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JP2003505110A - マイクロリットル以下の反応のための、テンプレート捕獲および正規化のための方法および装置 - Google Patents

マイクロリットル以下の反応のための、テンプレート捕獲および正規化のための方法および装置

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JP2003505110A
JP2003505110A JP2001513644A JP2001513644A JP2003505110A JP 2003505110 A JP2003505110 A JP 2003505110A JP 2001513644 A JP2001513644 A JP 2001513644A JP 2001513644 A JP2001513644 A JP 2001513644A JP 2003505110 A JP2003505110 A JP 2003505110A
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JP
Japan
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dna
nucleic acid
substrate
reaction
capillary
Prior art date
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Withdrawn
Application number
JP2001513644A
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Inventor
アンディー ハド，
ステファン ジョバノビッチ，
Original Assignee
モレキュラー・ダイナミックス・インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by モレキュラー・ダイナミックス・インコーポレイテッド filed Critical モレキュラー・ダイナミックス・インコーポレイテッド
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Abstract

(57)【要約】 核酸を用いてナノスケール反応物を調製するための方法が示される。核酸を、反応チャンバ（代表的にはキャピラリー）の内部表面上に、飽和的に、ただし可逆的に捕獲する。過剰な核酸を取り除き、そして反応をキャピラリー内で直接実施する。あるいは、飽和結合した核酸を溶出し、引き続く反応のために一定量の核酸を別のチャンバに分配する。本発明の方法を達成するためのデバイス、およびハイスループット核酸配列決定反応のためにこの方法を利用するために有利に設計したシステムがまた、提供される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、バイオテクノロジーの分野であり、そして小スケールの反応（特に
、核酸テンプレートを使用する小スケールのサイクリング反応および等温反応）
を調製および実施するための、方法および装置に関する。
【０００２】 （発明の背景） 連邦政府に資金援助されるヒトゲノム計画の本来の目的は、ヒトゲノムの配列
を、１０倍の範囲で、２００５年までに完成することであった。速さの劇的な加
速により、部分的な草稿が、最近提示された。
【０００３】 しかし、迅速な安価なＤＮＡ配列決定に対する必要性は、ヒトゲノム計画の完
了後に、減少するよりむしろ、劇的に増加する。
【０００４】 例えば、非ヒト生物（細菌、植物および動物を含む）のゲノムの配列決定に、
次第に増加している興味がおかれている。より重要なことには、急に発達してい
る分子病理学および薬理ゲノム学の分野は、個々の患者由来の複数の遺伝子の配
列決定を必要とする。分子病理学は、特定の遺伝子における変異を同定すること
による、ヒトの疾患についての診断、およびしばしば予後の処方に関連する。薬
理ゲノム学とは、全てのヒト集団に存在する対立遺伝子の差異が、いかにして、
薬物に対する個体の治療応答、および副作用に対する感受性に影響を与えるかを
理解することをいう。個体患者由来の遺伝子を配列決定する必要性が増加するに
つれて、医療の点の配列決定の可能性に対する要求もまた、増加する。大きな、
集中型の、ハイスループットＤＮＡ配列決定設備（これは、十分に資金援助され
た学術的研究センターおよびゲノム会社においてのみ存在する）から、小さな、
複雑ではない、中程度のスループットの遺伝子配列決定システム（大部分の病院
および診療所に設置され得るもの）へのシフトが、必要とされる。配列決定技術
の市場におけるこのシフトは、試薬の費用を低下させること、およびサンプル処
理工程を可能な限り単純かつ切れ目なくすることの励みになる。
【０００５】 １９７０後期に、Ｓａｎｇｅｒらは、ＤＮＡ配列分析のための酵素的鎖終結法
を開発した。この方法は、その配列全体にわたる全てのヌクレオチドにおいて、
共通の出発点および無作為な終結を有する、内包されたＤＮＡフラグメントのセ
ットを生成する。Ｌｌｏｙｄ Ｓｍｉｔｈ、Ｌｅｅ Ｈｏｏｄらは、Ｓａｎｇｅ
ｒ法を改変して、配列決定反応において４つの蛍光標識を使用し、単一レーンの
分離を可能にした。このことにより、最初の自動化ＤＮＡシークエンサーが作製
され、これは、分離のためにポリアクリルアミドスラブゲルを使用する。より最
近には、蛍光エネルギー移動色素が使用されて、シグナルを２〜１０倍増強し、
そして光学的配置を単純化する、色素セットが作製された。
【０００６】 自動化蛍光キャピラリーアレイ電気泳動（ＣＡＥ）ＤＮＡシークエンサーは、
スラブゲルを交換するための、合意された技術であるようである。キャピラリー
ゲル電気泳動は、配列決定生成物の分離を加速し、そして必要とされるサンプル
容量を劇的に減少させる可能性を有する。９６チャネルのキャピラリー電気泳動
機器である、ＭｅｇａＢＡＣＥTM（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ（Ｓ
ｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）から市販されている）は、レーザー誘導蛍光（ＬＩＦ
）共焦点蛍光スキャナを使用して、２時間のサイクル時間での９０分間の泳動に
おいて、１つのキャピラリー（Ｐｈｒｅｄ ２０ウィンドウ）あたり平均約６２
５塩基まで検出する。共焦点空間濾過は、より高いシグナル対ノイズ比を生じる
。なぜなら、周囲の材料からの過剰の反射および蛍光が、光電子増倍管（ＰＭＴ
）におけるシグナル検出の前に、排除されるからである。従って、１つの配列決
定バンドあたりアットモル以下のレベルでの感度が、達成可能である。共焦点画
像化もまた、ガラスまたはプラスチックのマイクロチップのバックグラウンド蛍
光が溶融シリカキャピラリーのバックグラウンド蛍光よりずっと高くあり得る、
キャピラリー電気泳動を使用するマイクロチップ分析システムにおいて、特に重
要である。キャピラリーアレイ電気泳動システムは、ＤＮＡ分析のためのゲノム
学団体の最初のスループットの必要性の多くを解決する。しかし、この低容量サ
ンプルの調製のための方法は、増加したスループットと低下した費用とに対する
有意な障壁を依然として提示する。
【０００７】 蛍光ＤＮＡシークエンサーは、ＤＮＡ配列の獲得のスループットを改善してい
るが、これらもまた、スループットの障害を、配列獲得からサンプル調製へと戻
して移動させた。これに応じて、配列決定テンプレートの調製のため、およびト
ランスポゾンにより容易になるＤＮＡ配列決定のための迅速な方法が、遠心分離
を排除した磁気ビーズ捕獲方法を有する方法として、開発された。好熱性Ａｒｃ
ｈａｅ ＤＮＡポリメラーゼがスクリーニングされ、そして遺伝子操作されて、
忠実度を改善し、高温における安定性を確実にし、長さを伸長させ、そしてジデ
オキシヌクレオチドおよび蛍光アナログに対する親和性を変化させた。これらの
改善は、試薬費用を低下させ、サンプル調製を単純化し、データの正確さをより
高め、そして読み取り長さを増加させた。
【０００８】 配列決定団体もまた、ＤＮＡテンプレート、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
反応、およびＤＮＡ配列決定反応を調製するための、よりハイスループットの方
法を開発した。サンプル調製は、次第に多様化しており、そして９６ウェルマイ
クロタイターおよび３８４ウェルマイクロタイター、多チャネルピペッター、な
らびに研究室ロボットワークステーションを使用して、自動化された。一般に、
これらのワークステーションは、技術者が実施する操作を模倣し、そして約１マ
イクロリットルの最小作動容量を有するが、独立型多チャネルピペッターは、よ
り小さな容量を操作するために使用されている。
【０００９】 キャピラリーシステムでのＤＮＡショットガン配列決定のための、代表的な全
スケールサンプル調製方法は、ファージプラークまたは細菌コロニーを溶解して
、サブクローニングされたＤＮＡを単離することにより開始する。いくつかの状
況下においては、サブクローニングされたＤＮＡインサートをＰＣＲ増幅してサ
ンプル中でのその濃度を指数関数的に増加させることが、望ましくあり得る。次
に、エキソヌクレアーゼＩ（ＥｘｏＩ）および北極エビアルカリホスファターゼ
（ＳＡＰ）を添加して酵素クリーンアップ反応を実施し、プライマーおよび過剰
のｄＮＴＰ（これは、サイクル配列決定を妨害する）を除去する。ＥｘｏＩを使
用して、二本鎖生成物を消化することなく、一本鎖プライマーをｄＮＭＰに分解
する。ＳＡＰは、ｄＮＴＰをｄＮＰに転換し、そしてｄＮＴＰ濃度を２００μＭ
（ＰＣＲ反応のために使用されるような）から０．１μＭ未満（蛍光配列決定に
おいて使用するため）へと低下させる。この反応を３７℃で実施し、次いで６５
℃に加熱して、ＥｘｏＩおよびＳＡＰを不可逆的に変性する。
【００１０】 ＰＣＲ増幅は、サイクル配列決定のためには過剰のテンプレートＤＮＡを生成
し得るので、ＥｘｏＩ／ＳＡＰで処理したＰＣＲサンプルは、サイクル配列決定
の前に、５倍に希釈され得る。このことにより、混入物の濃度が、キャピラリー
電気泳動分析のより少ない妨害を引き起こす範囲に減少する。サイクル配列決定
試薬を、代表的には蛍光標識色素のプライマーまたはターミネーターを用いて添
加し、そしてこの反応を熱サイクルして、標識フラグメントの直鎖状増幅を駆動
する。最後に、サイクリングの後に、これらのサンプルを、代表的には、エタノ
ール沈殿またはスピン濾過、ホルムアルデヒド、別の変性剤、または水への再懸
濁によって後処理し、そしてサンプルを、界面動電的にキャピラリー電気泳動シ
ステムに注入する。
【００１１】 このワークフローは、ＭｅｇａＢＡＣＥTMシステムの性能を劇的に改善し、そ
して類似のワークフローは、現在、同様に他のキャピラリー電気泳動システムの
ための選択の方法であるようである。ヒトゲノム無作為サブクローンまたは発現
した配列タグ（ＥＳＴ）の、単一のプラークおよびコロニー由来の実際のサンプ
ルを使用して、分離マトリックスとして直鎖ポリアクリルアミドを用いるこのワ
ークフローは、２００塩基対を超えるサンプルの成功率を約６０％から８５〜９
０％だけ改善し、そして平均読み取り長さを約４００〜６００を超える塩基だけ
改善した。さらに、この方法は、非常に頑健であることが示された。
【００１２】 上記サンプル調製法は、大いに増加したスループットを有するが、試薬の費用
は、配列決定の費用の主要な構成要素であるままである。キャピラリー電気泳動
は、アットモル以下のみのサンプルを必要とするが、現在、サンプルは、ピコモ
ルの範囲で調製される。従って、反応容量を減少させることは、ＤＮＡ配列決定
の費用を減少させ、そしてなお、分析のための十分な材料を提供する。しかし、
反応容量の有意な減少は、満足のいく方法がサンプルおよび試薬の操作および反
応のために開発され得る場合にのみ、達成され得る。理想的には、このような方
法は自動化され、そして複数のサンプルを一度に生成するよう配置される。さら
に、このような方法を、さらなる構成要素（例えば、キャピラリー電気泳動なら
びに分離および分析のための検出器）とインターフェースし得るモジュールとし
て組み込むことが、望ましい。
【００１３】 いくつかのデバイスが、サンプル調製の自動化を補助するために、設計された
。例えば、米国特許第５，７２０，９２３号は、小規模のサイクリング反応が、
１ｍｍ程度に小さな直径を有するチューブ内で起こるシステムを記載する。これ
らのチューブは、引き続いて、熱ブロックにより発生する熱サイクルに供されて
、所望の反応を生じさせる。少量のサンプル（これらの各々は、チューブ中で、
このサンプルと混合しない液体によって分離される）として吸引することによっ
て、複数のサンプルが、単一のチューブ内でプロセスされ得る。流体が、ポンプ
によって、これらの試験を通って移動する。これらの特徴は、自動的にチューブ
を洗浄し、サンプルを含むウェルを有するサンプルトレイを移動させ、そしてこ
れらのチューブをサンプルトレイ中のウェルと接触させるシステムに、組み込ま
れる。
【００１４】 米国特許第５，７８５，９２６号は、少量のサンプルを移送するためのシステ
ムを開示する。このシステムにおいて、少なくとも１つのキャピラリーチューブ
が、少量のサンプルを移送するために使用される。コンピュータにより制御され
るモータに接続される、精密直線アクチュエータが、チューブを使用して、液体
をアリコート採取し、そして分配するための、空気力ピストンとして作用する。
サンプルの量は、キャピラリーセグメント内の液体の存在を検出する光学センサ
によりモニタリングされる。このシステムは、堆積される液体を含む流体ステー
ション、および移送キャピラリーを位置決めするための位置決めデバイスを備え
る。
【００１５】 米国特許第５，８９７，８４２号は、熱サイクリングを使用する、自動化サン
プル調製のためのシステムを開示する。このシステムにおいて、反応混合物は、
キャピラリーチューブ内にポンピングされる。このチューブの一端は、接続され
たポンプからの圧力を使用してシールされ、一方で他端は、このチューブを障壁
に押し付けることによってシールされる。このポンプはまた、このチューブ内の
流体を移動させるよう作用する。一旦、これらの端部がシールされると、このチ
ューブは、熱サイクルに供される。このシステムにおいて、ロボット移送デバイ
スが、これらのチューブを、サンプル調製ステーション（ここで、ポンプが反応
混合物の成分をチューブに装填する）と熱サイクリングステーションとの間で移
動させる。
【００１６】 上記で議論したシステムにおいて、サンプル（例えば、配列決定のためのＤＮ
Ａテンプレート）と試薬とを最初に一緒に混合することが必要であり、その後、
この混合物を反応チャンバに導入する。この中間の混合する工程は、さらなる試
薬およびサンプルの取り扱い工程を必然的に必要とし、この工程は、浪費を生じ
る。例えば、別個のマイクロピペットを使用して、サンプルおよび試薬を混合チ
ャンバ内に分配する場合には、少量のサンプルおよび試薬が、それぞれのピペッ
ト中に残り、そして反応混合物は、この混合チャンバ内に保持される。ハイスル
ープットシステムにおいては、この浪費、ならびに新しいかまたは適切に洗浄さ
れたピペットおよび混合チャンバを提供することの費用が、急激に増加する。浪
費の程度は、少量のより高い濃度の液体を分配する際の不正確さを補償するスト
ラテジーとして、低濃度で反応成分を含む比較的多量の液体を分配する必要性に
よって、しばしば悪化する。通常、反応混合物を形成した後に、小割合のみが、
分析のために必要とされ、そして残りは処分される。
【００１７】 従って、分析されるべき生物学的サンプルが、反応を起こすために必要な試薬
とサンプルとを最初に混合する必要性なしに、反応チャンバに導入され得る手段
に対する必要性が、存在する。
【００１８】 米国特許第５，８４６，７２７号は、熱サイクリングのための反応チャンバと
して働くガラスキャピラリーチューブの内側にテンプレートＤＮＡが固定される
、アフィニティー捕獲方法を開示する。このキャピラリーは、最初に、ビオチン
分子をそのキャピラリーの内側表面に固定し、続いて、このカラムにアビジンま
たはストレプトアビジン（これは、ビオチンを堅固に結合する）を充填すること
によって、調製される。配列決定されるべきテンプレートＤＮＡは、ＰＣＲによ
ってビオチン部分に共有結合され、次いで、キャピラリーの内側のアビジンに曝
される。これによって、テンプレートがキャピラリー壁に、ビオチン−アビジン
−ビオチン結合を介して固定される。結合していないテンプレートを洗浄除去し
た後に、配列決定試薬が添加され、そしてキャピラリーの内容物が、熱サイクル
に供されて、配列決定反応を活性化する。この様式では、キャピラリーに装填す
る前にテンプレートＤＮＡを配列決定試薬と混合することは、不必要である。
【００１９】 しかし、この方法は、ＰＣＲによってビオチンをテンプレートＤＮＡに結合す
ることを必要とし、配列決定反応の前でさえも、反応を設定および実施すること
を必要とすることのみが記載されている。この必須の予備的な工程は、配列デー
タの獲得に関連する時間および費用を追加する。さらに、ＤＮＡの固定は、事実
上は不可逆的である。なぜなら、ビオチン−アビジン結合が非常に強力であるの
で、アビジンを変性させる薬剤を用いてのみ、切断され得るからである。この処
理は、この反応の任意の他のタンパク質成分をもまた変性させる処理である。そ
の結果として、テンプレートＤＮＡは、キャピラリーの内側表面に結合したまま
でなければならない。ＤＮＡは溶液中で自由ではないので、反応成分がＤＮＡと
相互作用し得る壁に拡散するために、さらなる時間が必要である。さらに、キャ
ピラリーを再利用することが所望である場合には、テンプレートＤＮＡをアビジ
ンの変性によって除去すること、洗浄、次いでアビジンのキャピラリーへの再充
填が必要であり、これらの全ては、時間および試薬費用を増加させる。
【００２０】 従って、分子を反応チャンバ内へと導入するための方法であって、最初のサン
プル−試薬混合工程がなく、アフィニティー捕獲部分をサンプル中の全ての分子
に結合させる必要がなく、そしてテンプレート固定が可逆的である、方法に関す
る、当該分野における必要性が存在し続けている。この様式で、試薬費用が最小
となり、そして処理速度が最大となる。
【００２１】 キャピラリーアレイ電気泳動システムおよびキャピラリー電気泳動マイクロチ
ップ分析システムは、アットモル以下のＤＮＡ配列決定反応生成物を検出し得る
。この非常な感度は、スラブゲルと比較して減少した、配列決定反応におけるテ
ンプレートＤＮＡの理想的な量からの逸脱に関する許容性の費用から生じる。例
えば、配列決定反応中のテンプレートＤＮＡが少なすぎる場合には、蛍光標識さ
れたプライマー伸長生成物の収量が低い。このことは、この反応生成物がレーザ
ーによって走査される場合に、弱いシグナル強度を生じる。このことは、クロマ
トグラムを分析するソフトウェアが、スペクトル分離を十分に実施することを妨
げ、配列読み取り長が平均より短くなる；この反応が繰り返されなければならず
、そうでなければ、配列情報が失われる。
【００２２】 多すぎるテンプレートＤＮＡもまた、キャピラリーの過剰装填に起因して、問
題を引き起こす。十分な収量の蛍光標識された反応生成物が存在するが、テンプ
レートが過剰である場合には、このテンプレートは、界面動電的な注入の間に、
キャピラリーに入るために、配列決定生成物と競合する。大きなテンプレートＤ
ＮＡ分子が存在することにより、キャピラリー電流の全体的な減少、または突然
の低下が生じ得、このことは、種々の様式で現れ得る。過剰の装填は、シグナル
強度を弱め、クロマトグラムにおける解釈可能な蛍光強度ピークの出現を遅くし
、そして反応生成物の分解を乏しくし得る。なぜなら、蛍光発光が幅広く、そし
て拡散するからである。これらの効果の全てが、読み取りをより短くし、そして
配列決定データの質を低下させる。
【００２３】 過剰装填の問題は、代表的に、配列決定反応を希釈すること、または配列決定
反応に導入されるテンプレートＤＮＡの量を注意深く滴定することのいずれかに
よって、解決される。これらの解決法はどちらも、実施が単純であるが、前者は
、反応の分析を繰り返すことを必要とし、そして後者は、従来の手段を使用して
ハイスループットシステムにおいて実施することが困難である。これらの手段は
、サンプル中のＤＮＡを結合する蛍光色素の量を検出すること、この蛍光色素の
量を標準濃度曲線と比較すること、または２６０ｎｍの波長の紫外光の吸光度を
測定することを包含し、これらは、ＤＮＡ濃度の絶対的な測定に変換され得る。
従って、ハイスループットのキャピラリー電気泳動システムを使用して分析され
るべき配列決定反応のためのテンプレートＤＮＡの量を、滴定する方法に関する
、当該分野における必要性が、存在し続けている。ここで、費用の最小化および
速度の最大化が、重要である。
【００２４】 小スケールの熱サイクリング反応を、高度に平行化した様式で実施し得る、自
