PT1951299E - Vacinas contra a gripe que incluem combinações de adjuvantes particulados e imuno-potenciadores - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "VACINAS CONTRA A GRIPE QUE INCLUEM COMBINAÇÕES DE ADJUVANTES PARTICULADOS E IMUNO-POTENCIADORES"

CAMPO TÉCNICO A presente invenção insere-se no campo das vacinas com adjuvante para proteger contra a infecção pelo vírus da gripe.

TÉCNICA ANTERIOR

Excepto o produto FLUAD™ (Chiron Vaccines), que utiliza o adjuvante de emulsão de óleo em água MF59 [1], as vacinas contra a gripe actualmente utilizadas não incluem em geral um adjuvante. Estas vacinas descrevem-se com mais pormenor nos capítulos 17 e 18 da referência 2. Baseiam-se em vírus vivos ou vírus inactivados, e as vacinas inactivadas podem basear-se em vírus completos, vírus 'fraccionados' ou em antigénios de superfície purificados (incluindo hemaglutinina e neuraminidase). A hemaglutinina (HA) é o principal imunogénio em vacinas contra a gripe inactivadas, e as doses de vacina estão normalizadas por referência a níveis de HA, contendo as vacinas normalmente aproximadamente 15 pg de HA por estirpe.

Num surto de gripe pandémica será necessário um grande número de doses de vacina contra a gripe, mas será difícil aumentar o fornecimento de vacinas para satisfazer a grande demanda. Portanto, em lugar de produzir mais antigénio de vacina, propôs-se utilizar uma menor quantidade de antigénio por estirpe, e utilizar um adjuvante para compensar a reduzida dose de antigénio. Também se propôs utilizar a mesma abordagem em períodos interpandémicos, por 2 exemplo, para permitir maior cobertura da população sem aumentar os níveis de fabrico.

Sugeriram-se adjuvantes particulados insolúveis [3] como sais de alumínio [4-7] ou micropartículas [8] para melhorar as vacinas contra a gripe. Embora estas vacinas com adjuvante sejam úteis, ainda há possibilidades de as melhorar. Portanto, é um objectivo da invenção proporcionar mais vacinas contra a gripe com adjuvante e melhoradas (para utilização tanto pandémica como interpandémica) e métodos para a sua preparação.

DIVULGAÇÃO DA INVENÇÃO

Encontraram-se vacinas contra a gripe que contêm adjuvantes particulados insolúveis para provocar uma resposta de IgG que é principalmente uma resposta de TH2 (IgGl). Esta resposta pode deslocar-se para uma resposta de TH1 (IgG2a) pela inclusão de imuno-potenciadores nas composições. Informou-se de respostas de tipo TH1 [9] para melhorar a imunidade heterosubtípica contra o vírus da gripe. Vantajosamente, também foi encontrado que os imuno-potenciadores aumentam os títulos de hemaglutinação e os títulos por técnica ELISA de anti-hemaglutinina.

Portanto, a invenção proporciona uma composição imunogénica que compreende: (i) um antigénio do vírus da gripe; (ii) um adjuvante particulado insolúvel; e (iii) um imuno-potenciador, como se define nas reivindicações. A invenção também proporciona um método para preparar uma composição imunogénica que compreende as etapas de combinar: (i) um antigénio do vírus da gripe; (ii) um adjuvante particulado insolúvel; e (iii) um imuno-potenciador, como é definido nas reivindicações. A invenção proporciona um kit que compreende: (i) uma primeira componente de kit que compreende um antigénio do vírus da gripe; e (ii) uma segunda componente de kit que compreende um adjuvante particulado insolúvel, em que tanto 3 (a) a primeira componente ou a segundo componente incluem um imuno-potenciador, como (b) o kit inclui uma terceira componente de kit que compreende um imuno-potenciador, como é definido nas reivindicações.

0 ANTIGÉNIO DO VÍRUS DA GRIPE

As composições da invenção incluem um antigénio do vírus da gripe. 0 antigénio preparar-se-á normalmente a partir de viriões da gripe mas, em alternativa, antigénios como a hemaglutinina podem expressar-se num hospedeiro recombinante (por exemplo, numa linha celular de insecto utilizando um vector de baculovírus) e utilizar-se em forma purificada [10, 11]. Em geral, no entanto, os antigénios serão de viriões. O antigénio adquire a forma de um vírus inactivado. Meios químicos para inactivar um vírus incluem tratamento com uma quantidade eficaz de um ou mais dos seguintes agentes: detergentes, formaldeído, formalina, β-propiolactona ou luz UV. Meios químicos adicionais para a inactivação incluem tratamento com azul de metileno, psoraleno, carboxifulereno (C60) ou uma combinação de qualquer um dos mesmos. Outros métodos de inactivação vírica conhecem-se na especialidade como, por exemplo, etilamina binária, acetiletilenimina, ou irradiação gama. 0 produto INFLEXAL™ é uma vacina inactivada de virião completo.

Utiliza-se vírus inactivado, e a vacina pode compreender virião completo, virião fraccionado ou antigénios de superfície purificados (incluindo hemaglutinina e normalmente incluindo também neuraminidase) .

Os viriões podem recolher-se de fluidos que contêm vírus por diferentes métodos. Por exemplo, um processo de purificação pode envolver centrifugação zonal utilizando uma dissolução em gradiente de sacarose linear que inclui 4 detergente para romper os viriões. Então, os antigénios podem purificar-se, após a diluição opcional, por diafiltração.

Os viriões fraccionados obtêm-se tratando viriões com detergentes (por exemplo, éter etilico, polisorbato 80, desoxicolato, fosfato de tri-N-butilo, Triton X-100, Triton N101, brometo de cetiltrimetilamónio, Tergitol NP9, etc.) para produzir preparações de sub-viriões, incluindo o método de fraccionamento do 'Tween-éter'. Os métodos de fraccionamento do virus da gripe são muito conhecidos na especialidade, por exemplo, ver as refs. 12-17, etc. O fraccionamento do virus realiza-se normalmente rompendo ou fragmentando virus completos, tanto se são infecciosos como não infecciosos, com uma concentração de rotura de um agente de fraccionamento. A rotura produz uma solubilização completa ou parcial das proteínas do virus, alterando a integridade do vírus. Os agentes de fraccionamento preferidos são tensioactivos não iónicos e iónicos (por exemplo, catiónicos), por exemplo, alquilglucósidos, alquiltioglucósidos, açúcares de acilo, sulfobetaínas, betaínas, polioxietilenalquiléteres, N,N-dialquil-glucamidas, Hecameg, alquilfenoxi-polietoxietanóis, compostos de amónio quaternário, sarcosil, CTAB (brometos de cetiltrimetilamónio), fosfato de tri-N-butilo, Cetavlon, sais de miristiltrimetilamónio, lipofectina, lipofectamina e DOT-MA, os octil- ou nonilfenoxipolioxietanóis (por exemplo, os tensioactivos de Triton como Triton X-100 ou Triton N101), ésteres de polioxietilensorbitano (os tensioactivos Tween), éteres depolioxietileno, ésteres de polioxietileno, etc. Um procedimento de fraccionamento útil utiliza os efeitos consecutivos do desoxicolato de sódio e o formaldeído, e o fraccionamento pode ocorrer durante a purificação do virião inicial (por exemplo, numa solução de gradiente de densidade de sacarose). Portanto, um processo de fraccionamento pode envolver clarificação do material 5 que contém os viriões (para eliminar o material de não virião) , concentração dos viriões recolhidos (por exemplo, utilizando um método de adsorção, como adsorção em CaHP04), separação de viriões completos de material de não virião, fraccionamento de viriões utilizando um agente de fraccionamento numa etapa de centrifugação em gradiente de densidade (por exemplo, utilizando um gradiente de sacarose que contém um agente de fraccionamento como desoxicolato de sódio), e depois filtração (por exemplo, ultrafiltração) para eliminar materiais não desejados. Os viriões fraccionados podem resuspender-se utilmente em solução isotónica de cloreto de sódio tamponada com fosfato de sódio. Os FLUSHIELD™ antigénios antigénios normalmente produtos BEGRIVAC™, FLUARIX™, FLUZONE™ e são vacinas fraccionadas. As vacinas de de superfície purificados compreendem os de superfície da gripe hemaglutinina e, também neuraminidase. Os Processos para preparar estas proteínas em forma purificada são muito conhecidos na especialidade. Os produtos FLUVIRIN™, AGRIPPAL™ e INFLUVAC™ são vacinas de sub-unidade.

Os antigénios da gripe também se podem apresentar em forma de virossomas [18]. 0 vírus da gripe pode ser atenuado. 0 vírus da gripe pode ser sensível à temperatura. 0 vírus da gripe pode ser adaptado ao frio. Estas três possibilidades aplicam-se em particular a vírus vivos.

