JP2003520568A - 高度な抗原提示プラットフォーム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、免疫応答を誘発する目的のために、ハプテン提示のための粒子を提供する。粒子を構成するモノマーのアミノ酸配列は、アヒルＢ型肝炎ウイルスのコアタンパク質由来である。この粒子はまた核酸を送達し得る。この核酸は、免疫応答を増強するためにか、または例えば遺伝子療法のために送達され得る。さらに、本発明は、ヌクレオカプシドタンパク質モノマーを含む粒子に関し、この粒子の１次配列はＢ型肝炎ウイルス由来であり、ここでこのモノマーがヒトＨＢｃＡｇに対する抗体と交差反応しない粒子に間する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の背景） （発明の分野） 本発明は、ワクチンの開発、特に抗原提示のための改良された方法の開発に関
する。本発明はさらに、核酸を粒子を介して細胞へ送達することに関する。

【０００２】 （背景の説明） すべてのワクチン接種の目標は、微生物の侵入を妨げる、すでに宿主に侵入し
た微生物を除去する、あるいは微生物の毒素を中和する特異的な免疫を誘導する
ことである。あいにく、細胞内の病原体に対する効果的なタンパク質のサブユニ
ットワクチンまたはペプチドワクチンの開発は、主に科学技術的および概念的な
欠点に妨げられてきた。

【０００３】 １つのこのような欠点は、強力なＴＨ１免疫応答を誘発し得ないことである。
ワクチン接種の間の抗原への免疫系の応答は、免疫応答を増強するために使用さ
れる疾患特異的抗原の大きさおよび組成、そして特にアジュバントに依存してい
くらか可変性である。潜在的な応答は、ＴＨ１応答、ＴＨ２応答または混合され
た（ＴＨ１／ＴＨ２）応答を含む。

【０００４】 サイトカインプロフィールは、免疫応答におけるＴ細胞調節およびエフェクタ
ー機能を決定する。サイトカインは、Ｔ細胞応答を指向する際に役割を果たす。
ヘルパー（ＣＤ４＋）Ｔ細胞は、他の免疫系細胞（他のＴ細胞を含む）に作用す
る可溶性因子の産生を通じて哺乳動物の免疫応答を調節する。ほとんどの成熟Ｃ
Ｄ４＋Ｔヘルパー細胞は、２つのサイトカインプロフィール（ＴＨ１またはＴＨ
２）の１つを発現する。ＴＨ１細胞は、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＦＮ−γ、ＴＮ
Ｆ−β、ＧＭ−ＣＳＦおよび高レベルのＴＮＦ−αを分泌する。ＴＨ２細胞は、
ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３
、ＧＭ−ＣＳＦおよび低レベルのＴＮＦ−αを発現する。ＴＨ１の部分集合は、
遅延型過敏症、細胞媒介免疫ならびにＩｇＧ２への免疫グロブリンクラスの転換
を促進する。ＴＨ２部分集合は、Ｂ細胞の活性化、抗体産生の促進、ならびにＩ
ｇＧおよびＩｇＥへのクラスの転換を誘導することによって体液性免疫を誘導す
る。

【０００５】 いくつかの因子は、ＴＨ１またはＴＨ２のプロフィールの方向づけに影響する
ことを示した。最も特徴付けられた制御因子は、サイトカインである。ＩＬ−１
２およびＩＦＮ−γは、正のＴＨ１制御因子および負のＴＨ２制御因子である。
ＩＬ−１２は、ＩＦＮ−γの産生を促進し、そしてＩＦＮ−γは、ＩＬ−１２に
ついての正のフィードバックを提供する。ＩＬ−４およびＩＬ−１０は、ＴＨ２
サイトカインプロフィールの確立およびＴＨ１サイトカイン産生を下方制御する
ために必要でありそうである；ＩＬ−４の効果は、いくつかの場合、ＩＬ−１２
の効果よりも優勢である。ＩＬ−１３は、ＩＬ−４と同様の方法で、炎症性サイ
トカイン（ＬＰＳ誘導性単球によるＩＬ−１２およびＴＮＦ−αを含む）の発現
を阻害することを示した。ＩＬ−１２ ｐ４０ホモダイマーは、ＩＬ−１２レセ
プターに結合し、そしてＩＬ−１２の生物学的活性を拮抗する；従って、ＩＬ−
１２ ｐ４０ホモダイマーは、ＩＬ−１２のプロＴＨ−１効果をブロックする。

【０００６】 ＴＨ１応答は、微生物の食細胞による除去のための、マクロファージ、Ｂ細胞
抗体産生細胞、プロフェッショナル（ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ）抗原提示細胞
（ＡＰＣ）、および細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の移動によって特徴付けられ
る。さらに、ＴＨ１応答は、ＩＦＮ−γの発現を誘導する。ＩＦＮ−γは、例え
ばＩｇＧ２（補体を固定し、そしてマクロファージによる食作用を促進する）の
ようなアイソタイプへのＢ細胞の転換を促進する。ＩＦＮ−γはまた、マクロフ
ァージの抗菌機能を活性化する。従って、ＴＨ１免疫応答は、細胞内の微生物の
除去に重要である食細胞依存性宿主反応を誘導する。従って、強力なＴＨ１応答
を誘発するワクチンが非常に望まれる。

【０００７】 いくつかの研究は、サイトカインＩＬ−１２が、ＴＨ１型免疫応答を促進する
ことによって、インビボでの抗ウイルス性の効果を誘導する際に、重要な役割を
果たすことを報告した。ＩＬ−１２は、マクロファージ、樹状細胞、およびＢ細
胞を含む、活性化された抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって主に産生され、そして
抗体、ＣＤ４⁺、およびＣＴＬ応答を増大することが報告される。ＩＬ−１２は
、１型ＴＨ細胞のＩＦＮ−γ産生細胞への成熟を誘導し、ナチュラルキラー（Ｎ
Ｋ）活性を促進し、そしてＣＴＬの成熟を増強する。それは、２つのサブユニッ
ト、ｐ３５およびｐ４０からなるヘテロダイナミック（ｈｅｔｅｒｏｄｙｎａｍ
ｉｃ）サイトカインである。ｐ３５サブユニットは、恒常的に（ｃｏｎｓｔｉｔ
ｕｉｔｉｖｅｌｙ）発現され、一方で、ｐ４０サブユニットは、ＡＰＣ活性化に
際してのみ発現される。従って、ＩＬ−１２の産生を除去するワクチンが非常に
望まれる。

【０００８】 タンパク質サブユニットまたはペプチドワクチンはそれら自体、しばしば免疫
学的に活性でなく、アジュバントと共に投与されなければならない。水酸化アル
ミニウム（ミョウバン）は、現在、ヒト使用のために認可された唯一のアジュバ
ントである。ミョウバンの重大な欠点は、ＴＨ１型免疫応答より、むしろＴＨ２
免疫応答を誘導することであり、そしてこれは、ＣＴＬの誘導を妨げ得る。確か
に、組換えＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を用いて免疫されたマウスにおいて
、ミョウバンの添加は、選択的にＣＤ８＋ ＣＴＬの活性化をブロックする（Ｓ
ｃｈｉｒｍｂｅｃｋら、１９９４）。ＨＢＶに対する保護免疫については必須で
はないが、それにもかかわらずＣＴＬは重要な役割を果たし得る。

【０００９】 ミョウバンの使用は、ＴＨ２型の疾患に関連していた。先進国における非常に
高いぜん息（ＴＨ２型疾患）の有病率は、高い衛生レベルおよび幼児期の感染症
の急速な処置に関連し得る（ＣｏｏｋｓｏｎおよびＭｏｆｆａｔｔ、１９９７）
。細菌ＤＮＡへの初期の曝露は、免疫系をＴＨ２型応答から離れてＴＨ１型応答
に向かってあと押しし、そしてこれは、幼児期に非常に高い頻度の上気道感染が
存在する発展途上国における低いぜん息の発生率を説明し得る。ＴＨ１型応答を
再確立し得る小児ワクチンが利用可能であり、それによってぜん息の発生率を減
少させることは有利である。

【００１０】 細胞外液（ほとんどのワクチンの場合）に蓄積された抗原による強力なＴＨ１
応答を誘導するために、非常に高い濃度の抗原が必要である。これは、安全かつ
有効な様式で達成され得ない。しかし、この問題に対する１つの解決は、粒子の
表面上の疾患特異的抗原を送達することである。マクロファージおよび樹状細胞
の両方は、大きな液胞内に粒子を内部移行する。ここで外来性抗原は、クラスＩ
提示経路およびクラスＩＩ提示経路の両方に移され得る。この外来性クラスＩ提
示経路は、ワクチン開発のための重要な目的である。なぜなら、それは細胞外液
中に蓄積される抗原を用いてＣＴＬ免疫を誘発する手段を提供するからである。
外来性抗原が天然で粒子である場合、それらはクラスＩ経路およびクラスＩＩ経
路の両方における可溶性抗原よりも１，０００〜１０，０００倍以上の効率で提
示されることが実証された（Ｈａｒｒｉｓら、１９９２；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら
、１９９３；Ｓｃｈｏｄｅｌら、１９９４；Ｓｃｈｉｒｍｂｅｃｋら、１９９５
；およびＲａｙｃｈａｕｄｈｕｒｉおよびＲｏｃｋ、１９９８）。抗原を輸送す
る粒子の使用の１例は、ヒトＢ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃＡｇ）の例であ
る。ヒトＨＢｃＡｇが、外来のエピトープ（いくつかの選択された部位で化学的
にタンパク質配列に結合されるか、または遺伝的にタンパク質配列に操作される
）のための効果的なキャリアとして役立ち得ることが示された（Ｍｉｌｉｃｈ、
１９９０；Ｓｃｈｏｄｅｌら、１９９２；Ｓｃｈｏｄｅｌら、１９９３；Ｓｃｈ
ｏｄｅｌら、１９９４；Ｍｉｌｉｃｈら、１９９５）。また、例えば、以下のＴ
ｈｏｒｎｔｏｎらへの米国特許第４，８８２，１４５号；同第４，８８２，１４
５号、および同第５，１４３，７２６号を参照のこと（これらは参考として本明
細書中に援用される）。これらの特許は、ポリペプチド免疫源に結合されたヒト
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ヌクレオカプシドタンパク質のＴ細胞刺激領域から
構成される融合タンパク質の使用に関する。しかし、ワクチンキャリアとしての
ヒトＨＢｃＡｇの使用についての１つの重要な欠点は、ＨＢｃＡｇそれ自体に対
する抗体（抗ＨＢｃ）がまた、ワクチンの受容者において発達することである。
これは、ヒトおよび血液（輸血の際に使用のために寄付された）におけるＨＢＶ
感染の検出は血液中の抗ＨＢｃについてのスクリーニングによるので、問題であ
る。従って、ヒトＨＢｃＡｇに基づくワクチンの広範な使用は、現在、使用され
るＢ型肝炎スクリーニングシステムに欠陥を生じさせる。いくつかの他の種（例
えば、ウッドチャック）由来のＢ型肝炎に基づく粒子の使用はまた、同じ問題を
引き起こす。なぜなら、それらは、ヒトＨＢｃＡｇと交差反応性であるからであ
る。世界中で、約５憶の人々がＨＢＶに感染したと推定される。これらの個人に
おいて、ヒトＨＢｃＡｇに基づくワクチンの投与は、効果がない。なぜなら、か
れらの免疫系は、ワクチン粒子が、それらの免疫効果を発揮する前に、おそらく
ワクチン粒子を攻撃し、そして破壊するからである。従って、現在のＨＢＶスク
リーニング手順を妨げない粒子性ワクチンキャリアが利用可能になることは有利
である。

