JP2003528030A - アポトーシス誘導分子ｉｉ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＴＮＦリガンドスーパーファミリーの新規メンバーに関する。より詳細には、ヒトアポトーシス誘導分子ＩＩ（ＡＩＭ ＩＩ）をコードする単離された核酸分子を提供する。ＡＩＭ ＩＩポリペプチドもまた提供される。ＡＩＭ ＩＩを産生するための、ベクター、宿主細胞および組換え方法も同様に提供される。さらに本発明は、ＡＩＭ ＩＩ活性のアゴニストおよびアンタゴニストを同定するためのスクリーニング方法に関する。リンパ節症、異常な骨発達、自己免疫および他の免疫系疾患、対宿主性移植片病、慢性関節リウマチ、変形性関節症を処置するための治療的方法、および腫瘍細胞増殖のような新形成を阻害する方法も提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の背景） （発明の技術分野） 本発明は、ＴＮＦリガンドスーパーファミリーの新規なメンバーに関する。よ
り詳細には、ヒトアポトーシス誘導分子ＩＩ（ＡＩＭ ＩＩ）をコードする単離
された核酸分子が提供される。ＡＩＭ ＩＩポリペプチドもまた提供され、同様
に、ベクター、宿主細胞およびＡＩＭ ＩＩポリペプチドを産生するための組換
え方法が提供される。本発明はさらに、ＡＩＭ ＩＩ活性のアゴニストおよびア
ンタゴニストを同定するためのスクリーニング方法に関する。リンパ節症、自己
免疫疾患、対宿主性移植片病を処置するため、そして新形成（例えば、腫瘍細胞
増殖）を阻害するための治療方法もまた、提供される。

【０００２】 （関連分野） ヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）およびヒト腫瘍壊死因子β（ＴＮＦ−β、
またはリンホトキシン）は、インターフェロン、インターロイキン、および増殖
因子（集団的にサイトカインと呼ばれる）を含む広範なクラスのポリペプチドメ
ディエーターに関連するメンバーである（Ｂｅｕｔｌｅｒ、Ｂ．およびＣｅｒａ
ｍｉ，Ａ．、Ａｎｎｕ．Ｒｅｔ，．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７：６２５〜６５５（１
９８９））。

【０００３】 腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−β）は本来、その抗腫瘍活性の結果
として発見されたが、現在、いくつかの形質転換細胞株のアポトーシス、細胞活
性化および細胞増殖の媒介を含む多数の生物学的活性を有する多面的なサイトカ
インとして、ならびに免疫調節および炎症において重要な役割も果たすと認識さ
れる。

【０００４】 現在までに、ＴＮＦリガンドスーパーファミリーの公知のメンバーは、ＴＮＦ
−α、ＴＮＦ−β（リンホトキシンα）、ＬＴ−β、ＯＸ４０Ｌ、Ｆａｓリガン
ド、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ４０Ｌおよび４−ＩＢＢＬを含む。ＴＮＦリ
ガンドスーパーファミリーのリガンドは、細胞外ドメインにおいて約２０％（範
囲、１２％〜３６％）の配列相同性を有する、酸性のＴＮＦ様分子であり、そし
て生物学的活性型が三量体／多量体の複合体である膜結合型として主に存在する
。ＴＮＦリガンドスーパーファミリーの可溶型は、現在までに、ＴＮＦ、ＬＴα
、およびＦａｓリガンドについてのみ同定されている（一般の総説については、
Ｇｒｕｓｓ，Ｈ．およびＤｏｗｅｒ，Ｓ．Ｋ．、Ｂｌｏｏｄ、８５（１２）：３
３７８〜３４０４（１９９５）を参照のこと）（その全体において、本明細書中
で参考として援用される）。

【０００５】 これらのタンパク質は、アポトーシスまたは細胞毒性による細胞の生存または
死の制御を含む、細胞増殖、細胞活性化、および細胞分化の調節に関与する（Ａ
ｒｍｉｔａｇｅ，Ｒ．Ｊ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６；４０７
（１９９４）およびＳｍｉｔｈ，Ｃ．Ａ．、Ｃｅｌｌ ７５：９５９（１９９４
））。

【０００６】 哺乳動物の発達は、細胞の増殖および分化の両方ならびにプログラムされた細
胞死（アポトーシスを介して生じる）に依存する（Ｗａｌｋｅｒら、Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ Ａｃｈｉｅｖ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．１３：１８（１９８８））。アポ
トーシスは、自己抗原を認識する免疫胸腺細胞の破壊に重要な役割を果たす。こ
の正常な除去プロセス不全は、自己免疫疾患において役割を果たし得る（Ｇａｍ
ｍｏｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １２：１９３（１９９１））。

【０００７】 Ｉｔｏｈら（Ｃｅｌｌ ６６：２３３（１９９１））は、細胞表面抗原である
Ｆａｓ／ＣＤ９５がアポトーシスを媒介し、そしてＴ細胞のクローン除去に関与
することを記述した。Ｆａｓは、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、好中球、ならびに胸腺
、肝臓、心臓および肺、ならびに成体マウスにおいては、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞
、好中球に加えて卵巣（Ｗａｔａｎａｂｅ−Ｆｕｋｕｎａｇａら、Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏ．１４８：１２７４（１９９２））に発現される。Ｆａｓに対するモノ
クローナル抗体がＦａｓに架橋される実験において、アポトーシスが誘導される
（Ｙｏｎｅｈａｒａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９：１７４７（１９８９）；
Ｔｒａｕｔｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５：３０１（１９８９））。さらに、Ｆ
ａｓに対するモノクローナル抗体の結合が、特定の条件下でＴ細胞を刺激し得る
例が存在する（Ａｌｄｅｒｓｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：２２３１（
１９９３））。

【０００８】 Ｆａｓ抗原は、４５ｋｄの相対分子量の細胞表面タンパク質である。Ｆａｓに
ついてのヒト遺伝子およびマウス遺伝子の両方は、Ｗａｔａｎａｂｅ−Ｆｕｋｕ
ｎａｇａら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１２７４（１９９２））およびＩｔ
ｏｈら（Ｃｅｌｌ ６６：２３３（１９９１））によってクローニングされてい
る。これらの遺伝子によりコードされるタンパク質は、両方とも、神経発育因子
／腫瘍壊死因子レセプタースーパーファミリーに構造相同性を有する膜貫通タン
パク質であり、このスーパーファミリーは、２つのＴＮＦレセプター、低親和性
神経発育因子レセプターおよびＬＴβレセプターＣＤ４０、ＣＤ２７、ＣＤ３０
、およびＯＸ４０を含む。

【０００９】 最近、Ｆａｓリガンドが、記述されている（Ｓｕｄａら、Ｃｅｌｌ ７５：１
１６９（１９９３））。このアミノ酸配列は、ＦａｓリガンドがＴＮＦファミリ
ーに属するＩＩ型膜貫通タンパク質であることを示す。Ｆａｓリガンドは、脾臓
細胞および胸腺細胞に発現される。この精製したＦａｓリガンドは、４０ｋｄの
分子量を有する。

【００１０】 最近、Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド相互作用がＴ細胞の活性化に続くアポトーシス
に必要とされることが実証されている（Ｊｕら、Ｎａｔｕｒｅ ３７３：４４４
（１９９５）：Ｂｒｕｎｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３７３：４４１（１９９５）
）。Ｔ細胞の活性化は、細胞表面上の両方のタンパク質を誘導する。引き続くリ
ガンドとレセプターとの間の相互作用は、細胞のアポトーシスを生じる。これは
、正常な免疫応答の間、Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド相互作用により誘導されるアポ
トーシスについて可能性のある調節役割を支持する。

【００１１】 本発明のポリペプチドは、構造的類似性および生物学的類似性に基づいて、Ｔ
ＮＦリガンドスーパーファミリーの新規なメンバーとして同定された。

【００１２】 明らかに、正常細胞および異常細胞の活性化、および分化を調節する因子が必
要である。従って、正常細胞および疾患状態細胞の両方の活性化、および分化を
調節するこのような因子の同定および特徴付けが必要である。特に、自己免疫疾
患、対宿主性移植片病、慢性関節リウマチおよびリンパ節症の処置のためにアポ
トーシスを制御するさらなるＦａｓリガンドを単離し、そして特徴付けることが
必要である。 （発明の要旨） 本発明は、図１Ａおよび図１Ｂ（配列番号２）に示されるアミノ酸配列、また
は１９９６年８月２２日にＡＴＣＣ寄託番号９７６８９として細菌宿主中に挿入
されたｃＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列を有するＡＩＭ ＩＩ
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供す
る。本発明はまた、図１Ｃおよび図１Ｄ（配列番号４０）に示されるアミノ酸配
列、または１９９６年５月１５日にＡＴＣＣ寄託番号９７４８３として細菌宿主
中に挿入されたｃＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列を有するＡＩ
Ｍ ＩＩポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子
を提供する。

【００１３】 本発明はまた、本発明の単離された核酸分子を含む組換えベクター、およびこ
の組換えベクターを含む宿主細胞、ならびにこのようなベクターおよび宿主細胞
を作製し、そして組換え技術によりこれらをＡＩＭ ＩＩポリペプチドまたはペ
プチドの産生に使用するための方法に関する。

【００１４】 本発明はさらに、本明細書中で記載されるポリヌクレオチドによりコードされ
るアミノ酸配列を有する単離されたＡＩＭ ＩＩポリペプチドを提供する。

【００１５】 本明細書中で使用される用語「ＡＩＭ ＩＩ」ポリペプチドは、膜結合タンパ
ク質（細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞外ドメインを含む）ならび
にＡＩＭ ＩＩポリペプチド活性を保持する短縮型タンパク質を含む。１つの実
施形態において、可溶性ＡＩＭ ＩＩポリペプチドは、ＡＩＭ ＩＩタンパク質
の細胞外ドメインの全てまたは部分を含むが、細胞膜上のポリペプチドの保持を
生じる膜貫通領域を欠損する。可溶性ＡＩＭ ＩＩはまた、可溶性ＡＩＭ ＩＩ
タンパク質が分泌され得る場合、膜貫通領域の部分または細胞質ドメインの部分
あるいは他の配列を含み得る。異種シグナルペプチドは、発現された際に、可溶
性ＡＩＭ ＩＩポリペプチドが分泌されるように、可溶性ＡＩＭ ＩＩポリペプ
チドのＮ末端に融合され得る。

【００１６】 本発明はまた、リンパ節症、慢性関節リウマチ、自己免疫疾患（例えば、炎症
性自己免疫疾患、重症筋無力症）、対宿主性移植片病、ＩｇＥ媒介性アレルギー
反応、アナフィラキシー、成人呼吸促進症候群、クローン病、アレルギー性喘息
、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ病、およびグレーヴズ病の
様な苦痛を処置するために用いられ得る、ＡＩＭ ＩＩポリペプチド、特にヒト
ＡＩＭ ＩＩポリペプチドを提供する。これらのポリペプチドは、末梢の寛容を
刺激し、いくつかの形質転換細胞株を破壊し、細胞活性化および細胞増殖を媒介
するために使用され得、そして免疫調節および炎症応答の最初のメディエーター
として機能的に関連し得る。

【００１７】 本発明はさらに、インビトロで細胞に、エキソビボで細胞に、およびインビボ
で細胞に、または多細胞生物に投与するためのＡＩＭ ＩＩポリヌクレオチドま
たはＡＩＭ ＩＩポリペプチドを含む組成物を提供する。本発明のこの局面の特
定の好ましい実施形態において、この組成物は、疾患の処置のために、宿主生物
中にＡＩＭ ＩＩポリペプチドを発現させるためのＡＩＭ ＩＩポリヌクレオチ
ドを含むか、あるいはこれらからなる。このことに関して特に好まれることは、
ＡＩＭ ＩＩの異常な内因性活性と関連した機能不全の処置のためのヒト患者で
の発現である。

【００１８】 本発明はまた、ＡＩＭ ＩＩにより誘導される細胞応答を増強し得るかまたは
阻害し得る化合物を同定するためのスクリーニング方法を提供する。この方法は
、ＡＩＭ ＩＩを発現する細胞を候補化合物と接触させる工程、細胞応答をアッ
セイする工程、そして標準的な細胞応答に対してこの細胞応答を比較する工程を
含む（標準は、候補化合物の非存在下で接触がなされた場合にアッセイされる）
。それによって、標準に対して上昇した細胞応答は、この化合物がアゴニストで
あることを示し、そしてこの標準に対して減少した細胞応答は、この化合物がア
ンタゴニストであることを示す。

【００１９】 別の局面において、ＡＩＭ ＩＩアゴニストおよびアンタゴニストについての
スクリーニングアッセイが提供される。このアンタゴニストを使用し、敗血症シ
ョック、炎症、大脳マラリア、ＨＩＶウイルスの活性化、移植片−宿主拒絶反応
、骨吸収、および悪液質（るいそうまたは栄養失調）を処置、診断、および／ま
たは予後し得る。好ましい実施形態において、本発明のＡＩＭ ＩＩアンタゴニ
スト（例えば、アンチ−ＡＩＭ ＩＩ抗体）を使用して、対宿主性移植片病を、
処置、予防、診断、および／または予後し得る。

【００２０】 本発明のさらなる局面において、ＡＩＭ ＩＩを使用して、新脈管形成の増加
または内皮細胞増殖の増加を阻害して、ＲＡにおいてしばしば観察されるように
、骨および軟骨に侵入するパンヌスを確認することによって、リウマチ様動脈炎
（ＲＡ）を処置し得る。

【００２１】 本発明のさらなる局面において、ＡＩＭ ＩＩを使用して、レセプターへのリ
ガンドの結合を阻害するか、またはレセプターに結合し、そしてレセプター媒介
製細胞応答を活性化することのいずれかによって、細胞レセプター（例えば、Ｌ
Ｔ−β−Ｒ、ＴＲ２、ＣＤ２７、およびＴＲＡＮＫ）によって媒介される細胞応
答を阻害または活性化し得る。

【００２２】 本発明のさらなる局面は、身体中において上昇したレベルのＡＩＭ ＩＩ活性
を必要とする個体を処置する工程、治療的に有効量の本発明の単離されたＡＩＭ
ＩＩポリペプチドまたはそのアゴニストを包含する組成物をこのような個体に
投与する工程を包含する方法に関する。

【００２３】 本発明のなおさらなる局面は、身体中において減少したレベルのＡＩＭ ＩＩ
活性を必要とする個体を処置する工程、治療的に有効量のＡＩＭ ＩＩアンタゴ
ニストを含む組成物をこのような個体に投与する工程を包含する方法に関する。

【００２４】 （詳細な説明） 本発明は、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）（これは、ｃＤＮＡを配列決定す
ることによって決定された）に示されるアミノ酸配列を有するＡＩＭ ＩＩポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むか、または代替的にそれからなる
単離された核酸分子を提供する。本発明のＡＩＭ ＩＩタンパク質は、ヒトＴＮ
Ｆ−α（配列番号３）、ヒトＴＮＦ−β（配列番号４）、ヒトリンホトキシン（
配列番号５）、およびヒトＦａｓリガンド（配列番号６）（図２Ａ〜２Ｆ）と配
列相同性を共有する。図１Ａおよび１Ｂ（配列番号１）に示されるヌクレオチド
配列は、１９９６年８月２２日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１０８０１、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．、Ｍ
ａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０−２２０９，ＵＳＡに寄託され、受託番号９
７６８９を与えられたｃＤＮＡを配列決定することにより得られた。寄託された
ｃＤＮＡクローンは、ｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）プラスミド（Ｓｔｒａ
ｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）に含まれる。図１Ｃおよび１Ｄに示さ
れるヌクレオチド配列は、１９９６年３月１５日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ
Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１０８０１、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
Ｂｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０−２２０９，ＵＳＡに寄託
され、受託番号９７４８３を与えられたｃＤＮＡを配列決定することにより得ら
れた。

【００２５】 （核酸分子） 他に示されていない場合は、ＤＮＡ分子の配列決定により決定された本明細書
中のヌクレオチド配列の全ては、自動化されたＤＮＡ配列決定装置（例えば、Ａ
ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．からのモデル３７３）を使用し
て決定され、そして本明細書中で決定されたＤＮＡ分子によりコードされるポリ
ペプチドのアミノ酸配列全ては、上記のように決定されたようなＤＮＡ配列の翻
訳により予想された。従って、この自動化された取り組みにより決定された全て
のＤＮＡ配列について当該分野で公知のように、本明細書中で決定されたどのヌ
クレオチド配列もいくつかの誤りを含み得る。自動操作により決定されたヌクレ
オチド配列は、配列決定されたＤＮＡ分子の実際のヌクレオチド配列と、代表的
には、少なくとも約９０％同一、より代表的に少なくとも約９５％〜少なくとも
約９９．９％同一である。実際の配列は、当該分野で周知の手動によるＤＮＡ配
列決定法を含む他の取り組みによって、より正確に決定され得る。また、当該分
野で公知であるように、決定されたヌクレオチド配列における実際の配列と比較
して１つの挿入または１つの欠失は、ヌクレオチド配列の翻訳においてフレーム
シフトを引き起こし、その結果、決定されたヌクレオチド配列によりコードされ
る推定アミノ酸配列が、配列決定されたＤＮＡ分子により実際にコードされるア
ミノ酸配列と完全に異なる。このフレームシフトは、このような挿入または欠失
の点にて始まる。

【００２６】 本明細書中に提供した情報、例えば、図１Ａおよび１Ｂのヌクレオチド配列を
使用して、ＡＩＭ ＩＩポリペプチドをコードする本発明の核酸分子は、標準の
クローニングおよびスクリーニング手順（例えば、出発物質としてｍＲＮＡを使
用してｃＤＮＡをクローン化する手順）を使用して入手され得る。本発明の例示
として、図１Ａおよび１Ｂに記載される核酸分子（配列番号１）は、ヒトマクロ
ファージ ｏｘ ＬＤＬ（ＨＭＣＣＢ６４）に由来するｃＤＮＡライブラリーに
おいて発見された。同じ遺伝子はまた、活性化Ｔ細胞（ＨＴ４ＣＣ７２）由来の
ｃＤＮＡライブラリーにおいて同定された。図１Ａおよび１Ｂ（配列番号１）の
ＡＩＭ ＩＩｃＤＮＡの決定されたヌクレオチド配列は、２４０アミノ酸残基の
タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、これは、図１Ａ
および１Ｂ（配列番号１）のヌクレオチド配列の４９〜５１位の開始コドン、図
１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）のおよそ６０〜およそ２４０のアミノ残基を含む
か、または代替的にそれからなる細胞外ドメイン、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号
２）のおよそ３７位〜およそ５９位のアミノ酸を含むか、または代替的にそれか
らなる膜貫通ドメイン、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）のおよそ１位〜およそ
３６位のアミノ酸を含むか、または代替的にそれからなる細胞内ドメイン、なら
びに約２６．４ｋＤａの推定分子量を有する。図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）
に示されるＡＩＭ ＩＩタンパク質は、ヒトＦａｓリガンド（図２Ａ〜２Ｆ）の
アミノ酸配列に対して約２７％同一でありかつ約５１％類似であり、そしてヒト
ＴＮＦ−α（図２Ａ〜２Ｆ）のアミノ酸配列に対して約２６％同一でありかつ約
４７％類似である。ＴＮＦリガンド様分子はダイマーとして機能し、ＡＩＭ Ｉ
ＩがＴＮＦリガンド様分子と相同であるならば、この分子はまた、ホモダイマー
として機能するらしい。

【００２７】 当業者が理解するように、上記で議論された配列決定エラーの可能性のため、
寄託されたｃＤＮＡによりコードされる推定ＡＩＭ ＩＩポリペプチドは、約２
４０アミノ酸を含むが、２３０〜２５０アミノ酸の範囲のどこかであり得る。使
用される判断基準に依存して、ＡＩＭ ＩＩポリペプチドの細胞外ドメイン、細
胞内ドメイン、および膜貫通ドメインの関係する正確な「位置付け」は、わずか
に異なることがさらに理解される。例えば、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）に
おけるＡＩＭ ＩＩ細胞外ドメインの正確な位置は、ドメインを規定するために
使用される判断基準に依存して、わずかに変化し得る（例えば、位置（ａｄｄｒ
ｅｓｓ）は、約１〜５残基「シフト」し得る）。

【００２８】 示されるように、本発明の核酸分子は、ＲＮＡの形態（例えばｍＲＮＡ）で、
またはＤＮＡの形態（例えば、クローニングにより入手されるかまたは合成的に
生成されるｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含む）であり得る。このＤＮＡは二本
鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、センス鎖としても知
られるコード鎖であり得、またはアンチセンス鎖とも呼ばれる非コード鎖であり
得る。

【００２９】 「単離された」核酸分子によって、天然の環境から取り出された核酸分子（Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡ）が意図される。例えば、ベクター中に含まれる組換えＤＮＡ
分子は、本発明の目的のために単離されていると考えられる。単離されたＤＮＡ
分子のさらなる例は、異種の宿主細胞において維持される組換えＤＮＡ分子、ま
たは溶液中の（部分的または実質的に）精製されたＤＮＡ分子を含む。単離され
たＲＮＡ分子は、本発明のＤＮＡ分子のインビボまたはインビトロでのＲＮＡ転
写物を含む。本発明に従う単離された核酸分子は、合成的に生成されたような分
子をさらに含む。

【００３０】 しかし、ライブラリーの他のメンバーから単離されていない（例えば、クロー
ンおよびライブラリーの他のメンバーを含む均質な溶液の形態で）、ライブラリ
ー（例えば、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリー）のメンバーであ
るクローンに含まれる核酸、あるいは、細胞または細胞溶解物から単離もしくは
除去されていない染色体（例えば、核型におけるような「染色体スプレッド」（
ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｓｐｒｅａｄ））は、本発明の目的のために「単離され
て」いない。本明細書中でさらに議論されるように、本発明に従って単離された
核酸は、天然に、組換え的に、または合成的に産生され得る。

【００３１】 本発明の単離された核酸分子は、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号１）または図１
Ｃおよび１Ｄ（配列番号３８）に示される読み取り枠（ＯＲＦ）を含むか、また
は代替的にそれからなるＤＮＡ分子を含む；ＤＮＡ分子は、図１Ａおよび１Ｂ（
配列番号２）または図１Ｃおよび１Ｄ（配列番号３９）に示されるＡＩＭ ＩＩ
タンパク質についてのコード配列を含むか、または代替的にそれからなり；そし
て上記の配列と実質的に異なる配列を含むか、または代替的にそれからなるＤＮ
Ａ分子は、しかし、遺伝コードの縮重に起因して、ＡＩＭ ＩＩタンパク質をな
おコードする。もちろん、遺伝コードは、当該分野において周知である。従って
、当業者にとって、このような縮重改変体を産生することは日常的である。

【００３２】 本発明に従う核酸分子は、Ｎ末端メチオニンを欠く全長ＡＩＭポリペプチドを
コードする核酸分子をさらに含む。

【００３３】 さらに、本発明は、配列番号１の一部に関連するヌクレオチド配列を有する核
酸分子を提供する。これは、以下の関連するｃＤＮＡから決定された：ＨＴ４Ｃ
Ｃ７２Ｒ（配列番号２０）。

【００３４】 別の局面において、本発明は、１９９６年８月２２日に寄託されたＡＴＣＣ受
託番号９７６８９として寄託されたプラスミド中に含まれるｃＤＮＡによって、
または１９９６年３月１５日に寄託されたＡＴＣＣ受託番号９７４８３として寄
託されたプラスミド中に含まれるｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を
有するＡＩＭ ＩＩポリペプチドをコードする、単離された核酸分子を提供する
。好ましくは、この核酸分子は、上記の寄託されたｃＤＮＡの１つによってコー
ドされるポリペプチドをコードする。本発明はさらに、図１Ａおよび１Ｂ（配列
番号１）または図１Ｃおよび１Ｄ（配列番号３８）に示されるヌクレオチド配列
を有する単離された核酸分子、または上記の寄託されたプラスミド中に含まれる
ＡＩＭ ＩＩ ｃＤＮＡの１つのヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子
、あるいは上記の配列のうちの１つと相補的な配列を有する核酸分子を提供する
。そのような単離された分子（特にＤＮＡ分子）は、例えば、染色体を用いたイ
ンサイチュハイブリダイゼーションによる遺伝子地図作成のためのプローブとし
て、そしてヒト組織中のＡＩＭ ＩＩ遺伝子の発現を検出（例えば、ノーザンブ
ロット解析による）するためのプローブとして有用である。

【００３５】 本発明のさらなる実施形態は、以下のヌクレオチド配列に対して、少なくとも
８０％同一、そしてより好ましくは、少なくとも８５％、９０％、９２％、９５
％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を有す
るポリヌクレオチドを含むか、あるいはこのポリヌクレオチドからなる、単離さ
れた核酸分子を含む：（ａ）図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）または図１Ｃおよ
び１Ｄ（配列番号３９）における完全アミノ酸配列を有するＡＩＭ ＩＩポリペ
プチドをコードするヌクレオチド配列；（ｂ）図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）
におけるアミノ酸配列を有するＡＩＭ ＩＩポリペプチドをコードするが、Ｎ末
端メチオニンを欠くヌクレオチド配列；（ｃ）ＡＴＣＣ受託番号９７６８９また
はＡＴＣＣ受託番号９７４８３に含まれるｃＤＮＡによってコードされる完全ア
ミノ酸配列を有するＡＩＭ ＩＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｄ）ＡＩＭ ＩＩポリペプチド細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列
；（ｅ）ＡＩＭ ＩＩポリペプチド膜貫通ドメインをコードするヌクレオチド配
列；（ｆ）ＡＩＭ ＩＩポリペプチド細胞内ドメインをコードするヌクレオチド
配列；（ｇ）細胞外ドメインおよび細胞内ドメインを有するが膜貫通ドメインを
欠く可溶性ＡＩＭ ＩＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；ならびに
（ｈ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、または（ｇ）
におけるヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。

【００３６】 本発明のさらなる実施形態は、以下のヌクレオチド配列に対して、少なくとも
８０％同一、そしてより好ましくは、少なくとも８５％、９０％、９２％、９５
％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を有す
るポリヌクレオチドを含むか、あるいはこのポリヌクレオチドからなる、単離さ
れた核酸分子を含む：（ａ）図１Ｃおよび１Ｄ（配列番号３９）におけるアミノ
酸約１〜約２０８の配列を有するＡＩＭ ＩＩポリペプチドをコードするヌクレ
オチド配列；（ｂ）図１Ｃおよび１Ｄ（配列番号３９）におけるアミノ酸約７〜
約２０８の配列を有するＡＩＭ ＩＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配
列；（ｃ）図１Ｃおよび１Ｄ（配列番号３９）におけるアミノ酸約３４〜約２０
８の配列を有するＡＩＭ ＩＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；な
らびに（ｄ）上記の（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）におけるヌクレオチド配列の
いずれかに相補的なヌクレオチド配列。

【００３７】 実際問題として、任意の特定の核酸分子が、例えば、図１Ａおよび１Ｂ（配列
番号１）または図１Ｃおよび１Ｄ（配列番号３８）に示されるヌクレオチド配列
に対して、あるいは寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列に対して少なくとも
８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９
９％同一であるか否かは、公知のコンピュータープログラム（例えば、Ｂｅｓｔ
ｆｉｔ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙ
ｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標）
，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉ
ｓｏｎ，ＷＩ５３７１１）を使用して従来どおり決定され得る。Ｂｅｓｔｆｉｔ
は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉ
ｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２−４８９（１９８１）の局所的相同
性アルゴリズムを用いて、２つの配列間の最も良好な相同性のセグメントを見出
す。Ｂｅｓｔｆｉｔまたは任意の他の配列整列プログラムを用いて、特定の配列
が、本発明に従う参照配列に対して、例えば、９５％同一であるか否かを決定す
る場合は、当然のことながら、同一性のパーセントが参照ヌクレオチド配列の全
長にわたり計算され、そして参照配列におけるヌクレオチド数全体の５％までの
相同性におけるギャップが許容されるように、パラメーターが設定される。

【００３８】 本発明の参照ヌクレオチド配列に、例えば、少なくとも９５％「同一」である
ヌクレオチド配列を有する核酸とは、そのポリヌクレオチド配列がＡＩＭ ＩＩ
ポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチドあたり
５つまでの点変異を含み得ることを除いて、そのポリヌクレオチドのヌクレオチ
ド配列が、参照配列に対して同一であることを意図する。換言すれば、参照ヌク
レオチド配列に対して少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌ
クレオチドを得るために、その参照配列中のヌクレオチドの５％までが、欠失さ
れ得るか、または別のヌクレオチドで置換され得るか、あるいは、その参照配列
の総ヌクレオチドの５％までの数のヌクレオチドが、その参照配列に挿入され得
る。参照配列のこれらの変異は、参照配列中のヌクレオチド間で個々に、または
参照配列中で１以上の連続する群中でのいずれかで散在して、参照ヌクレオチド
配列の５’末端位置または３’末端位置で生じ得るか、またはこれらの末端位置
の間のどこかで生じ得る。問い合わせ配列は、図１Ａおよび１Ｂまたは図１Ｃお
よび１Ｄにおいて示される全体配列、ＯＲＦ（読み取り枠）、または本明細書中
で記載されるような特定の任意のフラグメントであり得る。

【００３９】 実際問題として、任意の特定の核酸分子またはポリぺプチドが、本発明のヌク
レオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９
６％、９７％、９８％、または９９％同一であるか否かは、公知のコンピュータ
ープログラムを使用して従来的に決定され得る。問い合わせ配列（本発明の配列
）と対象配列との間の最も良好な全体的な適合性（全体的な配列整列としてもま
た参照される）を決定するための好ましい方法は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ
．Ａｐｐ． Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０））のアルゴリズム
に基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して決定され得る。配列
整列において、問い合わせ配列および対象配列は、両方ともにＤＮＡ配列である
。ＲＮＡ配列は、ＵからＴに変換することによって比較され得る。この全体的な
配列整列の結果は、同一性パーセント（％）で示される。同一性パーセントを算
定するためにＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢ整列において使用される好ましいパラメ
ーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝Ｕｎｉｔａｒｙ、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝４、Ｍｉｓｍａｔ
ｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝３０、Ｒａｎｄ
ｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒ
ｅ＝１、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ ０
．０５、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００または対象ヌクレオチド配列の長さ（
どちらかより短い方）である。

【００４０】 対象配列が、５’または３’欠失のために（内部欠失のためではなく）問い合
わせ配列より短い場合、手動の補正が結果に対してなされなけらばならない。こ
れは、同一性パーセントを計算する場合に、ＦＡＳＴＤＢプログラムが対象配列
の５’および３’切断を考慮しないからである。５’末端または３’末端で切断
される対象配列について、問い合わせ配列に対して、同一性パーセントは、問い
合わせ配列の総塩基のパーセントとして一致／整列されない対象配列の５’およ
び３’である問い合わせ配列の塩基の数を計算することによって補正される。ヌ
クレオチドが一致／整列されるか否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果によって
決定される。次いで、このパーセントは、同一性パーセントから差し引かれ、特
定のパラメーターを用いて上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって算定され、最
終的な同一性パーセントのスコアに到達する。この補正されたスコアが、本発明
の目的に使用されるものである。ＦＡＳＴＤＢ整列によって示されるように、問
い合わせ配列と一致／整列されない、対象配列の５’および３’塩基の外側の塩
基のみが、同一性パーセントのスコアを手動で調整する目的で算定される。

【００４１】 例えば、９０塩基の対象配列は、同一性パーセントを決定するために１００塩
基の問い合わせ配列に整列される。欠失は、対象配列の５’末端で生じ、従って
、ＦＡＳＴＤＢ整列は、５’末端の最初の１０塩基で一致／整列を示さない。１
０個の不対合塩基は、配列の１０％（一致していない５’および３’末端での塩
基の数／問い合わせ配列の塩基の総数）を表し、そのため１０％は、ＦＡＳＴＤ
Ｂプログラムによって算定される同一性パーセントのスコアから差し引かれる。
残りの９０塩基が完全に一致する場合は、最終的な同一性パーセントは９０％で
ある。別の例では、９０塩基の対象配列が、１００塩基の問い合わせ配列と比較
される。この場合、欠失は、内部欠失であり、その結果、問い合わせと一致／整
列しない対象配列の５’または３’に塩基が存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤ
Ｂによって算定される同一性パーセントは手動で補正されない。再び、問い合わ
せ配列と一致／整列しない対象配列の５’または３’の塩基のみが手動で補正さ
れる。他の手動の補正は、本発明の目的のためにはなされない。

【００４２】 本願は、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号１）、または図１Ｃおよび１Ｄ（配列番
号３８）に示される核酸配列に対して、あるいは寄託されたｃＤＮＡの核酸配列
に対して、それらがそれぞれＡＩＭ ＩＩ活性を有するポリペプチドをコードす
るか否かに関係なく、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９
６％、９７％、９８％、または９９％同一である核酸分子に関する。なぜならば
、これは、特定の核酸分子がＡＩＭ ＩＩ活性を有するポリペプチドをコードし
ない場合ですら、当業者はどのようにこの核酸分子を使用するか（例えば、ハイ
ブリダイゼーションプローブとしてまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プラ
イマーとして）をなお知っているからである。ＡＩＭ ＩＩ活性を有するポリペ
プチドをコードしない本発明の核酸分子の使用としては、特に、（１）ｃＤＮＡ
ライブラリー中のＡＩＭ ＩＩ遺伝子またはその対立遺伝子改変体を単離するこ
と；（２）Ｖｅｒｍａら、Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ Ｍａｎｕ
ａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓ
ｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）に記載されるような、ＡＩＭ ＩＩ遺伝子の
正確な染色体位置を提供するための、分裂中期染色体スプレッド（ｍｅｔａｐｈ
ａｓｅ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｓｐｒｅａｄ）に対するインサイチュハイブ
リダイゼーション（例えば、ＦＩＳＨ）；および（３）特定の組織におけるＡＩ
Ｍ ＩＩ ｍＲＮＡ発現を検出するためのノーザンブロット分析が挙げられる。

【００４３】 しかし、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号１）、また図１Ｃおよび１Ｄ（配列番号
３８）に示される核酸配列に対して、または寄託されたｃＤＮＡの１つの核酸配
列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９
７％、９８％、または９９％同一である配列を有する核酸分子が好ましく、これ
は、実際に、ＡＩＭ ＩＩのタンパク質活性を有するポリペプチドをコードする
。「ＡＩＭ ＩＩ活性を有するポリペプチド」によって、特定の生物学的アッセ
イにおいて測定されるように、本発明のＡＩＭ ＩＩタンパク質の活性に対して
、類似しているが必ずしも同一ではない活性を示すポリペプチドが意図される。
例えば、ＡＩＭ ＩＩタンパク質細胞傷害性活性は、Ｚａｒｒｅｓら、Ｃｅｌｌ
７０：３１−４６（１９９２）によって記載されるように、ヨウ化プロピジウ
ム染色を用いて測定し、アポトーシスを実証し得る。あるいは、アポトーシスを
誘導するＡＩＭ ＩＩはまた、Ｇａｖｉｅｒｌｉら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．
１１９：４９３−５０１（１９９２）によって記載されるように、ＴＵＮＥＬ染
色を用いて測定され得る。これらのポリヌクレオチドによってコードされるポリ
ペプチドもまた、本発明の範囲に含まれる。

【００４４】 手短に言えば、ヨウ化プロピジウム染色を、以下のように実行する。組織また
は培養物のいずれかからの細胞を、ホルムアルデヒド中で固定し、凍結切片に切
り出し、そしてヨウ化プロピジウムで染色する。細胞核を、共焦点蛍光顕微鏡を
使用して、ヨウ化プロピジウムによって可視化する。細胞死は、核濃縮症の核（
染色体の集塊、縮小、および／または核の断片化）によって示される。

【００４５】 もちろん、遺伝暗号の縮重のために、当業者は、寄託されたｃＤＮＡの１つの
核酸配列に対して、あるいは図１Ａ〜および１Ｂ（配列番号１）、または図１Ｃ
および１Ｄ（配列番号３８）に示される核酸配列に対して、少なくとも８０％、
８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一
である配列を有する多くの核酸分子が、「ＡＩＭＩＩタンパク質活性を有する」
ポリペプチドをコードすることを、ただちに認識する。実際、これらのヌクレオ
チド配列の縮重改変体は、すべて同じポリペプチドをコードするため、このこと
は、上記の比較アッセイを行わなくても当業者には明らかである。当該分野にお
いては、適切な数もまた、ＡＩＭ ＩＩタンパク質活性を有するポリペプチドを
コードすることが、このような縮重改変体ではない核酸分子についてさらに認識
される。なぜなら、これは、当業者が、十分に、さらに下記の通り、タンパク質
の機能に有意に影響する可能性が低いようであるか、または影響しないようであ
るかのいずれかであるアミノ酸の置換（例えば、ある脂肪族アミノ酸を第二の脂
肪族アミノ酸と置換すること）に気づいているからである。

【００４６】 例えば、表現型的にサイレントなアミノ酸置換を作製する方法に関する指針は
、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら、「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇ
ｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ
Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４
７：１３０６−１３１０（１９９０）において提供され、ここで、著者らは、タ
ンパク質が、驚くべきほどアミノ酸置換に寛容性であることを指摘する。

【００４７】 本発明の好ましいポリペプチドおよびポリヌクレオチドフラグメントは、ＡＩ
Ｍ ＩＩ機能的活性を示すポリペプチドをコードする。ＡＩＭ ＩＩ「機能的活
性」を示すポリペプチドとは、全長ポリペプチドおよび／または分泌ＡＩＭ Ｉ
Ｉポリペプチドと関連した１つ以上の公知の機能的活性を示し得るポリペプチド
を意味する。これらの機能的活性としては、以下が、挙げられるが、これらに限
定されない：生物学的活性、抗原性、抗ＡＩＭ ＩＩ抗体と結合する能力（また
は、結合のためにポリペプチドと競合する能力）、免疫原性（ポリペプチドと結
合する抗体を産生する能力）、本発明のポリペプチドと多量体を形成する能力、
ならびにポリペプチドがレセプターまたはリガンドと結合する能力（例えば、Ｔ
Ｒ２（国際公開ＷＯ９６／３４０９５）、ＬＴ−βレセプター、ＴＲ６（国際公
開ＷＯ９８／３０６９４）、およびＣＤ２７）。

【００４８】 ＡＩＭ ＩＩポリペプチド、ならびにそれらのフラグメント、改変体、誘導体
、およびアナログの機能的活性は、種々の方法によってアッセイされ得る。

【００４９】 例えば、抗ＡＩＭ ＩＩ抗体への結合について本発明の全長ポリペプチドに結
合するか、またはそれと競合する能力についてアッセイする、１つの実施形態で
は、当該分野で公知の種々の免疫アッセイが、用いられ得る。このようなアッセ
イとしては、放射免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「
サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫放射分析アッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫
拡散アッセイ、インサイチュ免疫アッセイ（例えば、コロイド金、酵素または放
射性同位体標識を用いる）、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例
えば、ゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ）、補体結合アッセイ、免疫蛍光ア
ッセイ、プロテインＡアッセイ、および免疫電気泳動アッセイなどのような技術
を用いる競合および非競合アッセイ系が挙げられるが、これらに限定されない。
１つの実施形態では、抗体結合が、一次抗体上の標識を検出することによって検
出される。別の実施形態では、この一次抗体は、この一次抗体に対する二次抗体
または試薬の結合を検出することによって検出される。さらなる実施形態では、
この二次抗体が標識される。多くの手段が、免疫アッセイにおける結合の検出に
ついて当該分野で公知であり、そして本発明の範囲内である。

【００５０】 別の実施形態では、同定されたリガンド（例えば、ＤＲ５（国際公開ＷＯ９８
／４１６２９を参照のこと）、ＴＲ１０（国際公開ＷＯ９８／５４２０２を参照
のこと）、３１２Ｃ２（国際公開ＷＯ９８／０６８４２を参照のこと）、ならび
にＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およびＴＲ１１ＳＶ２（米国特許出願０９／１７
６，２００を参照のこと））、または本発明のポリペプチドフラグメント、改変
体、または誘導体が多量体化する能力が評価される場合、結合が、例えば、還元
および非還元ゲルクロマトグラフィー、タンパク質アフィニティークロマトグラ
フィー、ならびにアフィニティーブロッティングのような当該分野で周知の手段
によって、アッセイされ得る。一般には、Ｐｈｉｚｉｃｋｙ、Ｅ．ら、１９９５
、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５９：９４−１２３を参照のこと。別の実施形
態では、その基質への結合の生理学的相関（シグナル伝達）がアッセイされ得る
。

【００５１】 他の方法は、当業者に公知であり、そして本発明の範囲内である。

【００５２】 本発明はさらに、本明細書中に記載される単離された核酸分子のフラグメント
を含むポリヌクレオチドに関する。寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列、ま
たは図１Ａおよび１Ｂに示されるヌクレオチド配列（配列番号１）または図１Ｃ
および１Ｄに示されるヌクレオチド配列（配列番号３８）を有する単離された核
酸分子のフラグメントとは、本明細書中で議論されるように、診断的なプローブ
およびプライマーとして有用である、少なくとも約１５ｎｔ、およびより好まし
くは、少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは、少なくとも３０ｎｔ、そ
してなおさらにより好ましくは少なくとも４０ｎｔの長さのフラグメントをいう
。この文脈において「約（おおよそ）」は、特に記載された値、あるいはそれよ
り数個（５、４、３、２、または１）のヌクレオチドだけ大きいかまたは小さな
値を含む。当然、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２
５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５
０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７
５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９０
０、９２５、９５０、９７５、１０００、１０２５、１０５０、１０７５、１１
００、１１２５、または１１５０ｎｔの長さのより長いフラグメントもまた、寄
託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列、または図１ＡおよびＢに示されるヌクレ
オチド配列（配列番号１）もしくは図１Ｃおよび１Ｄに示されるヌクレオチド配
列（配列番号３８）のほとんどに（全てではないが）対応するフラグメントとし
て本発明に従って有用である。少なくとも２０ｎｔの長さのフラグメントとは、
例えば、寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列、または図１ＡおよびＢに示さ
れるヌクレオチド配列（配列番号１）もしくは図１Ｃおよび１Ｄに示されるヌク
レオチド配列（配列番号３８）からの２０以上の連続した塩基を含むフラグメン
トをいう。

【００５３】 本発明は、さらに、ＡＩＭ ＩＩドメインのサブポーション（ｓｕｂｐｏｒｔ
ｉｏｎ）をコードする単離された核酸分子のフラグメントを含むポリヌクレオチ
ドに指向される。特に、本発明は、以下の配列番号１のヌクレオチドかななる群
から選択されるメンバーのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する
：４９〜１０８、５９〜１１８、６９〜１２８、７９〜１３８、８９〜１４８、
９９〜１５６、１０９〜１５８、１０９〜１６８、１１９〜１７８、１２９〜１
８８、１３９〜１９８、１４９〜２０８、１５７〜２１６、１５７〜２２５、１
６８〜２２７、１７８〜２３７、１８８〜２４７、１９８〜２５７、２０８〜２
６７、２１８〜２７７、２２６〜２８５、２３６〜２９５、２４６〜３０５、２
５６〜３１５、２６６〜３２５、２７６〜３３５、２８６〜３４５、２９６〜３
５５、３０６〜３６５、３１６〜３７５、３２６〜３８５、３３６〜３９５、３
４６〜４０５、３５６〜４１５、３６６〜４２５、３７６〜４３５、３８６〜４
４５、３９６〜４５５、４０９〜４６９、４５６〜５１５、４７６〜５３６、４
９６〜５５６、５１６〜５７５、５３６〜５９５、５７６〜６３５、５９６〜６
５５、６３６〜６９５、６５６〜７１５、６９６から７５５、７０６〜７６５お
よび７１６から７６８． 本発明はさらに、ＡＩＭ ＩＩのドメインをコードする単離された核酸分子を
含むポリヌクレオチドに指向される。１局面において、本発明は、表２に記載さ
れるＡＩＭ ＩＩのβシート領域をコードする核酸分子を含むポリヌクレオチド
を提供する。このようなポリヌクレオチドの代表的な例は、配列番号２の以下の
アミノ酸残基からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコ
ードする核酸分子を含む：約７〜約１４のアミノ酸残基、約１８〜約２３のアミ
ノ酸残基、約１７〜約２５のアミノ酸残基、約３３〜約４６ののアミノ酸残基、
約３５〜約３９のアミノ酸残基、約５７〜約６０のアミノ酸残基、約６７〜約７
２のアミノ酸残基、約１０２〜約１０７のアミノ酸残基、約１２１〜約１２６の
アミノ酸残基、約１３１〜約１６６のアミノ酸残基、約１４１〜約１５２のアミ
ノ酸残基、約１５８〜約１６９のアミノ酸残基、約２１３〜約２２１のアミノ酸
残基、約２３２〜約２４０のアミノ酸残基。本発明はさらに、配列番号２の以下
のアミノ酸残基からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペ
プチドに指向される：約７〜約１４のアミノ酸残基、約１８〜約２３のアミノ酸
残基、約１７〜約２５のアミノ酸残基、約３３〜約４６ののアミノ酸残基、約３
５〜約３９のアミノ酸残基、約５７〜約６０のアミノ酸残基、約６７〜約７２の
アミノ酸残基、約１０２〜約１０７のアミノ酸残基、約１２１〜約１２６のアミ
ノ酸残基、約１３１〜約１６６のアミノ酸残基、約１４１〜約１５２のアミノ酸
残基、約１５８〜約１６９のアミノ酸残基、約２１３〜約２２１のアミノ酸残基
、約２３２〜約２４０のアミノ酸残基。この文脈において「約（おおよそ）」は
、特に記載された値、あるいはそれより数個（５、４、３、２、または１）のヌ
クレオチドだけ大きいかまたは小さな値を含む。

【００５４】 本発明の核酸フラグメントは、ＡＩＭ ＩＩタンパク質のβシート領域をコー
ドする核酸分子、ならびにＡＩＭ ＩＩタンパク質のβシート領域をコードする
核酸分子と、少なくとも８０％同一、そしてより好ましくは、少なくとも８５％
、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一の核酸配
列を有するポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を含む。βシート領域と
少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％
、または９９％同一のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、同様に、こ
れらのポリヌクレオチドによって、コードされるポリペプチドもまた、本発明の
範囲内である。

【００５５】 本発明はまた、配列番号２の以下のアミノ酸残基からなる群から選択されるア
ミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする単離された核酸分子を含むポリヌ
クレオチドに指向される：約９４〜約１００のアミノ酸残基、約１２１〜約１２
４のアミノ酸残基、約１２７〜約１３５のアミノ酸残基、約１３９〜約１４９の
アミノ酸残基、約１６０〜約１６８のアミノ酸残基、約１７５〜約１８５のアミ
ノ酸残基、約１９７〜２０９のアミノ酸残基、約２１３〜約２２０のアミノ酸残
基、および約２３２〜約２４０のアミノ酸残基。本発明はさらに、配列番号２の
以下のアミノ酸残基からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポ
リペプチドに指向される：約９４〜約１００のアミノ酸残基、約１２１〜約１２
４のアミノ酸残基、約１２７〜約１３５のアミノ酸残基、約１３９〜約１４９の
アミノ酸残基、約１６０〜約１６８のアミノ酸残基、約１７５〜約１８５のアミ
ノ酸残基、約１９７〜２０９のアミノ酸残基、約２１３〜約２２０のアミノ酸残
基、および約２３２〜約２４０のアミノ酸残基。この文脈において「約（おおよ
そ）」は、特に記載された値、あるいはそれより数個（５、４、３、２、または
１）のヌクレオチドだけ大きいかまたは小さな値を含む。

【００５６】 本発明の好ましい核酸フラグメントは、ＡＩＭ ＩＩタンパク質のエピトープ
含有部分をコードする核酸分子を含む。特に、本発明のこのような核酸フラグメ
ントは、以下をコードする核酸分子を含む：図１および１Ｂ（配列番号２）の約
１３〜約２０のアミノ酸残基から選択される１、２、３、４、５以上のアミノ酸
配列を含むポリペプチド；図１（配列番号２）の約２３〜約３６のアミノ酸残基
を含むポリペプチド；図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）の約６９〜約７９のアミ
ノ酸残基を含むポリペプチド；図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）の約８５〜約９
４のアミノ酸残基を含むポリペプチド；図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）の約１
６７〜約１７８のアミノ酸残基を含むポリペプチド；図１Ａおよび１Ｂ（配列番
号２）の約１８４〜約１９６のアミノ酸残基を含むポリペプチド；ならびに図１
Ａおよび１Ｂ（配列番号２）の約２２１〜約２３３のアミノ酸残基を含むポリペ
プチド。この文脈において「約（おおよそ）」は、特に記載された値、あるいは
それより数個（５、４、３、２、または１）のヌクレオチドだけ大きいかまたは
小さな値を含む。本発明者らは、上記のポリペプチドフラグメントがＡＩＭ Ｉ
Ｉタンパク質の抗原領域であることを決定した。他のこのようなＡＩＭ ＩＩタ
ンパク質のエピトープ含有部分を決定するための方法は、以下に記載される。こ
れらのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドはまた、本発明に含
まれる。

【００５７】 以下により詳細に記載されるように、ＡＩＭ ＩＩポリヌクレオチドは、本発
明に従って、様々な適用（特に、ＡＩＭ ＩＩの化学特性および生物学的特性を
使用する適用）に使用され得る。とりわけ、これらの適用は、自己免疫疾患、免
疫欠損および異常細胞増殖である。さらなる適用は、細胞、組織および器官の障
害の診断および処置に関する。

【００５８】 別の局面において、本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条
件下で、上記に記載の本発明の核酸分子（例えば、本明細書に記載されるポリヌ
クレオチドフラグメントの補体、あるいはＡＴＣＣ受諾番号第９７６８９号また
はＡＴＣＣ受諾番号第９７４８３号に含まれるｃＤＮＡプラスミド）におけるポ
リヌクレオチドの一部分にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む単離され
た核酸分子を提供する。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」と
は、以下を含む溶液中で、４２℃で終夜インキュベートし、次いで、約６５℃で
０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄することを意図する：５０％ホルムアミド
、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭ クエン酸三ナトリウム）、５
０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％デキスト
ラン硫酸、および２０ｇ／ｍｌ 変性、剪断サケ精子ＤＮＡ。

【００５９】 ポリヌクレオチドの「一部分」にハイブリダイズするポリヌクレオチドとは、
参照ポリヌクレオチドの少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、およびより好
ましくは、少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは、少なくとも３０ｎｔ
、そして、なおさらにより好ましくは約３０〜７０ｎｔにハイブリダイズするポ
リヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）を意図する。この文脈におい
て「約（おおよそ）」は、特に記載された値、あるいはそれより数個（５、４、
３、２、または１）のヌクレオチドだけ大きいかまたは小さな値を含む。これら
は、上記で議論し、そしてさらに以下で詳細に議論されるように、診断上のプロ
ーブおよび診断上のプライマーとして有用である。

【００６０】 「少なくとも２０ｎｔの長さ」のポリヌクレオチドの一部分とは、例えば、参
照ポリヌクレオチド（例えば、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号１）または図１Ｃお
よび１Ｄ（配列番号３８）に示されるような寄託されたｃＤＮＡまたは核酸配列
の１つ）のヌクレオチド配列からの２０以上の連続したヌクレオチドを意図する
。

【００６１】 当然、ポリＡ配列のみにハイブリダイズするポリヌクレオチド（例えば、図１
Ａおよび１Ｂ（配列番号１）もしくは図１Ｃおよび１Ｄ（配列番号３８）に示さ
れるＡＩＭ ＩＩ ｃＤＮＡの３’末端ポリ（Ａ）領域）、またはＴ（もしくは
Ｕ）残基の相補的なストレッチにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、本発
明の核酸の一部分にハイブリダイズするために使用される本発明のポリヌクレオ
チドに含まれない。なぜなら、このようなポリヌクレオチドは、ポリ（Ａ）スト
レッチを含む任意の核酸分子、またはその相補体にハイブリダイズするからであ
る（例えば、特に、オリゴｄＴ感作ｃＤＮＡライブラリから産生された、任意の
二重鎖ｃＤＮＡ）。

【００６２】 示されるように、ＡＩＭ ＩＩポリペプチドをコードする本発明の核酸分子は
、以下を含み得るが、これらに限定されない：単独でポリペプチドのアミノ酸配
列をコードする核酸分子；このポリペプチドのコード配列およびさらなる配列（
例えば、プレタンパク質配列またはプロタンパク質配列またはプレプロタンパク
質配列のような、リーダー配列もしくは分泌配列をコードする配列）；さらなる
非コード配列を伴う、上記のさらなるコード配列を含むかまたは含まない、この
ポリペプチドのコード配列（さらなる非コード配列は、例えば、イントロンおよ
び非コード５’配列および３’配列（例えば、スプライシングおよびポリアデニ
ル化シグナルを含む、転写、ｍＲＮＡプロセシングにおいて役割（例えば、リボ
ソーム結合およびｍＲＮＡの安定性）を担う、転写される非翻訳配列を含むが、
これらに限定されない））；さらなる機能性を提供するようなさらなるアミノ酸
をコードするさらなるコード配列。従って、このポリペプチドをコードする配列
は、融合されたポリペプチドの精製を容易にするペプチドをコードする配列のよ
うな、マーカー配列と融合され得る。本発明のこの局面の特定の好ましい実施態
様において、マーカーアミノ酸配列は、とりわけ、ｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅ
ｎ，Ｉｎｃ．）中に提供されるタグのような、ヘキサヒスチジンペプチドである
。これらの多くは市販されている。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１−８２４（１９８９）において記載
されるように、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。
「ＨＡ」タグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対
応する、精製のために有用な別のペプチドであり、それは、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃ
ｅｌｌ ３７：７６７（１９８４）によって記載されている。以下で考察される
ように、他のそのような融合タンパク質は、Ｎ末端またはＣ末端にてＦｃに融合
されたＡＩＭ ＩＩを含む。

【００６３】 本発明は、さらに、ＡＩＭ ＩＩのタンパク質の部分、アナログ、または誘導
体をコードする、本発明の核酸分子の改変体に関する。天然の対立遺伝子改変体
のような改変体は、天然に生じ得る。「対立遺伝子改変体」によって、生物の染
色体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの代わりの形態のうちの１つ
が意図される。Ｇｅｎｅｓ ＩＩ，Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ
＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８５）。

【００６４】 天然に存在しない改変体は、当該分野で公知の変異誘発技術を使用して産生さ
れ得、この技術としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：オリゴ
ヌクレオチド媒介変異誘発、アラニンスキャニング、ＰＣＲ変異誘発、部位特異
的変異誘発（例えば、Ｃａｒｔｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：
４３３１（１９８６）；およびＺｏｌｌｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
．１０：６４８７（１９８２）を参照のこと）、カセット変異誘発（例えば、Ｗ
ｅｌｌｓら、Ｇｅｎｅ ３４：３１５（１９８５）を参照のこと）、制限選択変
異誘発（例えば、Ｗｅｌｌｓら、Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏ
ｎｄｏｎ Ｓｅｒ．Ａ ３１７：４１５（１９８６）を参照のこと）。

【００６５】 このような改変体には、ヌクレオチドの置換、欠失、または付加により産生さ
れる改変体が含まれる。この置換、欠失、または付加には１つ以上のヌクレオチ
ドが含まれ得る。改変体は、コード領域、非コード領域、または両方において変
更され得る。コード領域における変更は、保存的または非保存的アミノ酸の置換
、欠失、または付加を生じ得る。これらの間で特に好ましいのは、サイレントな
置換、付加、および欠失であり、これらはＡＩＭ ＩＩタンパク質、またはそれ
らの部分の特性および活性を変化させない。このことについてまた特に好ましい
のは、保存的置換である。

【００６６】 （ベクターおよび宿主細胞） 本発明はまた、本発明の単離されたＤＮＡ分子を含むベクター、組換えベクタ
ーで遺伝子操作された宿主細胞、および組換え技術によるＡＩＭ ＩＩポリペプ
チドまたはそのフラグメントの産生に関する。

【００６７】 ポリヌクレオチドは、宿主における増殖のために、選択マーカーを含むベクタ
ーに結合され得る。一般的に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈澱物
のような沈澱物中か、または荷電した脂質との複合体中で導入される。ベクター
がウイルスである場合、ベクターは、適切なパッケージング細胞株を用いてイン
ビトロでパッケージングされ得、次いで宿主細胞に形質導入され得る。

【００６８】 ＤＮＡインサートは、適切なプロモーター（少数の例を挙げれば、例えば、λ
ファージのＰＬプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉのｌａｃ、ｔｒｐ、およびｔａｃプ
ロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、ならびにレトロウイルスＬ
ＴＲのプロモーター）に、作動可能に連結されるべきである。他の適切なプロモ
ーターは、当業者に公知である。発現構築物は、転写開始、終始に関する部位、
および転写された領域中に、翻訳のためのリボソーム結合部位をさらに含む。こ
の構築物により発現された成熟転写産物のコード部分は、好ましくは、翻訳され
るポリペプチドの先頭で開始する翻訳および翻訳されるポリペプチドの末端に適
切に配置された終止コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡ、またはＵＡＧ）を含む。

【００６９】 示されるように、発現ベクターは、好ましくは、少なくとも１つの選択マーカ
ーを含む。このようなマーカーは、真核生物細胞培養のためのジヒドロ葉酸還元
酵素またはネオマイシン耐性ならびにＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌中で培養する
ためのテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性遺伝子を含む。適切な宿主の代
表的な例には、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓお
よびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞）；真菌細胞（例えば
、酵母細胞）；昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２およびＳｐｏｄ
ｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞）；動物細胞（例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、およびＢｏ
ｗｅｓ ｍｅｌａｎｏｍａ細胞）；および植物細胞が挙げられるが、これらに限
定されない。上記記載の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は、当該分
野で公知である。

【００７０】 本発明の実施における発現ベクターの使用に加え、本発明は、目的のタンパク
質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたオペレーターエレメン
トおよびプロモーターエレメントを含む、新規な発現ベクターをさらに含む。こ
のようなベクターの１つの例は、以下に詳細に記載されるｐＨＥ４−５である。

【００７１】 図１０および図１１に要約されるように、ｐＨＥ４−５ベクター（配列番号５
０）の構成要素は、以下を含む：１）選択マーカーとしてネオマイシンホスホト
ランスフェラーゼ遺伝子、２）Ｅ．ｃｏｌｉ複製開始点、３）Ｔ５ファージプロ
モーター配列、４）２つのｌａｃオペレーター配列、５）シャイン−ダルガーノ
配列、６）ラクトースオペロンリプレッサー遺伝子（ｌａｃＩｑ）。複製開始点
（ＯｒｉＣ）は、ｐＵＣ１９（ＬＴＩ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）由来
である。プロモーター配列およびオペレーター配列は、合成により作製された。
核酸配列の合成調製は、当該分野で周知である。ＣＬＯＮＴＥＣＨ ９５／９６
Ｃａｔａｌｏｇ、２１５〜２１６頁、ＣＬＯＮＴＥＣＨ、１０２０ Ｅａｓｔ
Ｍｅａｄｏｗ Ｃｉｒｃｌｅ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ、９４３０３。ＡＩ
ＭＩＩをコードするヌクレオチド配列（配列番号１）は、ｐＨＥ４−５ベクター
のＮｄｅＩ部位とＡｓｐ７１８部位との間にこのヌクレオチド配列を挿入するこ
とにより、これらのプロモーターおよびオペレーターに作動可能に連結される。

【００７２】 上述のように、ｐＨＥ４−５ベクターは、ｌａｃＩｑ遺伝子を含む。ｌａｃＩ
ｑは、ｌａｃＩ遺伝子の対立遺伝子であり、ｌａｃオペレーターの強固な調節を
付与する。Ａｍａｎｎ，Ｅ．ら、Ｇｅｎｅ ６９：３０１〜３１５（１９８８）
；Ｓｔａｒｋ，Ｍ．、Ｇｅｎｅ ５１：２５５〜２６７（１９８７）。ｌａｃＩ
ｑ遺伝子は、ｌａｃオペレーター配列に結合し、そして下流（すなわち、３’）
配列の転写を阻止する、リプレッサータンパク質をコードする。しかし、ｌａｃ
Ｉｑ遺伝子産物は、ラクトースかまたは特定のラクトースアナログ（例えば、イ
ソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ））のいずれかの存在下
で、ｌａｃオペレーターから分離する。従って、ＡＩＭ ＩＩは、ｐＨＥ４−５
ベクターを含む非誘導宿主細胞において、感知可能な量で産生されない。しかし
、ＩＰＴＧのような薬剤の添加によるこれらの宿主細胞の誘導は、ＡＩＭ ＩＩ
コード配列の発現を生じる。

【００７３】 ｐＨＥ４−５ベクターのプロモーター／オペレーター配列（配列番号５１）は
、Ｔ５ファージプロモーターおよび２つのｌａｃオペレーター配列を含む。１つ
のオペレーターは、転写開始部位の５’側に配置され、そしてもう他方は、同部
位の３’側に位置する。これらのオペレーターは、ｌａｃＩｑ遺伝子産物と組合
せて存在する場合、ｌａｃオペロンインデューサー（例えば、ＩＰＴＧ）の非存
在下での、下流配列の強固な抑制を与える。このｌａｃオペレーターから下流に
位置する作動可能に連結された配列の発現は、ｌａｃオペロンインデューサー（
例えば、ＩＰＴＧ）の添加により誘導され得る。ｌａｃＩｑタンパク質へのｌａ
ｃインデューサーの結合は、ｌａｃオペレーター配列からのそれらの解放、およ
び作動可能に連結された配列の転写の開始を生じる。遺伝子発現のｌａｃオペロ
ン調節は、Ｄｅｖｌｉｎ，Ｔ．、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ ｗｉｔｈ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ、第４版（１
９９７）、８０２〜８０７頁に概説される。

【００７４】 ｐＨＥ４シリーズのベクターは、ＡＩＭ ＩＩコード配列を除くｐＨＥ４−５
ベクターの全ての構成要素を含む。ｐＨＥ４ベクターの特徴は、最適化された合
成Ｔ５ファージプロモーター、ｌａｃオペレーター、およびシャイン−ダルガー
ノ配列を含む。さらに、これらの配列はまた、最適に間隔を空けられ、その結果
、挿入された遺伝子の発現は強固に調節され得、そして高レベルの発現が誘導に
際して生じる。

【００７５】 本発明のタンパク質の生成における使用に適切な公知の細菌性プロモーターの
中には、Ｅ．ｃｏｌｉのｌａｃＩおよびｌａｃＺプロモーター、Ｔ３およびＴ７
プロモーター、ｇｐｔプロモーター、λ ＰＲおよびＰＬプロモーター、ならび
にｔｒｐプロモーターを含む。適切な真核生物プロモーターは、ＣＭＶ前初期プ
ロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期および後期ＳＶ４０プ
ロモーター、レトロウイルスＬＴＲのプロモーター（例えば、ラウス肉腫ウイル
ス（ＲＳＶ））、ならびにメタロチオネインプロモーター（例えば、マウスメタ
ロチオネイン−Ｉプロモーター）が挙げられる。

【００７６】 ｐＨＥ４−５ベクターはまた、ＡＵＧ開始コドンの５’側にシャイン−ダルガ
ーノ配列を含む。シャイン−ダルガーノ配列は、一般に、ＡＵＧ開始コドンから
約１０ヌクレオチド上流（すなわち、５’）に位置する短い配列である。これら
の配列は、本質的には、原核生物リボソームを、ＡＵＧ開始コドンに配向する。

【００７７】 従って、本発明はまた、本発明のタンパク質の産生に有用な発現ベクターに関
する。本発明のこの局面は、ｐＨＥ４−５ベクター（配列番号５０）に例示され
る。

【００７８】 細菌における使用に好ましいベクター中には、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０および
ｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎから入手可能）；ｐＢＳベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒ
ｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、
ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ならびに
ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩ
Ｔ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）が挙げられる。好ましい真核生物ベク
ターの中には、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐ
ＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ならびにｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、
ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）がある。他の適切
なベクターは、当業者には容易に明白である。

【００７９】 宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥ
ＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフ
ェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染または他の方法によって
もたらされ得る。このような方法は、多くの標準的研究室マニュアルに記載され
ている（例えば、Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６））。

【００８０】 このポリペプチドは、改変された形態（例えば、融合タンパク質）において発
現され得、そして分泌シグナルのみではなくさらなる異種機能領域もまた含み得
る。例えば、さらなるアミノ酸、特に荷電したアミノ酸の領域が、ポリペプチド
のＮ末端に付加され、精製の間またはその後の取り扱いおよび貯蔵の間の、宿主
細胞中での安定性および持続性を改善し得る。また、ペプチド部分が、精製を容
易にするためにポリペプチドに付加され得る。このような領域は、ポリペプチド
の最終的な調製前に除去され得る。とりわけ、安定性を改善し、かつ精製を容易
にするために、分泌または排出を引き起こすペプチド部分のポリペプチドへの付
加は、よく知られており、そして当該分野における慣用技術である。

【００８１】 好ましい融合タンパク質は、タンパク質を可溶化するために有用である免疫グ
ロブリン由来の異種領域を含む。例えば、ＥＰ−Ａ−Ｏ ４６４５３３（カナダ
国対応特許第２０４５８６９号）は、別のヒトタンパク質またはその部分ととも
に免疫グロブリン分子の定常領域の種々の部分を含む融合タンパク質を開示する
。多くの場合、融合タンパク質のＦｃ部分は、治療および診断における使用にか
なり有益であり、従って、例えば、改良された薬物動態学的な特性を生じ得る（
ＥＰ−Ａ ０２３２２６２）。一方、いくつかの使用については、記載される有
利な様式において融合タンパク質が発現され、検出され、そして精製された後に
、Ｆｃ部分を欠失し得ることが望ましい。Ｆｃ部分が、治療および診断における
使用の妨害であることが判明する場合、例えば、融合タンパク質が免疫化のため
の抗原として使用される場合がそうである。例えば、薬物の発見において、ｈＩ
Ｌ−５レセプターのようなヒトタンパク質は、ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同
定するためのハイズループットスクリーニングアッセイの目的のためにＦｃ部分
と融合されてきた（Ｄ．Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ 第８巻：５２−５８（１９９５）およびＫ
．Ｊｏｈａｎｓｏｎら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．第２７０巻１６号：９４５９−９４７１（１９９５）を
参照のこと）。

【００８２】 ＡＩＭ ＩＩタンパク質は、周知の方法により組換え細胞培養物から回収およ
び精製され得る。この方法としては、硫酸アンモニウム沈澱またはエタノール沈
澱、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロー
スクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティーク
ロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチ
ンクロマトグラフィーが挙げられる。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフ
ィー（「ＨＰＬＣ」）が、精製に用いられる。本発明のポリペプチドとしては、
天然に精製された産物、化学合成手順の産物、および原核生物宿主もしくは真核
生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳
動物細胞を含む）から組換え技術によって産生される産物が挙げられる。組換え
産生手順において使用される宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、グリコ
シル化されていてもよく、またはグリコシル化されていなくてもよい。さらに、
本発明のポリペプチドはまた、いくつかの場合、宿主媒介プロセスの結果として
、開始改変メチオニン残基を含み得る。

【００８３】 本明細書中に議論されるベクター構築物を含む宿主細胞を包含することに加え
て、本発明はまた、内因性遺伝物質（例えば、ＡＩＭ ＩＩコード配列）を欠失
するかまたは置換し、そして／あるいは本発明のＡＩＭ ＩＩポリヌクレオチド
に作動可能に連結し、そして内因性ＡＩＭ ＩＩポリヌクレオチドを活性化、変
更、および／または増幅する遺伝物質（例えば、異種ポリヌクレオチド配列）を
含むように操作されている、脊椎動物起源、特に哺乳動物起源の初代宿主細胞、
二次性宿主細胞、および不死化宿主細胞を含む。例えば、当該分野において公知
の技術が、異種制御領域（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）
ならびに内因性ＡＩＭ ＩＩポリヌクレオチド配列を、相同組換えを介して作動
可能に結合させるために使用され得る（例えば、米国特許第５，６４１，６７０
号（１９９６年６月２４日刊行）；ＷＯ９６／２９４１１（１９９６年９月２６
日公開）；ＷＯ９４／１２６５０（１９９４年８月４日公開）；Ｋｏｌｌｅｒら
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２〜８９３５
（１９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら、Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５〜４
３８（１９８９）（これらの各々の開示は、それらの全体において参考として援
用される）を参照のこと）。

【００８４】 （ＡＩＭ ＩＩポリペプチドおよびフラグメント） 本発明はさらに、寄託されたｃＤＮＡのうちの１つによりコードされるアミノ
酸配列、または図１Ａおよび図１Ｂのアミノ酸配列（配列番号２）もしくは図１
Ｃおよび図１Ｄのアミノ酸配列（配列番号３９）を有する単離されたＡＩＭ Ｉ
Ｉポリペプチド、あるいは上記のポリペプチドの一部を含むか、またはそれらか
らなるペプチドまたはポリペプチドを提供する。

【００８５】 本発明のポリペプチドは、寄託されたｃＤＮＡのうちの１つによりコードされ
るポリペプチド、または図１Ａおよび図１Ｂのポリペプチド（配列番号２）もし
くは図１Ｃおよび図１Ｄのポリペプチド（配列番号３９）、図１Ａおよび図１Ｂ
（配列番号２）からなるがＮ末端メチオニンを欠くポリペプチド、細胞外ドメイ
ン、膜貫通ドメイン、細胞内ドメイン、可溶性ポリペプチド（細胞外ドメインお
よび細胞内ドメインの全てまたは一部を含むかまたはこれらからなるが、膜貫通
ドメインを欠く）、ならびに寄託されたｃＤＮＡのうちの１つによりコードされ
るポリペプチド、または図１Ａおよび図１Ｂのポリペプチド（配列番号２）もし
くは図１Ｃおよび図１Ｄのポリペプチド（配列番号３９）に少なくとも８０％同
一、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９２％もしくは９５％同一、な
おより好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一なポリ
ペプチドを含み、そしてまた、少なくとも３０個のアミノ酸、およびより好まし
くは少なくとも５０個のアミノ酸を有するこのようなポリペプチドの一部を含む
。

【００８６】 本発明のポリペプチドはさらに、（ａ）図１Ｃおよび図１Ｄ（配列番号３９）
の約１個〜約２０８個のアミノ酸配列を有するＡＩＭ ＩＩポリペプチド；（ｂ
）図１Ｃおよび図１Ｄ（配列番号３９）の約７個〜約２０８個のアミノ酸配列を
有するＡＩＭ ＩＩポリペプチド；および（ｃ）図１Ｃおよび図１Ｄ（配列番号
３９）の約３４個〜約２０８個のアミノ酸配列を有するＡＩＭ ＩＩポリペプチ
ド、ならびに寄託されたｃＤＮＡのうちの１つによりコードされるポリペプチド
、図１Ａおよび図１Ｂ（配列番号２）もしくは図１Ｃおよび図１Ｄ（配列番号３
９）のポリペプチド、に少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも８５
％、９０％、９２％もしくは９５％同一、なおより好ましくは少なくとも９６％
、９７％、９８％もしくは９９％同一なポリペプチドを含み、そしてまた、少な
くとも３０個のアミノ酸、および好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸を有す
るこのようなポリペプチドの一部を含む。

【００８７】 ＡＩＭ ＩＩポリペプチドの参照アミノ酸配列に、例えば、少なくとも９５％
「同一」なアミノ酸配列を有するポリペプチドにより、ポリペプチド配列が、Ａ
ＩＭ ＩＩポリペプチドの参照アミノ酸の各１００アミノ酸ごとに５つまでのア
ミノ酸変化を含み得ることを除いて、そのポリペプチドのアミノ酸配列が、参照
配列に同一であることが意図される。換言すると、参照アミノ酸配列に少なくと
も９５％同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、参照配列のア
ミノ酸残基の５％までが、欠失され得るか、もしくは別のアミノ酸で置換され得
るか、または参照配列のアミノ酸残基全体の５％までの多数のアミノ酸が、その
参照配列に挿入され得る。参照配列のこれらの変化は、参照アミノ酸配列のアミ
ノ末端位置かまたはカルボキシ末端位置でか、あるいはこれらの末端位置間のど
こかで生じ得、参照配列の残基間で個々にか、または参照配列内で１個以上連続
する群としてかのいずれかで間に散在する。

【００８８】 実際的な問題として、任意の特定のポリペプチドが、例えば、図１Ａおよび図
１Ｂに示されるアミノ酸配列（配列番号２）もしくは図１Ｃおよび図１Ｄに示さ
れるアミノ酸配列（配列番号３９）、または寄託されたｃＤＮＡのうちの１つに
よりコードされるアミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％
、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるか否かは、Ｂｅｓｔ
ｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ
Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅ
ｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓ
ｅｒｃｈ Ｐａｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，
ＷＩ ５３７１１）のような公知のコンピュータープログラムを使用して従来の
ように決定され得る。特定の配列が、本発明に従う参照配列に、例えば９５％同
一かどうか決定するために、Ｂｅｓｔｆｉｔまたは任意の他の配列アライメント
プログラムを使用する場合、もちろん、参照アミノ酸配列の全長に渡って同一性
の百分率が算出されるように、そして参照配列中のアミノ酸残基の合計の数の５
％までの相同性のギャップが許容されるように、パラメーターは設定される。

【００８９】 本発明の問い合わせアミノ酸配列に、例えば、少なくとも９５％「同一」なア
ミノ酸配列を有するポリペプチドにより、対象ポリペプチド配列が、問い合わせ
アミノ酸の各１００アミノ酸ごとに５つまでのアミノ酸変化を含み得ることを除
いて、対象ポリペプチドのアミノ酸配列が、問い合わせ配列に同一であることが
意図される。換言すると、問い合わせアミノ酸配列に少なくとも９５％同一なア
ミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、対象配列のアミノ酸残基の５％
までが、挿入され得るか、欠失され得るか、もしくは別のアミノ酸で置換され得
る。参照配列のこれらの変化は、参照アミノ酸配列のアミノ末端位置かまたはカ
ルボキシ末端位置でか、あるいはこれらの末端位置間のどこかで生じ得、参照配
列の残基間で個々にか、または参照配列内で１個以上連続する群としてかのいず
れかで散在する。

【００９０】 実際問題として、任意の特定のポリペプチドが、例えば、表１に示されるアミ
ノ酸配列、または寄託されたＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列に少なくと
も８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９
９％同一であるか否かは、従来の公知のコンピュータプログラムを使用して決定
され得る。問い合わせ配列（本発明の配列）と対象配列との間の最高の全体的な
一致（また、全体的な配列の整列といわれる）を決定するための好ましい方法は
、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７〜２４５（
１９９０））のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを使
用して決定され得る。配列の整列において、問い合わせ配列および対象配列は、
両方がヌクレオチド配列であるか、または両方がアミノ酸配列であるかのいずれ
かである。上記の全体的配列の整列の結果は、同一性パーセントにおいてである
。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸整列に用いられる好ましいパラメーターは：Ｍａｔｒｉ
ｘ＝ＰＡＭ ０、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１
、Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝２０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒ
ｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓ
ｉｚｅ＝配列の長さ、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎ
ａｌｔｙ＝０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００または対象アミノ酸配列
の長さ（どちらかより短い方）である。

【００９１】 対象配列が、Ｎ末端またはＣ末端欠失により（内部の欠失のためではなく）問
い合わせ配列よりも短い場合、手動の補正が結果に対してなされる。これは、Ｆ
ＡＳＴＤＢプログラムが全体的な同一性パーセントを算定する場合に、対象配列
のＮ末端短縮およびＣ末端短縮を考慮しないからである。問い合わせ配列に対し
てＮ末端およびＣ末端で短縮されている対象配列に関して、同一性パーセントは
、問い合わせ配列の総塩基のパーセントとして、対応する対象残基と一致／整列
しない、対象配列のＮ末端およびＣ末端である問い合わせ配列の残基の数を計算
することによって補正される。残基が一致／整列されているか否かの決定は、Ｆ
ＡＳＴＤＢ配列整列の結果によって決定される。次いで、このパーセントは、同
一性パーセントから差し引かれ、上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって特定の
パラメーターを使用して計算され、最終的な同一性パーセントのスコアに到達す
る。この最終的な同一性パーセントのスコアは、本発明の目的のために使用され
るものである。対象配列のＮ末端またはＣ末端を超えて伸びる問い合わせ（参照
）配列の残基のみが、同一性パーセントスコアを手動で調整する目的のために考
慮される。すなわち、問い合わせ配列のＮ末端またはＣ末端と一致／整列されな
い残基のみが、同一性パーセントスコアを手動で調整する場合に計算される。

【００９２】 例えば、９０アミノ酸残基の対象配列は、同一性パーセントを決定するために
１００残基の問い合わせ配列と整列される。欠失が対象配列のＮ末端で生じ、そ
してそれゆえＦＡＳＴＤＢ整列は、Ｎ末端での最初の１０残基の一致／整列を示
さない。１０個の不対合残基は、配列の１０％（一致していないＮ末端およびＣ
末端での残基の数／問い合わせ配列中の残基の総数）を表し、その結果ＦＡＳＴ
ＤＢプログラムによって計算される同一性パーセントのスコアから１０％が差し
引かれる。残りの９０残基が完全に一致した場合、最終的な同一性パーセントは
９０％である。別の例において、９０残基の対象配列が、１００残基の問い合わ
せ配列と比較される。この場合、欠失は、内部欠失であり、そのため問い合わせ
配列と一致／整列しない対象配列のＮ末端またはＣ末端の残基は存在しない。こ
の場合、ＦＡＳＴＤＢによって算定される同一性パーセントは、手動で補正され
ない。再び、ＦＡＳＴＤＢ整列において示される、問い合わせ配列と一致／整列
しない対象配列のＮ末端およびＣ末端の外の残基位置のみが手動で補正される。
他の手動の補正は、本発明の目的のためにはなされない。

【００９３】 ＡＩＭ ＩＩの天然にプロセスされた形態（これは、全長ＡＩＭ ＩＩ ｃＤ
ＮＡで形質転換されたＭＣＡ−３８細胞の馴化培地からＬＴ−βレセプターカラ
ムにおいてアフィニティー精製された）は、配列番号２のＬｅｕ−８３〜Ｖａｌ
−２４０である（例えば、実施例１０を参照のこと）。しかし、ＡＩＭ ＩＩは
、ＣＯＳ細胞とは異ってプロセスされ、Ｇｌｕ−６７とＭｅｔ−６８との間を切
断されたＡＩＭ ＩＩを産生して、配列番号２のアミノ酸６８〜２４０を有する
ポリペプチドを生じるようである。さらに、ＣＯＳ細胞もまた、Ｍｅｔ−６８と
Ｖａｌ−６９との間のＡＩＭ ＩＩを切断して、配列番号２のアミノ酸６９〜２
４０を有するポリペプチドを生じる。

【００９４】 本発明のポリペプチドは、好ましくは、単離された形態で提供される。「単離
されたポリペプチド」によって、そのネイティブ環境から取り出されたポリペプ
チドが意図される。従って、組換え宿主内で産生されるポリペプチドおよび／ま
たは組換え宿主細胞内に含まれるポリペプチドは、本発明の目的のために単離さ
れたと考えられる。「単離されたポリペプチド」としてまた意図されるのは、組
換え宿主から、部分的または実質的に精製されたポリペプチドである。例えば、
ＡＩＭ ＩＩポリペプチドの組換え産生されたバージョンは、Ｓｍｉｔｈおよび
Ｊｈｏｎｓｏｎ（Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０（１９８８））に記載される一工
程法によって実質的に精製され得る。

【００９５】 本発明のＡＩＭ ＩＩポリペプチドは、単量体または多量体（すなわち、二量
体、三量体、四量体およびより高度の多量体）であり得る。従って、本発明は、
本発明のＡＩＭ ＩＩポリペプチドの単量体および多量体、それらの調製ならび
にそれらを含む組成物（好ましくは、薬学的組成物）に関する。特定の実施形態
では、本発明のポリペプチドは、単量体、二量体、三量体または四量体である。
さらなる実施形態では、本発明の多量体は、少なくとも二量体、少なくとも三量
体、または少なくとも四量体である。

【００９６】 本発明によって含まれる多量体は、ホモマー（ｈｏｍｏｍｅｒ）またはヘテロ
マー（ｈｅｔｅｒｏｍｅｒ）であり得る。本明細書中で用いられる場合、用語ホ
モマーは、本発明のＡＩＭ ＩＩポリペプチド（本明細書中に記載されるＡＩＭ
ＩＩフラグメント、改変体、スプライス改変体および融合タンパク質を含む）
のみを含む多量体をいう。これらのホモマーは、同一または異なるアミノ酸配列
を有するＡＩＭ ＩＩポリペプチドを含み得る。特定の実施形態では、本発明の
ホモマーは、同一のアミノ酸配列を有するＡＩＭ ＩＩポリペプチドのみを含む
多量体である。別の特定の実施形態では、本発明のホモマーは、異なるアミノ酸
配列を有するＡＩＭ ＩＩポリペプチドを含む多量体である。特定の実施形態で
は、本発明の多量体は、ホモ二量体（例えば、同一または異なるアミノ酸配列を
有するＡＩＭ ＩＩポリペプチドを含む）あるいはホモ三量体（例えば、同一お
よび／または異なるアミノ酸配列を有するＡＩＭ ＩＩポリペプチドを含む）で
ある。さらなる実施形態では、本発明のホモマー性多量体は、少なくともホモ二
量体、少なくともホモ三量体または少なくともホモ四量体である。

【００９７】 本明細書中で用いられる場合、用語ヘテロマーとは、本発明のＡＩＭ ＩＩポ
リペプチドに加えて１以上の異種ポリペプチド（すなわち、異なるタンパク質の
ポリペプチド）を含む多量体をいう。特定の実施形態では、本発明の多量体は、
ヘテロ二量体、ヘテロ三量体またはヘテロ四量体である。さらなる実施形態では
、本発明のヘテロマー性多量体は、少なくともヘテロ二量体、少なくともヘテロ
三量体または少なくともヘテロ四量体である。

【００９８】 本発明の多量体は、疎水性、親水性、イオン性および／もしくは共有結合的な
結合の結果であり得、そして／または例えば、リポソーム形成によって間接連結
され得る。従って、１つの実施形態では、本発明の多量体（例えば、ホモ二量体
またはホモ三量体など）は、本発明のポリペプチドが溶液中で互いに接触する場
合に形成される。別の実施形態では、本発明のへテロ多量体（例えば、ヘテロ三
量体またはヘテロ四量体など）は、本発明のポリペプチドが、溶液中で本発明の
ポリペプチドに対する抗体（本発明の融合タンパク質における異種ポリペプチド
配列に対する抗体を含む）と接触した場合に形成される。他の実施形態では、本
発明の多量体は、本発明のポリペプチドとの、および／または本発明のポリペプ
チド間での共有結合によって形成される。このような共有結合は、ポリペプチド
配列（例えば、配列番号２または配列番号３９に示されるポリペプチド配列、あ
るいはＡＴＣＣ登録番号９７６８９または９７４８３として命名された寄託物の
ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドに含まれるポリペプチド配列）中に含
まれる１以上のアミノ酸残基を含み得る。１例では、この共有結合は、ネイティ
ブ（すなわち、天然に存在する）ポリペプチドにおいて相互作用するポリペプチ
ド配列内に存在するシステイン残基間での架橋である。別の例では、この共有結
合は、化学的操作または組換え操作の結果である。あるいは、このような共有結
合は、ＡＩＭ ＩＩ融合タンパク質中の異種ポリペプチド配列において含まれる
１以上のアミノ酸残基を含み得る。１例では、共有結合は、本発明の融合タンパ
ク質に含まれる異種配列間にある（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号を
参照のこと）。特定の例では、この共有結合は、（本明細書中に記載されるよう
な）本発明のＡＩＭ ＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質に含まれる異種配列間にある。
別の特定の例では、本発明の融合タンパク質の共有結合は、共有結合した多量体
を形成し得る別のＴＮＦファミリーリガンド／レセプターのメンバー（例えば、
オステオプロテゲリン（ｏｓｅｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）など）由来の異種
ポリペプチド配列間にある（例えば、国際公開番号ＷＯ ９８／４９３０５号（
この内容はその全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。

【００９９】 本発明の多量体は、当該分野で公知の化学技術を用いて生成され得る。例えば
、本発明の多量体に含まれることが所望されるポリペプチドは、当該分野で公知
のリンカー分子およびリンカー分子長最適化技術を用いて化学的に架橋され得る
（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第５，４７
８，９２５号を参照のこと）。さらに、本発明の多量体は、当該分野で公知の技
術を用いて生成されて、多量体に含まれることが所望されるポリペプチドの配列
内に存在するシステイン残基間の１以上の分子間架橋を形成し得る（例えば、本
明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第５，４７８，９２５号
を参照のこと）。さらに、本発明のポリペプチドは、ポリペプチドのＣ末端また
はＮ末端へのシステインまたはビオチンの付加によって慣用的に改変され得、そ
して当該分野で公知の技術が、１以上のこれらの改変されたポリペプチドを含む
多量体を生成するために適用され得る（例えば、本明細書中にその全体が参考と
して援用される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。さらに、当
該分野で公知の技術は、本発明の多量体に含まれることが所望されるポリペプチ
ド成分を含むリポソームを生成するために適用され得る（例えば、本明細書中に
その全体が参考として援用される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこ
と）。

【０１００】 あるいは、本発明の多量体は、当該分野で公知の遺伝子操作技術を用いて生成
され得る。１つの実施形態では、本発明の多量体に含まれるポリペプチドは、本
明細書中に記載されるかさもなくば当該分野で公知の融合タンパク質技術を用い
て組換え生成される（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、
米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。特定の実施形態では、本発明
のホモ二量体をコードするポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコード
するポリヌクレオチド配列を、リンカーポリペプチドをコードする配列に連結し
、次いでさらに元々のＣ末端からＮ末端の方向とは逆方向でポリペプチドの翻訳
産物をコードする合成ポリヌクレオチド（リーダー配列を欠く）に連結すること
によって生成される（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、
米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。別の実施形態では、本明細書
中に記載されるかさもなくば当該分野で公知の組換え技術を適用して、膜貫通ド
メイン（または疎水性ペプチドもしくはシグナルペプチド）を含み、そして膜再
構成技術によってリポソームに取り込まれ得る、本発明の組換えポリペプチドを
生成する（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第
５，４７８，９２５号を参照のこと）。

【０１０１】 本発明はさらに、抗体の可変領域以外のドメインに融合または結合された、本
発明のポリぺプチドを含む組成物を含む。例えば、本発明のポリぺプチドは、抗
体のＦｃ領域、またはその部分に融合または結合され得る。本発明のポリぺプチ
ドに融合されたこの抗体の部分は、ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイ
ン、およびＣＨ３ドメイン、またはそれらのドメイン全体もしくは部分の任意の
組合せを含み得る。本発明のポリペプチドは、当該分野において公知の方法を使
用して、このポリペプチドのインビボ半減期を増大させるために、またはイムノ
アッセイにおける使用のために、上記の抗体部分に融合または結合体化され得る
。これらのポリぺプチドはまた、上記の抗体の部分に融合または結合され得、多
量体を形成する。例えば、本発明のポリぺプチドに融合されたＦｃ部分は、この
Ｆｃ部分の間のジスルフィド結合を通して二量体を形成し得る。より高度の多量
体形態は、ポリぺプチドをＩｇＡおよびＩｇＭの部分に融合させることによって
作製され得る。本発明のポリぺプチドを抗体部分に融合または結合させるための
方法は、当該分野において公知である。例えば、米国特許第５，３３６，６０３
号；同第５，６２２，９２９号；同第５，３５９，０４６号；同第５，３４９，
０５３号；同第５，４４７，８５１号；同第５，１１２，９４６号；ＥＰ ０
３０７ ４３４；ＥＰ ０ ３６７ １６６；ＷＯ９６／０４３８８；ＷＯ９１
／０６５７０；Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、ＰＮＡＳ ８８：１０５３５−１０５３
９（１９９１）；Ｚｈｅｎｇ，Ｘ．Ｘ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５５
９０−５６００（１９９５）；およびＶｉｌ，Ｈ．ら、ＰＮＡＳ ８９：１１３
３７−１１３４１（１９９２）（上記の参考文献はその全体が参考として援用さ
れる）を参照のこと。

【０１０２】 本明細書中で使用される用語「ＡＩＭ ＩＩ」ポリペプチドは、膜結合タンパ
ク質（細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞外ドメインを含むか、ある
いはそれらからなる）ならびにＡＩＭ ＩＩ機能活性を保持する短縮型タンパク
質を含む。１つの実施態様において、可溶性ＡＩＭ ＩＩポリペプチドは、ＡＩ
Ｍ ＩＩタンパク質の細胞外ドメインの全てまたは部分を含むかまたはそれらか
らなるが、細胞膜上のポリペプチドの保持を生じる膜貫通領域を欠損する。可溶
性ＡＩＭ ＩＩはまた、可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質が分泌され得る場合、膜
貫通領域の部分または細胞質ドメインの部分あるいは他の配列を含み得る。異種
シグナルペプチドは、発現された際に、可溶性ＡＩＭ ＩＩポリペプチドが分泌
されるように、可溶性ＡＩＭ ＩＩポリペプチドのＮ末端に融合され得る。

【０１０３】 本発明のポリペプチドは、当業者に周知の方法を使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ゲルまたは分子ふるいゲル濾過カラムにおいて、分子量マーカーとしての目的を
含むがこれらに限定されない用途を有する。

【０１０４】 ＡＩＭ ＩＩポリペプチドのいくつかのアミノ酸配列は、タンパク質の構造ま
たは機能の有意な効果を伴わずに変えられ得ることが、当該分野で認識される。
配列におけるこのような差異が意図される場合、活性を決定するタンパク質上に
重大な領域が存在することを、考えるべきである。

【０１０５】 従って、本発明はさらに、実質的なＡＩＭ ＩＩポリペプチド活性を示すか、
または以下に議論されるタンパク質部分のようなＡＩＭ ＩＩタンパク質の領域
を含む、ＡＩＭ ＩＩポリペプチドのバリエーションを含む。このような変異体
は、欠失、挿入、逆位、反復、および型置換を含む。上記のように、どのアミノ
酸変化が表現型的にサイレントである可能性があるかに関する指針は、Ｂｏｗｉ
ｅ，Ｊ．Ｕ．ら、「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ
Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０
６〜１３１０（１９９０）に見出され得る。これらのフラグメント、誘導体、ま
たはアナログをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明によって包含される
。

【０１０６】 従って、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）または図１Ｃまたは１Ｄ（配列番号
３９）のポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログ、あるいは寄託さ
れたｃＤＮＡの１つによってコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体
またはアナログは、以下のものであり得る：（ｉ）１つ以上のアミノ酸残基（例
えば、３、５、８、１０、１５または２０）が保存アミノ酸残基もしくは非保存
アミノ酸残基（好ましくは、保存アミノ酸残基）で置換されるものであり、この
ような置換アミノ酸残基は遺伝コードによってコードされるものであってもなく
てもよい、または（ｉｉ）１つ以上のアミノ酸残基が置換基（例えば、３、５、
８、１０、１５または２０）を含むもの、または（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドが
、ポリペプチドの半減期を増加する化合物のような別の化合物（例えば、ポリエ
チレングリコール）と融合されているもの、または（ｉｖ）さらなるアミノ酸が
、ＩｇＧ Ｆｃ融合領域ペプチドもしくはリーダー配列もしくは分泌配列または
成熟ポリペプチドもしくはプロタンパク質配列の精製のために使用される配列の
ような成熟ポリペプチドに融合されるもの。このようなフラグメント、誘導体お
よびアナログは、本明細書中の教示から、当業者の範囲内にあるとみなされる。
これらのフラグメント、誘導体、またはアナログをコードするポリヌクレオチド
もまた、本発明によって包含される。

【０１０７】 特定の目的は、荷電アミノ酸の、別の荷電アミノ酸、および中性アミノ酸また
は負に荷電したアミノ酸との置換である。後者は、減少した正の電荷を有するタ
ンパク質を生じて、ＡＩＭ ＩＩタンパク質の特徴を改善する。凝集の防止は、
非常に望ましい。タンパク質の凝集は、活性の損失を生じるだけでなく、薬学的
処方物を調製する場合に問題となり得る。なぜなら、凝集は、免疫原性であり得
るからである。（Ｐｉｎｃｋａｒｄら、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２
：３３１−３４０（１９６７）；Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３６：
８３８−８４５（１９８７）；Ｃｌｅｌａｎｄら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ
ａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ １０：３０７−
３７７（１９９３））。

【０１０８】 アミノ酸の置換はまた、細胞表面レセプターへの結合の選択性を変更し得る。
Ｏｓｔａｄｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３６１：２６６−２６８（１９９３）は、２つ
の公知の型のＴＮＦレセプターの１つのみへのＴＮＦ−αの選択的結合を生じる
特定の変異を記載する。従って、本発明のＡＩＭ ＩＩレセプターは、天然の変
異または人為的操作のいずれか由来の、１つ以上（例えば、３、５、８、１０、
１５または２０）のアミノ酸置換、欠失、または付加を含み得る。

【０１０９】 示されるように、変更は、好ましくは、タンパク質の折りたたみまたは活性に
有意に影響しない保存的アミノ酸置換のような、あまり重要でない性質の変更で
ある（表１を参照のこと）。

【０１１０】

【表１】 もちろん、アミノ酸置換の数は、当業者が多くの要因（上記のものを含む）に
依存して作製する。一般に、任意の所定のＡＩＭ−ＩＩポリペプチドについての
置換の数は、５０、４０、３０、２５、２０、１５、１０、５または３を超えな
い。

【０１１１】 本発明のＡＩＭ ＩＩタンパク質中の、機能に必須であるアミノ酸は、部位特
異的変異誘発またはアラニンスキャニング変異誘発のような、当該分野で公知の
方法によって同定され得る（ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５（１９８９））。後者の手順は、分子中の
全ての残基で単一のアラニン変異を導入する。次いで、得られた変異体分子は、
レセプター結合のような生物学的活性、またはインビトロもしくはインビトロで
の増殖活性について試験される。リガンド−レセプター結合のために重要な部位
もまた、結晶化、核磁気共鳴、または光親和性標識のような構造解析によって決
定され得る（Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９−９０４（
１９９２）およびｄｅ Ｖｏｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３０６−３１２（
１９９２））。

【０１１２】 本発明において、アミノ末端欠失変異体もまた含まれる。このような変異体と
しては、配列番号２の少なくともＮ−末端の初めのアミノ酸の欠失、しかしＮ−
末端の初めの１１４アミノ残基を超えないアミノ酸残基の欠失を有する、配列番
号２に示されるアミノ酸配列を含むものが挙げられる。あるいは、この欠失は、
配列番号２の少なくともＮ−末端の初めの３５アミノ酸残基、しかしＮ−末端の
初めの１１４残基を超えないアミノ酸残基を含む。あるいは、この欠失は、配列
番号２の少なくともＮ−末端の初めの５９アミノ酸残基、しかしＮ−末端の初め
の１１４残基を超えないアミノ酸残基を含む。あるいは、この欠失は、配列番号
２の少なくともＮ−末端の初めの６７アミノ酸残基、しかしＮ−末端の初めの１
１４残基を超えないアミノ酸残基を含む。あるいは、この欠失は、配列番号２の
少なくともＮ−末端の初めの６８アミノ酸残基、しかしＮ−末端の初めの１１４
残基を超えないアミノ酸残基を含む。あるいは、この欠失は、配列番号２の少な
くともＮ−末端の初めの７３アミノ酸残基、しかしＮ−末端の初めの１１４残基
を超えないアミノ酸残基を含む。あるいは、この欠失は、配列番号２の少なくと
もＮ−末端の初めの８２アミノ酸残基、しかしＮ−末端の初めの１１４残基を超
えないアミノ酸残基を含む。あるいは、この欠失は、配列番号２の少なくともＮ
−末端の初めの１００アミノ酸残基、しかしＮ−末端の初めの１１４残基を超え
ないアミノ酸残基を含む。これらの欠失変異体をコードするポリヌクレオチドも
また、本発明によって包含され、上記の欠失変異体をコードするポリヌクレオチ
ドに対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９
７％、９８％、または９９％同一であるポリヌクレオチド、およびこれらの欠失
変異体に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％
、９７％、９８％、または９９％同一であるポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドである。本発明はまた、異種ポリヌクレオチドに融合された上記のポリ
ヌクレオチドおよびこれらのポリヌクレオチドのポリペプチド発現産物を包含す
る。

【０１１３】 上記のＮ−末端欠失変異体の範囲に加えて、本発明はまた、上記の範囲の全て
の組み合わせに関する。例えば、配列番号２の少なくともＮ−末端の初めの５９
アミノ酸残基、しかしＮ−末端の初めの６７アミノ酸残基を超えない欠失；配列
番号２の少なくともＮ−末端の初めの５９アミノ酸残基、しかしＮ−末端の初め
の６８アミノ酸残基を超えない欠失；配列番号２の少なくともＮ−末端の初めの
５９アミノ酸残基、しかしＮ−末端の初めの７３アミノ酸残基を超えない欠失；
配列番号２の少なくともＮ−末端の初めの５９アミノ酸残基、しかしＮ−末端の
初めの８２アミノ酸残基を超えない欠失；配列番号２の少なくともＮ−末端の初
めの５９アミノ酸残基、しかしＮ−末端の初めの１００アミノ酸残基を超えない
欠失；配列番号２の少なくともＮ−末端の初めの６７アミノ酸残基、しかしＮ−
末端の初めの７３アミノ酸残基を超えない欠失；配列番号２の少なくともＮ−末
端の初めの６７アミノ酸残基、しかしＮ−末端の初めの８２アミノ酸残基を超え
ない欠失；配列番号２の少なくともＮ−末端の初めの６７アミノ酸残基、しかし
Ｎ−末端の初めの１００アミノ酸残基を超えない欠失；配列番号２の少なくとも
Ｎ−末端の初めの６８アミノ酸残基、しかしＮ−末端の初めの７３アミノ酸残基
を超えない欠失；配列番号２の少なくともＮ−末端の初めの６８アミノ酸残基、
しかしＮ−末端の初めの８２アミノ酸残基を超えない欠失；配列番号２の少なく
ともＮ−末端の初めの６８アミノ酸残基、しかしＮ−末端の初めの１００アミノ
酸残基を超えない欠失；配列番号２の少なくともＮ−末端の初めの７３アミノ酸
残基、しかしＮ−末端の初めの８２アミノ酸残基を超えない欠失；配列番号２の
少なくともＮ−末端の初めの７３アミノ酸残基、しかしＮ−末端の初めの１００
アミノ酸残基を超えない欠失；配列番号２の少なくともＮ−末端の初めの８２ア
ミノ酸残基、しかしＮ−末端の初めの１００アミノ酸残基を超えない欠失；など
。これらの欠失変異体をコードするポリヌクレオチドもまた、本発明によって包
含され、上記の欠失変異体をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも
８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９
９％同一であるポリヌクレオチド、およびこれらの欠失変異体に対して、少なく
とも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、また
は９９％同一であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。本発明
はまた、異種ポリヌクレオチドに融合された上記のポリヌクレオチドおよびこれ
らのポリヌクレオチドのポリペプチド発現産物を包含する。