As estirpes do vírus da gripe para a sua utilização em vacinas mudam de estação para estação. No presente período interpandémico, as vacinas normalmente incluem duas estirpes da gripe A (H1N1 e H3N2) e uma estirpe da gripe B, e as vacinas trivalentes são típicas. A invenção também utiliza vírus de estirpes pandémicas (isto é, estirpes para as que o receptor da vacina e a população humana geral não recebeu previamente tratamento imunológico) como as estirpes dos subtipos H2, H5, H7 ou H9 (em particular do 6 vírus da gripe A), e as vacinas contra a gripe para estirpes pandémicas podem ser monovalentes ou podem basear-se numa vacina trivalente normal complementada por uma estirpe pandémica. No entanto, consoante da estação e da natureza do antigénio incluído na vacina, a invenção pode proteger contra um ou mais dos subtipos de hemaglutinina do vírus da gripe A Hl, H2, H3, H4, H5 H6, H7, H8, H9, H10, Hll, H12, H13, H14, H15 ou H16. A invenção pode proteger contra um ou mais dos subtipos de NA do virus da gripe A Nl, N2, N3; N4; N5, N6, N7, N8 ou N9.

Outras estirpes que se podem incluir utilmente nas composições são estirpes que são resistentes à terapêutica antivírica (por exemplo, resistentes a oseltamivir [19] e/ou zanamivir), que incluem estirpes pandémicas resistentes [20].

As composições com adjuvantes da invenção são particularmente úteis para imunizar contra estirpes pandémicas. As características de uma estirpe da gripe que têm o potencial de produzir um surto pandémico são: (a) contém uma nova hemaglutinina em comparação com as hemaglutininas em estirpes humanas actualmente em circulação, isto é, uma que não foi evidente na população humana durante mais de uma década (por exemplo, H2), ou não foi vista previamente na população humana (por exemplo, H5, H6 ou H9, que geralmente só foi encontrada em populações aviárias), de forma que a população humana será imunologicamente naive à hemaglutinina da estirpe; (b) pode ser transmitida horizontalmente na população humana; e (c) é patogénica para os seres humanos. Prefere-se um vírus com tipo de hemaglutinina H5 para imunizar contra a gripe pandémica como uma estirpe H5N1. Outras estirpes possíveis incluem H5N3, H9N2, H2N2, H7N1 e H7N7, e qualquer outra estirpe pandémica potencialmente emergente. Dentro do subtipo H5, um vírus pode classificar-se em subtipo de HA 7 1, subtipo de HA 1', subtipo de HA 2 ou subtipo de HA 3 [21], sendo os subtipos 1 e 3 particularmente relevantes.

As composições da invenção podem incluir antigénio(s) de uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou mais) estirpes do virus da gripe, que incluem virus da gripe A e/ou virus da gripe B. Se uma vacina inclui mais de uma estirpe da gripe, as diferentes estirpes cultivam-se normalmente em separado e misturam-se depois de se recolherem os virus e de se preparar os antigénios. Portanto, um método segundo a invenção pode incluir a etapa de misturar antigénios de mais de uma estirpe da gripe. 0 virus da gripe pode ser uma estirpe reagrupada, e pode ter-se obtido por técnicas de genética reversa. As técnicas de genética reversa [por exemplo, 22-26] permitem que os vírus da gripe com segmentos de genoma desejados sejam preparados in vitro utilizando plasmídeos. Normalmente envolve expressar (a) moléculas de ADN que codificam moléculas de ARN vírico desejadas, por exemplo, de promotores poli, e (b) moléculas de ADN que codificam proteínas viricas, por exemplo, de promotores polll, de forma que a expressão de ambos os tipos de ADN numa célula conduza a uma montagem de um virião infeccioso intacto completo. 0 ADN proporciona preferentemente todo o ARN e as proteínas viricas, mas também é possível utilizar um vírus colaborador para proporcionar algo de ARN e proteínas. Os métodos baseados em plasmídeos utilizando plasmídeos separados para produzir cada ARN vírico são preferidos [27— 29], e estes métodos também envolverão a utilização de plasmídeos para expressar todas ou algumas (por exemplo, só as proteínas PB1, PB2, PA e NP) das proteínas viricas, utilizando-se 12 plasmídeos nalguns métodos.

Para reduzir o número de plasmídeos necessários, uma recente abordagem [30] combina uma pluralidade de cassetes de transcrição da ARN polimerase I (para a síntese de ARN vírico) no mesmo plasmídeo (por exemplo, sequências que 8 codificam 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou os 8 segmentos do ARN da gripe A) , e uma pluralidade de regiões codificantes de proteínas com promotores da ARN polimerase II noutro plasmídeo (por exemplo, sequências que codificam 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou os 8 transcritos de ARNm da gripe A) . Aspectos preferidos do método de referência 30 envolvem: (a) regiões que codificam ARNm de PB1, PB2 e PA num único plasmídeo; e (b) os 8 segmentos que codificam ARNv num único plasmídeo. O incluir os segmentos de NA e HA num plasmídeo e os outros seis segmentos noutro plasmídeo também pode facilitar assuntos.

Em alternativa a utilizar promotores poli para codificar os segmentos de ARN vírico é possível utilizar promotores da polimerase de bacteriófago [31]. Por exemplo, os promotores para as polimerases SP6, T3 ou T7 podem utilizar-se convenientemente. Devido à especificidade por espécie dos promotores poli, os promotores da polimerase de bacteriófago podem ser mais convenientes para muitos tipos de células (por exemplo, MDCK), embora uma célula também se deva transfectar com um plasmídeo que codifica a enzima polimerase exógena.

Noutras técnicas é possível utilizar promotores poli e polll duais para codificar simultaneamente os ARN víricos e para ARNm que podem ser expressos a partir de um único molde [32, 33] .

Portanto, um vírus da gripe A pode incluir um ou mais segmentos de ARN de um vírus de A/PR/8/34 (normalmente 6 segmentos de A/PR/8/34, sendo os segmentos de HA e N de uma estirpe de vacina, isto é, um reagrupamento 6:2), particularmente quando os vírus se cultivam em ovos. Também pode incluir um ou mais segmentos de ARN de um vírus A/WSN/33, ou de qualquer outra estirpe de vírus útil para gerar vírus de reagrupamento para a preparação de vacinas. Normalmente, a composição imunogénica da invenção protege contra uma estirpe que se pode transmitir de ser humano 9 para ser humano, e então o genoma de estirpe incluirá normalmente pelo menos um segmento de ARN que se originou num virus da gripe de mamífero (por exemplo, num ser humano) . Pode incluir segmento de NS que se originou num vírus da gripe aviária.

Os vírus utilizados como fonte de antigénios podem cultivar-se tanto em ovos (normalmente ovos SPF) como em cultura celular. 0 presente método convencional para o crescimento de virus da gripe utiliza ovos de galinha embrionados, purificando-se o vírus do conteúdo do ovo (fluido alantóico). No entanto, mais recentemente, os vírus têm sido cultivados em cultura celular animal e, por motivos de velocidade e alergias nos pacientes, prefere-se este método de crescimento. Se for utilizado crescimento vírico baseado em ovos, então um ou mais aminoácidos podem introduzir-se no fluido alantóico do ovo juntamente com o vírus [15]. 0 substrato de células será normalmente uma linha celular de mamífero. Células de mamífero adequadas de origem incluem, mas não se limitam a, células de hamster, gado bovino, primata (incluindo seres humanos e macacos) e cão. Podem utilizar-se diversos tipos de células, como células de rim, fibroblastos, células da retina, células de pulmão, etc. Exemplos de células de hamster adequadas são as linhas celulares que têm os nomes BHK21 ou HKCC. Células de macaco adequadas são, por exemplo, células de macaco verde africano, como células de rim como na linha celular Vero. Células de cão adequadas são, por exemplo, células de rim, como na linha celular MUCK. Portanto, linhas celulares adequadas incluem, mas não se limitam a: MDCK; CHO; 293T; BHK; Vero; MRC-5; PER.C6; WI-38; etc. As linhas celulares de mamífero preferidas para cultivar os vírus da gripe incluem: células MDCK [34-37], derivadas de rim canino

Madin Darby; células Vero [38-40], derivadas de rim de macaco verde africano (Cercopithecus aethíops); ou células 10 PER.C6 [41], derivadas de retinoblastos embrionários humanos. Estas linhas celulares estão amplamente disponíveis, por exemplo, da Colecção americana de culturas de células tipo (ATCC) [42], dos Repositórios de células Coriell [43], ou da Colecção europeia de culturas celulares (ECACC). Por exemplo, a ACC fornece diversas células Vero diferentes sob os números de catálogo CCL-81, CCL-81,2, CRL-1586 e CRL-1587, e fornece células MDCK sob o número de catálogo CCL-34. PER.C6 está disponível da ECACC sob o número de depósito 96022940. Em alternativa menos preferida às linhas celulares de mamífero, o vírus pode cultivar-se em linhas celulares aviárias [por exemplo, refs. 44-46], que incluem linhas celulares derivadas de patos (por exemplo, retina de pato) ou galinhas, por exemplo, fibroblastos de embrião de frango (CEF), etc. Exemplos incluem citoblastos embrionários aviários [44,47], que incluem a linha celular EBx derivada de fibroblastos embrionários de frango, EB45, EB14 e EB14-074 [48].

Se o vírus foi cultivado numa linha celular de mamífero, então a composição estará vantajosamente livre de proteínas do ovo (por exemplo, albumina de ovo e ovomucoide) e de ADN de frango, reduzindo assim a alergenicidade.