【００１１】 現在のワクチンの別の主要な欠点は、侵入してくる細菌の「類似種（ｑｕａｓ
ｉｓｐｅｓｉｅｓ）」に対して特定の免疫応答を刺激する際に有効なハプテンを
送達するためのビヒクルを産生し得ないことである。類似種は、感染の間に発達
する最初の微生物の子孫である。類似種の遺伝的特徴は、変異によって改変され
、これらの構造的に類似の微生物が、免疫系による除去から逃れ、そして病理学
的な状態を維持することを可能にする。従って、ワクチンにおける使用のための
ハプテンビヒクルを開発することもまた非常に望まれる。このハプテンビヒクル
は、遺伝的超可変微生物（例えば、ウイルス）によって示されるハプテンのよう
な、広範な種々の構造的に類似のハプテンに対する保護応答を誘発することが可
能であった。このようなハプテンビヒクルは、標的微生物および感染の間に産生
される類似種に対する免疫応答を刺激し得る。

【００１２】 （発明の要旨） 本発明は、複数のヌクレオカプシドタンパク質モノマーから構成される組成物
を提供し、ヌクレオカプシドタンパク質モノマーの一次配列は、アヒルＢ型肝炎
ウイルスに由来する。ここで複数のモノマーは集合し、粒子を形成する。このモ
ノマーは、さらに粒子の用途に依存して第１ハプテンおよび第２ハプテン、なら
びに多重ハプテンを含み得る。この粒子はさらに、核酸を含み得る。これらの核
酸は、配列番号３〜１９に対応する配列を有し得るが、これらに限定されない。

【００１３】 このハプテンは、以下からなる群より選択される因子によって引き起こされる
疾患状態に関連し得る：一本鎖ＤＮＡウイルス、二本鎖ＤＮＡウイルス、一本鎖
ＲＮＡウイルス、二本鎖ＲＮＡウイルス、細胞内寄生生物、真菌、細菌、および
癌。

【００１４】 本発明は、さらに粒子（この粒子は所望の核酸配列を含む）の形態に集合した
複数のヌクレオカプシドタンパク質モノマーから構成される組成物を投与するこ
とによってそれを必要とする被験体に核酸を送達する方法を包含する。

【００１５】 本発明はまた、粒子を作製するための方法を提供し、この方法は、以下の工程
：複数のヌクレオカプシドタンパク質モノマー（一次配列は、アヒルＢ型肝炎ウ
イルスに由来する）から構成される組成物を提供する工程（この複数のモノマー
は、集合して、粒子を形成する）、荷電した因子に粒子を曝露して、粒子を分解
させ、そして核酸または異なるハプテンを含む他のヌクレオシドカプシドモノマ
ーを混合することを可能にする工程、そしてこの荷電された因子を除去する工程
（荷電された因子の除去は、モノマーを再集合することを可能にする）、を包含
する。不必要な核酸を除去する工程および所望の核酸を付加する工程のようなさ
らなる工程は、この方法に包含され得る。この荷電された因子は、以下からなる
群より選択される二価の陽イオンであり得る：Ｍｇ⁺²、Ｚｎ⁺²、Ｂａ⁺²、Ｓｒ⁺² 、Ｃａ⁺²およびＰｂ⁺²。

【００１６】 （発明の詳細な説明） （定義：） 抗体：免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥなど）とよばれるグリコシル
化されたタンパク質のファミリーのメンバーである分子。この分子は、抗原と特
異的に結合し得る。

【００１７】 抗原：抗体により結合される実体を示すため、そしてまた、抗体の生成を誘導
する実体を示すために歴史的に用いられている用語。より最近の使用法では、抗
原の意味は、抗体により結合される実体に制限されている。その一方で、語「免
疫原」は、抗体生成を誘導する実体に関して用いられている。本明細書中で議論
される実体が、免疫原性および抗原性の両方である場合、この実体を免疫原また
は抗原のいずれかとして参照することは、代表的には、意図される利用に従って
行われる。

【００１８】 抗原決定基：抗原結合部位またはＴ細胞レセプターを結合する抗体により免疫
学的に結合される抗原の実際の構造部分。この用語は、「エピトープ」と交換可
能である。

【００１９】 サイトカイン：細胞の増殖および分化を促進するタンパク質ホルモン。サイト
カインは、抗原性刺激に応答して、免疫細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ
、樹状細胞など）により分泌される。

【００２０】 ＧＭ−ＣＳＦ：顆粒球単球コロニー刺激因子は、一般には骨髄に作用して炎症
性白血球の生成を増加させるサイトカインである。これは、また、マクロファー
ジ活性化因子であり、そしてランゲルハンス細胞を樹状細胞に分化させることを
促進する。

【００２１】 ハプテン：生化学的、遺伝的、またはコンピューター手段により同定される疾
患特異的抗原決定基。

【００２２】 ＨＢｃＡｇ：Ｂ型肝炎ウイルスのヌクレオカプシドタンパク質遺伝子によりコ
ードされるアミノ酸残基配列に対応するアミノ酸残基配列を有するＴ細胞刺激タ
ンパク質またはポリペプチド。

【００２３】 ＩＦＮ−γ：インターフェロン−γは、活性化ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞
、ならびにＮＫ細胞により生成される。ＩＦＮ−γの生成は、抗原活性化の直接
的結果であり、そしてサイトカインＩＬ−２およびＩＬ−１２の存在により増強
される。

【００２４】 単球性細胞（ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ ｃｅｌｌ）：単球性細胞は、不完全に分化
した細胞として骨髄から放出され、そして「単球（ｍｏｎｏｃｙｔｅ）」といわ
れる。

【００２５】 核酸（またはオリゴヌクレオチド）：少なくとも５塩基長のヌクレオチドのポ
リマー形態。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、
またはそのいずれかの改変形態であり得る。それらは、二本鎖または一本鎖であ
り得る。

【００２６】 ポリペプチドまたはペプチド：隣接するアミノ酸のαアミノ基とカルボキシ基
との間でペプチド結合により互いに結合されたアミノ酸の直鎖状のひとつづき。
それらは、それらの中性（非荷電性）形態、または塩形態、およびグリコシル化
、側鎖の酸化、リン酸化などのような修飾を含んでいようと、含んでいまいと、
種々の長さであり得る。また、さらなる置換基（例えば、グリコシル単位、脂質
、または無機イオン（例えば、リン酸）および化学的変換または鎖に関連する改
変（例えば、スルフヒドリル基の酸化））により修飾されたタンパク質もまた含
まれる。

【００２７】 タンパク質：約７０以上のアミノ酸を有するポリペプチド。

【００２８】 ＴＨ（ＴＨ１およびＴＨ２においても同様）：Ｔヘルパー細胞。感作されてい
ないＣＤ４＋細胞は、ＴＨＩおよびＴＨ２の部分集合に分化し得る。この分化は
、免疫応答を誘発する微生物に応答して、早くに生成されるサイトカイン環境に
より影響される。ＴＨ１細胞の原理的なエフェクター機能は、感染に対する食細
胞媒介性防御である。ＴＨ２細胞は、主に、抗体の発生およびアレルギー性免疫
応答に関与する。

【００２９】 本発明は、免疫応答を誘発するために、免疫応答を増強する際に使用するため
の核酸を送達するために、遺伝子治療のために、および他の用途のために、ハプ
テンの提示において使用するための新たな型のビヒクルを提供する。このビヒク
ルは粒子であり、そしてこの粒子の構造は、アヒルＢ型肝炎ウイルスコア抗原（
アヒルＨＢｃＡｇ）に一部基づいている。出願人は、アヒルＨＢｃＡｇの組換え
形態をアセンブルすることにより形成される粒子が、高度に免疫原性であり、Ｔ
Ｈ１型免疫応答を誘発し、そしてこの粒子が、比較的穏和な、非変性条件下で脱
アセンブルされ得、そして再アセンブルされ得ることを発見した。この後者の発
見（公知の組換えＤＮＡ技術と合わせられる）は、単一粒子上で広範な種々の異
なるハプテンを運ぶ粒子を生成する予測を開拓する。さらに、可逆的な脱アセン
ブルプロセスは、免疫刺激し得る（免疫応答をさらに増強するために）か、また
はいくつかの他の目的のために（例えば、遺伝子治療のために）有用であり得る
核酸を含む粒子を生成する手段を提供する。

【００３０】 ネイティブなアヒルＨＢｃＡｇ粒子は、２４０の同一サブユニットモノマーか
ら構成され、そしてヒトＨＢｃＡｇの構造と非常に類似した３２〜３４ｎｍの粒
子である。しかし、出願人は、アヒルＨｂｃＡｇがウッドチャックまたはヒトの
ＨＢｃＡｇ抗体と交差反応しないことを見出した。このことは、以下の２つの理
由のために重要な発見である：第１に、抗ヒトＨｂｃＡｇ抗体が生成されないの
で、アヒルＨＢｃＡｇ粒子をハプテンキャリアとして使用することは、ヒトＨＢ
ｃＡｇを検出するための現在のプロトコルを妨げない。第２に、抗ヒトＨＢｃＡ
ｇを抗体を既に有する個体は、アヒルＨＢｃＡｇでなお免疫され得る。従って、
この発見は、粒子状ワクチンビヒクルの開発におけるかなりの進歩を示す。

【００３１】 本発明の好ましい実施形態において、本発明の粒子を作製するモノマーの主要
アミノ酸配列、およびこれらをコードする核酸配列は、アヒルＨＢｃＡｇから「
誘導され」る。アヒルＨＢｃＡｇモノマーは、２６２アミノ酸（図１に示される
配列番号１）からなり、アセンブリドメインは、残基１〜２００から構成され、
そしてアルギニンリッチ核酸が残基２０１〜２６２からなるドメインに結合する
。「から誘導される」により、本発明は、組換えモノマーの配列が、ネイティブ
なアヒルＨｂｃＡｇの配列と同一である組換えモノマーから、そしてまた、アヒ
ルＨＢｃＡｇのアミノ酸および／または核酸の配列の両方において変動性を有す
る組換えモノマーからも構成される粒子を含むことを意味する。例えば、代替的
なクローニング部位は、配列をベクターに移動し、ハプテンを挿入するための核
酸配列に遺伝子操作され得、そしてアミノ酸置換を行い得る、など。当業者に公
知の任意の遺伝子操作の可能性は、得られるモノマーが本発明の実施において機
能する能力をなお保持する限り、適用され得る。特に、図１に示されるアヒルＢ
型肝炎コアタンパク質は、図３に示されるような粒子にアセンブルされ得る。ア
ヒルＨＢｃＡｇに対応するタンパク質および核酸の配列は、本発明の実施を行う
ために、または本発明の実施を最適化するために、必要な場合は、欠失、挿入、
または置換により改変され得、そしてこのような改変の全ては、本発明の範囲内
にあることが意図される。アヒルＢ型肝炎コアタンパク質から誘導される改変タ
ンパク質は、配列番号１に挿入された１つ以上のハプテン（または図１７および
１９に示される短縮化バージョン、または他の短縮化バージョン）を含み得、そ
して図３に示される粒子にアセンブルされる能力を有する。このような遺伝的改
変を行う方法は、当業者に周知である。

【００３２】 本発明の好ましい実施形態において、モノマー配列は、ＢＣ−２０１Ｄとして
公知のアヒルＨＢｃＡｇの組換え形態から誘導され、そのアミノ酸配列は、図１
（配列番号１）に示される。ＢＣ−２０１Ｄをコードする核酸配列は、図２（配
列番号２）に示される。一文字コードとアミノ酸または核酸塩基との間の対応を
表１に示す。

