DE69332893T2

DE69332893T2 - Methode zur erhöhung der produktion von rekombinanten disulfidverknüpften-proteinen in (saccharomyces cerevisiae)

Info

Publication number: DE69332893T2
Application number: DE69332893T
Authority: DE
Inventors: W. Ellis; Robert B. Freedman; Z. Markus; L. Montgomery; D. Schultz; Michael F. Tuite
Original assignee: University of Kent at Canterbury; Merck and Co Inc
Current assignee: University of Canterbury; Merck Sharp and Dohme LLC
Priority date: 1992-06-12
Filing date: 1993-06-02
Publication date: 2003-12-24
Anticipated expiration: 2013-06-03
Also published as: CA2137142C; JP4148852B2; JP3953094B2; ATE237684T1; KR0171205B1; DK0746611T3; JP2008271976A; JP2004041210A; EP0746611A1; JPH07508881A; ES2194848T3; JP4562786B2; WO1993025676A1; DE69332893D1; US6291205B1; CA2137142A1; EP0746611A4; EP0746611B1; NZ253873A; AU679448B2

Description

Hinter4rund der Erfindung

Proteindisulfidisomerase (PDI) ist ein Enzym, das bei der Katalyse der Bildung von Disulfidbindungen in sekretorischen Proteinen und Zelloberflächenproteinen eine Rolle spielt. Unter Verwendung eines Oligonukleotids, das zum Nachweis der konservierten "thioredoxin-ähnlichen" aktiven Stelle von Vertebraten-PDIs (WCGHCK) (SEQ-ID-Nr. 1) konstruiert wurde, haben wir ein Gen isoliert, das für PDI aus dem niederen Eukaryoten Saccharomyces cerevisiae kodiert. Die Nukleotidsequenz und der abgeleitete offene Leserahmen des klonierten Gens sagen ein 530-Aminosäuren-Protein mit einem Molekulargewicht von 59.082 und einem pl-Wert von 4,1 voraus, physikalischen Eigenschaften, die für Säuger-PDIs charakteristisch sind. Darüber hinaus zeigt die Aminosäuresequenz 30-32% Identität und 53-56% Ähnlichkeit mit Säuger- und Vogel-PDI-Sequenzen und hat eine sehr ähnliche allgemeine Organisation, nämlich die Anwesenheit von 2 Segmenten mit 100 Resten, von denen jedes wiederholt ist, mit den signifikantesten Homologien zu Säuger- und Vogel-PDIs in den Regionen (a, a'), welche die konservierte "thioredoxin-ähnliche" aktive Stelle enthalten. Der N-terminale Bereich hat die Charakteristiken einer spaltbaren sekretorischen Signalsequenz und die C-terminalen 4 Aminosäuren (-HDEL) (SEQ-ID-Nr. 2) stehen in Einklang damit, daß das Protein eine Komponente des endoplasmatischen Retikulums (E. R.) von S. cerevisiae ist. Transformanten, welche mehrere Kopien dieses Gens (mit der Bezeichnung PDI1) tragen, haben 10fach höhere Niveaus an PDI-Aktivität und überexprimieren ein Protein des vorausgesagten Molekulargewichts. Das PDI1-Gen ist einmalig im Hefegenom und kodiert für ein einzelnes 1,8-kb-Transkript, das weder in Zellen in der stationären Phase gefunden wird, noch durch Hitze induzierbar ist. Die Unterbrechung des PDI1-Gens ist haplo-lethal, was anzeigt, daß das Produkt dieses Gens essentiell für die Lebensfähigkeit ist.
Proteindisulfidisomerase (PDI), ein Enzym, welches Thiol : Disulfid-Austauschreaktionen katalysiert, ist eine residente Hauptproteinkomponente des E. R.-Lumens in sekretorischen Zellen. Befunde hinsichtlich der zellulären Verteilung des Enzyms, dessen subzelluläre Lokalisierung und dessen Entwicklungseigenschaften fegen nahe, daß es eine Rolle bei der Biosynthese sekretorischer Proteine spielt (Freedman, 1984, Trends Biochem. Sci. 9, S. 438- 41), und dies wird durch direkte Vernetzungsstudien in situ gestützt (Roth und Pierce, 1987, Biochemistry, 26, S. 4179-82). Der Befund, daß mikrosomale Membranen, denen PDI fehlt, einen spezifischen Defekt bei der cotranslationalen Proteindisulfidbildung zeigen (Bulleid und Freedman, 1988, Nature, 335, S. 649-51), impliziert, daß das Enzym als Katalysator der nativen Disulfidbindungsbildung während der Biosynthese von sekretorischen Proteinen und Zelloberflächenproteinen fungiert. Diese Rolle steht im Einklang damit, was von den katalytischen Eigenschaften des Enzyms in vitro bekannt ist: es katalysiert Thiol-Disulfid-Austauschreaktionen, welche zu einer Nettoproteindisulfidbildung, -bindungslösung oder -isomerisierung führen, und kann Proteinfaltung und die Bildung von nativen Disulfidbindungen in einer breiten Vielfalt von reduzierten, ungefalteten Proteinsubstraten katalysieren (Freedman et al., 1989, Biochem. Soc. Symp., 55, S. 167-192). Die DNA- und Aminosäuresequenz des Enzyms ist für mehrere Spezies bekannt (Scherens, B. et al., 1991, Yeast, 7, S. 185-193; Farquhar, R. et al., 1991, Gene, 108, S. 81-89) und es gibt zunehmend mehr Informationen bezüglich des Wirkungsmechanismus des Enzyms, welches bis zur Homogenität aus Säugerleber gereinigt wurde (Creighton et al., 1980, J. Mol. Biol., 142, S. 43-62; Freedman et al., 1988, Biochem. Soc. Trans., 16, S. 96-9; Gilbert, 1989, Biochemistry 28, S. 7298- 7305; Lundstrom und Holmgren, 1990, J. Biol. Chem., 265, S. 9114-9120; Hawkins und Freedman, 1990, Biochem. J., 275, S. 335-339). Von den vielen Proteinfaktoren, die gegenwärtig als Mediatoren von Proteinfaltung, -zusammenbau und -translokation in der Zelle in Betracht gezogen werden (Rothman, 1989, Cell 59. S. 591-601), ist PDI insofern ungewöhnlich, als es eine wohldefinierte katalytische Aktivität aufweist.