動化システムに対するさらなる必要性が、存在する。このシステムは、試薬の消
費を最小にして、サイクリング反応の迅速な調製を可能にするべきである。反応
のために必要とされる試薬の量を減少させることと、反応のために必要とされる
時間を短縮することとの組み合わせは、サイクリング反応の調製の全体の費用を
、大いに低下させる。
【００２５】 （発明の要旨） 従って、本発明の目的は、反応混合物を生成するための試薬との核酸の前混合
を回避する様式で、配列決定されるテンプレートＤＮＡのような少量の核酸を反
応チャンバに導入するための新規の方法を提供することである。
【００２６】 本発明のさらなる目的は、核酸または反応チャンバに結合した親和性捕獲部分
を使用することなく、反応チャンバへ少量の核酸を導入するのに有用な方法を提
供することである。
【００２７】 本発明のさらなる目的は、核酸が反応チャンバの壁に不可逆結合することなく
、少量の核酸を反応チャンバへ導入する方法を提供することである。
【００２８】 本発明のなお別の目的は、ＤＮＡが引き出された溶液中の核酸の濃度を決定す
る必要なしに、配列決定されるテンプレートＤＮＡのような、反応における使用
のための予め決定された適切な量の核酸を得るために有用な方法を提供すること
である。本発明の特定の目的は、ハイスループットキャピラリーアレイ電気泳動
システム（ここでは、コストを最小し、速度を最大にすることは困難である）を
使用して分析される配列決定反応における使用のためのテンプレートＤＮＡの量
を滴定するための方法を提供することである。
【００２９】 本発明のさらなる目的は、高度に平行な様式で、小規模熱サイクリング反応を
実施することが可能である自動化システムを提供することである。
【００３０】 本発明によれば、予め決定され、再現性のある量の核酸が、広い範囲の核酸濃
度を有する溶液から、直接に、しかも可逆的に、反応チャンバの表面上に捕獲さ
れる方法が提供され、この方法は、反応チャンバ内での直接のマイクロリットル
以下の（ｓｕｂｍｉｃｒｏｌｉｔｅｒ）反応のため、または次の使用のための第
２のチャンバへの定量された溶出のいずれかのためにある。本発明の他の局面に
よれば、本発明の方法を実施するのに有用な装置およびシステムが提供される。
【００３１】 本発明は、一部は、核酸の特定物質の表面への飽和性でしかも可逆的な結合の
新規な使用に基づく。この再現性があり、飽和性で、しかも可逆的な結合は、核
酸が捕獲される溶液中の核酸の濃度の必要とされる前決定なしに、次の反応にテ
ンプレートとして送達される核酸の量を制御するために使用される。特定の実施
形態において、キャピラリーの内面は、核酸の捕獲を達成するために使用され、
核酸テンプレートが次の反応が実施されるチャンバ内に直接捕獲されることを可
能にする。
【００３２】 従って、第１の局面において、本発明は、酵素反応に予め決定された適切な量
の核酸を導入する方法を提供し、この方法は、以下：酵素反応が実施されるチャ
ンバの内面上に直接、過剰の核酸からの予め決定された適切な量の核酸を飽和可
能に捕獲する工程、および次いでその過剰の核酸を除去する工程、を包含する。
【００３３】 本発明の方法は、マイクロリットル以下のＤＮＡ配列決定反応において特に有
用である。従って、別の局面において、本発明は、ＤＮＡ配列決定反応を達成す
る方法を提供し、この方法は、以下：テンプレートＤＮＡを直接、基板上に固定
する工程、および次いで、テンプレートＤＮＡを、ＤＮＡ配列決定反応を達成す
る反応混合物と接触させる工程、を包含する。関連した局面において、本発明は
、さらに、上記の方法によって達成されるＤＮＡ配列決定反応の産物、およびＤ
ＮＡ配列決定反応の産物から誘導されるＤＮＡ配列を提供する。
【００３４】 別の局面において、本発明は、溶液中のテンプレートＤＮＡの配列を実証する
方法を提供し、ここで、この溶液は、空間的にアドレス可能なアレイの一部とし
て第１の基板に接触されているか、または接触されることが所望される。この方
法は、以下：テンプレートＤＮＡを直接、第２の基板上に固定する工程であって
、ここで、このテンプレートＤＮＡが、第２の基板を、ＤＮＡが固定されるのに
十分な時間、テンプレートＤＮＡの溶液と接触させることによって固定する、工
程、および次いで、このテンプレートＤＮＡを、このＤＮＡ配列決定反応を達成
する反応混合物と接触させる工程を包含し、ここで、この第１および第２の基板
に接触されるテンプレートＤＮＡ溶液の組成は本質的に同一である。
【００３５】 本発明は、さらにハイスループット反応を達成するために、本発明のキャピラ
リーベースの実施形態を有利に利用するシステムを提供する。本発明のこの局面
の１実施形態において、このシステムは、平行配列に整列された多数のキャピラ
リーチューブセグメントから構成されるキャピラリーカセットを使用する。この
チューブセグメントは、基板を通して延び、一般に、均一の間隔で配置される。
このキャピラリーカセットは、試薬を定量するために、そして反応チャンバ（こ
こで、反応が行なわれる）としての両方に、使用され得る。
【００３６】 本発明のシステムは、配列決定反応物の調製に有用であるが、また、細胞溶解
物の高度に平行な調製、プラスミド抽出、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖
反応、循環増幅反応を回転する工程、薬物発見のための化合物ライブラリーまた
は化合物活性をスクリーニングする工程、タンパク質消化／配列決定、ＥＬＩＳ
Ａ、ラジオイムノアッセイおよび他の化学的または生化学的な反応またはアッセ
イに使用され得る。
【００３７】 （発明の詳細な説明） 本明細書中に記載される発明が完全に理解され得るために、以下の詳細な説明
が記載される。
【００３８】 本発明は、核酸が捕獲される溶液中の核酸の濃度の必要とされる前決定なしに
、次の反応にテンプレートとして送達される核酸の量を制御するために、特定の
物質による核酸の飽和性で、しかも可逆的な結合の新規な使用に一部基づいてい
る。特定の実施形態において、キャピラリーの内面は、核酸捕獲を達成するため
に使用され、次の反応が実施されるチャンバ内で核酸テンプレートが直接捕獲さ
れることが可能となる。
【００３９】 （本発明の利点） 本発明は、特に、キャピラリー電気泳動を利用するハイスループットサンプル
処理システムの状況において、ＤＮＡ配列決定反応を実施するためのその使用を
特に参照して、本明細書中に記載され、その実施のために、本発明の方法および
装置は特に有利である。しかし、本発明が、基板としてＤＮＡならびにＲＮＡを
使用する多くの型の生化学的反応および化学的反応を実施する過程において使用
され得ることは、以下により詳細に記載されるように、当業者にとって明らかで
ある。
【００４０】 以下により詳細に開示されるように、本発明は、ガラスキャピラリーチューブ
、またはその機能的等価物のような反応チャンバの内面上に直接核酸を可逆的に
固定するための方法を提供する。固定および他の処理工程後、核酸はキャピラリ
ーチューブ内部で実施される化学的反応、生化学的反応または酵素反応に使用さ
れるよう準備される。あるいは、核酸は、次の使用のための制御された量の核酸
を分配するようにキャピラリーから溶出かつ放出され得る。
【００４１】 高度に敏感なキャピラリー電気泳動システム（例えば、ＭｅｇａＢＡＣＥ（登
録商標）システム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌ
ｅ，ＣＡ））を使用するＤＮＡ配列決定反応の首尾よい分析のために、反応にお
ける一貫した、予め決定された量のテンプレートＤＮＡを使用することが重要で
あり、その結果、テンプレートの量は、低すぎも高すぎもしない。一貫したＤＮ
Ａ結合能力を有するキャピラリーチューブを利用することによって、全ての反応
にわたって使用されるテンプレートＤＮＡの量を「正規化する（ｎｏｒｍａｌｉ
ｚｅ）」ことが可能であり、それによって、全てが同様の量のテンプレートで開
始することを確実にする。正規化は他の様式で達成され得るが、キャピラリーチ
ューブの使用は、一貫性を確実にするために必要な工程を削減することによって
時間の劇的な節約を生じる。
【００４２】 核酸結合は、ガラス表面の固有の特性であるが、この捕獲表面がその結合能力
または結合選択性を変更するために改変され得ることが理解される。例えば、非
改変ＤＮＡを捕獲するために、主な結合力は、疎水性力、電荷−電荷（静電的）
力、および水素結合である。従って、非改変ＤＮＡを捕獲するために、ビニル基
が溶液相中の反応によって捕獲表面に加えられ得、プロピルアミン基がＣＶＤに
よって加えられ得、他のアミン，好ましくは３級アミンが、公知の反応によって
加えられ、電荷−電荷相互作用を最大化し得る。他の代替において、オリゴｄ（
Ｔ）は、アミノ化表面に共有結合され得、ポリ（Ａ）ｍＲＮＡの捕獲を増加する
。一般的形態Ｃnのスペーサーは、シリコン表面と官能基との間に加えられ得る
。これらの各々について、特徴および／または結合能力は、官能基の濃度を変え
ることによって変更され得る。
【００４３】 本発明の追加の利点は、特に、ハイスループットサンプル処理システムの状況
において、核酸との反応を実行することに付随した処理工程の数、ならびに核酸
との反応を実行するために必要とされる核酸および試薬の量を削減するために有
用であることである。例えば、ＤＮＡ配列決定反応のために、反応を活性化する
熱サイクリングを実施する前に、テンプレートＤＮＡを、配列決定プライマー、
ＤＮＡポリメラーゼ、ジデオキシヌクレオチド、ｄＮＴＰｓ、緩衝剤、塩および
水を含む反応混合物と合わせることが必要である。代表的には、これは、反応混
合物をチューブに等分し、次いで２００ｎｇのテンプレートＤＮＡの添加によっ
て２０μｌの反応物を調製する工程を包含する。ＤＮＡを等分するために使用さ
れるピペットチップは、典型的に、ＤＮＡストック（貯蔵）の汚染を回避するた
めに廃棄される。次いで、これらの成分は混合され、熱循環され、そして分析さ
れる。
【００４４】 本発明の一実施形態によると、キャピラリーチューブは、ＤＮＡ溶液を充填さ
れて、５ｎｇのキャピラリーの内側へのテンプレートの可逆性固定を生じる。い
くつかの処理工程の後、このキャピラリーは、次いで、５００ｎｌの反応混合物
を充填され、このことにより、このテンプレートはチューブの内側からこの混合
物中に溶出する。次いで、このキャピラリーはシールされ、そして熱循環され、
続いて、反応生成物が、高感度キャピラリー電気泳動システムによって分析され
る。キャピラリーは、毛管作用により充填されたピペッター、および反応チャン
バとして同時に働くため、テンプレートＤＮＡ溶液または反応混合物のいずれか
を、専用のピペッティングシステムを用いて別々に等分することは不要である。
これらのＤＮＡ溶液または反応混合物のいずれかを充填するためには、キャピラ
リーを浸漬する各々のストック（貯蔵）を提供することのみが必要である。この
ストックは、処理工程および使い捨てピペッターチップのような材料を節約する
。そうでなければ、これはまた、処理工程の間に移送され、かつ反応系に導入さ
れない試薬を節約する。
【００４５】 キャピラリーで行われる配列決定反応は、反応容積のほんの１／１０〜１／４
０、従って、１／１０〜１／４０の試薬のコストで達成され得る。まとめると、
これらの利点により、処理が減少し、速度が増加し、そしてコストが減少する。
ハイスループットサンプル処理システムの設計において、キャピラリーまたはそ
れらの機能的等価物は、同時に処理され得る反応物の数を増加させるために、当
業者に周知の様式で並列に配置され得る。本明細書中に開示される本願発明の様
々な実施形態を用いて享受される利点の規模は、処理されるサンプルの数に応じ
て増加する。
【００４６】 （反応チャンバ内の核酸の可逆性直接固定） 図１５は、フローチャートであり、そして図１６は、本発明の実施形態に従う
工程を示す概略図であり、これにより核酸は、反応チャンバ（例えば、ガラスキ
ャピラリーチューブ）の内面に可逆的に固定される。このように調製される反応
チャンバは、次いで、核酸との配列決定反応を実施するため、核酸との別の型の
酵素的反応もしくは生化学的反応を実施するため、または所定量の核酸を基板（
例えば、マイクロタイターディッシュウェル）もしくは分析機器（例えば、キャ
ピラリー電気泳動デバイス）に分配するために使用され得る。
【００４７】 図１５および図１６を参照すると、工程１において、核酸サンプルが適切な供
給源から調製され、この後、工程２において、核酸８０が、カオトロピックイオ
ンを含有する溶液８１に溶解される。工程３において、反応チャンバは、核酸カ
オトロピック溶液を充填され、そして工程４において、核酸８０を反応チャンバ
１２の内面８２に可逆性結合させるのに十分な時間、インキュベートされる。工
程５において、この核酸カオトロピック溶液が除去され、続いて、工程６におい
て、反応チャンバが洗浄され、そして工程７において、この反応チャンバが乾燥
される。反応チャンバが使用可能であるのはこの時点である。部品１２とは、キ
ャピラリーチューブ、またはより広範には、キャピラリーチューブおよびその機
能において等価な構造体を備える反応チャンバをいう。部品８０とは、ＤＮＡ、
またはより広範には、ＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびにそれらの誘導体を含む核酸
をいう。
【００４８】 適切な供給源から、核酸を得ることによって、プロセスが始まる（図１５、工
程１）。この核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）または
それらの分子の誘導体化形態であり得る。核酸は、当該分野に周知の方法に従っ
て、種々の生物、または生存細胞に依存する自己複製系から単離および精製され
得る（Ｃｕｒｒｅｎｔ 「Ｐｒｏｔｏｃｏｌｏｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２０００
，Ｆｒｅｄ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、ＩＳＢＮ ０−４７１−５０３３８−Ｘ
を参照のこと）。細胞は、ヒトおよび非ヒト哺乳動物細胞、非哺乳動物動物細胞
、植物細胞および真菌細胞を含む、真核生物細胞であり得る。さらに、真核生物
細胞は、アメーバまたは他の寄生生物のような、自由な生存単細胞生物を含み得
る。細胞はまた、細菌および古細菌を含む原核生物細胞であり得る。核酸はまた
、ＲＮＡウイルスおよびＤＮＡウイルスを含むウイルス、ならびに動物細胞、植
物細胞、真菌細胞および細菌細胞を感染させるウイルスから得られ得る。核酸は
また、当該分野で周知の化学合成法に従って生成され得る。
【００４９】 適切な供給源からテンプレート核酸を得た後、この核酸（図１６、８０）は、
カオトロピック剤を含有する溶液に再懸濁および／または溶解される（図１５、
工程２、および図１６、８２）。このカオトロピック剤は、望ましくは、核酸の
可逆性結合を達成するが、本発明の実施の際にこの溶液が供される全ての条件下
で、この溶液から核酸またはカオトロープ自体が沈殿しないような、十分に高い
濃度（例えば、約０．５Ｍ〜８．０Ｍ）にある。
【００５０】 カオトロピック剤は、水の局部構造に対して物質の有する分裂効果に起因して
、分子を非水相から水相に分配する物質である。カオトロピック剤は、カオトロ
ピックイオンの塩であり、そして水溶液に対して高溶解性である。水溶液中の十
分な高濃度において、このような塩から提供されるカオトロピックイオンにより
、核酸は二次または三次構造を失い得、そして二本鎖核酸は溶解し得る（すなわ
ち、鎖分離）。カオトロピックイオンは、水中に存在する水素結合の網目構造を
破壊することによって、そのような効果を有し、典型的な水性環境に存在するよ
り高次な構造体（例えば、二重らせん）の構造と比較して、核酸の変性形態をよ
り熱力学的に安定にし得ると仮定される。
【００５１】 Ｖａｇｅｌｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
７６，６１５−６１９（１９７９）、およびＣｈｅｎおよびＴｈｏｍａｓ、Ａｎ
ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０１，３３９−３５１（１９８０）によって以前に記
載されたように、十分に高濃度（例えば、約０．５Ｍ〜約８．０Ｍ）のカオトロ
ピックイオンの存在下において、核酸は、特定の物質（例えば、シリカ）に可逆
的に結合する。シリカへの核酸の結合のメカニズムは、負電荷のシリカの表面に
おける、水の構造のカオトロピックイオン破壊に関連し得、これにより、このシ
リカと、核酸鎖の負に荷電したリン酸骨格との間にカチオン（例えば、Ｎａ+ま
たはＫ+）媒介性の塩橋が形成され得る。核酸シリカ結合を達成するために、カ
オトロピック剤が、単独でかまたは２つ以上のカオトロープの混合物として使用
され得る。この塩橋は、永久的な結合ではなく、この結合の近位におけるイオン
濃度が低下した場合、崩壊し得る。このように、核酸は、水または他の適切な低
イオン強度の水性緩衝液を用いて、シリカまたは同様の材料から溶離され得る。
【００５２】 カオトロピックイオンとしては、グアニジニウム、ヨウ化物イオン、過塩化物
イオンおよびトリクロロ酢酸イオンが挙げられる。カオトロピック塩としては、
過塩素酸ナトリウム、過塩素酸カリウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム、ヨウ
化ナトリウム、ヨウ化カリウム、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウ
ム、チオシアン酸グアニジン、イソチオシアン酸ナトリウム、イソチオシアン酸
カリウム、塩酸グアニジン、イソチオシアン酸グアニジン、塩化リチウム、トリ
クロロ酢酸ナトリウム、およびトリクロロ酢酸カリウムが挙げられる。カオトロ
ピック特性を有する他の物質としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、尿
素、およびテトラアミンハライド（テトラエチルアミンクロリドを含む）が挙げ
られる。
【００５３】 カオトロープの溶液に核酸を溶解した後、この核酸−カオトロープ溶液（図１
６、８３）を、反応チャンバに導入する（図１５、工程３、および図１６、１２
）。
【００５４】 配列決定反応を行うために使用される試薬のコストを減少する目的のため、反
応チャンバは、典型的に、非常に小さい容積、望ましくは約１〜１０００ナノリ
ットル（ｎｌ）、より望ましくは約１０〜５００ｎｌ、最も望ましくは約１００
〜５００ｎｌである。
【００５５】 最適な場合において、この反応チャンバは、毛管作用を利用することによって
、溶液がこの反応チャンバに受動的に導入され得るように構成される。毛管作用
は、液体が固体（例えばチューブの側面）に接触している場合に、この液体の上
昇が起こり、そしてキャピラリーチューブ（すなわち、非常に小さい直径のチュ
ーブ）において最も顕著である現象である。毛管作用は、チューブの側面の表面
張力および濡れにより生じる力に依存する。液体の固体（濡れている）への接着
力が、この液体内の粘着力（表面張力）を超える場合、この液体はチューブを上
昇する（すなわち、この液体は静水レベルより上に上昇する）。あるいは、溶液
は、例えば、陽大気圧または負大気圧を使用するポンピングによって、反応チャ
ンバに能動的に導入され得る。
【００５６】 反応チャンバに核酸−カオトロピック溶液を充填するために毛管作用を利用す
ることは、最も簡単かつ最も経済的であり、この場合、キャピラリーチューブは
反応チャンバとして働く。キャピラリーの穴が既知の均一な表面断面積を有する
場合、このチューブの容積は容易に算出され、その長さに対して直線的に比例し
ている。従って、所定の総容積のキャピラリーチューブ反応チャンバは、チュー
ビングを計算によって与えられる所望の長さに切断することによって得られ得る
。しかし、流体力学の法則に従って、流体の密度はそれほど大きくなく、その表
面張力はあまりに小さく、そしてチュービングの直径の小ささが不十分であるた
め、溶液の円柱は重力に打ち勝ち得ず、従ってこのチューブが充填され得ないこ
とに注意しなければならない。
【００５７】 充填中、チューブの一端は核酸−カオトロピック溶液（図１６、８３）に浸漬
され、この溶液は、充填される任意のチューブの総容積を超える容積で通常備え
られる。このように、このチューブは、一工程で充填され、入口における気泡形
成の機会を減少させる。このキャピラリーの反対端は開かれるか、またはそうで
なければ、空気を充填チューブから逃し得なければならない。
【００５８】 反応チャンバの外側は、キャピラリーチューブの場合のように、高く薄い円柱
の形態に近いことは必須ではない。むしろ、当業者に理解されるように、キャピ
ラリーチューブの機能的等価物が、様々な様式で製造され得る。本明細書全体に
わたって、用語、キャピラリーチューブは、一般にキャピラリーチューブと称さ
れる構造だけではなく、その機能的等価物である任意の構造もまた表すことが理
