DE20022783U1 - Chemisches und biochemisches Reaktionssystem von geringem Volumen - Google Patents
Chemisches und biochemisches Reaktionssystem von geringem VolumenInfo
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Description
TER MEER STEINMEISTER & PARTNER GbR
PATENTANWÄLTE - EUROPEAN PATENT ATTORNEYS
Dr. Nicolaus ter Meer, Dipl.-Chem. Helmut Ste nmeister, Dipl.-Ing.
Peter Urner, Dipl.-Phys. Manfred Wiäbusch
Gebhard Merkle, Dipl.-Ing. (FH) Bernhard P. Wagner, Dipl.-Phys.
Mauerki rcherstrasse 45 Artur-Ladet eck-Strasse
D-81679 MÜNCHEN D-33617 BIELEFELD
07.02.2002
Case: PB9942 „.
928 East Arques Avenue,
Sunnyvale, California 94086
USA
Priorität USA 2. August 1999 60/146,732
Priorität USA 23. Mai 2000 09/577,199
CHEMISCHES UND BIOCHEMISCHES REAK TIONSSYSTEM
VON GERINGEM VOLUMEN
VON GERINGEM VOLUMEN
Querverweis auf verwandte Anmeh Lung
Diese Anmeldung beansprucht die Priorität der provisorischen Anmeldung Serien-Nr. 60/ 146 732, eingereicht am 2.August 1999.
Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Durchführuni; von Reaktionen in kleinem Maßstab. Insbesondere betrifft die vorliegende Offenbarung Zyklierungs- bzw. Cycling-Reaktionen in kleinem Maßstab und Vorrichtungen zum Zusammenfügen von Submikroliter-Reaktionsmischungen.
Das "Human Genome Program" ist ein wissenschaftliche:; Vorhaben, welches in den Vereinigten Staaten eine nationale Priorität darstellt. Das urspi üngliche Ziel des mit Bundesmitteln geförderten U.S.-Vorhabens bestand darin, die Sequen2 in zehnfacher Abdeckung bis zum Jahr 2005 zu vervollständigen. Eine entwurfsmäßige Vers ion des menschlichen Genoms in fünffacher Tiefe wird nun im Jahre 2001 erstellt werden. Um dieses Ziel zu erreichen, wurden die Bemühungen beschleunigt, um die Sequenzierungs-Durchsatzraten zu verbessern und die DNA-Sequenzierungs-Kosten zu verringern.
In den späten 1970er-Jahren entwickelten Sanger et al. ein e nzymatisches Kettenabbruch-Verfahren für die DNA-Sequenz-Analyse, welches einen ve:-schachtelten Satz von DNA-Fragmenten mit einem gemeinsamen Startpunkt und statistischen Terminationen an jedem Nukleotid über die gesamte Sequenz hinweg erzeugt. Lloyd Smith, Lee Hood und andere modifizierten das Sanger-Verfahren, um vier fluoreszierende Markierungen in Sequenzier-
• » e t ·
ungsreaktionen zu verwenden, was Separationen in einer einz: gen Spur ermöglichte. Dies führte zur Erzeugung der ersten automatischen DNA-Sequen::ierer. Noch kürzlicher sind fluoreszierende Energietransfer-Farbstoffe verwendet worden, ui &igr; Farbstoffsätze herzustellen, welche Signale um das 2- bis lOfache verstärken und die opische Konfiguration vereinfachen.
Automatische fluoreszierende Kapillaren-Feldanordnungs-Elektrophorese (CAE, capillary array electrophoresis)-DNA-Sequenzierer scheinen die Konsensus-Technologie zum Ersatz von Flachgelen zu sein. Kapillargelelektrophorese beschleunigt < lie Trennung von Sequenzierungsprodukten und besitzt das Potential, die Anforderungen an las Probenvolumen drastisch zu verringern. Das 96-Kanal-CAE-Instrument, MegaBACETM, welches im Handel von Molecular Dynamics (Sunnyvale, CA) erhältlich ist, verwendet einen konfokalen Fluoreszenz-Scanner für laserinduzierte Fluoreszenz (LIF), um bis zu durchschnittlich etwa 625 Basen pro Kapillare (Phred 20-Fenster) in 90-Minuten-Durc iläufen mit Zykluszeiten von zwei Stunden nachzuweisen. Ein konfokales räumliches FiIt ;rn führt zu einem höheren Signal-zu-Grundrauschen-Verhältnis, weil überflüssige Reflels tionen und Fluoreszenz aus umgebenden Materialien vor dem Signalnachweis an der Pr otomultiplier-Röhre (PMT) eliminiert werden. Folglich ist eine Empfindlichkeit auf der Ebene von Subattomolen je Sequenzierbande erzielbar. Die konfokale Bilderzeugung ist auc &igr; besonders bedeutsam in der Kapillarelektrophorese in Mikrochip-Analysesystemen, wo die '. iintergrundfluoreszenz eines Glas- oder Kunststoff-Mikrochips viel höher als diejenige von C uarzglaskapillaren sein kann. Kapillaren-Feldanordnungs-Elektrophoresesysteme werden vielt der anfänglichen Durchsatz-Erfordernisse der Genom-"Gemeinde" hinsichtlich DNA-Analyse erfüllen. Allerdings stellt die Probenherstellung in geringem Volumen noch eine signifik; inte Gelegenheit dar, um den Durchsatz zu erhöhen und Kosten zu senken.
Während Fluoreszenz-DNA-Sequenzierer den Durchsatz der Di IA-Sequenzerfassung verbessern, haben sie auch den Durchsatz-Engpass von der Sequenzerfä ssung zurück hin zur Probenherstellung gerückt. Als Antwort sind Schnellverfahren zur herstellung von Sequenziermatrizen und zur Transposon-erleichterten DNA-Sequenzierung entwickelt worden, wie auch Magnetperlen-Einfangverfahren, welche eine Zentrifugatio &igr; eliminieren. Thermophile ,4rc/zae-DNA-Polymerasen sind gescreent und gentechnisch verändert worden, um die Zuverlässigkeit zu verbessern, die Stabilität bei hohen Tempen türen zu sichern, die Längen bzw. Strecken zu erweitern und Affinitäten für Didesoxynul deotide und fluoreszierende Analoge zu verändern. Diese Verbesserungen haben zu liedrigeren Kosten für die Reagenzien, einer einfacheren Probenherstellung, einer höheren Datengenauigkeit und vergrößerten Lesestrecken geführt.
Die Sequenzier-"Gemeinde" hat auch Verfahren mit höherem Eurchsatz zur Herstellung von DNA-Matrizen, PCR-Reaktionen und DNA-Sequenzierungsreiktionen entwickelt. Die Probenherstellung erfolgte zunehmend Multiplex-artig und ist automatisiert worden, wobei 96- und 384-Vertiefungs-Mikrotiterplatten, Mehrkanal-Pipettiereinri :htungen und Laboratoriums-Roboter-Arbeitsstationen eingesetzt wurden. Im allgemeinen ahmen diese Arbeitsstationen die Manipulationen nach, die ein Techniker ausführen würde, und weisen ein Minimum-Arbeitsvolumen von etwa einem Mikroliter auf, obwohl "Stand -Alone"-Mehrkanal-Pipettiereinrichtungen eingesetzt werden, um mit kleineren Volumina um zugehen.
Ein typisches Verfahren zur Herstellung von Proben in vollem Maßstab für DNA-Schrotschuß-Sequenzierung auf Kapillarsystemen beginnt mil dem Lysieren von Phagenplaques oder Bakterienkolonien, um subklonierte DNA zu isolieren. Da Kapillarelektrophorese empfindlicher gegen Verunreingungen in Sequenzierrea ctionen ist als Flachgele, wird das subklonierte DNA-Insert mittels PCR amplifiziert, um sein s Konzentration in der Probe exponentiell zu erhöhen. Als nächstes werden Exonuklease I (Exol) und Alkalische Phosphatase aus arktischen Krabben (shrimp alkaline phosphata se, SAP) zugegeben, um eine enzymatische Säuberungsreaktion zur Entfernung von Primei und überschüssigen dNTPs vorzunehmen, welche die Zyklus-Sequenzierung stören würden. Exol wird verwendet, um die einzelsträngigen Primer zu dNMPs abzubauen, ohne doppelstri ngige Produkte zu verdauen. SAP wandelt dNTPs zu dNMPs um und senkt die dNTP-Konze itration von 200 &mgr;&Mgr;, wie für die PCR-Reaktion verwendet, auf weniger als 0,1 &mgr;&Mgr; zur Verv rendung bei der Fluoreszenz-Sequenzierung. Die Reaktion wird bei 370C durchgeführt und dinn auf 65°C erwärmt, um die Exol und SAP irreversibel zu denaturieren.
Da die PCR-Amplifikationsverfahren Matrizen-DNA im Überschuß für die Zyklus-Sequenzierung erzeugt, kann die ExoI/SAP-behandelte PCR-Pi obe vor dem Zyklus-Sequenzieren fünffach verdünnt werden. Dies senkt die Konzentration von Kontaminanten in einen Bereich ab, der eine geringere Störung der CAE-Analyse hervoi ruft. Zyklus-Sequenzierungs-Reagenzien werden zugegeben, typischerweise mit fluoreszent narkierten Farbstoff-Primern oder -Terminatoren, und die Reaktion wird thermozyklisch ausgeführt, um die lineare Amplifikation von markierten Fragmenten voranzutreiben. Schließlich werden die Proben, nach dem Zykeln, mit Ethanol, Formamid oder einem anderen Denaturierungsmittel gefällt, und die Probe wird elektrokinetisch in das CAE-System injiziert.
Dieser Arbeitsablauf hat zu einer dramatischen Verbesserung d er Leistung des MegaB ACE-Systems geführt und scheint derzeit gleichfalls die Methode der Wahl für andere CAE-
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Systeme zu sein. Unter Verwendung tatsächlicher Proben aus Einzelplaques und -kolonien von statistischen Subklonen des menschlichen Genoms oder "Exprimierten-Sequenz-Tags" (ESTs) hat dieser Arbeitsablauf mit linearem Polyacrylamid als Separationsmatrix die Erfolgsrate von Proben über 200 Basenpaaren von etwa 60% auf 85-90% verbessert und hat die durchschnittliche Lesestrecke von etwa 350 auf mehr als 500 Basen erhöht. Darüber hinaus hat sich dieses Verfahren als ziemlich robust erwiesen.
Während die obenstehenden Probenherstellungs-Verfahren den ] Durchsatz stark erhöht haben, bleiben die Kosten von Reagenzien eine Hauptkomponente de: Kosten der Sequenzierung.
Die CAE erfordert nur Subattomole an Probe. Die Reduzierung des Reaktionsvolumens wird deswegen die Kosten der DNA-Sequenzierung senken. Jedoch können wesentliche Reduzierungen des Reaktionsvolumens nur erreicht werden, wenn zufriedenstellende Verfahren zur Manipulierung und Reaktion von Proben und R iagenzien entwickelt werden können. Idealerweise wäre ein solches Verfahren automatisiert und so konfiguriert, daß mehrere Proben zu einer Zeit hergestellt werden könnter. Darüber hinaus wäre es wünschenswert, ein solches Verfahren als ein Modul zu integrieren, das fähig ist, Berührungspunkte mit zusätzlichen Komponenten, wie der CAE und einem Detektor für Separation und Analyse, aufzuweisen.
Mehrere Vorrichtungen sind entworfen worden, um die Automatisierung der Probenherstellung zu unterstützen. Zum Beispiel beschreibt das U.S.-Patent Nr. 5 720 923 ein System, in welchem zyklierende Reaktionen in kleinem Maßstab in Röhi chen mit einem Durchmesser von so wenig wie 1 mm stattfinden. Die Röhrchen werden anschließend an von Thermoblöcken erzeugte Wärmezyklen ausgesetzt, um eins gewünschte Reaktion zu bewirken. Mehrere Proben können in einem Einzelröhrchen ver irbeitet werden, indem kleine Mengen an Probe eingezogen werden, die in dem Röhrchen j( weils durch eine Flüssigkeit getrennt sind, welche sich nicht mit der Probe vereinigen wird.'. Das Fluid bewegt sich mittels einer Pumpe durch die Röhrchen. Diese Merkmale sind in ein 5 ystem eingebunden, welches die Röhrchen automatisch säubert, Probentröge mit Probe-enthe ltenden Vertiefungen bewegt und die Röhrchen in Kontakt mit den Vertiefungen in den Probei trögen bringt.
Das U.S.-Patent Nr. 5 785 926 offenbart ein System zum Transportieren kleiner Volumen an Probe. In diesem System wird mindestens eine Kapillarenröhre verwendet, um kleine Menge an Probe zu transportieren. Ein an einen Computer-gesteuerten Motor angeschlossener linearer Präzisions-Stellantrieb wirkt als ein pneumatischer Kolben, um Flüssigkeit unter Anwendung der Röhre zu aliquotieren und auszuteilen. Die Pn )benmenge wird durch einen optischen Sensor überwacht, der die Gegenwart von Flüssigkeit innerhalb des Kapillaren-
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segments nachweist. Das System schließt eine Fluidstation, welche abzusetzende Flüssigkeiten enthält, und eine Positionierungs-Vorrichtung zum Posit 'onieren der Transportkapillare ein.
Das U.S.-Patent Nr. 5 897 842 offenbart ein System für die automatische Probenherstellung unter Anwendung von Thermozyklen. In diesem System wird e ine Reaktionsmischung in eine Kapillarenröhre gepumpt. Ein Ende der Röhre wird verschlossen, indem Druck aus einer assoziierten Pumpe angewandt wird, während das andere Eide durch Pressen der Röhre gegen eine Barriere verschlossen wird. Die Pumpe dient atch zur Bewegung des Fluids innerhalb der Röhre. Sobald die Enden verschlossen sind, wird die Röhre an Thermozyklen ausgesetzt. In diesem System bewegt eine Roboter-Transfervoi richtung die Röhren zwischen der Proben-Vorbereitungs-Station, wo die Pumpe die Kompoi tenten der Reaktionsmischung in die Röhren lädt, und der Thermozykler-Station.
Es gibt einen zusätzlichen Bedarf für ein automatisches System, das fähig ist, Thermozykler-Reaktionen in kleinem Maßstab auf eine hochparallele Weis: durchzuführen. Das System sollte die rasche Herstellung von Zykler-Reaktionen mit minim den Reagenzien gestatten. Die Kombination aus der Reduktion der für eine Reaktion erforde rlichen Reagenzienmenge und der Reduktion der für eine Reaktion erforderlichen Zeit wird in großem Maße die Gesamtkosten der Herstellung von Zykler-Reaktionen verminde rn.
Kapillaren-Feldanordnungs-Elektrophoresesysteme und analy ische Kapillarelektrophorese-Mikrochip-Systeme können Subattomole von Reaktionsproduk :en nachweisen. Es ist ein Ziel der Erfindung, ein System für Zykler-Reaktionen zu offenbaren, welche in einem Submikroliter-Maßstab arbeiten, der die Vorteile der hchen Empfindlichkeit dieser analytischen Systeme ausnutzt. Diese Reduktion des Reaktionsvolumens wird die Reagenzienanforderungen und die Kosten jeder Reaktion vermildern. Es ist ein weiteres Ziel, ein automatisiertes System vorzusehen, das fähig ist, die für die Herstellung einer Zykler-Reaktion erforderliche Zeit zu verringern. Es ist ein zusatz! ches Ziel der Erfindung, ein System vorzusehen, welches mit derzeitigen Analysegeräte &agr;, einschließlich Kapillaren-Feldanordnungs-Elektrophoresesystemen und Elektrophorese-C lips, integriert werden kann.
Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, ein automatisiertes System zur Herstellung von Reaktionen und Befüllung eines Reaktionsbehälters unter An1S Sendung von Kapillarwirkung vorzusehen. Dies gestattet das Abmessen einer Flüssigkeiten ienge in eine Kapillarröhren-Länge von festgelegtem Volumen ohne den Gebrauch einer au ßeren Kraft zum Pumpen von Flüssigkeiten. Es ist ein weiteres Ziel, eine Reagenz-Abmessu igsvorrichtung zu offenbaren,
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welche auch als der Reaktionsbehälter fungieren kann. Es ist ai ich ein Ziel der Erfindung, ein System vorzusehen, welches erlaubt, daß die Nanomaßstab-Re aktionsbehälter gesäubert und wiederverwendet werden, wodurch Materialkosten eingespart w 2rden.
Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, ein System mit hochparalleler Verarbeitung zur Verfugung zu stellen, das einen größeren Durchsatz gestattet. ^ rorzugsweise wird das System der Dichte von Mikrovertiefungsplatten entsprechen. Es ist au ;h ein Ziel der Erfindung, ein automatisiertes System vorzusehen, in welchem eine Ar zahl verschiedener ZyklerReaktionen parallel unter Nutzung einer einzigen Teniperatur-Regulierungsquelle durchgeführt werden könnte, was eine effizientere Anwendung der Thermozykler-Vorrichtung zuläßt. Es ist ein weiteres Ziel, isothermische Reak ionen in einer hoch-parallelen Weise in Submikroliter-Volumen durchzuführen. Es ist auch ein Ziel der Erfindung, ein automatisches Reaktionsherstellungssystem vorzusehen, welches fähig ist, verfügbare Automatisierungswerkzeuge zu benutzen, indem es mit Sta idard-Plattengrößenformaten kompatibel ist.
Zusammenfassung der Erfindun
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Die obenstehenden Ziele sind erreicht worden durch ein Systei &igr; zur Herstellung von Zykler-Reaktionsmischungen. Das System verwendet eine Kapillarei !cassette, aufgebaut aus einer Anzahl von Kapillarröhrensegmenten, welche in paralleler Aus richtung angeordnet sind. Die Röhrensegmente reichen durch ein Substrat und sind im allgem einen in einem gleichmäßigen räumlichen Abstand positioniert. Die Kapillarenkassette kann sowohl zum Abmessen von Reagenzien als auch als eine Reaktionskammer, in welcher di<: Reaktion durchgeführt wird, verwendet werden.
Eine Reaktionsmischung, enthaltend eine Nukleinsäureprobe und Reaktionsreagenzien zur Durchführung einer thermischen Kreislaufreaktion bzw. einer einem thermischen Zyklus unterzogenen Reaktion (wie der Polymerasekettenreaktion, Ligasekettenreaktion oder der Herstellung einer Kettenabbruch-Sequenzierungsreaktion) wrd in die Kapillaren einer Kapillarenkassette eingeführt. In einer Ausführungsform enthält jede Kapillare eine einzigartige Nukleinsäureprobe aber dieselben Reaktionsreagen: den.
Die Reaktionsmischung kann auf verschiedene Weisen erzeugl werden. In einem Probenherstellungsverfahren haftet die Proben-DNA an der Innenseite der Kapillarröhren der Kapillarenkassette oder auf einem Substrat. Die Flüssigkeit, in welcher die DNA suspendiert war, kann aus der Kapillare oder von dem Substrat elirriniert werden, während die
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Nukleinsäure, gebunden an die Kapillare oder das Substrat, zurückgehalten wird. Die Reaktionsreagenzien können dann in die Kapillare oder auf d; ls Substrat eingeführt werden, wobei die Probe und die Reaktionsreagenzien unter Bildung e iner Assaymischung vereinigt werden. In einer anderen Ausführungsform werden die Kapilla ren in einer Kapillarenkassette 5 oder die Vertiefungen in einer Mehrfachvertiefungsplatte mit dehydratisierten Reaktionsreagenzien überzogen. Die Nukleinsäureprobe wird in die Kapillaren der Kapillarenkassette oder die Vertiefungen einer Mehrfachvertie: imgsplatte eingeführt, und die Reaktionsreagenzien werden unter Bildung einer Reaktionsmisc hung dehydratisiert. Wenn die Mehrfachvertiefungsplatte verwendet wird, wird die Reaktioni mischung anschließend in die Kapillaren einer Kapillarenkassette überführt. In einer anderen Ausführungsform werden sowohl die Reaktionsreagenzien als auch die Nukleinsäureprc be durch die Kapillaren einer Kapillarenkassette abgemessen. Die Kapillaren werden in die "V ertiefungen einer Probenplatte getaucht, und eine festgelegte Menge an Fluid (definiert durch das Innenvolumen der Kapillare) wird in die Kapillare eingezogen. Das von den Kapillarenröhren abgemessene Flüssigkeitsvolumen wird durch positive Verdrängung, Zem rifugalkraft oder ein anderes Verdrängungsverfahren in die Vertiefungen einer M:kroplatte ausgeteilt. Eine Kapillarenkassette wird verwendet, um auf eine ähnliche Weise sowohl die Reaktionsreagenzien abzumessen als auch die abgemessenen Flüssigke: ten auf eine Stelle auf einem Substrat auszuteilen, wobei die Probe und die Reaktionsrei .genzien unter Bildung einer Reaktionsmischung vereinigt werden. In jedem dieser Ausführungsformen werden Reaktionsreagenzien, die Nukleinsäureprobe und die zusamme ngestellte Reaktionsmischung in die Kapillarröhren einer Kapillarenkassette eingeführt oder durch Kapillarwirkung in die Kapillarenkassette eingezogen. Flüssigkeiten können auch dui ch aktives Füllen, wie mittels Druck oder Vakuum, in die Kapillaren eingeführt werden. Zu &eegr; Beispiel kann ein Ende der Kapillaren mit einer flüssigkeitsundurchlässigen (hydrophober), gasdurchlässigen Membran verschlossen werden. Durch Anlegen einer Vakuumkraft an ein &iacgr; Seite der Membran wird sich die Kapillare mit Flüssigkeit bis zur Höhe der Membran fülle n, wo hydrophobe Kräfte ein weiteres Füllen der Kapillare verhindern werden.
Die mit der Reaktionsmischung gefüllte Kapillarenkassette w xd als nächstes verschlossen, indem die zwei Enden der Kapillarenröhrensegmente gegei deformierbare Membranen gepresst werden. Die Kapillarenkassette mit den gegen deformierbare Membranen verschlossenen Enden ist innerhalb einer Innenkammer einer Te mperatur-Zykler-Vorrichtung enthalten. Die Temperatur-Zykler-Vorrichtung setzt den Inhalt der Kapillaren an thermische Zyklen aus, was das Stattfinden der Wärmezyklus-Reaktion ver irsacht. In einer Ausführungsform ist die Thermozykler-Vorrichtung eine Luftthermozyklerv Drrichtung. Diese Vorrichtung nimmt die Kapillarenkassette in eine Innenkammer auf, wo cie Enden der Kapillaren ver-
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schlossen werden. Die Temperaturänderungen finden unter Anwendung von schnell fließender Luft statt. Die Temperatur der umlaufenden Luft kan &igr; durch Entlüften von Luft aus der Zykler-Innenkammer nach außen rasch gesenkt werden. Lin Thermoelement-Sensor im Luftweg der Kapillarenkassette gestattet die präzise Überwachung der Temperatur der Reaktionsmischung. Unter den Gegebenheiten des raschei. Wärmetransfers durch die Kapillare und der präzisen Temperaturerfassung, welche durch das Thermoelement ermöglicht wird, sind rasche Reaktionszeiten möglich. Die koir pletten Thermozyklier-Zeiten, benötigt für 30 Zyklen Denaturierungs-Erhitzung, gefolgt /on einer Periode geringerer Temperatur zur Verlängerung eines 600-700 Basen langen DNA-Strangs, werden in 30 Minuten oder weniger durchlaufen und könnten theoretisch in so wenig wie 8 Minuten bewerkstelligt werden. Im Anschluß an eine programmierte Za] il von Thermozyklen wird die Kapillarenkassette aus der Temperaturzyklierungs-Kammer entf srnt.
