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JP2003125791A - 酵母プロモーター - Google Patents

酵母プロモーター

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Publication number
JP2003125791A
JP2003125791A JP2002236592A JP2002236592A JP2003125791A JP 2003125791 A JP2003125791 A JP 2003125791A JP 2002236592 A JP2002236592 A JP 2002236592A JP 2002236592 A JP2002236592 A JP 2002236592A JP 2003125791 A JP2003125791 A JP 2003125791A
Authority
JP
Japan
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thr
ser
leu
val
gly
Prior art date
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Pending
Application number
JP2002236592A
Other languages
English (en)
Inventor
Andrew Robert Goodey
ロバート グッディ アンドリュー
Darrell Sleep
スリープ ダレル
Dina Vakeria
バケリア ディナ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Albumedix Ltd
Original Assignee
Delta Biotechnology Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Delta Biotechnology Ltd filed Critical Delta Biotechnology Ltd
Publication of JP2003125791A publication Critical patent/JP2003125791A/ja
Pending legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2428—Glucan 1,4-alpha-glucosidase (3.2.1.3), i.e. glucoamylase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】酵母プロモーター、即ち、例えばサッカロミセ
スセレビッシュ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒ
ｅｖｉｃｅａｅ）などの酵母のコード配列の発現を指令
するヌクレオチド配列に関するものである。既に酵母か
ら数種のこのようなプロモーターが単離されており、酵
母の異種コード配列の発現を指令するのに有用である。 【解決手段】特定のＤＮＡプロモーター配列又はその変
種又は機能性部分を、野生株のサッカロミセスセレビッ
シェ中で通常該配列に隣接するであろうコード配列から
分離された形で与える。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は酵母プロモーター、
即ち酵母（例えばサッカロミセスセレビッシェ（Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｃｅａｅ））のコ
ード配列の発現を指令するヌクレオチド配列に関する。
【０００２】
【従来の技術】既に酵母から数種のこのようなプロモー
ターが単離されており、酵母の異種コード配列（ｃｏｄ
ｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の発現を指令するのに有用
であることが証明されている。本明細書で「異種」と
は、該コード配列はプロモーターの存在する野生型微生
物の中のプロモーターにより発現が指令されるものでは
ないという意味である；普通該コード配列は野生型微生
物には全く存在しないものである。
【０００３】
【課題を解決するための手段】われわれはこうして使用
できる酵母プロモーター及びその断片を見いだし、それ
らは予測できなかった利点を有していた。本発明は、Ｄ
ＮＡプロモーター配列ＳＥＱ１又はその変種又は機能性
部分を、野生型のサッカロミセスセレビッシェ中で通常
該配列に隣接するであろうコード配列から分離された形
で与える。
【０００４】
【発明の実施の形態】異種蛋白を発現させるためにプロ
モーターを使用すると融合蛋白が産生されるため普通は
好ましくはないが、本発明のプロモーターは、通常隣接
するコード配列の一部分を伴っていてもよい。
【０００５】該配列の「変種又は機能性部分」とは、そ
れぞれヌクレオチド配列が少し変化したもの及び／又は
長さが短いものであるが、比較されている２つの発現系
のパラメーター（例えば３’制御領域）は同じで、前記
の配列の下流に位置するコード配列の転写を促進する該
配列の能力の少なくとも１０％（好ましくは８０％、９
０％、９５％又は９９％）を保持しているものである。
該配列の一部の場合、このような制御活性はその部分の
み（即ち他の５’制御配列はなし）について、又はその
部分の５’又は３’に位置する別の５’制御配列ととも
に測定される。好ましくは「変種」は該配列と８０％、
９０％、９５％又は９９％の相同性を有する。
【０００６】好ましくは、配列の「機能性部分」は該配
列の最も相同性のある領域と、８０％、９０％、９５
％、９９％又は１００％の相同性を有する。好ましくは
この部分は少なくとも１００ヌクレオチドの長さであ
り、さらに好ましくは少なくとも２００、３００、４０
０、５００、１０００又は１５００ヌクレオチドの長さ
である。「機能性部分」は、複合炭素源（例えばブドウ
糖又はショ糖）の存在下では制御され、このような炭素
源が存在しない場合は、グリセロール又はエタノールの
存在の有無にかかわらず脱抑制されるような該配列の能
力を保持していることが適当である。
【０００７】任意の「機能性部分」の３’未満はＳＥＱ
１の３’未満に対応し、該部分は３’から５’方向に連
続的に約１．３５又は１．４０ｋ塩基対まで延長してい
ることが適当であり、ここから先は（本来の環境中で
は）Ａｌａ−ｔＲＮＡGCUの遺伝子のようである。天然
の形ではＳＥＱ１の３’未満はＡＴＧ開始コドンのすぐ
前にある。
【０００８】機能性部分はＳＥＱ３（即ちＡＴＧ開始コ
ドンのすぐ上流の３７９塩基対領域）からなり、随時さ
らに配列の５’部分を含むことが有利である。
【０００９】前述したＳＥＱ１、その変種、その一部分
そして配列を変更したものは、以後本発明のプロモータ
ーと称する。
【００１０】このプロモーターはサッカロミセスセレビ
ッシェのグリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナ
ーゼのプロモーターであるようである（ＧｕＴ２、ジー
・エフ・スプレーグとアール・クロナン（Ｓｐｒａｇｕ
ｅ，Ｇ．Ｆ．ａｎｄ Ｃｒｏｎａｎ，Ｒ）、ジャーナル
・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔ．）第１２９
巻、１３３５−１３４２頁、（１９７７年））。グリセ
ロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼコード領域
は、マウス、ウサギ、そしてショウジョウバエ（Ｄｒｏ
ｓｏｐｈｉｌａ ｍａｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）のグリセ
ロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼと相同性が
あり、それらに対してそれぞれ６４％、６０％、そして
５６％の相同性がある。グリセロール−３−ホスフェー
トデヒドロゲナーゼはグリセロールをジヒドロキシアセ
トンホスフェートに変換するのに必要な２つの酵素のう
ちの１つである；グリセロールを単一の炭素源として与
えたときは、これらは必須の遺伝子である。ＳＥＱ２
は、ＧＵＴ２のプロモーターの横に位置する５’領域の
一部を示し、ＳＥＱ１領域とその上流の１２３塩基対そ
してＡＴＧ開始コドンにより構成される。
【００１１】異種コード配列がプロモーターの下流に位
置し、翻訳開始コドンに関して正しいリーディングフレ
ーム（ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）中に存在するよう
に、本発明のプロモーターは制御部位に隣接して、クロ
ーニングベクター又は発現ベクター中に位置していても
よい。開始コドンはベクター上（例えばプロモーターの
すぐ横の３’）で供給してもよいし、又は異種コード配
列の５’末端として挿入してもよい。必要であれば本発
明のプロモーターと開始コドンの間にリンカーを加える
こともできる。３’制御領域も同様にベクター上で供給
するか、又はコード配列とともに挿入することができ
る。転写停止シグナルは、菌類の転写停止とポリアデニ
ル化（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ）の正しいシグ
ナルを含有する真核細胞遺伝子の３’隣接配列（３’ｆ
ｌａｎｋｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）であることが好ま
しい。適当なフランキング配列としては、例えばＧＵＴ
２遺伝子のフランキング配列であるか、又は別のもので
もよい。好ましくは停止シグナルはサッカロミセスセレ
ビッシェＰＧＫ１又はＡＤＨ１のものである。本発明の
ＤＮＡ構成体は、この構成体のクローニングベクター中
へと挿入とクローニングを可能にする合成オリゴヌクレ
オチドリンカーを両端に有する形で与えられることが好
ましい。本発明のプロモーター、ＤＮＡコード配列そし
て菌類の転写停止シグナルは、機能的な形で結合され
る。即ちそれらの正常な機能が維持されるように隣接し
て配列される。即ちその並び方は、発現制御配列はコー
ド配列の正しい発現を可能にし、転写停止シグナルは転
写とポリアデニル化の正しい停止を可能にするようなも
のである。これらの配列は、エンドヌクレアーゼの認識
配列を有する合成オリゴヌクレオチドリンカーにより結
合されることが好ましい。
【００１２】本発明ではさらに、それぞれ本発明のプロ
モーターよりなる１つ又は複数のＤＮＡ挿入体、目的の
ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列よりなるプロモー
ターの転写の制御下にあるＤＮＡ断片、そして真核細胞
転写停止シグナルを含有するＤＮＡ配列を有するハイブ
リッドベクター（ｈｙｂｒｉｄ ｖｅｃｔｏｒ）が与え
られる。
【００１３】本発明のハイブリッドベクターは、ハイブ
リッドプラスミッド又は線状ＤＮＡベクターであり、形
質転換される予定の宿主生物により選択される。
【００１４】本発明はまた特に、発現制御配列、上記の
ＤＮＡ断片、そして転写停止シグナルを含有する配列と
は別に、プロモーターの機能（即ち目的のポリペプチド
の発現）には必須ではないか又はそれほど重要ではない
が、例えばハイブリッドプラスミッドで形質転換した細
胞の増殖において重要な役割を果たす追加のＤＮＡ配列
を含むハイブリッドプラスミッドに関する。この追加の
ＤＮＡ配列は、原核細胞及び／又は真核細胞でもよく、
染色体ＤＮＡ及び／又は染色体外ＤＮＡ配列を含んでい
てもよい。例えば追加のＤＮＡ配列は、プラスミッドＤ
ＮＡ（例えば細菌性又は真各細胞プラスミッドＤＮ
Ａ）、ウイルスＤＮＡ及び／又は染色体ＤＮＡ（例えば
細菌、酵母又は高等真核細胞の染色体ＤＮＡ）由来でも
（又は、より構成されていても）よい。好適なハイブリ
ッドプラスミッドは、細菌性プラスミッド（特に大腸菌
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）プラスミッドｐ
ＢＲ３２２又は関連プラスミッド）、バクテリオファー
ジ、酵母２μプラスミッド、及び／又は酵母染色体ＤＮ
Ａ由来の追加のＤＮＡ配列を含む。
【００１５】本発明の好適なハイブリッドプラスミッド
において、追加のＤＮＡ配列は酵母の複製開始点と酵母
の選択的遺伝マーカーを有する。酵母の複製開始点を含
むハイブリッドプラスミッド（例えば自律的に複製する
断片（ａｒｓ））は、形質転換後に酵母細菌中で染色体
外で維持され、糸状分裂で自律的に複製される。酵母の
２μプラスミッドＤＮＡに相同性のある配列を含むハイ
ブリッドプラスミッドを使用することもできる。これら
のハイブリッドプラスミッドはすでに細胞内に存在する
２μプラスミッド中に組換えにより取り込まれるか、又
は自律的に複製される。取り込みベクターであるヨーロ
ッパ特許出願第２５１７４４号の取り込みベクター（ｉ
ｎｅｇｒａｔｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）又はヨーロッパ特
許出願第２８６４２４号の「分解」ベクター（“ｄｉｓ
ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ”ｖｅｃｔｏｒ）を使用するこ
ともできる。
【００１６】酵母の選択的遺伝マーカーについては、マ
ーカーの表現型発現による形質転換体の選択を促進する
任意のマーカー遺伝子が使用できる。酵母の適当なマー
カーとしては特に抗生物質耐性を示すもの、又は栄養要
求性（ａｕｘｏｔｒｏｐｈｉｃ）酵母突然変異体の場合
は宿主の障害を補正する遺伝子である。対応する遺伝子
は、例えば抗生物質サイクロヘキシミドに対する耐性を
与え、栄養要求性酵母突然変異体（例えばＵＲＡ１、Ｕ
ＲＡ３、ＡＲＧ４、ＬＥＵ２、ＨＩＳ４、ＨＩＳ３、Ｔ
ＲＰ５又はＴＲＰ１遺伝子）に無機物から栄養を取る能
力（プロトトロフィー（ｐｒｏｔｏｔｒｏｐｈｙ））を
与える。
【００１７】本発明のハイブリッドプラスミッド中に存
在する追加のＤＮＡ配列はまた、複製開始点と細菌宿主
（特に大腸菌）の選択的遺伝マーカーを有することが有
効である。酵母のハイブリッドプラスミッド中に大腸菌
の複製開始点と大腸菌のマーカーが存在することには有
用な特色がある。まず大腸菌中での増殖と増幅により大
量のハイブリッドプラスミッドＤＮＡが得られること、
第２に大腸菌に基づく全範囲のクローニング技術が利用
できるため大腸菌中でのハイブリッドプラスミッドの作
成が便利であることである。大腸菌プラスミッド（例え
ばｐＢＲ３２２など）は、大腸菌複製開始点と抗生物質
（例えばテトラサイクロンやアンピシリン）耐性を与え
る大腸菌遺伝子マーカーを含み、酵母のハイブリッドベ
クターの一部として有効に使用できる。
【００１８】本発明のハイブリッドベクターは、特にそ
れぞれ発現制御配列と、目的の蛋白をコードするＤＮＡ
配列よりなる１つ又は複数のＤＮＡ挿入体を含む。もし
ハイブリッドベクターが複数のＤＮＡ挿入体（例えば２
つから４つのＤＮＡ挿入体）を含む場合、これらはハイ
ブリッドベクター中で一列に並んで、又は異なる位置に
存在する。好適なハイブリッドベクターは一列に並んだ
１つ又は複数のＤＮＡ挿入体を含む。ＤＮＡ挿入体は特
に頭から尾に配列している。
【００１９】本発明のハイブリッドプラスミッドは当業
者に公知の方法で調製される。ハイブリッドベクターの
調製法は、本発明のプロモーター、目的のポリペプチド
をコードするＤＮＡ配列よりなり発現制御配列の転写制
御下にあるＤＮＡ断片、そして菌類の転写停止シグナル
を含有するＤＮＡ配列を含有する１つ又は複数のＤＮＡ
作成体をそのまま、又は該ＤＮＡ作成体の成分をあらか
じめ決められた順序で、ベクターに導入することよりな