解されるべきである。例えば、毛管作用、または幾分かの力（例えば、陽圧もし
くは負圧、または遠心力）の直接付与によって、流体が充填され得るように構成
されるトンネル、チャネルまたは溝が形成され得る。このトンネル、チャネルま
たは溝は、機械的、化学的、熱的または当業者に公知の他の手段によって形成さ
れ得る。チャネルまたはトンネルは、例えば、ドリルビット、レーザーまたは化
学エッチングを使用して、マトリクスから材料を除去することによって形成され
得る。
【００５９】 図３Ｅに例示されるように、基板７２（例えば、任意の形状および寸法のガラ
ススライド）の表面にある溝またはチャネル７８は、鋸で切断されるか、または
レーザー切断または化学エッチングによって形成されて、チップまたはマイクロ
チップ７０と呼ばれる構造体を生成し得る。例えば、シリコンウェハの溝は、当
該分野で公知の写真平板方法によって形成され得、そしてガラススライドの溝は
フッ化水素酸を使用してエッチングされ得る。
【００６０】 溝または同様の凹部７８が基板７２の表面に形成される場合、通常、この溝ま
たは凹部７８をカバー７４でカバーして、囲まれた空間を形成することが有利で
ある。この溝または凹部７８をカバーすることは、毛管作用と相互作用し、それ
によりこれを促進させる流体の最大表面積が存在し、混入物が反応物と接触する
機会を最小にし、蒸気バリアを生成することを保証して、反応温度の任意の上昇
の間（例えば、熱サイクルの間）、反応物が気化する傾向が最小化されることを
保証する。
【００６１】 カバー７４（これは、溝が切断されている基板７２の材料と同一であるかまた
は異なる材料から構成され得る）は、当該分野で公知の様々な手段を使用して適
用され得る。例えば、カバー７４は、エポキシ接着剤、シアノアクリレート接着
剤、または他のタイプの接着剤を使用して、基板に接着され得る。このカバーは
、この接着剤および下にある材料を、それらが融けるまで、熱または光の付与に
よって融解することによって溶接され得る。カバー７４はまた、例えば、クラン
プを用いて機械的にか、またはさらに磁気的に適所に固定され得る。
【００６２】 反応チャンバを構成する材料は、有利には、テンプレートＤＮＡまたは他の核
酸が、十分に高濃度のカオトロピックイオンの存在下で可逆的かつ過飽和的に結
合する材料である。頻繁には、この反応チャンバは、特にキャピラリーチューブ
として構成される場合、ガラスから構成される。高品質のガラスキャピラリーチ
ュービングは、Ｐｏｌｙｍｉｃｒｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｐｈｏｅｎｉ
ｘ、Ａｒｉｚｏｎａ，ＵＳＡ）を含む様々なメーカーから、ある範囲の内部寸法
で容易に入手可能である。
【００６３】 ガラスのような脆性の親水性材料から構成する場合、このキャピラリーチュー
ブの外側を、ポリマー材料（例えば、ポリイミド）でコーティングすることが有
利であり得る。ポリイミドコーティングは、曲げによる摩耗および破壊から、こ
のキャピラリーチューブを保護する保護層を提供する。ポリイミドはまた、キャ
ピラリーの外面上に疎水性層を生成し、この疎水性層は、キャピラリーを反応混
合物に浸漬する（これは、試薬の廃棄を防止するのを助ける）ことによってキャ
ピラリーが充填された場合、水性反応混合物の接着を防止するのを助け得る。他
の可能なコーティングは、アクリレート、シリコーン、フルオロポリマー、およ
びアルミニウムである。
【００６４】 多くのタイプのガラスが、使用され得、これには、アルカリ−ホウケイ酸ガラ
ス、アルミナ−ケイ酸ガラス、バリウムフリントガラス、バリウム−ホウ酸ガラ
ス、ホウケイ酸ガラス、Ｂ2Ｏ3を含有するホウ酸ガラス、ＧｅＯ2を含有するゲ
ルマニウム酸化物ガラス、カルコゲニドガラス、ＳｉＯ2を含有するケイ酸ガラ
ス、シリカガラス、溶融シリカガラス、合成溶融シリカガラス、石英（結晶性Ｓ
ｉＯ2）、溶融石英（非晶質ＳｉＯ2）、ドープ合成溶融シリカ（微量の元素（例
えば、ゲルマニウム、フッ素、臭素、リンおよびチタン）でドープされている）
、ランタンガラス、光学ガラス、リン酸塩ガラス、およびソーダ石灰ガラスが挙
げられる。
【００６５】 あるいは、反応チャンバは、金属材料、またはガラスのような、キャピラリー
またはウェハに成形され得る半金属材料から構成され得る。適切な純金属または
合金には、マグネシウム、アルミニウム、チタン、バナジウム、クロム、マグネ
シウム、鉄、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛、ガリウム、ジルコニウム、ニオブ
、モリブデン、パラジウム、金、銀、コバルト、ニオブ、インジウム、ロジウム
、スズ、鋼、ステンレス鋼、および青銅が挙げられる。適切な純非金属または合
金非金属には、シリコン、ゲルマニウム、砒素、およびガリウム砒素が挙げられ
る。
【００６６】 反応チャンバはまた、複数の同素体の炭素（グラファイト、ダイアモンド、Ｃ 60 、および例えば、ナノチューブを含む関連の同素体を含む）から構成され得る
か、またはプラスチックのような有機化合物から構成され得る。これらの材料に
ついて、カオトロピックイオンの存在下で、プラスチックへの核酸の可逆的結合
を支持するような様式で、炭素またはプラスチックを誘導体化する必要があり得
る。
【００６７】 反応チャンバ（例えば、ガラスキャピラリー）（図１６、１２）が、核酸−カ
オトロピック溶液８３で充填された後、この溶液は、溶液中のＤＮＡの少なくと
も一部分が、チャンバまたはチューブの内面（図１６、８２）に可逆的に結合す
るような時間および条件下で、インキュベートされる（図１５、工程４）。他の
実施形態において、不可逆性結合が達成され得る。
【００６８】 理論に縛られることを望まないが、上記のように、内面がＳｉＯ2（シリカ）
を含有するガラスである場合、十分に高濃度のカオトロピックイオンの存在下で
、核酸は、リン酸骨格を介してシリカと最もよく塩橋型結合を形成するようであ
ると考えられる。通常、結合は、ほぼ室温（約２４℃）で進行し得るが、結合の
効果が有意に妨害されない限り、かつＤＮＡもカオトロープもこの溶液から沈降
しない限り、他の温度が適切であるとして選択され得る。
【００６９】 核酸−カオトロープ溶液中の核酸が、反応チャンバまたはチュービングの内面
８２に結合する機会を有した後、未結合のＤＮＡおよびカオトロープを含有する
溶液は、次いで除去され（５）、内面は洗浄溶液で洗浄され（６）、次いで、こ
の洗浄溶液の残りの微量の液体が、乾燥によって除去される（７）。
【００７０】 陽空気圧または負空気圧の付与を含む様々な手段によって、または溶液を放出
する遠心法によって、より多くの割合の核酸−カオトロープ溶液が、チャンバか
ら除去される。
【００７１】 過剰の結合していない核酸、カオトロピック剤、および核酸で汚染され得た任
意の不純物を除去することによって結合した核酸を精製するために、洗浄を実施
する。カオトロピック剤を除去することは重要である。なぜならば、これらのイ
オンは、ほとんどの続く化学的反応および生化学的反応を、非常に低い濃度でさ
え激しく妨害し得るからである。種々の方法で、洗浄を実施し得る。例えば、キ
ャピラリーチューブを毛管作用により充填し得、その後、この洗浄液を同様の様
式で排出し、この様式によって核酸カオトロピック剤を除去する。あるいは、反
応チャンバを、洗浄溶液を汲み上げることによって充填しそして空にし得る。全
ての汚染の存在を本質的に排除するに十分な体積の洗浄溶液を使用する。洗浄後
、洗浄溶液を、このチャンバまたはチューブから除去する。
【００７２】 洗浄溶液の組成物は、チャンバまたはチューブの内部表面に結合してしまった
核酸の任意の実質的な部分を溶出することでは除去されないように選択され、そ
して代表的には、純水を含むアルコール溶液である。適切なアルコールとしては
、低分子量のアルコールである、メタノール、エタノールおよびイソプロパノー
ルが挙げられる。アルコールの濃度は、核酸の溶出が最小となるように十分高濃
度であり、そして好ましくは、少なくとも５０容量％、より好ましくは少なくと
も６０容量％、そして最も好ましくは少なくとも７０容量％である。代表的に、
約７０容量％〜８０容量％よりも高い濃度のエタノールが、使用される。
【００７３】 洗浄溶液はまた、塩、好ましくは、緩衝液の形態（例えば、酢酸緩衝液、また
はトリス−ＥＤＴＡ緩衝液（例えば、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌおよび１ｍＭ
のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ｐＨ８．０を含む）を含み得る。この
塩は、ｐＨが約６．５〜８．５の範囲にあるようにｐＨを緩衝する効果、および
また、洗浄の際にチャンバまたはチューブのＤＮＡと内部表面との間の結合相互
作用を安定させる効果を有し得る。
【００７４】 チャンバまたはキャピラリーチューブに残っている任意の少量の洗浄溶液に由
来する全ての微量の液体を、乾燥により本質的に除去することが頻繁に所望され
る。この液体（例えば、エタノール）の低濃度のいくつかの成分は、続く生物学
的反応と有意に干渉する傾向はないが、より高濃度では、干渉し得る。液体を蒸
発させそして除去するに十分な高い真空状態まで、チャンバまたはチューブを供
することによって、乾燥は、達成され得る。あるいは、乾燥ガス（例えば、空気
、窒素またはアルゴン）を、チャンバまたはチューブを通過する圧力にさせてこ
とで、液体の蒸発を促進し得る。この乾燥ガスを、蒸発をさらに促進するために
温かくし得る。
【００７５】 乾燥の後に、反応チャンバ（ここでは、固定化核酸を可逆的に有する）を、核
酸との生物学的な反応を実施するため即座に使用するか、またはさらなる使用の
ために適切な条件下で保存し得る。上記の工程に従って調製した反応チャンバは
、並行反応において使用されるべき核酸の量を正規化し、基板上の所定の量のＤ
ＮＡまたはＲＮＡを分配し、そしてナノスケールのＤＮＡ配列決定反応ならびに
ＤＮＡおよびＲＮＡとの他の多くの型の反応を実施するために、有利に使用され
得る。しかし、当業者にとっては明瞭なことであるように、これらの特定の適用
は、このような反応チャンバを配置し得るための使用の範囲を限定するものとし
て理解されるべきではない。
【００７６】 （自動化システムにおける本発明の使用） キャピラリーチューブの形態における反応チャンバは、図１５に例示されるよ
うに処理され、かつ単独で使用され得るが、特に、自動化システムにおいて、サ
ンプルのスループットを増加し得るように、並行様式で複数のキャピラリーチュ
ーブと組合せることは、しばしば利点がある。この目的のために、キャピラリー
チューブは、キャピラリーカッセット中に便利に組み込まれ；１つのカセット当
たりのキャピラリーチューブの密度が上昇するにつれて、サンプルのスループッ
トの能力も上がる。装置（例えば、同時係属中の米国出願番号第０９／５７７，
１９９に記載される装置）は、図１に例示される処理工程、および固定化核酸と
の反応を実施することに関連する任意の続く工程（キャピラリーの充填化、未充
填化、洗浄、乾燥、および／または熱サイクルを含む）を自動化するために使用
され得る。この方法を使用して、このカセットは、自動化された固定化容積平行
（並列）ピペッター（ｆｉｘｅｄ−ｖｏｌｕｍｅ ｐａｒａｌｌｅｌ ｐｉｐｅ
ｔｔｏｒ）となり、全てのキャピラリーチューブが、キャピラリーの作用によっ
てサンプルプレートのウェルから同時に充填されるのを可能にする。
【００７７】 キャピラリーカッセット１５を、図３Ａに示す。このキャピラリーカセットは
、基板１０を通過して延びる複数のキャピラリーチューブから構成される。好ま
しくは、このキャピラリーカッセットは、少なくとも１列に８本のキャピラリー
チューブを有し、そしてこのキャピラリーカセットは、等間隔を有する。示され
るキャピラリーカセットは、８×１２のアレイで配列された９６個のキャピラリ
ーチューブを備える基板１０を有し、このチューブの間隔は、９６ウェルマイク
ロプレートのウェルの間隔と一致する。
【００７８】 このキャピラリーチューブ１２は、基板１０を通過して延び、そして好ましく
は、均一なパターンで配列される。このキャピラリーチューブは、同じ長さであ
り、そして実質的に平行方向にこの基板を通過して延びる。その結果、このキャ
ピラリーチューブ１２の両端の二ヵ所の各々は同一平面上にあり、そしてキャピ
ラリーチューブ１２の末端によって規定されるプレートは、基板１０に対して実
質的に平行である。このキャピラリーチューブの間隔は、均一であり得、そして
マイクロプレート上のウェルの中心間の間隔と一致するように選択され得る。例
えば、標準的な９６ウェルのマイクロプレート上において、このキャピラリーチ
ューブは、９ｍｍの中心間の間隔を有するように配列され、３８４ウェルマイク
ロプレートにおいて、このキャピラリーチューブ１２は、４．５ｍｍの中心間の
間隔を有するように配列される。１５３６ウェルマイクプレートに適合する、よ
り高度に密集したキャピラリー形式またはなおさらに高度に密集したウェルを有
するプレートがまた、可能であるべきである。このキャピラリーチューブ１２は
、好ましくは、基板内で固定され、基板１０の一方向から延びるキャピラリーチ
ューブ１２の長さは、基板１０の反対方向のキャピラリーチューブの長さよりも
短い。この基板のより短い方のキャピラリーチューブ１２の長さは、マイクロプ
レートのウェルの深さと一致し得る。その結果、より短い方の長さは、マイクロ
プレートのウェルの深さよりも短い長さである。この特徴により、このキャピラ
リーカッセットが、マイクロプレートに挿入されることを可能にし、その結果、
基板１０は、マルチウェルプレートの頂部の縁に接して静止し、そして基板の一
方向のキャピラリーは、底部と接触することなくマルチウェルプレートの方へ延
び得る。例えば、９６ウェルマイクロプレートにおいて、キャピラリーチューブ
は、基板に配置され、その結果、基板から延びるキャピラリーチューブのより短
い方は、キャピラリーがウェルの底部と接触することなく、マイクロプレートの
ウェルに挿入され得る。このことは、ウェルに分配された液体が、キャピラリー
に再び入るのを防止するために、キャピラリーから取り除かれることを保証する
。
【００７９】 キャピラリーカセットの基板１０は、ファイバーグラスボードまたは他の剛性
材料もしくは半可撓性材料から作製され得る。このキャピラリーチューブ１２は
、基板において等しく配置された穴を通過して挿入され、そして接着剤で固定さ
れ得る。１実施形態において、基板の長さおよび幅は、標準的な９６ウェルマイ
クロプレートの長さおよび幅と同一である。このことは、キャピラリーカセット
を取り扱うためのマイクロプレートの操作用に設計された、自動化システムの適
用を単純化する。
【００８０】 （生物学的な反応に使用するための、核酸の量の正確な制御および正規化） 核酸との生物学的反応の実施を行う場合、添加した核酸の量を正確に知ること
が、反応の成功のためにしばしば重要である。このことにより、実験者が、他の
反応成分（例えば、酵素）の適切な比率を適切に計算することを可能にする。例
えば、背景の節で議論したように、過剰のテンプレートＤＮＡを、キャピラリー
電気泳動システムを用いて分析される配列決定反応に使用する場合、乏しい量の
配列決定データがしばしば得られる。ストック（貯蔵）サンプル中の核酸の濃度
は、２６０ｎｍにおける光吸収を測定することまたは標準曲線と比較して色素結
合の量を測定することによって比較的容易に決定される。しかし、これらのアプ
ローチの両方は、このサンプルの一部を使い果たし、そしてこれらのアプローチ
のいずれも、ハイスループットサンプル処理システムの状況において実行するが
容易ではない。幸運なことに、本発明は、種々の適用に使用されるべき核酸の量
を正確に制御するために有用である。
【００８１】 結合反応が反応チャンバ中で生じる間に、核酸−カオトロピック溶液が、十分
な時間、チャンバまたはチューブの内部表面と接触させる場合、および核酸が、
溶液中で十分高い濃度である場合、チャンバまたはキャピラリーの内部表面上の
利用可能な結合部位を核酸で飽和することが可能である。このことは、飽和性結
合として公知である。インキュベーションの前に溶液中の核酸の量が、チャンバ
の内部表面の結合能力を超える限り、核酸の固定した最大量は、最初の溶液中の
核酸の量に関係なく、固定される。この方法において、溶液中の核酸の濃度が、
最小値を超える場合、実際の濃度を知ることは必要でなく；核酸の結合の量は、
単に反応チャンバの結合能力によって決定される。従って、飽和結合したキャピ
ラリーチューブ中の核酸が既知の液体の容積中に溶出される場合、液体中の核酸
の濃度および量は、高い程度の精度に近づく。
【００８２】 従って、キャピラリーチューブまたは他の形状の反応チャンバの結合能力に基
づいて、正確に公知の少ない一貫した核酸の量を得るため、または測定するため
に、本発明を使用することが可能である。例えば、１０ｎｇの核酸を使用して反
応を実施することが所望される場合、総量で１０ｎｇの核酸結合能力を有する、
キャピラリーチューブ、または他の反応チャンバを得ることのみが、必要である
。次いで、このキャピラリーは、核酸カオトロピック溶液で充填される。ここで
、核酸およびカオトロピックの両方は、合理的な時間で飽和結合を支持するのに
十分高濃度である。インキュベーション、未充填化、洗浄および乾燥工程が完了
した後、実験者は、キャピラリーが、分配のために溶出され得るか、または将来
の使用のためにキャピラリー中に残したままにされ得る、１０ｎｇの核酸を含む
ことを確信する。
【００８３】 代表的に、結合能力、または内部表面に飽和的に結合され得る核酸の量は、経
験的に決定される。例えば、既知量の試験核酸は、当該分野で公知の方法に従っ
て、35Ｓ、33Ｐまたは32Ｐのような放射性核種で標識される。標識化後、標識化
核酸の比活性を決定して、核酸の単位質量または単位濃度につき、１分間当たり
の崩壊比を決定する。次いで、標識化核酸を、所定の濃度でカオトロピックイオ
ンを含有する溶液中に溶解させる。次いで、標準的な反応チャンバ（一般供給源
の代表物）を試験する。例えば、ガラスキャピラリーチューブを所定の長さで切
断し、そして標識化核酸カオトロピック溶液で充填する。過飽和結合が生じるの
に十分な時間後に、このキャピラリーを空にし、そして洗浄する。次いで、チュ
ーブ内に保持される放射能の量を測定し、そして標識化の比活性の知識を用いて
、核酸の量に変換する。次いで、結合のための同様の条件が、続く任意の実験に
おいて使用される限り、この因子が、同じロットから切断された任意の長さのキ
ャピラリーチューブに保持される核酸の量を計算するために使用され得る。
【００８４】 所定の核酸の量を正確に得るために本発明を使用する利点は、続く使用のため
に核酸の量を正規化することである。多くのサンプルを処理するために必要であ
る場合、この利点は、特に重要である。例えば、当該分野の現状において、配列
決定のために異なるテンプレートＤＮＡを調製する場合、テンプレートの濃度が
同じであることを保証することは実際的ではない。従って、先行技術の方法に従
うと、各調製においてＤＮＡの濃度を別個に決定することによって、ならびに各
サンプルおよび全てのサンプルごとに適切な濃度までＤＮＡを希釈することによ
って、異なるテンプレートＤＮＡサンプルを正規化することが必要であった。テ
ンプレートＤＮＡでキャピラリーを充填する技術の感度のために、このことは、
キャピラリー電気泳動にために特に重要である。テンプレートＤＮＡの正規化の
ために必要なことは、このシステムを使用する多量のＤＮＡ配列データを得るた
めに十分な時間および費用をかけることであり、研究員が増加した失敗の確率を
受け入れることが必要とされる。
【００８５】 しかし、本発明は、非常に迅速な正規化で、初期テンプレート濃度の差異を最
小限にすることを可能にする。所定の濃度まで異なるテンプレートを正規化する
ために、公知の飽和ＤＮＡ結合能力を有する機能的に等価なキャピラリーチュー
ブ（各テンプレートに対応するチューブ）、ならびに合理的な時間内でこのキャ
ピラリーにおけるＤＮＡ結合部位の全てを占有するに十分高濃度のＤＮＡおよび
イオンの両方を含む、テンプレートＤＮＡ−カオトロピック溶液を提供すること
のみが、必要である。未充填化および洗浄の後、全てのキャピラリーは、おおよ
そ同一の量のテンプレートＤＮＡを含み、それにより、正規化される。
【００８６】 当業者に明らかであるように、反応チャンバ内の可能な全ての核酸結合部位を
飽和状態にすることが所望されない場合、可逆的に結合される核酸の量を制御す
ることが可能である。結合反応速度論は、複数の変数（核酸の濃度、核酸の平均
分子サイズ、溶液のｐＨ、カオトロピックイオン濃度、反応チャンバの内部表面
上の利用可能な結合部位の数、および温度が挙げられる）に依存するので、この
制御が可能である。従って、経験的な分析により、反応チャンバ内の全ての利用
可能な核酸結合部位を飽和状態にしない核酸の所定の量の、一貫した予測可能な
可逆的結合を生じる、結合条件を確立することは、当業者に可能である。
【００８７】 （キャピラリー電気泳動でのＤＮＡ配列決定） 本発明の利点は、ＤＮＡ配列決定反応（特に、ＭｅｇａＢＡＣＥTMのような高