Als nächstes wird die Reaktionsmischung aus der Kapillarenls assette ausgeteilt und auf ein Substrat überführt. In einer Ausführungsform ist das Substrat, auf welches die vervollständigte Reaktionsmischung abgegeben wird, ein analytisc tier Chip. Im Anschluß an den Transfer aus der Kapillarenkassette kann die Reaktionsmisc tiung getrennt und analysiert werden. Alternativ dazu kann die Probe in eine Mikroplate oder ein anderes Substrat ausgeteilt werden. Das Substrat kann dann, manuell oder mittels eines automatischen Systems, an eine Stelle gebracht werden, wo es durch Kapillaren-Feldanordnungs-Elektrophorese analysiert werden kann. Zusätzlich zur Elektro phorese kann das vorliegende Reaktionsherstellungssystem auch zur Verwendung bei der H Erstellung von Nukleinsäure-, Protein- oder anderen Biomolekülen für Mikrofeldanordnui igs-Analyse, Massenspektrometrieanalyse oder andere Analyseverfahren angepaßt werden. Die Kapillarenkassette kann auch zur Durchführung von ELISA oder anderen Assays, welcr e die Bindung an ein Substrat erfordern, verwendet werden.
Die Anwendung des vorliegenden Systems gestattet einen vere infachten Übergang zwischen Herstellungsschritten im Nanomaßstab und größeren Maßstab. Zum Beispiel kann der PCR-Schritt im Nanomaßstab in der Kapillarenkassette der vorlieg« nden Erfindung durchgeführt werden. Die resultierenden Produkte könnten für eine enzyr iatische Säuberung in einem größeren Maßstab in eine Mikroplattenvertiefung ausgeteilt we: den. Im Anschluß an die Säuberung kann die amplifizierte Nukleinsäure erneut in eine Na aomaßstab-Kapillarenkassette zur anschließenden Reaktionsmischungs-Herstellung (z. B. Zyklus-Sequenzierung) abgemessen werden. Damit erreicht man einen einfachen Übergang von Nanomaßstäben zu größeren Maßstäben.
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Die Austeilung der Reaktionsmischungen aus der Kapillarenkass Jtte in die Vertiefungen einer 96-Vertiefungs-Platte gestattet die anschließende Verarbeiturg durch Kapillaren-Feldanordnungs-Elektrophorese-Systeme. Auch eine Nachreaktions-Vi :rarbeitung ist möglich. Dies könnte das Abgeben der Reaktionsmischung in Ethanol zur Fällung der in der Reaktion hergestellten DNA-Fragmente oder das Abgeben der Reaktionsmischung in Formamid zur Denaturierung doppelsträngiger DNA-Reaktionsprodukte einschl leßen.
Im Anschluß an jede Verwendung kann die Kapillarenkassette in eine Kapillarenkassetten-Wascheinrichtung gebracht und gewaschen werden. Im Anschl aß an das Waschen kann die Kapillarenkassette wiederverwendet werden.
Das System kann mit Magazinen zum Halten der Probenplatten, der Mehrfachvertiefungs-Mischplatten und der Platten, welche die fertiggestellten Reaktionen enthalten, entworfen werden. Dies würde dem System erlauben, kontinuierlich zu lauf ^n und Reaktionsmischungen herzustellen. Darüber hinaus würde ein integriertes System mit e iner zentralen elektronischen Steuerung ein System ermöglichen, welches gleichzeitig Reak ionsmischungen zusammenfügen, das Thermozyklieren durchführen und die Kapillarenkasse tten waschen kann.
Das System ist nützlich bei der Herstellung von Sequenzierung sreaktionen, kann aber auch bei der hochparallelen Erstellung von Zell-Lysierung und Pia smidextraktion, Polymerasekettenreaktionen, Ligasekettenreaktionen, "Rolling Circle" Am jlifizierungsreaktionen, dem Screening von Verbindungs-Bibliotheken zur Arzneistoffentdc ckung oder hinsichtlich der Verbindungs-Aktivität, Protein-Verdau/Sequenzierung, ELISA, Radioimmunassays und anderen chemischen oder biochemischen Reaktionen oder Assay; eingesetzt werden.
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Die Fig. 1 ist ein Schema eines integrierten Systems für die Herstellung von Cycling-Reaktionsprodukten.
Die Fig. 2 ist ein Flußdiagramm, veranschaulichend die Schritte bei der Reaktionsherstellung unter Anwendung des vorliegenden Systems.
Die Fig. 2 ist ein Flußdiagramm, veranschaulichend die Schritte bei der Reaktionsherstellung unter Anwendung des vorliegenden Systems.
Die Fig. 3 A ist eine perspektivische Ansicht der Kapillarenkas sette der vorliegenden Erfindung.
Die Fig. 3B ist eine perspektivische Ansicht der Kapillaren! assette, eingeführt in einen Kapillarenkassetten-Halter.
Die Fig. 3 C ist eine flexible Kapillarenkassette.
Die Fig. 3D veranschaulicht die Kapillarenkassette von Fig. 3C, gebogen an einen Rahmen und passend zu den Vertiefungen eines analytischen Chips.
Die Fig. 3E zeigt ein Zweischichtsubstrat mit darin enthaltenen N [ikrokanälen.
Die Fig. 4A veranschaulicht den Abgabekopf zum Austeil· ;n von Flüssigkeit aus der Kapillarenkassette.
Die Fig. 4B zeigt einen internen Querschnitt eines Luftverdräng ungs-Abgabekopfes von Fig.
Die Fig. 4C zeigt den Abgabekopf von Fig. 4A, wobei der Abgat ekopf geschlossen ist.
Die Fig. 5A veranschaulicht eine Oberseitenansicht einer Zentrif ige, verwendet, um Fluid aus der Kapillarenkassette von Fig. 3 A zu bewegen.
Die Fig. 5B veranschaulicht einen Querschnitt eines Rotorarme; von Fig. 5A, welcher einen Ausschwing-Mikroplatten-Becherhält.
Die Fig. 6 zeigt ein Schema einer Luft-basierenden Thermozyl leitvorrichtung, wobei die in Fig. 3B gezeigte Kapillarenkassette samt Halter in die T smperaturzyklervorrichtung eingeführt sind.
Die Fig. 7A zeigt einen Innenquerschnitt eines Luft-basit renden Thermozyklers mit integrierten, Kapillarenkassetten-verschließenden Membranen.
Die Fig. 7B zeigt ein Detail des Luft-basierenden Thermozyk iers von Fig. 7A, wobei der Deckel angehoben ist, um die Kammer zu veranschaulichen, in velche die Kapillarenkassette eingeführt wird.
Die Fig. 7C zeigt einen Querschnitt des Kassettenkompartimen :s mit der Kapillarenkassette, eingeführt in die Innenkammer des Thermozyklers von Fig. 7A.
Die Fig. 8 A ist eine Frontansicht der Kapillarenkassetten-Waschi tation.
Die Fig. 8B ist eine Seitenansicht der Ansicht von Fig. 8A, wobei das Waschverteilerstück abgesenkt und der Waschtank angehoben ist.
Die Fig. 8C ist eine Ansicht von Fig. 8B, wobei das Waschvert« dlerstück angehoben und der Waschtank gesenkt ist.
Die Fig. 8D ist ein Innenquerschnitt des Waschverteilerstücks.
Die Fig. 8E ist ein schematisches Installations-Diagramm der We schstation.
Die Fig. 8F ist eine perspektivische Oberseitenansicht des Wasch tanks.
Die Fig. 8F ist eine perspektivische Oberseitenansicht des Wasch tanks.
Die Fig. 9 zeigt ein Histogramm des prozentualen Erfolg-gegeti-Leselänge-Fensters für die Sequenzierungsanalyse von Beispiel 2.
Die Fig. 10 ist ein Elektropherogramm der Reaktionsprodukte von Beispiel 2.
Die Fig. 11 zeigt ein Histogramm des prozentualen Erfolg-gegcn-Leselänge-Fensters für die Sequenzierungsanalyse von Beispiel 3.
Die Fig. 12A zeigt ein gescanntes Gelbild von elektrophoretiscl &igr; getrennten PCR-Produkten, hergestellt bei Voll-Volumen.
Die Fig. 12B zeigt ein gescanntes Gelbild von elektrophoretisch getrennten PCR-Produkten, hergestellt im Nanomaßstab (500 nl).
Die Fig. 13 ist ein Elektropherogramm der Analyse von hergestellten Sequenzierungsmischungen.
Die Fig. 14 ist eine Graphik, welche die Signalstärke von E eaktionsprodukten, welche in Röhrchen, Kapillaren und Kapillaren unter Anwendung von C »berflächenbindung hergestellt wurden, vergleicht.
In der vorliegenden Erfindung wurde realisiert, daß ein Kapillarensegment sowohl zur Abmessung von Reagenzien als auch als ein Reaktionsbehälter zur Durchführung von Temperaturzyklierungs-Reaktionen verwendet werden kann. Die Länj; ;e der Kapillare und der Innendurchmesser (ID) der Bohrung der Kapillarenröhre definieren das Volumen des Innenraums des Kapillarröhrensegments. Kapillaren mit einem ID von 50-150 &mgr;&eegr;&agr; sind in weitem Umfang verfugbar. Der kleine Innendurchmesser der Kapillarröhren ei möglicht die Erzeugung eines Reaktionsbehälters mit einem Innenvolumen von weniger als nnem Mikroliter. Bei der vorliegenden Erfindung sind Kapillaren mit Innenvolumen von 10-500 Nanolitern an die Herstellung von DNA-Zyklussequenzierungs-Reaktionen oder jedwedi andere Reaktionen anpaßbar.
Der von dem vorliegenden automatisierten System durchgeführte Prozess ist in dem Flußdiagramm von Fig. 2 gezeigt. Der Prozess beginnt mit der Zu; ;ammenfügung der Reaktionsmischung, Kasten bzw. Rahmen 52, durch Vereinigen von Rei genzien und einer Probennukleinsäure. Die vereinigten Reagenzien werden dann in die Kapi llaren einer Kapillarenkassette eingeführt, Kasten 54. Die Enden der Kapillaren werden als nächstes verschlossen, Kasten 56. Die verschlossenen Kapillarensegmente werden an WärmezykJen ausgesetzt, Kasten 58, welche die Cycling-Reaktion bewirken. Die Kapillaren der Kapilarenkassette werden dann auf ein Substrat ausgeteilt, Kasten 60. Das Substrat wird dann &eegr; ein Analysesystem für die Analyse der Reaktionsmischung überführt, Kasten 62.
Unter Bezug auf Fig. 1 wird ein automatisiertes System für die Zusammenfügung von Reaktionsmischungen, die Temperaturzyklierung zur Bewirkung dei chemischen Reaktion und die Austeilung des Volumens der vervollständigten Reaktionsmisc hung auf ein Substrat für eine anschließende Analyse gezeigt. In dem System kann ein autoirc tischer Roboter 102 die Länge der Bühne 114 bewegen und kann so rotieren, daß der automatische Roboter 102 im Verhältnis zu anderen Komponenten des automatisierten Systems bew sgt werden kann. Der automatische Roboter 102 kann rotiert werden, um dem Transferkopf 104 auf dem automatischen
Roboter 102 Zugang zu Objekten auf allen an die Bühne 114 angrenzenden Seiten zu gewähren. Die Zusammenfügung einer Reaktionsmischung w irde damit beginnen, daß der Transferkopf 104 eine Kapillarenkassette aus dem Kassetten-Hotel 106 aufnimmt.
Die Kapillarenkassette 15 wird in der Fig. 3A gezeigt. Die l· 'apillarenkassette besteht aus einer Anzahl von Kapillarröhren 12, welche durch ein Substrat 0 reichen. Es wird bevorzugt, daß die Kapillarenkassette mindestens eine Reihe von acht Ka] nllarröhren aufweist, und daß die Kapillarröhren in einem gleichmäßigen räumlichen Abs:and vorliegen. Die gezeigte Kapillarenkassette weist ein Substrat 10 auf, bei welchem 96 Kapillarröhren in einer Feldanordnung von 8 mal 12 angeordnet sind, wobei der Abstard der Röhren dem räumlichen Abstand der Vertiefungen einer 96-Vertiefungs-Mikroplatti: entspricht. Die Länge der Kapillarröhren 12, welche sich aus jeder Seite des Substrates '. 0 erstrecken, ist ungleich. Es wird bevorzugt, daß das kürzere Ende der Kapillarröhrensegme nte 12 kürzer ist als die Tiefe einer Mikroplatten vertiefung. Dies gestattet, daß das kurze End; von Kapillarröhren 12 in die Vertiefungen einer Mikroplatte eingeführt wird, während das substrat 10 auf der Oberseite der Mikroplatte aufliegt.
Die Kapillarröhren können aus jedwedem mit dem Assay und (ier durchzuführenden Herstellung kompatiblen Material gefertigt sein, aber bevorzugte Ka nllarenmaterialien schließen, ohne darauf eingeschränkt zu sein, Glas- und Silica-Kapilkren ein, obwohl Kunststoff, Metalle und andere Materialien ebenfalls verwendet werden sonnen. Es können Kapillarröhren von verschiedenen Abmessungen verwendet werden, wi<: Kapillarröhren mit einem ID von 75 &mgr;&eegr;&igr; oder Kapillarröhren mit einem ID von 150 &mgr;&eegr;&igr;/O.D. bzw. Außendurchmesser von 360 &mgr;&pgr;&igr;.
Die Kapillarröhren 12 reichen durch ein Substrat 10 und sind vorzugsweise in einem gleichmäßigen Muster angeordnet. Die Kapillarröhren sind von gleicr er Länge und reichen in einer im wesentlichen parallelen Orientierung durch das Substrat, so daß jedes der zwei entgegengesetzten Enden der Kapillarröhren 12 koplanar liegt, und die durch die Enden der Kapillarröhren 12 definierten Ebenen im wesentlichen parallel zum Sub Jtrat 10 sind. Der Abstand der Kapillarröhren kann gleichmäßig und gewählt sein, um dem Mitte-zu-Mitte-Abstand von Vertiefungen auf einer Mikroplatte zu entsprechen. Zum Beispiel würden auf einer standardmäßigen 96-Vertiefungs-Mikroplatte die Kapillarröhn :n bei einem Mitte-zu-Mitte-Abstand von 9 mm angeordnet sein, und auf einer 384-Vertieimigs-Mikroplatte würden die Kapillarröhren 12 bei einem Mitte-zu-Mitte-Abstand von 4,5 mii angeordnet sein. Kapillarenformate mit höherer Dichte, kompatibel mit 1536-Vertiefungs-Mikroplatten oder Platten mit noch höherer Vertiefungsdichte, sollten ebenfalls möglich sein. Die Kapillarenröhren 12
werden vorzugsweise so innerhalb des Substrats gesichert, daß die Länge von Kapillarenröhren 12, welche sich aus einer Seite des Substrates 10 erstrecken, kürzer ist als die Länge der Kapillarröhre auf der entgegenliegenden Seite von Substrat 10. Die Länge der Kapillarröhren 12 auf der kürzeren Seite des Substrats kann an die Tiefe von Vertiefungen in einer Mikroplatte so angepaßt sein, daß die Länge der kürzeren Seite von einer kürzeren Länge ist als die Tiefe einer Vertiefung in einer Mikroplatte. D: eses Merkmal ermöglicht, daß die Kapillarenkassette so in eine Mikroplatte eingeführt were en kann, daß das Substrat 10 gegen die Oberseitenkante der Mehrfachvertiefungsplatte auflie gt und die Kapillaren auf einer Seite des Substrates in die Mehrfachvertiefungsplatte hineinrag &iacgr;&eegr; können, ohne den Boden zu berühren. Bei einer 96-Vertiefungs-Mikroplatte können die Kapillarröhren zum Beispiel so auf einem Substrat angeordnet sein, daß die kürzere Seite der ] Capillarröhre, welche aus dem Substrat hervorragt, in Vertiefungen in einer Mikroplatte eing jführt werden kann, ohne daß die Kapillare den Boden der Vertiefung berührt. Dies gewährleistet, daß die in eine Vertiefung ausgeteilte Flüssigkeit von der Kapillare freigegebc &eegr; ist, um einen Wiedereintritt in die Kapillare zu verhindern.
Das Kapillarenkassetten-Substrat 10 kann aus einer Fieberg! as-Tafel oder einem anderen starren oder halb-flexiblen Material hergestellt sein. Die Kaoillarröhren 12 können durch gleichmäßig räumlich angeordnete Löcher in dem Substrat Ungeführt und mit Klebstoff gesichert werden. In einer Ausführungsform sind die Länge um I Breite des Substrates ähnlich zu der Länge und Breite einer standardmäßigen 96-Vertiefungs -Mikroplatte. Dies vereinfacht das Anpassen von für den Umgang mit Mikroplatten entworfen ;n automatischen Systemen an die Handhabung der Kapillarenkassette.
Im manchen Ausführungsformen kann es vorteilhaft sein, das [nnere der Kapillaren mit verschiedenen Oberflächenüberzügen, wie ionischen und nich -ionischen Tensiden, zu beschichten. Beschichtungen, welche verwendet werden können,: chließen Rinderserumalbumin (BSA), Glycerin, Polyvinylalkohol und Tween 20 ein. Die E eschichtungen werden in die Kapillare eingeführt und auf die Innenoberfläche der Kapillarr 3hre aufgetrocknet. Alternativ dazu kann eine kovalente Modifikation der Innenoberfläche durch Silanisieren oder eine Griganard-Reaktion gewünscht werden. Zum Beispiel kann eine kovalente Modifikation der Innenoberflächen von Kapillarröhren, welche die Elektroendoosmose verringert, auch nützlich zur Verringerung von Ladungsoberflächer effekten zwischen einer Kapillareninnenoberfläche und Komponenten einer Re iktionsmischung sein. Die ausdrückliche hiermit durch den Bezug darauf hierin für alle Absichten einbezogene U.S.Patentanmeldung Serien-Nr. 09/324 892 offenbart die Verwendung von Acryloyldiethanolamin als eine kovalente Kapillarenbeschichti ing mit vorteilhafter Stabilität
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gegen Alkali. Zusätzlich zu dieser Beschichtung können Aciylimid oder andere bekannte Beschichtungen ebenfalls verwendet werden, um die Kapillaren -Innenoberflächen kovalent zu modifizieren.
A. Zusammenfugen der Reaktionsmischung
Unter erneuter Betrachtung der Fig. 1 ermöglicht das automatik ierte System die Vereinigung von Reaktionsreagenzien und Proben-DNA unter Verwendung der Kapillarenkassette. Die Kapillarenkassette würde vom Transferkopf 104 aus dem Kai setten-Hotel 106 entnommen und in Kontakt mit den Proben, enthalten in einer Probenpli .tte an der Stelle a, gebracht werden. Die Probenplatte wird aus dem Probenplatten-Hotel 108 ausgegeben. Die Probe würde dann durch Kapillarwirkung in die Kapillarröhren der Kapillarenkassette gezogen werden. Das Innenvolumen der Kapillarröhre ist durch die Länj ;e der Kapillarröhre und ihren Innendurchmesser definiert. Die Kapillarenkassette von Fig. 3A wirkt als ein Parallel-Pipettierapparat mit fixiertem Volumen, der gestattet, daß eine Anzahl von Kapillarröhren parallel gefüllt wird. Jedes Kapillarröhrensegment wird ein»; diskrete Flüssigkeitsmenge abmessen, welche anschließend ausgeteilt werden kann.
Sobald ein Ende jeder Kapillare in die Proben-enthaltende Verti jfung eingeführt ist, wird eine Flüssigkeit in die Kapillare gezogen werden. Diese kleine Men je an Probe kann mit anderen Flüssigkeiten unter Bildung einer Reaktionsmischung vereinigt werden. Die Empfindlichkeit von analytischen Instrumenten, wie einem Kapillaren-Feldanorc nungs-Elektrophoresesystem, und die exponentiell Amplifizierung von Reaktionsmischungs-Produkten, ermöglicht durch Cycling-Reaktionen, gestattet Reaktionen und Analyse im Nan Dmaßstab. Reaktionen in sehr kleinem Maßstab sind fähig zur zuverlässigen Erzeugung von I Leaktionsmischungsprodukten von ausreichender Quantität für die Analyse auf einem Kapill; iren-Feldanordnungs-Elektrophoresesystem oder einem Kapillarelektrophorese-Chip. Signifikant weniger Reaktionsreagenzien werden erfordet, wenn eine Reaktionsmischung im N anomaßstab ermöglicht wird.
Das automatisierte System kann auf verschiedenen Wegen verv'endet werden, um Reaktionsmischungen herzustellen. Einige wenige der vielen Anwenc.ungen des Systems bei der Herstellung von Reaktionsmischungen folgen.
Herstellung der Reaktionsmischung bestehend darin, die Pipet iereinrichtung zu verwenden, um die Komponenten einer Reaktionsmischung getrennt ibzumessen. Für eine PCR-Mischung würden zum Beispiel die Nukleinsäureprobe u:id PCR-Reagenzien separat abgemessen und in einen einzelnen Behälter gegeben werden, wobei die Flüssigkeiten vereinigt werden. Bei der Verwendung des automatisierten S; rstems von Fig. 1 bewegt der automatische Roboter 102 den Transferkopf 104, enthaltend e ine Kapillarenkassette, an die Stelle a, wo eine Probenplatte lokalisiert ist. Die Enden der Kapillarröhren der Kapillarenkassette werden in die Vertiefungen getaucht. Die Kapillarröhi en füllen sich durch Kapillarwirkung, wobei eine genaue Menge an Probe abgemessen wird. Die Vertiefungen der Probenplatte enthalten die Nukleinsäureprobe. Die DNA-Probe sollte ausreichend verdünnt sein, so daß 5-20 ng DNA in dem Volumen von 10-10000 n. enthalten sind, welches von jedem Kapillarröhrensegment in der Kapillarenkassette abgeme: sen wurde.