【００３３】

【表１】 組換えアヒルＨＢｃＡｇ（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおい
て作製される場合）は、高分子コア粒子に自然に自己アセンブルする。本発明を
行う際に使用するための粒子を得ることに関して、適切な量の粒子を産生し、そ
してそれらを生成する手段は、当業者に周知である。例えば、Ｉｔｓｋｕｒａの
米国特許第４，３５６，２７０号およびＭｕｒｒａｙの同第４，５６３，４２３
号（これらは、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。

【００３４】 本発明の好ましい実施形態において、本発明の粒子は、Ｅ．ｃｏｌｉ組換え系
において産生される。しかし、この粒子は、種々の他の組換え発現系におけるモ
ノマーの発現により、産生され得る。例えば、酵母系、昆虫細胞系（例えば、バ
キュロウイルス発現ベクターを用いる）、植物細胞系（例えば、タバコ、ジャガ
イモ、トウモロコシなど）、トランスジェニック動物系または哺乳動物細胞培養
系である。本発明の粒子を正確に産生する任意の適切な発現系は、本発明の粒子
において使用され得る。組換えタンパク質の産生のためのこのような系およびそ
の使用は、当業者に周知である。

【００３５】 本発明の好ましい実施形態において、この粒子は、１以上の外来（すなわち、
非アヒル）ハプテンを含むように一般的に設計されているモノマーで構成される
。このハプテンは、ワクチン接種の際に、この粒子により宿主に輸送され、従っ
て、この宿主の免疫系に提示される。このような外来の非アヒルハプテンの例と
しては、二本鎖ＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルス、一本鎖のＤＮＡウイルス
またはＲＮＡウイルス、細胞内寄生虫、真菌、細菌および癌に付随するハプテン
を含むが、これらに限定されない。特に重要な例示的免疫原は、以下に由来する
：細菌（例えば、Ａ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｓ．ｐａｒａｔｈｙｐｈｏｉｄＡお
よびＳ．ｐａｒａｔｈｙｐｈｏｉｄＢ、Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃ．ｔｅ
ｔａｎｕｓ、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃ．ｐｅｒｉｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ａ．ａ
ｎｔｈｒａｃｉｓ、Ａ．ｐｅｓｔｉｓ、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａ、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒ
ｈｅａ、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｔ．ｐａｌｌａｄｉｕｍなど）、ウイルス
（ポリオウイルス、アデノウイルス、パラインフルエンザウイルス、麻疹、おた
ふくかぜ、ＲＳウイルス、インフルエンザウイルス、ウマの脳脊髄炎、豚コレラ
ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、家禽ポックスウイルス、狂犬病ウイルス
、ネコジステンパーウイルスおよびイヌジステンパーウイルス、口蹄疫ウイルス
、ヒトおよびサル免疫不全ウイルスなど）由来の免疫原；発疹チフスおよび発疹
熱および斑点熱属などのようなリケッチア免疫原。本発明の粒子のモノマーサブ
ユニットに挿入され得、そして免疫応答を誘発することが望ましい任意のハプテ
ンは、本発明を行う際に利用され得る。アヒルＨＢｃＡｇの配列が、知られてお
り、そして多くの適切なハプテンの配列は、ハプテン挿入に必要な組換えＤＮＡ
技術であるとして、当業者に公知である。

【００３６】 発現された粒子が所望のハプテンを含むことを確認するためのいくつかの方法
は、当業者に周知である。例えば、モノマーの配列は、アミノ酸配列決定のいく
つかの周知の方法のいずれかにより、決定され得る。

【００３７】 本発明の好ましい実施形態において、１つのハプテンの単一のコピー、１つの
ハプテンのいくつかのコピーまたはいくつかの異なるハプテンのコピーは、組換
えアヒルＨＢｃＡｇモノマーの単一の領域またはいくつかの領域に挿入され得る
。従って、本発明の粒子は、ハプテンの提示のための非常に凡用性のあるビヒク
ルであり、免疫原粒子の設計において広範な順応性を提供する。

【００３８】 本発明の好ましい実施形態において、ハプテンが挿入され得る領域は、粒子ア
センブリ上の、ハプテンに免疫応答を誘発する領域である。本発明の好ましい実
施形態において、ハプテンを含むアミノ酸は、これらが、組換えモノマーの、等
しい数のアミノ酸を置換するような様式で、挿入される。他の実施形態において
、より少ないかまたはより多いかあるいは全くない組換えモノマーアミノ酸が、
ハプテンにより置換され得る。一般的に、約１０〜３０のアミノ酸長のハプテン
は、組換えモノマーに有効に挿入され得る。しかし、より長いかまたはより短い
ハプテンがまた、挿入され得る。挿入されたハプテン（または１より多くのコピ
ーが挿入される場合のハプテン）は、アヒルＨＢｃＡｇタンパク質に対する配列
またはアヒルＨＢｃＡｇタンパク質由来である配列に対応する、アミノ末端隣接
配列およびカルボキシ末端隣接配列により、究極的に隣接され得る。さらに、ハ
プテンの１より多いコピーは、単一の部位または同じモノマー上の異なる部位に
挿入され得るか、あるいは異なるハプテンは、単一の部位で縦列に挿入され得る
か、あるいは異なるハプテンは、同じモノマーの異なる部位で挿入され得る。任
意の長さおよび組合せのハプテンは、産生されるモノマーが免疫応答を誘発する
粒子にアセンブルされ得る限り、挿入され得る。

【００３９】 ハプテンが挿入され得る領域の選択は、関連する肝炎コア抗原分子（例えば、
ヒトＨＢｃＡｇ）の公知の一次配列および３次元構造と比較してなされ得る。例
えば、Ｂｒｉｎｇａｓ（１９９７）およびＷｙｎｎｅら（１９９９）の、ヒト肝
炎ウイルスコアタンパク質構造の詳細な議論を参照のこと。当業者は、いくつか
の方法が、関連するタンパク質（例えば、ヒトＨＢｃＡｇおよびアヒルＨＢｃＡ
ｇ）の機能的ドメインの比較のアラインメントについて存在することを、認識す
る。

【００４０】 本発明の別の好ましい実施形態において、本発明の粒子は、非アヒルハプテン
を伴わないモノマーで構成される。これらの粒子は、核酸を含んでもよりし、ま
たは含まなくても良い。例えば、短縮形態のアヒルＨＢｃＡｇ（ｔ−アヒルＨＢ
ｃＡｇ）（核酸結合ドメインは、これから欠失されている）は、一般的な免疫刺
激性薬剤（例えば、アジュバント）として、それ自体で使用され得る。さらに、
非アヒルハプテンを有さないモノマーで構成される粒子は、核酸（組換え宿主由
来のランダム核酸またはこの粒子の再アセンブルの間添加される規定された核酸
のいずれか）を含み得、そしてこれらの核酸のための送達機構として役立ち得る
。規定された核酸は、遺伝子治療または遺伝子医療（例えば、アンチセンスＲＮ
Ａ，ＤＮＡ配列（これらは、治療剤などをコードする）などの送達）のために、
この粒子により送達され得る。

【００４１】 粒子が免疫応答を刺激するか否か決定するために、「刺激指標」を測定し得る
。この刺激指標は、免疫応答を行う、この粒子の能力の測定であり、そして免疫
パラメータ（例えば、抗体形成能力、リンパ球小集団の数、混合された白血球応
答、リンパ球増殖など）を測定することにより、種々の免疫細胞アッセイいおい
て試験され得る。免疫応答の刺激を、感染または腫瘍の増殖に対する抵抗性を決
定するアッセイにおいて測定し得る。刺激指標を測定する方法は、当業者に周知
である。例えば、１つのアッセイは、ネズミのＢ細胞培養における³Ｈウリジン
の組み込みである。この培養物を、３７℃にて１０μｇの粒子と２０時間接触さ
せ、次いで、³Ｈウリジンを用いてパルスし、４時間後、細胞を収集し、そして
ＲＮＡに組み込まれた³Ｈウリジンを、測定する。特定のサイトカインの分泌の
誘導はまた、刺激指標を評価するために使用され得る。理論により束縛されるこ
とを意味しないが、インビボでの使用のために（例えば、病原性薬剤に対して曝
露の危険性のもとで、被験体を処置するために）、この粒子が、単球細胞および
／またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の溶解の活性によって有効にサイトカイ
ン分泌を誘導し得ることが、重要である。１つの方法において、Ｂ細胞増殖に対
するこの粒子の刺激指標は、少なくとも約５であり、好ましくは、少なくとも約
１０であり、より好ましくは、約１５であり、最も好ましくは、少なくとも約２
０であるが一方で、個々の間の刺激指標に差異があることを認識する。

【００４２】 高レベルの変異性に起因して、本発明の粒子は、いくつかの型があり得る。第
１に、それらは、性質が「非モザイク性」または「モザイク性」のいずれかであ
り得る。「非モザイク性」に関しては、単一の型のハプテンを含む粒子を意味す
る。非モザイク性の粒子を作製するモノマーは、ハプテンの単一のコピーまたは
同じハプテンの２つ以上のコピーを有し得る。このハプテン（単数または複数）
は、このモノマーの単一の領域または１より大きい領域に、挿入され得る。

【００４３】 モザイク粒子は、２つ以上の異なるハプテンを含む粒子である。モザイク粒子
は、「内因性」または「外因性」のいずれかであり得る。内因性モザイク粒子は
、モノマーから構成される粒子であり、このモノマーにおいて、２つ以上の異な
るハプテンが、同じモノマー上に存在する。内因性モザイク粒子は、２つ以上の
異なるハプテンを単一のモノマーサブユニットの領域（単数または複数）中に遺
伝子操作することにより、産生され得る。

【００４４】 外因性モザイク粒子は、２つ以上の異なるハプテンを含む粒子であり、このハ
プテンにおいて、異なるハプテンが、異なるモノマー上に存在し、そしてこの粒
子は、このようなモノマーの混合物から形成される。このような外因性モザイク
粒子を産生するための１つの手段は、２つ以上の異なる非モザイク性粒子（また
は２つ以上の異なるモザイク性および非モザイク性の粒子）を産生し、それらを
モノマーに分解し、このモノマーを混合し、そしてそれらを粒子に再アセンブル
させることである。再アセンブルされた各粒子は、各型のモノマーの混合物で構
成され、従って、ハプテンの混合物を示す。

【００４５】 本発明の外因性モザイク粒子の開発は、組換えアヒルＨＢｃＡｇ粒子が、マイ
ルドな、非変性の条件下で可逆的に分解され得るという出願人の発見により、可
能にされた。この発見は、免疫系への提示のために、１粒子あたり１〜数百の異
なるハプテンを含有する広範な種々の外因性モザイク粒子の比較的容易な産生を
可能にする。このようにして、本発明の粒子は、単一の免疫性において、準種の
多血症に対して免疫するために使用され得る。これは、以前のハプテン輸送を超
える有意な改良である。

【００４６】 組換えアヒルＨＢｃＡｇ粒子が、マイルドな条件下で分解され得る理由は、こ
のモノマーが、単一のシステイン残基のみを有することであり、そして遊離のス
ルフヒドリル形態で存在することである。対照的に、ヒトＨＢｃＡｇモノマーは
、多数のジスルフィド結合により、粒子中で互いに接触され、この粒子を分解さ
せるために厳しい条件を必要とする。

【００４７】 本発明の粒子を分解およびアセンブルさせる能力は、本発明の別の局面を実行
するための方法を提供する。組換えアヒルＨＢＣＡｇモノマーは、核酸結合ドメ
イン（アルギニンが豊富なアミノ酸残基２０１〜２６２）を有する結果として、
核酸分子に結合するための内因性能力を有する。核酸結合ドメインの本来の機能
は、Ｂ型肝炎ウイルス粒子がそれらの独自の遺伝的物質に結合および「パッケー
ジ」することを可能にし、従って、感染の間、それを細胞から細胞へそして宿主
から宿主へ移送させることである。本発明の粒子は（例えばＥ．ｃｏｌｉ組換え
発現系から単離される場合）、細菌宿主由来のランダムな核酸の、短い、異質な
集団を、それらの中に有する。本発明の粒子は、分解され得、このモノマーは、
宿主核酸から分離され得、次いで、このモノマーは、選び抜きの異なる核酸分子
が存在すると、再アセンブルされ得る。選び抜きの核酸分子は、モノマーにより
結合され、そして再アセンブルされた粒子に「パッケージ」される。