感度のキャピラリー電気泳動システム用いる分析）を実施するのに有利に適用さ
れる。ＤＮＡ配列決定に本発明を使用するために、テンプレートＤＮＡを、キャ
ピラリーチューブ、またはその機能的に等価なもので固定化しなければならない
。テンプレートＤＮＡは、このＤＮＡについて成分塩基の配列が決定されるＤＮ
Ａである。テンプレートＤＮＡは、一本鎖、または二本鎖であり得、ここで、２
本の相補的ＤＮＡ鎖は、共にハイブリダイズされ、そして一方の鎖の配列の情報
を、ワトソン−クリック塩基対の相補性の規則に従って、他方の鎖の塩基の配列
を推測するために使用し得る。
【００８８】 配列決定されるＤＮＡフラグメントがクローン化される宿主中で増加したテン
プレートＤＮＡは、代表的に、自己複製遺伝系から直接的に得られる。あるいは
、このテンプレートは、ポリメラーゼ連鎖反応、または機能的に等価な直線的（
ｌｉｎｅａｒ）増幅プロセスまたは指数的（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ）増幅プロ
セスを使用して特定のＤＮＡ配列を増幅することによって任意の供給源から得ら
れ得る。
【００８９】 自己複製遺伝系は、複製起点を含むプラスミド、またはバクテリオファージ（
例えば、λまたはＭ１３）のようなエピソームエレメントを含み、この両方は、
それぞれ形質転換または感染の後に、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）内で複製さ
れ得る。テンプレートＤＮＡを保有するプラスミドは、細菌を破壊して開口し（
このプラスミドは、十分に多いコピー数まで複製される）、そしてその上清から
プラスミドを単離することによって得られる。宿主細菌の溶解後に、細菌培地の
上清に放出されるバクテリオファージを採取し、そしてＤＮＡを、バクテリオフ
ァージ粒子を破壊して開口することにより単離した。哺乳動物細胞の哺乳動物の
複製起点を含むエピソーム因子を増大させ、続いて、Ｈｉｒｔ法に従ってＤＮＡ
を単離することがまた可能である。
【００９０】 ゲノムＤＮＡと比較する場合、プラスミドＤＮＡまたは他のエピソームＤＮＡ
との間の分子の質量の実質的な差異に起因して、反応チャンバのようなキャピラ
リーチューブの使用は、その両方が、細菌または他の型の細胞を溶解した後に放
出される場合に、汚染しているゲノムＤＮＡからプラスミドＤＮＡを迅速に精製
することによる従来の方法を提供する。手短には、プラスミドＤＮＡおよびゲノ
ムＤＮＡの混合物は、カオトロピックイオンの溶液中に混合される。プラスミド
が好ましく固定化されるキャピラリーは、溶液中に浸される。このプラスミドの
小さな質量のために、プラスミドは、キャピラリーに充填される場合、キャピラ
リーの穴を容易に通過し、これにより、ガラス壁と相互作用し、塩橋を確立し、
そして固定化される。それに対して、ゲノムＤＮＡは、極度に大きな分子質量を
有するので、キャピラリーの小さな穴から排除され、従って、サイズ排除によっ
てプラスミドと分離される。
【００９１】 示したように、テンプレートＤＮＡはまた、適切な供給源（例えば、ウイルス
、原核生物細胞（細菌を含む）、または真核生物細胞（哺乳動物、他の動物、も
しくは植物を含む）から直接、ＤＮＡフラグメントを増幅することによるクロー
ニング工程を必要とせずに得られ得る。
【００９２】 テンプレートＤＮＡ（図１６ ８０）を、本発明の方法に従ってガラスキャピ
ラリーチューブ１２の内部表面８２に直接可逆的に固定した後、キャピラリーを
、ＤＮＡ配列決定反応をもたらす配列決定反応混合液８４で満す。この反応を、
当該分野で周知の技術に従って実施し、これによってＤＮＡ配列決定反応産物は
、蛍光色素で標識される。サンガージデオキシヌクレオチド鎖終結技術は、当該
分野において十分に確立されている。簡潔には、テンプレートＤＮＡ分子におけ
る配列に相補的なプライマーは、このテンプレートにハイブリダイズすることを
許容される。次いで、ＤＮＡポリメラーゼは、成長しているプライマーの３’末
端にｄＮＴＰを付加することによってテンプレート中の塩基の配列を読むことに
よってプライマーを伸長する。しかし、対応するｄＮＴＰに特徴的なヒドロキシ
ル基を欠失するジデオキシヌクレオチド三リン酸は、成長している鎖に塩基をさ
らに付加することを妨害する。結果として、この鎖は終結する。クロマトグラム
において終結鎖のパターンは、実験者によるこのテンプレートにおける塩基配列
の推測を許容する。終結反応産物は、伸長するプライマーに蛍光団を結合するか
、または成長しているＤＮＡ鎖に取り込まれた場合、プライマー伸長の終結を生
じる全てのジデオキシターミネーターに蛍光団を結合するかのいずれかによって
蛍光的に標識される。
【００９３】 近年、エネルギー移動の使用、光アクセプター色素および蛍光エミッター色素
からなる色素結合蛍光団系が、レーザースキャン配列決定系の性能を改善させた
。各々のジデオキシターミネーターは、２つの色素を用いて標識される。これら
の色素のうち１つ（フルオレセイン）は、配列決定機器のレーザーにより生成さ
れる入射レーザー光から光エネルギーを吸収し、そして無放射エネルギー移動を
介して収集されたエネルギーをアクセプター色素へ移動する。４つの鎖ターミネ
ーター（ｄｄＧ、ｄｄＡ、ｄｄＴ、およびｄｄＣ）の各々は、フルオレセインド
ナーと結合される異なるアクセプター色素を有する。次いで、このアクセプター
色素（例えば、ローダミン１１０、ローダミン−６−Ｇ、テトラメチルローダミ
ン、およびローダミンＸ）は、それらの特徴的な波長の光を放射する。この蛍光
は、終結事象の原因であるヌクレオチドの同定を可能にする機器によって検出さ
れる。エネルギー移動系の使用は、レーザーによる直接の励起よりもアクセプタ
ー色素のより効果的な励起を生じ、高感度を生じる。ジデオキシターミネーター
の蛍光標識の代替として、配列決定プライマーを標識することが可能である。こ
の系を用いる場合、エネルギー移動色素は、同様に、プライマーにドナー色素お
よびアクセプター色素を結合することによって用いられ得る。プライマーに結合
されるドナー色素の例は、５−カルボキシ−フルオレセイン（ＦＡＭ）であり、
そしてプライマーに結合されるアクセプター色素の例は、シトシンについてはロ
ーダミン１１０（Ｒ１１０）、アデニンについては６−カルボキシローダミン（
ＲＥＧ）、グアニンについてはＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−５−カルボ
キシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、およびチミンについては５−カルボキシ−Ｘ−
ローダミン（ＲＯＸ）である。エネルギー移動色素結合蛍光団系は、公表された
米国特許第５，６８８，６４８号、同第５，７０７，８０４号、同第５，７２８
，５２８号、同第５，８５３，９９２号、同第５，８６９，２５５号、および同
第６，０２８，１９０号（これら全てが、それらの全体が本明細書中に参考とし
て援用される）においてより詳細に議論されている。
【００９４】 固定されたテンプレートＤＮＡ８０を含むキャピラリー（図１６ １２）は、
反応混合物で満たされたリザーバ８５にキャピラリーを浸すことによる毛管作用
によって満たされる。この反応混合物８４は、配列決定反応をもたらすのに適切
な濃度で全ての成分を含み、これには、水、塩、緩衝液、プライマー、ＤＮＡポ
リメラーゼ、ｄＮＴＰおよびジデオキシターミネーターが含まれている。理論に
拘束されることを望まないで、現在、水性混合物がキャピラリーを登ると、固定
ＤＮＡは、おそらく再水和すると仮定されている。さらに、混合物における塩の
イオン強度が比較的低いので、ＤＮＡを固定し得る塩橋が、水分子によって破壊
され、そしてこのＤＮＡは、キャピラリーの内表面から溶出され、そして反応混
合物中に拡散する。あるいは、またはさらに、このＤＮＡは、熱サイクル反応の
間に脱着する。いかなる機構でも、混合物へのＤＮＡの物理的な混合は、反応の
実行には必要ない。
【００９５】 一旦、キャピラリーが満たされると、その末端は、液体を含有している内側の
気化を防ぐためにシールされ、続いて、複数回の配列決定反応を活性化するため
に熱サイクルを行った。その結果、分析される蛍光標識された産物が生成される
。キャピラリーのシールおよび熱サイクルは、当業者に明らかなように、複数の
方法で達成され得る。よくあるように、並行に複数の配列決定反応を実行するこ
とを望む場合、実施者は、ハイスループット装置（例えば、同時係属中の米国特
許出願第０９／５７７，１９９号（これは、その全体が本明細書中に参考として
援用される）に開示される装置）を使用し得る。開示された装置は、カセット形
式で配置した複数のキャピラリーチューブをシールする手段およびそのキャピラ
リーに含まれる配列決定反応混合物の熱サイクルを達成する手段の両方を提供す
る。
【００９６】 配列決定が完了した後、その反応産物は、そのキャピラリーチューブから排出
される（代表的には、キャピラリー電気泳動による分析のための調製において）
。
【００９７】 代表的に、この反応産物は、基板上にか、またはキャピラリー電気泳動系が、
分析のためにこの産物をサンプリングし得る液体のためのホルダーのいくつかの
形式（例えば、マイクロタイター皿のウェル）中に排出される。しかし、当業者
は、反応産物が、この反応キャピラリーから電気泳動キャピラリーへ直接排出さ
れ得ることを理解する。反応産物は、遠心力の適用によって、動電学的に正また
は負の気圧の適用によって、あるいは当該分野で公知の他の手段によって反応キ
ャピラリーから排出され得る。
【００９８】 さらに、反応産物は、分析的な処理の他の型に適合された基板（例えば、質量
分析のためのＭＡＬＤＩ（マトリックスアシスティドレーザーデソープション／
イオン化）またはＳＥＬＤＩ（表面増強レーザーデソープション／イオン化）の
基板）上に排出され得る。
【００９９】 蛍光標識された配列決定反応産物の電気泳動中、レーザーは、その産物を有す
るキャピラリー中の窓をスキャンし、そして蛍光団を励起する。発光団による発
光は捕獲され、そしてコンピューター記憶装置中に保存される強度および光周波
数データに変換される。スキャニングおよびリーディングが完了した後、コンピ
ューターは、スキャニングシステムによって検出される全ての反応産物を示すク
ロマトグラムをアセンブルする。このクロマトグラムにおけるデータは、出発テ
ンプレートＤＮＡにおけるヌクレオチド塩基の配列を推測するためにこのクロマ
トグラムを翻訳するコンピューターソフトウェアによって処理される。次いで、
配列出力は、ランダムアクセス記憶装置中か、専用長期記憶デバイス（例えば、
フロッピー（登録商標）ディスク、ＺＩＰディスク、ＪＡＺディスク、ハードデ ィスク、ＣＤ−ＲＯＭ、コンピューターテープなど）かのいずれかのコンピュー ターデータファイル中に保存される。このデータのエンドユーザーの利便性のた めに、配列データを含むコンピューターファイルが、リモートクライアントコン ピューターからアクセスされ得るコンピューターサーバー上に保存され得る。こ のファイルが転送される場合、これは、銅線、光ファイバー電話線、ケーブルテ レビ線を介して、または電波によって運ばれる搬送波と関連するデータ信号とし て示される。
【０１００】 一旦、空になったら、このキャピラリーチューブは、配列決定される新しい核
酸サンプル（例えば、ＤＮＡテンプレート）の固定のためにリサイクルされる。
このチューブのリサイクルは、以前の反応の有害な痕跡（反応産物、反応混合物
成分および固定された核酸）を除去するために洗浄することを必要とする。
【０１０１】 代表的に、洗浄溶液は、任意の残存している固定核酸を溶出および運び去る傾
向にある低イオン強度の水性洗浄溶液である。二重蒸留水は、効果的である。洗
浄溶液は、洗浄の有効性を上昇するために加熱され得、そして洗浄サイクル１回
あたりの洗浄回数および／または洗浄溶液の容量は、洗浄の有効性を最大化する
のに必要であるように変化され得る。キャピラリーは、毛管作用によって洗浄溶
液で満たされ得る。次いで、反応産物が排出される同一の方法を用いて空にされ
る。洗浄が動電学的に注排水することによって達成されることを望む場合、洗浄
溶液は、いくらかの最小濃度のイオンを含まなければならない。あるいは、機械
ポンプを使用して、キャピラリーを通じて洗浄溶液を駆動し得る。
【０１０２】 この洗浄はまた、共有され、かつ２０００年５月２３日に出願された同時係属
中の米国特許出願第０９／５７７，１９９号（この開示は、その全体が本明細書
中に参考として援用される）に開示されるような機械キャピラリーカセット洗浄
機によって達成され得る。
【０１０３】 カッセト内に配置された複数のキャピラリーを洗浄するように設計されたキャ
ピラリーチューブ洗浄デバイスのための設計は、同時係属中の米国特許出願第０
９／５７７，１９９号（その全体が本明細書中に参考として援用される）に開示
される。
【０１０４】 水性洗浄の後、高濃度のエタノールを通常含むアルコール洗浄が使用され、水
および洗浄溶液の他の成分のほとんどの痕跡を除去する。次いで、このキャピラ
リーは代表的に、暖かい乾燥空気をキャピラリーを通じて引き込むことによって
乾燥される。その後、キャピラリーは、保存または再使用のために準備される。
【０１０５】 いくつかの適用のために、本質的に核酸がこのキャピラリーにおける以前の反
応に残存していないことが重要である。１つの例がＰＣＲであり、これによって
古い残存しているテンプレートＤＮＡが、飛躍的に増幅され得、新しい反応の汚
染の原因となる。このような場合、リサイクルプロセスは、核酸の痕跡を破壊す
ることにおいて効果的な工程を包含し得る。このような手段としては、エキソヌ
クレアーゼを含む溶液でキャピラリーを満たす工程および任意の核酸を消化する
のに必要である時間インキュベートする工程を包含する。他の手段としては、核
酸の化学的な分解が挙げられる（例えば、強酸性溶液または強塩基性溶液で洗浄
することによって；漂白剤と接触させることによって；イオン化放射線でキャピ
ラリーを照射することによって；または高温で焼くことによって）。残存核酸を
破壊した後、このキャピラリーは、代表的に、標準溶液を用いて洗浄される。
【０１０６】 １つの適用（たった１つだけではないが）によってカセットにおけるキャピラ
リーを用いる並行処理は、ＤＮＡ、しばしばＰＣＲ産物の配列の確認、デノボで
のハイスループットの配列決定（例えば、一塩基多型（ＳＮＰ）の発見）のため
に有用であると証明する。ＳＮＰの発見のために、本発明の方法および装置は、
「深い（ｄｅｅｐ）」配列決定を可能とし、この配列決定において、同一の遺伝
子または遺伝子座が、複数の個体から配列決定される（配列決定された集団に存
在する、配列が同定されている多型における差異）。これらのうち、いくつかの
ＳＮＰが有意な表現型（例えば、疾患の素因、存在、または進行の可能性）と関
連すると実証された。
【０１０７】 別の適用によって、カセットにおけるキャピラリーを用いて平行な処理は、マ
イクロアレイを作製するために基板上にスポットしようとするＤＮＡ、しばしば
ＰＣＲ産物の配列の確認に有用であると証明する。このようなマイクロアレイは
、基礎研究および応用研究における用途の増加が見出されていて、代表的には、
各々のスポットにおいて公知のＤＮＡ配列とは違う配列を有する、スライドガラ
ス上のＤＮＡのスポットの矩形のアレイから構成される。次いで、実施者は、標
識されたサンプル（ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれか）を得、そして標識された核
酸とこのアレイにスポットされたＤＮＡとの間のハイブリダイゼーション事象を
検出する。この方法において、実施者は、標識した核酸の部分的な配列または完
全な配列の同一性を推測し得る。
【０１０８】 マイクロアレイを用いて作製されたデータの保全性を確実にするために、スポ
ットされたＤＮＡの配列の同一性が、高い信用を有することが知られていること
が必要である。再アレイ化および他のサンプルの取り扱い手順は、検出されなけ
ればならない誤りの様式化を導入する。さらに、ＰＣＲが、しばしば使用され、
スポットされるべきＤＮＡを作製する。当該分野で周知のように、Ｔａｑおよび
他の熱安定性ポリメラーゼは、これがテンプレートを増幅する場合、１０００塩
基にある特定の数の間違った塩基対を導入する。誤りが導入された場合、これら
は検出されなければならなく、そして増幅した産物は処分される。通常、これは
、ＰＣＲ産物をスポットする工程に関連する工程とは区別される多数の処理工程
を必要とする。しかし、本発明の実施形態の使用は、配列決定および確認の有効
性を非常に上昇する。
【０１０９】 スポットされるべきＤＮＡサンプルは、通常、カオトロピックイオン（例えば
、チオシアン酸ナトリウム）を含有する溶液に所定の濃度で溶解される。ＤＮＡ
は、核酸がキャピラリーチューブの内側に固定されるのと同様の様式でガラスマ
イクロアレイスライドの表面に固定されているので、よく溶解する。代表的に、
異なるＤＮＡカオトロピック溶液は、マイクロアレイ上にスポットする準備がで
きるまで、保存のために３８４ウェルキャピラリーマイクロタイター皿のウェル
に等分される。スポットする前に、この皿は、自動化スポットシステムに関連す
るロボットによって拾われ、そしてある位置に操作される。これにより、スポッ
ト針またはペンは、複数のウェル（通常、１２ウェル）に一度に浸され得る。
【０１１０】 本発明は、スポットペンのためのＤＮＡ供給源として使用される同一の３８４
ウェル皿の複数のウェルにおいてＤＮＡをサンプリングおよび配列決定するため
に適合され得る。これはまた、３８４ウェルよりも多いウェルを有する皿からサ
ンプリングするために適合され得ることが理解される。配列決定されるＤＮＡは
、スポットされる同一のサンプル由来であるので、異なるサンプル由来のＤＮＡ
を配列決定することに関連する多数の処理工程が除かれる。これは、時間および
材料の費用の実質的な節約を生じる。本発明のこの実施形態に従って、ガラスキ
ャピラリーは、この皿の１つ以上の行または列においてウェルと同一のパターン
およびキャピラリー間の寸法でカセットに配置される。最大能力について、総数
３８４個のキャピラリーが、それ自体の皿と同一の寸法を有するパターンに配置
される。スポットの前に、キャピラリーカセットは、本発明の方法に従ってＤＮ
Ａ−カオトロピック溶液（通常は、チオシアン酸ナトリウム）で満たされる。Ｄ
ＮＡサンプルが固定され、そして処理された後、ＤＮＡ産物は、配列決定される
。テンプレートのいずれかが、正確な配列を与えない場合、スポット装置の操作
者は、ＤＮＡをスポットすることを知らないか、またはスポットされた場合、そ
の対応するスポットにおけるハイブリダイゼーションに関連するデータは、不必
要な配列のためであり、そして得られるデータセットから除去されるべきである
。
【０１１１】 （可逆的に固定した核酸との代替的な生化学的反応） 本反応混合アセンブリは、反応の多数の型のアセンブリのために使用され得る
。ＰＣＲ反応混合物をアセンブリするために使用される同様の基本的な方法は、
サークル配列決定混合物、ローリングサークル（ｒｏｌｌｉｎｇ ｃｉｒｃｌｅ
）増幅反応混合物、酵素アッセイ、化学反応、または他の反応混合物のアセンブ
リに適合され得る。
【０１１２】 （所定の量の核酸の分配） 容易に明らかなように、実施者は、キャピラリーチューブの内側に固定された
核酸との反応を実施することは義務づけられていない。種々の理由のために、キ
ャピラリーの内表面から固定された核酸を溶出し、そして異なる反応チャンバに
おいてその核酸との反応を実施するか、または、このキャピラリーの外側でいく
つかの他の方法で核酸を処理するかのいずれかが好ましくあり得る。このような
状況において、一定容量の液体中の所定のおおよその質量の核酸（従って、所定
のおおよその濃度で）を実施者の選択した基板上に分配するためのピペッターと
してキャピラリーを使用することが可能である。これを行うために、このキャピ
ラリーは、可逆的に固定された核酸の本質的に全てを溶出する溶出液体で満たさ
れる。その後、溶出液体および核酸の溶液は、通常基板上または基板中に分配さ
れる。反応混合物が輸送される基板は、マルチウェルのマイクロタイタープレー
ト（平面的な基板上の位置）のウェル、または分析チップに入るウェルであり得
る。この反応物はまた、さらなる化学反応または生化学反応のために溶液中に分
配され得る。
【０１１３】 複数のキャピラリーが、カッセト内に配置される場合、上記のように、このカ
セットは、マルチチャネルの平行ピペッターとなり、そしてこれは、多数の正規
化された核酸サンプルを同時に分配することを可能にする。この分配は、マイク
ロタイターウェル、マイクロチップ、およびさらなる反応のための他のチャンバ
中にされ得る。さらに、この核酸は、キャピラリーアレイ電気泳動マイクロチッ
プのリザーバ中にか、またはＭＡＬＤＩ標的もしくはＳＥＬＤＩ標的上にか、あ
るいは他の分析的様相において使用されるように適合された基板上もしくは基板
中に直接分配され得る。