る。
【００２０】本発明のハイブリッドプラスミッドは従来
の結合法を応用することにより作成される。プラスミッ
ドの成分は通常の制限部位及び／又は合成リンカー分子
及び／又はブラント末端結合法により結合される。
【００２１】本発明のプロモーターは、形質転換した酵
母（例えばサッカロミセスセレビッシェ又はシゾサッカ
ロミセスポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓｐｏｍｂｅ）、又はプロモーターが有効である他の
任意の宿主）中で使用できる。菌類細胞としては、ピキ
ア（Ｐｉｃｈｉａ）属、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ）属、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅ
ｒｏｍｙｃｅｓ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）
属、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ)属、ハンゼ
ニュラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、シゾサッカロミセス
（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シテロ
ミセス（Ｃｉｔｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、パキソレン（Ｐ
ａｃｈｙｓｏｌｅｎ）属、デバロミセス（Ｄｅｂａｒｏ
ｍｙｃｅｓ）属、メチュニコビア（Ｍｅｔｓｈｕｎｉｋ
ｏｗｉａ）属、ロードスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏ
ｒｉｄｉｕｍ）属、ロイコスポリジウム（Ｌｅｕｃｏｓ
ｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、ボツリオアスカス（Ｂｏｔｒｙ
ｏａｓｃｕｓ）属、スポリジオボラス（Ｓｐｏｒｉｄｉ
ｏｂｏｌｕｓ）属、エンドミコプシス（Ｅｎｄｏｍｙｃ
ｏｐｓｉｓ）属などがある。好適な属は、ピキア（Ｐｉ
ｃｈｉａ）属、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ）属、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙ
ｃｅｓ）属、ヤロビア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属そしてハ
ンゼニュラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属よりなる群から選
択されるものである。その理由は、現在これらの酵母の
ＤＮＡを操作する能力は、上記の他の属の酵母より充分
に開発されているからである。サッカロミセスの例とし
ては、サッカロミセスセレビッシェ、サッカロミセスイ
タリカス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｉｔａｌｉｃ
ｕｓ）そしてサッカロミセスルーキシー（Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ）がある。クルイベロミ
セスの例としては、クルイベロミセスフラジリス（Ｋｌ
ｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｌａｇｉｌｉｓ）とクルイ
ベロミセスラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ
ｌａｃｔｉｓ）がある。ハンゼニュラの例としては、ハ
ンゼニュラポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌ
ｙｍｏｒｐｈａ）とハンゼニュラアノマラ（Ｈａｎｓｅ
ｎｕｌａ ａｎｏｍａｌａ）そしてハンゼニュラカプス
ラータ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｃａｐｓｕｌａｔａ）が
ある。ヤロビアリポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉ
ｐｏｌｙｔｉｃａ）は適当なヤロビア種の例である。糸
状性の菌類としては、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅ
ｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）がある。
【００２２】菌類細胞は、（ａ）細胞壁を消化してスフ
ェロプラスト（ｓｐｈｅｒｏｐｌａｓｔ）を産生し；
（ｂ）スフェロプラストを形質転換ＤＮＡ（種々の供給
源から入手されたものであり、天然又は非天然のＤＮＡ
配列を含む）と混合し；そして（ｃ）形質転換細胞を再
生させることにより形質転換される。次に再生した細胞
を、形質転換ＤＮＡの導入のためにスクリーニングす
る。
【００２３】ピキア属、サッカロミセス属、クルイベロ
ミセス属、ヤロビア属そしてハンゼニュラ属の菌類細胞
は、細胞壁を酵素で消化してスフェロプラストを産生さ
せて形質転換し；次にスフェロプラストを形質転換ＤＮ
Ａと混合し、カルシウムイオンとポリエチレングリコー
ルの存在下でインキュベートし、形質転換したスフェロ
プラストを再生培地中で再生することにより、形質転換
できることが証明されている。
【００２４】サッカロミセスセレビッシェの形質転換法
は、ヨーロッパ特許第２５１７４４号、第２５８０６７
号、そしてＷ０９０／０１０６３号に一般的に記載され
ており、これらは全て参考のため本明細書に引用されて
いる。
【００２５】又はヒンネン（Ｈｉｎｎｅｎ）らの方法
（プロシーディングズオブナショナルアカデミーオブサ
イエンシーズオブユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）第７５巻、１９２９頁（１
９７８年））による、ハイブリッドベクターで酵母を形
質転換することができる。この方法は３つの段階に分類
できる： （１） 例えばカタツムリの消化管液（ｇｕｔ ｊｕｉ
ｃｅｓ）（例えばグルスラーゼＧｌｕｓｕｌａｓｅR）
又はヘリカーゼ（ＨｅｌｉｃａｓｅR））のような種々
のグルコシダーゼ調製物、又は微生物より得られた酵素
混合物（例えばザイモリアーゼ（Ｚｙｍｏｌｙａｓ
ｅR））を用いて、浸透圧を安定化させた溶液（例えば
１Ｍソルビトール）中で、酵母の細胞壁又はその一部を
除去。 （２） ポリエチレングリコールとＣａ2+イオンの存在
下でＤＮＡベクターによる「裸の」酵母細胞（スフェロ
プラスト）の処理。 （３） 細胞壁の再生と寒天の固体層での形質転換した
細胞の選択。この再生はスフェロプラストを寒天中に埋
め込んで行うのが便利である。例えば溶解した寒天（約
５０℃）をスフェロプラストと混合する。溶液を酵母の
増殖温度（約３０℃）に冷却して固体層を得る。この寒
天層は、スフェロプラストからの必須高分子の急速な拡
散と消失を防ぐためであり、従って細胞壁の再生を促進
する。しかしスフェロプラストをあらかじめ作成した寒
天層の表面に広げることによっても、（効率は低いが）
細胞壁の再生は可能である。
【００２６】好ましくは、形質転換した細胞の再生と選
択が同時にできるように、再生寒天を調製する。選択マ
ーカー（−同上）としてアミノ酸生合成経路の酵素をコ
ードする酵母遺伝子が一般に使用されるため、再生は好
ましくは酵母の最小培地寒天中で行われる。非常に効率
の高い再生が必要な場合は、以下の２段階法が有効であ
る： （１） 栄養豊富な複合培地（ｒｉｃｈ ｃｏｍｐｌｅ
ｘ ｍｅｄｉｕｍ）中での細胞壁の再生、そして （２） 選択寒天平板への細胞層のレプリカ平板法によ
る形質転換細胞の選択。
【００２７】ＤＮＡベクターが真核宿主の細胞の形質転
換に使用される線状ＤＮＡベクターの場合、形質転換は
好ましくは、酵母の選択マーカーを含む第２のベクター
の存在下で行われる。この共形質転換（ｃｏｔｒａｎｓ
ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）により、直接には選択することが
できないＤＮＡを取り上げた宿主細胞を濃縮することが
できる。コンピタントな（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）細胞は
任意の型のＤＮＡを取り上げるため、選択ベクターで形
質転換した大多数の細胞は追加のＤＮＡ（例えば上記の
線状ＤＮＡベクター）を持っている。目的のポリペプチ
ドの産生に当たっては、当業者に公知の方法を用いて突
然変位や選択により、形質転換宿主細胞を改良すること
ができる。突然変異は例えば紫外線照射又は適当な化学
試薬により行うことができる。プロテアーゼＡ又はＢの
欠損した株が特に好ましく、このような株は一般的に入
手することができる。
【００２８】異種コード配列は任意のポリペプチド（オ
リゴペプチドを含む）をコードする。ポリペプチドとし
ては、フィブロネクチン又はその一部（例えばヨーロッ
パ特許第２０７５１号に記載のコラーゲン又はフィブリ
ン結合部分）、ウロキナーゼ、プローウロキナーゼ、Ｃ
Ｄ４の１−３６８部分（ディー・スミス（Ｄ．Ｓｍｉｔ
ｈ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）第３２８巻、１
７０４−１７０７頁（１９８７年））、血小板由来増殖
因子（コリンズ（Ｃｏｌｌｉｎｓ）ら、ネーチャー（Ｎ
ａｔｕｒｅ）第３１６巻、７４８−７５０頁（１９８５
年））、形質転換増殖因子β（デリンク（Ｄｅｒｙｎｃ
ｋ）ら、ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第３１６巻、７０
１−７０５頁（１９８５年））、ホンビルブラント因子
（ＶｏｎＷｉｌｌｅｂｒ ａｎｄ’ｓ Ｆａｃｔｏｒ）
の１−２７２部分（ボンタム（Ｂｏｎｔｈａｍ）ら、ヌ
クレイックアシッズリサーチ（Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲ
ｅｓ．）第１４５巻、７１２５−７１２７頁）、フィブ
ロネクチンのカテプシンＤ断片（５８５−１５７８）、
α１−アンチトリプシン、プラスミノーゲンアクティベ
ーターインヒビター、第ＶＩＩＩ因子、α−グロビン、
β−ブロビン、ミオグロビン、神経増殖因子、ＬＡＣＩ
（リポ蛋白関連凝固インヒビター）（ジー・ジェイ・ブ
ローズ（Ｂｒｏｚｅ，Ｇ．Ｊ．）、バイオケミストリー
（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）第２９巻、７５３９−７
５４６頁（１９９０年））、ラクトフェリン（ジェイ・
フレッチャー（Ｆｌｅｔｃｈｅｒ，Ｊ．）、「免疫、腫
瘍、炎症における鉄」（“Ｉｒｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎ
ｉｔｙ，Ｃａｎｃｅｒ＆Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏ
ｎ”）、１９８９年、ウィリーアンドサンズ（Ｗｉｌｌ
ｅｙ＆Ｓｏｎｓ）、エム・デソウサとジェイ・エイチ・
ブロック（ｄｅ Ｓｏｕｓａ，Ｍ．＆ Ｂｒｏｃｋ，
Ｊ．Ｈ．）編）又は血小板由来内皮細胞増殖因子（ＰＤ
ＥＣＧＦ）（エフ・イシカワ（Ｉｓｈｉｋａｗａ，
Ｆ．）、ネーチャー（ｎａｔｕｒｅ）第３３８巻、５５
７−５６２頁（１９８９年））、又はこれらの保存的変
種がある。ポリペプチドはまた、ＨＳＡ又はそのＮ−末
端部分と他のポリペプチド（例えば上記したもの）との
融合物でもよい。好ましくはポリペプチドは天然に存在
するヒト血清アルブミン、修飾ヒト血清アルブミン又は
これらのいずれかの断片（このような修飾型や断片が
「変種」である）、又はα−又はβ−グロビンである。
これらの変種は、ＨＳＡの少なくとも１つの生理学的機
能を果たし、（当業者によりＨＳＡの型又は断片と見な
される）構造的（特に３次元構造）にＨＳＡに充分類似
の全ての型のＨＳＡ又はＨＳＡの断片を含む。
【００２９】特に、そのリガンド結合能（例えばビリル
ビン又は脂肪酸に関して）の少なくとも５０％（好まし
くは８０％、又は９５％）、及び／又はその作用の少な
くとも５０％（好ましくは８０％又は９５％）を保持す
るＨＳＡの変種又は断片が含まれる。このような性質は
ジェイ・アール・ブラウンとピー・ショックレイ（Ｂｒ
ｏｗｎ，Ｊ Ｒ ＆ Ｓｈｏｃｋｌｅｙ，Ｐ）（１９８
２年）、脂肪−蛋白相互作用（Ｌｉｐｉｄ−Ｐｒｏｔｅ
ｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）第１巻、２６−６８
頁、ピー・シー・ジョストとオー・エィチ・グリフィス
（Ｊｏｓｔ，ＰＣ＆Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，Ｏ Ｈ）編）に
討論されている。
【００３０】ヨーロッパ特許第３２２０９４号に開示さ
れているＨＳＡの部分は、本発明のプロモーターの使用
により発現される有用なＨＳＡ断片の例である。
【００３１】ポリペプチドは最初は分泌リーダー配列と
の融合物として発現される。ＨＳＡの場合はこれは例え
ば、天然のＨＳＡリーダー、サッカロミセスセレビッシ
ェのαメーティング因子（ｍａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏ
ｒ）、クルイベロミセスラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏ
ｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）キラー毒素リーダー、又は
天然のＨＳＡリーダーと上記酵母リーダーのいずれかと
の融合物である。即ちリーダーはＳＥＱ４とＳＥＱ５の
いずれか、又はいずれかの配列の保存的に修飾された変
種（ＷＯ９０／０１０６３に記載）である。
【００３２】宿主細胞は公知の方法で目的のポリペプチ
ドを発現させるために発酵される。ポリペプチドは公知
の方法（例えば（（もしポリペプチドが分泌されない場
合）細胞を分離し、上澄液を集め、濃縮しそしてクロマ
トグラフィーでポリペプチドを分離）により精製され
る。
【００３３】本発明のプロモーターは複合炭素源が存在
しないところで（グリセロールとエタノールの存在にか
かわらず）脱抑制され、これは酵母の大量培養に有用で
ある。即ち本発明は形質転換した酵母を大量に増殖さ
せ、培地から複合炭素源を枯渇させて単純な炭素源（例
えばグリセロール又はエタノール）を添加して目的のポ
リペプチドの発現を誘導する方法を与える。
【００３４】本発明の好適な点を実施例と添付の図面に
関して説明する。図１から９は、それぞれプラスミッド
ｐＸＬ５、ｐＡＹＥ２７４、ｐＡＹＥ２７５、ｐＡＹＥ
３３４、ｐＡＹＥ２７６、ｐＡＹＥ３２３、ｐＡＹＥ３
２４、ｐＳＡＣ３５そしてｐＡＹＥ３２１の制限酵素地
図である。図１０は、異なる時間に撮った標識ＲＮＡを
示すゲルの写真である。図１１は、図１０に対応するグ
リセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼのプロ
モーターの発現の経時変化を示す写真である。図１２は
プラスミッドｐＤＸＬ２００の制限酵素地図である。図
１３はプラスミッドｐＤＶＸ２の制限酵素地図である。
図１４はプラスミッドｐＤＶＸ４の制限酵素地図であ
る。
【００３５】
【実施例】概論 株と培養条件 プラスミッド作成のために、大腸菌ＤＨ５α（Ｆ-、φ
８０ｄｌａｃＺデルタＭ１５、デルタ（ｌａｃＺＹＡ−
ａｒｇＦ）Ｕ１６９、ｒｅｃＡ１、ｅｎｄＡ１、ｈｓｄ
Ｒ１７（ｒk -、ｍk +）、ｓｕｐＥ４４、ラムダ、ｔｈｉ
−１、ｇｙｒＡ、ｒｅｌＡ１）を使用した。Ｍ１３ベク
