにより決定した。１μgの各プラスミドを含有するサンプル(これは450の感染
性VLP／上清(ml)を生じた）を参照として選択した（１の値）。プラスミドから完全に生産されたVLPの確実性 VLPが本物のインフルエンザウイ
ルスのように感染を開始することを確認するために、VLPをWSN HAに対する抗体
で中和した。プラスミドでトランスフェクトした293T細胞に由来するVLPを含有
する上清を、抗−WSN HAモノクローナル抗体のプールまたは水疱性口内炎ウイル
ス(VSV)のＧタンパク質に対するモノクローナル抗体（陰性対照）と、室温で１
時間インキューベーションした。抗−WSN HAモノクローナル抗体のプールにより
中和されないA/PR/8/34ヘルパーウイルスを混合物に加え、そしてMDCK細胞に接
種した。抗−WSN HAモノクローナル抗体のみがVSVを中和し、HAがVLPの細胞への
付着および侵入を媒介することを示した。
【００５７】 次にVLPの形成に必要な最少組のタンパク質を同定した。他者は３つのインフ
ルエンザウイルスポリメラーゼおよびNPがvRNAの複製および転写に必須であるこ
とを確立した（Honda et al.,1988)．したがってこれら４つの各タンパク質は含
めるが、HA、NA、M1、M2またはN2を連続して省略した。これらのプラスミドの排
除は、トランスフェクトした293T細胞におけるGFP vRNAの複製／転写に影響を及
ぼさなかった。HA、NA、M1またはN2タンパク質を欠くトランスフェクトした293T
細胞に由来する上清は、感染したMDCK細胞においてGFP発現を促進せず、感染性V
LPの不存在を示していた。感染性VLPはM2の省略で検出されたが、その数は低か
った（＞構造タンパク質の完全な組に比べて500倍の減少）。すなわちワクシニ
アウイルス系の研究からのデータと一致して、すべてのインフルエンザウイルス
構造タンパク質が感染性VLPの効率的形成には必要である。VLPの生産においてVSV糖タンパク質はHAおよびNAタンパク質と置き換えることが できる。 インフルエンザウイルスHAおよびNAタンパク質を、レセプターの結合
および融合に機能するVSV糖タンパク質と置き換えた。pPo1I-GFPでトランスフェ
クトした293T細胞；PB2、PB1、PA、NP、M1、M2およびNS2発現構築物の最適量；
および１μgのVSV-G構築物(pCAGGS-VSV-G)では、インフルエンザウイルスの糖タ
ンパク質のVSV-Gタンパク質への置換はVLP形成に悪い影響を及ぼさなかった。対
照的に、ウイルス糖タンパク質としてHAおよびNAを提供するよりははむしろVSV-
Gの時に高い数のGFP-陽性細胞が再生産的に見いだされた。すなわちVSV Gタンパ
ク質はインフルエンザビリオン中に効率的に取り込まれることができ、そしてウ
イルスの放出および侵入においてHAおよびNAと同様に機能することができる。
【００５８】 感染性インフルエンザウイルス粒子を作成する効率的な系は、このウイルスを
用いた研究で、ならびにワクチンおよび遺伝子療法用のベクターの生産に役立つ
可能性がある。現存するワクシニアウイルス系とは対照的に、本明細書に記載す
るVLP生産法は初期の細胞の初期のトランスフェクションおよびVLPの収量（＞104 感染性粒子／ml（上清））の両方において高度に効率的である。さらにインフ
ルエンザウイルスタンパク質を発現するプラスミドにより完全に駆動され（すな
わち任意の他のウイルスタンパク質の不存在）、これは結果の解釈を大いに単純
化する。別の主な進歩は、ビリオン形成、RNP複合体のパッケージング、ウイル
ス複製物の出芽（budding)、および結合および融合プロセスにおける致死的突然
変異の効果を研究するための能力である。さらに上記のシステムは他のウイルス
、例えばパラミクソウイルスおよびラブドウイルスでも十分に操作される。
【００５９】 インフルエンザウイルスHAおよびNAタンパク質は、VSV糖タンパク質Ｇにより
機能的に置き換えることができる。以前、インフルエンザウイルスは組換えSV40
ウイルスにより提供された時に、VSV Ｇタンパク質を取り込めないと報告された
（Naim et al.,1993)。本明細書に記載する結果はHAまたはNAのいずれもがVLPの
形成に必須ではないが、これらの糖タンパク質が他のウイルスタンパク質との相
互作用に役割を果たす可能性を除外することはできず、すなわち尾の少ないHA、
NAまたは両方を発現するウイルスの細長い形状により示唆されるようなビリオン
の構造に影響を及ぼすことを示唆している（Garcia-Sastre et al.,1995：Jin e
t al.,1994：Jin et al.,1997：Mitnaul et al.,1996)。
【００６０】 これまでに記載したプラスミドに基づく系は、治療用の遺伝子送達に特に有用
となり得る。VLPは、転写および複製に必要なタンパク質（すなわちNPおよびポ
リメラーゼ)をコードするvRNA、ならびに目的のタンパク質をコードするvRNAを
含むように調製することができる。これらの粒子は感染性であり、そして指定し
た遺伝子を標的細胞に送達することができ、ここで複製し、そして転写される。
これらの粒子はウイルス遺伝子の完全な成分を含んでいないので、感染性の子孫
ウイルスを生産することはできない。この特徴はウイルスゲノムの宿主染色体へ
の組込みの欠如と一緒に、ヒトおよび非ヒト個体に遺伝子への送達の生物学的安
全性を確実にするだろう。最後に、15HAおよび9NAサブタイプおよびそれらの変
異体の利用可能性は、VLPの反復投与を可能とし、これによりアデノウイルスの
ような他のウイルスベクターの反復使用で直面する主要な障害の１つであるベク
ターが生成するタンパク質に対する免疫抵抗を克服する。プラスミドが駆動する
系のさらなる利点は、ガンの処置のような外来タンパク質の短期発現だけを必要
とする状況で実現されるだろう。
【００６１】 実施例３ Cre-loxP系を使用することにより、複製−欠損性ウイルスの生産のためのパッ
ケッージング細胞系を作成することができる。例えば２つのloxP部位により挟ま
れた転写停止カセット（例えばpBS302、ライフテクノロジーズ（Life Technolog
ies)、ベセスダ、メリーランド州；およびSauer et al.,1993；Lasko et al.,19
92；Pichel et al.,1993；Bolivar et al.,1977；Stuhl et al.,1981；Stuhl et
al.,1985；Fiers et al.,1978)、およびウイルス遺伝子の１つを含むタンパク
質発現ベクターを調製する。プロモーター配列で開始する転写を、転写停止部位
で遮断する。すなわちウイルス遺伝子は停止および翻訳されない。そのようなベ
クターで安定にトランスフェクトされた細胞を、loxP系にクローン化された遺伝
子をコードするvRNAを欠くインフルエンザウイルスに感染させる。このウイルス
もCreタンパク質をコードするさらなるvRNAを含む。このウイルスはそのvRNAの