PDI wird unschwer aus Säugergeweben isoliert und das homogene Enzym ist ein Homodimer (2 · 57 kD) mit einem charakteristisch sauren pl-Wert (4,0-4,5) (Hillson et al., 1984, Methods Enzymol., 107, S. 281-292). Das Enzym wurde auch aus Weizen und aus der Alge Chlamydomonas reinhardii gereinigt (Kaska et al., 1990, Biochem. J. 268, S. 63-68). Die Aktivität wurde in einer breiten Vielfalt von Quellen nachgewiesen und in einem vorläufigen Bericht wurde behauptet, daß PDI-Aktivität in S. cerevisiae nachweisbar sei (Williams et al., 1968, FEBS Letts., 2, S. 133-135). Kürzlich wurden die vollständigen Aminosäuresequenzen einer Reihe von PDIs angegeben, hauptsächlich von klonierten cDNA-Sequenzen abgeleitet; diese umfassen die PDIs von Ratte (Edman et al., 1985, Nature, 317, S. 267-270), Rind (Yamauchi et al., 1987, Biochem. Biophys. Res. Comm., 146, S. 1485-1492), Mensch (Pihlajaniemi et al., 1987, EMBO J., 6, 5 643-9), Hefe (Scherens B., et al., oben; Farquhar; R. et al., oben) und Huhn (Parkkonen et al., 1988, Biochem. J., 256, S. 1005-1011). Die Proteine von diesen Vertebratenspezies zeigen durchwegs einen hohen Grad an Sequenzkonservierung und alle zeigen mehrere gemeinsame Merkmale, die zuerst in der Ratten-PDI- Sequenz festgestellt wurden (Edman et al., 1985, oben). Am signifikantesten ist die Anwesenheit von zwei Regionen mit etwa 100 Resten in der PDI-Sequenz, die stark homolog zueinander sind und in der Sequenz eng verwandt mit Thioredoxin, einem kleinen redoxaktiven Protein, das ein Disulfid/Dithiol-Paar, gebildet zwischen vicinalen Cys-Resten, an der aktiven Stelle enthält. Bei Thioredoxin ist die Sequenz der aktiven Stelle WCGPCK (SEQ-ID- Nr. 3), wohingegen die korrespondierende Region, die zweimal in PDI gefunden wird, die Sequenz WCGHCK (SEQ-ID-Nr. 1) aufweist. (Andere Repeats, Motive und Homologien, die in den PDI-Sequenzen identifiziert wurden, werden im folgenden erörtert).
Sequenzen, die PDI entsprechen oder damit eng verwandt sind, wurden bei Arbeiten identifiziert, die auf die Analyse von anderen Funktionen als Disulfidbindungsbildung gerichtet waren. Beispielsweise gibt es eindeutige Befunde dafür, daß PDI als die β-Untereinheiten des tetrameren α&sub2;β&sub2;-Enzyms Prolyl-4-hydroxylase fungiert, welches eine größere posttranslationale Modifizierung von naszierenden oder neu synthetisierten Procollagen-Polypeptiden innerhalb des E. R. katalysiert (Pihlajaniemi et al., 1987, supra; Koivu et al., 1987, J. Biol. Chem., 262, S. 6447-49). Es gibt auch Befunde, welche nahelegen, daß PDI in dem System zur cotranslationalen N-Glycosylierung eine Rolle spielt, (Geetha-Habib et al., 1988, Cell, 54, S. 63-68) und kürzlich wurde postuliert, daß das Enzym an dem Komplex beteiligt ist, welcher Triglycerid auf naszierende sekretorische Lipoproteine überführt (Wetterau et al., 1990, J. Biol. Chem., 265, S. 9800-7). Somit könnte PDI bei der co- und posttranslationalen Modifizierung sekretorischer Proteine multifunktionell sein (Freedman, 1989, Cell, 57, S. 1069-72).
Die weit überwiegende Mehrheit von sekretorischen Säugerproteineri enthält mehrere intramolekulare und/oder intermolekulare Disulfidbindungen. Beispiele umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Hypophysenhormone, Interleukine, Immunglobuline, Proteasen und deren Inhibitoren und andere Serumproteine. Solche Proteine sind unter den Hauptzielen für die kommerzielle Gentechnik, jedoch hat die frühe Erfahrung mit deren Expression in Bakterien und Hefe eine Reihe von Problemen dabei aufgezeigt, diese als funktionell aktive rekombinante Produkte zu erhalten. Dies lenkte die Aufmerksamkeit auf die Notwendigkeit eines besseren Verständnisses von posttranslationalen Modifizierungen im allgemeinen und der Proteinfaltung und Disulfidbindungsbildung im besonderen.