ターの増殖のために、大腸菌ＸＬ１−ブルー（ストラー
タジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｅｎｄＡ１、ｈｓ
ｄＲ１７（ｒk -、ｍk +）、ｓｕｐＥ４４、ｔｈｉ−１、
ラムダ、ｒｅｃＡ１、ｇｙｒＡ９６、ｒｅｌＡ１、（ｌ
ａｃ−）、［Ｆ’、ｐｒｏＡＢ、ｌａｃＩqＺデルタＭ
１５、Ｔｎ１０、（ｔｅｔr）］）を使用した。組換え
アルブミン発現の宿主としてサッカロミセスセレビッシ
ェＤＢ１ｃｉｒ°（ａ、ｌｅｕ２）を使用した。使用し
た他のサッカロミセスセレビッシェ株はＡＨ２２ｃｉｒ
+（ａ、ｃａｎ１、ｌｅｕ２、ｈｉｓ４）；ＢＪ１９９
１ｃｉｒ+（α、ｐｒｂｌ−１１２２、ｐｅｐ４−３、
ｌｅｕ２、ｔｒｐ１、ｕｒａ３−５２）とＳ２２ｃｉｒ
+（α、ａｄｅ１、ａｄｅ２、ｕｒａ１、ｈｉｓ７、ｔ
ｙｒ１、ｌｙｓ７、ｇａｌ１、ｇｕｔ２）である。酵母
細胞は３０℃で、適当な炭素源を補ったＹＥＰ（１％
（Ｗ／Ｖ）酵母エキス、２％（Ｗ／Ｖ）バクトペプト
ン）栄養寒天（ｎｕｔｒｉｅｎｔａｇａｒ）上で行っ
た。サッカロミセスセレビッシェ形式転換体は、５０ｍ
ｌの円錐形振盪フラスコ中の１０ｍｌ ＹＥＰ、２％
（Ｗ／Ｖ）ショ糖中で、３０℃、２００ｒｐｍで７２時
間増殖させた。１％（Ｗ／Ｖ）電気泳動品質のアガロー
スを含有するＹＥＰを５０℃に冷却してＨＳＡ抗体平板
を調製した。次に適当な炭素源と共に２．５％（Ｖ／
Ｖ）になるようにウサギ抗−ヒトアンブミン抗血清（キ
ャンビオ（Ｃａｍｂｉｏ）、ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒ
ｉｄｇｅ）、英国）を加え、栄養培地（ｎｕｔｒｉｅｎ
ｔ ｍｅｄｉｕｍ）をシャーレのなかに注ぎ、冷却させ
た。
【００３６】ＤＮＡ操作 標準ＤＮＡ操作法を使用した（マニアティス（Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ）ら、１９８２年、モレキュラークローニン
グ、実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）；
コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ）；サンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）
ら、１９８９年（第２版））。ＤＮＡ断片は遠心分離に
よりアガロースゲルからなるルーチン的に回収した（ビ
ー・フォーゲルスタイン（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，
Ｂ．）、アナリティカルバイオケミストリー（Ａｎａ
ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ）、第１６０巻、１１５−１１８頁
（１９８７年））。放射標識ＤＮＡは［α−32Ｐ］ｄＡ
ＴＰ（アマーシャムインターナショナル（Ａｍｅｓｈａ
ｍＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＰＬＣ）とランダムプ
ライマー標識法（エー・ピー・フェインバーグとビー・
フォーゲルスタイン（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ，Ａ Ｐａｎｄ
Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．）、アナリティカルバイ
オケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ）、第１３
７巻、２６６−２６７頁（１９８４年））を用いて行っ
た。制限エンドヌクレアーゼ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、
Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼそして大腸菌ＤＮＡポリメラ
ーゼＩ（クレノウ断片）はベーリンガーマンハイム（Ｂ
ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｎｈｅｉｍ）社より入手
した。
【００３７】グリセロール−３−ホスフェートデヒドロ
ゲナーゼ（ＧＵＴ２）酵母プロモーター断片は、酵母Ｄ
ＮＡのＢｇｌＩＩ制限により得られた断片のゲノムライ
ブラリーから得た。ＢｇｌＩＩ制限断片は、単純ヘルペ
ス（Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ）のチミジンキナー
ゼ（ＴＫ）遺伝子を含むプラスミッドの単一のＢｇｌＩ
Ｉ部位に挿入された。プロモーター断片がチミジンキナ
ーゼ遺伝子の前にクローン化される場合のみ、このプラ
スミッドで形質転換した酵母は葉酸アンタゴニスト（例
えばスルファにルアミドとアメトプテリン）の存在下で
増殖する（グッディ（Ｇｏｏｄｅｙ）ら、モレキュラー
アンドジェネラルジェネティックス（Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）第２
０４巻、５０５−５１１頁（１９８６年）、参考のため
本明細書中に引用されている）。
【００３８】細胞抽出物中のチミジンキナーゼ活性を測
定することにより、活性プロモーターを有するプラスミ
ッドを選択した。
【００３９】プロモーター断片はプラスミッドｐＸＬ５
のＢｇｌＩＩ制限断片中に封じ込めた（図１）。グリセ
ロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼプロモータ
ーの１．４８ｋ塩基対の断片の配列を決定した（ＳＥＱ
２）。酵母プロモーターの３’末端上にＳｆｉＩ制限エ
ンドヌクレアーゼ部位を導入してプロモーター断片を修
飾した。
【００４０】天然の これらの２つの配列はそれぞれＳＥＱ６とＳＥＱ７であ
る。
【００４１】実施例１：組換えヒト血清アルブミン（ｒ
ＨＡ）の発現 ＧＵＴ２プロモーターの２８２塩基対のＰｓｔＩ−Ｒｓ
ａＩ断片（即ちＳＥＱ１の１０３１−１０３６位のＣＴ
ＧＣＡＧから１３１４−１３１７位のＧＴＡＣまで）と
５６塩基対の二本鎖オリゴヌクレオチドリンカー （この５’−３’鎖はＳＥＱ１３を構成する）をＭ１３
ｍｐ１８のＰｓｔＩとＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入し（ヤ
ニッシュ−ペロン（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ）
ら、ジーン（Ｇｅｎｅ）第３３巻、１０３−１０９頁
（１９８５年））プラスミッドｐＡＹＥ２７４（図２）
を作成し、単一のＳｆｉＩ５’部位を翻訳開始部位に導
入した。ＥｃｏＲＩとＰｓｔＩでｐＡＹＥ２７４を線状
化し、ｐＸＬ５（図１）からの２．３ｋｂのＥｃｏＲＩ
−ＰｓｔＩ断片で再び環状化し、ｐＡＹＥ２７５を作成
した（図３）。これをＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩで消
化し２．３ｋｂのＧＵＴ２プロモーター断片を精製し
た。
【００４２】プラスミッドｐＡＹＥ３３４（本実験の次
の段階で使用される）の作成は、同時継続出願第８９２
７４８０．７号に記載されているが、本明細書でも繰り
返して記載する。
【００４３】プラスミッドｐＡＡＨ５（グッデイ（Ｇｏ
ｏｄｙ）ら、１９８７年：イーストバイオテクノロジー
（Ｙｅａｓｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、４０１
−４２９頁、ディー・アール・ベリー、アイ・ラッセル
とジー・ジー・スチュアート（Ｂｅｒｒｙ，Ｄ．Ｒ．，
Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｉ．ａｎｄ Ｓｔｅｗｒｔ，Ｇ．
Ｇ．）編、アレンアンドアンウィン社（Ａｌｌｅｎｎ
ａｎｄ Ｕｎｗｉｎ）発行）をＢａｍＨＩで部分消化し
て線状化した。５’の突き出た末端をＴ４ＤＮＡポリメ
ラーゼでブラント末端にし、二本鎖オリゴヌクレオチド
リンカー： で結合させた。ＡＤＨ１ターミネーター（ｔｅｒｍｉｎ
ａｔｏｒ）の３’末端でＢａｍＨＩ部位がＮｏｔＩ制限
部位に置き変わっている組換えプラスミッドｐＡＹＥ３
３４（図４）を選択した。
【００４４】ｐＡＹＥ２７５（図３）からの修飾断片と
ｐＡＹＥ３３４からの４５０塩基対のＨｉｎｄＩＩＩ−
ＮｏｔＩ ＡＤＨ１ターミネーター断片を、それ自身の
ＮｏｔＩ認識部位（５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣ−３’）が
ＢａｍＨＩ部位に導入されＢａｍＨＩ部位を破壊してい
るｐＡＴ１５３に結合し（ツイッグとシェラット（Ｔｗ
ｉｇｇ ａｎｄ Ｓｈｅｒｒａｔｔ）、１９８０年）、
ｐＡＹＥ２７６を作成した（図５）。
【００４５】プラスミッドｐＡＹＥ２７６をＥｃｏＲＩ
−ＳｓｔＩＩで線状化し、３’のへこんだ（ｒｅｃｅｓ
ｓｅｄ）末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼとｄＮＴＰで埋
め、過剰のＮｏｔＩリンカー（５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣ
−３’）で再環状化してプラスミッドｐＡＹＥ３２３を
作成した（図６）。このプラスミッドをＨｉｎｄＩＩＩ
で線状化し、二本鎖オリゴヌクレオチドリンカー： （この５’−３’鎖はＳＥＱ１３を構成する）と、Ｘｈ
ｏＩで線状化したｍｐ１９．７（ヨーロッパ特許出願第
２０１２３９号）から放出される１．９ｋ塩基対のＨＡ
ｃＤＮＡ断片で再環状化し、Ｓ１ヌクレアーゼでプラン
ト末端にした後ＨｉｎｄＩＩＩで消化してプラスミッド
ｐＡＹＥ３２４を作成した（図７）。プラスミッドｐＡ
ＹＥ３２４（図７）中に作られた３．７２ｋ塩基対のＮ
ｏｔＩ制限断片は、次に単一のＮｏｔＩ制限部位を含有
する適当な酵母複製ベクター（例えばｐＳＡＣ３５、図
８）に移し、ｐＡＹＥ３２１（図９）のようなプラスミ
ッドを作成することができる。
【００４６】プラスミッドｐＳＡＣ３５はチネリとヒン
チュリフェ（Ｃｈｉｎｅｒｙ ａｎｄ Ｈｉｎｃｈｌｉ
ｆｆｅ）（カレントジェネティクス（Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎ
ｅｔ．）第１６巻、２１−２５頁（１９８９年））とヨ
ーロッパ特許第２８６４２４号に記載されたｐＳＡＣ３
の誘導体である。ＬＥＵ２選択マーカーは、ｐＳＡＣ３
のＳｎａＢＩ部位に挿入されたＹＥＰ１３（ジェイ・ア
ール・ブローチ（Ｂｒｏａｃｈ Ｊ Ｒ）ら、セル（Ｃ
ｅｌｌ）第１６巻、８２７−８３９頁（１９７９年））
からの１．９５ｋ塩基対のＳａｌＩ−ＨｐａＩ断片であ
る。ＬＥＵ２遺伝子は単一のＴｔｈＬ１１Ｉ部位を有す
る。この酵素で処理した後大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ
のクレノウ断片で処理して５’の突き出た末端を除去し
た。ブラント末端と線状化したＤＮＡを配列 の二本鎖オリゴヌクレオチドと結合させて、ＮｏｔＩ認
識部位を挿入してｐＳＡＣ３５を作成した。
【００４７】ＳｆｉＩ制限部位への挿入のために、広範
囲の蛋白をコードするＤＮＡ断片を修飾するのに、多く
の方法があることが当業者には認識できるであろう。
【００４８】本例では本発明のプロモーターを導入する
ＨＳＡ分泌ベクター（ｐＡＹＥ３２１）について記載す
る。このベクターは５つの異なる酵母株を形質転換する
のに使用されている：これら５つの全ての株は培養上澄
液中にＨＳＡを分泌した。プロモーターの制限下にある
ＨＳＡの発現のタイミングも調べた。細胞が後期対数増
殖期に達すると、まずＨＳＡ ｍＲＮＡが検出された。
培養物が静止期に入ってからも高レベルのＨＳＡ ｍＲ
ＮＡが維持された。
【００４９】プラスミッドｐＡＹＥ３２４（図７）は、
ＮｏｔＩ制限部位がその横に存在する全プロモーター／
ＨＳＡ分泌カセットを有するｐＡＴ１５３ベースのベク
ターである。この３．１７５ｋ塩基対の分泌カセットは
以下の特徴を有する： １） 上記したように（ＳＥＱ７）ＡＴＧの上流の３０
から４０塩基対の間の部位で４つのヌクレオチドの置換
が導入されている以外は、天然のプロモーターＡＴＧ環
境を含む１．３５ｋ塩基対のプロモーター断片。 ２） 成熟ＨＳＡの分泌を指令する天然のＨＳＡ／α−
因子融合リーダー配列（Ｗ０９０／０１０６３）。 ３） 酵母アルコールデヒドロゲナーゼＡＤＨ１ターミ
ネーター領域。
【００５０】３．１７５ｋ塩基対のＮｏｔＩプロモータ
ー／ＨＳＡ分泌カセットを精製しｐＳＡＣ３５（図８）
の単一のＮｏｔＩクローニング部位に挿入してプラスミ
ッドｐＡＹＥ３２１を作成した（図９）。
【００５１】５つの［ｃｉｒ°］株をプラスミッドｐＡ
ＹＥ３２１でロイシンのプロトトロフィー（ｐｒｏｔｏ
ｔｒｏｐｈｙ）にした：即ち株１［ｃｉｒ°］株２［ｃ
ｉｒ°］、株３［ｃｉｒ°］、株４［ｃｉｒ°］、株５
［ｃｉｒ°］。形質転換は基本的にベッグズ（Ｂｅｇｇ
ｓ）の記載する方法（ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第２
７５巻、１０４−１０９頁（１９７８年））に従い実施
したが、以下の変更を行った。１．２Ｍのソルビトー
ル、１０ｍＭ ＣａＣｌ2と１２．５μｌの２０％（Ｗ
／Ｖ）ポリエチレングリコール３３５０（シグマ）、１
０ｍＭＣａＣｌ2、１０ｍＭトリス／塩酸（ｐＨ７．
５）中で、１０μｌ脱イオン水中の形質転換ＤＮＡを５
０μｌのスフェロプラストと静かに混合させ、氷の上に
１５分間保持した。さらに５００μｌの２０％（Ｗ／
Ｖ）ポリエチレングリコール３３５０（シグマ）、１０
ｍＭＣａＣｌ2、１０ｍＭトリス／塩酸（ｐＨ７．５）
を添加してから、スフェロプラストを５ｍｌの１．２Ｍ
ソルビトール選択寒天培地と静かに混合し、平板に広げ
た。各株からの２つの独立の形質転換体を、１０ｍｌの
ＹＥＰ（１％Ｗ／Ｖ 酵母エキス、２％Ｗ／Ｖバクトペ
プトンそして２％Ｗ／Ｖブドウ糖）中で、２００ｒｐｍ
で攪拌して３０℃で７２時間増殖させた。
【００５２】すべての形質転換体の培養上澄液中にＨＳ
Ａが検出され、プロモーターは酵母中の異種蛋白の発現
／分泌を指令することができることを示していた。
【００５３】実施例２：発現のタイミング ４００ｍｌのＹＥＰ、２％（Ｗ／Ｖ）のブドウ糖を含む
１リットルのシェークフラスコに株１ｐＡＹＥ３２１を
接種し、３０℃、２００ｒｐｍでインキュベートした。
接種後２４時間目、４８時間目、７２時間目、９６時間
目、１２０時間目に試料（２０ｍｌ）を採った。各時間
で培養物の光学密度と分泌されたＨＳＡを測定した。次
に遠心分離により試料を細胞ペレットと培養上澄液に分
離した。上澄液に分泌されたＨＳＡの濃度はロケットゲ
ル電気泳動で測定し、細胞ペレットからＲＮＡを抽出し
た。ゲル電気泳動で各時間のＲＮＡを各成分に分離し、
ノーザンブロットを行い、ＰＧＫとＨＳＡ構造遺伝子に
相同性のある放射標識ＤＮＡをプローブとして検出し
た。リングイスト（Ｌｉｎｇｕｉｓｔ）の方法（ネーチ
ャー（Ｎａｔｕｒｅ）第２９３巻、３１１−３１４頁
（１９８１年））により酵母細胞からＲＮＡを抽出し
た。１０μｇの全酵母ＲＮＡを１．０％アガロース−ホ
ルムアルデヒドゲル上で溶解し、２０×ＳＳＰＥからポ
ールバイオダイン（Ｐａｕｌ ｂｉｏ−ｄｙｎｅ）ナイ
ロン膜上にバキュームブロットし、クロチェックとシー
ベット（Ｋｒｏｃｚｅｋ ａｎｄ Ｓｉｅｂｅｔ）の方
法（アナリティカルバイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ）第１８４巻、９０−９５頁（１９９０
年））に従い、紫外線で架橋させた。６×ＳＳＰＥ、５
×デンハルツ（Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ）、０．１％（Ｗ／