１つが欠けているので正常な細胞では生存できない。しかしパッケージング細胞
中ではvRNAから発現するCreタンパク質がloxP部位で組換えを生じ、転写停止部
位の欠失をもたらす。このように個々のウイルス遺伝子（１つまたは複数）は今
、転写そして発現され、ウイルスのこのような細胞中での増幅が可能となる（図
１１）。
【００６２】 さらにパッケージング細胞系を、loxP系により制御される後期ウイルスタンパ
ク質（すなわちHA、NA、M1、M2およびNS2）を発現するように調製する（図１２
）。HAおよびNAは他のウイルスレセプター−結合および融合タンパク質（例えば
、Ebola GP、Marburg GP、ブニヤウイルス科(Bunyaviridae)の糖タンパク質GP1
およびGP2、ラブドウイルスおよびパラミクソウイルスのＧおよび／またはＦタ
ンパク質、トゴトウイルスの糖タンパク質、および（＋）−鎖RNAウイルスの糖
タンパク質）に置き換えることができる。複製／転写(すなわちポリメラーゼお
よびNPタンパク質）に必要なタンパク質をコードするvRNA、目的遺伝子をコード
するvRNA、およびCreをコードするvRNAを含むウイルス−様粒子が生成される。
これらのvRNAはパッケージング細胞系のウイルス−様粒子中にパッケージングさ
れる。
【００６３】 これらのウイルス−様粒子は、以下の理由によりワクチンおよび遺伝子療法の
目的に使用できる；（i）それらがウイルス遺伝子の完全な補完物を含まず、そ
してすなわち感染性の子孫粒子が形成されず、厳しい安全的関心事(concern）に
合う；（ii）それらは外来タンパク質を高レベルで発現するだろう；（iii）そ
れらは主要抗原であるウイルスの糖タンパク質（HA、NA)を発現しない、すなわ
ちウイルスタンパク質に対する宿主免疫応答が限定されるはずである。
【００６４】
【表４】
【００６５】
【表５】
【００６６】
【表６】
【００６７】 すべての公報、特許および特許出願は、引用により本明細書に編入する。前述
の明細書では本発明をそれらの特定の好適な態様に関して記載し、そして多くの
詳細を具体的説明の目的で説明したが、当業者には本発明のさらなる態様も可能
であり、そして本明細書に記載した特定の詳細は本発明の基本的理論から逸脱す
ることなくかなり変動させることができることは明白である。
【００６８】
【図面の簡単な説明】
【図１】 確立された逆遺伝系の該略図である。RNAトランスフェクション法（Ａ）では
、精製したNPおよびポリメラーゼタンパク質が、インビトロ−合成したvRNAの使
用によりRNPに集成される。細胞をRNPでトランスフェクトし、続いてヘルパーウ
イルス感染を行う。RNAポリメラーゼI法（Ｂ）では、RNAポリメラーゼIプロモー
ター、vRNAをコードするcDNAを含むプラスミドはレスキューされ、そしてRNAポ
リメラーゼIターミネーターを細胞にトランスフェクトする。RNAポリメラーゼI
による細胞内転写で合成vRNAを生じ、これはヘルパーウイルスの感染で子孫ウイ
ルス粒子にパッケージングされる。両方法により、トランスフェクション体ウイ
ルス（すなわちクローン化されたcDNAに由来するRNAを含むもの）がヘルパーウ
イルス群から選択される。
【図２】 RNAポリメラーゼI構築物の作成の該略図である。インフルエンザウイルスに由
来するcDNAをPCRにより増幅し、BsmIで消化し、そしてpHH21ベクター（E.Hoffma
nn博士論文、ジャスタス、リービッヒ−大学、ゲッセン、独国）のBsmI部位でク
ローン化し、これはヒトRNAポリメラーゼIプロモーター（Ｐ）およびマウスRNA
ポリメラーゼIターミネーター（Ｔ）を含む。ターミネーター配列（＊Ｔ）のチ
ミジンヌクレオチド上流は、インフルエンザウイルスRNAの3'末端を表す。イン
フルエンザＡ型ウイルス配列は、肉太活字文字で示す。
【図３】 分離した（−）−センスRNAウイルスを作成するために提案された逆遺伝法。R
NAポリメラーゼIプロモーター、８つの各ウイルスRNAセグメントのcDNA、および
RNAポリメラーゼIターミネーターを含むプラスミドを、タンパク質発現ベクター
と一緒に細胞にトランスフェクトする。感染性ウイルスはPA、PB1、PB2およびNP
を発現するプラスミドを用いて作成することができるが、残りのすべての構造タ
ンパク質（角型カッコで示す)の発現は、生成するウイルスに依存してウイルス
生産の効率を上げる。
【図４】 トランスフェクション体ウイルスに感染した細胞中のFLAGエピトープの検出。
抗体染色を使用してPR-WSN-FL79（Ａ、Ｄ）またはA/WSN/33野生型ウイルス（Ｂ
、Ｅ）またはmock-感染MDCK細胞（Ｃ、Ｆ）のいずれかに感染したMDCK細胞中のN
Aを同定した。感染から９時間後、細胞をパラホルムアルデヒドで固定し、Trito
nX-100で処理し、そして抗-FLAG（Ａ〜Ｃ）または抗-WSN NA（Ｄ〜Ｆ）モノクロ
ーナル抗体のいずれかとインキューベーションした。徹底的なゴルジ染色（赤）
が陽性サンプルで見られる（Ａ、ＤおよびＥ）。
【図５】 PA突然変異体の回収。各ウイルスのPA遺伝子は、RT-PCRにより1226bpフラグメ
ントを生じるプライマーを用いて増幅させ（mRNAの677〜1903位、レーン１、３
、５）、次いでこれを制限酵素Bsp120I（mRNAの846位、レーン４、７）またはPv u II（mRNAの1284位、レーン２、６）で消化した。PCR生成物中のBsp120IまたはP vu II部位の存在は、169bpおよび1057bpまたは607bpおよび619bpフラグメントを
それぞれ生じた。MW＝分子量マーカー。
【図６】 インフルエンザ配列を増幅するために使用したプライマー。
【図７】 GFPタンパク質をコードするインフルエンザウイルス-様RNAを作成するためのp Pol II-GFPプラスミド。このプラスミドはGFP遺伝子（pEGFP-N1に由来する、クロ
ーンテック（Clontech）、パロ アルト、カリフォルニア州）を、ヒトRNAポリ
メラーゼIプロモーターおよびマウスRNAポリメラーゼIターミネーターにより挟
まれたインフルエンザＡ型ウイルスセグメント５の5'および3'非コード領域の間
にアンチセンス方向で含む。
【図８】 VLP作成法の該略図。個々のタンパク質発現プラスミドおよびRNAポリメラーゼ
Iプロモーター、GFPレポーター遺伝子コードするcDNAおよびRNAポリメラーゼIタ
ーミネーターを含むプラスミドを、293T細胞に感染させる。RNAポリメラーゼIに
よる細胞内の転写は、逆転文字に示すような負の極性のGFP vRNAを生じる。VLP
を含む上清を回収し、インフルエンザヘルパーウイルスと混合し、そしてMDCK細
胞に接種する。
【図９】 インフルエンザＡ型ウイルスのPA、PB1、PB2およびNPタンパク質は、RNAポリ
メラーゼIにより生産されたGFP vRNAをカプシド化し、GFP発現を導く。293T細胞
はPB2、PB1、PAおよびNPタンパク質を発現するプラスミド(Ａ)で、あるいはNPタ
ンパク質除くすべてのプラスミドで(Ｂ)で、レポーター遺伝子vRNAの細胞内合成