Die Fig. 4A zeigt die Kapillarenkassette beim Überführen vor Fluidproben aus einer Mehrfachvertiefungsplatte 36 in eine Kapillarenkassette 15. Die Kap: Uarröhrensegmente 12 auf der Kapillarenkassette 15 reichen in die Vertiefungen der Mehr Tachvertiefungsplatte 36. Die Vertiefungen der Mehrfachvertiefungsplatte 36 sind konisch, und die Flüssigkeit in der Vertiefung wird in den mittleren Bodenbereich jeder Vertiefkig fließen. Dies gestattet, daß eine kleine Menge an Flüssigkeit so innerhalb der Vertiefung pe sitioniert wird, daß eine in die Mitte der Vertiefung und überhalb des Bodens der Vertiefung h iserierte Kapillare die Flüssigkeit kontaktieren wird. Die Kapillarröhrensegmente der Kapil arenkassette füllen sich dann durch Kapillarwirkung mit der Flüssigkeit in den Vertiefungen. Es wird bevorzugt, daß die Kapillarenkassette Kapillarröhrensegmente aufweist, welch &idigr; denselben Mitte-zu-Mitte-Abstand wie die Vertiefungen der Mehrfachvertiefungsplatte, enthaltend die DNA-Proben, aufweisen. In einer Ausführungsform besitzt die Kapillarenka jsette die gleiche Anzahl von Kapillarröhrensegmenten wie die Anzahl von Vertiefungen ii einer Mehrfachvertiefungsplatte, welche Proben hält.
Nachdem die Kapillarenkassette in die Vertiefungen, welche Nukleinsäureprobe enthalten, getaucht wird, kann die Kapillarenkassette durch den Transferkopf 104 zu einer Austeilvorrichtungs-Stelle 122 bewegt werden. An der Austeilvorrichtungs-Stelle 122 wird die Probe auf ein Substrat ausgeteilt. Eine saubere Kapillarenkassette wird dann herangeholt und in eine Probenplatte, welche die PCR-Reagenzien enthält, getaucht. Wie früher ersichtlich, mißt die Kapillarenkassette eine präzise Menge an Flüssigkeit ab, definiert durch
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das Innenvolumen der Kapillarröhren, welche in der Kapillarenkassette gehalten werden. Bei der abgemessenen Menge an Reaktionsreagenzien kann es sich um das gleiche Volumen handeln, wie das Volumen der ausgeteilten Probe. Die Reaktior sreagenzien werden aus jedem Kapillarröhrensegment auf Stellen auf dem Misch-Substrat, &lgr; /eiche die Nukleinsäureprobe enthalten, ausgeteilt.
Die vorliegende Reaktionsmischungs-Zusammenfügung kam für das Zusammensetzen zahlreicher Typen an Reaktionen verwendet werden. Dieselbe j grundlegende Vorgehensweise, verwendet zur Zusammensetzung der PCR-Reaktionsmischung. kann an das Zusammensetzen einer Zyklus-Sequenzierungsmischung, "Rolling Circle"-Ampifikations-Reaktionsmischung oder anderer Reaktionsmischungen angepaßt werden.
Bei der Austeilung des Inhalts in eine Mikroplatte muß eine ; gewisse Vorsicht darauf angewandt werden, die Probe und die Reaktionsreagenzien auf eine Weise zu mischen, welche ein Verspritzen vermeidet. Eine Anzahl von verschiedenen Verf ihren ist in Betracht gezogen worden, um Flüssigkeit aus der Kapillarenkassette auszuteilen.
Kapillarenkassetten-Austeilungs-Beispiel 1:
Zentrifugalkraft
Austeilen des Inhalts der Kapillarenkassette unter Vermeidung von Verspritzen, unter Verwendung einer Zentrifuge, um das Fluid durch Zentrifugalkraft auszuteilen. Die Zentrifugalkraft wird gleichmäßig auf alle Kapillaren in der Ka pillarenkassette angewandt, so daß die Kapillaren unabhängig voneinander in Mikroplattenve rtiefungen ausgeteilt werden. Die ausgeteilte Flüssigkeit wird durch Zentrifugalkraft zum B öden von Vertiefungen in der Mehrfachvertiefungsplatte gezogen.
In der Fig. 5 A ist die Zentrifuge 42 gezeigt, welche einen Aus schwing-Mikroplatten-Becher 43 aufweist, welcher eine Mehrfachvertiefungsplatte mit einer inserierten Kapillarenkassette enthalten kann. Die Ausschwing-Mikroplatten-Becher werden a jf dem Rotor 41 gehalten.
Die Fig. 5B zeigt einen Querschnitt des Ausschwing-Mikropla ten-Bechers 43. Die Kapillarröhren 12 der Kapillarenkassette sind in die Vertiefungen 36a ier Mehrfachvertiefungsplatte 36 inseriert. Die Kassette ist so inseriert, daß der Teil der Kapil iarröhren 12, welcher aus dem Substrat 10 herausreicht, kürzer ist als die Tiefe der Vertiefungen 36a. Wie in Fig. 5B gezeigt, erreicht die Kapillarröhre 12, welche aus dem Substrat K1 ragt, nicht den Boden der Vertiefungen 36a der Mehrfachvertiefungsplatte 36. Der Mikrc platten-Ausschwingbecher 43
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besteht aus einem Arm 45 und einer Plattform 44. Ein oberes Ej ide des Armes 45 paßt auf den Klinken-Kopf 42 auf dem Rotor 41. Die Mikroplatte 36 :st auf der Plattform 44 des Mikroplatten-Ausschwingbechers 43 positioniert. Wenn die Zentrifuge in Bewegung ist, rotiert die Plattform 144 auf dem Klinken-Kopf 42 so, daß die Viehrfachvertiefungsplatte zur Seitenwand der Zentrifuge gerichtet ist, und die Zentrifugalb aft auf die Flüssigkeit in den Kapillarenröhren die Flüssigkeit in den Boden der Vertiefunger 36a der Mehrfachvertiefungsplatte 36 austeilt. Wenn Vertiefungen von konischer Gestalt verwendet werden, wird die Zentrifugalkraft die Flüssigkeiten innerhalb der Vertiefung zur Vertiefungsmitte ziehen, was verursacht, daß die Probe an einer präziseren Stelle lokalisiert ,vird. Die Flüssigkeit wird bei ziemlich niedrigen Zentrifugengeschwindigkeiten aus der Kapil are verdrängt werden.
In der Fig. 1 kann eine Niedergeschwindigkeits-Zentrifuge wah !weise in dem automatisierten System an der Austeilvorrichtungs-Stelle 122 eingeschlossen sein. Der automatische Roboter 102 verwendet den Transferkopf 104, um eine Nanotiterplatte aufzunehmen, welche von dem Nanotiterplatten-Hotel 110 auf den Standort b ausgeteilt wu*de. Die Nanotiterplatte wird durch den Transferkopf 104 auf die Bühne der Niedergeschwir digkeits-Zentrifuge überführt. Eine Kapillarenkassette wird mit Proben oder Reaktionsreager zien gefüllt, wie beschrieben, und wird auf die Nanotiterplatte auf der Bühne der Niedergesc tiwindigkeits-Zentrifuge überführt. Die Platte und Kassette werden dann in der Zentrifuge ze ntrifugiert, wobei die Flüssigkeit aus den Kapillaren in die Vertiefungen der Nanotiterplat e ausgeteilt wird. Sobald die Flüssigkeit ausgeteilt worden ist und die Zentrifuge mit dem R( tieren aufgehört hat, kann die Kapillarenkassette durch den Transferkopf entfernt und zur K issettenwascheinrichtung 118 überführt werden. Der Transferkopf 104 kann dann eine saube-e Kapillarenkassette aus dem Kapillarenkassetten-Hotel 106 aufnehmen. Die saubere Kapil [arenkassette kann verwendet werden, um eine zweite flüssige Reaktionskomponente abzumessen, welche in ähnlicher Weise unter Verwendung der Zentrifuge ausgeteilt wird. In dem automatisierten System schließt die Zentrifuge einen mit dem Rotor assoziierten Sensor ein, verwendet im Zusammenhang mit einem Rotorbremssystem, um den Rotor in einer Position zu stoppen, auf welche der Transferkopf 104 Zugriff hat, wobei ein solcher Sensor magnetisch, optisch, mechanisch sein könnte oder ein anderer bekannter Weg zuri Erfassen der Rotorposition verwendet wird.
Kapillarenkassetten-Austeilungs-Beispiel 2:
Luftverdrängung
Austeilen der Flüssigkeit, enthalten in den Kapillarröhrensegnu nten einer Kapillarenkassette, bestehend in der Verwendung einer Luftverdrängungs-Vorrich tung. Unter Bezugnahme auf
die Fig. 1 wird eine aus dem Nanotiter-Plattenhotel entnommene Nanotiterplatte durch den Transferkopf 104 zur Austeilvorrichtungs-Stelle 122 überführt. An dieser Stelle befindet sich ein Luft-Dispenser, wie derjenige, der in Fig. 4A-C abgebildet ist. Anschließend wird eine Kapillarenkassette von dem Transferkopf 104 herangezogen, die entweder mit Probe aus einer Proben-Mehrfachvertiefungsplatte oder Reaktionsreagenzien gefüllt ist. Die Kapillarenkassette wird dann zu der Austeilungsvorrichtungs-Stelle 122 bewegt und in Kontakt mit dem Luftverdrängungskopf gebracht. Das Substr it der Kapillarenkassette wird auf eine Empfängerplattform auf dem Luftverdrängungskopf gt setzt. Alternativ dazu kann der Luftverdrängungskopf mit dem automatischen Transferroboter lO2 verbindbar sein.
Unter Bezug auf die Fig. 4A wird der Luftverdrängungskopf 301 gezeigt, wobei eine Kapillarenkassette 15 auf der Bodenplatte 302 gehalten wird. Die Boc.enplatte 302 ist durch das Gelenk 318 an einer Verteilerstück-Baugruppe angebracht. Das K apillarenkassetten-Substrat 10 wird auf einem Schaumgummipolster 304 gehalten, welches auf der Bodenplatte 302 befestigt ist. Ein Feld von Löchern 325 reicht durch das Schaumgummipolster 304 und die Bodenplatte 302, welche so räumlich angeordnet sind, daß den Kapillarröhi en 12 gestattet wird, durch das Schaumgummipolster 304 und die Bodenplatte 302 zu reichen, wenn die Kapillarenkassette auf der Bodenplatte 302 positioniert ist. Die Verteilerstück-Baugruppe des Luftverdrängungskopfes ist aufgebaut aus einem oberen Gehäuse 306, einer Kammereinheit 310 und einem Satz von Klammern 314. Die Klammern 314 befestigen die Membran 312 an der unteren Oberfläche der Kammereinheit 310. Die Membran 312 bildet einen Verschluß für die obere Oberfläche der Kapillarenkassette 15, wenn die Verteilerstücls -Baugruppe über der Kassette geschlossen wird. Die Membran 312 besitzt Löcher 316, ertsprechend zu Positionen der Kapillaren 12 in der Kassette, wenn die Kapillare 12-Positio:ien in der Kassette, wenn die Kapillarenkassette 15 auf der Bodenplatte 302 plaziert ^vird. Wenn das Oberseiten-Verteilerstück des Luftverdrängungskopfes 301 gegen die Bodenplatte 302 geschlossen wird, werden die Kapillarröhren 12 in den Kapillarröhren-aufneh nenden Löchern 316 auf der Membran 312 positioniert. Wenn der Luftverdrängungskopf: »01 geschlossen wird, kann er durch den Riegel 322 gesichert werden, welcher in das Loch 324 gesteckt wird, um die Kapillarenkassette zwischen dem Schaumgummipolster 304 und der Membran 312 einzuklemmen, was zu einem Abschluß zwischen der oberen Oberfläche der Kassette 15 und der Membran 312 führt.
Die Fig. 4B veranschaulicht eine Querschnittsansicht des Verdrängungskopfes 301. Das obere Gehäuse 306 ist aus Metall, Acryl oder einem anderen starren Material konstruiert. Der Gaseinlaß-Koppler 303 ist auf dem oberen Gehäuse 301 angeordret. Wenn eine Druckgas- oder Vakuumleitung 305 an den Gaseinlaßkoppler 303 angebracht wird, kann ein Vakuum oder
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eine Druckkraft in die obere Kammer 307 eingeführt werden. Zwischen dem oberen Gehäuse 306 und der Kammereinheit 310 wird eine gasundurchlässige elastische Membran 308 gehalten. Der Bereich zwischen der elastischen Membran 308 und dem oberen Gehäuse 306 definiert die obere Kammer 307. Auf Klammern 314 ist die Membran 312 gesichert. Die Membran 312 wird gegen das Substrat 10 einer Kapillarenkai sette gedrückt, welche in den Verdrängungskopf 301 eingeführt ist. Das Substrat 10 ist innerhalb des Verdrängungskopfes 301 durch die Bodenplatte 302 gesichert. Das Gummipolster 304 sieht eine deformierbare Oberfläche vor, welche einen gleichmäßigen Druck ausübt, wodurch das Substrat 10 gegen die Membran 312 gedrückt wird. Die Membran 312 besitzt ein Feld von Löchern 316, welche den Kapillaren 12 der Kapillarenkassette gestatten, durch die IV embran 312 zu reichen. Wenn eine Kapillarenkassette in den Luftverdrängungskopf 301 < ingeführt wird, schließt das Substrat die Löcher 316, wobei die untere Kammer 313 umsd Jossen wird. Wenn Druckgas durch die Gasleitung 305 in die Kammer 307 eingeführt wird, wird die elastische Membran 308 in die untere Kammer 313 gepresst. Die Membran 308 ist zwischen der oberen Kammer 307 und den unteren Kammern 313 angeordnet. Die Memb-an 308 dient sowohl als ein Abschluß für das obere Ende der Kammern 313 als auch als das Kammer-Verdrängungs-Stellglied, wenn Druck durch den Koppler 303 auf die obere Kammer 307 angewandt wird. Der Grad der Verdrängung ist vom angelegten Druck abhängig. Die resultierende Luftverdrängung wird dahingehend wirken, Flüssigkeit aus d;n Kapillarröhren 12, welche sich durch die Kapillare und in die untere Kammer 313 eistrecken, auszuteilen. Durch Regulieren der Menge des durch die Leitung 305 angelegten Drucks wird eine konsistente Verdrängungskraft auf jede Kapillarröhre ausgeübt werden, /jigesichts des Submikroliter-Volumens der Kapillarröhrensegmente sollten Fluktuationen ii &igr; der Menge des Austeilungs-Drucks die Verdrängung aus den Röhren nicht nachteilig beeinf ussen.
Die Fig. 4C veranschaulicht den geschlossenen Luftverdrängungskopf 301. Das obere Gehäuse 306 wird durch den Riegel 322 in Richtung auf die Bodenplatte 302 gezogen, um die Membran 312 gegen die Oberseite des Kapillarenkassetten-Substrates zu pressen, wodurch ein Abschluß gebildet wird. Die Klammern 314 befestigen die Membran 312 auf der Kammereinheit 310. Der Luftverdrängungskopf 301 ist auf einem Arm 320 montiert. Der Arm 320 kann von einem automatischen Transferroboter 102 ausgehen, gezeigt in Fig. 1, oder an der Austeilungs-Stelle 122 positioniert sein. Druckgas kann durch den Gaseinlaß-Koppler 303 in das obere Gehäuse 306 eingeführt werden.
Dieser Verdrängungskopf stellt eine individuelle Verdrär gungskammer für jede der ausgeteilten Kapillaren bereit. Obwohl eine 16-Kapillaren-Ka:!sette abgebildet ist, kann der Verdrängungskopf konstruiert sein, um Kapillarenkassetten mit einem Feld von 96 Kapillaren
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oder größeren Kapillarendichten auszuteilen. Die auf jede Kapillare angewandte Austeilungskraft ist ausreichend klein, um das direkte Austeilen auf ein Si ibstrat zu gestatten, wobei die Probe auf eine diskrete Stelle ausgeteilt wird.
Luftverdrängung oder Zentrifugalverdrängung können angewar dt werden, um Flüssigkeit aus den Kapillarröhrensegmenten in einer Kapillarenkassette auszi iteilen. Es kann auch möglich sein, Flüssigkeit aus den Kapillarröhren unter Verwendung ein 2r Bank von Spritzenpumpen, Anwendung von Druck durch eine gasdurchlässige/flüssigkeit »undurchlässige (hydrophobe) Membran, unter Verwendung von elektrokinetischer Austeilung oder anderen bekannten Dispenser-Einrichtungen auszuteilen. Der Luftverdrängungskopf kann auch verwendet werden, um fertiggestellte Reaktionsmischungen für eine ar schließende Analyse auf ein Substrat auszuteilen.
Reaktionsmischungs-Zusammenfügungs-Beispiel 2:
Entwässerte Reagenzien
Zusammenfügen der Reaktionsmischung bestehend darin daß die für die Reaktion erforderlichen Reagenzien als eine dehydratisierte Beschichtun g entweder auf der Innenseite einer Kapillare oder auf einem Substrat, wie innerhalb einer Vertiefung einer Mehrfachvertiefungs-Platte, aufbewahrt werden. Wenn die Reaktionsreagenzien auf die Innenseite von Kapillarröhrensegmenten in einer Kapillar :nkassette auf-dehydratisiert werden, wird das Einführen einer Probe in die Kapillare eine Re hydratisierung, Mischung und Bildung der Reaktionsmischung verursachen. In einer ähnlchen Weise wird, wenn die Vertiefungen einer Mikroplatte mit den dehydratisierten Ree ktionsreagenzien beschichtet sind, das Zusetzen einer Nukleinsäureprobe in die Vertiefungen die Reaktionsreagenzien unter Bildung einer Assaymischung in Lösung bringen. Die Probe könnte mit einer Kapillarenkassette abgemessen und durch eines der obenstehem I dargelegten Vorgehensweise aus der Kapillarenkassette ausgeteilt werden. Die Probe würde c ie dehydratisierten Reaktionsreagenzien in Lösung bringen und durch Diffusion mit dei nukleinsäurehaltigen Probe vermischen. Dies stellt eine Möglichkeit zum Zusammenfüge &igr; der Reaktionsmischung auf eine sehr einfache Weise bereit, potentiell ohne die Notwend gkeit, die Kapillarröhren mit einer Zentrifuge oder Luftverdrängungs-Vorrichtung auszuteilen. Dies könnte sowohl das Reaktionsverarbeitungssystem vereinfachen als auch die Reak tions-Zusammenfügungs-Zeit verkürzen.
Für PCR ist eine dehydratisierte Reagenzienmischung im Haidel erhältlich, vertrieben als Ready-to-Go® (Amersham Pharmacia Biotechnology, Piscataway, New Jersey). Die
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stabilisierten, dehydratisierten Reagenzien können auf die Innei loberfläche von Kapillarensegmenten oder die Innenseite der Vertiefungen einer Mehrfachve rtiefangs-Platte aufbeschichtet werden. Das Ready-to-Go®-Produkt verwendet eine Kohlenhydrat-Matrix zur Stabilisierung der Reaktionsreagenzien (DNA-Polymerase, Pufferreagenzien, dNTPs) in einem eingetrockneten Zustand. Das In-Lösung-Bringen der Reagenzien in dem Ready-to-Go®-Gemisch mit der flüssigen Nukleinsäureprobe und Primern in Lösung erzeugt die für die Reaktion erforderte letztendliche Reaktionsmischung. Das Vereinigen de: stabilisierten Ready-to-Go®- Verbindungen, der Matrizen-DNA, der Primer und ausreicher .d Wasser stellt ein letztliches Reaktionsprodukt her. Es wird in Betracht gezogen, daß Reagenzien für Kettenabbruch-Sequenzierungsreaktionen ebenfalls in einem eingetrocknetei. Zustand aufbewahrt werden könnten.
Die Beschichtung könnte auf vielfache Weise auf Oberflächen aufgebracht werden, einschließlich Dampfphasenbeschichten, Füllen einer Kapillare (durch Kapillarwirkung, Druckfüllung etc.) mit der Ready-to-Go®-Mischung und Entleeren der Hauptmenge der Phase (unter Vakuum, Druck oder anderen Kräften) oder Ein :auchen eines Substrates (wie einer Perle) in die Reagenzien und anschließendes Trocknen dei Perle.
Reaktionsmischungs-Zusammenfiigungs-Beispiel 3:
Nukleinsäure-Einfang
Zusammenfügen der Reaktionsmischung bestehend darin, dl·: Probennukleinsäure auf der Oberfläche eines Substrates, wie der Innenseite eines Kapillarr ährensegmentes, einzufangen. Die Proben-Nukleinsäure kann mittels einer Anzahl von "Verfahren auf die Oberfläche geheftet werden. Diese schließen kovalente Anheftung, DNA-Hybridisierung, hydrophobe Wechselwirkungen, elektrisches Feld, Magnetfeld oder andere chemische oder physikalische Kräfte ein. Sobald die Probe angeheftet worden ist, kann die &ngr; ;rbleibende Flüssigkeit, in der die Probe suspendiert war, aus der Kapillare oder dem Mikroa lip durch chemische Reaktion oder physikalische Kraft evakuiert werden. Luftverdränj ;ung oder ein zentrifugales Austeilungsverfahren können angewandt werden, um die Kapillare zu leeren, und auch ein Vakuum kann angewandt werden. Die Proben-Nukleinsäure wird auf der Oberfläche des Substrates bleiben. In diesem Einzelschritt kann die Probennukleinsäure im wesentlichen gereinigt werden. Die Reaktionsreagenzien können dann mit de: ■ Probennukleinsäure vereinigt werden, wobei die Reaktionsmischung hergestellt wird.
Immobilisieren der Nukleinsäureprobe bestehend darin, die Nukleinsäure direkt an eine Oberfläche anzuheften. Dies kann durch nicht-kov ilente Modifikation (wie
·* · · tftf * *
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Oberflächenbehandlung mit NaSCN, DMSO etc.) oder kovaleite Verknüpfung erfolgen. Es gibt eine Anzahl von im Fachgebiet bekannten verschiedenen kovalenten Anheftungsverfahren für DNA. Zum Beispiel kann eine Aminogruppe ai die Desoxyribose-Base von DNA angeheftet und während einer Synthesereaktion eingebat it werden, wie während PCR-Amplifikation eines DNA-Plasmidinserts. Das Glas oder Silici eines Kapillareninnenraums könnte silanisiert werden, und die Aminogruppe der modifizierten DNA würde kovalent an die silanisierte Innenseite der Kapillare binden. Alternativ d;izu stehen andere chemische Vorgehen zur kovalenten Immobilisierung von DNA auf ein &idigr; Oberfläche zur Verfügung. Sobald die DNA an die Oberfläche einer Kapillare oder eines anderen Substrates gebunden ist, kann die Flüssigkeit, in der die DNA suspendiert war, aus d( r Kapillare eliminiert werden, und die Kapillare kann mit Reaktionsreagenzien gefüllt werden.