Ｖ）ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの変性したニシンの精子
ＤＮＡ中で５０℃で１８時間ハイブリダイゼーションを
行った。洗浄のストリンジャンシー（ｗａｓｈｉｎｇ
ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）は０．２×ＳＳＰＥ、０．１％
（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ、５０℃であった。
【００５４】その結果を図１０に示す。図１１は、実験
中の光学密度とｒＨＡのレベルを示す。接種後最初の時
間の２４時間目では、ＰＧＫ ｍＲＮＡが観察された
が、ＨＳＡの分泌もＨＳＡ ｍＲＮＡも検出されなかっ
た。接種後４８時間目では、ＰＧＫとＨＳＡのｍＲＮＡ
が細胞内に検出される。分泌されたＨＳＡは培養上澄液
中に観察されるため、ＨＳＡ ｍＲＮＡは翻訳に使用す
ることができる。次の３つの時間点（接種後７２時間
目、９６時間目、１２０時間目）では、ＨＳＡ ｍＲＮ
Ａのみが観察され、ＰＧＫ ｍＲＮＡは消失していた。
培養上澄液中に観察されるＨＳＡのレベルは、これより
前の時間より増加していたが、それ以上の増加は見られ
なかった。従って以下の結論が得られる： １） 増殖の初期にＨＳＡ遺伝子は発現されず、ＰＧＫ
の発現を反映していない。 ２） 後期対数期と静止増殖期にいはＨＳＡ遺伝子が発
現され、ＨＳＡが分泌される。 ３） 静止期中ＨＳＡ ｍＲＮＡのレベルは維持され
る。
【００５５】さらにバッチ培養であろうが、フェッド−
バッチ（ｆｅｄ ｂａｔｃｈ）であろうが、又は連続培
養であろうが、発酵容器の調節された環境中では発現の
タイミングは操作することができる。単一の炭素源とし
て抑制性の炭素源（例えばショ糖又はブドウ糖）を与え
ると、異種蛋白の発現は抑制される。従って宿主生物の
増殖は異種蛋白の合成により防げられない。オペレータ
ーがあらかじめ決めた点でショ糖又はブドウ糖を非抑制
性の炭素源（例えばグリセロール又はエタノール）に交
換することができる。これらの条件下では、異種蛋白の
発現は脱抑制される。従って目的の生成物の合成を最適
化するように産生を調節することができる。
【００５６】実施例３：種々の炭素源による発現 種々の炭素源を補足した１０ｍｌのＹＥＰ中で、株１ｐ
ＡＹＥ３２１を３０℃で２００ｒｐｍで７２時間増殖さ
せた。対照実験でブドウ糖の代わりにショ糖を与えた
が、最終的なＨＳＡ分泌レベルは同じである。他のすべ
ての実験でＨＳＡ分泌の刺激が観察される。その結果を
以下の表１に示す。最適な炭素源は１％（Ｖ／Ｖ）エタ
ノールと１％（Ｖ／Ｖ）グリセロールの組合せのようで
ある。一目では刺激効果はそれほど大きくないようであ
るが、ショ糖を炭素源として得られた値はショ糖とエタ
ノールを炭素源として得られた値であることに注意すべ
きである。ショ糖を過剰にして培養を続けると、分泌さ
れるＨＳＡのレベルは大きく低下するであろう。
【００５７】
【００５８】実施例４ 本例ではサッカロミセスセレビッシェのジアスタティカ
ス（ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）変種のグルコアミラーゼ
を発現し、分泌させるためのプラスミッドｐＤＶＸ４に
ついて記載する。
【００５９】プラスミッドｐＤＶＸ４の作成 最初の段階では、一般的な醸造酵母ベクターｐＤＸＬ２
００（図１２）の作成であり、これは以下のＤＮＡ配列
を含んでいた： ａ） 修飾したＧＵＴ２プロモーター（ｐＡＹＥ２７
５）の０．３４ｋ塩基対のＳｍａＩ−ＳｆｉＩ断片 ｂ） ＳｆｉＩ、ＢｇｌＩＩそしてＨｉｎｄＩＩＩの制
限酵素部位を含む合成オリゴヌクレオチドリンカー合成
オリゴヌクレオチドリンカー ５’−３’修飾領域と２つのオリゴヌクレオチドはそれ
ぞれＳＥＱ１５、ＳＥＱ８、ＳＥＱ９として記載されて
いる。
【００６０】ｃ） ０．４５ｋ塩基対のＡＤＨ１ターミ
ネーター（アール・エー・ヒッツェマン（Ｈｉｔｚｅｍ
ａｎ，Ｒ Ａ）ら、ネーチャー（ｎａｔｕｒｅ）第２９
３巻、７１７頁（１９８１年））。 ｄ） サッカロミセスセレビッシェのＣＵＰ−１遺伝子
とそのフランキング配列（ｆｌａｎｋｉｎｇ ｓｅｑｕ
ｅｃｎｃｅｓ）はそれぞれ０．７ｋ塩基対のＫｐｎＩ−
ＸｂａＩ断片と０．３８ｋ塩基対のＢａｍＨＩ−Ｋｐｎ
Ｉ断片上に存在した（エム・カリン（ｋａｒｉｎ，Ｍ）
ら、プロシーディングズオブナショナルアカデミーオブ
サイエンシーズ（ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．）第８１巻、３３７頁（１９８４年））。ＣＵＰ−
１遺伝子は醸造酵母の形質転換の選択的遺伝子マーカー
として使用した。
【００６１】ｅ） ｐＳＡＣの３上に存在する２．７ｋ
塩基対の細菌性ＤＮＡ（ｐＵＣ９）（チネリとヒンチュ
リフェ（Ｃｈｉｎｅｒｙ ａｎｄ Ｈｉｎｃｈｌｉｆｆ
ｅ）、カレントジェネチックス（Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ
ｔ．）第１６巻、２１−２５頁（１９８９年））。 ｆ） ２μｍＤＮＡ：２μｍ複製開始点を含有する２．
２ｋ塩基対ＨｉｎｄＩＩＩ断片（ジェイ・アール・ブロ
ーチ（Ｂｒｏａｃｈ Ｊ Ｒ）（１９８２年）。「酵母
サッカロミセスセレビッシェの分子生物学：生活史と遺
伝」（“ＴｈｅＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
ｏｆ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ：Ｌｉｆｅ Ｃｙｃｌｅ ａ
ｎｄ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ”）中の酵母プラスミッ
ド２μｍサークル（Ｔｈｅ ｙｅａｓｔ ｐｌａｓｍｉ
ｄ ２μｍ ｃｉｒｃｌｅ）。ジェイ・エヌ・ストラー
サーン、イー・ダブリュー・ジョーンズとジェイ・アー
ル・ブローチ（Ｓｔｒａｔｈｅｒｎ，Ｊ Ｎ，Ｅ Ｗ
Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ ＪＲ Ｂｒｏａｃｈ）編、コール
ドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ）、４４５頁）。２μｍＤＮＡの全ＤＮＡ配列
も知られている（ジェイ・エル・ハートレイとジェイ・
イー・ドネルソン（Ｈａｒｔｌｅｙ，ｊ Ｌ ａｎｄ
Ｄｏｎｅｌｓｏｎ，Ｊ Ｅ）、ネーチャー（Ｎａｔｕｒ
ｅ）第２２６巻、８６０頁、（１９８０年））。
【００６２】グルコアミラーゼをコードするＤＥＸ１遺
伝子はサッカロミセスセレビッシェのジアスタティカス
変種から単離した（ピー・ケー・ミーデン（Ｍｅａｄｅ
ｎＰ Ｋ）ら、ジーン（Ｇｅｎｅ）第３４巻、３２５頁
（１９８５年）、ＰＣＴ／ＧＢ８５／００５９９；パル
ド（Ｐａｒｄｏ）ら、（エフ・イー・ビー・エス・レタ
ーズ（ＦＥＢＳ．Ｌｅｔｔ）第２３９巻、１７９−１８
４頁（１９８８年）はＤＥＸ１プロモーターとそのオー
プンリーディングフレームの一部について記載してい
る）。ＤＥＸ１遺伝子を有する２．７５ｋ塩基対のＢｇ
ｌＩＩ断片をｐＤＸＬ２００中の単一のＢｇｌＩＩ部位
にクローン化し、ＤＮＡ配列をＳＥＱ１０とし、そのコ
ードする蛋白はをＳＥＱ１１として現れた。得られたプ
ラスミッド、ｐＤＶＸ２（図１３）をＸｂａＩで消化し
て、細菌性ＤＮＡを含有する小さい断片（２．７ｋ塩基
対）を除去した。ゲル精製の後大きいＸｂａＩ断片を醸
造酵母中に形質転換し、このプラスミッドをｐＤＶＸ４
とした（図１４）。
【００６３】ＤＥＸ１の発現 プラスミッドｐＤＶＸ４で銅に対して耐性にした醸造酵
母株を、ヘキソキナーゼＶＵ定量法（ベーリンガーマン
ハイム社（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉ
ｍ））を用いて、グルコアミラーゼ産生について測定し
た。すべての例で銅耐性形質転換体は多量の細胞外グル
コアミラーゼを産生した。
【００６４】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Delta Biotechnology Limited <120> Yeast promoter <130> PA-28880 <150> GB 8923521.2 <151> 1989-10-18 <160> 15 <170> SeqWin99 <210> 1 <211> 1357 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <221> promoter <222> (42)...(52) <223> function=“RNA POL III promoter box A” <220> <221> promoter <222> (86)...(96) <223> function=“RNA POL III promoter box B” <220> <221> promoter <222> (113)...(118) <223> function=“RNA POL III Terminator” <220> <221> protein_bound <222> (1091)...(1103) <223> bound_moiety=“RAP I/GRF I/TUF I” <220> <221> protein_bound <222> (1106)...(1118) <223> bound_moiety=“RAP I/GRF I/TUF I” <220> <221> misc_signal <222> (1176)...(1241) <223> function=“Pyrimidine (CT) block” <220> <221> misc_feature <222> (1031)...(1036) <223> function=“Pst I restriction site” <220> <221> misc_feature <222> (1314)...(1317) <400> 1 ccgcggtgcc gagatgcaga cgtggccaac tgtgtctgcc gtcgcaaaat gatttgaatt 60 ttgcgtcgcg cacgtttctc acgtacataa taagtatttt catacagttc tagcaagacg 120 aggtggtcaa aatagaagcg tcctatgttt tacagtacaa gacagtccat actgaaatga 180 caacgtactt gacttttcag tattttcttt ttctcacagt ctggttattt ttgaaagcgc 240 acgaaatata tgtaggcaag cattttctga gtctgctgac ctctaaaatt aatgctattg 300 tgcaccttag taacccaagg caggacagtt accttgcgtg gtgttactat ggccggaagc 360 ccgaaagagt tatcgttact ccgattattt tgtacagctg atgggacctt gccgtcttca 420 tttttttttt ttttcaccta tagagccggg cagagctgcc cggcttaact aagggccgga 480 aaaaaaacgg aaaaaagaaa gccaagcgtg tagacgtagt ataacagtat atctgacacg 540 cacgtgatga ccacgtaatc gcatcgcccc tcacctctca cctctcaccg ctgactcagc 600 ttcactaaaa aggaaaatat atactctttc ccaggcaagg tgacagcggt ccccgtctcc 660 tccacaaagg cctctcctgg ggtttgagca agtctaagtt tacgtagcat aaaaattctc 720 ggattgcgtc aaataataaa aaaagtaacc ccacttctac ttctacatcg gaaaaacatt 780 ccattcacat atcgtctttg gcctatcttg ttttgtcctc ggtagatcag gtcagtacaa 840 acgcaacacg aaagaacaaa aaaagaagaa aacagaaggc caagacaggg tcaatgagac 900 tgttgtcctc ctactgtccc tatgtctctg gccgatcacg cgccattgtc cctcagaaac 960 aaatcaaaca cccacacccc gggcacccaa agtccccacc cacaccacca atacgtaaac 1020 ggggcgcccc ctgcaggccc tcctgcgcgc ggcctcccgc cttgcttctc tccccttcct 1080 tttctttttc cagttttccc tattttgtcc ctttttccgc acaacaagta tcagaatggg 1140 ttcatcaaat ctatccaacc taattcgcac gtagactggc ttggtattgg cagtttcgta 1200 gttatatata tactaccatg agtgaaactg ttacgttacc ttaaattctt tctcccttta 1260 attttctttt atcttactct cctacataag acatcaagaa acaattgtat attgtacacc 1320 ccccccctcc acaaacacaa atattgataa tataaag 1357 <210> 2 <211> 1483 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <221> misc_feature <222> (123)...(124) <223> function=“Sst II restriction site” <220> <221> TATA_signal <222> (1326)...(1335) <220> <221> misc_signal <222> (1369)...(1406) <223> function=“Pyrimidine (CT) block” <220> <221> misc_signal <222> (1418)...(1421) <223> function=“CAAG box” <220> <221> misc_signal <222> (1425)...