【０１１４】 異なる方法を使用して、キャピラリーチューブから液体を排出かまたは分配し
得る。当業者に明らかなように、これらの方法を使用して、溶出した核酸溶液を
分配するだけでなく、反応後に反応産物を除去するための、または洗浄溶液を除
去するための目的に関係なく満たされたキャピラリーをから液体を除去し得る。
【０１１５】 カッセト形式中に配置された単一キャピラリーチューブまたは複数の同様のキ
ャピラリーの内容物を分配するための１つの方法は、遠心力によって液体を分配
するための遠心分離機を使用する。遠心力は、このキャピラリーカセットにおけ
るキャピラリーの全てに対して均一に適用される。その結果、キャピラリーは、
液体が排出されるキャピラリーの開口部の下に位置している基板上にそのキャピ
ラリーの内容物を独立して分配する。この基板が、マイクロタイター皿のウェル
である場合、この分配された液体は、遠心力によってこのウェルの底に引き付け
られる。遠心分離機および関連するローターならびにカセットを保持するための
バケットのための設計は、同時係属中の米国特許出願第０９／５７７，１９９号
（その全体が本明細書中に参考として援用される）に開示される。
【０１１６】 キャピラリーチューブ内に含まれる液体を分配する第２の方法は、空気置換デ
バイスの使用による。カセット内に配置された複数のキャピラリーの液体内容物
を分配するように設計された空気置換デバイスのための設計は、同時係属中の出
願である米国特許出願第０９／５７７，１９９号（本明細書中にその全体が参考
として援用される）に開示される。
【０１１７】 あるいは、キャピラリーの内容物は、分析デバイス（図３Ｅ ７０）（例えば
、電気泳動チップ）のウェルまたはサンプルポート（図３Ｅ ７６）に直接分配
され得る。図３Ｅに示されるように、このような分析チップは、それらのそれぞ
れのサンプル入口またはポート７６と流体連絡した分析レーン７８のアレイを有
する。複数のキャピラリーは、キャピラリーの間隔が、チップにおけるサンプル
入口７６の間隔と一致するようにカセット形式内に配置され得る。例えば、８つ
の列のうちの２つの平行な列に１６本のキャピラリーを有するキャピラリーカセ
ットは、分析チップにおける１６のウェルとドッキングする。
【０１１８】 例として、図３Ｃに図示されるキャピラリーカセットは、可撓性ストリップ１
１を通って延びているキャピラリー１２を備える。可撓性ストリップ１１は、単
独で使用されても、他のこのようなストリップと組み合わせて使用されてもよい
。本質的に直線状のキャピラリーの配向は、ストリップ１１を曲げて弧を形成す
ることによって変更され得る。図３Ｄは、キャピラリー１２が環状パターンにあ
る基板上に配置された入口ポートと一致することを可能にするように曲げられた
、ストリップ１１を図示する。次いで、キャピラリー１２中の液体は、適切な電
極アレイまたは他の分配方法が使用される場合、キャピラリー１２から分析チッ
プ７０のポート７６に動電学的に注入されるか、そうでなければ分配される。ス
トリップ１１は、ストリップ１１を湾曲した形態（例えば、湾曲した金属ブロッ
ク）に対して押し付けることによって、湾曲した配向に位置づけられ得る。これ
は、自動サンプル調製システムに組み込まれた自動ストリップムーバーによって
なされ得る。
【０１１９】 キャピラリーカッセットは、空気置換、または好ましくは飛び跳ねおよび泡形
成を最小にするように選択される、他の分配手段によって分配され得る。調製し
た反応混合物を分析のためのウェル７６に分配する前に、少量の希釈剤が各分析
マイクロチップウェル７６に添加され得る。キャピラリーカセットが分配される
場合、希釈剤によりサンプルウェル７６中がサンプルを希釈される。キャピラリ
ーカセット内で調製されたマイクロリットル以下の容積の反応混合物（例えば、
ＤＮＡ配列決定反応生成物混合物）は、配列決定または他の分析方法のために、
容易に分析チップに組み込まれ得る。
【０１２０】 溶出流体は、好ましくは低イオン強度の水溶液であり、より好ましくは、水ま
たは核酸材料が安定かつ実質的にインタクトであるｐＨ（通常、ｐＨ６．５と８
．５との間）付近の低イオン強度緩衝液である。１×濃度のＴＥ緩衝液（１０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ｐＨ
８．０）および蒸留水または脱イオン水は、本発明における使用のために特に好
ましい溶出溶液である。上記の溶出溶液の低イオン強度の好ましい形態は、核酸
とキャピラリーの内表面を構成する物質との間で確立される塩橋を破壊する傾向
があり、核酸が溶液中に溶出されることを確実にする。本発明の方法における使
用のために適切な他の溶出溶液は、当業者に容易に理解される。
【０１２１】 本発明の方法に従って、ガラスキャピラリーチューブの内表面に結合する核酸
は可飽和である。適切な条件下で、任意の特定のキャピラリーの内側に固定され
る核酸の量を、高度な正確さで制御することが可能である。従って、核酸が水溶
液中に溶出され、分配された場合、溶液中の核酸の濃度、およびこの溶液の任意
の特定の容積中にある核酸の全量を知ることができる。例えば、キャピラリーの
結合能が１０ｎｇ ＤＮＡであり、そしてこれが５００ｎｌの溶出流体中に溶出
される場合、溶液の濃度は０．０２グラム／リットルであり、モル濃度は、ＤＮ
Ａ分子の分子量に依存する。５００ｎｌすべてが分配される場合、その液滴は１
０ｎｇのＤＮＡを含む。
【０１２２】 当業者に理解されるように、異なるキャピラリーチューブの間の小さな変動に
より、固定および溶出され得る核酸の量は、非常に一貫しているが、キャピラリ
ーチューブ間、または同じチューブの繰り返し使用の間でさえで同一ではない。
この理由のために、溶出流体中に溶出される核酸の予め決められた量または質量
は、おおよその量または質量である。好ましくは、この状況においては、予め決
められたおおよその質量とは、他のすべての条件が等しい、同様のキャピラリー
または同じキャピラリーの繰り返し使用の間で、固定または分配されると予測さ
れた質量と実際に固定または分配された質量との間の誤差が、１０％以下、より
好ましくは５％以下、より好ましくは２％以下、そして最も好ましくは１％以下
の誤差であることを意味するべきである。
【０１２３】 通常、本発明の分配機能は、飽和している量の核酸を特定のキャピラリー内に
固定し、そして全容積を分配することによって利用される。従って、分配された
核酸の量および濃度を制御するために、実験者は、予め決定された結合能および
容積を有するキャピラリーを選択する。しかし、上記で議論されるように、実験
者は、予め決定された飽和していない量の固定された核酸が結合する条件を、実
験的に決定し得る。従って、これらの条件を使用することによって、飽和してい
ない予め決定された量の核酸を固定し得、次いでキャピラリーから溶出し得、実
験者が任意の所定量の核酸を意のままに分配することを可能にする。
【０１２４】 キャピラリーが、予め決定された量の飽和していない核酸または飽和している
核酸を可逆的に結合する、両方の状況下で、実験者が、当業者によく知られてい
る方法を用いて、キャピラリーから放出された核酸溶出流体の量を制御する場合
、その容積についての知識は、正確な量の核酸を分配することを可能にする。例
えば、制御された量の流体は、機械的ポンピングまたは動電学的ポンピングによ
って放出され得る。
【０１２５】 以下の実施例は、本発明の方法の使用を図示し、そして開示された方法を用い
て行われ得る多くの異なる型の生化学反応または酵素反応の代表的なものである
。これらの反応としては、１）色素−プライマーＤＮＡ配列決定、２）色素−タ
ーミネーターＤＮＡ配列決定、３）ＰＣＲ増幅、４）ＰＣＲ増幅、酵素精製、お
よびＤＮＡ配列決定、ならびに５）一般的な酵素反応が挙げられる。以下の実施
例は、例示のために提供され、限定のために提供されるのではない。
【０１２６】 （実施例１） （キャピラリー電気泳動によって分析された色素−プライマーＤＮＡ配列決定
） 色素−プライマー配列決定反応を、９６の被覆していない石英ガラスキャピラ
リー（長さ２．８ｃｍ、１５０μｍ Ｉ．Ｄ．、３６０μｍ Ｏ．Ｄ．）を含む
キャピラリーカセット中で行った。色素−プライマー配列決定反応を、テンプレ
ートＤＮＡを、ｄｄＴ、ｄｄＡ、ｄｄＣ、およびｄｄＧ終結反応に対応する放出
特異的プライマーを用いて増幅することによって行った。テンプレートの増幅を
、各キャピラリー中で単一の反応として行い、反応後のプロセシングおよび分析
のために、同じウエル内にプールした。
【０１２７】 色特異的プライマーは、５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）をドナー色
素として、および指示されたチミン（Ｔ*）に結合した終結特異的蛍光をアクセ
プター色素として有する、Ｍ１３−４０ ＦＷＤプライマー（５’−ＦＡＭ−Ｇ
ＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴ*ＣＡＣＧＡＣＧ−３’）に基づいた。このチミンを、ｄ
ｄＣ−終結反応ためのＦＡＭ（Ｃ−ＦＡＭ）、ｄｄＡ反応のための６−カルボキ
シローダミン（Ａ−ＲＥＧ）、ｄｄＧ反応のためのＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ
メチル−５−カルボキシローダミン（Ｇ−ＴＭＲ）、およびｄｄＴ反応のための
５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（Ｔ−ＲＯＸ）で標識した。１００色素−プラ
イマー配列決定反応のためのマスター混合物を、６５μＬ 反応緩衝液（２２０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ９．５、３３．２ｍＭ ＭｇＣｌ2）、１００
μＬ 色素−プライマー溶液（１μＭ Ｔ−ＲＯＸ、１μＭ Ｇ−ＴＭＲ、０．
５μＭ Ａ−ＲＥＧ、または０．５μＭ Ｃ−ＦＡＭのいずれか）、１００μＬ
の対応するデオキシヌクレオチドおよびジデオキシヌクレオチド混合物（３．１
μＭ ジデオキシヌクレオチドを含む、０．９４ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄ
ＴＴＰ、７−デアザ−ｄＧＴＰ）、１０μＬの酵素（３２単位／μＬ Ｔｈｅｒ
ｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ）、ならびに２２５μＬ濾過脱イオン水（ｄｅｍｏｎｉ
ｚｅｄ ｗａｔｅｒ）を合わせることによって調製した。この溶液を、テンプレ
ートＤＮＡと混合する前に、９６ウェル試薬プレートにアリコートした。一般的
な混合スキームは、２つのキャピラリーカセットおよび３８４ウェル「混合プレ
ート」の使用を必要とした。第１のキャピラリーカセット（トランスファーカセ
ット）を、テンプレートＤＮＡの溶液（２０ｎｇ／μＬ Ｍ１３ｍｐ１８）に浸
し、次いで３８４ウェル「混合プレート」の上で逆さにして、キャピラリーの短
い端部をウェルに挿入した。逆さにしたトランスファーカセットおよび混合プレ
ートを、ベンチトップ遠心分離機の中に置いた。バランスプレートを、ローター
のバランスを取るために加え、そして３，０００×ｇで５秒間遠心分離した。こ
の遠心分離により、トランスファーカセットの内容物を３８４ウェルプレートの
個々のウェルに均一に分配した。遠心分離工程の後、トランスファーカセットを
洗浄のためにキャピラリーカセットウオッシャー４１０に移し、そして混合プレ
ートを、試薬添加のための引き続く遠心分離工程のために使用した。
【０１２８】 試薬を添加するために、第２のキャピラリーカセット（反応カセット）を、配
列決定試薬（前述の段落に記載されるように調製した）を含むウェルに浸し、そ
して同じ３８４ウェルプレートの同じウェルの上で逆さにした。反応カセットお
よび混合プレートを遠心分離機の中に置き、３，０００×ｇで５秒間回転させ、
そして遠心分離機から取り出した。この時点で、各ウェルは、５００ｎＬのテン
プレートＤＮＡおよび５００ｎＬの配列決定試薬を含み、最終反応混合物を形成
した。次いで、第２のキャピラリーカセット（試薬を添加するために使用した）
を、混合プレート中に含まれる１μＬ混合物に浸し、反応カセットのキャピラリ
ーを５００ｎＬで満たした。
【０１２９】 キャピラリーカセットを、本明細書中、図７Ａ〜Ｃに記載されるような空気ベ
ースの熱サイクラーの内部チャンバ（ここでキャピラリーの端部を変形可能な膜
２６４ａおよび２６４ｂに対して押すことによって、キャピラリーセグメントの
端部をシールする）に挿入した。９５℃で２秒間、５５℃で２秒間、および７２
℃で６０秒間の３０サイクルの後、熱サイクラーを開けて変形可能な膜との接触
からキャピラリーの端部を取り外した。キャピラリーカセットを取り外し、そし
てキャピラリーの短い端部をウェルに挿入した状態で、９６ウェル「プーリング
プレート」の上に置いた。キャピラリーカセットおよび混合プレートを、バラン
スプレートとともに遠心分離機内に置いた。反応生成物を、遠心力（約２５００
×ｇ）によって４０μＬの８０％イソプロピルアルコールを含むマイクロタイタ
ープレートに分配した。最初の反応の後、キャピラリーを本明細書中に記載され
るように洗浄した。４回の色素−プライマー反応を４つの個々のキャピラリーカ
セット内で行い、そして４セットの生成物を９６ウェルプーリングマイクロタイ
タープレートのウェルにプールした後、続いてサンプルを３０００×ｇで３０分
間遠心分離した。アルコールを穏やかな逆回転によりデカントし、そしてサンプ
ルを、動電学的注入およびＭｅｇａＢＡＣＥTMキャピラリーアレイ電気泳動によ
る分析のために、５μＬのｄｄＨ2Ｏに再懸濁させた。
【０１３０】 ＤＮＡ配列決定フラグメントの分析を、ＭｅｇａＢＡＣＥTM（９６キャピラリ
ーアレイ電気泳動機器）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙ
ｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて、走査型共焦点レーザー誘導蛍光検出を使用して行っ
た。分離を、４０ｃｍの作用分離距離を有する石英ガラスキャピラリー（長さ６
２ｃｍ、７５μｍ Ｉ．Ｄ．、２００μｍ Ｏ．Ｄ．）中で行った。電気浸透流
を、ビニル基のキャピラリー表面へのグリニャールカップリングおよびアクリル
アミド重合によって減少させた。キャピラリーを、３％ 直鎖ポリアクリルアミ
ド（ＬＰＡ）（ＭｅｇａＢＡＣＥTM Ｌｏｎｇ Ｒｅａｄ Ｍａｔｒｉｘ，Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）の
新鮮な溶液で満たした。この溶液を、アノードチャンバからカソードチャンバに
含まれる９６ウェル緩衝液プレートの個々のウェルに、高圧下で、キャピラリー
を通してポンピングした。各ウェルを、１００μＬのＴｒｉｓ−ＴＡＰＳ流動緩
衝液（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ ＴＡＰＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ
８．０）で満たした。マトリックスを２０分間平衡化し、続いて１８０Ｖ／ｃｍ
で５分間、予備電気泳動（ｐｒｅ−ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）した。サ
ンプル注入の前に、カソードキャピラリー端部および電極を、２回蒸留した水（
ｄｄＨ2Ｏ）でリンスして、サンプル注入の前に残ったＬＰＡを除去した。
【０１３１】 ＤＮＡ配列決定サンプルを、特定の条件に従って、９６ウェルマイクロタイタ
ープレートから一定の電圧で動電学的に注入した；５００ｎＬサンプルについて
の１つの好ましい注入条件は、２ｋＶの印加電圧で４０秒の注入である。注入後
、キャピラリー端部を水でリンスし、緩衝液プレートをカソードチャンバ内に置
き、そして電気泳動を開始した。分離は、代表的には、８ｋＶで１２０分間であ
った。機器およびデータ収集のコンピュータ制御した自動化は、ＬａｂＢｅｎｃ
ｈソフトウエア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ
，ＣＡ）を用いて行った。特定の注入および電気泳動条件は、分析されるべき反
応混合物に合わせた。
【０１３２】 マイクロリットル以下の色素−プライマーサイクル配列決定のための記載され
た方法の再現性を、図９に示す。このヒストグラムは、異なる読み取り長（ｒｅ
ａｄ ｌｅｎｇｔｈ）のビン（ｂｉｎ）におけるサンプルのパーセントを示し、
そしてこの方法が非常に再現性があることを示す。配列決定したＤＮＡインサー
トの８０パーセントを超えるＤＮＡインサートは、６００塩基を超える読み取り
長を有した。全体として、この９６サンプルのプレートは、６０５塩基の平均読
み取り長を有する、５５，０００の質の高い「Ｐｈｒｅｄ ２０」塩基を生じた
。
【０１３３】 （実施例２） （キャピラリー電気泳動マイクロチップによって分析された色素−プライマー
ＤＮＡ配列決定） 別の分析実施例において、同じキャピラリーカセットで行った色素−プライマ
ー反応を、Ｓ．Ｌｉｕ，Ｈ．Ｒｅｎ，Ｑ．Ｇａｏ，Ｄ．Ｊ．Ｒｏａｃｈ，Ｒ．Ｔ
．Ｌｏｄｅｒ Ｊｒ．，Ｔ．Ｍ．Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ｑ．Ｍａｏ，Ｉ．Ｂｌａ
ｇａ，Ｄ．Ｌ．ＢａｒｋｅｒおよびＳ．Ｂ．Ｊｏｖａｎｏｖｉｃｈ，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，５−００に詳細に記載される、１６チャ
ネルの微小作製された「チップベース」の分析器への直接的な注入によって分析
した。この１６チャネルチップは、２つのガラスウェハを結合することによって
形成され、上のウェハは、標準的な微小作成方法によってその中にエッチングさ
れた、深さ５０ｕｍ×幅１００ｕｍのチャネルを有する。エッチングされたパタ
ーンは、２つの８チャネルグループの組み合わせを有し、各々共通のアノードレ
ザバを有する。１６のサンプルレザバおよび１６の廃棄物レザバと同様に、１６
のカソードレザバを、４．５ｍｍの等しい間隔をあけて一列に配置した。これら
のレザバは、上部のエッチングしたウェハを通るアクセスホールを穿孔すること
によって形成した。１６の長さ２５０μｍのｔｗｉｎ−Ｔインジェクターを、メ
イン分離チャネルを結合するサンプルレザバおよび廃棄物レザバからのチャネル
のオフセットにより形成した。隣接するチャネル間（中心間）の距離は、検出領
域において６００μｍであった。２つの位置合わせホールは、チップを検出器に
対して位置合わせをするために使用した。
【０１３４】 この実施例においては、ｄｄＴによって終結させた色素−プライマー反応を、
記載されたように行い、そして１．５μＬのｄｄＨ2Ｏを含むマイクロチップの
サンプルウェル中に分配した。サンプル注入を、５０ボルトおよび１０ボルトの
電圧を廃棄物レザバおよびカソードレザバに、代表的には６０秒間それぞれ印加
し、一方、サンプルレザバおよびアノードレザバをアースすることによって行っ
た。分離を、２，０００ボルトをアノードレザバに、１４０ボルトをサンプルレ
ザバおよび廃棄物レザバに印加し、一方、カソードレザバをアースすることによ
って、サンプル注入後すぐに行った。対応する分離電界の強さは、約２２７Ｖ／
ｃｍであった。レーザー誘導蛍光を集め、デジタル化し、そして図１０に示され
る電気泳動図に処理した。この電気泳動図は、記載されたキャピラリーカセット
システムにおいて行った反応のマイクロチップ分析を示す。
【０１３５】 （実施例３） （アルコール沈殿精製を用いる色素−ターミネーターサイクル配列決定） 色素−ターミネーターサイクル配列決定を、キャピラリーカセットセステムお
よびキャピラリーアレイ電気泳動の前のクリーンアップのためのアルコール沈殿
を用いて実証した。この実施例においては、配列決定反応混合物は、４００μＬ
の配列決定試薬（Ｄｙｎａｍｉｃ ＥＴ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｋｉｔ、Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐａｒｔ８１６００）を
１００μＬの５ｐｍｏｌ／μＬのＭ１３−２８ ＦＷＤプライマー（５’−ＴＧ
Ｔ ＡＡＡ ＡＣＧ ＡＣＧ ＧＣＣ ＡＧＴ−３’）と混合することによって
調製した。この反応混合物を、５μＬアリーコートで９６ウェル「試薬」プレー
トに分配した。テンプレートＤＮＡと配列決定試薬との混合は、５００ｎＬのＤ
ＮＡサンプルを移すために使用したトランスファーカセットおよび５００ｎＬの
配列決定試薬を試薬プレートから混合プレートのウェルに移すための反応カセッ
トを使用して、実施例１と同じ一連の工程で行った。次いで、この同じ反応カセ
ットを毛管作用によってテンプレート／試薬混合物で満たした。
【０１３６】 キャピラリーカセットを、空気ベースの熱サイクラーに運び、そこで、このキ
ャピラリーを熱サイクラー内の変形可能な膜の間でシールした。熱サイクリング
は、９５℃の３０サイクル２秒間、５５℃２秒間、そして６０℃６０秒間で達成