As linhas celulares mais preferidas para cultivar o vírus da gripe são linhas celulares MDCK. A linha celular MDCK original está disponível da ATCC como CCL-34, mas também se podem utilizar derivados desta linha celular. Por exemplo, a referência 34 revela uma linha celular de MDCK que se adaptou para o crescimento em cultura em suspensão ('MDCK 33016', depositada como DSM ACC 2219). Similarmente, a referência 49 revela uma linha celular derivada de MDCK que cresce em suspensão em cultura livre de soro ( 'B—702', depositada como FERM BP-7449) . A referência 50 revela células MDCK não tumorigénicas que incluem 'MDCK-S' (ATCC PTA-6500), 'MDCK-SF101' (ATCC PTA-6501), 'MDCK-SF102' (ATCC 11 ΡΤΑ-6502) e 'MDCK-SF103' (PTA-6503). A referência 51 revela linhas celulares de MDCK com alta susceptibilidade à infecção que incluem células 'MDCK.5F1' (ATCC CRL-12042). Pode utilizar-se qualquer uma destas linhas celulares de MDCK.

Se o virus foi cultivado numa linha celular, então a cultura para o crescimento, e também o inoculo virico utilizado para iniciar a cultura, estarão preferentementes livre de (isto é, terá sido testado para e dará um resultado negativo para contaminação por) virus do herpes simples, virus respiratório sincicial, virus paragripal 3, coronavirus do SARS, adenovirus, rinovirus, reovirus, virus do polioma, birnavirus, circovirus e/ou parvovirus [52]. Prefere-se particularmente a ausência dos virus do herpes simples.

Se o virus foi cultivado numa linha celular, então a composição contém preferentemente menos de 10 ng (preferentemente menos de 1 ng, e mais preferentemente menos de 100 pg) de ADN de células hospedeiras residual por dose, embora possam estar presentes quantidades traço de ADN de células hospedeiras. Em geral, o ADN de células hospedeiras que se pretende excluir das composições da invenção é ADN que tem mais de 100 pb de comprimento.

A medição do ADN de células hospedeiras residual é agora um requisito regulador rotineiro para produtos biológicos e está dentro das capacidades normais do perito na especialidade. O ensaio utilizado para medir ADN será normalmente um ensaio validado [53, 54]. As caracteristicas de rendimento de um ensaio validado podem descrever-se em termos matemáticos e quantificáveis, e serão identificadas as suas possíveis fontes de erro. 0 ensaio provará geralmente caracteristicas como a exactidão, precisão, especificidade. Uma vez que foi calibrado um ensaio (por exemplo, contra quantidades padrão conhecidas de ADN de células hospedeiras) e provado, então as medições de ADN 12 quantitativas podem realizar-se rotineiramente. Podem utilizar-se três técnicas principais para a quantificação de ADN: métodos de hibridação, como transferências Southern ou transferências por ranhura [55]; métodos de imuno-ensaio, como o sistema Threshold™ [56]; e PCR quantitativa [57] . Estes métodos são todos familiares para o especialista, embora as características precisas de cada método podem depender da célula hospedeira em questão, por exemplo, a escolha de sondas para hibridação, a escolha de iniciadores e/ou sondas para amplificação, etc. 0 sistema Threshold™ de Molecular Devices é um ensaio quantitativo para níveis de picograma de ADN total e foi utilizado para monitorizar níveis de ADN contaminante em produtos bio-farmacêuticos [56]. Um ensaio típico envolve formação específica de não sequência de um complexo de reacção entre uma proteína de união a ADN monocatenário biotinilado, um anticorpo anti-ADN monocatenário conjugado com urease e ADN. Todas as componentes do ensaio estão incluídas no kit de ensaio de ADN total completo disponível do fabricante. Diversos fabricantes comerciais oferecem ensaios de PCR quantitativa para detectar ADN de células hospedeiras residual, por exemplo, AppTec™ Laboratory Services, BioReliance™, Althea Technologies, etc. Uma comparação de um ensaio de hibridação quimioluminiscente e o sistema Threshold™ de ADN total para medir a contaminação de ADN de células hospedeiras de uma vacina vírica humana pode encontrar-se na referência 58. 0 ADN contaminante pode eliminar-se durante a preparação de vacinas utilizando métodos de purificação convencionais, por exemplo, cromatografia, etc. A eliminação de ADN de células hospedeira residual pode potenciar-se por tratamento com nuclease, por exemplo, utilizando uma DNase. Um método conveniente para reduzir a contaminação do ADN de células hospedeiras revela-se nas referências 59 e 60, que envolve um tratamento de duas 13 etapas, primeiro utilizando uma DNase (por exemplo, benzonase), que se pode utilizar durante o crescimento virico, e depois um detergente catiónico (por exemplo, CTAB), que se pode utilizar durante a rotura de viriões. 0 tratamento com um agente alquilante, como β-propiolactona, também pode utilizar-se para eliminar o ADN de células hospedeira, e vantajosamente também se pode utilizar para inactivar viriões [61].

Preferem-se as vacinas que contêm <10 ng (por exemplo, < 1 ng, < 100 pg) de ADN de células hospedeiras por 15 pg de hemaglut inina, já que são vacinas que contêm < 10 ng (por exemplo, < 1 ng, < 100 pg) de ADN de células hospedeiras por 0,25 ml de volume. São mais preferidas as vacinas que contêm < 10 ng (por exemplo, < 1 ng, < 100 pg) de ADN de células hospedeiras por 50 pg de hemaglutinina, já que são vacinas que contêm < 10 ng (por exemplo, < 1 ng, < 100 pg) de ADN de células hospedeiras por 0,5 ml de volume.

Prefere-se que o comprimento médio de qualquer ADN de células hospedeiras residual seja inferior a 500 pb, por exemplo, inferior a 400 pb, inferior a 300 pb, inferior a 200 pb, inferior a 100 pb, etc.

Para o crescimento numa linha celular como em células MDCK, o virus pode cultivar-se em células em suspensão [34, 62, 63] ou em cultura aderente. Uma linha celular MDCK adequada para cultura em suspensão é MDCK 33016 (depositada como DSM ACC 2219) . Em alternativa pode utilizar-se cultura em microveiculo.

As linhas celulares que suportam a replicação do virus da gripe cultivam-se preferentemente em meios de cultura livres de soro e/ou meios livres de proteina. Um meio denomina-se doravante um meio livre de soro no contexto da presente invenção em que não existem aditivos de soro de origem humano ou animal. Livre de proteina entende-se culturas em que a multiplicação das células se produz com 14 exclusão de proteínas, factores de crescimento, outros aditivos de proteínas e proteínas não séricas, mas opcionalmente podem incluir proteínas como tripsina ou outras proteases que podem ser necessárias para o crescimento vírico. As células que se cultivam nessas culturas contêm naturalmente as próprias proteínas.

As linhas celulares que suportam a replicação do vírus da gripe se cultivam preferentemente abaixo de 37°C [64] (por exemplo, 30-36°C, ou a aproximadamente 30°C, 31°C, 32°C, 33°C, 34°C, 35°C, 36°C), por exemplo, durante a replicação vírica. 0 método para propagar o vírus em células cultivadas geralmente inclui as etapas de inocular as células cultivadas com a estirpe que vai ser cultivada, cultivar as células infectadas durante um período de tempo pretendido para a propagação do vírus como, por exemplo, como foi determinado pelo titulo de vírus ou expressão de antigénio (por exemplo, entre 24 e 168 horas após a inoculação) e recolher o vírus propagado. As células cultivadas inoculam-se com uma relação de virus (medido por PFU ou TCID50) relativamente a célula de 1:500 a 1:1, preferentemente 1:100 a 1:5, mais preferentemente 1:50 a 1:10. O vírus adiciona-se a uma suspensão das células ou aplica-se a uma monocamada das células, e o virus é absorvido sobre as células durante pelo menos 60 minutos, mas normalmente menos de 300 minutos, preferentemente entre 90 e 240 minutos a 25°C a 40°C, preferentemente a 28°C a 37°C. A cultura celular infectada (por exemplo, monocamadas) pode eliminar-se tanto por congelamento-descongelamento como por acção enzimática para aumentar o conteúdo vírico dos sobrenadantes de cultura recolhidos. Então, os fluidos recolhidos tanto inactivados como guardam-se congelados. As células cultivadas podem infectar-se a uma multiplicidade de infecção ("m.o.i.") de aproximadamente 0,0001 a 10, preferentemente de 0,002 a 5, mais preferentemente de 0,001 15 a 2. Ainda mais preferentemente, as células infectam-se a uma m.o.i de aproximadamente 0,01. As células infectadas podem recolher-se 30 a 60 horas após a infecção. Preferentemente, as células recolhem-se 34 a 48 horas após a infecção. Ainda mais preferentemente, as células recolhem-se 38 a 40 horas após a infecção. As proteases (normalmente tripsina) adicionam-se geralmente durante a cultura celular para permitir a libertação virica, e as proteases podem adicionar-se em qualquer etapa adequada durante a cultura. A hemaglutinina (HA) é o principal imunogénio em vacinas contra a gripe inactivadas, e as doses de vacina estão normalizadas por referência a niveis de HA, normalmente como se mede por um ensaio de imuno-difusão radial simples (SRID). As vacinas normalmente contêm aproximadamente 15 pg de HA por estirpe, embora também sejam utilizadas doses menores, por exemplo, para crianças, ou em situações pandémicas. Utilizaram-se doses fraccionárias como Vé (isto é, 7,5 pg de HA por estirpe), H e H [6,7], já que têm maiores doses (por exemplo, 3x ou 9x doses [65, 66]). Portanto, as vacinas podem incluir entre 0,1 e 150 pg de HA por estirpe da gripe, preferentemente entre 0,1 e 50 pg, por exemplo, 0,1-20 pg, 0,1-15 pg, 0,Ι-ΙΟ pg, 0,1-7,5 pg, 0,5-5 pg, etc. Doses particulares incluem, por exemplo, aproximadamente 45, aproximadamente 30, aproximadamente 15, aproximadamente 10, aproximadamente 7,5, aproximadamente 5, aproximadamente 3,8, aproximadamente 1,9, aproximadamente 1,5, etc. Estas doses menores são as mais úteis quando um adjuvante está presente na vacina, como com a invenção. A HA utilizada com a invenção pode ser uma HA natural como se encontra num vírus, ou pode ter-se modificado. Por exemplo, conhece-se modificar a HA para eliminar determinantes (por exemplo, regiões hiperbásicas em torno do sítio de clivagem entre HA1 e HA2) que fazem com que um 16 vírus seja altamente patogénico em espécies aviárias, uma vez que estes determinantes podem prevenir de outro modo que um vírus se cultive em ovos. A componente de antigénio dos kits da invenção pode incluir detergente, por exemplo, um tensioactivo de éster de polioxietilensorbitano (conhecidos como 'Tweens1 ), um octoxinol (como octoxinol-9 (Triton X-100) ou t-octilfenoxipolietoxietanol), um brometo de cetiltrimetilamónio ('CTAB'), ou desoxicolato de sódio, particularmente para vacinas fraccionadas ou de antigénio de superfície. 0 detergente pode estar presente só a quantidades traço. Portanto, a vacina pode incluir menos de 1 mg/ml de cada um de octoxinol-10, hidrogenosuccinato de α-tocoferilo e polisorbato 80. Outras componentes residuais em quantidades traço poderiam ser antibióticos (por exemplo, neomicina, kanamicina, polimixina B).