【００４８】 本発明の粒子は、選び抜きの任意の核酸を収容するように、集合され得る。こ
のような核酸の例としては、一本鎖のＤＮＡおよび／またはＲＮＡならびに／あ
るいは二本鎖のＤＮＡおよび／またはＲＮＡ（あるいはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリ
ット）を含むが、これらに限定されない。この核酸は、例えば、治療的実体に転
写または翻訳されるかあるいは、それらの核酸の転写または翻訳を増強または予
防するための、身体中にすでに存在する他の核酸に結合するために、任意の治療
的目的のために送達され得る。本発明において使用するために、核酸は、当該分
野で周知の多くの手順のいずれかを用いて、新規に合成され得る。例えば、β−
シアノエチルホスホラミダイト方法（ＢｅｕａｃａｇｅおよびＣａｒｕｔｈｅｒ
ｓ、１９８１）；ヌクレオチドＨ−ホスホネート方法（Ｇａｒｅｇｇら、１９８
６；Ｆｒｏｅｌｄｅｒら、１９８６；Ｇａｒｅｇｇら、１９８６；およびＧａｆ
ｆｎｅｙら、１９８８）。これらの化学物質を、市販の種々のオリゴヌクレオチ
ド自動合成機により、実施し得る。あるいは、オリゴヌクレオチドを、公知の技
術（例えば、制限酵素、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼを使用す
る技術）を用いて、核酸配列（例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ）の存在か
ら調製し得る。

【００４９】 インビボでの使用のために、核酸は、好ましくは、分解（例えば、エンドヌク
レアーゼおよびエキソヌクレアーゼを介する）に対して抵抗性である。二次構造
（例えば、ステムループ）は、分解に対して核酸を安定化し得る。あるいは、核
酸の安定化を、リン酸エステルのバックボーンの改変を介して達成し得る。安定
化された好ましい核酸は、少なくとも部分的にホスホロチオネートで改変された
バックボーンを有する。ホスホロチオエートを、ホスホラミダイトまたはＨホス
ホネート化学物質のいずれかを使用する自動化技術を用いて合成し得る。アリー
ルホスホネートおよびアルキルホスホネートを、作製し得（例えば、米国特許第
４，４６９，８６３号に記載される）；そして、アルキルホスホトリエステル（
これにおける荷電した酸素部位は、米国特許第５，０２３，２４３号および欧州
特許第０９２，５７４号に記載されるようにアルキル化される）を、市販の試薬
を用いて自動固相合成により調製し得る。他のＤＮＡバックボーン改変体および
置換物を作製するための方法が、記載されている（ＵｈｌｍａｎｎおよびＰｅｙ
ｍａｎ，１９９０；Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，１９９０）。

【００５０】 核酸は、分子内のバックボーン内のホスホジエステラーゼ結合ではなく、ホス
ホチオエート末端結合またはホスホジチオエート末端結合、あるいはメチルホス
ホチオエート末端結合の使用を含み得る（Ｋｒｅｉｇら、１９９６；Ｂｏｇｇら
、１９９７）。リン酸エステルのバックボーンの改変は、核酸の５’末端（例え
ば、核酸の最初の２つのヌクレオチドの５’末端）で起こり得る。このリン酸エ
ステルバックボーンの改変は、核酸の３’末端（例えば、核酸の最初の２つのヌ
クレオチドの３’末端）で起こり得る。非古典的塩基（例えば、イノシンおよび
クエオシン）ならびにアデニン、シチジン、グアニン、チミジン、およびウリジ
ンのアセチル形態、チオ形態、および同様に改変された形態もまた、含まれ得、
これらは、内因性エンドヌクレアーゼによって容易に認識され得ない。他の安定
化された核酸分子は、非イオン性ＤＮＡアナログ（例えば、アルキルホスホネー
トおよびアリールホスホネート（これらにおける荷電した酸素部位は、アルキル
化される））を含む。いずれかの終端またはその両方で、ジオール（例えば、テ
トラヒレングリコール（ｔｅｔｒａｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）またはヘキサエ
チレングリコール）を含む核酸分子もまた、含む。用語「オリゴヌクレオチド」
は、一本鎖ＤＮＡの形態および二本鎖ＤＮＡの形態の両方を含む。

【００５１】 本発明の好ましい実施形態において、本発明の粒子が免疫刺激核酸を含むよう
に再アセンブルされる。このような免疫刺激核酸が、最近記載されている（Ｃａ
ｒｓｏｎおよびＲａｚ、１９９７；Ｄａｖｉｓら、１９９８；Ｋｒｅｉｇら、１
９９５；Ｌｉｐｆｏｒｄら、１９９７ａ；Ｌｉｐｆｏｒｄら、１９９７ｂ；Ｐｉ
ｓｅｔｓｋｙ、１９９６；Ｓｐａｒｗａｓｓｅｒら、１９９７；Ｓｐａｒｗａｓ
ｓｅｒら、１９９８；Ｓｔａｃｅｙら、１９９６；Ｓｕｎら、１９９８；および
Ｚｉｍｍｅｒｍａｎら、１９９８）。ＤＮＡは、細菌ＤＮＡが、直接的な腫瘍細
胞傷害性を伴わずに、インビボで移植可能な腫瘍の退行を引き起こすことが観察
された場合、免疫刺激物質として最初に記載された。ＤＮＡによって誘導される
この腫瘍耐性は、増殖したナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性から生じた。ＮＫ
活性は、種々の細菌供給源由来のＤＮＡによって刺激され得るが、哺乳動物ＤＮ
Ａによっては刺激され得ない。このことは、ＤＮＡ骨格ではなく、塩基改変およ
び／またはヌクレオチド配列が、ＮＫ刺激の重大なメディエータであることを示
す。ランダムに選択されたオリゴヌクレオチドの免疫刺激活性を評価する研究に
よって、定義されたモチーフ（ＲＡＣＧＴＹ、ここで、Ｒ＝ＡまたはＧ、および
Ｙ＝ＣまたはＴ）が、ＮＫ細胞の強力な誘導を引き起こすことが示された。哺乳
動物ＤＮＡに関して、この配列は過小表示され、そしてこの配列が哺乳動物ＤＮ
Ａにおいて見出される場合、改変によってマスクされる。実験によって、これら
の改変配列を有するオリゴヌクレオチドが、ＮＫ活性も他の免疫刺激活性も有さ
ないことが決定された。これらの核酸による免疫刺激機構は、いまだ未知である
。抗原提示細胞（ＡＰＣ）におけるサイトカインＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、ＩＬ
−６およびＩＬ−１の産生が刺激されることが公知である。初期の研究によって
、これらのサイトカインの個々のレベルは、定義された免疫刺激モチーフを取り
囲む配列の変化によって調節され得ることが示される。

【００５２】 ワクチンにおける免疫刺激核酸の使用は、以前に記載されている。例えば、Ｈ
ｕｔｃｈｅｒｓｏｎらの米国特許第５，７２３，３３５号およびＰＣＴ国際出願
公開ＷＯ ９８／４０１００（これらの両方は、本明細書中で参考として援用さ
れる）は、ワクチンに対する免疫応答を高めるための免疫強化核酸の使用を記載
する。しかし、この送達機構は、他のワクチン成分とともに核酸を単に注射する
ことであり、これは有効な様式で十分な量の核酸を送達しないかもしれない方法
である。

【００５３】 細菌ＤＮＡは、バルク相のエンドサイトーシスまたはプロトサイトーシス（ｐ
ｒｏｔｏｃｙｔｏｓｉｓ）によって免疫細胞に侵入するようであり、ここで、次
いで、抗原提示細胞によってプロセスされる。抗原提示細胞は、バルク相のエン
ドサイトーシスまたはレセプター媒介性エンドサイトーシスのいずれかによって
、本発明の粒子をプロセスするようである。粒子の内因性部分として免疫刺激核
酸を含むことによって、免疫刺激核酸は、濃縮形態で宿主に輸送され、そして抗
原提示細胞によって直接的にプロセスされ、アジュバントとしての免疫刺激核酸
の効果を最大にする。

【００５４】 本発明の好ましい実施形態において、免疫刺激核酸は、どちらかの側で２０ま
でのヌクレオチドによって取り囲まれる、塩基配列５’−ＲＡＣＧＴＹ−３’（
配列番号２０）を有するオリゴヌクレオチドによって特徴付けられる。好ましく
は、この免疫刺激オリゴヌクレオチドは、約８〜３０の塩基サイズの範囲である
。本発明における使用について、核酸は、上記で列挙されたような種々の改変塩
基から構成され得、そして上記で列挙されたように、当該分野で周知の多くの手
順のいずれかを使用して、新たに合成され得る。例えば、「Ｉｍｍｕｎｅ ｓｔ
ｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｏｌｉｇｏｎ
ｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎａｌｏｇｓ」と題する国際特許出願ＷＯ ９５／２６
２０４は、ホスホロチオエート改変オリゴヌクレオチドの非配列特異的免疫刺激
効果を報告する。あるいは、ＣｐＧジヌクレオチドは、プラスミドにおいてラー
ジスケールで産生され得（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）、このジヌクレオチ
ドは、被験体に投与された後に、オリゴヌクレオチドに分解される。オリゴヌク
レオチドは、公知技術（例えば、制限酵素、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌ
クレアーゼを使用する技術）を使用して、現存する核酸配列（例えば、ゲノムＤ
ＮＡまたはｃＤＮＡ）から調製され得る。

【００５５】 免疫刺激核酸は、サイトカイン産生（例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＦＮ
−γ、ＴＮＦ−αおよびＧＭ−ＣＳＦ）を刺激し得る。例示的な配列としては、
以下が挙げられるが、これらに限定されない：

【００５６】

【化１】 免疫刺激核酸は、被験体においてナチュラルキラー細胞（ＮＫ）溶解活性を刺
激し得る。このような配列の特定の例ではあるが、限定しない例としては、以下
が挙げられる：