用のRNAポリメラーゼI-GFP遺伝子プラスミドと一緒にトランスフェクトした。細
胞をトランスフェクションから48時間後に固定し、そしてGFP発現を蛍光顕微鏡
で測定した。
【図１０】 感染性インフルエンザVLPの作成。293T細胞は、それぞれが異なるウイルス構
造タンパク質を発現する９つのプラスミドで（Ａ）、またはNPに関する構築物を
省く８つのプラスミドで（Ｂ）、RNAポリメラーゼI-GFP遺伝子プラスミドと一緒
にトランスフェクトした。トランスフェクションから48時間後にVLPを含有する
上清を回収し、A/WSN/33ヘルパーウイルスと混合し、そしてMDCK細胞に接種した
。細胞を感染から10時間後に固定し、そしてGFP発現を蛍光顕微鏡で測定した。
【図１１】 ゲノムには組換えDNA分子が加えられている細胞中のインフルエンザNS2タンパ
ク質を発現するために、Creリコンビナーゼの使用の概略。細胞のゲノムは、NS2
遺伝子に連結された第１の部位特異的組換え部位と同じ方向に、第２の部位特異
的組換え部位に連結された転写停止配列に連結された部位特異的組換え部位（例
えばloxP）に連結されたプロモーターを含んで成る組換えDNA分子を含んで成る
。
【図１２】 複製欠損性インフルエンザウイルスの調製。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年６月５日（２００１．６．５）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA14 BA32 CA01 DA02 EA02 FA02 GA11 4B065 AA90X AA95X AA95Y AB01 AC14 BA02 4C084 AA13 NA14 ZB332 4C085 AA03 BA55 DD62

Claims (100)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ａ）転写終結配列に連結されたインフルエンザ ウイルスPA
    cDNAに操作可能に連結されたプロモーターを含んで成るベクター、転写終結配列
    に連結されたインフルエンザ ウイルスPB1 cDNAに操作可能に連結されたプロモ
    ーターを含んで成るベクター、転写終結配列に連結されたインフルエンザ ウイ
    ルスPB2 cDNAに操作可能に連結されたプロモーターを含んで成るベクター、転写
    終結配列に連結されたインフルエンザ ウイルスHA cDNAに操作可能に連結された
    プロモーターを含んで成るベクター、転写終結配列に連結されたインフルエンザ
    ウイルスNP cDNAに操作可能に連結されたプロモーターを含んで成るベクター、
    転写終結配列に連結されたインフルエンザ ウイルスNA cDNAに操作可能に連結さ
    れたプロモーターを含んで成るベクター、転写終結配列に連結されたインフルエ
    ンザ ウイルスM cDNAに操作可能に連結されたプロモーターを含んで成るベクタ
    ーおよび転写終結配列に連結されたインフルエンザ ウイルスNS cDNAに操作可能
    に連結されたプロモーターを含んで成るベクターから選択される少なくとも２つ
    のベクター；および ｂ）インフルエンザ ウイルスPAをコードするDNAセグメントに操作可能に連結さ
    れたプロモーターを含んで成るベクター、インフルエンザ ウイルスPB1をコード
    するDNAセグメントに操作可能に連結されたプロモーターを含んで成るベクター
    、インフルエンザ ウイルスPB2をコードするDNAセグメントに操作可能に連結さ
    れたプロモーターを含んで成るベクターおよびインフルエンザ ウイルスNPをコ
    ードするDNAセグメントに操作可能に連結されたプロモーターを含んで成るベク
    ターから選択される少なくとも２つのベクター、 を含んで成る複数のオルトミクソウイルス ベクターを含んで成る組成物。
  2. 【請求項２】 ａ）転写終結配列に連結されたインフルエンザ ウイルスPA
    cDNAに操作可能に連結されたプロモーターを含んで成るベクター、転写終結配列
    に連結されたインフルエンザ ウイルスPB1 cDNAに操作可能に連結されたプロモ
    ーターを含んで成るベクター、転写終結配列に連結されたインフルエンザ ウイ
    ルスPB2 cDNAに操作可能に連結されたプロモーターを含んで成るベクター、転写
    終結配列に連結されたインフルエンザ ウイルスHA cDNAに操作可能に連結された
    プロモーターを含んで成るベクター、転写終結配列に連結されたインフルエンザ
    ウイルスNP cDNAに操作可能に連結されたプロモーターを含んで成るベクター、
    転写終結配列に連結されたインフルエンザ ウイルスNA cDNAに操作可能に連結さ
    れたプロモーターを含んで成るベクター、転写終結配列に連結されたインフルエ
    ンザ ウイルスM cDNAに操作可能に連結されたプロモーターを含んで成るベクタ
    ーおよび転写終結配列に連結されたインフルエンザ ウイルスNS cDNAに操作可能
    に連結されたプロモーターを含んで成るベクターから選択される少なくとも２つ
    のベクター；および ｂ）インフルエンザ ウイルスPAをコードするDNAセグメントに操作可能に連結さ
    れたプロモーターを含んで成るベクター、インフルエンザ ウイルスPB1をコード
    するDNAセグメントに操作可能に連結されたプロモーターを含んで成るベクター
    、インフルエンザ ウイルスPB2をコードするDNAセグメントに操作可能に連結さ
    れたプロモーターを含んで成るベクター、インフルエンザ ウイルスNPをコード
    するDNAセグメントに操作可能に連結されたプロモーターを含んで成るベクター
    、インフルエンザ ウイルスHAをコードするDNAセグメントに操作可能に連結され
    たプロモーターを含んで成るベクター、インフルエンザ ウイルスNAをコードす
    るDNAセグメントに操作可能に連結されたプロモーターを含んで成るベクター、
    インフルエンザ ウイルスM1をコードするDNAセグメントに操作可能に連結された
    プロモーターを含んで成るベクター、インフルエンザ ウイルスM2をコードするD
    NAセグメントに操作可能に連結されたプロモーターを含んで成るベクターおよび
    インフルエンザ ウイルスNS2をコードするDNAセグメントに操作可能に連結され
    たプロモーターを含んで成るベクターから選択される少なくとも２つのベクター
    、 を含んで成る複数のオルトミクソウイルス ベクターを含んで成る組成物。
  3. 【請求項３】 RNA ポリメラーゼI転写終結配列に連結されたインフルエン
    ザ ウイルスPA cDNAに操作可能に連結されたRNA ポリメラーゼIプロモーターを
    含んで成るベクター、RNA ポリメラーゼI転写終結配列に連結されたインフルエ
    ンザ ウイルスPB1 cDNAに操作可能に連結されたRNA ポリメラーゼIプロモーター