Uma vacina inactivada, mas de células não completas (por exemplo, uma vacina de virus fraccionados ou uma vacina de antigénio de superfície purificada), pode incluir proteína da matriz com a finalidade beneficiar-se dos epítopos de linfócitos T adicionais que se localizam dentro deste antigénio. Portanto, uma vacina de células não completas (particularmente uma vacina fraccionada) que inclui hemaglutinina e neuraminidase pode incluir adicionalmente proteína da matriz Ml e/ou M2. Se estiver presente uma proteína da matriz, prefere-se a inclusão de níveis detectáveis de proteína da matriz M2. A nucleoproteina também pode estar presente.

O ADJUVANTE PARTICULADO INSOLÚVEL

As composições e kits da invenção incluem adjuvantes particulados insolúveis que são micropartículas feitas de poli(lactido-co-glicolido).

MICROPARTÍCULAS 17

As micropartículas foram descritas para a sua utilização como adjuvantes, por exemplo, ver as referências 77 e 78.

As micropartículas são feitas de polímeros de poli(D, L-lactido-co-glicolido) biodegradáveis e não tóxicos, denominados doravante 'PLG'. Os polímeros de poli(D,L-lactido-co-glicolido) preferidos são os que têm uma razão molar de lactida/glicolida que varia entre 25:75 e 75:25, mais preferentemente de 40:60 a 60:40, por exemplo, aproximadamente 50:50. Um polímero de PLG 50:50, que contém 50% de D,L-lactida e 50% de glicolida, proporcionará um copolímero de rápida reabsorção, enquanto a PLG 75:25 se degrada mais lentamente, e 85:15 e 90:10, inclusive mais lentamente, devido ao aumento da componente de lactida.

Estes polímeros estão disponíveis numa variedade de pesos moleculares, e o peso molecular apropriado para um antigénio determinado é facilmente determinado por um perito na especialidade. Para as polilactidas, por exemplo, um peso molecular adequado será da ordem de aproximadamente 2000 a 5000. Para PLG, pesos moleculares adequados oscilarão geralmente de aproximadamente 10.000 a aproximadamente 200.000, preferentemente de aproximadamente 15.000 a aproximadamente 150.000, e o mais preferentemente de aproximadamente 50.000 a aproximadamente 100.000. Um intervalo útil é de 30.000 Dalton a 70.000 Dalton.

As micropartículas podem ter um diâmetro no intervalo de -100 nm a -150 pm, mais preferentemente -200 nm a -30 pm de diâmetro, e o mais preferentemente -500 nm a -10 pm de diâmetro. Normalmente serão substancialmente esféricas.

As micropartículas podem preparar-se de diversas formas. Por exemplo, conhecem-se métodos de evaporação de emulsão/solvente duplo que envolvem a formação de uma emulsão primária que consiste em gotículas de dissolução de polímero que posteriormente se mistura com uma fase aquosa 18 contínua que contém um estabilizador/tensioactivo de partículas. Mais particularmente, pode utilizar-se um sistema de evaporação de solvente de água em óleo em água (w/o/w) para formar as micropartículas, como se descreve na referência 79. Nesta técnica, o polímero particular é combinado com um solvente orgânico, como acetato de etilo, cloreto de dimetilo (também denominado cloreto de metileno e diclorometano) , acetonitrilo, acetona, clorofórmio e semelhantes. 0 polímero proporcionar-se-á em aproximadamente 2-15%, mais preferentemente aproximadamente 4-10%, e o mais preferentemente 6% de solução em solvente orgânico. A solução de polímero é emulsionada utilizando, por exemplo, um homogeneizador. Então, a emulsão combina-se com um volume maior de uma solução aquosa de um estabilizador de emulsão tal como poli(álcool vinílico) (PVA) ou polivinilpirrolidona. O estabilizador de emulsão proporciona-se normalmente em aproximadamente uma solução de 2-15%, mais normalmente aproximadamente uma solução de 4-10%. Então, a mistura é homogeneizada para produzir uma emulsão dupla w/o/w estável. Depois se evaporam os solventes orgânicos. Os parâmetros de formulação podem manipular-se para permitir a preparação de micropartículas pequenas (< 5 μιη) e grandes (>30 μιη) . Por exemplo, a agitação reduzida produz maiores micropartículas, como um aumento no volume de fase interno. O tamanho de partícula pode determinar-se por métodos rotineiros.

Além de usar técnicas de emulsão dupla, também se podem utilizar métodos de emulsão simples. As micropartículas também se podem formar-se utilizando secagem por pulverização e coacervação, ou por técnicas de cobertura de suspensão no ar, como cobertura em bandeja e cobertura Wurster. Também se pode utilizar gelificação iónica. 19

Após a preparação, as micropartícuias podem armazenar-se como estiverem, ou podem liofilizar-se para a utilização posterior.

Um método para absorver antigénio sobre microparticulas preparadas é do seguinte modo. As microparticulas são desidratadas e dispersadas numa suspensão de microparticulas essencialmente monomérica utilizando detergentes dializáveis. Detergentes úteis incluem, mas não se limitam a, qualquer uma das diversas N-metilglucamidas (conhecidas como MEGA); como heptanoil-N-metilglucamida (MEGA-7), octanoil-N-metilglucamida (MEGA-8), nonanoil-N-metilglucamida (MEGA-9) y decanoil-N-metilglucamida (MEGA-10); ácido eólico; colato de sódio; ácido desoxicólico; desoxicolato de sódio; ácido taurocólico; taurocolato de sódio; ácido taurodesoxicólico; taurodesoxicolato de sódio; 3 [ (3 — colamidopropil)dimetilamonio]-1-propano-sulfonato (CHAPS); 3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-2-hidroxi-l-propano-sulfonato (CHAPSO); N-dodecil-N,N-dimetil-3-amonio-l-propano-sulfonato (ZWITTERGENT 3-12); N,N-bis-(3-D- gluconamidopropil)-desoxicolamida (DEOXY-BIG CHAP); N-octilglucósido; monolaurato de sacarose; ácido glicocólico/glicocolato de sódio; laurosarcosina (sal de sódio); ácido glicodesoxicólico/glicodesoxicolato de sódio. Geralmente utilizar-se-á uma relação de aproximadamente 0,0156:1 de detergente relativamente à micropartícula (peso:peso), mais preferentemente aproximadamente 0,625:1, inclusive mais preferentemente aproximadamente 0,25:1 e o mais preferentemente aproximadamente 1:1 a 2:1 de detergente relativamente à micropartícula (peso:peso).

Então, a mistura de microparticula/detergente tritura-se fisicamente, por exemplo, utilizando um almofariz de cerâmica e pilão, até formar uma suave suspensão. Então é adicionado um tampão aquoso apropriado, como solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou solução salina tamponada com 20

Tris e a mistura resultante é sonicada ou homogeneizada até as microparticulas suspenderem completamente. Então, o antigénio de interesse é adicionado à suspensão de microparticulas, e o sistema é submetido a diálise para eliminar o detergente. As microparticulas de polimero e o sistema de detergente escolhem-se preferentemente de forma que o antigénio de interesse se adsorva à superfície da micropartícuia enquanto ainda se mantiver a actividade do antigénio. Os antigénios resultantes adsorvidos à superfície que contêm microparticulas podem lavar-se livres de antigénio sem ligar e guardar-se como uma suspensão numa formulação de tampão apropriado, ou liofilizar-se com os excipientes apropriados, como se descreve adicionalmente doravante.