Disulfid-gebundene Proteine, die eine einzige gefaltete Domäne umfassen, können im allgemeinen vollständig reduziert und denaturiert und anschließend in vitro renaturiert werden, um den korrekt disulfid-verknüpften Zustand in vernünftiger Ausbeute herzustellen. Das Verfahren beinhaltet die schnelle Bildung einer gemischten Population vieler verschiedener disulfid-gebundener Formen, welche langsam isomerisieren, um die native Disulfidpaarung zu ergeben. Der Prozeß wird durch Thiol-/Disulfid-Redoxpuffer (z. B. GSH und GSSG) und durch einen alkalischen pH-Wert katalysiert. Niedrige Proteinkonzentrationen sind erforderlich, um eine Präzipitation und Interketten-Disulfidbildung zu verhindern. Im allgemeinen nehmen die Bildungsrate des nativen Proteins und die optimal erhältliche Ausbeute beide ab, wenn die Anzahl intramolekularer Disulfide zunimmt. Das Problem wird bei Proteinen verschärft, die mehrere disulfid-gebundene Domänen enthalten (z. B. Gewebeplasminogenaktivator), bei denen sich jede Domäne unabhängig falten und ihre nativen Disulfidbindungen ausbilden muß.
Der Prozeß der Disulfidbindungsbildung in vivo findet cotranslational oder als sehr frühes posttranslationales Ereignis statt. Studien hinsichtlich naszierender und neu synthetisierter sekretorischer Proteine im Lumen des E. R. in Säugerzellen zeigen, daß native Disulfidbindungen bereits gebildet sind. Der Prozeß in vivo scheint durch das Enzym Proteindisulfidisomerase katalysiert zu werden, welches ein häufig vorkommendes Protein in sekretorischen Zellen ist und an der luminalen Oberfläche des endoplasmatischen Retikulums lokalisiert ist [Freedman, R. B., 1984, Trends in Biochemical Sciences, 9, 438-441]. Dieses Enzym katalysiert in vitro Thiol : Proteindisulfid-Austauschreaktionen bei einem breiten Spektrum von Proteinsubstraten und besitzt die Eigenschaften, die von einem zellulären Katalysator nativer Proteindisulfidbildung verlangt werden [Freedman, R. B. et al., 1984, Biochem. Soc. Trans., 12, 939-942]. Weitere Beweisanzeichen für seine Rolle beinhalten (i), daß dessen Gewebeverteilung der Synthese von disulfid-gebundenen sekretorischen Proteinen entspricht [Brockway, B. E. et al., 1980, Biochem. J., 191, 873-876] und (ii), daß bei einer Reihe von Systemen die vorhandene Menge an Enzym parallel zu einer physiologischen Änderung in der Syntheserate von disulfid-gebundenem sekretorischem Protein variiert [Brockway, B. E., et al., 1980, Biochem J., 191, 873-876; Freedman, R. B. et al., 1983, in "Functions of Glutathione: Biochemical, Physiological, Toxicological & Clinical Aspects", Hrsg. A. Larsson, 5. Orrenius, A. Holmgren & B. Mannervik, Raven Press, New York, S. 271-282; Paver, J. L. et al., 1989, FEBS Letters, 242, S. 357-362].
Das Enzym wurde bei einer Reihe von tierischen Quellen [Lambert, N. und Freedman, R. B., 1983, Biochem. J., 213, S. 225-234] und bei Weizen [de Azevedo, G. M. V. et al., 1983, Biochem. Soc. Trans., 12, 1043] charakterisiert und es wurde eine sehr ausgeprägte Erhaltung von molekularen und kinetischen Eigenschaften festgestellt [Freedman, R. B. et al., 1984, Biochem. Soc. Trans. 12, S. 939-942; Brockway, B. E. und Freedman, R. B., 1984, Biochem. J., 219, 51-59]. Das Enzym wurde jedoch nicht eingehend in niederen Eukaryoten oder in Bakterien untersucht. Die starken Homologien zwischen Hefe und höheren Eukaryoten in den Mechanismen und molekularen Komponenten, die an der Sekretion beteiligt sind, legen stark nahe, daß das Enzym oder ein Analogon in Hefe vorhanden ist, da mindestens einige sekretorische Hefeproteine (z. B. Killer-Toxin) Disulfidbindungen enthalten.
Die Verwendung von Hefe als vielseitiger Wirt zur Expression von kommerziell wichtigen Säugerproteinen wird bis zu einem gewissen Grad durch die begrenzte Kapazität des sekretorischen Systems von Hefe und durch einige Unterschiede zwischen diesem und jenem von höheren Eukaryoten (z. B. bei der Glycosylierung) beeinträchtigt.
EP 509,841 (veröffentlicht am 21.10.1992) offenbart die Produktion von disulfid-gebundenem Humanserumalbumin mit Hilfe heterologer Coexpression von Human-PDI zusammen mit HSA in Saccharomyces cerevisiae. Diese Offenbarung betrifft hauptsächlich ein "Dreigen"- Verfahren zur Herstellurig disulfid-verbrückter Proteine, das die Expression eines ERD2- Rezeptorproteins neben PDI und HSA beinhaltet. Obwohl ein "Zweigen"-Expressionssystem umfaßt ist, verlangt diese Patentanmeldung in diesem Fall, daß das PDI-Gen ein Fusionsgen ist, welches DNA inkorporiert, die für die HSA-Präprosequenz kodiert.
EP 510,658 offenbart ein Verfahren zur verstärkten Bildung der nativen Konformation von disulfid-gebundenen Proteinen in E. coli. Diese Anmeldung bezieht sich ausschließlich auf die Verwendung prokaryotischer Wirtsorganismen und stellt nur für die Verwendung von E. coli eine ausführbare Offenbarung där.
EP 293,793 offenbart die heterologe Expression von Human-PDI in einer Vielfalt von Wirtszellen, einschließlich E. coli, Affen-COS-7-Zellen und Saccharomyces cerevisiae, und den Einsatz der daraus resultierenden PDI zur Überführung geeigneter Proteine in ihre disulfidverbrückten Formen.