(1429) <223> function=“ CCAAT box” <400> 2 aagaaagatt ctcggtaacg accatacaaa tattgggcgt gtggcgtagt cggtagcgcg 60 ctcccttagc atgggagagg tctccggttc gattccggac tcgtccaaat tattttttac 120 tttccgcggt gccgagatgc agacgtggcc aactgtgtct gccgtcgcaa aatgatttga 180 attttgcgtc gcgcacgttt ctcacgtaca taataagtat tttcatacag ttctagcaag 240 acgaggtggt caaaatagaa gcgtcctatg ttttacagta caagacagtc catactgaaa 300 tgacaacgta cttgactttt cagtattttc tttttctcac agtctggtta tttttgaaag 360 cgcacgaaat atatgtaggc aagcattttc tgagtctgct gacctctaaa attaatgcta 420 ttgtgcacct tagtaaccca aggcaggaca gttaccttgc gtggtgttac tatggccgga 480 agcccgaaag agttatcgtt actccgatta ttttgtacag ctgatgggac cttgccgtct 540 tcattttttt tttttttcac ctatagagcc gggcagagct gcccggctta actaagggcc 600 ggaaaaaaaa cggaaaaaag aaagccaagc gtgtagacgt agtataacag tatatctgac 660 acgcacgtga tgaccacgta atcgcatcgc ccctcacctc tcacctctca ccgctgactc 720 agcttcacta aaaaggaaaa tatatactct ttcccaggca aggtgacagc ggtccccgtc 780 tcctccacaa aggcctctcc tggggtttga gcaagtctaa gtttacgtag cataaaaatt 840 ctcggattgc gtcaaataat aaaaaaagta accccacttc tacttctaca tcggaaaaac 900 attccattca catatcgtct ttggcctatc ttgttttgtc ctcggtagat caggtcagta 960 caaacgcaac acgaaagaac aaaaaaagaa gaaaacagaa ggccaagaca gggtcaatga 1020 gactgttgtc ctcctactgt ccctatgtct ctggccgatc acgcgccatt gtccctcaga 1080 aacaaatcaa acacccacac cccgggcacc caaagtcccc acccacacca ccaatacgta 1140 aacggggcgc cccctgcagg ccctcctgcg cgcggcctcc cgccttgctt ctctcccctt 1200 ccttttcttt ttccagtttt ccctattttg tccctttttc cgcacaacaa gtatcagaat 1260 gggttcatca aatctatcca acctaattcg cacgtagact ggcttggtat tggcagtttc 1320 gtagttatat atatactacc atgagtgaaa ctgttacgtt accttaaatt ctttctccct 1380 ttaattttct tttatcttac tctcctacat aagacatcaa gaaacaattg tatattgtac 1440 accccccccc tccacaaaca caaatattga taatataaag atg 1483 <210> 3 <211> 380 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <221> misc_feature <222> (54)...(59) <223> function=“Pst I restriction site” <220> <221> misc_feature <222> (54)...(59) <223> function=“Pst I restriction site” <220> <221> misc_feature <222> (337)...(340) <223> function=“Rsa I restriction site” <400> 3 cccgggcacc caaagtcccc acccacacca ccaatacgta aacggggcgc cccctgcagg 60 ccctcctgcg cgcggcctcc cgccttgctt ctctcccctt ccttttcttt ttccagtttt 120 ccctattttg tccctttttc cgcacaacaa gtatcagaat gggttcatca aatctatcca 180 acctaattcg cacgtagact ggcttggtat tggcagtttc gtagttatat atatactacc 240 atgagtgaaa ctgttacgtt accttaaatt ctttctccct ttaattttct tttatcttac 300 tctcctacat aagacatcaa gaaacaattg tatattgtac accccccccc tccacaaaca 360 caaatattga taatataaag 380 <210> 4 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> PEPTIDE <222> (1)...(24) <223> label=leader, note=“Synthetic secretion leader sequence” <400> 4 Met Lys Trp Val Ser Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 15 Tyr Ser Arg Ser Leu Asp Lys Arg 20 <210> 5 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> PEPTIDE <222> (1)...(21) <223> label=leader, note=“Synthetic secretion leader sequence” <400> 5 Met Asn Ile Phe Tyr Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Phe Val Gln Gly 1 5 10 15 Ser Leu Asp Lys Arg 20 <210> 6 <211> 47 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae 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ctttgttcaa 840 ctggtactgg cgaatacact actgaagcta ccgcccctgt tacaacagct gtcacaacca 900 ccgttgttac cactgaatcc tctacgggta ctaactccgt cggtaagacg acaactagtt 960 acacaacaaa gtctgtacca accacctatg tatttgactt tggcaagggc attctcgatc 1020 aaagctgcgg cggtgtattt tcaaacaacg gctcttcgca agtgcagctg cgggatgtag 1080 tcttgatgaa tgggacagtg gtatacgatt caaacggcgc ttgggacagt agtgcgctgg 1140 aggagtggct ccagcgacag aaaaaagttt ccatcgaaag aatatttgaa aatattgggc 1200 ccagcgccgt gtatccgtct attttgcctg gggtcgtgat tgcgtcacca tcgcaaacgc 1260 atccagacta cttctaccaa tggataaggg acagcgcgtt gacgataaac agtattgtct 1320 ctcattctgc ggacccggca atagagacgt tattgcagta cctgaacgtt tcattccact 1380 tgcaaagaac caacaacaca ttgggcgctg gcattggtta cactaacgat acagtggctt 1440 tgggagaccc taagtggaac gtcgacaaca cggctttcac ggaaccttgg ggtcgtcctc 1500 aaaacgatgg ccctgctctt cgaagcattg ccatcttaaa aatcatcgac tacatcaagc 1560 aatctggcac tgatctgggg gccaagtacc cattccagtc caccgcagat atctttgatg 1620 atattgtacg ttggtacctg aggttcatta ttgaccactg gaattcttcc ggatttgatc 1680 tatgggagga agtcaatggc atgcatttct ttactttact ggtacaactg tctgcagtgg 1740 acaggacgct gtcgtatttt aacgcctcag aacggtcgtc tccctttgtt gaagaattgc 1800 gtcagacacg ccgggacatc tccaagtttt tagtggaccc tgcgaatggg tttatcaacg 1860 gcaagtacaa ttatattgtt gagacaccca tgattgccga cacattgaga tccggactgg 1920 acatatccac tttattagct gcgaacaccg tccacgatgc gccatctgct tcccatcttc 1980 cgttcgatat caatgaccct gccgtcctga acacgttgca ccatttgatg ttgcacatgc 2040 gttcgatata ccccatcaac gatagctcca aaaatgcaac gggtattgcc ctggggcggt 2100 atcctgagga cgtatatgat ggatatggcg ttggcgaggg aaatccctgg gtcctggcca 2160 cgtgtgccgc ttcaacaacg ctttatcagc tcatttacag acacatctct gagcagcatg 2220 acttggttgt cccaatgaac aacgattgtt cgaacgcatt ttggagcgag ctggtattct 2280 ccaacctcac gactttggga aatgacgaag gctatttgat tttggagttc aatacacctg 2340 ccttcaatca aaccatacaa aaaatcttcc aactagctga ttcattcttg gtcaagctga 2400 aagcccacgt gggaacagac ggggaactaa gtgaacaatt taacaaatac acagggttta 2460 tgcagggtgc ccaacacctt acctggtcct atacttcatt ctgggatgcc tatcaaataa 2520 gacaagaagt tttacagagt ttgtagacaa aaaaaaataa aagaaaagcg agaagtatac 2580 acaagtgtat ttcctagata tttacatcaa atatatatat atatacttat ttacaaaact 2640 ctgatattat aaattaatta gataactatg tcggaacgtc cagcccaacc acgtttgcag 2700 ttcttttcac tttctcatcc tgtgtcaact tgttgccgga ttgtatctgt cgac 2754 <210> 11 <211> 806 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 11 Met Gln Arg Pro Phe Leu Leu Ala Tyr Leu Val Leu Ser Leu Leu Phe 1 5 10 15 Asn Ser Ala Leu Gly Phe Pro Thr Ala Leu Val Pro Arg Gly Ser Ser 20 25 30 Ser Ser Asn Ile Thr Ser Ser Gly Pro Ser Ser Thr Pro Phe Ser Ser 35 40 45 Ala Thr Glu Ser Phe Ser Thr Gly Thr Thr Val Thr Pro Ser Ser Ser 50 55 60 Lys Tyr Pro Gly Ser Lys Thr Glu Thr Ser Val Ser Ser Thr Thr Glu 65 70 75 80 Thr Thr Ile Val Pro Thr Thr Thr Thr Thr Ser Val Ile Thr Pro Ser 85 90 95 Thr Thr Thr Ile Thr Thr Thr Val Cys Ser Thr Gly Thr Asn Ser Ala 100 105 110 Gly Glu Thr Thr Ser Gly Cys Ser Pro Lys Thr Ile Thr Thr Thr Val 115 120 125 Pro Cys Ser Thr Ser Pro Ser Glu Thr Ala Ser Glu Ser Thr Thr Thr 130 135 140 Ser Pro Thr Thr Pro Val Thr Thr Val Val Ala Thr Thr Val Val Thr 145 150 155 160 Thr Glu Tyr Ser Thr Ser Thr Lys Gln Gly Gly Glu Ile Thr Thr Thr 165 170 175 Phe Val Thr Lys Asn Ser Pro Thr Thr Tyr Leu Thr Thr Ile Ala Pro 180 185 190 Thr Ser Ser Val Thr Thr Val Thr Asn Phe Thr Pro Thr Thr Ile Thr 195 200 205 Thr Thr Val Cys Ser Thr Gly Thr Asn Ser Ala Gly Glu Thr Thr Ser 210 215 220 Gly Cys Ser Pro Lys Thr Val Thr Thr Thr Val Leu Cys Ser Thr Gly 225 230 235 240 Thr Gly Glu Tyr Thr Thr Glu Ala Thr Ala Pro Val Thr Thr Ala Val 245 250 255 Thr Thr Thr Val Val Thr Thr Glu Ser Ser Thr Gly Thr Asn Ser Val 260 265 270 Gly Lys Thr Thr Thr Ser Tyr Thr Thr Lys Ser Val Pro Thr Thr Tyr 275 280 285 Val Phe Asp Phe Gly Lys Gly Ile Leu Asp Gln Ser Cys Gly Gly Val 290 295 300 Phe Ser Asn Asn Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Arg Asp Val Val Leu 305 310 315 320 Met Asn Gly Thr Val Val Tyr Asp Ser Asn Gly Ala Trp Asp Ser Ser 325 330 335 Ala Leu Glu Glu Trp Leu Gln Arg Gln Lys Lys Val Ser Ile Glu Arg 340 345 350 Ile Phe Glu Asn Ile Gly Pro Ser Ala Val Tyr Pro Ser Ile Leu Pro 355 360 365 Gly Val Val Ile Ala Ser Pro Ser Gln Thr His Pro Asp Tyr Phe Tyr 370 375 380 Gln Trp Ile Arg Asp Ser Ala Leu Thr Ile Asn Ser Ile Val Ser His 385 390 395 400 Ser Ala Asp Pro Ala Ile Glu Thr Leu Leu Gln Tyr Leu Asn Val Ser 405 410 415 Phe His Leu