【００５７】

【化２】 免疫刺激核酸は、Ｂ細胞増殖を刺激し得る。このような配列の特定の例ではあ
るが、限定しない例としては、以下が挙げられる：

【００５８】

【化３】 任意の適切な免疫刺激核酸が、本発明の実施において使用され得る。

【００５９】 本発明は、比較的穏やかな、生理学的条件下における、本発明の粒子の分解お
よび再アセンブルのための方法を提供する。一般的には、この方法は、１）複数
のヌクレオキャプシドタンパク質モノマー、アヒルＢ型肝炎ウイルス由来である
一次アミノ酸配列から構成される粒子を提供する工程であって、ここで、この複
数のモノマーがアセンブルし、粒子を形成する工程；２）粒子を荷電性薬剤に曝
露する工程；および３）荷電性薬剤を取り除く工程、を包含する。荷電性薬剤の
除去に際して、このモノマーは、自発的に粒子に再アセンブルする。本方法の好
ましい実施形態は、以下の通りである：粒子は、単純な４工程方法によって、組
換え発現系から単離され得る。例えば、細胞は、遠心分離によってペレット化さ
れ、そしてフレンチプレスによって溶解される。硫酸アンモニウムを、１Ｌ当た
り２７７ｇまで添加する。沈殿物質は、遠心分離によって収集され、そしてリン
酸緩衝液中で再懸濁され、そしてリン酸緩衝液に対して一晩透析される。得られ
た透析液を、ヒドロキシアパタイトカラムにかけて、そして２８０ｎｍでの光学
濃度が０．１未満になるまで、リン酸緩衝液で洗浄し、１Ｌ当たり２７７ｇの硫
酸アンモニウムを、プールされた画分に添加し、そして沈殿を、遠心分離によっ
て収集する。得られたペレットを、最少緩衝液中で再懸濁し、そしてＳｅｐｈａ
ｒｏｓｅ−ＣＬ４Ｂサイズ排除クロマトグラフィーカラムにかける。この粒子を
表すピーク画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定し、そしてプールする。この
粒子を、中性緩衝液（例えば、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ，ｐＨ７．０）およ
び高濃度（０．１〜１Ｍ）の二価の陽イオン（例えば、Ｍｇ⁺²、Ｚｎ⁺²、Ｂａ⁺² 、Ｃａ⁺²、Ｐｂ⁺²およびＳｒ⁺²）中で再懸濁する。この粒子は、約１時間でモノ
マーに解離され（穏やかに混合しながら）、そして解離の進行が、Ｆａｓｔ Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＦＰＬＣ）Ｓｅ
ｐｈａｒｏｓｅ−ＣＬ４Ｂサイズ排除カラムクロマトグラフィーまたはネイティ
ブアガロースゲル電気泳動によってモニターされ得る。リボヌクレアーゼＡを添
加し、本来単離されたときに粒子の内部に含まれた核酸（例えば、組換え宿主核
酸）が取り除かれ得る。再アセンブルは、以下の様式において果たされる：核酸
結合ドメインが欠失しているアヒルＨＢｃＡｇの短縮化形態（ｔ−ｄｕｃｋ Ｈ
ＢｃＡｇ）について、再アセンブルおよび粒子形成は、１００〜２００ｍＭ Ｎ
ａＣｌを加えた適切な緩衝液に対する単純な透析に際して生じる。アヒルＨＢｃ
Ａｇの非短縮化形態は、核酸の存在下でのみ再アセンブルする。従って、このモ
ノマーは、選り抜きの核酸と混合され得、適切な緩衝液に対して透析され、核酸
を含む透析再アセンブリ粒子が形成される。本発明の好ましい実施形態において
、核酸対モノマーのモル比は、約１：１である。再アセンブリ粒子に組み込まれ
なかった外因性ＤＮＡは、サイズ排除カラムクロマトグラフィーによって取り除
かれ得る。当業者は、本発明の方法の実施において、多くの重要ではない改変が
、本方法の結果を顕著に変更せずに行われ得ることを理解する。例えば、手順は
、産生の目的のために、「スケールアップ」または「スケールダウン」され得る
。さらに、いくつかの改変（例えば、イオン強度、ｐＨ、核酸対モノマーの正確
な比などにおける改変）は、特定のモノマーの型についての手順を最適化するた
めに有益であり得る。すべてのこのような改変および最適化は、本発明の方法の
範囲に含まれる。

【００６０】 解離／再アセンブルプロセスを、図３に例示する。この図では、粒子１０は、
例えば、百日咳に特異的なハプテンを含むアヒルＨＢｃＡｇモノマー１１から構
成され、そして粒子２０は、例えば、ポリオ特異的ハプテンを含むアヒルＨＢｃ
Ａｇモノマー２１から構成される。粒子１０および２０は、荷電性薬剤（例えば
、二価の陽イオン）に曝露され、曝露粒子１０および２０は、モノマー１１およ
び２１に解離される。粒子の内部に含まれた不要な核酸は、例えば、ヌクレアー
ゼの添加によって取り除かれ得る。ヌクレアーゼの除去後、特定の核酸３０が、
モノマー１１および２１の混合物に添加され得る。荷電性薬剤の除去に際して、
モノマー１１および２１が再アセンブルし、外因性のモザイク粒子４０を形成し
、このモザイク粒子は、核酸３０を含む。

【００６１】 本発明の別の局面において、外来の非アヒルハプテンは、遺伝子操作されてモ
ノマー配列に接着するのではなく、粒子に接着し得る。個々のポリペプチドハプ
テン（例えば、ポリペプチド、糖質など）アミノ酸残基側鎖を通じて粒子に操作
的に連結され、免疫原性結合体（すなわち、分枝鎖ポリペプチドおよび／または
ポリペプチド／糖質ポリマー）を形成し得る。このような粒子は、上記のような
アヒルＨＢｃＡｇ「由来」であるとみなされ、そして本発明の実施内での使用が
意図される。

【００６２】 本発明は、宿主中の免疫応答の誘発における使用のための粒子を提供する。本
発明の好ましい実施形態において、この粒子は、古典的意味（すなわち、予防的
に、疾患を引き起こす存在物への曝露の前に、宿主の免疫系を特発するために）
でのワクチンとして用いられ得る。本発明のさらに別の好ましい実施形態におい
て、本発明の粒子は、治療的に（すなわち、すでに被験体に感染した病原体に対
する被験体の免疫応答をブーストするために）、例えば、ＨＩＶ感染の場合に用
いられ得る。

【００６３】 本発明はまた、本発明の粒子を含む免疫応答の誘発における使用のための組成
物を提供する。ワクチンとしての使用のためのこのような組成物の調製は、当業
者に周知である。代表的には、このような組成物は、液体溶液または懸濁液のい
ずれかとして調製されるが、固体形態（例えば、錠剤、丸剤、散剤など）もまた
意図される。投与の前に、液体中の溶液または液体中の懸濁液に適切な固体形態
もまた、調製され得る。この調製物はまた、乳化され得る。活性成分は、薬学的
に受容可能であり、そして活性成分と適合性である賦形剤と混合され得る。適切
な賦形剤としては、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、
エタノールなど、またはその組み合わせが挙げられる。さらに、この組成物は、
少量の補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝化剤など）を含み得る
。さらに、この組成物は、他のアジュバントを含み得る。この組成物の経口形態
の投与が所望される場合、種々のシックナー、調味料、希釈剤、乳化剤、分散剤
（ｄｉｓｐｅｒｓｉｎｇ ａｉｄｓ）または結合剤などが、添加され得る。本発
明の組成物は、組成物を投与に適した形態で提供するために、任意のこのような
さらなる成分を含み得る。処方物における活性成分の最終的な量は、変化し得る
。しかし、一般的に、処方物における活性成分（粒子）の量は、１〜９９％であ
る。

【００６４】 本発明はまた、被験体において免疫応答を誘発するための方法を提供し、この
方法は、この被験体に、本発明の粒子を含む組成物の有効量を投与する工程を包
含する。有効量とは、本発明者らは、被験体の症状を予防するか、治療するか、
または少なくとも部分的に阻止するために必要な本発明の組成物の量を意味する
。被験体は、任意の脊椎動物（例えば、任意の哺乳動物種（例えば、ヒト）また
はトリ種）であり得る。投与されるべき化合物の正確な量は、被験体によって変
化し、そして、例えば、体重、性、年齢、全体的な身体状態などに依存し得る。
このような変異性は、当業者に十分に理解され、そして当業者によって最良に評
価される。

【００６５】 本発明の組成物は、当業者に周知である種々のいずれかの方法において投与さ
れ得、そして以下を含むが、これらに限定されない：非経口（例えば、皮下ある
いは皮内注射または筋肉内注射によって）、経口、オプタルミカリー（ｏｐｔｈ
ａｌｍｉｃａｌｌｙ）、膣、直腸、鼻腔内、経皮など。投与の任意の適切な方法
が、組成物が有効な様式で送達される限りは、本発明の実施において使用され得
る。

【００６６】 以下の実施例は、本発明のいくつかの局面を例示するために与えられ、そして
本発明の出願を限定するように、どんな方法においても解釈されるべきではない
。

【００６７】 （実施例） （材料） （アヒルＨＢｃＡｇ粒子） アヒルＨＢｃＡｇ粒子を、Ｅ．ｃｏｌｉ組換え発現系から得た。アヒルＨＢｃ
Ａｇ粒子は、図１（配列番号１）において示されるアミノ酸配列を有し、そして
宿主由来核酸の不均質集合を含み得る。アヒルＨＢｃＡｇ（１−２３９）粒子は
、図１７（配列番号２１）において示されるアミノ酸配列および図１８（配列番
号２２）において示される核酸配列を有する。ｔ−アヒルＨＢｃＡｇ粒子は、図
１９（配列番号２３）において示されるアミノ酸配列および図２０（配列番号２
４）において示される核酸配列を有する。ｔ−アヒルＨＢｃＡｇ（「短縮」アヒ
ルＨＢｃＡｇ）粒子は、核酸結合ドメインが遺伝的操作により欠失されたモノマ
ーサブユニットから構成される。

【００６８】 （方法） （特定のＲＮＡの定量） Ｊ７７４Ａ．１マクロファージ細胞により産生される特定のＲＮＡを、異なる
型の刺激：１）核酸を含むアヒルＨＢｃＡｇ粒子または２）核酸を含まないｔ−
アヒルＨＢｃＡｇ粒子）への曝露後、定量した。細胞を、１０μｇのアヒルＨＢ
ｃＡｇ粒子またはｔ−アヒルＨＢｃＡｇ粒子のいずれかを用いて処理し、そして
総ＲＮＡを、種々の時点の複製サンプルから単離した。総ＲＮＡを、ランダムな
ヘキサマーを用いて逆転写し、次いで遺伝子特異的プライマーを用いて線状領域
でＰＣＲを実施した。ＰＣＲ産物を、ゲル電気泳動によって分析し、そしてデン
シトメトリーにより定量した。使用前に、組換えタンパク質を、Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１１４を用いて３回処理し、リポ多糖類夾雑物を除去した。

【００６９】 （ＩＬ−１２の定量） 捕捉−ＥＬＩＳＡを使用して、Ｒ＆Ｄ ＥＬＩＳＡキットを用いて細胞培養培
地および細胞抽出物中のＩＬ−１２ ｐ７０タンパク質を測定した。ＩＬ−１２
の生物学的活性形態は、ｐ３５サブユニットおよびｐ４０サブユニットからなる
ヘテロ二量体ジスルフィド結合糖タンパク質である。ＩＬ−１２を、マクロファ
ージ、樹状細胞、およびＢ細胞を含む活性化された抗原提示細胞により産生する
。活性化後、ｐ４０発現を誘導し、そして翻訳させる。生じたｐ４０タンパク質
は、構成的に発現されるｐ３０サブユニットに結合し、そして分泌されて種々の
生物学的機能を実施する。捕捉ＥＬＩＳＡを使用して、増加する量のアヒルＨＢ
ｃＡｇを用いた処理後、樹状細胞により分泌されそしてＪ７７４Ａ．１マクロフ
ァージにおいて分泌され、そして細胞内に位置するＩＬ−１２の濃度を測定した
。ＩＬ−１２ ｐ７０を捕捉するための抗体を用いてコートされたマイクロプレ
ート（８ウェル×１２列／プレート）を、アヒルＨＢｃＡｇへの１８時間の曝露
後、清澄化した細胞培養培地または細胞抽出物と共にインキュベートした。この
混合物を、２時間インキュベートさせた。インキュベーション後、ウェルを洗浄
緩衝液を用いて５回洗浄した。洗浄後、この捕捉抗体以外の別個の結合モチーフ
に結合する西洋ワサビペルオキシダーゼに結合体化された抗ｐ７０抗体を含む緩
衝液を、添加し、そして２時間室温にてインキュベートする。インキュベーショ
ン後、ウェルを、再度５回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼと反応する比
色基質を、３０分間、室温にて、暗所で添加する。３０分後、酸性溶液を添加し
、反応を停止する。次いで、各サンプルの吸光度を４５０ｎｍにて測定し、そし
て５４０ｎｍにて補正した。結果を、同じ時間の同じ条件下で実施された標準反
応と比較し、そして単位ｐｇ／ｍｌにて得た。