【０１１４】 好ましいＡＩＭ ＩＩポリペプチドは、以下に示される配列の１つ以上を有す
るポリペプチドである（タンパク質における初めのアミノ酸（Ｍｅｔ）から数え
始める）：

【０１１５】

【化１】 特に好ましい実施形態には、以下の１つ以上のＡＩＭ ＩＩＮ末端欠失を含ぬ
か、またはあるいはそれらからなるポリペプチドを含む：Ｇｌｎ−６０〜Ｖａｌ
−２４０（ＡＩＭ ＩＩ（アミノ酸６０−２４０））、Ｍｅｔ−６８〜Ｖａｌ−
２４０（ＡＩＭ ＩＩ（アミノ酸６８−２４０））、Ｖａｌ−６９〜Ｖａｌ−２
４０（ＡＩＭ ＩＩ（アミノ酸６９−２４０））、Ａｓｐ−７４〜Ｖａｌ−２４
０（ＡＩＭ ＩＩ（アミノ酸７４−２４０））、Ｌｅｕ−８３〜Ｖａｌ−２４０
（ＡＩＭ ＩＩ（アミノ酸８３−２４０））、およびＡｌａ−１０１〜Ｖａｌ−
２４０（ＡＩＭ ＩＩ（アミノ酸１０１−２４０））。これらのポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドもまた、本発明によって包含され、上記のポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも８０％、８５％、９０
％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるポリヌ
クレオチド、およびこれらのポリペプチドに対して、少なくとも８０％、８５％
、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。本発明はまた、異種ポリヌ
クレオチドに融合された上記のポリヌクレオチドおよびこれらのポリヌクレオチ
ドのポリペプチド発現産物を包含する。

【０１１６】 タンパク質のＮ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が、タンパク質の１つ以
上の生物学的機能の改変または欠失を生じたとしても、他の生物学的活性はなお
保持され得る。従って、ポリペプチドの完全な形態または熟成形態を認識する抗
体を誘導および／または結合する、短縮されたＡＩＭ ＩＩムテインの能力は、
一般に、完全また成熟したポリペプチドの大多数より少ない残基が、Ｎ末端から
除去される場合に保持される。完全なポリペプチドのＮ末端残基を欠損する特定
のポリぺプチドが、このような免疫原性活性を保持するか否かは、本明細書中に
記載される慣用的な方法、およびそうでなければ当該分野において公知の慣用的
な方法によって容易に決定され得る。多数の欠失したＮ末端アミノ酸残基を有す
るＡＩＭ ＩＩムテインは、いくつかの生物学的活性または免疫源性活性を保持
し得るようである。実際に、６つと同じくらい少ないＡＩＭ ＩＩアミノ酸残基
からなるペプチドは、しばしば免疫応答を惹起し得る。

【０１１７】 従って、本発明はさらに、図１Ａおよび１Ｂに示されるＡＩＭ ＩＩアミノ酸
配列のアミノ末端から欠失した１つ以上の残基を有するポリペプチドを提供する
（位置番号２３５のフェニルアラニンまでの配列番号２、およびこのようなポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチド）。特に、本発明は、図１Ａおよび１Ｂ
（配列番号２）の残基ｎ−３１４のアミノ酸配列を有するか、あるいはそれらか
らなるポリペプチドを提供し、ここで、ｎは、２〜２３５の範囲の整数であり、
そして２３６は、ＡＩＭ ＩＩポリペプチドの少なくとも免疫原性活性のために
必要であると考えられる完全なＡＩＭ ＩＩポリペプチドのＮ末端からの最初の
残基の位置である。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた
、本発明によって包含される。

【０１１８】 より特に、本発明は、配列番号２に示されるＡＩＭ ＩＩ配列（これは、配列
番号２のアミノ酸残基が、Ｎ末端からＣ末端に、連続的に１から２４０に番号付
けされることを除いて、図１Ａおよび１Ｂに示される配列と同一である）の以下
の残基からなる群から選択されたメンバーのアミノ酸配列を含むか、あるいはこ
れらからなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する：

【０１１９】

【化２】 本発明はまた、上記のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に対して
、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８
％、または９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、あるいはそれらか
らなる核酸分子に関する。本発明はまた、異種ポリヌクレオチドに融合された上
記のポリヌクレオチドを包含する。これらのポリヌクレオチド配列によってコー
ドされるポリペプチドもまた、本発明によって包含される。

【０１２０】 上記のように、タンパク質のＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が、タン
パク質の１つ以上の生物学的機能の改変または欠失を生じたとしても、他の生物
学的活性はなお保持され得る。従って、ポリペプチドの完全な形態または熟成形
態を認識する抗体を誘導および／または結合する、短縮されたＡＩＭ ＩＩムテ
インの能力は、一般に、完全なポリペプチドまたは熟成ポリペプチドの大多数よ
り少ない残基が、Ｃ末端から除去される場合に保持される。完全なポリペプチド
のＣ末端残基を欠損する特定のポリぺプチドが、このような免疫原性活性を保持
するか否かは、本明細書中に記載される慣用的な方法、およびそうでなければ当
該分野において公知の慣用的な方法によって容易に決定され得る。多数の欠失し
たＣ末端アミノ酸残基を有するＡＩＭ ＩＩムテインは、いくつかの生物学的活
性または免疫原性活性を保持し得るようである。実際に、６つと同じくらい少な
いＡＩＭ ＩＩアミノ酸残基からなるペプチドは、しばしば免疫応答を惹起し得
る。

【０１２１】 従って、本発明はさらに、位置番号６のバリン残基までの、図１Ａおよび１Ｂ
（配列番号２）に示されるＡＩＭ ＩＩアミノ酸配列のカルボキシ末端から欠失
した１つ以上の残基を有するポリペプチド、ならびにこのようなポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドを提供する。特に、本発明は、図１Ａおよび１Ｂ（
すなわち、配列番号２）の残基１−ｍのアミノ酸配列を含むか、あるいはそれら
からなるポリペプチドを提供し、ここで、ｍは、２〜２３９の範囲の整数であり
、そして６は、ＡＩＭ ＩＩポリペプチドの少なくとも免疫原性活性のために必
要であると考えられる完全なＡＩＭ ＩＩポリペプチドのＣ末端からの最初の残
基の位置である。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、
本発明によって包含される。

【０１２２】 より特に、本発明は、図１Ａおよび１Ｂに示されるＡＩＭ ＩＩ配列の配列（
これは、配列番号２のアミノ酸残基が、Ｎ末端からＣ末端に、連続的に１から２
４０に番号付けされることを除いて、配列番号２に示される配列と同一である）
の以下の残基からなる群から選択されるメンバーのアミノ酸配列を含むか、ある
いはこれらからなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する：

【０１２３】

【化３】 本発明はまた、上記のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に対して
、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８
％、または９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、あるいはそれをか
らなる核酸分子に関する。本発明はまた、異種ポリヌクレオチド配列に融合され
た上記のポリヌクレオチド配列を包含する。これらのポリヌクレオチド配列によ
ってコードされるポリペプチドはまた、本発明によって含まれる。

【０１２４】 本発明はまた、ＡＩＭ ＩＩポリペプチドのアミノ末端およびカルボキシル末
端の両方から欠失された一つ以上のアミノ酸を有するポリペプチドを提供し、Ａ
ＩＭ ＩＩポリペプチドは、図１Ａおよび１Ｂ（すなわち、配列番号２）の残基
ｎ−ｍを有するものとして一般に記載され得る（ここで、ｎおよびｍは、上記の
整数である）。

【０１２５】 さらなる実施形態において、本発明は、図１Ａおよび１Ｂ（すなわち、配列番
号２）の８３−ｍ¹ 残基のアミノ酸配列を含むか、あるいはそれらからなるポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供し、ここで、ｍ¹は８９〜２３９
の整数であり、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）のアミノ酸残基の位置に対応す
る。例えば、本発明は、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）に示されるＡＩＭ Ｉ
Ｉ配列の配列の以下の残基；

【０１２６】

【化４】 からなる群から選択されるメンバーのアミノ酸配列を含むか、あるいはそれらか
らからなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。この適用は
また、上記のＡＩＭ ＩＩポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と、
少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％
または９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、あるいはそれらからな
る核酸分子に関する。本発明はまた、異種ポリヌクレオチド配列と融合された上
記ポリヌクレオチド配列を含む。これらのポリヌクレオチド配列によってコード
されるポリペプチドはまた、本発明により含まれる。

【０１２７】 さらなる実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ＡＩＭ ＩＩの機
能的特性をコードする。この点において、本発明の好ましい実施形態は、１、２
３、４つ以上の一つ以上の以下の機能ドメイン：ＡＩＭ ＩＩのα−へリックス
およびα−へリックス形成領域（「α−領域」）、β−シートおよびβ−シート
形成領域（「β−領域」）、ターンおよびターン形成領域（「ターン−領域」）
、コイルおよびコイル形成領域（「コイル−領域」）、親水性領域、疎水性領域
、α両親媒性領域、β両親媒性領域、可撓性領域、表面形成領域および高抗原性
指標領域を含むか、あるいはそれらからなるフラグメントを含む。

【０１２８】 図３Ａ−３Ｆおよび／または表２に示されるＡＩＭ ＩＩの構造的もしくは機
能的特性を表わすデータを、デフォルトパラメータに設定されるＤＮＡ^*ＳＴＡ
Ｒの種々の同定されたモジュールおよびアルゴリズムを使用して、作製した。好
ましい実施形態において、表２の欄ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩＩＩ、およびＸＩＶに
示されるデータを使用して、抗原性について高度な可能性を示すＡＩＭ ＩＩの
領域を決定し得る。高抗原性の領域は、抗原認識が免疫応答の開始のプロセスに
おいて生じ得る環境で、ポリペプチドの表面におそらく曝露されるポリペプチド
の領域を示す値を選択することによって、欄ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩＩＩ、および
／またはＩＶに示されるデータから決定される。

【０１２９】 これらに関して特定の好ましい領域は、図３Ａ−３Ｆにて示されるが、表２に
示されるように、表形式において表され得るか、または同定され得る。図３Ａ−
３Ｆ（最初のデフォルトパラメータに対して設定される）を作製するために使用
されるＤＮＡ^*ＳＴＡＲコンピュータアルゴリズムを使用して、表形式（表２を
参照のこと）の図３Ａ−３Ｆにおいてデータを示した。図３Ａ−３Ｆにおけるデ
ータの表形式を使用して、好ましい領域の特定の境界を容易に決定し得る。

【０１３０】 図３Ａ−３Ｆおよび表２に示される上記の好ましい領域は、図１Ａおよび１Ｂ
に示されるアミノ酸配列の分析によって同定される上記の型の領域を含むが、こ
れらに限定されない。図３Ａ−３Ｆおよび表２に示されるように、そのような好
ましい領域は、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ α−領域、β−領域、ターン−
領域、およびコイル−領域（表２における欄Ｉ、ＩＩＩ、Ｖ、およびＶＩＩ）、
Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ α−領域、β−領域、およびターン−領域（表２にお
ける欄ＩＩ、ＩＶ、およびＶＩ）、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ親水性領域（
表２の欄ＶＩＩＩ）、Ｈｏｐｐ−Ｗｏｏｄｓ疎水性領域（表２の欄ＩＸ）、Ｅｉ
ｓｅｎｂｅｒｇ α−両親媒性領域およびＥｉｓｅｎｂｅｒｇ β−両親媒性領
域（表２における欄ＸおよびＸＩ）、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚ可撓性領域
（表２の欄ＸＩＩ）、高抗原性指標のＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ領域（表２の欄
ＸＩＩＩ）、およびＥｍｉｎｉ表面形成領域（表２の欄ＸＩＶ）を含む。

【０１３１】

【表２】 この点について、非常に好ましいフラグメントには、上記表２において記載さ
れたいくつかの特徴のような、いくつかの構造的特徴を組み合わせるＡＩＭ Ｉ
Ｉの領域を含むフラグメントがある。

【０１３２】 本発明はさらに、ＡＩＭ ＩＩのフラグメントを含むか、あるいはそれらから
なる単離されたポリペプチドに関する。特に、本発明は、配列番号２のアミノ酸
１〜６０、１１〜７０、２１〜８０、３１〜９０、４１〜１００、５１〜１１０
、６１〜１２０、７１〜１３０、８１〜１４０、９１〜１５０、１０１〜１６０
、１１１〜１７０、１２１〜１８０、１３１〜１９０、１４１〜２００、１５１
〜２１０、１６１〜２２０、１７１〜２３０、および１８１〜２４０からなる群
から選択されるメンバーのアミノ酸配列を含むか、あるいはこれらからなる単離
されたポリペプチド、ならびにこれらのポリペプチドをコードする単離されたポ
リヌクレオチドを提供する。

【０１３３】 本発明はまた、ＡＩＭ ＩＩのドメインを含むか、あるいはそれらからなる単
離されたポリペプチドに関する。特に、本発明は、表２に記載されるＡＩＭ Ｉ
Ｉのβ−シート領域を含むか、またはそれらからなるポリペプチドを提供する。
これらのポリペプチドは、配列番号２の約７〜約１４アミノ酸残基、約１８〜約
２３アミノ酸残基、約１７〜約２５アミノ酸残基、約３３〜約４６アミノ酸残基
、約３５〜約３９アミノ酸残基、約５７〜約６０アミノ酸残基、約６７〜約７２
アミノ酸残基、約１０２〜約１０７アミノ酸残基、約１２１〜約１２６アミノ酸
残基、約１３１〜約１６６アミノ酸残基、約１４１〜約１５２アミノ酸残基、約
１５８〜約１６９アミノ酸残基、約２１３〜約２２１アミノ酸残基、約２３２〜
約２４０アミノ酸残基からなる群から選択されるメンバーのアミノ酸配列を含む
か、あるいはこれらからなるポリペプチドを含む。本発明は、さらに、表２に記
載されるβシート領域をコードする核酸分子を含むか、あるいはそれらからなる
単離されたポリヌクレオチド、およびＡＩＭ ＩＩタンパク質のβーシート領域
をコードする核酸分子に、少なくとも８０％同一、そしてより好ましくは少なく
とも８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同
一なアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなる単離されたポリペプチドに関
する。

【０１３４】 本発明はまた、配列番号２または配列番号３９のアミノ酸配列を有するＡＩＭ
ＩＩポリペプチドと関連する１つ以上の活性を有するＡＩＭ ＩＩを含むか、
あるいはそれらからなる単離されたポリペプチド、ならびにこれらのポリペプチ
ドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。

【０１３５】 抗原性エピトープを保有するペプチドまたはポリペプチド（すなわち、抗体が
結合し得るタンパク質分子の領域を含む）の選択について、タンパク質配列の一
部に模倣する比較的短い合成ペプチドが、部分的に模倣されたタンパク質と反応
する抗血清を慣用的に誘発し得ることが、当該分野で周知である。例えば、Ｓｕ
ｔｃｌｉｆｆｅ，Ｊ．Ｇ．、Ｓｈｉｎｎｉｃｋ，Ｔ．Ｍ．、Ｇｒｅｅｎ，Ｎ．お
よびＬｅａｒｎｅｒ，Ｒ．Ａ．（１９８３）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ
ｒｅａｃｔ ｗｉｔｈ ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｓｉｔｅｓ ｏｎ ｐｒ
ｏｔｅｉｎｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９：６６０〜６６６を参照のこと。タンパ
ク質反応性の血清を誘発し得るペプチドは、タンパク質の一次配列においてしば
しば示され、一組の単純な化学法則によって特徴付けられ得、そしてインタクト
なタンパク質の免疫優性領域（すなわち、免疫原性エピトープ）またはアミノ末
端もしくはカルボキシ末端のいずれにも制限されない。

【０１３６】 従って、本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよび抗原性エピトープ保有
ポリペプチドは、本発明のポリペプチドに対して特異的に結合する抗体（モノク
ローナル抗体を含む）を惹起するために有用である。例えば、Ｗｉｌｓｏｎら、
Ｃｅｌｌ ３７：７６７〜７７８（１９８４）の７７７を参照のこと。

【０１３７】 本発明は、配列番号２または配列番号３９のアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドのエピトープ、またはＡＴＣＣ受託番号９７６８９または９７４８３として同
定される寄託されたクローンに含まれるポリヌクレオチド配列によって、もしく
は配列番号１または配列番号３８の配列の相補物にハイブリダイズするポリヌク
レオチドによってコードされるポリペプチド配列のエピトープ、または上記で規
定されたようなストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下もしくはより
低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下でＡＴＣＣ寄託番号９
７６８９または９７４８３として同定された寄託されたクローン中に含まれるポ
リヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列のエピトープを含む
か、あるいはそれらからなるポリペプチドを含む。本発明はさらに、本発明のポ
リペプチド配列（例えば、配列番号１または配列番号３８で開示された配列）の
エピトープをコードするポリヌクレオチド配列、本発明のエピトープをコードす
るポリヌクレオチド配列の相補鎖のポリヌクレオチド配列、および上記で定義さ
れたストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下またはより低いストリン
ジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で相補鎖にハイブリダイズするポリ
ヌクレオチド配列を含む。

【０１３８】 用語「エピトープ」とは、本明細書中で使用される場合、動物において、好ま
しくは哺乳動物において、そして最も好ましくはヒトにおいて抗原性活性または
免疫原性活性を有するポリペプチドの部分をいう。好ましい実施形態において、
本発明は、エピトープを含むポリペプチド、およびこのポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドを含む。「免疫原性エピトープ」とは、本明細書中で使用さ
れる場合、当該分野で公知の任意の方法によって決定されるような（例えば、下
記に記載される抗体を産生するための方法による）、動物における抗体応答を誘
発するタンパク質の一部として定義される（例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３９９８−４００２（１９８３
）を参照のこと）。用語「抗原性エピトープ」とは、本明細書中で使用される場
合、当該分野で周知の任意の方法（例えば、本明細書中に記載される免疫アッセ
イによる）によって決定されるような、抗体がその抗原に免疫特異的に結合し得
るタンパク質の一部として定義される。免疫特異的結合は、非特異的結合は除外
するが、他の抗原との交差反応を除外する必要はない。抗原性エピトープは、免
疫原性である必要はない。

【０１３９】 エピトープとして機能するフラグメントは、任意の従来の方法によって産生さ
れ得る。（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ８２：５１３１−５１３５（１９８５）を参照のこと。これはさらに
、米国特許第４，６３１，２１１号に記載される）。

【０１４０】 本発明においては、抗原性エピトープは、好ましくは、少なくとも４、少なく
とも５、少なくとも６、少なくとも７アミノ酸配列を含み、より好ましくは、少
なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０
、少なくとも２５、そして最も好ましくは約１５アミノ酸と約３０アミノ酸との
間の配列を含む。免疫原性エピトープまたは抗原性エピトープを含有する好まし
いポリペプチドは、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４
５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１０
０アミノ酸残基の長さである。抗原性エピトープは、有用である（例えば、エピ
トープに特異的に結合する抗体（モノクローナル抗体を含む）を惹起するため）
。抗原性エピトープは、イムノアッセイにおいて、標的分子として使用され得る
。（例えば、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７−７７８（１９８４）；
Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９：６６０−６６６（１９８３）
を参照のこと）。

【０１４１】 同様に、免疫原性エピトープを使用して、例えば、当該分野で周知の方法に従
う抗体を誘導し得る。（例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、前出；Ｗｉｌｓｏｎら
，前出；Ｃｈｏｗら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：
９１０−９１４；およびＢｉｔｔｌｅら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３
４７−２３５４（１９８５）を参照のこと）。好ましい免疫原性エピトープは、
分泌タンパク質を含む。１つ以上の免疫原性エピトープを含むポリペプチドは、
キャリアタンパク質（例えば、アルブミン）とともに動物系（例えば、ウサギま
たはマウス）に対する抗体応答を誘発するために提示され得るか、またはこのポ
リペプチドが十分に長い場合（少なくとも約２５アミノ酸）、そのポリペプチド
はキャリアなしで提示され得る。しかし、８〜１０個程度の少なさのアミノ酸を
含む免疫原性エピトープは、少なくとも変性ポリペプチド中の直鎖状エピトープ
に結合し得る抗体を惹起するには十分であることが示されている（例えば、ウェ
スタンブロッティングにおいて）。

【０１４２】 ＡＩＭ ＩＩ特異的抗体を産生するために使用され得る、抗原性ポリペプチド
または抗原性ペプチドの限定されない例は、以下を含む：図１ＡおよびＢ（配列
番号２）におけるアミノ酸残基約１３〜約２０を含むポリペプチド、あるいはそ
れらからなるポリペプチド；図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）におけるアミノ酸
残基約２３〜約３６を含むポリペプチド、あるいはそれらからなるポリペプチド
；図１ＡおよびＢ（配列番号２）におけるアミノ酸残基約６９〜約７９を含むポ
リペプチド、あるいはそれらからなるポリペプチド；図１ＡおよびＢ（配列番号
２）におけるアミノ酸残基約８５〜約９４を含むポリペプチド、あるいはそれら
からなるポリペプチド；図１ＡおよびＢ（配列番号２）におけるアミノ酸残基約
１６７〜約１７８を含むポリペプチド、あるいはそれらからなるポリペプチド；
図１ＡおよびＢ（配列番号２）におけるアミノ酸残基約１８４〜約１９６を含む
ポリペプチド、あるいはそれらからなるポリペプチド；ならびに図１ＡおよびＢ
（配列番号２）におけるアミノ酸残基約２２１〜約２３３を含むポリペプチド、
あるいはそれらからなるポリペプチド。この文脈において「約（おおよそ）」は
、特に記載された範囲（いずれかの末端もしくは両方の末端において、これより
数個（５、４、３、２、または１）のアミノ酸だけ大きいかまたは小さな範囲）
を含む。上記のように、本発明者らは、上記のポリペプチドフラグメントがＡＩ
Ｍ ＩＩタンパク質の抗原性領域であることを決定した。これらのポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。

【０１４３】 本発明のエピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、任意の従来の手段に
よって産生され得る。Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．Ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏ
ｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉ
ｓ ｏｆ ｌａｒｇｅ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｓｐｅｃｉ
ｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ−ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎｔｅｒａｃｔｉ
ｏｎ ａｔ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ａｍｉｎｏ
ａｃｉｄｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：５１３１
〜５１３５（１９８５）。この「Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ
Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＳＭＰＳ）」プロセスは、Ｈｏｕｇｈ
ｔｅｎら（１９８６）に対する米国特許第４，６３１，２２１号において、さら
に記載される。

【０１４４】 本発明のエピトープ保有ポリペプチドは、当該分野で周知の方法に従って抗体
を誘導するために使用され得る。これらの周知の方法としては、インビボ免疫、
インビトロ免疫、およびファージディスプレイ法が挙げられるが、それらに限定
されない。例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、前出；Ｗｉｌｓｏｎら、前出、およ
びＢｉｔｔｌｅら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、６６：２３４７−２３５４（１
９８５）を参照のこと。インビボ免疫を使用する場合、動物を遊離ペプチドを用
いて免疫し得る；しかし、抗ペプチド抗体力価は、高分子キャリア（例えば、キ
ーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）または破傷風トキソイド）にペプチ
ドを結合させることによりブーストされ得る。例えば、システイン残基を含むペ
プチドは、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｍ
ＢＳ）のようなリンカーを用いてキャリアに結合され得る。その一方、他のペプ
チドは、より一般的な結合剤（例えば、グルタルアルデヒド）を用いてキャリア
に結合され得る。ウサギ、ラット、およびマウスのような動物は、遊離のペプチ
ドまたはキャリア結合ペプチドのいずれかを用いて、例えば、約１００μｇのペ
プチドまたはキャリアタンパク質およびフロイントアジュバントまたは免疫応答
を刺激することが公知である他のアジュバントを含むエマルジョンを腹腔内注射
および／または皮内注射することにより免疫される。いくつかのブースター注射
が、抗ペプチド抗体の有用な力価を提供するために、例えば、約２週間の間隔で
、必要とされ得る。この力価は、例えば、固体表面に吸着した遊離のペプチドを
用いるＥＬＩＳＡアッセイにより検出され得る。免疫した動物由来の血清中の抗
ペプチド抗体の力価は、抗ペプチド抗体の選択（例えば、当該分野で周知の方法
に従う固体支持体上のペプチドへの吸着および選択された抗体の溶出による）に
より上昇し得る。

【０１４５】 当業者に理解されるように、そして上記で考察されるように、免疫原性エピト
ープまたは抗原性エピトープを含む本発明のポリペプチドは、他のポリペプチド
配列に融合され得る。例えば、本発明のポリペプチドは、免疫グロブリン（Ｉｇ
Ａ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）の定常ドメインまたはそれらの部分（ＣＨ１、Ｃ
Ｈ２、ＣＨ３、またはそれらの任意の組み合わせ、およびこれらの部分）と融合
し得、これがキメラポリペプチドを生じる。このような融合タンパク質は、精製
を容易にし得、そしてインビボにおける半減期を増加し得る。このことは、ヒト
ＣＤ４ポリペプチドの最初の２つのドメインおよび哺乳動物の免疫グロブリンの
重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質について
示された。例えば、ＥＰ ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕ
ｒｅ，３３１：８４−８６（１９８８）を参照のこと。ジスルフィド架橋二量体
構造を有するＩｇＧ融合タンパク質はまた、そのＩｇＧ部分ジスルフィド結合に
起因して、単量体ポリペプチドまたはそれらのフラグメント単独よりも、他の分
子の結合および中和においてより効果的であることが見出された。例えば、Ｆｏ
ｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２７０：３９５８−３９６４
（１９９５）を参照のこと。上記のエピトープをコードする核酸はまた、エピト
ープタグ（例えば、血球凝集素（「ＨＡ」）タグまたはフラッグタグ（ｆｌａｇ
ｔａｇ））として目的の遺伝子と組換えられ、発現されたポリペプチドの検出
および精製を補助し得る。例えば、Ｊａｎｋｎｅｃｈｔらによって記載された系
は、ヒト細胞株において発現される非変性融合タンパク質の迅速な精製を可能に
する（Ｊａｎｋｎｅｃｈｔら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８８：８９７２−８９７）。この系において、目的の遺伝子は、遺
伝子のオープンリーディングフレームが、６つのヒスチジン残基からなるアミノ
末端タグと翻訳で融合されるように、ワクシニア組換えプラスミド中にサブクロ
ーンされる。このタグは、融合タンパク質についてのマトリックス結合ドメイン
として働く。組換えワクシニアウイルスに感染した細胞由来の抽出物は、Ｎｉ²⁺ ニトリロ三酢酸アガロースカラムに充填され、そしてヒスチジンタグ化したタン
パク質が、イミダゾール含有緩衝液を用いて選択的に溶出され得る。

【０１４６】 本発明のさらなる融合タンパク質は、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッ
フリング、エキソンシャッフリング、および／またはコドンシャッフリング（総
称して「ＤＮＡシャッフリング」といわれる）の技術を通じて生成され得る。Ｄ
ＮＡシャッフリングを使用して、本発明のポリペプチドの活性を調節し得、この
ような方法を用いて、変化した活性を有するポリペプチド、ならびにそのポリペ
プチドのアゴニストおよびアンタゴニストを生成し得る。一般には、米国特許第
５，６０５，７９３号；同第５，８１１，２３８号；同第５，８３０，７２１号
；同第５，８３４，２５２号；および同第５，８３７，４５８号、ならびにＰａ
ｔｔｅｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７２４−
３３（１９９７）；Ｈａｒａｙａｍａ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．
１６（２）：７６−８２（１９９８）；Ｈａｎｓｓｏｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．２８７：２６５−７６（１９９９）；ならびにＬｏｒｅｎｚｏおよびＢｌａ
ｓｃｏ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４（２）：３０８−１３（１９９８）
（これらの特許および刊行物の各々は、本明細書によってその全体が参考として
援用される）を参照のこと。１つの実施形態において、配列番号１に対応するポ
リヌクレオチドおよびこれらのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプ
チドの改変は、ＤＮＡシャッフリングにより達成され得る。ＤＮＡシャッフリン
グは、相同組換えまたは部位特異的組換えにより、２つ以上のＤＮＡセグメント
をアセンブリして、ポリヌクレオチド配列における変化を産生することを含む。
別の実施形態において、本発明のポリヌクオチドまたはコードされるポリペプチ
ドは、組換え前に、エラープローンＰＣＲ、ランダムヌクレオチド挿入または他
の方法による、ランダムな変異誘発に供されることによって改変され得る。別の
実施形態において、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの１つ
以上の成分、モチーフ、セクション（ｓｅｃｔｉｏｎ）、部分、ドメイン、フラ
グメントなどは、１つ以上の異種分子の１つ以上の成分、モチーフ、セクション
、部分、ドメイン、フラグメントなどと組み換えられ得る。

【０１４７】 免疫原性エピトープを含むアミノ酸配列の例の列挙を表２に示す。これは、表
２がＪａｍｅｓｏｎおよびＷｏｌｆ，Ｃｏｍｐ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４
：１８１〜１８６（１９８８）（この引用文献はその全体が参考として援用され
ている）のアルゴリズムを用いて最高の抗原性を有することが予想されたエピト
ープを含むアミノ酸残基のみを列挙することが指摘されている。Ｊａｍｅｓｏｎ
−Ｗｏｌｆ抗原性分析を、デフォルトパラメーターを用いるコンピュータープロ
グラムＰＲＯＴＥＡＮ（Ｐｏｗｅｒ ＭａｃＩｎｔｏｓｈ用，Ｖｅｒｓｉｏｎ
３．１１ ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，１２２８ Ｓｏｕｔｈ Ｐａｒｋ Ｓｔ
ｒｅｅｔ Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて実行した。表２および表２に列挙さ
れないポリペプチドの一部は、非免疫性とは考えられない。表２の免疫原性エピ
トープは、例示的な列挙であって、排他的な列挙ではない。なぜなら、他の免疫
原性エピトープが、使用される特定のアルゴリズムによって認識されないだけで
あるからである。他の免疫原性エピトープを含むアミノ酸残基は、Ｊａｍｅｓｏ
ｎ−Ｗｏｌｆ分析に類似のアルゴリズムを用いて、または当該分野で公知の方法
を用いる抗原性反応についてのインビボ試験により慣用的に決定され得る。例え
ば、Ｇｅｙｓｅｎら、前出；米国特許第４，７０８，７８１号；同第５，１９４
，３９２号；同第４，４３３，０９２号；および同第５，４８０，９７１号（こ
れらの参考文献はその全体が参考として援用される）を参照のこと。

【０１４８】 表２のアミノ酸配列が免疫原性エピトープを含むことが特に示されている。表
２は、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ分析により決定される免疫原性エピトープの重
要な残基のみを列挙している。このように、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およ
びＣ末端の両方のいずれかの末端におけるさらなる隣接する残基を配列に付加し
、本発明のエピトープ保有ポリペプチドを生成し得る。従って、表２の免疫原性
エピトープは、さらなるＮ末端アミノ酸残基またはＣ末端アミノ酸残基を含み得
る。さらなる隣接するアミノ酸残基は、本発明のポリペプチドからの連続した隣
接するＮ末端配列および／またはＣ末端配列、異種ポリペプチド配列であっても
よいし、あるいは本発明のポリペプチドおよび異種ポリペプチド配列からの連続
した隣接する配列の両方を含み得る。

【０１４９】 免疫原性エピトープ保有フラグメントおよび抗原性エピトープ保有フラグメン
トは、上記のような連続したアミノ酸残基の数、または配列番号２のアミノ酸配
列のこれらのフラグメントのＮ末端位置およびＣ末端位置によりさらに特定され
得る。例えば、少なくとも７または少なくとも１５の連続したアミノ酸残基長の
フラグメントが配列番号２のアミノ酸配列上で占有し得る、Ｎ末端位置およびＣ
末端位置のあらゆる組み合わせは、本発明に含まれる。再度、「少なくとも７の
連続したアミノ酸残基長」は、７アミノ酸残基長、または７アミノ酸と本発明の
全長ポリペプチドのアミノ酸残基数との間の任意の整数を意味する。詳細には、
７と完全長ポリペプチドのアミノ酸残基数との間のそれぞれの整数およびあらゆ
る整数が、本発明に含まれる。

【０１５０】 本発明の免疫原性エピトープ保有ポリペプチドおよび抗原性エピトープ保有ポ
リペプチドは、例えば、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体を作製す
るため、および本発明のポリペプチドを検出するためのイムノアッセイにおいて
有用である。この抗体は、例えば、本発明のポリペプチドのアフニティー精製に
有用である。この抗体はまた、種々の定性的イムノアッセイまたは定量的イムノ
アッセイにおいて、特に当該分野で公知の方法を用いる本発明のポリペプチドの
ために、慣用的に用いられ得る。例えば、Ｈａｒｌｏｗら、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥ
Ｓ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；第２版、１９８８）を参照の
こと。

【０１５１】 本発明のエピトープ保有ポリペプチドは、当該分野で公知の合成方法および組
換え方法を含むポリペプチドの作製のための任意の従来の手段により産生され得
る。例えば、エピトープ保有ペプチドは、化学合成の公知の方法を用いて合成さ
れ得る。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎは、多数のペプチド、例えば、１０〜２０ｍ
ｇの２４８の個々のペプチドおよびＨＡ１ポリペプチドのセグメントの単一のア
ミノ酸改変体を示す別の１３残基ペプチド（これら全ては、４週未満で調製され
そして特徴付けされた（ＥＬＩＳＡ型結合研究により））の合成のための簡易な
方法を記載している（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，８２：５１３１〜５１３５（１９８５））。この「同時複数ペプチ
ド合成（Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙ
ｎｔｈｅｓｉｓ）（ＳＭＰＳ）」プロセスは、Ｈｏｕｇｈｔｅｎおよび共働研究
者（１９８６）の米国特許第４，６３１，２１１号にさらに記載されている。こ
の手順において、種々のペプチドの固相合成のための個別の樹脂が、別の溶媒透
過性パケットに含まれる。これは固相方法に関与する多数の同一の反復性工程の
最適の使用を可能にする。完全なマニュアル手順は、同時に実行される５００〜
１０００以上の合成を可能にする（Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：５１３１〜５１３５、５１３４（１９
８５））。

【０１５２】 本発明のエピトープ保有ポリペプチドは、インビボ免疫、インビトロ免疫、お
よびファージディスプレイ方法が挙げられるがこれらに限定されない、当該分野
で周知の方法に従って抗体を誘導するために用いられる。例えば、Ｓｕｔｃｌｉ
ｆｆｅら、前出；Ｗｉｌｓｏｎら、前出およびＢｉｔｔｌｅら．，Ｊ．Ｇｅｎ．
Ｖｉｒｏｌ．６６：２３４７〜２３５４（１９８５）を参照のこと。インビボ免
疫を用いる場合、動物は、遊離のペプチドで免疫され得る；しかし、抗ペプチド
抗体の力価は、高分子キャリア（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（
ＫＬＨ）または破傷風毒素）に対するペプチドの結合によりブーストされ得る。
例えば、ペプチド含有システイン残基は、リンカー（例えば、Ｎ−マレイミドベ
ンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ））を用いてキャリ
アに結合され得るが、一方、他のペプチドは、より一般的な結合剤（例えば、グ
ルタルアルデヒド）を用いてキャリアに結合され得る。ウサギ、ラット、および
マウスのような動物は、遊離のペプチドまたはキャリア結合ペプチドのいずれか
を用いて、例えば、エマルジョン（約１００μｇのペプチドまたはキャリアタン
パク質およびフロイントアジュバントを含む）の腹腔内注射および／または皮内
注射により免疫される。いくつかのブースター注射が、抗ペプチド抗体の有用な
力価を提供するために、例えば、約２週間の間隔で、必要とされ得る。この力価
は、例えば、固相表面に吸着した遊離のペプチドを用いるＥＬＩＳＡアッセイに
より検出され得る。免疫した動物由来の血清中の抗ペプチド抗体の力価は、抗ペ
プチド抗体の選択（例えば、当該分野で周知の方法に従い選択された抗体の固体
支持体および溶出物へのペプチドの吸着による）により上昇し得る。

【０１５３】 当業者に理解されるように、そして上記で考察されるように、免疫原性エピト
ープまたは抗原性エピトープを含む本発明のポリペプチドは、異種ポリペプチド
配列に融合され得る。例えば、本発明のポリペプチドは、免疫グロブリン（Ｉｇ
Ａ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）の定常ドメインまたはそれらの部分（ＣＨ１、Ｃ
Ｈ２、ＣＨ３、それらの任意の組み合わせ（全ドメインおよびそれらの部分の両
方を含む））と融合し得、これがキメラポリペプチドを生じる。これらの融合タ
ンパク質は、精製を容易にし、そしてインビボにおいて増加した半減期を示す。
これは、例えば、ヒトＣＤ４ポリペプチドの最初の２つのドメインからなるキメ
ラタンパク質、および哺乳動物の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の
種々のドメインを示す。例えば、ＥＰＡ ０，３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃ
ｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，３３１：８４〜８６（１９８８）を参照のこと。Ｉｇ
Ｇ部分に起因してジスルフィド架橋二量体構造を有する融合タンパク質はまた、
単量体ポリペプチドまたはそれらの単独のフラグメントよりも、他の分子の結合
および中和においてより効果的であり得る。例えば、Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓ
ら．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７０：３９５８〜３９６４（１９９５）を参照
のこと。上記のエピトープをコードする核酸はまた、エピトープタグとして目的
の遺伝子と組換えられ、発現されたポリペプチドの検出および精製を補助し得る
。

【０１５４】 さらに、本発明のタンパク質は、当該分野で公知の技術を使用して化学的に合
成され得る（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，１９８３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔ
ｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｗ．
Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．およびＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ，Ｍら、
Ｎａｔｕｒｅ，３１０：１０５−１１１（１９８４）を参照のこと）。例えば、
本発明のＡＩＭ ＩＩポリペプチのフラグメントに対応するポリペプチドは、ペ
プチドシンセサイザーの使用によって合成され得る。さらに、所望される場合、
非古典的アミノ酸または化学的アミノ酸アナログが、ＡＩＭ ＩＩのポリペプチ
ド配列に置換または付加として導入され得る。非古典的アミノ酸としては、一般
的なアミノ酸のＤ−異性体、２，４−ジアミノ酪酸、ａ−アミノイソ酪酸、４−
アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、α−Ａｂｕ、α−Ａｈｘ、６−アミノヘ
キサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン
、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、
ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フ
ェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、α−アラニン、フルオロアミノ酸、
デザイナーアミノ酸（例えば、α−メチルアミノ酸）、Ｃａ−メチルアミノ酸、
Ｎａ−メチルアミノ酸、および一般的なアミノ酸アナログが挙げられるがこれら
に限定されない。さらに、アミノ酸は、Ｄ（右旋性）またはＬ（左旋性）であり
得る。

【０１５５】 天然に存在しない改変体は、当該分野において公知の変異誘発技術（オリゴヌ
クレオチド媒介変異誘発、アラニン走査、ＰＣＲ変異誘発、部位特異的変異誘発
（例えば、Ｃａｒｔｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：４３３１（
１９８６）；およびＺｏｌｌｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：６
４８７（１９８２）を参照のこと）、カセット変異誘発（例えば、Ｗｅｌｌｓら
、Ｇｅｎｅ ３４：３１５（１９８５）を参照のこと）、制限選択変異誘発（例
えば、Ｗｅｌｌｓら、Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ
ＳｅｒＡ ３１７：４１５（１９８６）参照のこと）を含むが、これらに限定さ
れない）を使用して産生され得る。

【０１５６】 本発明は、翻訳の間または翻訳後に、例えば、グリコシル化、アセチル化、リ
ン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質
分解切断、抗体分子または他の細胞性リガンドへの結合などによって示差的に改
変されるＡＩＭ ＩＩのポリペプチドをさらに含む。任意の多数の化学的改変は
、以下を含むがこれらに限定されない公知の技術によって実施され得る：臭化シ
アン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ₄
による特異的化学的切断；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカマイシ
ンの存在下での代謝合成；など。

【０１５７】 本発明によって含まれるさらなる翻訳後修飾としては、例えば、以下などが挙
げられる：Ｎ結合型もしくはＯ結合型の炭水化物鎖（Ｎ末端またはＣ末端のプロ
セシング）、アミノ酸バックボーンへの化学部分の結合、Ｎ結合型もしくはＯ結
合型の炭水化物鎖の化学修飾、および原核生物宿主細胞発現の結果としてのＮ末
端メチオニン残基の付加もしくは欠失。このポリペプチドはまた、検出可能な標
識（例えば、酵素標識、蛍光標識、同位体標識または親和性標識）を用いて改変
して、このタンパク質の検出および単離が可能にされ得る。

【０１５８】 本発明によってまた、さらなる利点（例えば、このポリペプチドの溶解度、安
定性および循環時間の増加、または免疫原性の減少）を提供し得る、ＡＩＭ Ｉ
Ｉのポリペプチドの化学修飾誘導体が提供される（米国特許第４，１７９，３３
７号を参照のこと）。誘導体化のための化学部分は、水溶性ポリマー（例えば、
ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマ
ー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコールなど）
から選択され得る。このポリペプチドは、この分子内のランダムな位置で、また
はこの分子内の所定の位置で改変され得、そして１、２、３以上の結合した化学
部分を含み得る。

【０１５９】 このポリマーは、任意の分子量のポリマーであり得、そして分枝状であっても
非分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールに関しては、好ましい分子量
は、取り扱いおよび製造の容易さのために、約１ｋＤａと約１００ｋＤａとの間
（用語「約」は、ポリエチレングリコールの調製において、いくつかの分子は示
した分子量よりも重く、いくつかは示した分子量よりも軽いことを示す）である
。所望の治療的プロフィール（例えば、所望される持続放出の持続時間、ある場
合には生物学的活性に対する効果、取り扱いの容易さ、抗原性の程度または抗原
性がないこと、および治療タンパク質またはアナログに対するポリエチレングリ
コールの他の公知の効果）に依存して、他のサイズが用いられ得る。例えば、ポ
リエチレングリコールは、約２００、５００、１０００、１５００、２０００、
２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６
０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５
００、１０，０００、１０，５００、１１，０００、１１，５００、１２，００
０、１２，５００、１３，０００、１３，５００、１４，０００、１４，５００
、１５，０００、１５，５００、１６，０００、１６，５００、１７，０００、
１７，５００、１８，０００、１８，５００、１９，０００、１９，５００、２
０，０００ 、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、５
０，０００、５５，０００、６０，０００、６５，０００、７０，０００、７５
，０００、８０，０００、８５，０００、９０，０００、９５，０００、または
１００，０００ｋＤａの平均分子量を有し得る。

【０１６０】 上記のように、ポリエチレングリコールは、分枝構造を有していてもよい。分
枝ポリエチレングリコールは、例えば、以下に記載される：米国特許第５，６４
３，５７５号；Ｍｏｒｐｕｒｇｏら、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌ．５６：５９−７２（１９９６）；Ｖｏｒｏｂｊｅｖら、Ｎｕｃｌｅｏ
ｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １８：２７４５−２７５０（１９９９）
；およびＣａｌｉｃｅｔｉら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１０：６３８−
６４６（１９９９）（これらの各々の開示は、本明細書中において参考として援
用される）。

【０１６１】 ポリエチレングリコール分子（または他の化学的部分）は、このタンパク質の
機能的ドメインまたは抗原性ドメインに対する効果を考慮してタンパク質に結合
されるべきである。当業者に利用可能な多数の結合方法が存在する（例えば、本
明細書中に参考として援用される、ＥＰ ０ ４０１ ３８４（Ｇ−ＣＳＦにＰ
ＥＧを結合する）、Ｍａｌｉｋら，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０２８−
１０３５（１９９２）（塩化トレシルを用いたＧＭ−ＣＳＦのペグ化（ｐｅｇｙ
ｌａｔｉｏｎ）を報告する）もまた参照のこと）。例えば、ポリエチレングリコ
ールは、反応性基（例えば、遊離のアミノ基またはカルボキシル基）によってア
ミノ酸残基を介して共有結合され得る。反応性基は、活性化ポリエチレングリコ
ール分子が結合し得る基である。遊離のアミノ基を有するアミノ酸残基としては
、リジン残基およびＮ末端アミノ酸残基が挙げられ得る；遊離のカルボキシル基
を有するアミノ酸残基としては、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基および
Ｃ末端アミノ酸残基が挙げられ得る。スルフヒドリル残基もまた、ポリエチレン
グリコール分子を結合するための反応性基として用いられ得る。治療目的のため
に好ましいのは、アミノ基での結合、例えば、Ｎ末端またはリジン基での結合で
ある。

【０１６２】 上記で示唆されるように、ポリエチレングリコールは、多くのアミノ酸残基の
いずれかへの結合を介してタンパク質に結合され得る。例えば、ポリエチレング
リコールは、リジン残基、ヒスチジン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸
残基、またはシステイン残基への共有結合を介してタンパク質に連結され得る。
１つ以上の反応化学系を用いて、タンパク質の特定のアミノ酸残基（例えば、リ
ジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはシステイン）またはタ
ンパク質の１つより多くの型のアミノ酸残基（例えば、リジン、ヒスチジン、ア
スパラギン酸、グルタミン酸、システインおよびそれらの組み合わせ）にポリエ
チレングリコールを結合し得る。

【０１６３】 Ｎ末端で化学修飾されたタンパク質を具体的に所望し得る。ポリエチレングリ
コールを本発明の組成の例示として用いて、種々のポリエチレングリコール分子
から（分子量、分枝などによって）、反応混合物中でのポリエチレングリコール
分子のタンパク質（またはペプチド）分子に対する比、行われるべきペグ化反応
の型、および選択されたＮ末端ペグ化タンパク質の獲得方法を選択し得る。Ｎ末
端ペグ化調製物の獲得方法（すなわち、必要な場合、この部分を他のモノペグ化
部分から分離すること）は、ペグ化タンパク質分子の集団からの、Ｎ末端ペグ化
物質の精製により行われ得る。Ｎ末端修飾で化学修飾された選択的タンパク質は
、特定のタンパク質における誘導体化に利用可能な異なる型の第１級アミノ基（
リジン対Ｎ末端）の示差的反応性を利用する還元的アルキル化によって達成され
得る。適切な反応条件下では、カルボニル基含有ポリマーを用いた、Ｎ末端での
タンパク質の実質的に選択的な誘導体化が達成される。

【０１６４】 上記のように、本発明のタンパク質のペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）は、か
なり多数の手段によって、達成され得る。例えば、ポリエチレングリコールは、
直接的または介在性リンカーによってのいずれかによってタンパク質に接続され
得る。タンパク質にポリエチレングリコールを接続させるためのリンカーレス（
ｌｉｎｋｅｒｌｅｓｓ）システムは、Ｄｅｌｇａｄｏら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔ
ｈｅｒａ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｒ Ｓｙｓ．９：２４９−３０４（１９９２）
；Ｆｒａｎｃｉｓら、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｊ．ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌ．６８：１−１
８（１９９８）；米国特許第４，００２，５３１号；米国特許第５，３４９，０
５２号；ＷＯ９５／０６０５８；およびＷＯ９８／３２４６６に記載される。こ
れらの各々の開示は、本明細書中に参考として援用される。

【０１６５】 介在性リンカーを伴わずに、ポリエチレングリコールを直接、タンパク質のア
ミノ酸残基に接続させるための一つの系は、トレシル化（ｔｒｅｓｙｌａｔｅｄ
）されたＭＰＥＧを利用する。トレシル化されたＭＰＥＧは、塩化トレシル（Ｃ
ｌＳＯ₂ＣＨ₂ＣＦ₃）を使用するモノメトキシ（ｍｏｎｍｅｔｈｏｘｙ）ポリエ
チレングリコール（ＭＰＥＧ）の改変によって生成される。トレシル化されたＭ
ＰＥＧを用いるタンパク質の反応の際に、ポリエチレングリコールが、直接タン
パク質のアミン基と接続される。従って、本発明は、２，２，２−トリフルオロ
エタン（ｔｒｉｆｌｕｏｒｅｏｔｈａｎｅ）スルホニル基を有するポリエチレン
グリコール分子と本発明のタンパク質を反応させることによって産生されるタン
パク質ポリエチレングリコール結合体を含む。

【０１６６】 ポリエチレングリコールはまた、多数の異なる介在性リンカーを使用して、タ
ンパク質と接続され得る。例えば、米国特許第５，６１２，４６０号（この全体
の開示は、本明細書中で参考として援用される）は、タンパク質とポリエチレン
グリコールを連結するためのウレタンリンカーを開示する。タンパク質−ポリエ
チレングリコール結合体（ここで、ポリエチレングリコールは、リンカーによっ
てタンパク質と接続される）はまた、化合物（例えば、ＭＰＥＧ−スクシンイミ
ジルスクシネート、１，１’−カルボニルジイミダゾールで活性化されたＭＰＥ
Ｇ、ＭＰＥＧ−２，４，５−トリクロロペニルカーボネート、ＭＰＥＧ−ｐ−ニ
トロフェノールカーボネート、および種々のＭＰＥＧスクシネート誘導体）とタ
ンパク質との反応によって、産生され得る。多数のさらなるポリエチレングリコ
ール誘導体およびポリエチレングリコールをタンパク質に接続するための反応化
学は、ＷＯ９８／３２４６６に記載され、その全体の開示は、本明細書中に参考
として援用される。本明細書中で設定された反応化学を使用して産生されるペグ
化タンパク質産物は、本発明の範囲内に含まれる。

【０１６７】 本発明の各タンパク質に接続されるポリエチレングリコール部分の数（すなわ
ち、置換の程度）はまた、変動し得る。例えば、本発明のペグ化タンパク質は、
平均して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１７、２
０、以上のポリエチレングリコール分子と連結され得る。同様に、タンパク質分
子当たりの置換の平均程度は、例えば、１−３、２−４、３−５、４−６、５−
７、６−８、７−９、８−１０、９−１１、１０−１２、１１−１３、１２−１
４、１３−１５、１４−１６、１５−１７、１６−１８、１７−１９、または１
８−２０のポリエチレングリコール部分の範囲内である。置換の程度を決定する
ための方法は、例えば、Ｄｅｌｇａｄｏら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａ．Ｄ
ｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓ．９：２４９−３０４（１９９２）において議
論される。

【０１６８】 （抗体） さらに、本発明は、（特異的な抗体抗原結合をアッセイするための当該分野で
周知のイムノアッセイによって決定されるような）本発明のポリペプチド、好ま
しくはエピトープ、に免疫特異的に結合する抗体およびＴ細胞抗原レセプター（
ＴＣＲ）に関する。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体
、多重特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ
フラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産
生されるフラグメント、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗
体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）、および上記のいずれかのエピトープ結合フラグ
メントを含むが、限定されない。本明細書中で使用される場合、用語「抗体」とは
、免疫グロブリン分子および免疫グロリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわ
ち、免疫特異的に抗原に結合する抗原結合部位を含む分子をいう。本発明の免疫
グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、
ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ１、
ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）または任意のサブク
ラスであり得る。

【０１６９】 最も好ましくは、この抗体は、本発明のヒト抗原結合抗体フラグメントであり
、これには、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃ
Ｆｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）ならびにＶＬまたはＶ
Ｈドメインのいずれかを含むフラグメントが挙げられるがこれらに限定されない
。単鎖抗体を含む抗原結合抗体フラグメントは、可変領域を単独で、または以下
の全体もしくは部分と組み合わせて含み得る：ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、Ｃ
Ｈ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン。また、可変領域とヒンジ領域、ＣＨ１ドメ
イン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインとの任意の組み合わせもまた含む抗
原結合フラグメントがまた本発明に含まれる。本発明の抗体は、鳥類および哺乳
動物を含む任意の動物起点由来であり得る。好ましくは、この抗体は、ヒト、ネ
ズミ（ｍｕｒｉｎｅ）、ロバ、シップウサギ（ｓｈｉｐ ｒａｂｂｉｔ）、ヤギ
、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリである。本明細書中で使用される
場合、「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、
そしてヒト免疫グロブリンライブラリーまたは１つ以上のヒト免疫グロブリンに
ついてトランスジェニックであり、そして内因性免疫グロブリンを発現しない動
物から単離さた抗体（下に記載のように、および例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａ
ｔｉらによる米国特許第５，９３９，５９８号において記載のような）を含む。

【０１７０】 本発明の抗体は、一重特異的、二重特異的、三重特異的またはより多くの多重
特異性の抗体であり得る。多重特異的な抗体は、本発明のポリペプチドの異なる
エピトープに対して特異的であり得るか、または本発明のポリペプチドおよび異
種のエピトープ（例えば、異種ポリペプチドもしくは固体支持体物質）、の両方
に特異的であり得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ ９３／１７７１５；同ＷＯ ９
２／０８８０２；同ＷＯ ９１／００３６０；同ＷＯ ９２／０５７９３；Ｔｕ
ｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９（１９９１）；米国特許第４
，４７４，８９３号、同第４，７１４，６８１号、同第４，９２５，６４８号、
同第５，５７３，９２０号、同第５，６０１，８１９号；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、
Ｊ．Ｉｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３（１９９２）を参照のこと。

【０１７１】 本発明の抗体は、これらが認識または特異的に結合する、本発明のポリペプチ
ドのエピトープまたは部分に関して記載または特定化され得る。このエピトープ
またはポリペプチドの部分は、例えば、Ｎ末端およびＣ末端位置によって、連続
するアミノ酸残基におけるサイズによって、または表および図に列挙されて本明
細書中に記載されるように特定され得る。本発明の任意のエピトープまたはポリ
ペプチドに特異的に結合する抗体はまた、排除され得る。従って、本発明は、本
発明のポリペプチドを特異的に結合し、そして本発明のポリペプチドの排除を可
能にする抗体を含む。

【０１７２】 本発明の抗体はまた、その交差反応性について記載または特定化され得る。本
発明のポリペプチドの任意の他のアナログ、オルソログまたはホモログを結合し
ない抗体が、含まれる。本発明のポリペプチドに対して少なくとも９５％、少な
くとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少な
くとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％および
少なくとも５０％の同一性（当該分野で公知の方法および本明細書中に記載され
る方法を用いて計算されるように）を有するポリペプチドを結合する抗体もまた
、本発明に含まれる。本発明のポリペプチドに対して９５％未満、９０％未満、
８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、
５５％未満および５０％未満の同一性（当該分野で公知の方法および本明細書中
に記載される方法を用いて計算されるように）を有するポリペプチドを結合しな
い抗体もまた、本発明に含まれる。さらに、ストリンジェントなハイブリダイゼ
ーション条件下（本明細書中で記載されるような）で本発明のポリヌクレオチド
にハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを結合
する抗体が、本発明に含まれる。本発明の抗体はまた、本発明のポリペプチドに
対するそれらの結合親和性について記載または特定化され得る。好ましい結合親
和性としては、５×１０^-2Ｍ未満、１０^-2Ｍ未満、５×１０^-3Ｍ未満、１０^-3Ｍ
未満、５×１０^-4Ｍ未満、１０^-4Ｍ未満、５×１０^-5Ｍ未満、１０^-5Ｍ未満、５
×１０^-6Ｍ未満、１０^-6Ｍ未満、５×１０^-7Ｍ未満、１０^-7Ｍ未満、５×１０^-8 Ｍ未満、１０^-8Ｍ未満、５×１０^-9Ｍ未満、１０^-9Ｍ未満、５×１０^-10Ｍ未満
、１０^-10Ｍ未満、５×１０^-11Ｍ未満、１０^-11Ｍ未満、５×１０^-12Ｍ未満、１
０^-12Ｍ未満、５×１０^-13Ｍ未満、１０^-13Ｍ未満、５×１０^-14Ｍ未満、１０^{-1 4} Ｍ未満、５×１０^-15Ｍ未満および１０^-15Ｍ未満の解離定数すなわちＫｄを有
する親和性が挙げられる。

【０１７３】 本発明はまた、競合性結合を決定するための当該分野で公知の任意の方法（例
えば、本明細書中で記載されるイムノアッセイ）によって決定されるような、本
発明のエピトープに対する抗体の結合を競合的に阻害する抗体を提供する。好ま
しい実施形態において、この抗体は、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少
なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％、エピトープへの
結合を競合的に阻害する。

【０１７４】 本発明の抗体は、本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストと
して作用し得る。例えば、本発明は、本発明のポリペプチドとのレセプター／リ
ガンド相互作用を部分的または完全にのいずれかで破壊する抗体を含む。本発明
はまた、リガンド結合を妨害しないがレセプター活性化を妨害するレセプター特
異的抗体の特徴を有する。レセプター活性化（すなわち、シグナル伝達）は、本
明細書中に記載の技術、そうでなければ、当該分野で公知の技術により決定され
得る。例えば、レセプター活性化は、レセプターのリン酸化（例えば、チロシン
またはセリン／トレオニン）、または免疫沈降それに続いてウェスタンブロット
分析（例えば、上記のような）によってその基質を検出することにより、決定さ
れ得る。特定の実施形態において、この抗体の非存在下で、リガンド活性または
レセプター活性を、その活性の少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくと
も７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％阻害する抗体が提供され
る。

【０１７５】 本発明はまた、リガンド結合およびレセプター活性化の両方を妨げるレセプタ
ー特異的抗体、ならびにレセプターリガンド複合体を認識し、そして好ましくは
、結合していないレセプターまたは結合していないリガンドを特異的に認識しな
いレセプター特異的抗体の特徴を有する。同様に、本発明は、リガンドと結合し
、そしてレセプターへのリガンドの結合を妨げる中和抗体、およびリガントと結
合し、それによりレセプター活性化を妨げるが、リガンドがレセプターを結合す
ることを妨げない抗体を含む。さらに、本発明は、レセプターを活性化する抗体
を含む。これらの抗体は、レセプターアゴニストとして作用し得、すなわち、リ
ガンド媒介レセプター活性化の生物学的活性化の全てまたはサブセットのいずれ
かを増強するかまたは活性化し得る。この抗体は、本明細書中に開示される本発
明のペプチドの特異的生物学的活性を含む生物学的活性についてのアゴニスト、
アンタゴニストまたは逆アゴニストとして特定化され得る。このように、本発明
は、さらに、本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストとして作
用する抗体に関連する。上記抗体アゴニストは、当該分野で公知の方法を用いて
作製され得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／４０２８１；米国特許第５，８１
１，０９７号；Ｄｅｎｇら、Ｂｌｏｏｄ ９２（６）：１９８１−１９８８（１
９９８）；Ｃｈｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８（１６）：３６６８−３６
７８（１９９８）；Ｈａｒｒｏｐら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（４）：１７
８６−１７９４（１９９８）；Ｚｈｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ：５８（１５）
：３２０９−３２１４（１９９８）；Ｙｏｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０
（７）：３１７０−３１７９（１９９８）；Ｐｒａｔら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ
．１１１（Ｐｔ２）：２３７−２４７（１９９８）；Ｐｉｔａｒｄら、Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０５（２）：１７７−１９０（１９９７）；Ｌ
ｉａｕｔａｒｄら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ９（４）：２３３−２４１（１９９７）
；Ｃａｒｌｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１７）：１１２９５−
１１３０１（１９９７）；Ｔａｒｙｍａｎら、Ｎｅｕｒｏｎ １４（４）：７５
５−７６２（１９９５）；Ｍｕｌｌｅｒら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ６（９）：１
１５３−１１６７（１９９８）；Ｂａｒｔｕｎｅｋら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ８（
１）：１４−２０（１９９６）（上記の文献は、全て、その全体が参考として本
明細書中に援用される）を参照のこと。

【０１７６】 本発明の抗体は、例えば、これらに限定されないが、本発明のポリペプチドを
精製し、検出し、そして標的化するために使用され得る。これらは、インビトロ
およびインビボの両方での診断方法および治療方法を含む。例えば、この抗体は
、生物学的サンプルにおける本発明のポリペプチドのレベルを定性的におよび定
量的に測定するためのイムノアッセイにおける使用を有する。例えば、Ｈａｒｌ
ｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，
第２版，１９８８）（本明細書中でその全体が参照として援用される）を参照の
こと。

【０１７７】 以下にさらに詳細に議論されるように、本発明の抗体は、単独または他の化合
物との組み合わせのいずれかで使用され得る。この抗体はさらに、ポリペプチド
または他の化合物へＮ末端でもしくはＣ末端で異種ポリペプチドに組換え的に融
合され得るか、または化学的に結合（共有結合および非共有結合を含む）され得
る。例えば、本発明の抗体は、検出アッセイにおける標識として有用な分子およ
び異種ポリペプチド、薬剤、または毒素のようなエフェクター分子へ組換え的に
融合または結合され得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０８４９５；ＷＯ９１
／１４４３８；ＷＯ８９／１２６２４；米国特許第５，３１４，９９５号；およ
び欧州特許第３９６，３８７号を参照のこと。

【０１７８】 本発明の抗体は、改変された（すなわち、共有結合性付着（ｃｏｖａｌｅｎｔ
ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）によって、抗体が抗イディオタイプ応答を産生するの
を妨げないように、抗体に対する任意の型の分子の共有結合性付着による）誘導
体を含む。例えば、制限されないが、抗体誘導体には、例えば、グリコシル化、
アセチル化、ぺグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）、リン酸化（ｐｈｏｓｐｈｙｌａ
ｔｉｏｎ）、アミド化、既知の保護基／ブロック基（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｇｒｏ
ｕｐ）による誘導体化、タンパク質分解性切断、細胞性リガンドまたは他のタン
パク質への連結などによって改変された抗体が挙げられる。多数の任意の化学的
改変が、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合
成などを含むが、これらに制限されない公知の技術によって実行され得る。さら
に、誘導体は、１つ以上の非古典的アミノ酸を含み得る。

【０１７９】 本発明の抗体は、当該分野で公知の任意の適切な方法によって産生され得る。
目的の抗原に対するポリクローナル抗体は、当該分野で周知の種々の手順によっ
て産生され得る。例えば、本発明のポリペプチドが種々の宿主動物（ウサギ、マ
ウス、ラットなどを含むがこれらに限定されない）に投与されて、抗原に対して
特異的なポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導し得る。種々のアジュバン
トが、宿主種に依存して、免疫学的応答を増加させるために使用され得、そして
フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル（
ｍｉｎｅｒａｌ ｇｅｌ）、リゾレシチンのような界面活性物質、プルロニック
（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、
キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（カ
ルメット−ゲラン杆菌）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ
のような潜在的に有用なヒトアジュバントを含むが、これらに限定されない。こ
のようなアジュバントはまた、当該分野で周知である。

【０１８０】 モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、およびファージディスプレ
イ技術、またはそれらの組み合わせの使用を含む、当該分野で公知の広範な種々
の技術を用いて調製され得る。例えば、モノクローナル抗体は、当該分野で公知
の以下に挙げられるハイブリドーマ技術を使用して産生され得、例えば、Ｈａｒ
ｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ
，第２版、１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ５６３−６
８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．１９８１）（上記の参考文献は、その全体が
参考として援用される）に教示される。本明細書中で使用される場合、用語「モ
ノクローナル抗体」とは、ハイブリドーマ技術を通して生成された抗体に限定さ
れない。用語「モノクローナル抗体」とは、任意の真核生物、原核生物、または
ファージクローンを含む単一のクローンに由来する抗体をいい、そしてその生成
される方法に由来する抗体ではない。このように、用語「モノクローナル抗体」
は、ハイブリドーマ技術を通じて産生される抗体に限定されない。モノクローナ
ル抗体は、ハイブリドーマおよび組換えおよびファージディスプレイ技術の使用
を含む、当該分野で公知の幅広い種々の技術を使用して調製され得る。

【０１８１】 ハイブリドーマ技術を用いて特異的抗体を産生およびスクリーニングする方法
は、当該分野で慣用的かつ周知であり、そして実施例２３に詳細に議論される。
手短には、マウスは、本発明のポリペプチドまたはそのようなペプチドを発現す
る細胞を用いて免疫され得る。一旦免疫応答が検出される（例えば、抗原に特異
的な抗体がマウスの血清中に検出される）と、マウスの脾臓を収集しそして脾細
胞を単離する。次に、その脾細胞を周知の技術によって任意の適切な骨髄腫細胞
（例えば、ＡＴＣＣから入手可能な細胞株ＳＰ２０由来の細胞）に融合させる。
ハイブリドーマを限界希釈によって選択およびクローン化する。次に、ハイブリ
ドーマクローンを、本発明のポリペプチドに結合し得る抗体を分泌する細胞につ
いて、当該分野で公知の方法によってアッセイする。一般的に高いレベルの抗体
を含む腹水（ａｓｃｉｔｅｓ ｆｌｕｉｄ）が、陽性ハイブリドーマクローンを
用いてマウスを免疫させることによって、産生され得る。

【０１８２】 従って、本発明は、モノクローナル抗体および本発明の抗体を分泌するハイブ
リドーマ細胞を培養する工程を包含する方法によって産生される抗体を、生成す
る方法を提供し、ここで、好ましくは、このハイブリドーマは、骨髄腫細胞と本
発明の抗原で免疫したマウスから単離された脾細胞とを融合させ、次いで本発明
のポリペプチドと結合し得る抗体を分泌するハイブリドーマクローンについて、
融合物から生じるハイブリドーマをスクリーニングすることによって生成される
。

【０１８３】 特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは、公知の技術によって生成さ
れ得る。例えば、本発明のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、（Ｆａ
ｂフラグメントを生成するために）パパインまたは（Ｆ（ａｂ’）２フラグメン
トを産生するために）ペプシンのような酵素を使用して、免疫グロブリン分子の
タンパク質分解切断によって産生され得る。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、可
変領域、軽鎖定常領域および重鎖のＣＨ１ドメインを含む。

【０１８４】 例えば、本発明の抗体はまた、当該分野で公知の種々のファージディスプレイ
方法を用いて産生され得る。ファージディスプレイ法において、機能的抗体ドメ
インは、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保有するファージ粒子の表
面に提示される。詳細には、そのようなファージは、レパートリーまたはコンビ
ナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウス）から発現される抗原
結合ドメインを提示するために利用され得る。目的の抗原に結合する抗原結合ド
メインを発現するファージは、抗原を用いて（例えば、標識した抗原あるいは固
体表面またはビーズに結合または補足された抗原を使用する）選択または同定さ
れ得る。これらの方法において用いられるファージは、代表的には、ファージ遺
伝子ＩＩＩタンパク質またはファージ遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに組
換え的に融合されたＦａｂ、Ｆｖまたはジスルフィド安定化されたＦｖの抗体ド
メインを有するファージから発現されたｆｄおよびＭ１３結合ドメインを含む糸
状ファージ（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｐｈａｇｅ）である。本発明の抗体を作
製するために用いられ得るファージディスプレイ方法の例としては、以下に開示
される方法が挙げられる：Ｂｒｉｎｋｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ １８２：４１−５０（１９９５）；Ａｍｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
Ｍｅｔｈｏｄｓ １８４：１７７−１８６（１９９５）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏ
ｕｇｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２−９５８（１９９４）；
Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ １８７ ９−１８（１９９７）；Ｂｕｒｔｏｎら、
Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５７：１９１−２８０（１９
９４）；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＰＣＴ公開ＷＯ ９０
／０２８０９；ＷＯ ９１／１０７３７；ＷＯ ９２／０１０４７；ＷＯ ９２
／１８６１９；ＷＯ ９３／１１２３６；ＷＯ ９５／１５９８２；ＷＯ ９５
／２０４０１；ならびに米国特許第５，６９８，４２６号；同第５，２２３，４
０９号；同第５，４０３，４８４号；同第５，５８０，７１７号；同第５，４２
７，９０８号；同第５，７５０，７５３号；同第５，８２１，０４７号；同第５
，５７１，６９８号；同第５，４２７，９０８号；同第５，５１６，６３７号；
同第５，７８０，２２５号；同第５，６５８，７２７号；同第５，７３３，７４
３号および同第５，９６９，１０８号（上記の参考文献は、本明細書中でその全
体が参考として援用される）。

【０１８５】 上記参考文献に記載されるように、ファージ選択後、ファージ由来の抗体をコ
ードする領域は、ヒト抗体を含む抗体の全体または任意の他の所望の抗原結合フ
ラグメントを作製するために単離されそして用いられ得、そして（例えば、以下
に詳細が記載されるように）哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細
菌を含む任意の所望の宿主において発現され得る。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’お
よびＦ（ａｂ’）２フラグメントを組換え的に作製するための技術はまた、当該
分野で公知の方法を用いて使用され得る。このような方法は、例えば、以下に開
示される：ＰＣＴ公開ＷＯ ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘら、ＢｉｏＴ
ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １２（６）：８６４−８６９（１９９２）；およびＳａｗ
ａｉら、ＡＪＲＩ ３４：２６−３４（１９９５）；およびＢｅｔｔｅｒら、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−１０４３（１９９８）（これらの参考文献は
、その全体が参考として援用される）。

【０１８６】 単鎖のＦｖｓおよび抗体を作製するために用いられ得る技術の例としては、米
国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎ
ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０３：４６−８８（１９
９１）；Ｓｈｕら、ＰＮＡＳ ９０：７９９５−７９９９（１９９３）；および
Ｓｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０３８−１０４０（１９８８）に
記載される技術が挙げられる。ヒトにおける抗体のインビボにおける使用および
インビトロ検出アッセイを含むいくつかの用途のために、キメラ抗体、ヒト化抗
体またはヒト抗体の使用が好ましくあり得る。キメラ抗体とは、抗体の異なる部
分が、異なる動物種に由来する分子（例えば、マウスモノクローナル抗体由来の
可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体）である。キメラ抗体
を作製するための方法は、当該分野において公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓ
ｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃ
ｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓら、（１９８９）Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１−２０２；米国特許第５，
８０７，７１５号；同第４，８１６，５６７号；および同第４，８１６，３９７
号を参照のこと（これらはそれらの全体が、参考として本明細書中に援用される
）。ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）および
ヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する所望された抗体に結
合する非ヒト種抗体由来の抗体分子である。しばしば、ヒトフレームワーク領域
内のフレームワーク残基（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｓｉｄｕｅ）は、抗原結合
を変化させるため（好ましくは改善させるために）ＣＤＲドナー抗体由来の対応
残基と置換される。これらフレームワークの置換は、当該分野で周知の方法によ
って、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するためのＣＤＲお
よびフレームワーク残基の相互作用のモデリング、ならびに特定の位置における
異常なフレームワーク残基を同定するための配列比較によって、同定され得る。
（例えば、Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５，５８５，０８９号；Ｒｉｅｃｈｍａｎ
ｎ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３（１９８８）を参照のこと。これらはそ
れらの全体が参考として本明細書中に援用される）。抗体は、以下を含む当該分
野で公知の種々の技術を用いてヒト化され得る：例えば、ＣＤＲ−移植（欧州特
許第２３９，４００号；ＰＣＴ公開ＷＯ ９１／０９９６７；米国特許第５，２
２５，５３９号；同第５，５３０，１０１号および同第５，５８５，０８９号）
、ベニヤリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）またはリサーフェイシング（ｒｅｓｕｒ
ｆａｃｉｎｇ）（欧州特許第５９２，１０６号；同第５１９，５９６号；Ｐａｄ
ｌａｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２８（４／５）：４８９
−４９８（１９９１）； Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎ
ｅｅｒｉｎｇ ７（６）：８０５−８１４（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａら、Ｐ
ＮＡＳ ９１：９６９−９７３（１９９４））、およびチェーンシャッフリング
（ｃｈａｉｎ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（米国特許第５，５６５，３３２号）。

【０１８７】 完全なヒト抗体は、ヒト患者の治療的処置に対して特に所望される。ヒト抗体
は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを用いた上記のファー
ジディスプレイ法を含む当該分野で公知の種々の方法により作製され得る。米国
特許第４，４４４，８８７号、同第４，７１６，１１１号；およびＰＣＴ公開Ｗ
Ｏ ９８／４６６４５、ＷＯ ９８／５０４３３、ＷＯ ９８／２４８９３、Ｗ
Ｏ ９８／１６６５４、ＷＯ ９６／３４０９６、ＷＯ ９６／３３７３５、お
よびＷＯ ９１／１０７４１；（これらの各々はその全体が参考として本明細書
中に援用される）もまた参照のこと。

【０１８８】 ヒト抗体はまた、機能的内因性免疫グロブリンの発現は出来ないが、ヒト免疫
グロブリン遺伝子を発現し得るトランスジェニックマウスを用いて産生され得る
。例えば、ヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子およびヒト軽鎖免疫グロブリン遺伝子
の複合体は、無作為にまたは相同組換えによってマウス胚性幹細胞に導入され得
る。あるいは、ヒト可変領域、定常領域および多様性領域（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｒｅｇｉｏｎ）は、ヒト重鎖遺伝子およびヒト軽鎖遺伝子に加えて、マウスの
胚性幹細胞に導入され得る。マウス重鎖免疫グロブリン遺伝子およびマウス軽鎖
免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えによるヒト免疫グロブリン座の導入と別々
にまたは同時に非機能的にされ得る。特に、ＪＨ領域のホモ接合性の欠失は、内
因性抗体の産生を妨げる。改変された胚性幹細胞を発達させ、そしてキメラマウ
スを産生するために、胚盤胞中に微量注入する。次に、キメラマウスを、ヒト抗
体を発現するホモ接合性の子孫を産生するために繁殖させる。トランスジェニッ
クマウスを、選択された抗原（例えば、本発明のポリペプチドの全体または部分
）を用いて通常の様式で免疫する。抗原に対するモノクローナル抗体は、従来の
ハイブリドーマ技術を用いて、免疫したトランスジェニックマウスから得られる
。ヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、トランスジェニックマウスの再編成によっ
てＢ細胞分化の間かくまわれ、そしてクラススイッチングおよび体細胞変異が引
き続いて起こる。従って、そのような技術の使用によって、治療的に有用なＩｇ
Ｇ抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＭ抗体およびＩｇＥ抗体の産生が可能である。ヒト抗
体を産生するためのこの技術の概要については、ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚ
ａｒ、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）を参照
のこと。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのこの技術のな
らびにそのような抗体を産生するためのプロトコールの詳細な議論については、
例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９６／３４０９６；ＷＯ９６／
３３７３５；米国特許第５，４１３，９２３号；同第５，６２５，１２６号；同
第５，６３３，４２５号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６６１，０１６
号；同第５，５４５，８０６号；同第５，８１４，３１８号；および同第５，９
３９，５９８号を参照のこと（これらはその全体が本明細書中に参考として援用
される）。さらに、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，ＣＡ）およ
びＧｅｎｐｈａｒｍ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）のような企業は、上記の技術に
類似した技術を用いて、選択した抗原に対するヒト抗体を提供することに従事し
得る。

【０１８９】 選択されたエピトープを完全に認識するヒト抗体を、「ガイドされた（ｇｕｉ
ｄｅｄ）選択」といわれる技術を用いて産生し得る。このアプローチにおいて、
選択された非ヒトモノクローナル抗体（例えば、マウス抗体）は、同じエピトー
プを完全に認識するヒト抗体の選択を導くために使用される（Ｊｅｓｐｅｒｓら
、Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：８９９−９０３（１９８８））。

【０１９０】 さらに、本発明のポリペプチドに対する抗体は、次に、当業者に周知の技術を
用いて本発明のポリペプチドを「模倣する」抗イディオタイプ抗体を産生するた
めに、利用され得る。（例えば、ＧｒｅｅｎｓｐａｎおよびＢｏｎａ、ＦＡＳＥ
Ｂ Ｊ．７（５）：４３７−４４４；（１９８９）およびＮｉｓｓｉｎｏｆｆ，
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（８）：２４２９−２４３８（１９９１）を参照の
こと。）例えば、ポリペプチドのマルチマー化（ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｚａｔｉｏ
ｎ）および／またはリガンドに対する本発明のポリペプチドの結合を、結合し、
そして競合的に阻害する抗体は、ポリペプチドのマルチマー化および／または結
合ドメインを「模倣する」抗イディオタイプを産生するために使用され得、そし
て結果としてポリペプチドおよび／またはそのリガンドに結合し、そして中和す
る。そのような抗イディオタイプまたはそのような抗イディオタイプのＦａｂフ
ラグメントの中和は、ポリペプチドリガンドを中和するための治療的レジメンに
使用され得る。例えば、そのような抗イディオタイプ抗体は、本発明のポリペプ
チドに結合するためおよび／またはそのリガンド／レセプターに結合するために
使用され得、そしてそれによってその生物学的活性がブロックされる。

【０１９１】 （Ａ．抗体をコードするポリヌクレオチド） 本発明はさらに、本発明の抗体およびそのフラグメントをコードするヌクレオ
チド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、ストリンジェント
な、または低いストリジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で（例えば、
上記に定義されるような）抗体（好ましくは、本発明のポリペプチドと特異的に
結合する、好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合
する抗体）をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチ
ドを含む。

【０１９２】 ポリヌクレオチドが、当該分野で公知の任意の方法によって得られ得、そして
ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が決定される。例えば、抗体のヌクレオチ
ド配列が知られている場合、抗体をコードするポリヌクレオチドは、化学的に合
成されたオリゴヌクレオチド（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒら、ＢｉｏＴｅｃｈｎ
ｉｑｕｅｓ １７：２４２（１９９４）に記載されるような）から集められ得、
これは、簡単にいうと、以下の工程を包含する：抗体をコードする配列の部分を
含むオーバーラップするオリゴヌクレオチドの合成、アニーリングおよびこれら
のオリゴヌクレオチドの連結、次いでＰＣＲによる連結されたオリゴヌクレオチ
ドの増幅。

【０１９３】 あるいは、抗体をコードするポリヌクレオチドは、適切な供給源からの核酸か
ら作製され得る。特定の抗体をコードする核酸を含むクローンは入手不可能だが
、その抗体分子の配列が既知である場合、免疫グロブリンをコードする核酸は、
適切な供給源（例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリー、または抗体を発現する任意
の組織もしくは細胞（例えば、本発明の抗体の発現のために選択されたハイブリ
ドーマ細胞）から作製されたｃＤＮＡライブラリー、またはそれから単離された
核酸（好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ））から、例えば、抗体をコードするｃＤＮＡ
ライブラリーからのｃＤＮＡクローンを同定するために、配列の３’末端および
５’末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを使用するＰＣＲ増幅によって
、または特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用するク
ローニングによって得られ得る。ＰＣＲによって作製された増幅された核酸は、
次いで、当該分野で周知の任意の方法を用いて、複製可能なクローニングベクタ
ーにクローニングされ得る。

【０１９４】 一旦、抗体のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列が決定されると、
抗体のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の操作について当該分野で周知の
方法（例えば、組換えＤＮＡ技術、部位指向性変異誘発、ＰＣＲなど（例えば、
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ
およびＡｕｓｕｂｅｌら編、１９９８，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ
，ＮＹに記載の技術を参照のこと。これらは両方がその全体において本明細書に
参考として援用される。））を用いて操作され、例えば、アミノ酸の置換、欠失
、および／または挿入を生成するように異なるアミノ酸配列を有する抗体を作製
し得る。

【０１９５】 特定の実施形態において、重鎖および／または軽鎖の可変ドメインのアミノ酸
配列は、相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列の同定のために、当該分野において周
知の方法によって（例えば、配列超可変性の領域を決定するために、他の重鎖、
および軽鎖の可変領域の既知のアミノ酸配列と比較することによって）調べられ
得る。慣用的な組換えＤＮＡ技術を用いて、１つ以上のＣＤＲが、前述のように
フレームワーク領域内に（例えば、非ヒト抗体をヒト化するために、ヒトフレー
ムワーク領域中に）挿入され得る。このフレームワーク領域は自然発生し得るか
、またはコンセンサスフレームワーク領域、および好ましくはヒトフレームワー
ク領域であり得る（例えば、列挙したヒトフレームワーク領域については、Ｃｈ
ｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８：４５７−４７９（１９９８）を
参照のこと）。好ましくは、フレームワーク領域およびＣＤＲの組み合わせによ
って作製されたポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドに特異的に結合する
抗体をコードする。好ましくは、上記に議論されるように、１つ以上のアミノ酸
置換は、フレームワーク領域内で作製され得、そして好ましくは、そのアミノ酸
置換は、抗体のその抗原への結合を改善する。さらに、このような方法は、１つ
以上の鎖内のジスルフィド結合が欠如した抗体分子を作製するように、鎖内ジス
ルフィド結合に関与する１つ以上の可変領域のシステイン残基のアミノ酸置換ま
たは欠失を作製するために使用され得る。ポリヌクレオチドへの他の変更は、本
発明によって、および当該分野の技術において包含される。

【０１９６】 さらに、適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子を、適切な生物学的
活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と共にスプライシングさせることによる、「キ
メラ抗体」を生産するために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：８５１−８５５；Ｎｅｕｂｅｒ
ｇｅｒら、１９８４、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８；Ｔａｋｅｄａら
、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２−４５４）が使用され得る。上記の
ように、キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種から誘導される分子であり、
このような分子は、マウスｍＡｂおよびヒト免疫グロブリンの定常領域（例えば
、ヒト化抗体）から誘導された可変領域を有する。

【０１９７】 あるいは、単鎖抗体の産生のために記載された技術（米国特許第４，６９４，
７７８号；Ｂｉｒｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８８、２４２：４２３−４２；Ｈｕ
ｓｔｏｎら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５
：５８７９−５８８３；およびＷａｒｄら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ ３３４：
５４４−５４）が、単鎖抗体の産生に適応され得る。単鎖抗体は、Ｆｖ領域の重
鎖フラグメントおよび軽鎖フラグメントがアミノ酸架橋を介して連結されれるこ
とによって形成され、単鎖ポリペプチドを生じる。Ｅ．ｃｏｌｉにおける機能性
Ｆｖフラグメントのアセンブリのための技術もまた、使用され得る（Ｓｋｅｒｒ
ａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１０３８−１０４１（１９８８））。

【０１９８】 （Ｂ．抗体を産生する方法） 本発明の抗体は、抗体を合成するための当該分野で公知の任意の方法によって
、特に、化学合成によって、または、好ましくは、組換え体発現技術によって産
生され得る。

【０１９９】 本発明の抗体、またはそのフラグメント、誘導体もしくはアナログ（例えば、
本発明の抗体の重鎖もしくは軽鎖または本発明の単鎖抗体）の組換え体発現は、
抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を必要とする
。一旦、本発明の抗体分子または抗体の重鎖もしくは軽鎖、あるいはそれらの部
分（好ましくは、重鎖または軽鎖の可変ドメインを含有する）をコードするポリ
ヌクレオチドが得られると、抗体分子の産生のためのベクターは、当該分野で周
知の技術を用いる組換えＤＮＡ技術によって生成され得る。従って、ヌクレオチ
ド配列をコードする抗体を含有するポリヌクレオチドの発現によってタンパク質
を調製するための方法は、本明細書に記載される。当業者に周知の方法は、抗体
をコードする配列ならびに適切な転写制御シグナルおよび翻訳制御シグナルを含
有する発現ベクターの構築のために使用され得る。これらの方法には、例えば、
インビトロの組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボの遺伝子組換えが挙
げられる。従って、本発明は、プロモーターに作動可能に連結した、本発明の抗
体分子、あるいはその重鎖もしくは軽鎖、または重鎖もしくは軽鎖の可変ドメイ
ンをコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。このよ
うなベクターは、抗体分子の定常領域（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ８６／０５８０
７；ＰＣＴ公開ＷＯ８９／０１０３６；および米国特許第５，１２２，４６４号
を参照のこと）をコードするヌクレオチド配列ならびに重鎖または軽鎖の全体の
発現のためにこのようなベクターにクローニングされ得る抗体の可変ドメインを
含み得る。

【０２００】 この発現ベクターは、従来技術によって宿主細胞へと移入され、そしてこのト
ランスフェクトされた細胞は、次いで、本発明の抗体を産生するために、従来技
術によって培養される。従って、本発明は、異種プロモーターに作動可能に連結
した、本発明の抗体、またはその重鎖もしくは軽鎖をコードするポリヌクレオチ
ドを含む宿主細胞を含む。二重鎖抗体の発現についての好ましい実施形態におい
て、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクターは、以下に詳述されるように、
免疫グロブリン分子の全体の発現のために宿主細胞において同時発現され得る。

【０２０１】 種々の宿主発現ベクター系は、本発明の抗体分子を発現させるために利用され
得る。このような宿主発現系は、目的のコード配列が産生され、かつ続いて精製
され得るビヒクルを表わすが、また、適切なヌクレオチドをコードする配列で形
質転換またはトランスフェクトされる場合に、インサイチュで本発明の抗体分子
を発現し得る細胞を表わす。これらには、抗体をコードする配列を含む組換えバ
クテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクター
を用いて形質転換された細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．サブチリス（ｓｕｂ
ｔｉｌｉｓ））のような微生物；抗体をコードする配列を含む組換え酵母発現ベ
クターで形質転換された酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈ
ｉａ）；抗体をコードする配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バ
キュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば
、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ
）に感染した植物細胞系または抗体をコードする配列を含む組換えプラスミド発
現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；あるいは
哺乳動物細胞のゲノムから誘導されたプロモーター（例えば、メタロチオネイン
プロモーター）または哺乳動物のウイルスから誘導されたプロモーター（例えば
、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター
）を含む組換え発現構築物を保有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ
、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。好ま
しくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのような細菌細胞、そしてより好ま
しくは、特に、組換え抗体分子全体の発現のために真核生物細胞が、組換え抗体
分子の発現のために使用される。例えば、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要
即時性初期遺伝子プロモーターエレメントのようなベクターと組み合わされた、
チャイニーズハムスターの卵巣細胞（ＣＨＯ）のような哺乳動物細胞が、抗体の
ための効果的な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇら、Ｇｅｎｅ、１９８６、４５
：１０１；Ｃｏｃｋｅｔｔら、１９９０、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：
２）。

【０２０２】 細菌系において、多くの発現ベクターが、抗体分子の発現を意図する使用に依
存して有利に選択され得る。例えば、多量のこのようなタンパク質が産生される
べき場合、抗体分子の薬学組成物の作製のために、容易に精製される融合タンパ
ク質産物の高レベルの発現を指向するベクターが所望され得る。このようなベク
ターには、抗体をコードする領域がｌａｃＺをコードする領域と共にベクターに
インフレームで個別に連結され得、その結果、融合タンパク質が産生されるＥ．
ｃｏｌｉ発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら、１９８３、ＥＭＢＯ Ｊ
．２：１７９１）；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ＆Ｉｎｏｕｙｅ、１９８５、
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９；Ｖａｎ Ｈ
ｅｅｋｅ＆Ｓｃｈｕｓｔｅｒ、１９８９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５
０３−５５０９）などが挙げられるが、これらに限定されない。ｐＧＥＸベクタ
ーもまた、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質
として、外来性ポリペプチドを発現させるために使用され得る。一般に、このよ
うな融合タンパク質は可溶性であり、そして溶解した細胞から、マトリックスグ
ルタチオン−アガロースビーズへの吸着および結合、それに続く遊離グルタチオ
ン存在化での溶出によって容易に精製され得る。このｐＧＥＸベクターは、トロ
ンビンまたはＸａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計され、その結果、
このクローニングされた標的遺伝子産物は、ＧＳＴ部分から放出され得る。

【０２０３】 昆虫系において、オートグラファカリフォルニカ核多核体病ウイルス（Ａｕｔ
ｏｇｒａｐｈａ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒ
ｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＡｃＮＰＶ）は、外来性遺伝子を発現させるためのベ
クターとして使用される。このウイルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉ
ｐｅｒｄａ細胞中で増殖する。この抗体をコードする配列は、ウイルスの非必須
領域（例えば、ポリヘドリン（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ）遺伝子）に個々にクロー
ニングされ得、そしてＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモー
ター）の制御下に配置され得る。

【０２０４】 哺乳動物の宿主細胞において、多くのウイルスに基づいた発現系が利用され得
る。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、抗体をコードする目
的の配列は、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体（例えば、後期プロモーター
および３部からなるリーダー配列）に連結され得る。次いで、このキメラ遺伝子
は、インビトロまたはインビボの組換えによって、アデノウイルスゲノム中に挿
入され得る。ウイルスのゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）へ
の挿入は、感染した宿主において生存し、かつ抗体分子を発現し得る組換えウイ
ルスを生じる。（例えば、Ｌｏｇａｎ＆Ｓｈｅｎｋ、１９８４、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３５５−３５９を参照のこと）。特定
の開始シグナルもまた、挿入された抗体をコードする配列の効率的な翻訳のため
に必要とされ得る。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接する配列
を含む。さらに、この開始コドンは、挿入物全体の翻訳を保証するように、所望
のコード配列のリーディングフレームと同調でなければならない。これらの外因
性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成の両方の種々の起源の
であり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネ
ーターなどを含めることによって増大され得る（Ｂｉｔｔｎｅｒら、１９８７、
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１−５４４を参照のこと）
。

【０２０５】 さらに、挿入された配列の発現を調節するか、または遺伝子産物を所望の特定
の様式に改変およびプロセスする宿主細胞株が、選択され得る。タンパク質産物
のこのような改変（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、切断
）は、タンパク質の機能にとって重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク
質産物および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび改変について特徴的かつ特
有の機構を有する。適切な細胞株または宿主系は、発現した外来性タンパク質の
正確な改変およびプロセシングを保証するように選択され得る。この目的のため
に、一次転写物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化、およびリン
酸化のための細胞の機構を有する真核生物の宿主細胞が使用され得る。このよう
な哺乳動物の宿主細胞には、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＣＯＳ、Ｍ
ＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８、および、特に、乳癌細胞株（例えば、ＢＴ
４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０およびＴ４７Ｄなど）、ならびに正
常な乳腺細胞株（例えば、ＣＲＬ７０３０およびＨｓ５７８Ｂｓｔなど）が挙げ
られるが、これらに限定されない。

【０２０６】 組換えタンパク質の長期の高収率の産生のために、安定した発現が好ましい。
例えば、抗体分子を安定して発現する細胞株が操作され得る。ウイルスの複製起
点を含む発現ベクターの使用よりも、むしろ宿主細胞は、適切な発現制御エレメ
ント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリ
アデニル化部位など）、および選択可能なマーカーによって制御されるＤＮＡで
形質転換され得る。外来性ＤＮＡの導入に続いて、操作された細胞は、濃縮され
た培地中で１〜２日間増殖され得、次いで選択培地に切り換えられる。組換えプ
ラスミド中の選択マーカーは、選択への耐性を与え、そして細胞がプラスミドを
それらの染色体に安定に組み込むことを可能とし、そして増殖し、次いで細胞株
にクローニングおよび増殖され得る病巣を形成する。この方法は、抗体分子を発
現する細胞株を操作するために有利に使用され得る。このような操作された細胞
株は、抗体分子と直接的または間接的に相互作用する化合物のスクリーニングお
よび評価において特に有用であり得る。

【０２０７】 多くの選択系が使用され得、それらには、それぞれｔｋ−細胞、ｈｇｐｒｔ−
細胞、またはａｐｒｔ−細胞において使用され得る、単純ヘルペスウイルスチミ
ジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、１９７７、Ｃｅｌｌ １１：２２３）、ヒポキ
サンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａお
よびＳｚｙｂａｌｓｋｉ、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ４８：２０２）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（
Ｌｏｗｙら、１９８０、Ｃｅｌｌ ２２：８１７）遺伝子が挙げられるが、これ
らに限定されない。また、代謝拮抗物質耐性は、以下の遺伝子に関する選択の基
礎として使用され得る：メトトレキサートへの耐性を与えるｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌ
ｅｒら、１９８０、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：３５７）；Ｏ
’Ｈａｒｅら、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７
８：１５２７；ミコフェノール酸への耐性を与えるｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎお
よびＢｅｒｇ、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７
８：２０７２）；アミノグリコシドＧ−４１８への耐性を与えるｎｅｏ（Ｃｌｉ
ｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４８８−５０５；ＷｕおよびＷｕ、１９
９１、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７−９５；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ、１９９
３、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５
９６；Ｍｕｌｌｉｇａｎ、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−９３２
；ならびにＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ、１９９３、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７；１９９３年５月，ＴＩＢ ＴＥＣＨ
１１（５）：１５５−２１５）；ならびにハイグロマイシンへの耐性を与えるｈ
ｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、１９８４、Ｇｅｎｅ ３０：１４７）。当該分
野で一般に公知である組換えＤＮＡ技術の方法は、所望の組換えクローンの選択
に慣用的に適用され得、そしてこのような方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（
編）、１９９３、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ；Ｋｒｉｅｇｌ
ｅｒ、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９
９０）；ならびにＤｒａｃｏｐｏｌｉら（編）、１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐ
ｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅ
ｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹの１２および１３章；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら
、１９８１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１に記載され、これらはその全体
が本明細書において参考として援用される。

【０２０８】 抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅によって増加され得る（総説について
は、ＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎおよびＨｅｎｔｓｃｈｅｌ、Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ
ｖｅｃｔｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉ
ｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ，第３巻
（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）を参照のこと
）。抗体を発現するベクター系においてマーカーが増幅できる場合、宿主細胞の
培養液に存在するインヒビターのレベルの増加は、マーカー遺伝子のコピーの数
を増加する。この増幅された領域が抗体遺伝子と結合しているために、この抗体
の産生もまた、増加する（Ｃｒｏｕｓｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：
２５７（１９８３））。

【０２０９】 その宿主細胞は、本発明の２つの発現ベクター（重鎖に由来するポリペプチド
をコードする第１のベクターおよび軽鎖に由来するポリペプチドをコードする第
２のベクター）で同時トランスフェクトされ得る。この２つのベクターは、重鎖
および軽鎖のポリペプチドの等しい発現を可能とする同一の選択マーカーを含み
得る。あるいは、重鎖および軽鎖のポリペプチドの両方をコードし、かつその発
現を可能とする単一のベクターが使用され得る。このような状況において、この
軽鎖は、過剰の有毒な遊離重鎖を避けるために、重鎖の前に配置されるべきであ
る（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ ３２２：５２；Ｋｏｈｌｅ
ｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：２１９７（１９８
０））。重鎖および軽鎖のコード配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含み得
る。

【０２１０】 一旦、本発明の抗体分子が、動物、化学合成、または組換え発現によって産生
されると、この抗体分子は、免疫グロブリン分子の精製に関する当該分野で公知
の任意の方法によって（例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロ
マトグラフィー、アフィニティー（特に、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａの後の特異的抗原
へのアフィニティーによる）クロマトグラフィー、およびサイジング（ｓｉｚｉ
ｎｇ）カラムクロマトグラフィー）、遠心分離、差示的溶解度によって、または
タンパク質の精製に関する他の任意の標準的な技術によって）精製され得る。

【０２１１】 （Ｃ．抗体結合体） 本発明は、融合タンパク質を生成するために、本発明のポリペプチド（または
それらの一部、好ましくは、ポリペプチドの少なくとも１０、２０、または５０
個のアミノ酸）に組換え的に融合されたか、あるいは化学的に結合（共有結合お
よび非共有結合の両方を含む）された抗体を含む。この融合は、必ずしも直接的
である必要はないが、リンカー配列を通して起こり得る。この抗体は、本発明の
ポリペプチド（またはそれらの一部、好ましくは、ポリペプチドの少なくとも１
０、２０、または５０個のアミノ酸）以外の抗原に特異的であり得る。例えば、
本発明のポリペプチドを、特定の細胞表面レセプターに特異的な抗体に融合させ
るかまたは結合させることによって、抗体は、インビトロまたはインビボのいず
れかで本発明のポリペプチドを特定の細胞型に標的化するために使用され得る。
本発明のポリペプチドに融合されたかまたは結合された抗体はまた、当該分野で
公知の方法を使用してインビトロイムノアッセイおよび精製方法にて使用され得
る。例えば、Ｈａｒｂｏｒら、前出、およびＰＣＴ公開ＷＯ ９３／２１２３２
；ＥＰ ４３９，０９５；Ｎａｒａｍｕｒａら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．３
９：９１−９９（１９９４）；米国特許第５，４７４，９８１号；Ｇｉｌｌｉｅ
ｓら、ＰＮＡＳ ８９：１４２８−１４３２（１９９２）；Ｆｅｌｌら、Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．１４６：２４４６−２４５２（１９９１）（これらは、それらの
全体において参考として援用される）を参照のこと。

【０２１２】 本発明はさらに、可変領域以外の抗体のドメインに融合されたかまたは結合さ
れた本発明のポリペプチドを含む組成物を含む。例えば、本発明のポリペプチド
を、抗体のＦｃ領域、あるいはその一部に融合または結合され得る。本発明のポ
リペプチドに融合された抗体部分は、定常領域、ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、
ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン、あるいはそれらのドメイン全体または
部分の任意の組合せを含み得る。このポリペプチドはまた、上記の抗体部分に融
合または結合され、マルチマーを形成し得る。例えば、本発明のポリペプチドに
融合されたＦｃ部分は、Ｆｃ部分間のジスルフィド結合を介して二量体を形成し
得る。より高次なマルチマー形態は、このポリペプチドをＩｇＡおよびＩｇＭの
部分に融合することにより作製され得る。本発明のポリペプチドを抗体部分に融
合または結合するための方法は、当該分野において公知である。例えば、米国特
許第５，３３６，６０３号；同第５，６２２，９２９号；同第５，３５９，０４
６号；同第５，３４９，０５３号；同第５，４４７，８５１号；同第５，１１２
，９４６号；ＥＰ ３０７，４３４；ＥＰ ３６７，１６６；ＰＣＴ公開ＷＯ
９６／０４３８８；ＷＯ ９１／０６５７０；Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１０５３５−１０５３９（１９
９１）；Ｚｈｅｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５５９０−５６００（１
９９５）；およびＶｉｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８９：１１３３７−１１３４１（１９９２）（上記の参考文献は、それらの全体
が参考として援用される）を参照のこと。