Die vorliegende Erfindung stellt ein in vitro-Verfahren zur Herstellung disulfid-gebundener rekombinanter Proteine bereit, umfassend:
a) Überexpression von rekombinanter Proteindisulfidisomerase von einer rekombinanten Expressionskassette, die ein für Proteindisulfidisomerase kodierendes Gen enthält, in einer rekombinanten Wirtszelle, und
b) Expression von einem oder mehreren rekombinanten Gen(en), kodierend für ein anderes oder mehrere andere disulfid-gebundene(s) Protein(e) als Proteindisulfidisomerase, in der rekombinanten Wirtszelle,
mit der Maßgabe, daß die rekombinante Wirtszelle eine andere als E. coli ist, und daß das Gen, welches für Proteindisulfidisomerase kodiert, kein DNA-Fragment umfaßt, das für eine Humanserumalbumin-Präprosequenz kodiert, und daß das Verfahren nicht die Expression von einer rekombinanten Expressionskassette eines Gens umfaßt, das für das Rezeptorprotein ERD2 von Hefe kodiert.
Die vorliegende Erfindung stellt auch einen Stamm der Hefe Saccharomyces cerevisiae bereit, welcher rekombinante Proteindisulfidisomerase von einer rekombinanten Expressionskassette, die ein für Proteindisulfidisomerase kodierendes Gen enthält, und ein oder mehrere rekombinante(s) Gen(e), kodierend für ein anderes oder mehrere andere disulfidgebundene(s) Protein(e) als Proteindisulfidisomerase, von einer rekombinanten Expressionskassette überexprimiert,
mit der Maßgabe, daß das Gen, welches für Proteindisulfidisomerase kodiert, kein DNA- Fragment umfaßt, das für eine Humanserumalbumin-Präprosequenz kodiert, und daß die Hefe kein Gen, das für das Rezeptorprotein ERD2 von Hefe kodiert, von einer rekombinanten Expressionskassette exprimiert.
Der Begriff "Wirt" in der gesamten Beschreibung wird so gebraucht, daß E. coli ausgeschlossen ist.
Die Begriffe "Proteindisulfidisomerase" und "PDI" in der gesamten Beschreibung werden so gebraucht, daß Fusionen ausgeschlossen sind, welche die Humanserumalbumin-Präprosequenzen umfassen.

Zusammenfassung der ErfindünQ

DNA, die für Human- und Hefe-Proteindisulfidisomerase (PDI) kodiert, wird isoliert und in Expressionskassetten oder Vektoren kloniert, welche einen Promotor und Transkriptionsterminator umfassen. Die Expressionskassetten oder Vektoren, welche PDI kodierende DNA enthalten, werden in Wirtszellen überführt, welche als Folge davon PDI-Protein überproduzieren. Diese PDI-überproduzierenden Zellen werden als rekombinante Wirte für die Expression von disulfid-gebundenen Proteinen eingesetzt. Die Sekretion von disulfid-gebundenen Proteinen ist in PDI-überproduzierenden Wirtszellen im Vergleich zu Wirtszellen, die normale Niveaus an PDI produzieren, substantiell erhöht.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt die SDS-PAGE-Analyse eines zellfreien Lysats einer S. cerevisiae- Transformante, die ein für Hefe-PDI kodierendes Gen auf einem Mehrfachkopienplasmid trägt.
Fig. 2 zeigt die "Dot-Plot"-Zuordnung von Hefe-PDI und Ratten-PDI unter Einsatz der "COMPARE"- und "DOTPLOT"-Software (UWGCG), wobei die Domänenstruktur von Säuger-PDI auf derselben Skala und unter der Zuordnung dargestellt ist.
Fig. 3 zeigt die Strategie und Ergebnisse für die Unterbrechung des Hefe-PDI1- Gens; Feld (b) zeigt die Ergebnisse für die Tetrad-Analyse des His&spplus; AS3324- Stammes, der heterozygot für die pdi1::HIS3-Unterbrechung ist.
Fig. 4 zeigt den Aufbau des Plasmids pUKCl61.
Fig. 5 zeigt den Aufbau des Plasmids pUC-ySP-hPDI.
Fig. 6 zeigt den Aufbau des Plasmids p401, welches auch als pUC18- GAL10p(B)ADH1t bekannt ist.
Fig. 7 zeigt den Aufbau des Plasmids pUC18-GAL10p-yPDI-ADH1t.
Fig. 8 illustriert den Aufbau des Plasmids pKH4α2/ALS, welches auch als K991 bekannt ist.
Fig. 9 illustriert den Aufbau von YEp24-GAL10p-yPDI.
Fig. 10 illustriert den Aufbau von YEP24-GAL1p-MFα-hPDI.
Fig. 11 illustriert den Aufbau von pUC-GAL1/10-hPDI/ALS.
Fig. 12 illustriert den Aufbau von pUC-GAL1/10-yPDI/ALS.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Der Prozeß der Proteinfaltung und -sekretion in Hefe ist sehr komplex und beinhaltet mehr als 30 Genprodukte, basierend auf genetischen Studien (Franzusoff, A. et al 1991, Methods Enzymology, 194, S. 662-674). Diese umfassen Peptidyl-Prolyl-Cis-Trans-Isomerasen, PDI und andere thioredoxin-ähnliche Proteine, BiP, verschiedene molekulare Chaperone (hsp70, hsp60 etc.), Signalpeptidase, Signalerkennungsprotein, die verschiedenen Proteine, die bei der Translokation von Vorläufern in das E. R. beteiligt sind, die verschiedenen strukturellen und funktionellen Komponenten des ER, Golgi und sekretorischer Vehikel plus viele Proteine, die noch nicht charakterisiert sind (Franzusoff, A., et al., 1991, oben; Rothman, J. E. und Orci L., 1992, Nature, 355, S. 409-415; Gething, M. G. und Sambrook, G., 1992, Nature, 355, S. 33-45). In Anbetracht dieser Komplexität würde es für einen Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet sehr unwahrscheinlich erscheinen, daß die Erhöhung der Niveaus von nur einer Komponente (d. h. PDI) diese Sekretion eines bestimmten heterologen Proteins wesentlich verbessern würde. Deshalb lieferte die vorliegende Erfindung sehr unerwartete Ergebnisse insofern, als erhöhte Niveaus von PDI allein eine signifikante und substantielle Erhöhung der Niveaus sekretierter Proteine, beispielsweise Antistasin, veranlaßten, ein Phänomen, das wahrscheinlich mit einer verbesserten Proteinfaltung und/oder Disulfidbindungsbildung in Zusammenhang steht.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erhöhung der Produktion rekombinanter Proteine durch rekombinante Wirtszellen mittels Überexpression von DNA, die für Proteindisulfidisomerase (PDI) kodiert. PDI, wie hier verwendet, bezieht sich auf ein Enzym, welches spezifisch die Bildung von intramolekularen und intermolekularen Disulfidbindungen katalysiert.