    を含んで成るベクター、RNA ポリメラーゼI転写終結配列に連結されたインフル
    エンザ ウイルスPB2 cDNAに操作可能に連結されたRNA ポリメラーゼIプロモータ
    ーを含んで成るベクター、RNA ポリメラーゼI転写終結配列に連結されたインフ
    ルエンザ ウイルスHA cDNAに操作可能に連結されたRNA ポリメラーゼIプロモー
    ターを含んで成るベクター、RNA ポリメラーゼI転写終結配列に連結されたイン
    フルエンザ ウイルスNP cDNAに操作可能に連結されたRNA ポリメラーゼIプロモ
    ーターを含んで成るベクター、RNA ポリメラーゼI転写終結配列に連結されたイ
    ンフルエンザ ウイルスNA cDNAに操作可能に連結されたRNA ポリメラーゼIプロ
    モーターを含んで成るベクター、RNA ポリメラーゼI転写終結配列に連結された
    インフルエンザ ウイルスM cDNAに操作可能に連結されたRNA ポリメラーゼIプロ
    モーターを含んで成るベクター、RNA ポリメラーゼI転写終結配列に連結された
    インフルエンザ ウイルスNS cDNAに操作可能に連結されたRNA ポリメラーゼIプ
    ロモーターを含んで成るベクター、インフルエンザ ウイルスPAをコードするDNA
    セグメントに操作可能に連結されたプロモーターを含んで成るベクター、インフ
    ルエンザ ウイルスPB1をコードするDNAセグメントに操作可能に連結されたプロ
    モーターを含んで成るベクター、インフルエンザ ウイルスPB2をコードするDNA
    セグメントに操作可能に連結されたプロモーターを含んで成るベクター、インフ
    ルエンザ ウイルスNPをコードするDNAセグメントに操作可能に連結されたプロモ
    ーターを含んで成るベクター、およびRNA ポリメラーゼI転写終結配列に連結さ
    れた3'非-コードインフルエンザウイルス配列に、アンチセンス方向で連結され
    た目的とするcDNAまたはそれらのフラグメントに連結された5'非-コードインフ
    ルエンザウイルス配列に連結されたRNAポリメラーゼIプロモーターを含んで成る
    ベクター、 を含んで成る複数のオルトミクソウイルス ベクターを含んで成る組成物。
  4. 【請求項４】 RNA ポリメラーゼI転写終結配列に連結されたインフルエン
    ザ ウイルスPA cDNAに操作可能に連結されたRNA ポリメラーゼIプロモーターを
    含んで成るベクター、RNA ポリメラーゼI転写終結配列に連結されたインフルエ
    ンザ ウイルスPB1 cDNAに操作可能に連結されたRNA ポリメラーゼIプロモーター
    を含んで成るベクター、RNA ポリメラーゼI転写終結配列に連結されたインフル
    エンザ ウイルスPB2 cDNAに操作可能に連結されたRNA ポリメラーゼIプロモータ
    ーを含んで成るベクター、RNA ポリメラーゼI転写終結配列に連結されたインフ
    ルエンザ ウイルスHA cDNAに操作可能に連結されたRNA ポリメラーゼIプロモー
    ターを含んで成るベクター、RNA ポリメラーゼI転写終結配列に連結されたイン
    フルエンザ ウイルスNP cDNAに操作可能に連結されたRNA ポリメラーゼIプロモ
    ーターを含んで成るベクター、RNA ポリメラーゼI転写終結配列に連結されたイ
    ンフルエンザ ウイルスNA cDNAに操作可能に連結されたRNA ポリメラーゼIプロ
    モーターを含んで成るベクター、RNA ポリメラーゼI転写終結配列に連結された
    インフルエンザ ウイルスM cDNAに操作可能に連結されたRNA ポリメラーゼIプロ
    モーターを含んで成るベクター、RNA ポリメラーゼI転写終結配列に連結された
    インフルエンザ ウイルスNS cDNAに操作可能に連結されたRNA ポリメラーゼIプ
    ロモーターを含んで成るベクター、インフルエンザ ウイルスPAをコードするDNA
    セグメントに操作可能に連結されたプロモーターを含んで成るベクター、インフ
    ルエンザ ウイルスPB1をコードするDNAセグメントに操作可能に連結されたプロ
    モーターを含んで成るベクター、インフルエンザ ウイルスPB2をコードするDNA
    セグメントに操作可能に連結されたプロモーターを含んで成るベクター、インフ
    ルエンザ ウイルスNPをコードするDNAセグメントに操作可能に連結されたプロモ
    ーターを含んで成るベクター、インフルエンザ ウイルスHAをコードするDNAセグ
    メントに操作可能に連結されたプロモーターを含んで成るベクター、インフルエ
    ンザ ウイルスNAをコードするDNAセグメントに操作可能に連結されたプロモータ
    ーを含んで成るベクター、インフルエンザ ウイルスM1をコードするDNAセグメン
    トに操作可能に連結されたプロモーターを含んで成るベクター、インフルエンザ
    ウイルスM2をコードするDNAセグメントに操作可能に連結されたプロモーターを
    含んで成るベクター、インフルエンザ ウイルスNS2をコードするDNAセグメント
    に操作可能に連結されたプロモーターを含んで成るベクター、およびRNA ポリメ
    ラーゼI転写終結配列に連結された3'非-コードインフルエンザウイルス配列に、
    アンチセンス方向で連結された目的とするcDNAまたはそれらのフラグメントに連
    結された5'非-コードインフルエンザウイルス配列に連結されたRNAポリメラーゼ
    Iプロモーターを含んで成るベクター、 を含んで成る複数のオルトミクソウイルス ベクターを含んで成る組成物。
  5. 【請求項５】 ａ）のベクターが連結されている、請求項１または２に記載
    の組成物。
  6. 【請求項６】 ｂ）のベクターが連結されている、請求項１または２に記載
    の組成物。
  7. 【請求項７】 ａ）の各ベクターが別れたプラスミド上にある、請求項１ま
    たは２に記載の組成物。
  8. 【請求項８】 ｂ）の各ベクターが別れたプラスミド上にある、請求項１ま
    たは２に記載の組成物。
  9. 【請求項９】 ａ）のベクターのプロモーターが、RNAポリメラーゼIプロモ
    ーター、RNAポリメラーゼIIプロモーター、RNAポリメラーゼIIIプロモーター、
    Ｔ７プロモーターまたはＴ３プロモーターを含んで成る、請求項１または２に記
    載の組成物。
  10. 【請求項１０】 RNAポリメラーゼIプロモーターが、ヒトRNAポリメラーゼI
    プロモーターである請求項９に記載の組成物。
  11. 【請求項１１】 ｂ）のベクターがさらにRNA転写終結配列を含んで成る、
    請求項１または２に記載の組成物。
  12. 【請求項１２】 ａ）のベクターの転写終結配列が、RNAポリメラーゼI転写
    終結配列、RNAポリメラーゼII転写終結配列、RNAポリメラーゼIII転写終結配列