【０２１３】 上記で議論されたように、本発明のポリペプチドは、上記の抗体部分に融合ま
たは結合され得、このポリペプチドのインビボの半減期を増加するか、または当
該分野で公知の方法を使用するイムノアッセイにおいて使用される。さらに、本
発明のポリペプチドは、精製を容易にするために、上記の抗体部分に融合または
結合され得る。１つの報告された実施例は、ヒトＣＤ４ポリペプチドの第１の２
つのドメインおよび哺乳動物免疫グロブリンの重鎖もしくは軽鎖の定常領域の種
々のドメインからなるキメラタンパク質を記載する。（ＥＰ ３９４，８２７；
Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３３１：８４−８６（１９８８））。
ジスルフィド連結した二量体構造（ＩｇＧに起因する）を有する抗体に融合また
は結合された本発明のポリペプチドはまた、単量体分泌タンパク質またはタンパ
ク質フラグメント単独よりも、他の分子との結合および中和においてより効率的
であり得る。（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：３
９５８−３９６４（１９９５））。多くの場合において、融合タンパク質のＦｃ
部分は、治療および診断において有利であり、従って、例えば、改良された薬物
動態学的な特性を生じ得る。（ＥＰ Ａ ２３２，２６２）。あるいは、融合タ
ンパク質が発現、検出、および精製された後のＦｃ部分の欠損は、好ましい。例
えば、この融合タンパク質が免疫化のための抗原として使用される場合、このＦ
ｃタンパク質は、治療および診断を妨げ得る。薬物の発見において、例えば、ヒ
トタンパク質（例えばｈＩＬ−５レセプター）は、ｈＩＬ−５のアンタゴニスト
を同定するための高処理能スクリーニングアッセイの目的のために、Ｆｃタンパ
ク質と融合された。（Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇ
ｎｉｔｉｏｎ ８：５２−５８（１９９５）；Ｊｏｈａｎｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：９４５９−９４７１（１９９５）を参照のこと。） さらに、本発明の抗体またはそれらのフラグメントは、精製を容易にするペプ
チドのような、マーカー配列と融合され得る。好ましい実施形態において、この
マーカーアミノ酸配列は、とりわけ、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ、Ｉｎｃ．
，９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１
１）において提供されるタグのようなヘキサ−ヒスチジンペプチドであり、それ
らの多くは市販されている。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１−８２４（１９８９）に記載されるように
、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。精製に有用
な他のペプチドタグには、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピト
ープに対応する「ＨＡ」タグ（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９
８４））および「ｆｌａｇ」タグが挙げられるが、これらに限定されない。

【０２１４】 本発明はさらに、診断剤または治療剤に結合される抗体またはそのフラグメン
トを含む。この抗体は、例えば、臨床試験の手順の一部（例えば、所定の治療レ
ジメンの有効性を決定するための）として、腫瘍の発生または進行をモニターす
るために診断的に使用され得る。検出は、抗体を検出可能な物質にカップリング
することによって容易にされ得る。検出可能な物質の例には、種々の酵素、補欠
分子群、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、種々の陽子射出断層
撮影法を使用する陽電子放射金属、および非放射性常磁性金属イオンが挙げられ
る。この検出可能な物質は、当該分野で公知の技術を用いて、抗体（または、そ
れらのフラグメント）に直接的にか、または中間体（例えば、当該分野で公知の
リンカーなど）を介して間接的にかのいずれかで、カップリングまたは結合され
得る。本発明に従う診断剤として使用するための抗体に結合され得る金属イオン
については、例えば、米国特許第４，７４１，９００号を参照のこと。適切な酵
素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラ
クトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適切な補欠分子
群複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが
挙げられ；適切な蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フル
オレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフル
オレセイン、ダンシルクロライドまたはフィコエリトリンが挙げられ；発光物質
の例には、ルミノールが挙げられ；生物発光物質の例には、ルシフェラーゼ、ル
シフェリン、およびエクオリンが挙げられ；そして適切な放射性物質の例には、 ¹²⁵ Ｉ、¹³¹Ｉ、¹¹¹Ｉｎまたは⁹⁹Ｔｃが挙げられる。

【０２１５】 さらに、抗体またはそのフラグメントは、細胞毒（例えば、細胞増殖抑制剤ま
たは細胞破壊剤）、治療剤または放射性金属イオンのような治療的な部分と結合
され得る。細胞毒または細胞毒性の薬剤は、細胞に有害な任意の薬剤を含む。例
には、パクリタキセル、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマ
イド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉ
ｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウ
ノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトザントロン、ミトラマイシ
ン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、
プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびプロマイシ
ンならびにそれらのアナログまたはホモログが挙げられる。治療剤としては、代
謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグア
ニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例え
ば、メクロレタミン（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、チオエパ（ｔｉｏｅ
ｐａ）クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムス
チン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）
、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン（ｓｔｒｅｐｔｏ
ｚｏｔｏｃｉｎ）、マイトマイシンＣ、およびシス−ジクロロジアミン白金（Ｉ
Ｉ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉ
ｎｅ）（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）、およびドキソルビ
シン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前は、アクチノマイシン）、
ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ａｎｔｈｒａｍｙ
ｃｉｎ）（ＡＭＣ））、ならびに抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチンおよび
ビンブラスチン）が挙げられるが、これらに限定されない。

【０２１６】 本発明の結合体は、所定の生物学的応答の改変のために使用され得、この治療
剤または薬物部分は、古典的な化学治療剤に制限されると解釈されるべきではな
い。例えば、この薬物部分は、所望の生物学的活性を保有するタンパク質または
ポリペプチドであり得る。このようなタンパク質には、例えば、アブリン、リシ
ンＡ、シュードモナス外毒素、またはジフテリア毒素のような毒素；腫瘍壊死因
子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来
成長因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、血栓剤または抗脈管形成剤（例え
ば、アンジオスタチン（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）またはエンドスタチン（ｅｎ
ｄｏｓｔａｔｉｎ））のようなタンパク質；あるいは、生物学的応答改変剤（例
えば、リンホカイン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキ
ン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マク
ロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（
「Ｇ−ＣＳＦ」）、または他の増殖因子など）が挙げられ得る。

【０２１７】 抗体はまた、標的抗原のイムノアッセイまたは精製に特に有用な固体支持体に
付着され得る。このような固体支持体には、ガラス、セルロース、ポリアクリル
アミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンが挙げ
られるが、これらに限定されない。

【０２１８】 このような治療部分を抗体に結合する技術は周知であり、例えば、Ａｒｎｏｎ
ら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔ
ａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」
Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅ
ｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編）、２４３−５６頁（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓ
ｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆ
ｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅ
ｌｉｖｅｒｙ（第２版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編）、６２３−５３頁（Ｍａｒ
ｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄ
ｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａ
ｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ‘８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編）、４７５−５０６頁（１
９８５）；「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒ
ｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ Ｏｆ
Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎ Ｃｎａｃｅｒ Ｔｈｅｒ
ａｐｙ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅ
ｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂａｌｄｗｉｎら（編）、
３０３−１６頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８５）、およびＴｈｏｒ
ｐｅら、「Ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｐ
ｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔ
ｅｓ」、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−５８（１９８２）を参照のこ
と。

【０２１９】 あるいは、抗体は２次抗体に結合され、米国特許第４，６７６，９８０号（こ
れは、その全体が本明細書に参考として援用される）におけるＳｅｇａｌによる
記載のような抗体異種結合体（ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を形成し得る
。

【０２２０】 単独、あるいは細胞毒性因子および／またはサイトカインと組み合わせて投与
される、抗体に結合される治療部分を有するかまたは有さない抗体が、治療薬と
して使用され得る。

【０２２１】 （Ｄ．抗体結合についてのアッセイ） 本発明の抗体は、当該分野において公知の任意の方法により、免疫特異的結合
についてアッセイされ得る。用いられ得る免疫アッセイとしては、（いくつかの
ものについてだけ名称を挙げると、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ
、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ
、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集ア
ッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射定量アッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロ
テインＡイムノアッセイのような技術を用いる競合アッセイ系および非競合アッ
セイ系が挙げられるが、これらに限定されない。このようなアッセイは慣用的で
あり、そして当該分野において周知である（例えば、その全体が本明細書中に参
考として援用される、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏ
ｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）。例
示的なイムノアッセイが、以下に簡潔に記載される（しかし、これらは限定を目
的とすることが意図されない）。

【０２２２】 免疫沈降プロトコルは一般に、タンパク質ホスファターゼおよび／またはプロ
テアーゼインヒビター（例えば、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチニン、バナジン
酸ナトリウム）を補充したＲＩＰＡ緩衝液（１％ ＮＰ−４０またはＴｒｉｔｏ
ｎ Ｘ−１００、１％ デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ ＳＤＳ、０．
１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２での０．０１Ｍ リン酸ナトリウム、１％ Ｔｒ
ａｓｙｌｏｌ）のような溶解緩衝液中で細胞の集団を溶解する工程、目的の抗体
を細胞溶解物に添加する工程、一定時間（例えば、１〜４時間）４℃でインキュ
ベートする工程、プロテインＡおよび／またはプロテインＧセファロースビーズ
を細胞溶解物に添加する工程、約１時間以上４℃でインキュベートする工程、溶
解緩衝液中でビーズを洗浄する工程、ならびにＳＤＳ／サンプル緩衝液中でビー
ズを再懸濁する工程を含む。目的の抗体の、特定の抗原を免疫沈降する能力は、
例えば、ウエスタンブロット分析により、アッセイされ得る。当業者は、抗体の
抗原への結合を増加させ、そしてバックグラウンドを減少させるように改変され
得るパラメータ（例えば、セファロースビーズを用いて細胞溶解物を事前にきれ
いにすること）に関して、精通している。免疫沈降プロトコルに関するさらなる
考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐ
ｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏ
ｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１０．１６．
１を参照のこと。

【０２２３】 ウエスタンブロット分析は、一般に、タンパク質サンプルを調製する工程、タ
ンパク質サンプルをポリアクリルアミドゲル（例えば、抗原の分子量に応じた８
％〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）中で電気泳動する工程、タンパク質サンプルをそ
のポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース、ＰＶＤＦまたはナイロンのよ
うな膜に移す工程、ブロッキング溶液（例えば、３％ ＢＳＡまたは脱脂粉乳を
有するＰＢＳ）中でその膜をブロッキングする工程、その膜を洗浄緩衝液（例え
ば、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ２０）中で洗浄する工程、ブロッキング緩衝液中で希
釈された一次抗体（目的の抗体）を有するその膜をブロッキングする工程、その
膜を洗浄緩衝液中で洗浄する工程、ブロッキング緩衝液中で希釈された酵素基質
（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）あるい
は放射性分子（例えば、³²Ｐまたは¹²⁵Ｉ）に結合した二次抗体（一次抗体を認
識する、例えば、抗ヒト抗体）を用いてその膜をブロッキングする工程、洗浄緩
衝液中でその膜を洗浄する工程、ならびにその抗原の存在を検出する工程を含む
。当業者は、検出されるシグナルを増加させ、そしてバックグラウンドノイズを
減少させるように改変され得るパラメータに関して、精通している。ウエスタン
ブロットプロトコルに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ
ら編，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ
．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１０．８．１を参照のこと。

【０２２４】 ＥＬＩＳＡは、抗原を調製する工程、９６ウェルマイクロタイタープレートの
ウェルをその抗原でコーティングする工程、酵素基質（例えば、西洋ワサビペル
オキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）のような検出可能な化合物に結合
した目的の抗体をそのウェルに添加し、そして一定時間インキュベートする工程
、および抗原の存在を検出する工程を含む。ＥＬＩＳＡにおいて、目的の抗体は
、検出可能な化合物に結合されている必要はない；その代わり、検出可能な化合
物に結合した二次抗体（目的の抗体を認識する）がウェルに添加され得る。さら
に、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、抗体がウェルにコーティングさ
れ得る。この場合、検出可能な化合物に結合した二次抗体が、コーティングされ
たウェルへの目的の抗原の添加に続いて、添加され得る。当業者は、検出される
シグナルを増加させるように改変され得るパラメータ、および当該分野において
公知のＥＬＩＳＡの他のバリエーションに関して、精通している。ＥＬＩＳＡに
関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９４，Ｃｕ
ｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
，１１．２．１を参照のこと。

【０２２５】 抗体の抗原に対する抗体の結合親和性および抗体−抗原相互作用のオフレート
（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）が、競合結合アッセイにより決定され得る。競合結合アッ
セイの一つの例は、ラジオイムノアッセイであり、ラジオイムノアッセイは、漸
増量の非標識抗原の存在下での標識した抗原（例えば、³Ｈまたは¹²⁵Ｉ）と目的
の抗体とのインキュベーション、および標識した抗原に結合した抗体の検出を含
む。目的の抗体の、特定の抗原に対する親和性、および結合オフレートは、スキ
ャッチャードプロット分析によるデータから決定され得る。二次抗体との競合は
また、ラジオイムノアッセイを用いて決定され得る。この場合、抗原は、漸増量
の非標識二次抗体の存在下で、標識した化合物（例えば、³Ｈまたは¹²⁵Ｉ）に結
合した目的の抗体とともにインキュベートされる。

【０２２６】 （Ｅ．抗体を基礎とした治療） 本発明はさらに、抗体を基礎とした治療に関し、この治療は、本発明の抗体を
、本明細書中に記載される１つ以上の障害または状態を処置するために、動物、
好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒトの患者に投与する工程を含む。
本発明の治療化合物としては、本発明の抗体（本明細書中に記載するような、そ
れらのフラグメント、アナログおよび誘導体を含む）ならびに本発明の抗体をコ
ードする核酸（本明細書中に記載されるような、それらのフラグメント、アナロ
グおよび誘導体を含む）が挙げられるがこれらに限定されない。本発明の抗体を
用いて、例えば、以下のような、本明細書中に記載される疾患、障害、または状
態のいずれか１つを含むが、これらに限定されない、本発明のポリペプチドの異
常な発現および／または活性に関連した疾患、障害、または状態を処置、抑制、
または予防し得る：対宿主性移植片病および自己免疫の疾患、障害、またはこの
ような疾患もしくは障害に関する状態（自己免疫溶血性貧血、自己免疫性新生児
血小板減少、突発性血小板減少症紫斑病（ｉｄｏｐａｔｈｉｃ ｔｈｒｏｍｂｏ
ｃｙｔｏｐｅｎｉａ ｐｕｒｐｕｒａ）、自己免疫性血球減少症、溶血性貧血、
抗リン脂質症候群、皮膚炎、アレルギー性脳脊髄炎、心筋炎、再発性多発性軟骨
炎、リウマチ性心疾患、糸球体腎炎（例えば、ＩｇＡネフロパシー）、多発性硬
化症、神経炎、ブドウ膜結膜炎、多発性内分泌腺症、紫斑病（例えば、Ｈｅｎｌ
ｏｃｈ−Ｓｃｏｅｎｌｅｉｎ紫斑病）、ライター病、スティッフマン症候群、自
己免疫性肺炎、ギヤン−バレー症候群、インスリン依存性糖尿病、および自己免
疫炎症性眼疾患、自己免疫性甲状腺炎、甲状腺機能不全症（すなわち、橋本甲状
腺炎）、全身性エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、天疱瘡、例えば、
（ａ）グレーヴズ病、（ｂ）重症筋無力症、および（ｃ）インスリン抵抗性のよ
うなレセプター自己免疫、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少性紫斑
病、慢性関節リウマチ、抗コラーゲン抗体を有する強皮症（ｓｃｈｌｅｒｏｄｅ
ｒｍａ）、混合結合組織病、多発性筋炎／皮膚筋炎、悪性貧血、突発性アディソ
ン病、不妊症、糸球体腎炎（例えば、原発性糸球体腎炎およびＩｇＡネフロパシ
ー）、水疱性類天疱瘡、シェーグレン症候群、真性糖尿病、およびアドレナリン
作用性薬物耐性（喘息または線維症に伴うアドレナリン作用性薬物耐性を含む）
、慢性活動性肝疾患、原発性胆汁性肝硬変、他の内分泌腺不全、白斑、脈管炎、
後期心筋梗塞（ｐｏｓｔ−ＭＩ）、心臓切開症候群、じんま疹、アトピー性皮膚
炎、喘息、炎症性筋障害、および他の炎症性、肉芽腫性（ｇｒａｎｕｌａｍａｔ
ｏｕｓ）、変性、および萎縮性の障害を含むが、これらに限定されない）、なら
びに免疫不全、またはこのような疾患もしくは障害に関する状態（重症複合型免
疫不全（ＳＣＩＤ）−Ｘ連鎖、ＳＣＩＤ−常染色体、アデノシンデアミナーゼ不
全症（ＡＤＡ不全症）、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症（ＸＬＡ）、ブルートン
病、先天性無ガンマグロブリン血症、Ｘ連鎖乳児無ガンマグロブリン血症、後天
性無ガンマグロブリン血症、成人発症無ガンマグロブリン血症、遅発性無ガンマ
グロブリン血症、低ガンマグロブリン血症、高ガンマグロブリン血症、新生児期
の一過性ガンマグロブリン血症、不特定の高ガンマグロブリン血症、ガンマグロ
ブリン血症、分類不能型免疫不全（ＣＩＶＤ）（後天性）、ヴィスコット−オー
ルドリッチ症候群（ＷＡＳ）、高ＩｇＭ（ｈｙｐｅｒ ＩｇＭ）を伴うＸ連鎖免
疫不全症、高ＩｇＭ（ｈｙｐｅｒ ＩｇＭ）を伴う非Ｘ連鎖免疫不全症、選択的
ＩｇＡ欠損症、ＩｇＧサブクラス欠損症（ＩｇＡ欠損症を伴うまたは伴わない）
、正常なまたは高められたＩｇｓを伴う抗体欠損症、胸腺腫を伴う免疫不全、Ｉ
ｇ重鎖欠損症、κ鎖欠損症、Ｂ細胞リンパ球増殖障害（ＢＬＰＤ）、選択的Ｉｇ
Ｍ免疫不全症、劣性無ガンマグロブリン血症（スイス型）、細網発育不全（ｒｅ
ｔｉｃｕｌａｒ ｄｙｓｇｅｎｅｓｉｓ）、新生児好中球減少症、重症先天性白
血球減少症、胸腺リンパ形成不全症または免疫不全を伴う形成異常症、毛細血管
拡張性運動失調、短肢小人症、Ｘ連鎖リンパ球増殖症候群（ＸＬＰ）、ネゼロフ
症候群複合Ｉｇｓを伴う免疫不全症、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ欠損症
（ＰＮＰ）、ＭＨＣクラスＩＩ欠損（不全リンパ球症候群）、重症複合免疫不全
症、ＤｉＧｅｏｒｇｅ異常、胸腺発育不全、慢性粘膜カンジダ症、ナチュラルキ
ラー細胞欠損、突発性ＣＤ４＋Ｔリンパ球減少症、および優性Ｔ細胞欠損症を伴
う免疫不全症を含むが、これらに限定されない）。

【０２２７】 特定の実施形態では、本発明の抗体を用いて、対宿主性移植片病および自己免
疫疾患を処置、抑制、予後、診断または予防し得る。

【０２２８】 別の特定の実施形態では、本発明の抗体を用いて、慢性間接リウマチを処置、
抑制、予後、診断または予防する。

【０２２９】 別の特定の実施形態では、本発明の抗体を用いて、全身性エリテマトーデスを
処置、抑制、予後、診断または予防する。本発明のポリペプチドの異常な発現お
よび/または活性に関連した疾患および障害の処置および/または予防は、これら
の疾患および障害に関連した症状を緩和することを含むが、これに限定されない
。本発明の抗体は、当該分野で公知のような、または本明細書中に記載されるよ
うな薬学的に受容可能な組成物中で提供される。

【０２３０】 本発明の抗体が治療的に使用され得る方法の１つの要約は、身体内で局所的に
または全身的に、あるいは（例えば、補体（ＣＤＣ）により、またはエフェクタ
ー細胞（ＡＤＣＣ）により媒介されるような）抗体の直接的な細胞傷害性により
、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを結合させることを含む。これ
らのアプローチのいくつかは、より詳細に以下に記載される。本明細書中で提供
される教示を与えられれば、当業者は、過度の実験なしに、診断上の目的、モニ
タリングの目的あるいは治療上の目的のために、本発明の抗体を使用する方法を
理解する。

【０２３１】 本発明の抗体は、例えば、抗体と相互作用するエフェクター細胞の数または活
性を増加させるように作用する、他のモノクローナル抗体またはキメラ抗体、あ
るいはリンホカインまたは造血増殖因子（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３およびＩ
Ｌ−７など）と組み合わせて有利に利用され得る。

【０２３２】 本発明の抗体は、単独で、または他の型の処置（例えば、放射線療法、化学療
法、ホルモン治療、免疫治療および抗腫瘍剤）との組み合わせで投与され得る。
一般的に、（抗体の場合には）患者の種と同じ種である種起源または種反応性の
生成物の投与が好ましい。従って、好ましい実施形態においては、ヒトの抗体、
フラグメント誘導体、アナログ、または核酸が、治療または予防のために、ヒト
の患者に投与される。

【０２３３】 本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（それらのフラグメントを含む
）に関するイムノアッセイ、およびそれらに関連した障害の治療の両方のために
、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対する、高親和性および／ま
たは強力な、インビボでの阻害抗体および／または中和抗体、そのフラグメント
、またはその領域を使用することが好ましい。このような抗体、フラグメント、
または領域は、好ましくは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（そ
れらのフラグメントを含む）に対して親和性を有する。好ましい結合親和性とし
ては、５×１０^-6Ｍ、１０^-6Ｍ、５×１０^-7Ｍ、１０^-7Ｍ、５×１０^-8Ｍ、１０ ^-8 Ｍ、５×１０^-9Ｍ、１０^-9Ｍ、５×１０^-10Ｍ、１０^-10Ｍ、５×１０^-11Ｍ、
１０^-11Ｍ、５×１０^-12Ｍ、１０^-12Ｍ、５×１０^-13Ｍ、１０^-13Ｍ、５×１０^{- 14} Ｍ、１０^-14Ｍ、５×１０^-15Ｍ、１０^-11Ｍ、５×１０^-12Ｍ、１０^-12Ｍ、５
×１０^-13Ｍ、１０^-13Ｍ、５×１０^-14Ｍ、１０^-14Ｍ、および１０^-15Ｍより小
さい解離定数すなわちＫｄを有する結合親和性が挙げられる。

【０２３４】 （ＡＩＭ ＩＩアゴニストおよびアンタゴニストの同定） 本発明はまた、細胞に対するＡＩＭ ＩＩの作用（例えば、レセプター分子の
ようなＡＩＭ ＩＩ結合分子との相互作用）を増強またはブロックする化合物を
同定するための、化合物をスクリーニングする方法を提供する。アゴニストは、
ＡＩＭ ＩＩの本来の生物学的機能を増加させる化合物であるか、またはＡＩＭ
ＩＩと類似の様式において機能する化合物である。一方、アンタゴニストはそ
のような機能を減少または排除する。

【０２３５】 例えば、細胞区画（例えば、膜の調製物）は、ＡＩＭ ＩＩに結合する分子（
例えば、ＡＩＭ ＩＩによって調節されるシグナル経路または調節経路の分子）
を発現する細胞から調製され得る。その調製物は、ＡＩＭ ＩＩアゴニストもし
くはＡＩＭ ＩＩアンタゴニストであり得る候補分子の非存在下または存在下で
、標識されたＡＩＭ ＩＩと共に培養される。結合分子またはＡＩＭ ＩＩ自身
に結合する候補分子の能力は、標識されたリガンド結合の減少に反映される。無
償で（ｇｒａｔｕｉｔｏｕｓｌｙ）結合する分子、すなわち、ＡＩＭ ＩＩ結合
分子に結合する場合にＡＩＭ ＩＩの効果を誘導することを伴わない分子は、優
良なアンタゴニストである可能性が最も高い。うまく結合し、そしてＡＩＭ Ｉ
Ｉと同じまたは密接に関連した効果を誘発する分子は、優良なアゴニストである
。

【０２３６】 潜在的アゴニストおよびアンタゴニストのＡＩＭ ＩＩ様の効果は、例えば、
細胞または適切な細胞調製物との候補分子の相互作用に続くセカンドメッセンジ
ャー系の活性を決定することにより、およびその効果をＡＩＭ ＩＩの効果もし
くはＡＩＭ ＩＩと同じような効果を誘発する分子の効果と比較することにより
測定され得る。これに関して有用であり得るセカンドメッセンジャー系としては
、ＡＭＰグアニル酸シクラーゼ、イオンチャネル、またはホスホイノシチド加水
分解セカンドメッセンジャー系が挙げられるが、これらに限定されない。

【０２３７】 ＡＩＭ ＩＩアンタゴニストについてのアッセイの別の例は、競合アッセイで
ある。このアッセイは競合的阻害アッセイについての適切な条件下で、ＡＩＭ
ＩＩおよび潜在的アンタゴニストと、膜結合ＡＩＭ ＩＩレセプター分子または
組換えＡＩＭ ＩＩレセプター分子を組み合わせる。ＡＩＭ ＩＩは、例えば、
放射性標識によって標識され得、その結果レセプター分子に結合したＡＩＭ Ｉ
Ｉ分子の数が、潜在的アンタゴニストの有効性を評価するために正確に決定され
得る。

【０２３８】 潜在的アンタゴニストとしては、本発明のポリペプチドに結合し、そしてそれ
によってその活性を阻害または無効にする有機低分子、ペプチド、ポリペプチド
および抗体が挙げられる。潜在的アンタゴニストはまた、ＡＩＭ ＩＩ誘導性活
性を誘導することなく、結合分子（例えば、レセプター分子）上の同じ部位に結
合し、それによって結合からＡＩＭ ＩＩを除外することによりＡＩＭ ＩＩの
作用を妨げる、密接に関連したタンパク質または抗体のような有機低分子、ペプ
チド、ポリペプチドであり得る。本発明のアンタゴニストとしては、配列番号２
に示されるアミノ酸配列を有するＡＩＭ ＩＩポリペプチドのフラグメントが挙
げられる。

【０２３９】 他の潜在的アンタゴニストとしては、アンチセンス分子が挙げられる。アンチ
センス技術は、アンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡを通して、または三重鎖ヘリ
ックス形成を通して遺伝子発現を制御するために使用され得る。アンチセンス技
術は、例えば、Ｏｋａｎｏ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１
）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ
Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、ＣＲＣ Ｐ
ｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒｏｔａｎ、ＦＬ（１９８８）において議論される。三重
鎖ヘリックス形成は、例えば、Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ ６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
４１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：
１３６０（１９９１）において議論される。この方法は、相補的ＤＮＡまたはＲ
ＮＡへのポリヌクレオチドの結合に基づく。例えば、本発明の成熟ポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドの５’コード部分は、長さが約１０〜４０塩基対
のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計するために使用され得る。ＤＮ
Ａオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域に相補的であるように設
計され、それによって転写およびＡＩＭ ＩＩの産生を妨げる。アンチセンスＲ
ＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボでｍＲＮＡにハイブリダイズし、そしてｍ
ＲＮＡ分子のＡＩＭ ＩＩポリペプチドへの翻訳をブロックする。上記されるオ
リゴヌクレオチドはまた、細胞に送達され得、その結果アンチセンスＲＮＡまた
はＤＮＡは、ＡＩＭ ＩＩの産生を阻害するようにインビボで発現され得る。

【０２４０】 （ＡＩＭ ＩＩ、ＡＩＭ ＩＩアゴニストおよびＡＩＭ ＩＩアンタゴニスト
の治療的使用） 腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーリガンドは、多くの細胞応答（細胞傷害性
、抗ウイルス活性、免疫調節活性、およびいくつかの遺伝子の転写調節を含む）
、最も多面的なサイトカインの１つであることが公知である（Ｇｏｅｄｄｅｌ，
Ｄ．Ｖ．ら「Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒｓ：Ｇｅｎｅ Ｓｔ
ｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ」、Ｓ
ｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：５９７−６０９（１９８６）、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ；Ｂｅｕｔｌｅｒ，Ｂ．およびＣｅｒａｍｉ，Ａ
．、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７：５０５−５１８（１９８８）；
Ｏｌｄ，Ｌ．Ｊ．、Ｓｃｉ．Ａｍ．２５８：５９−７５（１９８８）；Ｆｉｅｒ
ｓ，Ｗ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２８５：１９９−２２４（１９９１））。ＴＮＦ
ファミリーリガンドは、ＴＮＦファミリーレセプターに結合することによって、
このような種々の細胞応答を誘導する。

【０２４１】 本発明のＡＩＭ ＩＩポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストまたはア
ンタゴニストは、欠損性ＡＩＭ ＩＩまたは不十分な量のＡＩＭ ＩＩによって
（直接的または間接的に）媒介される任意の障害についての処置を開発する際に
使用され得る。ＡＩＭ ＩＩポリペプチド、アゴニストまたはアンタゴニストは
、このような障害に罹患する患者（例えば、哺乳動物（好ましくは、ヒト））に
投与され得る。あるいは、遺伝子治療アプローチが、このような障害を処置する
ために適用され得る。ＡＩＭ ＩＩヌクレオチド配列の本明細書中の開示は、欠
損性ＡＩＭ ＩＩ遺伝子の検出、および欠損性ＡＩＭ ＩＩ遺伝子の正常なＡＩ
Ｍ ＩＩコード遺伝子での置換を可能にする。欠損性遺伝子は、インビトロ診断
アッセイにおいて、および本明細書中に開示されるＡＩＭ ＩＩヌクレオチド配
列の、この遺伝子に欠損を有することが疑われる患者由来のＡＩＭ ＩＩ遺伝子
のヌクレオチド配列との比較によって、検出され得る。

【０２４２】 本発明のＡＩＭ ＩＩポリペプチドは、リンパ節症を生じるリンパ増殖疾患を
処置するために使用され得、ＡＩＭ ＩＩは、Ｔ細胞のクローン除去を刺激する
ことによってアポトーシスを媒介し、従って、自己免疫疾患を処置するために末
梢性の耐性および細胞傷害性Ｔ細胞媒介性のアポトーシスを刺激するために使用
され得る。ＡＩＭ ＩＩはまた、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、グレーヴ
ズ病、免疫増殖性疾患リンパ節症（ＩＰＬ）、血管免疫芽球増殖性リンパ節症（
ＡＩＬ）、免疫芽球性リンパ節症（ＩＢＬ）、慢性関節リウマチ、糖尿病、およ
び多発性硬化症、アレルギーを含む自己免疫障害の生物学を解明する際の研究手
段として、および対宿主性移植片病を処置するために、使用され得る。

【０２４３】 本発明のＡＩＭ ＩＩポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび／あるいはアゴ
ニストまたはアンタゴニストは、自己免疫障害、免疫不全障害、および対宿主性
移植片病を含むが、これらに限定されない疾患を処置、予防、診断および／また
は予後判定するために使用され得る。

【０２４４】 本発明のＡＩＭ ＩＩポリペプチドはまた、新形成（例えば、腫瘍細胞増殖）
を阻害するために使用され得る。ＡＩＭ ＩＩポリペプチドは、特定の細胞に対
するアポトーシスおよび細胞傷害性による腫瘍の破壊の原因であり得る。ＡＩＭ
ＩＩが、内皮起源の細胞に対して増殖効果を有するので、ＡＩＭ ＩＩはまた
、増殖促進活性を必要とする疾患（例えば、再狭窄）を処置するために使用され
得る。従って、ＡＩＭ ＩＩはまた、内皮細胞発達において造血を調節するため
に使用され得る。

【０２４５】 本発明のＡＩＭ ＩＩポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／あるいはア
ンタゴニストまたはアゴニストによって処置、予防、診断および／またはまたは
予後判定され得る、細胞生存の増大あるいはアポトーシスの阻害に関連する疾患
には、癌（例えば、濾胞性リンパ腫、ｐ５３変異を有する癌腫、およびホルモン
依存性腫瘍、これらは以下：結腸癌、心臓腫瘍、膵臓癌、黒色腫、網膜芽細胞腫
、神経膠芽細胞腫、肺癌、腸の癌、精巣癌、胃癌、神経芽細胞腫、粘液腫、筋腫
、リンパ腫、内皮腫、骨芽細胞腫、骨巨細胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、腺腫、乳癌
、前立腺癌、カポージ肉腫および卵巣癌を含むが、これらに限定されない）；自
己免疫障害（例えば、多発性硬化症、シェーグレン症候群、グレーヴス病、橋本
甲状腺炎、自己免疫糖尿病、胆汁性肝硬変、ベーチェット病（Ｂｅｈｃｅｔ’ｓ
ｄｉｓｅａｓｅ）、クローン病、多発性筋炎、全身性エリテマトーデスおよび
免疫関連糸球体腎炎ならびに慢性関節リウマチ）およびウイルス感染（例えば、
ヘルペスウイルス、ポックスウイルスおよびアデノウイルス）、炎症、対宿主性
移植片病（急性および／または慢性）、急性移植片拒絶、ならびに慢性移植片拒
絶、が挙げられる。好ましい実施形態において、本発明のＡＩＭポリヌクレオチ
ド、ポリペプチド、アンタゴニストまたはアンタゴニストは、特に上記に列挙さ
れるか、または以下の段落の、癌の増殖、進行、および／または転移を阻害する
ために使用される。

【０２４６】 本発明のＡＩＭ ＩＩポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／あるいはア
ンタゴニストまたはアゴニストによって処置、予防、診断および／またはまたは
予後判定され得る、細胞生存の増大に関連するさらなる疾患または状態には、悪
性疾患ならびに以下のような関連する障害の進行および／または転移が挙げられ
るが、これらに限定されない：白血病（急性白血病（例えば、急性リンパ性白血
病、急性骨髄性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤
白血病を含む）を含む）ならびに慢性白血病（例えば、慢性骨髄性（顆粒球性）
白血病および慢性リンパ球性白血病））、真性赤血球増加症、リンパ腫（例えば
、ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマク
ログロブリン血症、Ｈ鎖病、ならびに固形腫瘍（肉腫および癌腫（例えば、線維
肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉
腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、リンパ管肉腫、リンパ管内皮腫、
骨膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌腫、膵臓癌
、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌
、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原生癌、腎細胞癌、肝細胞
癌腫、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、頸部癌、精巣
腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、神経膠星状細胞腫、髄芽
細胞腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏
突起神経膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、黒色腫、神経芽細胞腫、およ
び網膜芽細胞腫）を含むが、これらに限定されない）。

【０２４７】 本発明のＡＩＭ ＩＩポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／あるいはア
ンタゴニストまたはアゴニストによって処置、予防、診断および／またはまたは
予後判定され得る、アポトーシスの増大に関連する疾患には、以下が挙げられる
が、これらに限定されない：ＡＩＤＳ；神経変性障害（例えば、アルツハイマー
病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、小脳変性および脳腫
瘍または以前に関連した疾患）；自己免疫障害（例えば、多発性硬化症、シェー
グレン症候群、グレーヴス病、橋本甲状腺炎、自己免疫糖尿病、胆汁性肝硬変、
ベーチェット病（Ｂｅｈｃｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、クローン病、多発性筋
炎、全身性エリテマトーデスおよび免疫関連糸球体腎炎ならびに慢性関節リウマ
チ）、脊髄形成異常症候群（例えば、再生不良性貧血）、対宿主性移植片病（急
性および／または慢性）、虚血性傷害（心筋梗塞、発作および再灌流傷害によっ
て生じるようなもの）、肝臓傷害または疾患（例えば、肝炎関連肝臓傷害、肝硬
変、虚血／再灌流傷害、胆汁うっ滞（ｃｈｏｌｅｓｔｏｓｉｓ）（胆管傷害）お
よび肝臓癌）；毒物誘導性肝臓疾患（アルコール引き起こされるようなもの）、
敗血症性ショック、潰瘍性大腸（結腸）炎、悪液質ならびに食欲不振。好ましい
実施形態において、ＡＩＭ ＩＩポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニスト
および／またはアンタゴニストは、上記の疾患および障害を処置するために使用
される。

【０２４８】 ＨＩＶに関連する多くの病理は、アポトーシスによって媒介され、これらには
、ＨＩＶ誘導性腎症およびＨＩＶ脳炎が挙げられる。従って、好ましい実施形態
において、本発明のＡＩＭ ＩＩポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニスト
またはアンタゴニストは、ＡＩＤＳおよびＡＩＤＳに関連する病理を処置するた
めに使用される。

【０２４９】 本発明の別の実施形態は、ＨＩＶ感染患者におけるＴ細胞のＡＩＭ ＩＩ媒介
性の死を減少するための、ＡＩＭ ＩＩポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは
アンタゴニストの使用に関する。ＡＩＤＳの発症におけるＴ細胞アポトーシスの
役割は、多くの研究の主題であった（例えば、Ｍｅｙａａｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２５７：２１７−２１９（１９９２）；Ｇｒｏｕｘら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ
．，１７５：３３１（１９９２）；およびＣｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａ
ｎｄ Ａｐｏｔｏｓｉｓ ｉｎ ＨＩＶ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ａｎｄｒｉｅｕ
およびＬｕ編、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１０１−１１４
頁（１９９５）における、Ｏｙａｉｚｕら、を参照のこと）。Ｆａｓ媒介性アポ
トーシスは、ＨＩＶ個体におけるＴ細胞の損失に関連していた（Ｋａｔｓｉｋｉ
ｓら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：２０２９−２０３６（１９９５））。また
、Ｔ細胞アポトーシスは、複数の機構を介して生じるようである。例えば、ＨＩ
Ｖ患者に見出されているＴ細胞死の少なくともいくつかは、ＡＩＭ ＩＩによっ
て媒介されるようである。

【０２５０】 活性化されたヒトＴ細胞は、ＣＤ３／Ｔ細胞レセプター複合体を介する誘発に
際して、プログラムされた細胞死（アポトーシス）（活性化誘導された細胞死（
ＡＩＣＤ）と呼ばれるプロセス）を受けるよう誘導される。ＨＩＶ感染した無症
候個体から単離されたＣＤ４ Ｔ細胞のＡＩＣＤが、報告されている（Ｇｒｏｕ
ｘら、前出）。従って、ＡＩＣＤは、ＣＤ４＋Ｔ細胞の枯渇およびＨＩＶ感染個
体におけるＡＩＤＳの進行において、役割を果たし得る。従って、本発明は、Ｈ
ＩＶ患者におけるＡＩＭ ＩＩ媒介Ｔ細胞死を阻害する方法を提供し、この方法
は、この患者に、ＡＩＭ ＩＩポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはアンタゴ
ニストを投与する工程を包含する。１つの実施形態において、ＡＩＭ ＩＩポリ
ヌクレオチド、ポリペプチドまたはアンタゴニストでの処置が開始されるとき、
患者は、無症候である。所望の場合、処置前に、末梢血Ｔ細胞が、ＨＩＶ患者か
ら抽出され得、そして当該分野で公知の手段によって、ＡＩＭ ＩＩ媒介細胞死
に対する感受性について試験する。１つの実施形態において、患者の血液または
血漿に、本発明のＡＩＭ ＩＩアンタゴニスト（例えば、抗ＡＩＭ ＩＩ抗体）
を、エキソビボで接触させる。このＡＩＭ ＩＩアンタゴニストは、当該分野で
公知の手段によって、適切なクロマトグラフィーマトリクスに結合され得る。こ
の患者の血液または血漿は、このマトリクスに結合されたＡＩＭ ＩＩアンタゴ
ニストを含むクロマトグラフィーカラムを通って流れ、その後、患者に戻される
。固定化されたＡＩＭ ＩＩアンタゴニストは、ＡＩＭ ＩＩを結合し、従って
、患者の血液からＡＩＭ ＩＩタンパク質を除去する。

【０２５１】 さらなる実施形態において、本発明のＡＩＭ ＩＩポリヌクレオチド、ポリペ
プチド、またはアンタゴニストは、Ｔ細胞アポトーシスの他のインヒビターと組
み合わせて投与される。例えば、上記のように、Ｆａｓ媒介アポトーシスはまた
、ＨＩＶ個体におけるＴ細胞の損失に関連していた（Ｋａｔｓｉｋｉｓら、Ｊ．
Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：２０２９−２０３６（１９９５））。従って、Ｆａｓ
リガンド媒介Ｔ細胞死およびＡＩＭ ＩＩ媒介Ｔ細胞死の両方に感受性の患者は
、ＡＩＭ ＩＩ／ＡＩＭ ＩＩレセプター相互作用をブロックする薬剤、および
Ｆａｓリガンド／Ｆａｓ相互作用をブロックする薬剤の両方で処置され得る。Ｆ
ａｓｉリガンドのＦａｓへの結合をブロックするための適切な薬剤としては、可
溶性Ｆａｓポリペプチド；可溶性Ｆａｓポリペプチドのマルチマー形態（例えば
、ｓＦａｓ／Ｆｃのダイマー）；アポトーシスを生じる生物学的シグナルの伝達
を伴わずにＦａｓを結合する、抗Ｆａｓ抗体；ＦａｓリガンドのＦａｓへの結合
をブロックする、抗Ｆａｓリガンド抗体；およびＦａｓを結合するが、アポトー
シスを生じる生物学的シグナルを伝達しない、Ｆａｓリガンドのムテインが挙げ
られるが、これらに限定されない。好ましくは、この方法に従って使用される抗
体は、モノクローナル抗体である。Ｆａｓリガンド／Ｆａｓ相互作用をブロック
（抗Ｆａｓモノクローナル抗体のブロックを含む）するための適切な薬剤の例は
、ＷＯ９５／１０５４０（本明細書によって、参考として援用される）に記載さ
れる。

【０２５２】 別の例において、ＴＲＡＩＬのＴＲＡＩＬレセプターへの結合をブロックする
薬剤が、本発明のＡＩＭ ＩＩポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはアンタ
ゴニストと共に投与される。このような薬剤としては、以下が挙げられるが、こ
れらに限定されない：可溶性ＴＲＡＩＬレセプターポリペプチド（例えば、ＯＰ
Ｇの可溶化形態、ＤＲ４（ＷＯ９８／３２８５６）；ＴＲ５（ＷＯ９８／３０６
９３）；ＤＲ５（ＷＯ９８／４１６２９）；およびＴＲ１０（ＷＯ９８／５４２
０２））；可溶性ＴＲＡＩＬレセプターポリペプチドのマルチマー形態；ならび
にアポトーシスを生じる生物学的シグナルの伝達を伴わずにＴＲＡＩＬレセプタ
ーを結合する、ＴＲＡＩＬレセプター抗体、１以上のＴＲＡＩＬレセプターへの
ＴＲＡＩＬの結合をブロックする、抗ＴＲＡＩＬ抗体、およびＴＲＡＩＬレセプ
ターを結合するが、アポトーシスを生じる生物学的シグナルを伝達しない、ＴＲ
ＡＩＬのムテイン。好ましくは、この方法に使用される抗体は、モノクローナル
抗体である。

【０２５３】 本発明のＡＩＭ ＩＩポリペプチドはまた、造血、および特に、赤血球生成を
調節するために使用され得る。造血は、複数の工程の細胞の増殖および分化プロ
セスであり、これは、多能性幹細胞のプールから開始する。これらの細胞は、異
なる刺激に応答して、造血前駆体に増殖および分化し得る。本発明のＡＩＭ Ｉ
Ｉポリペプチド、ならびにそのアゴニストおよびアンタゴニストは、造血細胞、
および特に、赤血球生成前駆細胞の発生を刺激または阻害のいずれかを行うため
に使用され得る。

【０２５４】 造血細胞の発生を調節するために使用されるＡＩＭ ＩＩポリペプチドは、多
くの形態（例えば、全長ポリペプチドまたは成熟ポリペプチド、ＡＩＭ ＩＩポ
リペプチドフラグメント、またはＡＩＭ ＩＩと非ＡＩＭ ＩＩポリペプチド（
例えば、コロニー刺激因子、エリスロポイエチン、インターフェロン、インター
ロイキンなど）から構成されるハイブリッド融合タンパク質として）で、造血標
的細胞と接触され得る。このような融合タンパク質を生成するための方法は、例
えば、Ｍｅｌｅら、米国特許第５，９１６，７７３号に記載される。

【０２５５】 本明細書中で記載される場合、句「造血細胞」とは、造血起源の細胞（例えば
、赤血球、血小板、リンパ球、好酸球、好塩基球、マクロファージおよび単球）
をいう。さらに、句「赤血球生成前駆細胞」とは、赤血球生成起源の細胞（例え
ば、赤血球）をいう。

【０２５６】 以下の実施例６、９および２２に考察されるように、ＡＩＭ ＩＩポリペプチ
ド（例えば、配列番号２のアミノ酸残基６９〜２４０または８３〜２４０を含む
か、あるいはこれらのアミノ酸残基からなる、ポリペプチド）、ならびにそれら
のアンタゴニスト（例えば、抗ＡＩＭ ＩＩ抗体、ＡＩＭ ＩＩの細胞外ドメイ
ンに含まれるアミノ酸配列を有するＡＩＭ ＩＩの可溶化形態）が、種々の細胞
型（例えば、Ｔ細胞）による、サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳ
Ｆ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−
１３、ＩＬ−１５、抗ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、血管内
皮増殖因子（ＶＥＧＦ））の産生を刺激するために使用され得る。

【０２５７】 ＡＩＭ ＩＩポリペプチド、ならびにそれらのアンタゴニストは、Ｔ細胞免疫
応答を調節するため（例えば、抗原誘導Ｔ細胞増殖を阻害するため）に使用され
得る。

【０２５８】 ＡＩＭ ＩＩポリペプチド、ならびにそれらのアゴニストはまた、細胞媒介免
疫応答を調節する（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞を活性化する）ために使用され得
る。

【０２５９】 ＡＩＭ ＩＩポリペプチド、ならびにそれらのアゴニストはまた、アポトーシ
スを調節するために使用され得る。

【０２６０】 さらに、ＡＩＭ ＩＩポリペプチド、ならびにそれらのアゴニストは、細胞傷
害性Ｔ細胞応答を誘導し、抗原特異的記憶の形成を促進するために使用され得る
。

【０２６１】 本発明のＡＩＭ ＩＩポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはそれら
のアゴニストまたはアンタゴニストはまた、以下のような適用を見出し得る： 特異的抗原に対する免疫応答性を増強するワクチンアジュバント。

【０２６２】 腫瘍特異的免疫応答を増強するためのアジュバント。

【０２６３】 抗ウイルス免疫応答を増強するためのアジュバント：本発明の組成物をアジュ
バントとして使用して増強され得る抗ウイルス免疫応答としては、本明細書中に
開示されるか、さもなければ当該分野で公知である、ウイルスおよびウイルス関
連性の疾患または症状が挙げられる。特定の実施形態において、本発明の組成物
は、以下からなる群より選択される、ウイルス、疾患または症状に対するに免疫
応答を増強するためのアジュバントとして使用される：ＡＩＤＳ、髄膜炎、デン
グ熱、ＥＢＶ、および肝炎（例えば、Ｂ型肝炎）。別の特定の実施形態において
、本発明の組成物は、以下からなる群より選択される、ウイルス、疾患または症
状に対するに免疫応答を増強するためのアジュバントとして使用される：ＨＩＶ
／ＡＩＤＳ、ＲＳウイルス、デング熱（Ｄｅｎｇｕｅ）、ロタウイルス、日本脳
炎Ｂ型、インフルエンザＡ型およびＢ型（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ａｎｄ Ｂ
）、パラインフルエンザ（Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、麻疹（Ｍｅａｓｌｅ
ｓ）、サイトメガロウイルス、狂犬病（Ｒａｂｉｅｓ）、フニン（Ｊｕｎｉｎ）
、チクングニヤ（Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ）、リフトバレー熱、単純ヘルペス（
Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ）、および黄熱病。

【０２６４】 抗菌性または抗真菌性免疫応答を増強するためのアジュバント：本発明の組成
物をアジュバントとして使用して増強され得る抗菌性または抗真菌性の免疫応答
としては、本明細書中に開示されるか、さもなければ当該分野で公知である、細
菌または真菌、および細菌または真菌関連性の疾患または症状が挙げられる。特
定の実施形態において、本発明の組成物は、以下からなる群より選択される、細
菌または真菌、疾患または症状に対する免疫応答を増強するためのアジュバント
として使用される：破傷風、ジフテリア（Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）、ボツリスム
、およびＢ型髄膜炎。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、以下か
らなる群より選択される、細菌または真菌、疾患または症状に対する免疫応答を
増強するためのアジュバントとして使用される：Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ
ｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙ
ｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｐａｒａｔｙｐｈｉ、Ｍｅｉｓｓｅｒｉａ ｍ
ｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
、Ｂ群連鎖球菌、Ｓｈｉｇｅｌｌａ属、腸毒性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ、腸出血性Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、およ
びＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ（マラリア）。

【０２６５】 抗寄生生物性免疫応答を増強するためのアジュバント：本発明の組成物をアジ
ュバントとして使用して増強され得る抗寄生生物性の免疫応答としては、本明細
書中に開示されるか、さもなければ当該分野で公知である、寄生生物および寄生
生物関連性の疾患または症状が挙げられる。特定の実施形態において、本発明の
組成物は、寄生生物に対する免疫応答を増強するためのアジュバントとして使用
される。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、プラスモディウム属
（マラリア）に対する免疫応答を増強するためのアジュバントとして使用される
。

【０２６６】 Ｂ細胞および／またはＴ細胞免疫不全個体（例えば、部分的または完全な脾摘
出を受けた個体など）における免疫応答性をブーストするための薬剤として。本
発明のＡＩＭ ＩＩポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、またはそれらのア
ゴニストを投与することによって改善または処置され得るＢ細胞免疫不全として
は、以下が挙げられ得るがこれらに限定されない：重症複合型免疫不全（ＳＣＩ
Ｄ）−Ｘ連鎖、ＳＣＩＤ−常染色体、アデノシンデアミナーゼ欠損（ＡＤＡ欠損
）、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症（ＸＬＡ）、ブルートン病（Ｂｒｕｔｏｎ’
ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、先天性無ガンマグロブリン血症、Ｘ連鎖乳児無ガンマグ
ロブリン血症、後天性無ガンマグロブリン血症、成人発症無ガンマグロブリン血
症、後期発症無ガンマグロブリン血症、異常ガンマグロブリン血症、低ガンマグ
ロブリン血症、一過性乳児低ガンマグロブリン血症、不特定低ガンマグロブリン
血症、無ガンマグロブリン血症、分類不能型免疫不全（ＣＶＩＤ）（後天性）、
ヴィスコット−オールドリッチ症候群（ＷＡＳ）、高ＩｇＭを伴うＸ連鎖免疫不
全、高ＩｇＭを伴う非Ｘ連鎖免疫不全、選択的ＩｇＡ欠損、ＩｇＧサブクラス欠
損（ＩｇＡ欠損を伴うかまたは伴わない）、正常または上昇したＩｇを伴う抗体
欠損、胸腺腫を伴う免疫不全、Ｉｇ重鎖欠失、κ鎖欠損、Ｂ細胞リンパ増殖障害
（ＢＬＰＤ）、選択的ＩｇＭ免疫不全、劣性無ガンマグロブリン血症（スイス型
）、網膜発育不全、新生児好中球減少、重症先天性白血球減少、胸腺リンパ形成
不全−免疫不全を伴う発育不全または形成異常、毛細管拡張性運動失調、短四肢
小人症（ｓｈｏｒｔ ｌｉｍｂｅｄ ｄｗａｒｆｉｓｍ）、Ｘ連鎖リンパ増殖症
候群（ＸＬＰ）、Ｉｇを伴うネゼロフ症候群複合型免疫不全、プリンヌクレオシ
ドホスホリラーゼ欠損（ＰＮＰ）、ＭＨＣクラスＩＩ欠損（不全リンパ球症候群
）および重症複合型免疫不全。本発明のＡＩＭ ＩＩポリペプチドもしくはポリ
ヌクレオチド、またはそれらのアゴニストを投与することによって改善または処
置され得るＴ細胞免疫不全としては、以下が挙げられ得るがこれらに限定されな
い：ディ・ジョージ異常、胸腺発育不全、慢性粘膜皮膚カンジダ症、ナチュラル
キラー細胞欠損、特発性ＣＤ４＋ Ｔリンパ球減少、および優勢なＴ細胞欠損を
伴う免疫不全。

【０２６７】 Ｂ細胞機能の後天性喪失を有する個体における免疫応答性をブーストするため
の薬剤として。本発明のＡＩＭ ＩＩポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、
またはそれらのアゴニストを投与することにより改善または処置され得る、Ｂ細
胞機能またはＴ細胞機能の後天性喪失となる状態としては、以下が挙げられるが
これらに限定されない：ＨＩＶ感染、ＡＩＤＳ、骨髄移植、およびＢ細胞慢性リ
ンパ性白血病（ＣＬＬ）。

【０２６８】 一時的免疫欠損を有する個体における免疫応答性をブーストするための薬剤と
して。本発明のＡＩＭ ＩＩポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、またはそ
れらのアゴニストを投与することにより改善または処置され得る、一時的免疫不
全となる状態としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ウイルス感
染（例えば、インフルエンザ）からの回復、栄養失調に関連した状態、伝染性単
核球症からの回復、またはストレスに関連した状態、麻疹からの回復、輸血から
の回復、手術からの回復。

【０２６９】 本発明のＡＩＭ ＩＩポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはそれら
のアゴニストもしくはアンタゴニストを用いて、以下の疾患もしくは障害、また
はそれらに関連した状態のうちの１以上の診断、予後判定、処置または予防をし
得る：原発性免疫不全、免疫媒介血小板減少、川崎病、骨髄移植（例えば、成体
または小児における最近の骨髄移植）、慢性Ｂ細胞リンパ性白血病、ＨＩＶ感染
（例えば、成体または小児のＨＩＶ感染）、慢性炎症性脱髄性多発性ニューロパ
シーおよび輸血後紫斑。

【０２７０】 さらに、本発明のＡＩＭ ＩＩポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、また
はそれらのアゴニストもしくはアンタゴニストを用いて、以下の疾患、障害、ま
たはそれらに関連した状態のうちの１以上を診断、予後判定、処置または予防し
得る：ギヤン−バレー症候群、貧血（例えば、パルボウイルスＢ１９に関連した
貧血、感染（例えば、再発性感染）の危険性がある、安定な多発性骨髄腫を有す
る患者、自己免疫溶血性貧血（例えば、温暖型自己免疫溶血性貧血）、血小板減
少（例えば、新生児血小板減少）、および免疫媒介好中球減少）、移植（例えば
、ＣＭＶ陽性器官の、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）陰性レシピエント）、低
ガンマグロブリン血症（例えば、感染または病的状態についての危険因子を伴う
低ガンマグロブリン血症新生児）、癲癇（例えば、難治性癲癇）、全身性脈管炎
症候群、重症筋無力症（例えば、重症筋無力症における代償不全）、皮膚筋炎、
および多発性筋炎。

【０２７１】 本発明のＡＩＭ ＩＩ ポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／またはア
ンタゴニスト（例えば、抗ＡＩＭ ＩＩ抗体）を用いて処置、予防および／また
は診断され得る自己免疫障害およびこれらの障害に関連した状態としては、以下
が挙げられるがこれらに限定されない：自己免疫溶血性貧血、自己免疫新生児血
小板減少、特発性血小板減少紫斑、自己免疫性血球減少症、溶血性貧血、抗リン
脂質症候群、皮膚炎、アレルギー性脳脊髄炎、心筋炎、再発性多発性軟骨炎、リ
ウマチ心疾患、糸球体腎炎（例えば、ＩｇＡネフロパシー）、多発性硬化症、神
経炎、ブドウ膜炎眼炎、多発性内分泌腺症、紫斑（例えば、ヘーノッホ−シェー
ンライン（Ｈｅｎｌｏｃｈ−Ｓｃｏｅｎｌｅｉｎ）紫斑）、ライター病、スティ
ッフマン症候群、自己免疫肺炎症、ギヤン−バレー症候群、インスリン依存性糖
尿病、および自己免疫炎症性眼疾患。

【０２７２】 本発明の組成物で処置、予防および／または診断され得る、（非常に疑わしい
）さらなる自己免疫障害としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：
自己免疫甲状腺炎、甲状腺機能低下（すなわち、橋本甲状腺炎）（しばしば、例
えば、細胞媒介性および体液性の甲状腺細胞傷害性によって特徴付けられる）、
全身性エリテマトーデス（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｈｙｔｈｅｍａ
ｔｏｓｕｓ）（しばしば、例えば、循環しそして局所で生成される免疫複合体に
よって特徴付けられる）、グッドパスチャー症候群（しばしば、例えば、抗基底
膜抗体によって特徴付けられる）、天疱瘡（しばしば、例えば、表皮棘細胞離開
（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ａｃａｎｔｈｏｌｙｔｉｃ）抗体によって特徴付けられ
る）、レセプター自己免疫（例えば、（ａ）グレーヴズ病（しばしば、例えば、
ＴＳＨレセプター抗体によって特徴付けられる）、（ｂ）重症筋無力症（しばし
ば、例えば、アセチルコリンレセプター抗体によって特徴付けられる）、および
（ｃ）インスリン抵抗性（しばしば、例えば、インスリンレセプター抗体によっ
て特徴付けられる）、自己免疫溶血性貧血（しばしば、例えば、抗体感作ＲＢＣ
の食作用によって特徴付けられる）、自己免疫血小板減少性紫斑（しばしば、例
えば、抗体感作血小板の食作用によって特徴付けられる）など）。

【０２７３】 本発明の組成物を用いて処置、予防および／または診断され得る、（可能であ
る）さらなる自己免疫障害としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない
：慢性関節リウマチ（しばしば、例えば、関節における免疫複合体によって特徴
付けられる）、抗コラーゲン抗体を有する強皮症（ｓｃｈｌｅｒｏｄｅｒｍａ）
（しばしば、例えば、核小体および他の核抗体によって特徴付けられる）、混合
結合組織病（しばしば、例えば、抽出可能な核抗原（例えば、リボ核タンパク質
）に対する抗体によって特徴付けられる）、多発性筋炎／皮膚筋炎（しばしば、
例えば、非ヒストンＡＮＡによって特徴付けられる）、悪性貧血（しばしば、例
えば、抗壁細胞、ミクロソームおよび内性因子抗体によって特徴付けられる）、
特発性アディソン病（しばしば、例えば、体液性および細胞媒介性の副腎細胞傷
害性によって特徴付けられる）、不妊症（しばしば、例えば、抗精子抗体によっ
て特徴付けられる）、糸球体腎炎（しばしば、例えば、糸球体基底膜抗体または
免疫複合体によって特徴付けられる）、例えば、原発性糸球体腎炎およびＩｇＡ
ネフロパシー、水疱性類天疱瘡（しばしば、例えば、基底膜におけるＩｇＧおよ
び補体によって特徴付けられる）、シェーグレン症候群（しばしば、例えば、複
数組織抗体および／または特異的非ヒストンＡＮＡ（ＳＳ−Ｂ）によって特徴付
けられる）、糖尿病（しばしば、例えば、細胞媒介および体液性の島細胞抗体に
よって特徴付けられる）、およびアドレナリン作用性薬物耐性（喘息または嚢胞
性線維症を伴うアドレナリン作用性薬物耐性を含む）（しばしば、例えば、β−
アドレナリン作用性レセプター抗体によって特徴付けられる）。

【０２７４】 本発明の組成物を用いて処置、予防および／または診断され得る、（可能であ
る）さらなる自己免疫障害としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない
：慢性活動性肝炎（しばしば、例えば、平滑筋抗体によって特徴付けられる）、
原発性胆汁性肝硬変（しばしば、例えば、ミトコンドリア抗体によって特徴付け
られる）、他の内分泌線欠損（しばしば、いくつかの場合、例えば、特異的な組
織抗体によって特徴付けられる）、白斑（しばしば、例えば、メラノサイト抗体
によって特徴付けられる）、脈管炎（しばしば、例えば、血管壁におけるＩｇお
よび補体ならびに／または低血清補体によって特徴付けられる）、ＭＩ後（ｐｏ
ｓｔ−ＭＩ）（しばしば、例えば、心筋抗体によって特徴付けられる）、心臓切
開症候群（しばしば、例えば、心筋抗体によって特徴付けられる）、蕁麻疹（し
ばしば、例えば、ＩｇＥに対するＩｇＧおよびＩｇＭ抗体によって特徴付けられ
る）、アトピー性皮膚炎（しばしば、例えば、ＩｇＥに対するＩｇＧおよびＩｇ
Ｍ抗体によって特徴付けられる）、喘息（しばしば、例えば、ＩｇＥに対するＩ
ｇＧおよびＩｇＭ抗体によって特徴付けられる）、炎症性ミオパシー、ならびに
多くの他の炎症性障害、肉芽腫性（ｇｒａｎｕｌａｍａｔｏｕｓ）障害、変性性
障害および萎縮性障害。

【０２７５】 好ましい実施形態では、自己免疫性の疾患および障害ならびに／または上記の
疾患および障害に関連する状態は、抗ＡＩＭ ＩＩ抗体を用いて処置、予防およ
び／または診断される。

【０２７６】 特定の好ましい実施形態では、慢性関節リウマチは、本発明の抗ＡＩＭ ＩＩ
抗体および／または他のアンタゴニストを用いて処置、予防および／または診断
される。

【０２７７】 特定の好ましい実施形態では、狼瘡は、本発明の抗ＡＩＭ ＩＩ抗体および／
または他のアンタゴニストを用いて処置、予防および／または診断される。

【０２７８】 特定の好ましい実施形態では、狼瘡に関連する腎炎は、本発明の抗ＡＩＭ Ｉ
Ｉ抗体および／または他のアンタゴニストを用いて処置、予防および／または診
断される。

【０２７９】 特定の実施形態では、ＡＩＭ ＩＩポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、
またはそれらのアンタゴニスト（例えば、抗ＡＩＭ ＩＩ抗体）を用いて、全身
性エリテマトーデスおよび／またはそれらに関連した疾患、障害もしくは状態を
処置または予防する。本発明のＡＩＭ ＩＩポリヌクレオチドもしくはポリペプ
チド、またはアンタゴニストを用いて処置または予防され得る、狼瘡に関連する
疾患、障害または状態としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：血
液学的障害（例えば、溶血性貧血、白血球減少、リンパ球減少および血小板減少
）、免疫学的障害（例えば、抗ＤＮＡ抗体および抗Ｓｍ抗体）、発疹、羞明、口
腔の潰瘍、関節炎、発熱、疲労、体重減少、漿膜炎（例えば、腹膜炎性（ｐｌｅ
ｕｒｉｔｕｓ）（胸膜炎（ｐｌｅｕｒｉｃｙ）））、腎障害（例えば、腎炎）、
神経学的障害（例えば、発作（ｓｅｉｚｕｒｅ）、末梢ニューロパシー、ＣＮＳ
関連障害）、胃腸（ｇａｓｔｒｏｉｎｓｔｅｓｔｉｎａｌ）障害、レーノー現象
、および心膜炎。好ましい実施形態では、ＡＩＭ ＩＩポリヌクレオチドもしく
はポリペプチド、またはそれらのアンタゴニスト（例えば、抗ＡＩＭ ＩＩ抗体
）を用いて、全身性エリテマトーデスに関連する腎障害を処置または予防する。
最も好ましい実施形態では、ＡＩＭ ＩＩポリヌクレオチドもしくはポリペプチ
ド、またはそれらのアンタゴニスト（例えば、抗ＡＩＭ ＩＩ抗体）を用いて、
全身性エリテマトーデスに関連する腎炎を処置または予防する。

【０２８０】 特定の実施形態では、本発明の可溶性ＡＩＭ ＩＩポリペプチド（例えば、配
列番号２のアミノ酸６９〜２４０またはアミノ酸８３〜２４０を含むかあるいは
これらからなるポリペプチド）またはそれらのアゴニストを投与して、以下を処
置、予防、予後判定および／または診断する：免疫不全（例えば、重症複合型免
疫不全（ＳＣＩＤ）−Ｘ連鎖、ＳＣＩＤ−常染色体、アデノシンデアミナーゼ欠
損（ＡＤＡ欠損）、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症（ＸＬＡ）、ブルートン病、
先天性無ガンマグロブリン血症、Ｘ連鎖乳児無ガンマグロブリン血症、後天性無
ガンマグロブリン血症、成人発症無ガンマグロブリン血症、後期発症無ガンマグ
ロブリン血症、異常ガンマグロブリン血症、低ガンマグロブリン血症、一過性乳
児低ガンマグロブリン血症、不特定低ガンマグロブリン血症、無ガンマグロブリ
ン血症、分類不能型免疫不全（ＣＶＩＤ）（後天性）、ヴィスコット−オールド
リッチ症候群（ＷＡＳ）、高ＩｇＭを伴うＸ連鎖免疫不全、高ＩｇＭを伴う非Ｘ
連鎖免疫不全、選択的ＩｇＡ欠損、ＩｇＧサブクラス欠損（ＩｇＡ欠損を伴うか
または伴わない）、正常または上昇したＩｇを伴う抗体欠損、胸腺腫を伴う免疫
不全、Ｉｇ重鎖欠失、κ鎖欠損、Ｂ細胞リンパ増殖障害（ＢＬＰＤ）、選択的Ｉ
ｇＭ免疫不全、劣性無ガンマグロブリン血症（スイス型）、網膜発育不全、新生
児好中球減少、重症先天性白血球減少、胸腺リンパ形成不全−免疫不全を伴う発
育不全または形成異常、毛細管拡張性運動失調、短四肢小人症、Ｘ連鎖リンパ増
殖症候群（ＸＬＰ）、Ｉｇを伴うネゼロフ症候群−複合型免疫不全、プリンヌク
レオシドホスホリラーゼ欠損（ＰＮＰ）、ＭＨＣクラスＩＩ欠損（不全リンパ球
症候群）ならびに重症複合型免疫不全、ディ・ジョージ異常、胸腺発育不全、慢
性粘膜皮膚カンジダ症、ナチュラルキラー細胞欠損、特発性ＣＤ４＋ Ｔリンパ
球減少、および優勢なＴ細胞不全を伴う免疫不全）あるいは免疫不全に関連する
障害。

【０２８１】 多数の可溶性形態の本発明のポリペプチドを用いて、疾患状態を処置、予防、
予後判定および／または診断し得る。これらの可溶性形態は一般に、ＡＩＭ Ｉ
Ｉ膜貫通ドメインを欠く。可溶性ＡＩＭ ＩＩポリペプチドの例としては、細胞
外ドメインおよび細胞内ドメインが存在するが、膜貫通ドメインが欠失している
ものが挙げられる。さらなる例は、配列番号２のアミノ酸６０〜２４０、６９〜
２４０または８３〜２４０を含むか、あるいはこれらからなる。

【０２８２】 特定の実施形態では、本発明のＡＩＭ ＩＩポリペプチドもしくはポリヌクレ
オチド、またはそれらのアゴニストを投与して、分類不能型免疫不全を処置、予
防、予後判定および／または診断する。

【０２８３】 特定の実施形態では、本発明のＡＩＭ ＩＩポリペプチドもしくはポリヌクレ
オチド、またはそれらのアゴニストを投与して、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症
を処置、予防、予後判定および／または診断する。

【０２８４】 別の特定の実施形態では、本発明のＡＩＭ ＩＩポリペプチドもしくはポリヌ
クレオチド、またはそれらのアゴニストを投与して、重症複合型免疫不全（ＳＣ
ＩＤ）を処置、予防、予後判定および／または診断する。

【０２８５】 別の特定の実施形態では、本発明のＡＩＭ ＩＩポリペプチドもしくはポリヌ
クレオチド、またはそれらのアゴニストを投与して、ヴィスコット−オールドリ
ッチ症候群を処置、予防、予後判定および／または診断する。

【０２８６】 別の特定の実施形態では、本発明のＡＩＭ ＩＩポリペプチドもしくはポリヌ
クレオチド、またはそれらのアゴニストを投与して、高ＩｇＭを伴うＸ連鎖Ｉｇ
欠損を処置、予防、予後判定および／または診断する。

【０２８７】 別の特定の実施形態では、本発明のＡＩＭ ＩＩポリペプチドもしくはポリヌ
クレオチド、またはそれらのアゴニストを投与して、ディ・ジョージ異常を処置
、予防、予後判定および／または診断する。

【０２８８】 ＡＩＭ ＩＩ アンタゴニストはまた、例えば、本明細書中以下で記載される
ような、薬学的に受容可能なキャリアを伴う組成物中で用いられ得る。

【０２８９】 アンタゴニストはさらに、例えば、ＡＩＭ ＩＩによって抑制されると考えら
れる、リポタンパク質リパーゼの全身性欠損から生じる脂質除去欠損である、悪
液質を処置するために用いられ得る。ＡＩＭ ＩＩアンタゴニストをまた用いて
、大脳マラリアを処置し得る。大脳マラリアでは、ＡＩＭ ＩＩは、病原の役割
を果たし得る。

【０２９０】 ＡＩＭ ＩＩアンタゴニストをまた用いて、（例えば、移植片の存在下におけ
る免疫系の刺激を予防することにより）移植片−宿主拒絶を予防し得る。

【０２９１】 ＡＩＭ ＩＩアンタゴニストをまた用いて、移植片−宿主疾患を予防し得る。
好ましい実施形態では、抗ＡＩＭ ＩＩ 抗体を用いて、移植片−宿主疾患を予
防する。

【０２９２】 ＡＩＭ ＩＩアンタゴニストをまた用いて、骨吸収を阻害し得、それゆえ、骨
粗鬆症を処置および／または予防し得る。

【０２９３】 アンタゴニストはまた、抗炎症剤として用いられ得、そしてエンドトキシンシ
ョックを処置するために用いられ得る。この重要な状態は、細菌感染および他の
型の感染に対する悪化した応答から生じる。

【０２９４】 ＡＩＭ ＩＩアンタゴニストはまた、以下の通りの適用を見出し得る： １以上のサイトカインの産生のインヒビターとして。

【０２９５】 細胞溶解性Ｔ細胞応答および抗原特異的記憶の形成のインヒビターとして。

【０２９６】 Ｔ細胞免疫応答のモジュレーター（例えば、抗原誘導性Ｔ細胞増殖のインヒビ
ター）として。

【０２９７】 細胞媒介性免疫応答のモジュレーター（例えば、細胞溶解性Ｔ細胞活性化のイ
ンヒビター）として。

【０２９８】 特定の実施形態では、抗体またはその機能的誘導体をコードする配列を含む核
酸を投与して、本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性と関連し
た疾患または障害を、遺伝子治療によって処置、阻害または予防する。遺伝子治
療とは、発現されたかまたは発現性の核酸の、被験体への投与によって行われる
治療をいう。本発明のこの実施形態では、核酸は、治療効果を媒介する、それら
のコードするタンパク質を産生する。

【０２９９】 当該分野で利用可能な遺伝子治療のための任意の方法は、本発明に従って用い
られ得る。例示的な方法を以下に記載する。

【０３００】 遺伝子治療の方法の一般的概説については、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら、１９９３
、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４８８−５０５；ＷｕおよびＷ
ｕ、１９９１、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７−９５；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ
、１９９３、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５
７３−５９６；Ｍｕｌｌｉｇａｎ、１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６
−９３２；ならびにＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ、１９９３、Ａｎｎ．
Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７； １９９３年５月、ＴＩＢＴ
ＥＣＨ １１（５）：１５５−２１５を参照のこと。組換えＤＮＡ技術の分野で
通常公知の、用いられ得る方法は、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、１９９３、Ｃｕｒ
ｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、
Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ＮＹ；およびＫｒｉｅｇｌｅｒ、１９９
０、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹに記載さ
れる。

【０３０１】 好ましい局面では、この化合物は、抗体をコードする核酸配列を含み、この核
酸配列は、適切な宿主において抗体またはそのフラグメントもしくはキメラタン
パク質または重鎖もしくは軽鎖を発現する発現ベクターの一部である。特に、こ
のような核酸配列は、抗体コード領域に作動可能に連結されたプロモーターを有
し、このプロモーターは、誘導性または構成性であり、そして必要に応じて組織
特異的である。別の特定の実施形態では、抗体コード配列および任意の他の所望
の配列が、ゲノム中での所望の部位での相同組換えを促進する領域に隣接してお
り、従って抗体核酸の染色体内発現を提供する核酸分子が用いられる（Ｋｏｌｌ
ｅｒおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２−８９３５；Ｚｉｊｌｓｔｒａら、１９８９、Ｎａ
ｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８）。特定の実施形態では、発現された抗体分
子は、単鎖抗体である；あるいは、この核酸配列は、この抗体の重鎖および軽鎖
の両方、またはそれらのフラグメントをコードする配列を含む。

【０３０２】 患者への核酸の送達は、直接的（この場合、患者は、核酸または核酸保有ベク
ターに直接曝露される）または間接的（この場合、細胞は、インビトロで核酸を
用いて最初に形質転換され、次いで患者中に移植される）のいずれかであり得る
。これらの２つのアプローチは、それぞれ、インビボ遺伝子治療またはエキソビ
ボ遺伝子治療として公知である。

【０３０３】 特定の実施形態では、核酸配列はインビボで直接的に投与され、そこで核酸配
列は発現されて、コードされる産物を産生する。これは、当該分野で公知の多数
の方法（例えば、それらを適切な核酸発現ベクターの一部分として構築し、そし
てそれを（例えば、欠損性または弱毒化したレトロウイルスまたは他のウイルス
ベクター（米国特許第４，９８０，２８６号を参照のこと）を用いる感染により
）細胞内になるように投与することにより、あるいは、裸のＤＮＡの直接注射に
より、あるいは、微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔ
ｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）の使用により、あるいは脂質または細胞表面レセプターま
たはトランスフェクト剤でコーティングするか、リポソーム、微粒子、またはマ
イクロカプセル中へのカプセル化により、あるいは、それらを核に入ることが公
知であるペプチドと結合させて投与することにより、レセプター媒介のエンドサ
イトーシスを受けるリガンド（これは、レセプターを特異的に発現する細胞の型
を標的にするために用いられ得る）と結合させて投与することにより（例えば、
ＷｕおよびＷｕ，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４
３２を参照のこと）などのいずれかにより達成され得る。別の実施形態において
、核酸−リガンド複合体が形成され得、ここで、このリガンドはエンドソームを
破壊するフソジェニック（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）ウイルス性ペプチドを含み、こ
の核酸がリソソーム分解を回避することを可能にする。さらに別の実施形態にお
いて、核酸は、特定のレセプターを標的化することにより、細胞特異的な取り込
みおよび発現についてインビボで標的化され得る（例えば、１９９２年４月１６
日付のＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０６１８０号（Ｗｕら）；１９９２年１２月２３
日付の同第ＷＯ９２／２２６３５号（Ｗｉｌｓｏｎら）；１９９２年１１月２６
日付の同第ＷＯ９２／２０３１６号（Ｆｉｎｄｅｉｓら）；１９９３年７月２２
日付の同第ＷＯ９３／１４１８８号（Ｃｌａｒｋｅら）、１９９３年１０月１４
日付の同第ＷＯ９３／２０２２１号（Ｙｏｕｎｇら）を参照のこと）。あるいは
、核酸は、細胞内部に導入され得、そして相同組換えにより、発現のために宿主
細胞ＤＮＡ中に組み込まれ得る（ＫｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ，１９８
９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２−８９３
５；Ｚｉｊｌｓｔｒａら，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８）
。

【０３０４】 特定の実施形態において、本発明の抗体をコードする核酸配列を含むウイルス
ベクターが使用される。例えば、レトロウイルスベクターが用いられ得る（Ｍｉ
ｌｌｅｒら，１９９３，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５８１−５９９を
参照のこと）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルス性ゲノムの正確な
パッケージングおよび宿主細胞ＤＮＡへの組込みのために必要でないレトロウイ
ルス配列を欠失している。遺伝子治療において使用される抗体をコードする核酸
配列は、一つ以上のベクター中にクローニングされ、これは、患者内への遺伝子
の送達を容易にする。レトロウイルスベクターに関するさらなる詳細は、Ｂｏｅ
ｓｅｎら，１９９４，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ６：２９１−３０２（これは、幹
細胞を化学療法に対してより耐性にするために、ｍｄｒ１遺伝子を造血性幹細胞
に送達するための、レトロウイルスベクターの使用を記載する）に見出され得る
。遺伝子治療におけるレトロウイルスベクターの使用を説明する他の参考文献は
、以下である：Ｃｌｏｗｅｓら，１９９４，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３
：６４４−６５１；Ｋｉｅｍら，１９９４，Ｂｌｏｏｄ ８３：１４６７−１４
７３；ＳａｌｍｏｎｓおよびＧｕｎｚｂｅｒｇ，１９９３，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎ
ｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：１２９−１４１；ならびにＧｒｏｓｓｍａｎおよびＷ
ｉｌｓｏｎ，１９９３，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ
Ｄｅｖｅｌ．３：１１０−１１４。

【０３０５】 アデノウイルスは、遺伝子治療において使用され得る他のウイルスベクターで
ある。アデノウイルスは、特に、気道上皮へ遺伝子を送達するための魅力的なビ
ヒクルである。アデノウイルスは、自然に気道上皮に感染し、そこで軽い疾患を
起こす。アデノウイルスベースの送達システムの他の標的は、肝臓、中枢神経系
、内皮細胞、および筋肉である。アデノウイルスは、非分裂細胞を感染すること
ができるという利点を有する。ＫｏｚａｒｓｋｙおよびＷｉｌｓｏｎ，１９９３
，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖ
ｅｌｏｐｍｅｎｔ ３：４９９−５０３は、アデノウイルスベースの遺伝子治療
の概説を示す。Ｂｏｕｔら，１９９４，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ
５：３−１０は、アカゲザルの気道上皮に遺伝子を移すためのアデノウイルス
ベクターの使用を示した。遺伝子治療におけるアデノウイルスの使用の他の例は
、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４
；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら，１９９２，Ｃｅｌｌ ６８：１４３−１５５；Ｍａｓ
ｔｒａｎｇｅｌｉら，１９９３，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２２５−
２３４；ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／１２６４９号；およびＷａｎｇら，１９９５，
Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７７５−７８３に見出され得る。好ましい実施
形態において、アデノウイルスベクターが使用される。

【０３０６】 アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）はまた、遺伝子治療における使用が提案されて
きた（Ｗａｌｓｈら，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ
．２０４：２８９−３００；米国特許第５，４３６，１４６号）。

【０３０７】 遺伝子治療への別のアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェクショ
ン、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、またはウイルス感染のような
方法により、組織培養中の細胞へ遺伝子を移入する工程を包含する。通常、移入
の方法は、選択可能なマーカーの細胞への移入を含む。次いで、細胞は、移入さ
れた遺伝子を取り込みそして発現する細胞を単離するために選択下に置かれる。
次いで、それらの細胞は患者に送達される。

【０３０８】 この実施形態においては、得られる組換え細胞のインビボ投与の前に、その核
酸が細胞に導入される。このような導入は、当該分野において公知の任意の方法
により実施され得、それらの方法としては以下が挙げられるがこれらに限定され
ない：トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクシ
ョン、その核酸配列を含むウイルスベクターまたはバクテリオファージベクター
での感染、細胞融合、染色体媒介性遺伝子移入、マイクロセル（ｍｉｃｒｏｃｅ
ｌｌ）媒介性遺伝子移入、スフェロプラスト融合など。細胞への外来遺伝子の導
入については、当該分野において多数の技術が公知であり（例えば、Ｌｏｅｆｆ
ｌｅｒおよびＢｅｈｒ，１９８３、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５９９
−６１８；Ｃｏｈｅｎら，１９８３、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：６１
８−６４４（１９９３）；Ｃｌｉｎｅ，１９８５、Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．
２９：６９−９２ｍを参照のこと）、そしてレシピエント細胞の必要な発生的お
よび生理学的機能が破壊されない場合、本発明に従って使用され得る。この技術
は、細胞への核酸の安定した移入を提供するはずであり、その結果、その核酸は
、その細胞により発現可能であり、そして好ましくは、その細胞の子孫により遺
伝性でかつ発現可能である。

【０３０９】 得られた組換え細胞は、当該分野において公知の様々な方法により、患者へ送
達され得る。組換え血球（例えば、造血幹細胞または造血前駆細胞）は、好まし
くは、静脈内投与される。使用が考えられる細胞の量は、所望の効果、患者の状
態などに依存し、そして当業者により決定され得る。

【０３１０】 遺伝子治療の目的のために核酸が導入され得る細胞は、任意の所望の利用可能
な細胞型を包含し、そして以下を含むがそれらに限定されない：上皮細胞、内皮
細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞；Ｔリンパ球、Ｂリンパ
球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球のような、血球；
種々の幹細胞または前駆細胞、特に、造血幹細胞または造血前駆細胞（例えば、
骨髄、臍帯血、末梢血、胎児の肝臓などから得られるような細胞）。

【０３１１】 好ましい実施形態において、遺伝子治療に使用される細胞は、患者に対して自
己由来である。

【０３１２】 遺伝子治療において組換え細胞が使用される実施形態において、抗体をコード
する核酸配列は、その細胞またはそれらの子孫によりその核酸配列が発現可能で
あるように細胞に導入され、次いで組換え細胞は、治療的効果のためにインビボ
で投与される。特定の実施形態において、幹細胞または前駆細胞が用いられる。
インビトロで単離され得かつ維持され得る任意の幹細胞および／または前駆細胞
は、本発明のこの実施形態に従って潜在的に使用され得る（例えば、ＰＣＴ公開
ＷＯ９４／０８５９８（１９９４年４月２８日）：ＳｔｅｍｐｌｅおよびＡｎｄ
ｅｒｓｏｎ，１９９２、Ｃｅｌｌ ７１：９７３−９８５；Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ
，１９８０、Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．２１Ａ：２２９；ならびにＰｉｔｔ
ｅｌｋｏｗおよびＳｃｏｔｔ，１９８０、Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ Ｐｒｏｃ．
６１：７７１を参照のこと）。

【０３１３】 特定の実施形態において、遺伝子治療の目的で導入される核酸は、コード領域
に作動可能に連結された誘導性プロモーターを含有し、その結果、その核酸の発
現は、適切な転写誘導因子の存在または非存在を制御することにより制御可能で
ある。

【０３１４】 上記のように、本発明のアンタゴニストおよびアゴニストは、ＡＩＭ ＩＩポ
リペプチドを含む。これらのポリペプチドは、例えば、レセプターのような細胞
性タンパク質に結合することによって、その効果を調節し得る。特定のタンパク
質と相互作用するペプチドを同定するための方法は、当該分野で公知である。例
えば、ＰｈｉｚｉｃｋｙおよびＦｉｅｌｄｓ、「Ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉ
ｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ」Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５９：９４〜１２
３（１９９５）は、第２のポリペプチドに対する結合親和性を有するペプチドを
同定するためにペプチドをスクリーニングするための方法を記載する。Ｐｈｉｚ
ｉｃｋｙおよびＦｉｅｌｄｓは、タンパク質アフィニティークロマトグラフィー
、アフィニティーブロッティング、同時免疫沈降、および架橋のような方法を考
察している。本発明を用いる使用に適切なさらなる分子生物学的方法としては、
発現ライブラリーのタンパク質プロービング、ツーハイブリッド系、細胞パニン
グ、およびファージディスプレイが、挙げられる。

【０３１５】 細胞表面レセプターに結合する本発明のＡＩＭ ＩＩポリペプチドを同定する
ための別の方法は、そのレセプターをコードするＤＮＡで真核生物細胞をトラン
スフェクションし、その結果、その細胞がその表面上にレセプターを発現する工
程、続いて、その細胞を標識（例えば、放射能標識、ビオチンなど）ＡＩＭ Ｉ
Ｉポリペプチドと接触させる工程を包含する。その細胞に結合した標識ＡＩＭ
ＩＩポリペプチドの量が測定され、そしてコントロール細胞に結合した量と比較
される。このコントロール細胞は、一般的には、その表面レセプターを発現しな
い細胞である。そのコントロール細胞と比較した場合の、そのレセプターを発現
する細胞に結合した標識の量の増加を検出することは、そのレセプターを発現す
る細胞がそのＡＩＭ ＩＩポリペプチドに結合することを示す。

【０３１６】 さらに、当業者は、ＡＩＭ ＩＩポリペプチドを発現および保持する細胞が、
ＡＩＭ ＩＩリガンドを同定するために使用され得ることを、認識する。１つの
このような実施形態において、ＡＩＭ ＩＩを発現する細胞が、検出可能に標識
された潜在的リガンドと接触させられる。さらに、このようなリガンドは、ファ
ージの表面上の配列のライブラリー（例えば、ファージディスプレイライブラリ
ー）の一部として発現される、ポリペプチドであり得る。

【０３１７】 一旦目的の細胞表面レセプターに結合するＡＩＭ ＩＩポリペプチドが同定さ
れると、そのＡＩＭ ＩＩポリペプチドが特定のレセプターにより通常惹起され
るレセプター媒介性細胞性応答を誘導または阻害するか否かを決定するために、
アッセイが実施され得る。ＡＩＭ ＩＩポリペプチドがレセプター媒介性細胞性
応答を活性化するか否かは、そのＡＩＭ ＩＩポリペプチドまたは別のリガンド
の存在下でそのレセプターにより惹起されることが既知である細胞性応答を測定
することによって、決定され得る。さらに、ＡＩＭ ＩＩポリペプチドがレセプ
ター媒介性細胞性応答を阻害するか否かは、その細胞性応答を誘導することが既
知である分子およびそのＡＩＭ ＩＩポリペプチドの両方の存在下でそのレセプ
ターにより惹起されることが既知の細胞性応答を測定することによって、決定さ
れ得る。

【０３１８】 本発明のポリペプチド（例えば、配列番号２のアミノ酸６９〜２４０または８
３〜２４０を含むかまたはこれらからなる、ＡＩＭポリペプチド）の可溶性形態
は、例えば、上記のリガンド結合およびレセプター活性化／阻害アッセイにおい
て、利用され得る。

【０３１９】 ＡＩＭ ＩＩはまた、光受容体細胞の分化および生存を阻害することが示され
ている。さらに、ＡＩＭ ＩＩは、網膜細胞によるロドプシンの産生を阻害する
ことが示されている。従って、ＡＩＭ ＩＩポリペプチドおよびＡＩＭ ＩＩア
ゴニストは、光受容体細胞（例えば、杆体および錐体）の分化および生存を阻害
するため、ならびに網膜細胞（例えば、杆体）によるロドプシン産生を阻害する
ために、有用である。

【０３２０】 本発明のＡＩＭ ＩＩポリペプチド、アゴニストまたはアンタゴニストは、末
梢動脈疾患（例えば、四肢の虚血）を含む、心血管障害を処置するために使用さ
れ得る。

【０３２１】 心血管障害としては、以下のような心血管異常が挙げられる：動動脈瘻（ａｒ
ｔｅｒｉｏ−ａｒｔｅｒｉａｌ ｆｉｓｔｕｌａ）、動静脈瘻、脳動静脈奇形、
先天性心欠損、肺動脈弁閉鎖症、およびシミター症候群。先天性心欠損としては
、大動脈縮窄症、三房心、冠状脈管（ｃｏｒｏｎａｒｙ ｖｅｓｓｅｌ）奇形、
交差心、右胸心、動脈管開存症、エブスタイン奇形、アイゼンメンガー複合体、
左心室発育不全症候群、左胸心、ファロー四徴症、大血管転位症、両大血管右室
起始症、三尖弁閉鎖症、動脈管遺残、ならびに心中隔欠損（例えば、大動脈肺動
脈中隔欠損、心内膜床欠損、リュタンバッシェ症候群、ファロー三徴症、および
心室心中隔欠損）が、挙げられる。

【０３２２】 心血管障害としてはまた、以下のような心疾患が挙げられる：不整脈、カルチ
ノイド心疾患、高心拍出量、低心拍出量、心臓タンポナーデ、心内膜炎（細菌性
心内膜炎を含む）、心動脈瘤、心拍停止、うっ血性心不全、うっ血性心筋症、発
作性呼吸困難、心臓性水腫、心肥大、うっ血性心筋症、左心室肥大、右心室肥大
、梗塞後の心臓破裂、心室中隔破裂、心臓弁疾患、心筋疾患、心筋虚血、心内膜
液浸出、心膜炎（梗塞性心膜炎および結核性心膜炎を含む）、気心膜症、心膜切
開後症候群、右心疾患、リウマチ性心疾患、心室不全、充血、心血管妊娠合併症
、シミター症候群、心血管梅毒、および心血管結核。

【０３２３】 不整脈は、以下を含む：洞性不整脈、心房性細動、心房粗動、徐脈、期外収縮
、アダムス−ストークス症候群、脚ブロック、洞房ブロック、ＱＴ延長（ｌｏｎ
ｇ ＱＴ）症候群、副収縮、ローン−ギャノング−レヴァイン症候群、マヘーム
型早期興奮症候群、ウルフ−パーキンソン−ホワイト症候群、洞不全症候群、心
頻拍、および心室性細動。心頻拍としては、以下が挙げられる：発作性心頻拍、
上室性頻拍症、加速性（ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ）心室固有調律、房室結節再入
頻拍症、異所心房性頻拍、異所接合部頻拍症、洞房結節再入頻拍、洞性頻拍、ト
ルサード・ド・ポワント、および心室性頻拍。

【０３２４】 心臓弁疾患としては、大動脈弁不全、大動脈弁狭窄、心雑音、大動脈弁逸脱、
僧帽弁逸脱、三尖弁逸脱、僧帽弁不全、僧帽弁狭窄、肺動脈弁閉鎖、肺動脈弁不
全、肺動脈弁狭窄、三尖弁閉鎖、三尖弁不全、および三尖弁狭窄が、挙げられる
。

【０３２５】 心筋疾患としては、アルコール性心筋症、うっ血性心筋症、肥大型心筋症、弁
下部性大動脈狭搾症、弁下部肺動脈狭搾症、拘束型心筋症、シャーガス心筋症、
心内膜線維弾性症、心内膜心筋線維症、キーンズ症候群、心筋再灌流障害、およ
び心筋炎が、挙げられる。

【０３２６】 心筋虚血としては、冠動脈疾患（例えば、狭心症、冠動脈瘤、冠動脈硬化、冠
状動脈血栓症、冠動脈血管痙攣、心筋梗塞および心筋性気絶（ｓｔｕｎｎｉｎｇ
））が、挙げられる。

【０３２７】 心血管疾患はまた、動脈瘤、血管形成異常、血管腫症、細菌性血管腫症状、ヒ
ッペル−リンダウ病、クリペル−トルノネー−ウェーバー症候群、スタージ−ウ
ェーバー症候群、血管神経性水腫、大動脈疾患、高安動脈炎、大動脈炎、ルリー
シュ症候群、動脈閉鎖性疾患、動脈炎、動脈内膜炎（ｅｎａｒｔｅｒｉｔｉｓ）
、結節性多発動脈炎、脳血管障害、糖尿病性血管障害、糖尿病性網膜症、塞栓症
、血栓症、先端紅痛症、痔核、肝静脈閉塞病、高血圧、低血圧、虚血、末梢血管
疾患、静脈炎、肺静脈閉塞病、レーノー病、ＣＲＥＳＴ症候群、網膜静脈閉鎖、
シミター症候群、上大静脈症候群、毛細血管拡張症、毛細血管拡張性運動失調（
ａｔａｃｉａ ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ）、遺伝性出血性毛細管拡張症、
精索静脈瘤、拡張蛇行静脈、静脈瘤性潰瘍、脈管炎、および静脈不全のような、
血管疾患を含む。

【０３２８】 動脈瘤は、解離性動脈瘤、偽性動脈瘤、感染性動脈瘤、破裂性大動脈瘤、大動
脈瘤、大脳動脈瘤、冠動脈瘤、心動脈瘤、および腸骨動脈瘤を含む。

【０３２９】 動脈閉鎖疾患は、動脈硬化、間欠性跛行、頸動脈狭窄、線維筋性形成異常、腸
間膜脈管閉鎖、モヤモヤ病、腎動脈閉塞、網膜動脈閉塞、および閉塞性血栓性血
管炎を含む。

【０３３０】 脳血管障害は、頸動脈疾患、脳のアミロイド血管症、大脳動脈瘤、脳無酸素症
、大脳動脈硬化症、大脳動静脈奇形、大脳動脈疾患、大脳塞栓症、および大脳血
栓症、頸動脈血栓症、静脈洞血栓症、ヴァレンベルク症候群、脳出血、硬膜上血
腫、硬膜下血腫、クモ膜下出血、大脳梗塞、大脳虚血（一過性を含む）、鎖骨下
動脈盗血症候群、室周白斑軟化症（ｐｅｒｉｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｌｅｕｋ
ｏｍａｌａｃｉａ）、血管性頭痛、群発性頭痛、片頭痛、および椎骨脳底動脈循
環不全症を含む。

【０３３１】 塞栓症は、空気塞栓症、羊水塞栓症、コレステロール塞栓症、爪先チアノーゼ
症候群、脂肪塞栓症、肺動脈塞栓症、および血栓塞栓症を含む。血栓症は、冠動
脈血栓症、肝静脈血栓症、網膜静脈閉鎖、頸動脈血栓症、静脈洞血栓症、ヴァレ
ンベルク症候群、および血栓性静脈炎を含む。

【０３３２】 虚血は、大脳虚血、虚血性結腸炎、仕切り症候群、前方（ａｎｔｅｒｉｏｒ）
仕切り症候群、心筋虚血、再灌流障害、および末梢性四肢虚血（ｐｅｒｉｐｈｅ
ｒａｌ ｌｉｍｂ ｉｓｃｈｅｍｉａ）を含む。脈管炎は、大動脈炎、動脈炎、
ベーチェット症候群、チャーグ−ストラウス症候群、皮膚粘膜リンパ節症候群、
閉塞性血栓性血管炎、過敏性血管炎、シェーンライン−ヘーノホ紫斑病、アレル
ギー性皮膚血管炎、およびヴェーゲナー肉芽腫症を含む。

【０３３３】 １つの実施形態において、本発明のＡＩＭＩＩポリヌクレオチド、ポリペプチ
ド、アゴニスト、またはアンタゴニストが、血栓性細小血管症を処置するために
使用される。１つのこのような障害は、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）で
ある（Ｋｗａａｎ，Ｈ．Ｃ．、Ｓｅｍｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２４１：７１（１
９８７）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｂｌｏｏｄ ８０：１８９０（１９９２））。
増加するＴＴＰ関連の死亡率が、Ｕ．Ｓ．Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａ
ｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌにより報告されている（Ｔｏｒｏｋら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｅｍ
ａｔｏｌ．５０：８４（１９９５））。ＴＴＰに罹患した患者（ＨＩＶ＋および
ＨＩＶ−の患者を含む）由来の血漿は、皮膚の微小血管起源のヒト内皮細胞のア
ポトーシスを誘導するが、大きな血管起源のヒト内皮細胞のアポトーシスは誘導
しない（Ｌａｕｒｅｎｃｅら、Ｂｌｏｏｄ ８７：３２４５（１９９６））。従
って、ＴＴＰ患者の血漿は、直接的にかまたは間接的にアポトーシスを誘導する
、１つ以上の因子を含むと考えられる。別の血栓性細小血管症は、溶血性尿毒症
症候群（ＨＵＳ）である（Ｍｏａｋｅ，Ｊ．Ｋ．、Ｌａｎｃｅｔ ３４３：３９
３（１９９４）；Ｍｅｌｎｙｋら、Ａｒｃｈ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１５５：
２０７７（１９９５）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、前出）。従って、１つの実施形態
において、本発明は、（子供も襲い得るが）しばしば「成人性ＨＵＳ」と呼ばれ
る状態を処置するための、ＡＩＭ ＩＩの使用に関する。小児型／下痢関連ＨＵ
Ｓとして公知の障害は、成人性ＨＵＳと病因が異なる。別の実施形態において、
小さい血管の凝固により特徴付けられる状態が、ＡＩＭ ＩＩを使用して処置さ
れ得る。このような状態としては、本明細書中に記載される状態が挙げられるが
、これらに限定されない。例えば、小児ＡＩＤＳ患者の約５〜１０％にて観察さ
れる心臓の問題は、小さい血管の凝固に関与すると考えられる。心臓の微小血管
構造の破壊が、多発性硬化症患者において報告されている。さらなる例として、
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の処置が、意図される。１つの実施形態にお
いて、患者の血液または血漿が、本発明のＡＩＭ ＩＩポリペプチドとエキソビ
ボで接触される。本発明のＡＩＭ ＩＩポリペプチドは、当該分野で公知の手順
により適切なクロマトグラフィーマトリックスに結合され得る。この実施形態に
より、この患者の血液または血漿は、患者に戻される前に、マトリックスに結合
した本発明のＡＩＭ ＩＩポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドを含む
、クロマトグラフィーカラムを流れる。固定されたＡＩＭ ＩＩは、ＡＩＭ Ｉ
Ｉに結合し、従って、患者の血液からＡＩＭ ＩＩタンパク質を除去する。ある
いは、本発明のＡＩＭ ＩＩポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストまた
はアンタゴニストが、血栓性細小血管症に罹患している患者にインビボで投与さ
れ得る。１つの実施形態において、本発明のＡＩＭ ＩＩポリペプチドの可溶性
形態が、患者に投与される。従って、本発明は、血栓性細小血管症を処置するた
めの方法を提供し、この方法は、有効量のＡＩＭ ＩＩポリヌクレオチド、ポリ
ペプチド、アゴニストまたはアンタゴニストの使用を含む。ＡＩＭ ＩＩポリペ
プチドは、インビボ手順またはエキソビボ手順にて、微小血管内皮細胞（の、例
えば、アポトーシス）に対するＡＩＭ ＩＩ媒介性損傷を阻害するために使用さ
れ得る。