Gln Arg Thr Asn Asn Thr Leu Gly Ala Gly Ile Gly Tyr 420 425 430 Thr Asn Asp Thr Val Ala Leu Gly Asp Pro Lys Trp Asn Val Asp Asn 435 440 445 Thr Ala Phe Thr Glu Pro Trp Gly Arg Pro Gln Asn Asp Gly Pro Ala 450 455 460 Leu Arg Ser Ile Ala Ile Leu Lys Ile Ile Asp Tyr Ile Lys Gln Ser 465 470 475 480 Gly Thr Asp Leu Gly Ala Lys Tyr Pro Phe Gln Ser Thr Ala Asp Ile 485 490 495 Phe Asp Asp Ile Val Arg Trp Tyr Leu Arg Phe Ile Ile Asp His Trp 500 505 510 Asn Ser Ser Gly Phe Asp Leu Trp Glu Glu Val Asn Gly Met His Phe 515 520 525 Phe Thr Leu Leu Val Gln Leu Ser Ala Val Asp Arg Thr Leu Ser Tyr 530 535 540 Phe Asn Ala Ser Glu Arg Ser Ser Pro Phe Val Glu Glu Leu Arg Gln 545 550 555 560 Thr Arg Arg Asp Ile Ser Lys Phe Leu Val Asp Pro Ala Asn Gly Phe 565 570 575 Ile Asn Gly Lys Tyr Asn Tyr Ile Val Glu Thr Pro Met Ile Ala Asp 580 585 590 Thr Leu Arg Ser Gly Leu Asp Ile Ser Thr Leu Leu Ala Ala Asn Thr 595 600 605 Val His Asp Ala Pro Ser Ala Ser His Leu Pro Phe Asp Ile Asn Asp 610 615 620 Pro Ala Val Leu Asn Thr Leu His His Leu Met Leu His Met Arg Ser 625 630 635 640 Ile Tyr Pro Ile Asn Asp Ser Ser Lys Asn Ala Thr Gly Ile Ala Leu 645 650 655 Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Val Tyr Asp Gly Tyr Gly Val Gly Glu Gly 660 665 670 Asn Pro Trp Val Leu Ala Thr Cys Ala Ala Ser Thr Thr Leu Tyr Gln 675 680 685 Leu Ile Tyr Arg His Ile Ser Glu Gln His Asp Leu Val Val Pro Met 690 695 700 Asn Asn Asp Cys Ser Asn Ala Phe Trp Ser Glu Leu Val Phe Ser Asn 705 710 715 720 Leu Thr Thr Leu Gly Asn Asp Glu Gly Tyr Leu Ile Leu Glu Phe Asn 725 730 735 Thr Pro Ala Phe Asn Gln Thr Ile Gln Lys Ile Phe Gln Leu Ala Asp 740 745 750 Ser Phe Leu Val Lys Leu Lys Ala His Val Gly Thr 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Ser Ile Leu Pro 355 360 365 Gly Val Val Ile Ala Ser Pro Ser Gln Thr His Pro Asp Tyr Phe Tyr 370 375 380 Gln Trp Ile Arg Asp Ser Ala Leu Thr Ile Asn Ser Ile Val Ser His 385 390 395 400 Ser Ala Asp Pro Ala Ile Glu Thr Leu Leu Gln Tyr Leu Asn Val Ser 405 410 415 Phe His Leu Gln Arg Thr Asn Asn Thr Leu Gly Ala Gly Ile Gly Tyr 420 425 430 Thr Asn Asp Thr Val Ala Leu Gly Asp Pro Lys Trp Asn Val Asp Asn 435 440 445 Thr Ala Phe Thr Glu Pro Trp Gly Arg Pro Gln Asn Asp Gly Pro Ala 450 455 460 Leu Arg Ser Ile Ala Ile Leu Lys Ile Ile Asp Tyr Ile Lys Gln Ser 465 470 475 480 Gly Thr Asp Leu Gly Ala Lys Tyr Pro Phe Gln Ser Thr Ala Asp Ile 485 490 495 Phe Asp Asp Ile Val Arg Trp Tyr Leu Arg Phe Ile Ile Asp His Trp 500 505 510 Asn Ser Ser Gly Phe Asp Leu Trp Glu Glu Val Asn Gly Met His Phe 515 520 525 Phe Thr Leu Leu Val Gln Leu Ser Ala Val Asp Arg Thr Leu Ser Tyr 530 535 540 Phe Asn Ala Ser Glu Arg Ser Ser Pro Phe Val Glu Glu Leu Arg Gln 545 550 555 560 Thr Arg Arg Asp Ile Ser Lys Phe Leu Val Asp Pro 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【図面の簡単な説明】
第１図から第９図は、それぞれプラスミッドｐＸＬ５、
ｐＡＹＥ２７４、ｐＡＹＥ２７５、ｐＡＹＥ３３４、ｐ
ＡＹＥ２７６、ｐＡＹＥ３２３、ｐＡＹＥ３２４、ｐＳ
ＡＣ３５そしてｐＡＹＥ３２１の制限酵素地図である。
【図１】プラスミッドｐＸＬ５の制限酵素地図である。
【図２】プラスミッドｐＡＹＥ２７４の制限酵素地図で
ある。
【図３】プラスミッドｐＡＹＥ２７５の制限酵素地図で
ある。
【図４】プラスミッドｐＡＹＥ３３４の制限酵素地図で
ある。
【図５】プラスミッドｐＡＹＥ２７６の制限酵素地図で
ある。
【図６】プラスミッドｐＡＹＥ３２３の制限酵素地図で
ある。
【図７】プラスミッドｐＡＹＥ３２４の制限酵素地図で
ある。
【図８】プラスミッドｐＳＡＣ３５の制限酵素地図であ
る。
【図９】プラスミッドｐＡＹＥ３２１の制限酵素地図で
ある。
【図１０】電気泳動の結果を示す写真であり、異なる時
間に撮った標識ＲＮＡを示すゲルの写真である。
【図１１】図１０に対応するグリセロール−３−ホスフ
ェートデヒドロゲナーゼのプロモーターの発現の経時変
化を示す。
【図１２】プラスミッドｐＤＸＬ２００の制限酵素地図
である。
【図１３】プラスミッドｐＤＶＸ２の制限酵素地図であ
る。
【図１４】プラスミッドｐＤＶＸ４の制限酵素地図であ
る。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１４年９月１３日（２００２．９．１
３）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００６４】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Delta Biotechnology Limited <120> Yeast promoter <130> PA-28880 <150> GB 8923521.2 <151> 1989-10-18 <160> 15 <170> SeqWin99 <210> 1 <211> 1357 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <221> protein_bound <222> (968)...(980) <223> bound_moiety=“RAP 1/GRF 1/TUF 1” <220> <221> protein_bound <222> (983)...(995) <223> bound_moiety=“RAP 1/GRF 1/TUF 1” <220> <221> misc_feature <222> (1031)...(1036) <223> function=“Pst I restriction site” <220> <221> misc_signal <222> (1053)...(1118) <223> function=“Pyrimidine (CT) block” <220> <221> TATA_signal <222> (1203)...(1212) <220> <221> misc_signal <222> (1246)...(1283) <223> function=“Pyrimidine (CT) block” <220> <221> misc_signal <222> (1295)...(1298) <223> function=“CAAG box” <220> <221> misc_signal <222> (1302)...(1306) <223> function=“ CCAAT box” <220> <221> misc_feature <222> (1314)...(1317) <400> 1 ccgcggtgcc gagatgcaga cgtggccaac tgtgtctgcc gtcgcaaaat gatttgaatt 60 ttgcgtcgcg cacgtttctc acgtacataa taagtatttt catacagttc tagcaagacg 120 aggtggtcaa aatagaagcg tcctatgttt tacagtacaa gacagtccat actgaaatga 180 caacgtactt gacttttcag tattttcttt ttctcacagt ctggttattt ttgaaagcgc 240 acgaaatata tgtaggcaag cattttctga gtctgctgac ctctaaaatt aatgctattg 300 tgcaccttag taacccaagg caggacagtt accttgcgtg gtgttactat ggccggaagc 360 ccgaaagagt tatcgttact ccgattattt tgtacagctg atgggacctt gccgtcttca 420 tttttttttt ttttcaccta tagagccggg cagagctgcc cggcttaact aagggccgga 480 aaaaaaacgg aaaaaagaaa gccaagcgtg tagacgtagt ataacagtat atctgacacg 540 cacgtgatga ccacgtaatc gcatcgcccc tcacctctca cctctcaccg ctgactcagc 600 ttcactaaaa aggaaaatat atactctttc ccaggcaagg tgacagcggt ccccgtctcc 660 tccacaaagg cctctcctgg ggtttgagca agtctaagtt tacgtagcat aaaaattctc 720 ggattgcgtc aaataataaa aaaagtaacc ccacttctac ttctacatcg gaaaaacatt 780 ccattcacat atcgtctttg gcctatcttg ttttgtcctc ggtagatcag gtcagtacaa 840 acgcaacacg aaagaacaaa aaaagaagaa aacagaaggc caagacaggg tcaatgagac 900 tgttgtcctc ctactgtccc tatgtctctg gccgatcacg cgccattgtc cctcagaaac 960 aaatcaaaca cccacacccc gggcacccaa agtccccacc cacaccacca atacgtaaac 1020 ggggcgcccc ctgcaggccc tcctgcgcgc ggcctcccgc cttgcttctc tccccttcct 1080 tttctttttc cagttttccc tattttgtcc ctttttccgc acaacaagta tcagaatggg 1140 ttcatcaaat ctatccaacc taattcgcac gtagactggc ttggtattgg cagtttcgta 1200 gttatatata tactaccatg agtgaaactg ttacgttacc ttaaattctt tctcccttta 1260 attttctttt atcttactct cctacataag acatcaagaa acaattgtat attgtacacc 1320 ccccccctcc acaaacacaa atattgataa tataaag 1357 <210> 2 <211> 1483 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <221> promoter <222> (42)...(52) <223> function=“RNA POL III promoter box A” <220> <221> promoter <222> (86)...(96) <223> function=“RNA POL III promoter box B” <220> <221> promoter <222> (113)...(118) <223> function=“RNA POL III Terminator” <220> <221> misc_feature <222> (123)...(124) <223> function=“Sst II restriction site” <220> <221> misc_feature <222> (1031)...(1036) <223> function=“Pst I restriction site” <220> <221> protein_bound <222> 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aatctatcca acctaattcg cacgtagact ggcttggtat tggcagtttc 1320 gtagttatat atatactacc atgagtgaaa ctgttacgtt accttaaatt ctttctccct 1380 ttaattttct tttatcttac tctcctacat aagacatcaa gaaacaattg tatattgtac 1440 accccccccc tccacaaaca caaatattga taatataaag atg 1483 <210> 3 <211> 380 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <221> misc_feature <222> (54)...(59) <223> function=“Pst I restriction site” <220> <221> misc_feature <222> (54)...