した。熱サイクリング後、カセットを、サイクリングチャンバーから除去し、そ
してキャピラリーの中身を、遠心力（３０００×ｇ）によって、８０％のエタノ
ールを４０μＬ含む９６ウェルのプレートに分配した。このサンプルを、３００
０×ｇで３０分間遠心分離した。アルコールを、穏やかな反転スピンでデカント
し、そしてそのサンプルを、動電学的な注入およびＭｅｇａＢＡＣＥTMキャピラ
リーアレー電気泳動法による分析のために、５μＬのｄｄＨ2Ｏ中に再懸濁させ
た。アルコール沈澱反応による色素ターミネーター反応のクリーンアップ、この
技術の再現性、および「実際の世界の」テンプレートへの適用を、図１１に成功
百分率 対 読み取り長のヒストグラムとして示す。図１１は、マウスの細菌性
人工染色体のサブクローンライブラリから調製されたＭ１３サブクローンインサ
ートを用いた優れた読み取り長および成功率を示す。
【０１３７】 （実施例４） （サイズ排除精製による色素ターミネーターサイクル配列決定） 別の実施例において、色素ターミネーター反応を、実施例３に記載されるよう
に、５００ｎＬのキャピラリー中で行い、そして反応生成物を、遠心力によって
、１５μＬのｄｄＨ2Ｏ中に分配した。このサンプル１５μＬを、４５μＬの水
和されたセファデックスＧ−５０を含むフィルタープレート中に移した。このサ
ンプルを、セファデックスマトリックスを通じて、９１０×ｇで５分間遠心分離
し、そして、そのフルーエントを清潔な９６ウェルの注入プレートに集めた。こ
のサンプルを、さらなる脱水またはＭｅｇａＢＡＣＥTMへのプロセッシングをせ
ずに、電動学的に注入した。１６サンプルに対して、平均６５０塩基の読み取り
長が得られ、サイズ排除精製によって、マイクロリッター以下の色素ターミネー
ター配列決定の適合性が示された。
【０１３８】 （実施例５） （プラスミドインサートＤＮＡのＰｃｒ増幅） 本発明の技術は、インサートＤＮＡ（例えば、ＤＮＡライブラリーからのサブ
クローンインサート）のＰＣＲ増幅のために、開示されたシステムを使用する。
ＰＣＲ反応混合物を、１０×ＧｅｎｅＡｍｐ緩衝液２５μＬ、２５ｍＭのＭｇＣ
ｌ2 １５μＬ、ＡｍｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ５μＬ、１ｍｇ／ｍＬのウシ胎仔
血清アルブミン（ＢＳＡ）２．５μＬ、およびｄｄＨ2Ｏ ６７．５μＬと共に
、１０μＭのＭ１３−４０ＦＷＤプライマー（５’ ＧＴＴ ＴＴＣ ＣＣＡ
ＧＴＣ ＡＣＧ ＡＣ ３’）５μＬおよび１０μＭのＭ１３−４０ＲＥＶプラ
イマー（５’ ＧＡＡ ＴＡＡ ＣＡＡ ＴＴＴ ＣＡＣ ＡＣＡ ＧＧ ３’
）５μＬを混合することによって、調製した。この混合物を、等しい体積で、０
．０２ｍＬチューブ１６個にアリコートした。
【０１３９】 この反応を、記載の２つのキャピラリーカセットおよび混合プレート方法を用
いて、ＰＣＲ混合物とテンプレートＤＮＡを混合することによって開始した。移
動カセットを、サブクローンライブラリーのグリセロールストック（貯蔵）溶液
に浸漬し、そして３８４ウェルプレートのウェルに遠心力によって分配した。第
２の「反応」カセットを使用し、ＰＣＲ混合物５００ｎＬを遠心力によって同じ
ウェルに移した。反応カセットのキャピラリーを、引き続いて、テンプレートＤ
ＮＡとＰＣＲ試薬の組み合わせられた混合物中に浸漬し、キャピラリー反応によ
ってキャピラリーを充填した。このキャピラリーをサイクリングチャンバーの中
に配置し、そして９５℃１２分間の活性化工程に続いて、６４℃４．５分間、そ
して９５℃５秒間の３０サイクルの熱サイクリングをすることによって、増幅を
行った。
【０１４０】 ＰＣＲ産生物を、アガロースゲル電気泳動法によって分析し、そして０．２０
ｍＬチューブ内で行った全容積（２５μＬ）反応によって増幅された同じサブク
ローンと比較した。ナノスケールキャピラリーカセットサンプルを、遠心力によ
って４．５μＬのｄｄＨ2Ｏに分配した。全容量反応の等容量のアリコートを、
低用量ピペッターを用いて、手で移した。各５μＬのサンプルに、６×ローディ
ング色素１μＬを加え、そして、このサンプルをアガロースゲルのウェルに定量
的に移した。アガロースゲル電気泳動法を、１×トリス−アセテート−ＥＤＴＡ
緩衝液（ｐＨ８）と共に０．７％のアガロースゲルを用いて行った。サンプルを
１５Ｖ／ｃｍで４０分間分離し、Ｓｙｂｒ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）で染色し、そして、二次元蛍光スキ
ャナー（ＦｌｕｏｒＩｍａｇｅｒ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ、Ｓ
ｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いて画像処理した。走査されたゲル画像を、図１
２Ａおよび図１２Ｂに示す。全容量で調製されたサンプル（図１２Ａ）と５００
ｎＬ容量で調製されたサンプル（図１２Ｂ）は、同じ分子重量分布を持つことが
観察され得る。この実施例は、ナノスケールサンプル調製がＰＣＲ反応のために
使用され得ること、ならびに、その産生物は、アガロースゲル電気泳動法のよう
な、伝統的なマクロスケールの分析方法によって分析され得ることを示す。
【０１４１】 （実施例６） （ＰＣＲ増幅およびサイクル配列決定） 本発明を用いた、サイクル配列決定サンプルを調製する好ましい方法は、ナノ
スケールのＰＣＲサンプルをキャピラリーカセットおよび関連する計測器中に調
製し、マクロスケールＥｘｏＩ／ＳＡＰ反応を行い、そして、次いで、キャピラ
リーカセットおよび関連する計測器中でサイクル配列決定を行うことである。Ｄ
ＮＡ配列決定のためのナノスケールＰＣＲテンプレート調製が、グリセロールス
トック（貯蔵）サブクローンからＰＣＲ増幅を行うことによって示された。グリ
セロールストックサブクローンを、実施例５に記載されるように、キャピラリー
カセットおよび関連するハードウェア内でＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ増幅後、キャ
ピラリーの中身を、遠心力によって、７．５ｍＵのエビアルカリ性ホスファター
ゼ（ＳＡＰ）および３７．５ｍＵのエキソヌクレアーゼ（ＲｘｏＩ）を４．５μ
Ｌ含む９６ウェルプレートのウェルに分配した。ＰＣＲ産生物およびＥｘｏＩ／
ＳＡＰ溶液を、３７℃で５分間インキュベートさせ、取り込まれていないプライ
マーを消化し、そして取り込まれていないヌクレオチドを脱水した。最初のイン
キュベーション後、溶液を１５分間７２℃に熱することによって、酵素を不活性
化した。
【０１４２】 ＥｘｏＩ／ＳＡＰで処理されたＰＣＲ産生物を、移動キャピラリーカセットお
よび遠心分配を用いて、新しい３８４ウェル混合プレートにアリコートした。色
素ターミネーター配列決定試薬の等アリコートを、別のキャピラリーカセット、
反応カセット、および遠心分配を用いて、精製されたＰＣＲ産生物５００ｎＬに
加えた。次いで、この反応カセットのキャピラリーを、キャピラリーカセットを
反応混合物１μＬに浸漬することによって、充填した。このテンプレートを、実
施例３に従って、増幅し、４０μＬの８０％エタノールに分配し、そして記載さ
れるように精製した。配列決定反応物の分析を、動電学的な注入を用いるＭｅｇ
ａＢＡＣＥTMによって行った。図１３に、グリセロールストック溶液からのナノ
スケールＰＣ増幅によって、およびナノスケールサイクル配列決定によって調製
されたサブクローンテンプレートからの６つの塩基の部分（配列決定電位図とい
う）を示す。キャピラリーカセット内でＰＣＲを行い、引き続いて、マイクロプ
レートに反応混合物を移すことによって、本発明のシステムは、ナノスケール（
１μＬ容量未満）からナノスケール反応容積より大きい容量への簡素化された転
移を可能にする。本発明のシステムによってまた、キャピラリーカセットでのサ
イクル配列決定のためにＥｘｏ Ｉ／ＳＡＰ反応を用いることによって示される
ように、マクロスケール（１μＬ容量より多い）からナノスケール反応容量への
簡素化された転移も可能となる。
【０１４３】 （実施例７） （マイクロリッター以下のキャピラリーカセットで行われる等温エンザイム） 酵素反応を行うための記載されるシステムの使用を、蛍光団リゾルフィン（ｒ
ｅｓｏｒｕｆｉｎ）へのβ−Ｄ−β−ガラクトシダーゼのβ−ガラクトシダーゼ
加水分解の蛍光酵素アッセイを用いて示す。リゾルフィン−β−Ｄ−ガラクトシ
ダーゼ（ＲＢＧ）のβ−ガラクトシダーゼ触媒加水分解を、９６キャピラリーカ
セットのキャピラリー内およびβ−ＧａｌがＲＢＧを加水分解するコントロール
全容量反応で行った。
【０１４４】 ３５μＭのＲＢＧのストック（貯蔵）溶液を、激しくボルテックスし、そして
０．０４ミクロンのフィルターを介して溶液を濾過し、そして、次いで、等量の
緩衝液に加えて、緩衝液（１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭのＫＣｌ、
および２ｍＭのＭｇＣｌ2）５ｍＬ内に、５ｍｇのＲＢＧまで調製した。次いで
、ＲＢＧの希釈曲線をストック溶液から準備した。０．２０ｍＬのチューブに調
製されたＲＢＧ溶液１０μＬの各々に、β−ガラクトシダーゼ２００μｇを加え
、そして簡単に混合した後、毛細管作用によってキャピラリーカセットに充填し
た。このカセットを、空気サイクラーに配置し、そして３７℃で２分の後、この
キャピラリーカセットを除去し、そして中身を、キャピラリーから１Ｍの炭酸ナ
トリウム５μＬを含む３８４ウェルのスキャンプレートに遠心分離した。引き続
いて、スキャンプレートのウェルを、５０μＬのｄｄＨ2Ｏで充填した。平行し
て、０．２ｍＬのチューブを、３７℃で２分間インキュベートし、そして、１Ｍ
の炭酸ナトリウムを加えることによって、全容量反応を停止した。０．２０ｍＬ
のチューブで行われた酵素反応からのコントロールアリコートを、スキャンプレ
ートに加えた。
【０１４５】 β−ガラクトシダーゼの固体相捕獲もまた、キャピラリー表面に結合させるた
めに、２０μｇ／ｍＬのβ−ガラクトシダーゼの溶液でカセットをかるく充填し
、続いて過剰の溶液を除去し、そして記載のカセット洗浄マニフォールドを用い
てカセットを乾燥させることによって、このシステムで示された。β−ガラクト
シダーゼ結合後、キャピラリーを、毛細管作用によってＲＢＧ溶液で充填した。
この反応を、３７℃で２分間行い、そして１Ｍの炭酸ナトリウムへ浸漬させるこ
とによって分析し、そしてスキャンプレートにおいて水で希釈した。
【０１４６】 一旦、これらの３セットの反応物（全容量のキャピラリーカセット、および固
体相捕獲を有するキャピラリーカセット）を全部スキャンプレートに加えてしま
うと、そのプレートは蛍光プレートリーダー（Ｔｙｐｈｏｏｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）で読み取られた。０．２
ｍＬのチューブ（ｔｕｂｅ ｒｘｎ）で行われた標準曲線の結果、固体相捕獲を
有しないキャピラリーカセットで行われた反応（キャピラリー反応）、および固
体相捕獲を有するキャピラリーカセットで行われた反応（結合を有するキャピラ
リー反応）を、図１４に要約する。図１４は、予期されるシグナル 対 チュー
ブ反応に関する基板濃度、ならびに、キャピラリーカセットで行われた、前もっ
て混合された酵素反応に関するシグナルのデータ点およびキャピラリー結合β−
ガラクトシダーゼアッセイに関するシグナルのデータ点を示す。
【０１４７】 この実施例は、一般の酵素活性アッセイおよび酵素阻害アッセイの範囲を行う
ための記載されるシステムの適合性を示すのに役立つ。さらに、固体相捕獲が、
タンパク質および酵素、ならびにＤＮＡに適用され得ることを示す。最終的に、
記載されるシステムは、等温反応に適用され得ることを示す。
【０１４８】 （実施例８） （テンプレート精製） この実施例は、本発明の方法が、配列決定反応および高品質の配列データの取
得を妨げる夾雑物からテンプレートＤＮＡを精製するために利用され得る効果を
示す。
【０１４９】 テンプレートは、融合シリカキャピラリーチューブの内表面への直接可逆結合
を用いるＤＮＡ配列決定テンプレートとしてのＰＣＲ産生物のクリーンアップを
獲得する。５００ｎＬ容量の配列反応を、ＥＴ色素ターミネーターサイクル配列
決定方法を用いて、内径１５０μｍのキャピラリーチューブで行い、そして２ｋ
Ｖ、３０ｓの注入を用いてＭｅｇａＢＡＣＥTM上で分析した。図１７Ａは、配列
決定前に反応混合物と混合された配列決定ＰＣＲ産生物の結果を示す。図１７Ｂ
は、まず、ＰＣＲテンプレートをチオシアン酸ナトリウムと混合し、ＤＮＡをキ
ャピラリーの内表面に結合させ、８０％のエタノールでそのＤＮＡを洗浄し、引
き続いて配列決定した結果を示す。
【０１５０】 （核酸正規化実施例） 以下の実施例は、キャピラリーチューブ内に直接かつ可逆的に固定された核酸
の量を正規化するための、本発明の有用性および有効性を示す。
【０１５１】 （実施例９） （Ｍ１３、プラスミド、およびＰＣＲ産生物ＤＮＡに対するテンプレート正規
化効果） 図１８は、テンプレート捕獲プロトコルに従うＤＮＡの保持量を示す。結合し
たＤＮＡの量は、Ｍ１３（▲）、プラスミド（●）、およびＰＣＲ産生物（■）
に関して、テンプレートを開始する４０ｎｇ以上で一定のままである。
【０１５２】 テンプレートＤＮＡを、Ｍ１３ｍｐ１８およびＰＵＣ１９ＤＮＡの制限消化物
によって調製し、それぞれ、直線の１本鎖ＤＮＡおよび直線の２本鎖ＤＮＡを形
成する。これらのテンプレートを、８００ｂｐのＰＣＲ産生物と共に（標準的増
幅条件）、［γ−３２］ＡＴＰ およびＴ４ポリヌクレオドキナーゼを用いて、 32 Ｐで末端標識した。標識されたＤＮＡを、同じ型の標識されていないテンプレ
ートに播種し、そして播種されたＤＮＡ溶液に対して検定曲線を作成した。スト
ック（貯蔵）ＤＮＡを１０Ｍのチオシアン酸ナトリウムと共に混合し、そして融
合シリカキャピラリー５００ｎＬにローディングすることによって、テンプレー
ト結合を行った。１０分のインキュベーションおよび８０％エタノール洗浄の後
、このキャピラリーを、シンチレーション流体中に配置し、そして質量分析した
。図１８は、テンプレートＤＮＡの３つの供給源についての決定的正規化を示す
。
【０１５３】 （実施例１０） （読み取り長に対するテンプレート捕獲正規化効果） 図１９は、テンプレート捕獲によって調製されたサンプル（●）と比較した、
前もって混合したＤＮＡと配列決定試薬によって調製されたサンプル（▲）に関
する、読み取り長 対 開始ＤＮＡ量のプロットを示す。この正規化効果は、テ
ンプレート捕獲サンプルに対して得られたほとんど一定の読み取り長によって強
調され、ここでは、前もって混合されたサンプルに対して、開始ＤＮＡ２０ｎｇ
以上で、テンプレートのオーバーローディングおよび読み取り長の減少が生じる
。
【０１５４】 ストックＭ１３ｍｐ１８ ＤＮＡを１０Ｍのチオシアン酸ナトリウムと混合し
、そして５００ｎＬの融合シリカキャピラリーにロードすることによって、テン
プレート結合を行った。１０分のインキュベーションおよび８０％エタノール洗
浄の後、このキャピラリーを、Ｍ１３−４０ＦＷＤ配列決定プロモーターライマ
ーと共に前もって混合された、ＥＴターミネーターで充填した。前もって混合さ
れた試薬を、１０μＬ容量に調整し、そして清潔なサンプル調整キャピラリーに
ローディングした。空気ベースのサイクル配列決定を、前記に記載したように行
い、引き続き、２ｋＶ、３０秒の注入、８ｋＶ、１２０分の実行時間でエタノー
ル精製およびＭｅｇａＢＡＣＥTM分析を行った。
【０１５５】 （実施例１１） （正規化によるテンプレート捕獲ポリメラーゼ連鎖反応） ＰＣＲ反応を、示された開始量のＭ１３ｍｐ１８のテンプレート結合の後、行
った。Ｍ１３−１００ＦＷＤプライマーおよびＭ１３−４００ＲＥＶプライマー
を用いた標準のＰＣＲ増殖反応を、５００ｎＬのキャピラリーカセットで、９５
℃で１０秒、５５℃で１０秒、そして７２℃で１２０秒、行った。反応産物を、
遠心力によってローディング緩衝液に分配し、そして１．５％アガロースゲルに
移した。この産物を、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ色素で染色し、そして、図２０に示
すように、Ｆｌｕｏｒｉｍａｇｅｒ装置を用いて画像処理した。
【０１５６】 （実施例１２） （ピーク高さおよび移動時間に対するテンプレート捕獲正規化効果ならびに前
もって混合されたサンプルに対するピーク高さおよび移動時間） テンプレート捕獲正規化は、ピーク高さおよび移動時間に影響を及ぼす。図２
１は、ピーク７９、ピーク３０８およびピーク６０４（電気泳動クロマトグラフ
の最初、真中、および終わりのｄｄＴ−終結ピーク）の強度によって示される、
増加するテンプレート濃度によって得られた関連シグナル強度を示す。ピーク強
度は、ピーク高さによって、４０ｎｇ／μｌに増加し、そして平らになり、この
ことは、テンプレート捕獲技術の正規化効果および飽和レベルを確認する。第１
ピークの移動時間は、テンプレート濃度にわたって比較的一定である。
【０１５７】 前もって混合されたサンプルに対するピーク高さおよび移動時間。図２２は、
増加するテンプレート濃度と共に増加し、配列決定サンプルのオーバーローディ
ングに起因して最大に達したピーク高さを示す。過剰のテンプレートＤＮＡは、
電動学的注入を阻害し、サンプル実行の際の流動を減少させ、引き続いて、キャ
ピラリーを通じたサンプルの移動時間を増加させた。
【０１５８】 （実施例１３） （クローンのグリセロールストック（貯蔵）からのナノスケール直接サイクル
配列決定） ＤＮＡ配列決定のためのサンプル調製は、細菌細胞においてクローニングされ
たＤＮＡ由来の配列決定サンプルを調製する際に関係する多くの工程のいくつか
が省略される場合、簡略化され得る。代表的に、キャピラリー電気泳動分析に対
して、細菌細胞は増殖されそして溶解され、ＰＣＲ増幅が行われ、続いて、Ｅｘ
ｏＩ／ＳＡＰクリーンアップ、次いで、サイクル配列決定が行われる。本発明は
、クローンのグリセロールストックから直接的にサイクル決定することにより、
仕事の流れを簡潔化するための方法を提供する。同じ容量のグリセロールストッ
クおよび１０Ｍ ＮａＳＣＮを、９６チャネル５００ｎｌキャピラリーカセット
に入れた。同時係属出願Ｕ．Ｓ．０９／５７７，１９９（本明細書中で、その全
体が参考として援用される）に開示される空気サイクラー（ｃｙｃｌｅｒ）中で
６０℃で行った。キャピラリーカセットを、同時係属出願Ｕ．Ｓ．０９／５７７
，１９９に開示されるキャピラリーカセット洗浄器中で８０％エタノールリンス
で洗浄し、そして窒素を流して乾燥した。次いで、カセットを、プライマー、Ｅ
Ｔターミネータープレミックスおよび水の１：４：５混合物を、毛管現象によっ
て満たし、そして空気サイクラー中でサイクルさせた。サイクルプロトコルは、
上の実施例１に記載されるようにＥＴターミネーターに対してであった。これら
のサンプルは、８０％エタノールを含むマイクロタイタープレートに、遠心分離
（４℃で３０分間の３２２０ｇ）によって分配されることによってエタノール沈
澱された。デカンテーションおよびエタノールを除去するための５０ｇでの３０
秒の逆回転の後、これらのサンプルを５μｌの水に再懸濁した。次いで、これら
のサンプルをＭｅｇａＢＡＣＥTMに、２ｋＶ、３０秒間の注入、続いて、８ｋＶ
、１４０分間の分離を用いて、注入した。これらのデータを、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
Ａｎａｌｙｚｅｒ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃ
ｓ）を用いて分析し、次いで、Ｐｈｒｅｄ２０塩基呼出し（ｃａｌｌｉｎｇ）ス
コアを決定するために処理した。図２３ＡおよびＢは、５６１塩基のＰｈｒｅｄ
２０スコアを有したこの方法によって得られる痕跡を示す。この例は、本発明の
、細菌の冷凍されたグリセロールストックからの直接配列決定への適用を実証す
る。この方法は、プレートが、新鮮であるか、または乾燥されているかに関わり
なく、寒天プレートまたは同様な固体増殖培地上で増殖される細菌コロニーの配
列決定に適用され得ることが、当業者に明らかである。
【０１５９】 （実施例１４） （核酸のナノスケール単一塩基伸長を用いる遺伝子型決定（ｇｅｎｏｔｙｐｉ
ｎｇ）） 本発明は、ナノスケール遺伝子型決定反応を行うために適用され得る。
【０１６０】 単一塩基伸長（ＳＢＥ）反応を、９６チャンネルキャピラリーカセットにおい
て、行った。単一塩基伸長分析は、塩基が問合される直前に終結するＤＮＡプラ
イマーの単一塩基伸長からなる。２５μｌのＰＣＲ反応は、５ｎｇ／μｌのゲノ
ムヒトＤＮＡ、１μＭの正方向プライマーおよび逆方向プライマー、緩衝液、Ｍ
ｇＣｌ2およびＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄを含む２５μｌのＰＣＲ反応物を調
製した。ＰＣＲサイクリングは、９６℃で１２分、９４℃で２０秒の３５サイク
ル、６０℃で２０秒、および７２℃で３０秒、続いて７２℃で２分であった。Ｅ