Anheften einer Nukleinsäure an die Innenseite der Kapillaren einer Kapillarenkassette erfolgend durch Affinitätschemie. Ein übliches Affinitätsch ;mie-Verfahren markiert ein Biomolekül mit Biotin und bindet dann das biotinylierte Biomolekül an Avidin oder Streptavidin. Das Avidin/Streptavidin kann verwendet werden, um die biotinylierten Moleküle zu verknüpfen. Mit Biotin markierte Nukleinsäure kann anschließend an eine Oberfläche, wie die Innenseite einer Kapillarröhre, angehef et werden. Dies kann durch Binden von Streptavidin an die Innenseite der Kapillare bewerki teiligt werden.
Ein Beispiel der Anwendung von Affinitätschemie für die Bindung von DNA an die Innenseite einer Kapillare wird beschrieben im U.S.-Pat. Nr. 5 846 727, das hiermit durch Bezug darauf ausdrücklich hierin für alle Absichten einbezogen ist. Diese Bezugsstelle beschreibt die Bindung von DNA an die Innenoberfläche der Kapillarröhren. Die Technik erfordert mit Biotin markierte Primer, welche mit dNTPs, einei DNA-Polymerase und einem Reaktionspuffer vereinigt werden. Dieses wird mit Matrizen-DNA, wie Plasmiden aus einer DNA-Bibliothek mit subklonierten DNA-Inserts, vereinigt, um die Reaktionsmischung zu bilden. In der vorliegenden Erfindung kann eine Mikroplaite 96 oder mehr Reaktionsmischungen enthalten, jede mit einem einzigartigen Plasmid riit einer subklonierten DNA-Sequenz. Diese Reaktionsmischung könnte durch wie in Rea ktionsmischungs-Zusammenfügungs-Beispiel 1 folgendermaßen zusammengefügt werden: Die Reaktionsreagenzien und die Plasmidprobe könnten nämlich separat abgemessen urd in eine 384-Vertiefungs-Mikrotiterplatte ausgeteilt werden. In einer Mikroplattenvertiei üng werden die Flüssigkeiten unter Bildung einer Reaktionsmischung vereinigt. Die Reaktionsmischung wird in die Kapillarröhrensegmente einer Kapillarenkassette abgemessen. Die PCR-Reaktion kann durch zeitweiliges Verschließen der Enden der Kapillarröhrensegmente und Aussetzen der Kapillarenkassette an Wärmezyklen, wie nachstehend beschrieben, bewirkt werden. Die
Ergebnisse der PCR-Reaktion sind exponentiell amplifizie:te Kopien des subklonierten Plasmid-DNA-Inserts, enthaltend den Biotin-markierten Primer
Die den Biotin-markierten Primer enthaltende Matrizen-DNA 1 :ann dann auf den Wänden der Kapillarröhren einer Kapillarenkassette immobilisiert werden. Die Immobilisierungs-Kapillarenkassette würde Kapillarröhren aufweisen, wobei Avidin oder Streptavidin auf die Innenoberfläche jeder Kapillarröhre aufbeschichtet wäre. Die Chemie zur Anheftung von Avidin/Streptavidin kann diejenige sein, welche zum Beispiel offenbart wird in L. Amankwa et al., "On-Line Peptide Mapping by Capillary Zone Electrophoresis", Anal. Chem., Band 65, S.
2693-2697 (1993). Die Kapillare wird mit (3-Aniopropyl)triir ethoxysilan (3-ATPS) gefüllt, 30 Minuten lang inkubiert und luftgetrocknet. Die getockneten Kapillaren in der Kapillarenkassette werden als nächstes mit Sulfosuccinimidyl-o-(biotinamido)hexonat (NHS-LC-Biotin) gefüllt, welches wiederum inkubiert wird, gefolgt&Lgr; On Lufttrocknen. Avidin oder Streptavidin in Phosphatpuffer bei pH 7,4 wird in jede Kapillarröhre zugesetzt. Das Avidin bindet an das Biotin, welches auf der Innenseite jeder Ka Dillare immobilisiert ist. Die doppelsträngigen, amplifizierten biotinylierten PCR-Produkte, suspendiert in einem Puffer (z.B. Tris-HCl oder EDTA, mit Zugabe von entweder NiCl oder LiCl bei 1-3 M für effektives Binden), werden in die Kapillarröhre gegeben und 5-10 Minuten lang inkubiert. Dies führt zu einer wie folgend modifizierten Kapillarenwan i: Kapillarenwand-Si-C3H6-NH-CO-Biotin - Avidin oder Streptavidin - amplifiziertes Ol igonukleotid mit assoziiertem Biotinprimer.
Sobald die DNA auf der Innenoberfläche der Kapillare immob ilisiert ist, kann der Inhalt der Kapillarröhre in der beschriebenen Art und Weise ausgeteilt w srden, und die DNA würde an die Oberfläche der Kapillare gebunden bleiben. Dies entfernt Zelltrümmer und andere Verunreinigungen aus der DNA, was ein rasches und wirksames Verfahren der DNA-Reinigung darstellt. Die Kapillare kann mit einem Puffer für eine weitere Reinigung gespült werden. Die definierte Fläche der Innenoberfläche der Kapillare liefert eine bekannte Menge an Bindestellen für die DNA-Anheftung. Dies sieht ein einfaches Verfahren für die Normierung der DNA-Konzentration vor. Die Kapillarenkassette kann dinn in Vertiefungen oder ein Reagenzienreservoir, enthaltend die Reagenzien für Zyklui-Sequenzierung, eingetaucht werden. Die Zyklus-Sequenzierungsreaktion kann durchgefül irt werden durch zeitweiliges Verschließen der Enden der Kapillarröhren durch Pressen je ies Endes der Kapillarröhren gegen eine deformierbare Membran. Die Kapillarenkassette kann dann an Wärmezyklen ausgesetzt werden, welche die Zyklus-Sequenzierungs-Reaktior bewirken.
In dieser Ausführungsform wird eher Biotin als Avidin oder St eptavidin zuerst kovalent an die Kapillarenwand angeheftet. Dies hilft bei der Regeneration &igr; ler Kapillarenkassette für anschließende Bindungsreaktionen. Nach Vervollständigen der Z>klus-Sequenzierungsreaktion wäre es schwierig, die amplifizierte biotinylierte DNA zu entfernen ohne auch das Avidinprotein zu denaturieren. Indem man Biotin an die Innenoberfläc ie der Kapillare bindet, kann die amplifizierte DNA einfach durch Füllen der Kapillare mit Ph &idigr;&eegr;&ogr;&idiagr;- oder Formamid-Lösung bei 65-90 Grad Celsius entfernt werden. Dies denaturiert das A ddinprotein ohne Entfernung des Biotins, welches an die Innenoberfläche der Kapillare gebun len ist. Diese Mischung wird dann ausgegeben. Die Kapillarenkassette kann dann erneut m t der avidinhaltigen Lösung gefüllt und zur Bindung einer nachfolgenden biotinylierten ai nplifizierten Matrizen-DNA wiederverwendet werden.
Vor dem Füllen können die Kapillarröhrensegmente der Kapillai enkassette mit einer Vielzahl von Verbindungen beschichtet werden. Es wurde gezeigt, daß die Beschichtung der Innenoberfläche der Kapillarröhrensegmente mit Rinderserumalbu min (BSA) oder Polyvinylalkohol die Leistung mancher Reaktionen, wie der Herstillung von Kettenabbruch-Sequenzierungsreaktionen, verbessert.
B. Thermozyklieren
Sobald die Reaktionsmischung in die Kapillarröhrensegmente der Kapillarenkassette eingeführt ist, werden die Enden der Kapillaren der Kapillaren] :assette verschlossen und die Kapillarenkassette wird an Temperaturzyklen ausgesetzt. Die E nden der Kapillarenkassette-Kapillaren werden durch Pressen jedes der Enden der Kapillar Öhren gegen eine deformierbare Membran verschlossen. Unter Rückblick auf Fij;. 1 werden, sobald die Kapillarenkassette mit der Reaktionsmischung gefüllt worden : st, die Enden der Kapillaren verschlossen und die Kapillaren an Wärmezyklen in der Th< rmozykler-Vorrichtung 116 ausgesetzt.
In einer Thermozykler-Vorrichtung, gezeigt in Fig. 7A-7C, besitzt die Thermozykler-Vorrichtung integrierte Membranen, welche die Enden der Kapillar &idigr;&eegr; verschließen, und sie setzt die Kapillarenkassette an Wärmezyklen aus. In diesem Gerät st die Einrichtung zum Verschließen der Enden der Kapillaren in der Kapillarenkas; ette in die Thermozykler-Vorrichtung eingebaut.
♦ · &phgr; · &psgr; &psgr;
Unter Bezug auf Fig. 7 A wird die Kapillarenkassette 15 auf ier Lippe 280 innerhalb des Innendurchlaufweges 256 zwischen den deformierbaren Membranen 264a und 264b gehalten. Wie in Fig. 7B ersichtlich, ist die deformierbare Membran 264a auf der Plattform 261 montiert. Der Deckel 262 ist auf der Plattform 261 befestigt. Di s Plattform 261 ist durch den Drehzapfen 286 an der Basis 265 angebracht. Die pneumatischen Einrichtungen 284a und 284b sind am oberen Ende der Plattform 261 an dem Drehzapfen 263 angebracht. Die Schraube 282 wirkt als ein Stopper für die Plattform 261, wenn die Plattform 261 auf das Gehäuse 270 gesenkt wird, wobei der Durchlaufsweg 256 um schlossen wird. Der Diffusor 258 fördert eine gleichmäßige Temperatur der im inneren Dur :hlaufsweg 256 umlaufenden Luft. Das Thermoelement 260 nimmt eine Messung der Temperatur der umlaufenden Luft vor. Die Funktion des Drehzapfens 277 und der Bodenmerrbran-Plattform 200 wird im Zusammenhang mit der Fig. 7C beschrieben.
Die Fig. 7C zeigt einen Querschnitt der Kapillarenkassetten-Hal tekammer mit der Kapillarenkassette 15, eingeführt in den inneren Durchlaufweg 256. Die Kapillarenkassette könnte in diesen Bereich durch den automatischen Roboter 102 von Fig. 1 eingeführt werden, nachdem die Kapillarröhrensegmente mit der Reaktionsmischung gefüllt worden sind. Die Kapillarenkassette 15 ist so positioniert, daß das Substrat 10 auf de: &eegr; Absatz 280 aufliegt. Die Kapillarenkassette ist so positioniert, daß die Enden der Kapillai röhrensegmente 12 gegen die obere deformierbare Membran 264a und die deformierbare Bcden-Membran 264b gedrückt werden, wenn die obere Plattform 261 über die Kapillarenkasset :e gesenkt wird und die untere Plattform 271 angehoben wird. Die Aussparungen 262a und 262b schließen entlang der Seitenlängen des Gehäuses 270, wenn die obere Plattform 261 abgesenkt wird, wodurch ein Gehäusesperrabschluß (host retaining seal) vorgesehen wird. Die Schraube 282 wirkt als ein Stopper für die obere Plattform 261, um die Plattform an ei ier so weiten Absenkung zu hindern, daß die Kapillarröhrensegmente gebogen ode: beschädigt werden. Die Basisplattform 266 ist an dem Pfosten 273 und an dem Gehäise 270 befestigt. Das untere Ende der pneumatischen Einrichtung 284b ist an einem unteren Drehzapfen 271a befestigt, um die Plattform 271 abzusenken. Durch die untere Plattform 271 erstrecken sich Ansatzschrauben 268, welche durch das Gehäuse 270 und die stationäre Plattform 266 reichen und an der unteren Plattform 200 gesichert sind. Wenn die &ogr; )ere Plattform 261 durch die pneumatische Einrichtung 284b gesenkt wird, wird die untere Plattform 271 auch gegen das Gehäuse 270 angehoben. Wenn die pneumatischen Zylinder 284b, 284a zurückgezogen werden, bewegen sich die pneumatischen Zylinder in eine senki echte Orientierung. Die obere Plattform 261 wird gesenkt und die untere Plattform 271 wire geringfügig angehoben, und zwar in einem Bogen. Die untere Plattform 271 wird auf den Drehzapfen 277 nach oben schwenken, um sich in eine Position zu bewegen, im wesentlichen parallel zur Plattform 261,
wenn der pneumatische Zylinder 284b vollständig eingezogen wird. Wenn eine Kapillarenkassette 15 in die Innenkammer 258 eingeführt wird, verhindert das Vermögen der Plattform 200, auf den Federn 275 zu "schweben", daß übermäßiger Druck die Kapillarröhren 12 oder die Membranen 264a, 264b beschädigt. Die Plattformen 261 und 200 üben eine Kraft von 400 Pfund pro Quadratzoll auf die Kapillarröhren 12 aus, was einen ausreichenden Verschließdruck zur Verfügung stellt. Wenn die obere Plattform 262 gesenkt ist, sind die Kapillarröhrensegmente 12 an jedem Ende durch die deformiert aren Membranen 264a, 264b verschlossen. Die deformierbaren Membranen 264a und 264b 1 ;önnen aus Siliconkautschuk oder einem anderen deformierbaren Material hergestellt sein.
Unter erneuter Bezugnahme auf die Fig. 7A treibt ein Motor 25 3 den Schaft 251 an, der das Käfigläufer-Gebläse 253 rotieren läßt. Das Gebläse 253 erzevgt Luftbewegung durch den Diffusor 254 unter Strömung in den inneren Durchgangsweg 25 3. Das Gebläse erzeugt einen ausreichenden Zirkulationsstrom, daß die Luft, welche durch den inneren Durchlaufweg 256 strömt, bei 2000 Fuß pro Minute zirkuliert. Der Diffusor 254 stellt sicher, daß die Wärme der durch das Gebläse 253 geblasenen Luft über den gesamten Durchlaufweg 256 hinweg gleichmäßig ist. Der Kegel 255 auf dem Diffusor 254 hilft beim Mischen der strömenden Luft, wodurch die Temperatur-Gleichmäßigkeit über den Durchl iufweg 256 hinweg gefördert wird. Der Diffusor 254 wirkt zur Sicherstellung eines gleichmi ißigen Luftstroms durch den Durchlaufweg 256 in der Region der Kapillarenkassette und verringert die Ungleichmäßigkeit durch Wandverlusteffekte im inneren Durchlaufweg 256.
Der innere Durchlaufweg 256 wird durch das Außengthäuse 270 begrenzt. Das Außengehäuse 270 weist vorzugsweise einen rechteckigen Qw :rschnitt auf und besteht aus Metallblech, Kunststoff oder einem anderen haltbaren Mater: al. Die Innenoberfläche des Außengehäuses 270 ist an allen Stellen, außer dem Einlaß 278 mit einer thermischen Schaumisolierung 272 ausgekleidet. Die Isolierung 272 \ erhindert eine übermäßige Erwärmung des Außengehäuses 270 und hilft bei der Beibehaltu ig der Wärme und unterstützt die Temperaturgleichmäßigkeit der durch den inneren Durchlau: weg 256 zirkulierenden Luft.
Nachdem sie zuerst durch den Diffusor 254 geströmt ist, fließt die Luft durch einen zweiten Diffusor 258. Die Diffusoren 254 und 258 fördern einen gleic imäßigen Luftstrom und die Temperaturgleichmäßigkeit über den inneren Durchlaufweg 2:i6 hinweg. Nach dem ersten Diffusor 254 verändert sich der Durchlaufweg 256 unter Anpass ung an die Abmessungen des nachfolgenden Durchlaufweges 256. Die erwärmte Luft strömt an dem Thermoelement 260 vorbei, welches in der Mitte des inneren Durchlaufweges 256, gleich nach dem zweiten Diffusor 258, vertikal angeordnet ist. Das Thermoelement 26C wirkt zur Überwachung der Temperatur innerhalb des inneren Durchlaufweges 256. Das T iermoelement 260 kann eine
Temperaturüberwachungsvorrichtung sein, inseriert in eine K.apillarrohr-Sektion, welche durch das Außengehäuse 270 und durch die Schaumisolierung 2 72 hindurchreicht. Alternativ dazu kann das Thermoelement 260 so gewählt sein, daß es die Innentemperatur einer Kapillarröhre genau wiedergibt.
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Die durch den Innendurchlaufsweg 256 zirkulierende Luft la aft am Thermoelement 260 vorbei und fließt an den Kapillarröhrensegmenten 12 der Kapillarenkassette 15 vorbei. Die Enden der Kapillarröhrensegmente sind an ihrem oberen Ende durch die deformierbare Membran 264a verschlossen, montiert auf der oberen Plattform 261, welche gesenkt worden ist, um einen luftdichten Verschluß mit dem Gehäuse 270 zu bilden. Das untere Ende der Kapillarröhrensegmente 12 wird durch die deformierbare Membran 264b verschlossen. Die deformierbare Membran 264b ist auf der Plattform 200 mor tiert, welche durch Ansatzschrauben 268 auf einer Bodenoberfläche befestigt ist. Die An; atzschrauben 268 erstrecken sich durch das Gehäuse 270 und werden durch die Plattforir 271 gehalten. Federn 275, lokalisiert zwischen der Plattform 200 und der Plattform 271. liefern eine Vorspannkraft, wobei zugelassen wird, daß die Plattform 200 schwebt, so daß die deformierbare Membran gegen die Enden der Kapillaren 12 gespannt wird. Die Funktion der doppelt wirkenden pneumatischen Einrichtungen bewirkt das Schließen des Deckel s 262 und die Ausübung von Kraft zur Positionierung der Plattform 271, und ist im Zusammenhang mit Fig. 7C beschrieben. Der Deckel 262 paßt auf das Gehäuse 270, so daß c as Blechmaterial oder andere Material, welches den Rand des Deckels 262 aufbaut, auf die Oberseite des Gehäuses 270 paßt. Die Membran 264a ist so auf der oberen Plattform 261 mo itiert, daß die Membran 264a wenigstens weit genug in den inneren Durchlaufweg 256 hineim eicht, daß die Membran 264a eben zu der Isolierung 272 liegt. Wenn die Luft an den Kapillarröhrensegmenten 12 vorbeiwandert, werden die Längen der Kapillarröhrensegmente 12 unterhalb des Substrates 10 rasch auf die Temperatur der Luft erwärmt und abgekühlt, welche sich schnell durch den inneren Durchlaufweg 256 bewegt.
Die Tür 274, gesteuert vom Motor 276, wird im Zusammenhang mit dem Thermoelement 260 und dem Heizelement 252 eingesetzt, um die Temperatur irnerhalb des inneren Durchlaufweges 256 zu regulieren. Wenn die Tür 274 geschlossen ist, wird die innerhalb des Innendurchlaufweges zirkulierende Luft nicht durch Außenluft aasgetauscht. Wenn die Luft kontinuierlich über das Heizelement 252 läuft, wird die Luft ra »ch erwärmt, bis die Luft zur gewählten Temperatur kommt. Sobald das Thermoelement 260 fühlt, daß die Temperatur bei einer gewählten Temperatur liegt, kann das Heizelement 252 bei einem geringeren Wärmeausstoß gehalten werden, so daß die interne Temperatur aufrechterhalten wird. Wenn die Temperatur rasch abgesenkt werden muß, wie während einer r Tiermozykler-Reaktion, kann
die Tür 274 in die Orientierung 274a bewegt werden mittels de > Motors 276, wobei die Tür 274 in den inneren Durchlaufweg 256 bewegt wird, was erlaubt, iaß die gesamte Luft, welche an der Kapillarenkassette 15 vorbeigelaufen ist, aus dem inneren Durchlaufweg 256 heraus nach außen abgestoßen wird. Es wird in Betracht gezogen, daß > :in Filter oder Abgasgang an der Tür 274 montiert werden könnte, um zu verhindern, daß Verbindungen in der zirkulierenden Luft in die Umwelt ausgestoßen werden. Die rasch zirkulierende Luft wird schnell in den Außenraum des Thermozyklers abgegeben, währe id Umgebungsluft durch den Lufteinlaß 278 eingezogen wird. Die durch den Einlaß 278 in de &eegr; inneren Durchlaufweg 256 hineingezogene Luft fließt durch den Heizer 252. Der Bereich, durch welchen die Luft sich bewegt, wird durch den Block 259 eingeengt, welcher über dem Heizer 252 innerhalb der Innenkammer 256 positioniert ist. Wiederum wird die Temperatur der Luft innerhalb des inneren Durchlaufweges 256 durch das Thermoelement 26C überwacht, und wenn der gewünschte Temperaturabfall stattgefunden hat, wird die Tür 274 zum Gehäuse 270 hin gebracht, wobei das durch den Lufteinlaß 278 eingezogene Luftv blumen verringert wird.
Durch Anschließen des Heizelementes 252, des Thermoelementes 260 und des Türmotors 276 an ein elektronisches Steuerungssystem, wie eine Computer-Steierungseinrichtung, kann dieser Thermozykler präzise Lufttemperatur-variierende Abfolgen a isfuhren. Zusätzliche Wärme wird, falls benötigt, durch das Heizelement 252 zugefügt, und V rärme wird durch Öffnen der Tür 274 abgeführt, wobei das Temperaturergebnis jeder Aktion durch das Thermoelement 260 überwacht wird. Das Ausstoßen von zirkulierender Luft durch die Tür 274 erlaubt, daß die Luft innerhalb des inneren Durchlaufweges hinsichtlich der Te tnperatur bei einer Rate von mehr als 10 Grad pro Sekunde abfällt.
Die rasche Temperaturveränderung, kombiniert mit dem rascher. Transfer von Wärme an die Kapillaren oder von ihnen weg, gestattet effiziente Temperatur yklierungs-Reaktionen. Zum Beispiel können in Reaktionen unter Verwendung einer thermos abilen Polymerase die Denaturierung von Nukleinsäuresträngen und die Anlagerung von Primer an Matrizenstränge jeweils in ein bis fünf Sekunden stattfinden. Die Verlängerung dis Primers wird weniger Zeit benötigen, um bewirkt zu werden, weil die rasch umlaufende Lu ft und die dünnen Wände der Kapillaren das Innenvolumen der Kapillaren schnell auf die g* wählte Temperatur bringen. Die dünnen Wände der Kapillaren und das kleine Kapillaren volumen ermöglichen einen raschen Temperaturwechsel und Wärmetransfer über das gesarr te innere Kapillarenvolumen hinweg. Dies verringert in großem Maße die für jede Reaktion bt nötigte Herstellungszeit, was eine effizientere Nutzung des Thermozyklers und einen größeren Durchsatz bei der Probenherstellung gestattet. Gegenwärtig kann eine 30-Zyklen-P ÜR-Amplifikation in weniger
als 30 Minuten durchgeführt werden. Es sollte möglich sein, diess Zeit auf unter 8 Minuten zu verringern.