【０３３４】 本発明のＡＩＭ ＩＩポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストまたはア
ンタゴニストは、特定の障害を処置する際に有用な他の薬剤とともに使用され得
る。例えば、Ｌａｕｒｅｎｃｅら、Ｂｌｏｏｄ ８７：３２４５（１９９６）に
より報告されたインビトロ研究において、微小血管内皮細胞のＴＴＰ血漿媒介性
アポトーシスのいくらかの減少が、抗Ｆａｓ遮断抗体、オーリントリカルボン酸
、または寒冷沈降物を含まない通常の血漿を使用することによって、達成された
。従って、患者は、内皮細胞のＦａｓリガンド媒介性アポトーシスを阻害する薬
剤（例えば、上記の薬剤）と組み合わせて、本発明のポリヌクレオチドおよび／
またはポリペプチドで処置され得る。１つの実施形態において、ＡＩＭ ＩＩポ
リヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストまたはアンタゴニスト、および抗Ｆ
ａｓ遮断抗体が両方とも、血栓性細小血管症により特徴付けられ障害（例えば、
ＴＴＰまたはＨＵＳ）に罹患した患者に投与される。Ｆａｓ抗原（ＣＤ５９）に
対するモノクローナル遮断抗体の例は、ＷＯ９５／１０５４０に記載され、この
出願は、参考として本明細書中に援用される。

【０３３５】 新脈管形成の内因性刺激因子と阻害因子と間の天然に存在するバランスは、阻
害の影響が優勢であるバランスである。Ｒａｓｔｉｎｅｊａｄら、Ｃｅｌｌ ５
６：３４５〜３５５（１９８９）。通常の生理学的条件下で新生脈管形成が生じ
るまれな例（例えば、創傷治癒、器官再生、胚発生、および雌性生殖プロセス）
において、新脈管形成は、厳密に調節され、そして空間的および時間的に区切ら
れる。病理学的新脈管形成の条件（例えば、固形腫瘍増殖を特徴とする条件）下
で、これらの調節制御は失敗する。調節されない新脈管形成は、病理学的になり
、そして多くの腫瘍性疾患および非腫瘍性疾患の進行を維持する。多数の重篤な
疾患が、異常な新生脈管形成により支配される。このような疾患は、固形腫瘍増
殖、および転移、関節炎、いくつかの型の眼の障害、および乾癬を含む。例えば
、Ｍｏｓｅｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．９：６３０〜６３４（１９９１）；Ｆｏｌｋ
ｍａｎら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３３：１７５７〜１７６３（１９９５
）；Ａｕｅｒｂａｃｈら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．２９：４０１〜４
１１（１９８５）；Ｆｏｌｋｍａｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＫｌｅｉｎおよびＷｅｉｎｈｏｕｓｅ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１７５〜２０３頁（１９８５）；Ｐａｔｚ、
Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ．９４：７１５〜７４３（１９８２）；ならびに
Ｆｏｌｋｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２１：７１９〜７２５（１９８３）によ
る概説を参照のこと。多数の病理学的状態において、新脈管形成のプロセスは、
その疾患の状態に寄与する。例えば、固形腫瘍の増殖が新脈管形成に依存するこ
とを示唆する、かなりの数のデータが蓄積している。ＦｏｌｋｍａｎおよびＫｌ
ａｇｓｂｒｕｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：４４２〜４４７（１９８７）。

【０３３６】 本発明は、本発明のＡＩＭ ＩＩポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチ
ド（ＡＩＭ ＩＩアゴニストおよび／またはアンタゴニストを含む）の投与によ
る、新生脈管形成に関係する疾患または障害の処置を提供する。本発明のポリヌ
クレオチドおよびポリペプチドで処置され得る悪性状態および転移状態としては
、以下が挙げられるがこれらに限定されない：本明細書中に記載されるかさもな
ければ当該分野で公知の、悪性疾患、固形腫瘍、および癌（このような障害の概
説のために、Ｆｉｓｈｍａｎら、Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第２版、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐ
ｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉｓ（１９８５）を参照のこと）
。

【０３３７】 さらに、本発明のＡＩＭ ＩＩポリヌクレオチドおよびポリペプチド（ＡＩＭ
ＩＩアゴニストおよびＡＩＭ ＩＩアンタゴニストを含む）で処置され得る新
生脈管形成に関係する眼の障害としては、以下が挙げられるがこれらに限定され
ない：血管新生緑内障、糖尿病性網膜症、網膜芽細胞腫、水晶体後線維増殖症、
ブドウ膜炎、未熟児網膜症、黄斑変性、角膜移植、新生血管形成、ならびに脈絡
膜または虹彩の新生脈管形成に関係する、他の眼の炎症疾患、眼の腫瘍および疾
患。例えば、Ｗａｌｔｍａｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌ．８５：７０４〜７
１０（１９７８）およびＧａｒｔｎｅｒら、Ｓｕｒｖ．Ｏｐｈｔｈａｌ．２２．
２９１〜３１２（１９７８）による概説を参照のこと。

【０３３８】 さらに、本発明のＡＩＭ ＩＩポリヌクレオチドおよびポリペプチド（ＡＩＭ
ＩＩアゴニストおよびＡＩＭ ＩＩアンタゴニストを含む）で処置され得る障
害としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：血管腫、関節炎、乾癬
、血管線維腫、アテローム硬化性斑、創傷治癒の遅延、肉芽形成、血友病性関節
、過形成性瘢痕、偽関節骨折、オースラー−ウェーバー症候群、化膿性肉芽腫、
強皮症、トラコーマ、および血管癒着。

【０３３９】 本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド、ならびに／またはそ
のアゴニストおよび／またはアンタゴニストは、広範な疾患および／または状態
の、診断および処置または予防において有用である。このような疾患および状態
としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：癌（例えば、免疫細胞に
関連した癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、濾胞性リンパ腫、ｐ５３の変異または改
変に関係する癌、脳腫瘍、膀胱癌、子宮頸部癌、結腸癌、結腸直腸癌、肺の非小
細胞癌、肺の小細胞癌、胃癌など）、リンパ球増殖性（ｌｙｍｐｈｏｐｒｏｌｉ
ｆｅｒａｔｉｖｅ）障害（例えば、リンパ節症）、微生物性（例えば、ウイルス
性、細菌性などの）感染（例えば、ＨＩＶ−１感染、ＨＩＶ−２感染、ヘルペス
ウイルス感染（ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＣＭＶ、ＶＺＶ、ＨＨＶ−６、ＨＨＶ
−７、ＥＢＶを含むが、これらに限定さない）、アデノウイルス感染、ポックス
ウイルス感染、ヒトパピローマウイルス感染、肝炎感染（例えば、ＨＡＶ、ＨＢ
Ｖ、ＨＣＶなど）、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ感染、非侵襲性Ｓ
ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉａなど）、寄生生物感染、腎炎、骨疾患（例えば、骨
粗鬆症）、アテローム性動脈硬化症、疼痛、心血管障害（例えば、新生脈管形成
、血管新生欠乏（ｈｙｐｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）または循環の減少
（例えば、虚血性疾患（例えば、心筋梗塞、発作など））、ＡＩＤＳ、アレルギ
ー、炎症、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮
性側索硬化症、色素性網膜症、小脳変性など）、移植片拒絶（急性および慢性）
、対宿主性移植片疾患、骨髄形成異常症（例えば、再生不良性貧血など）に起因
する疾患、リウマチにおける関節組織破壊、肝臓疾患（例えば、急性および慢性
の肝炎、肝傷害、および肝硬変）、自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症、慢性
関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、免疫複合体性糸球体腎炎、自己免疫性
糖尿病、自己免疫性血小板減少性紫斑病、グレーブス病、橋本甲状腺炎など）、
心筋症（例えば、拡張型心筋症）、糖尿病、糖尿病性合併症（例えば、糖尿病性
腎症、糖尿病性ニューロパシー、糖尿病性網膜症）、インフルエンザ、喘息、乾
癬、糸球体腎炎、敗血症性ショック、および潰瘍性結腸炎。

【０３４０】 本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド、ならびに／あるいは
そのアゴニストおよび／またはアンタゴニストは、新脈管形成、創傷治癒（例え
ば、創傷、火傷、および骨折）を促進する際に有用である。

【０３４１】 本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド、ならびに／あるいは
そのアゴニストおよび／またはアンタゴニストは、特定の抗原に対する免疫応答
性および／または抗ウイルス性免疫応答を増強するためのアジュバントとして有
用である。

【０３４２】 より一般的には、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド、な
らびに／あるいはそのアゴニストおよび／またはアンタゴニストは、免疫応答を
調節する（すなわち、上昇させるかまたは低減させる）際に有用である。例えば
、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドは、手術、外傷、放射
線療法、化学療法および移植の準備またはそれらからの回復において有用であり
得るか、あるいは老齢かつ免疫無防備状態の個体において免疫応答をブーストす
るため、および／または回復を加速させるために使用され得る。あるいは、本発
明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド、ならびに／あるいはそのア
ゴニストおよび／またはアンタゴニストは、例えば、自己免疫障害の処置または
予防において、免疫抑制剤として有用である。特定の実施形態において、本発明
のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドは、慢性炎症、アレルギー性状
態または自己免疫状態（例えば、本明細書中に記載されるかさもなくば当該分野
で公知である、状態）を処置または予防するために使用される。

【０３４３】 ＡＩＭ ＩＩポリペプチド（特に、ヒトＡＩＭ ＩＩポリペプチド）の使用と
しては、以下の処置または予防が挙げられるがこれらに限定されない：ウイルス
性肝炎、ヘルペスウイルス感染、アレルギー反応、成人性呼吸窮迫症候群、新形
成、アナフィラキシー、アレルギー性喘息、アレルギー性（ａｌｌｅｒｇｅｎ）
鼻炎、薬物アレルギー（例えば、ペニシリン、セファロスポリンに対する）、原
発性中枢神経リンパ腫（ＰＣＮＳＬ）、神経膠芽腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬ
Ｌ）、リンパ節症、自己免疫疾患、対宿主性移植片疾患、慢性関節リウマチ、変
形性関節症、グレーブス病、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、リンパ腫（ホ
ジキン病および非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ））、眼障害、ブドウ膜網膜炎（ｕ
ｖｅｏｒｅｔｉｎｉｔｉｓ）、Ｉ型糖尿病の自己免疫期（ｐｈａｓｅ）、重症筋
無力症、糸球体腎炎、自己免疫性肝臓学的障害、自己免疫性炎症性腸疾患、およ
びクローン病。さらに、本発明のＡＩＭ ＩＩポリペプチドは、新形成（例えば
、腫瘍細胞増殖）を阻害するために使用され得る。ＩＬ−２またはＩＬ−１２の
ような免疫治療剤とのＡＩＭ ＩＩタンパク質の組み合わせは、確立された癌の
処置に有用な相乗効果または相加効果を生じ得る。このＡＩＭ ＩＩポリペプチ
ドはまた、腫瘍治療に有用であり得る。ＡＩＭ ＩＩはさらに、増殖の促進活性
を必要とする疾患（例えば、再狭窄）を処置するために使用され得る。なぜなら
、ＡＩＭ ＩＩは、内皮起源の細胞に対する増殖性効果を有するからである。従
って、ＡＩＭ ＩＩはまた、内皮細胞の発達における造血を調節するために使用
され得る。

【０３４４】 本発明のＡＩＭ ＩＩポリペプチドはまた、Ｔ細胞およびＢ細胞の分化および
増殖を阻害するために使用され得る。ＡＩＭ ＩＩが誘導した、Ｔ細胞およびＢ
細胞の活性化、分化および／または増殖の阻害は、免疫学に基づく多くの疾患を
処置するために使用され得る。これらの疾患のうちのいくらかは、上記で言及さ
れる。さらに、使用される特定のＡＩＭ ＩＩポリペプチドに依存して、本発明
のＡＩＭ ＩＩポリペプチドはまた、Ｔ細胞およびＢ細胞の活性化、分化および
／または増殖を刺激するために使用され得る。

【０３４５】 ＡＩＭ ＩＩは、サイトカインアジュバントまたは同時刺激性分子として作用
し得る。以下の実験を行って、宿主免疫系に対するインビボでのＡＩＭ ＩＩタ
ンパク質を評価する。

【０３４６】 腫瘍抗原またはスーパー抗原で免疫する前または後に、腫瘍保有マウスまたは
腫瘍を保有していないマウスを、３つの異なる用量（０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ
／ｋｇ、および１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ＱＤ、１０〜１４日、１群あたりＮ
＝５）のＡＩＭ ＩＩタンパク質で処理し、処理後毎週、血液採取の後にマウス
を屠殺する。脾臓またはリンパ節を、当業者に周知の以下のインビトロ分析のた
めに使用する： ＦＡＣＳ分析：Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞、同時刺激性分子、
および接着分子についての表面マーカーの発現。 サイトカイン産生アッセイ。 Ｔ細胞増殖または細胞傷害性アッセイ。

【０３４７】 ＡＩＭ ＩＩタンパク質および腫瘍抗原は、防御免疫の誘導を生じ得、これは
、その後の腫瘍チャレンジからマウスを防御することを導き得る。この可能性を
試験するために、同系Ｃ５７ＢＬ／６マウスを用いて以下の実験を行い、腫瘍ま
たはＡｇ特異的防御免疫の誘導に対するＡＩＭ ＩＩの効果を試験し得る。

【０３４８】 ＡＩＭ ＩＩタンパク質で処理したＭＣ−３８無腫瘍マウスを、当業者に周知
の技術を使用して、ＭＣ−３８または無関係のマウス肉腫ＭＣＡ−１０２でチャ
レンジする。３つの可能性のある結果が、観察され得る：

【０３４９】

【化５】 ＃１からの指摘：腫瘍特異的な防御免疫の証拠。 ＃２からの指摘：非腫瘍特異的免疫の証拠。 ＃３からの指摘：防御免疫の欠失。

【０３５０】 ＡＩＭ ＩＩ処理の際の腫瘍特異的な防御免疫の発生が実証される場合、以下
の枯渇実験を行い、どの白血球部分集団が、腫瘍拒絶を担うかを同定する。当業
者に周知の技術を用いて、マウスを、ＣＤ４⁺Ｔ細胞もしくはＣＤ８⁺Ｔ細胞、Ｎ
Ｋ細胞、顆粒球（Ｇｒｌ＋）、またはＩＦＮγのような特定のサイトカインのい
ずれかを認識する種々のｍＡｂで処理する。これらの抗体処理マウスにおける腫
瘍増殖を測定する。

【０３５１】 ＡＩＭ ＩＩはまた、脈管形成の増加、または骨および軟骨における侵襲され
ているパンヌス（慢性関節リウマチ（ＲＡ）においてしばしば観察される）を維
持するために必要な内皮細胞増殖の増加を阻害することによりＲＡを処置するた
めに使用され得る。内皮細胞増殖は、変形性関節症（ＯＡ）を有する患者または
非罹患個体に対して比較すると、ＲＡ患者の滑液において増大している。新生血
管形成は、骨および軟膏に侵襲しているパンヌスの質量増加を維持するために必
要である。脈管形成の阻害は、動物モデルにおける初期および慢性両方の関節炎
の重篤度における有意な減少と関連する。

【０３５２】 ＡＩＭ ＩＩポリペプチドは、多くのタンパク質（いくつかのヒト細胞レセプ
ターを含む）についての結合活性を有すると考えられる。これらのレセプターと
しては、リンホトキシン−β−レセプター（ＬＴ−β−Ｒ）、ＴＲ２（ヘルペス
ウイルス侵入メディエーター（ＨＶＥＭ）およびＡＴＡＲともいわれる）、ＣＤ
２７、ＴＲ６（ＤｃＲ３ともいわれる）、ＴＲ９（ＤＲ６）およびＴＲＡＮＫ（
核因子κＢ（ＲＡＮＫ）のレセプターアクチベーターともいわれる）が挙げられ
る。

【０３５３】 直ぐ上に列挙したレセプターの各々は、種々の生理学的プロセスに関与する。
このプロセスは、本発明のＡＩＭ ＩＩポリペプチドにより調節され得る。より
具体的には、本発明のポリペプチドを使用して、ＡＩＭ ＩＩ結合活性を有する
細胞レセプター（例えば、ＬＴ−β−Ｒ、ＴＲ２、ＣＤ２７、ＴＲ６、ＴＲ９お
よびＴＲＡＮＫ）に結合するリガンドの作用を刺激するか、またはこの作用をブ
ロックし得る。

【０３５４】 ＬＴ−β（ＬＴ−β−Ｒに結合する）は、二次リンパ組織の発達および成体に
おける組織化されたリンパ組織の維持に関連していた。ＬＴ−β−Ｒは、いくつ
かの例においては、ＴＲ２と共同して機能して、細胞応答を媒介し得、そしてＴ
リンパ球の部分集団を含む、肺における多くの組織において発現されることが示
された。ＬＴ−β−Ｒはまた、胚中心の形成に関連しており、従って、体液性免
疫応答に関与すると思われる。Ｒｅｎｎｅｒｔら，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９
：１６２７−１６３９（１９９７）。

【０３５５】 本発明のＡＩＭ ＩＩポリペプチドは、ＬＴ−β−Ｒに対する細胞リガンドの
接近をブロックすることにより、胚中心の形成およびＬＴ−β−Ｒ媒介体液性応
答を阻害するために使用され得る。さらに、本発明のポリペプチドは、ＬＴ−β
−Ｒを活性化することにより、胚中心の形成およびＬＴ−β−Ｒ媒介体液性応答
を刺激し得る。

【０３５６】 当業者は、ＡＩＭ ＩＩポリペプチドの異なる部分が、ＬＴ−β−Ｒに対して
異なる効果を有し得ることを認識する。当業者はまた、本発明のＡＩＭ ＩＩポ
リペプチドがＬＴ−β−Ｒに対して有する効果が、個々のペプチドおよびＬＴ−
β−Ｒに結合した場合にＡＩＭ ＩＩポリペプチドが有する効果とともに変化す
ることを認識する。細胞応答のアゴニスト活性およびアンタゴニスト活性を有す
る分子をスクリーニングする方法は、上に記載される。

【０３５７】 Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のコアタンパク質はまた、ＬＴ−β−Ｒと会合し
、そしてこのレセプターによって媒介されるシグナル伝達を増強することが示さ
れた。Ｃｈｅｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：９４１７−９４２６（１９９７）。
さらに、このタンパク質とＬＴ−β−Ｒとの相互作用は、慢性的に活性化された
持続性状態のＨＣＶ感染細胞に寄与し得る。本発明のＡＩＭ ＩＩポリペプチド
は、ＬＴ−β−ＲのＨＣＶ刺激およびこのウイルスと関連する病理をブロックす
るために使用され得る。

【０３５８】 ＴＲ２は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）レセプターファミリーのメンバーであり、
このファミリーは、多くのヒト組織および細胞株において発現される。このタン
パク質は、構成的にそして末梢血Ｔ細胞、Ｂ細胞、および単球において比較的高
レベルで発現される。Ｋｗｏｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１４２７
２−１４２７６（１９９７）。ＴＲ２は、インビボで多くの機能を提供し、これ
らの機能としては、感染の間の細胞へのヘルペスウイルス侵入の媒介が挙げられ
る。さらに、ＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質は、混合したリンパ球反応媒介増殖を
阻害することが実証された。これらのデータは、ＴＲ２およびそのリガンドがＴ
細胞刺激において役割を果たすことを示唆する。このことは、ＴＲ２の過剰発現
がＮＦ−κＢおよびＡＰ−Ｉを活性化するこれらの株とともに示された。この活
性化は、ＴＮＦレセプター関連因子（ＴＲＡＦ）媒介機構を通じて生じるようで
ある。

【０３５９】 本発明のＡＩＭ ＩＩポリペプチドは、このレセプターを活性化する細胞リガ
ンドによるＴＲ２への接近をブロックすることにより、Ｔ細胞活性化、従って、
Ｔ細胞媒介免疫応答を阻害するために使用され得る。同様に、本発明のポリペプ
チドは、ＴＲ２を活性化することによりＴ細胞活性化を刺激し得る。ＬＴ−β−
Ｒに関しては上記のように、当業者は、ＡＩＭ ＩＩポリペプチドの異なる部分
がＴＲ２媒介細胞応答を阻害し得るかまたは刺激し得るかのいずれかであること
を認識する。

【０３６０】 本発明のＡＩＭ ＩＩポリペプチドはまた、ヘルペスウイルス感染を予防また
は処置するために使用され得る。

【０３６１】 ＣＤ２７およびそのリガンドであるＣＤ７０の発現は、リンパ球に主に制限さ
れる。さらにＣＤ２７は、ＣＤ７０と相互作用し、そしてＢ細胞におけるＩｇＥ
合成の誘導に関与することが示された。Ｎａｇｕｍｏら，Ｊ．Ｉｍｒｎｕｎｏｌ
．１６１：６４９６−６５０２（１９９８）。さらに、ＣＤ２７の活性化は、Ｉ
ｇＥ合成を増強し得る。従って、ＣＤ２７とＣＤ７０との間の相互作用の阻害に
より、ＩｇＥ生成およびアレルギー性応答が阻害され得る。

【０３６２】 本発明のＡＩＭ ＩＩポリペプチドは、免疫応答を調節するために使用され得
る。例えば、ＡＩＭ ＩＩポリペプチドを使用して、ＣＤ２７とＣＤ７０との間
の相互作用を阻害することによりＢ細胞の機能を調節し得る。従って、ＡＩＭ
ＩＩポリペプチドは、ＣＤ２７に結合し得、そしてＢ細胞分化および増殖、なら
びにこれらの細胞によるタンパク質（例えば、ＩｇＥ）の分泌を阻害し得る。従
って、ＡＩＭ ＩＩポリペプチドを使用して、ＩｇＥ誘導性即時型過敏反応（例
えば、アレルギー性鼻炎（枯草熱としても公知）、気管支喘息、アレルギー性喘
息、アナフィラキシー、アトピー性皮膚炎および胃腸性の食物アレルギー）の処
置におけるＩｇＥ抗体形成を抑制し得る。

【０３６３】 ＣＤ２７はまた、Ｓｉｖａとしても一般に公知のプロアポトーシスタンパク質
についてのレセプターであると考えられる。Ｐａｎｄａｎｉｌａｍら、Ｋｉｄｎ
ｅｙ Ｉｎｔ．５４：１９６７−１９７５（１９９８）。本発明のＡＩＭ ＩＩ
ポリペプチドは、ＳｉｖａとＣＤ２７との間の相互作用を阻害し、従ってアポト
ーシスのＳｉｖａ／ＣＤ２７媒介性誘導を妨げるために使用され得る。細胞生存
の減少またはアポトーシスの増加と関連する疾患としては、以下が挙げられる：
ＡＩＤＳ；神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮
性側索硬化症、色素性網膜症、小脳変性）；脊椎形成異常症候群（ｍｙｅｌｏｄ
ｙｓｐｌａｓｔｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（例えば、再生不良性貧血）；虚血性
傷害（例えば、心筋梗塞、発作および再灌流障害により引き起こされるもの）、
毒素誘導性肝臓疾患（例えば、アルコールにより引き起こされるもの）、敗血症
性ショック、悪液質および食欲不振。

【０３６４】 本発明のＡＩＭ ＩＩポリペプチドはまた、Ｓｉｖａ／ＣＤ２７アポトーシス
経路の活性化を増強し、従って、アポトーシスの誘導を促進するために使用され
得る。細胞生存の増加、またはアポトーシスの阻害と関連する疾患としては、以
下が挙げられる：癌（例えば、濾胞性リンパ腫、ｐ５３変異を伴う癌腫、および
ホルモン依存性腫瘍）、自己免疫障害（例えば、全身性エリテマトーデス、免疫
関連糸球体腎炎、および慢性関節リウマチ）およびウイルス感染（例えば、ヘル
ペスウイルス、ポックスウイルスおよびアデノウイルス）、対宿主性移植片病、
急性移植片拒絶、および慢性移植片拒絶の事実（ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）。

【０３６５】 ＣＤ２７は膜結合型であり得るが、可溶性形態のＣＤ２７は免疫応答の過程に
おいて生成される。可溶性ＣＤ２７（ｓＣＤ２７）は、多くの体液において見出
され、そして局所的および全身的免疫活性化をモニターするために測定され得る
。さらにＣＤ２７は、ヒト悪性Ｂ細胞上で発現され、そして高レベルのｓＣＤ２
７は、種々のＢ細胞悪性疾患を有する患者の血清中に存在する。Ｋｅｒｓｔｅｎ
ら，Ｂｌｏｏｄ ８７：１９８５−１９８９（１９９６）。ｓＣＤ２７のレベル
のこれらの上昇は、腫瘍負荷と強く相関することが示されている。

【０３６６】 ｓＣＤ２７はまた、種々のリンパ球悪性疾患および中枢神経系の固形腫瘍を有
する患者において上昇することが示されている。これらの苦痛をもたらすもの（
ａｆｆｌｉｃｔｉｏｎ）としては、原発性中枢神経系リンパ腫（ｐｒｉｍａｒｙ
ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｌｙｍｐｈｏｍａ（ＰＣＮ
ＳＬ））および髄膜に位置するリンパ系悪性疾患（例えば、急性リンパ性白血病
（ＡＬＬ）および非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ））が挙げられる。

【０３６７】 可溶性ＣＤ２７はまた、多くの非過剰増殖性障害を有する患者において上昇し
ていることが見出された。例えば、ｓＣＤ２７は、未処置のグレーブス甲状腺機
能亢進を有する患者において上昇していることが示された。Ｋａｌｌｉｏら，Ｊ
．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ Ｍｅｄ．１３２：４７８−４８２（１９９８）。さらに、
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を有する患者においてｓＣＤ２７血清レベル
の増加が見出され、そしてこの増加は、疾患の活性と関連することが見出された
。Ｆｏｎｔら，Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．８１：
２３９−２４３（１９９６）；Ｓｗａａｋら，Ｃｌｉｎ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．
１４：２９３−３００（１９９５）。また、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を有
する患者の大部分に由来するＢ細胞は、膜結合型ＣＤ２７と可溶性ＣＤ２７の両
方、ならびにＣＤ７０を同時に発現していることが示された。Ｒａｎｈｅｉｍら
，Ｂｌｏｏｄ ８５：３５５６−３５６５（１９９５）。

【０３６８】 ｓＣＤ２７は、白血病Ｂ細胞のＣＤ７０を介したＴ細胞刺激を妨げ得、従って
、Ｂ細胞が抗原提示細胞として機能する能力を損ない得ることが仮定される。Ｒ
ａｎｈｅｉｍら，Ｂｌｏｏｄ ８５：３５５６−３５６５（１９９５）。本発明
のポリペプチドは、ｓＣＤ２７とＣＤ７０との間の相互作用を阻害し、従って、
Ｂ細胞が抗原提示細胞として働く能力を増強するために使用され得る。

【０３６９】 本発明のＡＩＭ ＩＩポリペプチドはまた、ＣＤ２７の増加したレベルと関連
する疾患および苦痛をもたらすものを処置するために使用され得る。機会論的理
論に拘束されることは望まないが、ＡＩＭ ＩＩポリペプチドは、ＡＩＭ ＩＩ
がｓＣＤ２７と結合し、そしてｓＣＤ２７が細胞リガンドと相互作用することを
妨げるので、これらの状態のための処置レジメンにおいて有用であり得る。

【０３７０】 ＡＩＭ ＩＩポリペプチドは、ＴＲ６と結合する（実施例１３を参照のこと）
。ＴＲ６（ＤｃＲ３）は、ＴＮＦＲスーパーファミリーの新規な可溶性メンバー
である。このメンバーは、肺組織、腫瘍細胞および内皮細胞において構成的に発
現される。ＴＲ６は、ＡＩＭ ＩＩおよびＦａｓＬに特異的に結合し、そしてそ
れらの活性を阻害する。ＤｃＲ１、ＤｃＲ２およびＴＮＦＲスーパーファミリー
の別の可溶性メンバーＯＰＧと同様に、ＴＲ６は、ＴＮＦファミリーメンバー、
ＦａｓＬおよびＡＩＭ ＩＩを通じてシグナル伝達のインヒビターとして作用し
得る。ＴＲ６は、アポトーシスおよび腫瘍調節の阻害において重要な役割を有す
るようである。ＴＲ６は、ＡＩＭ ＩＩ相互作用のインヒビターとして作用し得
、そしてまた、細胞型に依存して、異なる役割で作用し得る。ＴＲ６（ＤｃＲ３
）は、デコイレセプターとして作用し得、そして緩慢なおよび迅速な腫瘍細胞死
（これらは、ＡＩＭ ＩＩまたはＦａｓＬ媒介アポトーシス経路によりそれぞれ
媒介される）の両方において免疫回避に寄与し得る。実際に、ＴＲ６（ＤｃＲ３
）はＦａｓＬに結合して、特定の腫瘍による免疫回避に寄与し得ることが示され
た（Ｐｉｔｔｉ，Ｒ．Ｍ．ら，Ｎａｔｕｒｅ ３９６：６９９−７０３（１９９
８））。ＡＩＭ ＩＩおよびＦａｓＬは、活性化Ｔ細胞において発現されること
が公知である。従って、ＴＲ６およびそのリガンドは、活性化Ｔリンパ球と内皮
細胞との間の相互作用に重要であると考えられる。ＴＲ６は、活性化Ｔ細胞輸送
および内皮細胞生存に関与し得る。別の可能性は、ＴＲ６が膜結合型ＦａｓＬま
たはＡＩＭ ＩＩを誘発するためにサイトカインとして作用し得、そしてＦａｓ
ＬまたはＡＩＭ ＩＩを通じて直接シグナル伝達し得ることである。最近、Ｄｅ
ｓｂａｒａｔｓのグループおよびＳｕｚｕｋｉのグループは、ＦａｓＬがそれ自
体シグナルを伝達し得、ＣＤ４⁺ Ｔ細胞における細胞周期の停止および細胞死
を導くが、ＣＤ８⁺ Ｔ細胞においては細胞増殖を導くことを報告した（Ｄｅｓ
ｂａｒａｔｓ，Ｊ．ら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４：１３７７−１３
８２（１９９８）；Ｓｕｚｕｋｉ，Ｉ．およびＦｉｎｋ，Ｐ．Ｊ．，Ｊ．Ｅｘｐ
．Ｍｅｄ．１８７：１２３−１２８（１９９８））。従って、ＴＲ６は、Ｆａｓ
ＬおよびＡＩｍ ＩＩを通じたシグナル伝達のためのサイトカインとして作用し
得る。

【０３７１】 ＴＲ６は、アポトーシスおよび腫瘍調節の阻害において重要な役割を有するよ
うであるので、本発明のＡＩＭ ＩＩポリペプチドはまた、ＴＲ６の増加したレ
ベルと関連する疾患および苦痛をもたらすもの、またはアポトーシスの増加が所
望される状態を処置するために使用され得る。機会論的理論に束縛されることは
望まないが、ＡＩＭ ＩＩポリペプチドは、ＡＩＭ ＩＩがＴＲ６に結合し、そ
してＴＲ６の細胞リガンドとの相互作用を妨げて、アポトーシスをブロックする
ので、これらの状態についての処置レジメンにおいて有用であり得る。

【０３７２】 ＡＩＭ ＩＩポリペプチドはまた、ＲＡＮＫに結合すると考えられる(Ａｎｄ
ｅｒｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３９０：１７５−１７９（１９９７）を参照のこ
とのこと）。ＲＡＮＫは、破骨細胞分化およびＴ細胞と樹状細胞との間の相互作
用の調節に関連するタンパク質である。ＲＡＮＫは、ＲＡＮＫＬ（オステオプロ
テゲリン（ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）リガンド（ＯＰＧＬ）、ＴＲＡＮ
ＣＥおよびＯＤＦともいわれる）との相互作用を介してその細胞効果を明らかに
媒介する。

【０３７３】 破壊されたＲＡＮＫＬ遺伝子を有するマウスは、重篤な骨粗鬆症を示し、欠損
した歯の出現を示し、おそして破骨細胞を欠如する。これらのマウスはまた、Ｔ
およびＢリンパ球分化における欠陥を示す。さらにＲＡＮＫＬ欠損マウスは、リ
ンパ節を欠くが、正常な脾臓構造およびパイアー斑を示す。これらのデータは、
ＲＡＮＫＬ媒介経路が、リンパ節器官発生、リンパ球発生、ならびに破骨細胞分
化および増殖を調節することを示す。

【０３７４】 骨細胞には２つの主要なクラスが存在する：骨を作る細胞、すなわち骨芽細胞
、および骨を吸収する細胞、すなわち破骨細胞。これらの細胞は、各々非常に正
確な機能を有し、かつそれらの活性の間のバランスは、骨格系の維持に重要であ
る。例えば、ヒト成人において、海綿質表面の１０〜１５％が類骨（骨芽細胞に
より作られた新たな石灰化されていない骨）で覆われているが、約４％は、活性
な再吸収表面を有する。骨細胞活性の連続的なフラックスの動的性質は、総骨格
カルシウムの約１８％がしばしば、一年間で除去され、そして沈着されるという
事実により示される。

【０３７５】 本発明のＡＩＭ ＩＩポリペプチドは、破骨細胞分化および増殖（骨形成）、
ならびに骨発生および分解を調節するために使用され得る。本発明のポリペプチ
ドは、例えば、破骨細胞の分化および増殖を阻害するために使用され得、従って
、骨分解の速度を減少するために使用され得る。破骨細胞の分化および増殖の阻
害ならびに骨分解は、骨粗鬆症、骨格異常および歯科的異常、骨癌、変形性関節
症、骨形成不全、およびフルラー症候群およびマルファン症候群のような状態の
処置において有用であり得る。本発明のポリペプチドはまた、骨および歯を作り
直す（ｒｅｓｈａｐｅ）するためのプロセス、および失われた骨の置換または骨
増大が必要な歯周再構築において（例えば、下顎骨において）、および歯周病か
ら生じる歯槽骨喪失を補充して歯の喪失を遅らせるかまたは予防するために使用
され得る（例えば、Ｓｉｇｕｒｄｓｓｏｎら，Ｊ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ．６
６：５１１−２１（１９９５）を参照のこと）。

【０３７６】 本発明のＡＩＭ ＩＩポリペプチドは、Ｔリンパ球およびＢリンパ球の分化お
よび増殖を調節するためにさらに使用され得る。従って、ＡＩＭ ＩＩポリペプ
チドは、ＲＡＮＫに結合し、そしてＴリンパ球およびＢリンパ球の分化および増
殖、ならびにこれらの細胞からのタンパク質（例えば、免疫グロブリン）の分泌
を阻害する。従って、ＡＩＭ ＩＩポリペプチドは、リンパ球媒介免疫応答を抑
制するため、例えば、移植片拒絶を予防するために使用され得る。ＡＩＭ ＩＩ
ポリペプチドはまた、破骨細胞の分化および増殖を阻害するために使用され得る
。従って、ＡＩＭ ＩＩポリペプチドは、骨癌のような疾患を処置するために使
用され得る。

【０３７７】 本発明はまた、ＲＡＮＫの１つ以上の天然のリガンドを模倣し、そしてＲＡＮ
Ｋ媒介細胞応答を刺激するＡＩＭ ＩＩポリペプチドを提供する。これらの細胞
応答としては、Ｔリンパ球およびＢリンパ球の分化および増殖の活性化、ならび
に破骨細胞分化の誘導が挙げられる。従って、ＡＩＭ ＩＩポリペプチドは、感
染（例えば、細菌感染、ウイルス感染、および原生動物感染）のような疾患を処
置するために使用され得る。ＡＩＭ ＩＩポリペプチドはまた、免疫応答（例え
ば、ＡＩＤＳおよびＡＩＤＳ関連合併症の処置において）を増強するため、また
は骨分解速度を増大させるために使用され得る。

【０３７８】 ＡＩＭ ＩＩポリペプチドはまた、ＴＲ９に結合する。ＴＲ９（ＤＲ６ともい
われる）は、細胞質死ドメインを有するレセプターの腫瘍壊死因子ファミリーの
新規なメンバーである（ＷＯ９８／５６８９２を参照のこと）。ＴＲ９は、哺乳
動物細胞においてアポトーシスを誘導し、そしてＮＦ−κＢおよびＪＮＫ経路に
係合し得る。ＴＲ９は、炎症性応答および免疫調節において役割を果たすと考え
られる。

【０３７９】 ＡＩＭ ＩＩポリペプチドは、ＴＲ９を介する炎症性応答および免疫調節を調
節するために使用され得る。ＡＩＭ ＩＩポリペプチドはまた、ＮＦ−κＢおよ
びＪＮＫ経路を介したＴＲ９によるアポトーシスを誘導するために使用され得る
。従って、ＡＩＭ ＩＩポリペプチドは、感染のような疾患を処置するために使
用され得る。ＡＩＭ ＩＩポリペプチドはまた、免疫応答を増強するために使用
され得る。

【０３８０】 ＡＩＭ ＩＩポリペプチドは、インビボで切断されて、可溶性形態の分子を形
成し得る。実施例１０に記載のように、切断部位は、配列番号２に示される配列
のアミノ酸残基８２と８３との間に位置するようである。ＡＩＭ ＩＩポリペプ
チドのこの位置での切断は、配列番号２のアミノ酸８３〜２４０を含むか、ある
いはそれからなる分子の可溶性形態の生成を生じると考えられる。可溶性形態の
ＡＩＭ ＩＩは、これらのペプチドの全身投与が好ましい疾患の処置のために特
に有用である。さらに、可溶性形態のＡＩＭ ＩＩはまた、局所的投与のために
有用である。本発明の完全および成熟ＡＩＭ ＩＩポリペプチド、ならびにこれ
らのポリペプチドのサブフラグメントは、これらの分子が結合するレセプターお
よび他のリガンドと関連する、苦痛をもたらすものを処置するために使用され得
る。

【０３８１】 １つの実施形態において、本発明は、本発明のポリペプチドを含む組成物（例
えば、異種ポリペプチド、異種核酸、毒素またはプロドラッグと会合したＡＩＭ
ＩＩポリペプチドまたは抗ＡＩＭ ＩＩ抗体を含む組成物）を標的化された細
胞（それらの表面にＡＩＭ ＩＩの膜結合形態を発現しているか、あるいはそれ
らの表面にＡＩＭ ＩＩレセプター（例えば、ＴＲ２、ＬＴβレセプターおよび
ＣＤ２７）を発現している）に送達する方法を提供する。本発明のＡＩＭ ＩＩ
ポリペプチドまたは抗ＡＩＭ ＩＩ抗体は、疎水性相互作用、親水性相互作用、
イオン性相互作用および／または共有結合相互作用によって異種ポリペプチド、
異種核酸、毒素またはプロドラッグと会合し得る。

【０３８２】 １つの実施形態において、本発明は、異種ポリペプチドまたは核酸と会合した
本発明のポリペプチド（例えば、ＡＩＭ ＩＩまたは抗ＡＩＭ ＩＩ抗体）を投
与することによって本発明の組成物を細胞に特異的に送達するための方法を提供
する。１つの例において、本発明は、標的化された細胞に治療的タンパク質を送
達するための方法を提供する。別の例において、本発明は、単一の標準的核酸（
例えば、アンチセンスまたはリボザイム）または二重標的核酸（例えば、細胞の
ゲノムに組み込まれ得るか、またはエピソームに複製され得、かつ転写され得る
ＤＮＡ）を標的化された細胞に送達する方法を提供する。

【０３８３】 別の実施形態において、本発明は、毒素または細胞傷害性プロドラッグと会合
した本発明のポリペプチド（例えば、ＡＩＭ ＩＩポリペプチドまたは抗ＡＩＭ
ＩＩ抗体）を投与することによって、細胞の特異的破壊（例えば、腫瘍細胞の
破壊）のための方法を提供する。

【０３８４】 特定の実施形態において、本発明は、毒素または細胞傷害性プロドラッグと会
合したＡＩＭ ＩＩポリペプチドを投与することによって、ＴＲ２、ＬＴβレセ
プター、および／またはＣＤ２７を表面に発現する細胞（例えば、活性化Ｔ細胞
、ならびに／または白血病もしくはリンパ腫に関連するＴ細胞および／もしくは
Ｂ細胞）の特異的破壊のための方法を提供する。

【０３８５】 別の特定の実施形態において、本発明は、毒素または細胞傷害性プロドラッグ
と会合した抗ＡＩＭ ＩＩ抗体を投与することによって、膜結合型のＡＩＭ Ｉ
Ｉを表面に発現する細胞（例えば、脾臓、骨髄、腎臓およびＰＢＬ）の特異的破
壊のための方法を提供する。

【０３８６】 「毒素」によって、内因性細胞傷害性エフェクター系に結合し、そして活性化
する化合物が意味され、このような毒素としては、例えば、放射性同位体、ホロ
トキシン（ｈｏｌｏｔｏｘｉｎ）、改変毒素、毒素の触媒性サブユニット、サイ
トトキシン（細胞傷害性薬剤）、または細胞死を引き起こす既定の条件下で細胞
の表面内および表面上に通常存在しない任意の分子または酵素が挙げられる。本
発明の方法に従って使用され得る毒素としては、以下が挙げられるが、これらに
限定されない：当該分野で公知の放射性同位体、例えば、固有のまたは誘導され
た内因性細胞傷害性エフェクター系に結合する抗体（またはその補体結合含有部
分）のような化合物、チミジンキナーゼ、エンドヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ、α
毒素、リシン、アブリン、シュードモナス外毒素Ａ、ジフテリアトキシン、サポ
リン（ｓａｐｏｒｉｎ）、モモルジン（ｍｏｍｏｒｄｉｎ）、ゲロニン（ｇｅｌ
ｏｎｉｎ）、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、αサルシン（ｓａｒｃ
ｉｎ）およびコレラ毒素。「毒素」としてはまた、細胞増殖抑制性（ｃｙｔｏｓ
ｔａｔｉｃ）薬剤または殺細胞薬剤（ｃｙｔｏｃｉｄａｌ）、治療剤または放射
活性金属イオン（例えば、²¹³Ｂｉのようなαエミッター）、または例えば、¹⁰³ Ｐｄ、¹³³Ｘｅ、¹³¹Ｉ、⁶⁸Ｇｅ、⁵⁷Ｃｏ、⁶⁵Ｚｎ、⁸⁵Ｓｒ、³²Ｐ、³⁵Ｓ、⁹⁰Ｙ、 ¹⁵³ Ｓｍ、¹⁵³Ｇｄ、¹⁶⁹Ｙｂ、⁵¹Ｃｒ、⁵⁴Ｍｎ、⁷⁵Ｓｅ、¹¹³Ｓｎ、⁹⁰イットリウ
ム、¹¹⁷スズ、¹⁸⁶レニウム、¹⁶⁶ホルミウム、および¹⁸⁸レニウムのような他の放
射性同位体；発光標識（例えば、ルミノール）；および蛍光標識（例えば、フル
オロセインおよびローダミン）ならびにビオチンが挙げられる。

【０３８７】 当該分野において公知の技術を応用して、本発明のタンパク質（抗体を含む）
を標識し得る。このような技術としては、二官能性共役剤の使用が挙げられるが
、これに限定されない（例えば、米国特許第５，７５６，０６５号；同第５，７
１４，６３１号；同第５，６９６，２３９号；同第５，６５２，３６１号；同第
５，５０５，９３１号；同第５，４８９，４２５号；同第５，４３５，９９０号
；同第５，４２８，１３９号；同第５，３４２，６０４号；同第５，２７４，１
１９号；同第４，９９４，５６０号；および同第５，８０８，００３号を参照の
こと；これらの各々の内容は、その全体が本明細書中に参考として援用される）
。細胞毒または細胞傷害性薬剤は、細胞に対して有害である任意の薬剤を含む。
例としては、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｏｌ）、サイトカラシンＢ、グ
ラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド
、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コ
ルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン
、ミトザントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテスト
ステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプ
ラノロール、およびプロマイシンならびにそのアナログまたはホモログが挙げら
れる。治療剤としては、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカ
プトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジ
ン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパ（ｔｈｉｏｅｐａ）ク
ロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（Ｃ
ＣＮＵ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスル
ファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、なら
びにシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラ
サイクリン（ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ）（例えば、ダウノルビシン（以前に
はダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイ
シン（以前にはアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、および
アントラマイシン（ＡＭＣ））、ならびに抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチ
ンおよびビンブラスチン）が挙げられるが、これらに限定されない。

【０３８８】 「細胞傷害性プロドラッグ」とは、通常細胞内に存在する酵素によって、細胞
傷害性化合物に変換される非毒性の化合物を意味する。本発明の方法に従って使
用し得る細胞傷害性プロドラッグとしては、安息香酸マスタードアルキル化剤の
グルタミル誘導体、エトポシドまたはマイトマイシンＣのリン酸誘導体、シトシ
ンアラビノシド、ダウノルビシン、およびドキソルビシンのフェノキシアセトア
ミド誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。

【０３８９】 （診断および画像化） 本発明はさらに、ＡＩＭ ＩＩポリヌクレオチドの、相補的なポリヌクレオチ
ドを検出するための使用（例えば、診断試薬としてのような）に関する。機能不
全に関連するＡＩＭ ＩＩの変異形態の検出は、ＡＩＭ ＩＩの不足発現、過剰
発現または変化した発現から生じる疾患（例えば、自己免疫疾患、悪性疾患およ
び／または免疫不全など）または疾患への感受性の診断を追加または規定し得る
、診断ツールを提供する。ＡＩＭ ＩＩをコードするポリヌクレオチドはまた、
本発明のポリペプチドの発現のための診断マーカーとして使用され得る。

【０３９０】 本発明者らは、ＡＩＭ ＩＩが、脾臓、胸腺および骨髄組織において発現され
ることを見出した。多数の障害（例えば、敗血症性ショック、炎症、大脳マラリ
ア、ＨＩＶウイルスの活性化、移植片−宿主拒絶、骨吸収、慢性関節リウマチお
よび悪液質）に関して、「標準的な」ＡＩＭ ＩＩ遺伝子発現レベル（すなわち
、その障害を有さない個体由来の組織または体液におけるＡＩＭ ＩＩ発現レベ
ル）と比較して有意により高いかまたはより低いレベルのＡＩＭ ＩＩ遺伝子発
現が、このような障害を有する個体から採取した特定の組織（例えば、脾臓、胸
腺および骨髄組織）または体液（例えば、血清、血漿、尿、滑液または髄液）に
おいて検出され得ると考えられる。従って、本発明は、障害を診断する間に有用
である診断方法を提供し、この方法は、以下を包含する：（ａ）ＡＩＭ ＩＩ遺
伝子発現レベルを、個体の細胞または体液においてアッセイする工程；（ｂ）こ
のＡＩＭ ＩＩ遺伝子発現レベルを、標準的なＡＩＭ ＩＩ遺伝子発現レベルと
比較する工程であって、これによって、アッセイしたＡＩＭ ＩＩ遺伝子発現レ
ベルの、標準発現レベルと比較しての増加または減少が、障害の指標である、工
程。

【０３９１】 癌を有する哺乳動物における特定の組織は、対応する「標準的な」哺乳動物（
すなわち、癌を有さない同じ種の哺乳動物）と比較した場合に、有意に減少した
レベルのＡＩＭ ＩＩタンパク質およびＡＩＭ ＩＩタンパク質をコードするｍ
ＲＮＡを発現することもまた、考えられる。さらに、癌を有さない同じ種の哺乳
動物由来の血清と比較した場合に、減少したレベルのＡＩＭ ＩＩタンパク質が
、癌を有する哺乳動物由来の特定の体液（例えば、血清、血漿、尿、および髄液
）において検出され得ることが、考えられる。従って、本発明は、腫瘍診断の間
に有用である診断方法を提供し、この方法は、哺乳動物の細胞または体液におい
て、ＡＩＭ ＩＩタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルをアッセイする工
程、およびこの遺伝子発現レベルを、標準的なＡＩＭ ＩＩ遺伝子発現レベルと
比較する工程であって、これによって、標準を超える遺伝子発現レベルの減少が
、特定の腫瘍の指標である、工程を包含する。

【０３９２】 腫瘍診断が、従来の方法に従ってすでになされた場合は、本発明は、予後指標
として有用であり、これによって、増強したＡＩＭ ＩＩ遺伝子発現を示す患者
は、より低いレベルにおいてこの遺伝子を発現する患者と比較して、より良好な
臨床結果を経験し得る。

【０３９３】 「ＡＩＭ ＩＩタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルをアッセイする」
によって、ＡＩＭ ＩＩタンパク質のレベルまたはＡＩＭ ＩＩタンパク質をコ
ードするｍＲＮＡのレベルを、第一の生物学的サンプルにおいて、直接的に（例
えば、絶対的なタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルを検定または推定するこ
とにより）かまたは相対的に（例えば、第二の生物学的サンプル中のＡＩＭ Ｉ
Ｉタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルと比較することにより）のいずれかで
、定性的にまたは定量的に、測定または推定することが意図される。

【０３９４】 好ましくは、第一の生物学的サンプル中のＡＩＭ ＩＩタンパク質レベルまた
はｍＲＮＡレベルは、測定または推定され、そして標準的なＡＩＭ ＩＩタンパ
ク質レベルまたはｍＲＮＡレベルと比較され、この標準物は、癌を有さない個体
から得た第二の生物学的サンプルから採取される。当該分野において理解される
ように、一旦、標準的なＡＩＭ ＩＩタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルが
既知となると、これを比較のための標準物として繰り返し使用し得る。

【０３９５】 「生物学的サンプル」によって、個体、細胞株、組織培養物、あるいはＡＩＭ
ＩＩタンパク質またはｍＲＮＡを含有する他の供給源から得られる任意の生物
学的サンプルが意図される。生物学的サンプルとしては、分泌された成熟ＡＩＭ
ＩＩタンパク質を含有する哺乳動物体液（例えば、血清、血漿、尿、滑液およ
び髄液）、ならびに卵巣、前立腺、心臓、胎盤、膵臓、肝臓、脾臓、肺、乳房お
よび臍帯組織が挙げられる。

【０３９６】 本発明は、哺乳動物において癌を検出するために有用である。特に、本発明は
、以下の型の癌を哺乳動物において診断する間に有用である：乳癌、卵巣癌、前
立腺癌、骨癌、肝臓癌、肺癌、膵臓癌および脾臓癌。好ましい哺乳動物としては
、サル、類人猿、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、およびヒトが挙げら
れる。特に好ましいのは、ヒトである。

【０３９７】 目的のポリペプチドに特異的に結合する、標識抗体、ならびにその誘導体およ
びアナログは、本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性に関連す
る疾患および／または障害を検出、診断、またはモニタリングするための診断目
的のために、使用され得る。本発明は、目的のポリペプチドの異常な発現の検出
を提供し、この検出は、以下を包含する：（ａ）目的のポリペプチドに対して特
異的な１つ以上の抗体を使用して、個体の細胞または体液において、目的のポリ
ペプチドの発現をアッセイする工程、および（ｂ）この遺伝子発現のレベルを、
標準的な遺伝子発現レベルと比較する工程であって、これによって、標準的な発
現レベルと比較した、アッセイされたポリペプチド遺伝子発現レベルの増加また
は減少が、異常な発現の指標である、工程。

【０３９８】 本発明は、障害を診断するための診断アッセイを提供し、このアッセイは、（
ａ）目的のポリペプチドに特異的な１つ以上の抗体を使用して、個体の細胞また
は体液中の目的のポリペプチドの発現をアッセイする工程、および（ｂ）この遺
伝子発現レベルと標準的な遺伝子発現のレベルを比較する工程、を包含し、これ
によって、その標準的な発現レベルと比較されるアッセイされたポリペプチド遺
伝子発現レベルの増加または減少が、特定の障害を示す。癌に関して、個体由来
の生検組織における比較的高い量の転写物の存在は、疾患の発生のための素因を
示し得るか、または実際の臨床症状の出現前に疾患を検出するための手段を提供
し得る。この型のより決定的な診断は、保健専門家に予防手段を使用させること
、または早期の積極的な処置を可能にし得、これにより、癌の発生またはさらな
る進行を予防する。

【０３９９】 本発明の診断アッセイは、ＡＩＭ ＩＩの変化した発現または産生に関連する
任意の疾患の診断および予後のために、使用され得る。これらのアッセイは、対
宿主性移植片病、自己免疫疾患および免疫欠損の、診断および予後のために、特
に有用であると考えられる。

【０４００】 本発明の抗体を使用して、当業者に公知の古典的な免疫組織学的方法（例えば
、Ｊａｌｋａｎｅｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８
５（１９８５）；Ｊａｌｋａｎｅｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５
：３０８７−３０９６（１９８７）を参照のこと）を使用して、生物学的サンプ
ル中のタンパク質レベルをアッセイし得る。タンパク質遺伝子発現を検出するた
めに有用な他の抗体に基づく方法としては、イムノアッセイ（例えば、酵素結合
イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ
））が挙げられる。適切な抗体アッセイ標識は、当該分野において公知であり、
そして酵素標識（例えば、グルコースオキシダーゼ）；放射性同位体（例えば、
ヨウ素（¹²⁵Ｉ、¹²¹Ｉ）、炭素（¹⁴Ｃ）、硫黄（³⁵Ｓ）、トリチウム（³Ｈ）、
インジウム（¹¹²Ｉｎ）、およびテクネチウム（⁹⁹Ｔｃ）；発光標識（例えば、
ルミノール）；ならびに蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびローダミン）
、およびビオチンが挙げられる。

【０４０１】 本発明の１つの局面は、動物（好ましくは哺乳動物であり、最も好ましくはヒ
トである）における、目的のポリペプチドの異常な発現に関連する疾患または障
害の検出および診断である。１つの実施形態において、診断は、以下を包含する
：ａ）目的のポリペプチドに特異的に結合する標識分子の有効量を、被験体に投
与（例えば、非経口、皮下、または腹腔内）する工程；ｂ）この投与に続いて、
この被験体の、このポリペプチドが発現する部位において、この標識分子が優先
的に濃縮されることを可能にするため（および結合していない標識分子がバック
グラウンドレベルまで除去されるため）の時間間隔を待つ工程；ｃ）バックグラ
ウンドレベルを決定する工程；およびｄ）この被験体中の標識化分子を検出する
工程、を包含し、その結果、このバックグラウンドレベルを超える標識化分子の
検出は、この被験体が目的のポリペプチドの異常な発現と関連する特定の疾患ま
たは障害を有することを示す。バックグラウンドレベルは、特定の系について以
前に決定された標準的な値と、検出された標識化分子の量を比較する工程を包含
する種々の方法により決定され得る。

【０４０２】 被験体の大きさおよび使用される画像化システムが、診断の画像を作成するた
めに必要である画像化部分の量を決定するということは、当該分野において理解
される。放射性同位体部分の場合、ヒト被験体について、注入される放射能の量
は、通常、約５〜２０ミリキュリーの範囲の９９ｍＴｃである。次いで、標識化
抗体または標識化抗体フラグメントは、特定のタンパク質を含む細胞の位置で優
先的に蓄積する。インビボでの腫瘍の画像化は、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌら、
「Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅ
ｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」（
Ｔｕｍｏｒ Ｉｍａｇｉｎｇ、第１３章：Ｔｈｅ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌおよび
Ｂ．Ａ．Ｒｈｏｄｅｓ編、Ｍａｓｓｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．（１
９８２）において、記載される。

【０４０３】 使用する標識の型および投与の様式を含む、いくつかの変動に依存して、標識
化分子が被験体中の部位に優先的に濃縮することを可能にするため、および結合
していない標識化分子がバックグラウンドレベルまで除去されるための投与後の
時間間隔は、６〜４８時間もしくは６〜２４時間または６〜１２時間である。別
の実施形態において、投与後の時間間隔は、５〜２０日間または５〜１０日間で
ある。

【０４０４】 １つの実施形態において、疾患および障害をモニターすることは、疾患または
障害（ｄｉｓｅａｓｅ）を診断するための方法を繰り返すことによって実施され
る（例えば、最初の診断から１ヶ月後、最初の診断から６ヶ月後、最初の診断か
ら１年後、など）。

【０４０５】 標識化分子の存在は、インビボスキャニングについての当該分野で公知の方法
を使用して患者中で検出され得る。これらの方法は、使用される標識の型に依存
する。当業者は、特定の標識を検出するための適切な方法を決定することができ
る。本発明の診断方法において使用され得る方法およびデバイスは、コンピュー
タ連動断層撮影法（ＣＴ）、体全体のスキャン（例えば、陽子（ｐｏｓｉｔｉｏ
ｎ）放射断層撮影法（ＰＥＴ））、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、および超音波診
断法を含むが、これらに限定されない。

【０４０６】 特定の実施形態において、分子を放射性同位体で標識し、そして放射応答外科
的機器（ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｓｕｒｇｉｃａｌ ｉｎ
ｓｔｒｕｍｅｎｔ）（Ｔｈｕｒｓｔｏｎら、米国特許第５，４４１，０５０号）
を使用して患者中で検出する。別の実施形態において、分子を蛍光化合物で標識
し、そして蛍光応答スキャニング機器を使用して患者中で検出する。別の実施形
態において、分子を陽電子射出金属で標識し、そして陽電子射出断層撮影法を使
用して患者中で検出する。さらに別の実施形態において、分子を常磁性標識で標
識し、そして磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を使用して患者中で検出する。

【０４０７】 全細胞ＲＮＡは、ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ、Ａｎａｌ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６−１５９（１９８７）に記載される、単一工程の
グアニジニウム−チオシアネート−フェノール−クロロホルム法を使用して、生
物学的サンプルから単離され得る。次いで、ＡＩＭ ＩＩタンパク質をコードす
るｍＲＮＡのレベルが、任意の適切な方法を使用してアッセイされる。これらと
しては、ノーザンブロット分析（Ｈａｒａｄａら、Ｃｅｌｌ ６３：３０３−３
１２（１９９０））、Ｓ１ヌクレアーゼマッピング（Ｆｕｊｉｔａら、Ｃｅｌｌ
４９：３５７−３６７（１９８７））、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ポリ
メラーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写（ＲＴ−ＰＣＲ）（Ｍａｋｉｎｏら、Ｔ
ｅｃｈｎｉｑｕｅ ２：２９５−３０１（１９９０））、およびリガーゼ連鎖反
応と組み合わせた逆転写（ＲＴ−ＬＣＲ）が挙げられる。

【０４０８】 生物学的サンプル中のＡＩＭ ＩＩタンパク質レベルをアッセイすることは、
抗体に基づく技術を使用して生じ得る。例えば、組織におけるＡＩＭ ＩＩタン
パク質発現は、古典的な免疫組織学的方法を用いて研究され得る（Ｊａｌｋａｎ
ｅｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８５）
；Ｊａｌｋａｎｅｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３
０９６（１９８７））。

【０４０９】 ＡＩＭ ＩＩタンパク質発現を検出するために有用な他の抗体に基づく方法と
しては、イムノアッセイ（例えば、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩ
ＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ））が挙げられる。

【０４１０】 適切な標識は当該分野で公知であり、そして以下が挙げられる：グルコースオ
キシダーゼのような酵素標識、ならびにヨウ素（¹²⁵Ｉ，¹²¹Ｉ）、炭素（¹⁴Ｃ）
、硫黄（³⁵Ｓ）、トリチウム（³Ｈ）、インジウム（¹¹²Ｉｎ）、テクネチウム（ ^99m Ｔｃ）のような放射性同位体、ならびにフルオレセインおよびローダミンの
ような蛍光標識、ならびにビオチン。

【０４１１】 （ＡＩＭ ＩＩ「ノックアウト」および相同組換え） 内因性の遺伝子発現はまた、標的化相同組換え（例えば、Ｓｍｉｔｈｉｅｓ
ら、Ｎａｔｕｒｅ ３１７：２３０−２３４（１９８５）；Ｔｈｏｍａｓおよび
Ｃａｐｅｃｃｈｉ、Ｃｅｌｌ ５１：５０３−５１２（１９８７）；Ｔｈｏｍｐ
ｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ５：３１３−３２１（１９８９）（これらの各々は、その
全体が参考として本明細書中に援用される）を参照のこと）を使用して、その遺
伝子および／またはそのプロモーターを不活性化すなわち「ノックアウト」する
ことによって減少され得る。例えば、内因性ポリヌクレオチド配列（この遺伝子
のコード領域または調節領域のいずれか）と相同性のＤＮＡに隣接される、本発
明の変異体、非機能的なポリヌクレオチド（または完全に関連のないＤＮＡ配列
）を、選択マーカーおよび／またはネガティブ選択マーカーを用いてまたは用い
ずに使用し、インビボで本発明のポリペプチドを発現する細胞をトランスフェク
トし得る。別の実施形態において、当該分野で公知の技術を、目的の遺伝子を含
むが、発現しない細胞中でノックアウトを作製するために使用する。標的化され
た相同組換えを介した、このＤＮＡ構築物の挿入は、標的化された遺伝子の不活
性化を生じる。このようなアプローチは、胚性幹細胞に対する改変が不活性な標
的化された遺伝子を有する動物の子孫を作製するために使用され得る研究および
農業分野に特に適する（例えば、ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ １９８
７ならびにＴｈｏｍｐｓｏｎ １９８９、前出を参照のこと）。しかし、このア
プローチは、当業者に明白な適切なウイルスベクターを使用して、組換えＤＮＡ
構築物がインビボで要求された部位に直接投与されるか、または標的化される場
合、ヒトにおける使用に慣用的に適合され得る。この段落で引用した文献の各々
の内容は、その全体が本明細書中に参考として援用される。

【０４１２】 本発明のさらなる実施形態において、本発明のポリペプチドを発現するために
遺伝子操作される細胞、あるいは本発明のポリペプチドを発現しないように遺伝
子操作された細胞（例えば、ノックアウト）を、インビボで患者に投与する。こ
のような細胞は、患者（すなわち、ヒトを含む動物）またはＭＨＣ適合性ドナー
から入手され得、そして線維芽細胞、骨髄細胞、血球（例えば、リンパ球）、脂
肪細胞、筋細胞、内皮細胞などを含み得るが、それらに限定されない。この細胞
を、例えば、形質導入（ウイルスベクターおよび好ましくは細胞ゲノム中に導入
遺伝子を組み込むベクターを使用する）、またはトランスフェクション手順（プ
ラスミド、コスミド、ＹＡＣ、裸のＤＮＡ、エレクトロポレーション、リポソー
ムなどの使用を含むが、これらに限定されない）によって、細胞中に本発明のポ
リペプチドのコード配列を導入するために、あるいはこのコード配列および／ま
たは本発明のポリペプチドに結合している内因性の調節配列を破壊するために、
組換えＤＮＡ技術を使用してインビトロで遺伝子操作する。本発明のポリペプチ
ドのコード配列を強力な構成的プロモーターもしくは誘導性プロモーターまたは
プロモーター／エンハンサーの制御下で配置し、本発明のポリペプチドの発現お
よび好ましくは分泌を達成し得る。本発明のポリペプチドを発現および好ましく
は分泌する操作した細胞を、例えば、循環中において、または腹腔内で患者中へ
全身的に導入し得る。あるいは、この細胞をマトリックスに組み込み得、そして
身体に移植し得る（例えば、遺伝子操作した線維芽細胞を皮膚移植片の一部とし
て移植し得る）；遺伝子操作した内皮細胞をリンパ移植片または脈管移植片の一
部として移植し得る（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、米国特許第５，３９９，３
４９号ならびにＭｕｌｌｉｇａｎおよびＷｉｌｓｏｎ、米国特許第５，４６０，
９５９号を参照のこと。これらの各々は、本明細書中でその全体が参考として援
用される）。

【０４１３】 投与される細胞が非自己または非ＭＨＣ適合性細胞である場合、それらを、こ
の導入細胞に対する宿主免疫応答の発生を妨害する周知の技術を使用して投与し
得る。例えば、この細胞をカプセル性の形態で導入し得、この形態は、構成成分
と即時の細胞外環境との交換を可能にしつつ、導入細胞が宿主免疫系によって認
識されることを可能にしない。

【０４１４】 （トランスジェニック非ヒト動物） 本発明のポリペプチドはまた、トランスジェニック動物において発現され得る
。マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、ブタ、ミニブタ、ヤギ、
ヒツジ、ウシおよびヒト以外の霊長類（例えば、ヒヒ、サルおよびチンパンジー
）を含むがこれらに限定されない任意の種の動物は、トランスジェニック動物を
作製するために用いられ得る。特定の実施形態において、本明細書に記載される
かまたはさもなければ当該分野で公知の技術が、遺伝子治療プロトコルの一部と
して、ヒトにおける本発明のポリペプチドの発現のために用いられる。

【０４１５】 当該分野で公知の任意の技術を、導入遺伝子（すなわち、本発明のポリヌクレ
オチド）の動物への導入に用いて、トランスジェニック動物の創始系統（ｆｏｕ
ｎｄｅｒ ｌｉｎｅ）を生成し得る。このような技術は、前核マイクロインジェ
クション（Ｐａｔｅｒｓｏｎら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌ．４０：６９１−６９８（１９９４）；Ｃａｒｖｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）１１：１２６３−１２７０（１９９３）；Ｗｒｉｇｈｔ
ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）９：８３０−８３４（１９９１）；お
よびＨｏｐｐｅら、米国特許第４，８７３，１９１号（１９８９））；生殖細胞
系へのレトロウイルス媒介遺伝子移入（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：６１４８−６１５２（１９
８５））、胚盤胞または胚；胚性幹細胞における遺伝子標的化（Ｔｈｏｍｐｓｏ
ｎら、Ｃｅｌｌ ５６：３１３−３２１（１９８９））；細胞または胚のエレク
トロポレーション（Ｌｏ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：１８０３−１８１
４（１９８３））；遺伝子銃を用いた本発明のポリヌクレオチドの導入（例えば
、Ｕｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５（１９９３）を参照のこと
）；胚性多能性（ｐｌｅｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞への核酸構築物の導入およ
び胚盤胞へのこの幹細胞の移入；ならびに精子媒介遺伝子移入（Ｌａｖｉｔｒａ
ｎｏら、Ｃｅｌｌ ５７：７１７−７２３（１９８９））；などを含むがこれら
に限定されない。このような技術の総説については、本明細書中にその全体が参
考として援用される、Ｇｏｒｄｏｎ、「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌｓ
」、Ｉｎｔｌ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１１５：１７１−２２９（１９８９）を参
照のこと。さらに、この段落で引用される文献の各々の内容は、その全体が本明
細書中に参考として援用される。また、米国特許第５，４６４，７６４号（Ｃａ
ｐｅｃｃｈｉら、Ｐｏｓｉｔｉｖｅ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ
Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｖｅｃｔｏｒｓ）；米国特許第５，６３１，１５３号
（Ｃａｐｅｃｃｈｉら、Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｎｏｎ−Ｈｕｍａｎ Ｏｒｇａｎ
ｉｓｍｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ Ｇｅｎｏｍｉ
ｃ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ−Ｎｅｇａｔｉｖ
ｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ
Ｍａｋｉｎｇ Ｓａｍｅ）；米国特許第４，７３６，８６６号（Ｌｅｄｅｒら、
Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｎｏｎ−Ｈｕｍｎａｎ Ａｎｉｍａｌｓ）；および米国
特許第４，８７３，１９１号（Ｗａｇｎｅｒら、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｒａｎｓｆ
ｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｚｙｇｏｔｅｓ）を参照のこと（これらの各々は、本
明細書中にその全体が参考として援用される）。

【０４１６】 当該分野で公知の任意の技術を用いて、本発明のポリヌクレオチドを含むトラ
ンスジェニッククローンを生成し得る（例えば、培養された、静止状態に誘導さ
れた胚細胞、胎児細胞または成体の細胞由来の除核した卵母細胞の核への核移入
（Ｃａｍｐｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ ３８０：６４−６６（１９９６）；Ｗｉｌ
ｍｕｔら、Ｎａｔｕｒｅ ３８５：８１０−８１３（１９９７））；これらの各
々は、本明細書中にその全体が参考として援用される。

【０４１７】 本発明は、その全ての細胞に導入遺伝子を有するトランスジェニック動物、な
らびにいくつかの細胞（しかしその全ての細胞ではない）に導入遺伝子を有する
動物（すなわち、モザイク動物またはキメラ）を提供する。導入遺伝子は、１つ
の導入遺伝子としてまたはコンカテマー（例えば、頭−頭タンデム型または頭−
尾タンデム型）のような複数のコピーとして組み込まれ得る。この導入遺伝子は
また、例えば、Ｌａｓｋｏらの教示（Ｌａｓｋｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６２３２−６２３６（１９９２））に従って特定
の細胞型に選択的に導入され得、そして活性化され得る。このような細胞型特異
的活性化に必要とされる調節配列は、目的の特定の細胞型に依存し、そしてそれ
らは当業者に明らかである。ポリヌクレオチド導入遺伝子が、内在性遺伝子の染
色体部位に組み込まれることが所望される場合、遺伝子の標的化が好ましい。手
短に言えば、このような技術が利用される場合、内在性遺伝子に対して相同ない
くつかのヌクレオチド配列を含むベクターが、染色体配列との相同な組換えを介
して内在性遺伝子のヌクレオチド配列に組み込まれ、そのヌクレオチド配列の機
能を破壊することを目的として設計される。導入遺伝子はまた、特定の細胞型に
選択的に導入され得、従って、例えば、Ｇｕら（Ｇｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６
５：１０３−１０６（１９９４））の教示に従って、導入された細胞型において
のみ内在性遺伝子が不活化される。そのような細胞型特異的不活化に必要とされ
る調節配列は、目的の特定の細胞型に依存し、そしてそれらは当業者に明らかで
ある。この段落で引用される文献の各々の内容は、その全体が本明細書中に参考
として援用される。

【０４１８】 一旦トランスジェニック動物が作製されると、その組換え遺伝子の発現は、標
準的な技術を利用してアッセイされ得る。最初のスクリーニングは、サザンブロ
ット分析またはＰＣＲ技術によって達成されて、導入遺伝子の組み込みが起きた
ことを動物組織の分析により確認し得る。トランスジェニック動物の組織におけ
る導入遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルはまた、動物から得た組織サンプルのノーザ
ンブロット分析、インサイチュハイブリダイゼーション分析および逆転写酵素Ｐ
ＣＲ（ｒｔ−ＰＣＲ）を含むがこれらに限定されない技術を用いて評価され得る
。トランスジェニック遺伝子発現組織のサンプルはまた、導入遺伝子産物に特異
的な抗体を用いて免疫細胞化学的または免疫組織化学的に評価され得る。

【０４１９】 一旦、創始動物が生成されると、それらは、交配、同系交配、異系交配または
交雑されて、特定の動物の群体を生成し得る。そのような交配戦略の例は、以下
を含むがそれらに限定されない：別の系統を樹立するために、１つより多くの組
み込み部位を有する創始動物の異系交配；各導入遺伝子の相加的発現効果によっ
て、より高いレベルで導入遺伝子を発現する複合トランスジェニックを生成する
ための別々の系統の同系交配；発現の増強およびＤＮＡ分析による動物のスクリ
ーニングの必要性の排除の両方のための、所定の組み込み部位についてホモ接合
性の動物を生成するヘテロ接合性トランスジェニック動物の交雑；複合ヘテロ接
合性またはホモ接合性系統を生成するための別々のホモ接合系統の交雑；ならび
に目的の実験モデルに適切な異なるバックグラウンド上に導入遺伝子を配置する
ための交配。

【０４２０】 本発明のトランスジェニックおよび「ノックアウト」動物は、ＡＩＭ ＩＩポ
リペプチドの生物学的機能の詳述、異常なＡＩＭ ＩＩ発現に関連する状態およ
び／または障害の研究、ならびにこのような状態および／または障害を寛解させ
るに有効な化合物のスクリーニングにおいて有用な動物モデル系を含むが、それ
らに限定されない用途を有する。

【０４２１】 （他の用途） 本発明はまた、細胞が本発明のＡＩＭ ＩＩポリペプチドまたはこれらのポリ
ペプチドに対する特異性を有する抗体のいずれかに結合するか否かに基づいて、
これらの細胞を亜集団に分離する方法に関する。これらの分離方法は、一般的に
、細胞表面においてＡＩＭ ＩＩポリペプチドを結合する表面レセプターを発現
するかまたはＡＩＭ ＩＩポリペプチドを有するかのいずれかの細胞が、標識化
されたＡＩＭ ＩＩポリペプチドまたはＡＩＭ ＩＩ特異的抗体を用いて同定さ
れ得るという原則に基づく。次いで、このような細胞は、これらのポリペプチド
または抗体を結合しない、集団中の他の細胞と分離され得る。細胞を分離する方
法（「細胞選別」として一般的に公知）は、当該分野において公知であり、そし
てＣｒａｎｅの米国特許第５，４８９，５０６号において考察されている。

【０４２２】 従って、１つの局面において、本発明はＡＩＭ ＩＩポリペプチドまたはＡＩ
Ｍ ＩＩポリペプチドに対する特異性を有する抗体のいずれかに結合する細胞を
分離する方法を提供する。この方法は、細胞の集団と、ＡＩＭ ＩＩポリペプチ
ドまたはＡＩＭ ＩＩポリペプチドに対する特異性を有する抗体のいずれかとを
接触させる工程（ここでこのＡＩＭ ＩＩポリペプチドまたは抗体は、検出可能
な標識で標識化される）、およびＡＩＭ ＩＩポリペプチドまたは抗ＡＩＭ Ｉ
Ｉポリペプチド抗体のいずれかに結合する細胞を、これらの分子に結合しない細
胞から分離する工程、を包含する。ＡＩＭ ＩＩポリペプチドを結合する細胞は
、リンホトキシン−β−レセプター（ＬＴ−β−Ｒ）、ＴＲ２、ＣＤ２７、およ
びＴＲＡＮＫを発現する細胞を含むと考えられる。

【０４２３】 別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、異なる細胞型に対してＬＴβレ
セプター／ＡＩＭ ＩＩ相互作用、ＴＲ６／ＡＩＭ ＩＩ相互作用、および／ま
たはＴＲＡＮＫ／ＡＩＭ ＩＩ相互作用を阻害することから生じる生物学的効果
を研究するための研究用ツールとして使用される。ＡＩＭ ＩＩポリペプチドは
また、ＬＴβレセプター、ＴＲ６、および／もしくはＴＲＡＮＫ、またはＡＩＭ
ＩＩ、あるいはそれらの相互作用を検出するためのインビトロアッセイにおい
て使用され得る。

【０４２４】 本発明はまた、ＡＩＭ ＩＩに結合する分子（例えば、レセプター分子）の同
定の方法を提供する。ＡＩＭ ＩＩに結合するタンパク質（例えば、レセプター
タンパク質）をコードする遺伝子は、当業者に公知の多くの方法（例えば、リガ
ンドパニング（ｌｉｇａｎｄ ｐａｎｎｉｎｇ）およびＦＡＣＳソーティングに
よって同定され得る。このような方法は、例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒ
ｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１（２）：第５章
（１９９１）のような、多くの研究室マニュアルに記載される。

【０４２５】 例えば、発現クローニングは、この目的のために使用され得る。この目標のた
めに、ポリアデニル化ＲＮＡがＡＩＭ ＩＩに応答する細胞から調製され、ｃＤ
ＮＡライブラリーがこのＲＮＡから作製され、このライブラリーがプールに分け
られ、そしてこのプールがＡＩＭ ＩＩに応答しない細胞内に個々にトランスフ
ェクトされる。次いで、トランスフェクトされた細胞は、標識されたＡＩＭ Ｉ
Ｉに曝露される（ＡＩＭ ＩＩは、放射性ヨウ素化または部位特異的プロテイン
キナーゼに対する認識部位の導入の標準的な方法を含む、種々の周知技術によっ
て標識され得る）。曝露後に、細胞が固定され、そしてＡＩＭ ＩＩの結合を決
定する。これらの手順は、簡便にガラススライド上で実行される。

【０４２６】 ＡＩＭ ＩＩ結合細胞を産生するｃＤＮＡのプールが同定される。サブプール
（ｓｕｂ−ｐｏｏｌ）は、これらの陽性から調製され、宿主細胞内にトランスフ
ェクトされ、そして上記のようにスクリーニングされる。反復性のサブプールお
よび再スクリーニングプロセスを使用して、推定される結合分子（例えば、レセ
プター分子）をコードする１つ以上の単一クローンが、単離され得る。

【０４２７】 あるいは、標識されたリガンドは、リガンドが結合する分子（例えば、レセプ
ター分子）を発現する細胞から調製された細胞抽出物（例えば、膜または膜抽出
物）に光親和的に連結され得る。架橋された物質は、ポリアクリルアミドゲル電
気泳動（「ＰＡＧＥ」）によって分離され、そしてＸ線フィルムに曝露される。
リガンド−レセプターを含む標識された複合体は、励起され得、ペプチドフラグ
メントへと分離され得、そしてタンパク質微量配列決定に供され得る。微量配列
決定から得られたアミノ酸配列は、推定のレセプター分子をコードする遺伝子を
同定するためにｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための、独特のオリ
ゴヌクレオチドプローブまたは縮重したオリゴヌクレオチドプローブを設計する
ために使用され得る。

【０４２８】 本発明のポリペプチドはまた、細胞において、または細胞を含まない調製物に
おいて、ＡＩＭ ＩＩ結合分子（例えば、レセプター分子）のＡＩＭ ＩＩ結合
能を評価するために使用され得る。

【０４２９】 本発明の核酸分子はまた、染色体同定に有用である。その配列は、個々のヒト
染色体上の特定の位置に特異的に標的化され、そしてそれとハイブリダイズし得
る。本発明による、ＤＮＡの染色体へのマッピングは、疾患と関連する遺伝子と
それらの配列とを相関付ける際の重要な第１の工程である。

【０４３０】 この点における特定の好ましい実施形態において、本明細書中において開示さ
れるｃＤＮＡの１つを使用して、ＡＩＭ ＩＩタンパク質遺伝子のゲノムＤＮＡ
をクローニングする。このことは、一般に市販されている種々の周知の技術およ
びライブラリーを使用して達成され得る。次いで、ゲノムＤＮＡを、インサイチ
ュ染色体マッピングのために、この目的のための周知の技術を使用して使用され
る。

【０４３１】 さらに、いくつかの場合において、配列は、ｃＤＮＡ由来のＰＣＲプライマー
（好ましくは、１５〜２５ｂｐ）を調製することによって、染色体にマッピング
され得る。遺伝子の３’非翻訳領域のコンピュータ分析を使用して、ゲノムＤＮ
Ａにおける１より多くのエキソンにまたがる（それによって増幅プロセスは複雑
にされる）ことのないプライマーを迅速に選択する。次いで、これらのプライマ
ーを、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングのた
めに使用する。

【０４３２】 中期染色体スプレッドへのｃＤＮＡクローンの蛍光インサイチュハイブリダイ
ゼーション（「ＦＩＳＨ」）を使用して、１つの工程で、正確な染色体位置を提
供し得る。この技術は、５０または６０ｂｐほどの短いｃＤＮＡ由来のプローブ
とともに使用され得る。この技術の概説について、Ｖｅｒｍａら、Ｈｕｍａｎ
Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ Ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉ
ｑｕｅｓ、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）を参
照のこと。

【０４３３】 一旦、配列が正確な染色体位置にマッピングされると、染色体上のその配列の
物理的位置を、遺伝マップデータに相関付けし得る。そのようなデータは、例え
ば、Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ Ｉ
ｎ Ｍａｎ（Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｅｌｃｈ
Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙからオンラインで利用可能）において見出さ
れる。次いで、同じ染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患との間の関係を
、連鎖解析（物理的に隣接する遺伝子の同時遺伝）を通して同定する。

【０４３４】 次いで、罹患している個体と罹患していない個体との間の、ｃＤＮＡまたはゲ
ノム配列における差を決定することが必要である。変異が、罹患している個体の
いくらか、またはすべてにおいて観察されるが、正常な個体においては観察され
ない場合、変異は、その疾患の原因因子である可能性がある。

【０４３５】 （治療活性または予防活性の証明） 本発明の化合物または薬学的組成物は、好ましくは、ヒトでの使用の前にイン
ビトロで、そして次いでインビボで、所望の治療活性または予防活性について試
験される。例えば、化合物または薬学的組成物の、治療有用性または予防有用性
を証明するためのインビトロアッセイとしては、細胞株または患者組織サンプル
に対する化合物の効果が挙げられる。細胞株および／または組織サンプルに対す
る化合物または組成物の効果は、当業者に公知である技術（ロゼット形成アッセ
イおよび細胞溶解アッセイが挙げられるがこれらに限定されない）を利用して決
定され得る。本発明に従って、特定の化合物の投与が指示されるか否かを決定す
るために用いられ得るインビトロアッセイとしては、インビトロ細胞培養アッセ
イが挙げられ、このアッセイでは、患者組織サンプルを培養において増殖させ、
そして化合物に曝されるか、そうでなければ化合物が投与され、そして、組織サ
ンプルに対するそのような化合物の効果が観察される。

【０４３６】 （キット） 本発明は、上記の方法において用いられ得るキットを提供する。１つの実施形
態においては、キットは、１以上の容器中に、本発明の抗体（好ましくは精製さ
れた抗体）を備える。特定の実施形態においては、本発明のキットは、このキッ
トに含まれる抗体と特異的に免疫反応性であるエピトープを含む、実質的に単離
されたポリペプチドを備える。好ましくは、本発明のキットは、目的のポリペプ
チドと反応しないコントロール抗体を、さらに備える。別の特定の実施形態にお
いては、本発明のキットは、目的のポリペプチドとの抗体の結合を検出するため
の手段を備える（例えば、この抗体は、検出可能な基質（例えば、蛍光化合物、
酵素基質、放射性化合物または発光化合物）と結合体化され得るか、あるいは一
次抗体を認識する二次抗体が、検出可能な基質と結合体化され得る）。

【０４３７】 本発明の別の特定の実施形態においては、このキットは、増殖性および／また
は癌性のポリヌクレオチドおよびポリペプチドに対して特異的な抗体を含む血清
をスクリーニングする際に用いる診断用キットである。このようなキットは、目
的のポリペプチドと反応しないコントロール抗体を備え得る。このようなキット
は、少なくとも１つの抗ポリペプチド抗原抗体と特異的に免疫反応性であるエピ
トープを含む、実質的に単離されたポリペプチド抗原を備え得る。さらに、この
ようなキットは、この抗体の抗原への結合（例えば、この抗体は、フローサイト
メトリーにより検出され得る、フルオレセインまたはローダミンのような蛍光化
合物と結合体化され得る）を検出するための手段を備える。特定の実施形態にお
いては、このキットは、組換え的に産生されたポリペプチド抗原または化学的に
合成されたポリペプチド抗原を備え得る。このキットのポリペプチド抗原はまた
、固体支持体に付着され得る。

【０４３８】 より特定の実施形態においては、上記のキットの検出手段は、このポリペプチ
ド抗原が付着される固体支持体を含む。このようなキットはまた、非付着レポー
ター標識抗ヒト抗体を備える。この実施形態においては、抗体のポリペプチド抗
原との結合は、このレポーター標識抗体の結合により検出され得る。

【０４３９】 さらなる実施形態においては、本発明は、本発明のポリペプチドの抗原を含む
血清をスクリーニングする際に用いる診断用キットを含む。この診断用キットは
、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド抗原と特異的に免疫反応性である、実質
的に単離された抗体、およびこのポリヌクレオチドまたはポリペプチド抗原の抗
体との結合を検出する手段を備える。１つの実施形態においては、この抗体は、
固体支持体に付着される。特定の実施形態においては、この抗体は、モノクロナ
ール抗体であり得る。このキットの検出手段は、第二の標識されたモノクロナー
ル抗体を含み得る。あるいは、またはさらに、この検出手段は、標識された、競
合抗原を含み得る。

【０４４０】 １つの診断の構成においては、試験血清は、本発明の方法により得られる表面
結合抗原を有する固相試薬と反応する。特異的な抗原抗体をこの試薬と結合させ
、そして結合されない血清成分を洗浄により除去した後、固体支持体上に結合す
る抗抗原抗体の量に応じて、レポーターをこの試薬と結合させるために、この試
薬をレポーター標識抗ヒト抗体と反応させる。この試薬は、結合されない標識抗
体を除去するため、再び洗浄され、そしてこの試薬と会合したレポーターの量が
決定される。代表的には、レポーターは、適切な蛍光定量的基質、発光基質また
は比色基質（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の存在下で、この固相をイ
ンキュベートすることにより検出される酵素である。

【０４４１】 上記のアッセイにおける固体表面試薬は、タンパク質材料を固体支持体材料（
例えば、高分子ビーズ、ディップスティック、９６ウェルプレートまたはフィル
ター材料）に付着させるための公知の技術により調製される。これらの付着方法
としては、一般的に、支持体へのタンパク質の非特異的な吸着または固体支持体
上の化学的に活性な基（例えば、活性化カルボキシル基、ヒドロキシル基、また
はアルデヒド基）とのタンパク質の共有結合（ｃｏｖａｌｅｎｔ ａｔｔａｃｈ
ｍｅｎｔ）（代表的には、遊離アミン基を介する）が挙げられる。あるいは、ス
トレプトアビジンでコートされたプレートが、ビオチン化された抗原と共に使用
され得る。

【０４４２】 従って、本発明は、この診断方法を行うためのアッセイ系またはキットを提供
する。このキットは、一般的に、表面結合された組換え抗原を有する支持体、お
よび表面結合された抗抗原抗体を検出するための、レポーター標識された抗ヒト
抗体を備える。

【０４４３】 （治療的／予防的な投与および組成物） 上記で考察したような状態が、ＡＩＭ ＩＩタンパク質の投与によって処置さ
れ得ることが理解される。結果として、本発明はさらに、ＡＩＭ ＩＩ活性のレ
ベルを増加させる必要のある個体を処置する方法を提供する。この方法は、この
ような個体におけるＡＩＭ ＩＩの活性レベルを増加させるために有効な有効量
の本発明の単離されたＡＩＭ ＩＩポリペプチドを含むか、あるいはその有効量
の本発明の単離されたＡＩＭ ＩＩポリペプチドからなる薬学的組成物を、この
ような個体に投与する工程を包含する。従って、本発明は、被験体への有効量の
本発明の化合物または薬学的組成物、好ましくは本発明の抗体の投与による処置
、阻害および予防の方法を提供する。好ましい局面において、化合物は実質的に
精製される（例えば、その効果を制限するかまたは望ましくない副作用を生じる
物質は実質的に含まない）。被験体は好ましくは、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ
、ネコ、イヌなどの動物が挙げられるがそれらに限定されない動物であり、そし
て好ましくは哺乳動物であり、そして最も好ましくはヒトである。

【０４４４】 化合物が核酸または免疫グロブリンを含む場合に使用され得る処方および投与
方法は、上記に記載され；さらなる適切な処方および投与経路は、本明細書中で
以下に記載されたものの中から選択され得る。

【０４４５】 様々な送達系が公知であり、そして本発明の化合物を投与するために用いられ
得る（例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル、この化合物の発現が可
能な組換え細胞中でのカプセル化、レセプター媒介エンドサイトーシス（例えば
、ＷｕおよびＷｕ、１９８７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４
４３２を参照のこと）、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての核酸
の構築など）。導入方法としては、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内
、硬膜外、および経口経路が挙げられるがそれらに限定されない。化合物または
組成物は、任意の好都合な経路により（例えば、注入またはボーラス注射により
、上皮または粘膜内層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜および腸粘膜など）を通し
ての吸収により）投与され得、そして他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与さ
れ得る。従って、本発明のＡＩＭ ＩＩを含む薬学的組成物は経口的、直腸的、
非経口的、槽内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｍａｌｌｙ）、膣内、腹腔内、局所的（
粉末、軟膏、ドロップ、または経皮パッチによって）、口腔内（ｂｕｃａｌｌｙ
）にか、または経口もしくは鼻内スプレーとして投与され得る。

【０４４６】 本明細書で用いる用語「非経口的」とは、静脈内、筋内、腹腔内、胸骨内、皮
下および関節内の注射および注入を含む投与の様式をいう。

【０４４７】 投与は、全身的または局所的であり得る。さらに、本発明の薬学的化合物また
は組成物を、任意の適切な経路（脳室内注射および髄腔内注射を包含し；脳室内
注射は、例えば、Ｏｍｍａｙａリザーバのようなリザーバに取り付けられた脳室
内カテーテルにより容易にされ得る）により中枢神経系に導入することが望まれ
得る。例えば、吸入器または噴霧器の使用、およびエアゾール化剤を用いた処方
により、肺投与もまた使用され得る。

【０４４８】 特定の実施形態において、本発明の薬学的化合物または組成物を、処置の必要
な領域に局所的に投与することが望まれ得る；これは、制限する目的ではないが
、例えば、手術中の局部注入、局所適用（例えば、手術後の創傷包帯との組み合
わせて）により、注射により、カテーテルにより、坐剤により、またはインプラ
ント（このインプラントは、シアラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜のよう
な膜または繊維を含む、多孔性、非多孔性、または膠様材料である）により達成
され得る。好ましくは、抗体を含む本発明のタンパク質を投与する場合、タンパ
ク質が吸収されない材料を使用するために注意が払われなければならない。

【０４４９】 別の実施形態において、化合物または組成物は、小胞、特に、リポソーム中へ
送達され得る（Ｌａｎｇｅｒ、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−
１５３３；Ｔｒｅａｔら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ
ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏ
ｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ，３５３〜３６５頁（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，同
書３１７〜３２７頁を参照のこと；広く同書を参照のこと）。

【０４５０】 さらに別の実施形態において、化合物または組成物は制御放出系中で送達され
得る。１つの実施形態において、ポンプが用いられ得る（Ｌａｎｇｅｒ，（前出
）；Ｓｅｆｔｏｎ、１９８７、ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎ
ｇ．１４：２０１；Ｂｕｃｈｗａｌｄら、１９８０、Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：５
０７；Ｓａｕｄｅｋら、１９８９、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４
を参照のこと）。別の実施形態において、高分子材料が用いられ得る（Ｍｅｄｉ
ｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａ
ｓｅ，ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編），ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ Ｒ
ａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂ
ｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａ
ｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌｌ（編），Ｗｉｌｅ
ｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）；ＲａｎｇｅｒおよびＰｅｐｐａｓ，Ｊ．、
１９８３、Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２３：６１を参照のこと；Ｌｅｖｙら、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１
９０；Ｄｕｒｉｎｇら、１９８９、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１；Ｈｏ
ｗａｒｄら、１９８９、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５もまた参照のこ
と）。さらに別の実施形態において、制御された放出系は、治療標的、即ち、脳
の近位に配置され得、従って、全身用量の一部のみを必要とする（例えば、Ｇｏ
ｏｄｓｏｎ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏ
ｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，（前出），第２巻，１１５〜１３８頁（１９８４）
を参照のこと）。

【０４５１】 他の制御された放出系は、Ｌａｎｇｅｒにより総説において議論される（１９
９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３）。

【０４５２】 本発明の化合物がタンパク質をコードする核酸である、特定の実施形態におい
て、その核酸は、それを適切な核酸発現ベクターの一部として構成し、そしてそ
れが細胞内になるように投与することにより（例えば、レトロウイルスベクター
の使用により（米国特許第４，９８０，２８６号を参照のこと）、または直接注
射により、または微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔ
ｉｃ，Ｄｕｐｏｎｔ）の使用により、または脂質もしくは細胞表面レセプターも
しくはトランスフェクト剤でコーティングすることにより、または核に入ること
が公知であるホメオボックス様ペプチドと結合させて投与すること（例えば、Ｊ
ｏｌｉｏｔら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８
８：１８６４−１８６８を参照のこと）などにより、そのコードされたタンパク
質の発現を促進するようにインビボで投与され得る。あるいは、核酸は、細胞内
に導入され得、そして、発現のために相同組換えにより宿主細胞ＤＮＡ内に組み
込まれ得る。

【０４５３】 慢性関節リウマチの処置において、本発明のＡＩＭ ＩＩポリペプチドの特に
好ましい投与様式としては、皮内、皮下、および関節内の注射および注入が挙げ
られる。好ましくは、１用量あたりの関節内または皮内に投与されるＡＩＭ Ｉ
Ｉポリペプチドは、患者の体重で約０．１〜約１．０ｍｇ／ｋｇの範囲である。

【０４５４】 本発明の組成物は、単独で、または他の治療的薬剤（例えば、同時刺激分子）
と組み合わせて投与され得る。本発明の組成物とともに投与され得る治療的薬剤
としては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：ＴＮＦファミリーの他
のメンバー、化学療法剤、抗生物質、ステロイド性および非ステロイド性の抗炎
症剤、従来の免疫療法剤、サイトカインならびに／または増殖因子。組み合わせ
は、例えば、混合物として同時に、別々であるが同時にもしくは並行して；また
は逐次的にかのいずれかで投与され得る。これは、組み合わされた薬剤が、治療
混合物としてともに投与される提示を含み、そして組み合わせた薬剤が、別々で
あるが同時に投与される手順（例えば、同じ個体へ別々の静脈ラインを通じての
場合）もまた含む。「組み合わせ」投与は、第１に与えられ、続いて第２に与え
られる化合物または薬剤のうちの１つを別々に投与することをさらに含む。従っ
て、実際、治療剤は、同時または異なる時間のいずれかに個体に投与され得る。
治療剤が異なる時間に個体に投与される場合の大半において、治療剤は、一般的
に、これらの薬剤の治療的効果が一定期間重複するような様式で投与される。

【０４５５】 １つの実施形態において、本発明の組成物は、ＴＮＦファミリーの他のメンバ
ーと組み合わせて投与される。本発明の組成物とともに投与され得るＴＮＦ分子
、ＴＮＦ関連分子、またはＴＮＦ様分子としては、以下が挙げられるが、これら
に限定されない：可溶性形態のＴＮＦ−α、リンホトキシン−α、（ＬＴ−α、
ＴＮＦ−βとしても公知）、ＬＴ−β（複合ヘテロトリマーＬＴ−α２−βで見
出された）、ＯＰＧＬ、ＦａｓＬ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、４−
１ＢＢＬ、ＤｃＲ３、ＯＸ４０Ｌ、ＴＮＦ−γ（国際公開番号ＷＯ９６／１４３
２８）、ＡＩＭ−Ｉ（国際公開番号ＷＯ９７／３３８９９）、ＡＰＲＩＬ（Ｊ．
Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８（６）：１１８５−１１９０）、エンドカイン（ｅｎｄ
ｏｋｉｎｅ）−α（国際公開番号ＷＯ９８／０７８８０）、ＴＲ６（国際公開番
号ＷＯ９８／３０６９４）、ＯＰＧ、およびニュートロカイン（ｎｅｕｔｒｏｋ
ｉｎｅ）−α（国際公開番号ＷＯ９８／１８９２１）、ＯＸ４０、および神経成
長因子（ＮＧＦ）、ならびに可溶性形態のＦａｓ、可溶性形態のＣＤ３０、可溶
性形態のＣＤ２７、可溶性形態のＣＤ４０および可溶性形態の４−ＩＢＢ、ＴＲ
２（国際公開番号ＷＯ９６／３４０９５）、ＤＲ３（国際公開番号ＷＯ９７／３
３９０４）、ＤＲ４（国際公開番号ＷＯ９８／３２８５６）、ＴＲ５（国際公開
番号ＷＯ９８／３０６９３）、ＴＲ６（国際公開番号ＷＯ９８／３０６９４）、
ＴＲ７（国際公開番号ＷＯ９８／４１６２９）、ＴＲＡＮＫ、ＴＲ９（国際公開
番号ＷＯ９８／５６８９２）、ＴＲ１０（国際公開番号ＷＯ９８／５４２０２）
、３１２Ｃ２（国際公開番号ＷＯ９８／０６８４２）、およびＴＲ１２、ならび
に可溶性形態のＣＤ１５４、可溶性形態のＣＤ７０、および可溶性形態のＣＤ１
５３。

【０４５６】 好ましい実施形態において、本発明の組成物は、以下と組み合わせて投与され
る：ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）；ＣＤ４０Ｌの可溶性形態（例えば、ＡＶ
ＲＥＮＤ^TM）；ＣＤ４０Ｌの生物学的活性フラグメント、改変体または誘導体；
抗ＣＤ４０Ｌ抗体（例えば、アゴニスト抗体またはアンタゴニスト抗体）；およ
び／または抗ＣＤ４０抗体（例えば、アゴニスト抗体またはアンタゴニスト抗体
）。

【０４５７】 好ましい実施形態において、本発明の組成物は、１、２、３、４、５つまたは
より多くの以下の組成物と組合せて投与される：ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ（Ｆｕｊ
ｉｓａｗａ）、ｔｈａｌｉｄｏｍｉｄｅ（例えば、Ｃｅｌｇｅｎｅ）、抗Ｔａｃ
（Ｆｖ）−ＰＥ４０（例えば。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓ）、ｉ
ｎｏｌｉｍｏｍａｂ（Ｂｉｏｔｅｓｔ）、ＭＡＫ−１９５Ｆ（Ｋｎｏｌｌ）、Ａ
ＳＭ−９８１（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、インターロイキン−１レセプター（例えば
、Ｉｍｍｕｎｅｘ）、インターロイキン−４レセプター（例えば、Ｉｍｍｕｎｅ
ｘ）、ＩＣＭ３（ＩＣＯＳ）、ＢＭＳ−１８８６６７（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅ
ｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、抗ＴＮＦ Ａｂ（例えば、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ抗体
）、ＣＧ−１０８８（Ｃｅｌｇｅｎｅ）、抗Ｂ７ Ｍａｂ（例えば、Ｉｎｎｏｇ
ｅｔｉｃｓ）、ＭＥＤＩ−５０７（Ｂｉｏ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）、ＡＢＸ−
ＣＢＬ（Ａｂｇｅｎｉｘ）。