Die DNA-Sequenz von PDI-Genen aus mehreren Spezies ist im Stand der Technik bekannt. Diese Spezies beinhalten, sind jedoch nicht beschränkt auf, Mensch, Rind, Ratte, Huhn und Hefe [Mizunaga et al., 1990, J. Biochem., 108, S. 846-851; Scherens et al., 1991, Yeast, 7, S. 185-193].
Das Ausgangsmaterial für die Isolierung von für PDI kodierender DNA kann eine beliebige Zelle oder ein beliebiger Gewebetyp sein, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Zellen und Gewebe von Säugern und anderen Vertebraten, sowie Zellen und Gewebe niederer Eukaryoten. Die vorliegende Erfindung wird demonstriert unter Verwendung von Hefe- und Human-PDI, die in rekombinanten Hefewirtszellen exprimiert wurden. Für einen Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet ist unschwer ersichtlich, daß sich die vorliegende Erfindung auf andere Expressionswirte erstreckt und diese einschließt, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Säugerzellen, Pflanzenzellen, prokaryotische Zellen wie z. B. Bakterien, Insektenzellen und niedere eukaryotische Zellen wie Hefe und Fadenpilze. Ferner ist für einen Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet unschwer ersichtlich, daß die Verwendung von PDI kodierender DNA, die von anderen Quellen als Hefe und Humanzellen erhalten wurde, von der vorliegenden Erfindung umfaßt wird. Andere Quellen von PDI kodierender DNA schliessen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, andere Vertebraten als der Mensch, z. B. Ratte und Maus, Nicht-Vertebraten wie Insekten, und niedere Eukaryoten wie Pilze.
Mikrosomale Membranfraktionen, aus S. cerevisiae nach dem Verfahren von Rothblatt und Meyer (1986, Cell, 44, S. 619-28) hergestellt, besaßen niedrige Niveaus an Proteindisulfidisomerase (PDI)-Aktivität, welche durch Beschallung um das 8-20fache erhöht wurden. Dies legte die Anwesenheit eines Enzyms im Lumen des endoplasmatischen Retikulums von Hefe nahe, welches mit PDI, die im selben zellulären Kompartiment in Vertebraten (Mills et al., 1983, Biochem. J., 213, S. 245-8); Lambert und Freedman, 1985, Biochem. J., 228, S. 635-45) und in Weizen (Roden et al., 1982, FEBS Lett., 138, S. 121-4) gefunden wird, vergleichbar ist. Das für PDI kodierende Gen wurde unter der Annahme von Homologie mit den Enzymen höherer Eukaryoten kloniert. Die Regionen, welche am wahrscheinlichsten eine starke Konservierung zeigen würden, wären die a- und a'-Domänen, welche bei Vertebraten-PDIs stark konserviert sind und eine sehr starke Homologie zu Thioredoxin, insbesondere im Bereich der beiden funktionellen aktiven Dithiol-Stellen, zeigen; die Konsensussequenz für die aktive Stelle ist FYAPWCGHCK (SEQ-ID-Nr. 4) (Parkonnen et al., 1988, oben). Ein nicht-redundantes 30-mer-Oligonukleotid wurde auf Grundlage der Codonbevorzugung in Hefe konstruiert (Sharp et al., 1986, Nucleic Acids Res., 14, S. 5125- 43), welches endmarkiert und zum Screenen einer genomischen Hefe-Bank, erstellt in dem Mehrfachkopien-YEp-Plasmid pMA3a (Crouzet und Tuite, 1987, Mol. Gen. Genet., 210, S. 581-3), eingesetzt wurde. Zwei stark positive Klone (als C7 und C10 bezeichnet) wurden bei dem Screening gewonnen und eine einleitende Restriktionskartierung offenbarte Insertgrößen von 14 kb bzw. 14,5 kb, wobei die beiden Inserts eine Reihe gemeinsamer Restriktionsstellen zeigen. Das Insert von Klon C7 wurde weiter analysiert.
Zur Bestätigung, daß der Klon C7 tatsächlich für PDI kodierte, wurde der Stamm MD40/4c [α trp1 ura2 his3 leu2; Tuite et al., 1986, EMBO. J., 1, S. 603-608] der Hefe S. cerevisiae mit dem Klon C7 und mit dem Ausgangsplasmid pMA3a transformiert. Eine SDS-PAGE-Analyse offenbarte, daß die C7-Transformante ein 58-kD-Hauptpolypeptid und möglicherweise ein zweites Polypeptid von etwa 77 kD überexprimierte (Fig. 1). Ferner zeigte, als die zelifreien Lysate der beiden Stämme hinsichtlich PDI-Aktivität untersucht wurden, die C7-Transformante 10fach höhere Niveaus an PDI-Aktivität (38,6 · 10&supmin;&sup5; E/ug Protein). Diese beiden Befunde stützten die Annahme, daß der C7-Klon für PDI und nicht Thioredoxin kodierte, da S. cerevisiae-Thioredoxin, welches die Sequenz der aktiven Stelle WCGPCK aufweist (SEQ- ID-Nr. 3), ein Molekulargewicht von etwa 12 kD (Porque et al., 1970, J. Biol. Chem., 245, S. 2363-70) besitzt.