    またはリボザイムを含んで成る、請求項１または２に記載の組成物。
  13. 【請求項１３】 さらに転写終結配列に連結された3'非-コードインフルエ
    ンザ配列に連結されたcDNAに連結された5'非-コードインフルエンザ配列に連結
    されたプロモーターを含んで成る、請求項１または２に記載の組成物。
  14. 【請求項１４】 cDNAのいずれか１つがセンス方向である、請求項１、２、
    ３または４に記載の組成物。
  15. 【請求項１５】 cDNAのいずれか１つがアンチセンス方向である、請求項１
    、２、３または４に記載の組成物。
  16. 【請求項１６】 細胞を請求項１、２、３または４に記載の組成物と、感染
    性インフルエンザウイルスを生産するために効果的な量で接触させることを含ん
    で成る、インフルエンザウイルスの調製法。
  17. 【請求項１７】 ウイルスを単離することをさらに含んで成る、請求項１６
    に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 請求項１６の方法により得られるウイルス。
  19. 【請求項１９】 RNA ポリメラーゼI転写終結配列に連結されたインフルエ
    ンザ ウイルスPA cDNAに操作可能に連結されたRNA ポリメラーゼIプロモーター
    を含んで成るベクター、RNA ポリメラーゼI転写終結配列に連結されたインフル
    エンザ ウイルスPB1 cDNAに操作可能に連結されたRNA ポリメラーゼIプロモータ
    ーを含んで成るベクター、RNA ポリメラーゼI転写終結配列に連結されたインフ
    ルエンザ ウイルスPB2 cDNAに操作可能に連結されたRNA ポリメラーゼIプロモー
    ターを含んで成るベクター、RNA ポリメラーゼI転写終結配列に連結されたイン
    フルエンザ ウイルスNP cDNAに操作可能に連結されたRNA ポリメラーゼIプロモ
    ーターを含んで成るベクター、インフルエンザ ウイルスPAをコードするDNAセグ
    メントに操作可能に連結されたプロモーターを含んで成るベクター、インフルエ
    ンザ ウイルスPB1をコードするDNAセグメントに操作可能に連結されたプロモー
    ターを含んで成るベクター、インフルエンザ ウイルスPB2をコードするDNAセグ
    メントに操作可能に連結されたプロモーターを含んで成るベクター、インフルエ
    ンザ ウイルスNPをコードするDNAセグメントに操作可能に連結されたプロモータ
    ーを含んで成るベクター、インフルエンザ ウイルスHAをコードするDNAセグメン
    トに操作可能に連結されたプロモーターを含んで成るベクター、インフルエンザ
    ウイルスNAをコードするDNAセグメントに操作可能に連結されたプロモーターを
    含んで成るベクター、インフルエンザ ウイルスM1をコードするDNAセグメントに
    操作可能に連結されたプロモーターを含んで成るベクター、インフルエンザ ウ
    イルスM2をコードするDNAセグメントに操作可能に連結されたプロモーターを含
    んで成るベクター、インフルエンザ ウイルスNS2をコードするDNAセグメントに
    操作可能に連結されたプロモーターを含んで成るベクター、およびRNA ポリメラ
    ーゼI転写終結配列に連結された3'非-コードインフルエンザウイルス配列に連結
    されたアンチセンスcDNAに連結された5'非-コードインフルエンザウイルス配列
    に連結されたRNAポリメラーゼIプロモーターを含んで成るベクター、 を含んで成る複数のオルトミクソウイルス ベクターを含んで成る組成物。
  20. 【請求項２０】 細胞を請求項１９に記載の組成物と、インフルエンザウイ
    ルスを生産するために効果的な量で接触させ、そしてウイルスを単離することを
    含んで成る、遺伝子送達媒介物の調製法。
  21. 【請求項２１】 請求項２０に記載の方法により得られるウイルス。
  22. 【請求項２２】 請求項１、２、３、４または１９に記載の組成物と接触し
    た細胞。
  23. 【請求項２３】 請求項１８に記載のウイルスに感染した細胞。
  24. 【請求項２４】 請求項２１に記載のウイルスに感染した細胞。
  25. 【請求項２５】 RNA ポリメラーゼI転写終結配列に連結されたインフルエ
    ンザウイルスPA cDNAに操作可能に連結されたヒトRNAポリメラーゼIプロモータ
    ーを含んで成るベクター。
  26. 【請求項２６】 RNA ポリメラーゼI転写終結配列に連結されたインフルエ
    ンザウイルスPB1 cDNAに操作可能に連結されたヒトRNAポリメラーゼIプロモータ
    ーを含んで成るベクター。
  27. 【請求項２７】 RNA ポリメラーゼI転写終結配列に連結されたインフルエ
    ンザウイルスPB2 cDNAに操作可能に連結されたヒトRNAポリメラーゼIプロモータ
    ーを含んで成るベクター。
  28. 【請求項２８】 RNA ポリメラーゼI転写終結配列に連結されたインフルエ
    ンザウイルスNP cDNAに操作可能に連結されたヒトRNAポリメラーゼIプロモータ
    ーを含んで成るベクター。
  29. 【請求項２９】 RNA ポリメラーゼI転写終結配列に連結されたインフルエ
    ンザウイルスHA cDNAに操作可能に連結されたヒトRNAポリメラーゼIプロモータ
    ーを含んで成るベクター。
  30. 【請求項３０】 RNA ポリメラーゼI転写終結配列に連結されたインフルエ
    ンザウイルスNA cDNAに操作可能に連結されたヒトRNAポリメラーゼIプロモータ
    ーを含んで成るベクター。
  31. 【請求項３１】 RNA ポリメラーゼI転写終結配列に連結されたインフルエ
    ンザウイルスM1 cDNAに操作可能に連結されたヒトRNAポリメラーゼIプロモータ
    ーを含んで成るベクター。
  32. 【請求項３２】 RNA ポリメラーゼI転写終結配列に連結されたインフルエ
    ンザウイルスM2 cDNAに操作可能に連結されたヒトRNAポリメラーゼIプロモータ
    ーを含んで成るベクター。
  33. 【請求項３３】 RNA ポリメラーゼI転写終結配列に連結されたインフルエ
    ンザウイルスNS2 cDNAに操作可能に連結されたヒトRNAポリメラーゼIプロモータ
    ーを含んで成るベクター。
  34. 【請求項３４】 RNA ポリメラーゼI転写終結配列に連結されたインフルエ
    ンザウイルスM cDNAに操作可能に連結されたヒトRNAポリメラーゼIプロモーター
    を含んで成るベクター。
  35. 【請求項３５】 RNA ポリメラーゼI転写終結配列に連結されたインフルエ
    ンザウイルスNS cDNAに操作可能に連結されたヒトRNAポリメラーゼIプロモータ
    ーを含んで成るベクター。
  36. 【請求項３６】 ゲノムに、以下の： インフルエンザウイルスHA コード領域に連結された第２loxP部位に連結され