【０４５８】 特定の実施形態において、本発明の組成物は、抗レトロウイルス薬剤、ヌクレ
オシド逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤および／またはプロ
テアーゼインヒビターと組み合わせて投与される。本発明の組成物と組み合わせ
て投与され得るヌクレオシド逆転写酵素阻害剤としては、以下が挙げられるが、
これらに限定されない：ＲＥＴＲＯＶＩＲ^TM（ジドブジン／ＡＺＴ）、ＶＩＤＥ
Ｚ^TM（ジダノシン／ｄｄＩ）、ＨＩＶＩＤ^TM（ザルシタビン／ｄｄＣ）、ＺＥＲ
ＩＴ^TM（スタブジン／ｄ４Ｔ）、ＥＰＩＶＩＲ^TM（ラミブジン／３ＴＣ）、およ
びＣＯＭＢＩＶＩＲ^TM（ジドブジン／ラミブジン）。本発明の組成物と組み合わ
せて投与され得る非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤としては、以下が挙げられる
が、これらに限定されない：ＶＩＲＡＭＵＮＥ^TM（ネビラピン）、ＲＥＳＣＲＩ
ＰＴＯＲ^TM（デラビルジン）、およびＳＵＳＴＩＶＡ^TM（エファビレンツ）。本
発明の組成物と組み合わせて投与され得るプロテアーゼインヒビターとしては、
以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＣＲＩＸＩＶＡＮ^TM（インディナ
ビル）、ＮＯＲＶＩＲ^TM（リトナビル）、ＩＮＶＩＲＡＳＥ^TM（サキナビル））
、およびＶＩＲＡＣＥＰＴ^TM（ネルフィナビル）。特定の実施形態において、抗
レトロウイルス薬剤、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵
素阻害剤、および／またはプロテアーゼインヒビターは、ＡＩＤＳを処置、およ
び／もしくは診断するため、ならびに／またはＨＩＶ感染を処置、予防および／
もしくは診断するために、本発明の組成物との任意の組み合わせで使用され得る
。

【０４５９】 他の実施形態において、本発明の組成物は、抗日和見感染症薬剤と組み合わせ
て投与され得る。本発明の組成物と組み合わせて投与され得る抗日和見感染症薬
剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＴＲＩＭＥＴＨＯＰ
ＲＩＭ−ＳＵＬＦＡＭＥＴＨＯＸＡＺＯＬＥ^TM、ＤＡＰＳＯＮＥ^TM、ＰＥＮＴＡ
ＭＩＤＩＮＥ^TM、ＡＴＯＶＡＱＵＯＮＥ^TM、ＩＳＯＮＩＡＺＩＤ^TM、ＲＩＦＡＭ
ＰＩＮ^TM、ＰＹＲＡＺＩＮＡＭＩＤＥ^TM、ＥＴＨＡＭＢＵＴＯＬ^TM、ＲＩＦＡＢ
ＵＴＩＮ^TM、ＣＬＡＲＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮ^TM、ＡＺＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮ^TM、
ＧＡＮＣＩＣＬＯＶＩＲ^TM、ＦＯＳＣＡＲＮＥＴ^TM、ＣＩＤＯＦＯＶＩＲ^TM、Ｆ
ＬＵＣＯＮＡＺＯＬＥ^TM、ＩＴＲＡＣＯＮＡＺＯＬＥ^TM、ＫＥＴＯＣＯＮＡＺＯ
ＬＥ^TM、ＡＣＹＣＬＯＶＩＲ^TM、ＦＡＭＣＩＣＯＬＶＩＲ^TM、ＰＹＲＩＭＥＴＨ
ＡＭＩＮＥ^TM、ＬＥＵＣＯＶＯＲＩＮ^TM、ＮＥＵＰＯＧＥＮ^TM（フィルグラスチ
ム／Ｇ−ＣＳＦ）、およびＬＥＵＫＩＮＥ^TM（サルグラモスチン（ｓａｒｇｒａ
ｍｏｓｔｉｍ）／ＧＭ−ＣＳＦ）。特定の実施形態において、本発明の組成物は
、日和見Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ肺炎感染を予防的に処置、
予防および／または診断するために、ＴＲＩＭＥＴＨＯＰＲＩＭ−ＳＵＬＦＡＭ
ＥＴＨＯＸＡＺＯＬＥ^TM、ＤＡＰＳＯＮＥ^TM、ＰＥＮＴＡＭＩＤＩＮＥ^TM、およ
び／またはＡＴＯＶＡＱＵＯＮＥ^TMとの任意の組み合わせで使用される。別の特
定の実施形態において、本発明の組成物は、日和見Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ａｖｉｕｍ複合感染を予防的に処置、予防および／または診断するために、Ｉ
ＳＯＮＩＡＺＩＤ^TM、ＲＩＦＡＭＰＩＮ^TM、ＰＹＲＡＺＩＮＡＭＩＤＥ^TM、およ
び／またはＥＴＨＡＭＢＵＴＯＬ^TMとの任意の組み合わせで使用される。別の特
定の実施形態において、本発明の組成物は、日和見Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染を予防的に処置、予防および／または診断する
ために、ＲＩＦＡＢＵＴＩＮ^TM、ＣＬＡＲＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮ^TM、および／ま
たはＡＺＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮ^TMとの任意の組み合わせで使用される。別の特定
の実施形態において、本発明の組成物は、日和見サイトメガロウイルス感染を予
防的に処置、予防および／または診断するために、ＧＡＮＣＩＣＬＯＶＩＲ^TM、
ＦＯＳＣＡＲＮＥＴ^TM、および／またはＣＩＤＯＦＯＶＩＲ^TMとの任意の組み合
わせで使用される。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、日和見真
菌感染を予防的に処置、予防および／または診断するために、ＦＬＵＣＯＮＡＺ
ＯＬＥ^TM、ＩＴＲＡＣＯＮＡＺＯＬＥ^TM、および／またはＫＥＴＯＣＯＮＡＺＯ
ＬＥ^TMとの任意の組み合わせで使用される。別の特定の実施形態において、本発
明の組成物は、日和見単純ヘルペスウイルスＩ型および／またはＩＩ型感染を予
防的に処置または予防するために、ＡＣＹＣＬＯＶＩＲ^TMおよび／またはＦＡＭ
ＣＩＣＯＬＶＩＲ^TMとの任意の組み合わせで使用される。別の特定の実施形態に
おいて、本発明の組成物は、日和見Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ感染を
予防的に処置または予防するために、ＰＹＲＩＭＥＴＨＡＭＩＮＥ^TMおよび／ま
たはＬＥＵＣＯＶＯＲＩＮ^TMとの任意の組み合わせで使用される。別の特定の実
施形態において、本発明の組成物は、日和見細菌感染を予防的に処置または予防
するために、ＬＥＵＣＯＶＯＲＩＮ^TMおよび／またはＮＥＵＰＯＧＥＮ^TMとの任
意の組み合わせで使用される。

【０４６０】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、抗ウイルス薬剤との組み合わ
せで投与される。本発明の組成物とともに投与され得る抗ウイルス薬剤としては
、アシクロビル、リバビリン、アマンタジン、およびレマンチジン（ｒｅｍａｎ
ｔｉｄｉｎｅ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【０４６１】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、抗生物質とともに投与される
。本発明の組成物とともに投与され得る抗生物質としては、アモキシシリン、ア
ミノ配糖体、β−ラクタム（グリコペプチド）、β−ラクタマーゼ、クリンダマ
イシン、クロラムフェニコール、セファロスポリン、シプロフロキサシン、エリ
スロマイシン、フルオロキノロン類、マクロライド系抗生物質、メトロニダゾル
、ペニシリン、キノロン類、リファンピン、ストレプトマイシン、スルホンアミ
ド、テトラサイクリン、トリメトプリム、トリメトプリム−スルファメトキサゾ
ール（ｓｕｌｆａｍｔｈｏｘａｚｏｌｅ）、およびバンコマイシンが挙げられる
が、これらに限定されない。

【０４６２】 本発明の組成物とともに投与され得る従来の非特異的免疫抑制剤としては、ス
テロイド類、シクロスポリン、シクロスポリンアナログ、シクロホスファミド、
シクロホスファミドＩＶ、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、アザチオプ
リン、ＦＫ−５０６、１５−デオキシスペルグアリン（１５−ｄｅｏｘｙｓｐｅ
ｒｇｕａｌｉｎ）、および応答Ｔ細胞の機能を抑制することによって作用する他
の免疫抑制剤が挙げられるが、これらに限定されない。

【０４６３】 特定の実施形態において、本発明の組成物は、免疫抑制剤と組み合わせて投与
される。本発明の組成物と共に投与され得る免疫抑制剤調製物としては、ＯＲＴ
ＨＯＣＬＯＮＥ^TM（ＯＫＴ３）、ＳＡＮＤＩＭＭＵＮＥ^TM／ＮＥＯＲＡＬ^TM／Ｓ
ＡＮＧＤＹＡ^TM（シクロスポリン）、ＰＲＯＧＲＡＦ^TM（タクロリムス）、ＣＥ
ＬＬＣＥＰＴ^TM（ミコフェノール酸塩）、アザチオプリン、グルコルチコステロ
イド類（ｇｌｕｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄｓ）、およびＲＡＰＡＭＵＮＥ^TM （シロリムス）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態におい
て、免疫抑制剤は、器官または骨髄の移植の拒絶を予防するために使用され得る
。

【０４６４】 好ましい実施形態では、本発明の組成物は、ステロイド治療と組み合わせて投
与される。本発明の組成物と組合せて投与され得るステロイドとしては、経口コ
ルチコステロイド、プレドニゾン、およびメチルプレドニゾロン（ｍｅｔｈｙｌ
ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ）（例えば、ＩＶメチルプレドニゾロン）が挙げられるが
、これらに限定されない。特定の実施形態では、本発明の組成物は、プレドニゾ
ンと組み合わせて投与される。さらなる特定の実施形態において、本発明の組成
物は、プレドニゾンおよび免疫抑制剤と組合せて投与される。本発明の組成物お
よびプレドニゾンと共に投与され得る免疫抑制剤としては、本明細書中に記載さ
れる免疫抑制剤、ならびにアザチオプリン、シクロホスファミド、およびシクロ
ホスファミドＩＶが挙げられるが、これらに限定されない。別の特定の実施形態
において、本発明の組成物は、メチルプレドニゾロンと組合せて投与される。さ
らなる特定の実施形態において、本発明の組成物は、メチルプレドニゾロンおよ
び免疫抑制剤と組合せて投与される。本発明の組成物およびメチルプレドニゾロ
ンと共に投与され得る免疫抑制剤は、本明細書中に記載される免疫抑制剤であり
、かつアザチオプリン、シクロホスファミドおよびシクロホスファミドＩＶを含
むがこれらに限定されない。

【０４６５】 好ましい実施形態において、本発明の組成物は、抗マラリア薬と組合せて投与
される。本発明の組成物とともに投与され得る抗マラリア薬としては、ヒドロキ
シクロロキン、クロロキン、および／またはキナクリンが挙げられるが、これら
に限定されない。

【０４６６】 好ましい実施形態において、本発明の組成物は、ＮＳＡＩＤと組み合わせて投
与される。

【０４６７】 非限定的な実施形態において、本発明の組成物は、１、２、３、４、５、１０
種またはそれより多くの以下の薬物と組み合わせて投与される：ＮＲＤ−１０１
（Ｈｏｅｃｈｓｔ Ｍａｒｉｏｎ Ｒｏｕｓｓｅｌ）、ジクロフェナク（Ｄｉｍ
ｅｔｈａｉｄ）、カリウムオキサプロジン（Ｍｏｎｓａｎｔｏ）、ｍｅｃａｓｅ
ｒｍｉｎ（Ｃｈｉｒｏｎ）、Ｔ−６１４（Ｔｏｙａｍａ）、ｐｅｍｅｔｒｅｘｅ
ｄ ｄｉｓｏｄｉｕｍ（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、ａｔｒｅｌｅｕｏｎ（Ａｂｂｏ
ｔｔ）、ｖａｌｄｅｃｏｘｉｂ（Ｍｏｎｓａｎｔｏ）、エルテナク（Ｂｙｋ Ｇ
ｕｌｄｅｎ）、ｃａｍｐａｔｈ、ＡＧＭ−１４７０（Ｔａｋｅｄａ）、ＣＤＰ−
５７１（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ Ｃｈｉｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＭ−１０１（Ｃａ
ｒｂｏＭｅｄ）、ＭＬ−３０００（Ｍｅｒｃｋｌｅ）、ＣＢ−２４３１（ＫＳ
Ｂｉｏｍｅｄｉｘ）、ＣＢＦ−ＢＳ２（ＫＳ Ｂｉｏｍｅｄｉｘ），ＩＬ−１Ｒ
ａ遺伝子治療（Ｖａｌｅｎｔｉｓ）、ＪＴＥ−５２２（Ｊａｐａｎ Ｔｏｂａｃ
ｃｏ）、パクリタキセル（Ａｎｇｉｏｔｅｃｈ）、ＤＷ−１６６ＨＣ（Ｄｏｎｇ
Ｗｈａ）、ｄａｒｂｕｆｅｌｏｎｅ ｍｅｓｙｌａｔｅ（Ｗａｒｎｅｒ−Ｌａ
ｍｂｅｒｔ）、可溶性ＴＮＦレセプター１（ｓｙｎｅｒｇｅｎ；Ａｍｇｅｎ）、
ＩＰＲ−６００１（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ
ｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、ｔｒｏｃａｄｅ（Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ
）、ＥＦ−５（Ｓｃｏｔｉａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＢＩＩＬ−
２８４（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）、ＢＩＩＦ−１１４９（
Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）、Ｌｅｕｋｏ Ｖａｘ（Ｉｎｆｌ
ａｍｍａｔｉｃｓ）、ＭＫ−６６３（Ｍｅｒｃｋ）、ＳＴ−１４８２（Ｓｉｇｍ
ａ−Ｔａｕ）、およびｂｕｔｉｘｏｃｏｒｔ ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（Ｗａｒｎ
ｅｒＬａｍｂｅｒｔ）。

【０４６８】 好ましい実施形態において、本発明の組成物は、１、２、３、４、５種または
それより多くの以下の薬物と組合せて投与される：メトトレキサート、スルファ
サラジン、金チオリンゴ酸ナトリウム、オーラノフィン、シクロスポリン、ペニ
シラミン、アザチオプリン、（例えば、本明細書中に記載される）抗マラリア薬
、シクロホスファミド、クロラムブシル、金、ＥＮＢＲＥＬ^TM（Ｅｔａｎｅｒｃ
ｅｐｔ）、抗ＴＮＦ抗体、およびプレドニゾロン。より好ましい実施形態におい
て、本発明の組成物は、抗マラリア薬、メトトレキサート、抗ＴＮＦ抗体、ＥＮ
ＢＲＥＬ^TMおよび／またはスルファサラジンと組合せて投与される。１つの実施
形態では、本発明の組成物は、メトトレキサートと組み合わせて投与される。別
の実施形態では、本発明の組成物は、抗ＴＮＦ抗体と組み合わせて投与される。
別の実施形態では、本発明の組成物は、メトトレキサートおよび抗ＴＮＦ抗体と
組合せて投与される。別の実施形態では、本発明の組成物は、スルファサラジン
と組み合わせて投与される。別の特定の実施形態では、本発明の組成物は、メト
トレキサート、抗ＴＮＦ抗体、およびスルファサラジンと組み合わせて投与され
る。別の実施形態では、本発明の組成物は、ＥＮＢＲＥＬ^TMと組合せて投与され
る。別の実施形態では、本発明の組成物は、ＥＮＢＲＥＬ^TMおよびメトトレキサ
ートと組合せて投与される。別の実施形態では、本発明の組成物は、ＥＮＢＲＥ
Ｌ^TM、メトトレキサートおよびスルファサラジンと組合せて投与される。別の実
施形態では、本発明の組成物は、ＥＮＢＲＥＬ^TM、メトトレキサートおよびスル
ファサラジンと組合せて投与される。他の実施形態では、１つ以上の抗マラリア
薬は、上記の列挙した組み合わせのうちの１つと合わせて投与される。特定の実
施形態では、本発明の組成物は、抗マラリア薬（例えば、ヒドロキシクロロキン
）、ＥＮＢＲＥＬ^TM、メトトレキサートおよびスルファサラジンと組み合わせて
投与される。別の特定の実施形態では、本発明の組成物は、抗マラリア薬（例え
ば、ヒドロキシクロロキン）、スルファサラジン、抗ＴＮＦ抗体およびメトトレ
キサートと組合せて投与される。

【０４６９】 本発明の組成物と組み合わせて投与され得る従来の非特異的免疫抑制剤として
は、以下が挙げられるが、それらに限定されない：ステロイド、シクロスポリン
、シクロスポリンアナログ、シクロホスファミド、メチルプレドニゾン、プレド
ニゾン、アザチオプリン、ＦＫ−５０６、１５−デオキシスペルグアリン、およ
び応答するＴ細胞の機能を抑制することにより作用する他の免疫抑制剤。

【０４７０】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、抗生物質薬剤と組み合わせて
投与される。本発明の組成物とともに投与され得る抗生物質としては、以下が挙
げられるが、これらに限定されない：テトラサイクリン、メトロニダゾール、ア
モキシリン、β−ラクタマーゼ、アミノグリコシド、マクロライド、キノロン、
フルオロキノロン、セファロスポリン、エリスロマイシン、シプロフロキサシン
、ストレプトマイシン。

【０４７１】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、単独でかまたは抗炎症剤と組
み合わせて投与される。本発明の組成物とともに投与され得る抗炎症剤としては
、グルココルチコイドおよび非ステロイド抗炎症剤、アミノアリールカルボン酸
誘導体、アリール酢酸誘導体、アリール酪酸誘導体、アリールカルボン酸、アリ
ールプロピオン酸誘導体、ピラゾール類、ピラゾロン類、サリチル酸誘導体、チ
アジンカルボキサミド類、ｅ−アセトアミドカプロン酸、Ｓ−アデノシルメチオ
ニン、３−アミノ−４−ヒドロキシ酪酸、アミキセトリン（ａｍｉｘｅｔｒｉｎ
ｅ）、ベンダザック、ベンジダミン、ブコローム、ジフェンピラミド、ジタゾー
ル、エモルファゾン、グアイアズレン、ナブメトン、ニメスリド、オルゴテイン
、オキサセプロール、パラニリン（ｐａｒａｎｙｌｉｎｅ）、ペリソキサール、
ピフオキシム、プロカゾン、プロキサゾール、およびテニダプが挙げられるが、
これらに限定されない。

【０４７２】 別の実施形態において、本発明の組成物は、化学療法剤と組み合わせて投与さ
れる。本発明の組成物とともに投与され得る化学療法剤としては、抗生物質誘導
体（例えば、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、およびダクチ
ノマイシン）；抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン）；抗代謝物（例えば
、フルオロウラシル、５−ＦＵ、メトトレキサート、フロクスウリジン、インタ
ーフェロンα−２ｂ、グルタミン酸、プリカマイシン（ｐｌｉｃａｍｙｃｉｎ）
、メルカプトプリン、および６−チオグアニン）；細胞傷害剤（例えば、カルム
スチン、ＢＣＮＵ、ロムスチン、ＣＣＮＵ、シトシンアラビノシド、シクロホス
ファミド、エストラムスチン、ヒドロキシウレア、プロカルバジン、マイトマイ
シン、ブスルファン、シス−プラチン、および硫酸ビンクリスチン）；ホルモン
（例えば、メドロキシプロゲステロン、エストラムスチンリン酸ナトリウム、エ
チニルエストラジオール、エストラジオール、酢酸メゲストロール、メチルテス
トステロン、ジエチルスチルベストロールジホスフェート、クロロトリアニセン
、およびテストラクトン）；ナイトロジェンマスタード誘導体（例えば、メファ
レン（ｍｅｐｈａｌｅｎ）、クロランブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、メ
クロレタミン（ナイトロジェンマスタード）およびチオテパ）；ステロイド類お
よび組み合わせ（例えば、ベタメタゾンリン酸ナトリウム）；ならびにその他（
例えば、ジカルバジン（ｄｉｃａｒｂａｚｉｎｅ）、アスパラギナーゼ、ミトー
テン、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンブラスチン、およびエトポシド）が挙げら
れるが、これらに限定されない。

【０４７３】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、サイトカインと組み合わせて
投与される。本発明の組成物とともに投与され得るサイトカインとしては、ＩＬ
−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ
−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、抗ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＩＦＮ−γおよび
ＴＮＦ−αが挙げられるが、これらに限定されない。

【０４７４】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、脈管形成タンパク質と組み合
わせて投与される。本発明の組成物とともに投与され得る脈管形成タンパク質と
しては、欧州特許番号ＥＰ−３９９８１６に開示されるようなグリオーム由来増
殖因子（ＧＤＧＦ）；欧州特許番号ＥＰ−６８２１１０に開示されるような血小
板由来増殖因子Ａ（ＰＤＧＦ−Ａ）；欧州特許番号ＥＰ−２８２３１７に開示さ
れるような血小板由来増殖因子Ｂ（ＰＤＧＦ−Ｂ）；国際公開番号ＷＯ９２／０
６１９４号に開示されるような胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）；Ｈａｕｓｅｒら、Ｇ
ｏｒｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ、４：２５９−２６８（１９９３）に開示されるよ
うな胎盤増殖因子２（ＰＩＧＦ−２）；国際公開番号ＷＯ９０／１３６４９号に
開示されるような血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；欧州特許番号ＥＰ−５０６４
７７に開示されるような血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）；国際公開番号Ｗ
Ｏ９６／３９５１５号に開示されるような血管内皮増殖因子２（ＶＥＧＦ−２）
；血管内皮増殖因子Ｂ（ＶＥＧＦ−３）；国際公開番号ＷＯ９６／２６７３６号
に開示されるような血管内皮増殖因子Ｂ−１８６（ＶＥＧＦ−Ｂ１８６）；国際
公開番号ＷＯ９８／０２５４３号に開示されるような血管内皮増殖因子Ｄ（ＶＥ
ＧＦ−Ｄ）；国際公開番号ＷＯ９８／０７８３２号に開示されるような血管内皮
増殖因子Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）；およびドイツ国特許番号ＤＥ１９６３９６０１に
開示されるような血管内皮増殖因子Ｅ（ＶＥＧＦ−Ｅ）が挙げられるが、これら
に限定されない。上記の参考文献は、本明細書で参考として援用される。

【０４７５】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、線維芽細胞成長因子と組み合
わせて投与される。本発明の組成物とともに投与され得る線維芽細胞成長因子と
しては、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧ
Ｆ−６、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１１、
ＦＧＦ−１２、ＦＧＦ−１３、ＦＧＦ−１４、およびＦＧＦ−１５が挙げられる
が、これらに限定されない。

【０４７６】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、他の治療レジメンまたは予防
レジメン（例えば、放射線治療）と組み合わせて投与される。

【０４７７】 本発明はまた、薬学的組成物を提供する。このような組成物は、治療有効量の
化合物、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。特定の実施形態において、
用語「薬学的に受容可能な」とは、動物における、そしてさらに特にヒトにおけ
る使用のために、連邦規制当局もしくは米国政府により認められたか、または米
国薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に列挙されたことを意味する。さ
らに、「薬学的に受容可能なキャリア」は、一般的には非毒性固体、半固体また
は液体充填剤、希釈剤、カプセル化材料または任意の型の処方補助剤である。

【０４７８】 用語「キャリア」とは、組成物とともに投与される、希釈剤、アジュバンド、
賦形剤、またはビヒクルをいう。このような薬学的なキャリアは、水および油（
石油起源、動物起源、植物起源、または合成起源の油（例えば、ピーナッツ油、
大豆油、鉱油、ゴマ油など）を含む）のような滅菌した液体であり得る。水は、
薬学的組成物が静脈内に投与される場合に、好ましいキャリアである。生理食塩
水溶液、ならびにデキストロースおよびグリセロールの水溶液はまた、特に注射
可能な溶液のために、液体キャリアとして使用され得る。適切な薬学的賦形剤と
しては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、イ
ネ、穀紛、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸
グリセロール、滑石、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、
グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物はまた、所望されるなら
ば、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤（例えば、酢酸塩、クエン
酸塩、リン酸塩）を含み得る。抗菌性（例えば、ベンジルアルコールまたはメチ
ルパラベン）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム
）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸）；および張度の調整のため
の薬剤（例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース）はまた意図される。こ
れらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放性
処方物などの形態を取り得る。この組成物は、従来の結合剤およびトリグリセリ
ドのようなキャリアとともに、坐剤として処方され得る。経口処方物は、薬学的
等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッ
カリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような標準キャリアを
含み得る。適切な薬学的キャリアの例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍ
ｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載
される。このような組成物は、治療有効量の化合物を、好ましくは精製された形
態で、適切な量のキャリアとともに含んで、患者への適切な投与のための形態を
提供する。処方物は、投与形態に適するべきである。元になる調製物は、ガラス
またはプラスチックから作製されるアンプル、使い捨て注射器または多重用量バ
イアル中に封入され得る。

【０４７９】 可溶性のＡＩＭ ＩＩポリペプチド（すなわち、膜貫通ドメインの全てまたは
一部を欠くＡＩＭ ＩＩポリペプチド）ＡＩＭ ＩＩポリぺプチドに加えて、膜
貫通領域を含むＡＩＭ ＩＩポリペプチドもまた、界面活性剤（例えば、トリト
ンＸ−１００）を含ませることによって緩衝液に適切に溶解される場合、使用さ
れ得る。

【０４８０】 好ましい実施形態において、組成物は、慣用手順に従って、ヒトへの静脈内投
与のために適合された薬学的組成物として、処方される。代表的には、静脈内投
与のための組成物は、滅菌等張水性緩衝液の溶液である。必要な場合、組成物は
また、可溶化剤および注射の部位での痛みを緩和するリグノカインのような局部
麻酔を含み得る。一般的には、成分は、単位投薬形態において別々にかまたは一
緒に混合してのいずれかで、例えば、活性薬剤の量を示すアンプルまたはサシェ
（ｓａｃｈｅｔｔｅ）のような気密容器中の乾燥した凍結粉体または水を含まな
い濃縮物として供給される。組成物が注入により投与されるべき場合には、組成
物は、滅菌した薬学的等級の水または生理食塩水を含む注入ボトルに分配され得
る。組成物が注射により投与される場合、成分が投与の前に混合され得るように
、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルが提供され得る。

【０４８１】 本発明の化合物は、中性または塩の形態として処方され得る。薬学的に受容可
能な塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するような
アニオンとともに形成される塩、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、
カルシウム、水酸化第２鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチ
ルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するようなカチオンと
ともに形成される塩が挙げられる。

【０４８２】 本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性と関連する疾患または
障害の処置、阻害および予防において効果的である本発明の化合物の量は、標準
的な臨床技術により決定され得る。さらに、インビトロアッセイは、必要に応じ
て、最適な投薬量の範囲の同定を補助するために使用され得る。処方において使
用されるべき正確な用量はまた、投与の経路、および疾患または障害の重篤さに
依存し、そして開業医の判断および各患者の状況に従って決定されるべきである
。有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系から得られた用量応答曲線に
基づいて推定され得る。

【０４８３】 一般的提案として、用量当り、非経口的に投与されるＡＩＭ ＩＩポリぺプチ
ドの合計薬学的有効量は、患者体重の、約１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／
日の範囲にあるが、上記のようにこれは治療的裁量に委ねられる。さらに好まし
くは、このホルモンについて、この用量は、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ／日
、最も好ましくはヒトに対して約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日と約１ｍｇ／ｋｇ／日
との間である。連続投与する場合、代表的には、治療剤を約１μｇ／ｋｇ／時間
〜約５０μｇ／ｋｇ／時間の投薬速度で１日に１〜４回の注射かまたは連続皮下
注入（例えばミニポンプを用いる）のいずれかにより投与する。静脈内用バッグ
溶液もまた使用し得る。

【０４８４】 抗体に関して、患者に投与される投薬量は、代表的に、患者の体重１ｋｇあた
り０．１ｍｇ〜１００ｍｇである。好ましくは、患者に投与される投薬量は、患
者の体重１ｋｇあたり０．１ｍｇと２０ｍｇとの間であり、より好ましくは、患
者の体重１ｋｇあたり１ｍｇ〜１０ｍｇである。一般に、ヒト抗体は、外来ポリ
ペプチドへの免疫応答に起因して、他種由来の抗体よりもヒト体内で長い半減期
を有する。従って、ヒト抗体の低い投薬量および頻度の低い投与は、しばしば可
能である。さらに、本発明の抗体の投与の投薬量および頻度は、例えば、脂溶化
（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）のような改変による抗体の取り込みおよび組織浸透（
例えば、脳への）を増強することにより減少され得る。

【０４８５】 本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１つ以上の成分で満たされている１つ
以上の容器を備える薬学的パックまたはキットを提供する。薬学的製品または生
物学的製品の製造、使用または販売を規制している政府機関により規定される形
式における通告は、このような容器に、必要に応じて伴ない得る。この通告は、
ヒトの投与のための製造、使用または販売のこの機関による認可を反映する。

【０４８６】 本発明を一般的に記載してきたが、本発明は、以下の実施例を参照してより容
易に理解される。以下の実施例は、例示の目的のために提供され、限定を意図さ
れない。

【０４８７】 （実施例） （実施例１：Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＡＩＭ ＩＩの発現および精製） （Ａ．Ｎ末端６−Ｈｉｓタグを有するＡＩＭ ＩＩの発現） ＡＴＣＣ寄託番号９７６８９の寄託されたｃＤＮＡ中のＡＩＭ ＩＩタンパク
質をコードするＤＮＡ配列を、ＡＩＭ ＩＩタンパク質のアミノ末端配列、およ
びその遺伝子の３’側のベクター配列に特異的なＰＣＲオリゴヌクレオチドプラ
イマーを使用して増幅する。クローニングを促進するための制限部位を含むさら
なるヌクレオチドを、それぞれ５’および３’配列に付加する。

【０４８８】 ２２ｋＤａのＡＩＭ ＩＩタンパク質フラグメント（Ｎ末端領域および膜貫通
領域を欠く）を、以下のプライマーを使用して発現させる： ５’オリゴヌクレオチドプライマーは、図１Ａ（配列番号１）のＡＩＭ ＩＩ
タンパク質コード配列のヌクレオチド２４４〜２５８を含む、下線を付したＢａ
ｍＨＩ制限部位を含む配列：

【０４８９】

【化６】 を有する。

【０４９０】 ３’プライマーは、下線を付したＨｉｎｄＩＩＩ制限部位、続いて図１Ｂ（配
列番号１）に示されるヌクレオチド７５７〜７７４に相補的なヌクレオチドを含
む、配列：

【０４９１】

【化７】 を有する。

【０４９２】 全ＡＩＭ ＩＩタンパク質は、以下のプライマーを用いて発現され得る： ５’オリゴヌクレオチドプライマーは、図１Ａ（配列番号１）のＡＩＭ ＩＩ
タンパク質コード配列のヌクレオチド４９〜７０を含む、下線を付したＢａｍＨ
Ｉ制限部位を含む配列：

【０４９３】

【化８】 を有する。

【０４９４】 ３’プライマーは、下線を付したＨｉｎｄＩＩＩ制限部位、続いて図１Ｂ（配
列番号１）に示されるヌクレオチド７５６〜７８３に相補的なヌクレオチドを含
む、配列：

【０４９５】

【化９】 を有する。

【０４９６】 これらの制限部位は、これらの実施例における細菌発現のために使用される、
細菌発現ベクターｐＱＥ９における制限酵素部位にとって都合がいい。（Ｑｉａ
ｇｅｎ，Ｉｎｃ．９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、
ＣＡ，９１３１１）。ｐＱＥ９は、アンピシリン抗生物質耐性（「Ａｍｐ^r」）
をコードし、そして細菌の複製起点（「ｏｒｉ」）、ＩＰＴＧ誘導性プロモータ
ー、リボソーム結合部位（「ＲＢＳ」）、６−Ｈｉｓタグ、および制限酵素部位
を含む。

【０４９７】 増幅されたＡＩＭ ＩＩ ＤＮＡおよびベクターｐＱＥ９の両方を、ＢａｍＨ
ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、次いで消化したＤＮＡをともに連結する。制
限されたｐＱＥ９ベクターへのＡＩＭ ＩＩタンパク質ＤＮＡの挿入によって、
ＡＩＭ ＩＩタンパク質コード領域を、ベクターのＩＰＴＧ誘導性プロモーター
の下流に、それに対して作動可能に連結されるように、そしてＡＩＭ ＩＩタン
パク質の翻訳のために適切に位置付けされた開始ＡＵＧに関してインフレームに
配置する。

【０４９８】 （Ｂ．Ｃ末端６−Ｈｉｓタグを有するＡＩＭ ＩＩの発現） 細菌発現ベクターｐＱＥ６０が、本実施例において細菌発現のために使用され
る。（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．、９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔ
ｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）。ｐＱＥ６０は、アンピシリン抗生物質耐性
（「Ａｍｐ^r」）をコードし、そして細菌複製起点（「ｏｒｉ」）、ＩＰＴＧ誘
導性プロモーター、リボソーム結合部位（「ＲＢＳ」）、ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ
．（上述）により販売されているニッケル−ニトリロ三酢酸（「Ｎｉ−ＮＴＡ」
）親和性樹脂を使用するアフィニティー精製を可能にするヒスチジン残基をコー
ドする６コドン、および適切な単一制限酵素切断部位を含有する。これらのエレ
メントは、ポリペプチドをコードする挿入ＤＮＡフラグメントが、そのポリペプ
チドのカルボキシル末端に共有結合で連結された６つのＨｉｓ残基（すなわち、
「６×Ｈｉｓタグ」）を有するポリペプチドを発現するように配置される。

【０４９９】 ＡＩＭ ＩＩタンパク質の所望の部分をコードするＤＮＡ配列を、ＰＣＲオリ
ゴヌクレオチドプライマーを使用して、寄託されたｃＤＮＡから増幅する。この
プライマーは、ＡＩＭ ＩＩタンパク質の所望の部分のアミノ末端配列およびｃ
ＤＮＡコード配列の３’側の寄託された構築物中の配列にアニールする。ｐＱＥ
６０ベクターにおけるクローン化を容易にするための制限部位を含むさらなるヌ
クレオチドを、５’配列および３’配列にそれぞれ付加する。

【０５００】 タンパク質のクローン化のために、５’プライマーは、配列：

【０５０１】

【化１０】 を有する。これは、下線を付したＮｃｏＩ制限部位、続いて、図１Ａ中のＡＩＭ
ＩＩ配列のアミノ末端コード配列に相補的なヌクレオチドを含有する。当然、
当業者は、タンパク質コード配列中における、５’プライマーが開始する地点が
、完全タンパク質の任意の所望の部分をコードするＤＮＡセグメント（より短い
またはより長い）を増幅するために変動され得ることを理解する。３’プライマ
ーは、配列：

【０５０２】

【化１１】 を有する。これは、下線を付したＢａｍＨＩ制限部位、続いて、図１Ｂ中のＡＩ
Ｍ ＩＩ ＤＮＡ配列中の停止コドンの直前のコード配列の３’末端に相補的な
ヌクレオチドを含有し、コード配列は、ｐＱＥ６０ベクター中の６つのＨｉｓコ
ドンの読み枠と共にその読み枠を維持するように制限部位と整列される。

【０５０３】 増幅されたＡＩＭ ＩＩ ＤＮＡフラグメントおよびベクターｐＱＥ６０を、
ＢａｍＨＩおよびＮｃｏＩで消化し、そして次いで、消化されたＤＮＡを共に連
結する。ＡＩＭ ＩＩ ＤＮＡの制限されたｐＱＥ６０ベクターへの挿入は、Ｉ
ＰＴＧ誘導性プロモーターから下流に、かつ開始ＡＵＧおよび６つのヒスチジン
コドンとインフレームに、ＡＩＭ ＩＩタンパク質コード領域を配置する。

【０５０４】 （Ｃ．Ｎ末端６−Ｈｉｓタグを有するＡＩＭ ＩＩ欠失変異体の発現） 寄託されたｃＤＮＡ中のＡＩＭ ＩＩタンパク質をコードするＤＮＡ配列を、
ＡＩＭ ＩＩタンパク質の配列および遺伝子の３’側のベクター配列に特異的な
ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅した。クローン化を容易に
するための制限部位を含むさらなるヌクレオチドを、５’配列および３’配列に
それぞれ付加した。

【０５０５】 特に、Ｎ末端欠失ＡＩＭ ＩＩ変異体（配列番号２中のＭｅｔ（６８）からＶ
ａｌ（２４０））を、以下のプライマーを使用して構築した： ５’オリゴヌクレオチドプライマーは、配列：

【０５０６】

【化１２】 を有する。これは、下線を付したＢａｍＨＩ制限部位を含み、そして図１Ａ（配
列番号１）中のＡＩＭ ＩＩタンパク質コード配列の１７ヌクレオチドを含有す
る。

【０５０７】 ３’プライマーは、配列：

【０５０８】

【化１３】 を有する。これは、下線を付したＨｉｎｄＩＩＩ制限部位、続いて、図１Ｂ（配
列番号１）中に示されるようなヌクレオチド７５３−７６８に相補的なヌクレオ
チドを含有する。

【０５０９】 これらの制限部位は、細菌発現ベクターｐＱＥ９における制限酵素部位に対し
て好都合である。これらは、本実施例において細菌発現のために使用される。（
Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒ
ｔｈ，ＣＡ，９１３１１）。ｐＱＥ９は、アンピシリン抗生物質耐性（「Ａｍｐ ^r 」）をコードし、そして細菌複製起点（「ｏｒｉ」）、ＩＰＴＧ誘導性プロモ
ーター、リボソーム結合部位（「ＲＢＳ」）、６−Ｈｉｓタグ、および制限酵素
部位を含有する。

【０５１０】 増幅されたＡＩＭ ＩＩ（ａａ６８−２４０）ＤＮＡおよびベクターｐＱＥ９
の両方をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そして次いで、消化された
ＤＮＡを共に連結した。ＡＩＭ ＩＩ（ａａ６８−２４０）タンパク質ＤＮＡの
、制限されたｐＱＥ９ベクターへの挿入は、ベクターのＩＰＴＧ誘導性プロモー
ターから下流に、かつこれに作動可能に連結され、かつＡＩＭ ＩＩ欠失タンパ
ク質の翻訳のために適切に位置された開始ＡＵＧとインフレームに、ＡＩＭ Ｉ
Ｉタンパク質コード領域を配置する。

【０５１１】 （細菌の形質転換） 上記のＡ、Ｂ、またはＣにおいて作製された６−Ｈｉｓタグ化発現構築物由来
の連結混合物は、標準的な手順を使用して、コンピテントなＥ．Ｃｏｌｉ細胞に
形質転換される。このような手順は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版；Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）に記載されている。Ｅ
．ｃｏｌｉ Ｍ１５／ｒｅｐ４株（多コピーのプラスミドｐＲＥＰ４を含有する
。これは、ｌａｃリプレッサーを発現し、そしてカナマイシン耐性（「Ｋａｎ^r
」）を与える）が、本明細書中に記載の例示的な実施例を実施することにおいて
使用される。この株は、ＡＩＭ ＩＩタンパク質の発現に適した多くのうちの唯
一の１つであり、Ｑｉａｇｅｎから市販されている。

【０５１２】 形質転換体は、アンピシリンおよびカナマイシンの存在下におけるＬＢプレー
ト上で増殖するそれらの能力によって同定される。プラスミドＤＮＡは耐性コロ
ニーから単離され、そしてクローン化ＤＮＡの正体は制限分析によって確認され
る。

【０５１３】 所望の構築物を含有するクローンを、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およ
びカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）の両方を添加したＬＢ培地中での液体培養に
おいて、一晩（「Ｏ／Ｎ」）増殖させる。

【０５１４】 このＯ／Ｎ培養物を、約１：１００〜１：２５０の希釈で大きな培養物を接種
するために使用する。細胞を、６００ｎｍでの光学密度（「ＯＤ６００」）が０
．４と０．６との間になるまで増殖させる。次いで、イソプロピル−β−Ｄ−チ
オガラクトピラノシド（「ＩＰＴＧ」）を最終濃度１ｍＭまで添加し、ｌａｃＩ
リプレッサーを不活性化することによりｌａｃリプレッサー感受性プロモーター
からの転写を誘導する。細胞を、続けてさらに３〜４時間インキュベートする。
次いで、細胞を、標準的な方法を使用して、遠心分離により採取し、そして破壊
する。封入体を破壊細胞から慣用的な採集技術を使用して精製し、そしてタンパ
ク質を封入体から８Ｍ尿素に可溶化する。可溶化タンパク質を含有する８Ｍ尿素
溶液を、２×リン酸緩衝化生理食塩水（「ＰＢＳ」）中でＰＤ−１０カラムに通
し、それにより尿素を除去し、緩衝液を交換し、そしてタンパク質を再フォール
ディングする。このタンパク質をクロマトグラフィーのさらなる段階によって精
製し、エンドトキシンを除去する。次いで、これを滅菌濾過する。滅菌濾過され
たタンパク質調製物を、９５μｇ／ｍｌの濃度で２×ＰＢＳ中に保存する。

【０５１５】 （Ｄ．６−Ｈｉｓタグを有さない全長ＡＩＭ ＩＩの発現および精製） 細菌発現ベクターｐＱＥ６０が、本実施例において細菌発現のために使用され
る（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗ
ｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）。ｐＱＥ６０は、アンピシリン抗生物質耐性（「
Ａｍｐ^r」）をコードし、そして細菌複製起点（「ｏｒｉ」）、ＩＰＴＧ誘導性
プロモーター、リボソーム結合部位（「ＲＢＳ」）、ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．（
上述）により販売されているニッケル−ニトリロ三酢酸（「Ｎｉ−ＮＴＡ」）親
和性樹脂を使用するアフィニティー精製を可能にするヒスチジン残基をコードす
る６コドン、および適切な単一制限酵素切断部位を含有する。これらのエレメン
トは、ポリペプチドをコードするＤＮＡフラグメントが、そのポリペプチドのカ
ルボキシル末端に共有結合で連結された６つのＨｉｓ残基（すなわち、「６×Ｈ
ｉｓタグ」）を有するポリペプチドを生成するように挿入され得るように配置さ
れる。しかし、本実施例では、ポリペプチドコード配列は、６Ｈｉｓコドンの翻
訳が妨害されるように挿入され、従って、このポリペプチドは、６×Ｈｉｓタグ
を有さずに生成される。

【０５１６】 ＡＩＭ ＩＩタンパク質の所望の部分をコードするＤＮＡ配列を、ＰＣＲオリ
ゴヌクレオチドプライマーを使用して、寄託されたｃＤＮＡクローンから増幅す
る。このプライマーは、ＡＩＭ ＩＩタンパク質の所望の部分のアミノ末端配列
およびｃＤＮＡコード配列の３’側の寄託された構築物中の配列にアニールする
。ｐＱＥ６０ベクターにおけるクローン化を容易にするための制限部位を含むさ
らなるヌクレオチドを、５’配列および３’配列にそれぞれ付加する。

【０５１７】 タンパク質のクローン化のために、５’プライマーは、配列：

【０５１８】

【化１４】 を有する。これは、下線を付したＮｃｏＩ制限部位を含有し、図１Ａ中のＡＩＭ
ＩＩ配列のアミノ末端コード領域のヌクレオチドを含む。当然、当業者は、タ
ンパク質コード配列中における、５’プライマーが開始する位置が、完全タンパ
ク質の所望の部分（すなわち、より短いまたはより長い）を増幅するために変動
され得ることを理解する。３’プライマーは、配列：

【０５１９】

【化１５】 を有する。これは、下線を付したＨｉｎｄＩＩＩ制限部位、続いて、図１Ｂ（配
列番号１）中のＡＩＭ ＩＩ ＤＮＡ配列中の非コード配列の３’末端に相補的
なヌクレオチドを含有する。

【０５２０】 増幅されたＡＩＭ ＩＩ ＤＮＡフラグメントおよびベクターｐＱＥ６０を、
ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そして次いで、消化されたＤＮＡを共
に連結する。ＡＩＭ ＩＩ ＤＮＡの制限されたｐＱＥ６０ベクターへの挿入は
、ＩＰＴＧ誘導性プロモーターから下流に、かつ開始ＡＵＧとインフレームに、
その関連停止コドンを含むＡＩＭ ＩＩタンパク質コード領域を配置する。関連
停止コドンは、挿入点の下流の６ヒスチジンコドンの翻訳を妨害する。

【０５２１】 （Ｅ．Ｎ末端ＡＩＭ II欠失変異体の構築） ＡＩＭ ＩＩ欠失変異体（配列番号２におけるＭｅｔ（６８）〜Ｖａｌ（２４
０））をクローニングするために、５’プライマーは、配列：

【０５２２】

【化１６】 を有する。これは、下線部のＮｃｏＩ制限酵素認識部位を含み、続いて、図１Ａ
中のＡＩＭ ＩＩタンパク質コード配列の１７ヌクレオチドを含む。３’プライ
マーは、配列：

【０５２３】

【化１７】 （下線部のＨｉｎｄ ＩＩＩ制限部位、続いて図１Ｂ（配列番号１）中のヌクレ
オチド７５３〜７６８に相補的なヌクレオチドを含む）を有する。

【０５２４】 増幅したＡＩＭ ＩＩ（アミノ酸６８〜２４０）ＤＮＡフラグメントおよびベ
クターｐＱＥ６０をＮｃｏＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩで消化し、次いで、消化し
たＤＮＡをともに連結した。ＡＩＭ ＩＩ（アミノ酸６８〜２４０）ＤＮＡの、
制限酵素で切断されたｐＱＥ６０ベクターへの挿入は、ＩＰＴＧ誘導プロモータ
ーから下流に、かつインフレームに開始ＡＵＧを有するように、ＡＩＭ ＩＩ（
アミノ酸６８〜２４０）タンパク質コード領域を配置する。ＨｉｎｄＩＩＩ消化
は、この挿入場所の下流の６つのヒスチジンコドンを除去する。

【０５２５】 （Ｆ．Ｎ末端ＡＩＭ ＩＩ欠失変異体の構築） ＡＩＭ ＩＩ欠失変異体（配列番号２中のＡｌａ（１０１）〜Ｖａｌ（２４０
））をクローニングするために、５’プライマーは、配列：

【０５２６】

【化１８】 （下線部のＮｃｏＩ制限酵素認識部位を含み、図１Ａ中のＡＩＭ ＩＩタンパク
質コード配列におけるヌクレオチド３４９〜３６６を含む）を有する。もちろん
、当業者は、タンパク質コード配列における５’プライマーの始点が完全なタン
パク質の所望の部分を増幅する（すなわち、より短くまたはより長く）ために変
化し得ることを理解する。３’プライマーは、配列：

【０５２７】

【化１９】 （下線部のＨｉｎｄ ＩＩＩ制限部位、続いて図１ＢのＡＩＭ ＩＩ ＤＮＡ配
列のヌクレオチド７５５〜７６８に相補的なヌクレオチドを含む）を有する。

【０５２８】 増幅されたＡＩＭ ＩＩ（アミノ酸１０１〜２４０）ＤＮＡフラグメントおよ
びベクターｐＱＥ６０をＮｃｏＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩで消化し、次いで、消
化したＤＮＡをともに連結した。ＡＩＭ ＩＩ（アミノ酸１０１〜２４０）ＤＮ
Ａの、制限されたｐＱＥ６０ベクターへの挿入は、ＩＰＴＧ誘導プロモーターか
ら下流に、かつインフレームに開始ＡＵＧを有するように、ＡＩＭ ＩＩ（アミ
ノ酸１０１〜２４０）タンパク質コード領域を配置する。Ｈｉｎｄ ＩＩＩ消化
は、挿入場所の下流の６つのヒスチジンコドンを除去する。

【０５２９】 （Ｇ． Ｅ．ｃｏｌｉからのＡＩＭ ＩＩの精製） ＡＩＭ ＩＩの可溶化フラグメント（配列番号２のアミノ酸残基Ｌ８３〜Ｖ２
４０に対応する）をコードするポリヌクレオチド配列を、ＨＧＳ Ｅ．ｃｏｌｉ
発現ベクターｐＨＥ４にクローン化した。得られたプラスミドＤＮＡ（ｐＨＥ４
：ＡＩＭＩＩ．８３−Ｖ２４０）を使用して、ＳＧ１３００９ Ｅ．ｃｏｌｉ宿
主細胞を形質転換した。細菌性の形質転換体を、カナマイシンを含有するＬＢ培
地で増殖させた。ＩＰＴＧ誘導の際に、組換えＡＩＭ ＩＩを、封入体に付着し
た不溶性タンパク質として、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させた。

【０５３０】 Ｅ．ｃｏｌｉ細胞ペーストを、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、
２ｍＭ ＣａＣｌ₂を含有する緩衝液中に再懸濁させ、微小流動床（Ｍｉｃｒｏ
ｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）を６０００〜８０００ｐｓｉで２回通
過させることにより、溶解した。溶解したサンプルを、０．５Ｍの最終濃度まで
ＮａＣｌと混合し、次いで、７０００×ｇで２０分間遠心分離した。得られたペ
レットを、０．５Ｍ ＮａＣｌを加えた同じ緩衝液で再度洗浄し、次いで７００
０×ｇで２０分間、再度遠心分離した。

【０５３１】 次いで、部分的に精製した封入体を、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、
２ｍＭ ＣａＣｌ₂、５ｍＭ システインを含む２．０Ｍグアニジン塩酸塩中に
、２０〜２５μＣで２〜４時間かけて再懸濁させ、そして遠心分離した。次いで
、得られたペレットを、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、２ｍＭ ＣａＣ
ｌ₂を含む３．０〜３．５Ｍグアニジン塩酸塩（５ｍＭシステインあり、または
５ｍＭシステインなし）中に、４μＣで４８〜７２時間かけて再懸濁させた。こ
のとき、ＡＩＭ ＩＩの一部は可溶化し、７，０００×ｇの遠心分離後、可溶相
中に残った。

【０５３２】 ３Ｍグアニジン塩酸塩抽出物を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１
５０ｍＭ 塩化ナトリウムを含む、２０〜３０容積の緩衝液で素早く希釈した。
界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ−２０、ＣＨＡＰＳ）を、折り畳み効果を増加
させるために添加し得る。その後、この混合物を、以下に記載のクロマトグラフ
ィー精製工程の前に、混合することなく、４μＣで２〜７日間静置した。

【０５３３】 （Ｈ．ＡＩＭ ＩＩの液体クロマトグラフィー精製） 希釈したＡＩＭ ＩＩサンプルを、０．４５μｍ滅菌フィルターを用いて透明
にした。次いで、ＡＩＭ ＩＩタンパク質を、０．５Ｍ ＭＥＳでｐＨ６〜６．
８に調整し、そして強カチオン交換樹脂（ＰＯＲＯＳ ＨＳ−５０）カラムでク
ロマトグラフした。このＨＳカラムを、まず、５０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐ
Ｈ６．６）および１５０ｍＭ 塩化ナトリウムを含む、６〜１０カラム容積の緩
衝液で洗浄した。結合タンパク質を、３〜５カラム容積の、段階的勾配（３００
ｍＭ、７００ｍＭ、１５００ｍＭ）の５０ｍＭ ＭＥＳ中の塩化ナトリウム（ｐ
Ｈ６．６）を用いて溶出した。

【０５３４】 ０．７Ｍ 塩化ナトリウムを用いて溶出したＨＳ画分を、水で３倍に希釈した
。

【０５３５】 （細菌の形質転換） 上記Ｄ、ＥまたはＦにおいて生成された発現構築物由来の連結混合物を、Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（
１９８９）に記載のような標準的手順を用いて、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞
へ形質転換した。ｌａｃリプレッサーを発現し、かつカナマイシン耐性（「Ｋａ
ｎ^r」）を与えるＥ．ｃｏｌｉ株ＭＩ５／ｒｅｐ４（プラスミドｐＲＥＰ４の複
数のコピーを含む）を、本明細書中に記載の例証的な実施例を実行する際に使用
した。ＡＩＭ ＩＩタンパク質を発現するために適切な多くの株のうち、たった
１つのこの株が、ＱＩＡＧＥＮ、Ｉｎｃ．（前出）より市販されていた。形質転
換体を、アンピシリンおよびカナマイシンの存在下においてＬＢプレート上で増
殖するそれらの能力によって同定した。プラスミドＤＮＡを耐性コロニーから単
離し、そしてクローン化されたＤＮＡの同定を、制限酵素分析、ＰＣＲおよびＤ
ＮＡ配列決定によって確認した。

【０５３６】 所望の構築物を含むクローンを、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびカ
ナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）の両方で補充されたＬＢ培地における液体培養で
一晩（「Ｏ／Ｎ」）増殖する。Ｏ／Ｎ培養は、約１：２５〜約１：２５０で希釈
して大きな培養物を接種するために使用した。この細胞を、６００ｎｍ（「ＯＤ
６００」）で０．４と０．６との間の光学密度になるように増殖させた。次いで
、ｌａｃＩリプレッサーを不活性化することにより、ｌａｃレセプター感受性プ
ロモーターから転写を誘導するために、イソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトピ
ラノシド（「ＩＰＴＧ」）を、最終濃度が１ｍＭになるように添加した。続いて
細胞をさらに３〜４時間インキュベートした。次いで、遠心分離により細胞を収
集した。

【０５３７】 次いで、この細胞を６ＭグアニジンＨＣｌ、ｐＨ８中で、４℃で３〜４時間、
攪拌した。この細胞破片を遠心分離によって除去し、そしてＡＩＭ ＩＩを含む
上清を、２００ｍＭ ＮａＣｌを補充した５０ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ
６に対して透析した。あるいは、このタンパク質は、プロテアーゼインヒビター
を含む５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０％グリセロール、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣ
ｌ ｐＨ７．４に対して透析することによって首尾よく再折り畳みされ得る。再
変性後、このタンパク質は、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用ク
ロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーによって精製され得る。
あるいは、抗体カラムのようなアフィニティークロマトグラフィー工程が、純粋
なＡＩＭ ＩＩタンパク質を得るために使用され得る。精製されたタンパク質を
４℃で保存するかまたは−８０℃で凍結した。

【０５３８】 （実施例２：バキュロウイルス発現系におけるＡＩＭ ＩＩタンパク質のクロ
ーニングおよび発現） （Ａ．全長ＡＩＭ ＩＩタンパク質のクローニングおよび発現：） ＡＴＣＣ寄託番号９７６８９を付与された寄託されたクローンにおける全長Ａ
ＩＭ ＩＩタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列は、遺伝子の５’および３’配
列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅される： この５’プライマーは、配列：

【０５３９】

【化２０】 （下線部のＢａｍ ＨＩ制限酵素部位、続いて図１Ａ中のＡＩＭ ＩＩタンパク
質に対するコード領域の２２塩基（すなわち、ヌクレオチド４９〜７０）を含む
）を有する。以下のように発現ベクターに挿入され、ＡＩＭ ＩＩをコードする
増幅されたフラグメントの５’末端は、有効なシグナルペプチドを提供する。Ｋ
ｏｚａｋ，Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９４７−９５０（１９８７）
によって記載される、真核生物細胞における翻訳開始のための有効なシグナルは
、構築物のベクター部分に適切に位置する。

【０５４０】 ３’プライマーは、配列：

【０５４１】

【化２１】 （下線部のＡｓｐ７１８制限酵素認識部位、続いて図１Ａ中に示すＡＩＭ ＩＩ
の７７０〜７９５ヌクレオチドに対して相補的なヌクレオチドを含む）を有する
。

【０５４２】 増幅されたフラグメントを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」、ＢＩＯ
１０１ Ｉｎｃ．、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａ．）を使用して１％アガロースゲ
ルから単離する。次いで、このフラグメントを、Ｂａｍ ＨＩおよびＡｓｐ７１
８を用いて消化し、そして再び１％アガロースゲル上で精製する。このフラグメ
ントは、本明細書においてＦ２と命名する。

【０５４３】 ベクターｐＡ２−ＧＰを、バキュロウイルス発現系において、Ｓｕｍｍｅｒｓ
ら、Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕ
ｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒ
ｏｃｅｄｕｒｅｓ，Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅ
ｎｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５（１９８７）に
記載されるように、標準的手法を使用して、ＡＩＭ ＩＩタンパク質を発現する
ために使用する。この発現ベクターは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒ
ｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の強力な多角体病プロモーター、
続いて都合の良い制限酵素部位を含む。ＡｃＭＮＰＶｇｐ６７のシグナルペプチ
ド（Ｎ末端メチオニンを含む）は、ちょうどＢａｍＨＩ部位の上流に位置する。
シミアンウイルス４０（「ＳＶ４０」）のポリアデニル化部位は、有効なポリア
デニル化のために使用される。組換えウイルスの容易な選択として、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子は、ポリヘドリンプロモーターとして同じ
方向に挿入され、そしてポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルが続く。
クローン化されたポリヌクレオチドを発現する生存可能なウイルスを産生するた
めに、このポリヘドリン配列は、両端で、野生型ウイルスＤＮＡとの細胞媒介相
同的組換えのためのウイルス配列と隣接する。

【０５４４】 他の多くのバキュロウイルスベクター（例えば、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１
、およびｐＡｃＩＭ１）は、当業者が容易に理解するように、構築物が転写、翻
訳、輸送などのために適切に配置されたシグナル（必要とされる場合、例えば、
インフレームなＡＵＧおよびシグナルペプチドを含む）を提供する限りにおいて
、ｐＡ２−ＧＰの代わりに使用され得る。このようなベクターは、例えば、Ｌｕ
ｃｋｏｗら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９（１９８９）に記載される
。

【０５４５】 プラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＡｓｐ７１８で消化し、ついで、当該
分野で公知の慣用の手順を用いて、仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化
する。次いでＤＮＡを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩＯ １０１
Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ）を使用して、１％アガロースゲルから単
離する。このベクターＤＮＡは、本明細書中では、「Ｖ」と称される。

【０５４６】 フラグメントＦ２および脱リン酸化したプラスミドＶ２を、Ｔ４ ＤＮＡリガ
ーゼを用いて互いに連結する。Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１を、連結混合液で形質
転換し、そして培養プレート上に拡げる。ヒトＡＩＭ ＩＩ遺伝子を含むプラス
ミドを含む細菌を、Ｘｂａ Ｉを使用する個々のコロニー由来のＤＮＡを消化し
、そして消化産物をゲル電気泳動によって分析することにより同定する。クロー
ニングしたフラグメントの配列をＤＮＡ配列決定によって確認する。このプラス
ミドは、本明細書中ではｐＢａｃＡＩＭ ＩＩと称される。

【０５４７】 （Ｂ．代替形態のＡＩＭ ＩＩタンパク質のクローニングおよび発現） ＡＴＣＣ寄託番号９７４８３として同定された寄託されたクローンにおけるヒ
トＡＩＭ ＩＩタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列を、この遺伝子の５’およ
び３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅する
。

【０５４８】 ５’プライマーは、以下の配列：

【０５４９】

【化２２】 を有し、これは、下線のＢａｍ ＨＩ制限酵素部位、続いて、配列番号３８のＡ
ＩＭ ＩＩの配列の１５の塩基を含む。以下に記載されるように、発現ベクター
に挿入された５’の増幅されたフラグメント（ヒトＡＩＭ ＩＩをコードする）
は、効果的なシグナルペプチドを提供する。真核生物細胞における翻訳の開始に
ついての効果的なシグナルペプチドは、Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｌ
ｏ．１９６：９４７−９５０（１９８７）に記載されるように、構築物のベクタ
ー部分に適切に位置する。

【０５５０】 ３’プライマーは、以下の配列：

【０５５１】

【化２３】 を有し、この配列は、下線のＸｂａＩ制限、続いてＡＩＭＩの最後の１８ヌクレ
オチドに相補的なヌクレオチドを含み、停止コドンを含む配列番号３８に示され
る配列をコードする。

【０５５２】 増幅されたフラグメントを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」、ＢＩＯ １０１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して、１％アガロースゲ
ルから単離する。次いで、このフラグメントを、Ｂａｍ ＨＩおよびＡｓｐ７１
８を用いて消化し、そして再び１％アガロースゲル上で精製する。次いで、この
ベクターをｐＡベクターを用いて、この実施例のＡ節に上記されるように基本的
に構築した。

【０５５３】 （Ｃ．Ｎ末端ＡＩＭ ＩＩ欠失変異体の構築） この例示的実施例において、プラスミドシャトルベクターｐＡ２ ＧＰを用い
て、ＡＩＭ ＩＩタンパク質のＮ末端欠損をコードするクローニングされたＤＮ
Ａを、配列番号２のＡＩＭ ＩＩ変異体（Ｇｌｎ（６０）〜Ｖａｌ（２４０））
およびＡＩＭ ＩＩ変異体（Ｓｅｒ（７９）〜Ｖａｌ（２４０））を発現するバ
キュロウイルスの、Ｓｕｍｍｅｒら、Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｆｏｒ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｉｎｓｅｃｔ
Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ、Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕ
ｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ
第１５５５号（１９８７）に記載のような標準的な方法を用いて挿入する。こ
の発現ベクターは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病
ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の強力なポリヘドリンプロモーター、続いてバキュロ
ウイルスｇｐ６７タンパク質の分泌シグナルペプチド（リーダー）を含み、Ｂａ
ｍＨＩ、ＸｂａＩ、およびＡｓｐ７１８のような簡便な制限部位を含む。サルウ
イルス４０（「ＳＶ４０」）のポリアデニル化部位を、効率的なポリアデニル化
のために用いる。組換えウイルスの平易な選択のために、プラスミドは、同じ方
向で、弱Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａプロモーターの制御下で、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のβ
ガラクトシダーゼ遺伝子を含み、続いて、ポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化
シグナルを含む。挿入遺伝子は、野生型ウイルスのＤＮＡとの細胞媒介性相同組
換えのためにウイルス配列の両側に隣接し、クローニングされたポリヌクレオチ
ドを発現する生存ウイルスを産生する。

【０５５４】 当業者が理解するように、転写、翻訳、分泌など（必要に応じて、例えば、シ
グナルペプチドおよびインフレームＡＵＧを含む）のために、適切に配置された
シグナルを、構築が提供するする限り、他の多くのバキュロウイルスベクター（
例えば、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１およびｐＡｃＩＭ１）は、上記のベクター
の代わりに使用され得る。このようなベクターは、とりわけ、Ｌｕｃｋｏｗら、
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９に記載される。

【０５５５】 ＡＩＭ ＩＩ（Ｇｌｎ（６０）〜Ｖａｌ（２４０））（図１Ａ（配列番号２）
）をコードするｃＤＮＡ配列を、この遺伝子の５’および３’配列に対応するＰ
ＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅した。

【０５５６】 この５’プライマーは、以下の配列：

【０５５７】

【化２４】 を有し、この配列は、下線のＢａｍＨＩ制限酵素部位、続いて図１Ａおよび１Ｂ
に示されるＡＩＭ ＩＩタンパク質をコードする２０のヌクレオチド（すなわち
、２２５〜２４５）を含み、タンパク質のアミノ酸６０で始まる。この３’プラ
イマーは、以下の配列：

【０５５８】

【化２５】 を有し、この配列は、下線のＸｂａＩ制限部位、続いて図１Ｂ（配列番号１）の
ヌクレオチド７５３〜７６８に相補的なヌクレオチドを含む。

【０５５９】 増幅されたフラグメントを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩＯ
１０１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ）を使用して１％アガロースゲルよ
り単離した。次いで、このフラグメントをＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、
そして再び１％アガロースゲルで精製した。このフラグメントは本明細書中で「
Ｆ１」と称される。

【０５６０】 プラスミドを、制限酵素Ｂａｍ ＨＩおよびＸｂａＩを用いて消化し、必要に
応じて、当該分野において公知の慣用的手順を使用して、仔ウシ腸ホスファター
ゼを用いて脱リン酸化し得る。次いで、このＤＮＡを市販のキット（「Ｇｅｎｅ
ｃｌｅａｎ」ＢＩＯ １０１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ．）を使用し
て１％アガロースゲルから単離する。このベクターＤＮＡは、本明細書中におい
て「Ｖ１」と称される。

【０５６１】 フラグメントＦ１および脱リン酸化プラスミドＶ１をともに、Ｔ４ ＤＮＡリ
ガーゼを用いて連結した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１または他の適切なＥ．ｃｏ
ｌｉ宿主（例えば、ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ））細胞を、連結混合液を用いて
形質転換し、そして培養プレート上に広げた。ＰＣＲ法を使用して、ヒトＡＩＭ
ＩＩ遺伝子を有するプラスミドを含む細菌を同定した。ＰＣＲ法において、使
用されたプライマーの１つはこの遺伝子を増幅するためであり、そして第２のプ
ライマーは十分にベクターの内部からであり、その結果ＡＩＭ ＩＩ遺伝子フラ
グメントを含有する細菌コロニーのみがＤＮＡの増幅を示す。クローン化された
フラグメントの配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。このプラスミドを、
本明細書においてｐＢａｃＡＩＭ ＩＩ（ａａ６０〜２４０）と称した。

【０５６２】 ＡＩＭ ＩＩ（Ｓｅｒ（７９）〜Ｖａｌ（２４０））（図１Ａ（配列番号２）
）をコードするｃＤＮＡ配列を、この遺伝子の５’および３’配列に対応するＰ
ＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅した。

【０５６３】 この５’プライマーは、以下の配列：

【０５６４】

【化２６】 を有し、この配列は、下線のＢａｍＨＩ制限酵素部位、続いて図１Ａおよび１Ｂ
に示すＡＩＭ ＩＩタンパク質をコードする２８３〜３０１のヌクレオチドを含
み、タンパク質のアミノ酸７９で始まる。この３’プライマーは、以下の配列：

【０５６５】

【化２７】 を有し、この配列は、下線のＢａｍＨＩ制限部位、続いて図１Ｂ（配列番号１）
のヌクレオチド７５７〜７７１に相補的なヌクレオチドを含む。

【０５６６】 増幅されたフラグメントを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩＯ
１０１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ）を使用して１％アガロースゲルよ
り単離した。次いで、このフラグメントをＢａｍＨＩで消化し、そして再び１％
アガロースゲルで精製した。このフラグメントを本明細書中で「Ｆ１」と称した
。

【０５６７】 プラスミドを、制限酵素Ｂａｍ ＨＩを用いて消化し、必要に応じて、当該分
野において公知の慣用的手順を使用して、仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リ
ン酸化し得る。次いで、このＤＮＡを市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」Ｂ
ＩＯ １０１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ．）を使用して１％アガロー
スゲルから単離する。このベクターＤＮＡを、本明細書中において「Ｖ１」と称
した。

【０５６８】 フラグメントＦ１および脱リン酸化プラスミドＶ１をともに、Ｔ４ ＤＮＡリ
ガーゼを用いて連結した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１または他の適切なＥ．ｃｏ
ｌｉ宿主（例えば、ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ））細胞を、連結混合液を用いて
形質転換し、そして培養プレート上に広げた。ＰＣＲ法を使用して、変異型ＡＩ
Ｍ ＩＩ遺伝子を有するプラスミドを含む細菌を同定した。ＰＣＲ法において、
使用されたプライマーの１つはこの遺伝子を増幅するためであり、そして第２の
プライマーは十分にベクターの内部からであり、その結果ＡＩＭ ＩＩ遺伝子フ
ラグメントを含有する細菌コロニーのみがＤＮＡの増幅を示す。クローン化され
たフラグメントの配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。このプラスミドを
、本明細書においてｐＢａｃＡＩＭ ＩＩ（ａａ７９〜２４０）と称した。

【０５６９】 （Ｄ．ＡＩＭ ＩＩ配列を含むバキュロウイルスベクターのトランスフェクシ
ョン） ｐＢａｃＡＩＭ ＩＩまたはｐＢａｃＡＩＭ ＩＩ（ａａ６０〜２４０）のい
ずれかのプラスミド５μｇを、市販の直線状バキュロウイルスＤＮＡ（「Ｂａｃ
ｕｌｏＧｏｌｄ^TMバキュロウイルスＤＮＡ」、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）１．０μｇと共に、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、 ８４：７４１３〜７４１７（１９８７）に記載
されるリポフェクション法を使用して、同時トランスフェクションした。１μｇ
のＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ^TMウイルスＤＮＡおよび５μｇのプラスミドｐＢａｃＡ
ＩＭ ＩＩまたはｐＢａｃＡＩＭ ＩＩ（ａａ６０〜２４０）を、５０μｌの無
血清グレース培地（Ｇｒａｃｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を含有する、滅菌
したマイクロタイタープレートのウェル中で混合した。その後、１０μｌのＬｉ
ｐｏｆｅｃｔｉｎおよび９０μｌのグレース培地を添加し、混合し、そして室温
で１５分間インキュベートした。次に、トランスフェクション混合物を、１ｍｌ
の無血清グレース培地を有する３５ｍｍ組織培養プレート中に播種したＳｆ９昆
虫細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）に、滴下した。このプレートを前後に揺
らし、新たに添加した溶液を混合した。次にこのプレートを２７℃で５時間イン
キュベートした。５時間後、トランスフェクション溶液をプレートから除去し、
そして１０％ウシ胎仔血清を補充した１ｍｌのグレース昆虫培地を添加した。こ
のプレートをインキュベートに戻し、そして２７℃での培養を４日間続けた。

【０５７０】 ４日後、上清を回収し、そしてプラークアッセイを、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳ
ｍｉｔｈ（上記に引用）によって記載されるように行った。「Ｂｌｕｅ Ｇａｌ
」（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒ
ｇ）を有するアガロースゲルを使用して、青く染まるプラークを産生するｇａｌ
発現クローンの容易な同定および単離を可能とした。（このタイプの「プラーク
アッセイ」の詳細な説明はまた、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ
．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇによって頒布された昆虫細胞培養とバキュロウイ
ルス学のための使用者のガイド（９〜１０頁）において見出され得る）。

【０５７１】 段階希釈の４日後、このウイルスをこの細胞に添加した。適切なインキュベー
ションの後に、青く染まるプラークをエッペンドルフピペットのチップを用いて
拾った。次に、組換えウイルスを含むアガーを、２００μｌのグレース培地を含
有するエッペンドルフチューブ中に再懸濁した。アガーを短時間の遠心分離によ
って除去し、そして組換えバキュロウイルスを含む上清を、３５ｍｍディッシュ
中に播種された昆虫Ｓｆ９細胞に対して使用した。４日後、これらの培養ディッ
シュの上清を回収し、次に上清を４℃で保存した。適切に挿入されたｈＥＳＳＢ
Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩを含むクローンを、制限マッピングおよび配列決定を含
むＤＮＡ分析によって同定した。このクローンを、本明細書においてＶ−ＡＩＭ
ＩＩまたはＶ−ＡＩＭ ＩＩ（ａａ６０〜２４０）と称した。

【０５７２】 Ｓｆ９細胞を１０％の熱非働化ＦＢＳを補充したグレース培地中で増殖した。
この細胞を、約２（約１〜約３）の感染多重度（「ＭＯＩ」）で、組換えバキュ
ロウイルスＶ−ＡＩＭ ＩＩまたはＶ−ＡＩＭ ＩＩ（ａａ６０〜２４０）を用
いて感染した。６時間後、この培地を除去し、そしてメチオニンおよびシステイ
ンを含まないＳＦ９００ＩＩ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎ
ｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇより入手可能）で置き換えた。４２時間後、５
μＣｉの³⁵Ｓメチオニンおよび５μＣｉの³⁵Ｓシステイン（Ａｍｅｒｓｈａｍよ
り入手可能）を、添加した。この細胞をさらに１６時間インキュベートし、次に
遠心分離によって回収し、溶解し、そして標識したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅおよびオートラジオグラフィーによって可視化した。

【０５７３】 （実施例３：クローニングおよび哺乳動物細胞における発現） 哺乳動物細胞中で、ＡＩＭ ＩＩタンパク質遺伝子配列の一過性の発現のため
に使用されるほとんどのベクターは、ＳＶ４０の複製起点を含むであろう。この
ことは、ウイルスＤＮＡ合成の開始に必要とされるＴ抗原を発現する細胞（例え
ば、ＣＯＳ細胞）中での、高コピー数までのベクターの複製を可能とする。任意
の他の哺乳動物細胞株はまた、この目的に使用され得る。

【０５７４】 代表的な哺乳動物発現ベクターは、ｍＲＮＡの転写の開始を媒介するプロモー
ターエレメント、タンパク質コード配列、転写の終結および転写物のポリアデニ
ル化に必要とされるシグナルを含む。さらなるエレメントとしては、エンハンサ
ー、Ｋｏｚａｋ配列、およびＲＮＡスプライシングのドナーおよびアクセプター
部位に隣接する介在配列が挙げられる。高効率の転写は、ＳＶ４０の初期および
後期プロモーター、レトロウイルス（例えば、ＲＳＶ、ＨＴＬＶＩ、ＨＩＶＩ）
の長末端反復配列（ＬＴＲ）、ならびにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期
プロモーターを用いて達成され得る。しかし、細胞性のシグナル（例えば、ヒト
アクチンプロモーター）もまた使用され得る。本発明の実施における使用のため
の適切な発現ベクターとしては、例えば、ｐＳＶＬおよびｐＭＳＧ（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）、ｐＲＳＶｃａｔ（ＡＴＣＣ ３７
１５２）、ｐＳＶ２ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）およびｐＢＣ１２ＭＩ（
ＡＴＣＣ ６７１０９）のようなベクターが挙げられる。使用され得る哺乳動物
宿主細胞としては、ヒトＨｅＬａ、２８３、Ｈ９およびジャーカット細胞、マウ
スＮＩＨ３Ｔ３およびＣ１２７細胞、Ｃｏｓ１、Ｃｏｓ７およびＣＶ１、アフリ
カミドリザル細胞、ウズラＱＣ１−３細胞、マウスＬ細胞およびチャイニーズハ
ムスター卵巣細胞が挙げられる。

【０５７５】 あるいは、この遺伝子は、染色体中に組み込まれた遺伝子を含有する安定な細
胞株中で発現され得る。ｄｈｆｒ、ｇｐｔ、ネオマイシン、ハイグロマイシンの
ような選択マーカーとの同時トランスフェクションは、トランスフェクションさ
れた細胞の同定および単離を可能にする。

【０５７６】 トランスフェクションされた遺伝子はまた増幅され、大量にコードされるタン
パク質を発現し得る。ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸還元酵素）は、目的の遺伝子の数
百コピーまたは数千コピーさえも保有する細胞株の発生の有用なマーカーである
。別の有用な選択マーカーは、グルタミンシンターゼ酵素（ＧＳ）である（Ｍｕ
ｒｐｈｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２２７：２７７〜２７９（１９９１）；Ｂｅ
ｂｂｉｎｇｔｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６９〜１７５（
１９９２））。これらのマーカーを使用して、哺乳動物細胞を、選択培地中で増
殖し、そして最も高度な耐性を有する細胞を選択する。これらの細胞株は、染色
体中に組み込まれた増殖した遺伝子を含有する。チャイニーズハムスター卵巣（
ＣＨＯ）細胞は、しばしばタンパク質の産生に使用される。

【０５７７】 発現ベクターｐＣ１およびｐＣ４は、ラウス肉腫ウイルスの強力なプロモータ
ー（ＬＴＲ）（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、４３８〜４４７（Ｍａｒｃｈ、１９８５））、およびＣＭ
Ｖエンハンサーのフラグメント（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４１：５２１〜
５３０（１９８５））を含む。多重クローニング部位（例えば、ＢａｍＨＩ、Ｘ
ｂａＩおよびＡｓｐ７１８の制限酵素切断部位を有する）は、目的の遺伝子のク
ローニングを促進する。このベクターは、３’イントロンに加えて、ラットプレ
プロインスリン遺伝子のポリアデニル化および終結シグナルを含む。

【０５７８】 （実施例３（ａ）：ＣＯＳ細胞におけるクローニングおよび発現） 発現プラスミドｐＡＩＭ ＩＩ ＨＡを、ＡＩＭ ＩＩをコードするｃＤＮＡ
を発現ベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．より入
手され得る）内にクローニングすることにより作製する。

【０５７９】 発現ベクターｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐは、以下を含む：（１）Ｅ．ｃｏｌｉおよ
び他の原核生物細胞における増殖に効果的なＥ．ｃｏｌｉの複製起点；（２）プ
ラスミドを保持する原核生物細胞の選択のためのアンピシリン耐性遺伝子；（３
）真核生物細胞における増殖のためのＳＶ４０複製起点；（４）配列されたＣＭ
Ｖプロモーター、ポリリンカー、ＳＶ４０イントロン、およびポリアデニル化シ
グナル（その結果、ｃＤＮＡは、ポリリン（ｐｏｌｙｌｉｎｅ）中の制限部位に
より都合よく、ＣＭＶプロモーターの発現制御下に配置され得、そしてＳＶ４０
イントロンおよびポリアデニル化シグナルに作動可能に連結され得る）。

【０５８０】 ＡＩＭ ＩＩタンパク質をコードするＤＮＡフラグメントおよびその３’末端
にインフレームで融合されたＨＡタグを、組換えタンパク質の発現がＣＭＶプロ
モーターにより指向されるように、ベクターのポリリン（ｐｏｌｙｌｉｎｅ）領
域にクローン化する。ＨＡタグは、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７（
１９８４）に記載される、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエ
ピトープに対応する。ＨＡタグの標的タンパク質への融合は、そのＨＡエピトー
プを認識する抗体を用いる組換えタンパク質の容易な検出を可能にする。

【０５８１】 全長ＡＩＭ ＩＩについてのプラスミド構築のストラテジーは、以下の通りで
ある。寄託されたクローンのＡＩＭ ＩＩ ｃＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉにおける
ＡＩＭ ＩＩ発現のための発現ベクターの構築に関する上記とほぼ同様に、都合
のよい制限部位を含むプライマーを使用して増幅する。発現されたＡＩＭ ＩＩ
の検出、精製および特徴づけを容易にするために、プライマーの１つは、上記の
赤血球凝集素タグ（「ＨＡタグ」）を含む。

【０５８２】 適切なプライマーとしては、以下のものが挙げられ、これを本実施例において
使用した。５’プライマー（下線部のＢａｍＨＩ部位、およびＡＵＧ開始コドン
を含む）は、以下の配列を有する：

【０５８３】

【化２８】 ３’プライマー（下線部のＸｂａＩ部位、終止コドン、後に赤血球凝集素ＨＡ
タグを形成する９コドン、および３’コード配列（３’末端での）の３３ｂｐを
含む）は、以下の配列を有する：

【０５８４】

【化２９】 ＰＣＲ増幅されたＤＮＡフラグメントおよびベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐを
、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩで消化し、次いで連結した。

【０５８５】 代替形態のＡＩＭ ＩＩについてのプラスミド構築のストラテジーは、以下の
通りである。寄託されたクローンのＡＩＭ ＩＩ ｃＤＮＡ（ＡＴＣＣ寄託番号
９７４８３として同定される）を、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳ．ｆｕｒｇｉｐｅｒｄ
ａにおけるＡＩＭ ＩＩ発現のための発現ベクターの構築に関する上記とほぼ同
様に、都合のよい制限部位を含むプライマーを使用して増幅する。発現されたＡ
ＩＭ ＩＩの検出、精製および特徴づけを容易にするために、プライマーの１つ
は、上記の赤血球凝集素タグ（「ＨＡタグ」）を含む。

【０５８６】 適切なプライマーとしては、以下のものが挙げられ、これを本実施例において
使用した。５’プライマー（下線部のＢａｍＨＩ部位、ＡＵＧ開始コドンおよび
後に以下の配列を有する５つのコドンを含む）は、以下の配列を有する：

【０５８７】

【化３０】 ３’プライマー（下線部のＸｂａＩ部位を含む）は、以下の配列を有する：

【０５８８】

【化３１】 ＰＣＲ増幅されたＤＮＡフラグメントおよびベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐを
、適切な制限酵素で消化し、次いで連結した。

【０５８９】 上記の各場合において、連結混合物を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＳＵＲＥ株（Ｓｔｒａ
ｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１１０９９ Ｎｏｒｔｈ Ｔ
ｏｒｒｅｙ Ｐｉｎｅｓ Ｒｏａｄ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ ９２０３７より
入手可能）内に形質転換し、形質転換した培養物を、アンピシリン培地プレート
上にプレートし、次いで、プレートをインキュベートして、アンピシリン耐性コ
ロニーを増殖させ得る。プラスミドＤＮＡを、耐性コロニーより単離し、ＡＩＭ
ＩＩコードフラグメントの存在について、制限分析およびゲル泳動により試験
した。

【０５９０】 組換えＡＩＭ ＩＩの発現のために、ＣＯＳ細胞を、ＤＥＡＥ−ＤＥＸＴＲＡ
Ｎ（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ（１９８９）に記載されるような）を使用して、上記の発現ベクターでトラ
ンスフェクトした。細胞を、ベクターによるＡＩＭ ＩＩの発現のための条件下
でインキュベートした。

【０５９１】 ＡＩＭ ＩＩ ＨＡ融合タンパク質の発現を、例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版；Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）に記載される
方法を使用して、放射標識および免疫沈澱により検出する。この目的ために、ト
ランスフェクション２日後に、細胞を、³⁵Ｓシステインを含む培地中での、８時
間のインキュベーションにより標識した。細胞および培地を収集して、そして細
胞を洗浄し、そして界面活性剤含有ＲＩＰＡ緩衝液：１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１
％ＮＰ−４０、０．１％ＳＤＳ、１％ＮＰ−４０、０．５％ＤＯＣ、５０ｍＭ
ＴＲＩＳ、ｐＨ７．５（上記に引用されたＷｉｌｓｏｎらにより記載される）で
溶解した。タンパク質を細胞溶解物から沈殿させ、そしてＨＡ特異的モノクロー
ナル抗体を使用して培養培地から沈殿させた。次いで、沈殿させたタンパク質を
、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよびオートラジオグラフィーにより分析した。予期さ
れる大きさの発現産物を、細胞溶解物中に見出し、それはネガティブコントロー
ルには見られなかった。

【０５９２】 （実施例３（ｂ）：ＣＨＯ細胞におけるクローニングおよび発現） ベクターｐＣ４をＡＩＭ ＩＩタンパク質の発現に使用した。プラスミドｐＣ
１は、プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ受託番号３７１４６）の誘導体
である。両プラスミドは、ＳＶ４０初期プロモーターの制御下にマウスＤＨＦＲ
遺伝子を含む。これらのプラスミドをトランスフェクトさせる、ジヒドロ葉酸活
性を欠損するチャイニーズハムスター卵巣細胞または他の細胞は、化学療法剤メ
トトレキセートを補充した選択培地（αマイナスＭＥＭ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅｓ）において細胞を増殖することにより選択され得る。メトトレキ
セート（ＭＴＸ）に耐性な細胞におけるＤＨＦＲ遺伝子の増幅は、詳細に実証さ
れている（例えば、Ａｌｔ，Ｆ．Ｗ．、Ｋｅｌｌｅｍｓ，Ｒ．Ｍ．、Ｂｅｒｔｉ
ｎｏ，Ｊ．Ｒ．、およびＳｃｈｉｍｋｅ，Ｒ．Ｔ．、１９７８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２５３：１３５７−１３７０、Ｈａｍｌｉｎ，Ｊ．Ｌ．およびＭａ，
Ｃ．１９９０、Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１０９７：
１０７−１４３、Ｐａｇｅ，Ｍ．Ｊ．およびＳｙｄｅｎｈａｍ，Ｍ．Ａ．１９９
１、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 第９巻：６４−６８を参照のこと）。増加す
るＭＴＸの濃度において増殖される細胞は、ＤＨＦＲ遺伝子の増幅の結果として
、標的酵素ＤＨＦＲを過剰生成することにより薬物に対する耐性を発生する。第
２の遺伝子がＤＨＦＲ遺伝子に連結される場合、それは通常、同時増幅され、そ
して過剰発現される。それは、１０００コピーを超える遺伝子を保持する細胞株
を発生するための当該技術の常識である。引き続き、メトトレキセートが回収さ
れる場合、細胞株は、染色体内に組込まれた増幅された遺伝子を保持する。

【０５９３】 プラスミドｐＣ４は、目的の遺伝子を発現するために、ラウス肉腫ウイルスの
長末端反復配列（ＬＴＲ）の強力なプロモーター（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｍａｒｃｈ １９８５
：４３８−４４７）およびヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の前初期遺伝子
のエンハンサーから単離されたフラグメント（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４
１：５２１−５３０（１９８５））を含む。プロモーターの下流には、遺伝子の
組み込みを可能にするＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、およびＡｓｐ７１８制限酵素切断
部位が存在する。このプラスミドは、これらのクローニング部位の後に、ラット
プレプロインスリン遺伝子の３’イントロンおよびポリアデニル化部位を含む。
他の高い効率のプロモーターもまた、発現のために使用され得る（例えば、ヒト
βアクチンプロモーター、ＳＶ４０初期または後期プロモーター、あるいは他の
レトロウイルス（例えば、ＨＩＶおよびＨＴＬＶＩ）由来の長末端反復配列）。
Ｃｌｏｎｔｅｃｈ’ｓ Ｔｅｔ−ＯｆｆおよびＴｅｔ−Ｏｎ遺伝子発現系ならび
に同様の系は、哺乳動物細胞の調節方法によりＡＩＭ ＩＩを発現するために使
用され得る（Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．およびＢｕｊａｒｄ，Ｈ．１９９２，Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：５５４７−５５５１）。ｍＲＮ
Ａのポリアデニル化のために、他のシグナル（例えば、ヒト成長ホルモンまたは
グロビン遺伝子由来の）もまた、同様に使用され得る。染色体に組込まれた目的
の遺伝子を保持する安定な細胞株もまた、選択可能なマーカー（例えば、ｇｐｔ
、Ｇ４１８またはハイグロマイシン）での同時トランスフェクションで選択され
得る。最初に１より多い選択マーカー（例えば、Ｇ４１８およびメトトレキセー
ト）を使用することは有利である。

【０５９４】 プラスミドｐＣ４を、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＡｓｐ７１８で消化し、次い
で、当該分野で公知の手順により、仔ウシ腸ホスファターゼを使用して脱リン酸
化する。次いで、ベクターを１％アガロースゲルから単離する。

【０５９５】 完全ＡＩＭ ＩＩタンパク質をコードするＤＮＡ配列を、この遺伝子の５’お
よび３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、増幅
する。５’プライマーは、配列５’ＧＣＴ ＣＣＡ ＧＧＡ ＴＣＣ ＧＣＣ
ＡＴＣ ＡＴＧ ＧＡＧ ＧＡＧ ＡＧＴ ＧＴＣ ＧＴＡ ＣＧＧ Ｃ ３’
（配列番号１５）を有し、この配列は、下線部のＢａｍＨＩ制限酵素部位、それ
に続く、真核生物における翻訳開始のための有能なシグナル（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．
、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９４７−９５０（１９８７）に記載されるよ
うな）、および図１Ａ（配列番号１）に示されるＡＩＭ ＩＩタンパク質のコー
ド領域の２２塩基（すなわち、ヌクレオチド４９〜７０）を含む。３’プライマ
ーは、配列５’ＧＡ ＣＧＣ ＧＧＴ ＡＣＣ ＧＴＣ ＣＡＡ ＴＧＣ ＡＣ
Ｃ ＡＣＧ ＣＴＣ ＣＴＴ ＣＣＴ ＴＣ ３’（配列番号１６）を有し、こ
の配列は、下線部のＡｓｐ７１８制限部位、それに続く、図１Ｂ（配列番号１）
に示されるＡＩＭ ＩＩ遺伝子のヌクレオチド７７０〜７９５に相補的なヌクレ
オチドを含む。

【０５９６】 増幅されたフラグメントを、エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＡｓｐ７１
８で消化し、次いで、１％アガロースゲル上で、再度、精製した。次いで、単離
されたフラグメントおよび脱リン酸化されたベクターを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ
で連結した。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１ またはＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細
胞を形質転換し、そしてプラスミドｐＣ４内に挿入されたフラグメントを含む細
菌を、例えば、制限酵素分析により同定する。

【０５９７】 （実施例３（ｃ）：ＣＨＯ細胞における、Ｎ末端欠失ＡＩＭ ＩＩのクローニ
ングおよび発現） ベクターｐＣ４を、ＡＩＭ ＩＩ変異体（配列番号２中のＭｅｔ（６８）〜Ｖ
ａｌ（２４０））タンパク質の発現のために使用した。プラスミドｐＣ４を、制
限酵素ＢａｍＨＩで消化し、次いで、当業者に公知の手順により仔ウシ腸ホスフ
ァターゼを使用して脱リン酸化した。次いで、このベクターを、１％アガロース
ゲルから単離した。

【０５９８】 ＡＩＭ ＩＩ（ａａ６８〜２４０）タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、こ
の遺伝子の５’および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー
を使用して、増幅した。以下の５’プライマーを使用した：５’ＧＡＣ ＡＧＴ
ＧＧＡ ＴＣＣ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＴＣ ＡＣＣ ＣＧＣ ＣＴＧ
ＣＣＴ ＧＡＣ ＧＧＡ Ｃ ３’（配列番号４０）。これは、下線部のＢａ
ｍＨＩ制限酵素部位、それに続く、真核生物における翻訳開始のための有能なシ
グナル（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９４７−９５０（
１９８７）に記載されるような）、および図１Ａ（配列番号１）に示されるＡＩ
Ｍ ＩＩポリペプチドのコード領域中のヌクレオチド２０２〜２２６を含む。以
下の３’プライマーを使用した：（ＢａｍＨＩおよび終止コドン（イタリック体
））

【０５９９】

【化３２】 これは、下線部のＢａｍＨＩ制限部位、それに続く、図１Ｂ（配列番号１）に示
されるｎｔ７５３〜７６８に相補的なヌクレオチドを含む。

【０６００】 増幅されたフラグメントを、エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ消化し、次いで、
１％アガロースゲル上で、再度、精製した。次いで、単離されたフラグメントお
よび脱リン酸化されたベクターを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで連結した。次いで、
Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１ またはＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞を形質転換し、そし
てプラスミドｐＣ４内に挿入されたフラグメントを含む細菌を、例えば、制限酵
素分析により同定する。

【０６０１】 ベクターｐＣ４／Ｃｋβ８（最初にＣｋβ８シグナルペプチドを、Ｃｋβ８シ
グナル配列の３’末端におけるＢａｍＨＩ部位で、ｐＣ４ベクター内にクローン
化したｐＣ４構築物）を、ＡＩＭ ＩＩ変異体（配列番号２のＴｒｐ（８０）〜
Ｖａｌ（２４０））タンパク質の発現のために使用した。プラスミドｐＣ４／Ｃ
ｋβ８を、制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、次いで、当業者に公知の手順により仔
ウシ腸ホスファターゼを使用して脱リン酸化した。次いで、このベクターを、１
％アガロースゲルから単離した。

【０６０２】 ＡＩＭ ＩＩ（ａａ８０〜２４０）タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、こ
の遺伝子の５’および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー
を使用して、増幅した。以下の５’プライマーを使用した：５’ｃｇｃ ＧＧＡ ＴＣＣ ＴＧＧＧＡＧＣＡＧＣＴＧＡＴＡＣ ３’（配列番号４１）。これは、下
線部のＢａｍＨＩ制限酵素部位、それに続く、図１Ａ（配列番号１）に示される
ＡＩＭ ＩＩポリペプチドのコード領域中のヌクレオチド２８６〜３０１を含む
。以下の３’プライマーを使用した：５’ｃｇｃ ＧＧＡＴＣＣ ＴＣＡ ＣＡ
ＣＣＡＴＧＡＡＡＧＣ ３’（配列番号２９）。これは、下線部のＢａｍＨＩ制
限部位、それに続く、図１Ｂ（配列番号１）に示されるｎｔ７５７〜７７１に相
補的なヌクレオチドを含む。

【０６０３】 増幅したフラグメントを、エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで消化し、次いで１
％アガロースゲル上で再度精製した。次いで、単離したフラグメントおよび脱リ
ン酸化したベクターを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで連結した。次いで、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ ＨＢ１０１またはＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞を形質転換し、そして、例えば制
限酵素分析を用いて、プラスミドｐＣ４／Ｃｋβ８に挿入されたフラグメントを
含む細菌を同定した。

【０６０４】 （ＣＨＯ細胞トランスフェクション） 活性なＤＨＦＲ遺伝子を欠くチャイニーズハムスター卵巣細胞をトランスフェ
クションのために使用する。５μｇの上記のｐＣ４発現ベクターを、リポフェク
チンを用いて０．５μｇのプラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏとともに同時トランスフ
ェクションした（Ｆｅｌｇｎｅｒら、前出）。プラスミドｐＳＶ２ｎｅｏは、優
性な選択マーカーであるｎｅｏ遺伝子を含み、これはＧ４１８を含む一群の抗体
に対して耐性を与える酵素をコードするＴｎ５由来である。その細胞を、１ｍｇ
／ｍｌのＧ４１８で補充したαマイナスＭＥＭ中に播種する。２日後、細胞をト
リプシン処理し、そして１０、２５、または５０ｎｇ／ｍｌのメトトレキサート
および１ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８で補充したαマイナスＭＥＭ中のハイブリドーマ
クローニングプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に播種する。約１０
〜１４日後、単一のクローンをトリプシン処理し、次いで、異なる濃度（５０ｎ
Ｍ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭ）のメトトレキサートを
使用して、６ウェルのペトリ皿または１０ｍｌフラスコに播種する。次いで、最
も高い濃度のメトトレキサートで増殖するクローンを、さらに高い濃度（１μＭ
、２μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭ）のメトトレキサートを含む６ウェルの
新しいプレートに移す。同じ手順を、１００〜２００μＭの濃度で増殖するクロ
ーンが得られるまで反復する。所望の遺伝子産物の発現を、例えば、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥおよびウェスタンブロッティング、または逆相ＨＰＬＣ分析によって分析
する。

【０６０５】 （実施例３（ｄ）：ＣＨＯ細胞におけるＡＩＭ ＩＩ Ｎ−末端欠失のクロー
ニングおよび発現） Ｃ−末端Ｆｃ免疫グロブリン領域を含むＡＩＭ ＩＩ変異体（配列番号２にお
けるＭｅｔ（６８）−Ｖａｌ（２４０））タンパク質の発現のために、ベクター
ｐＣ４を使用した。この構築物において、Ｃｋβ８シグナルペプチドを、Ｃｋβ
８の３’末端のＢａｍＨＩ部位を用いて最初にｐＣ４にクローニングした。Ｂａ
ｍＨＩおよびＸｂａＩ部位によって隣接されるＦｃフラグメントを、そのベクタ
ーにクローニングして、ｐＣ４／Ｃｋβ８／Ｆｃを生じた。次いで、ＡＩＭ Ｉ
Ｉフラグメントを、ＢａｍＨＩ部位で、ＣＫ−β８リーダーとＦｃフラグメント
との間にクローニングした。

【０６０６】 プラスミドｐＣ４を、制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、次いで、当該分野で公知
の手順によって仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化した。次いで、この
ベクターを、１％アガロースゲルから単離した。

【０６０７】 完全ＡＩＭ ＩＩ（ａａ６８〜２４０）タンパク質をコードするＤＮＡ配列を
、この遺伝子の５’および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライ
マーを用いて増幅した。以下の５’プライマーを使用した：５’ＧＡＣ ＡＧＴ
ＧＧＡ ＴＣＣ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＴＣ ＡＣＣ ＣＧＣ ＣＴＧ
ＣＣＴ ＧＡＣ ＧＧＡ Ｃ３’（配列番号４０）。このプライマーは、下線
を付したＢａｍＨＩ制限酵素部位、続いて、Ｋｏｚａｋ，Ｍ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．１９６：９４７〜９５０（１９８７）によって記載される真核生物にお
ける翻訳の開始のための有効なシグナル、および図１Ａ（配列番号１）に示され
るＡＩＭ ＩＩポリペプチドについてのコード領域におけるヌクレオチド２０２
〜２２６を含む。以下の３’プライマーを使用した：（ＢａｍＨＩ）５’−ＧＧ
Ｇ ＧＧＡ ＴＣＣ ＣＡＣ ＣＡＴ ＧＡＡ ＡＧＣ ＣＣＣ Ｇ−３’（配
列番号３０）。このプライマーは、下線を付したＢａｍＨＩ制限部位、続いて図
１Ａおよび１Ｂ（配列番号１）に示されるｎｔ７５３〜７６８に相補的なヌクレ
オチド、続いて以下の配列を有するＦｃ免疫グロブリンフラグメントを含む：

【０６０８】

【化３３】 増幅したフラグメントを、エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで消化し、次いで１
％アガロースゲル上で再度精製した。次いで、単離したフラグメントおよび脱リ
ン酸化したベクターを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで連結した。次いで、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ ＨＢ１０１またはＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞を形質転換した。そして、例えば
制限酵素分析を用いて、プラスミドｐＣ４に挿入されたフラグメントを含む細菌
を同定する。

【０６０９】 （ＣＨＯ細胞トランスフェクション） チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−ＤＧ４４）細胞を、リポフ
ェクチンを使用して、発現ベクター（ｐＣ４／ｓｐＣＫβ８／Ｆｃ／ＡＩＭ Ｉ
Ｉ）を用いてトランスフェクトした。組換えクローンを、５％ 透析ウシ胎仔血
清（ＤｉＦＢＳ）、１％ ペニシリン／ストレプトマイシン（ＰＳ）、１ｍｇ／
ｍＬ ゲネチシン（Ｇ４１８）および１０ｎＭ メトトレキサート（ＭＴＸ）を
有するＭＥＭα選択培地中で細胞を増殖させることによって単離した。次いで、
ＢＩＡｃｏｒｅ法を使用して組換えクローンをスクリーニングすることによって
確認した高発現クローン（より詳細には、以下を参照のこと）を、ＭＴＸの濃度
を１００μＭの最終濃度まで段階的に増加させることによって個々に増殖させた
。この高発現クローンを、マイクロキャリアＣＨＯ灌流バイオリアクター中のＡ
ＩＭ ＩＩ−ＩｇＧ１融合タンパク質の産生のために使用した。