Sobald die Thermozykler-Reaktion abgeschlossen ist, kann die obere Plattform 261 angehoben werden, und die Kapillarenkassette 15 wird aus dem Innendurchlaufsweg 256 entfernt. Während des Temperatur-Cycling-Verfahrens wird si:h die Flüssigkeit innerhalb jedes Kapillarröhrensegmentes etwas ausdehnen, und etwas Flüsigkeit wird aus der Kapillare auslecken und von der rasch strömenden Luft fortgetragen wei den. Jedoch beläuft sich ein solcher Verlust nur auf einige wenige Prozent des Volumens < es Kapillarröhrensegmentes und sollte weder ein Kontaminationsproblem darstellen noch genügend Reaktionsprodukt-Verlust verursachen, um die anschließende Analyse materiell zu beeinflussen. Darüber hinaus wird der Teil der Kapillarröhrensegmente 12, lokalisiert zwischen dem Substrat 10 und der deformierbaren Membran 264a, nur einen geringen LuftstrDm erfahren und wird die Denaturationstemperatur mit geringerer Wahrscheinlichkeit rasch erreichen. Da jedoch diese Strecke kurz ist, sollte das Versagen dieses Bereichs, die Denatui ierungstemperatur schnell zu erreichen, nicht die Fähigkeit des verbleibenden Teiles der Kapi Uare nachteilig beeinflussen, ausreichend Reaktionsprodukt für die anschließende Analyse zu (rzeugen.
Eine alternative Vorrichtung zum Verschließen der Enden der K ipillare ist ein Kapillarenkassettenhalter, welcher die Enden der Kapillarröhrensegmen :e einer Kapillarenkassette verschließt. Unter Bezugnahme auf die Fig. 3B besteht der K apillarenkassettenhalter aus einem Paar von parallelen, deformierbaren Membranen 14a, 14 3, jeweils befestigt auf einer Plattform 16a, 16b. Die deformierbaren Membranen können Silicongummi-Verschlüße, Teflon®, Kunststoff oder ein anderes elastisches deformierbares Material sein. Ein Paar von parallelen Pfosten 9 erstreckt sich von der Bodenplattiorm 16a zur Oberseiten-Trägerplattform 24, wo die Pfosten durch die Innengewinde-ISiuß 18 gesichert sind. Der Pfosten 9 läuft durch die Plattform 24, und die Nuß 18 wird auf ;iner ringförmigen Lippe der Plattform 24 gehalten. Die Ansatz schrauben 20 reichen durch Löcher im Träger 24 und sind auf der oberen Plattform 16b befestigt. Die Federn 22 spannen die obere Plattform 16b gegen die Enden von Kapillarröhrensegmenten 12, während es 16b gesi artet wird, zu schweben. Das Substrat 10 der Kapillarenkassette 15 kann entworfen sein, um L öcher zu haben, welche dem Abstand und der Ausmessung der Pfosten 18 entsprechen, so d iß die Kapillarenkassette 15 einfacher und sicherer innerhalb des Halters 23 gehalten werden 1 :ann.
Sobald die Enden der Kapillarenkassette im Halter 23 verschlossen sind, können die Kapillarenkassette und der Halter in Kombination an Wärmezyklen aus gesetzt werden. Der gezeigte Halter verschließt 16 Kapillaren. Jedoch kann ein Halter entwerfen werden, um Kapillaren-
kassetten mit 96 Kapillaren oder höheren Dichten von Kapilkren zu halten. Zusätzlich zu Kapillarenkassetten können Chips von anderen Substraten als die Reaktionsbehälter verwendet werden. Die Fig. 3E zeigt ein Chipsubstrat 70, bestehend aus zwei verklebten Substratschichten 72, 74. Eine Schicht 72 besitzt Rinnen 76, wel :he sich der Länge des Chips nach erstrecken. Das angeheftete Oberseitensubstrat 72 umschl eßt einen Durchtrittsweg 76 mit der Abmessung einer Kapillare mit entgegengesetzten offenen Enden. Eine flüssige Reaktionsmischung kann in den eingeschlossenen Durchtritts veg eingeführt werden. Die Enden dieser Durchtrittswege können verschlossen werden, indem die Enden gegen eine deformierbare Membran gepresst werden, wie es bei den Kapil iarenkassetten bewerkstelligt wurde. Die Temperatur-Zyklierung kann längere Zeiten erfordern, wegen der größeren Materialmasse, welche der Chip umfaßt, aber die Zyklierunj ;szeiten sollten immer noch rascher sein als beim herkömmlichen Cycling.
Für isothermische Reaktionen, wie "Rolling Cycle"-Amplifika1ion, wird keine Temperatur-Zyklierung erfordert, um die Reaktion zu bewirken. Sobald eine isothermische Reaktionsmischung vereinigt und in eine Kapillarenkassette eingeführt ist, wird die Inkubation der Kassette bei einer Reaktionstemperatur das Stattfinden der Reaktion erlauben. Unter Bezugnahme auf die Fig. 1 kann die automatische Transfervorrichtung eine Kapillarenkassette in den Inkubator 124 überführen, wo die Kapillarenkassette bei einer gewählten Temperatur inkubiert wird. Ein Satz deformierbarer Membranen kann verwendet werden, um die Enden der Kapillaren während der Inkubation zu verschließen. Wie bei anderen Systemkomponenten gesehen wurde, kann der Inkubator 124 zur gleichen Zeit wie andere Systemkomponenten verwendet werden.
Im Falle von PCR- oder Kettenabbruch-Sequenzierungs-Reaktionen ist es notwendig, die Reaktionsmischung an Temperaturzyklen zu exponieren. In der Fi\. 1 bewegt der Transferkopf 104 die Kapillarenkassette in den Thermozykler 116. Die The rmozykler-Vorrichtung kann jedwede Vorrichtung sein, welche die Kapillarröhrensegmente der Kapillarenkassette an Temperaturzyklen aussetzen kann. Thermozykler-Vorrichtungen, we lche Wasser, ein elektrisches Feld, Heizblöcke oder andere Einrichtungen verwenden, können eingesetzt werden. Alternativ dazu sind luftbasierende Thermozykler-Vorrichtungen schnell u id sind anpaßbar an das Niedervolumen-Zyklieren der vorliegenden Erfindung.
Eine Thermozykler-Vorrichtung, welche Luft als das Temperat lrtransfermedium verwendet, ist in der Fig. 6 gezeigt. Die Reaktionsmischung ist in Kapilk rröhrensegmenten enthalten, welche ein hohes Oberfläche-zu-Volumen-Verhältnis und gerir ge Materialdicke aufweisen.
Dies gestattet den sehr raschen Transfer von Wärme durch die &lgr; /ände der Kapillare und über
die gesamte flüssige Reaktionsmischung hinweg. Eine Gleichge\ /ichtstemperatur wird schnell über die gesamte Flüssigkeit in der Kapillare hinweg erreicht. E ie Verwendung von Luft als ein Wärmetransfermedium ermöglicht das rasche rampenförmij ;e Ändern der Temperatur in der Reaktionskammer. Die rasche Zirkulation der Luft stellt eine schnelle und gleichmäßigere Erwärmung oder Abkühlung der Kapillarensegmente und ihres Ir halts sicher.
Die innerhalb des Halters 8 verschlossene Kapillarenkassette 15 wird durch die Öffnung 215 in das Gehäuse 202 des luftbasierenden Thermozyklers eingefür. rt. Der Halter 8 wird von der Gehäuseoberfläche 215 der Thermozyklerkammer 210 getragen. Die Kapillarröhren 12, montiert auf dem Substrat 10, werden an die Luft der Thermozykl· :rkammer 210 ausgesetzt, so daß die Luft frei um die Kapillarröhrensegmente 12 fließen kam. Das Thermoelement 216 überwacht die Temperatur der sich an den Kapillarröhren 12 vort eibewegenden Luft.
In der luftbasierenden Thermozyklervorrichtung wälzt die vom Motor 206 angetriebene Schaufel 208 die Luft innerhalb der Reaktionskammer 210 rasch um. Die Luft wird schnell an den Kapillaren 12 der Kapillarenkassette 15 vorbei zirkuliert. Die Halogenbirne 220 wirkt als eine Wärmequelle zur Erwärmung der Luft innerhalb der Thermozyklerkammer 210. Um eine Thermozyklerreaktion zu bewirken, wird die zirkulierende Luft während einer gewählten Zeitdauer bei einer gewählten Temperatur gehalten. Das Thermoelement 216 übermittelt die Temperatur des Kapillarröhrensegments 12 an den Mikroprozessor 218. Um die benötigten Temperaturänderungen zu bewirken, weist der Mikroprozessor den Stellantrieb 222 an, die Tür 226 zu öffnen, was das Hindurchtreten von Luft durch den Luftabzug 224 gestattet. Mit dem Hindurchtreten von Luft durch den Luftabzug 224 wird zusätzliche Luft durch den Lufteinlaß 203 mittels der Ventilatorschaufel 204 in die Reaktionskammer eingezogen. Die Ventilatorschaufel 204 wird durch den Motor 206 angetrieben. Die Entlüftung von Heißluft und das Ersetzen mit kühlerer Umgebungsluft, kombiniert mit der raschen Zirkulation von Luft durch das Gebläse 208, einer relativ kleinen Thermozyklerkammer 210 und der präzisen Messung der Probentemperaturen durch das Thermoelement 216, ermöglicht die rasche, rampenartige Änderung der Temperatur. Die zur Bewirkung de r Wärmezyklen erforderliche Zeit wird in großem Maße verringert. Eine typische Thermozyklerreaktion erfordert verschiedene Temperaturen zum Denaturieren von Nukleinsä uresträngen, Anlagern eines Primers und zur Verlängerung mittels einer Polymerase. Die De: iaturierungs- und Annealing-Schritte finden rasch in einer Kapillarröhre statt, worin dis kleine Innenvolumen an Flüssigkeit schnell zu einem Gleichgewicht kommen wird, wiihrend die Verlängerung des DNA-Moleküls weniger als 10 Sekunden für eine Verlängerung um 500 Basen benötigt. Die für jeden Wärmezyklus aus den drei Temperaturen (Anlagern, Verlängern, Denaturieren) erforderte Zeit kann auf unter 15 Sekunden reduziert verden, indem der rasche
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Wärmetransfer der luftbasierenden Thermozyklervorrichtung genutzt wird. Ein Programm von 30 Zyklen, wobei jeder Zyklus die Kapillare während variierender Zeitdauern an drei Temperaturen aussetzt, kann theoretisch in unter 8 Minuten bewe rkstelligt werden.
Die Verwendung der Kapillarenkassette in Kombination mit ein< m Luft-basierenden Thermozykler läßt weitere Vorteile zu. Der Kapillarenkassetten-Halter ' ^erschließt zeitweilig die Kapillare, was ein rasches und vereinfachtes Verschließen jedes Ka pillarröhrensegments erlaubt. Die Kapillarenkassette enthält eine Anzahl von Kapillarröhren ii &igr; paralleler Ausrichtung, was eine effizientere Nutzung des Thermozyklers gestattet und einen größeren Probendurchsatz erlaubt. Sobald der Wärmezyklus abgeschlossen ist, wird die irr Halter 8 enthaltene Kapillarenkassette 15 durch die Öffnung 215 entfernt. Die Kapillarenka.· isette 15 wird aus dem Halter freigegeben und wird anschließend ausgeteilt.
Die Thermozykler von Fig. 6 und 7A-C wurden im Einsatz m it Kapillarenkassetten veranschaulicht. Die gleichen Vorrichtungen sind an andere Behälter nit entgegengesetzten Enden anpaßbar. Zum Beispiel besitzt ein Chip-artiges Substrat mit eir er Mehrzahl von Durchtrittswegen, welche sich durch den Chip erstrecken (wie in Fij;. 3E ersichtlich), wie eine Kapillarenkassette, gleichmäßig räumlich angeordnete entgegengesetzte offene Enden. Mehrere Chips könnten in einen Thermozykler eingebracht wen en, wobei die offenen Enden zeitweilig verschlossen werden, und an Wärmezyklen ausg ;setzt werden. Die raschen Temperaruränderungen können wegen der erhöhten Materialdick; ein bißchen langsamer sein. Andere Behälter mit entgegengesetzten offenen Enden können ebenfalls mit beiden Temperaturzyklierungs-Vorrichtungen eingesetzt werden.
C. Austeilung der vervollständigten Reaktionsmischung
Im Anschluß an den Abschluß der Thermozyklerreaktion wird iie hergestellte Reaktionsmischung für die Analyse durch ein analytisches System in ein Sut strat ausgeteilt. Wie obenstehend angegeben, kann die Kapillarenkassette durch Luftverdri ngung, Zentrifugalkraft, Vakuum oder eine andere Verdrängungsmethode ausgeteilt were en. Das Substrat, in das die Reaktionsmischung verlagert wird, kann in den Vertiefungen ein &idigr;&ggr; Mehrfachvertiefungsplatte, Stellen auf einem ebenen Substrat oder Vertiefungen, welche in einen analytischen Chip führen, bestehen. Die Reaktionsmischung kann, obwohl klein, noch genug amplifiziertes Reaktionsprodukt herstellen, daß eine Verdünnung notwendig ist.
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Austeilung der vervollständigten Reaktionsmischung, Beispiel I:
Direkte Verdünnung
Unter Bezugnahme auf die Fig. I kann die Kapillarenkassette, im Anschluß an die Vervollständigung des Temperaturzyklierungs-Verfahrens, aus iem Luft-Thermozykler 116 mittels des Transferkopfes 104 entnommen werden. Die Kapillarenkassette kann durch den Transferkopf 104 bewegt werden, um in eine Platte gebracht zu werden, welche aus dem Hotel für fertiggestellte Proben 112 ausgegeben wurde. Die PIaI te, lokalisiert an der Position c, kann eine Mehrfachvertiefungs-Platte sein, wie eine 384-Vertiefungs-Mikroplatte. Die Vertiefungen der Platte enthalten eine Verdünnungsflüssigkeit, vie Formamid, Wasser, TBE oder einen anderen gewählten Puffer. Die Reaktionsmischung kann aus den Kapillarröhrensegmenten der Kapillarenkassette durch positive Verdrängurg, Zentrifugation oder eine andere Dispenser-Methode ausgeteilt werden. Die Reaktion kan &igr; für eine weitere chemische oder biochemische Reaktion auch in eine Lösung abgegeben wer len.
Austeilung der vervollständigten Reaktionsmischung, Beispiel 2:
Ethanolfällung
Eine Ethanolfällung kann in einer Dispenser-Einrichtung, ähnlic &igr; zu den Methoden der direkten Verdünnung, bewirkt werden. Der Transferkopf 104 von Fig.. 1 würde erneut die KapiUarenkassette aus dem Luft-Thermozykler 116 nehmen und die kurzen Enden der Kapillaren in eine Mehrfachvertiefungs-Platte bringen, lokalisiert an der Posii ion c. In diesem Fall würden die Vertiefungen der Platte einen Ethanol enthalten, wie auf 4°C gekühlten 90%igen Ethanol. Die Reaktionsmischung würde mittels Zentrifuge, positiver Vei drängung oder einer anderen Austeilungsmethode aus der Kapillarenkassette in den Ethanol a isgeteilt werden. Der Ethanol könnte dann durch Absaugen oder andere Mittel entfernt werden Die ausgefällte DNA könnte dann in Formamid, Wasser oder einem anderen geeigneten Ver iünnungsmittel resuspendiert werden. Sobald die Probenplatte vorbereitet ist, entweder durch direktes Verdünnen oder Ethanolfällung, kann die Platte durch den Transferkopf 104 ;;ur analytischen Bühne 120 überführt werden. Die analytische Bühne 120 kann die Probenpli ttte direkt in ein Analysegerät zuführen, zum Beispiel ein Kapillaren-Feldanordnungs-^lektrophoresesystem, wie MegaBACE™, hergestellt von Molecular Dynamics, Sunnyval·; CA. Alternativ dazu könnte die analytische Bühne das Produkt zur weiteren Verarbeitung a a andere Systemen zuführen. Es ist auch möglich, die Proben auf ein Substrat für Massenspektrometrie-Analyse, kalorimetrische Analyse oder andere analytische Verfahren auszi iteilen.
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Austeilung der vervollständigten Reaktionsmischung; Beispiel 3:
Direktes Austeilen in ein analytisches System
In den vorhergehenden zwei Beispielen wurden die Proben in Mehrfachvertiefungs-Platten ausgeteilt. Diese Platten konnten dann manuell oder per Robotei auf eine Bühne für die Analyse durch ein analytisches System bewegt werden. Alternativ di lzu könnte die Kapillarenkassette direkt in die Vertiefungen einer analytischen Vorrichtung, wie einem Elektrophorese-Chip, ausgeteilt werden. Zum Beispiel kann eine Kapillarer kassette mit 16 Kapillaren, angeordnet in dem Substrat in zwei parallelen Reihen von acht K apillaren, an 16 Vertiefungen in einem analytischen Mikrochip andocken. Ein solcher Mikrochip würde eine Feldanordnung von analytischen Spuren in Fluid-Kommunikation mit einer Prob enöffnung aufweisen.
Die Kapillarenkassette kann so entworfen sein, daß der räumliche Abstand der Kapillaren dem räumlichen Abstand der Probenreservoir-Eingänge entsprk ht. Zum Beispiel schließt die in Fig. 3 C veranschaulichte Kapillarenkassette Kapillaren 12 ein, welche durch den flexiblen Streifen 11 reichen. Der flexible Streifen 11 kann allein oder in'. Combination mit anderen solchen Streifen verwendet werden. Die Orientierung der Kapillare: &igr; in einer im wesentlichen geraden Linie kann verändert werden, indem der Streifen 11 inter Bildung eines Bogens gebogen wird. Die Fig. 3D veranschaulicht den Streifen 11, w)bei jedoch zugelassen wird, daß die Kapillaren 12 in Eingabe-Öffnungen passen, welche auf einem Substrat in einem zirkulären Muster angeordnet sind. Die Flüssigkeit in den Kapillaren 12 kann dann elektrokinetisch injiziert oder anderweitig aus den Kapillaren 12 in Öffnungen eines analytischen Chips ausgeteilt werden, wenn eine passende Elektroden-Feldar Ordnung eingesetzt wird. Der Streifen 13 kann durch Pressen des Streifens 13 gegen eine gekrümmte Form, wie einen gekrümmten Metallblock, in der gekrümmten Orientierung pe sitioniert werden. Dies kann durch eine automatische Streifen-Bewegungseinrichtung bewi :kt werden, welche in einem automatischen Probenherstellungs-System eingebunden ist.
Die Kapillarenkassette könnte durch Luftverdrängung oder and sre Dispenser-Einrichtungen, die vorzugsweise gewählt sind, um Verspritzen und Blasenbildung zu minimieren, ausgeteilt werden. Vor dem Austeilen der hergestellten Reaktionsmischung in die Vertiefungen zur Analyse, könnte eine kleine Menge eines Verdünnungsmittels in jede Vertiefung des analytischen Mikrochips zugegeben werden. Wenn die KapiL arenkassette ausgeteilt wird, wird das Verdünnungsmittel die Proben in den Proben-VertieJ üngen verdünnen. Die in der Kapillarenkassette hergestellten Reaktionsmischungen von Sub nikroliter-Volumen, wie eine DNA-Sequenzierungs-Reaktionsproduktmischung, können leicht mit dem analytischen Mikrochip zur Sequenzierung integriert werden.
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Im Anschluß an jede Verwendung einer Kapillarenkassette kann die Kapillarenkassette gewasehen und wiederverwendet werden. Nachdem der Inhalt der Kapillarenkassette ausgeteilt worden ist oder eine Kapillarenkassette anderweitig verwendet worden ist, wird die Kapillarenkassette zur Kassetten-Wascheinrichtung 118 gebracht, wo c ie Kassette gewaschen wird. Im Anschluß an das Waschen wird die Kassette in das Kassetten iotel 106 zurückgebracht, wo die Kassette erneut verwendet werden kann.
Unter Bezug auf die Fig. 8A ist die Kapillarenkassetten-Wascheinrichtung 410 aufgebaut aus dem Waschverteilerstück 412 und der Waschtankbühne 416. Zwischen dem Waschverteilerstück 412 und der Waschtankbühne 416 befindet sich die Kapil arenkassetten-Plattform 414. Von der Waschtankbühne 416 geht das Bein 419 aus. In diesem Waschsystem wird eine Waschflüssigkeit aus einem oder mehreren der Behälter 452, 454, 456, 458 durch jeweilige Schläuche 1, 2, 3, 4 in jeweilige "Router"- bzw. Leitwegrichter· Eingänge 453, 455, 457, 459 gepumpt. Der Router leitet das gewählte Waschfluid durch den ] louter-Ausfluß 451 durch die Leitung 451a in den Waschtank 440. Das Fluid wird aus dem Waschtank 440 durch Kapillarröhrensegmente einer Kapillarenkassette gezogen. Das Kapillai enkassetten-Substrat wird so zwischen dem Waschverteilerstück 412 und dem Waschtank 440 gehalten, daß wenn ein Sog am Waschverteilerstück 412 angelegt wird, das Waschfluid dur:h Kapillarenröhrensegmente aus dem Waschtank 440 gezogen werden wird. Die Wasch-Lösung wird mittels Vakuum durch das Waschverteilerstück 412 und in das Abfallbehältnis 450 gezogen.
Die Fig. 8E liefert ein Schema des Funktionierens der Wäschst ation. Der Stickstofftank 460 liefert eine Druckquelle, um den Fluidfluß zu leiten. Das Öffnen das Handventils 462 gestattet, daß Gas durch den Regulator 466 und durch den FiIt ir 468 strömt. Der Regulator 466 regelt den Druck aus der Druckquelle. Der Drucksensor 464 überwacht den Gasdruck aus der Stickstoffquelle und gibt an, wenn der Gasdruck unterhalb > ;ines gewählten Drucks liegt.