ｘｏ Ｉ／ＳＡＰクリーンアップを、９単位のＳＡＰおよび４５単位のＥｘｏ
Ｉを、２５μｌのＰＣＲ産物に添加することによって、行った。反応物を、３７
℃で４５分間インキュベートし、次いで、９５℃に１５分間加熱することによっ
て、ＥｘｏＩ／ＳＡＰ酵素を変性した。
【０１６１】 全容積コントロール反応物について、９μｌのＳＢＥプレミックス（蛍光標識
されたジデオキシターミナネーター、ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝溶液、１μｌの
２μＭプライマーを含む）を、１０μｌのＥｘｏＩ／ＳＡＰ処理ＰＣＲ産物に添
加した。５００ｎｌのキャピラリーカセットにおける反応物について、サンプル
を毛管現象によって、充填した。
【０１６２】 単一塩基伸長反応を、９６℃で１０秒、５０℃で５秒、６０℃で３０秒の２５
サイクルで実施した。熱サイクリングを、全容積コントロールについて、ＭＪ
Ｒｅｓｅａｒｃｈテトラッド（ｔｅｔｒａｄ）（熱サイクリングマシーンの型）
、またはキャピラリーカセットサンプルについては、空気サイクラー（同時係属
出願Ｕ．Ｓ．０９／５７７，１９９（本明細書中でその全体が参考として援用さ
れる）に開示される）のいずれかにおいて、実施した。サンプルを水に分配し、
そして分析のためにＭｅｇａＢＡＣＥTMに注入した。
【０１６３】 図２４は、キャピラリーベースの反応が、単一ヌクレオチド多型性を正しく同
定し得ることを立証する。トレース１、３および４を、問い合わせされた塩基に
おいてホモ接合性せあるサンプルから得た。トレース２を、問い合わせ塩基にお
いてヘテロ接合性であるサンプルから得、そして対立遺伝子多型性が、ナノスケ
ール反応物を使用して検出され得ることを実証する。シグナルは、本質的に、全
容積反応を用いて得られるシグナルと同じである。
【０１６４】 プロセスの全体（ＰＣＲからＳＢＥ）を、キャピラリーカセットを用いて達成
した。
【０１６５】 本願に記載にされるように、キャピラリー中でのテンプレート捕獲を、このナ
ノスケール一塩基伸長反応の改善されたバージョンにおいて使用し、そしてより
よい結果を提供する。
【０１６６】 逆転写および蛍光標識リボヌクレオチドを使用するメッセンジャーＲＮＡの一
塩基伸長は、ゲノムＤＮＡに対する代替物としてｍＲＮＡを使用する遺伝子型決
定を可能にすることもまた当業者に明らかである。
【０１６７】 （実施例１５） （増幅フラグメント長多型性を用いるナノスケール遺伝子型決定） 本発明の方法を使用して、ナノリットルの容積において、ＡＦＬＰ（増幅フラ
グメント長多型性）を実施し得る。ＡＦＬＰ反応を実施するために、ゲノムＤＮ
Ａを、制限酵素の対で消化する。フラグメントを、リンカーに連結するか、使用
される２つの制限酵素によって決定されるように、特定の方向に、特定の長さの
フラグメントを増幅するために増幅するか、またはあるいは、縮重（ｄｅｇｅｎ
ｅｒａｔｅ）プライマーを使用して、直接ＰＣＲによって増幅されるかのいずれ
かである。増幅されたフラグメントを、キャピラリー電気泳動によって分析する
。ＡＦＬＰ分析法を使用して、可変プラグメントおよび定常フラグメントを有す
る、ゲノムの「表現」（単位複製配列とも呼ばれる）を生成する。この単位複製
配列を使用して、生物の集団の多様性を評価するか、または配列およびマーカー
情報がほとんど利用可能ではない生物におけるゲノムマップを作製する。
【０１６８】 （実施例１６） （直接ディスプレイ分析を用いるナノスケール遺伝子型決定） 本発明の方法は、ナノリットル容積中での直接ディスプレイ分析を実施するた
めに、使用され得る。直接ディスプレイ分析方法を実施するために、相補的ＤＮ
Ａを、制限酵素の対で消化する。これらのフラグメントをリガンドに連結され使
用される２つの制限酵素に依存する特定の配向の特定の長さのフラグメントを増
幅するために増幅されるか、あるいは縮重プライマーを使用してＰＣＲによって
直接増幅するかののいずれかである。これらの増幅されたフラグメントを、キャ
ピラリー電気泳動によって分析する。直接ディスプレイ分析方法は、可変フラグ
メントおよび定常フラグメントを有する、転写物（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｓｏ
ｍｅ）の「表示（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）」を生成するために使用され
得る。直接ディスプレイ分析は、生物間の発現のレベルの定量的変化、または環
境的効果または生理学的効果を評価するために使用される。
【０１６９】 （実施例１７） （ミクロサテライト分析によるナノスケール遺伝子型決定） 本発明の方法は、ナノリットル容量でのミクロサテライト分析により遺伝子型
決定を実施するために使用され得る。ミクロサテライト分析反応により遺伝子決
定を実施するために、ゲノムＤＮＡを、マーカーパネル（例えば、ＰＥ Ａｐｐ
ｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｌｉｎｋａｇｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｓｅｔｓ
）を用いてＰＣＲ増幅する。例えば、９６ヒトサンプルを、４色分析を用いて約
３０分間、１２の遺伝子型にパネルに対して分析する。３つの色を４つのプライ
マーセットと共に使用するが、一方で、４番目の色は、内部サイズ標準を提供す
る。
【０１７０】 ＰＣＲ設定および熱サイクリングを、プライマーパネルの製造者によって推奨
されるように実施する。
【０１７１】 ポリメラーゼ連鎖反応混合物の例は、以下の通りである：
【０１７２】
【表１】 プライマー混合物は、正方向プライマーおよび逆方向プライマーの両方を含み、
各々は、５μＭの最終濃度である。
【０１７３】 熱サイクルプログラムの例は、以下の通りである：
【０１７４】
【表２】 （プーリング） シールされたＰＣサンプルトレイを−２０℃で保存する。
【０１７５】 最初に、１μｌの各ＰＣＲ産物をプールし、その後、最終容積を、水を用いて
、約１５〜２０μｌにする。次いで、サンプルを、透析する。透析を０．１Ｘ
ＴＥにおいて、１５分間行い、その後、プールされたＰＣＲサンプルをＭｅｇａ
ＢＡＣＥTMに充填する。
【０１７６】 （充填） サンプルを、以下のように、ＭｅｇａＢＡＣＥTMへの充填のために調製する：
【０１７７】
【表３】 （実施例１８） （核酸を用いるナノスケール酵素反応） 本発明は、ナノリットルの容積中での核酸を用いてナノスケール酵素反応を実
施する工程に有利に適用される。核酸は、本発明の方法に従って調製される、反
応チャンバ（例えば、ガラスキャピラリー）内に固定化される。キャピラリーは
、異なる酵素（例えば、制限酵素）の１つ以上を含む反応混合物で満たされる。
【０１７８】 代表的な制限酵素消化は、０．２〜１．５μｇの基質ＤＮＡおよびＤＮＡに対
して２〜１０倍過剰の制限酵素を含む、全容積２０μＬにおいて実施する。反応
緩衝液、酵素、水、およびＤＮＡを反応チューブ中で混合し、そして３７℃で１
〜４時間インキュベートする。本発明に従って、テンプレートＤＮＡを、キャロ
ラリーチューブの内部表面に結合させる。次いで、１×ＫＧＢ緩衝液（１００ｍ
Ｍグルタミン酸カリウム、２５ｍＭトリスアセテート、ｐＨ７．５、１０ｍＭ硫
酸マグネシウム、５０μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、および１ｍＭβ−メルカ
プトエタノール）中の制限酵素（例えば、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ）のプレミックスを
、毛細管現象によってキャピラリーに引く。この反応物を、３７℃で割り当てら
れた時間インキュベートし、その後、内容物を、アガロースゲルサイズ決めのた
めのゲル充填緩衝液に分配するか、または１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む溶液に、分
配する。
【０１７９】 異なる酵素を含む他の反応物もまた、可能である。これらの酵素は、メチル化
酵素、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ酵素、ターミナルトランスフェラーゼ酵
素、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ酵素、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ酵
素、ホスファターゼ酵素、キナーゼ酵素、エキソヌクレアーゼ酵素（例えば、Ｓ
１）、あるいは大豆ヌクレアーゼ、他のヌクレアーゼ酵素、リボヌクレアーゼ酵
素、あるいはＤＮＡまたはＲＮＡリガーゼ酵素を含むが、これらに限定されない
。これらの反応物のほとんどにおいて、酵素に対する核酸の比の制御は、反応プ
ロセスの成功に対して重要である。
【０１８０】 本願の使用は、核酸との濃度依存性酵素反応に関する誤差を有利に減少させ、
そして可変酵素の消費を減少させる。さらに、洗浄を通して、本発明の方法の使
用は、残留イオン（例えば、酢酸アンモニウム、ＥＤＴＡ、および塩化リチウム
）および他の汚染物（例えば、酵素活性を妨害する多糖類）の排除のために、有
効である。
【０１８１】 （実施例１９） （マイクロアレイスポッティングプレートからの直接配列決定） マイクロアレイを使用して生成されたデータの整合性を確実にするために、ス
ポットされたＤＮＡの配列の同一性が、高い信頼度と共に知られていることが必
要である。ＰＣＲは、しばしば、スポットされるＤＮＡを生成するために使用さ
れ、このことは、当該分野で周知であり、Ｔａｑおよび関連する熱安定的なポリ
メラーゼを、それがテンプレートを増幅するにつれて、千当たり特定の数の誤っ
た塩基対を導入する。誤りが導入された場合、それらは検出されなければならず
、そして増幅された産物またはそれからのデータが廃棄されなくてならない。通
常、このことは、ＰＣＲ産物をスポットする工程と関連する工程から分離された
種々の処理工程を必要とする。しかし、本発明の実施形態の使用は、配列確認の
効率を非常に増加させる。
【０１８２】 一連のマイクロアレイスポッティングサンプルの配列の確認は、本発明の方法
を使用して、以下のように達成された。
【０１８３】 マイクロアレイスポッティングサンプルを、ヒトゲノムＤＮＡテンプレート由
来のＰＣＲサンプル（平均５００ｂｐ）から調製した。これらの産物を、標準グ
アニジウム塩酸塩ガラスフィルタープレート処理を使用し、そして等容量の１０
Ｍのチオシアン酸ナトリウムと混合して精製した。サンプルを、マイクロアレイ
スライドへの引き続くスポッティングにために、マイクロタイタープレート（「
スポッティングプレート」）に配置した。
【０１８４】 ＰＣＲ産物配列およびマイクロアレイハイブリタイゼーションスライド上での
位置整列を確認するために、配列決定反応を、９６キャピラリーカセットの端部
をスポッティングプレートに浸漬し、そしてＤＮＡをキャピラリーの内部表面に
結合させることによって、実施した。８０％エタノールでの洗浄工程の後、キャ
ピラリーを、緩衝液、ポリメラーゼ、色素標識ジデオキシヌクレオチド、および
１×濃度の配列決定プライマーを含む配列決定混合物で満たした。熱サイクリン
グ（９５℃で５秒、５５℃で５秒、６０℃で６０秒の３０サイクル）の後、配列
決定反応物を、エタノール沈澱によって精製し、そしてＭｅｇａＢＡＣＥTMによ
って分析した。
【０１８５】 この実施例において、６０サンプルが、確認配列を得、３３５塩基（４５０ｂ
ｐ最大）の平均読み取り長を有した。同じ調製物およびアレイ上にスポットされ
た供給源からの直接配列決定によって、本発明者らは、ＰＣＲ産物の位置または
同一性における曖昧さを解決した。
【０１８６】 （実施例２０） （ＰＣＲヌクレオチドおよびプライマーの予備除去を行わないＰＣＲ産物の直
接配列決定） 本発明の方法は、配列決定の前にＰＣＲ産物の精製を簡単化するために使用さ
れている。代表的に、プライマーおよび過剰のｄＮＴＰを除去するために、エキ
ソヌクレアーゼＩ（ＥｘｏＩ）および北極エビ（ａｒｃｔｉｃ ｓｈｒｉｍｐ）
アルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）を使用するＰＣＲ産物の酵素的精製は、サイ
クル配列決定の前に必要とされる。しかし、テンプレート結合は、サイズ依存性
であるために、取り込まれていないプライマーおよび残りのヌクレオチドは、そ
の代わり、テンプレートのキャピラリーへの示差的結合によってテンプレートか
ら除去され得、続いて、洗浄によってヌクレオチドおよびプライマーが除去され
得る。このアプローチは、ＰＣＲ産物の酵素的クリーンアップを取り除き、そし
て全ての仕事の流れを非常に簡略化する。
【０１８７】 証拠として、Ｍ１３ ＤＮＡ（マウスサブクローン挿入物を含む）の９６のＰ
ＣＲ産物を、ＰＣＲ増幅後に酵素的精製を行うことなく直接配列決定した。
【０１８８】 ＰＣＲ増幅反応を、マウスゲノムＤＮＡのサブクローン挿入物（約２０００ｂ
ｐ）を含むＭ１３テンプレートを使用して実施した。このＭ１３テンプレートは
、以前に、ポリエチレングリコール沈澱および界面活性剤溶媒和（Ｔｈｅｒｍｏ
ｍａｘ）によって調製し、２００倍に希釈し、そして９６ウェルマイクロタイタ
ープレートに整列した。
【０１８９】 この溶液の２μＬのアリコートを、以下を用いて調製されたＰＣＲ増幅混合物
に移した：２．５μｌ １０Ｘ ＧｅｎｅＡｍｐ緩衝液、０．２μＬの各２５ｍ
ＭのｄＮＴＰ、０．５μＬの１０μＬ Ｍ１３ −４０ＦＷＤ（ＧＴＴ ＴＴＣ
ＣＣＡ ＧＴＣ ＡＣＧ ＡＣ）、０．５μＬの１０μＭ Ｍ１３ −４０Ｒ
ＥＶプライマー（ＧＧＡ ＴＡＡ ＣＣＡ ＴＴＴ ＣＡＣ ＡＣＡ ＧＧ（、
１．５μＬの２５ｍＭ塩化マグネシウム、０．５μＬの５Ｕ／μＬ Ａｍｐｌｉ
Ｔａｑポリメラーゼ、および１７．３μＬの水。混合およびプレートのシール後
、反応物を、９５℃で１０秒、５５℃で１０秒、および７２℃で２分の３０サイ
クルで、熱サイクルさせた。ＰＣＲ増幅後、５μＬのアリコートを取り出し、分
離した９６ウェルプレート中で、５μＬの１０Ｍチオシアン酸ナトリウムと混合
した。
【０１９０】 ９６ウェルキャピラリーカセットのキャピラリーを、カオトロープ−ＰＣＲ産
物混合物に浸漬し、従って、カセットを満たした。６０℃での５分間のインキュ
ベーション後、残留カオトロープ、未結合の緩衝液成分およびＤＮＡを、減圧化
でキャピラリーを通してエタノールを引くことによって適用される、８０％エタ
ノール洗浄を用いて除去した。１分間の空気流で内部表面を乾燥した後、キャピ
ラリーを、ＥＴターミネーター反応混合物の１ｘ溶液および正方向配列決定プラ
イマー（Ｍ１３ −２１ＦＷＤ（ＴＧＴ ＡＡＡ ＡＣＧ ＡＣＧ ＧＣＣ Ａ
ＧＴ））を含む配列決定混合物に浸漬した。
【０１９１】 サイクル配列決定を、空気−熱サイクルにおいてキャピラリーに端部をシール
することによって、行った。この反応を、９５℃の５秒、５５℃の５秒、および
６０℃の６０秒で、３０回サイクルさせた。サイクル配列決定産物を、遠心力を
使用して、４０μＬの８０％エタノールを含むマイクロタイタープレートに分配
した。３０００×ｇでの３０分間の遠心分離後、アルコールをデカントし、ペレ
ット化したＤＮＡを、５μＬのｄｄＨ２Ｏ中に再懸濁し、そしてサンプルを、Ｍ
ｅｇａＢＡＣＥTMによって分析した。
【０１９２】 これらの９６のサンプルに対して、５５０塩基の平均読み取り長さを、８３％
の通過率および４４００塩基の合計を用いて達成した。この手順を、全容積およ
び酵素的に精製された反応物について、改良が実証された５０００を超えるサン
プルについて繰り返した。
【０１９３】 全ての特許、特許公報、および本明細書中に記載される出版された参考文献は
、各々が個々におよび具体的に本明細書中で参考として援用されるように、本明
細書中でその全体が参考として援用される。本発明の好ましい例示的な実施形態
が記載されるが、当業者は、本発明が、説明された実施形態（これらは、例示の
目的で示され、制限のために示されているわけではない）以外によって実施され
得ることが理解する。本発明は、上記の特許請求の範囲によってのみ制限される
。
【図面の簡単な説明】 本発明の上記および他の目的および利点は、添付の図面と組み合わせて、以下
の詳細な説明を考慮すると明らかであり、ここで同様の記号は、全体を通して、
同様の部分をいう。
【図１】 図１は、サイクル配列決定産物の調製のための一体化システムの概略図であり
、このシステムは、本発明の方法を有利に使用し得る。
【図２】 図２は、サイクル反応の産生における工程を例示するフローチャートであり、
この第１の工程は、本発明の方法の使用によって有利に改善され得る。
【図３Ａ】 図３Ａは、本発明のハイスループット実施形態において使用されるキャピラリ
ーカセットの斜視図である。
【図３Ｂ】 図３Ｂは、本発明の方法のハイスループット適用のためのシステムにおけるキ
ャピラリーカセットホルダーに挿入された図３Ａのキャピラリーカセットの斜視
図である。
【図３Ｃ】 図３Ｃは、本発明の方法を有利に使用し得る可撓性キャピラリーカセットであ
る。
【図３Ｄ】 図３Ｄは、キャピラリー末端が湾曲したパターンにあるように湾曲した方向に
曲げられた図３Ｃのキャピラリーカセットを例示する。
【図３Ｅ】 図３Ｅは、本発明に従う核酸の直接的な可逆的固定を含むサンプル調製のため
の、機能的にキャピラリーチューブに等価なチャネルを含むマイクロチップデバ
イスである。
【図４Ａ】 図４Ａは、本発明における使用のための、図３のキャピラリーカセットから液
体を分配するための分配ヘッドを例示する。
【図４Ｂ】 図４Ｂは、図４Ａの空気置換分配ヘッドの内部断面図を示す。
【図４Ｃ】 図４Ｃは、図４Ａの分配ヘッドを示し、これは分配ヘッドが閉鎖されている。
【図５Ａ】 図５Ａは、図３Ａのキャピラリーカセットから流体を分配するために使用され
得る遠心分離器の上面図を例示する。
【図５Ｂ】 図５Ｂは、マイクロタイタープレート内に挿入されたキャピラリーカセットを
含むスイングマイクロプレートバケットを保持する図５Ａの回転アームの断面を
例示する。
【図６】 図６は、本発明のテンプレート捕獲および正規化方法を有利に使用し得る並行
反応を実施するための、熱サイクルデバイスに挿入された図３Ｂに示されるキャ
ピラリーカセットおよびホルダーを有する空気ベースの熱サイクルデバイスの概
略図を示す。
【図７Ａ】 図７Ａは、一体化されたキャピラリーカセットシーリング膜を有する空気ベー
スの熱サイクラーの内部断面図を示し、これは、本発明のテンプレート捕獲方法
によって有利に使用され得る。
【図７Ｂ】 図７Ｂは、図７Ａの空気ベースの熱サイクラーの斜視詳細図を示し、これは、
キャピラリーカセットが挿入されたチャンバを例示するために蓋が上げられてい
る。
【図７Ｃ】 図７Ｃは、図７Ａの熱サイクラーの内部チャンバに挿入されたキャピラリーカ
セットを有するカセット区画の断面図を示す。
【図８Ａ】 図８Ａは、本発明の方法のハイスループット性能において有用なキャピラリー
カセット洗浄ステーションの前面図である。
【図８Ｂ】 図８Ｂは、洗浄マニホルドが下降し、そして洗浄タンクが上昇した図８Ａのキ
ャピラリー洗浄ステーションの側面図である。
【図８Ｃ】 図８Ｃは、洗浄マニホルドが上昇し、そして洗浄タンクが下降した図８Ａおよ
び図８Ｂのキャピラリー洗浄ステーションのさらなる図である。
【図８Ｄ】 図８Ｄは、洗浄マニホルドの内部断面である。
【図８Ｅ】 図８Ｅは、洗浄ステーションの概略的な給排水設備図である。
【図８Ｆ】 図８Ｆは、洗浄タンクの上面斜視図である。
【図９】 図９は、実施例１の配列決定分析についての成功％対読み取り長さウインドウ
の棒グラフを示す。
【図１０】 図１０は、実施例２の反応産物の電気泳動図である。
【図１１】 図１１は、実施例３の配列決定分析についての成功％対読み取り長さウインド
ウの棒グラフを示す。
【図１２Ａ】 図１２Ａは、全容量で調製した電気泳動的に分離したＰＣＲ産物の走査ゲル画
像を示す。
【図１２Ｂ】 図１２Ｂは、ナノスケール容量（５００ｎＬ）で調製した電気泳動的に分離し
たＰＣＲ産物の走査ゲル画像を示す。
【図１３】 図１３は、５００ｎＬ容量におけるＰＣＲ、全容量におけるクリーナップ反応
を実施し、次いで、５００ｎＬで実施されたサイクル配列決定反応によって、調
製した配列決定混合物の分析の電気泳動図である。
【図１４】 図１４は、チューブ、キャピラリー、および表面結合を使用するキャピラリー
中で調製した産物についての等温反応のシグナル強度を比較するグラフである。
【図１５】 図１５は、核酸が可逆的に直接固定される、キャピラリーチューブを調製する
ための方法を説明するフローチャートである。
【図１６】 図１６は、本発明の方法の実施形態を例示する。
【図１７】 図１７Ａは、配列決定の前に反応混合物と混合された配列決定ＰＣＲ産物の結
果を示す。図１７Ｂは、まず、ＰＣＲテンプレートをチオシアン酸ナトリウムと
混合し、キャピラリーの内面にＤＮＡを結合し、ＤＮＡを８０％エタノールで洗
浄し、次いで配列決定した結果を示す。
【図１８】 図１８は、テンプレート捕獲プロトコル後のＤＮＡの保持された量を表す。