【０６１０】 ＣＨＯ ＡＩＭ ＩＩ−ＩｇＧ１細胞を、１％ ｕｌｔｒａ−ｌｏｗ ＩｇＧ
ＦＢＳを含むＨＧＳ−ＣＨＯ−３培地中で、Ｃｙｔｏｄｅｘ １マイクロキャ
リア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）上
で増殖させた。マルチプルマイクロキャリアスピナー中で増殖させた細胞を、１
０Ｌのマイクロキャリア灌流バイオリアクターにスケールアップした。灌流バイ
オリアクターを２７日間連続して操作して、そしてその時間の間、ＡＩＭ ＩＩ
−ＩｇＧ１融合タンパク質を含み、マイクロキャリアを含まない９０リッターの
上清を収集した。この上清を、０．２μｍの滅菌フィルターを使用する濾過プロ
セスを通して清澄化し、そして５ｍＭ ＥＤＴＡを添加することによって安定化
した。清澄化した上清をアフィニティーカラムにロードして、ＡＩＭ ＩＩ−Ｉ
ｇＧ１融合タンパク質を捕捉した。

【０６１１】 （ＡＩＭ ＩＩ−ＩｇＧ１融合タンパク質の精製） ＡＩＭ ＩＩ−ＩｇＧ１融合タンパク質を、１５ＬのＣＨＯ馴化培地から精製
した。この馴化培地を、３０ｍＬ／分の流速で、ＢｉｏＣａｄ６０（ＰｅｒＳｅ
ｐｔｉｖｅｓ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で１０℃で、プロテインＡ Ｈｙｐｅ
ｒＤ（５４ｍＬ総容積、ＢｉｏＳｅｐｒａ）アフィニティーカラムにロードした
。このカラムを、２５ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ８および０．１Ｍ ＮａＣｌ
で前もって平衡化した。ロード後、このカラムをそれぞれ３容量の０．１Ｍ ク
エン酸ナトリウム、ｐＨ５および０．１Ｍ ＮａＣｌ、ならびに０．１Ｍ クエ
ン酸ナトリウム、ｐＨ ２．８および０．１Ｍ ＮａＣｌで洗浄した。ＡＩＭ
ＩＩ−ＩｇＧ融合タンパク質を含むピーク画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によっ
て決定し、そしてプールした。この精製タンパク質の同定を、Ｎ末端配列分析に
よって確認した。最終的なタンパク質収率は、馴化培地１リッターあたり約９ｍ
ｇであった。

【０６１２】 （実施例４：ＡＩＭ ＩＩ発現構築物） （全長構築物） （ａ）ｐＣＭＶｓｐｏｒｔ：真核生物発現ベクターｐＣＭＶｓｐｏｒｔは、Ｍ
ｅｔ（１）からＶａｌ（２４０）までのＡＩＭ ＩＩ ＯＲＦをコードするヌク
レオチドを含む。プラスミド構築ストラテジーは以下の通りである。寄託された
クローンのＡＩＭ ＩＩ ｃＤＮＡを、便利な制限部位を含むプライマーを使用
して増幅する。適切なプライマーは、この実施例で使用される以下のものを含む
。５’プライマーは、ＡＩＭ ＩＩポリペプチド（配列番号１）のコード領域に
おける、下線を付したＳａｌＩ部位、ＡＵＧ開始コドン、ヌクレオチド５１〜６
９を含み、そして以下の配列を有する：

【０６１３】

【化３４】 ３’プライマーは、下線を付したＮｏｔＩ部位を含み、配列番号１のヌクレオ
チド７５３〜７６７に相補的なヌクレオチド、および終止コドンを含み、そして
以下の配列を有する：

【０６１４】

【化３５】 ＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントを、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩで消化し、次いで
ゲル精製する。次いで、単離したフラグメントをＳａｌＩおよびＮｏｔＩ消化し
たベクターｐＣＭＶｓｐｏｒｔに連結した。連結混合物をＥ．ｃｏｌｉに形質転
換し、そして形質転換した培養物を、抗生物質培地プレート上に置き、次いでそ
のプレートをインキュベートして、抗生物質耐性コロニーの増殖を可能にする。
プラスミドＤＮＡを、耐性コロニーから単離し、そしてＡＩＭ ＩＩコードフラ
グメントの存在について、制限分析およびゲルサイジングによって試験する。

【０６１５】 組換えＡＩＭ ＩＩの発現のために、真核生物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞また
はＣＨＯ細胞）を、上記の実施例３に示すようなＤＥＡＥ−ＤＥＸＴＲＡＮを使
用して、上記に示すように発現ベクターでトランスフェクトした。ＡＩＭ ＩＩ
組換えタンパク質の発現は、実施例３中の上記の方法によって検出される。

【０６１６】 （ｂ）ｐＧ１ＳａｍＥＮ：レトロウイルス発現ベクターｐＧ１ＳａｍＥＮは、
Ｍｅｔ（１）〜Ｖａｌ（２４０）のＡＩＭ ＩＩ ＯＲＦをコードする。ｐＧ１
ベクターは、Ｍｏｒｇａｎ，Ｒ．Ａ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０
（６）：１２９３〜１２９９（１９９２）において記載され、そしてＬＮベクタ
ーに類似するが（Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．およびＲｏｓｍａｎ，Ｇ．Ｊ．Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７：９８０〜９９０（１９８９））、さらなるクローニ
ング部位を有する。プラスミド構築ストラテジーは以下の通りである。寄託され
たクローンのＡＩＭ ＩＩ ｃＤＮＡを、便利な制限部位を含むプライマーを使
用して増幅する。適切なプライマーは、本実施例中で使用される以下のものを含
む。５’プライマーは、下線を付したＮｏｔＩ部位、および ＡＵＧ開始コドン
、 ＡＩＭ ＩＩポリペプチド（配列番号１）のコード領域のヌクレオチド５１
〜６９を含み、以下の配列を有する：

【０６１７】

【化３６】 ３’プライマーは、下線を付したＳａｌＩ部位、配列番号１のヌクレオチド７
５３〜７６８に相補的なヌクレオチド、および終止コドンを含み、以下の配列を
有する：

【０６１８】

【化３７】 ＰＣＲ増幅したＤＮＡフラグメントをＳａｌＩおよびＮｏｔＩで消化し、次い
でゲル精製する。次いで、単離したフラグメントをＳａｌＩおよびＮｏｔＩ消化
したベクターに連結した。連結混合物をＥ．ｃｏｌｉに形質転換し、そして形質
転換した培養物を抗生物質培地プレート上に置き、次いでインキュベートして抗
生物質耐性コロニーの増殖を可能にする。プラスミドＤＮＡを耐性コロニーから
単離し、そしてＡＩＭ ＩＩコードフラグメントの存在について、制限分析およ
びゲルサイジングによって試験する。

【０６１９】 組換えＡＩＭ ＩＩの発現のために、真核生物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞また
はＣＨＯ細胞）を、上記の実施例３に示すようなＤＥＡＥ−ＤＥＸＴＲＡＮを使
用して、上記に示すように発現ベクターでトランスフェクトした。ＡＩＭ ＩＩ
組換えタンパク質の発現は、実施例３中の上記の方法によって検出される。

【０６２０】 （２．Ｎ末端欠失構築物） （ａ）ｐＧ１／ｃｋβ８：この真核生物の発現ベクターは、ＡＩＭ−ＩＩ変異
体（配列番号２におけるＧｌｎ（６０）からＶａｌ（２４０））（ＡＩＭ−２（
ａａ６０〜２４０）をコードし、そしてヒトＣｋ−β８シグナルペプチドの指揮
下で分泌される。このｐＧ１ベクターは、Ｍｏｒｇａｎ，Ｒ．Ａ．ら、Ｎｕｃｌ
．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０（６）：１２９３−１２９９（１９９２）に記載さ
れ、そしてＬＮベクターに類似しているが（Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．およびＲｏ
ｓｍａｎ，Ｇ．Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７：９８０−９９０（１９８
９））、付加的なクローニング部位を有する。このプラスミド構築ストラテジー
は、以下のとおりである。寄託されたクローンのＡＩＭ ＩＩ ｃＤＮＡは、都
合のよい制限部位を含むプライマーを使用して増幅される。適切なプライマーと
しては、本実施例に用いられる以下のプライマーが挙げられる。下線を付したＮ
ｏｔＩ部位、ＡＩＭ ＩＩポリペプチドに対するコード領域中のヌクレオチド（
配列番号１）、およびＡＵＧ開始コドンを含む５’プライマーは、以下の配列を
有する：

【０６２１】

【化３８】 下線を付したＳａｌＩ部位、配列番号１におけるヌクレオチド７５３〜７６８
に対して相補的なヌクレオチドおよび終止コドンを含む３’プライマーは、以下
の配列を有する： ５’−ＧＧＧ ＧＴＣ ＧＡＣ ＴＣＡ ＣＡＣ ＣＡＴ ＧＡＡ ＡＧＣ Ｃ
ＣＣ Ｇ−３’（配列番号３７）。

【０６２２】 ＰＣＲで増幅したＤＮＡフラグメントを、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩで消化し、
次いでゲルで精製する。次いで、単離したフラグメントを、ＳａｌＩおよびＮｏ
ｔＩ消化したベクターｐＧ１に連結した。連結混合物を、Ｅ．ｃｏｌｉに形質転
換し、そしてこの形質転換された培養物を、抗生物質培地プレート上にプレート
し、次いで、抗生物質耐性コロニーの増殖を可能にするためにインキュベートす
る。プラスミドＤＮＡを、耐性コロニーから単離し、ＡＩＭ ＩＩをコードする
フラグメントの存在について、制限分析およびゲルサイジングによって試験する
。

【０６２３】 組換えＡＩＭ ＩＩの発現のために、ＣＯＳまたはＣＨＯのような真核生物細
胞を、上記実施例３に記載したＤＥＡＥ−ＤＥＸＴＲＡＮを用いて、上記の発現
ベクターでトランスフェクトする。ＡＩＭ ＩＩ組換えタンパク質の発現を、上
記の実施例３に記載した方法によって検出する。

【０６２４】 （ｂ）ｐＨＥ４：プラスミドｐＨＥ４は、２つのｌａｃオペレーターを有する
強力な合成プロモーターを含む細菌の発現ベクターである。このプロモーターか
らの発現を、ｌａｃリプレッサーの存在によって調節し、そしてＩＰＴＧまたは
ラクトースを用いて誘導する。このプラスミドはまた、効率的なリボソーム結合
部位、およびＡＩＭ ＩＩ変異体遺伝子の下流に合成転写ターミネーターを含む
。このベクターはまた、ｐＵＣプラスミドの複製領域およびカナマイシン耐性遺
伝子を含む。

【０６２５】 このＡＩＭ ＩＩ Ｎ末端欠失変異体を、以下のスキームに従って構築した。
寄託されたクローンのＡＩＭ ＩＩ ｃＤＮＡを、都合のよい制限部位を含むプ
ライマーを用いて増幅する。本実施例において用いられる適切なプライマーは、
以下を含む。

【０６２６】 配列番号２におけるＡＩＭ ＩＩ（Ｔｈｒ（７０）からＶａｌ（２４０））ポ
リペプチドについて、下線を付したＮｄｅＩ部位およびＡＵＧ開始コドン、ＡＩ
Ｍ ＩＩポリペプチドに関するコード領域中のヌクレオチド２５６〜２７１（配
列番号１）を含む５’プライマーは、以下の配列を有する： ５’−ｃｇｃ ＣＡＴＡＴＧ Ａ ＣＣＣＧＣＣＴＧＣＣＴＧＡＣＧ−３’（配
列番号４２）。

【０６２７】 配列番号２におけるＡＩＭ ＩＩ（Ｓｅｒ（７９）からＶａｌ（２４０））ポ
リペプチドについて、下線を付したＮｄｅＩ部位およびＡＵＧ開始コドン、ＡＩ
Ｍ ＩＩポリペプチドに関するコード領域中のヌクレオチド２８３〜３１０（配
列番号１）を含む５’プライマーは、以下の配列を有する： ５’−ｃｇｃ ＣＡＴＡＴＧ Ａ ＧＣ ＴＧＧＧＡＧＣＡＧＣＴＧＡＴＡＣ−
３’（配列番号４３）。

【０６２８】 配列番号２におけるＡＩＭ ＩＩ（Ｓｅｒ（１０３）からＶａｌ（２４０））
ポリペプチドについて、下線を付したＮｄｅＩ部位およびＡＵＧ開始コドン、Ａ
ＩＭ ＩＩポリペプチドに関するコード領域中のヌクレオチド３５５〜３７３（
配列番号１）を含む５’プライマーは、以下の配列を有する： ５’−ｃｇｃ ＣＡＴＡＴＧ Ａ ＧＣ ＡＧＣＴＴＧＡＣＣＧＧＣＡＧＣＧ−
３’（配列番号４４）。

【０６２９】 以下の３’プライマーを、上述のＮ末端欠失を構築するために使用し得る： 下線を付したＡｓｐ７１８部位、配列番号１におけるヌクレオチド７５３−７
６８に相補的なヌクレオチドおよび終止コドンを含む３’プライマーは、以下の
配列を有する： ５’−ｃｇｃ ＧＧＴＡＣＣ ＴＴＡ ＣＡＣＣＡＴＧＡＡＡＧＣＣＣＣＧ−３
’（配列番号４５）。

【０６３０】 このＰＣＲ増幅したＤＮＡフラグメントを、ＮｄｅＩおよびＡｓｐ７１８で消
化し、次いでゲルで精製する。次に、この単離したフラグメントを、適切に消化
したｐＨＥ４ベクターに連結した。この連結混合物を、Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換
し、そして形質転換した培養物を、抗生物質培地プレート上にプレートし、次い
でインキュベートし、抗生物質耐性コロニーの増殖を可能にする。プラスミドＤ
ＮＡを、耐性コロニーから単離し、そしてＡＩＭ ＩＩをコードするフラグメン
トの存在について、制限分析およびゲルサイジングにより試験する。

【０６３１】 Ｎ末端欠失の組換えＡＩＭ ＩＩの発現のために、細菌細胞を、実施例１にお
いて上記に記載したように発現ベクターでトランスフェクトする。ＡＩＭ ＩＩ
組換えタンパク質の発現を、実施例１において上記に記載したような方法で検出
する。

【０６３２】 （実施例５：ＡＩＭ ＩＩポリペプチドの生物学的特徴付け） 以下の実験のセットは、ＡＩＭ ＩＩタンパク質の生物学的特徴付けを提供し
、そしてＡＩＭ ＩＩが、インビボおよびインビトロにおいて強力な抗腫瘍活性
を有することを実証する。

【０６３３】 （Ａ．ＡＩＭ ＩＩは、活性化リンパ球において多く発現されるが、癌細胞に
おいては高度に発現されない。） ノーザンブロット分析は、ＡＩＭ ＩＩ ｍＲＮＡが、約１．９ｋｂの長さで
あり、そして主に脾臓、脳、および末梢血細胞において発現されることを示した
。ＡＩＭ ＩＩはまた、前立腺、精巣、卵巣、小腸、胎盤、肝臓、骨格筋、およ
び肺において、ある程度検出可能である。ＡＩＭ ＩＩメッセージは、胎児性組
織、多くの内分泌腺、ならびに非造血および骨髄由来の腫瘍株において検出され
なかった。

【０６３４】 ＲＴ−ＰＣＲアッセイを、活性化ＰＢＭＣ対休止ＰＢＭＣにおいてＡＩＭ Ｉ
Ｉの発現を調査するために行った。Ｔ細胞、Ｂリンパ球、ＮＫ細胞、単球、およ
び顆粒球の混合物を含む新鮮なＰＢＭＣは、ノーザンブロット分析と一致するＡ
ＩＭ ＩＩ ｍＲＮＡを発現する。発現は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびＮＫ細胞の
混合物としての休止ＰＢＬ、ジャーカット細胞（休止または活性化）またはＫ５
６２細胞において見出されなかった。ＡＩＭ ＩＩの増加した発現が、活性化Ｐ
ＢＬ、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）、顆
粒球、および単球において見出された。さらなるＲＴ−ＰＣＲ分析は、ＬＰＳ活
性化好中球およびＰＭＡ刺激したＵ９３７細胞においてＡＩＭ ＩＩ ｍＲＮＡ
の存在を示した。興味深いことに、ＡＩＭ ＩＩの発現は、乳房、前立腺または
卵巣由来の種々の癌細胞株（ヒト乳房上皮性由来の非腫瘍形成性細胞株ＭＣＡ−
１ＯＡ細胞を除く）においては検出可能ではなかった。さらに、ＡＩＭ ＩＩの
発現は、試験された３つの乳癌サンプルからは見出されなかった。

【０６３５】 （Ｂ．ＡＩＭ ＩＩの構成性発現は、血清飢餓またはＩＦＮγ処理下で増殖阻
害を生じた） ＡＩＭ ＩＩの生物学的機能を調査するため、ＡＩＭ ＩＩ遺伝子を、ヒト乳
房癌腫細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１にレトロウィルスベクターを用いて安定に形
質導入した。これらの細胞におけるＡＩＭ ＩＩ遺伝子の発現を、ノーザンブロ
ット分析によって確認した。さらに、薬物耐性遺伝子Ｎｅｏを発現するＭＤＡ−
ＭＢ−２３１細胞を、本研究においてコントロールとして使用した。これらの細
胞を、１０％ＦＢＳを含む培地において培養した場合、その親細胞またはベクタ
ーコントロールトランスフェクト化細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／Ｎｅｏ）と比
較して、ＡＩＭ ＩＩトランスフェクト体（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＡＩＭ Ｉ
Ｉ）中で、インビトロにおける増殖率における差異は観察されなかった。しかし
、血清濃度が、１％にまで低下した場合、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＡＩＭ ＩＩ
細胞に関して８０％の増殖阻害（図４Ａ）があったが、親細胞またはベクターコ
ントロールＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞では存在しなかった。異なる量の血清に関
する用量依存性増殖阻害もまた、観察された。

【０６３６】 野生型ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、１０％または１％のいずれかの血清にお
いて、代表的なパイルアップ（ｐｉｌｅ−ｕｐ）特性を伴って非常に高い密度ま
で増殖した（図４Ａ）。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＡＩＭ ＩＩ細胞において、ほ
とんどの細胞が培地中に浮遊し、そして培養物の全体にわたって単層の増殖パタ
ーンを維持することを伴う、形態学的な変化が注目された。形態学の変化は、ベ
クターコントロールＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞において見出されなかった。ＭＤ
Ａ−ＭＢ−２３１細胞を発現するＡＩＭ ＩＩの増殖阻害を、ソフトアガーコロ
ニーアッセイでさらに試験した。図４Ｂに示されるように、コロニー形成の８０
％の減少が、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＡＩＭ ＩＩ細胞において、それらの親細
胞またはベクターコントロール細胞と比較して見出された。ＩＦＮγの２５μ／
ｍｌでの処理もまた、ＡＩＭ ＩＩ発現ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の８０％の増
殖阻害を引き起こし得るが、一方親細胞またはベクターコントロール細胞におい
ては、わずか２０〜３０％にすぎない阻害が存在した。従って、ＡＩＭ ＩＩを
発現する細胞は、サイトカインＩＦＮγにより媒介された細胞傷害性に対する増
強された感度を示した。

【０６３７】 （Ｃ．ＡＩＭ ＩＩ発現細胞における増強されたアポトーシス） アネキシン−Ｖ ＦＡＣＳ分析を、ＡＩＭ ＩＩ発現細胞の増殖阻害の潜在的
な機構を調査するために行った。１０％血清の存在下、３つの細胞株全てにおい
て、２％未満のアポトーシス細胞が存在する。減少した血清（０．５％ＦＢＳ）
における４８時間のインキュベーション後、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のアポト
ーシス集団比は、３倍（８％まで）の増加を示した。親細胞またはベクターコン
トロールＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞においては、アポトーシスのわずかな増加が
あるか、または増加がない（図５Ａ〜５Ｃ）。アポトーシスの誘導は、ＤＮＡフ
ラグメント化によって、さらに確認された。フラグメント化したＤＮＡは、ＡＩ
Ｍ ＩＩ発現ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞において、特に１％血清においてのみ見
られた。ＡＩＭ ＩＩ発現細胞を、Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ（ｔａｘｏｌ）で処理
した場合、親細胞またはベクターコントロール細胞において見られたよりも、よ
り多くのフラグメント化ＤＮＡの観察があった。従って、このデータは、ＡＩＭ
ＩＩ発現が、血清飢餓下、あるいはＩＦＮγまたはタキソールの添加で、ＭＤ
Ａ−ＭＢ−２３１細胞のアポトーシスの引き金となり得ることを示唆する。

【０６３８】 （Ｄ．ＡＩＭ ＩＩの強力なインビボ抗腫瘍活性） 本発明者らは、インビボにおける腫瘍増殖に対するＡＩＭ ＩＩ形質導入の効
果を評価した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、乳房脂肪パッド中へ接種した場合
、ＡＩＭ ＩＩ発現は、ヌードマウスにおけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１の腫瘍形成
を有意に阻害したが、ベクターコントロールＭＤＡ−ＭＢ−２３１／Ｎｅｏ細胞
は、それらの親ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞と比較して腫瘍増殖において何ら変化
も示さなかった（図６Ａ）。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＡＩＭ ＩＩ細胞における
同様の腫瘍抑制はまた、ＳＣＩＤマウスにおいても示された。ＡＩＭ ＩＩ発現
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞由来か、あるいはそれらの親細胞またはベクターコン
トロール細胞由来の腫瘍の組織学的な試験を行った。親細胞またはベクターコン
トロールＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、わずかな細胞浸潤を伴うかまたは細胞浸
潤を伴わずに、優位に腫瘍細胞で満たされた大きな固形腫瘍塊を形成した。対照
的に、ヌードマウスにおいてＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＡＩＭ ＩＩ細胞によって
形成された小さな残留腫瘍においてでさえ、大規模な壊死が観察された。さらに
、ＡＩＭ ＩＩ発現腫瘍において、好中球細胞の浸潤の数に有意な増加がある。
Ｇｒ−１ ｍＡｂ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用い
る免疫組織学的染色に基づき、野生型、Ｎｅｏコントロール、およびＡＩＭ Ｉ
Ｉ形質導入ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍におけるｍｍ²腫瘍サイズあたりの好中球
の平均数（平均±Ｓ．Ｄ．）は、それぞれ１０１±２６、７７±１６および２２
６±３８であった。

【０６３９】 ＡＩＭ ＩＩの腫瘍抑制に対する阻害効果を、同系のマウス腫瘍モデルでさら
に確認した。ＭＣ−３８マウス結腸ガン細胞におけるＡＩＭ ＩＩの局所的発現
は、１０匹のＣ５７ＢＬ／６マウスのうち８匹で腫瘍形成の完全な抑制を生じた
（図６Ｂ）。ＡＩＭ ＩＩの局所的産生によってもまた、ＭＣ−３８腫瘍を有す
るマウスの生存が劇的に延長された。全ての動物実験を３回繰り返し、そして同
様の結果が得られた。

【０６４０】 ＡＩＭ ＩＩ発現腫瘍細胞の注射によって、実験期間中、ヌードマウス（ＳＣ
ＩＤマウスまたはＣ５７ＢＬ／６マウス）において著しい異常（例えば、体重減
少または肝臓損傷）は引き起こされなかった。これは、局所的に生成されたＡＩ
Ｍ ＩＩが全身毒性を誘導することなく強力な抗腫瘍効果を発揮したことを示す
。

【０６４１】 （Ｅ．可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質の発現および細胞傷害性） ＡＩＭ ＩＩタンパク質の活性を研究するために、ＡＩＭ ＩＩタンパク質の
組換え可溶性形態（ｓＡＩＭ ＩＩ）を構築物ｐＦｌａｇ−ＡＩＭ ＩＩで２９
３Ｔ細胞を一過性にトランスフェクトすることによって生成した。この構築物は
、ＡＩＭ ＩＩの細胞外ドメインをコードするが、ＡＩＭ ＩＩの膜貫通部分を
欠失している（図７Ａ）。単一の２０ｋＤａポリペプチド（ｓＡＩＭ ＩＩ）を
ｐＦｌａｇ−ＡＩＭ ＩＩを形質導入した２９３Ｔ細胞の馴化培地から抗Ｆｌａ
ｇモノクローナル抗体で精製し得る。乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の増殖は、
用量依存性様式でこの可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質の処理に応答して阻害され
た（図７Ｂ〜図７Ｃ）。ＩＮＦγの添加（１０ｕ／ｍｌまたは５０ｕ／ｍｌ）は
、可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質の細胞傷害性を劇的に高めた。ＩＦＮγ単独で
は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対してほとんど活性を示さなかった（図７Ｂ〜
図７Ｃ）。これは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞がＴＮＦまたはＩＦＮγ処理のよ
うな単一のサイトカインに耐性であるという先の報告と一致する。

【０６４２】 一連の正常細胞株および癌細胞株を、１０ｕ／ｍｌのＩＮＦγの存在下で最適
濃度未満の濃度（５０ｎｇ／ｍｌ）で可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質の細胞傷害
性効果に対するそれらの感受性について試験した。図８Ｃに示されるように、Ｍ
ＤＡ−１３０、ＭＣＦ−７，ＨＴ−２９由来の細胞は、ＡＩＭ ＩＩの細胞傷害
性に対して感受性であるが、Ｕ９３Ｔ、ＭＣ３−１、ＳＷ４８０、ＭＣＦ−１０
Ａ由来の細胞は、ＡＩＭ ＩＩ媒介細胞殺傷に対して耐性である。試験した全て
の細胞株の中で、結腸腺癌細胞株ＨＴ−２９が最も感受性であり、ＩＣ₅₀は、１
ｎｇ／ｍｌ未満である。ＨＴ−２９細胞は、ＩＦＮγの存在下で、ＴＮＦ、Ｆａ
ｓまたはリンホトキシンβレセプター媒介殺傷に対して非常に感受性であること
を示した。

【０６４３】 （Ｆ．ＬＴβＲおよびＴＲ２の両方が、癌細胞のＡＩＭ ＩＩ誘導性増殖阻害
を必要とする） ＡＩＭ ＩＩは、本来、活性化Ｔ細胞ｃＤＮＡライブラリーから同定されたが
、リンパ球細胞株においてアポトーシスを誘導しない。ＲＴ−ＰＣＲ分析を使用
して、試験した全てのリンパ球細胞がＬＴβＲの発現を示さないことを示したが
、ＴＲ２発現がこれらの全ての細胞、特に活性化ジャーカット細胞またはＰＢＬ
で見いだされた。これは、末梢リンパ球がＬＴβＲを発現しないという先の報告
と一致するが、ＴＲ２発現は、Ｔ細胞活性化と関連する。

【０６４４】 ＬＴβＲおよびＴＲ２の一連のヒト癌細胞における細胞表面発現を、ＬＴβＲ
またはＴＲ２に対するモノクローナル抗体を使用して、ＦＡＣＳ分析によって調
べた。図８Ａ〜８Ｈに示されるように、両方のレセプターが高レベルであること
がＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＨＴ−２９細胞で見いだされたが、その一方でＭ
Ｃ３−１細胞はＴＲ２を発現せず、そしてジャーカット細胞は、ＬＴβＲを発現
しない。図８Ｌに、試験した全ての細胞株における両方のレセプターの表面発現
をまとめる。レセプターの一方のみを発現する細胞株（例えば、ジャーカットま
たはＭＣ３−１）は、ＡＩＭ ＩＩの細胞傷害性に対して耐性である。まとめる
と、これらのデータは、腫瘍細胞におけるＡＩＭ ＩＩ媒介増殖阻害がＬＴβＲ
およびＴＲ２レセプターの両方を必要とし得るが、その一方で、レセプターのう
ちの一方のみを発現する細胞は、細胞殺傷を媒介するためには十分ではないこと
を示唆する。

【０６４５】 ＡＩＭ ＩＩがＬＴβＲおよびＴＲ２レセプター両方について関連するリガン
ドであり、ならびにＡＩＭ ＩＩ媒介腫瘍細胞増殖阻害における両方のレセプタ
ーに重要であることをさらに実証するために、Ｆｌａｇタグ化ＡＩＭ ＩＩタン
パク質を、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１またはＨＴ−２９細胞とともにインキュベート
し、次いで、ＦＡＣＳ分析を、抗Ｆｌａｇ ｍＡｂを用いて行った。図８Ｉ〜８
Ｋに示されるように、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１またはＨＴ−２９細胞の、Ｆｌａｇ
タグ化可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質との結合は正にシフトする。結合の特異性
を、同じ細胞中で可溶性ＡＩＭ ＩＩ−ｆｌａｇタンパク質とのＬＴβＲ−Ｆｃ
融合タンパク質またはＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質（これは、両方のレセプター
の結合を効果的にブロックした）のプレインキュベーションによってさらに確認
した（図８Ｉ〜８Ｋ）。

【０６４６】 腫瘍細胞に対するＡＩＭ ＩＩ媒介細胞傷害性におけるＬＴβＲおよびＴＲ２
の両方の改善の重要性は、インビトロ増殖アッセイから得られたデータによって
さらに支持された：ＨＴ−２９のｓＡＩＭ ＩＩ媒介細胞傷害性を用量依存性様
式でＬＴβＲ−Ｆｃ融合タンパク質またはＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質の添加に
よって無効にされたが、一方で、ＬＴβＲ−Ｆｃ融合タンパク質またはＴＲ２−
Ｆｃ融合タンパク質それ自体は、細胞増殖に対して全く効果を示さなかった（図
８Ｍ）。さらに、同様のアッセイにおいて、ｓＡＩＭ ＩＩは他のメンバーのＴ
ＮＦＲ（例えば、ＴＮＦＲＩ、Ｆａｓ、ＤＲ３またはＤＲ１４）に結合し得なか
った。

【０６４７】 さらに、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＷｔまたはＨＴ−２９細胞とＭＤＡ−ＭＢ−
２３１／ＡＩＭ ＩＩ細胞との共培養は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／Ｗｔまたは野
生型ＨＴ−２９細胞の殺傷を生じた。しかし、共培養したＭＤＡ−ＭＢ−２３１
／ＡＩＭ ＩＩまたはＭＣ−３８／ＡＩＭ ＩＩ細胞から回収された馴化培地は
、ＨＴ−２９細胞の増殖のインビトロに対する阻害効果を全く示さなかった。こ
の結果は、天然のＡＩＭ ＩＩタンパク質が切断され得ず、そして培地中に分泌
され得ないことを示した。従って、膜結合ＡＩＭ ＩＩは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３
１またはＨＴ−２９のような適切な表面レセプターを発現する細胞で機能的であ
る。まとめると、このデータは、腫瘍細胞のＡＩＭ ＩＩ媒介増殖阻害がＬＴβ
ＲおよびＴＲ２レセプターの両方を必要とし得るが、レセプターのうちの一方の
みを発現する細胞は、細胞殺傷を媒介するためには十分ではないことを示唆する
。

【０６４８】 （Ｇ．リンパ球に対するＡＩＭ ＩＩの効果） ＡＩＭ ＩＩは、本来、活性化Ｔ細胞ｃＤＮＡライブラリーから同定されたが
、リンパ球細胞株においてアポトーシスを誘導しない。ＲＴ−ＰＣＲ分析を使用
して、試験した全てのリンパ球細胞がＬＴβＲを発現しないことを示したが、Ｔ
Ｒ２はこれらの全ての細胞、特に活性化ジャーカット細胞またはＰＢＬで陽性で
あった。これは、末梢リンパ球がＬＴβＲを発現しないという先の報告と一致す
るが、ＴＲ２発現は、Ｔ細胞活性化と関連する。

【０６４９】 膜結合ＡＩＭ ＩＩがリンパ球に対して異なる活性を発揮するか否かを調べる
ために、ＴＩＬ１２００細胞のＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＡＩＭ ＩＩ細胞との共
培養実験を行った。ＴＩＬ１２００は、高レベルのＦａｓを発現するＣＤ８⁺（
９９５）腫瘍浸潤リンパ球株である。膜結合ＡＩＭ ＩＩは、ＴＩＬ１２００の
アポトーシスを誘導しなかったが、Ｆａｓ抗体の添加によって、９０％のＴＩＬ
１２００が誘発されて、アポトーシスを受けた。同様の結果が、新鮮なＴＩＬ細
胞またはジャーカット細胞で得られた。

【０６５０】 さらに、いくつかのリンパ系細胞株およびＰＢＬを可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパ
ク質に対するこれらの応答性についてスクリーニングした。ＡＩＭ ＩＩの細胞
傷害性は、ジャーカット細胞（休止またはＣＤ３ ｍＡｂ活性化のいずれか）、
Ｋ５６２細胞、またはＴＩＬ１２００（腫瘍浸潤リンパ球）、ＰＢＭＣ（新鮮ま
たはＩＬ−２／ＣＤ３ ｍＡｂ活性化）（図８Ｌ）においてみられなかった。対
照的に、ＰＢＬのｓＡＩＭ ＩＩでの処理は、ＩＦＮγの放出によって実証され
るように、ＴＲ２発現Ｔ細胞の活性化を生じる（図９）。

【０６５１】 （考察） 前述の実験で、ＡＩＭ ＩＩの生物学的機能およびＬＴβＲおよびＴＲ２の新
規なリガンドとしての作用の、そのあり得る機構が特徴づけられた。この結果は
、ＡＩＭ ＩＩタンパク質がインビトロおよびインビボの両方で形質転換された
腫瘍細胞において主に強力な細胞傷害性を示すが、同時に、リンパ球を活性化す
ることが実証される。インビボおよびインビトロでのＡＩＭ ＩＩの生物学的活
性は、２つの異なるシグナル伝達経路：ＬＴβＲおよびＴＲ２への結合を含むい
くつかの方法においてＴＮＦ／ＦａｓＬファミリーの他の公知のメンバーと、Ａ
ＩＭ ＩＩとを明らかに区別する。ＡＩＭ ＩＩ発現が腫瘍増殖を阻害する能力
が異系（ｘｅｎｏｇｒａｐｈｉｃ）（免疫不全）モデルおよび同系（免疫コンピ
テント）モデルの両方で実証されたので、この結果は、Ｔ細胞媒介腫瘍特異的応
答が、この研究における原発性腫瘍拒絶についての本質的な因子ではないかもし
れないことを示唆する。

【０６５２】 ＴＮＦレセプターファミリーの活性化は、細胞増殖、あるいは細胞分化または
細胞死を直接誘導し得る。前述の実験は、ＡＩＭ ＩＩ発現が、血清飢餓または
ＩＦＮγの添加と関連して、ヒト乳癌腫細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１における増
殖阻害およびアポトーシスを生じたことを示す。アポトーシスの誘導は、アネキ
シン−Ｖ ＦＡＣＳ分析およびＤＮＡ断片化で示されるように、インビトロでの
増殖阻害についての主な原因であるようである。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＬＴ−
γ細胞の形態および増殖パターンは、細胞接着のいくらかの損失の関与を示唆す
る。Ｂｒｏｗｎｉｎｇらは、Ｆａｓ活性化が急激な細胞死（１２〜２４時間）を
導き、ＴＮＦの効果には２４時間を必要とし、そしてＬＴｃＸ１２０ヘテロトリ
マーは、ＨＴ−２９細胞についてのアポトーシスの誘導が最も遅かった（２〜３
日）ことを示した。可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質での処理に応答して、ＬＴγ
ＲおよびＴＲ２を発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞およびＨＴ−２９細胞の溶
解は、同様の緩慢な効果を示した（すなわち、少なくとも３〜５日）。実質的な
細胞溶解は、いくつかの細胞株については、３〜４日後ですら起こらない。ＡＩ
Ｍ ＩＩの作用の動態は、ＬＴαＩβ２ヘテロトリマーにより類似している。

【０６５３】 ＡＩＭ ＩＩは、本来、ＴＮＦ／Ｆａｓリガンドおよびレセプタースーパーフ
ァミリーのシステインリッチモチーフとの配列相同性のスクリーニングによって
ヒト活性化Ｔ細胞ライブラリーから同定された。他のＴＮＦ関連リガンドと同様
に、ＡＩＭ ＩＩは、外側細胞表面上のＣ末端、単一の膜貫通ドメイン、および
短い細胞質テイルを有するＩＩ型膜貫通タンパク質である。予測されるように、
ＡＩＭ ＩＩ遺伝子の全長ｃＤＮＡの形質導入によって、タンパク質の細胞表面
発現を生じ、そしてこのタンパク質は、ＦＡＣＳ分析で実証されるように、２つ
のレセプターに結合する。可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質は、両方のレセプター
に結合し、そして標的細胞に対する細胞傷害性効果を誘発するためには十分であ
る。しかしトランスウェル（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）共培養実験（ここでは、２つ
の型の細胞が培養培地を共有するが物理的には分離している）において、野生型
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１またはＨＴ−２９細胞に対する、ＡＩＭ ＩＩ発現ＭＤＡ
−ＭＢ−２３１細胞に由来する細胞傷害性は観察されなかった。直接共培養アッ
セイにおいて、膜結合ＡＩＭ ＩＩは、近接の接触に由来する殺傷を効果的に媒
介した。従って、天然のＡＩＭ ＩＩタンパク質は、分泌されたタンパク質では
ないかもしれないことが考えられる。蛍光インサイチュハイブリダイゼーション
（ＦＩＳＨ）によって、ＡＩＭ ＩＩ遺伝子は、ヒト第１６染色体、バンドｐ１
１．２に位置した。ＡＩＭ ＩＩの位置は、コア結合タンパク質、スルホトラン
スフェラーゼ、シンタキシン１Ｂ、網膜芽細胞腫結合タンパク質６、ジンクフィ
ンガータンパク質４４、細胞接着調節遺伝子およびウィルムス腫瘍−３遺伝子と
非常に近い。他の公知のＴＮＦリガンド（例えば、ＴＮＦ、ＬＴα、およびＬＴ
β）をコードする遺伝子は、クラスＩＩＩとＨＬＡ−Ｂ遺伝子座との間に挟まれ
た主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）内のヒト第６染色体上で密接に関連して
いる。

【０６５４】 ＬＴβＲおよびＴＲ２の両方は、デスドメインを欠如している。従って、ＬＴ
βＲおよびＴＲ２の両方に対するＡＩＭ ＩＩ結合の実証は、興味深い。ＬＴβ
ＲおよびＴＲ２は、ＴＮＦＲに対する会合因子（ＴＲＡＦ）との会合を介して一
般的なシグナル伝達経路を活性化し得るが、ＡＩＭ ＩＩ−ＬＴβＲおよびＡＩ
Ｍ ＩＩ−ＴＲ２の相互作用が、異なる生物学的事象の引き金となり得る。本実
施例に示したように、ＡＩＭ ＩＩの発現は、ＴＲ２レセプターのみを発現して
いるリンパ球を活性化するが、ＬＴβＲおよびＴＲ２の両方を発現している細胞
を死へと誘導する。ＬＴβＲを介したシグナル伝達は、ＴＲＡＦ３依存経路を活
性化する。対照的に、ＡＩＭ ＩＩ−ＴＲ２相互作用は、おそらくＴＲＡＦ（Ｔ
ＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３およびＴＲＡＦ５）を介した宿主免疫系の刺
激性応答を励起する。このＡＩＭ ＩＩ二重シグナル伝達仮説は、ＬＴβＲおよ
びＴＲ２の異なる組織発現パターンおよび細胞発現パターンによりさらに支持さ
れる。ＬＴβＲは、腫瘍および他の上皮細胞において顕著であるが、ＴおよびＢ
細胞には存在しない。対照的に、ＴＲ２は、休止および活性化されたＴ細胞、Ｂ
細胞および単球および顆粒細胞（ｇｒｎｕｎｏｃｙｔｅ）において匹敵するレベ
ルで大量に発現される。それゆえ、ＡＩＭ ＩＩはおそらく、アポトーシスおよ
び免疫活性化の誘導のような重大な役割を果たしており、そしてそれゆえ、癌に
ついての治療的適用を有し得る。

【０６５５】 ＬＴβＲは、元々、ＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーであるヒト第１２
ｐ染色体上にコードされる転写配列として記載されていた。ＬＴβＲは、リンパ
節の発達および細胞性免疫反応を調節するのに重要なエレメントとして関係して
いる。ＬＴβＲが、腫瘍株を含む種々の組織および細胞株で発現されていること
が示されている。ＴＮＦＲファミリーの他のメンバーとは異なり、ＬＴβＲは、
Ｔリンパ球およびＢリンパ球のいずれにおいても発現されない。組換えＬＴα１
β２ヘテロトリマーを用いることによる、または固定化された抗体との架橋によ
るＬＴβＲの活性化は、ＬＴβＲが、自身の細胞質領域内にデスドメインを含ま
ないにもかかわらず、腺癌細胞株の死ならびにケモカインＩＬ−８およびＲＡＮ
ＴＥＳの産生を誘導する。

【０６５６】 ＴＲ２が、複数のヒト組織において発現され、そして休止期および活性化され
たＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球および好中球を含む造血性系統
細胞における恒常的および相対的に高い発現を示す。ＴＲ２細胞質尾部は、Ｆａ
ｓおよびＴＮＦＲ−Ｉ細胞内ドメインに見られるデスドメインを含まず、そして
ＣＤ４０および４−１ＢＢのドメインにより関連しているようである。４−1Ｂ
ＢおよびＣＤ４０を介したシグナルが、それぞれＴ細胞およびＢ細胞に対して共
刺激性であることが示されている。ＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質は、アポトーシ
スの引き金となるＦａｓＬおよびＴＮＦとは対照的に混合リンパ球反応媒介増殖
を阻害した。試験した全ての造血性由来細胞は、ＴＲ２レセプターを発現してい
るが、腫瘍細胞で観察されたＡＩＭ ＩＩ媒介殺傷に対して耐性である。これは
、ＴＲ２単独では、デスシグナルを媒介しないことを示す。しかし、試験した全
ての癌細胞が、ＬＴβＲおよびＴＲ２の両方を発現したが、ＡＩＭ ＩＩ−ＬＴ
βＲシグナル伝達およびＡＩＭ ＩＩ−ＴＲ２シグナル伝達の両方が、腫瘍細胞
において、等しくＡＩＭ ＩＩ媒介細胞毒性に貢献しているか否かを、解明する
ことが残されている。本発明者らはまた、可溶性ＡＩＭ ＩＩは、ＤＲ３、ＤＲ
４およびＤＲ５にインビトロ結合アッセイにおいては結合しないが、ＡＩＭ Ｉ
ＩがＤＲ３、ＤＲ４およびＤＲ５のような他の公知または未知のデスレセプター
と相互作用する可能性を排除し得ない。

【０６５７】 Ｔ細胞に対する、ＴＮＦの用量制限毒性およびＦａｓＬの細胞毒性が、それら
の臨床的適用を制限する。ＡＩＭ ＩＩでの処置は、ＡＩＭ ＩＩが、ＴＲ２を
発現するがＬＴβＲを欠いている宿主免疫細胞に対してデスシグナルよりも刺激
性シグナルの引き金となるので、代替的な魅力的なアプローチとなり得た。ＡＩ
Ｍ ＩＩは、おそらくＬＴβＲおよびＴＲ２を介して腫瘍細胞の死を選択的に誘
導し得る能力を有し、そして同時に、見かけ上ＴＲ２シグナル伝達経路を介して
リンパ球からのＩＦＮγの分泌の引き金となり得る。従って、このモデルは、Ａ
ＩＭ ＩＩが、抗癌薬剤としてのさらなる開発のための魅力的な候補であること
を示すだけでなく、より重要なことに、ＴＮＦリガンド−レセプター相互作用の
メンバーのシグナル伝達経路をさらに理解するために、以前に定義されたＴＮＦ
またはＦａｓシステムとは異なる新規なシステムを提供する。

【０６５８】 （方法） （ＡＩＭ ＩＩ全長遺伝子の分子クローニング） ５００を超える異なるｃＤＮＡライブラリーから得た１，０００，０００より
多くのＥＳＴ（発現配列タグ）を含むデータベースが、ランダムに選択されたヒ
トｃＤＮＡクローンの高処理能力を有する自動ＤＮＡ配列分析を用いて、Ｈｕｍ
ａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．およびＴｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕ
ｔｅ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈの合わさった努力を通じて生
成されている。各ＥＳＴの配列相同性比較を、ｂｌａｓｔｎおよびｂｌａｓｔｎ
アルゴリズムを用いて、ＧｅｎＢａｎｋデータベースに対して行い、以前に同定
された配列に対する相同性を有するＥＳＴ（およそ０．０１以下）を、相同であ
る配列の名称に基づいて一時的な名称を与えた。このヒトＥＳＴデータベースに
対するＴＮＦ／Ｆａｓリガンドファミリーの保存されたアミノ酸配列（ＧＬＹＬ
ＩＹＳＱＶＬＦ（配列番号４６））を用いる特定の相同性およびモチーフ検索が
、＞５０％の相同性を有するいくつかのＥＳＴを明らかにした。ヒト活性化Ｔ細
胞ライブラリー由来のＧＹＹＹＩＹＳＫＶＱＬ（配列番号４７）を含む１つのク
ローンを、選択した。このＥＳＴを、３’末端に対する両方の鎖において配列決
定した。その相同性を確認した。最初のクローンは、ＴＮＦファミリーの他のメ
ンバーと比較して遺伝子の５’部分を欠いている。全長配列を得るために、ネス
ト化（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲ反応を、２つの遺伝子特異的オリゴヌクレオチドお
よび２つのベクター特異的プライマーを用いて行なった。５’末端のさらなる７
２ヌクレオチドを得た。次いで、全長配列を、ベクターｐＣＭＶｓｐｏｒｔ２．
０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍ
Ｄ）中にクローニングした。

【０６５９】 （ノーザンブロット分析） ヒト多重組織ノーザンブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＭＴＮｂｌｏｔｓ、＃７
７５９−１および＃７７６０−１）を、製造者の説明書に従って、³²Ｐ標識され
たＡＩＭ ＩＩ全長ｃＤＮＡを用いてプローブした。ブロットを、使用前に４２
℃で予熱したハイブリゾル溶液（Ｏｎｃｏｒ）中で、一晩ハイブリダイズし、そ
の後、引き続いて４２℃で、２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳおよび０．２×ＳＳＣ
／０．１％ＳＤＳ中で２回洗浄し、Ｐｈｏｓｐｈｏｌｍａｇｅｒ^TM（Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｃｏ．）を用いて可視化した。

【０６６０】 （インサイチュハイブリダイゼーションおよびＦＩＳＨ検出） ＡＩＭ ＩＩ遺伝子の正確な染色体上の位置を決定するために、標準的なヒト
分裂中期染色体の広がりに対する単一コピー遺伝子の蛍光インサイチュハイブリ
ダイゼーション（ＦＩＳＨ）を、試みた（Ｌａｗｒｅｎｃｅら、１９８８）。２
ＫｂのｃＤＮＡを、Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ−１１−ｄＵＴＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いてニックトランスレーションし、ＦＩＳＨを
、Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９１ｂに詳述のように行なった。個々の染色体は、Ｄ
ＡＰＩおよびカラーデジタルイメージで対比染色し、ＤＡＰＩおよびローダミン
で検出された遺伝子シグナルの両方を含んだ物を、トリプル−バンドパスフィル
ターセット（Ｃｈｒｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．、Ｂｒａｔｔｌｅ
ｂｕｒｏ、ＶＴ）を冷却電荷結合素子カメラ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ、Ｉｎ
ｃ．、Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ）および可変励起波長フィルター（ｖａｒｉａｂｌｅ
ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ｗａｖｅ ｌｅｎｇｔｈ ｆｉｌｔｅｒｓ）（Ｊｏｈ
ｎｓｏｎら、１９９１ａ）と組み合わせて用いて記録した。画像を、ＩＳＥＥソ
フトウェアパッケージ（Ｉｎｏｖｉｓｉｏｎ Ｃｏｒｐ．、Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ
）を用いて分析した。

【０６６１】 （細胞および試薬） ヒト乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、サブクローン２ＬＭＰを、胸腺欠損ヌードマ
ウスのＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のインビボ継代より得、全ての実験に用いた。
ＭＣ−３８は、Ｈ−２ｂ起源の１，２−ジメチルヒドラジン誘導マウス結腸腺癌
である。ヒトＴリンパ球株ＪｕｒｋａｔおよびＣＨＯ株を、アメリカンタイプカ
ルチャーコレクション（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）より得た。ヒト
黒色腫抗原ｇｐ１００反応性ＣＤ８＋ Ｔ細胞株ＴＩＬ１２００は、Ｄｒ．Ｙｕ
ｔａｋａ Ｋａｗａｋａｍｉ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔ
ｕｔｅ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）により快く提供された。ＭＤＡ−ＭＢ−２３
１を除く全ての腫瘍細胞株を、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で増殖
および維持した。この培地は、ダルベッコ改変されたＥａｇｌｅ’ｓ培地を基本
培地として用いた。ＨＬＡ−Ａ−２制限ＴＩＬ １２００を、１０％ヒト血清お
よび１０００ＵのＩＬ−２を含むＡｉｍ−Ｖ培地において増殖させた。アポトー
シス誘導性抗Ｆａｓ Ｍａｂ ＣＨ−１１を、Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙより得た。インターフェロンを、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒ
ｎａｔｉｏｎａｌ（ＣＡ）より得た。

【０６６２】 （可溶性ＡＩＭ ＩＩの生成） ＡＩＭ ＩＩのアミノ酸７４−２４０（すなわち、推定細胞外ドメイン）をコ
ードする配列を、プレプロトリプシンシグナルペプチドおよびＦＬＡＧペプチド
タグをコードする配列とインフレームでベクターｐＦＬＡＧ．ＣＭＶ−１にサブ
クローニングした。得られた構築物、ｐＦＬＡＧ−ｓＡＩＭ ＩＩを、組換えｓ
ＡＩＭ ＩＩを生成するために２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。ｐＦＬＡ
Ｇ．ＣＭＶ−１またはｐＦＬＡＧ−ｓＡＩＭ ＩＩをトランスフェクトした細胞
からの培養培地を、抗−ＦＬＡＧ ｍＡｂ（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏ
．）アフィニティーカラムに通した。カラム溶離液を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより
分画し、そして、ｓＡＩＭ ＩＩを、抗−ＦＬＡＧ ｍＡｂおよびＥＣＬ検出試
薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を用いてウェスタンブロ
ット分析により検出した。

【０６６３】 （組換えレセプター−Ｆｃ融合タンパク質の生成） ヒトＬＴβＲの細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲ技術に
よりＨｅｐＧ２細胞から増幅した。オリゴヌクレオチドプライマーの配列は、以
下であり：正方向５’ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＣＴＣＣＴＧＣＣＴＴＧＧＧＣＣ
ＡＣ３’（配列番号４８）；および逆方向５’ＧＣＧＧＡＴＣＣＴＧＧＧＧＧＣ
ＡＧＴＧＧＣＴＣＴＡＡＴＧＧ３’（配列番号４９）、そしてｐＳＫ＋ベクター
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）へのＰＣＲ産物のクローニングが促進されるように各
末端にＢａｍＨＩ制限酵素部位を含んだ。増幅された配列を、ＢａｍＨＩ消化に
供し、そして配列決定のためにＢａｍＨＩ切断ｐＳＫ＋ベクターに連結した。増
幅したｃＤＮＡフラグメントの忠実度をジデオキシＤＮＡ配列決定により確認し
た。ヒトＬＴβＲ−Ｆｃ融合タンパク質を得るために、ＬＴβＲの細胞外ドメイ
ンを、ＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼを用いてｐＳＫ＋ベクターから切り出
し、そしてフレーム連結するようにＢｇｌＩＩ切断ｐＵＣ１９−ＩｇＧｌ−Ｆｃ
ベクターに連結した。組換えバキュロウイルスを生成するために、融合遺伝子を
まず、ｐＵＣ１９−ＩｇＧ−ＦｃベクターからＨｐａｌ／ＨｉｎｄＩＩＩで切り
出し、続いてＳｍａＩ切断ｐＢａｃＰＡＫ９ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｃｏ
．）との連結で塞いだ後、次いで、Ｓｆ９細胞内に線状化したＢａｃＰＡＫ６
ＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｃｏ．）と共トランスフェクトした。組換え可溶性
ＬＴβＲ融合タンパク質を得るために、組換えウイルスを感染させた昆虫Ｓｆ２
１細胞からの５日間培養した上清を、濾過し、プロテインＡセファロースビーズ
上に捕捉し、次いで、結合ｓＬＴβＲタンパク質を、グリシン緩衝液（ｐＨ３．
０）で溶出し、続いてＰＢＳ中で透析した。ＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質の産生
は、記載した。

【０６６４】 （ＬＴβＲ抗体およびＴＲ２抗体の生成） Ｂａｌｂ／ｃＪマウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂ
ａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）を、フロイントアジュバント中のＬＴβＲ−Ｆｃ融
合タンパク質で免疫した。マウスを、３回追加免疫し、次いで、脾臓細胞を、Ｈ
ＥＰＥＳ中５０％のポリエチレングリコール存在下（ＰＥＧ １５００、Ｂｏｅ
ｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）でマウスミエローマＮＳ−１細胞と融合し
、続いて、ＰＲＭＩ１６４０／ＨＡＴおよびＲＰＭＩ１６４０／ＨＴ選択培地（
Ｂｏｅｈｅｒｉｎｇｅｒ Ｃｏ．）中で培養した。ポジティブウェルからの上清
を、ＬＴβＲ−Ｆｃ融合タンパク質に結合するがヒトＩｇＧには結合しない能力
についてＥＬＩＳＡにより試験した。ＬＴβＲ−Ｆｃ融合タンパク質に対する抗
体を産生するハイブリドーマを、３回の制限希釈によりクローニングした。大量
のｍＡｂを産生するために、１０⁷ハイブリドーマ細胞をＢａｌｂ／ｃマウスの
プリスタン処理した腹腔内に注入し、続いてｍＡｂを、アフィニティークロマト
グラフィーにより腹水から精製した。同様に、ＴＲ２−ＧＳＴ融合タンパク質を
用いて、ＴＲ２に対するモノクローナル抗体を産生させ、ＥＬＩＳＡアッセイに
よりスクリーニングした。

【０６６５】 （インビトロ増殖アッセイ） 細胞（５，０００細胞／ウェル）を、１０％ＦＢＳまたは１％ＦＢＳのいずれ
かの存在下のＩＭＥＭと共に、２４−マルチウェル組織培養プレート中に３連で
プレートした。３日、５日または７日目の生存細胞の数を、トリパンブルー排除
法により決定した。細胞を、この時間経過の間２日毎に新鮮な培地と交換した。

【０６６６】 ９６ウェルプレート中で細胞増殖のための可溶性テトラゾリウム／ホルマザン
（ＸＴＴ）アッセイを実施した。細胞（２，０００〜４，０００細胞／ウェル）
を１０％ＦＢＳまたは１％ＦＢＳを有するＩＭＥＭ培地中で増殖させた。４〜５
日の培養後、ＸＴＴ（１．０ｍｇ／ｍｌおよび１．５３ｍｇ／ｍｌのＰＭＳ）を
各ウェルに添加し、そして３７℃で４時間インキュベートした。４５０ｎｍでの
吸光度をＤｙｎａｔｅｃｈ Ｍｏｄｅｌ ＭＲ７００で測定した。

【０６６７】 （ＦＡＣＳ分析） 細胞をトリプシン処理または吸引で集め、そして１５００〜２０００ｒｐｍで
５分間、遠心分離した。細胞ペレットを再懸濁し、そして５ｍｌの氷冷ＰＢＳで
２回洗浄した。次いで、細胞を結合緩衝液（１０％ ＢＳＡ、２０ｍＭ ＨＥＰ
ＥＳ（ｐＨ７．２）、０．０２％ ＮａＮ₃および２５μｇ／ｍｌ正常ラットＩ
ｇを含むＨＢＳＳ）中で、３０分間、４℃において、１０μｇ／ｍｌのＦｌａｇ
−タグ化ＡＩＭ ＩＩタンパク質またはＡｂｓと共にインキュベートした。次い
で、細胞を洗浄し、そして記載のようにヤギ抗−マウスＩｇＧに結合体化させた
フィコエリスリン（ＰＥ）２０μｇ／ｍｌを用いて染色した。細胞表面結合に対
して競合させるために、可溶性ＬＴＲβＲ−Ｆｃ融合タンパク質、ＴＲ２−Ｆｃ
を１０μｇ／ｍｌで細胞に添加前に、３０分間、ＡＩＭ ＩＩとプレインキュベ
ートした。蛍光をＦＡＣスキャンフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃ
ｋｉｎｓｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）によって分析した。

【０６６８】 アポトーシスアッセイのために、細胞ペレットを１：１００希釈のＡｎｎｅｘ
ｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣ（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）お
よび５０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムを含む１×結合緩衝液（１０ｍＭ Ｈ
ＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ₂、１．８ｍＭ ＣａＣｌ₂）中で再懸濁し、４℃で１５分間インキュベー
トした。各細胞のＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣおよびヨウ化プロピジウムの蛍
光をフローサイトメトリー（Ｃｏｕｌｔｅｒ）で分析した。

【０６６９】 （腫瘍細胞のレトロウイルス形質導入） レトロウイルスベクターをＡＩＭ ＩＩ遺伝子で腫瘍細胞を安定に形質導入す
ために使用した。ＡＩＭ ＩＩをコードするプラスミドを構築するために、ＡＩ
Ｍ ＩＩ ｃＤＮＡを含む１．９ｋｄ Ｎｏｔ Ｉ／Ｓａｌ Ｉフラグメントを
親プラスミドｐＧ１ＳａｍＥＮに挿入した。このレトロウイルス骨格は、モロニ
ーマウス白血病ウイルスに由来し、そしてＡＩＭ ＩＩ遺伝子は、モロニー（Ｍ
ｏｌｉｎｅ）マウス白血病ウイルス由来の長末端反復の転写制御下であった。レ
トロウイルスパッケージング株の生成は、以前に記載された（Ｍａｒｋｏｗｉｔ
ｚら）。簡潔には、３０μｇのｐＧ１ＳａｍＥＮ−ＡＩＭ ＩＩ ＤＮＡを２×
１０⁵のＰＡ３１７両栄養性パッケージング株および３×１０⁵ＧＰ＋Ｅ８６エコ
トロピックパッケージング株の混合物をトランスフェクトするために使用した。
２週間の選択後、次いで、高力価Ｇ４１８耐性ＰＡ３１７クローンをパッケージ
ング株ＰＡ−ＡＩＭ ＩＩを再生成するために選択し、そして腫瘍細胞中への遺
伝子導入のため使用した。コントロールレトロウイルス産生株、ＰＡ−ｎｅｏも
また使用した。これらのパッケージング株を２０時間、増殖させ、レトロウイル
スの上清を収穫し、野生型、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１またはＭＣ−３８の７５％コ
ンフルエントなフラスコにそれぞれ添加した。ヒトＡＩＭ ＩＩをコードする組
換えレトロウイルスを用いた形質導入後、ＡＩＭ ＩＩ発現ＭＤＡ−ＭＢ−２３
１またはＭＣ−３８細胞をネオマイシンアナログ、Ｇ４１８で選択し、そしてＭ
ＤＡ−ＭＢ−２３１／ＡＩＭ ＩＩまたはＭＣ−３８／ＡＩＭ ＩＩをそれぞれ
設計した。これらの腫瘍細胞中でのＡＩＭ ＩＩ発現をノーザンブロット分析で
確認した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＡＩＭ ＩＩ、ベクターコントロール株、Ｍ
ＤＡ−ＭＢ−２３１／ｎｅｏ、ＭＣ−３８／ＡＩＭ ＩＩおよびベクターコント
ロール株、ＭＣ−３８／ｎｅｏを含む全ての安定なトランスフェクト体を増殖さ
せ、そして、１．５ｍｇ／ｍｌおよび０．３７５ｍｇ／ｍｌのそれぞれのＧ４１
８の存在下で維持した。

【０６７０】 （ジャーカット細胞の同時培養アッセイ） ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を６ウェル組織培養プレートにプレートし、そして
コンフルエントまで増殖させた。培地の除去および１×ＰＢＳでの単層の洗浄の
後、１×１０⁶ジャーカット細胞（非付着性）を単層または空のウェル上の１ｍ
ｌのＲＰＭＩ培地中にプレートした。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞単独を有するウ
ェル（ジャーカット細胞を重層することなしに）をさらなるコントロールとして
維持した。２４または４８時間の培養後、混合培養物の非付着性相をプレートの
穏やかな揺動後、プレートされた６ウェルから収集し、そしてトリパンブルー排
除を使用して生存度をアッセイした。アポトーシスの検出については、Ａｎｎｅ
ｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣ ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターを使用して、サン
プル当たり２０，０００細胞を測定した。

【０６７１】 （リンホカイン放出アッセイ） リンホカイン放出アッセイを以前に記載（Ｚｈａｉら）のように、ＡＩＭ Ｉ
ＩでヒトＰＢＬ反応性を検出するために実施した。簡潔には、ヒトＰＢＬ細胞を
抗−ＣＤ３ｍＡｂ（０．１μｇ／ｍｌ）およびｒｌＬ−２ ２０Ｕ/ｍｌならび
に種々の濃度のＡＩＭ ＩＩタンパク質の存在下で５日間インキュべートし、上
清を収集し、そしてＩＦＮγの分泌をＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐ
ｏｌｉｓ、ＭＮ）から購入したＥＬＩＳＡキットを使用して決定した。

【０６７２】 （腫瘍形成能研究） メス無胸腺症Ｎｃｒ−ｎｕヌードマウス（６週齢）をＦｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｃ
ａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｅｎｔｅｒ
、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（Ｆｒｅｄｅｒ
ｉｃｈ、ＭＤ）およびＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
（Ｒａｌｅｉｇｈ、ＮＣ）から得た。メスＣ５７ＢＬ／６マウス（６−７週齢）
をＨａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、
ＩＮ）から購入し、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（１×１０⁶）をメス無胸腺症の
ヌードマウスの乳房脂肪パッドに０日目に注射として同様に、ＭＣ−３８細胞を
Ｃ５８ＢＬ／６マウスの隣接領域に皮下（ｓ．ｃ）注射した。次いで、マウスを
耳にタグ化し、そして無作為化した。腫瘍サイズを盲目的な様式で週に２回カリ
パーを用いて垂直直径を測定することによって評価した。各処置群は、１０頭の
動物からなり、実験は、３回繰り返した。腫瘍の組織学的検査をＨ／Ｅ染色を使
用して実施した。

【０６７３】 （実施例６：ＢＩＡｃｏｒｅ分析によるＡＩＭ ＩＩ発現の検出） ＣＨＯ細胞をＡＩＭ ＩＩ−Ｆｌａｇ タグ発現ベクターまたはＢＡＰ−Ｆｌ
ａｇ（ネガティブコントロール）のいずれかでトランスフェクトした。トランス
フェクトの３日後、ＡＩＭ ＩＩ発現をＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＢＩＡｃｏｒｅ、
Ｉｎｃ．）を用いて測定し、これは、固定化ＡＩＭ ＩＩレセプター、リンホト
キシン−βレセプターに対する、タンパク質結合現象のリアルタイム測定を可能
とする（ＢＩＡｃｏｒｅセンサーグラムは、フローセルの表面で屈折率の変化に
よって結合を検出する）。リンホトキシン−βレセプター−Ｆｃ融合タンパク質
をＮ−エチル−Ｎ’−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド／Ｎ−ヒドロ
キシスクシンイミド化学を使用して、アミン基を介してＢＩＡｃｏｒｅフローセ
ルに共有結合的に固定化した。ＡＩＭ ＩＩ−Ｆｒａｇおよびネガティブコント
ロール（ＢＡＰ−Ｆｌａｇ）馴化無血清培地の種々の希釈をリンホトキシン−β
−レセプター−誘導体化フローセルに、５０μｌの総用量について５μｌ／分で
適用した。結合タンパク質の量をＨＢＳ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７
．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３．４ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ Ｓｕｒ
ｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０）でのフローセル洗浄後、決定した。このフローセル表
面を２０μｌの１０ｍＭ ＨＣｌでの洗浄による結合タンパク質の置換によって
再生した。

【０６７４】 リンホトキシン−β−レセプターに対する特異的結合をＡＩＭ ＩＩ−Ｆｌａ
ｇ培養物からの１０倍までの馴化培地の希釈で検出したが、ネガティブコントロ
ール（ＢＡＰ−Ｆｌａｇ）馴化培地について有意な結合を全く観察しなかった。
このことは、ＡＩＭ ＩＩ−Ｆｌａｇ結合がリンホトキシン−β−レセプターに
特異的であり、そしてこの融合タンパク質のＦｃ部分に対しては特異的でないこ
とを実証する。さらに、ＡＩＭ ＩＩ−Ｆｌａｇタンパク質による特異的レセプ
ター結合は、この結合がこの細胞によって分泌されるようなネイティブな構造物
を表すことを示す。従って、このＢＩＡｃｏｒｅに基づいたアッセイを馴化培地
および他の生物学的液体からのＡＩＭ ＩＩの発現を検出するために使用し得る
。さらに、純粋なＡＩＭ ＩＩタンパク質の公知量を使用することによって、こ
のアッセイをＡＩＭ ＩＩ濃度を決定するための定量的アッセイに開発し得る。

【０６７５】 （実施例７：活性化−誘導アポトーシスアッセイ） 活性化−誘導アポトーシスをＳｕｐＴ−１３ Ｔ白血病細胞を使用してアッセ
イし、そして細胞周期分析によって測定する。このアッセイを以下のように実施
する。ＳｕｐＴ−１３細胞を、対数増殖（約１×１０⁶）において、１０％ Ｆ
ＣＳを含むＲＰＭ Ｉ中で維持する。Ｓｕｐ−Ｔ１３細胞を０．５×１０⁶／ｍ
ｌ、１ｍｌ／ウェルで、２４ウェルプレートのウェルに播種する。ＡＩＭ ＩＩ
タンパク質（０．０１、０．１、１、１０、１００、１０００ｎｇ／ｍｌ）また
は緩衝液コントロールをこのウェルに添加し、そしてこの細胞を３７℃で２４時
間インキュベートする。別の２４ウェルプレートのウェルを抗−ＣＤ３抗体の存
在、または非存在で、ウェル中、０．５ｍｌ／ウェルの滅菌ろ過した０．０５Ｍ
炭酸水素塩緩衝液（ｐＨ９．５）中で１０μｇ／ｍｌの濃度の精製ＢＣ３ ｍ
Ａｂを、または緩衝液単独で、インキュベートすることによって調製した。この
プレートを４℃で一晩インキュベートする。抗体被覆プレートのウェルを４℃で
、滅菌ＰＢＳを用いて、３回洗浄する。ＡＩＭ ＩＩ処理Ｓｕｐ−Ｔ１３細胞を
抗体被覆ウェルに移し、そして３７℃で１８時間インキュベートする。アポトー
シスをヨウ化プロピジウムおよびフローサイトメトリーを使用する細胞周期分析
によって測定する。処理細胞の増殖を各処理ウェルの総量３００μｌを取り、そ
して９６ウェルプレートの３連ウェル（１００μｌ／ウェル）に対して、送達す
ることによって測定する。各ウェルに対して、２０μｌ／ウェルの³Ｈチミジン
（０．５μＣｉ／２０μｌ、２Ｃｉ／ｍＭ）を加え、そして３７℃で１８時間イ
ンキュベートする。細胞を収穫し、そしてこの細胞による³Ｈ−チミジンの取り
込みを計数する。この測定を使用し、他の方法で観察される場合、アポトーシス
に対する影響を確認する。このアッセイのためのポジティブコントロールは、抗
−ＣＤ３架橋単独である。さらに、抗−ｆａｓモノクローナル抗体（可溶性形態
−ＩｇＭ ｍＡｂ中で５００ｎｇ／ｍｌ）を使用して、この株における著明およ
び再現性のあるアポトーシスを実証している。このアッセイのネガティブコント
ロールは、培地または緩衝液単独である。また、別の抗−ＣＤ３ ｍＡＢ（ＯＫ
Ｔ３）での架橋は、効果のないことを示している。

【０６７６】 効果が細胞周期分析によって観察される場合、この細胞を当業者に周知の技術
である、フローサイトメトリーに対するまたはＡｎｎｅｘｉｎ Ｖでの、ＴＵＮ
ＥＬアッセイのためにさらに染色する。

【０６７７】 （実施例８：ＣＤ３−誘導増殖アッセイ） ＣＤ３−誘導増殖アッセイをＰＢＭＣ上で実施し、そして³Ｈ−チミジンの取
り込みによって測定する。このアッセイを以下のように実施する。９６ウェルプ
レートを１００μｌ／ウェルのＣＤ３に対するｍＡｂで（ＨＩＴ３ａ、Ｐｈａｒ
ｍｉｎｇｅｎ）、またはアイソタイプ−適合コントロール ｍＡｂ（Ｂ３３．１
）で一晩、４℃で被覆し（０．０５Ｍ 炭酸水素塩緩衝液（ｐＨ９．５）中の１
μｇ／ｍｌ）、次いで、ＰＢＳで３回洗浄する。ＰＢＭＣをヒト末梢血液からＦ
／Ｈ勾配遠心分離によって単離し、そして異なった濃度のＡＩＭ ＩＩタンパク
質の存在下で１０％ ＦＣＳおよびＰ／Ｓを含むＲＰＭＩ中でｍＡｂ被覆プレー
トの４連のウェル（５×１０⁴／ウェル）に添加する（総容量、２００μｌ）。
関連タンパク質の緩衝液単独および培地単独がコントロールである。４８時間、
３７℃で培養後、プレートを２分間、１０００ｒｐｍで遠心沈殿し、そして増殖
に対する効果が観察される場合、１００μｌの上清を除去し、そしてＩＬ−２（
または他のサイトカイン）の測定のために−２０℃で貯蔵した。ウェルを０．５
μＣｉの³Ｈ−チミジンを含む１００μｌの培地で補充し、そして３７℃で１８
〜２４時間培養する。ウェルを収穫し、そして³Ｈ−チミジンの取り込みを増殖
の測定として使用する。抗−ＣＤ３単独は、増殖のポジティブコントロールであ
る。ＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）もまた、増殖を増強するコントロールとして使
用する。Ｔ細胞の増殖を誘導しないコントロール抗体をＣＤ３−誘導増殖につい
てのネガティブコントロールとして使用し、そして培地または緩衝液をＡＩＭ
ＩＩタンパク質の効果ついてのネガティブコントロールとして使用する。

【０６７８】 （実施例９：ＭＨＣ クラスＩＩ、同時刺激分子および接着分子の発現、なら
びにヒト樹状細胞由来の単球の細胞分化へのＡＩＭ ＩＩの効果、） 樹状細胞を末梢血中で見られる増殖している前駆体の拡大により生成する：接
着性ＰＢＭＣまたは溶出した単球の画分をＧＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）およ
びＩＬ−４（２０ｎｇ／ｍｌ）を用いて７〜１０日間培養する。これらの樹状細
胞は、非成熟細胞の特徴的表現型を有している（ＣＤ１、ＣＤ８０、ＣＤ８６、
ＣＤ４０およびＭＨＣクラスＩＩ抗原の発現）。ＴＮＦ−αのような活性化因子
での処理は、表面表現型の迅速な変化を生じる（ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ、同
時刺激分子および接着分子の発現の上昇、ＦｃγＲＩＩの下方制御、ＣＤ８３の
上方制御）。これらの変化は、樹状細胞の抗原提示能力の上昇、および機能的成
熟と相関する。

【０６７９】 表面抗原のＦＡＣＳ分析を以下のように実施する。細胞を種々の濃度のＡＩＭ
−ＩＩ（０．１、１、１０、１００、１０００ｎｇ／ｍｌ）または陽性コントロ
ールとしてＬＰＳで１〜３日処理し、１％ＢＳＡおよび０．０２ｍＭアジ化ナト
リウムを含有するＰＢＳで洗浄し、次いで４℃で３０分間、１：２０希釈の適切
なＦＩＴＣ標識モノクローナル抗体またはＰＥ標識モノクローナル抗体を用いて
インキュベートする。さらなる洗浄後、標識した細胞をＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃ
ｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でフローサイトメトリーにより分析する。

【０６８０】 （サイトカインの産生への効果） 樹状細胞により産生されたサイトカイン、特にＩＬ−１２は、Ｔ細胞依存性の
免疫応答の開始において重要である。ＩＬ−１２は、Ｔｈ１ヘルパーＴ細胞免疫
応答の発生に強力に影響し、そして細胞傷害性Ｔ細胞の機能およびＮＫ細胞の機
能を誘導する。ＥＬＩＳＡは、以下のようにＩＬ−１２の放出を測定するために
用いられる。樹状細胞（１０⁶／ｍｌ）をＡＩＭ−ＩＩ（０．１、１、１０、１
００、１０００ｎｇ／ｍｌ）で２４時間処理する。ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）
を陽性コントロールとして細胞培養物に添加する。次いで、細胞培養物由来の上
清を採取し、そして市販のＥＬＩＳＡキットを用いてＩＬ−１２の含量について
分析する。キットに与えられた標準的なプロトコルを用いる。

【０６８１】 （ＭＨＣクラスＩＩ、同時刺激分子および接着分子の発現への効果） 細胞表面抗原の３つの主なファミリーは、単球上で同定され得る：接着分子、
抗原提示に関与する分子、およびＦｃレセプター。ＭＨＣクラスＩＩ抗原および
他の同時刺激分子（例えばＢ７およびＩＣＡＭ−１）の発現の調節は、単球の抗
原提示能力およびＴ細胞活性化を誘導する能力の変化を生じ得る。Ｆｃレセプタ
ーの発現上昇は、単球の細胞傷害活性、サイトカイン放出および貪食作用の改善
と相関し得る。

【０６８２】 ＦＡＣＳ分析を、以下のように表面抗原を試験するために用いる。単球を、種
々の濃度のＡＩＭ−ＩＩ（０．１、１、１０、１００、１０００ｎｇ／ｍｌ）ま
たはＬＰＳ（陽性コントロール）を用いて１〜５日処理し、１％ＢＳＡおよび０
．０２ｍＭアジ化ナトリウムを含有するＰＢＳで洗浄し、次いで４℃で３０分間
、１：２０希釈の適切なＦＩＴＣ標識モノクローナル抗体またはＰＥ標識モノク
ローナル抗体を用いてインキュベートする。さらなる洗浄後、標識した細胞をＦ
ＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でフローサイトメトリーに
より分析する。

【０６８３】 （単球生存への効果） ヒト末梢血単球は、血清または他の刺激物の非存在下で培養された場合、徐々
に生存率を減少する。それらの死亡は、内的に調節された過程（アポトーシス）
に起因する。ＴＮＦ−αのような活性化因子を培養物に添加することは、細胞生
存を劇的に改善し、そしてＤＮＡ断片化を防ぐ。

【０６８４】 ヨウ化プロピジウム染色を、以下のようにアポトーシスを測定するために用い
る。単球（１０⁷／ｍｌ）を、ＴＮＦ−α（１００ｎｇ／ｍｌ、陽性コントロー
ル）またはＡＩＭ−ＩＩ（０．１、１、１０、１００、１０００ｎｇ／ｍｌ）の
存在下または非存在下で２日間、ＤＭＥＭを入れたポリプロピレンチューブに懸
濁、培養する。細胞の生存率をヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色により評価する
。細胞を、最終濃度５μｇ／ｍｌのＰＩを含有するＰＢＳに２×１０⁶／ｍｌの
濃度で懸濁し、次いでＦＡＣＳｃａｎ分析の前に５分間室温でインキュベートす
る。ＰＩ取り込みは、この実験パラダイムにおけるＤＮＡ断片化と相関すること
が実証された。

【０６８５】 （サイトカイン放出への効果） 単球／マクロファージの重要な機能は、刺激後のサイトカインの放出を通じる
免疫系の他の細胞集団への調節活性である。ＩＬ−１β放出を測定するためのＥ
ＬＩＳＡを以下のように実行する。ヒト単球を４８ウェルプレートに１０⁶／ｍ
ｌで添加し、そして種々の濃度のＡＩＭ−ＩＩ（０．１、１、１０、１００、１
０００ｎｇ／ｍｌ）を１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳの存在または非存在で、添加す
る。２４時間のインキュベーション後、上清を採集し、そしてＥＬＩＳＡキット
によりサイトカインの存在についてアッセイする。キットに与えられた標準のプ
ロトコルを用いる。

【０６８６】 （実施例１０：Ｎ末端配列分析のための可溶性ＡＩＭ ＩＩのアフィニティー
精製） 以前のデータは、リンホトキシンβレセプター（ＬＴβＲ）−Ｆｃ融合タンパ
ク質で誘導体化されたＢＩＡｃｏｒｅチップがＡＩＭ ＩＩ（ａ．ａ．７４−２
４０）−Ｆｌａｇ融合タンパク質と特異的に結合し得たことを示した（実施例５
、第Ｅ節および図７Ａ参照のこと）。次いで、どの細胞株をＮ末端配列分析のた
めのさらなる精製のために用いるべきかを決定するために、ＬＴβＲ ＢＩＡｃ
ｏｒｅチップを用い、非Ｆｌａｇタグ化されたＡＩＭ ＩＩ安定トランスフェク
ト体の馴化培地からの可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質の発現を検出した。

【０６８７】 ＣＨＯ細胞をｃｋ−β８シグナルペプチドに融合したＡＩＭ ＩＩの細胞外領
域（アミノ酸６０〜２４０）からなる発現構築物（ｐＣ４ベクター）でトランス
フェクトした。クローンをメトトレキセート含有培地中での増殖により、高い発
現について選択した。ＬＴβＲ ＢＩＡｃｏｒｅチップへの結合の最高量を有す
るクローンをさらに増幅した。ＣＨＯ １１（高レベルＡＩＭ ＩＩ産生クロー
ン）からの馴化培地（２０ｍＬ）を得た。完全長ｃＤＮＡをコードする第２のＡ
ＩＭ ＩＩ構築物を、マウスのＭＣＡ−３８癌細胞にトランスフェクトし、そし
てＧ４１８を用いる選択に供した。馴化培地をこれらのトランスフェクトされた
ＭＣＡ−３８細胞から得た。

【０６８８】 安定なトランスフェクタント（ＣＨＯ １１またはＭＣＡ−３８細胞）由来の
馴化培地を濾過し、１０，０００×ｇで遠心分離し、次いで、ＭＣＩＦ−Ｆｃア
フィニティーカラム（コントロールカラム）に、その後、ＬＴβＲ−Ｆｃアフィ
ニティーカラム（０．２ｍＬのベッド容量）を通した。このカラムを０．００５
％の界面活性剤Ｐ−２０を含有する数ベッドカラム容量のＨＥＰＥＳ緩衝液化生
理食塩水で洗浄した。結合タンパク質を１０ｍＭのＨＣｌ（３×０．５ｍＬ画分
）で溶出し、そして直ちにＴＲＩＳ緩衝液で中和した。ＬＴβＲカラムから溶出
された画分は、ＬＴβＲ ＢＩＡｃｏｒｅチップへの結合を保持していたが、一
方、コントロールのＭＣＩＦ−Ｆｃカラムから溶出した画分は、結合に関して陰
性であった。溶出した画分をＳｐｅｄｖａｃ中で乾燥し、次いで２０μＬの水に
再懸濁した。溶出したタンパク質のアリコートを還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによ
り分析し、そして銀染色によって検出した。ＣＨＯ−１１およびＭＣＡ−３８細
胞株由来のＬＴβＲカラムに特異的に結合した約２５ｋＤａおよび２１ｋＤａの
バンドを検出した。残りの溶出物質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、そしてＮ末端配
列の分析のためにＰＶＤＦ膜上にブロットした。

【０６８９】 ＭＣＡ−３８細胞から精製されたＡＩＭ ＩＩ分子のＮ末端は、分子の推定細
胞外領域中の残基８３で開始していた（表３）。ＣＨＯ−１１由来のＡＩＭ Ｉ
Ｉの結果はまた、このタンパク質がＡＩＭ ＩＩタンパク質に対応することを確
認した；Ｎ末端は、３残基離れて始まる２つの配列（残基６０で開始するＡＩＭ
ＩＩの細胞外領域が続くｃｋ−β８シグナルペプチド内で始まる）を含んだ（
表３）。従って、ＡＩＭ ＩＩの天然のプロセス化形態は、残基８３〜２４０に
対応し、１７，２８４ダルトンの分子量を有するはずである。約２１ｋＤａの明
白な電気泳動の移動度は、いくつかの電気泳動種の存在により証明されるように
グリコシル化と一致している。同様にＣＨＯ−１１発現したｃｋ−β８／ＡＩＭ
ＩＩ融合タンパク質の約２５ｋＤａのみかけの分子量は、その配列から予想さ
れた分子量（２０，３６１）よりも大きかった。また、これも、タンパク質のグ
リコシル化に起因し得る（完全長ＡＩＭ ＩＩの残基１０４に１つのＮ−グリコ
シル化部位が存在する）。

【０６９０】

【表３】 ＢＩＡｃｏｒｅチップ上で固定されたＬＴβＲ−Ｆｃ 対 ＭＣＩＦ−Ｆｃへ
のＭＣＡ−３８ ＡＩＭ ＩＩ馴化培地の結合の特異性のセンサーグラムを図１
２に示す。馴化培地を、リンホトキシンβレセプターＦｃ融合タンパク質で誘導
体化されたＢＩＡｃｏｒｅ装置フローセル上で分析した。馴化培地（１００μＬ
）を５μＬ／分でチップに流し、そしてＨＢＳ緩衝液でも５μＬ／分で洗浄した
。示したデータは、固定されたレセプターに対するＡＩＭ ＩＩの結合後のプロ
ットの正味の結合（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）領域を示し、そして時間に対する相対質
量単位（ＲＵ）で測定される。結合条件は、拡散制限条件下（ｄｉｆｆｕｓｉｏ
ｎ−ｌｉｍｉｔｅｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）で高いレセプターチップ密度で実行
された。凡例：ＬＴβＲ−ＦｃおよびＭＣＩＦ−Ｆｃは、それぞれ、ＬＴβＲ−
ＦｃおよびＭＣＩＦ−Ｆｃを固定したＢＩＡｃｏｒｅのチップ表面からの結合デ
ータをいう。

【０６９１】 ＬＴβＲ−Ｆｃカラムから溶出したＡＩＭ ＩＩによるＬＴβＲ結合の決定を
図１３に示す。ＬＴβＲおよびＭＣＩＦとは、それぞれ、ＬＴβＲ−Ｆｃまたは
ＭＣＩＦ−Ｆｃを固定したＢＩＡｃｏｒｅのチップ表面からの結合データをいう
。ＭＣＡ３８細胞からの未希釈の馴化培地を、アフィニティーカラムの通過の前
（プレ：ｐｒｅ）、ならびに、ＭＣＩＦ−Ｆｃアフィニティーカラムの通過後（
ｐｏｓｔ−ＭＣＩＦ）およびＬＴβＲ−Ｆｃアフィニティーカラムの通過後（ｐ
ｏｓｔ−ＬＴβＲ）に分析した。ＬＴβＲ（Ｅ４−６）およびＭＣＩＦ−Ｆｃ（
Ｅ１−３）のアフィニティーカラムから溶出した画分（１ｍＬ）を３倍に希釈し
、そしてＬＴβＲ ＢＩＡｃｏｒｅのチップへの結合について試験した。

【０６９２】 （実施例１１：ラットのアジュバント誘導関節炎の処置におけるＡＩＭ ＩＩ
の効果） 慢性関節リウマチ（ＲＡ）を処置するためＡＩＭ ＩＩの使用の分析を、ラッ
トにおけるアジュバント誘導性関節炎モデル（ＡＩＡ）の使用を通じて実行する
。ＡＩＡは、十分に特徴付けられ、そして慢性関節リウマチの再現性のある動物
モデルであり、このことは、当業者に周知である（Ｐｅａｒｓｏｎら、Ａｎｎ．
Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．１５：３７９（１９５６））；Ｐｅａｒｓｏｎら、Ａｒｔ
ｈｒｉｔｉｓ Ｐｈｅｕｍ．２：４４０、（１９５９））。ＡＩＭ ＩＩは、脈
管形成における増加またはＲＡのこの動物モデルで観測された骨および軟骨の侵
入性パンヌスを維持する必要がある内皮細胞増殖中における増加を阻害するよう
に予期される。ＬｅｗｉｓラットおよびＢＢラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅ
ｒ Ｌａｂ，Ｒａｌｅｉｇｈ，Ｎ．Ｃ．およびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍ
ａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅ
ｒ，ＭＡから入手可能）を、これらの実験におけるアジュバント誘導性関節炎に
対する一般的かつ応答性の系統として使用する。

【０６９３】 関節炎状態の開始を、尾の基部中に０．１ｍｌのアジュバント（５ｍｇ／ｍｌ
）を皮内注射することによって誘導する。５〜６匹のラットの群は、アジュバン
トの注射の２０日後に、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ ＡＩＭ ＩＩまたはビヒクル
を関節内に受けた。この時点で、慢性関節炎は、最大レベルに到達し、そして慢
性のパンヌス形成が、始まった。慢性関節炎に対するＡＩＭ ＩＩの効果を、Ｔ
ａｕｒｏｇおよび共同研究者らにより本質的に記載されるように（Ｊ．Ｅｘｐ．
Ｍｅｄ．１６２：９６２、（１９８５））、アジュバントチャレンジ後の１５日
後の、各週に一度、放射線医学的に分析する。簡潔には、ラットは、エーテルま
たは抱水クロラールのいずれかで麻酔をして、そして両方の後肢を一緒にＸ線照
射するように配置する。Ｘ線フィルムを、骨膜反応、骨侵食、関節空間の狭まり
および破壊についての０〜３のスコアリングシステムを使用して、盲目的に試験
する。ビヒクルで処置したラットにおいて有意な量の関節損傷が存在する場合、
これららの動物を屠殺する。この時点で、これらの足を、組織損傷の相対度およ
びＡＩＭ ＩＩがこれらの関節に対して発揮した治療効果について組織学的に評
価する。

【０６９４】 最終的には、ＡＩＭ ＩＩ処置動物およびビヒクル処置動物は、体積変動記録
計（Ｐｌｅｔｈｙｓｍｏｍｅｔｅｒ）システムおよび体重を使用して後足容積を
評価するために１週間あたり２回臨床評価を受ける。

【０６９５】 （実施例１２：マウスにおけるコラーゲン誘導関節炎を処置する際のＡＩＭ
ＩＩの効果） 慢性関節リウマチ（ＲＡ）を処置するためのＡＩＭ ＩＩの使用の分析を、マ
ウスにおけるコラーゲン誘導自己免疫関節炎（ＣＩＡ）の使用を通じて実行する
。ＣＩＡは、十分に特徴付けられ、そして慢性関節リウマチの再現性のある別の
動物モデルであり、このことは、当業者に周知である（Ｃｏｕｒｔｅｎａｙら、
Ｎａｔｕｒｅ ２８３：６６６（１９８０）；Ｗｏｏｌｅｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍ
ｅｄ．１５４：６８８（１９８１）；Ｈｏｌｍｄａｈｌら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒ
ｅｖｉｅｗｓ １１８：１９３（１９９０））。ＡＩＭ ＩＩは、アポトーシス
を誘導し、そして関節炎リウマチおよびＲＡのこの自己免疫動物モデルにおいて
観測された骨および軟骨に侵入性パンヌスを形成する必要がある滑膜細胞増殖を
阻害すると予期される。

【０６９６】 ＤＢＡ／１ Ｌａｃ Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂ（Ｂａｒ Ｈａｒｂ
ｏｒ，ＭＥ）から入手可能）を、これらの実験におけるコラーゲン誘導関節炎の
最も普遍的な感受性鎖として使用する。

【０６９７】 関節炎状態の開始を、尾の基部中に０．１ｍｌの完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバン
ト中のウシ型ＩＩコラーゲン（１ｍｇ／ｍｌ）を皮内注射することによって誘導
する。３週間後、動物を関節炎の進行を加速するために４０μｇのＬＰＳで注射
する。１０匹のマウスの群は、ＬＰＳの注射の７〜１５日後に、０．１〜１ｍｇ
／ｋｇ ＡＩＭ ＩＩまたはビヒクルを皮内にまたは関節内に受けた。この時点
で、慢性炎症は、最大レベルに到達すると予期され、そして慢性パンヌス形成が
まさに始まった。慢性関節炎に対するＡＩＭ ＩＩの効果を、以下のスコア：０
＝正常、０．５＝増大した数、１＝全足の増大、２＝変形および３＝強直症を用
いて、モニターしかつ分析する。特異的な量の強直症が、ビヒクル処置したラッ
トの足において生じると決定する場合、動物は、犠牲にされ、そしれ足は、パン
ヌス形成、軟骨および骨の破壊の相対度について組織学的に評価され、そしてこ
のために、ＡＩＭ ＩＩは、これらの結合に関して誘発した。

【０６９８】 （実施例１３：ＴＲ６は、ＡＩＭ ＩＩ（ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ−Ｌ）−媒介
アポトーシスを抑制する） ＴＲ６（ＤｃＲ３）は、腫瘍ネクローシス要因レセプター（ＴＮＦＲ）ファミ
リーの新規のメンバーである。以下の研究は、ＡＩＭ ＩＩがＴＲ６についての
リガンドであることを示す。

【０６９９】 （背景） 腫瘍ネクローシス要因（ＴＮＦ）ファミリーのメンバーは、多種多様な生物学
的活性の調節（例えば、細胞増殖、分化、細胞生存、細胞死、サイトカイン生成
、リンパ球同時刺激、免疫グロブリン分泌、およびアイソタイプ転換の調節）（
Ａｒｍｉｔａｇｅ，Ｒ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：４０７−
４１３（１９９４）；Ｔｅｗａｒｉ，Ｍ．およびＤｉｘｉｔ，Ｖ．Ｍ．，Ｃｕｒ
ｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．６：３９−４４（１９９６）に関する。こ
のファミリーにおけるレセプターは、約３０〜４０のアミノ酸の、複数のシステ
インに富む繰り返しからなるそれらの細胞外ドメインにおいて、共通の構造的モ
チーフを有する（Ｇｒｕｓｓ，Ｈ−Ｊ．およびＤｏｗｅｒ，Ｓ．Ｋ．，Ｂｌｏｏ
ｄ ８５：３３７８−３４０４（１９９５））。ＴＮＦＲ１、ＣＤ９５／Ｆａｓ
／ＡＰＯ−１、ＤＲ３／ＴＲＡＭＰ／ＡＰＯ−３、ＤＲ４／ＴＲＡＩＬ−Ｒ１／
ＡＰＯ−２、ＤＲ５／ＴＲＡＩＬ−Ｒ２およびＤＲ６レセプターは、死ドメイン
と呼ばれる３０〜４０アミノ酸の保存された細胞内モチーフを含み、アポトーシ
スのシグナル伝達通路の活性化に関し、他のメンバーは、細胞内ドメインの低配
列同一性を含み、転写因子ＮＦ−κＢおよびＡＰ−１を刺激する（Ａｒｍｉｔａ
ｇｅ，Ｒ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：４０７−４１３（１９
９４）；Ｔｅｗａｒｉ，Ｍ．およびＤｉｘｉｔ，Ｖ．Ｍ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ
．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．６：３９−４４（１９９６）；Ｇｒｕｓｓ，Ｈ．−Ｊ．
およびＤｏｗｅｒ，Ｓ．Ｋ．，Ｂｌｏｏｄ ８５：３３７８−３４０４（１９９
５））。

【０７００】 大部分のＴＮＦレセプターは、機能的細胞質ドメインを含み、そしてそれらと
しては、ＴＮＦＲ１（Ｌｏｅｔｓｈｅｒ，Ｈ．ら、Ｃｅｌｌ ６１：３５１−３
５６（１９９０）；Ｓｃｈａｌｌ，Ｔ．Ｊ．ら、Ｃｅｌｌ ６１：３６１−３７
０（１９９０））、ＴＮＦＲ２（Ｓｍｉｔｈ，Ｃ．Ａ．ら， Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４８：１０１９−１０２３（１９９０）），リンホトキシンβレセプター（Ｌ
ＴβＲ）（Ｂａｅｎｓ， Ｍ．ら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １６：２１４−２１８（
１９９３））、４−ＩＢＢ（Ｋｗｏｎ，Ｂ．Ｓ．およびＷｅｉｓｓｍａｎ，Ｓ．
Ｍ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：１９６３−
１９６７（１９８９））、ＨＶＥＭ／ＴＲ２／ＡＴＡＲ（Ｋｗｏｎ，Ｂ．Ｓ．ら
、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１４２７２−１４２７６（１９９７）；Ｍ
ｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，Ｒ．Ｉ．ら、Ｃｅｌｌ ８７：４２７−４３６（１９９６
）；Ｈｓｕ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１３４７１−１３４７
４（１９９７））、ＮＧＦＲ（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｄ．ら、Ｃｅｌｌ４７：５４５
−５５４（１９８６））、ＣＤ２７（Ｖａｎ Ｌｉｅｒ， Ｒ． Ａ．ら、Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：１５８９−１５９６（１９８７））、ＣＤ３０（Ｄｕ
ｒｋｏｒｐ，Ｈ．ら、Ｃｅｌｌ ６８：４２１−４２７（１９９２））、ＣＤ４
０（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ，Ｊ．ら、Ｃｅｌｌ ６８：４２１−４２７（１９９
４））、ＯＸ４０（Ｍａｌｌｅｔｔ，Ｓ．ら、ＥＭＢＯ Ｊ．９：１０６３−１
０６８（１９９０））、Ｆａｓ（Ｉｔｏｈ，Ｎ．ら、Ｃｅｌｌ ６６：２３３−
２４３（１９９１））、ＤＲ３／ＴＲＡＭＰ（Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎ，Ａ．Ｍ．
ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：９９０−９９２（１９９６））、ＤＲ４／ＴＲＡ
ＩＬ−ＲＩ（Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎ，Ａ．Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：９
９０−９９２（１９９６））、ＤＲ５／ＴＲＡＩＬ−Ｒ２ （Ｐａｎ，Ｇ．ら、
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７：８１５−８１８（１９９７））、およびＲＡＮＫ（Ａ
ｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３９０：１７５−１７９（１９９
７））が挙げれる。ＴＮＦＲスーパーファミリーのいくつかのメンバー（例えば
、オステオプロテゲリン（ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）（ＯＰＧ））（Ｓ
ｉｍｍｏｎｅｔ，Ｗ．Ｓ．ら、Ｃｅｌｌ ８９：３０９−３１９（１９９７））
は、細胞質ドメインを有さず、そして分泌されないか、または糖リン脂質テイル
（例えば、ＴＲＩＤ／ＤｃＲ１／ＴＲＡＩＬ−Ｒ３（Ｄｅｇｌｉ−Ｅｓｐｏｓｔ
ｉ，Ｍ．Ａ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：１１６５−１１７０（１９９７
）；Ｓｈｅｒｉｄａｎ，Ｊ．Ｐ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７：８１８−８２１
（１９９７））を介して膜に結合される。可溶性ＴＮＦＲ（例えば、ＳＦＶ−Ｔ
２（Ｓｍｉｔｈ，Ｃ．Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：１０１９−１０２３（
１９９０））、Ｖａ５３（Ｈｏｗａｄ，Ｓ．Ｔ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８０
：６３３−６４７（１９９１）ら、Ｇ４ＲＧ（Ｈｕ，Ｆ．Ｑ．ら、Ｖｉｒｏｌｏ
ｇｙ ２０４：３４３−３５６（１９９４））、およびｃｒｍＢ（Ｇｒｕｓｓ，
Ｈ．−Ｊ．＆Ｄｏｗｅｒ，Ｓ．Ｋ．，Ｂｌｏｏｄ ８５：３３７８−３４０４（
１９９５））をコードするウイルス性オープンリーディングフレームはまた、同
定されてきた。

【０７０１】 発現された配列タグ（ＥＳＴ）データベースを検索することにより、ＴＮＦＲ
スーパーファミリーの新規のメンバーは、同定され、ＴＲ６と命名され、そして
ＡＩＭ ＩＩ（ＬＩＧＨＴとしてもいわれる）およびＦａｓＬ／ＣＤ９５Ｌに対
する可溶性の同起源のリガンドとして特徴付けられた。ＡＩＭＩＩ（ＬＩＧＨＴ
）およびＦａｓＬは、アポトーシスを媒介し、このアポトーシスは、細胞死の最
も共通の生理学的形態であり、そして胚進展、組織再構築、免疫調節および腫瘍
退化の間、生じる。

【０７０２】 ＡＩＭ ＩＩ（ＬｉＧＨＴ）は、活性化Ｔリンパ球およびマクロファージにお
いて高度に誘導される。ＡＩＭ ＩＩ（ＬＩＧＨＴ）は、ＨＶＥＭ／ＴＲ２およ
びＬＴβＲ（Ｍａｕｒｉ，Ｄ．Ｎ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ８：２１−３０（１
９９８））についての細胞リガンドとして特徴付けられた。ＨＶＥＭ／ＴＲ２は
、ヒトＴリンパ芽球への単純疱疹ウイルス型Ｉ（ＨＳＶ−１）の侵入のためのレ
セプターである。ＨＶＥＭ／ＴＲ２−Ｆｃの可溶性形態およびＨＶＥＭ／ＴＲ２
に対する抗体は、混合されたリンパ球反応を阻害するように示され、Ｔリンパ球
増幅におけるこのレセプターまたはそのリガンドのための役目を示唆する（Ｋｗ
ｏｎ，Ｂ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１４２７２−１４２７６
（１９９７）；Ｍａｕｒｉ，Ｄ．Ｎ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ８：２１−３０（
１９９８）；Ｈａｒｒｏｐ，Ｊ．Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：１７８
６−１７９４（１９９８））。ＬＴβＲ発現のレベルは、上皮細胞において顕著
であるが、ＴおよびＢリンパ球において不在である。ＬＴβＲを介するシグナル
伝達は、いくつかの線癌における細胞死を誘発する（Ｂｒｏｗｎｉｎｇ，Ｊ．Ｌ
ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：８６７−８７８（１９９６））。活性化リン
パ球によって産生されたＡＩＭ ＩＩ（ＬＩＧＨＴ）は、ＨＶＥＭ／ＴＲ２のみ
を発現する造血性の細胞から免疫調節を引き起こし得、そして腫瘍細胞のアポト
ーシスを誘導し得、これは、ＬＴβＲおよびＨＶＥｍ／ＴＲ２レセプターの両方
を発現する（Ｚｈａｉ，Ｙ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０２：１１４
２−１１５２(１９９８）；Ｈａｒｒｏｐ，Ｊ．Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２７３：２７５４８−２７５５６（１９９８））。