【００７０】 （フローサイトメトリー） 細胞マーカー（ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、Ｌｙ−６Ａ／ＥおよびＢ７−２）を、以
下の様式において、フローサイトメトリーによってモニターした： 細胞培養：Ｊ７７４Ａ．１細胞を、実験の１日前に１ウェルあたり５００，００
０細胞に分けた。実験の日に、無ＬＰＳアヒルＨＢｃＡｇを、適切な濃度まで細
胞培養培地に直接添加し、そして１８時間、その細胞と共にインキュベートさせ
た。１８時間で、細胞を、ピペッティングにより取り除き、５００ｘｇにて１０
分間遠心分離し、次いでリン酸緩衝化生理食塩水中で３回洗浄した。次いで、Ｆ
ｃレセプターをブロックするために、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む
リン酸緩衝化生理食塩水中で、細胞を１０μｇ／ｍｌのマウスＩｇＧと共にイン
キュベートした。マウスＢ７．２（ＣＤ８６）、Ｈ−２ｋ^b（ＭＨＣ−Ｉ）、Ｉ
−Ａ^b（ＭＨＣ−ＩＩ）に対する一次抗体を結合体化したフルオロセインイソシ
アネート（ＦＩＴＣ）；Ｌｙ６Ａ／ＥおよびＬｙ６／Ｃに対する一次抗体を結合
体化したフルオロセインイソシアネート（ＦＩＴＣ）をそれぞれ添加して、そし
て４℃にて３０分インキュベートした。フルオレセインアイソタイプが一致する
非特異的抗体を、ネガティブコントロールとして使用した。少なくとも１０⁵個
の細胞を、データ分析のために収集した。細胞を、遠心分離によってペレット状
にし、そして非結合抗体を、１％ ＢＳＡを含むＰＢＳを用いた三回の洗浄で洗
い去った。次いで、細胞をＦＡＣＳ緩衝液中で再懸濁し、そして細胞表面マーカ
ーを、Ｂｅｃｋ−Ｄｉｃｋｓｏｎ ＦＡＣｓｃａｎｎｅｒにより定量した。マウ
スＣＤ８−ＲＰＥに対する抗体およびＣＤ４−ＲＰＥ（Ｒ−フィコエリトリン）
に対する抗体もまた含むことを除き同様の方法を脾臓細胞に対して使用した。

【００７１】 （合計およびアイソタイプ両方の、Ｉｇ力価の定量） マウスを、アジュバントなしで無リポ多糖類アヒルＨＢｃＡｇ粒子（０μｇ、
１μｇまたは１０μｇ）を用いて免疫した。１０日目、２４日目、次いで二次免
疫後二次免疫後１４日目に、血液を採取し、そしてアヒルＨＢｃＡｇ抗体につい
て試験した。およそ１００μｌの血液を、眼窩後（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌ
）穿刺により採取した。この採血後、サンプルを凝固させた。血餅を、遠心分離
によって除去した。そして生じた血清は、ＩｇＧ画分を含んだ。血清サンプルを
、１０（１）〜１０（６）まで連続希釈した。

【００７２】 アヒルＨＢｃＡｇタンパク質（粒子状形態）を用いてコートされたＥＬＩＳＡ
プレートを、市販のＥＬＩＳＡプレートを室温にて一晩、重炭酸緩衝液中のアヒ
ルＨＢｃＡｇタンパク質と共にインキュベートすることによって調製した。プレ
ートを、洗浄緩衝液を用いて５回洗浄し、次いでウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
を用いて、２時間室温にて非特異的結合をブロックした。プレートを、洗浄緩衝
液を用いて５回洗浄し、そして使用前に４℃にて保存した。

【００７３】 １００μｌの希釈血清サンプルを、予めコートされたプレートを用いて、２時
間、室温にてインキュベートした。インキュベーション後、ウェルを、洗浄緩衝
液を用いて５回洗浄した。洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合体化され
たラット抗マウスＩｇＧ抗体を含む緩衝液を添加し、そして２時間室温にてイン
キュベートする。インキュベーション後、再度５回洗浄する。西洋ワサビペルオ
キシダーゼと反応する比色基質を、３０分間、室温にて、暗所において添加する
。３０分後、酸性停止液を添加し、そしてこの反応を停止する。次いで、各サン
プルの４５０ｎｍの吸光度を４５０ｎｍにて測定し、そして５４０ｎｍにて補正
する。結果を、同じ条件下で同じ時間に実施された標準反応と比較し、そして相
対力価の単位にて得る。

【００７４】 アイソタイプ特異的アッセイについて、抗体アイソタイプに特異的なラット抗
マウス抗体を、一般的なラット抗マウス抗体の代わりに使用した。他の条件全て
は、同じままにした。

【００７５】 （アヒルＨＢｃＡｇ、アヒルＨＢｃＡｇ（１−２３９）およびｔ−アヒルＨＢ
ｃＡｇを脱アセンブルおよび再アセンブルさせるための方法） アヒルＨＢｃＡｇ粒子、アヒルＨＢｃＡｇ（１−２３９）粒子およびｔ−アヒ
ルＨＢｃＡｇ粒子を、モノマー形態と粒子状形態との間で可逆的にアセンブルし
得ることが発見された。このプロセスは、中性緩衝液（例えば、Ｔｒｉｓ ＨＣ
ｌ ｐＨ７．０）および高濃度（例えば、０．１−１Ｍ）の２価のカチオン（例
えば、Ｍｇ⁺²、Ｚｎ⁺²、Ｂａ⁺²、Ｃａ⁺²、Ｐｂ⁺²およびＳｒ⁺²）における非変性
条件下で行われ得る。組換え発現系から単離されるような粒子を、およそ１時間
（穏やかな混合により）モノマーに解離することが可能であり、そして解離の進
行は、ＦＰＬＣ（Ｐｈａｒｍａｉｃａ）Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ−ＣＬ４Ｂサイズ排
除カラムクロマトグラフィーによってか、またはネイティブなアガロースゲル電
気泳動によりモニターする。リボヌクレアーゼＡ（例えば、７．５μｇ／ｍＬ）
を添加し、粒子中に含まれた組換え宿主核酸を除去する。なぜなら、単離された
再アセンブリを、以下の様式においてもたらすからである：非核酸結合ｔ−アヒ
ルＨＢｃＡｇモノマーを、１００〜２００ｍＭ ＮａＣｌを含む中性緩衝液中で
、単純な透析により再アセンブルし得る。アヒルＨＢｃＡｇモノマーおよびアヒ
ルＨＢｃＡｇ（１−２３９）モノマーは、適切な再アセンブリについての核酸の
存在に依存的である。これらモノマーを、より抜きの核酸と混合し、そして中性
緩衝液に対して透析する。この透析の際に、その核酸を含む再アセンブルした粒
子が形成される。好ましい、モノマー対オリゴヌクレオチドのモル比は、１：１
である。再アセンブルした粒子に組み込まれない外因性ＤＮＡは、サイズ排除カ
ラムクロマトグラフィーにより除去され得る。

【００７６】 （実施例１．インビトロでのサイトカインの誘導） もしある場合、どのサイトカインが組換えアヒルＨＢｃＡｇおよびｔ−アヒル
ＨＢｃＡｇへのＪ７７４Ａ．１マクロファージ細胞の曝露により誘導されるかを
決定するために、方法において記載されるような実験を行った。結果を、図４に
おいて与える。理解され得るように、ＴＨ１型サイトカインＩＬ−１α、ＩＬ−
６およびＩＬ−１２の増加された転写を、アヒルＨＢｃＡｇおよびｔ−アヒルＨ
ＢｃＡｇの両方により誘導した。このことは、コアタンパク質が、ＴＨ１サイト
カインプロフィールの誘導を担うことを示した。

【００７７】 （実施例２．ＩＬ−１２ ｐ７０タンパク質産生の誘導） Ｊ７７４Ａ．１マクロファージ細胞へのアヒルＨＢｃＡｇおよびｔ−アヒルＨ
ＢｃＡｇの添加、ならびにマウス骨髄生成樹状細胞へのアヒルＨＢｃＡｇの添加
が、ＩＬ−１２ ｐ７０タンパク質の産生を誘導したかどうかを決定するために
、実験をインビトロで行った。細胞培養培地および細胞抽出物におけるＩＬ−１
２ ｐ７０の量の分析を、方法において記載されるように行い、そして結果を図
５Ａ、５Ｂおよび図６において与える。理解され得るように、７２時間のアヒル
ＨＢｃＡｇおよびｔ−アヒルＨＢｃＡｇへの曝露は、培養培地（図５Ａ）中およ
びＪ７７４Ａ．１マクロファージ細胞の細胞自体（図５Ｂ）中において、ＩＬ−
１２の濃度を増加した。２４時間の、アヒルＨＢｃＡｇへのＢＡＬＢ／Ｃマウス
およびＢ１０マウス両方由来のマウス骨髄生成樹状細胞の曝露は、培養培地にお
けるＩＬ−１２の増加を生じた（図６）。この応答は、ＴＨ１型免疫応答の誘導
と一致する。

【００７８】 （実施例３．Ｊ７７４Ａ．１マクロファージ細胞上の細胞マーカーの分析） Ｊ７７４Ａ．１マクロファージ細胞へのアヒルＨＢｃＡｇおよびｔ−アヒルＨ
ＢｃＡｇの添加が、細胞マーカー（ＭＨＣ−Ｉ、ＭＨＣ−ＩＩ、Ｌｙ−６Ａ／Ｅ
およびＢ７−２）の存在を誘導し得るかどうかを決定するため、実験を、インビ
トロで行った。これらの細胞表面マーカーは、ＴＨ１型免疫応答に直接関係する
。細胞マーカーの存在を、方法において記載されるようにフローサイトメトリー
によって決定した。この結果を、図６において与える。理解され得るように、こ
のデータは、細胞表面抗原の各型が、アヒルＨＢｃＡｇを用いる１８時間の処理
後、アップレギュレートされたことを示した。このことは、マクロファージが、
アヒルＨＢｃＡｇおよびｔ−アヒルＨＢｃＡｇにより刺激され得ることを示した
。

【００７９】 （実施例４．アヒルＨＢｃＡｇの免疫原性） アヒルＨＢｃＡｇの免疫原性を、以下の様式において、アヒルＨＢｃＡｇにつ
いての総ＩｇＧ力価を決定することにより、試験した：２つの系統のマウス（Ｂ
１０およびＢＡＬＢ／Ｃ）を、方法において記載されるように免役した。その結
果を、図７において与える。理解され得るように、Ｂ１０（図７Ａ）マウスおよ
びＢＡＬＢ／Ｃマウス（図７Ｂ）の両方が、１０⁵より大きい抗体力価を生成し
た。このことは、アヒルＨＢｃＡｇは、非常に免疫原性であることを示した。さ
らに、図８において示されるＩｇＧ画分のアイソタイプは、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ
２ｂおよびＩｇＧ３の産生を介してＴＨ１の偏向を示す。たとえ、それらの遺伝
的背景がＴＨ２免疫応答に通常には片寄るとしても、ＢＡＬＢ／ＣマウスがＴＨ
１の偏向を示した事実は、特に重要である。