    た転写停止配列を含んで成るDNAセグメントに連結された第１lox部位に連結され
    た、宿主細胞中で機能的なプロモーターを含んで成る組換えDNA分子、 インフルエンザウイルスNA コード領域に連結された第２lox部位に連結された
    転写停止配列を含んで成るDNAセグメントに連結された第１lox部位に連結された
    、宿主細胞中で機能的なプロモーターを含んで成る組換えDNA分子、 インフルエンザウイルスM1 コード領域に連結された第２lox部位に連結された
    転写停止配列を含んで成るDNAセグメントに連結された第１lox部位に連結された
    、宿主細胞中で機能的なプロモーターを含んで成る組換えDNA分子、 インフルエンザウイルスNS2 コード領域に連結された第２lox部位に連結され
    た転写停止配列を含んで成るDNAセグメントに連結された第１lox部位に連結され
    た、宿主細胞中で機能的なプロモーターを含んで成る組換えDNA分子、 インフルエンザウイルスM2 コード領域に連結された第２lox部位に連結された
    転写停止配列を含んで成るDNAセグメントに連結された第１lox部位に連結された
    、宿主細胞中で機能的なプロモーターを含んで成る組換えDNA分子、 インフルエンザウイルスPA コード領域に連結された第２lox部位に連結された
    転写停止配列を含んで成るDNAセグメントに連結された第１lox部位に連結された
    、宿主細胞中で機能的なプロモーターを含んで成る組換えDNA分子、 インフルエンザウイルスPB1 コード領域に連結された第２lox部位に連結され
    た転写停止配列を含んで成るDNAセグメントに連結された第１lox部位に連結され
    た、宿主細胞中で機能的なプロモーターを含んで成る組換えDNA分子、 インフルエンザウイルスPB2 コード領域に連結された第２lox部位に連結され
    た転写停止配列を含んで成るDNAセグメントに連結された第１lox部位に連結され
    た、宿主細胞中で機能的なプロモーターを含んで成る組換えDNA分子、 インフルエンザウイルスNP コード領域に連結された第２lox部位に連結された
    転写停止配列を含んで成るDNAセグメントに連結された第１lox部位に連結された
    、宿主細胞中で機能的なプロモーターを含んで成る組換えDNA分子、 の少なくとも１つが安定に加えられた宿主細胞。
  37. 【請求項３７】 インフルエンザウイルスHA コード領域に連結された第２l ox 部位に連結された転写停止配列を含んで成るDNAセグメントに連結された第１l ox 部位に連結された、宿主細胞中で機能的なプロモーターを含んで成る組換えDN
    A分子；インフルエンザウイルスNA コード領域に連結された第２lox部位に連結
    された転写停止配列を含んで成るDNAセグメントに連結された第１lox部位に連結
    された、宿主細胞中で機能的なプロモーターを含んで成る組換えDNA分子；イン
    フルエンザウイルスM1 コード領域に連結された第２lox部位に連結された転写停
    止配列を含んで成るDNAセグメントに連結された第１lox部位に連結された、宿主
    細胞中で機能的なプロモーターを含んで成る組換えDNA分子；インフルエンザウ
    イルスNS2 コード領域に連結された第２lox部位に連結された転写停止配列を含
    んで成るDNAセグメントに連結された第１lox部位に連結された、宿主細胞中で機
    能的なプロモーターを含んで成る組換えDNA分子；および インフルエンザウイルスM2 コード領域に連結された第２lox部位に連結された転
    写停止配列を含んで成るDNAセグメントに連結された第１lox部位に連結された、
    宿主細胞中で機能的なプロモーターを含んで成る組換えDNA分子が加えられた、
    請求項３６に記載の宿主細胞。
  38. 【請求項３８】 細胞にインフルエンザウイルスNS2 コード領域に連結され
    た第２lox部位に連結された転写停止配列を含んで成るDNAセグメントに連結され
    た第１lox部位に連結された、宿主細胞中で機能的なプロモーターを含んで成る
    組換えDNA分子が加えられた請求項３６に記載の宿主細胞。
  39. 【請求項３９】 lox部位がloxP部位である、請求項３６、３７または３８
    に記載の宿主細胞。
  40. 【請求項４０】 感染性の複製欠損性インフルエンザウイルスの調製法であ
    って： i）請求項３６または３７に記載の宿主細胞を、Creオープンリーディングフレイ
    ムを含んで成るvRNAおよび宿主細胞のゲノムには存在しないインフルエンザ遺伝
    子を含んで成るvRNAを含んで成る組換えインフルエンザウイルスと接触させ；そ
    して ii）宿主細胞からウイルスを回収する、 ことを含んで成る、上記方法。
  41. 【請求項４１】 感染性の複製欠損性インフルエンザウイルスの調製法であ
    って： i）請求項３８に記載の宿主細胞を、Creオープンリーディングフレイムを含んで
    成るvRNA、PAを含んで成るvRNA、PB1を含んで成るvRNA、PB2を含んで成るvRNA、
    NPを含んで成るvRNA、HAを含んで成るvRNA、NAを含んで成るvRNA、M1を含んで成
    るvRNA、およびM2を含んで成るvRNAを含んで成る組換えインフルエンザウイルス
    と接触させ；そして ii）宿主細胞からウイルスを回収する、 ことを含んで成る、上記方法。
  42. 【請求項４２】 感染性の複製欠損性インフルエンザウイルスの調製法であ
    って： i）請求項３８に記載の宿主細胞を、Creオープンリーディングフレイムを含んで
    成るvRNA、PAを含んで成るvRNA、PB1を含んで成るvRNA、PB2を含んで成るvRNA、
    NPを含んで成るvRNA、HAを含んで成るvRNA、NAを含んで成るvRNAおよびMを含ん
    で成るvRNAを含んで成る組換えインフルエンザウイルスと接触させ；そして ii）宿主細胞からウイルスを回収する、 ことを含んで成る、上記方法。
  43. 【請求項４３】 感染性の複製欠損性インフルエンザウイルスの調製法であ
    って： i）請求項３６または３７に記載の宿主細胞を、CreをコードするDNAセグメント
    に操作可能に連結された、宿主細胞中で機能的なプロモーターを含んで成るベク
    ター、および各々が宿主細胞により発現されないインフルエンザ遺伝子に操作可
    能に連結されたプロモーターを含んで成る複数のベクターと接触させ；そして ii）宿主細胞からウイルスを回収する、 ことを含んで成る、上記方法。
  44. 【請求項４４】 請求項４１に記載の方法により調製されたウイルス。
  45. 【請求項４５】 請求項４４に記載のウイルスに感染した細胞。
  46. 【請求項４６】 請求項４２に記載の方法により調製されたウイルス。
  47. 【請求項４７】 請求項４６に記載のウイルスに感染した細胞。