【０７０３】 ＦａｓＬは、細胞毒性のＴリンパ球およびナチュラルキラー細胞の主要なエフ
ェクターの１つである。リンパ球の活性化誘導細胞死における、末梢耐性の確立
にも関する。さらに、非リンパ系の細胞および腫瘍細胞におけるＦａｓＬの発現
は、Ｆａｓ感受性リンパ球の侵入を予防することにより、組織の免疫特権の維持
に寄与する（Ｎａｇａｔａ，Ｓ．，Ｃｅｌｌ ８８：３５５−３６５（１９９７
））。ＦａｓＬはまた、ヒト細胞の表面から促進され、そして減少される（Ｓｃ
ｈｎｅｉｄｅｒ，Ｐ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：１２０５−１２１３（
１９９８））。

【０７０４】 以下の実験は、ＴＲ６（ＤｃＲ３）である、ＴＮＦＲのスーパーファミリーの
新規のメンバーが、ＡＩＭ ＩＩ（ＬＩＧＨＴ）およびＦａｓＬに結合すること
を実証する。従って、ＴＲ６（ＤｃＲ３）は、ＡＩＭ ＩＩとそのレセプターと
の相互作用をブロックすることにより、ＡＩＭ ＩＩ（ＬＩＧＨＴ）誘導腫瘍細
胞死におけるインヒビターとして作用するように予期される。

【０７０５】 （ＴＮＦＲスーパーファミリーの新規なメンバーの同定およびクローニング） ＥＳＴ ｃＤＮＡデータベース（６００より多くの異なるｃＤＮＡライブラリ
ーから得た）を、ＢＬＡＳＴＮおよびＴＢＬＡＳＴＮアルゴリズムを用いて、Ｔ
ＮＦＲスーパーファミリーのシステインに富むモチーフとの配列相同性について
スクリーニングした。アミノ酸配列が、ＴＮＦＲ−ＩＩに対する特異的な相同性
を示す同一なオープンリーディングフレームを含む３つのＥＳＴクローンを、ヒ
ト正常前立腺腫瘍および膵臓腫瘍のｃＤＮＡライブラリーから同定した。インタ
クトなＮ末端シグナルペプチドをコードする全長ＴＲ６ｃＤＮＡクローンを、ヒ
ト正常前立腺ライブラリーから得た。

【０７０６】 （ＲＴ−ＰＣＲ分析） ＲＴ−ＰＣＲ分析について、全ＲＮＡを、ＰＭＡ／イオノマイシンまたはＬＰ
Ｓを用いる刺激の前および後に、Ｔｒｉｚｏｌ（ＧＩＢＣＯ）を用いて、種々の
ヒト細胞株から単離した。ＲＮＡを、逆転写によりｃＤＮＡに転換し、そしてＰ
ＣＲによって３５サイクル増幅した。ＴＲ６フラグメントの増幅に使用されたプ
ライマーは、ＴＲ６の配列に従う。βアクチンを、ＲＮＡ完全性のための内部コ
ントロールとして使用した。ＰＣＲ産物を、２％アガロースゲルにかけ、エチジ
ウムブロマイドで染色し、そしてＵＶ照射により視覚化した。

【０７０７】 （組換えタンパク質産生および精製） 組換えＴＲ６タンパク質を、Ｃ末端でヘキサヒスチジンを用いて産生した。全
ＴＲ６タンパク質をコードするＴＲ６−（Ｈｉｓ）を、ＰＣＲによって増幅した
。正しく配向されたクローニングについて、順方向プライマー（５’−ＡＧＡＣ
ＣＣＡＡＧＣＴＴＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＣＡＴＧ−３’）（配列
番号６０）の５’末端におけるＨｉｎｄＩＩＩ部位および逆方向プライマー（５
’−ＡＧＡＣＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＡＣＡＧＧＧＡ
ＧＧＡＡＧＣＧＣＴＣ−３’）（配列番号６１）の５’末端におけるＢａｍＨｉ
部位を、作製した。増幅されたフラグメントを、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩで
切断し、そして哺乳動物発現ベクター（ｐＣＥＰ４）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
にクローニングした。ＴＲ−６（Ｈｉｓ）／ｐＣＥＰ４プラスミドを、組換えＴ
Ｒ−６（Ｈｉｓ）を産生するために、ＨＥＫ ２９３ ＥＢＮＡ細胞に安定にト
ランスフェクトした。ＴＲ６−（Ｈｉｓ）／ｐＣＥＰ４をトランスフェクトされ
た細胞由来の無血清培養培地を、Ｎｉカラム（Ｎｏｖａｇｅｎ）を通過させた。
カラム溶出液を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより画分化し、そしてＴＲ６−（Ｈｉｓ）
を、抗ポリ（Ｈｉｓ）₆抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いてウエスタンブロット分析に
より検出した。

【０７０８】 ＨＶＥＭ／ＴＲ２−Ｆｃ、ＬＴβＲ−ＦｃおよびＦｌａｇタグ化可溶性ＡＩＭ ＩＩ（ｓＡＩＭ ＩＩ、ｓＬＩＧＨＴ）融合タンパク質の産生は、以前に記載
された（Ｚｈａｉ，Ｙ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０２：１１４２−
１１５１（１９９８））。Ｆｃ融合タンパク質を含有する上清を、濾過し、プロ
テイン−Ｇセファロースビーズ上にトラップした。Ｆｌａｇタグ化ｓＡＩＭ Ｉ
Ｉ（ｓＬＩＧＨＴ）タンパク質を、抗フラグｍＡｂアフィニティーカラムを用い
て精製した。

【０７０９】 （免疫沈降） ＴＲ６−（Ｈｉｓ）を、４℃にて結合性緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．
１％のＮＰ−４０、０．２５％のゼラチン、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４
）中のＴＮＦスーパーファミリーの種々のＦｌａｇタグ化リガンドおよび抗Ｆｌ
ａｇアガロースと共に一晩インキュベートし、次いで沈殿させた。結合体化タン
パク質を、１２．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより溶解させ、そしてＨＲＰ−結合
化抗ポリ（Ｈｉｓ）₆または抗ヒトＩｇＧ１抗体を用いるウエスタンブロットに
より検出した。

【０７１０】 （細胞結合アッセイ） 細胞結合アッセイのために、ＨＥＫ ２９３ ＥＢＮＡ細胞を、ＡＩＭ ＩＩ
（ＬＩＧＨＴ）ｃＤＮＡのｐＣＥＰ／全配列またはｐＣＥＰ４ベクターのみを用
いるリン酸カルシウム方法を用いて安定にトランスフェクトした。Ｈｙｇｒｏｍ
ｙｃｉｎＢを用いる選択の後、細胞を、ＰＢＳ中の１ｍＭ ＥＤＴＡを用いて収
集し、そしてＴＲ６−（Ｈｉｓ）、ＨＶＥＭ／ＴＲ２−Ｆｃ、またはＬＴβＲ−
Ｆｃと共に氷上で２０分間インキュベートした。Ｆｃ融合タンパク質を検出する
ために、細胞を、ＦＩＦＴ結合体合ヤギ抗ヒトＩｇＧで染色した。ＴＲ６の結合
を検出するために、細胞を、抗ポリ（Ｈｉｓ）₆およびＦＩＴＣ結合体化ヤギ抗
マウスＩｇＧを用いて連続的に染色した。細胞を、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏ
ｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により分析した。

【０７１１】 （細胞毒性アッセイ） ＨＴ２９細胞を用いる細胞毒性アッセイを、以前に記載された（Ｂｒｏｗｎｉ
ｎｇ，Ｊ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：８６７−８７８（１９９６）
）のように行った。手短には、５０００ ＨＴ２９細胞を、１％ＦＢＳ、ＤＭＥ
Ｍを用いて９６−ウェルプレートに播種し、そしてｓＡＩＭ ＩＩ（ｓＬＩＧＨ
Ｔ）（１０ｎｇ／ｍｌ）および１０ユニット／ｍｌのヒト組換えインターフェロ
ン−γ（ＩＦＮ−γ）を用いて処理した。ＴＲ６−（Ｈｉｓ）の連続的な希釈液
を、４通りにマイクロタイターウェルに添加した。ＩＦＮ−γおよびｓＡＩＭ
ＩＩ（ｓＬＩＧＨＴ）で処置した細胞を、種々の量のＴＲ６−（Ｈｉｓ）をと供
に４日間インキュベートし、その後［³Ｈ］チミジンを添加して６時間培養した
。細胞を収集し、そしてチミジンの組込みを、液体シンチレーションカウンター
を用いて決定した。

【０７１２】 （結果および考察） （ＴＲ６は、ＴＮＦＲスーパーファミリーの新規のメンバーである） ＴＲ６を、ＥＳＴデータベースを検索することにより同定した。同一性オープ
ンリーディングフレームを含む３つのクローンを、ヒト正常前立腺および膵臓腫
瘍のｃＤＮＡライブラリーから同定した。インタクトなＮ末端シグナルペプチド
をコードする全長ＴＲ６ ｃＤＮＡを、ヒト正常前立腺ライブラリーから得た。
ＴＲ６のオープンリーディングフレームは、３００のアミノ酸をコードする。成
熟ＴＲ６のＮ末端アミノ酸配列を決定するために、ヘキサヒスチジンタグ化ＴＲ
６を、哺乳動物細胞発現系において発現させ、そしてＮ末端アミノ酸配列を、ペ
プチド配列決定によって決定した。プロセシングされた成熟ＴＲ６−（Ｈｉｓ）
のＮ末端配列は、アミノ酸３０から開始し、最初の２９アミノ酸は、シグナル配
列を構成することを示す（図１４Ａ）。従って、ＴＲ６の成熟タンパク質は、貫
通膜領域を有さない２７１のアミノ酸で構成された。ＴＲ６中に１つの潜在的な
Ｎ結合グリコシル化部位（Ａｓｎ１７３）がある。（ＯＰＧ）（Ｓｉｍｍｏｎｅ
ｔ，Ｗ．Ｓ．ら、Ｃｅｌｌ ８９：３０９−３１９（１９９７））のように、こ
の予想したタンパク質は、可溶性であり、分泌タンパク質であり、そして哺乳動
物細胞中で発現された組換えＴＲ６は、ポリアクリルアミドゲル上で見積もった
通りに約４０ｋＤであった。図１４Ｂは、ＴＮＦＲ−Ｉ、ＴＮＦＲ−ＩＩ、４−
１ＢＢ、ＴＲ２／ＨＶＥＭ、ＬＴβＲ、ＴＲ１／ＯＰＧおよびＴＲ６の中で整合
された潜在的なシステインに富むモチーフを示す。ＴＲ６は、２つの完全なシス
テインに富むモチーフおよび２つの不完全なシステインに富むモチーフを含み、
そしてそのアミノ酸配列は、ＴＲ１／ＯＰＧアミノ酸配列に著しく類似していた
。ＴＲ６は、ＯＰＧおよびＴＮＦＲ−ＩＩと約３０％の配列相同性を有する。

【０７１３】 （ｍＲＮＡ発現） ヒトの複数組織におけるＴＲ６ ｍＲＮＡの発現を、ノザンブロットハイブリ
ダイゼーションによって分析した。ノザンブロット分析は、ＴＲ６ ｍＲＮＡが
、約１．３ｋｂ長であり、そして肺組織および結腸直腸線癌細胞株ＳＷ４８０に
おいて優性的に発現される。ＲＴ−ＰＣＲ分析を、種々の細胞株におけるＴＲ６
の発現パターンを決定するために実行した。そしてこの発現を、刺激されたジャ
ーカットＴ白血病細胞中の活性化シグナル上で誘導した。興味深いことに、ＴＲ
６ｍＲＮＡを、内皮細胞株（ＨＵＶＥＣ）において高レベルで構成的に発現した
。

【０７１４】 （ＴＲ６についてのリガンドの同定） ＴＲ６についてのリガンドを同定するために、ＴＮＦリガンドファミリーメン
バーの幾らかのＦｌａｇタグ化可溶性タンパク質を、免疫的沈殿によって組換え
ＴＲ６−（Ｈｉｓ）タンパク質に結合体化するためにスクリーニングした。ＴＲ
６−（Ｈｉｓ）は、ＡＩＭ ＩＩ（ＬＩＧＨＴ）−Ｆｌａｇおよび試験したＦｌ
ａｇタグ化可溶性ＴＮＦリガンドメンバー間のＦａｓＬ−フラグ（すなわち、Ｔ
ＲＡＮＣＥ、ＴＬ−３、ＴＬ−６、ＴＬ−７、４−１ＢＢＬ、ＡＩＭ ＩＩおよ
びＦａｓＬ）に選択的に結合した。この結果は、ＴＲ６が少なくとも２つのリガ
ンド、ＡＩＭ ＩＩ（ＬＩＧＨＴ）およびＦａｓＬに結合することを示す。ＡＩ
Ｍ ＩＩ（ＬＩＧＨＴ）は、ＦａｓＬ（３１％）のＣ末端レセプター結合ドメイ
ンと特異的な配列相同性を示すが、ｓＡＩＭ ＩＩ（ｓＬＩＧＨＴ）は、Ｆａｓ
に結合し得ない（Ｍａｕｒｉ，Ｄ．Ｎ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ８：２１−３０
（１９９８）；Ｚｈａｉ，Ｙ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０２：１１
４２−１１５１（１９９８））。それらは、ＴＲ６結合について類似の結合エピ
トープを有し得る。

【０７１５】 以前に、ＺｈａｉおよびＨａｒｒｏｐ（Ｚｈａｉ，Ｙ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉ
ｎｖｅｓｔ．１０２：１１４２−１１５１（１９９８）；Ｈａｒｒｏｐ，Ｊ．Ａ
．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２７５４８−２７５５６（１９９８）
）は、ＡＩＭ ＩＩ（ＬＩＧＨＴ）の生物学的機能およびＨＶＥＭ／ＴＲ２およ
び／またはＬＴβＲについてのリガンドとしての作用のその可能な機構を報告し
ている。ＡＩＭ ＩＩ（ＬＩＧＨＴ）は、活性化Ｔ細胞中で発現される。血清の
餓死またはＩＦＮ−γの付加と関連して、ＡＩＭ ＩＩ（ＬＩＧＨＴ）は、腫瘍
細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＨＴ２９中の細胞増殖を示す。

【０７１６】 ＴＲ６が、ＨＶＥＭ／ＴＲ２またはＬＴβＲと相互作用し得るＡＩＭ ＩＩ（
ＬＩＧＨＴ）に対するインヒビターとして作用するか否かを決定するために、Ａ
ＩＭ ＩＩ（ＬＩＧＨＴ）−ＨＥＶＥＮ／ＴＲ２相互作用における競合的なイン
ヒビターとしてＴＲ６−（Ｈｉｓ）使用した。ＡＩＭ ＩＩ（ＬＩＧＨＴ）をＴ
Ｒ６−（Ｈｉｓ）の存在下でＨＶＥＭ／ＴＲ２−Ｆｃを用いて免疫沈降した場合
、ＡＩＭ ＩＩ（ＬＩＧＨＴ）に結合するＨＶＥＭ／ＴＲ２−Ｆｃは、ＴＲ６−
（Ｈｉｓ）により競合的に減少するが、ＡＩＭ ＩＩ（ＬＩＧＨＴ）に結合する
ＴＲ６−（Ｈｉｓ）は、ＨＶＥＭ／ＴＲ２−Ｆｃにより変化しなかった。さらに
、ＨＶＥＭ／ＴＲ２−Ｆｃ（６ｎＭ）またはＬＴβＲ（６ｎＭ）の結合体化は、
免疫沈降アッセイにおける２０ｎＭのＴＲ６−（Ｈｉｓ）タンパク質によって完
全に阻害された。これらの結果は、ＴＲ６が、ＨＶＥＭ／ＴＲ２およびＬＴβＲ
を通してＡＩＭ ＩＩ（ＬＩＧＨＴ）機能の強力なインヒビターとして作用し得
るという意思を支持する。

【０７１７】 （ＴＲ６−（Ｈｉｓ）のＡＩＭ ＩＩ（ＬＩＧＨＴ）でトランスフェクトされ
た細胞への結合） ＴＲ６が、細胞表面膜上で発現されたＡＩＭ ＩＩ（ＬＩＧＨＴ）に結合する
か否かを決定するために、結合アッセイを、ＡＩＭ ＩＩ（ＬＩＧＨＴ）でトラ
ンスフェクトされたＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞を用いて、フローサイトメトリー
により実行した。ＡＩＭ ＩＩ（ＬＩＧＨＴ）ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞を、Ｔ
Ｒ６−（Ｈｉｓ）ならびにＨＶＥＭ／ＴＲ２−Ｆｃ、ＬＴβＲ−Ｆｃによって有
意に染色した。任意の融合タンパク質を有するｐＣＥＰ４ベクターでトランスフ
ェクトされたＨＥＫ ２９３ ＥＢＮＡ細胞において、結合を検出しなかった（
図１５Ａ〜１５Ｃ）。さらに、コントロール同位体は、ＡＩＭ ＩＩ（ＬＩＧＨ
Ｔ）でトランスフェクトされたＨＥＫ ２９３ ＥＢＮＡ細胞に結合せず、そし
て上記の融合タンパク質のいずれも、ベクターでトランスフェクトされた細胞に
結合せず、これらの結合の特異性を確認した。これらの結合は、ＴＲ６が、ＡＩ
Ｍ ＩＩ（ＬＩＧＨＴ）の可溶性形態および膜結合形態の両方の形態に結合し得
ることを示す。

【０７１８】 （ＴＲ６は、ＨＴ２９細胞に対するＡＩＭ ＩＩ（ＬＩＧＨＴ）誘導体化細胞
毒性を阻害する） Ｂｒｏｗｎｉｎｇら、（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：８６７−８７８（１９
９６））は、Ｆａｓ活性化が、迅速な細胞死へ導く（１２〜２４時間）一方で、
ＬＴβＲが、結腸直腸線癌細胞株（ＨＴ２９）についてのアポトーシスの誘導の
際に２〜３日かかることを示している。Ｚｈａｉ，Ｙ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎ
ｖｅｓｔ．１０２：１１４２〜１１５１（１９９８）およびＭａｕｒｉ，Ｄ．Ｎ
．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ８：２１−３０（１９９８）はまた、ＬＴβＲおよび
ＨＶＥＭ／ＴＲ２の両方を発現する細胞の死を導くが、ＬＴβＲまたはＨＶＥＭ
／ＴＲ２レセプターのみを発現する細胞の死を導かないことを報告した。ＨＶＥ
Ｍ／ＴＲ２およびＬＴβＲの両方は、ＨＴ２９細胞のＡＩＭ ＩＩ（ＬＩＧＨＴ
）媒介死滅に協同的に関する（Ｚｈａｉ，Ｙ．ら、前出）。

【０７１９】 ＴＲ６の結合体化が、ＡＩＭ ＩＩ（ＬＩＧＨＴ）媒介細胞毒性を阻害するか
否かを決定するために、ＨＴ２９細胞を、２００ｎｇ／ｍｌのＬＴβＲ−Ｆｃま
たはＴＲ６−（Ｈｉｓ）の存在化で１０ｎｇ／ｍｌのｓＡＩＭ ＩＩ（ｓＬＩＧ
ＨＴ）およびＩＦＮ−γ（１０Ｕ／ｍｌ）でインキュベートした。図１６Ａに示
されるように、ＴＲ６−（Ｈｉｓ）は、全ＡＩＭ ＩＩ（ＬＩＧＨＴ）媒介細胞
死滅のほとんどをブロックした。細胞をまた、異なる濃度のＴＲ６−（Ｈｉｓ）
の存在下でｓＡＩＭ ＩＩ（ｓＬＩＧＨＴ）および／またはＩＦＮ−γでインキ
ュベートした。ＴＲ６−（Ｈｉｓ）は、ｓＡＩＭ ＩＩ（ｓＬＩＧＨＴ）で誘導
された細胞死を容量依存的にブロックした（図１６Ｂ）。まとめると、ＴＲ６は
、ＡＩＭ ＩＩ（ＬＩＧＨＴ）で誘導された腫瘍細胞死のナチュラルインヒビタ
ーとして作用し得、そして腫瘍により免疫回避に寄与し得る。

【０７２０】 ＨＶＥＭ／ＴＲ２および／またはＬＴβＲとのＡＩＭ ＩＩ（ＬＩＧＨＴ）と
の相互作用は、異なる生物学的事象（例えば、Ｔ細胞増殖、ＨＶＥＭ依存ＨＳＶ
１感染のブロック、および抗腫瘍活性）を誘発すると予期される（Ｍａｕｒｉ，
Ｄ．Ｎ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ８：２１−３０（１９９８）；Ｚｈａｉ，Ｙ．
ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０２：１１４２−１１５１（１９９８）；
Ｈａｒｒｏｐ，Ｊ．Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２７５４８−２
７５５６（１９９８））。ＴＲ６は、ＡＩＭ ＩＩ（ＬＩＧＨＴ）相互作用のイ
ンヒビターとして作用すると考えられ、そしてまた、細胞型に依存して、異なる
役割を果たすと考えられる。実際に、ＴＲ６（ＤｃＲ３）は、ＦａｓＬに結合す
ることが示され、そして特定の腫瘍による免疫回避に寄与すると考えられる（Ｐ
ｉｔｔｉ，Ｒ．Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３９６：６９９−７０３（１９９８））
。ＴＲ６（ＤｃＲ３）は、おとりレセプターとして作用すると考えられ、そして
、それぞれＡＩＭ ＩＩ（ＬＩＧＨＴ）媒介性アポトーシス経路またはＦａｓＬ
媒介性アポトーシス経路によって媒介される、緩徐な腫瘍細胞死および急速な腫
瘍細胞死の両方における免疫回避に寄与すると考えられる。

【０７２１】 別の可能性は、ＴＲ６が、膜に結合したＦａｓＬまたはＡＩＭ ＩＩ（ＬＩＧ
ＨＴ）を誘発するためのサイトカインとして作用し得、そしてＦａｓＬまたはＡ
ＩＭ ＩＩ（ＬＩＧＨＴ）を介してシグナルを直接変換し得ることである。最近
、ＤｅｓｂａｒａｔｓおよびＳｕｚｕｋｉのグループが、ＦａｓＬは、それ自体
でシグナルを変換し得、ＣＤ４^-Ｔ細胞において細胞周期の阻止および細胞死を
導くが、ＣＤ８^-Ｔ細胞においては細胞増殖を導くことを報告した（Ｄｅｓｂａ
ｒａｔｓ，Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４：１３７７−１３８２
（１９９８）；Ｓｕｚｕｋｉ，Ｉ．およびＦｉｎｋ，Ｐ．Ｊ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍ
ｅｄ．１８７：１２３−１２８（１９９８））。従って、ＴＲ６は、ＦａｓＬお
よびＡＩＭ ＩＩ（ＬＩＧＨＴ）を介したシグナル伝達のためのサイトカインと
して作用し得る。

【０７２２】 ＨＵＶＥＣ細胞は、ＲＴ−ＰＣＲ分析において、ＴＲ６を構成的に発現した。
ＡＩＭ ＩＩ（ＬＩＧＨＴ）およびＦａｓＬが、活性化Ｔ細胞において発現する
ことが公知である。従って、ＴＲ６およびそのリガンドが、活性化Ｔリンパ球と
内皮との間の相互作用に重要であると考えられる。ＴＲ６は、活性化Ｔ細胞輸送
ならびに内皮細胞の生存に関与し得る。

【０７２３】 従って、ＴＮＦＲスーパーファミリーの新規の可溶性メンバーであるＴＲ６が
同定された。ＴＲ６は、肺組織、腫瘍細胞および内皮細胞において構成的に発現
される。ＴＲ６のリガンドは、ＡＩＭ ＩＩ（ＬＩＧＨＴ）およびＦａｓＬのよ
うであり、これらは、細胞死の経路に関与する。ＴＲ６は、ＡＩＭ ＩＩ（ＬＩ
ＧＨＴ）およびＦａｓＬに特異的に結合し、そして、ＡＩＭ ＩＩ（ＬＩＧＨＴ
）およびＦａｓＬの活性を阻害する。ＤｃＲ１、ＤｃＲ２およびＴＮＦＲスーパ
ーファミリーの別の可溶性メンバーであるＯＰＧと同様に、ＴＲ６は、ＴＮＦフ
ァミリーのメンバーであるＦａｓＬおよびＡＩＭ ＩＩ（ＬＩＧＨＴ）を介した
シグナル伝達のインヒビターとして作用すると考えられる。それ故、ＴＲ６は、
アポトーシスおよび腫瘍調節の阻害において重要な役割を有すると考えられる。 （実施例１４：ｓｃＦｖのライブラリー由来の本発明のポリペプチドに対する抗
体フラグメントの単離） ヒトＰＢＬから単離した天然に存在するＶ−遺伝子を、ドナーが曝露されても
、曝露されなくてもよい本発明のポリペプチドに対する反応性を含む抗体フラグ
メントの大きなライブラリー中に構築する（例えば、米国特許第５，８８５，７
９３号（その全体が参考として本明細書に援用される）を参照のこと）。

【０７２４】 （ライブラリーのレスキュー） ＷＯ ９２／０１０４７に記載のように、ヒトＰＢＬのＲＮＡからｓｃＦｖの
ライブラリーを構築する。抗体フラグメントを提示するファージをレスキューす
るため、ファージミドを保有する約１０⁹個のＥ．ｃｏｌｉを用いて、５０ｍｌ
の２×ＴＹ（１％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する
）（２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＧＬＵ）を接種し、そして振盪しながら０．８のＯ．Ｄ
．まで増殖させる。この培養物の５ｍｌを用いて５０ｍｌの２×ＴＹ−ＡＭＰ−
ＧＬＵを接種（ｉｎｎｏｃｕｌａｔｅ）し、２×１０⁸ＴＵのΔ遺伝子３ヘルパ
ーファージ（Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩ、ＷＯ９２／０１０４７を参照のこと）を添
加し、そして培養物を振盪なしで３７℃で４５分間インキュベートし、次いで振
盪しながら３７℃で４５分間インキュベートする。この培養物を１０分間４００
０ｒ．ｐ．ｍ．で遠心分離し、そしてペレットを２リットルの２×ＴＹ（１００
μｇ／ｍｌアンピシリンおよび５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有する）中に再
懸濁し、そして一晩増殖させる。ファージをＷＯ９２／０１０４７に記載のよう
に調製する。

【０７２５】 Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩを以下のように調製する：Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩヘルパ
ーファージは、遺伝子ＩＩＩタンパク質をコードしない。それゆえ、抗体フラグ
メントを提示するファージ（ファージミド）は、抗原に対するより大きい結合ア
ビディティーを有する。ファージ形態形成の間、野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質
を供給するｐＵＣ１９誘導体を保有する細胞においてヘルパーファージを増殖さ
せることにより、感染性Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩ粒子を作製する。培養物を振盪な
しで３７℃で１時間インキュベートし、次いで振盪しながら３７℃でさらに１時
間インキュベートする。細胞をペレット化（ＩＥＣ−Ｃｅｎｔｒａ ８，４００
ｒｅｖｓ／分で１０分間）し、１ｍｌあたり１００μｇのアンピシリンおよび１
ｍｌあたり２５μｇのカナマイシンを含有する２×ＴＹブロス（２×ＴＹ−ＡＭ
Ｐ−ＫＡＮ）３００ｍｌ中で再懸濁し、そして３７℃で振盪しながら一晩増殖さ
せた。ファージ粒子を、２回のＰＥＧ沈殿（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０）に
より培養培地から精製および濃縮し、２ｍｌ ＰＢＳに再懸濁し、そして０．４
５μｍのフィルター（Ｍｉｎｉｓａｒｔ ＮＭＬ；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を通過
させ、１ｍｌあたり約１０¹³形質導入単位（アンピシリン耐性クローン）の最終
濃度を得た。

【０７２６】 （ライブラリーのパニング） Ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅｓ（Ｎｕｎｃ）を、１００ｍｇ／ｍｌまたは１０ｍｇ／
ｍｌのいずれかの本発明のポリペプチド４ｍｌを用いてＰＢＳ中で一晩コーティ
ングする。チューブを２％Ｍａｒｖｅｌ−ＰＢＳを用いて３７℃で２時間ブロッ
クし、次いでＰＢＳ中で３回洗浄する。約１０¹³ＴＵのファージをこのチューブ
に適用し、そして、回転盤で上下に傾けながら室温で３０分間インキュベートし
、次いでさらに１．５時間静置しておく。チューブをＰＢＳ ０．１％Ｔｗｅｅ
ｎ−２０で１０回、そしてＰＢＳで１０回洗浄する。１ｍｌの１００ｍＭトリエ
チルアミンを添加し、そして回転盤で１５分間上下に回転させることによりファ
ージを溶出し、その後、この溶液を０．５ｍｌの１．０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、
ｐＨ７．４で直ちに中和する。次いで、溶出したファージを細菌とともに３７℃
で３０分間インキュベートすることにより、ファージを用いて、１０ｍｌの対数
増殖中期のＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１に感染させる。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉを１％グ
ルコースおよび１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＴＹＥプレート上にプ
レーティングする。次いで、生じた細菌ライブラリーを、上記のようにΔ遺伝子
３ヘルパーファージでレスキューし、次の回の選択のためのファージを調製する
。次いで、このプロセスを、アフィニティー精製の全４回について反復し、３回
目および４回目にはチューブ洗浄をＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で２０回
、そしてＰＢＳで２０回に増加する。

【０７２７】 （結合剤の特徴付け） ３回目および４回目の選択から溶出したファージを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｈ
Ｂ ２１５１を感染させ、そして可溶性ｓｃＦｖをアッセイのために単一コロニ
ーから生成する（Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９
７（１９９１））。５０ｍＭ炭酸水素塩、ｐＨ９．６中の本発明のポリペプチド
の１０ｐｇ／ｍｌのいずれかでコーティングしたマイクロタイタープレートを用
いてＥＬＩＳＡを実行する。ＥＬＩＳＡ中の陽性クローンをＰＣＲフィンガープ
リンティング（例えば、ＷＯ９２／０１０４７を参照のこと）、次いで、配列決
定することによりさらに特徴付ける。

【０７２８】 （実施例１５：ＡＩＭ ＩＩ遺伝子における変化の決定方法） 目的の表現型（例えば、疾患）を提示する家族全員または個々の患者からＲＮ
Ａを単離する。次いで、ｃＤＮＡをこれらのＲＮＡサンプルから当該分野で公知
のプロトコルを使用して生成する（Ｓａｍｂｒｏｏｋらを参照のこと）。次いで
、このｃＤＮＡを、配列番号１における目的の領域を取り囲むプライマーを用い
るＰＣＲのテンプレートとして使用する。示唆されるＰＣＲ条件は、Ｓｉｄｒａ
ｎｓｋｙ，Ｄ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：７０６（１９９１）に記載の緩衝
溶液を使用し、９５℃で３０秒間；５２〜５８℃で６０〜１２０秒間；および７
０℃で６０〜１２０秒間の３５サイクルからなる。

【０７２９】 次いで、ＰＣＲ産物を、ＳｅｑｕｉＴｈｅｒｍ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｅｐ
ｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、５’末端にＴ４ポリヌク
レオチドキナーゼで標識したプライマーを使用して配列決定する。ＡＩＭ ＩＩ
の選択したエキソンのイントロン−エキソン境界もまた決定し、そしてゲノムＰ
ＣＲ産物を分析してその結果を確認する。次いで、ＡＩＭ ＩＩにおいて疑わし
い変異を有するＰＣＲ産物のクローン化および配列決定を行い、直接配列決定の
結果を確認する。

【０７３０】 ＡＩＭ ＩＩのＰＣＲ産物を、Ｈｏｌｔｏｎ，Ｔ．Ａ．およびＧｒａｈａｍ，
Ｍ．Ｗ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９：１１５６（
１９９１）に記載のようにＴテールベクターにクローン化し、そしてＴ７ポリメ
ラーゼ（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）で配列決定す
る。罹患個体を、非罹患個体には存在しないＡＩＭ ＩＩにおける変異により同
定する。

【０７３１】 ゲノム再配置もまた、ＡＩＭ ＩＩ遺伝子における改変を決定する方法として
観察する。当該分野の公知技術を使用して単離したゲノムクローンを、ジゴキシ
ゲニンデオキシ−ウリジン５’−三リン酸（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅ
ｉｍ）を用いてニックトランスレーションし、そしてＪｏｈｎｓｏｎ，Ｃ．ら、
Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３５：７３−９９（１９９１）に記載の
ようにＦＩＳＨを行う。ＡＩＭ ＩＩ遺伝子座への特異的ハイブリダイゼーショ
ンのために、大過剰のヒトｃｏｔ−１ ＤＮＡを用いて標識プローブとのハイブ
リダイゼーションを行う。

【０７３２】 染色体を、４，６−ジアミノ−２−フェニリドールおよびヨウ化プロピジウム
で対比染色し、ＣバンドおよびＲバンドの組み合わせを生成する。正確なマッピ
ングのための整列イメージを、冷却電荷結合素子カメラ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉ
ｃｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）および可変励起波長フィルターを組み合わせた三重
バンドフィルターセット（Ｃｈｒｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｒａｔｔｌ
ｅｂｏｒｏ，ＶＴ）を用いて得る（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｃｖ．ら、Ｇｅｎｅｔ．Ａ
ｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．，８：７５（１９９１））。ＩＳｅｅ Ｇｒａｐ
ｈｉｃａｌ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｉｎｏｖｉｓｉｏｎ Ｃｏｒｐ
ｏｒａｔｉｏｎ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）を使用して、イメージ収集、分析および
染色体部分長測定を行う。（プローブによってハイブリダイズした）ＡＩＭ Ｉ
Ｉのゲノム領域の染色体変化を、挿入、欠失および転座として同定する。これら
ＡＩＭ ＩＩ変化を関連疾患の診断マーカーとして使用する。

【０７３３】 （実施例１６：生物学的サンプル中のＡＩＭ ＩＩの異常レベルを検出する方
法） ＡＩＭ ＩＩポリペプチドは生物学的サンプル中で検出され得、そしてＡＩＭ
ＩＩレベルの上昇または低下が検出されるなら、このポリペプチドは、特定表
現型のマーカーである。検出方法は数多くあり、そしてそれ故、当業者は以下の
アッセイをそれらの特定の必要性に適合するように改変し得ることが理解される
。

【０７３４】 例えば、抗体サンドイッチＥＬＩＳＡを使用し、サンプル中、好ましくは、生
物学的サンプル中のＡＩＭ ＩＩを検出する。マイクロタイタープレートのウェ
ルを、ＡＩＭ ＩＩに対する特異的抗体を最終濃度０．２〜１０μｇ／ｍｌで用
いてコーティングする。この抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルのい
ずれかであって、そして当該分野の公知技術を使用して産生される。ウェルに対
するＡＩＭ ＩＩの非特異的結合が減少するように、このウェルをブロックする
。

【０７３５】 次いで、コーティングしたウェルを、ＡＩＭ ＩＩ含有サンプルを用いてＲＴ
で２時間を超えてインキュベートする。好ましくは、サンプルの系列希釈を使用
して結果を確認すべきである。次いで、プレートを脱イオン水または蒸留水で三
回洗浄し、非結合ＡＩＭ ＩＩを除去する。

【０７３６】 次に、特異的抗体−アルカリホスファターゼ結合体５０μｌを２５〜４００ｎ
ｇの濃度で添加し、そして室温で２時間インキュベートする。プレートを再び脱
イオン水または蒸留水で三回洗浄し、未結合の結合体を除去する。

【０７３７】 次いで、４−メチルウンベリフェリルリン酸（ＭＵＰ）またはｐ−ニトロフェ
ニルリン酸（ＮＰＰ）基質溶液７５μｌを各ウェルに添加し、そして室温で１時
間インキュベートし、基質および蛍光の切断を可能にする。蛍光をマイクロタイ
タープレートリーダーにより測定する。コントロールサンプルの系列希釈からの
実験結果を使用して検量線を作成し、そしてＸ軸（対数スケール）にサンプル濃
度を、そしてＹ軸（直線スケール）に蛍光または吸光度をプロットする。次いで
、このサンプルの測定された蛍光に基づいて、検量線を用いてサンプル中のＡＩ
Ｍ ＩＩポリペプチド濃度を補間する。

【０７３８】 （実施例１７：ＡＩＭ ＩＩのレベル上昇を処置する方法） 本発明は、体内におけるＡＩＭ ＩＩの生物学的活性のレベルを減少させる必
要のある個体を処置するための方法に関し、その方法は、治療有効量のＡＩＭ
ＩＩアンタゴニストを含むか、あるいはこのアンタゴニストからなる組成物をそ
のような個体に投与する工程を包含する。本発明における使用のために好ましい
アンタゴニストは、ＡＩＭ ＩＩ特異的な抗体である。

【０７３９】 さらに、個体におけるＡＩＭ ＩＩの標準または正常発現レベルの低下により
引き起こされる状態は、ＡＩＭ ＩＩを、好ましくは可溶性形態および／または
分泌形態で投与することにより処置し得ることが理解される。従って、本発明は
また、ＡＩＭ ＩＩポリペプチドのレベルの増加が必要な個体の処置方法を提供
する。この方法は、このような個体に、このような個体でＡＩＭ ＩＩの生物学
的活性のレベルを増加させる量のＡＩＭ ＩＩを含むか、あるいはこの量のＡＩ
Ｍ ＩＩからなる薬学的組成物を投与する工程を包含する。

【０７４０】 例えば、ＡＩＭ ＩＩポリペプチドのレベルが低下した患者は、ポリペプチド
を、１日用量０．１〜１００μｇ／ｋｇで６日続けて服用する。好ましくは、ポ
リペプチドは、可溶性形態および／または分泌形態である。

【０７４１】 （実施例１８：ＡＩＭ ＩＩのレベル低下を処置する方法） 本発明はまた、体内におけるＡＩＭ ＩＩの生物学的活性のレベルを増加させ
る必要のある個体を処置するための方法に関し、その方法は、治療有効量のＡＩ
Ｍ ＩＩまたはそのアゴニストを含むか、あるいはこのアゴニストからなる組成
物をそのような個体に投与する工程を包含する。

【０７４２】 アンチセンス技術を、ＡＩＭ ＩＩの産生を阻害するために使用する。この技
術は、癌のような様々な病因に起因するＡＩＭ ＩＩポリペプチド、好ましくは
、可溶性形態および／または分泌形態のＡＩＭ ＩＩポリペプチドのレべルを低
下させる方法の１つの例である。

【０７４３】 例えば、ＡＩＭ ＩＩのレベルが異常に上昇したと診断された患者に、アンチ
センスポリヌクレオチドを、１日当たり０．５、１．０、１．５、２．０および
３．０ｍｇ／ｋｇで静脈内に２１日間投与する。この処置に対して十分な耐性が
あれば、７日間の休薬期間後に、この処置を繰り返す。

【０７４４】 （実施例１９：遺伝子治療を使用する処置方法−エキソビボ） 遺伝子治療の１つの方法は、可溶性および／または成熟ＡＩＭ ＩＩポリペプ
チドを発現し得る線維芽細胞を患者に移植する方法である。一般に、線維芽細胞
は、皮膚生検により被験体から得られる。得られた組織を組織培養培地中に配置
し、そして小片に分割する。小塊の組織を組織培養フラスコの湿潤表面に置き、
ほぼ１０片を各フラスコに置く。このフラスコを倒置し、しっかりと閉め、そし
て室温で一晩放置する。室温で２４時間後、フラスコを反転させ、組織塊をフラ
スコの底に固定させたままにし、そして新鮮培地（例えば、１０％ＦＢＳ、ペニ
シリンおよびストレプトマイシンを含有するＨａｍのＦ１２培地）を添加する。
次いで、フラスコを３７℃で約１週間インキュベートする。

【０７４５】 この時点で、新鮮培地を添加し、次いで数日ごとに取り換える。さらに二週間
培養した後に単層の線維芽細胞が出現する。単層をトリプシン処理し、そしてさ
らに大きなフラスコにスケールアップする。

【０７４６】 Ｍｏｌｏｎｅｙマウス肉腫ウイルスの長末端反復が隣接するｐＭＶ−７（Ｋｉ
ｒｓｃｈｍｅｉｅｒ，Ｐ．Ｔ．ら、ＤＮＡ，７：２１９−２５（１９８８））を
ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、仔ウシ腸ホスファターゼで処理
する。線状ベクターをアガロースゲルで分画し、そしてガラスビーズを使用して
精製する。

【０７４７】 ＡＩＭ ＩＩをコードするｃＤＮＡを、それぞれ５’および３’末端のコード
配列に対応するＰＣＲプライマーを使用して増幅し得る。好ましくは、５’プラ
イマーはＥｃｏＲＩ部位を含み、そして３’プライマーはＨｉｎｄＩＩＩ部位を
含む。等量の、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス肉腫ウイルス線状骨格および増幅したＥｃ
ｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存在下で
一緒に加える。得られた混合物を二つのフラグメントを連結するのに適した条件
下で維持する。次いで、連結混合物を使用し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１を形質
転換する。次いで、ベクターが正確に挿入されたＡＩＭ ＩＩを有することを確
認する目的のために、それを、カナマイシンを含む寒天上にプレーティングした
。

【０７４８】 アンフォトロピックｐＡ３１７またはＧＰ＋ａｍ１２パッケージング細胞を、
１０％仔ウシ血清（ＣＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むＤｕｌ
ｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅｓ培地（ＤＭＥＭ）中、組織培養でコンフルエントな
密度まで増殖させる。次いで、ＡＩＭ ＩＩ遺伝子を含むＭＳＶベクターを培地
に加え、そしてパッケージング細胞にベクターを形質導入する。このとき、パッ
ケージング細胞はＡＩＭ ＩＩ遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生する（こ
こで、パッケージング細胞をプロデューサー細胞という）。

【０７４９】 形質導入されたプロデューサー細胞に新鮮培地を添加し、次いで培地を１０ｃ
ｍプレートのコンフルエントなプロデューサー細胞から採取する。感染性ウイル
ス粒子を含む使用済み培地を、ミリポアーフィルターを通して濾過し、はがれた
プロデューサー細胞を除去し、次いでこの培地を使用して、線維芽細胞を感染さ
せる。線維芽細胞のサブコンフルエントなプレートから培地を除去し、そしてプ
ロデューサー細胞からの培地で速やかに置き換える。この培地を除去し、そして
新鮮培地と置き換える。ウイルスの力価が高ければ、実質的にすべての線維芽細
胞が感染され、選択は必要ではない。力価が非常に低ければ、ｎｅｏまたはｈｉ
ｓのような選択マーカーを有するレトロウイルスベクターを使用することが必要
である。一旦、線維芽細胞が効率的に感染したなら、線維芽細胞を分析し、ＡＩ
Ｍ ＩＩタンパク質が産生されているか否かを決定する。

【０７５０】 次いで、操作された線維芽細胞を、単独で、またはサイトデックス３マイクロ
キャリアビーズ上でコンフルエントに増殖させた後のいずれかで宿主に移植する
。

【０７５１】 （実施例２０：遺伝子治療を使用する処置方法−インビボ） 本発明の別の局面は、障害、疾患、および状態を処置するためにインビボ遺伝
子治療方法を使用することである。この遺伝子治療法は、ＡＩＭ ＩＩポリペプ
チドの発現を増大または減少させるための、動物への裸の核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ
、およびアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ）のＡＩＭ ＩＩ配列の導入に関する
。ＡＩＭ ＩＩポリヌクレオチドは、プロモーター、または標的組織によるＡＩ
Ｍ ＩＩポリペプチドの発現に必要な任意の他の遺伝子エレメントに、作動可能
に連結され得る。このような遺伝子治療および送達の技術および方法は、当該分
野で公知であり、例えば、ＷＯ９０／１１０９２、ＷＯ９８／１１７７９；米国
特許第５６９３６２２号、同第５７０５１５１号、同第５５８０８５９号；Ｔａ
ｂａｔａ Ｈ．ら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．３５：４７０−４７９（１
９９７）；Ｃｈａｏ Ｊ．ら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．３５：５１７−５
２２（１９９７）；Ｗｏｌｆｆ Ｊ．Ａ．、Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ．Ｄｉｓｏ
ｒｄ．７：３１４−３１８（１９９７）；Ｓｃｈｗａｒｔｚ Ｂ．ら、Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒ．３：４０５−４１１（１９９６）；Ｔｓｕｒｕｍｉ Ｙ．ら、Ｃｉ
ｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９４：３２８１−３２９０（１９９６）（本明細書中に参
考として援用される）を参照のこと。

【０７５２】 ＡＩＭ ＩＩポリヌクレオチド構築物は、注入可能な物質を動物の細胞に送達
する任意の方法（例えば、組織（心臓、筋肉、皮膚、肺、肝臓、腸など）の間隙
空間への注入）によって送達され得る。このＡＩＭ ＩＩポリヌクレオチド構築
物は、薬学的に受容可能な液体または水性キャリア中で送達され得る。

【０７５３】 用語「裸の」ポリヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮＡは、細胞への侵入を補助
、促進、または容易にするように作用するいかなる送達ビヒクル（ウイルス配列
、ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフェクチン、または沈澱剤などを含む
）も含まない配列をいう。しかし、ＡＩＭ ＩＩポリヌクレオチドはまた、当業
者に周知の方法によって調製され得るリポソーム処方物（例えば、Ｆｅｌｇｎｅ
ｒ Ｐ．Ｌ．ら、Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７２：１２６−１３９（
１９９５）およびＡｂｄａｌｌａｈ Ｂ．ら、Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ ８５：１−
７（１９９５）で教示されたもの）中で送達され得る。

【０７５４】 この遺伝子治療方法において使用されるＡＩＭ ＩＩポリヌクレオチドベクタ
ー構築物は、好ましくは、宿主ゲノムに組み込まれず、複製を可能にする配列も
含まない構築物である。当業者に公知の任意の強力なプロモーターが、ＤＮＡの
発現を駆動するために用いられ得る。他の遺伝子治療技術とは異なり、裸の核酸
配列を標的細胞に導入する１つの主要な利点は、その細胞におけるポリヌクレオ
チド合成の一過性の性質である。研究によって、非複製ＤＮＡ配列が細胞に導入
されて、６ヶ月までの間の期間、所望のポリペプチドの産生を提供し得ることが
示された。

【０７５５】 このＡＩＭ ＩＩポリヌクレオチド構築物は、動物内の組織（筋肉、皮膚、脳
、肺、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、
胆嚢、胃、腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺、および結合組織を包
含する）の間隙空間に送達され得る。この組織の間隙空間は、細胞間液、ムコ多
糖基質（器官組織の細網線維、血管または腔（ｃｈａｍｂｅｒ）の壁における弾
性線維、線維性組織のコラーゲン線維の間にある）、あるいは結合組織鞘性筋肉
細胞内または骨の裂孔中の同じ基質を包含する。これは、同様に、循環の血漿お
よびリンパチャンネルのリンパ液により占められた空間である。筋肉組織の間隙
空間への送達は、以下に考察する理由のために好ましい。それらは、これらの細
胞を含む組織への注入によって、好都合に送達され得る。それらは、好ましくは
、分化した持続性の非分裂細胞に送達され、そしてその細胞において発現される
が、送達および発現は、非分化細胞または完全には分化していない細胞（例えば
、血液の幹細胞または皮膚線維芽細胞）において達成され得る。インビボで、筋
肉細胞は、ポリヌクレオチドを取り込み、そして発現する能力において、特に適
格である。

【０７５６】 裸のＡＩＭ ＩＩポリヌクレオチド注入のために、ＤＮＡまたはＲＮＡの有効
投薬量は、約０．０５μｇ／ｋｇ体重から約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲にある。
好ましくは、この投薬量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇであ
り、そしてより好ましくは、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇである。
もちろん、当業者が認識するように、この投薬量は、注入の組織部位に従って変
化する。核酸配列の適切かつ有効な投薬量は、当業者によって容易に決定され得
、そして処置される状態および投与経路に依存し得る。好ましい投与経路は、組
織の間隙空間への非経口注入経路によってである。しかし、他の非経口経路もま
た用いられ得、これには、例えば、特に肺または気管支組織、咽喉、または鼻の
粘膜への送達のためのエアロゾル処方物の吸入が挙げられる。さらに、裸のＡＩ
Ｍ ＩＩポリヌクレオチド構築物が、血管形成術の間にこの手順において用いら
れるカテーテルによって動脈に送達され得る。

【０７５７】 インビボでの筋肉における注入ＡＩＭ ＩＩポリヌクレオチドの用量応答効果
を、以下のようにして決定する。ＡＩＭ ＩＩポリペプチドをコードするｍＲＮ
Ａの生成のための適切なＡＩＭ ＩＩ鋳型ＤＮＡを、標準的な組換えＤＮＡ方法
論に従って調製する。この鋳型ＤＮＡ（これは環状または線状のいずれかであり
得る）を裸のＤＮＡとして使用するか、またはリポソームと複合体化するかのい
ずれかである。次いで、マウスの四頭筋に、種々の量の鋳型ＤＮＡを注入する。

【０７５８】 ５〜６週齢の雌性および雄性のＢａｌｂ／Ｃマウスに、０．３ｍｌの２．５％
Ａｖｅｒｔｉｎを腹腔内注射することにより麻酔する。１．５ｃｍの切開を大腿
前部で行い、そして四頭筋を直接可視化する。ＡＩＭ ＩＩ鋳型ＤＮＡを、０．
１ｍｌのキャリアに入れて、１ｃｃ注射器で２７ゲージ針を通して１分間にわた
って、筋肉の遠位挿入部位から約０．５ｃｍのところで膝に、約０．２ｃｍの深
さで注入する。縫合を、将来の位置決定のために注入部位の上で行い、そしてそ
の皮膚をステンレス鋼クリップで閉じる。

【０７５９】 適切なインキュベーション時間（例えば、７日）後、筋肉抽出物を、四頭筋全
体を切り出すことによって調製する。個々の四頭筋の５枚毎の１５μｍ切片を、
ＡＩＭ ＩＩタンパク質発現について組織化学的に染色する。ＡＩＭ ＩＩタン
パク質発現についてのタイムコースを、異なるマウスからの四頭筋を異なる時間
で採取すること以外は、同様な様式で行い得る。注射後の筋肉中のＡＩＭ ＩＩ
ＤＮＡの持続性を、注射したマウスおよびコントロールマウスからの全細胞性
ＤＮＡおよびＨＩＲＴ上清を調製した後、サザンブロット分析によって決定し得
る。マウスにおける上記実験の結果は、ＡＩＭ ＩＩの裸のＤＮＡを用いて、ヒ
トおよび他の動物において適切な投与量および他の処置パラメーターを推定する
ために使用し得る。

【０７６０】 （実施例２１：内因性ＡＩＭ ＩＩ遺伝子を使用する遺伝子治療） 本発明に従う遺伝子治療の別の方法は、内因性ＡＩＭ ＩＩ配列を、例えば、
米国特許第５，６４１，６７０号（１９９７年６月２４日出願）；国際公開第Ｗ
Ｏ ９６／２９４１１号（１９９６年９月２６日公開）；国際公開第ＷＯ ９４
／１２６５０号（１９９４年８月４日公開）；Ｋｏｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：８９３２〜８９３５（１９８９）
；およびＺｉｊｌｓｔｒａら、Ｎａｔｕｒｅ，３４２：４３５〜４３８（１９８
９）に記載されるように、相同組換えを介してプロモーターに作動可能に結合す
る工程を包含する。この方法は、その標的細胞中に存在するが、その細胞中で発
現されないかまたは所望されるよりも低いレベルで発現される、遺伝子の活性化
を包含する。プロモーターおよび標的配列を含むポリヌクレオチド構築物を作製
する。この標的配列は、プロモーターに隣接する、内因性ＡＩＭ ＩＩの配列の
５’非コード配列と相同である。この標的配列は、このＡＩＭ ＩＩの配列の５
’末端に十分に近く、その結果、このプロモーターは、相同組換えの際にこの内
因性配列に作動可能に連結される。このプロモーターおよび標的配列を、ＰＣＲ
を使用して増幅し得る。好ましくは、この増幅したプロモーターは、５’末端お
よび３’末端上に異なる制限酵素部位を含む。好ましくは、第１の標的配列の３
’末端は、増幅したプロモーターの５’末端と同じ制限酵素部位を含み、そして
第２の標的配列の５’末端は、増幅したプロモーターの３’末端と同じ制限部位
を含む。

【０７６１】 この増幅したプロモーターおよび増幅した標的配列を、適切な制限酵素で消化
し、続いてウシ腸ホスファターゼで処理する。消化したプロモーターおよび消化
した標的配列を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存在下でともに加える。生じた混合物
を、これら２つのフラグメントの連結に適切な条件下で維持する。この構築物を
アガロースゲル上でサイズ分画し、次いでフェノール抽出およびエタノール沈殿
により精製する。

【０７６２】 この実施例において、このポリヌクレオチド構築物を、エレクトロポレーショ
ンを介して裸のポリヌクレオチドとして投与する。しかし、このポリヌクレオチ
ド構築物はまた、トランスフェクション促進剤（例えば、リポソーム、ウイルス
配列、ウイルス粒子、沈殿剤など）と共に投与され得る。このような送達方法は
、当該分野で公知である。

【０７６３】 一旦、細胞をトランスフェクトすると、相同組換えが起こり、この内因性ＡＩ
Ｍ ＩＩ配列に作動可能に連結されるプロモーターを生じる。これは、この細胞
中におけるＡＩＭ ＩＩの発現を生じる。発現は、免疫学的染色または当該分野
で公知の他の任意の方法により、検出され得る。

【０７６４】 線維芽細胞を、皮膚生検により被験者から得る。得られた組織を、ＤＭＥＭ＋
１０％胎仔ウシ血清中に置く。対数増殖期または定常期初期の線維芽細胞を、ト
リプシン処理し、そしてプラスチックの表面から栄養培地でリンスする。細胞懸
濁液のアリコートを、計数のために取り出し、そして残りの細胞を遠心分離に供
する。上清を吸引し、そしてペレットを５ｍｌのエレクトロポレーション緩衝液
（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．３、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ
、０．７ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄、６ｍＭデキストロース）に再懸濁する。この細胞
を再遠心分離し、上清を吸引し、そして細胞をアセチル化ウシ血清アルブミン１
ｍｇ／ｍｌを含むエレクトロポレーション緩衝液に再懸濁する。この最終細胞懸
濁物は、約３×１０⁶細胞／ｍｌを含む。エレクトロポレーションを、再懸濁直
後に実施すべきである。

【０７６５】 プラスミドＤＮＡを、標準的技術に従って調製する。例えば、ＡＩＭ ＩＩの
遺伝子座に標的化するためのプラスミドを構築するために、プラスミドｐＵＣ１
８（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ａｍｈｅｒｓｔ、ＮＹ）をＨｉｎｄＩＩＩで
消化する。ＣＭＶプロモーターを、５’末端にＸｂａＩ部位および３’末端にＢ
ａｍＨＩ部位を備えてＰＣＲにより増幅する。２つのＡＩＭ ＩＩ非コード配列
をＰＣＲを介して増幅する：一方のＡＩＭ ＩＩ非コード配列（ＡＩＭ ＩＩフ
ラグメント１）を、５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位および３’末端にＸｂａＩ部
位を備えて増幅する；他方のＡＩＭ ＩＩ非コード配列（ＡＩＭ ＩＩフラグメ
ント２）を、５’末端にＢａｍＨＩ部位および３’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を
備えて増幅する。このＣＭＶプロモーターおよびＡＩＭ ＩＩフラグメント（１
および２）を、適切な酵素（ＣＭＶプロモーター−ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ；
ＡＩＭ ＩＩフラグメント１−ＸｂａＩ；ＡＩＭ ＩＩフラグメント２−Ｂａｍ
ＨＩ）で消化し、そして共に連結する。生じた連結生成物をＨｉｎｄＩＩＩで消
化し、そしてＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＵＣ１８プラスミドと連結する。

【０７６６】 プラスミドＤＮＡを、０．４ｃｍの電極ギャップを備える滅菌キュベット（Ｂ
ｉｏ−Ｒａｄ）に添加する。最終ＤＮＡ濃度は、一般的に、少なくとも１２０μ
ｇ／ｍｌである。次いで、この細胞懸濁液の０．５ｍｌ（約１．５×１０⁶細胞
を含む）をこのキュベットに添加し、そしてこの細胞懸濁液およびＤＮＡ溶液を
、穏やかに混合する。エレクトロポレーションを、Ｇｅｎｅ−Ｐｕｌｓｅｒ装置
（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて実施する。キャパシタンスおよび電圧を、それぞれ
、９６０μＦおよび２５０〜３００Ｖに設定する。電圧が増加すると、細胞の生
存が減少するが、導入されたＤＮＡをそのゲノム中に安定に組込む生存細胞の割
合は劇的に増加する。これらのパラメーターを考慮すると、パルス時間約１４〜
２０ｍＳｅｃが観察されるはずである。

【０７６７】 エレクトロポレーションした細胞を、室温で約５分間維持し、次いで、このキ
ュベットの中身を、滅菌した移動ピペットを用いて穏やかに取り出す。この細胞
を、１０ｃｍのディッシュ中の、予め温めた栄養培地（１５％ウシ血清を含むＤ
ＭＥＭ）１０ｍｌに直接加え、そして３７℃でインキュベートする。翌日、この
培地を吸引し、そして１０ｍｌの新鮮な培地で置換し、そしてさらに１６〜２４
時間インキュベートする。

【０７６８】 次いで、操作された線維芽細胞を、宿主中に、単独か、またはサイトデックス
（ｃｙｔｏｄｅｘ）３マイクロキャリア（ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ）ビーズ上
でコンフルエントになるまで増殖させた後かのいずれかで、注射する。ここで、
この線維芽細胞は、タンパク質産物を生成する。次いで、この線維芽細胞を、上
記のような患者に導入し得る。

【０７６９】 （実施例２２：ＡＩＭ ＩＩ同時刺激経路を介する、腫瘍および対宿主性移植
片病モデルにおけるＴ細胞媒介性免疫の改変） （導入） Ｔリンパ球は、増殖するため、およびさらに免疫応答を媒介するエフェクター
細胞へ分化するために、しばしば２つの異なるシグナルを必要とする（Ｓｃｈｗ
ａｒｔｚ，Ｒ．Ｈ．、Ｃｅｌｌ ７１：１０６５−１０６８（１９９２））。Ｔ
ＣＲにより送達される抗原シグナルに加えて、Ｔ細胞上の同時刺激レセプターと
それらのリガンドまたは専門的な抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の対レセプター（ｃ
ｏｎｔｅｒｒｅｃｅｐｔｏｒ）との間の相互作用は、Ｔ細胞の至適活性化および
生存に必須である。可溶性ＣＴＬＡ４−Ｉｇまたは抗Ｂ７モノクローナル抗体（
ｍＡｂ）によるＢ７−ＣＤ２８同時刺激経路の妨害は、自己免疫疾患、移植した
器官の拒絶および対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）の進行を阻害する（Ｃｒｏｓｓ
，Ａ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９５：２７８３−２７８９（１９
９５）；Ｌｅｎｓｃｈｏｗ，Ｄ．Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：７８９−７
９２（１９９２）；Ｂｌａｚａｒ，Ｂ．Ｒ．ら、Ｂｌｏｏｄ ８３：３８１５−
３８２５（１９９４））。一方、Ｂ７の遺伝子移入または４−１ＢＢに対するア
ゴニストｍＡｂによる同時刺激シグナルの刺激は、抗腫瘍免疫応答を増強し得る
（Ｃｈｅｎ，Ｌ．ら、Ｃｅｌｌ ７１：１０９３−１１０２（１９９２）；Ｍｅ
ｌｅｒｏ，Ｉ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．３：６８２−６８５（１９９７））。これ
らの研究は、同時刺激相互作用が、免疫応答の誘発の間に重要な役割を果たすこ
とを示す。より重要には、同時刺激経路は、治療目的のために操作され得る。

【０７７０】 ＬＩＧＨＴ（リンホトキシンに対する相同、誘導発現を示し、そしてＴリンパ
球により発現されるレセプターであるＨＶＥＭについてＨＳＶ糖タンパク質Ｄと
競合する）といわれるＡＩＭ ＩＩはまた、ＴＮＦサイトカインファミリーのメ
ンバーであり（Ｍａｕｒｉ，Ｄ．Ｎ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ８：２１−３０（
１９９８））、このｍＲＮＡは、活性化に際して大多数の末梢血単核細胞（ＰＢ
ＭＣ）において検出され得る（Ｍａｕｒｉ，Ｄ．Ｎ．ら、 Ｉｍｍｕｎｉｔｙ
８：２１−３０（１９９８）；Ｚｈａｉ，Ｙ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ
．１０２：１１４２−１１５１（１９９８））。２つの細胞レセプターである、
ＨＶＥＭ（ＡＴＡＲ、ＴＲ２）およびＬＴβＲは、高親和性でＡＩＭ ＩＩと結
合することが見出される（Ｍａｕｒｉ，Ｄ．Ｎ．ら、 Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ８：
２１−３０（１９９８））。ＨＶＥＭの発現は、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞
を含む大多数の造血細胞において検出され得、そして内皮細胞においては弱く検
出され得る（Ｈａｒｒｏｐ，Ｊ．Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：１７８
６−１７９４（１９９８）；Ｋｗｏｎ，Ｂ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２
７２：１４２７２−１４２７６（１９９７））。対照的に、ＬＴβＲは、Ｔ細胞
およびＢ細胞においては見出されないが、単球および間質細胞において高レベル
で発現される（Ｂｒｏｗｎｉｎｇ，Ｊ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：
３２８８−３２９８（１９９７））。ＡＩＭ ＩＩは、インビトロおよびインビ
ボでいくつかの腫瘍株のアポトーシスを誘発し、そしてその効果は、腫瘍細胞上
のＨＶＥＭおよびＬＴβＲの両方の発現を必要とするようである（Ｚｈａｉ，Ｙ
．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０２：１１４２−１１５１（１９９８）
）。しかし、これらのレセプターは、典型的な死ドメインを欠く（Ｍｏｎｔｇｏ
ｍｅｒｙ，Ｒ．Ｉ．ら、Ｃｅｌｌ ８７：４２７−４３６（１９９６）；Ｓｍｉ
ｔｈ，Ｃ．Ａ．ら、Ｃｅｌｌ ７６：９５９−９６２（１９９４））。最近の報
告は、ＡＩＭ ＩＩはまた、膜貫通配列の欠如に起因して可溶性形態でのみ発現
される、ＴＲ６、おとり（ｄｅｃｏｙ）レセプター（ＤｃＲ３）に結合し得るこ
とを示す（Ｙｕ，Ｋ．Ｙ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１３７３３−
１３７３６（１９９９））。

【０７７１】 いくつかの最近の研究は、ＡＩＭ ＩＩが細胞免疫応答の調節に関与し得るこ
とを示唆する。ＡＩＭ ＩＩは、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の三元の混合リン
パ球反応（ＭＬＲ）を刺激する（Ｈａｒｒｏｐ，Ｊ．Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２７３：２７５４８−２７５５６（１９９８））。この刺激は、ＨＶＥ
Ｍ連結を介して媒介するようである。なぜなら、Ｔ細胞は、ＬＴβＲを発現しな
いからである（Ｂｒｏｗｎｉｎｇ，Ｊ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：
３２８８−３２９８（１９９７））。ＨＶＥＭは、いくつかのＴＮＦレセプター
関連因子（ＴＲＡＦ）と相互作用し、そして２９３細胞におけるＨＶＥＭの過剰
発現は、核因子（ＮＦ）−κＢの活性化を誘導する（Ｈｓｕ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１３４７１−１３４７４（１９９７）；Ｍａｒｓｔｅ
ｒｓ，Ｓ．Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１４０２９−１４０３２
（１９９７））。ＨＶＥＭ−Ｉｇまたは特異的ｍＡｂによるＨＶＥＭの遮断は、
ＰＢＭＣの同種ＭＬＲを阻害し得る（Ｈａｒｒｏｐ，Ｊ．Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．１６１：１７８６−１７９４（１９９８）；Ｋｗｏｎ，Ｂ．Ｓら、Ｊ．
Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２７２：１４２７２−１４２７６（１９９７））。概して、
これらの結果は、ＡＩＭ ＩＩおよびＨＶＥＭの相互作用が同種Ｔ細胞応答の生
成に関与することを支持する。

【０７７２】 ヒトＡＩＭ ＩＩのマウスホモログは、クローニングされそして特徴付けられ
た。さらに、ＡＩＭ ＩＩが、Ｔ細胞の増殖および分化に重要であるＣＤ２８非
依存性同時刺激分子であることが示された。腫瘍およびＧＶＤＦにおけるＴ細胞
媒介免疫応答がＡＩＭ ＩＩ同時刺激経路のインビボでの操作により調節され得
ることもまた示された。

【０７７３】 （マウス ＡＩＭ ＩＩの分子クローニング） ヒトＡＩＭ ＩＩのマウスホモログの全長ｃＤＮＡは、ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末
端の高速増幅）およびＲＴ−ＰＣＲの組み合わせによりＣｏｎＡ活性化マウスＴ
細胞から単離し、そしてｐｃＤＮＡ３哺乳動物細胞発現ベクター（ｐｍＡＩＭ
ＩＩ）にクローン化した。マウスＡＩＭ ＩＩのｃＤＮＡは、推定２３９−アミ
ノ酸タンパク質をコードし、このマウスＡＩＭ ＩＩのｃＤＮＡは、ＩＩ型膜貫
通タンパク質の特徴を有し、ヒトＡＩＭ ＩＩと７７％アミノ酸相同性を示す（
図１７Ａ）。マウスＡＩＭ ＩＩの推定レセプター結合領域は、Ｆａｓリガンド
、ＬＴβ、ＬＴα、ＴＮＦ、ＲＡＮＫリガンドおよびＴＲＡＩＬの推定レセプタ
ー結合領域と有意な配列相同性を有する（Ｆａｓリガンド（３３％）、ＬＴβ（
３０％）、ＬＴα（２８％）、ＴＮＦ（２７％）、ＲＡＮＫリガンド（２６％）
およびＴＲＡＩＬ（２３％））（データは示さず）。２９３細胞へのｐｍＡＩＭ
ＩＩのトランスフェクションに際して、ＡＩＭ ＩＩの表面発現は、フローサ
イトメトリー分析によりウサギ抗ＡＩＭ ＩＩ抗血清またはＬＴβＲ−Ｉｇ融合
タンパク質で染色された（図１７Ｂ−１〜図１７Ｂ−４）。

【０７７４】 （ＡＩＭ ＩＩは、ＣＤ２８非依存性Ｔ細胞応答を同時刺激する） ヒトＡＩＭ ＩＩタンパク質が、インビトロ培養において同種抗原に対するヒ
ト末梢血単核細胞の増殖応答を増強し得ることが示された（Ｈａｒｒｏｐ，Ｊ．
Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２７５４８−２７５５６（１９９８
））。このことは、ＡＩＭ ＩＩがＴ細胞応答に関与し得ることを示唆する。し
かし、この増強の性質は、明確ではない。ＡＩＭ ＩＩがＴ細胞レセプターシグ
ナルの存在下で刺激分子として機能し得る可能性が、試験された。この目的のた
めに、最適以下の量で固定した抗ＣＤ３ ｍＡｂの存在下で、精製した成熟Ｔ細
胞を刺激するために、トランスフェクトしたＡＩＭ ＩＩを発現するＣＯＳ細胞
を使用するインビトロ同時刺激アッセイを使用した。ＣＯＳ細胞は、コントロー
ルベクターをトランスフェクトしたＣＯＳ細胞増殖の増加と比較してＴ細胞増殖
の有意な増加を誘導する、ｐｍＡＩＭ ＩＩでトランスフェクトした（図１８Ａ
）。抗ＣＤ３の非存在下で、ｐｍＡＩＭ ＩＩをトランスフェクトしたＣＯＳ細
胞は、Ｔ細胞増殖を刺激しなかった（図１８Ａ）。この結果は、ＡＩＭ ＩＩが
、抗原シグナルの存在下でＴ細胞の増殖を同時刺激し得ることを示す。この結論
についての直接的な証拠を提供するために、８アミノ酸フラッグペプチドと融合
したマウスＡＩＭ ＩＩの細胞外ドメインからなる融合タンパク質（ＡＩＭ Ｉ
Ｉ．フラッグ）が、調製された。図１８Ｂに示されるように、固定したＡＩＭ
ＩＩ．フラッグは、用量依存様式で最適以下の抗ＣＤ３の存在下で、精製したマ
ウスＴ細胞の増殖を強力に刺激した。図１８Ａにおける結果と同様に、ＡＩＭ
ＩＩ．フラッグは、抗ＣＤ３の非存在下でＴ細胞を刺激しなかった（図１８Ｂ）
。これらの結果は、ＴＣＲが関与する場合、ＡＩＭ ＩＩがＴ細胞の増殖を同時
刺激し得ることを示す。

【０７７５】 ＡＩＭ ＩＩ同時刺激がＢ７−ＣＤ２８経路（最も集中して研究された同時刺
激経路（Ｌｅｎｓｃｈｏｗ，Ｄ．Ｊ．ら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
１４：２３３−２５８（１９９６））である）に関連するか否かを決定するため
に、ＣＤ２８欠乏（ＣＤ２８^-/-）マウスから単離されたＴ細胞および抗ＣＤ３
ｍＡｂの存在下での正常な同腹仔から単離されたＴ細胞の増殖を刺激する、Ａ
ＩＭ ＩＩ．フラッグの能力を比較した。図１８Ｃに示されるように、ＡＩＭ
ＩＩ．フラッグ融合タンパク質は、ＣＤ２８^+/+Ｔ細胞の増殖と比較可能なレベ
ルでＣＤ２８^-/-Ｔ細胞の増殖を刺激した。一方、ＣＤ２８^-/-マウスにおける抗
ＣＤ２８ ｍＡｂに対する増殖応答は、観察されなかった。まとめると、これら
の結果は、ＡＩＭ ＩＩがＣＤ２８同時刺激経路に関係なく機能し得ることを示
す。

【０７７６】 （インビボでのＡＩＭ ＩＩ遺伝子移入によるＴ細胞媒介腫瘍免疫の増大） ＡＩＭ ＩＩ同時刺激の増大が、インビボでの細胞媒介免疫応答を増加し得る
か否かを試験するために、ｐｍＡＭＩ ＩＩプラスミドは、Ｐ８１５腫瘍細胞に
より誘発される、確立された腫瘍塊中へ直接注射され、そして腫瘍抗原に対する
細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の誘導における、およびその腫瘍塊の後退における
ＡＩＭ ＩＩ発現の効果が試験された。リポソームが運搬するかまたは裸の、免
疫刺激性遺伝子（例えば、抗原（Ｂ７およびサイトカイン））をコードするプラ
スミドの投与は、哺乳動物組織において分子を発現し得、そしてＴ細胞応答を刺
激する際に効果的であることが示された（Ｋｉｍ，Ｊ．Ｊ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏ
ｔｈｃｈ．１５：６４１−６４６（１９９７）；Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ，Ｎ．Ｓ．
ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：６４７−６５２（１９９７）；Ｐｌａｕｔ
ｚ，Ｇ．Ｅ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｕｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：４
６４５−４６４９（１９９３）；Ｓｙｒｅｎｇｅｌａｓ，Ａ．Ｄ．ら、Ｎａｔ．
Ｍｅｄ．２：１０３８−１０４１（１９９６）；Ｉｗａｓｋｉ，Ａ．ら、Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．１５８：４５９１−４６０１（１９９７））。さらに、２×１０ ⁵ 個のＰ８１５細胞で皮下に（ｓ．ｃ．）播種したマウスが、一週間に平均直径
で３〜５ｍｍのサイズの範囲の明確な腫瘍を生じることが、以前に示されている
（Ｃｈｅｎ，Ｌ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：５２３−５３２（１９９４
））。

【０７７７】 リポソームが運搬するｐｍＡＩＭ ＩＩを、腫瘍細胞の皮下への播種から７日
後に開始し、繰り返し腫瘍塊中に注射した。トランスフェクトされたＡＩＭ Ｉ
Ｉの発現は、ＲＴ−ＰＣＲにより腫瘍塊中で検出され得る（データは示さず）。
最後のプラスミド注射の一週間後、脾細胞は、４日間混合されたリンパ球−腫瘍
培養中で刺激され、そして標準の⁵¹Ｃｒ放出アッセイにおいてＰ８１５細胞に対
するこれらのＣＴＬ活性のついてアッセイされた（Ｃｈｅｎ，Ｌ．ら、Ｃｅｌｌ
７１：１０９３−１１０２（１９９２））。ｐｍＡＩＭ ＩＩで処置されたマ
ウスは、培地またはコントロールベクターで処置したマウスと比較して、ｐ８１
５細胞に対する明らかに増加したＣＴＬ活性を有した（図１９Ａ−１）。ＣＴＬ
は、高レベルでｐ８１５細胞を溶解したが、ＣＴＬは、同じアッセイにおいてＬ
１２１０細胞を殺傷せず（図１９Ａ−２）、このことは、ＣＴＬがＰ１８５腫瘍
抗原に特異的であることを示す。これらの結果は、インビボでのＡＩＭ ＩＩの
同時刺激がＰ８１５腫瘍抗原に対するＣＴＬ応答を増大し得ることを示す。

【０７７８】 ｐｍ−ＡＩＭ ＩＩの繰り返しの注射は、注射の開始から３週間内に、全ての
処置したマウスにおいて腫瘍後退をさらに誘導した（図１９Ｂ）。一方、培地ま
たはコントロールベクターにより処置したコントロール群のマウスは、進行性増
殖腫瘍を生じた。数匹のマウスで、コントロールベクターの注射は、おそらく非
特異的炎症に起因して腫瘍増殖のｓＡＩＭ ＩＩ遅延を生じた。いかなる場合も
、コントロール群における全ての腫瘍は、進行的に増殖し、そして最終的にマウ
スを殺した。

【０７７９】 ｐｍＡＩＭ ＩＩプラスミド注射後の消失した腫瘍を有するマウスは、再発せ
ずに、４０日以上腫瘍を有しないままであった（図１９Ｂ）。長期的な腫瘍免疫
が生じたか否かを試験するために、このマウスを、致死量のＰ８１５細胞で試験
した。図１９Ｃ〜１に示されるように、これらのマウスは、この試験後、腫瘍を
有しないままであり、一方全てのネイティブなマウスは、腫瘍を発生した。この
保護は、Ｐ８１５に特異的であった。なぜなら、Ｌ１２１０（抗原的に無関係な
同系のリンパ腫）の細胞を有するマウスの試験は、ネイティブなマウスにおける
増殖と同様のスピードで腫瘍増殖を誘導するからである（図１９Ｃ−２）。

【０７８０】 （ＡＩＭ ＩＩの妨害によるアロ反応性Ｔ細胞媒介ＧＶＨＤの回復） 細胞媒介免疫応答における、内在性ＡＩＭ ＩＩの役割を決定するために、Ｌ
ＴβＲ−Ｉｇ（ＡＩＭ ＩＩの可溶性レセプター）を投与し、そしてマウス急性
ＧＶＨＤモデルにおけるＡＩＭ ＩＩ経路をブロックする効果が試験された。こ
のモデルにおいて、致死的に放射線照射されたかまたは放射線照射されていない
ＢＤＦ１（Ｈ−２^b×^d）レシピエントなマウスへのＢ６（Ｈ−２^b）由来Ｔ細胞
の注入は、急性ＧＶＨＤを増加し、急速な体重減少、アロ反応性ドナーＴ細胞の
発現、宿主脾細胞の減少、胸腺の収縮およびマウスの急速な死が伴う（Ｖｉａ，
Ｃ．Ｓ．およびＳｈｅａｒｅｒ，Ｇ．Ｍ．、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ９：
２０７−２１３（１９８８））。Ｂ６マウス由来の７×１０⁷個の脾細胞を用い
た静脈内（ｉ．ｖ．）注射後、レシピエントなマウスは、非細胞移入の１日前か
ら始めて３日毎にｉ．ｖ．でＬＴβＲ−Ｉｇを受けた。ＬＴβＲ−Ｉｇで処置し
た全てのマウスは、３０日まで生存し（図２０Ａ）、ＧＶＨＤ誘発後、一時的に
減少したマウスの体重を増加し（図２０Ｂ）、そしてＢ６脾細胞移入の１１日後
にアッセイされた脾臓において、減少したアロ反応性（Ｈ−２^dに対して）ＣＴ
Ｌ活性を有した（図２０Ｃ−１および図２０Ｃ−２）。対照的に、コントロール
Ｉｇで処置した全てのマウスは、激しい体重の減少が伴う非細胞移入後２週間以
内に死んだ（図２０Ａおよび図２０Ｂ）。ＢＤＦ１マウス由来の脾細胞が移入さ
れたコントロールＢＤＦ１マウスと比較して、高度なレベルのアロ反応性ＣＴＬ
活性が、ＧＶＨＤを経験したマウスにおいて検出され得る（図２０Ｃ−１および
図２０Ｃ−２）。さらに、ＧＶＨＤによる典型的な結果である宿主脾臓Ｂリンパ
球およびダブルポジティブな胸腺細胞の減少は、ＬＴβＲ−Ｉｇ注射により有意
に阻害された（データは示さず）。これらの結果は、ＬＴβＲ−Ｉｇがアロ反応
性Ｔ細胞媒介ＧＶＨＤを回復し得ることを示す。

【０７８１】 これらのデータは、ＡＩＭ ＩＩ同時刺激経路の妨害がＧＶＨＤを予防するこ
とに関連するが、ＬＴβがさらなる役割を果たし得ることは可能である。なぜな
ら、ＬＴβＲ−Ｉｇが、ＧＶＨＤに罹っているマウスにおける内在性ＬＴβ産生
を中和し得るからである。この可能性を取り除くために、ＬＴα３複合体および
ＬＴα１β２へテロ三量体（ＬＴβ）の両方を欠くＬＴα欠失Ｂ６マウス由来の
脾細胞（Ｗａｒｅ，Ｃ．Ｆ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｉｂｉｏｌ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．１９８：１７５−２１８（１９９５））を、放射線照射していない
ＢＤＦ１マウス中に移入し、そして抗宿主ＣＴＬ活性の生成を試験した。ＬＴα
欠失Ｂ６マウス由来の脾細胞を使用して移入したＢＤＦ１レイシピエントマウス
は、ＬＴα^+/+同腹仔コントロールの応答と同様にアロ反応性ＣＴＬ応答を示し
た（図２０Ｄ−１および図２０Ｄ−２）。この結果は、ドナー細胞からのＬＴβ
産生が、このＧＶＨＤモデルにおいてアロ反応性ＣＴＬ応答を生成するために必
要ではないことを示す。

【０７８２】 ＬＴα^-/-Ｂ６Ｔ細胞を使用するインビトロでの同種抗原に対するＣＴＬの生
成に対するＬＴβＲ−Ｉｇの効果をまた試験した。図２０−１および図２０Ｅ−
２に示すように、５日間、放射線照射したＢＡＬＢ／ｃ脾細胞によるＬＴα^-/-
Ｂ６Ｔ細胞の刺激は、Ｈ−２^d標的に対する有意なＣＴＬ活性を誘導する。従っ
て、図２０Ｄ−１および図２０Ｄ−２に示されるインビボ実験と同様に、アロ反
応性Ｔ細胞のインビトロ誘導は、ＬＴに非依存的である。さらに、有意にアロ反
応性ＣＴＬ応答が阻害される培養物には、コントロールＩｇではなくＬＴβＲ−
Ｉｇが含まれる（図２０Ｅ−１および図２０Ｅ−２）。まとめると、これらの結
果は、アロ反応性Ｔ細胞の生成へのＬＴの関与を否定し、そしてＬＴβＲ−Ｉｇ
によるＡＩＭ ＩＩの妨害が、アロ反応性ＣＴＬ媒介ＧＶＨＤの阻害に応答可能
であり得ることを示唆する。

【０７８３】 （ＡＩＭ ＩＩ同時刺激によるＴｈ１様サイトカインの優先的な誘発） Ｔ細胞の分化におけるＡＩＭ ＩＩの同時刺激および阻害の効果が研究される
。Ｂ６マウス由来の精製したＴ細胞を、２日間、最適以下の量の抗ＣＤ３の存在
下で固定したＡＩＭ ＩＩフラッグ融合タンパク質で刺激し、そして培養上清を
サンドイッチＥＬＩＳＡによりＴｈ１型およびＴｈ２型のサイトカインについて
分析した。図２１Ａ−１〜図２１Ａ−４に示すように、ＡＩＭ ＩＩフラッグは
、ＩＦＮ−γおよびＧＭ−ＣＳＦの産生を劇的に同時刺激し、一方ＩＬ−４およ
びＩＬ−１０の分泌は、変化しなかった。図２１Ｅに示すように、同種ＭＬＲの
培養上清中のサイトカイン産生を試験した。ＬＴα欠失脾細胞から精製したＴ細
胞を使用し、ＬＴの効果を除いた。同種ＭＬＲの培養上清は、高レベルのＩＦＮ
−γおよびＧＭ−ＣＳＦを含み、一方ＩＬ−４およびＩＬ−１０は、微弱または
検出不可能のどちらかであった。ＬＴβＲ−Ｉｇの包含は、ＩＦＮ−γおよびＧ
Ｍ−ＣＳＦ産生を有意に阻害した（図２１Ｂ−１〜図２１Ｂ−４）。これらの結
果は、ＡＩＭ ＩＩ同時刺激経路がＴｈ１型Ｔ細胞応答を優先的に誘発し、一方
ＡＩＭＩＩ同時刺激の妨害は、Ｔｈ１型サイトカイン産生を減少することを示す
。

【０７８４】 （考察） ヒトＡＩＭ ＩＩのマウスホモログをクローニングし、そしてその免疫調節機
能を研究した。得られたデータは、ＡＩＭ ＩＩがＣＤ２８非依存的Ｔ細胞活性
化に重要な同時刺激分子であり、そしてＴｈ１型サイトカイン産生を優先的に誘
導することを示す。２つのマウスモデルを使用して、Ｐ８１５腫瘍に対する、お
よび急性ＧＶＨＤにおける同種抗原に対するＴ細胞媒介免疫応答を試験した。確
立されたＰ８１５腫瘍の回復を誘導する、ＡＩＭ ＩＩ遺伝子移入が刺激する腫
瘍特異的ＣＴＬ活性、およびＬＴβＲ−ＩｇによるＡＩＭ ＩＩの妨害は、ＧＶ
ＨＤを後退し得る。従って、これらの研究は、新規な同時刺激分子（ＡＩＭ Ｉ
Ｉ）を細胞媒介免疫応答の誘発に重要な成分として確立する。

【０７８５】 ＡＩＭ ＩＩは、潜在的に３つのレセプター（ＨＶＥＭ、ＬＴβＲおよびＤｃ
Ｒ３／ＴＲ６）に結合し（Ｍａｕｒｉ，Ｄ．Ｎ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ８：２
１−３０（１９９８）；Ｙｕ，Ｋ．Ｙ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：
１３７３３−１３７３６（１９９９））、シグナルを伝達し、そして他の細胞と
相互作用するが、本研究におて記載されるように、ＨＶＥＭのみがＴ細胞同時刺
激に応答可能であるようである。このことは、ＬＴβＲがＴ細胞上に見出されず
（Ｂｒｏｗｉｎｇ，Ｊ．Ｌ．ら、Ｊ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：３２８８−３２
９８（１９９７））、そしてＤｃＲ３／ＴＲ６タンパク質は膜貫通ドメインを有
さない（Ｙｕ，Ｋ．Ｙ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１３７３３−１
３７３６（１９９９）；Ｐｉｔｔｉ，Ｒ．Ｍ．ら、Ｍａｔｕｒｅ ３９６：６９
９−７０３（１９９８））という以前の発見に基づく。ＡＩＭ ＩＩによるＨＶ
ＥＭの関与は、同時刺激シグナルを明確に送達するが、他のレセプターは、ＡＩ
Ｍ ＩＩ媒介同時刺激の調節に関与し得る。ＬＴβＲがリンパ組織の複数の非リ
ンパ間質細胞により発現され（Ｂｒｏｗｉｎｇ，Ｊ．Ｌ．ら、Ｊ，Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．１５９：３２８８−３２９８（１９９７）；Ｆｏｒｃｅ，Ｗ．Ｒ．ら、Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１５：５２８０−５２８８（１９９５））、そして高親和性
でＡＩＭ ＩＩと結合する（Ｍａｕｒｉ，Ｄ．Ｎ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．３：６
８２−６８５（１９９７））という事実を考慮すると、リンパ器官におけるＡＩ
Ｍ ＩＩのＨＶＥＭへのアクセスが、ＬＴβＲにより妨害されることが推測され
得る。ＡＩＭ ＩＩおよびＬＴβＲの相互作用に関する結果は、知られてないが
、特異的なｍＡｂまたはＬＴβによるＬＴβＲの架橋は、ケモカインＩＬ−８お
よびＲＡＮＴＥＳの分泌を誘導し（Ｄｅｇｌｉ−Ｅｓｐｏｓｔｉ，Ｍ．Ａ．ら、
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：１７５６−１７６２（１９９７））、そしてイン
ビトロでいくつかの腫瘍株に増殖阻害シグナルを送達する（Ｄｅｇｌｉ−Ｅｓｐ
ｏｓｔｉ，Ｍ．Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：１７５６−１７６２（１
９９７）；Ｂｒｏｗｉｎｇ，Ｊ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：８６７
−８７８（１９９６））。従って、異なるレセプターと結合することによって、
ＡＩＭ ＩＩが先天免疫応答および順応性免疫応答の調節に関与し得ることは、
可能である。ＡＩＭ ＩＩの別のレセプターであるＤｃＲ３／ＴＲ６が、多くの
肺癌および大腸癌において過剰発現され、そしてまたＦａｓＬに結合する（Ｐｉ
ｔｔｉ，Ｒ．Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３９６：６９９−７０３（１９９８））と
考えられることは、特に興味深い。これらの結果は、Ｐｉｔｔｉおよび同僚らの
研究（Ｐｉｔｔｉ，Ｒ．Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３９６：６９９−７０３（１９
９８））により示されるようにＤｃＲ３／ＴＲ６によるＦａｓ−ＦａｓＬ媒介ア
ポトーシスの予防に加えて、いくつかの腫瘍が可溶性ＤｃＲ３／ＴＲ６を分泌し
、ＡＩＭ ＩＩを中和し、Ｔ細胞の活性化を上昇し得ることを示唆する。しかし
、これらの研究は、腫瘍塊へのＡＩＭ ＩＩの遺伝子の移入により増強されたＡ
ＩＭ ＩＩ−ＨＶＥＮ相互作用が確立された腫瘍細胞の後退を誘導し得ることを
示し（図１９）、このことは、ＡＩＭ ＩＩ−ＨＶＥＭ同時刺激経路が操作され
得、腫瘍に対する増強されたＴ細胞応答を誘導することを示唆する。同時に、Ａ
ＩＭ ＩＩによる遺伝子移入が、Ｐ８１５に加えて、腫瘍の広域スペクトルに効
果的であり得るか否かが分かる。

【０７８６】 ＡＩＭ ＩＩは、免疫系のほかの成分の非存在下で腫瘍細胞の死を誘導し得る
。ＡＩＭ ＩＩが、細胞培養物中のいくらかの腫瘍細胞のアポトーシスを直接誘
発し、そしてＡＩＭ ＩＩがトランスフェクトされたヒト乳癌株がＴ細胞欠失胸
腺ヌードマウスにおいて後退することが示された（Ｚｈａｉ，Ｙ．ら、Ｊ．Ｃｌ
ｉｎ，Ｉｎｖｅｓｔ．１０２：１１４２−１１５１（１９９８））。ＬＴβＲお
よびＨＶＥＭの両方を発現する細胞のみがＡＩＭ ＩＩ媒介アポトーシスに対し
て感受性である（Ｚｈａｉ，Ｙ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ，Ｉｎｖｅｓｔ．１０２：１
１４２−１１５１（１９９８））ことは、興味深い。それにも関わらず 、このアポトーシスの機構は、これらの研究において除外され得る。なぜなら、
Ｐ８１５は、ＲＴ−ＰＣＲ分析によりＬＴβＲおよびＨＶＥＭの両方に対してネ
ガティブであったからである（データは示さず）。さらに、Ｐ８１５腫瘍の後退
についての機構は、Ｐ８１５に特異的な増幅されたＣＴＬ応答に明らかに相関す
る（図１９Ａ−１および図１９Ａ２）。先の研究は、ＣＤ４⁺、ＣＤ８⁺、Ｔ細胞
またはＮＫ細胞の枯渇が、少なくとも部分的に、ＡＩＭ ＩＩ誘発腫瘍の後退の
効果を抑止することを示し（データは示さず）、このことは、リンパ球のこれら
のサブセットが、ＡＩＭ ＩＩ誘発腫瘍免疫に関与することを示唆した。

【０７８７】 内因性同時刺激経路（例えば、Ｂ７−ＣＤ２８およびＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０）
の遮断は、動物モデルにおいて、ＧＶＨＤの寛解を誘導する（Ｂｌａｚａｒ，Ｂ
．Ｒ．ら、Ｂｌｏｏｄ ８３：３８１５−３８２５（１９９４）；Ｄｕｒｉｅ，
Ｆ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１３３３−１３３８（１９９
４））。ＡＩＭ ＩＩを、大量の活性化ＰＢＭＣの存在下で検出し得（Ｈａｒｒ
ｏｐ，Ｊ．Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：１７８６−１７９４（１９９
８））、そして免疫応答におけるこれらの内因的に発現されたＡＩＭ ＩＩの役
割は、あまり知られていない。最近の研究は、ＨＶＥＭに対するｍＡｂがインビ
トロで同種ＭＬＲにおいてＴ細胞の増殖を有意に阻害し得ることを示し（Ｈａｒ
ｒｏｐ，Ｊ．Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：１７８６−１７９４（１９
９８））、このことは、内因性ＡＩＭ ＩＩ−ＨＶＥＭ相互作用が同種Ｔ細胞の
誘発に必要であることを示唆した。これらの研究は、この知見を発展させ、そし
てＬＴβＲ−Ｉｇの注入が、Ｆ１レシピエントにおけるＧＶＨＤの発症を予防し
、そして同種ＣＴＬ活性を阻害し（図２０）そしてＦ１レシピエントにおけるド
ナーＴ細胞の発現を阻害する（データは示さず）ことを示す。これらの結果は、
ＬＴβＲ−Ｉｇによる内因性ＡＩＭ ＩＩの遮断の結果として解釈され得るが、
いくつかの代替の解釈が考慮されるべきである。ＬＴα、ＬＴβもしくはＬＴβ
Ｒの遺伝的破壊、または妊娠マウスへのＬＴβＲ−Ｉｇの注射は、リンパ節発生
を阻害し、そして正常な脾臓構築の発達を妨げる（Ｃｈａｐｌｉｎ，Ｄ．Ｄ．お
よびＦｕ，Ｙ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：２８９−２９７
（１９９８））。成体マウスにおいて、ＬＴβＲ−Ｉｇの注入は、濾胞樹状細胞
（ＦＤＣ）を減少し、体液性免疫応答を誘導する（Ｍａｃｋａｙ，Ｆ．およびＢ
ｒｏｗｉｎｇ，Ｊ．Ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３９５：２６−２７（１９９８））。
しかし、ＦＤＣの減少がこれらのマウスにおいて抗原提示機能に影響しないこと
は、明らかである。例えば、ＧＶＨＤは、ＴＮＦＲｐ５５欠失マウスにおいて誘
導され得る（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７１：１２８９
−１２９１（１９９６））が、これらのマウスは、ＬＴαノックアウトマウスに
おいて観察される構築と同様に、ＦＤＣネットワークを破壊しており、そして脾
臓の構築を障害していた（Ｓｐｅｉｓｅｒ，Ｄ．Ｅ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
１５８：５１８５−５１９０（１９９７））。ＬＴαおよび膜結合ＬＴβの両方
を欠くＬＴα^-/-ドナー細胞（Ｗａｒｅ，Ｃ．Ｆ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８：１７５−２１８（１９９５））の移
入は、インビボで抗宿主ＣＴＬ応答をなお生成し（図２０）、このことは、ＬＴ
α欠失マウス中のＴ細胞が機能的に正常であり、そしてドナー細胞のＬＴαまた
はＬＴαβ複合体がＧＶＤＨの誘導期に必要とされないことを示唆する。

【０７８８】 さらに、これらの研究は、放射線照射したＢＡＬＢ／ｃ脾臓細胞のを有するＬ
Ｔα欠失マウス由来の精製したＢ６Ｔ細胞の同時培養が、同種ＣＴＬを正常に誘
導することを示し、また、ドナー細胞のＬＴα複合体またはＬＴαβ複合体がこ
の系において同種ＣＴＬの誘導に必要とされないことを示す。最終的に、ＬＴβ
Ｒ−Ｉｇの包含は、ＭＬＲアッセイにおけるＬＴα欠失Ｔ細胞からの同種ＣＴＬ
生成を完全に抑止する。レシピエント由来のＬＴβは、この研究で観察されるＧ
ＶＨＤにおいて役割を果たさないようである。なぜなら、ＧＶＨＤに対する重要
な応答物であるＴ細胞は、ＬＴβＲを発現しないからである。さらに、Ｔ細胞、
Ｂ細胞、ＮＫ細胞を含む放射線感受性ＬＴβ−産生細胞を除去した、放射線照し
たＢＤＦ１マウスに移入したドナーＴ細胞を、なお感作し、ＧＶＨＤを誘導し得
る（図２０Ａ、図２０Ｂ）。まとめると、これらのデータは、ＧＶＨＤの発症に
おけるＬＴの役割を否定し、そして、これらの応答におけるＡＩＭ ＩＩの重要
な寄与を支持する。要約すると、これらの研究は、ＡＩＭ ＩＩが細胞媒介免疫
応答において重要な成分であること、およびＡＩＭ ＩＩ同時刺激経路が癌、移
植および自己免疫疾患のような疾患の治療的利点に関して操作され得ることを示
す。

【０７８９】 （方法） （マウス）雌のＣ５７ＢＬ／６（Ｂ６）マウス、ＢＡＬＢ／ｃマウス、ＤＢＡ
／２マウスおよびＦ１（Ｂ６×ＤＢＡ／２）（ＢＤＦ１）マウスをＮａｔｉｏｎ
ａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ−Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤから購入
した。Ｂ６バックグラウンドにおけるＣＤ２８^-/-マウスおよびＬＴα^-/-マウス
は、以前に記載される（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ａ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：
３７０２−３７０８（１９９９）；ＤｅＴｏｇｎｉ，Ｐ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２６４：７０３−７０７（１９９４））。

【０７９０】 （細胞株）ＣＯＳ、２９３ヒト肝臓上皮細胞、Ｐ８１５マウス肥満細胞腫、Ｌ
１２１０マウスリンパ腫およびＥＬ−４マウスＴ細胞リンパ腫を、Ａｍｅｒｉｋ
ａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入
した。Ｃ２６マウス大腸癌株は、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａ
ｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥのＲｏｂｅｒｔ Ｅｖａｎｓ博士により快く提供された
。細胞株を、１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、２５ｍＭ
ＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン Ｇおよび１００μｇ／ｍｌ 硫酸ス
トレプトマイシンで補充したＲＰＭＩ−１６４０（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇａｉ
ｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）の完全培地中で維持した。

【０７９１】 （マウスＡＩＭ ＩＩ ｃＤＮＡの単離）マウスＡＩＭ ＩＩ ｃＤＮＡをヒ
トＡＩＭ ＩＩの縮重プライマーを使用してＰＣＲにより単離した。センスプラ
イマー（５’−ＴＴＴＣＧＴＩＧＡＴＣＧＧＩＣＡ−３’（配列番号６２）（Ｉ
は、イノシンを表す））は、３１〜４７におけるヒトＡＩＭ ＩＩに対応する配
列を保有する。アンチセンス（５’ＡＧＧＡＴＧＩＡＣＩＡＣＩＣＣＩＣＣ−３
’（配列番号６３））は、６０９から６２６におけるヒトＡＩＭ ＩＩ配列に対
応する。ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓由来のポリ（Ａ）^-ＲＮＡを逆転写し、そし
て上記プライマーを用いてＰＣＲに供した。ＰＣＲ産物の配列は、ヒトＡＩＭ
ＩＩ ｃＤＮＡの配列に高度に相同であり、そしてこの産物を使用して、Ｍａｒ
ａｔｈｏｎ^TM ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｃｌｏｎｔｅｃ
ｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用してＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の高速増幅
）手順により、失った５’末端および３’末端を単離した。マウスＡＩＭ ＩＩ
の全長ｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂ
ａｄ，ＣＡ）中はクローン化した。マウスＡＩＭ ＩＩとヒトＡＩＭ ＩＩとの
間の相同性をＭａｃｖｅｃｔｏｒ６．５のＣｌｕｓｒｔａｌＷプログラムにより
分析した。

【０７９２】 （融合タンパク質および抗体）マウスＬＴβＲ−Ｉｇ融合タンパク質を調製す
るために、マウス肺ｍＲＭＡ由来の、マウスＬＴβＲ細胞外ドメインをコードす
るｃＤＮＡをセンスプライマー：（５’−ＡＡＡＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＧＣＣ
Ｔ−３’（配列番号６４））およびアンチセンスプライマー：（５’−ＴＴＡＡ
ＧＣＴＴＣＡＧＴＡＧＣＡＴＴＧＣＴＣＣＴＧＧＣＴ−３’（配列番号６５））
を使用するＲＴ−ＰＣＲにより生成した。ＮｏｃＩ／ＨｉｎｄＩＩＩでの消化後
、このＰＣＲ産物をｐ３０２４２ベクター中のＩＬ−３リーダー配列と融合し、
次いでＩＥ−１７５プロモーターおよびヒトＩｇＧ１のＦｃタンパク質を含むｐ
Ｘ５８ベクター中へサブクローン化した。次いで、この構築物をＢＨＫ／ＶＰ１
６細胞中にトランスフェクトし、そしてマウスＬＴβＲ−Ｉｇ融合タンパク質を
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ アフィニティーカラムにより馴化培
地から精製した。次いで画分を４〜２０％勾配ゲルを通してＳＤＳ−ＰＡＧＥに
より分析し、所望のタンパク質の存在を確認し、そしてさらにＰＢＳに対して透
析した。精製後、得られたマウスＬＴβＲ−Ｉｇは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのク
ーマシーブルー染色により決定する場合、９５％を超える純度であった。