【図１９】 図１９は、テンプレート捕獲によって調製したサンプル（黒丸）と比較したＤ
ＮＡおよび配列決定試薬を予め混合することによって調製したサンプル（黒三角
）について、読み取り長さ対開始ＤＮＡ量のプロットを示す。
【図２０】 図２０は、１．５％アガロースゲルを通して電気泳動され、ＳＹＢＲ Ｇｒｅ
ｅｎ色素で染色され、そしてＦｌｕｏｒｉｍａｇｅｒ装置を用いて画像化された
、指示された開始量のｏＭ１３ｍｐ１８のテンプレート結合後のＰＣＲ反応の産
物を示す。
【図２１】 図２１は、テンプレート濃度の増加と共に得られた相対シグナル強度を表す。
【図２２】 図２２は、テンプレート濃度の増加と共に得られた相対シグナル強度を表し、
これは、テンプレート濃度の増加と共に増加するピーク高さを示す。
【図２３Ａ】 図２３Ａは、グリセロールストックからのナノスケール直接サイクル配列決定
によって得られる５６１塩基のＰｈｒｅｄ２０スコアを有するトレースを示す。
【図２３Ｂ】 図２３Ｂは、グリセロールストックからのナノスケール直接サイクル配列決定
によって得られる５６１塩基のＰｈｒｅｄ２０スコアを有するトレースを示す。
【図２４】 図２４は、テンプレート捕獲なしの、４個のナノスケール単一塩基伸長反応か
らのＭｅｇａＢＡＣＥ（登録商標）トレースであり、トレース２においてヘテロ
接合性を証明する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ジョバノビッチ， ステファン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94550， リバーモア， ヘイゼル ストリート 723 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA01 CA09 CA11 CA20 HA14 HA19 4B029 AA21 AA23 BB20 CC03 FA01 FA15 4B063 QA01 QA18 QQ42 QQ52 QR56 QR62 QR84 QS25 QS34 QS39 QX02

Claims (86)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＤＮＡ配列決定反応を実施するための方法であって、以下： 基板上にテンプレートＤＮＡを直接固定する工程、および次いで、該テンプレ
    ートＤＮＡを、該ＤＮＡ配列決定反応を達成する反応混合物と接触させる工程、
    を包含する、方法。
  2. 【請求項２】 前記テンプレートＤＮＡが、二本鎖ＤＮＡである、請求項１
    に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記テンプレートＤＮＡが、一本鎖ＤＮＡである、請求項１
    に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記テンプレートＤＮＡが、ポリメラーゼ連鎖反応によって
    調製される、請求項２または３に記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記テンプレートＤＮＡが、以下： 該テンプレートＤＮＡが固定されるのに十分な時間、前記基板と該テンプレー
    トＤＮＡの溶液とを接触させる工程、 によって固定されている、請求項１に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記溶液を除去する工程をさらに包含し、ここで該除去工程
    は、前記固定工程の後に生じる、請求項１に記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記基板を洗浄する工程をさらに包含し、ここで該洗浄工程
    は、前記除去工程の後に生じる、請求項６に記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記洗浄工程が不純物を除去する、請求項７に記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記洗浄工程が、少なくとも約７０％のエタノールのエタノ
    ール溶液を用いて達成される、請求項７に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記基板を乾燥する工程をさらに包含し、ここで該乾燥工
    程は、前記洗浄工程の後に生じる、請求項７に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記基板から前記ＤＮＡを溶出する工程をさらに包含し、
    ここで該溶出工程は、前記除去工程の後に生じる、請求項６に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記反応混合物と接触している前記テンプレートＤＮＡを
    、少なくとも１回の熱サイクルに供する工程をさらに包含する、請求項７に記載
    の方法。
  13. 【請求項１３】 前記ＤＮＡ配列決定反応の産物を分配する工程をさらに包
    含し、ここで該分配工程は、該反応が達成された後に生じる、請求項１２に記載
    の方法。
  14. 【請求項１４】 前記テンプレートＤＮＡ固定が、前記基板への飽和的結合
    により達成される、請求項１または５に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 請求項５に記載の方法であって、前記ＤＮＡテンプレート
    溶液が、物質を含み、該物質は非共有的相互作用により前記基板上への該テンプ
    レートＤＮＡの直接の固定を達成している、方法。
  16. 【請求項１６】 前記非共有的相互作用が静電的相互作用である、請求項１
    ５に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記物質がカオトロピック剤である、請求項１５に記載の
    方法。
  18. 【請求項１８】 請求項１７に記載の方法であって、ここで前記カオトロピ
    ック剤が、以下：尿素、過塩素酸ナトリウム、過塩素酸カリウム、臭化ナトリウ
    ム、臭化カリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、チオシアン酸ナトリウ
    ム、チオシアン酸カリウム、チオシアン酸グアニジン、イソチオシアン酸ナトリ
    ウム、イソチオシアン酸カリウム、塩酸グアニジン、イソチオシアン酸グアニジ
    ン、塩化リチウム、トリクロロ酢酸ナトリウム、ジメチルスルホキシド、テトラ
    −アミンハライド、塩化テトラエチルアミン、およびトリクロロ酢酸カリウム、
    からなる群より選択される、方法。
  19. 【請求項１９】 前記試薬混合物が、オリゴヌクレオチドプライマー、ＤＮ
    Ａポリメラーゼ、およびデオキシヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰ）を含む、請
    求項１に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記試薬混合物が、前記基板から前記ＤＮＡを溶出する、
    請求項１９に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 前記試薬混合物がさらに、限界濃度のジデオキシヌクレオ
    チド３リン酸を含む、請求項１９に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 前記ジデオキシヌクレオチド３リン酸のそれぞれが、蛍光
    団に結合体化した、請求項２１に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 前記プライマーが、前記ＤＮＡテンプレートの少なくとも
    １本の鎖において、複数の連続的に整列されたヌクレオチドに相補的である、請
    求項１９に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 前記プライマーが、蛍光団に結合体化される、請求項２３
    に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 前記蛍光団が、エネルギー移動蛍光団である、請求項２４
    に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 前記ＤＮＡポリメラーゼが熱安定性である、請求項１９に
    記載の方法。
  27. 【請求項２７】 前記反応混合物と接触している前記テンプレートＤＮＡを
    、少なくとも１回の熱サイクルに供する工程をさらに包含する、請求項１９に記
    載の方法。
  28. 【請求項２８】 前記基板が、囲まれたチャネルの少なくとも１つの内部表
    面である、請求項１に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 前記囲まれたチャネルを液体で充填する工程をさらに包含
    する、請求項２８に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 前記囲まれたチャネルを該チャネルに含まれる液体で出口
    に対してシールする工程をさらに包含する、請求項２８に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 前記基板がガラスである、請求項２８に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 前記基板が金属である、請求項２８に記載の方法。
  33. 【請求項３３】 前記基板が半金属である、請求項２８に記載の方法。
  34. 【請求項３４】 前記囲まれたチャネルが、キャピラリーチューブにより形
    成される、請求項２８に記載の方法。
  35. 【請求項３５】 前記囲まれたチャネルが、少なくとも１部分でカバーを配
    置されているくぼみによって形成され、ここで該カバーは該チャネルを囲んでい
    る、請求項２８に記載の方法。
  36. 【請求項３６】 請求項１、５、６、７、１１、１２、１３、１５、１９ま
    たは２８のいずれか１項に記載の方法により達成されるＤＮＡ配列決定反応の、
    産物。
  37. 【請求項３７】 請求項３６に記載のＤＮＡ配列決定反応の産物から誘導さ
    れた、ＤＮＡ配列。
  38. 【請求項３８】 コンピューター読み取り可能な媒体に具現化された、請求
    項３７に記載のＤＮＡ配列。
  39. 【請求項３９】 コンピューターデータ信号であって、請求項３７に記載の
    ＤＮＡ配列を含む、搬送波に具体化された、コンピューターデータ信号。
  40. 【請求項４０】 事前に決定された量に近似の核酸を得るための方法であっ
    て、以下： 該核酸を基板に直接固定する工程であって、ここで該基板は、該核酸を飽和的
    に結合する工程、 を包含する、方法。
  41. 【請求項４１】 前記核酸がＲＮＡである、請求項４０に記載の方法。
  42. 【請求項４２】 前記核酸がＤＮＡである、請求項４０に記載の方法。
  43. 【請求項４３】 前記ＤＮＡが二本鎖ＤＮＡである、請求項４２に記載の方
    法。
  44. 【請求項４４】 前記ＤＮＡが一本鎖ＤＮＡである、請求項４２に記載の方
    法。
  45. 【請求項４５】 前記ＤＮＡがポリメラーゼ連鎖反応によって生成される、
    請求項４２に記載の方法。
  46. 【請求項４６】 前記ＤＮＡが、真核生物細胞、原核生物細胞、古細菌細胞
    、ウイルス、またはバクテリオファージから単離される、請求項４２に記載の方
    法。
  47. 【請求項４７】 前記ＤＮＡが、化学合成プロセスにより生成される、請求
    項４２に記載の方法。
  48. 【請求項４８】 前記核酸が、酵素反応に用いられる、請求項４０に記載の
    方法。
  49. 【請求項４９】 前記ＤＮＡが、酵素反応に用いられる、請求項４２に記載
    の方法。
  50. 【請求項５０】 前記反応が、ＤＮＡ配列決定反応である、請求項４９に記
    載の方法。
  51. 【請求項５１】 事前決定した量に近似の核酸を分配する方法であって、以
    下： 第１の基板上に該核酸を直接固定する工程であって、ここで該基板は、該核酸
    を飽和的に結合する工程、および 該核酸を第２の基板に移動する工程、 を包含する、方法。
  52. 【請求項５２】 前記基板から前記核酸を溶出させる工程をさらに包含する
    、請求項５１に記載の方法。
  53. 【請求項５３】 前記核酸がＲＮＡである、請求項５１に記載の方法。
  54. 【請求項５４】 前記核酸がＤＮＡである、請求項５１に記載の方法。
  55. 【請求項５５】 前記ＤＮＡが二本鎖ＤＮＡである、請求項５４に記載の方
    法。
  56. 【請求項５６】 前記ＤＮＡが一本鎖ＤＮＡである、請求項５４に記載の方
    法。
  57. 【請求項５７】 前記核酸が、約１〜１０００ナノリットルの液体容積で、
    前記第２の基板に移動される、請求項５１に記載の方法。
  58. 【請求項５８】 前記核酸が、約１〜５００ナノリットルの液体容積で、前
    記第２の基板に移動される、請求項５１に記載の方法。
  59. 【請求項５９】 前記核酸が、約１〜１００ナノリットルの液体容積で、前
    記第２の基板に移動される、請求項５１に記載の方法。
  60. 【請求項６０】 前記核酸が、約１〜１０ナノリットルの液体容積で、前記
    第２の基板に移動される、請求項５１に記載の方法。
  61. 【請求項６１】 前記核酸が、以下： 該核酸が固定されるのに十分な時間、前記基板と該核酸の溶液とを接触させる工
    程、 によって固定される、請求項４０または５１に記載の方法。
  62. 【請求項６２】 前記核酸溶液が、物質を含み、該物質は、非共有的相互作
    用により前記基板上への該核酸の直接の固定を達成している、請求項６１に記載
    の方法。
  63. 【請求項６３】 前記非共有的相互作用が静電的相互作用である、請求項６
    ２に記載の方法。
  64. 【請求項６４】 前記物質がカオトロピック剤である、請求項６２に記載の
    方法。
  65. 【請求項６５】 請求項６４に記載の方法であって、ここで前記カオトロピ
    ック剤が、以下：尿素、過塩素酸ナトリウム、過塩素酸カリウム、臭化ナトリウ
    ム、臭化カリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、チオシアン酸ナトリウ
    ム、チオシアン酸カリウム、チオシアン酸グアニジン、イソチオシアン酸ナトリ
    ウム、イソチオシアン酸カリウム、塩酸グアニジン、イソチオシアン酸グアニジ
    ン、塩化リチウム、トリクロロ酢酸ナトリウム、ジメチルスルホキシド、テトラ
    −アミンハライド、塩化テトラエチルアミン、およびトリクロロ酢酸カリウム、
    からなる群より選択される、方法。
  66. 【請求項６６】 前記溶液を除去する工程をさらに包含し、ここで該除去工
    程は、前記固定工程の後に生じる、請求項６１に記載の方法。
  67. 【請求項６７】 前記基板を洗浄する工程をさらに包含し、ここで該洗浄工
    程は、前記除去工程の後に生じる、請求項６６に記載の方法。
  68. 【請求項６８】 前記基板を乾燥する工程をさらに包含し、ここで該乾燥工
    程は、前記洗浄工程の後に生じる、請求項６７に記載の方法。
  69. 【請求項６９】 前記基板が、囲まれたチャネルの少なくとも１つの壁であ
    る、請求項４０または５１のいずれかに記載の方法。
  70. 【請求項７０】 前記囲まれたチャネルを液体で充填する工程をさらに包含
    する、請求項６９に記載の方法。
  71. 【請求項７１】 前記基板がガラスである、請求項６９に記載の方法。
  72. 【請求項７２】 前記基板が金属である、請求項６９に記載の方法。
  73. 【請求項７３】 前記基板が半金属である、請求項６９に記載の方法。
  74. 【請求項７４】 前記囲まれたチャネルが、キャピラリーチューブにより形
    成される、請求項６９に記載の方法。
  75. 【請求項７５】 前記囲まれたチャネルが、少なくとも１部分でカバーを配
    置されているくぼみによって形成され、ここで該カバーは流体連絡を防止する隔
    壁を作製している、請求項６９に記載の方法。
  76. 【請求項７６】 事前に決定された量に近似のサイズ選択されたＤＮＡを得
    るための方法であって、以下： 正規化されるべきＤＮＡをサイズ選択する工程、および 該サイズ選択したＤＮＡを基板に直接固定する工程、 を包含し、 ここで該基板は、該核酸を飽和的に結合する、方法。
  77. 【請求項７７】 得られるべき前記ＤＮＡが、プラスミドまたはエピゾーマ
    ルＤＮＡである、請求項７６に記載の方法。
  78. 【請求項７８】 前記サイズ選択が、囲まれたチャネルの穴からのゲノムＤ
    ＮＡの排除により達成される、請求項７７に記載の方法。
  79. 【請求項７９】 前記囲まれたチャネルが、キャピラリーチューブである、
    請求項７８に記載の方法。
  80. 【請求項８０】 前記固定が、前記囲まれたチャネルまたはキャピラリーチ
    ューブの少なくとも１つの壁を、ＤＮＡおよびカオトロピック剤を含有する溶液
    と接触させる工程により達成される、請求項７８または７９に記載の方法。
  81. 【請求項８１】 請求項８０に記載の方法であって、ここで前記カオトロピ
    ック剤が、以下：尿素、過塩素酸ナトリウム、過塩素酸カリウム、臭化ナトリウ
    ム、臭化カリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、チオシアン酸ナトリウ
    ム、チオシアン酸カリウム、チオシアン酸グアニジン、イソチオシアン酸ナトリ
    ウム、イソチオシアン酸カリウム、塩酸グアニジン、イソチオシアン酸グアニジ
    ン、塩化リチウム、トリクロロ酢酸ナトリウム、ジメチルスルホキシド、テトラ
    −アミンハライド、塩化テトラエチルアミン、およびトリクロロ酢酸カリウム、
    からなる群より選択される、方法。
  82. 【請求項８２】 請求項１、５、６、７、１０、１５、１６、１７、１８、
    ２８、３４、３５、４０、４１、４２、または５０のいずれか１項に記載の基板
    であって、前記核酸または前記ＤＮＡが固定されている、基板。
  83. 【請求項８３】 酵素反応中に、事前に決定された量に近似の核酸を導入す
    るための方法であって、以下： 該酵素反応が実施されるチャンバの内部表面上に、直接、飽和的に、事前に決
    定された量に近似の核酸を過剰量の核酸から捕獲する工程、および次いで、該過
    剰量を除去する工程、 を包含する、方法。
  84. 【請求項８４】 酵素反応混合物が、前記過剰量の核酸が除去された後に、
    前記反応チャンバ中に導入される、請求項８３に記載の方法。
  85. 【請求項８５】 請求項８４に記載の方法であって、前記反応混合物が、以
    下： ポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＳｅｑｕｅｎａｓｅTM、Ｔｈｅｒｍｏ
    Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ＩＩTM、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、熱安定性ポリ
    メラーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、制限酵素、エンドヌクレアー
    ゼ、エキソヌクレアーゼ、トポイソメラーゼ、ターミナルトランスフェラーゼ、
    グリコシダーゼ、およびメチラーゼ、 からなる群の中から選択される酵素を含む、方法。
  86. 【請求項８６】 溶液中のテンプレートＤＮＡの配列を確認するための方法
    であって、ここで該溶液は、空間的にアドレス可能なアレイの一部として第１の
    基板に接触しているか、または接触させられることが所望されており、以下の工
    程： 該テンプレートＤＮＡを第２の基板上に直接固定する工程であって、ここで該
    テンプレートＤＮＡが、以下：該第２の基板を、該ＤＮＡが固定されるのに十分
    な時間、該テンプレートＤＮＡの溶液と接触させる工程、によって固定される、
    工程、および、次いで、 該テンプレートＤＮＡを、該ＤＮＡの配列決定反応を達成する反応混合物と接
    触させる工程であって、ここで該第１および第２の基板に接触させられるべき該
    テンプレートＤＮＡ溶液の組成は、本質的に同一である、工程、 を包含する、方法。
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