(59) <223> function=“Pst I restriction site” <220> <221> misc_feature <222> (337)...(340) <223> function=“Rsa I restriction site” <400> 3 cccgggcacc caaagtcccc acccacacca ccaatacgta aacggggcgc cccctgcagg 60 ccctcctgcg cgcggcctcc cgccttgctt ctctcccctt ccttttcttt ttccagtttt 120 ccctattttg tccctttttc cgcacaacaa gtatcagaat gggttcatca aatctatcca 180 acctaattcg cacgtagact ggcttggtat tggcagtttc gtagttatat atatactacc 240 atgagtgaaa ctgttacgtt accttaaatt ctttctccct ttaattttct tttatcttac 300 tctcctacat aagacatcaa gaaacaattg tatattgtac accccccccc tccacaaaca 360 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tcactccatc atcatccaaa taccctggca gtaaaacaga aacttctgtt tcttctacaa 360 ccgaaactac cattgttcca actacaacta cgacttctgt cataacacca tcaacaacca 420 ctattaccac tacggtttgc tctacaggaa caaactctgc cggtgaaact acttctggat 480 gctctccaaa gaccattaca actactgttc catgttcaac cagtccaagc gaaaccgcat 540 cggaatcaac aaccacttca cctaccacac ctgtaactac agttgtcgca accaccgtcg 600 ttactactga gtattctact agtacaaaac aaggtggtga aattacaact acatttgtca 660 ccaaaaacag tccaaccact tacctaacta caattgctcc aacttcatca gtcactacgg 720 ttaccaattt caccccaacc actattacta ctacggtttg ctctacagga acaaactctg 780 ccggtgaaac tacctctgga tgctctccaa agactgtcac aacaactgtt ctttgttcaa 840 ctggtactgg cgaatacact actgaagcta ccgcccctgt tacaacagct gtcacaacca 900 ccgttgttac cactgaatcc tctacgggta ctaactccgt cggtaagacg acaactagtt 960 acacaacaaa gtctgtacca accacctatg tatttgactt tggcaagggc attctcgatc 1020 aaagctgcgg cggtgtattt tcaaacaacg gctcttcgca agtgcagctg cgggatgtag 1080 tcttgatgaa tgggacagtg gtatacgatt caaacggcgc ttgggacagt agtgcgctgg 1140 aggagtggct ccagcgacag aaaaaagttt ccatcgaaag aatatttgaa aatattgggc 1200 ccagcgccgt gtatccgtct attttgcctg gggtcgtgat tgcgtcacca tcgcaaacgc 1260 atccagacta cttctaccaa tggataaggg acagcgcgtt gacgataaac agtattgtct 1320 ctcattctgc ggacccggca atagagacgt tattgcagta cctgaacgtt tcattccact 1380 tgcaaagaac caacaacaca ttgggcgctg gcattggtta cactaacgat acagtggctt 1440 tgggagaccc taagtggaac gtcgacaaca cggctttcac ggaaccttgg ggtcgtcctc 1500 aaaacgatgg ccctgctctt cgaagcattg ccatcttaaa aatcatcgac tacatcaagc 1560 aatctggcac tgatctgggg gccaagtacc cattccagtc caccgcagat atctttgatg 1620 atattgtacg ttggtacctg aggttcatta ttgaccactg gaattcttcc ggatttgatc 1680 tatgggagga agtcaatggc atgcatttct ttactttact ggtacaactg tctgcagtgg 1740 acaggacgct gtcgtatttt aacgcctcag aacggtcgtc tccctttgtt gaagaattgc 1800 gtcagacacg ccgggacatc tccaagtttt tagtggaccc tgcgaatggg tttatcaacg 1860 gcaagtacaa ttatattgtt gagacaccca tgattgccga cacattgaga tccggactgg 1920 acatatccac tttattagct gcgaacaccg tccacgatgc gccatctgct tcccatcttc 1980 cgttcgatat caatgaccct gccgtcctga acacgttgca ccatttgatg ttgcacatgc 2040 gttcgatata ccccatcaac gatagctcca aaaatgcaac gggtattgcc ctggggcggt 2100 atcctgagga cgtatatgat ggatatggcg ttggcgaggg aaatccctgg gtcctggcca 2160 cgtgtgccgc ttcaacaacg ctttatcagc tcatttacag acacatctct gagcagcatg 2220 acttggttgt cccaatgaac aacgattgtt cgaacgcatt ttggagcgag ctggtattct 2280 ccaacctcac gactttggga aatgacgaag gctatttgat tttggagttc aatacacctg 2340 ccttcaatca aaccatacaa aaaatcttcc aactagctga ttcattcttg gtcaagctga 2400 aagcccacgt gggaacagac ggggaactaa gtgaacaatt taacaaatac acagggttta 2460 tgcagggtgc ccaacacctt acctggtcct atacttcatt ctgggatgcc tatcaaataa 2520 gacaagaagt tttacagagt ttgtagacaa aaaaaaataa aagaaaagcg agaagtatac 2580 acaagtgtat ttcctagata tttacatcaa atatatatat atatacttat ttacaaaact 2640 ctgatattat aaattaatta gataactatg tcggaacgtc cagcccaacc acgtttgcag 2700 ttcttttcac tttctcatcc tgtgtcaact tgttgccgga ttgtatctgt cgac 2754 <210> 11 <211> 806 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 11 Met Gln Arg Pro Phe Leu Leu Ala Tyr Leu Val Leu Ser Leu Leu Phe 1 5 10 15 Asn Ser Ala Leu Gly Phe Pro Thr Ala Leu Val Pro Arg Gly Ser Ser 20 25 30 Ser Ser Asn Ile Thr Ser Ser Gly Pro Ser Ser Thr Pro Phe Ser Ser 35 40 45 Ala Thr Glu Ser Phe Ser Thr Gly Thr Thr Val Thr Pro Ser Ser Ser 50 55 60 Lys Tyr Pro Gly Ser Lys Thr Glu Thr Ser Val Ser Ser Thr Thr Glu 65 70 75 80 Thr Thr Ile Val Pro Thr Thr Thr Thr Thr Ser Val Ile Thr Pro Ser 85 90 95 Thr Thr Thr Ile Thr Thr Thr Val Cys Ser Thr Gly Thr Asn Ser Ala 100 105 110 Gly Glu Thr Thr Ser Gly Cys Ser Pro Lys Thr Ile Thr Thr Thr Val 115 120 125 Pro Cys Ser Thr Ser Pro Ser Glu Thr Ala Ser Glu Ser Thr Thr Thr 130 135 140 Ser Pro Thr Thr Pro Val Thr Thr Val Val Ala Thr Thr Val Val Thr 145 150 155 160 Thr Glu Tyr Ser Thr Ser Thr Lys Gln Gly Gly Glu Ile Thr Thr Thr 165 170 175 Phe Val Thr Lys Asn Ser Pro Thr Thr Tyr Leu Thr Thr Ile Ala Pro 180 185 190 Thr Ser Ser Val Thr Thr Val Thr Asn Phe Thr Pro Thr Thr Ile Thr 195 200 205 Thr Thr Val Cys Ser Thr Gly Thr Asn Ser Ala Gly Glu Thr Thr Ser 210 215 220 Gly Cys Ser Pro Lys Thr Val Thr Thr Thr Val Leu Cys Ser Thr Gly 225 230 235 240 Thr Gly Glu Tyr Thr Thr Glu Ala Thr Ala Pro Val Thr Thr Ala Val 245 250 255 Thr Thr Thr Val Val Thr Thr Glu Ser Ser Thr Gly Thr Asn Ser Val 260 265 270 Gly Lys Thr Thr Thr Ser Tyr Thr Thr Lys Ser Val Pro Thr Thr Tyr 275 280 285 Val Phe Asp Phe Gly Lys Gly Ile Leu Asp Gln Ser Cys Gly Gly Val 290 295 300 Phe Ser Asn Asn Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Arg Asp Val Val Leu 305 310 315 320 Met Asn Gly Thr Val Val Tyr Asp Ser Asn Gly Ala Trp Asp Ser Ser 325 330 335 Ala Leu Glu Glu Trp Leu Gln Arg Gln Lys Lys Val Ser Ile Glu Arg 340 345 350 Ile Phe Glu Asn Ile Gly Pro Ser Ala Val Tyr Pro Ser Ile Leu Pro 355 360 365 Gly Val Val Ile Ala Ser Pro Ser Gln Thr His Pro Asp Tyr Phe Tyr 370 375 380 Gln Trp Ile Arg Asp Ser Ala Leu Thr Ile Asn Ser Ile Val Ser His 385 390 395 400 Ser Ala Asp Pro Ala Ile Glu Thr Leu Leu Gln Tyr Leu Asn Val Ser 405 410 415 Phe His Leu Gln Arg Thr Asn Asn Thr Leu Gly Ala Gly Ile Gly Tyr 420 425 430 Thr Asn Asp Thr Val Ala Leu Gly Asp Pro Lys Trp Asn Val Asp Asn 435 440 445 Thr Ala Phe Thr Glu Pro Trp Gly Arg Pro Gln Asn Asp Gly Pro Ala 450 455 460 Leu Arg Ser Ile Ala Ile Leu Lys Ile Ile Asp Tyr Ile Lys Gln Ser 465 470 475 480 Gly Thr Asp Leu Gly Ala Lys Tyr Pro Phe Gln Ser Thr Ala Asp Ile 485 490 495 Phe Asp Asp Ile Val Arg Trp Tyr Leu Arg Phe Ile Ile Asp His Trp 500 505 510 Asn Ser Ser Gly Phe Asp Leu Trp Glu Glu Val Asn Gly Met His Phe 515 520 525 Phe Thr Leu Leu Val Gln Leu Ser Ala Val Asp Arg Thr Leu Ser Tyr 530 535 540 Phe Asn Ala Ser Glu Arg Ser Ser Pro Phe Val Glu Glu Leu Arg Gln 545 550 555 560 Thr Arg Arg Asp Ile Ser Lys Phe Leu Val Asp Pro Ala Asn Gly Phe 565 570 575 Ile Asn Gly Lys Tyr Asn Tyr Ile Val Glu Thr Pro Met Ile Ala Asp 580 585 590 Thr Leu Arg Ser Gly Leu Asp Ile Ser Thr Leu Leu Ala Ala Asn Thr 595 600 605 Val His Asp Ala Pro Ser Ala Ser His Leu Pro Phe Asp Ile Asn Asp 610 615 620 Pro Ala Val Leu Asn Thr Leu His His Leu Met Leu His Met Arg Ser 625 630 635 640 Ile Tyr Pro Ile Asn Asp Ser Ser Lys Asn Ala Thr Gly Ile Ala Leu 645 650 655 Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Val Tyr Asp Gly Tyr Gly Val Gly Glu Gly 660 665 670 Asn Pro Trp Val Leu Ala Thr Cys Ala Ala Ser Thr Thr Leu Tyr Gln 675 680 685 Leu Ile Tyr Arg His Ile Ser Glu Gln His Asp Leu Val Val Pro Met 690 695 700 Asn Asn Asp Cys Ser Asn Ala Phe Trp Ser Glu Leu Val Phe Ser Asn 705 