Das unter Druck gesetzte Gas fließt durch den Filter 468 in die Leitung 470. Die Druckgasleitung 470 verzweigt sich zur Spitze von verschlösse: ien Waschflaschen 471, 472, 473 und 474. Der unter Druck gesetzte Stickstoff pumpt die We schflüssigkeit innerhalb jeder Waschflasche in jeweilige Fluidleitungen 471a, 472a, 473a bzw. 474a durch einen Aufnahmefilter 476 auf jeder der jeweiligen Fluidleitungen. Jede der verschlossenen Waschlösungsflaschen kann eine andere Waschlösung enthalten, wie Wasse-, Alkohol, einen Puffer oder eine andere Waschlösung. Obwohl vier Waschflaschen illustrie 1 sind, ist das System an den Einsatz mit mehr oder weniger Waschfluiden anpassbar. E arüber hinaus erfordert der
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Wechsel von Waschflaschen lediglich das Entlüften des N2-I)rucks auf den Flaschen 471, 472, 473, 474 am Ventil 462, das Entfernen der Kappe von der gewählten Flasche und das Umsetzen der Kappe mit angebrachten Druck- und Fluid! situngen in eine neue oder wiederaufgefüllte Waschfluidflasche. Jede der Fluidleitunger 471a, 472a, 473a und 474a endet im Selektorventü 478. Gemäß einem vorher eingestellten Programm leitet das Selektorventil eines der gewählten Fluide aus der Eingangsleitung in d e Ventilausgangsleitung 480. Die Ventilausgangsleitung transportiert dann die Flüssigkeit u lter Druck in den Waschtank 440.
Die Kapillarröhren in der Kapillarenkassette wirken als ein Abzi igkanal für den Transport von Fluid aus dem Waschtank 440 in den Waschverteilerstück-Inner raum 425. Die Vakuumquelle 496 liefert eine Vakuumkraft, sobald das Ventil 492 offen ist. Wenn das Vakuumventil 498 offen ist, wird eine Vakuumkraft in die Abwasserflasche 490 £ ;erichtet, was einen negativen Druck innerhalb der Leitung 490a erzeugt. Wenn das Ventil 49f offen ist, wird ein Sog durch die Absaugleitung 490a, die Absaugleitung 495a und die Absaugleitungen 424a angelegt. Mit Anlegen eines Sogs über die Absaugöffnungen 424 durch die Saugleitungen 424a wird der negative Druck über den Waschverteilerstück-Innenraum 425 Flüssigkeit durch die Kapillarröhrensegmente, welche in den Waschverteilerstück-Innenraur &igr; 425 reichen, aufziehen. Die Flüssigkeit wird durch die Absaugdurchtrittswege 424, in di; Absaugleitungen 424a, am Ventil 495 vorbei, durch die Absaugleitungen 495a und 490a ur.d in die Abwasserflasche 490 wandern.
Die Fig. 8D veranschaulicht eine Ansicht des Waschverteilers ücks. Der Boden des Waschverteilerstücks enthält Löcher 426, in die die Kapillaren eingeschoben werden. Der Innenraum des Waschverteilerstücks 425 besteht aus Spuren, verbunden in einem ersten Ende zu Absaugdurchtrittswegen 424 und an einem zweiten Ende zu Spüldi rchtrittswegen 423. Wenn ein Sog über die Leitung 424a angelegt wird, wird Fluid durch die JCapillaren in die Spuren, welche den Innenraum 425 umfassen, über Durchtrittswege 424 un< I in die Leitung 424a gezogen werden. Wenn das Spülventil geöffnet wird, wird Luft durch die Leitung 423 a, über den Durchtrittsweg 423, in den Innenraum 425 und in den Durchtr ittsweg 424 treten, wobei der Innenraum 425 von jeglicher im Innenraum 425 verbleibenden P lüssigkeit geklärt wird.
Im Anschluß an das Waschen, wird der Waschtank 440 relati &igr; zu der Kapillarenkassetten-Plattform gesenkt, so daß die Enden der Kapillarröhrensegim nte nicht in Kontakt mit der Flüssigkeit im Waschtank 440 stehen. Die Flüssigkeit innerhdb des Waschtanks 440 wird über den Ablauf 484 abgeführt, der das Fluid in die Ablaufleiturj g 484a leitet, wenn das Ventil
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485 geöffnet wird und ein Sog über die Absaugleitung 49Oi angelegt wird. Das Fluid innerhalb des Waschtanks 440 wird dann in die Abwasserflasche 490 ablaufen.
Bevor jede Waschlösung in den Waschtank 440 eingeführt wird, werden die Waschfluid-Zufahrleitung 480 und das Waschtank-Verteilerstück 480a gespült, am die Leitung von jeglicher vorhergehenden Flüssigkeit zu leeren. Dies wird durch Öffnen e ines der Ventile im Selektorventil 478 und Fließenlassen von Waschfluid durch die Zufuhrle rung 480 und durch die Auslaufleitungen 482 bewirkt. Das Öffnen des Ventils 487 erlaubt c ie Übermittlung einer Vakuumkraft über die Leitung 490a durch Leitung 488, was einen Sog vorsieht, der im Zusammenhang mit dem Fluiddruck verwendet wird, um das Ve teilerstück über die Auslaufleitungen 482 auszuspülen. Sobald die Waschfiuid-Zufuhrleitun &igr; 480 und das Verteilerstück gespült sind, wird das Ventil 487 geschlossen und der Waschtank wird angehoben und gefüllt. Der Füllungsspiegel des Waschtanks 440 wird durch eine gew ihlte Waschfluid-Einfüllzeit und den Waschfluid-Druck gesteuert. Eine Überlauföffnung 4 16 dient als ein Sicherheitsablauf, um eine Fluidüberfüllung abzuleiten. Wenn der Fluids; riegel innerhalb des Waschtanks 440 zu hoch ist, wird Flüssigkeit aus dem Waschtank 440 in die Überlauföffnung 486 und in die Leitung 486a fließen. Wenn das Ventil 487 offen i: ;t, wird die Absaugkraft aus Leitung 490a und 488 Überlauf-Flüssigkeit aus der Überlauföi fnung 486 in die Abwasserflasche 490 abziehen. Das Drosselungs-Strömungsventil 441 beschränkt den Fluß des flüssigen Fluids durch die Leitungen 482.
Die Fig. 8F zeigt die perspektivische Aufsicht auf den Waschfl aidtank 440. Eine Eingangs-Leitung führt eine Waschlösung in das Waschfluid verteilende Verteilerstück 480a. Dieses Verteilerstück stellt Waschfluid-Öffnungen 481 bereit, welche den Tank 440 füllen. Der räumliche Abstand der Waschfluid-Öffnungen 481 unterstützt di2 gleichmäßige Füllung quer über die Breite des Tanks 440. Die Füllzeit und der Fluiddruck regeln die Menge an Fluid, welche den Tank 440 füllt. Wenn überschüßiges Fluid in den T< ink 440 tritt, wird es aus der Überlauföffnung 486 ablaufen.
Um den Tank zu leeren, wird der Tank durch die pneumatische Einrichtung, wie beschrieben, abgesenkt, und der Ablauf 484 wird geöffnet. Die Form des Ta iks 440 lenkt das Fluid zum Ablauf 484, wenn das Ende des Tanks 440 mit dem Ablauf 484 gesenkt wird. Diese Konfiguration ist zur effektiven Befüllung, Leerung und Spülung des Ta iks 440 und der assoziierten Füll-Leitungen entworfen.
Unter erneutem Bezug auf die Fig. 8E kann, sobald ein Waschzyklus abgeschlossen worden ist, jedwede innerhalb des Innenraums des Waschverteilerstücks 425 verbleibende Flüssigkeit
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durch Öffnen des Ventils 491, während ein Sog über das Vertei erstück angelegt wird, eliminiert werden. Das Öffnen des Ventils 491 verursacht, daß ein Luft-Stoß über die Lüftungsöffnung 493 eingezogen wird. Die Luft wird in den Innenraum dss Waschverteilerstücks 425 über die Spülleitungen 423a eingeführt und wird durch die Absaugleitungen 424a entfernt. Wenn sich das Verteilerstück in Kontakt mit Kapillaren befinde t, stellen die verhältnismäßig engen Bohrungen der Kapillarenkassette eine limitierte Kapazität zum Ziehen von Luft durch das Waschverteilerstück bereit. Durch Öffnen des Ventils 491 kann eine viel größere Menge an Luft durch das Verteilerstück über die Spülleitungen 423 a, welche eine viel größere Kapazität zum Ziehen von Luft aufweisen, gezogen werden. Di is wird zu einem plötzlichen Andrang von durch das Verteilerstück gezogener Luft führen. Dieser wirkt zur Säuberung des Waschverteilerstücks von jeglicher innerhalb des Innenraums des Waschverteilerstücks 425 verbleibender Flüssigkeit. Vorzugsweise wird der Innenraum de: &igr; Verteilerstücks 425 vor und nach dem Anheben des Waschverteilerstücks gespült.
Unter Bezug auf die Fig. 8B wird die Waschstation 410 in der Seitenansicht gezeigt. Die Kapillarenkassetten-Plattform 414 ist auf Trägerbeinen 445 montie 1. Die Reservoir-Sektion, gezeigt im Innenquerschnitt, weist ein rückswärtiges unteres Ende des Reservoirs, den Abfluß-Ausgang 484, auf. Oberhalb vom Abfluß-Ausgang an der Rück wand des Tanks positioniert, befindet sich der Überlauf-Auslaß 486. Angeordnet auf der Vorderseite des Reservoirs befindet sich der Reservoir-Ablaufausgang 446. Jeder Ausgang ist assoziiert mit einem jeweiligen Rohr und Ventil, wie im Zusammenhang mit der Fig 8E beschrieben. Jedes Rohr trägt Flüssigkeit, welche aus einem assoziierten Ausgang fließt, wenn das assoziierte Ventil geöffnet und eine Vakuumquelle angelegt wird.
Die Kapillarenkassetten-Plattform 414 wird durch die Trägerbei:ie 445 in einer fixierten Position gehalten. Von der Vorderseite der Kapillarenkassetten-Platti orm 414 nach unten reichend befindet sich das Scharniergelenk 418 mit dem Drehzapfen 432 An einem unteren Ende des Gelenks 418 ist die Waschtankbühne 416 angebracht. Von der Waschtankbühne 416 sich nach unten erstreckend befindet sich das Bein 419, welches an e nem unteren Ende durch den Drehzapfen 443 mit dem pneumatischen Zylinder 429 verbunden ist. Am rückwärtigen Ende der stationären Kapillarenkassetten-Plattform 414 ist das Wasch/erteilerstück am Drehzapfen 420 angebracht. Wenn der pneumatische Zylinder 429 vom unteren Ende her gestreckt wird, wird die Waschtankbühne 416 in einem Bogen weg von der staionären Kapillarenkassetten-Plattform abgesenkt werden. Dies findet statt, wenn kein Drucl: an 429 angelegt ist und die Schwerkraft das Herunterschwenken der Waschtankbühne verursacht. Wenn der pneumatische Zylinder 429 vom oberen Ende her durch angelegten E ruck gestreckt wird, wird das
Waschverteilerstück 412 in einem Bogen weg von der Kapillarenkassetten-Plattform 414 angehoben werden.
Oberhalb der Kapillarenkassetten-Plattform 414 ist das Waschvt :rteilerstück 412 angeordnet. Das Waschverteilerstück weist einen Ausspül-Durchtrittsweg 4.13 auf, angeordnet an einem vorderen Ende, und einen Absaug-Durchtrittsweg 424, angeon.net zum rückwärtigen Ende hin. Die jeweiligen Leitungen, welche Luft zum Verteilerstück hingen oder Gas oder Flüssigkeiten aus dem Verteilerstück entfernen, werden im Zusammenh mg mit der Fig. 8E beschrieben.
Unter Bezug auf die Fig. 8C ist der pneumatische Zylinder 429 ir vollständiger Streckung von einem unteren Verbindungs-Drehzapfen 443 auf dem Bein 419, durch das Loch 333 in einer Kapillarenkassetten-Plattform 414, bis zu einer oberen Verbincung am Drehzapfen 428 auf dem Waschverteilerstück 412 gezeigt. Die ausgestreckte Höhe djs Waschverteilerstücks wird durch die Platte 430 begrenzt, welche auf der Oberseite des Vei teilerstücks 412 befestigt ist. Die Platte 430 stößt an den Stift 422 auf der Kapillarenkassetten-Plattform 414 an, wenn das Waschverteilerstück auf eine gewählte Höhe angehoben wird, ur d verhindert, daß das Waschverteilerstück 412 über diese Höhe hinaus angehoben wird. We: in ein Sog an den Waschverteilerstück-Innenraum 425 durch Anlegen eines Sogs durch der. Absaug-Durchtrittsweg 424 angelegt wird, wird Fluid durch die Kapillaren 12 aus dem Tank HO gezogen.
Das vordere Ende der Kapillarenkassetten-Plattform 414 ist am Drehzapfen 432 mit dem Gelenk 418 und der Waschtankbühne 416 verbunden, und das rücl< wärtige Ende der Kapillarenkassetten-Plattform 414 ist am Drehzapfen 420 mit dem Waschverteilerstück 412 verbunden.
Durch die Kapillarenkassetten-Plattform 414 hindurchreichend ist die Aussparung 434 vorgesehen. Die Abmessungen der Aussparung 434 sind so beschaffen, daß die Kapillarenkassette 15, wenn sie auf die Kapillarenkassetten-Plattform 414 gebracht wird, assoziierte Kapillarröhrensegmente 12 aufweist, welche durch die Kapillarenkassel ten-Plattform 414 hindurchreichen, während die vier Kanten des Kapillarenkassetten-Substrats 10 auf der Kapillarenkassetten-Plattform 414 auf dem Rand der Aussparung 434 gehalten werden. Ausrichtungs-Stifte können auf der Kapillarenkassetten-Plattform 414 hinzugefügt werden, um die Kapillarenkassette richtig zu positionieren.
Um die Kassetten-Waschsequenz zu bewirken, lässt eine elektro tusche Steuerungseinrichtung eine Abfolge von Schritten abarbeiten. Die elektronische Steuereinrichtung weist assoziierte angesteuerte Vorrichtungen der Waschstation an, eine prograrr mierte Waschsequenz auszuführen. Die programmierte Sequenz beginnt damit, daß die Ka] lillarenkassette von einer Ro-
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boter-Transfervorrichtung auf die Kapillarenkassetten-Bühne g ;bracht wird. Das Waschverteilerstück senkt sich so auf die Kapillarenkassette, daß das kürzere Ende der Kapillarröhrensegmente in das Waschverteilerstück ragt und die ei tgegengesetzten Enden der Kapillarröhrensegmente sich innerhalb der Waschflüssigkeit im Waschtank befinden, sobald dieser gefüllt ist. Das Substrat sieht einen teilweisen Abschluß &zgr; ,vischen dem Waschverteilerstück und der Kassette vor, so daß wenn ein Sog an die Kapil arröhrensegmente durch das Waschverteilerstück angelegt wird, Fluid über die Kapillarr ihrensegmente hoch in das Waschverteilerstück aufgezogen werden wird. Die Waschlösunj ;s-Zufuhrleitung wird mit der ersten gewählten Flüssigkeit gespült, um die vorhergehen e Lösung aus der Leitung auszutreiben. Wie in Bezug auf die Fig. 8E bemerkt, wird die Sf üllösung durch das Verteilerstück in den Ablauf 484 und die Entwässerungs-Leitungen 482 ii. die Waschabwasser-Leitung 488 und 490a und dann in die Abwasserflasche 490 entfernt. D;r Waschtank 440 wird dann angehoben und mit der gewählten Waschlösung gefüllt.
Ein Vakuum wird an das Waschverteilerstück angelegt, was verursacht, daß die Lösung im Waschtank über alle Kapillarröhrensegmente in der Kapillarenka ssette aufgezogen wird. Nach der programmierten Waschdauer wird der Waschtank auslaufen gelassen und abgesenkt. Die Vakuumkraft über das Waschverteilerstück wird fortgesetzt, wo( urch Luft durch die Kapillarröhrensegmente gezogen wird. Sobald die Kapillarröhrensegme ate getrocknet sind, wird die Vakuumleitung des Waschverteilerstück abgestellt. Die Wasc ilösungs-Zufuhrleitung wird mit der nächsten Waschlösung gespült, und die Schritte des Anhebens und Füllens des Waschtanks, das Ziehens der Waschlösung durch die Kapillarröl irensegmente und des Entleerens des Waschtanks werden für jede gewählte Lösung wiederholt. Die spezifizierte Sequenz kann diese Schritte für jedwede Anzahl von Waschlösungen wiederholen. Nachdem der letzte Waschgang abgeschlossen und der Tank entleert worden ist, w rd Luft durch Anlegen eines Vakuums an das Waschverteilerstück durch die Kapillaren gezogen, wobei die Kapillarröhrensegmente getrocknet werden. Periodisch wird das Spülventil 491 geöffnet, und Luft wird durch die Lüftungsöffnung 493 in die Spülleitungen 4 23a in die Spül-Einlässe 423 eingezogen. Dies zieht einen Luftstoß durch den Waschvertei lerstück-Innenraum 425 und säubert den Waschverteilerstück-Innenraum von jeglicher zurückbleibenden Flüssigkeit, womit sichergestellt wird, daß jegliche innerhalb des Waschvei teilerstücks zurückbleibende Flüssigkeit nicht zurück in die Kapillaren sickern wird. Das Verfc :ilerstück-Vakuum wird dann beendet und das Verteilerstück wird angehoben, wobei c.as Verteilerstück von der Kapillarenkassette entfernt wird. Das Verteilerstück-Vakuum &ngr; ird erneut angelegt, und das Spülventil 491 wird geöffnet und Luft wird durch die Lüftungsöffnung 493 in die Spülleitung 423a in den Spül-Einlaß 423 gezogen. Dies stellt sicher, d<.ß jegliche zurückbleibende Flüssigkeit aus dem Waschverteilerstück-Innenraum entfernt wird. Das Vakuum wird dann
beendet. Die gewaschene und getrocknete Kapillarenkassette ka nn dann durch den Transfer-Roboter zu einem Kapillarenkassetten-Hotel oder an einen ander« &eegr; Standort bewegt werden.
Die Komponenten des Systems könnten zu einem kombinierten I üystem integriert werden, das zulässt, daß mehrere Elemente des kompletten Systems von Fig ur 1 zur gleichen Zeit in Betrieb sind. Zum Beispiel kann die elektronische Steuerungsvorrichtung 123 verwendet werden, um Anweisungen an die Komponenten des integrierten Systems zu senden. Bei der elektronischen Steuerungsvorrichtung kann es sich um einen Computer handeln, der elektronische Signale an verschiedene Systemkomponenten sendet, um einen programmierten Satz an Instruktionen zu bewirken. Elemente des Systems könn en gleichzeitig arbeiten, was die Effizienz des Systems erhöht. Zum Beispiel könnte der aromatische Transfer-Roboter 102 eine Kapillarenkassette aus dem Kapillarenkassetten-Hc tel 106 entnehmen und die Kapillarenkassette in eine Probenplatte auf der Bühne a plaziere :n. Eine Menge an Probe aus der Platte wird durch Kapillarwirkung in die Kapill irröhren eingezogen. Die Kapillarenkassette könnte dann bewegt werden, um auf der Obe: seite einer Nanotiterplatte so plaziert zu werden, daß die kurzen Enden der Kapillarröhrensegriente in den Vertiefungen der Nanotiterplatte sind. Der Roboter 102 könnte dann die kombinierte Nanotiterplatte/Kapillarenkassette zur Austeilung zur Dispenser-Stelle 122 überführen. Die Bewegung des Roboters 102, des Transferkopfs 104 und der an der Stelle 122 lokalisierten Austeilungsvorrichtung werden von der elektronischen Steuerungsvorrichtung 123 gesteuert.
Zur gleichen Zeit, zu der eine Reaktionsmischung zusammengefügt wird, könnte die elektronische Steuerungsvorrichtung auch elektronische Signae an den Thermozykler 116 senden. Die Lüftungstür, das Heizelement und das Thermoelement des Thermozyklers 116 könnten mit der elektronischen Steuerungsvorrichtung 12!> verbunden sein, was der elektronischen Steuerungsvorrichtung 123 erlaubt, ein gewähl :es Temperatur-Zyklierungs-Verfahren durch Regulieren der Temperatur, bei der Luft innerhalb des Thermozyklers zirkuliert, zu bewirken. Diese genaue Überwachung erlaubt, daß das Temperatur-Zyklierungs-Verfahren in einem minimalen Zeitraum erfolgen kann. Sobdd das Wärme-Zyklierungs-Verfahren vollständig ist, könnte die elektronische Steuerungsvorrichtung 123 den Thermozykler elektronisch anweisen, das Thermozykler-Gebläse und c as Heizelement abzuschalten und den Deckel pneumatisch zu öffnen, um das Entnehmen de r Kapillarenkassette aus dem Innenraum des Thermozyklers zu gestatten.
Während der automatische Roboter 102 die Kapillarenkassetter. bewegt, um eine Reaktionsmischung zusammenzufügen, und der Thermozykler in Betrüb ist, könnte die Kassetten-Wascheinrichtung 118 auch eine Kapillarenkassette reinigen. W ederum könnte die elektronische Steuerungsvorrichtung 123 die Kassetten-Wascheinrichtun; \ 118 anweisen, eine Wasch-Sequenz auszuführen, in welcher eine Kapillarenkassette mit e iner gewählten Abfolge von Waschflüssigkeiten gesäubert und mit Luft getrocknet wird.
Die elektronische Steuerungsvorrichtung 123 erlaubt, daß jedes Jilement des Systems mit maximaler Effizienz verwendet werden kann. Ein einzelner Sa &zgr; von Instruktionen an die elektronische Steuerungsvorrichtung 123 könnte das Zusammensetzen der Reaktionsmischung, das Wärmezyklieren der Reaktionsmischung, um die gewünschte Reaktion zu bewirken, das Austeilen der vervollständigten Reaktionsmischung auf ein analytisches Substrat, die Bewegung des analytischen Substrats auf eine Bühr e zur Verarbeitung durch ein analytisches Instrument und das Säubern der gebrauchten Kapilla renkassetten zulassen.
E. Reaktionsherstellungs-Beispiele
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Anwendung der k( nnbinierten Reaktionsherstellungs-Systeme. Die Beispiele sind repräsentativ für die viele &igr; verschiedenen Typen von Reaktionen, welche mit dem offenbarten Gerät oder System bewerkstelligt werden könnten, und werden durch 1) Farbstoff-Primer-DNA-Sequenzierung, 2) Farbstoff-Terminator-DNA-Sequenzierung, 3) PCR-Amplifikation, 4) PCR-Amplifikation, < ;nzymatische Reinigung und DNA-Sequenzierung, und 5) eine allgemeine enzymatische Reakion beschrieben.
Beispiel 1: Farbstoff-Primer-DNA-Sequenzierung, analysiert durch CAE.