【０７９３】 ＡＩＭ ＩＩ．フラッグ融合タンパク質を生成するために、マウスＡＩＭ Ｉ
Ｉ細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡをフラッグペプチド配列と融合し、そし
てＥ．ｃｏｌｉにおいて封入体で発現した。６Ｍグアニジン塩酸中で可溶化後、
続いてタンパク質を希釈し、そして折り畳ませた。次いで、折り畳まれたタンパ
ク質を、陽イオン交換カラムクロマトグラフィーによりほぼ同種まで精製した。
最終生成物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクーマシーブルー染色から決定する場合
、９５％を超える純度であった。エンドトキシン濃度は、ＬＡＬアッセイ（ＣＡ
ＰＥ ＣＯＤ，Ｗｏｏｄｓ Ｈｏｌｅ，ＭＡ）に従って、精製したタンパク質の
１ｐｇ／ｍｇ未満であった。

【０７９４】 ウサギ抗マウスＡＩＭ ＩＩペプチド抗体は、ＫＬＨに結合体化させたマウス
ＡＩＭ ＩＩの２０９〜２３２での合成ペプチド（ＣＥＡＧＥＥＶＶＶＲＶＰＧ
ＮＲＬＶＲＰＲＤＧＴＲＳ（配列番号６６））での免疫化により、ｔｈｅ Ｃｏ
ｃａｌｉｃｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｒｅａｍｓｔｏｗｎ，ＰＡ
）にて調製された。この抗体を、ペプチド結合体化カラムを用いて血清からアフ
ィニティー精製した。マウスＣＤ３、ＣＤ２８、フルオレセインイソチオシアネ
ート（ＦＩＴＣ）結合体化ＣＤ４およびＣＤ８に対する精製されたｍＡｂｓを、
Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。ＦＩＴＣ結
合体化ヤギ抗ヒトｍＡｂおよび抗ウサギｍＡｂを、各々Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉ
ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）およびＳｏｕｔｈｅｒ
ｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｉｒｍ
ｉｎｇｈａｍ，ＬＡ）から購入した。精製されたヒトＩｇＧ１およびウサギＩｇ
Ｇを、各々Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）およびＲｏｃｋｌａｎｄ（Ｇ
ｉｌｂｅｒｔｓｖｉｌｌｅ，ＰＡ）から購入した。

【０７９５】 （フローサイトメトリー分析）ヒト２９３細胞（１×１０⁶細胞）を、リン酸
カルシウム法によりマウスＡＩＭ ＩＩ ｐｃＤＮＡ３ベクター（１０μｇ）ま
たはモックベクター（１０μｇ）のどちらかでトランスフェクトした。トランス
フェクションの３０時間後、２９３細胞を収集し、そして４℃にて３０分間、５
％ＦＢＳおよび０．０２％アジドで補充した５０μｌのＰＢＳ中の１μｇのマウ
スＬＴβＲ−Ｉｇまたは抗ＡＩＭ ＩＩ抗体で染色した。次いで、この細胞を洗
浄し、さらに、４℃にて３０分間、各々ＦＩＴＣ−結合体化抗ヒトＩｇＧまたは
抗ウサギＩｇＧと共にインキュベートした。フルオレセインを、Ｃｅｌｌ Ｑｕ
ｅｓｔ ソフトウエア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）と共にＦＡＣＳＣ
ａｌｉｂｕｒ フローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｍ
ｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）により分析した。

【０７９６】 （腫瘍治療モデル）５〜１０匹の群のＤＢＡ／２マウスを、２×１０⁵個のＰ
８１５細胞で皮下に播種した。１週間後、３〜５ｍｍの平均直径の明確な腫瘍を
有するこのマウスを治療に使用した。インビボ注射のためのＡＩＭ ＩＩ ＤＮ
Ａを調製するために、１０μｇのｐｍＡＩＭ ＩＩおよび２５μｇの陽イオン性
リポソーム、ＤＭＲＩＥ−Ｃ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を、５０μｌのＯｐｔｉ−
ＭＥＭ Ｉ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）中で混合し、そして３０分間室温にてポリス
チレン管中でインキュベートした。この複合体を、腫瘍接種後、７日、１０日、
１４日および１７日後に、腫瘍内に注射した。コントロールのために、５０μｌ
のＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ、または５０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ中の親のｐｃ
ＤＮＡ３（１０μｇ）およびＤＭＲＩＥ−Ｃ（２５μｇ）の混合物を上記のよう
に注射した。腫瘍のサイズを、３日または４日毎に直交の直径を測定することに
より評価した。

【０７９７】 ｐｍＡＩＭ ＩＩ注射後にＰ８１５腫瘍が後退したＤＢＡ／２マウスを、最初
の腫瘍接種の４０日後に、右背中に２×１０⁵個のＰ８１５細胞で、左背中に同
じ数のＬ１２１０細胞で、皮下に再実験した。２×１０⁵個のＰ８１５およびＬ
１２１０を受けたナイーブなＤＢＡ／２マウスを、コントロールとして使用した
。その後、腫瘍のサイズを、記載される（Ｃｈｅｎ，Ｌら、Ｃｅｌｌ ７１：１
０９３−１１０２（１９９２））ように直交の直径を測定することにより評価し
た。

【０７９８】 ＣＴＬアッセイのために、７日、９日、１１日目に２×１０⁵個のＰ８１５細
胞で皮下に接種したＤＢＡ／２マウスの脾細胞、および７日、９日、１１日目に
上記のようにｐｍＡＩＭ ＩＩまたはコントロールのいずれかで処置したＤＢＡ
／２マウスの脾細胞を、１８日目に回収した。脾細胞（５×１０⁶個／ｍｌ）を
、４日間、１５０Ｇｙで放射線照射したＰ８１５細胞の存在下で培養し、次いで
、標準の⁵¹Ｃｒ放出アッセイ（Ｃｈｅｎ，Ｌ．ら、Ｃｅｌｌ ７１：１０９３−
１１０２（１９９２））でＣＴＬ活性についてアッセイした。４時間のインキュ
ベーション後、１００μｌの上清を収集し、そして放射活性を、ＭｉｃｒｏＢｅ
ｔａ ＴｒｉＬｕｘ液体シンチレーションカウンター（Ｗａｌｌａｃ，Ｆｉｎｌ
ａｎｄ）で測定した。

【０７９９】 （ＧＶＨＤモデルおよびインビトロ同種ＭＬＲ）急性ＧＶＨＤのインキュベー
ションのために、Ｂ６マウス由来の７×１０⁷個の脾細胞を、致死的に放射線照
射（４Ｇｙ）したか、または非射線照射のＢＤＦ１レシピエント（Ｂ６-Ｆ１）
のどちらかに静脈内注射した。放射線照射したレシピエントなマウスを、脾細胞
注射の１日前に１００μｇのＬＴβＲ−ＩｇまたはコントロールのヒトＩｇＧ１
で静脈内投与し、そしてさらに６回、３日毎に繰り返し投与した。このマウスを
、毎日、生存および体重についてモニターした。ＣＴＬアッセイのために、非放
射線照射のレシピエントを、脾細胞注射の１日前に１００μｇのＬＴβＲ−Ｉｇ
またはコントロールＩｇで静脈内投与し、そしてさらに５回、毎日繰り返し投与
した。１１日目に、レシピエントの脾細胞のＣＴＬ活性を、標準の⁵¹Ｃｒ放出ア
ッセイにおいて標識したＰ８１５（Ｈ−２^d）またはＥＬ−４（Ｈ−２^b）と同時
培養することによりアッセイした。ＢＤＦ１の脾細胞移入を受けたＢＤＦ１マウ
ス（Ｆ１−Ｆ１）由来の脾細胞を、ネガティブコントロールとして使用した。同
一の実験をまた、Ｂ６ＬＴα^-/-マウス由来の脾細胞を使用して行い、そして年
齢の一致するＢ６マウスをこの実験におけるコントロールとして使用した。

【０８００】 ＭＬＲにおける同種抗原に対するＣＴＬのインビトロ導入を、記載される（Ｄ
ｅＴｏｎｇｉ，Ｐ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４：７０３−７０７（１９９４）
）ように行った。簡潔には、Ｔ細胞を、製造業者（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔ
ｅｃ Ｉｎｃ．Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）により指導されるように、磁界で抗ＦＩＴ
Ｃミクロビーズを使用して、ＦＩＴＣ結合体化した抗ＣＤ４ ｍＡｂおよびＣＤ
８ ｍＡｂによりポジティブに選択した。単離したＴ細胞の純度は、抗ＣＤ３
ｍＡｂを使用するフローサイトメトリーにより評価される場合、９５％以上であ
った。精製したＢ６ＬＴα^-/-マウスＴ細胞を、ＬＴβＲ−Ｉｇまたはコントロ
ールヒトＩｇＧ１の存在下または非存在下で、同じ数の３０Ｇｙ−放射線照射し
たＢＡＬＢ／ｃ脾細胞とともに、１×１０⁶細胞／ｍｌで同時培養した。５日後
、Ｃ２６（Ｈ−２^d）およびＥＬ−４（Ｈ−２^b）に対するＣＴＬ活性を、標準の ⁵¹ Ｃｒ放出アッセイにおいて試験した。

【０８０１】 （Ｔ細胞同時刺激アッセイ）マウスの脾細胞由来の１×１０⁶細胞／ｍｌの磁
気ビース−精製Ｔ細胞を、１５０Ｇｙ−放射線照射したＣＯＳ細胞（５×１０⁴
細胞／ｍｌ）の存在下で、プレートコートした抗ＣＤ３ ｍＡｂで刺激した。こ
のＣＯＳ細胞は、４８時間、ＤＥＡＥ−デキストラン法により、ｐｃＤＮＡ３ま
たはｐｍＡＩＭ ＩＩのどちらかで、トランスフェクトされている。あるいは、
抗ＣＤ３コートしたプレートを、４時間３７℃にて、望ましい量のＡＩＭ ＩＩ
．フラッグ融合タンパク質でさらにコートした。洗浄後、Ｂ６、ＣＤ２８^-/-マ
ウスまたは同腹仔のいすれかの脾臓から精製したＴ細胞（１×１０⁶細胞／ｍｌ
）を、ウェルに添加した。抗ＣＤ２８（１μｇ／ｍｌ）ｍＡｂを、可溶性形態と
して使用した。Ｔ細胞の増殖を、３日間の培養の最後の１５時間の間に、１μＣ
ｉ／ウェルの³Ｈ−ＴｄＲの添加により評価した。³Ｈ−ＴｄＲの取り込みを、Ｍ
ｉｃｒｏＢｅｔａ ＴｒｉＬｕｘ液体シンチレーションカウンター（Ｗａｌｌａ
ｃ，Ｆｉｎｌａｎｄ）により計数した。

【０８０２】 （サイトカインアッセイ）１×１０⁶細胞／ｍｌの精製したＢ６ Ｔ細胞を、
上記のように、抗ＣＤ３（０．５μｇ／ｍｌ）の存在下で、プレートコートした
ＡＩＭ ＩＩ．フラッグ（３．２μｇ／ｍｌ）で刺激した。培養上清を、４８時
間で回収し、そして製造業者（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）の指示に従ってＩＦＮ−
γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４およびＩＬ−１０について、サンドイッチＥＬＩＳ
Ａによりアッセイした。同種ＭＬＲにおけるサイトカイン産生をアッセイするた
めに、１×１０⁶細胞／ｍｌの精製したＢ６ＬＴα^-/-Ｔ細胞を、ＬＴβＲ−Ｉｇ
融合タンパク質およびコントロールヒトＩｇＧの存在下または非存在下で、同じ
数の放射線照射したＢＡＬＢ／ｃ脾細胞で刺激した。培養上清を、７２時間で回
収し、そしてＥＬＩＳＡによりＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４およびＩＬ
−１０の産生についてアッセイした。

【０８０３】 （実施例２３：抗体の産生） （Ａ．ハイブリドーマ技術） 本発明の抗体は、種々の方法によって調製され得る。（Ａｕｓｂｅｌら、編、
１９９８，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ，第２章を参照のこと
）。このような方法の１つの例として、ＡＩＭ ＩＩを発現する細胞は、ポリク
ローナル抗体を含む血清の産生を誘導するために動物に投与される。好ましい方
法において、ＡＩＭ ＩＩタンパク質の調製物が調製され、そして精製されて、
天然の夾雑物を実質的に含まないようにされる。次いで、より大きな比活性のポ
リクローナル抗血清を生成するために、このような調製物は、動物に導入される
。

【０８０４】 タンパク質ＡＩＭ ＩＩに対して特異的なモノクローナル抗体は、ハイブリド
ーマ技術を使用して調製される（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９
５（１９７５）；Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１（
１９７６）；Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２９２（１９
７６）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅ
ｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ
．、５６３−６８１頁（１９８１））。一般に、動物（好ましくは、マウス）を
、ＡＩＭ ＩＩポリぺプチド、またはより好ましくは、分泌ＡＩＭ ＩＩポリぺ
プチド発現細胞で免疫する。このようなポリペプチド発現細胞は、任意の適切な
組織培養培地において培養され、好ましくは、１０％ウシ胎仔血清（約５６℃で
非働化した）を補充し、そして約１０ｇ／ｌの非必須アミノ酸、約１，０００Ｕ
／ｍｌのペニシリン、および約１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充し
たＥａｒｌｅ改変イーグル培地において培養される。

【０８０５】 このようなマウスの脾細胞は抽出され、そして適切なミエローマ細胞株と融合
される。任意の適切なミエローマ細胞株が、本発明に従って用いられ得る；しか
し、ＡＴＣＣから入手可能な親ミエローマ細胞株（ＳＰ２Ｏ）を用いることが好
ましい。融合後、得られるハイブリドーマ細胞を、ＨＡＴ培地において選択的に
維持し、次いでＷａｎｄｓら（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ８０：２２
５−２３２（１９８１））によって記載されるように限界希釈によってクローン
化する。このような選択によって得られるハイブリドーマ細胞は、次いでＡＩＭ
ＩＩポリぺプチドに結合し得る抗体を分泌するクローンを同定するためにアッ
セイされる。

【０８０６】 あるいは、ＡＩＭ ＩＩポリぺプチドに結合し得るさらなる抗体を、抗イディ
オタイプ抗体を使用して２段階工程の手順において生成し得る。このような方法
は、抗体がそれ自体抗原であり、それゆえ第二の抗体に結合する抗体を得ること
が可能であるという事実を利用する。この方法に従って、タンパク質特異的抗体
を使用して、動物（好ましくは、マウス）を免疫する。次いで、このような動物
の脾細胞を使用して、ハイブリドーマ細胞を産生し、そしてこのハイブリドーマ
細胞は、ＡＩＭ ＩＩタンパク質特異的抗体に結合する能力がＡＩＭ ＩＩによ
ってブロックされ得る抗体を産生するクローンを同定するためにスクリーニング
される。このような抗体は、ＡＩＭ ＩＩタンパク質特異的抗体に対する抗イデ
ィオタイプ抗体を含み、そして動物を免疫してさらなるタンパク質特異的抗体の
形成を誘導するために使用される。

【０８０７】 ヒトにおける抗体のインビボ使用のために、抗体は、「ヒト化」される。この
ような抗体は、上記のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞に由来
する遺伝的構築物を使用して産生され得る。キメラ抗体およびヒト化抗体を産生
するための方法は、当該分野で公知であり、そして本明細書中で考察される。（
総説については、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２（１９
８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６）；Ｃａ
ｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、ＥＰ
１７１４９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、ＥＰ １７３４９４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅ
ｒら、ＷＯ ８６０１５３３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、ＷＯ ８７０２６７１；Ｂ
ｏｕｌｉａｎｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６４３（１９８４）；Ｎｅｕｂｅ
ｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２６８（１９８５）を参照のこと） （Ｂ．ｓｃＦｖのライブラリー由来のＡＩＭ ＩＩに対する抗体フラグメント
の単離） ヒトＰＢＬから単離した天然に存在するＶ−遺伝子を、ドナーが曝露されても
、曝露されなくてもよいＡＩＭ ＩＩに対する反応性を含む抗体フラグメントの
ライブラリー中に構築する（例えば、米国特許第５，８８５，７９３号（その全
体が参考として本明細書に援用される）を参照のこと）。

【０８０８】 （ライブラリーのレスキュー） ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０１０４７に記載のように、ヒトＰＢＬのＲＮＡからｓ
ｃＦｖのライブラリーを構築する。抗体フラグメントを提示するファージをレス
キューするため、ファージミドを保有する約１０⁹個のＥ．ｃｏｌｉを用いて、
５０ｍｌの２×ＴＹ（１％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを
含有する）（２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＧＬＵ）を接種（ｉｎｎｏｃｕｌａｔｅ）し、
そして振盪しながら０．８のＯ．Ｄ．まで増殖させる。この培養物の５ｍｌを用
いて５０ｍｌの２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＧＬＵを接種し、２×１０⁸ＴＵのΔ遺伝子
３ヘルパー（Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩ、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０１０４７を参照の
こと）を添加し、そして培養物を振盪なしで３７℃で４５分間インキュベートし
、次いで振盪しながら３７℃で４５分間インキュベートする。この培養物を１０
分間４０００ｒ．ｐ．ｍ．で遠心分離し、そしてペレットを２リットルの２×Ｔ
Ｙ（１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有す
る）中に再懸濁し、そして一晩増殖させる。ファージをＰＣＴ公開ＷＯ９２／０
１０４７に記載のように調製する。

【０８０９】 Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩを以下のように調製する：Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩヘルパ
ーファージは、遺伝子ＩＩＩタンパク質をコードしない。それゆえ、抗体フラグ
メントを提示するファージ（ファージミド）は、抗原に対するより大きい結合ア
ビディティーを有する。ファージ形態形成の間、野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質
を供給するｐＵＣ１９誘導体を保有する細胞においてヘルパーファージを増殖さ
せることにより、感染性Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩ粒子を作製する。培養物を振盪な
しで３７℃で１時間インキュベートし、次いで振盪しながら３７℃でさらに１時
間インキュベートする。細胞をスピンダウン（ＩＥＣ−Ｃｅｎｔｒａ ８，４０
０ ｒ．ｐ．ｍで１０分間）し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび２５μ
ｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する２×ＴＹブロス（２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＫＡＮ
）３００ｍｌ中で再懸濁し、そして３７℃で振盪しながら一晩増殖させた。ファ
ージ粒子を、２回のＰＥＧ沈殿（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０）により培養培
地から精製および濃縮し、２ｍｌ ＰＢＳに再懸濁し、そして０．４５μｍのフ
ィルター（Ｍｉｎｉｓａｒｔ ＮＭＬ；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を通過させ、約１
０¹³形質導入単位／ｍｌ（アンピシリン耐性クローン）の最終濃度を得た。

【０８１０】 （ライブラリーのパニング） Ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅｓ（Ｎｕｎｃ）を、１００μｇ／ｍｌまたは１０μｇ／
ｍｌのいずれかの本発明のポリペプチド４ｍｌを用いてＰＢＳ中で一晩被膜する
。チューブを２％Ｍａｒｖｅｌ−ＰＢＳを用いて３７℃で２時間ブロックし、次
いでＰＢＳ中で３回洗浄する。約１０¹³ＴＵのファージをこのチューブに適用し
、そして、回転盤上で上下に傾けながら室温で３０分間インキュベートし、次い
でさらに１．５時間静置しておく。チューブをＰＢＳ ０．１％Ｔｗｅｅｎ−２
０で１０回、そしてＰＢＳで１０回洗浄する。１ｍｌの１００ｍＭトリエチルア
ミンを添加し、そして回転盤上で１５分間上下に回転させることによりファージ
を溶出し、その後、この溶液を０．５ｍｌの１．０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ
７．４で直ちに中和する。次いで、溶出したファージを細菌とともに３７℃で３
０分間インキュベートすることにより、ファージを用いて、１０ｍｌの対数増殖
中期のＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１に感染させる。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉを１％グルコ
ースおよび１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＴＹＥプレート上にプレー
ティングする。次いで、生じた細菌ライブラリーを、上記のようにΔ遺伝子３ヘ
ルパーファージでレスキューし、次の回の選択のためのファージを調製する。次
いで、このプロセスを、アフィニティー精製の全４回について反復し、３回目お
よび４回目にはチューブ洗浄をＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で２０回、そ
してＰＢＳで２０回に増加する。

【０８１１】 （結合剤の特徴付け） ３回目および４回目の選択から溶出したファージを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｈ
Ｂ ２１５１を感染させ、そして可溶性ｓｃＦｖをアッセイのために単一コロニ
ーから生成する（Ｍａｒｋｓら、１９９１）。５０ｍＭ炭酸水素塩、ｐＨ９．６
中の本発明のポリペプチドの１０ｐｇ／ｍｌのいずれかで被膜したマイクロタイ
タープレートを用いてＥＬＩＳＡを実行する。ＥＬＩＳＡ中の陽性クローンをＰ
ＣＲフィンガープリンティング（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０１０４７を参
照のこと）、次に配列決定することによりさらに特徴付ける。

【０８１２】 （実施例２４：ＡＩＭ ＩＩ発現の組織分布） ノーザンブロット分析は、とりわけＳａｍｂｒｏｏｋら（上述）によって記載
された方法を使用して、ヒト組織におけるＡＩＭ ＩＩの発現のレベルを試験す
るために実行される。全細胞ＲＮＡサンプルは、ＲＮＡｚｏｌ^TMＢシステム（Ｂ
ｉｏｔｅｃｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，６０２３ Ｓｏｕｔｈ
Ｌｏｏｐ Ｅａｓｔ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｔｅｘ）を用いて単離される。

【０８１３】 約１０μｇの全ＲＮＡは、組織サンプルから単離される。ＲＮＡは、高度に変
性した条件下で、１％アガロースゲルを通る電気泳動によって大きさで分離され
る。ＲＮＡは、ゲルからナイロンフィルター上にブロットされ、次いでフィルタ
ーは検出可能に標識されたポリヌクレオチドプローブへのハイブリダイゼーショ
ンのために調製される。

【０８１４】 ＡＩＭ ＩＩをコードするｍＲＮＡを検出するプローブとして、ＡＴＣＣ受託
番号９７４８３として同定される寄託されたクローンにおけるｃＤＮＡ挿入部分
のコード領域のアンチセンス鎖は、高い特異的活性に対して標識される。ｃＤＮ
Ａは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから得られるＰｒｉｍｅ−Ｉｔキットを使用して、
プライマー伸長によって標識される。この反応は、５０ｎｇのｃＤＮＡを使用し
て、供給者によって勧められる標準的反応プロトコルに従って実施される。標識
されたポリヌクレオチドは、５ Ｐｒｉｍｅ−３ Ｐｒｉｍｅ，Ｉｎｃ（５６０
３ Ａｒａｐａｈｏｅ Ｒｏａｄ，Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）から得られるＳｅｌ
ｅｃｔ−Ｇ−５０カラムを使用し、カラムクロマトグラフィによって、他の標識
反応成分から精製される。

【０８１５】 標識されたプローブは、１，０００，０００ｃｐｍ／ｍｌの濃度で、小さな容
積の７％ＳＤＳ、０．５ Ｍ ＮａＰＯ₄、ｐＨ７．４において、６５℃で、一
晩フィルターにハイブリダイズされる。

【０８１６】 その後、プローブ溶液を排出し、そしてフィルターを０．５×ＳＳＣ、０．１
％ＳＤＳで、室温で２回、そして６０℃で２回洗浄する。次いで、フィルターを
乾燥し、そして増感紙を用いて、−７０℃で一晩フィルムに暴露する。

【０８１７】 オートラジオグラフィは、ＡＩＭ ＩＩについてのｍＲＮＡが、脾臓、骨髄、
および胸腺において豊富であることを示す。

【０８１８】 本発明を、前述の説明および実施例に詳細に記載される以外の方法で実施し得
ることは、明らかである。

【０８１９】 本発明の多数の改変およびバリエーションが、上記の教示を考慮して可能であ
り、従って、それは、添付の特許請求の範囲の範囲内にある。

【０８２０】 本明細書中に引用された全ての刊行物の全開示（特許、特許出願、学術文献、
実験マニュアル、書籍または他の文書を含む）は、本明細書中に参考として援用
される。

【０８２１】

【表４】

【０８２２】

【表５】

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】 図１Ａは、ＡＩＭ ＩＩのヌクレオチド（配列番号１）および推定アミノ酸（
配列番号２）配列を示す。このタンパク質は、推定分子量約２６．４ｋＤａを有
する。ＡＩＭ ＩＩタンパク質の推定膜貫通ドメインに下線を付してある。

【図１Ｂ】 図１Ｂは、ＡＩＭ ＩＩのヌクレオチド（配列番号１）および推定アミノ酸（
配列番号２）配列を示す。このタンパク質は、推定分子量約２６．４ｋＤａを有
する。ＡＩＭ ＩＩタンパク質の推定膜貫通ドメインに下線を付してある。

【図１Ｃ】 図１Ｃは、同様に得られた部分ＡＩＭ ＩＩ ｃＤＮＡのヌクレオチド（配列
番号３８）および推定アミノ酸（配列番号３９）配列番号を示す。

【図１Ｄ】 図１Ｄは、同様に得られた部分ＡＩＭ ＩＩ ｃＤＮＡのヌクレオチド（配列
番号３８）および推定アミノ酸（配列番号３９）配列番号を示す。

【図２Ａ】 図２Ａは、ＡＩＭ ＩＩタンパク質およびヒトＴＮＦ−α（配列番号３）、ヒ
トＴＮＦ−β（配列番号４）、ヒトリンホトキシン（配列番号５）、ならびにヒ
トＦａｓリガンド（配列番号６）のアミノ酸配列間の類似の領域を示す。

【図２Ｂ】 図２Ｂは、ＡＩＭ ＩＩタンパク質およびヒトＴＮＦ−α（配列番号３）、ヒ
トＴＮＦ−β（配列番号４）、ヒトリンホトキシン（配列番号５）、ならびにヒ
トＦａｓリガンド（配列番号６）のアミノ酸配列間の類似の領域を示す。

【図２Ｃ】 図２Ｃは、ＡＩＭ ＩＩタンパク質およびヒトＴＮＦ−α（配列番号３）、ヒ
トＴＮＦ−β（配列番号４）、ヒトリンホトキシン（配列番号５）、ならびにヒ
トＦａｓリガンド（配列番号６）のアミノ酸配列間の類似の領域を示す。

【図２Ｄ】 図２Ｄは、ＡＩＭ ＩＩタンパク質およびヒトＴＮＦ−α（配列番号３）、ヒ
トＴＮＦ−β（配列番号４）、ヒトリンホトキシン（配列番号５）、ならびにヒ
トＦａｓリガンド（配列番号６）のアミノ酸配列間の類似の領域を示す。

【図２Ｅ】 図２Ｅは、ＡＩＭ ＩＩタンパク質およびヒトＴＮＦ−α（配列番号３）、ヒ
トＴＮＦ−β（配列番号４）、ヒトリンホトキシン（配列番号５）、ならびにヒ
トＦａｓリガンド（配列番号６）のアミノ酸配列間の類似の領域を示す。

【図２Ｆ】 図２Ｆは、ＡＩＭ ＩＩタンパク質およびヒトＴＮＦ−α（配列番号３）、ヒ
トＴＮＦ−β（配列番号４）、ヒトリンホトキシン（配列番号５）、ならびにヒ
トＦａｓリガンド（配列番号６）のアミノ酸配列間の類似の領域を示す。

【図３Ａ】 図３Ａは、ＡＩＭ ＩＩアミノ酸配列の分析を示す。α、β、ターン、および
コイル領域；親水性および疎水性；両親媒性領域；可撓性領域；抗原性指標およ
び表面確率が示されている。「抗原性指標−Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ」グラフ
において、図１ＡおよびＢ（配列番号２）の約アミノ酸残基１３〜２０、２３〜
３６、６９〜７９、８５〜９４、１６７〜１７８、１８４〜１９６、２２１〜２
３３は、ＡＩＭ ＩＩタンパク質の示された高度に抗原性の領域に対応する。

【図３Ｂ】 図３Ｂは、ＡＩＭ ＩＩアミノ酸配列の分析を示す。α、β、ターン、および
コイル領域；親水性および疎水性；両親媒性領域；可撓性領域；抗原性指標およ
び表面確率が示されている。「抗原性指標−Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ」グラフ
において、図１ＡおよびＢ（配列番号２）の約アミノ酸残基１３〜２０、２３〜
３６、６９〜７９、８５〜９４、１６７〜１７８、１８４〜１９６、２２１〜２
３３は、ＡＩＭ ＩＩタンパク質の示された高度に抗原性の領域に対応する。

【図３Ｃ】 図３Ｃは、ＡＩＭ ＩＩアミノ酸配列の分析を示す。α、β、ターン、および
コイル領域；親水性および疎水性；両親媒性領域；可撓性領域；抗原性指標およ
び表面確率が示されている。「抗原性指標−Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ」グラフ
において、図１ＡおよびＢ（配列番号２）の約アミノ酸残基１３〜２０、２３〜
３６、６９〜７９、８５〜９４、１６７〜１７８、１８４〜１９６、２２１〜２
３３は、ＡＩＭ ＩＩタンパク質の示された高度に抗原性の領域に対応する。

【図３Ｄ】 図３Ｄは、ＡＩＭ ＩＩアミノ酸配列の分析を示す。α、β、ターン、および
コイル領域；親水性および疎水性；両親媒性領域；可撓性領域；抗原性指標およ
び表面確率が示されている。「抗原性指標−Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ」グラフ
において、図１ＡおよびＢ（配列番号２）の約アミノ酸残基１３〜２０、２３〜
３６、６９〜７９、８５〜９４、１６７〜１７８、１８４〜１９６、２２１〜２
３３は、ＡＩＭ ＩＩタンパク質の示された高度に抗原性の領域に対応する。

【図３Ｅ】 図３Ｅは、ＡＩＭ ＩＩアミノ酸配列の分析を示す。α、β、ターン、および
コイル領域；親水性および疎水性；両親媒性領域；可撓性領域；抗原性指標およ
び表面確率が示されている。「抗原性指標−Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ」グラフ
において、図１ＡおよびＢ（配列番号２）の約アミノ酸残基１３〜２０、２３〜
３６、６９〜７９、８５〜９４、１６７〜１７８、１８４〜１９６、２２１〜２
３３は、ＡＩＭ ＩＩタンパク質の示された高度に抗原性の領域に対応する。

【図３Ｆ】 図３Ｆは、ＡＩＭ ＩＩアミノ酸配列の分析を示す。α、β、ターン、および
コイル領域；親水性および疎水性；両親媒性領域；可撓性領域；抗原性指標およ
び表面確率が示されている。「抗原性指標−Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ」グラフ
において、図１ＡおよびＢ（配列番号２）の約アミノ酸残基１３〜２０、２３〜
３６、６９〜７９、８５〜９４、１６７〜１７８、１８４〜１９６、２２１〜２
３３は、ＡＩＭ ＩＩタンパク質の示された高度に抗原性の領域に対応する。

【図４】 図４ＡおよびＢは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞のインビトロ増殖に対
するＡＩＭＩＩの効果を示す。５，０００ ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＷＴ（マル
）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／Ｎｅｏ（三角）またはＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＡＩ
ＭＩＩ（四角）細胞を、３連で２４ウェルプレートにＩＭＥＭとともに１０％Ｆ
ＢＳ（黒マル、黒四角、黒三角）または１％ＦＢＳ（白抜きマル、白抜き四角、
白抜き三角）のいずれかの存在下で、プレートした。生細胞の数を、トリパンブ
ルー排除法により、３日目、５日目、または７日目に決定した。この時間経過の
間、細胞に新鮮な培地を２日おきに補給した。図４Ｂは、０．３３％アガロース
におけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＷＴ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／Ｎｅｏ、および
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＡＩＭＩＩ細胞のコロニー形成を示す。

【図５】 図５Ａ〜Ｃは、実施例５の材料および方法に記載されるＡｎｎｅｘｉｎ−Ｖ
ＦＡＣＳ分析での、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＷＴ（図５Ａ）細胞またはＭＤＡ−
ＭＢ−２３１／Ｎｅｏ（図５Ｂ）細胞と比較した、０．５％血清におけるＭＤＡ
−ＭＢ−２３１／ＡＩＭＩＩ（図５Ｃ）におけるアポトーシス細胞の増加を表す
。

【図６Ａ】 図６Ａは、ヌードマウスにおける異種移植片ヒト乳癌ＭＤＡ−２３１の増殖に
対するＡＩＭＩＩの効果の評価を示す。雌胸腺欠損ヌードマウスに、皮下注射で
、親ＭＤＡ−２３ １（ＭＤＡ−２３ １−ＷＴ）またはＡＩＭＩＩで安定にト
ランスフェクトしたＭＤＡ−２３ １あるいはベクターコントロールｎｅｏ（ｎ
＝１０）の１０⁶細胞を注入した。次いで、マウスに耳標を付け、そして無作為
化した。腫瘍増殖を、盲検様式でカリパーで週に２回評価した。このパネルは、
１グループあたり各々１０匹のマウスを有する３つの実験を示す。

【図６Ｂ】 図６Ｂは、同系のＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＭＣ−３８マウス結腸癌の増
殖の阻害に対するＡＩＭＩＩ形質導入の効果を示す。雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに
、皮下注射により親ＭＣ−３８（ＭＣ−３８−ＷＴ）またはＡｉｍＩＩで安定に
トランスフェクトしたＭＣ−３８、あるいはベクターコントロールｎｅｏ（ｎ＝
１０）の１０⁶細胞を注射した。次いで、マウスに耳標を付けそして無作為化し
た。腫瘍増殖を、コード化した盲検様式でカリパーで週に２回評価した。このパ
ネルは、１グループあたり各々１０匹のマウスを有する４つの実験を表す。

【図７Ａ】 図７Ａは、ｐＦｌａｇ−ＡＩＭＩＩプラスミド構築物（図７Ａ）、ＩＦＮγの
存在下または非存在下での（図７Ｂ）またはＩＦＮγ単独での（図７Ｃ）、ＭＤ
Ａ−ＭＢ−２３１細胞における組換え可溶性形態のＡＩＭ ＩＩ（ｓＡＩＭＩＩ
）の細胞傷害性を示す。実験は、実施例５の材料および方法に記載されるように
行われた。

【図７Ｂ】 図７Ｂは、ｐＦｌａｇ−ＡＩＭＩＩプラスミド構築物（図７Ａ）、ＩＦＮγの
存在下または非存在下での（図７Ｂ）またはＩＦＮγ単独での（図７Ｃ）、ＭＤ
Ａ−ＭＢ−２３１細胞における組換え可溶性形態のＡＩＭ ＩＩ（ｓＡＩＭＩＩ
）の細胞傷害性を示す。実験は、実施例５の材料および方法に記載されるように
行われた。

【図７Ｃ】 図７Ｃは、ｐＦｌａｇ−ＡＩＭＩＩプラスミド構築物（図７Ａ）、ＩＦＮγの
存在下または非存在下での（図７Ｂ）またはＩＦＮγ単独での（図７Ｃ）、ＭＤ
Ａ−ＭＢ−２３１細胞における組換え可溶性形態のＡＩＭ ＩＩ（ｓＡＩＭＩＩ
）の細胞傷害性を示す。実験は、実施例５の材料および方法に記載されるように
行われた。

【図８Ａ】 図８Ａは、ＬＴβＲ（図８Ａ〜８Ｄ）またはＴＲ２（図８Ｅ〜８Ｈ）ｍＡｂを
使用したＦＡＣＳ分析によるＬＴβＲまたはＴＲ２の細胞表面発現である。ＭＤ
Ａ−ＭＢ−２３１（図８Ａおよび８Ｅ）、ＨＴ−２９（図８Ｂおよび８Ｆ）、Ｍ
Ｃ−３（図８Ｃおよび８Ｇ）、Ｕ９３Ｔ（図８Ｄおよび８Ｈ）。ＭＤＡ−ＭＢ−
２３１細胞における、可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質単独のＦＡＣＳ結合分析（
図８Ｉ）、および可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質結合のＬＴβＲ−Ｆｃ融合タン
パク質（図８Ｊ）またはＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質（図８Ｋ）でのプレインキ
ュベーションによるブロッキング。図８Ｌは、種々の細胞株におけるＬＴβＲお
よびＴＲ２の表面発現を要約する。ＬＴβＲ−ＦｃまたはＴＲ２−Ｆｃ融合タン
パク質の、ＨＴ−２９細胞におけるｓＡＩＭ ＩＩ媒介細胞傷害性をブロッキン
グする効果。細胞を９６ウェルプレートにプレートし、そしてｓＡＩＭ ＩＩ（
１０ｎｇ／ｍｌ）を５Ｕ／ｍｌのＩＦＮγの存在下で様々な量のｓＬＴβＲ−Ｆ
ｃ（白抜きマル ＬＴβＲ−Ｆｃ単独、黒マル ＬＴβＲ−ＦｃおよびＩＦＮγ
）、またはＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質（白抜き三角 ＴＲ−２Ｆｃ単独、黒三
角 ＴＲ２−ＦｃとｓＬＴγおよびＩＦＮγ）とともに添加した。細胞を５日間
インキュベートし、そして細胞の生存度をＸＴＴアッセイによって決定した。

【図８Ｂ】 図８Ｂは、ＬＴβＲ（図８Ａ〜８Ｄ）またはＴＲ２（図８Ｅ〜８Ｈ）ｍＡｂを
使用したＦＡＣＳ分析によるＬＴβＲまたはＴＲ２の細胞表面発現である。ＭＤ
Ａ−ＭＢ−２３１（図８Ａおよび８Ｅ）、ＨＴ−２９（図８Ｂおよび８Ｆ）、Ｍ
Ｃ−３（図８Ｃおよび８Ｇ）、Ｕ９３Ｔ（図８Ｄおよび８Ｈ）。ＭＤＡ−ＭＢ−
２３１細胞における、可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質単独のＦＡＣＳ結合分析（
図８Ｉ）、および可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質結合のＬＴβＲ−Ｆｃ融合タン
パク質（図８Ｊ）またはＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質（図８Ｋ）でのプレインキ
ュベーションによるブロッキング。図８Ｌは、種々の細胞株におけるＬＴβＲお
よびＴＲ２の表面発現を要約する。ＬＴβＲ−ＦｃまたはＴＲ２−Ｆｃ融合タン
パク質の、ＨＴ−２９細胞におけるｓＡＩＭ ＩＩ媒介細胞傷害性をブロッキン
グする効果。細胞を９６ウェルプレートにプレートし、そしてｓＡＩＭ ＩＩ（
１０ｎｇ／ｍｌ）を５Ｕ／ｍｌのＩＦＮγの存在下で様々な量のｓＬＴβＲ−Ｆ
ｃ（白抜きマル ＬＴβＲ−Ｆｃ単独、黒マル ＬＴβＲ−ＦｃおよびＩＦＮγ
）、またはＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質（白抜き三角 ＴＲ−２Ｆｃ単独、黒三
角 ＴＲ２−ＦｃとｓＬＴγおよびＩＦＮγ）とともに添加した。細胞を５日間
インキュベートし、そして細胞の生存度をＸＴＴアッセイによって決定した。

【図８Ｃ】 図８Ｃは、ＬＴβＲ（図８Ａ〜８Ｄ）またはＴＲ２（図８Ｅ〜８Ｈ）ｍＡｂを
使用したＦＡＣＳ分析によるＬＴβＲまたはＴＲ２の細胞表面発現である。ＭＤ
Ａ−ＭＢ−２３１（図８Ａおよび８Ｅ）、ＨＴ−２９（図８Ｂおよび８Ｆ）、Ｍ
Ｃ−３（図８Ｃおよび８Ｇ）、Ｕ９３Ｔ（図８Ｄおよび８Ｈ）。ＭＤＡ−ＭＢ−
２３１細胞における、可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質単独のＦＡＣＳ結合分析（
図８Ｉ）、および可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質結合のＬＴβＲ−Ｆｃ融合タン
パク質（図８Ｊ）またはＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質（図８Ｋ）でのプレインキ
ュベーションによるブロッキング。図８Ｌは、種々の細胞株におけるＬＴβＲお
よびＴＲ２の表面発現を要約する。ＬＴβＲ−ＦｃまたはＴＲ２−Ｆｃ融合タン
パク質の、ＨＴ−２９細胞におけるｓＡＩＭ ＩＩ媒介細胞傷害性をブロッキン
グする効果。細胞を９６ウェルプレートにプレートし、そしてｓＡＩＭ ＩＩ（
１０ｎｇ／ｍｌ）を５Ｕ／ｍｌのＩＦＮγの存在下で様々な量のｓＬＴβＲ−Ｆ
ｃ（白抜きマル ＬＴβＲ−Ｆｃ単独、黒マル ＬＴβＲ−ＦｃおよびＩＦＮγ
）、またはＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質（白抜き三角 ＴＲ−２Ｆｃ単独、黒三
角 ＴＲ２−ＦｃとｓＬＴγおよびＩＦＮγ）とともに添加した。細胞を５日間
インキュベートし、そして細胞の生存度をＸＴＴアッセイによって決定した。

【図８Ｄ】 図８Ｄは、ＬＴβＲ（図８Ａ〜８Ｄ）またはＴＲ２（図８Ｅ〜８Ｈ）ｍＡｂを
使用したＦＡＣＳ分析によるＬＴβＲまたはＴＲ２の細胞表面発現である。ＭＤ
Ａ−ＭＢ−２３１（図８Ａおよび８Ｅ）、ＨＴ−２９（図８Ｂおよび８Ｆ）、Ｍ
Ｃ−３（図８Ｃおよび８Ｇ）、Ｕ９３Ｔ（図８Ｄおよび８Ｈ）。ＭＤＡ−ＭＢ−
２３１細胞における、可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質単独のＦＡＣＳ結合分析（
図８Ｉ）、および可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質結合のＬＴβＲ−Ｆｃ融合タン
パク質（図８Ｊ）またはＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質（図８Ｋ）でのプレインキ
ュベーションによるブロッキング。図８Ｌは、種々の細胞株におけるＬＴβＲお
よびＴＲ２の表面発現を要約する。ＬＴβＲ−ＦｃまたはＴＲ２−Ｆｃ融合タン
パク質の、ＨＴ−２９細胞におけるｓＡＩＭ ＩＩ媒介細胞傷害性をブロッキン
グする効果。細胞を９６ウェルプレートにプレートし、そしてｓＡＩＭ ＩＩ（
１０ｎｇ／ｍｌ）を５Ｕ／ｍｌのＩＦＮγの存在下で様々な量のｓＬＴβＲ−Ｆ
ｃ（白抜きマル ＬＴβＲ−Ｆｃ単独、黒マル ＬＴβＲ−ＦｃおよびＩＦＮγ
）、またはＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質（白抜き三角 ＴＲ−２Ｆｃ単独、黒三
角 ＴＲ２−ＦｃとｓＬＴγおよびＩＦＮγ）とともに添加した。細胞を５日間
インキュベートし、そして細胞の生存度をＸＴＴアッセイによって決定した。

【図８Ｅ】 図８Ｅは、ＬＴβＲ（図８Ａ〜８Ｄ）またはＴＲ２（図８Ｅ〜８Ｈ）ｍＡｂを
使用したＦＡＣＳ分析によるＬＴβＲまたはＴＲ２の細胞表面発現である。ＭＤ
Ａ−ＭＢ−２３１（図８Ａおよび８Ｅ）、ＨＴ−２９（図８Ｂおよび８Ｆ）、Ｍ
Ｃ−３（図８Ｃおよび８Ｇ）、Ｕ９３Ｔ（図８Ｄおよび８Ｈ）。ＭＤＡ−ＭＢ−
２３１細胞における、可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質単独のＦＡＣＳ結合分析（
図８Ｉ）、および可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質結合のＬＴβＲ−Ｆｃ融合タン
パク質（図８Ｊ）またはＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質（図８Ｋ）でのプレインキ
ュベーションによるブロッキング。図８Ｌは、種々の細胞株におけるＬＴβＲお
よびＴＲ２の表面発現を要約する。ＬＴβＲ−ＦｃまたはＴＲ２−Ｆｃ融合タン
パク質の、ＨＴ−２９細胞におけるｓＡＩＭ ＩＩ媒介細胞傷害性をブロッキン
グする効果。細胞を９６ウェルプレートにプレートし、そしてｓＡＩＭ ＩＩ（
１０ｎｇ／ｍｌ）を５Ｕ／ｍｌのＩＦＮγの存在下で様々な量のｓＬＴβＲ−Ｆ
ｃ（白抜きマル ＬＴβＲ−Ｆｃ単独、黒マル ＬＴβＲ−ＦｃおよびＩＦＮγ
）、またはＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質（白抜き三角 ＴＲ−２Ｆｃ単独、黒三
角 ＴＲ２−ＦｃとｓＬＴγおよびＩＦＮγ）とともに添加した。細胞を５日間
インキュベートし、そして細胞の生存度をＸＴＴアッセイによって決定した。

【図８Ｆ】 図８Ｆは、ＬＴβＲ（図８Ａ〜８Ｄ）またはＴＲ２（図８Ｅ〜８Ｈ）ｍＡｂを
使用したＦＡＣＳ分析によるＬＴβＲまたはＴＲ２の細胞表面発現である。ＭＤ
Ａ−ＭＢ−２３１（図８Ａおよび８Ｅ）、ＨＴ−２９（図８Ｂおよび８Ｆ）、Ｍ
Ｃ−３（図８Ｃおよび８Ｇ）、Ｕ９３Ｔ（図８Ｄおよび８Ｈ）。ＭＤＡ−ＭＢ−
２３１細胞における、可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質単独のＦＡＣＳ結合分析（
図８Ｉ）、および可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質結合のＬＴβＲ−Ｆｃ融合タン
パク質（図８Ｊ）またはＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質（図８Ｋ）でのプレインキ
ュベーションによるブロッキング。図８Ｌは、種々の細胞株におけるＬＴβＲお
よびＴＲ２の表面発現を要約する。ＬＴβＲ−ＦｃまたはＴＲ２−Ｆｃ融合タン
パク質の、ＨＴ−２９細胞におけるｓＡＩＭ ＩＩ媒介細胞傷害性をブロッキン
グする効果。細胞を９６ウェルプレートにプレートし、そしてｓＡＩＭ ＩＩ（
１０ｎｇ／ｍｌ）を５Ｕ／ｍｌのＩＦＮγの存在下で様々な量のｓＬＴβＲ−Ｆ
ｃ（白抜きマル ＬＴβＲ−Ｆｃ単独、黒マル ＬＴβＲ−ＦｃおよびＩＦＮγ
）、またはＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質（白抜き三角 ＴＲ−２Ｆｃ単独、黒三
角 ＴＲ２−ＦｃとｓＬＴγおよびＩＦＮγ）とともに添加した。細胞を５日間
インキュベートし、そして細胞の生存度をＸＴＴアッセイによって決定した。

【図８Ｇ】 図８Ｇは、ＬＴβＲ（図８Ａ〜８Ｄ）またはＴＲ２（図８Ｅ〜８Ｈ）ｍＡｂを
使用したＦＡＣＳ分析によるＬＴβＲまたはＴＲ２の細胞表面発現である。ＭＤ
Ａ−ＭＢ−２３１（図８Ａおよび８Ｅ）、ＨＴ−２９（図８Ｂおよび８Ｆ）、Ｍ
Ｃ−３（図８Ｃおよび８Ｇ）、Ｕ９３Ｔ（図８Ｄおよび８Ｈ）。ＭＤＡ−ＭＢ−
２３１細胞における、可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質単独のＦＡＣＳ結合分析（
図８Ｉ）、および可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質結合のＬＴβＲ−Ｆｃ融合タン
パク質（図８Ｊ）またはＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質（図８Ｋ）でのプレインキ
ュベーションによるブロッキング。図８Ｌは、種々の細胞株におけるＬＴβＲお
よびＴＲ２の表面発現を要約する。ＬＴβＲ−ＦｃまたはＴＲ２−Ｆｃ融合タン
パク質の、ＨＴ−２９細胞におけるｓＡＩＭ ＩＩ媒介細胞傷害性をブロッキン
グする効果。細胞を９６ウェルプレートにプレートし、そしてｓＡＩＭ ＩＩ（
１０ｎｇ／ｍｌ）を５Ｕ／ｍｌのＩＦＮγの存在下で様々な量のｓＬＴβＲ−Ｆ
ｃ（白抜きマル ＬＴβＲ−Ｆｃ単独、黒マル ＬＴβＲ−ＦｃおよびＩＦＮγ
）、またはＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質（白抜き三角 ＴＲ−２Ｆｃ単独、黒三
角 ＴＲ２−ＦｃとｓＬＴγおよびＩＦＮγ）とともに添加した。細胞を５日間
インキュベートし、そして細胞の生存度をＸＴＴアッセイによって決定した。

【図８Ｈ】 図８Ｈは、ＬＴβＲ（図８Ａ〜８Ｄ）またはＴＲ２（図８Ｅ〜８Ｈ）ｍＡｂを
使用したＦＡＣＳ分析によるＬＴβＲまたはＴＲ２の細胞表面発現である。ＭＤ
Ａ−ＭＢ−２３１（図８Ａおよび８Ｅ）、ＨＴ−２９（図８Ｂおよび８Ｆ）、Ｍ
Ｃ−３（図８Ｃおよび８Ｇ）、Ｕ９３Ｔ（図８Ｄおよび８Ｈ）。ＭＤＡ−ＭＢ−
２３１細胞における、可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質単独のＦＡＣＳ結合分析（
図８Ｉ）、および可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質結合のＬＴβＲ−Ｆｃ融合タン
パク質（図８Ｊ）またはＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質（図８Ｋ）でのプレインキ
ュベーションによるブロッキング。図８Ｌは、種々の細胞株におけるＬＴβＲお
よびＴＲ２の表面発現を要約する。ＬＴβＲ−ＦｃまたはＴＲ２−Ｆｃ融合タン
パク質の、ＨＴ−２９細胞におけるｓＡＩＭ ＩＩ媒介細胞傷害性をブロッキン
グする効果。細胞を９６ウェルプレートにプレートし、そしてｓＡＩＭ ＩＩ（
１０ｎｇ／ｍｌ）を５Ｕ／ｍｌのＩＦＮγの存在下で様々な量のｓＬＴβＲ−Ｆ
ｃ（白抜きマル ＬＴβＲ−Ｆｃ単独、黒マル ＬＴβＲ−ＦｃおよびＩＦＮγ
）、またはＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質（白抜き三角 ＴＲ−２Ｆｃ単独、黒三
角 ＴＲ２−ＦｃとｓＬＴγおよびＩＦＮγ）とともに添加した。細胞を５日間
インキュベートし、そして細胞の生存度をＸＴＴアッセイによって決定した。

【図８Ｉ】 図８Ｉは、ＬＴβＲ（図８Ａ〜８Ｄ）またはＴＲ２（図８Ｅ〜８Ｈ）ｍＡｂを
使用したＦＡＣＳ分析によるＬＴβＲまたはＴＲ２の細胞表面発現である。ＭＤ
Ａ−ＭＢ−２３１（図８Ａおよび８Ｅ）、ＨＴ−２９（図８Ｂおよび８Ｆ）、Ｍ
Ｃ−３（図８Ｃおよび８Ｇ）、Ｕ９３Ｔ（図８Ｄおよび８Ｈ）。ＭＤＡ−ＭＢ−
２３１細胞における、可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質単独のＦＡＣＳ結合分析（
図８Ｉ）、および可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質結合のＬＴβＲ−Ｆｃ融合タン
パク質（図８Ｊ）またはＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質（図８Ｋ）でのプレインキ
ュベーションによるブロッキング。図８Ｌは、種々の細胞株におけるＬＴβＲお
よびＴＲ２の表面発現を要約する。ＬＴβＲ−ＦｃまたはＴＲ２−Ｆｃ融合タン
パク質の、ＨＴ−２９細胞におけるｓＡＩＭ ＩＩ媒介細胞傷害性をブロッキン
グする効果。細胞を９６ウェルプレートにプレートし、そしてｓＡＩＭ ＩＩ（
１０ｎｇ／ｍｌ）を５Ｕ／ｍｌのＩＦＮγの存在下で様々な量のｓＬＴβＲ−Ｆ
ｃ（白抜きマル ＬＴβＲ−Ｆｃ単独、黒マル ＬＴβＲ−ＦｃおよびＩＦＮγ
）、またはＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質（白抜き三角 ＴＲ−２Ｆｃ単独、黒三
角 ＴＲ２−ＦｃとｓＬＴγおよびＩＦＮγ）とともに添加した。細胞を５日間
インキュベートし、そして細胞の生存度をＸＴＴアッセイによって決定した。

【図８Ｊ】 図８Ｊは、ＬＴβＲ（図８Ａ〜８Ｄ）またはＴＲ２（図８Ｅ〜８Ｈ）ｍＡｂを
使用したＦＡＣＳ分析によるＬＴβＲまたはＴＲ２の細胞表面発現である。ＭＤ
Ａ−ＭＢ−２３１（図８Ａおよび８Ｅ）、ＨＴ−２９（図８Ｂおよび８Ｆ）、Ｍ
Ｃ−３（図８Ｃおよび８Ｇ）、Ｕ９３Ｔ（図８Ｄおよび８Ｈ）。ＭＤＡ−ＭＢ−
２３１細胞における、可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質単独のＦＡＣＳ結合分析（
図８Ｉ）、および可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質結合のＬＴβＲ−Ｆｃ融合タン
パク質（図８Ｊ）またはＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質（図８Ｋ）でのプレインキ
ュベーションによるブロッキング。図８Ｌは、種々の細胞株におけるＬＴβＲお
よびＴＲ２の表面発現を要約する。ＬＴβＲ−ＦｃまたはＴＲ２−Ｆｃ融合タン
パク質の、ＨＴ−２９細胞におけるｓＡＩＭ ＩＩ媒介細胞傷害性をブロッキン
グする効果。細胞を９６ウェルプレートにプレートし、そしてｓＡＩＭ ＩＩ（
１０ｎｇ／ｍｌ）を５Ｕ／ｍｌのＩＦＮγの存在下で様々な量のｓＬＴβＲ−Ｆ
ｃ（白抜きマル ＬＴβＲ−Ｆｃ単独、黒マル ＬＴβＲ−ＦｃおよびＩＦＮγ
）、またはＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質（白抜き三角 ＴＲ−２Ｆｃ単独、黒三
角 ＴＲ２−ＦｃとｓＬＴγおよびＩＦＮγ）とともに添加した。細胞を５日間
インキュベートし、そして細胞の生存度をＸＴＴアッセイによって決定した。

【図８Ｋ】 図８Ｋは、ＬＴβＲ（図８Ａ〜８Ｄ）またはＴＲ２（図８Ｅ〜８Ｈ）ｍＡｂを
使用したＦＡＣＳ分析によるＬＴβＲまたはＴＲ２の細胞表面発現である。ＭＤ
Ａ−ＭＢ−２３１（図８Ａおよび８Ｅ）、ＨＴ−２９（図８Ｂおよび８Ｆ）、Ｍ
Ｃ−３（図８Ｃおよび８Ｇ）、Ｕ９３Ｔ（図８Ｄおよび８Ｈ）。ＭＤＡ−ＭＢ−
２３１細胞における、可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質単独のＦＡＣＳ結合分析（
図８Ｉ）、および可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質結合のＬＴβＲ−Ｆｃ融合タン
パク質（図８Ｊ）またはＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質（図８Ｋ）でのプレインキ
ュベーションによるブロッキング。図８Ｌは、種々の細胞株におけるＬＴβＲお
よびＴＲ２の表面発現を要約する。ＬＴβＲ−ＦｃまたはＴＲ２−Ｆｃ融合タン
パク質の、ＨＴ−２９細胞におけるｓＡＩＭ ＩＩ媒介細胞傷害性をブロッキン
グする効果。細胞を９６ウェルプレートにプレートし、そしてｓＡＩＭ ＩＩ（
１０ｎｇ／ｍｌ）を５Ｕ／ｍｌのＩＦＮγの存在下で様々な量のｓＬＴβＲ−Ｆ
ｃ（白抜きマル ＬＴβＲ−Ｆｃ単独、黒マル ＬＴβＲ−ＦｃおよびＩＦＮγ
）、またはＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質（白抜き三角 ＴＲ−２Ｆｃ単独、黒三
角 ＴＲ２−ＦｃとｓＬＴγおよびＩＦＮγ）とともに添加した。細胞を５日間
インキュベートし、そして細胞の生存度をＸＴＴアッセイによって決定した。

【図８Ｌ】 図８Ｌは、ＬＴβＲ（図８Ａ〜８Ｄ）またはＴＲ２（図８Ｅ〜８Ｈ）ｍＡｂを
使用したＦＡＣＳ分析によるＬＴβＲまたはＴＲ２の細胞表面発現である。ＭＤ
Ａ−ＭＢ−２３１（図８Ａおよび８Ｅ）、ＨＴ−２９（図８Ｂおよび８Ｆ）、Ｍ
Ｃ−３（図８Ｃおよび８Ｇ）、Ｕ９３Ｔ（図８Ｄおよび８Ｈ）。ＭＤＡ−ＭＢ−
２３１細胞における、可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質単独のＦＡＣＳ結合分析（
図８Ｉ）、および可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質結合のＬＴβＲ−Ｆｃ融合タン
パク質（図８Ｊ）またはＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質（図８Ｋ）でのプレインキ
ュベーションによるブロッキング。図８Ｌは、種々の細胞株におけるＬＴβＲお
よびＴＲ２の表面発現を要約する。ＬＴβＲ−ＦｃまたはＴＲ２−Ｆｃ融合タン
パク質の、ＨＴ−２９細胞におけるｓＡＩＭ ＩＩ媒介細胞傷害性をブロッキン
グする効果。細胞を９６ウェルプレートにプレートし、そしてｓＡＩＭ ＩＩ（
１０ｎｇ／ｍｌ）を５Ｕ／ｍｌのＩＦＮγの存在下で様々な量のｓＬＴβＲ−Ｆ
ｃ（白抜きマル ＬＴβＲ−Ｆｃ単独、黒マル ＬＴβＲ−ＦｃおよびＩＦＮγ
）、またはＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質（白抜き三角 ＴＲ−２Ｆｃ単独、黒三
角 ＴＲ２−ＦｃとｓＬＴγおよびＩＦＮγ）とともに添加した。細胞を５日間
インキュベートし、そして細胞の生存度をＸＴＴアッセイによって決定した。

【図８Ｍ】 図８Ｍは、ＬＴβＲ（図８Ａ〜８Ｄ）またはＴＲ２（図８Ｅ〜８Ｈ）ｍＡｂを
使用したＦＡＣＳ分析によるＬＴβＲまたはＴＲ２の細胞表面発現である。ＭＤ
Ａ−ＭＢ−２３１（図８Ａおよび８Ｅ）、ＨＴ−２９（図８Ｂおよび８Ｆ）、Ｍ
Ｃ−３（図８Ｃおよび８Ｇ）、Ｕ９３Ｔ（図８Ｄおよび８Ｈ）。ＭＤＡ−ＭＢ−
２３１細胞における、可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質単独のＦＡＣＳ結合分析（
図８Ｉ）、および可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質結合のＬＴβＲ−Ｆｃ融合タン
パク質（図８Ｊ）またはＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質（図８Ｋ）でのプレインキ
ュベーションによるブロッキング。図８Ｌは、種々の細胞株におけるＬＴβＲお
よびＴＲ２の表面発現を要約する。ＬＴβＲ−ＦｃまたはＴＲ２−Ｆｃ融合タン
パク質の、ＨＴ−２９細胞におけるｓＡＩＭ ＩＩ媒介細胞傷害性をブロッキン
グする効果。細胞を９６ウェルプレートにプレートし、そしてｓＡＩＭ ＩＩ（
１０ｎｇ／ｍｌ）を５Ｕ／ｍｌのＩＦＮγの存在下で様々な量のｓＬＴβＲ−Ｆ
ｃ（白抜きマル ＬＴβＲ−Ｆｃ単独、黒マル ＬＴβＲ−ＦｃおよびＩＦＮγ
）、またはＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質（白抜き三角 ＴＲ−２Ｆｃ単独、黒三
角 ＴＲ２−ＦｃとｓＬＴγおよびＩＦＮγ）とともに添加した。細胞を５日間
インキュベートし、そして細胞の生存度をＸＴＴアッセイによって決定した。

【図９】 図９は、ｓＡＩＭ ＩＩ処理ヒトＰＢＬ細胞によるＩＦＮ−γの分泌を示す。
ヒトＰＢＬ（９６ウェルプレートにおいてウェルあたり５×１０⁵細胞）を、抗
ＣＤ３ ｍＡｂおよびＩＬ−２（２０Ｕ／ｍｌ）ありまたはなしでｓＡＩＭ Ｉ
Ｉの存在下または非存在下で５日間処理した。次いで、上清を以下の細胞の群か
ら収集した：ｓＡＩＭＩＩの存在下（黒マル）または非存在下（白抜きマル）の
ＰＢＬ、あるいはｓＡＩＭＩＩあり（黒三角）またはなし（白抜き三角）での休
止ＰＢＬ。ヒトＩＦＮγ濃度を、ＥＬＩＳＡによって決定した。

【図１０】 図１０は、ｐＨＥ４〜５発現ベクター（配列番号５０）およびサブクローン化
ＡＩＭＩＩ ｃＤＮＡコード配列の模式図を示す。カナマイシン耐性マーカー遺
伝子の位置、ＡＩＭＩＩコード配列、ｏｒｉＣ配列、およびｌａｃＩｑコード配
列が示されている。

【図１１】 図１１は、ｐＨＥプロモーターの調節エレメントのヌクレオチド配列（配列番
号５１）を示す。２つのｌａｃオペレーター配列、Ｓｈｉｎｅ−Ｄｅｌｇａｒｎ
ｏ配列（Ｓ／Ｄ）、ならびに末端ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｄｅＩ制限部位（イタ
リック）を示す。

【図１２】 図１２は、ＭＣＡ−３８ ＡＩＭ ＩＩ馴化培地の、ＢＩＡｃｏｒｅチップ上
に固定化したＬＴβＲ−Ｆｃ対ＭＣＩＦ−Ｆ_Cへの結合の特異性のセンサーグラ
ムを示す。馴化培地を、リンホトキシンβレセプターＦｃ融合タンパク質で誘導
体化したＢＩＡｃｏｒｅ装置フローセル上で分析した。馴化培地（１００μＬ）
を、５μＬ／分でチップ上に流し、そして同様に５μＬ／分でＨＢＳ緩衝液で洗
浄した。示されたデータは、ＡＩＭＩＩの固定化レセプターへの結合後のプロッ
トの正味の結合した（オフレート）領域を表し、そして相対質量単位（ＲＵ）対
時間で測定されている。結合条件を、拡散限定条件下で高レセプターチップ密度
で行った。説明：ＬＴβＲ−ＦｃおよびＭＣＩＦ−Ｆｃは、それぞれ、ＬＴβＲ
−ＦｃまたはＭＣＩＦ−Ｆｃ固定化ＢＩＡｃｏｒｅチップ表面からの結合データ
を参照する。

【図１３】 図１３は、ＬＴβＲ−ＦｃカラムからのＡＩＭ ＩＩ溶出によるＬＴβＲ結合
の決定を示す。結合条件は、図１１に記載するとおりであった。説明：ＬＴβＲ
およびＭＣＩＦは、それぞれＬＴβＲ−ＦｃまたはＭＣＩＦ−Ｆｃ固定化ＢＩＡ
ｃｏｒｅチップ表面からの結合データを参照する。ＭＣＡ３８細胞由来の希釈し
ていない馴化培地を、ＭＣＩＦ−Ｆｃ（ＭＣＩＦ後）およびＬＴβＲ−Ｆｃ（Ｌ
ＴβＲ後）アフィニティーカラムを通過する前（プレ）および後に分析した。Ｌ
ＴβＲ（Ｅ４〜６）およびＭＣＩＦ−Ｆｃ（Ｅ１〜３）アフィニティーカラムか
ら溶出した画分（１ｍＬ）を、３倍に希釈し、そしてＬＴβＲ ＢＩＡｃｏｒｅ
チップへの結合を試験した。

【図１４】 図１４Ａ〜１４Ｂは、ＴＲ６の配列およびシステインリッチモチーフの整列ア
ミノ酸配列を示す。（Ａ）は、ＴＲ６の推定アミノ酸配列（配列番号５２）を示
す。シグナル配列は下線が引かれている。可能なＮ−グリコシル化部位（ＮＣＴ
、アミノ酸残基１７３〜１７５）は、斜線で下線を付けられている。組換えＴＲ
−６（Ｈｉｓ）のＮ−末端アミノ酸配列は、ＶＡＥＴＰＴ−−−として読みとり
、これは、最初の２９アミノ酸がシグナル配列を構築することを示す。

【図１５】 図１５Ａ〜Ｃは、膜結合ＴＲ６リガンドの同一性を示す。ＨＥＫ２９３ＥＢＮ
Ａ細胞に、ｐＣＥＰ４コントロールベクター（斜線領域）またはｐＣＥＰ４／コ
ード化全長ＡＩＭ ＩＩ（ＬＩＧＨＴ）ｃＤＮＡ（実線）をトランスフェクトし
た。細胞を、（Ａ）ＨＶＥＭ／ＴＲ２−Ｆｃ（０．３４ｇ）、（Ｂ）ＬＴβＲ−
Ｆｃ（０．３４ｇ）、（Ｃ）ＴＲ６−（Ｈｉｓ）（０．３４ｇ）または緩衝液コ
ントロール（ベクターと同じ）と共にインキュベートした。ＨＶＥＭ／ＴＲ２お
よびＬＴβＲ結合を検出するために、細胞を抗ｈＩｇＧ−ＦＩＴＣで染色した。
ＴＲ６結合を検出するために、細胞を抗ポリ（Ｈｉｓ）および抗ｍＩｇＧ−ＦＩ
ＴＣで染色した。これらを、ＦＡＣＳにより結合について分析した。

【図１６】 図１６Ａおよび１６Ｂは、ＨＴ２９細胞において、ＴＲ６がＡＩＭ ＩＩ（Ｌ
ＩＧＨＴ）誘導細胞死を阻害することを示す。９６ウェルプレート中で、ＨＴ２
９細胞を、コントロール培地と共に、１０Ｕ／ｍｌ ＩＦＮ−γのみと共に、Ｉ
ＦＮ−γ（１０Ｕ／ｍｌ）の存在または非存在下で精製ｓＡＩＭ ＩＩ（ｓＬＩ
ＧＨＴ）タンパク質（１０ｎｇ／ｍｌ）と共に、ＩＦＮ−γ（１０Ｕ／ｍｌ）お
よびｓＡＩＭ ＩＩ（ｓＬＩＧＨＴ）（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で精製ｓＬＴ
βＲ−Ｆｃ（２００ｎｇ／ｍｌ）またはＴＲ６−（Ｈｉｓ）（２００ｎｇ／ｍｌ
）と共に、インキュベートした。

【図１７Ａ】 図１７は、マウスＡＩＭ ＩＩ（ＬＩＧＨＴ）のアミノ酸配列および発現を示
す。ｃＤＮＡ配列から推定したマウスＡＩＭ ＩＩの推定アミノ酸配列は、ヒト
ＡＩＭ ＩＩのアミノ酸配列と整列させた（図１７Ａ）。最適な整列を得るため
に、いくつかのギャップ（−）を、Ｍａｃｖｅｃｔｏｒソフトウェア（バージョ
ン６．５）を使用するＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを用いて導入した。相同性領
域を囲い、そして同一の残基に斜線を引いた。膜貫通領域（ＴＭ）に下線を引く
。アスタリスク（^*）は、予測したＮ−グリコシル化部位の位置を示す。アミノ
酸数を、整列の側方に示す。ｐｍＡＩＭ ＩＩまたはｐｃＤＮＡ３をトランスフ
ェクトし、そしてＬＴβＲ−Ｉｇまたは抗−ＡＩＭ ＩＩ抗体で染色し、続いて
ＦＩＴＣ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧまたは抗ウサギＩｇＧでそれぞれ染色した（実線
）ヒト２９３細胞を使用して、図１７Ｂ−１〜１７Ｂ−４に示されるデータを得
た。ヒトＩｇＧＩまたはウサギＩｇＧによる染色を、コントロール（斜線領域と
して使用した（図１７Ｂ−１〜１７Ｂ−４）。

【図１７Ｂ】 図１７は、マウスＡＩＭ ＩＩ（ＬＩＧＨＴ）のアミノ酸配列および発現を示
す。ｃＤＮＡ配列から推定したマウスＡＩＭ ＩＩの推定アミノ酸配列は、ヒト
ＡＩＭ ＩＩのアミノ酸配列と整列させた（図１７Ａ）。最適な整列を得るため
に、いくつかのギャップ（−）を、Ｍａｃｖｅｃｔｏｒソフトウェア（バージョ
ン６．５）を使用するＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを用いて導入した。相同性領
域を囲い、そして同一の残基に斜線を引いた。膜貫通領域（ＴＭ）に下線を引く
。アスタリスク（^*）は、予測したＮ−グリコシル化部位の位置を示す。アミノ
酸数を、整列の側方に示す。ｐｍＡＩＭ ＩＩまたはｐｃＤＮＡ３をトランスフ
ェクトし、そしてＬＴβＲ−Ｉｇまたは抗−ＡＩＭ ＩＩ抗体で染色し、続いて
ＦＩＴＣ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧまたは抗ウサギＩｇＧでそれぞれ染色した（実線
）ヒト２９３細胞を使用して、図１７Ｂ−１〜１７Ｂ−４に示されるデータを得
た。ヒトＩｇＧＩまたはウサギＩｇＧによる染色を、コントロール（斜線領域と
して使用した（図１７Ｂ−１〜１７Ｂ−４）。

【図１８Ａ】 図１８Ａは、マウスＡＩＭ ＩＩの同時刺激活性を示す。固定化抗−ＣＤ３の
存在または非存在下、９６ウェル平底マイクロプレート中で、精製Ｔ細胞（１×
１０⁶細胞／ｍｌ）を、５×１０⁴細胞／ｍｌの照射ＣＯＳ細胞（これは、ｐｃＤ
ＮＡ３またはｐｍＡＩＭ ＩＩプラスミドで７２時間トランスフェクトした）（
図１８Ａ）、または示された用量の固定化ＡＩＭ ＩＩ．ｆｌａｇ融合タンパク
質（図１８Ｂ）のいずれかで刺激した。抗−ＣＤ３ｍＡｂの濃度は、図１８Ａに
おいて２μｇ／ｍｌであり、図１８Ｂにおいて、０．２μｇ／ｍｌであった。Ｃ
Ｄ２８^-/-またはＣＤ２８^+/+球状赤血球のいずれかの精製Ｔ細胞（１×１０⁶細
胞／ｍｌ）を、固定化抗−ＣＤ３（０．２μｇ／ｍｌ）の存在下、固定化ＡＩＭ
ＩＩ．フラッグ融合タンパク質（４μｇ／ｍｌ）または可溶性抗−ＣＤ２８（
１μｇ／ｍｌ）で刺激した（図１８Ｃ）。全てのアッセイにおいて、これらの細
胞を７２時間インキュベートし、そしてＴ細胞の増殖応答を、最後の１５時間の
間に、³Ｈ−ＴｄＲの取込みによってモニタリングした。

【図１８Ｂ】 図１８Ｂは、マウスＡＩＭ ＩＩの同時刺激活性を示す。固定化抗−ＣＤ３の
存在または非存在下、９６ウェル平底マイクロプレート中で、精製Ｔ細胞（１×
１０⁶細胞／ｍｌ）を、５×１０⁴細胞／ｍｌの照射ＣＯＳ細胞（これは、ｐｃＤ
ＮＡ３またはｐｍＡＩＭ ＩＩプラスミドで７２時間トランスフェクトした）（
図１８Ａ）、または示された用量の固定化ＡＩＭ ＩＩ．ｆｌａｇ融合タンパク
質（図１８Ｂ）のいずれかで刺激した。抗−ＣＤ３ｍＡｂの濃度は、図１８Ａに
おいて２μｇ／ｍｌであり、図１８Ｂにおいて、０．２μｇ／ｍｌであった。Ｃ
Ｄ２８^-/-またはＣＤ２８^+/+球状赤血球のいずれかの精製Ｔ細胞（１×１０⁶細
胞／ｍｌ）を、固定化抗−ＣＤ３（０．２μｇ／ｍｌ）の存在下、固定化ＡＩＭ
ＩＩ．フラッグ融合タンパク質（４μｇ／ｍｌ）または可溶性抗−ＣＤ２８（
１μｇ／ｍｌ）で刺激した（図１８Ｃ）。全てのアッセイにおいて、これらの細
胞を７２時間インキュベートし、そしてＴ細胞の増殖応答を、最後の１５時間の
間に、³Ｈ−ＴｄＲの取込みによってモニタリングした。

【図１８Ｃ】 図１８Ｃは、マウスＡＩＭ ＩＩの同時刺激活性を示す。固定化抗−ＣＤ３の
存在または非存在下、９６ウェル平底マイクロプレート中で、精製Ｔ細胞（１×
１０⁶細胞／ｍｌ）を、５×１０⁴細胞／ｍｌの照射ＣＯＳ細胞（これは、ｐｃＤ
ＮＡ３またはｐｍＡＩＭ ＩＩプラスミドで７２時間トランスフェクトした）（
図１８Ａ）、または示された用量の固定化ＡＩＭ ＩＩ．ｆｌａｇ融合タンパク
質（図１８Ｂ）のいずれかで刺激した。抗−ＣＤ３ｍＡｂの濃度は、図１８Ａに
おいて２μｇ／ｍｌであり、図１８Ｂにおいて、０．２μｇ／ｍｌであった。Ｃ
Ｄ２８^-/-またはＣＤ２８^+/+球状赤血球のいずれかの精製Ｔ細胞（１×１０⁶細
胞／ｍｌ）を、固定化抗−ＣＤ３（０．２μｇ／ｍｌ）の存在下、固定化ＡＩＭ
ＩＩ．フラッグ融合タンパク質（４μｇ／ｍｌ）または可溶性抗−ＣＤ２８（
１μｇ／ｍｌ）で刺激した（図１８Ｃ）。全てのアッセイにおいて、これらの細
胞を７２時間インキュベートし、そしてＴ細胞の増殖応答を、最後の１５時間の
間に、³Ｈ−ＴｄＲの取込みによってモニタリングした。

【図１９Ａ】 図１９Ａは、ＡＩＭ ＩＩ ＤＮＡの注射が、増加した細胞溶解性Ｔ細胞（Ｃ
ＴＬ）応答、および記憶腫瘍免疫を有する樹立Ｐ８１５腫瘍の後退を誘導するこ
とを示す。図１９Ａ−１および１９Ａ−２に示されるデータを得るために、ＤＢ
Ａ／２マウスに２×１０⁵細胞のＰ８１５細胞を、０日目で接種し、次いで、７
、９および１１日目に、媒体、リポソームと混合したｐｃＤＮＡ３またはｐｍＡ
ＩＭ ＩＩを腫瘍内注射した。最後の注射後７日目で、脾臓細胞を収集し、そし
て４日間、照射Ｐ８１５細胞で再刺激した。ＣＴＬ活性を、示されたエフェクタ
ー：標的（Ｅ／Ｔ）比で、Ｐ８１５およびＬ１２１０細胞に対する標準４時間の ⁵¹ Ｃｒリリースアッセイによって評価した。結果を、三通りのウェルの平均±Ｓ
Ｄとして示す。同様の結果が、３つの独立した実験において得られた。 図１９Ｂに示されるデータを得るために、ＤＢＡ／２マウスに、２×１０⁵細
胞のＰ８１５細胞を、０日目に皮下接種した。７日後、触知可能な腫瘍塊を有す
るマウスに、媒体、リポソームと混合したｐｃＤＮＡ３またはｐｍＡＩＭ ＩＩ
のいずれかを腫瘍内注射した。注射を、１０、１４および１７日目に繰り返した
。腫瘍のサイズを、直径を測定することによって評価し、そして最長直径が２ｍ
ｍより大きい腫瘍を、触知可能な腫瘍とみなした。結果は、触知可能な腫瘍を有
するマウスの割合として示す。同様の結果が、３つの独立した実験において得ら
れた。 図１９Ｃ−１および１９Ｃ−２に示されるデータを得るために、ｐｍＡＩＭ
ＩＩ処置後の後退したＰ８１５腫瘍を有するマウスに、２×１０⁵のＰ８１５細
胞を右背部に腫瘍内負荷し、最初の腫瘍接種後４０日後に、同数のＬ１２１０細
胞を左背部腫瘍内負荷した。Ｐ８１５およびＬ１２１０負荷の両方を受けたナイ
ーブのＤＢＡ／２マウスを、コントロールとして使用した。腫瘍のサイズを、垂
直直径を測定することによって評価した。結果を、各グループの５匹のマウスの
平均±ＳＤとして示す。

【図１９Ｂ】 図１９Ｂは、ＡＩＭ ＩＩ ＤＮＡの注射が、増加した細胞溶解性Ｔ細胞（Ｃ
ＴＬ）応答、および記憶腫瘍免疫を有する樹立Ｐ８１５腫瘍の後退を誘導するこ
とを示す。図１９Ａ−１および１９Ａ−２に示されるデータを得るために、ＤＢ
Ａ／２マウスに２×１０⁵細胞のＰ８１５細胞を、０日目で接種し、次いで、７
、９および１１日目に、媒体、リポソームと混合したｐｃＤＮＡ３またはｐｍＡ
ＩＭ ＩＩを腫瘍内注射した。最後の注射後７日目で、脾臓細胞を収集し、そし
て４日間、照射Ｐ８１５細胞で再刺激した。ＣＴＬ活性を、示されたエフェクタ
ー：標的（Ｅ／Ｔ）比で、Ｐ８１５およびＬ１２１０細胞に対する標準４時間の ⁵¹ Ｃｒリリースアッセイによって評価した。結果を、三通りのウェルの平均±Ｓ
Ｄとして示す。同様の結果が、３つの独立した実験において得られた。 図１９Ｂに示されるデータを得るために、ＤＢＡ／２マウスに、２×１０⁵細
胞のＰ８１５細胞を、０日目に皮下接種した。７日後、触知可能な腫瘍塊を有す
るマウスに、媒体、リポソームと混合したｐｃＤＮＡ３またはｐｍＡＩＭ ＩＩ
のいずれかを腫瘍内注射した。注射を、１０、１４および１７日目に繰り返した
。腫瘍のサイズを、直径を測定することによって評価し、そして最長直径が２ｍ
ｍより大きい腫瘍を、触知可能な腫瘍とみなした。結果は、触知可能な腫瘍を有
するマウスの割合として示す。同様の結果が、３つの独立した実験において得ら
れた。 図１９Ｃ−１および１９Ｃ−２に示されるデータを得るために、ｐｍＡＩＭ
ＩＩ処置後の後退したＰ８１５腫瘍を有するマウスに、２×１０⁵のＰ８１５細
胞を右背部に腫瘍内負荷し、最初の腫瘍接種後４０日後に、同数のＬ１２１０細
胞を左背部腫瘍内負荷した。Ｐ８１５およびＬ１２１０負荷の両方を受けたナイ
ーブのＤＢＡ／２マウスを、コントロールとして使用した。腫瘍のサイズを、垂
直直径を測定することによって評価した。結果を、各グループの５匹のマウスの
平均±ＳＤとして示す。

【図１９Ｃ】 図１９Ｃは、ＡＩＭ ＩＩ ＤＮＡの注射が、増加した細胞溶解性Ｔ細胞（Ｃ
ＴＬ）応答、および記憶腫瘍免疫を有する樹立Ｐ８１５腫瘍の後退を誘導するこ
とを示す。図１９Ａ−１および１９Ａ−２に示されるデータを得るために、ＤＢ
Ａ／２マウスに２×１０⁵細胞のＰ８１５細胞を、０日目で接種し、次いで、７
、９および１１日目に、媒体、リポソームと混合したｐｃＤＮＡ３またはｐｍＡ
ＩＭ ＩＩを腫瘍内注射した。最後の注射後７日目で、脾臓細胞を収集し、そし
て４日間、照射Ｐ８１５細胞で再刺激した。ＣＴＬ活性を、示されたエフェクタ
ー：標的（Ｅ／Ｔ）比で、Ｐ８１５およびＬ１２１０細胞に対する標準４時間の ⁵¹ Ｃｒリリースアッセイによって評価した。結果を、三通りのウェルの平均±Ｓ
Ｄとして示す。同様の結果が、３つの独立した実験において得られた。 図１９Ｂに示されるデータを得るために、ＤＢＡ／２マウスに、２×１０⁵細
胞のＰ８１５細胞を、０日目に皮下接種した。７日後、触知可能な腫瘍塊を有す
るマウスに、媒体、リポソームと混合したｐｃＤＮＡ３またはｐｍＡＩＭ ＩＩ
のいずれかを腫瘍内注射した。注射を、１０、１４および１７日目に繰り返した
。腫瘍のサイズを、直径を測定することによって評価し、そして最長直径が２ｍ
ｍより大きい腫瘍を、触知可能な腫瘍とみなした。結果は、触知可能な腫瘍を有
するマウスの割合として示す。同様の結果が、３つの独立した実験において得ら
れた。 図１９Ｃ−１および１９Ｃ−２に示されるデータを得るために、ｐｍＡＩＭ
ＩＩ処置後の後退したＰ８１５腫瘍を有するマウスに、２×１０⁵のＰ８１５細
胞を右背部に腫瘍内負荷し、最初の腫瘍接種後４０日後に、同数のＬ１２１０細
胞を左背部腫瘍内負荷した。Ｐ８１５およびＬ１２１０負荷の両方を受けたナイ
ーブのＤＢＡ／２マウスを、コントロールとして使用した。腫瘍のサイズを、垂
直直径を測定することによって評価した。結果を、各グループの５匹のマウスの
平均±ＳＤとして示す。

【図２０】 図２０は、ＡＩＭ ＩＩの妨害によるＧＶＨＤの阻害を示す。（図２０Ａおよ
び２０Ｂ）致死量以下（４Ｇｙ）照射したＢＤＦ１マウスに、０日目に７×１０ ⁷ 細胞のＢ６脾細胞を静脈内注射した。レシピエントマウスに、ＬＴβＲ−Ｉｇ
またはコントロールヒトＩｇＧ１のいずれかを−１、２、５、８、１１、１４、
および１７日目にマウスあたり１００μｇで静脈内投与した（コントロールＩｇ
は、すべてのマウスが１２日目で死亡したために１１日目まで投与した）。レシ
ピエントの生存（図２０Ａ）および体重（図２０Ｂ）を、毎日モニタリングした
。図２０Ｂにおける結果は、各グループの５マウスの平均グラム±ＳＥＭとして
表現する。 照射していないＢＤＦ１マウスに、０日目に７×１０⁷細胞のＢ６（Ｂ６−Ｆ
１）脾細胞またはＢＤＦ１（Ｆ１−Ｆ１）脾細胞を静脈内注射した。レシピエン
トマウスに、ＬＴβＲ−ＩｇまたはコントロールヒトＩｇＧ１のいずれかを−１
、３、５、７、９日目にマウスあたり１００μｇで静脈内投与した。１１日目に
、脾細胞をレシピエントマウスから調製し、そしてＰ８１５（Ｈ−２^d）および
ＥＬ−４（Ｈ−２^b）に対するそれらのＣＴＬ活性について、標準的な⁵¹Ｃｒ放
出アッセイにおいて、インビトロでのさらなる刺激なしでアッセイした（図２０
Ｃ−１および２０Ｃ−２）。 照射していないＢＤＦ１マウスに、０日目に７×１０⁷細胞のＢ６ ＬＴα^-/- 脾細胞またはＬＴ^+/+脾細胞を静脈内注射した。ＢＤＦ１脾細胞（７×１０⁷細胞
）を注射したＢＤＦ１マウスを、コントロールとして使用した（Ｆ１−Ｆ１）。
１１日目に、レシピエント脾細胞のＣＴＬ活性を、上記のように評価した（図２
０Ｄ−１および２０Ｄ−２）。 Ｂ６ ＬＴα^-/-脾細胞の精製したＴ細胞（１×１０⁶細胞／ｍｌ）を、２５μ
ｇのＬＴβＲ−ＩｇまたはコントロールヒトＩｇＧ１の存在下で、照射したＢＡ
ＬＢ／ｃ脾細胞（１×１０⁶細胞／ｍｌ）を用いて培養した。５日後、Ｃ２６（
Ｈ−２^d）およびＥＬ−４（Ｈ−２^b）に対するＣＴＬ活性を、標準的な⁵¹Ｃｒ放
出アッセイにおいて試験した（図２０Ｅ−１および２０Ｅ−２）。その結果を、
三連のウェルの平均±ＳＤとして表現する（図２０Ｃ−１および図２０Ｃ−２、
図２０Ｄ−１および図２０Ｄ−２、ならびに図２０Ｅ−１および図２０Ｅ−２）
。

【図２１】 図２１は、ＡＩＭ ＩＩ同時刺激経路の調節によるサイトカイン産生を示す。
精製したＴ細胞（１×１０⁶細胞／ｍｌ）を、９６ウェル平底マイクロプレート
中で、固定化した抗ＣＤ３（０．５μｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で、固
定化したＡＩＭ ＩＩ．ｆｌａｇ融合タンパク質（３．２μｇ／ｍｌ）で刺激し
た。４８時間後、培養上清を収集し、そしてサイトカイン産生をサンドウィッチ
ＥＬＩＳＡによって評価した（図２１Ａ−１〜２１Ａ−４）。図２１Ｂ−１〜２
１Ｂ−４に示されるデータは、２５μｇ／ｍｌのＬＴβＲ−Ｉｇ融合タンパク質
またはコントロールヒトＩｇＧ１のいずれかの存在下で、照射したＢＡＬＢ／ｃ
脾細胞（１×１０⁶細胞／ｍｌ）を用いて培養したＬＴα^-/-脾細胞から精製した
Ｔ細胞（１×１０⁶細胞／ｍｌ）を使用して生成した。７２時間後、培養上清を
収集し、そしてサイトカイン産生をサンドウィッチＥＬＩＳＡによって評価した
。ＩＬ−１０は、すべてのウェルにおいて検出不能（ｎ，ｄ．）（＜０．３ｎｇ
／ｍｌ）であった（図２１Ｂ−１〜２１Ｂ−４）。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 11/00 Ａ６１Ｐ 19/00 ４Ｈ０４５ 19/00 29/00 29/00 31/00 31/00 35/00 35/00 37/02 37/02 37/08 37/08 43/00 １０５ 43/00 １０５ Ｃ０７Ｋ 14/525 ＺＮＡ Ｃ０７Ｋ 14/525 ＺＮＡ 16/24 16/24 19/00 19/00 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:91 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:91） (31)優先権主張番号 ６０／１４２，６５７ (32)優先日 平成11年７月６日(1999．7．6) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１４８，３２６ (32)優先日 平成11年８月11日(1999．8．11) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１６８，３８０ (32)優先日 平成11年12月２日(1999．12．2) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ， ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，Ｋ Ｒ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 エブナー， レインハード アメリカ合衆国 メリーランド 20878， ゲイザーズバーグ， シェルバーン テ ラス ナンバー316 9906 (72)発明者 ユ， グゥオ−リャン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94705， バークレイ， グラバット ドライブ 242 (72)発明者 ルーベン， スティーブン エム． アメリカ合衆国 メリーランド 20832， オルネイ， ヘリテイジ ヒルズ ドラ イブ 18528 (72)発明者 ツァイ， イ−ファン アメリカ合衆国 メリーランド 20879， ゲイザーズバーグ， ロイヤル ウッズ コート 10330 (72)発明者 ウルリッチ， ステフェン アメリカ合衆国 メリーランド 20853， ロックビル， ラムズ ヘッド コート 4713 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 AA12 BA28 BA44 CA04 DA02 EA04 GA11 HA01 HA12 HA15 HA17 4B064 AG07 CA10 CA19 CC24 DA05 DA13 DA14 4C076 CC26 CC27 CC41 EE23 EE59 4C084 AA02 AA17 BA01 BA02 BA20 BA21 BA22 DA12 DA25 MA02 NA05 ZB07 ZB26 4C085 AA14 BB11 BB42 CC02 CC23 CC32 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 BA41 BA57 CA40 DA14 DA76 DA86 EA22 EA28 EA29 FA50 FA74

Claims (29)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 対宿主性移植片病、免疫不全または自己免疫を処置するため
   の方法であって、治療有効量の以下： （ａ）配列番号２のアミノ酸１〜２４０からなるポリペプチドに結合する抗体
   を含有する、第１の治療剤；ならびに （ｂ）以下からなる群より選択される、第２の治療剤： （ｉ）腫瘍壊死因子； （ｉｉ）免疫抑制剤； （ｉｉｉ）抗生物質； （ｉｖ）抗炎症剤； （ｖ）化学療法剤； （ｖｉ）サイトカイン； （ｖｉｉ）脈管形成剤；および （ｖｉｉｉ）線維芽細胞成長因子 を個体に投与する工程を包含する、方法。
2. 【請求項２】 請求項１に記載の方法であって、ここで前記第１の治療剤お
   よび第２の治療剤が、同時に前記個体へ投与される、方法。
3. 【請求項３】 請求項１に記載の方法であって、ここで前記第１の治療剤お
   よび第２の治療剤が、異なるときに前記個体へ投与される、方法。
4. 【請求項４】 請求項１に記載の方法であって、ここで前記腫瘍壊死因子が
   以下： （ａ）ＴＮＦ−α； （ｂ）ＴＮＦ−β；および （ｃ）ＴＮＦ−γ からなる群より選択される、方法。
5. 【請求項５】 請求項１に記載の方法であって、ここで、前記免疫抑制剤が
   以下： （ａ）シクロスポリン； （ｂ）シクロホスファミドメチルプレドニゾン； （ｃ）プレドニゾン； （ｄ）アザチオプリン； （ｅ）ＦＫ−５０６；および （ｆ）１５−デオキシスペルグアリン からなる群より選択される、方法。
6. 【請求項６】 請求項１に記載の方法であって、ここで、前記サイトカイン
   が以下： （ａ）ＩＬ−２； （ｂ）ＩＬ−３； （ｃ）ＩＬ−４； （ｄ）ＩＬ−５； （ｅ）ＩＬ−６； （ｆ）ＩＬ−７； （ｇ）ＩＬ−１０； （ｈ）ＩＬ−１２； （ｉ）ＩＬ−１３； （ｊ）ＩＬ−１５；および （ｋ）ＩＦＮ−γ からなる群より選択される、方法。
7. 【請求項７】 組成物であって、以下： （ａ）配列番号２のアミノ酸１〜２４０からなるポリペプチドに結合する抗体
   を含有する、第１の治療剤；ならびに （ｂ）以下からなる群より選択される、第２の治療剤： （ｉ）腫瘍壊死因子； （ｉｉ）免疫抑制剤； （ｉｉｉ）抗生物質； （ｉｖ）抗炎症剤； （ｖ）化学療法剤； （ｖｉ）サイトカイン； （ｖｉｉ）脈管形成剤；および （ｖｉｉｉ）線維芽細胞成長因子 を含有する、組成物。
8. 【請求項８】 請求項７に記載の組成物であって、薬学的に受容可能なキャ
   リアまたは賦形剤をさらに含む、組成物。
9. 【請求項９】 以下からなる群より選択される障害を有する個体の処置をす
   るための方法であって： （ａ）対宿主性移植片病； （ｂ）免疫不全；および （ｃ）自己免疫、 ここで該方法は、治療有効量の請求項７に記載の組成物を個体に投与する工程
   を包含する、方法。
10. 【請求項１０】 免疫不全または癌を処置するための方法であって、以下： （ａ）配列番号２のアミノ酸８３〜２４０に少なくとも９０％同一なアミノ酸
    残基を含む単離されたポリペプチドを含有する、第１の治療剤；ならびに （ｂ）以下からなる群より選択される、第２の治療剤： （ｉ）抗生物質； （ｉｉ）抗炎症剤； （ｉｉｉ）脈管形成剤；および （ｉｖ）線維芽細胞成長因子 の治療有効量を個体に投与する工程を包含する、方法。
11. 【請求項１１】 請求項１０に記載の方法であって、ここで前記単離された
    ポリペプチドは、Ｆｃ免疫グロブリンポリペプチドに融合される、方法。
12. 【請求項１２】 請求項１０に記載の方法であって、ここで前記第１の治療
    剤および第２の治療剤が、同時に個体へ投与される、方法。
13. 【請求項１３】 請求項１０に記載の方法であって、ここで前記第１の治療
    剤および第２の治療剤が、異なるときに個体へ投与される、方法。
14. 【請求項１４】 請求項１０に記載の方法であって、ここで、前記抗生物質
    剤が以下： （ａ）アモキシリン； （ｂ）クリンダマイシン； （ｃ）クロラムフェニコール； （ｄ）シプロフロキサシン； （ｅ）エリスロマイシン； （ｆ）リファンピン； （ｇ）ストレプトマイシン； （ｈ）テトラサイクリン；および （ｉ）バンコマイシン； からなる群より選択される、方法。
15. 【請求項１５】 免疫不全または癌を処置するための方法であって、以下： （ａ）配列番号２のアミノ酸６０〜２４０に少なくとも９０％同一なアミノ酸
    残基を含む単離されたポリペプチドを含有する、第１の治療剤；ならびに （ｂ）以下からなる群より選択される、第２の治療剤： （ｉ）抗生物質； （ｉｉ）抗炎症剤； （ｉｉｉ）脈管形成剤；および （ｉｖ）線維芽細胞成長因子 の治療有効量を個体に投与する工程を包含する、方法。
16. 【請求項１６】 組成物であって、以下： （ａ）配列番号２のアミノ酸８３〜２４０に少なくとも９０％同一なアミノ酸
    残基を含む単離されたポリペプチドを含有する、第１の治療剤；ならびに （ｂ）以下からなる群より選択される、第２の治療剤： （ｉ）抗生物質； （ｉｉ）抗炎症剤； （ｉｉｉ）脈管形成剤；および （ｉｖ）線維芽細胞成長因子 を含有する、組成物。
17. 【請求項１７】 請求項１６に記載の組成物であって、薬学的に受容可能な
    キャリアまたは賦形剤をさらに含む、組成物。
18. 【請求項１８】 請求項１６に記載の組成物であって、ここで前記単離され
    たポリペプチドは、Ｆｃ免疫グロブリンポリペプチドに融合される、組成物。
19. 【請求項１９】 以下からなる群より選択される障害を有する個体の処置の
    ための方法であって： （ａ）免疫不全；および （ｂ）癌、 ここで、該方法は、治療有効量の請求項１６に記載の組成物を個体に投与する
    工程を包含する、方法。
20. 【請求項２０】 配列番号２のアミノ酸８３〜２４０に少なくとも９０％同
    一なアミノ酸残基を含有する単離されたポリペプチドであって； ここで該ポリペプチドは、ポリエチレングリコールに共有結合され、該ポリエ
    チレングリコールは、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７
    ０００、８０００、９０００、１０，０００、１５，０００および２０，０００
    からなる群より選択される平均分子量を有する、 単離されたポリペプチド。
21. 【請求項２１】 請求項２０に記載の単離されたポリペプチドであって、こ
    こで該ポリペプチドは、ポリエチレングリコールと、１〜３、２〜４、３〜５、
    ４〜６、５〜７、６〜８、７〜９、８〜１０、９〜１１および１０〜１２からな
    る群より選択される範囲内に分類される平均置換度を有する、単離されたポリペ
    プチド。
22. 【請求項２２】 組み換え宿主細胞によって産生される、請求項２０に記載
    の単離されたポリペプチド。
23. 【請求項２３】 異種ポリペプチドを含有する、請求項２０に記載の単離さ
    れたポリペプチド。
24. 【請求項２４】 請求項２０に記載の単離されたポリペプチドおよび薬学的
    に受容可能なキャリアを含有する、組成物。
25. 【請求項２５】 配列番号２のアミノ酸８３〜２４０に少なくとも９５％同
    一であるアミノ酸残基を含有する単離されたポリペプチドであって； ここで該ポリペプチドは、ポリエチレングリコールに共有結合され、該ポリエ
    チレングリコールは、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７
    ０００、８０００、９０００、１０，０００、１５，０００および２０，０００
    からなる群より選択される平均分子量を有する、 単離されたポリペプチド。
26. 【請求項２６】 配列番号２のアミノ酸８３〜２４０を含有する単離された
    ポリペプチドであって； ここで該ポリペプチドは、ポリエチレングリコールに共有結合され、該ポリエ
    チレングリコールは、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７
    ０００、８０００、９０００、１０，０００、１５，０００および２０，０００
    からなる群より選択される平均分子量を有する、 単離されたポリペプチド。
27. 【請求項２７】 配列番号２のアミノ酸６０〜２４０に少なくとも９０％同
    一であるアミノ酸残基を含有する単離されたポリペプチドであって； ここで該ポリペプチドは、ポリエチレングリコールに共有結合され、該ポリエ
    チレングリコールは、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７
    ０００、８０００、９０００、１０，０００、１５，０００および２０，０００
    からなる群より選択される平均分子量を有する、 単離されたポリペプチド。
28. 【請求項２８】 配列番号２のアミノ酸６０〜２４０に少なくとも９５％同
    一であるアミノ酸残基を含有する単離されたポリペプチドであって； ここで該ポリペプチドは、ポリエチレングリコールに共有結合され、該ポリエ
    チレングリコールは、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７
    ０００、８０００、９０００、１０，０００、１５，０００および２０，０００
    からなる群より選択される平均分子量を有する、 単離されたポリペプチド。
29. 【請求項２９】 配列番号２のアミノ酸６０〜２４０を含有する単離された
    ポリペプチドであって； ここで該ポリペプチドは、ポリエチレングリコールに共有結合され、該ポリエ
    チレングリコールは、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７
    ０００、８０００、９０００、１０，０００、１５，０００および２０，０００
    からなる群より選択される平均分子量を有する、 単離されたポリペプチド。