As microparticulas podem tratar-se opcionalmente para ter uma superfície negativamente carregada (por exemplo, com SDS) ou uma superfície positivamente carregada (por exemplo, com um detergente catiónico como CTAB). As mudanças nas características superficiais podem alterar as caracteristicas de adsorção segundo o antigénio que venha a ser adsorvido.

O IMUNO—POTENCIADOR

As composições da invenção incluem um imuno-potenciador, e foi encontrado que a combinação de um imuno-potenciador com um adjuvante particulado insolúvel da uma composição imunogénica surpreendentemente eficaz. O imuno-potenciador é um oligonucleótido imunoestimulante como um que contém um motivo de CpG (uma sequência de dinucleótidos que contém uma citosina sem metilar unida por uma ligação fosfato a uma guanosina), ou um ARN de cadeia dupla, ou um oligonucleótido que contém uma sequência palindrómica, ou um oligonucleótido que contém uma sequência de poli(dG).

OLIGONUCLEÓTIDOS IMUNOESTIMULANTES 21

Os oligonucleótidos imunoestimulantes podem incluir modificações/análogos de nucleótidos como modificações de fosforotioato e podem ser de cadeia dupla (excepto o ARN de cadeia dupla) ou de cadeia simples. As referências 116, 117 e 118 revelam possíveis substituições de análogos, por exemplo, substituição de guanosina com 2'-desoxi-7-desazaguanosina. 0 efeito adjuvante dos oligonucleótidos de CpG trata-se adicionalmente nas refs. 119-124. A sequência de CpG pode dirigir-se a TLR9, como o motivo GTCGTT ou TTCGTT [125]. A sequência de CpG pode ser específica para induzir uma resposta imunitária de Thl, como um ODN (oligodesoxinucleótido) de CpG-A, ou pode ser mais específica para induzir uma resposta de linfócitos B, como um ODN de CpG-B. Os ODN de CpG-A e CpG-B tratam-se nas refs. 126-128. Preferentemente, o CpG é um ODN de CpG-A. Preferentemente, o oligonucleótido de CpG constrói-se de forma que a extremidade 5' esteja acessível para o reconhecimento do receptor. Opcionalmente, duas sequências de oligonucleótidos de CpG podem unir-se nas suas extremidades 3' para formar "imunómeros". Ver, por exemplo, as referências 125 e 129-131. Um adjuvante de CpG útil é CpG7909, também conhecido como ProMune™ (Coley Phamaceutical Group, Inc.) .

Em alternativa, ou além de utilizar sequências de CpG, podem utilizar-se as sequências de TpG [132]. Estes oligonucleótidos podem estar livres de motivos de CpG sem metilar. 0 oligonucleótido imunoestimulante pode ser rico em pirimidina. Por exemplo, pode compreender mais do que um nucleótido de timidina consecutivo (por exemplo, TTTT, como se revela na ref. 132), e/ou pode ter uma composição de nucleótidos com >25% de timidina (por exemplo, >35%, >40%, >50%, >60%, >80%, etc.). Por exemplo, pode compreender mais do que um nucleótido de citosina consecutivo (por exemplo, CCCC, como se revela na ref. 132), e/ou pode ter uma 22 composição de nucleótidos com >25% de citosina (por exemplo, >35%, >40%, >50%, >60%, >80%, etc.)· Estes oligonucleótidos podem estar livres de motivos de CpG sem metilar. Os oligonucleótidos imunoestimulantes compreenderão normalmente pelo menos 20 nucleótidos. Podem compreender menos de 100 nucleótidos.

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

As composições da invenção são farmaceuticamente aceitáveis. Podem incluir componentes, além do antigénio, adjuvante e imunopotenciador, por exemplo, normalmente incluirão um ou mais veículos farmacêuticos e/ou excipientes. Uma discussão meticulosa desses componentes está disponível na referência 137. A composição pode incluir conservantes como tiomersal ou 2-fenoxietanol. No entanto, prefere-se que a vacina esteja substancialmente livre (isto é, menos de 5 pg/ml) de material mercurial, por exemplo, livre de tiomersal [14, 138] . As vacinas que não contêm mercúrio são mais preferidas. As vacinas sem conservante são particularmente preferidas.

Para controlar a tonicidade prefere-se incluir um sal fisiológico como um sal de sódio. Prefere-se o cloreto de sódio (NaCl), que pode estar presente a entre 1 e 20 mg/ml. Outros sais que podem estar presentes incluem cloreto de potássio, dihidrogenofosfato de potássio, fosfato de disódio desidratado, cloreto de magnésio, cloreto de cálcio, etc.

As composições terão geralmente uma osmolalidade de entre 200 mOsm/kg e 400 mOsm/kg, preferentemente entre 240-360 mOsm/kg, e encontrar-se-ão mais preferentemente dentro do intervalo de 290-310 mOsm/kg. Previamente informou-se que a osmolalidade não tem um impacto sobre a dor produzida pela vacinação [139], mas no entanto é preferível manter a osmolalidade neste intervalo. 23

As composições podem incluir um ou mais tampões. Tampões típicos incluem: um tampão fosfato; um tampão Tris, um tampão borato; um tampão succinato; um tampão histidina ou um tampão citrato. Os tampones incluir-se-ão normalmente no intervalo de 5-20 mM. 0 pH de uma composição estará geralmente entre 5,0 e 8,1, e mais normalmente entre 6,0 e 8,0 por exemplo, entre 6,5 e 7,5, ou entre 7,0 e 7,8. Portanto, um método da invenção pode incluir uma etapa de ajustar o pH da vacina a granel antes de ser embalada. Ã composição é preferentemente estéril. A composição é preferentemente não pirogénica, por exemplo, que contém <1 UE (unidade de endotoxina, uma medida padrão) por dose, e preferentemente <0,1 UE por dose. A composição está preferentemente livre de glúten. A composição pode incluir material para uma única imunização, ou pode incluir material para múltiplas imunizações (isto é, um kit 'multidose'). Prefere-se a inclusão de um conservante em disposições multidose. Em alternativa (ou ainda) a incluir um conservante em composições multidose, as composições podem estar contidas num recipiente que tem um adaptador asséptico para a extracção do material.

As vacinas contra a gripe administram-se normalmente num volume de dosagem de aproximadamente 0,5 ml, embora a metade da dose (isto é, aproximadamente 0,25 ml) pode administrar-se a crianças. 0 antigénio, adjuvante e imunopotenciador numa composição estarão normalmente em mistura. As composições da invenção estarão normalmente em forma aquosa.

As composições e kits guardam-se preferentemente a entre 2°C e 8°C. Não se devem congelar. Idealmente devem guardar-se afastadas da luz directa.

KITS DA INVENÇÃO 24

Como se menciona anteriormente, as composições da invenção podem preparar-se extemporaneamente, no momento da administração. Portanto, a invenção proporciona kits que incluem os diversos componentes prontos para a mistura. 0 kit permite que o adjuvante e o antigénio se mantenham em separado até o momento da utilização. 0 imuno-potenciador pode incluir-se numa destas duas componentes de kit, ou pode ser parte de uma terceira componente de kit.

As componentes estão fisicamente separadas entre si dentro do kit, e esta separação pode conseguir-se de diversas formas. Por exemplo, as componentes podem estar em recipientes separados, como frascos. Então, o conteúdo de dois frascos pode misturar-se, por exemplo, extraindo o conteúdo de um frasco e adicionando-o ao outro frasco, ou extraindo por separado o conteúdo de ambos frascos e misturando-os num terceiro recipiente.

Numa disposição preferida, uma das componentes de kit está numa seringa o e a outra está num recipiente como um frasco. A seringa pode utilizar-se (por exemplo, com uma agulha) para inserir o seu conteúdo no segundo recipiente para a mistura, e a mistura pode então extrair-se na seringa. Os conteúdos misturados da seringa podem então administrar-se a um paciente, normalmente mediante uma agulha estéril nova. Ao embalar uma componente numa seringa elimina a necessidade de utilizar uma seringa separada para a administração ao paciente.

Noutra disposição preferida, as duas componentes de kit mantêm-se juntos, mas em separado na mesma seringa, por exemplo, uma seringa de câmara dual, como as reveladas nas referências 140-147, etc. Se a seringa for accionada (por exemplo, durante a administração a um paciente), então o conteúdo das duas câmaras mistura-se. Esta disposição evita a necessidade de uma etapa de mistura separada no momento de utilização. 25 0 conteúdo das diversas componentes do kit estará geralmente todo em forma aquosa. Nalgumas disposições, uma componente (normalmente uma componente de antigénio em vez de uma componente de adjuvante) está em forma seca (por exemplo, numa forma liofilizada), estando a outra componente em forma aquosa. As duas componentes podem misturar-se com o objectivo de reactivar a componente seca e dar uma composição aquosa para administração a um paciente. Uma componente liofilizada localizar-se-á normalmente dentro de um frasco em vez de uma seringa. As componentes secas podem incluir estabilizantes como lactose, sacarose ou manitol, além das misturas dos mesmos, por exemplo, misturas de lactose/sacarose, misturas de sacarose/manitol, etc. Uma disposição possível utiliza uma componente de adjuvante aquosa numa seringa pré-carregada e uma componente de antigénio liofilizada num frasco.