Farbstoff-Primer-Sequenzierungs-Reaktionen wurden innerhalb einer Kapillarenkassette, bestehend aus 96 unbeschichteten 2,8 cm langen Quarzglas-Kapill iren, mit einem I.D. von 150 &mgr;&pgr;&igr; und einem O.D. von 360, durchgeführt. Farbstoff-Primer Sequenzierungs-Reaktionen wurden durchgeführt durch Amplifizieren von Matrizen-DNA mit Emissions-spezifischen Primern, entsprechend zu ddT, ddA, ddC und ddG-tern linierten Reaktionen. Die Amplifikation von Matrize wurde in Form von Einzelreaktionen &eegr; jeder Kapillare ausgeführt, und diese wurden für die Nach-Reaktions-Verarbeitung und Analyse in eine gemeinsame Vertiefung vereinigt. Die farbspezifischen Primer basierten auf dem Ml3 -40 FWD- bzw. Vorwärts-Primer (5'-FAM-GTTTTCCCAGT*CACGACG-3') mit 5-Carboxyfluorescein (FAM) als dem Donor-Farbstoff, und einem terminations-spezi fischen Fluor, angeheftet an das angegebene Thymin (T*), als dem Akzeptor-Farbstoff. Di .s Thymin war mit FAM für
ddC-terminierte Reaktionen (C-FAM), 6-Carboxyrhodamin fü.· ddA-Reaktionen (A-REG), N,N,N',N'-Tetramethyl-5-carboxyrhodamin für ddG-Reaktionen O-TMR), und 5-Carboxy-X-Rhodamin für ddT-Reaktionen (T-ROX) markiert. Eine Master-Mischung für 100 Farbstoff-Primer-Sequenzierungsreaktionen wurde hergestellt durch Vereinigen von 65 &mgr;&idiagr; Reaktionspuffer (220 mM TrisHCl, pH 9,5, 33,2 mM MgCb), 100 &mgr;&idiagr; Farbstoff-Primer-Lösung (entweder 1 &mgr;&Mgr; T-ROX, 1 &mgr;&Mgr; G-TMR, 0,5 &mgr;&Mgr; A-REG oder 0,5 &mgr;&Mgr; C-FAM), 100 &mgr;&idiagr; des entsprechenden Desoxy- und Didesoxynukleotid-Mix (0.94 mM dATP, dCTP, dTTP, 7-Deaza-dGTP, mit 3,1 &mgr;&Mgr; Didesoxynukleotid), 10 &mgr;&idiagr; Enzym ^32 U/&mgr;&Igr; ThermoSequenase), und 225 &mgr;&idiagr; gefiltertem entionisierten Wasser. Diese Lösung ^vurde vor dem Mischen mit Matrizen-DNA in eine 96-Vertiefungs-Reagenzienplatte aliquoiert. Das allgemeine Misch-Schema erforderte die Verwendung von zwei Kapillarenkassette a und einer 384-Vertiefungs-"Mixplatte". Die erste Kapillarenkassette (Transferkassette) wurde in eine Lösung von Matrizen-DNA (20 ng/&mgr;&idiagr; M13m/?18) getaucht und dann auf die Oberseite einer 384-Vertiefungs-"Mixplatte" umgedreht, wobei die kurzen Enien der Kapillaren in die Vertiefungen eingeführt waren. Die umgedrehte Kapillarenkasse tte und die Mixplatte wurden in eine Laborbank-Zentrifuge eingebracht. Eine Gegengewicht-] 'latte wurde zum Austarieren des Rotors hinzugefügt, und die Zentrifuge wurde 5 Sekunden lang auf 3000 &khgr; g gebracht. Die Zentrifugation teilte den Inhalt der Transferkassette in einzelne Vertiefungen der 384-Vertiefungs-Platte aus. Nach dem Zentrifugenschritt wurde die Tr insferkassette zur Reinigung zur Kapillarenkassetten-Wascheinrichtung 410 überführt, und de Mixplatte wurde für einen anschließenden Zentrifugationsschritt zur Reagenzienzugabe ver vendet.
Um Reagenzien zuzugegeben, wurde eine zweite Kapillarenka: sette (die Reaktionskassette) in die Vertiefungen, welche Sequenzierungs-Reagenzien enthielt 2n (hergestellt wie im vorhergehenden Absatz beschrieben), eingetaucht und über den Vertiefungen derselben 384-Vertiefungs-Platte umgedreht. Die Reaktionskassette und die Mixpl itte wurden in die Zentrifuge gebracht, 5 Sekunden lang bei 3000 &khgr; g zentrifugiert, und aus dt r Zentrifuge entfernt. An diesem Punkt enthielt jede Vertiefung 500nl Matrizen-DNA und 500nl Sequenzierungs-Reagenzien, um die letztliche Reaktionsmischung zu bilden. Die zweite Kapillarenkassette (verwendet, um Reagenzien zuzugegeben) wurde dann in die 1 xl große Mischung, enthalten in der Mixplatte, getaucht, wobei die Kapillaren der Reaktionskassette zu 500 nl gefüllt wurden.
Die Kapillarenkassette wurde in die Innenkammer eines luftbas ierenden Thermozyklers, wie hierin beschrieben, eingeführt, worin die Enden der Kapillarensi gmente durch Niederdrücken der Enden der Kapillaren gegen deformierbare Membranen verschlossen wurden. Nach 30 Zyklen von 95°C während 2 Sekunden, 55°C während 2 Sekunden und 72°C während 60
Sekunden, wurde der Thermozykler geöffnet, wobei die Enden der Kapillaren aus dem xKontakt mit den deformierbaren Membranen entfernt wurden. ] )ie Kapillarenkassette wurde entnommen und auf die Oberseite einer 384-Vertiefungs-"Mix)latte" aufgesetzt, wobei die kurzen Enden der Kapillaren in die Vertiefungen eingeführt waren. Die Kapillarenkassette und die Mixplatte wurden, mit einer Gegengewicht-Platte, in e ne Zentrifuge gebracht. Die Reaktionsprodukte wurden durch Zentrifugalkraft (-2500 j) in eine Mikrotiterplatte ausgeteilt, welche 40 &mgr;&idiagr; an 80%igem Isopropylalkohol enthidt. Nach einer anfänglichen Reaktion wurden die Kapillaren wie hierin beschrieben gewaschen. Nachdem die vier Farbstoff-Primer-Reaktionen in vier einzelnen Kapillarenkas äetten durchgeführt worden waren, und die Produkte in die Vertiefungen einer Mikrotiterpl; itte vereinigt worden waren, wurden die Proben anschließend bei 3000 &khgr; g 30 Minuten lan &igr; zentrifugiert. Der Alkohol wurde durch vorsichtiges Kopfüber-Umdrehen dekantiert, und die Proben wurden in 5 &mgr;&idiagr; ddH2O für die elektrokinetische Injektion und Analyse durch Kapillaren-Feldanordnungs-Elektrophorese resuspendiert.
Die Analyse der DNA-Sequenzierungs-Fragmente wurde mit MogaBACE, einem 96-Kapillaren-Feldanordnungs-Elektrophorese-Instrument (Molecular Dyn amics, Sunnyvale, CA) unter Verwendung eines Abtastnachweises der Konfokal-Laser-indu: vierten Fluoreszenz durchgeführt. Die Separationen erfolgten in 62 cm langen, 75 &mgr;&pgr;&igr; Innen lurchmesser, 200 &mgr;&tgr;&eegr; Außendurchmesser aufweisenden Quarzglas-Kapillaren mit einer Arbe its-Trennungsstrecke von 40 cm. Der elektroosmotische Fluß wurde durch Grignard-Kopplt ng einer Vinylgruppe an die Kapillaren-Oberfläche und Acrylamid-Polymerisation vermindei t. Die Kapillaren wurden mit einer frischen Lösung aus 3 % linearem Polyacrylamid (LP^) (MegaBACE Long Read Matrix, Amersham Life Sciences, Piscataway, NJ) gefüllt, weIcI e unter Hochdruck durch die Kapillaren aus der Anodenkammer in einzelne Vertiefungen äiner 96-Vertiefungs-Pufferplatte, enthalten in der Kathodenkammer, gepumpt wurde. Jede Vertiefung wurde gefüllt mit 100 &mgr;&idiagr; Tris-TAPS-Laufpuffer (30 mM Tris, 100 mM TAPS, 1 mM EDTA, pH 8,0). Die Matrix wurde 20 Minuten lang äquilibriert, gefolgt von 5 Minuten langer Vor-Elektrophorese bei 180 V/cm. Vor der Proben-Injektion wurden die Kathoden-Kapillarenenden und Elektroden mit ddH2O gespült, um restliches LPA vor der Probe; linjektion zu entfernen.
DNA-Sequenzierungs-Proben wurden elektrokinetisch bei konst inter Spannung aus einer 96-Vertiefungs-Mikrotiterplatte gemäß den angegebenen Bedingungen injiziert; eine bevorzugte Injektions-Bedingung für 500 nl große Proben besteht in 40 Sekunden langer Injektion bei einer angelegten Spannung von 2 kV. Nach der Injektion wurden < lie Kapillarenenden mit Wasser gespült, die Pufferplatte wurde in die Kathodenkammer gebi acht und der Elektrophorese-Lauf wurde begonnen. Die Separationen erfolgten typischerweis; 120 Minuten lang bei 8 kV.
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Eine Computer-gesteuerte Automatisierung der Gerätschaft und Datenerfassung erfolgte unter Anwendung der LabBench-Software (Molecular Dynamics, Sinnyvale, CA). Spezifische Injektions- und Lauf-Bedingungen wurden für die zu analysierem Ie Reaktionsmischung passend eingerichtet.
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Die Reproduzierbarkeit der Submikroliter-Farbstoff-Primer-Z} klus-Sequenzierung ist in der Figur 9 gezeigt. Dieses Histogramm zeigt das prozentualer-Erf )lg-gegen-Lesestrecke-Fenster und zeigt die hohe Reproduzierbarkeit. Über 80 Prozent der sequenzierten DNA-Inserts wiesen eine Leselänge von über 600 Basen auf. Insgesarit ergab diese Platte 55000 Hochqualitäts-Basen bei einer durchschnittlichen Lesestrecke ve >n 605 Basen.
In einem weiteren Analyse-Beispiel wurden in der gleichen Ka pillarenkassette durchgeführte Farbstoff-Primer-Reaktionen durch direkte Injektion in einen &igr; aikro-gefertigten "Chip-basierenden" Analysator analysiert. In diesem Beispiel wurde eine di rch ddT terminierte Farbstoff-Primer-Reaktion durchgeführt, wie beschrieben, und in die Prol len-Vertiefungen eines Mikrochips ausgeteilt, welche 1,5 &mgr;&idiagr; ddH2Ü enthielten. Das Elektrop lerogramm ist in der Figur 10 aufgeführt, welche eine in dem beschriebenen System durchge: ührte Mikrochip-Analyse von Reaktionen beispielhaft verdeutlicht.
Beispiel 3. Farbstoff-Terminator-Zyklus-Sequenzierung mit Alkoholfällungs-Reinigung
Eine Farbstoff-Terminator-Zyklus-Sequenzierung wurde unter Anwendung des Kapillarenkassetten-Systems und Alkoholfällung für die Rein; gung vor der Kapillarenfeld-Elelektrophorese demonstriert. In diesem Beispiel wurde die S ;quenzier-Reaktionsmischung hergestellt durch Mischen von 400 &mgr;&idiagr; Sequenzierungsreagenzi« :n (Dyenamic ET Terminator-Kit, Amersham Pharmacia Biotech, Teil 81600) mit 100 ml ai 5 pmol/&mgr;&idiagr; Ml3 -28 FWD-Primer (5'-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3')· Die Reaktionsmischung wurde in 5 &mgr;&idiagr;-Aliquots in eine 96-Vertiefungs-"Reagenzien"-Platte verteilt. Di s Mischen der Matrizen-DNA und der Sequenzierungsreagenzien wurde in derselben Reihe &ngr; )n Schritten durchgeführt, die in Beispiel 1 beschrieben ist. Eine zweite Kassette wurde verwendet, um 500 nl Sequenzierungs-Reagenzien aus der Reagenzienplatte in die V srtiefungen der Mix-Platte zu überführen. Diese selbe Kassette wurde dann durch Kapillare irkung mit der Mischung aus Matrize/Reagenz gefüllt.
Die Kapillarenkassette wurde in den luftbasierenden Thermozyk er überführt, wo die Kapillaren zwischen den deformierbaren Membranen innerhalb des Thermozyklers verschlossen wurden. Das Thermozyklieren wurde mit 30 Zyklen bei 95°C während 2 s, 55°C während 2 s, und 60°C während 60 Sekunden, bewerkstelligt. Nach dem Thermozyklieren wurde die Kassette aus der Zykler-Kammer entfernt und der Inhalt der Kap illaren durch Zentrifugalkraft (3000 &khgr; g) in eine 96-Vertiefungsplatte ausgeteilt, welche 40 &mgr;&idiagr; <n 80%igem Ethanol enthielt. Die Proben wurden bei 3000 &khgr; g 30 Minuten lang zentrifugiei t. Der Alkohol wurde durch vorsichtiges Kopfüber-Drehen dekantiert, und die Proben wurien in 5 &mgr;&idiagr; ddH^O für die elektrokinetische Injektion und Analyse durch Kapillarenfeld-Elektrophorese resuspendiert. Die Reinigung von Farbstoff-Terminator-Reaktionen durch Alkoholpräzipitation, die Reproduzierbarkeit der Technik und die Anwendung auf "Reale Welt"-Matrizen wird als ein Histogram des prozentualen Erfolges gegen die Lesestrecke in ] rigur 11 wiedergegeben. Die Figur 11 zeigt ausgezeichnete Lesestrecken und Erfolgsrate:&igr; mit M13-Subklon-Inserts, hergestellt aus der Subklon-Bibliothek eines "bakteriellen artifi: fellen Chromosoms" (BAC) aus der Maus.
Beispiel 4. Farbstoff-Terminator-Zyklus-Sequenzierung mit Größenausschluß-Reinigung.
In einem anderen Beispiel wurden Farbstoff-Terminator-Reaktionen in 500-nl-Kapillaren, wie beschrieben in Beispiel 3, durchgeführt, und die Reaktionsprodukte wurden mittels Zentrifugalkraft in 15 &mgr;&idiagr; ddH2O ausgeteilt. Die 15 ml großen Proben wurden auf eine Filterplatte überführt, welche 45 ml hydratisiertes Sephadex G-50 enthielt. E ie Proben wurden 5 Minuten lang bei 910 &khgr; g durch die Sephadex-Matrix zentrifugiert, und das Eluat wurde in einer sauberen 96-Vertiefungs-Injektionsplatte aufgefangen. Die Prosen wurden elektrokinetisch ohne weitere Dehydratation oder Verarbeitung injiziert. Für 15 Proben wurde eine durchschnittliche Lesestrecke von 650 Basen erhalten, was die Kompatibilität von Submikroliter-Farbstoff-Terminator-Sequenzierung mit Alkohol- und Größenausschluß-Reinigung zeigt.
Beispiel 5. PCR-Amplifikation von Plasmid-Insert-DNA
Die vorliegende Technik verwendet das offenbarte System für die Polymerasekettenreaktion(PCR)-Amplifikation von Insert-DNA (z. B. Subklon-Inserts aus einer DNA-Bibliothek). Die PCR-Reaktionsmischung wurde durch Mischen von 5 &mgr;&idiagr; 1) &mgr;&Mgr; Ml3 -40 FWD-Primer (5' GTT TTC CCA GTC ACG AC 3') und 5 &mgr;&idiagr; 10 &mgr;&Mgr; M13 -40 REV-Primer (5' GGA TAA CAA TTT CAC ACA GG 3') mit 25 &mgr;&idiagr; 1Ox GeneAmp-Puffer, 1 5 &mgr;&idiagr; an 25 mM MgCl2, 5 &mgr;&idiagr;
AmpliTaq Gold, 2,5 &mgr;&idiagr; 1 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA) ur d 67,5 &mgr;&idiagr; ddt^O hergestellt. Diese Mischung wurde in gleiche Volumina auf sechzehn 0,20 ir 1 große Röhrchen aliquotiert.
Die Reaktion wurde durch Mischen von Matrizen-DNA mit dem PCR-Cocktail unter Verwendung der beschriebenen Zwei-Kapillarenkassetten-und-lV ixplatte-Methode eingeleitet. Die Transfer-Kassette wurde in die Glycerin-Stammlösunge &agr; einer Subklon-Bibliothek getaucht und mittels Zentrifugalkraft in die Vertiefungen einer 384-Vertiefungs-Platte ausgeteilt. Eine zweite "Reaktions"-Kassette wurde verwendd, um 500 nl PCR-Cocktail mittels Zentrifugalkraft in die gleichen Vertiefungen zu überfü iren. Die Kapillaren wurden anschließend in die vereinigte Mischung von Matrizen-DNA urd PCR-Reagenzien getaucht, wobei sich die Kapillaren durch Kapillarwirkung füllten. Die Amplifikation erfolgte durch Einbringen der Kapillaren in die Zykler-Kammer und T lermozyklieren mit einem Aktivationsschritt von 95°C während 12 Minuten, gefolgt von 30 Zyklen von 64°C für 4,5 Minuten und 950C für 5 Sekunden.
Die PCR-Produkte wurden durch Agarosegelelektrophorese analysiert und mit den gleichen Subklonen verglichen, amplifiziert durch Reaktion in großem V blumen (25 &mgr;&idiagr;), durchgeführt in 0,20 ml großen Röhrchen. Nanomaßstab-Kapillarenkassetten-Proben wurden mittels Zentrifugalkraft in 4,5 &mgr;&idiagr; ddH2O ausgeteilt. Äquivalente V olumen-Aliquots von VoIl-Volumen-Reaktionen wurden manuell unter Verwendung eires Niedervolumen-Pipettors überführt. Zu jeder 5 &mgr;&Igr;-Probe wurde 1 &mgr;&idiagr; 6x-Auftragsfarbstc ff zugegeben und die Probe wurde quantitativ in die Vertiefungen eines Agarosegels überführt. Eine Agarosegelelektrophorese wurde unter Verwendung eines 0,7%igen Agaiosegels mit 1 &khgr; Tris-Acetat-EDTA-Puffer, pH 8,0, durchgeführt. Die Proben wurden 40 Minuten lang bei 15 V/cm getrennt, mit Sybr Green II (Molecular Probes, Eugene, OR) ang jfärbt und unter Verwendung eines zweidimensionalen Fluoreszenz-Scanners (Fluorlma >er, Molecular Dynamics, Sunnyvale,CA) abgebildet. Das gescannte Gel-Bild ist in den F guren 12A und 12B gezeigt. Man kann erkennen, daß die bei Voll-Volumen hergestellten Proben (Figur 12 A) und jene bei 500 nl Amplifikation (Figur 12 B) dieselbe Molekulargewichts-Verteilung aufweisen. Dieses Beispiel zeigt, daß eine Nanomaßstab-Probenherstellung durch herkömmliche Analyse im Makromaßstab, wie Agarosegelelektrophorese, analysiert werden kann.
Ein bevorzugter Weg zur Herstellung von Zyklus-Sequenzierungsproben unter Anwendung der vorliegenden Erfindung besteht darin, Nanomaßstab-PCl L-Proben in der Kapillarenkassette und verwandten Gerätschaften vorzubereiten, Exol/i 1 AP-Reaktionen im Makro-
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Maßstab durchzuführen und dann die Zyklus-Sequenzierung in der Kapillarenkassette und verwandten Gerätschaften auszuführen. Die Nanomaßstab-PCR-i vlatrizen-Herstellung für eine DNA-Sequenzierung wurde durch Ausführung der PCR-A nplifikation aus Glycerin-Stammkultur-Subklonen gezeigt. Glycerin-Stammkultur-Subklone wurde per PCR amplifiziert, wie in Beispiel 5 beschrieben. Nach der PCR-Ampl fikation wurde der Inhalt der Kapillaren durch Zentrifugation in die Vertiefungen einer 96-Vertiefungsplatte ausgeteilt, welche 4,5 &mgr;&idiagr; an 7,5 mU Krabben-Alkalische-Phosphatase (SAP &igr; und 37,5 mU Exonuklease I (Exol) enthielten. Die PCR-Produkte und die Exol/SAP-Lösung; wurden 5 Minuten lang bei 370C inkubieren gelassen, um die nicht-eingebauten Primer zu verdauen und die nichteingebauten Nukleotide zu dephosphorylieren. Nach einer anfänglichen Inkubation wurden die Enzyme durch 15 Minuten langes Erwärmen der Lösung auf', '20C inaktiviert.
Die Exol/SAP-behandelten PCR-Produkte wurden auf eine fr sehe 384-Vertiefungs-Mix-Platte aliquotiert, und zwar mit einer Transfer-Kapillarenkass ;tte und zentrifugalem Austeilen. Ein gleiches Aliquot an Farbstoff-Terminator-Sequenzicr-Reagenzien wurde zu den 500 nl gereinigten PCR-Produkten zugegeben, wobei eine andere Kapillarenkassette und zentrifugale Austeilung angewandt wurden. Die Kapillaren wu: den dann durch Eintauchen der Kapillarenkassette in die &Igr;-&mgr;&Igr;-Reaktionsmischung gefüllt. Die Matrize wurde gemäß Beispiel 3 amplifiziert, in 40 &mgr;&idiagr; 80%igen Ethanol ausgeteilt un i wie beschrieben gereinigt.
Die Analyse der Sequenzier-Reaktionen wurde mittels MegaB \CE unter Anwendung von elektrokinetischer Injektion durchgeführt. Portionen vo:i sechs Basen-benannten Sequenzierungs-Elektropherogrammen aus Subklon-Matr zen, hergestellt durch Nanomaßstab-PCR-Amplifikation aus Glycerin-Stammlösungei und durch Nanomaßstab-Zyklus-Sequenzierung, sind in der Figur 13 gezeigt. Durch Ausführen von PCR in einer Kapillarenkassette und anschließendes Überführen der Reaktionsmischung auf eine Mikroplatte erlaubt das vorliegende System einen vereinfachten Übergang von Reaktionsvolumen im Nanomaßstab (weniger als 1 &mgr;&idiagr; Volumei &igr;) zu Reaktionsvolumen, die größer als Nanomaßstab sind. Das vorliegende System gestattet auch einen vereinfachten Übergang von Reaktionsvolumen im Makro-Maßstab (mehr als 1 &mgr;&idiagr; Volumen) zu solchen im Nanomaßstab, wie gezeigt durch Anwendung der Exol/S^ P-Reaktionen zur Zyklus-Sequenzierung in der Kapillarenkassette.