Zur Lokalisierung der mutmaßlich für PDI kodierenden Sequenz wurde der C7-Klon mit einer Vielfalt von Restriktionsenzymen verdaut, die Verdaus wurden auf Nitrocellulose überführt und mit dem oben beschriebenen 30-mer-Oligonukleotid der "aktiven Stelle" sondiert. Das Verfahren identifizierte ein 5-kb-BamHI-SaII-Fragment und zwei anscheinend benachbarte HindIII-Fragmente von 5,0 bzw. 4,5 kb. Das letztere Muster legte die mögliche Existenz von zwei Zielen für die Sonde der "aktiven Stelle" nahe, wie man für PDI voraussagen würde, welche zwei Kopien der aktiven Stelle enthält. Eine einleitende DNA-Sequenzanalyse von den beiden HindIII-Stellen offenbarte einen offenen Leserahmen mit schwacher Homologie zu Vertebraten-PDIs, demonstrierte jedoch auch, daß es eine weitere HindIII-Stelle geben mußte, da sie keine zusammenhängenden Sequenzen waren. Eine detaillierte Restriktionskartierung, gekoppelt mit DNA-Sequenzierung, bestätigte diese Annahme. Unter Einsatz natürlich vorkommender Restriktionsstellen und Oligonukleotid-Primer würde ein HindIII- EcoRI-Fragment von 2,5 kb, umfassend die beiden benachbarten HindIII-Stellen, auf beiden Strängen sequenziert.
Die DNA-Sequenz sagte einen einzigen offenen Leserahmen von 1593 bp voraus, mit dem Potential zur Kodierung für ein Polypeptid von 530 Aminosäuren mit einem vorausgesagten Molekulargewicht von 59.082 (Farquhar, R., et al., oben, siehe Fig. 2). Der offene Leserahmen besaß eine Codonbevorzugung, die typisch für Hefe-mRNAs ist, welche für mäßig häufige Proteine kodieren (Bennetzen und Hall, 1982, J. Biol. Chem., 257, S. 3029-3031); der berechnete Index der Codonbevorzugung war 0,60.
Eine Analyse der bestimmten Nukleotidsequenz offenbart eine Reihe von Standard-Hefe- Promotor und -Terminator-Motiven (Farquhar, R. et al., oben, siehe Fig. 2). Diese beinhalten eine TATA-Box-Homologie als Teil einer (TA)&sub1;&sub4;-Sequenz, die zwischen -100 und -128 bezüglich des offenen Leserahmens liegt, und eine pyrimidinreiche Region (34 von 37 Nukleotiden) zwischen Position -201 und -238. Am 3'-Ende des offenen Leserahmens, nach dem TAA-Translationsterminator, gibt es Homologien zu sowohl der Sequenz, die als Signal für die Transkriptionstermination und/oder Polyadenylierung in S. cerevisiae postuliert wurde (Zaret und Sherman, 1982, Cell, 28, S. 563-73), als auch zu der eukaryotischen Polyadenylierungsstelle (Proudfoot und Brownlee, 1976, Nature, 264, S. 211-4).
Zur Feststellung, ob dieses klonierte Gen transkribiert wurde, wurde ein HindIII-StuI-Fragment von 800 bp, das sich in dem offenen Leserahmen befand, dazu verwendet, einen Northernblot von Gesamt-RNA-Proben, hergestellt aus zwei verschiedenen Stämmen von S. cerevisiae (MD40/4c und SKQ2n [α/a ade1/+ ade2/+ his1/+; Gasion et al 1979, J. Biol. Chem., 254, S. 3965-3969]), die auf zwei verschiedenen Kohlenstoffquellen, Glucose und Acetat, bis zu verschiedenen Stadien des Wachstumszyklus gezüchtet worden waren, zu sondieren. Bei exponentiell wachsenden Zellen wurde ein einziges 1,8-kb-Transkript bei auf Glucose und Acetat gezüchteten Zellen nachgewiesen, während das Transkript bei nicht- wachsenden Zellen kaum nachweisbar war. Die Größe des Transkripts war wie anhand des offenen Leserahmens vorausgesagt, der etwa 200 Nukleotide von nicht-translatierter Sequenz in den 5'- und 3'-Bereichen der mRNA erlaubte.
Die vorausgesagte Aminosäuresequenz legte aus den folgenden Gründen stark nahe, daß diese tatsächlich PDI war:
(i) sie besaß ein vorausgesagtes Molekulargewicht von 59 kD und einen pl-Wert (4,1), der für Säuger-PDIs charakteristisch ist;
(ii) die Aminosäuresequenz zeigte 30-32% Gesamtidentität und 53-56% Gesamtähnlichkeit mit zuvor berichteten Säuger- und Vogel-PDI-Sequenzen, wie definiert durch BESTFIT-Software (UWGCG, University of Wisconsin); und
(iii) sie enthielt zwei Kopien der "thioredoxin-ähnlichen" aktiven Stelle an den Positionen 58-65 und 403-410 in der Aminosäuresequenz.
Ferner waren diese Sequenzen Teil größerer interner Duplizierungen von etwa 100 Aminosäuren, welche eine starke Aminosäureidentität mit den duplizierten a/a'-Regionen innerhalb von Säuger-PDI zeigen (Fig. 2) Eine Zuordnung der Hefe- und Säuger-PDI-Sequenzen offenbarte auch andere Regionen, außerhalb der a- und a'-Regionen, welche eine signifikante Homologie zeigten (Fig. 2).