EMBALAGEM DAS COMPOSIÇÕES Οϋ COMPONENTES DO KIT

Recipientes adequados para as composições da invenção (ou componentes de kit) incluem frascos, seringas (por exemplo, seringas descartáveis), sprays nasais, etc. Estes recipientes devem ser estéreis.

Se uma composição/componente localiza-se num frasco, o frasco está preferentemente feito de um material de vidro ou de plástico. 0 frasco esteriliza-se preferentemente antes de adicionar-se a composição. Para evitar problemas com pacientes sensíveis ao látex, os frascos estão preferentemente fechados com um tampão livre de látex, e prefere-se a ausência de látex em todo o material da embalagem. 0 frasco pode incluir uma dose única de vacina, ou pode incluir mais do que uma dose (um frasco 'multidose' ) , por exemplo, 10 doses. Os frascos preferidos estão feitos de vidro incolor.

Um frasco pode ter uma tampa (por exemplo, um Luer lock) adaptada de forma que uma seringa pré-carregada possa 26 inserir-se na tampa, o conteúdo da seringa possa expulsar-se no frasco (por exemplo, para reconstituir o material liofilizado no seu interior) , e o conteúdo do frasco possa retirar-se novamente na seringa. Após retirar a seringa do frasco, uma agulha pode então unir-se e a composição pode administrar-se a um paciente. A tampa está preferentemente localizada dentro de um selo ou cobertura, de forma que o selo ou cobertura tem de se retirar antes de se poder aceder à tampa. Um frasco pode ter uma tampa que permita a extracção asséptica do seu conteúdo, particularmente para frascos de multidoses.

Se uma componente está embalada numa seringa, a seringa pode ter uma agulha unida à mesma. Se uma agulha não estiver unida, pode fornecer-se uma agulha separada com a seringa para a montagem e utilização. Uma agulha assim pode estar revestida. Preferem-se agulhas de segurança. São típicas agulhas de 1 polegada de calibre 23, 1 polegada de calibre 25 e 5/8 de polegada de calibre 25. As seringas podem proporcionar-se com etiquetas removíveis sobre as que se pode imprimir o número de lote, a estação da gripe e a data de validade do conteúdo para facilitar a manutenção do registo. 0 êmbolo na seringa tem preferentemente um tampão para evitar que o êmbolo seja acidentalmente retirado durante a aspiração. As seringas podem ter uma tampa de borracha de látex e/ou êmbolo. As seringas descartáveis contêm uma dose única de vacina. A seringa terá geralmente um protector para fechar a ponta antes da união de uma agulha, e o protector é preferentemente de uma borracha de butilo. Se a seringa e a agulha se embalam em separado, então a agulha está preferentemente ajustada com uma cobertura de borracha de butilo. As seringas preferidas são as comercializadas sob o nome comercial "Tip-Lok"™.

Os recipientes podem marcar-se para mostrar um volume de meia dose, por exemplo, para facilitar a administração a crianças. Por exemplo, uma seringa que contém uma dose de 27 0,5 ml pode ter uma marca que apresenta um volume de 0,25 ml.

Se for utilizado um recipiente de vidro (por exemplo, uma seringa ou um frasco), então é preferível utilizar um recipiente feito de um vidro de borossilicato em vez de um vidro de cal sodada.

Um kit ou composição pode embalar-se (por exemplo, na mesma caixa) com um prospecto que inclui detalhes da vacina, por exemplo, instruções para administração, detalhes dos antigénios dentro da vacina, etc. As instruções também podem conter advertências, por exemplo, para manter uma solução de adrenalina facilmente disponível no caso de reacção anafiláctica após a vacinação, etc.

MÉTODOS DE TRATAMENTO E ADMINISTRAÇÃO DA VACINA

As composições da invenção são adequadas para administração a pacientes humanos para fomentar uma resposta imunitária num paciente. A invenção também proporciona um kit ou composição da invenção para utilização como um medicamento. A resposta imunitária incluirá geralmente uma resposta de anticorpos, preferentemente uma resposta de anticorpos protectora. Os métodos para avaliar as respostas de anticorpos, capacidade de neutralização e protecção após a vacinação contra o vírus da gripe são muito conhecidos na especialidade. Os estudos em seres humanos demonstraram que os títulos de anticorpos contra a hemaglutinina do vírus da gripe humano guardam relação com a protecção (um título de inibição da hemaglutinação de amostras de soro de aproximadamente 30-40 da aproximadamente 50% de protecção contra infecção por um vírus homólogo) [148]. As respostas de anticorpos medem-se normalmente por inibição da hemaglutinação, por microneutralização, por imunodifusão radial simples (SRID) e/ou por hemólise radial simples (SRH) . Estas técnicas de ensaio são muito conhecidas na 28 especialidade. As composições da invenção podem administrar-se de diversas formas. A via de imunização mais preferida é por injecção intramuscular (por exemplo, no braço ou perna), mas outras vias disponíveis incluem injecção subcutânea, intra-nasal [1449-151], oral [152], intradérmica [153,154], transcutânea, transdérmica [155], etc,

As vacinas preparadas segundo a invenção podem utilizar-se para tratar, tanto crianças como adultos. As vacinas contra a gripe recomendam-se actualmente para a sua utilização em imunização pediátrica e de adultos, a partir da idade de 6 meses. Portanto, o paciente pode ter menos de 1 ano, 1-5 anos, 5-15 anos, 15-55 anos, ou pelo menos 55 anos. Os pacientes preferidos para receber as vacinas são os idosos (por exemplo, Ú50 anos, Ú60 anos, preferentemente >65 anos), jovens (por exemplo, ^5 anos), pacientes internados, trabalhadores da saúde, serviço armado e pessoal militar, mulheres grávidas, doentes crónicos, pacientes imunodeprimidos, pacientes que tomaram um composto antivírico (por exemplo, um composto de oseltamivir ou zanamivir, como fosfato de oseltamivir; ver mais à frente) nos 7 dias anteriores a receber a vacina, e pessoas que viajam para o estrangeiro. No entanto, as vacinas não são apenas adequadas para estas grupos e podem utilizar-se mais geralmente numa população. Para estirpes pandémicas prefere-se a administração a todos os grupos etários.

0 tratamento pode ser por um programa de dose única ou um programa de doses múltiplas. As doses múltiplas podem utilizar-se num programa de imunização primária e/ou num programa de imunização de reforço. Num programa de doses múltiplas, as diversas doses podem administrar-se pelas mesmas vias ou vias diferentes, por exemplo, uma sensibilização parentérica e reforço mucoso, uma sensibilização parentérica e reforço parentérico, etc. A 29 administração de mais de uma dose (normalmente duas doses) é particularmente útil em pacientes imunologicamente naive, por exemplo, para pessoas que nunca receberam uma vacina contra a gripe antes, ou para vacinar contra um novo subtipo de HA (como num surto pandémico). As doses múltiplas serão administradas normalmente pelo menos 1 semana separadas (por exemplo, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 8 semanas, aproximadamente 10 semanas, aproximadamente 12 semanas, aproximadamente 16 semanas, etc.).

As composições preferidas da invenção satisfazem 1, 2 ou 3 dos critérios do CPMP para eficácia. Nos adultos (18-60 anos), estes critérios são: (1) ^70% de sero-protecção; (2) ^40% de sero-conversão; e/ou (3) um aumento de GMT de >2,5 vezes. Nos idosos (>60 anos), estes critérios são: (1) >60% de sero-protecção; (2) >30% de sero-conversão; e/ou (3) um aumento de GMT de >2 vezes. Estes critérios baseiam-se em estudos de etiqueta aberta com pelo menos 50 pacientes.

As vacinas da invenção podem administrar-se a pacientes em substancialmente o mesmo momento (por exemplo, durante a própria consulta médica ou visita ao profissional da saúde ou centro de vacinação) que outras vacinas, por exemplo, em substancialmente o mesmo momento que uma vacina contra o sarampo, uma vacina contra as papeiras, uma vacina contra a rubéola, uma vacina contra MMR, uma vacina contra a varicela, uma vacina contra MMRV, uma vacina contra a difteria, uma vacina contra o tétano, uma vacina contra coqueluche, um vacina contra DTP, uma vacina contra H. influenzae de tipo b conjugada, uma vacina contra o virus da poliomielitis inactivado, uma vacina contra o virus da hepatite B, uma vacina conjugada meningocócica (como uma vacina A-C-W135-Y tetravalente), uma vacina contra o virus respiratório sincitial, uma vacina conjugada neumocócica, 30 etc. A administração em substancialmente o mesmo momento que uma vacina pneumocócica e/ou uma vacina meningocócica é particularmente útil em pacientes idosos.