【００８０】 （実施例５．脾臓細胞における細胞マーカーの分析） 死に至る採血の後、脾臓細胞を、Ｂ１０マウスから得て、そして１μｇのアヒ
ルＨＢｃＡｇと共に、２４時間培養した。フローサイトメトリー（方法において
記載されるように）を使用して、細胞マーカー（ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、Ｌｙ−６
Ａ／ＥおよびＢ７−２）をモニターした。この結果を、図９において示す。理解
され得るように、１μｇ免疫マウスおよび１０μｇ免疫マウスの両方は、非免疫
マウス由来のコントロール細胞より、これらの細胞マーカーの存在の実質的な増
加を有した。このことは、強いＴ細胞応答を示した。

【００８１】 （実施例６．ヒトおよびウッドチャックＨＢｃＡｇとのアヒルＨＢｃＡｇの交
差反応性の欠如の証明） アヒル、ウッドチャックおよびヒトのＨＢｃＡｇの交差反応性を比較するため
に、方法において記載されるような実験を行った。図１１Ａにおいて理解され得
るように、ウッドチャック抗体は、ヒトＨＢｃＡｇとの広範囲の交差反応性を示
し、そしてアヒルＨＢｃＡｇとの交差反応性は示さない。同様に、ヒトＨＢｃＡ
ｇ抗体は、ウッドチャックＨＢｃＡｇと広範な交差反応性を示し、そしてアヒル
ＨＢｃＡｇとの公差反応性を示さない（図１１Ａ）。

【００８２】 （実施例７．アヒルＨＢｃＡｇ粒子の脱アセンブリおよび再アセンブリ） アヒルＨＢｃＡｇ粒子を、首尾よく脱アセンブルし得、そして再アセンブルし
得ることを示すために、実験を行った。アヒルＨＢｃＡｇ（１ｍｇ／ｍＬ）を、
３７℃にて、０．３Ｍ ＭｇＣｌ₂、７．４μｇ／ｍＬ Ｒｎａｓｅ Ａ、また
はその両方と共にインキュベートした。３０分後、各サンプルをトリス緩衝化生
理食塩水（ＴＢＳ）に対して４時間透析し、そしてネイティブなアガロース電気
泳動によって分析した。マグネシウムを用いた処理および後の透析は、アヒルＨ
ＢｃＡｇ標準物（図１２、レーン１）と共に同時移動した粒子（図１２、レーン
２）への、処理タンパク質の再アセンブルを生じた。Ｒｎａｓｅ Ａ単独を用い
た処理は、アヒルＨＢｃＡｇ（図１２、レーン４）の電気泳動移動度を変更せず
、このことは、Ｒｎａｓｅ Ａ単独では、アヒルＨＢｃＡｇ粒子に対して明らか
な効果を有さないことを示唆した。しかし、Ｒｎａｓｅ ＡおよびＭｇＣｌ₂の
両方を用いた処理は、アヒルＨＢｃＡｇ標準物（図１２、レーン３）と共に同時
移動するバンドの量的な除去を生じる。これは、二価カチオンの存在下で、Ｒｎ
ａｓｅ Ａが、その粒子におけるリボ核酸の加水分解を触媒し得（すなわち、粒
子は、脱アセンブルする）、そしてその核酸を、分離したアヒルＨＢｃＡｇの再
アセンブリのために必要とすることを示唆する。Ｒｎａｓｅ Ａ／ＭｇＣｌ₂処
理アヒルＨＢｃＡｇを透析工程の間に内因性ＤＮＡおよびｔＲＮＡで補う、類似
の実験を行った。再アセンブルした粒子を、これらの方法により検出しなかった
。

【００８３】 （実施例８．アヒルＨＢｃＡｇ（１−２３９）粒子の脱アセンブリおよび再ア
センブリ） アヒルＨＢｃＡｇ（１−２３９）を、実施例７に記載されるのと同じ方法によ
り分析した。同一の結果を得た。そしてこれを、図１３において与える。マグネ
シウムを用いた処理および後の透析は、アヒルＨＢｃＡｇ（１−２３９）標準物
（図１３、レーン１）と共に同時移動した（図１３、レーン２）粒子への、処理
されたタンパク質の再アセンブルを生じる。Ｒｎａｓｅ Ａのみを用いた処理は
、アヒルＨＢｃＡｇ（１−２３９）（図１３、レーン４）の電気泳動移動度を変
更せず、このことは、Ｒｎａｓｅ Ａ単独は、アヒルＨＢｃＡｇ（１−２３９）
粒子に対して明らかな効果を有さないことを示唆した。しかし、Ｒｎａｓｅ Ａ
およびＭｇＣｌ₂両方を用いた処理は、アヒルＨＢｃＡｇ（１−２３９）標準物
（図１３、レーン３）と同時移動するバンドの量的な除去を生じる。これは、二
価カチオンの存在下で、Ｒｎａｓｅ Ａが粒子におけるリボ核酸の加水分解を触
媒し得（すなわち、粒子を、脱アセンブルする）、そしてその核酸が再アセンブ
ルに必要であることを示唆する。

【００８４】 しかし、全長アヒルＨＢｃＡｇを用いて得られる結果と対照的に、Ｒｎａｓｅ
Ａ／ＭｇＣｌ₂処理アヒルＨＢｃＡｇ（１−２３９）への内因性ＤＮＡの添加
は、核酸含有コア構造への分離されたモノマーの再アセンブルを支持する。これ
を、図１４および図１５において例示する。図１４、レーン１は、Ｒｎａｓｅ
ＡおよびＭｇＣｌ₂両方を用いて処理しそしてＴＢＳに対して透析した、アヒル
ＨＢｃＡｇ（１−２３９）を示す。図１４、レーン２は、Ｒｎａｓｅ Ａおよび
ＭｇＣｌ₂の両方を用いて処理しそしてＴＢＳに対して透析し、そして外因性オ
リゴヌクレオチドを透析前に添加した、アヒルＨＢｃＡｇ（１−２３９）を示す
。理解され得るように、コントロールアヒルＨｂｃＡｇ（１−２３９）（レーン
３）の位置に、移動するバンドが観察され得、このことは、外因性オリゴヌクレ
オチドの存在下における粒子の再アセンブルを示す。これらの結果を、さらに図
１５において例示す。図１５のレーン１は、コントロールアヒルＨｂｃＡｇ（１
−２３９）を示す。図１５のレーン２は、Ｒｎａｓｅ ＡおよびＭｇＣｌ₂の両
方を用いて処理し、そしてＴＢＳに対して透析し、そして外因性オリゴヌクレオ
チドを透析前に添加した、アヒルＨｂｃＡｇ（１−２３９）を示す。理解され得
るように、コントロールアヒルＨｂｃＡｇ（１−２３９）（レーン１）の位置に
、移動するバンドが観察され得、このことは、外因性オリゴヌクレオチドの存在
下での粒子の再アセンブルを示す。

【００８５】 （実施例９） 外因性核酸を用いたアヒルＨＢｃＡｇ（１−２３９）の再アセンブルを、Ｓｅ
ｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂにおけるクロマトグラフィーにより確認した。この結果を
、図１６において示し、ここで１６Ａのピーク２は、アヒルＨＢｃＡｇ（１−２
３９）のネイティブなコアのピークを示す（ピーク１は、大きな分子量の細菌集
合体を表す大発見の材料（ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈ ｍａｔｅｒｉａｌ）であ
る）。１６Ｂのピーク３は、分離したコアモノマー（二価カチオンに曝露後）に
対応し、そしてピーク４は、外因性ＤＮＡである。１６Ｃのピーク５は、二価カ
チオンの除去および外因性ＤＮＡの添加後に再アセンブルしたアヒルＨＢｃＡｇ
（１−２３９）コア粒子に対応し；ピーク６は、組み込まれていない外因性ＤＮ
Ａを表す。

【００８６】

【表２】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、アヒルＨｂｃＡｇのアミノ酸配列である。

【図２】 図２は、アヒルＨｂｃＡｇの核酸配列である。

【図３】 図３は、外因性モザイク組換えアヒルＨｂｃＡｇ粒子の例示である。

【図４】 図４Ａ、４Ｂは、組換えアヒルＨＢｃＡｇ粒子（４Ａ）または組換えｔ−アヒ
ルＨＢｃＡｇ粒子（４Ｂ）への曝露の後のＪ７７４Ａ．１マクロファージ細胞に
おける特異的ＲＮＡの分析である。ＲＮＡを、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応
（ＲＴ−ＰＣＲ）によって検出し、そしてアガロースゲル電気泳動によって可視
化した。

【図５Ａ】 図５Ａは、組換えアヒルＨＢｃＡｇ粒子または組換えｔ−アヒルＨＢｃＡｇ粒
子で７２時間処理した後のＪ７７４Ａ．１マクロファージ細胞の培養培地（５Ａ
）におけるＩＬ−１２の濃度である。

【図５Ｂ】 図５Ｂは、組換えアヒルＨＢｃＡｇ粒子または組換えｔ−アヒルＨＢｃＡｇ粒
子で７２時間処理した後のＪ７７４Ａ．１マクロファージ細胞の細胞抽出物（５
Ｂ）におけるＩＬ−１２の濃度である。

【図６】 図６は、組換えアヒルＨＢｃＡｇ粒子で２４時間処理した後のＢＡＬＢ／Ｃマ
ウスおよびＢ１０マウス由来の骨髄由来樹状細胞の培養培地におけるＩＬ−１２
の濃度である。

【図７】 図７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｄおよび７Ｅは、組換えアヒルＨＢｃＡｇ粒子での処
理後のＪ７７４Ａ．１マクロファージ細胞における細胞表面抗原発現のフローサ
イトメトリー分析である。７Ａ：ＣＤ８６；７Ｂ：ＭＨＣ Ｉ；７Ｃ：ＭＨＣ
ＩＩ；７Ｄ：Ｌｙ−６Ａ／Ｅ；７Ｅ：Ｌｙ−６Ｃ。矢印：１、斜線部分：アイソ
タイプコントロール；２、実線：未処理コントロール；３、点線：１０μｇの組
換えアヒルＨＢｃＡｇ粒子で処理した。

【図８】 図８Ａおよび８Ｂは、インビボでのアヒルＨＢｃＡｇの全ＩｇＧ力価である。
８Ａ：Ｂ１０マウス。８Ｂ：ＢＡＬＢ／Ｃマウス。

【図９】Ｂ１０マウスおよびＢＡＬＢ／ＣマウスにおけるアヒルＨＢｃＡｇ
のＩｇＧアイソタイプ力価である。

【図１０】 図１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃおよび１０Ｄは、インビトロで２４時間、１μｇの
アヒルＨＢｃＡｇで再刺激した後の脾臓細胞における細胞表面抗原の発現のフロ
ーサイトメトリー分析である。１０Ａ：ＣＤ８６；１０Ｂ：Ｌｙ−６Ｃ；１０Ｃ
：ＣＤ４＋；１０Ｄ：ＣＤ８＋。矢印；１、０μｇのアヒルＨＢｃＡｇで免疫し
た。２、１μｇのアヒルＨＢｃＡｇで免疫した。３、１０μｇのアヒルＨＢｃＡ
ｇで免疫した。

【図１１】 図１１Ａおよび１１Ｂは、アヒルおよびヒトの抗体（１１Ａ）との、ウッドチ
ャックの交差反応と、アヒルおよびウッドチャックの抗体（１１Ｂ）との、ヒト
の交差反応の比較である。

【図１２】 図１２は、核酸を有するアヒルＨＢｃＡｇ粒子および核酸を有しないアヒルＨＢ
ｃＡｇ粒子の分解／再集合である。レーン１：アヒルＨＢｃＡｇ；レーン２：Ｍ
ｇＣｌ₂で処理し、そしてＴＢＳに対して透析したアヒルＨＢｃＡｇ；レーン３
：ＭｇＣｌ₂およびＲｎａｓｅ Ａの両方で処理し、そして透析したアヒルＨＢ
ｃＡｇ；レーン４：Ｒｎａｓｅ Ａで処理し、そして透析したアヒルＨＢｃＡｇ
。