  48. 【請求項４８】 請求項４３に記載の方法により調製されたウイルス。
  49. 【請求項４９】 請求項４８に記載のウイルスに感染した細胞。
  50. 【請求項５０】 請求項４０に記載の方法により調製されたウイルス。
  51. 【請求項５１】 請求項５０に記載のウイルスに感染した細胞。
  52. 【請求項５２】 組換えウイルスがさらに所望のオープンリーディングフレ
    イムを含んで成るvRNAを含んで成る、請求項４０に記載の方法。
  53. 【請求項５３】 複数のベクターがさらに、インフルエンザウイルスの3'非
    -コード領域に連結された所望のオープンリーディングフレイムに連結されたイ
    ンフルエンザウイルスの5'非-コード領域に連結されたプロモーターを含んで成
    るベクターを含んで成る、請求項４３に記載の方法。
  54. 【請求項５４】 組換えウイルスがさらに、所望のオープンリーディングフ
    レイムを含んで成るvRNAを含んで成る、請求項４１または４２に記載の方法。
  55. 【請求項５５】 ゲノムに、宿主細胞表面結合タンパク質コード領域に連結
    された第２lox部位に連結された転写停止配列を含んで成るDNAセグメントに連結
    された第１lox部位に連結された、宿主細胞中で機能的なプロモーターを含んで
    成る組換えDNA分子；融合タンパク質 コード領域に連結された第２lox部位に連
    結された転写停止配列を含んで成るDNAセグメントに連結された第１lox部位に連
    結された、宿主細胞中で機能的なプロモーターを含んで成る組換えDNA分子；イ
    ンフルエンザウイルスM1 コード領域に連結された第２lox部位に連結された転写
    停止配列を含んで成るDNAセグメントに連結された第１lox部位に連結された、宿
    主細胞中で機能的なプロモーターを含んで成る組換えDNA分子；インフルエンザ
    ウイルスNS2 コード領域に連結された第２lox部位に連結された転写停止配列を
    含んで成るDNAセグメントに連結された第１lox部位に連結された、宿主細胞中で
    機能的なプロモーターを含んで成る組換えDNA分子；インフルエンザウイルスM2
    コード領域に連結された第２lox部位に連結された転写停止配列を含んで成るDNA
    セグメントに連結された第１lox部位に連結された、宿主細胞中で機能的なプロ
    モーターを含んで成る組換えDNA分子が加えられた宿主細胞。
  56. 【請求項５６】 宿主細胞表面結合タンパク質がHAである、請求項５６に記
    載の宿主細胞。
  57. 【請求項５７】 融合タンパク質がNAである、請求項５６に記載の宿主細胞
    。
  58. 【請求項５８】 lox部位がloxP部位である、請求項５６に記載の宿主細胞
    。
  59. 【請求項５９】 ゲノムに、宿主細胞表面結合タンパク質および融合タンパ
    ク質コード領域に連結された第２lox部位に連結された転写停止配列を含んで成
    るDNAセグメントに連結された第１lox部位に連結された、宿主細胞中で機能的な
    プロモーターを含んで成る組換えDNA分子；インフルエンザウイルスM1 コード領
    域に連結された第２loxP部位に連結された転写停止配列を含んで成るDNAセグメ
    ントに連結された第１lox部位に連結された、宿主細胞中で機能的なプロモータ
    ーを含んで成る組換えDNA分子；インフルエンザウイルスNS2 コード領域に連結
    された第２lox部位に連結された転写停止配列を含んで成るDNAセグメントに連結
    された第１lox部位に連結された、宿主細胞中で機能的なプロモーターを含んで
    成る組換えDNA分子；およびインフルエンザウイルスM2 コード領域に連結された
    第２lox部位に連結された転写停止配列を含んで成るDNAセグメントに連結された
    第１lox部位に連結された、宿主細胞中で機能的なプロモーターを含んで成る組
    換えDNA分子が加えられた宿主細胞。
  60. 【請求項６０】 lox部位がloxP部位である、請求項５９に記載の宿主細胞
    。
  61. 【請求項６１】 感染性の複製欠損性インフルエンザウイルスの調製法であ
    って： i）請求項５５または５９に記載の宿主細胞を、Creオープンリーディングフレイ
    ムを含んで成るvRNA、PAを含んで成るvRNA、NPを含んで成るvRNA、PB1を含んで
    成るvRNAおよびPB2を含んで成るvRNAを含んで成る組換えインフルエンザウイル
    スと接触させ；そして ii）宿主細胞からウイルスを回収する、 ことを含んで成る、上記方法。
  62. 【請求項６２】 請求項６１に記載の方法により調製されたウイルス。
  63. 【請求項６３】 請求項６２に記載のウイルスに感染した細胞。
  64. 【請求項６４】 組換えウイルスがさらに、所望のオープンリーディングフ
    レイムを含んで成るvRNAを含んで成る、請求項６１に記載の方法。
  65. 【請求項６５】 オープンリーディングフレイムを含んで成るアンチセンス
    cDNAが、免疫原性ポリペプチドまたは病原体のペプチドをコードする、請求項３
    、４または１９に記載の組成物。
  66. 【請求項６６】 細胞を請求項６５に記載の組成物と、感染性インフルエン
    ザウイルスを生産するために効果的な量で接触させることを含んで成る、インフ
    ルエンザウイルスの調製法。
  67. 【請求項６７】 さらにウイルスを単離することを含んで成る、請求項６６
    に記載の方法。
  68. 【請求項６８】 請求項６７に記載の方法により得られるウイルス。
  69. 【請求項６９】 オープンリーディングフレイムが、免疫原性ポリペプチド
    または病原体のペプチドをコードする、請求項５２、５３または６４に記載の方
    法。
  70. 【請求項７０】 請求項６９に記載の方法により得られるウイルス。
  71. 【請求項７１】 オープンリーディングフレイムが、免疫原性ポリペプチド
    または病原体のペプチドをコードする、請求項５４に記載の方法。
  72. 【請求項７２】 請求項７１に記載の方法により得られるウイルス。
  73. 【請求項７３】 個体に、個体を免疫感作するために効果的な量の請求項６
    ８、７０または７２に記載のウイルスを投与することを含んで成る、病原体に対
    する個体の免疫感作法。
  74. 【請求項７４】 RNAポリメラーゼI転写終結配列に連結された（＋）センス
    RNAウイルスcDNAに操作可能に連結されたRNAポリメラーゼIプロモーターを含ん
    で成るベクター。
  75. 【請求項７５】 cDNAがセンス方向である、請求項７４に記載のベクター。
  76. 【請求項７６】 cDNAがアンチセンス方向である、請求項７４に記載のベク
    ター。
  77. 【請求項７７】 RNAポリメラーゼI転写終結配列にセンス方向で連結された
    （＋）センスRNAウイルスのcDNAに操作可能に連結されたRNAポリメラーゼIプロ