De forma semelhante, as vacinas da invenção podem administrar-se a pacientes em substancialmente o mesmo momento (por exemplo, durante a mesma consulta médica ou visita ao profissional da saúde) que um composto antivirico, e em particular um composto antivirico contra o vírus da gripe (por exemplo, oseltamivir e/ou zanamivir). Estes antivíricos incluem inibidores da neuraminidase como um ácido (3R,4R,5S)-4-acetilamino-5-amino-3(1-etilpropoxi)-1-ciclohexeno-l-carboxílico ou ácido 5-(acetilamino)-4-[(aminoiminometil)-amino]-2,6-anhidro-3,4,5-tridesoxi-D-glicero-D-galactonon-2-enonico, incluindo ésteres dos mesmos (por exemplo, os ésteres etílicos) e sais dos mesmos (por exemplo, os sais de fosfato). Um antivirico preferido é ácido (3R,4R,5S)-4-acetilamino-5-amino-3(1-etilpropoxi)-1-ciclohexeno-l-carboxílico, éster etílico, fosfato (1:1), também conhecido como fosfato de oseltamivir (TAMIFLU™).

GERAL 0 termo "que compreende" engloba "que inclui" além de "que consiste", por exemplo, uma composição "que compreende" X pode consistir exclusivamente em X ou pode incluir algo adicional, por exemplo, X + Y. A palavra "substancialmente" não exclui "completamente", por exemplo, uma composição que está "substancialmente livre" de Y pode estar completamente livre de Y. Se for necessário, a palavra "substancialmente" pode omitir-se da definição da invenção. 0 termo "aproximadamente" em relação com um valor numérico x significa, por exemplo, x ± 10%. A menos que se estabeleça especificamente, um método que compreende uma etapa de misturar duas ou mais componentes não requer nenhuma ordem específica de mistura. 31

Por tanto, as componentes podem misturar-se em qualquer ordem. Se existirem três componentes, então duas componentes podem combinar-se entre si, e depois a combinação pode combinar-se com a terceira componente, etc.

Se utilizados materiais animais (e particularmente bovinos) na cultura de células, devem obter-se de fontes que estiverem livres de encefalopatias espongiformes transmissíveis (EET), e em particular livres da encefalopatia espongiforme bovina (EEB). Em geral, prefere-se cultivar células em ausência total de materiais derivados de animais.

Se um composto for administrado ao corpo como parte de uma composição, então esse composto pode substituir-se alternativamente por um pro-fármaco adequado.

Se for utilizado um substrato de célula para os métodos de re-agrupamento ou de genética inversa, é preferentemente um que se autorizou para a sua utilização na produção de vacinas humanas, por exemplo, como o capítulo geral de Ph Eur 5.2.3.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

As Figuras 1 a 3 apresentam loglO de títulos de anticorpos em soro (ELISA) para ratinhos imunizados com diferentes composições. A Figura 1 apresenta H1N1. A Figura 2 apresenta H3N2. A Figura 3 apresenta a gripe B. A Figura 4 apresenta títulos de Hl. As barras em primeiro plano são os grupos 1 a 3, e as barras em segundo plano são os grupos 4 a 6. A Figura 5 apresenta GMT (UA/ml) para IgG. A barra esquerda em cada par apresenta IgGl; a direita apresenta IgG2a.

MODOS PARA LEVAR A CABO A INVENÇÃO

Estirpes do vírus da gripe Wyoming H3N2 (A) , New-Caledonia H1N1 (A) e Jiangsu (B) cultivaram-se em separado em células MDCK. Preparou-se uma vacina de glicoproteína de superfície trivalente e utilizou-se para imunizar ratinhos 32

Balb/C sem tratamento imunitário prévio a 0,1 pg de HA por estirpe nos dias 0 e 28, intramuscularmente. Os animais sangraram-se no dia 42 e realizaram-se diversos ensaios de anticorpos com o sangue: títulos de Hl; respostas anti-HA, medidos por ELISA. As respostas de IgG classificaram-se como IgGl ou IgG2a.

Testaram-se três adjuvantes particulados insolúveis: (i) um hidróxido de alumínio, utilizado a 1 mg/ml e que incluiu um tampão de histidina 5 mM; (ii) fosfato de cálcio, utilizado a 1 mg/ml e que incluiu um tampão de histidina 5 mM; ou (iii) micropartícuias formadas a partir de composição de copolímero 50:50 de poli(lactido-co-glicolido), viscosidade intrínseca 0,4 ('PLG').

Testaram-se dois imuno-potenciadores: (a) um ODN de CpG imunoestimulante com um esqueleto de fosforotioato, a 10 pg/doses; e (b) R-848.

Portanto, existiram 12 grupos de animais, dos quais o grupo 6 é uma realização da invenção:_ (i) AI-H (ii) Ca-P (iii) PLG Sem adjuvante partic. Sem imunopot. 1 2 3 10 (a) CpG 4 5 6 11 (b) R-848 7 8 9 12

Para as formulações de AI-H, o antigénio trivalente foi absorvido a hidróxido de alumínio a 1 mg/ml, 3 pg/ml de antigénio, tampão de histidina 5 mM a pH 6,5, e 9 mg/ml de cloreto de sódio a 4°C durante a noite.

Para as formulações de Ca-P, uma suspensão de fosfato de cálcio foi homogeneizado a 15.000 rpm durante 3 minutos utilizando uma sonda de 20 mm para reduzir o tamanho de partícula. Então, os antigénios foram absorvidos à suspensão homogeneizada a 1 mg/ml de Ca-P, 3 pg/ml de antigénio, em tampão de histidina 5 mM a pH 6,5, e 9 mg/ml de cloreto de sódio durante a noite a 4°C. 33

Prepararam-se micropartícuias de PLG por um método de evaporação de solvente. Brevemente, as micropartícuias prepararam-se homogeneizando 10 ml de solução a 6% peso/volume de polímero em cloreto de metileno com 2,5 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) utilizando uma sonda de 10 mm. Então, a emulsão de água em óleo assim formada adicionou-se a 50 ml de água destilada que continha DSS, e a mistura foi homogeneizada a muito alta velocidade com uma sonda de 20 mm durante 5 minutos num banho de gelo. Este procedimento produziu a formação de uma emulsão de água em óleo em água que depois foi agitada a 10 00 rpm durante 12 horas a temperatura ambiente. Deixou-se que se evaporasse o cloreto de metileno. A distribuição de tamanho das micropartículas resultantes determinou-se com um analisador do tamanho de partícula. O potencial zero foi medido com um analisador Malvern Zeta. O antigénio adsorveu-se a uma carga de 0,03% peso/peso incubando uma suspensão que continha 100 mg de micropartículas de PLG de branco com 30 pg de antigénio da gripe trivalente. A solução de tampão de histidina concentrada foi adicionada a uma concentração final de 10 mM a pH 6,2 num volume total de 10 ml. Deixou-se que a suspensão se misturasse num agitador de balanço de laboratório a 4°C durante a noite. Extraiu-se 1 ml nesse momento que ia a ser usado para a determinação da eficiência de adsorção. As alíquotas que continham 3,6 pg de antigénio trivalente colocaram-se em pequenos frascos de vidro e foram liofilizados a -50°C e 90 x 10-3 mbar com manitol e sacarose para se obter uma concentração final de 4,5% e 1,5% respectivamente, após a reconstituição. A eficiência da adsorção de proteínas aos três adjuvantes determinou-se do seguinte modo: 1 ml de alíquota de PLG/FCC, Al-H/FCC ou Ca-P/FCC extraiu-se após a etapa de incubação durante a noite. Após a centrifugação, a quantidade de proteína sem ligar restante no sobrenadante 34 mediu-se por filtração em cromatografia em gel. Essencialmente, 100 μΐ do sobrenadante injectaram-se num TSK3000SWXL com um instrumento 2690/432 de Waters. Estabeleceu-se uma curva de calibragem linear com antigénio trivalente, e calculou-se a quantidade de proteína presente no sobrenadante. Então, a quantidade total de proteína sem ligar restou-se da quantidade total de proteína adicionada inicialmente e a diferença foi utilizada para calcular a eficiência de carga real.

Para a extracção de antigénio de formulações de Al-H e Ca-P, as alíquotas foram centrifugadas durante 15-20 minutos a 5000 rpm. O sobrenadante de cada amostra foi eliminado sem perturbar os sedimentos. Para deslocar o antigénio, um tampão de dessorção (Na2HP04 0,25 M + EDTA 0,15 M) adicionou-se a cada sedimento e incubou-se durante 2-3 horas a temperatura ambiente com balanço suave. O antigénio extraído separou-se do sistema de administração por centrifugação.

Para a extracção de antigénios de micropartículas de PLG, adicionou-se PBS com 0,05% de octil-p-glucósido, incubou-se durante 1-2 horas a temperatura ambiente sob movimento de balanço suave. O sobrenadante que continha os antigénios de FCC extraídos separou-se do sedimento por centrifugação.