【図１３】 図１３は、核酸を有するアヒルＨＢｃＡｇ（１−２３９）粒子および核酸を有
しないアヒルＨＢｃＡｇ（１−２３９）粒子の分解／再集合である。レーン１：
アヒルＨＢｃＡｇ（１−２３９）；レーン２：ＭｇＣｌ₂で処理し、そしてＴＢ
Ｓに対して透析したアヒルＨＢｃＡｇ（１−２３９）；レーン３：ＭｇＣｌ₂で
処理するが、透析しないアヒルＨＢｃＡｇ（１−２３９）；レーン４：Ｒｎａｓ
ｅ Ａで処理し、そして透析したアヒルＨＢｃＡｇ（１−２３９）；レーン５：
ＭｇＣｌ₂およびＲｎａｓｅ Ａの両方で処理し、そして透析したアヒルＨＢｃ
Ａｇ（１−２３９）。

【図１４】 図１４は、核酸を有するアヒルＨＢｃＡｇ（１−２３９）粒子および核酸を有
しないアヒルＨＢｃＡｇ（１−２３９）粒子の分解／再集合である。レーン１：
Ｒｎａｓｅ ＡおよびＭｇＣｌ₂の両方で処理し、そしてＴＢＳに対して透析し
たアヒルＨＢｃＡｇ（１−２３９）。レーン２：Ｒｎａｓｅ ＡおよびＭｇＣｌ ₂ の両方で処理し、そしてＴＢＳに対して透析したアヒルＨＢｃＡｇ（１−２３
９）；外因性オリゴヌクレオチドを透析前に添加した；レーン３：アヒルＨＢｃ
Ａｇ（１−２３９）。

【図１５】 図１５は、核酸を有するアヒルＨＢｃＡｇ（１−２３９）粒子および核酸を有
しないアヒルＨＢｃＡｇ（１−２３９）粒子の分解／再集合である。レーン１：
アヒルＨＢｃＡｇ（１−２３９）；レーン２：Ｒｎａｓｅ ＡおよびＭｇＣｌ₂
の両方で処理し、そしてＴＢＳに対して透析したアヒルＨＢｃＡｇ（１−２３９
）；外因性オリゴヌクレオチドを透析前に添加した。

【図１６】 図１６Ａ、１６Ｂおよび１６Ｃは、外因性核酸を有するアヒルＨＢｃＡｇ（１
−２３９）粒子の分解／再集合である：クロマトグラフィーによる確認。１６Ａ
：ピーク１：ブレイクスルー物質は高分子量の細菌集合体を示す；ピーク２：ア
ヒルＨＢｃＡｇネイティブコアピーク。１６Ｂ：ピーク３：解離したコアモノマ
ー；ピーク４：外因性ＤＮＡ。１６Ｃ：ピーク５：再アセンブルしたアヒルＨＢ
ｃＡｇコア粒子；ピーク６：取り込まれていない外因性ＤＮＡ。

【図１７】 図１７は、アヒルＨＢｃＡｇ（１−２３９）のアミノ酸配列である。

【図１８】 図１８は、アヒルＨＢｃＡｇ（１−２３９）の核酸配列である。

【図１９】 図１９は、ｔ−アヒルＨＢｃＡｇのアミノ酸配列である。

【図２０】 図２０は、ｔ−アヒルＨＢｃＡｇの核酸配列である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ピーターソン， ダレル エル． アメリカ合衆国 バージニア 23832， チェスターフィールド， ラウンドヒル ドライブ 4345 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA33 CA02 GA11 HA17 4C085 AA03 BA89 BB01 BB11 CC08 EE03 EE06 FF02 4H045 AA11 AA20 AA30 BA10 CA02 DA86 EA29 FA74

Claims (34)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヌクレオカプシドタンパク質モノマーを含む粒子であって、
   該粒子の１次配列はＢ型肝炎ウイルス由来であり、ここで該モノマーがヒトＨＢ
   ｃＡｇに対する抗体と交差反応しない、粒子。
2. 【請求項２】 前記ヌクレオカプシドタンパク質モノマーの１部が、第１の
   ハプテンを含む、請求項１に記載の粒子。
3. 【請求項３】 前記ヌクレオカプシドタンパク質モノマーの第２の部分が前
   記第１のハプテンとは異なる第２のハプテンを含む、請求項２に記載の粒子。
4. 【請求項４】 前記粒子が前記モノマーに結合した核酸をさらに含む、請求
   項１に記載の粒子。
5. 【請求項５】 前記Ｂ型肝炎ウイルスがアヒルＢ型肝炎ウイルスである、請
   求項１に記載の粒子。
6. 【請求項６】 前記粒子が前記粒子と結合する核酸をさらに含む、請求項２
   に記載の粒子。
7. 【請求項７】 前記粒子が前記粒子と結合する核酸をさらに含む、請求項３
   に記載の粒子。
8. 【請求項８】 前記核酸が、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番
   号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配
   列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列
   番号１７、配列番号１８および配列番号１９からなる群より選択される、請求項
   ４に記載の粒子。
9. 【請求項９】 前記核酸が、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番
   号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配
   列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列
   番号１７、配列番号１８および配列番号１９からなる群より選択される、請求項
   ６に記載の粒子。
10. 【請求項１０】 前記核酸が、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列
    番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、
    配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配
    列番号１７、配列番号１８および配列番号１９からなる群より選択される、請求
    項７に記載の粒子。
11. 【請求項１１】 請求項２に記載の粒子であって、ここで前記第１のハプテ
    ンが、１本鎖ＤＮＡウイルス、２本鎖ＤＮＡウイルス、１本鎖ＲＮＡウイルス、
    ２本鎖ＲＮＡウイルス、細胞内寄生生物、真菌、細菌および癌からなる群より選
    択される因子によって引き起こされる疾患状態に関連する、粒子。
12. 【請求項１２】 請求項３に記載の粒子であって、ここで前記第２のハプテ
    ンが、１本鎖ＤＮＡウイルス、２本鎖ＤＮＡウイルス、１本鎖ＲＮＡウイルス、
    ２本鎖ＲＮＡウイルス、細胞内寄生生物、真菌、細菌および癌からなる群より選
    択される因子によって引き起こされる疾患状態に関連する、粒子。
13. 【請求項１３】 第１および第２のハプテンさらに含み、そしてここで前記
    粒子が外因性のモザイクとしてアセンブルされる、請求項１に記載の粒子。
14. 【請求項１４】 第１および第２のハプテンさらに含み、そしてここで前記
    粒子が内因性のモザイクとしてアセンブルされる、請求項１に記載の粒子。
15. 【請求項１５】 被験体に核酸を送達する方法であって、該方法が該被験体
    にヌクレオカプシドタンパク質モノマーおよび核酸を含む粒子を投与する工程を
    包含し、ここで該モノマーの第１の配列がＢ型肝炎ウイルス由来であり、そして
    ここで該モノマーがヒトＨＢｃＡｇに対する抗体と交差反応しない、方法。
16. 【請求項１６】 前記ヌクレオカプシドタンパク質モノマーの第１の部分が
    第１のハプテンを含む、請求項１５に記載の方法。
17. 【請求項１７】 前記ヌクレオカプシドタンパク質モノマーの第２の部分が
    前記第１のハプテンとは異なる第２のハプテンを含む、請求項１５に記載の方法
    。
18. 【請求項１８】 前記Ｂ型肝炎ウイルスが、アヒルＢ型肝炎ウイルスである
    、請求項１５に記載の方法。
19. 【請求項１９】 ヌクレオカプシドタンパク質モノマー粒子を作製する方法
    であって、以下の工程：複数のヌクレオカプシドタンパク質モノマーを含む組成
    物を提供する工程であって、該モノマーの１次配列がＢ型肝炎ウイルスに由来し
    、ここで該モノマーがヒトＨＢｃＡｇに対する抗体と反応せず、そしてここで複
    数の該モノマーがアセンブルされて粒子を形成する工程；荷電因子に該粒子を曝
    露して、非粒子形態で該モノマーの混合物を産生する工程；そして該混合物から
    該荷電因子を除去することによって、該混合物中の該ヌクレオカプシドタンパク
    質モノマーから粒子をアセンブルする工程、を包含する、方法。
20. 【請求項２０】 請求項１９に記載の方法であって、該方法が前記曝露する
    工程において産生された前記混合物から不必要な核酸を除去する工程をさらに包
    含する、方法。
21. 【請求項２１】 請求項１９に記載の方法であって、該方法が以下の工程：
    （ａ）内因性モザイク粒子を添加する工程；（ｂ）外因性モザイク粒子を添加す
    る工程；（ｃ）核酸を添加する工程；（ｄ）前記アセンブルする工程において（
    ａ）、（ｂ）または（ｃ）の任意の組み合わせを添加する工程をさらに包含する
    、方法。
22. 【請求項２２】 請求項１９に記載の方法であって、ここで前記曝露する工
    程において使用される前記荷電因子が、Ｍｇ⁺²、Ｚｎ⁺²、Ｂａ⁺²、Ｓｒ⁺²、Ｃａ ⁺² 、およびＰｂ⁺²からなる群より選択される二価のカチオンである、方法。
23. 【請求項２３】 被験体における免疫原性応答を誘発するための方法であっ
    て、該方法が、該被験体に、ヌクレオカプシドモノマーを含む、粒子を含む有効
    量の組成物を投与する工程であって、該モノマーの１次配列がＢ型肝炎ウイルス
    由来であり、そしてここで該モノマーがヒトＨＢｃＡｇに対する抗体と交差反応
    しない、工程を包含する、方法。
24. 【請求項２４】 前記Ｂ型肝炎ウイルスがアヒルＢ型肝炎である、請求項２
    ３に記載の方法。
25. 【請求項２５】 前記組成物が、前記粒子と結合する核酸をさらに含む、請
    求項２３に記載の方法。
26. 【請求項２６】 前記組成物が、複数の前記ヌクレオカプシドモノマーの少
    なくとも１部と関連する、１以上のハプテンをさらに含む、請求項２３に記載の
    方法。
27. 【請求項２７】 複数のヌクレオカプシドタンパク質モノマーからアセンブ
    ルされた粒子を含むワクチンであって、該モノマーの１次配列がＢ型肝炎ウイル
    ス由来であり、そしてここで、該モノマーがヒトＨＢｃＡｇに対する抗体と交差
    反応しない、ワクチン。
28. 【請求項２８】 前記１次配列が１つのハプテンをさらに含む、請求項２７
    に記載のワクチン。
29. 【請求項２９】 前記１次配列が２本鎖ＤＮＡウイルス由来の１つのハプテ
    ンをさらに含む、請求項２７に記載のワクチン。
30. 【請求項３０】 前記１次配列が２本鎖ＤＮＡウイルス由来の第２のハプテ
    ンをさらに含む、請求項２７に記載のワクチン。
31. 【請求項３１】 前記ハプテンがＨＩＶ由来である、請求項２８に記載のワ
    クチン。
32. 【請求項３２】 前記ハプテンが癌細胞由来である、請求項２８に記載のワ
    クチン。
33. 【請求項３３】 被験体においてＴＨ１型免疫応答を誘発する方法であって
    、該方法が、該被験体にヌクレオカプシドモノマーを含む粒子を含む、有効量の
    組成物を投与する工程であって、該モノマーの１次配列がＢ型肝炎ウイルス由来
    であり、ここで該モノマーがヒトＨＢｃＡｇに対する抗体と交差反応せず、そし
    て疾患状態と関連する少なくとも１つのハプテンを含む工程を包含する、方法。
34. 【請求項３４】 前記疾患状態が癌またはＡＩＤＳである、請求項３３に記
    載の方法。