Beispiel 7. Isothermaler Enzymassay, durchgeführt in einer Submikroliter-Kapillarenkassette
Die Verwendung des beschriebenen Systems zur Durchführung < .llgemeiner Enzymreaktionen wurde mit einem fluorogenen Assay von ß-Galaktosidase demo istriert. Die von ß-Galaktosidase (ß-Gal) katalysierte Hydrolyse von Resorufin-ß-D-ß-Galak:osid [ase (ß-Gal) katalysierte Hydrolyse von Resorufin-ß-D-Galaktosidase] (RBG) wurde innerhalb der Kapillaren einer 96-Vertiefungs-Kassette durchgeführt, wobei ß-Gal das RBG zum Fluorophor Resorufin hydrolysiert.
Eine Stammlösung aus 350 mikromolarem RBG wurde in 5 ml 100 mM Tris-HCl, 20 mM KCl, und 2 mM MgCl2 zu 5 mg RGB, heftiges Vortexmisch« :n und Filtrieren der Lösung durch einen 0,40 Mikrometer-Filter hergestellt. Eine Ein-Halb-Verdünnungskurve von RGB wurde aus der Stammlösung hergestellt. Zu je 10 Mikolitern RG B-Lösung, hergestellt in 0,20 ml großen Röhrchen, wurden 200 &mgr;g ß-Gal zugegeben, und nacl kurzem Mischen wurde dies durch Kapillarwirkung in eine Kapillarenkassette eingefüllt. Die Kassette wurde in einen Luft-Zykler gebracht, und nach 2 Minuten bei 37°C wurde die Kapillarenkassette entfernt und der Inhalt aus den Kapillaren heraus in eine 3 84-Vertiefung 3-Abtastplatte, enthaltend 5 Mikroliter 1 M Natriumbicarbonat, zentrifugiert. Die Vertiefungen der Abtastplatte wurden anschließend mit 50 Mikrolitern ddH2O gefüllt, und die Platte wurde mittels einer Fluoreszenz-Platten-Leseeinrichtung (Typhoon, Molecular Dynamics) abgelesen. Ein Kontrollaliquot aus den in den 0,20 ml großen Röhrchen durchgeführten Enzymreaktionen wurde auf die Abtastplatte zugesetzt.
Der Festphasen-Einfang des ß-Gal wurde ebenfalls mit diesem System aufgezeigt, indem lediglich ein Füllen der Kassette mit einer 20 &mgr;g/ml-Lösung voi &igr; ß-Gal erfolgte, was dem ß-GaI erlaubt, an die Kapillarenoberfläche zu binden, gefolgt von I Entfernung der überschüßigen Flüssigkeit und Trocknen der Kassette unter Anwendung des beschriebenen Kassetten-Waschverteilerstücks. Nach der ß-Gal-Bindung wurden die Ilapillaren mit RBG-Lösung durch Kapillarwirkung gefüllt. Die Reaktion wurde 2 Minuten lang bei 37°C durchgeführt und durch Austeilen in 1 M Natriumbicarbonat und Verdünnen &eegr; lit Wasser in der Abtastplatte analysiert.
Sobald alle drei Sätze von Reaktionen (volles Volumen, Kapill arenkassette und Kapillarenkassette mit Festphasen-Einfang) auf die Abtastplatte gegeben &ngr; worden sind, wurde die Platte durch eine Fluoreszenz-Platten-Leseeinrichtung (Typhoon, Mol· :cular Dynamics, Sunnyvale, CA) abgelesen. Die Ergebnisse der Standardkurve, durchgefühi t in 0,2 ml großen Röhrchen (Röhrchen-Reaktion), sowie einer Reaktion, durchgeführt in der <Capillarenkassette ohne Festphasen-Einfang (Kapillaren-Reaktion) und in der Kapillarenkas; lette mit Festphasen-Einfang (Kapillare mit Bindungsreaktion), sind in der Figur 14 zusamm sngefaßt. Die Figur 14 zeigt
das erwartete Signal gegen die Substratkonzentration für dh Röhrchen-Reaktionen und Signal-Datenpunkte für die vorgemischte Enzymreaktion, duichgeführt in der Kapillarenkassette, und für den ß-Galaktosidase-Assay mit Kapillarenbindi ng.
Dieses Beispiel dient zur Veranschaulichung der Kompatibilitj t des beschriebenen Systems mit der Durchführung einer Reihe von allgemeinen Enzym- <\ktivitäts- und -Inhibitions-Assays. Darüber hinaus zeigt es, daß Festphasen-Einfang auf Proteine und Enzyme sowie DNA angewandt werden kann. Schließlich zeigt es, daß das beschriebene System auf isothermische Reaktionen angewandt werden kann.
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Claims (43)
1. System zur Durchführung von Reaktionen in kleinem Maßstab, wobei das System umfaßt:
eine Kapillarenkassette mit einem Substrat und einer Mehrzahl von Kapillaren, welche durch das Substrat reichen, wobei jede der Kapillaren erste und zweite offene Enden auf entgegengesetzten Seiten des Substrats aufweist;
ein Paar von Membranen, so orientiert und räumlich getrennt daß sie zeitweise die entgegengesetzten Enden der Kapillaren verschließen können;
einen Thermozykler mit einer Innenkammer von ausreichender Kapazität, um die Kapillarenkassette und die Membranen zu halten; und
eine automatische Transfervorrichtung, dergestalt positioniert, um die Kapillarenkassette zu kontaktieren und an eine Stelle zu bewegen, an der die Enden der Kapillare durch das Paar von Membranen verschlossen werden können und die Kapillarenkassette mit durch die Membranen verschlossenen Enden innerhalb der Innenkammer des Thermozyklers untergebracht werden kann.
eine Kapillarenkassette mit einem Substrat und einer Mehrzahl von Kapillaren, welche durch das Substrat reichen, wobei jede der Kapillaren erste und zweite offene Enden auf entgegengesetzten Seiten des Substrats aufweist;
ein Paar von Membranen, so orientiert und räumlich getrennt daß sie zeitweise die entgegengesetzten Enden der Kapillaren verschließen können;
einen Thermozykler mit einer Innenkammer von ausreichender Kapazität, um die Kapillarenkassette und die Membranen zu halten; und
eine automatische Transfervorrichtung, dergestalt positioniert, um die Kapillarenkassette zu kontaktieren und an eine Stelle zu bewegen, an der die Enden der Kapillare durch das Paar von Membranen verschlossen werden können und die Kapillarenkassette mit durch die Membranen verschlossenen Enden innerhalb der Innenkammer des Thermozyklers untergebracht werden kann.
2. System von Anspruch 1, ferner umfassend einen Dispenser, der ein Fluid aus Kapillaren der Kapillarenkassette auf eine Stelle auf einem Empfänger-Substrat abgibt, wobei die automatische Transfervorrichtung die Kapillarenkassette in Bezug auf die Dispenser- Vorrichtung und das Empfänger-Substrat so bewegen kann, daß das innerhalb der Kapillaren der Kapillarenkassette enthaltene Fluid auf das Substrat ausgeteilt wird.
3. System von Anspruch 2, wobei die Dispenser-Vorrichtung eine Zentrifuge ist.
4. System von Anspruch 2, wobei der Dispenser ein Luft-Verdrängungs-Dispenser ist.
5. System von Anspruch 1, wobei die Kapillaren ein Innenvolumen von 10-1000 nl aufweisen.
6. System von Anspruch 1, ferner umfassend eine analytische Bühne, so positioniert, daß die automatische Transfervorrichtung die Kapillarenkassette in Bezug auf den Dispenser so transferieren kann, daß der Inhalt innerhalb der Kapillarenkassette auf ein auf der Bühne lokalisiertes Substrat ausgeteilt werden kann.
7. System von Anspruch 6, wobei das Substrat ein Probenherstellungs-Mikrochip ist und die automatische Transfervorrichtung angeordnet ist, um die Kapillarenkassette direkt in eine Mehrzahl von Probenherstellungs-Mikrochip-Probenaufnahme-Vertiefungen auszuteilen.
8. System von Anspruch 2, wobei das Substrat eine Mehrfachvertiefungs-Platte ist.
9. System von Anspruch 6, wobei das Substrat eine Feldanordnung von Kapillaren ist und die automatische Transfervorrichtung angeordnet ist, um die Kapillarenkassette direkt in die Kapillaren auszuteilen.
10. System von Anspruch 1, ferner einschließend eine Kapillarenkassetten-Waschstation, wobei die automatische Transfervorrichtung eine Kapillarenkassette in Kontakt zu der Waschstation führen kann, wobei die Waschstation eine Waschlösung durch die Kapillaren der Kapillarenkassette lenkt, wenn die Kapillarenkassette innerhalb der Waschstation eingebracht wird.
11. System von Anspruch 10, wobei die Waschstation einen Waschlösungstank und ein oberes Waschverteilerstück aufweist, das in eine Position oberhalb des Waschlösungstanks bewegt werden kann, wobei ein Waschfluid in den Waschlösungstank eingeführt und durch Absaugen in das Waschverteilerstück gezogen werden kann, wenn die Kapillarenkassette in die Waschstation eingeführt wird.
12. System von Anspruch 11, wobei die Waschstation ferner eine Mehrzahl von Waschfluidflaschen einschließt, wobei jede ein Waschfluid und ein Selektorventil enthält, welches die Auswahl eines Waschfluids aus einer der Flaschen gestattet, um den Waschlösungstank zu füllen.
13. System von Anspruch 1, ferner umfassend eine elektronische Steuerung, welche programmiert werden kann, um elektronische Anweisungen an Komponenten des Systems zu senden.
14. System von Anspruch 1, wobei das Paar von Membranen an entgegengesetzten Seiten der Innenkammer der Thermozyklervorrichtung angebracht ist.
15. System von Anspruch 1, ferner umfassend eine Mehrzahl von Mikroplatten-Haltemagazinen, welche Mikroplatten an eine Stelle geben, wo die automatische Transfervorrichtung die Mikroplatten kontaktieren und bewegen kann.
16. System von Anspruch 1, wobei die Membranen deformierbare Membranen sind, gehalten von einer Vorspannfeder, um die Enden der Kapillaren zeitweilig zu verschließen.
17. System zur Reaktionsherstellung im Nanomaßstab, wobei das System umfasst:
eine Kapillarenkassette, einschließlich eines Substrats und einer Mehrzahl von Kapillaren, welche durch das Substrat reichen, wobei jede Kapillaren ein Innenvolumen von zwischen 10 nl und etwa 1 µl aufweist, wobei jede der Kapillaren ein erstes und zweites offenes Ende auf entgegengesetzten Seiten des Substrats aufweist, wobei die Länge der Kapillare, welche durch das Substrat reicht, auf einer Seite des Substrats angepasst ist, um kürzer zu sein als die Tiefe einer Mikroplattenvertiefung;
eine Mehrfachvertiefungs-Platte mit einer Mehrzahl von Vertiefungen, in welche die Kapillaren der Kapillarenkassette eingeführt werden können;
einen Dispenser, der innerhalb der Kapillaren der Kapillarenl assette enthaltenes Fluid in Vertiefungen der Mehrfachvertiefungs-Platte abgibt, wenn die Kapillare zum Dispenser transportiert wird;
einen automatischen Transfer-Roboter mit einem Transfer-Kopf, um Gegenstände zu tragen, gewählt aus der Gruppe, umfassend Kapillarenkassetten, Mehrfachvertiefungs- Platten und Mehrfachvertiefungs-Platten, bei denen Kapillaren einer Kapillarenkassette in die Vertiefungen der Mehrfachvertiefungs-Platten eingeführt sind;
ein Paar von entgegengesetzten Membranoberflächen, wobei die Enden der Kapillaren zeitweilig durch Pressen der Membranen gegen die Enden verschlossen werden können; und
einen Thermozykler mit einer Innenkammer von ausreichender Kapazität, um die Kapillarenkassette und die Membranen zu halten, wenn die Membranen die Enden der Kapillaren der Kapillarenkassette verschließen, wobei der Thermozykler so angeordnet ist, daß der automatisierte Transfer-Roboter eine Kapillarenk, issette in eine Innenkammer innerhalb des Thermozyklers bringen kann, wobei die Membranen das Ende der Kapillaren der Kapillarenkassette innerhalb der Innenkammer verschließen können.
eine Kapillarenkassette, einschließlich eines Substrats und einer Mehrzahl von Kapillaren, welche durch das Substrat reichen, wobei jede Kapillaren ein Innenvolumen von zwischen 10 nl und etwa 1 µl aufweist, wobei jede der Kapillaren ein erstes und zweites offenes Ende auf entgegengesetzten Seiten des Substrats aufweist, wobei die Länge der Kapillare, welche durch das Substrat reicht, auf einer Seite des Substrats angepasst ist, um kürzer zu sein als die Tiefe einer Mikroplattenvertiefung;
eine Mehrfachvertiefungs-Platte mit einer Mehrzahl von Vertiefungen, in welche die Kapillaren der Kapillarenkassette eingeführt werden können;
einen Dispenser, der innerhalb der Kapillaren der Kapillarenl assette enthaltenes Fluid in Vertiefungen der Mehrfachvertiefungs-Platte abgibt, wenn die Kapillare zum Dispenser transportiert wird;
einen automatischen Transfer-Roboter mit einem Transfer-Kopf, um Gegenstände zu tragen, gewählt aus der Gruppe, umfassend Kapillarenkassetten, Mehrfachvertiefungs- Platten und Mehrfachvertiefungs-Platten, bei denen Kapillaren einer Kapillarenkassette in die Vertiefungen der Mehrfachvertiefungs-Platten eingeführt sind;
ein Paar von entgegengesetzten Membranoberflächen, wobei die Enden der Kapillaren zeitweilig durch Pressen der Membranen gegen die Enden verschlossen werden können; und
einen Thermozykler mit einer Innenkammer von ausreichender Kapazität, um die Kapillarenkassette und die Membranen zu halten, wenn die Membranen die Enden der Kapillaren der Kapillarenkassette verschließen, wobei der Thermozykler so angeordnet ist, daß der automatisierte Transfer-Roboter eine Kapillarenk, issette in eine Innenkammer innerhalb des Thermozyklers bringen kann, wobei die Membranen das Ende der Kapillaren der Kapillarenkassette innerhalb der Innenkammer verschließen können.
18. System von Anspruch 17, wobei der Dispenser eine elektrokinetische Injektionseinrichtung ist.
19. System von Anspruch 17, wobei der Dispenser eine Zentrifuge ist.
20. System von Anspruch 17, wobei der Dispenser ein Luft-Verdrängungs-Kopf ist.
21. System von Anspruch 17, wobei der Dispenser angeordnet ist, um Flüssigkeit aus den Kapillaren auf ein analytisches Substrat abzugeben, das auf einer analytischen Bühne lokalisiert ist.
22. System von Anspruch 17, ferner umfassend eine Kapillarenkassetten-Waschstation, wobei die automatische Transfervorrichtung eine Kapillarenkassette in Kontakt mit der Waschstation bringen kann, wobei die Waschstation eine Waschlösung durch die Innenräume der Kapillaren der Kapillarenkassette lenkt, wenn die Kapillarenkassette innerhalb der Waschstation plaziert wird.
23. System von Anspruch 22, wobei die Waschstation einen unteren Waschlösungstank und ein oberes Waschverteilerstück einschließt, wobei ein Waschfluid in den Waschlösungstank eingeführt und durch Absaugen in das Waschverteilerstück gezogen werden kann, wenn die Kapillarenkassette in die Waschstation eingeführt wird.
24. System von Anspruch 22, wobei die Waschstation ferner eine Mehrzahl von Waschfluidflaschen und ein Selektorventil in Fluidkommunikation mit den Flaschen zur Auswahl eines Waschfluids, um den Waschlösungstank zu füllen, einschließt.
25. System von Anspruch 17, ferner umfassend eine elektronische Steuerung, wobei die Steuerung elektronische Anweisungen sendet, um einen programmierten Betrieb des Systems zu bewirken.
26. System zur Herstellung von Reaktionen im Nanomaßstab, wobei das System umfasst:
ein Substrat, aufweisend integral assoziierte längliche Submikrolitervolumen-Reaktionsbehälter mit zwei entgegengesetzten Enden;
eine Reaktionsmischung, enthalten innerhalb der Reaktionsbehälter;
ein Paar von Membranen, angeordnet, um die entgegengesetzten Enden der Reaktionsbehälter zeitweilig zu verschließen;
einen Thermozykler mit einer Innenkammer von ausreichender Abmessung, um das Substrat mit assoziierten länglichen Reaktionskammern, verschlossen durch die Membranen, aufzunehmen.
ein Substrat, aufweisend integral assoziierte längliche Submikrolitervolumen-Reaktionsbehälter mit zwei entgegengesetzten Enden;
eine Reaktionsmischung, enthalten innerhalb der Reaktionsbehälter;
ein Paar von Membranen, angeordnet, um die entgegengesetzten Enden der Reaktionsbehälter zeitweilig zu verschließen;
einen Thermozykler mit einer Innenkammer von ausreichender Abmessung, um das Substrat mit assoziierten länglichen Reaktionskammern, verschlossen durch die Membranen, aufzunehmen.
27. System von Anspruch 26, wobei das Substrat Kapillaren aufweist, welche durch das Substrat reichen, wobei die Kapillaren als die Reaktionskammern fungieren.
28. System von Anspruch 26, wobei die länglichen Reaktionsbehälter durch die Dicke des Substrats hindurchtreten.
29. System von Anspruch 26, wobei der Thermozykler erwärmte Luft durch einen kontinuierlichen Kreislauf zirkuliert, wobei die Innenkammer Teil des kontinuierlichen Kreislaufs ist.
30. System von Anspruch 29, wobei der kontinuierliche Kreislaufentlüftet werden kann durch Blockieren einer Sektion des internen Durchlaufwegs und Entlüften der erwärmten Luft, wodurch eine rasche Temperatureinstellung der erwärmten Luft zugelassen wird.
31. System von Anspruch 30, wobei die Innenkammer die deformierbaren Membranen enthält, die auf entgegengesetzten Oberflächen der Innenkammer montiert sind.
32. System von Anspruch 31, wobei mindestens eine der Membranen innerhalb der Innenkammer mit einer Vorspannfeder montiert ist, welche eine Verschlußkraft der Membranen gegen die koplanaren Enden bereitstellt.
33. System von Anspruch 26, ferner umfassend eine Einrichtung zum Austeilen der Reaktionsbehälter.
34. System von Anspruch 26, ferner umfassend eine Einrichtung zum Vereinigen von Reagenzien, um die Reaktionsmischung zu bilden, und eine Einrichtung zum Befüllen der Reaktionsbehälter mit der Reaktionsmischung.
35. System von Anspruch 26, ferner umfassend eine Waschstation, welche die Reaktionsbehälter halten und waschen kann.
36. Thermozykler-Vorrichtung zum Aussetzen von Reaktionsmischungen an Temperaturzyklen, wobei die Vorrichtung umfasst:
ein Gehäuse, einschließend einen kontinuierlichen Innenraum-Kreislaufweg, wobei das Gehäuse eine Sektion aufweist, welche zeitweilig geöffnet werden kann, um Zugang zum Inneren des Gehäuses zu gewähren;
ein Gebläse, angeordnet innerhalb des Kreislaufweges, um den Luftstrom in eine Richtung im Innen-Kreislaufweg zu lenken;
ein Heizelement, angeordnet innerhalb des Innen-Kreislaufweges, so daß die innerhalb des Durchlaufweges umlaufende Luft durch das Heizelement läuft;
ein Proben-Haltekompartiment mit zwei Membranen, positioniert in entgegengesetzter Orientierung innerhalb des Proben-Haltekompartiments, wobei die Membranen gegen entgegengesetzte Enden der in das Proben-Haltekompartiment eingefügten Behälter gespannt werden können;
ein Gehäuse-Luftabzug, welcher geöffnet werden kann, um erwärmte umlaufende Luft rasch auszustoßen; und
ein Gehäuse-Lufteinlaß zum Einziehen von Luft in den Innenraum-Kreislaufweg, wenn der Abzug erwärmte umlaufende Luft ausstößt.
ein Gehäuse, einschließend einen kontinuierlichen Innenraum-Kreislaufweg, wobei das Gehäuse eine Sektion aufweist, welche zeitweilig geöffnet werden kann, um Zugang zum Inneren des Gehäuses zu gewähren;
ein Gebläse, angeordnet innerhalb des Kreislaufweges, um den Luftstrom in eine Richtung im Innen-Kreislaufweg zu lenken;
ein Heizelement, angeordnet innerhalb des Innen-Kreislaufweges, so daß die innerhalb des Durchlaufweges umlaufende Luft durch das Heizelement läuft;
ein Proben-Haltekompartiment mit zwei Membranen, positioniert in entgegengesetzter Orientierung innerhalb des Proben-Haltekompartiments, wobei die Membranen gegen entgegengesetzte Enden der in das Proben-Haltekompartiment eingefügten Behälter gespannt werden können;
ein Gehäuse-Luftabzug, welcher geöffnet werden kann, um erwärmte umlaufende Luft rasch auszustoßen; und
ein Gehäuse-Lufteinlaß zum Einziehen von Luft in den Innenraum-Kreislaufweg, wenn der Abzug erwärmte umlaufende Luft ausstößt.
37. Thermozykler-Vorrichtung von Anspruch 36, ferner umfassend eine Temperatur-Überwachungsvorrichtung, angeordnet im inneren Durchlaufweg in der Nähe eines Proben- Haltekompartiments.
38. Thermozykler-Vorrichtung von Anspruch 36, ferner umfassend mindestens einen Luft- Diffusor, angeordnet im inneren Durchlaufweg zwischen den. Gebläse und dem Proben- Haltekompartiment, wobei der Diffusor eine gleichmäßige Temperatur in der im inneren Durchlaufweg umlaufenden Luft fördert.
39. Thermozykler-Vorrichtung von Anspruch 36, wobei mindestens eine der deformierbaren Membranen innerhalb des Proben-Haltekompartiments mit Federn vorgespannt ist.
40. Thermozykler-Vorrichtung von Anspruch 36, ferner umfassend eine an den Oberflächen des inneren Kreislauf-Durchlaufwegs befestigte Isolierung.
41. Thermozykler-Vorrichtung von Anspruch 36, ferner umfassend eine elektronische Steuerung, welche Anweisungen an Komponenten der Thermozykler-Vorrichtung sendet.
42. Thermozykler-Vorrichtung von Anspruch 36, wobei der Abzug geöffnet wird durch Bewegen einer Sektion des Gehäuses, gelegen zwischen dem Proben-Haltekompartiment und dem Lufteinlaß, so daß der innere Durchlaufweg mindestens teilweise verengt und eine Öffnung des Gehäuses nach Außen erzeugt wird.
43. Thermozykler-Vorrichtung von Anspruch 36, wobei das Gehäuse eine verschließbare Öffnung aufweist, um Zugang zum Proben-Haltekompartiment zu gewähren.
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