710 715 720 Leu Thr Thr Leu Gly Asn Asp Glu Gly Tyr Leu Ile Leu Glu Phe Asn 725 730 735 Thr Pro Ala Phe Asn Gln Thr Ile Gln Lys Ile Phe Gln Leu Ala Asp 740 745 750 Ser Phe Leu Val Lys Leu Lys Ala His Val Gly Thr Asp Gly Glu Leu 755 760 765 Ser Glu Gln Phe Asn Lys Tyr Thr Gly Phe Met Gln Gly Ala Gln His 770 775 780 Leu Thr Trp Ser Tyr Thr Ser Phe Trp Asp Ala Tyr Gln Ile Arg Gln 785 790 795 800 Glu Val Leu Gln Ser Leu 805 <210> 12 <211> 806 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 12 Met Gln Arg Pro Phe Leu Leu Ala Tyr Leu Val Leu Ser Leu Leu Phe 1 5 10 15 Asn Ser Ala Leu Gly Phe Pro Thr Ala Leu Val Pro Arg Gly Ser Ser 20 25 30 Ser Ser Asn Ile Thr Ser Ser Gly Pro Ser Ser Thr Pro Phe Ser Ser 35 40 45 Ala Thr Glu Ser Phe Ser Thr Gly Thr Thr Val Thr Pro Ser Ser Ser 50 55 60 Lys Tyr Pro Gly Ser Lys Thr Glu Thr Ser Val Ser Ser Thr Thr Glu 65 70 75 80 Thr Thr Ile Val Pro Thr Thr Thr Thr Thr Ser Val Ile Thr Pro Ser 85 90 95 Thr Thr Thr Ile Thr Thr Thr Val Cys Ser Thr Gly Thr Asn Ser Ala 100 105 110 Gly Glu Thr Thr Ser Gly Cys Ser Pro Lys Thr Ile Thr Thr Thr Val 115 120 125 Pro Cys Ser Thr Ser Pro Ser Glu Thr Ala Ser Glu Ser Thr Thr Thr 130 135 140 Ser Pro Thr Thr Pro Val Thr Thr Val Val Ala Thr Thr Val Val Thr 145 150 155 160 Thr Glu Tyr Ser Thr Ser Thr Lys Gln Gly Gly Glu Ile Thr Thr Thr 165 170 175 Phe Val Thr Lys Asn Ser Pro Thr Thr Tyr Leu Thr Thr Ile Ala Pro 180 185 190 Thr Ser Ser Val Thr Thr Val Thr Asn Phe Thr Pro Thr Thr Ile Thr 195 200 205 Thr Thr Val Cys Ser Thr Gly Thr Asn Ser Ala Gly Glu Thr Thr Ser 210 215 220 Gly Cys Ser Pro Lys Thr Val Thr Thr Thr Val Leu Cys Ser Thr Gly 225 230 235 240 Thr Gly Glu Tyr Thr Thr Glu Ala Thr Ala Pro Val Thr Thr Ala Val 245 250 255 Thr Thr Thr Val Val Thr Thr Glu Ser Ser Thr Gly Thr Asn Ser Val 260 265 270 Gly Lys Thr Thr Thr Ser Tyr Thr Thr Lys Ser Val Pro Thr Thr Tyr 275 280 285 Val Phe Asp Phe Gly Lys Gly Ile Leu Asp Gln Ser Cys Gly Gly Val 290 295 300 Phe Ser Asn Asn Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Arg Asp Val Val Leu 305 310 315 320 Met Asn Gly Thr Val Val Tyr Asp Ser Asn Gly Ala Trp Asp Ser Ser 325 330 335 Ala Leu Glu Glu Trp Leu Gln Arg Gln Lys Lys Val Ser Ile Glu Arg 340 345 350 Ile Phe Glu Asn Ile Gly Pro Ser Ala Val Tyr Pro Ser Ile Leu Pro 355 360 365 Gly Val Val Ile Ala Ser Pro Ser Gln Thr His Pro Asp Tyr Phe Tyr 370 375 380 Gln Trp Ile Arg Asp Ser Ala Leu Thr Ile Asn Ser Ile Val Ser His 385 390 395 400 Ser Ala Asp Pro Ala Ile Glu Thr Leu Leu Gln Tyr Leu Asn Val Ser 405 410 415 Phe His Leu Gln Arg Thr Asn Asn Thr Leu Gly Ala Gly Ile Gly Tyr 420 425 430 Thr Asn Asp Thr Val Ala Leu Gly Asp Pro Lys Trp Asn Val Asp Asn 435 440 445 Thr Ala Phe Thr Glu Pro Trp Gly Arg Pro Gln Asn Asp Gly Pro Ala 450 455 460 Leu Arg Ser Ile Ala Ile Leu Lys Ile Ile Asp Tyr Ile Lys Gln Ser 465 470 475 480 Gly Thr Asp Leu Gly Ala Lys Tyr Pro Phe Gln Ser Thr Ala Asp Ile 485 490 495 Phe Asp Asp Ile Val Arg Trp Tyr Leu Arg Phe Ile Ile Asp His Trp 500 505 510 Asn Ser Ser Gly Phe Asp Leu Trp Glu Glu Val Asn Gly Met His Phe 515 520 525 Phe Thr Leu Leu Val Gln Leu Ser Ala Val Asp Arg Thr Leu Ser Tyr 530 535 540 Phe Asn Ala Ser Glu Arg Ser Ser Pro Phe Val Glu Glu Leu Arg Gln 545 550 555 560 Thr Arg Arg Asp Ile Ser Lys Phe Leu Val Asp Pro Ala Asn Gly Phe 565 570 575 Ile Asn Gly Lys Tyr Asn Tyr Ile Val Glu Thr Pro Met Ile Ala Asp 580 585 590 Thr Leu Arg Ser Gly Leu Asp Ile Ser Thr Leu Leu Ala Ala Asn Thr 595 600 605 Val His Asp Ala Pro Ser Ala Ser His Leu Pro Phe Asp Ile Asn Asp 610 615 620 Pro Ala Val Leu Asn Thr Leu His His Leu Met Leu His Met Arg Ser 625 630 635 640 Ile Tyr Pro Ile Asn Asp Ser Ser Lys Asn Ala Thr Gly Ile Ala Leu 645 650 655 Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Val Tyr Asp Gly Tyr Gly Val Gly Glu Gly 660 665 670 Asn Pro Trp Val Leu Ala Thr Cys Ala Ala Ser Thr Thr Leu Tyr Gln 675 680 685 Leu Ile Tyr Arg His Ile Ser Glu Gln His Asp Leu Val Val Pro Met 690 695 700 Asn Asn Asp Cys Ser Asn Ala Phe Trp Ser Glu Leu Val Phe Ser Asn 705 710 715 720 Leu Thr Thr Leu Gly Asn Asp Glu Gly Tyr Leu Ile Leu Glu Phe Asn 725 730 735 Thr Pro Ala Phe Asn Gln Thr Ile Gln Lys Ile Phe Gln Leu Ala Asp 740 745 750 Ser Phe Leu Val Lys Leu Lys Ala His Val Gly Thr Asp Gly Glu Leu 755 760 765 Ser Glu Gln Phe Asn Lys Tyr Thr Gly Phe Met Gln Gly Ala Gln His 770 775 780 Leu Thr Trp Ser Tyr Thr Ser Phe Trp Asp Ala Tyr Gln Ile Arg Gln 785 790 795 800 Glu Val Leu Gln Ser Leu 805 <210> 13 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker used to create pAYE274 <400> 13 acggcccccc cggccacaaa cacaaatatt gataatataa agatgaagtg ggta 54 <210> 14 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide linker used to construct pAYE309 <400> 14 agctttattt cccttctttt tctctttagc tcggcttatt ccaggagctt ggataaaaga 60 <210> 15 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker used in the construction of pDXL200 <400> 15 gtacggcccc cccggccaga tctaagctt 29 <210> 16 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker - complementary to SEQ 13 <400> 16 agcttaccca cttcatcttt atattatcaa tatttgtgtt tgtggccggg ggggccgt 58 <210> 17 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker - complementary to SEQ 14 <400> 17 tcttttatcc aagctcctgg aataagccga gctaaagaga aaaagaaggg aaataa 56 <210> 18 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker - complementary to SEQ 15 <400> 18 aagcttagat ctggccgggg gggccgtac 29
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ダレル スリープ イギリス国ノッティンガム，ウエスト ブ リッジフォード，レディ ベイ ロード 60 (72)発明者 ディナ バケリア イギリス国ノッティンガム，チルウェル, カムデール クロース 16 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA12 BA40 CA03 CA06 DA12 EA04 FA02 FA17 GA11 GA19 HA01 4B064 AG01 CA06 CC03 CC24 CD06 CD09 DA01 DA10 4B065 AA80X AA80Y AA93Y AB01 AC14 AC15 BA02 BA25 BB06 BB15 BB16 BC13 CA24 CA32 CA41 CA44

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 野生型のサッカロミセスセレビッシェ
    （Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
    ｅ）中で通常隣接しているコード配列から分離された、
    配列表中の配列No.１（ＳＥＱ１）の配列を有するＤＮ
    Ａプロモーターの変種又はその機能性部分であって、そ
    の下流に位置するコード配列の転写を促進する該ＤＮＡ
    プロモーターの能力の少なくとも８０％を有し、 ただし、該ＤＮＡプロモーターは含まない、上記変種又
    は機能性部分。
  2. 【請求項２】 変種又は機能性部分が、該ＤＮＡプロモ
    ーターと少なくとも８０％の相同性を有する、請求項１
    に記載のプロモーター。
  3. 【請求項３】 変種又は機能性部分が、少なくとも２０
    ０ヌクレオチドの長さがある、請求項１又は２に記載の
    プロモーター。
  4. 【請求項４】 請求項１から３のいずれか一項に記載の
    プロモーターを含むクローニングベクター又は酵母発現
    ベクターにおいて、異種コード配列が該プロモーターの
    下流に位置し、翻訳開始コドンに対して正しいリーディ
    ングフレーム中にあるように制限部位に隣接した、該プ
    ロモーターを含む上記ベクター。
  5. 【請求項５】 請求項４に記載されたように挿入された
    異種コード配列よりなる、請求項４に記載の酵母発現ベ
    クター。
  6. 【請求項６】異種コード配列はヒト血清アルブミン又は
    その変種又はその一部をコードし、随時分泌リーダー配
    列を有する、請求項５に記載の酵母発現ベクター。
  7. 【請求項７】 異種コード配列はサッカロミセスセレビ
    ッシェのジアスタティカス（ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）
    変種のグルコアミラーゼをコードする、請求項６に記載
    の酵母発現ベクター。
  8. 【請求項８】 請求項５から７のいずれか一項に記載の
    発現ベクターで形質転換した酵母。
  9. 【請求項９】 請求項８に記載の酵母を発酵させて、該
    異種コード配列で発現されるポリペプチドを少なくとも
    部分的に精製することよりなる、ポリペプチドの調製方
    法。
  10. 【請求項１０】 請求項９に記載の方法において、最初
    酵母をポリペプチドの発現を抑制する１つ又は複数の炭
    素源中で増殖させ、次に炭素源を非抑制性の化合物又は
    このような化合物の混合物に変えることによりなる、上
    記方法。
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