Os anticorpos específicos de antigénio determinaram-se por técnica ELISA. A avaliação de IgG específicos de HA realizou-se em soros individuais 2 semanas após da última imunização. Placas de fundo plano de 96 poços Maxisorp secaram-se. cobriram-se durante a noite a 27-30°C com 0,2 pg/cavidade com H1N1, H2N3 ou B em solução salina tamponada com fosfato a pH 7,4 (PBS). Os poços cobertos bloquearam-se durante 1 hora a temperatura ambiente com 300 μΐ de 3% de PVP. As placas lavaram-se com PBS a pH 7,4, 0,1% de BSA e 0,05% de Tween-20, aplicaram-se nos mesmos pequenos golpes e As amostras de soro e o padrão de soro 35 diluíram-se inicialmente 1:5.000-1: 20.000 com tampão de diluição (PBS a pH 7,4, 1% de BSA, 0,05% de Tween-20), depois se transferiram a placas bloqueadas cobertas em que as amostras se diluíram em série e três vezes com o mesmo tampão. As IgG específicas de antigénio revelaram-se com anticorpo de cabra dirigido contra IgG de ratinho conjugada com fosfatase alcalina. Os títulos de anticorpos expressaram-se como o logaritmo dos títulos por técnica ELISA que deram uma densidade óptica (DO) superior à média mais cinco vezes o desvio padrão (DE) da DO média obtida nos soros pré-imunes. Os títulos normalizaram-se relativamente ao soro de referência ensaiado em paralelo.

Os anticorpos também se determinaram por um ensaio de inibição da hemaglutinação levado a cabo em placas de microtitulação de 96 poços com forma de V em soros individuais tomados 2 semanas após a primeira imunização (após de 1) e 2 semanas após da segunda imunização (após de 2) Brevemente, 25 μΐ de amostras em série diluídas duas vezes incubam-se com 25 μΐ do antigénio da gripe específico de estirpe (vírus completos que contêm 4 unidades de hemaglutinação) durante 60 minutos a temperatura ambiente. Adiciona-se uma suspensão a 0,5% volume/volume de glóbulos vermelhos obtida de galos adultos e a mistura é incubada durante outros 60 minutos. As reacções são seguidas por inspecção visual: uma formação de pontos vermelhos indica uma reacção positiva (inibição) e um remendo difuso de células uma reacção negativa (hemaglutinação). O título define-se como a diluição de soro em que se produz a última inibição da aglutinação completa. A concentração de anticorpos corresponde-se com o valor recíproco do título.

As Figuras 1 a 3 apresentam respostas da técnica ELISA anti-HA para os 12 grupos. Uma comparação dos grupos 1 e 4 apresenta que a adição de CpG a hidróxido de alumínio aumenta os titulos de HA. Similarmente, CpG aumenta os títulos de HA quando é adicionando ao adjuvante de fosfato 36 de cálcio (grupos 2 e 5) e ao adjuvante de PLG (grupos 3 e 6) . A Figura 4 apresenta títulos de Hl para os grupos 1 a 6. A adição de CpG potência os títulos de Hl.

Para ver se as respostas imunitárias foram ou não de IgG específicas de HA de tipo TH1 ou TH2, subclassificaram-se como IgGl (TH2) ou IgG2a (TH1). A Figura 5 apresenta os resultados desta análise. Os antigénios de partículas sozinhos (grupos 1, 2 e 3) apresentam muito pouca IgG2a. No entanto, quando se adiciona CpG, observam-se destacadas respostas de IgG2a (grupos 4, 5 e 6), tornando-se IgG2a dominante no grupo 5 (CpG+CaP). Portanto, a adição de um imuno-potenciador como CpG aos adjuvantes particulados insolúveis conduz a uma deslocação da resposta de tipo TH2 e para uma resposta de tipo TH1. Informou-se que as respostas de tipo TH1 melhoram a imunidade heterosubtípica contra o vírus da gripe [9], e então as vacinas contra a gripe conhecidas que contêm adjuvantes particulados insolúveis podem melhorar-se mediante a adição de um imuno-potenciador .

Entender-se-á que a invenção só foi descrita a modo de exemplo e que se podem fazer alterações enquanto continuem dentro do âmbito da invenção.

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DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor da presente solicitação de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição us 6372223 B [0114] wo 0015251 A [0114] wo 0122992 A [0114] wo 9637624 A [0114] wo 9846262 A [0114] wo 0228422 A [0114] wo 02067983 A [0114] wo 02097072 A [0114] wo 2005113756 A [0114] wo 02074336 A [0114] wo 0121151 A [0114] wo 0060050 A [0114] wo 0104333 A [0114] us 6649372 B [0114] wo 2006067211 A [0114] wo 0183794 A [0114] wo 9737000 A [0114] wo 03076601 A [0114] wo 2005042728 A [0114] wo 03043415 A [0114] wo 0185938 A [0114] wo 2006108846 A [0114] EP 1260581 A [0114] wo 0164846 A [0114] wo 2006071563 A [0114] wo 2005113758 A [0114] wo 2006027698 A [0114] EP 0870508 B [0114] us 5948410 A [0114] us 60732786 B [0114] wo 03023021 A [0114] wo 03023025 A [0114] 43 43 WO 9737001 US 5676976 WO 0046147 US 6355271 WO 0305139 US 5443832 US 5851670 US 4016252 WO 9833487 US 4680338 US 4988815 WO 9215582 US 4689338 US 4929624 US 5238944 US 5266575 US 5268376 US 5346905 US 5352784 US 5389640 US 5395937 US 5482936 US 5494916 US 5525612 US 6083505 US 6440992 US 6627640 US 6656938 US 6660735 US 6660747 US 6664260 US 6664264 US 6664265 US 6667312 US 6670372 US 6677347 US 6677348 US 6677349 US 6683088 US 6703402 US 6743920 US 6800624 US 6809203 US 6888000 US 6924293 WO 2 A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B 004060308 A [0114] A [0114] A [0114] B [0114] 4 A [0114] [0114] [0114] [0114] [0114] [0114] [0114] [0114] [0114] [0114] [0114] [0114] [0114] [0114] [0114] [0114] [0114] [0114] [0114] [0114] [0114] [0114] [0114] [0114] [0114] [0114] [0114] [0114] [0114] [0114] [0114] [0114] [0114] [0114] [0114] [0114] [0114] [0114] [0114] [0114] [0114] A [0114] 44 wo 2004064 759 A [0114] us 6924271 B [0114] us 2005007 0556 A [0114] us 5658731 A [0114] us 5011828 A [0114] FR 2859633 [0114] US 2005022 769 W [0114] WO 0030112 23 A [0114] US 2005021 5517 A [0114] WO 2004871 53 A [0114] US 6605617 B [0114] wo 0218383 A [0114] wo 2004018 455 A [0114] wo 03082272 A [0114] wo 2004064 715 A [0114] wo 0226757 A [0114] wo 9962923 A [0114] wo 9840100 A [0114] us 6207646 B [0114] us 6239116 B [0114] us 6429199 B [0114] wo 0195935 A [0114] wo 0303583 6 A [0114] wo 0122972 A [0114] GB 2220211 A [0114] wo 9626741 A [0114] wo 9319780 A [0114] wo 9421292 A [0114] wo 2005089 837 A [0114] us 6692468 B [0114] wo 0007647 A [0114] wo 9917820 A [0114] us 5971953 A [0114] us 4060082 A [0114] EP 0520618 A [0114] wo 9801174 A [0114] na

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Claims (7)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Uma composição imunogénica que compreende: (i) um antigénio do vírus da gripe que é um vírus inactivado e compreende vírus completos, vírus fraccionados ou antigénios de superfície purificados, ou está em forma de virossomas; (ii) um adjuvante particulado insolúvel que compreende uma micropartícuia preparada a partir de poli(lactido-co-glicolido); e (iii) um imunopotenciador que é um oligonucleótido imunoestimulante.

2. A composição da reivindicação 1, em que o antigénio do vírus da gripe é de um subtipo do vírus da gripe A Hl, H2, H3, H5, H7 ou H9.

3. A composição de qualquer reivindicação precedente, em que o antigénio do vírus da gripe se prepara a partir de um vírus da gripe cultivado em ovos.

4. A composição de qualquer uma da reivindicação 1 a 2, em que a composição está livre de albumina de ovo, ovomucóide e ADN de frango.

5. A composição de qualquer reivindicação precedente, em que a composição contém entre 0,1 e 20 pg de hemaglutinina por estirpe vírica.

6 . Um método para preparar uma composição imunogénica que compreende as etapas de combinar: (i) um antigénio do vírus da gripe que é um vírus inactivado; compreende vírus completos, vírus fraccionados ou antigénios de superfície purificados; ou está em forma de virossomas; (ii) um adjuvante particulado insolúvel que compreende uma micropartícuia preparada a partir de poli(lactido-co- 2 glicolido); e (iii) um imuno-potenciador que é um oligonucleótido imunoestimulante.

7. Um kit que compreende: (i) um primeiro componente de kit que compreende um antigénio do vírus da gripe que é um vírus inactivado; compreende vírus completos, vírus fraccionados ou antigénios de superfície purificados; ou está em forma de virossomas; e (ii) um segundo componente do kit que compreende um adjuvante particulado insolúvel que compreende uma micropartícuia preparada a partir de poli(lactido-co-glicolido), em que tanto (a) o primeiro componente como o segundo componente incluem um imuno-potenciador que é um oligonucleótido imunoestimulante, ou (b) o kit inclui um terceiro componente de kit que compreende um imuno-potenciador que é um oligonucleótido imunoestimulante.