    モーターを含んで成るベクター；およびRNAポリメラーゼI転写終結配列にアンチ
    センス方向で連結された（＋）センスRNAウイルスのcDNAに操作可能に連結され
    たRNAポリメラーゼIプロモーターを含んで成るベクターを含んで成る組成物。
  78. 【請求項７８】 感染性ウイルスを生産するために、宿主細胞と請求項７４
    に記載のベクターとを接触させることを含んで成る、感染性ウイルスの調製法。
  79. 【請求項７９】 感染性ウイルスを生産するために、宿主細胞と請求項７７
    に記載の組成物とを接触させることを含んで成る、感染性ウイルスの調製法。
  80. 【請求項８０】 感染性ウイルスを生産するために細胞を、転写終結配列に
    連結されたインフルエンザウイルスPA cDNAに操作可能に連結されたプロモータ
    ーを含んで成るベクター、転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスPB
    1 cDNAに操作可能に連結されたプロモーターを含んで成るベクター、転写終結配
    列に連結されたインフルエンザウイルスPB2 cDNAに操作可能に連結されたプロモ
    ーターを含んで成るベクター、転写終結配列に連結されたインフルエンザウイル
    スHA cDNAに操作可能に連結されたプロモーターを含んで成るベクター、転写終
    結配列に連結されたインフルエンザウイルスNP cDNAに操作可能に連結されたプ
    ロモーターを含んで成るベクター、転写終結配列に連結されたインフルエンザウ
    イルスNA cDNAに操作可能に連結されたプロモーターを含んで成るベクター、転
    写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスM cDNAに操作可能に連結された
    プロモーターを含んで成るベクターおよび転写終結配列に連結されたインフルエ
    ンザウイルスNS cDNAに操作可能に連結されたプロモーターを含んで成るベクタ
    ー、インフルエンザウイルスPAをコードするDNAセグメントに操作可能に連結さ
    れたプロモーターを含んで成るベクター、インフルエンザウイルスPB1をコード
    するDNAセグメントに操作可能に連結されたプロモーターを含んで成るベクター
    、インフルエンザウイルスPB2をコードするDNAセグメントに操作可能に連結され
    たプロモーターを含んで成るベクターおよびインフルエンザウイルスNPをコード
    するDNAセグメントに操作可能に連結されたプロモーターを含んで成るベクター
    と接触させることを含んで成る、インフルエンザウイルスの調製法。
  81. 【請求項８１】 さらにインフルエンザウイルスHAをコードするDNAセグメ
    ントに操作可能に連結されたプロモーターを含んで成るベクター、インフルエン
    ザウイルスNAをコードするDNAセグメントに操作可能に連結されたプロモーター
    を含んで成るベクター、インフルエンザウイルスM1をコードするDNAセグメント
    に操作可能に連結されたプロモーターを含んで成るベクター、インフルエンザウ
    イルスM2をコードするDNAセグメントに操作可能に連結されたプロモーターを含
    んで成るベクターおよびインフルエンザウイルスNS2をコードするDNAセグメント
    に操作可能に連結されたプロモーターを含んで成るベクターを含んで成る、請求
    項８０に記載の方法。
  82. 【請求項８２】 転写終結配列に連結された3'非-コードインフルエンザウ
    イルス配列に、アンチセンス方向で連結された目的とするcDNAまたはそれらのフ
    ラグメントに連結された5'非-コードインフルエンザウイルス配列に連結された
    プロモーターを含んで成るベクターをさらに含んで成る、請求項８０または８１
    に記載の方法。
  83. 【請求項８３】 さらにウイルスを単離することを含んで成る、請求項８０
    ないし８２のいずれか１項に記載の方法。
  84. 【請求項８４】 請求項８３の方法により得られるウイルス。
  85. 【請求項８５】 請求項８４のウイルスと接触した細胞。
  86. 【請求項８６】 請求項８４のウイルスに感染した細胞。
  87. 【請求項８７】 個体に、個体を免疫感作するために効果的な量の請求項８
    ４に記載のウイルスを投与することを含んで成る、病原体に対する個体の免疫感
    作法。
  88. 【請求項８８】 転写終結配列に連結された(-)鎖RNAウイルスのゲノムの少
    なくとも一部を含んで成るcDNAに操作可能に連結されたプロモーターを含んで成
    るベクター。
  89. 【請求項８９】 cDNAが非分離の１本鎖RNAウイルスの一部である、請求項
    ８８に記載のベクター。
  90. 【請求項９０】 cDNAが分離した１本鎖RNAウイルスから得られる、請求項
    ８８に記載のベクター。
  91. 【請求項９１】 プロモーターがRNAポリメラーゼIプロモーターである、請
    求項８８に記載のベクター。
  92. 【請求項９２】 終結配列がRNAポリメラーゼI転写終結配列である、請求項
    ８８に記載のベクター。
  93. 【請求項９３】 ａ）転写終結配列に連結された(-)鎖RNAウイルスのゲノム
    の少なくとも一部を含んで成るcDNAに操作可能に連結されたプロモーターを含ん
    で成る少なくとも１つのベクター；およびｂ）(-)鎖RNAウイルスの少なくとも１
    つのウイルスタンパク質をコードするDNAセグメントに操作可能に連結されたプ
    ロモーターを含んで成る少なくとも１つのベクター、を含んで成る複数のウイル
    スベクターを含んで成る組成物。
  94. 【請求項９４】 ａ）のベクターのプロモーターが、RNAポリメラーゼIプロ
    モーターである、請求項９３に記載の組成物。
  95. 【請求項９５】 ａ）のベクターがさらに転写終結配列を含んで成る、請求
    項９３に記載の組成物。
  96. 【請求項９６】 転写終結配列がRNAポリメラーゼI転写終結配列である、請
    求項９５に記載の組成物。
  97. 【請求項９７】 感染性ウイルスを生産するために、宿主細胞を請求項８８
    に記載の組成物と接触させることを含んで成る、ウイルスの調製法。
  98. 【請求項９８】 感染性ウイルスを生産するために、宿主細胞を請求項９３
    に記載のベクターと接触させることを含んで成る、ウイルスの調製法。
  99. 【請求項９９】 請求項９７または９８のいずれか１項に記載の方法により
    単離されたウイルス。
  100. 【請求項１００】 請求項１８、２１、４４、４６、４８、５０、６２、６
    ８、７０、７２、８４または９９のいずれか１項に記載のウイルスの使用。
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