Darüber hinaus legen zwei weitere Merkmale des kodierten Polypeptids nahe, daß es eine Komponente des endoplasmatischen Retikulums von S. cerevisiae ist; das Protein kodiert für eine sehr hydrophobe N-terminale Sequenz mit den charakteristischen Merkmalen eines mutmaßlichen sekretorischen Signals (Gierasch, 1989, Biochemistry, 28, S. 923-930) und die vier C-terminalen Aminosäuren sind identisch mit denjenigen in Hefe-BiP (Normington et al., 1989, Cell, 57, S. 1223-36) und wurden als das Retentionssignal für das endoplasmatische Retikulum für S. cerevisiae genannt (Pelham et al., 1988, EMBO J., 7, S. 1757-62).
Wir bezeichneten das klonierte S. cerevisiae-PDI-Gen als PDI1. Das S. cerevisiae-PDI1-Gen liegt in nur einer Kopie in dem Genom vor. Dies wurde bestätigt durch hochstringente Hybridisierung unter Verwendung des oben beschriebenen HindIII-StuI-Fragments von 0,8 kb als Sonde gegenüber einer Vielfalt von genomischen Verdaus.
Zur Feststellung, ob das einzelne PDI1-Gen für die Lebensfähigkeit essentiell war, konstruierten wir ein Null-Allel, bei dem das 1,8-kb-BamHI-Fragment, welches das HIS3-Gen trägt, [Montiel, G. F. et al., 1984, Nucleic Acids Res., 12, S. 1049-1068] in die EcoRV-Stelle innerhalb der für PDI1 kodierenden Sequenz inseriert war (Fig. 3). Ein diploider his3-Stamm der Hefe S. cerevisiae (AS3324; [Spalding, A., 1988, Dissertation, University of Kent]) wurde mit einem DNA-Fragment transformiert, weiches die pdi1::HIS3-Unterbrechung trug, um eines der beiden chromosomalen Kopien des PDI1-Gens durch dieses nicht-funktionelle Allel zu ersetzen. Drei HIS&spplus;-AS3324-Transformanten (Y1, Y2 und Y3) wurden weiter untersucht und in jedem Fall ergab die Sporulierung der Diploiden nur zwei lebensfähige Sporen pro Tetrade (Fig. 3), von denen alle his waren. Dieses Ergebnis zeigt an, daß der lethale Phänotyp mit der pdi1::HIS3-Mutation assoziiert war. Durch Southern-Hybridisierung gegen geblottete genomische Hefe-DNA, die mit PstI verdaut war, wurde unter Verwendung des 800-bp- HindIII-StuI-Fragments als Sonde bestätigt, daß der korrekte Genaustausch in den HIS&spplus;- Transformanten Y1 und Y2 stattgefunden hatte. Nachdem das PDI1-Gen keine internen PstI- Stellen enthält (Fig. 3), jedoch das HIS3-Gen eine einzige PstI-Stelle enthält (Fig. 3), sollte dies eine einfache Identifizierung des pdi1::HIS3-Allels erlauben. Wie bei dem untransformierten Stamm AS3324 vorausgesagt, wurde ein einzelnes 9-kb-PstI-Fragment nachgewiesen, während in den Y1- und Y2-Transformanten zwei Banden von 9 kb und 2,2 kb nachgewiesen wurden, wobei die 9-kb-Bande mutmaßlich aus zwei Banden unterschiedlicher Herkunft bestand. Diese Daten bestätigen, daß das PDI1-Gen auf einem der beiden Chromosomen durch das HIS3-Allel ersetzt worden war und das ein solches Ereignis haplo-lethal war.
Zur molekularen Klonierung von für Hefe-PDI kodierender DNA kann irgendeines einer Vielfalt von Verfahren eingesetzt werden. Diese Verfahren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, direkte funktionelle Expression des PDI-Gens nach der Konstruktion einer PDI-enthaltenden DNA-Bank in einem geeigneten Expressionsvektorsystem. Ein weiteres Verfahren ist das Screenen einer PDI-enthaltenden DNA-Bank, die in einem Bakteriophagen- oder Plasmid-Shuttle-Vektor konstruiert wurde, mit einer markierten Oligonukleotid- Sonde, die von der Aminosäuresequenz der PDI-Proteine konstruiert wurde. Das bevorzugte Verfahren besteht aus dem Screenen einer Human- oder Hefe-PDI-enthaltenden genomischen DNA-Bank, die in einem Plasmid-Shuttle-Vektor konstruiert wurde, mit einer abgeleiteten DNA-Sonde, welche für die bekannte Aminosäuresequenz der aktiven Stelle des Enzyms kodiert.
Es ist für Fachleute ohne weiteres ersichtlich, daß andere Typen von Banken sowie Banken, die aus anderen Zellen oder Zelltypen konstruiert wurden, zur Isolierung von DNA, die für PDI kodiert, geeignet sein können. Andere Typen von Banken umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, cDNA-Banken und genomische DNA-Banken, die von anderen Human-, Vertebraten-, Invertebraten-Zellen oder -Zellinien und Zellen oder Zellinien niederer Eukaryoten außer Hefe-Zellen stammen.
Es ist für Fachleute unschwer ersichtlich, daß geeignete cDNA-Banken aus Zellen oder Zellinien, die PDI-Aktivität aufweisen, hergestellt werden können. Die Selektion von Zellen oder Zellinien zur Verwendung für die Herstellung einer cDNA-Bank zur Isolierung von PDIcDNA kann durchgeführt werden, indem zuerst die zellassozierte PDI-Aktivität mit Hilfe der oben ausführlich beschriebenen Verfahren gemessen wird.
Die Herstellung von cDNA-Banken kann nach Standardverfahren erfolgen, die im Stand der Technik wohl bekannt sind. Wohlbekannte Verfahren zur Konstruktion von cDNA-Banken sind z. B. in Maniatis, T, Fritsch, E. F., Sambrook, J., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1982) zu finden.
Es ist auch für Fachleute unschwer ersichtlich, daß für PDI kodierende DNA auch aus einer geeigneten genomischen DNA-Bank konstruiert werden kann.
Die Konstruktion von genomischen DNA-Banken kann nach im Stand der Technik wohlbekannten Standardverfahren durchgeführt werden. Wohlbekannte Verfahren zur Konstruktion von genomischen DNA-Banken sind in Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J., in Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1982) zu finden.
Die klonierte PDI, erhalten mit den oben beschriebenen Verfahren, kann durch molekulare Klonierung in einen Expressionsvektor, der einen geeigneten Promotor und andere geeignete regulatorische Transkriptionselemente enthält, rekombinant exprimiert werden und in prokaryotische oder eukaryotische Wirtszellen überführt werden, um rekombinante PDI herzustellen. Techniken für solche Manipulationen sind vollständig in Maniatis T., et al., oben, beschrieben und im Stand der Technik wohl bekannt.
Expressionsvektoren sind hier definiert als DNA-Sequenzen, welche für die Transkription klonierter Kopien von Genen und die Translation ihrer mRNAs in einen geeigneten Wirt erforderlich sind. Solche Vektoren können zur Expression von eukaryotischen Genen in einer Vielfalt von Wirten wie Bakterien, blaugrünen Algen, Pflanzenzellen, Pilzen, Insektenzellen und Tierzellen eingesetzt werden.
Speziell konstruierte Vektoren erlauben das Shuttling von DNA zwischen Wirten wie Bakterien-Hefe oder Bakterien-Tierzellen. Ein geeignet konstruierter Expressionsvektor sollte enthalten: einen Replikationsursprung für autonome Replikation in Wirtszellen, selektierbare Marker, eine begrenzte Anzahl geeigneter Restriktionsenzymstellen, ein Potential für eine hohe Kopienzahl und aktive Promotoren. Ein Promotor ist definiert äls eine DNA-Sequenz, welche RNA-Polymerase zur Bindung an DNA und zur Initiierung von RNA-Synthese veranlaßt. Ein starker Promotor ist einer, der die Initiierung von mRNAs mit hoher Frequenz veranlaßt. Expressionsvektoren können umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Klonierungsvektoren, modifizierte Klonierungsvektoren, speziell konstruierte Plasmide oder Viren.
Zur Expression von rekombinanter PDI in Säugerzellen kann eine Vielfalt von Säuger- Expressionsvektoren eingesetzt werden. Im Handel erhältliche Säuger-Expressionsvektoren, welche zur Expression von rekombinanter PDI geeignet sein können, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, pMC1neo (Stratagene), pXT1 (Stratagene), pSGS (Stratagene), EBO- pSV2-neo (ATCC 37593) pBPV-1 (8-2) (ATCC 37110), pdBPV-MMTneo(342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198), pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460), und gZD35 (ATCC 37565).
DNA, die für PDI kodiert, kann auch in einen Expressionsvektor zur Expression in einer Vielfalt von rekombinanten Wirtszellen kloniert werden. Rekombinante Wirtszellen können Prokaryoten sein, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Bakterien, oder Eukaryoten, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Hefe, Säugerzellen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Zellinien, die vom Menschen, Rindern, Schweinen, Affen und Nagern stammen, und Insektenzellen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, von Drosophila abgeleitete Zellinien und Spodoptera frugiperda (SF9)-Insektenzellen zur Verwendung mit rekombinanten Baculovirus-Expressionssystemen. Von Säugerspezies abgeleitete Zellinien, welche·geeignet sein mögen und im Handel erhältlich sind, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), CHO-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C1271 (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26) und MRC-5 (ATCC CCL 171).
Ein in Hefe aktiver Promotor initiiert die Transkription des PDI-Gens in Hefewirten. Deshalb ist es für Fachleute auf dem Gebiet unschwer ersichtlich, daß irgendeine in Hefe aktive Promotorsequenz verwendet werden kann, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, GAL1, GAL10, GAL7, PGK1, ADH1, ADH2, PHO5, und GAP491 (TDH3). Es ist auch für Fachleute auf dem Gebiet unschwer ersichtlich, daß ein geeignetes Assay-System, z. B. ein Immunoblot oder ein RIA oder enzym-gekoppelter Immunoassay (EIA), eingesetzt werden kann, um die Expression von PDI in rekombinanten Wirten nachzuweisen.
S. cerevisiae besitzt 5 Gene, die für die Enzyme kodieren, welche für die Verwertung von Galactose als Kohlenstoffquelle für das Wachstum verantwortlich sind. Die GAL1- GAL2- GAL5- GAL7- bzw. GAL10-Gene kodieren für Galactokinase, Galactosepermease, das Haupt-Isoenzym von Phosphoglucomutase, α-D-Galactose-1-phosphat-uridyltransferase und Uridindiphosphogalactose-4-epimerase. In Abwesenheit von Galactose wird sehr wenig Expression dieser Enzyme nachgewiesen. Wenn Zellen auf Glucose gezüchtet werden und dann Galactose der Kultur zugesetzt wird, werden diese drei Enzyme auf der Ebene der RNA-Transkription um mindestens das 1000fache (mit Ausnahme von GAL5, welches etwa Sfach induziert wird) koordiniert induziert. Die GAL1-, GAL5-, GAL7- und GAL10-Gene wurden molekular kloniert und sequenziert. Die regulatorischen Sequenzen und Promotorsequenzen auf den 5'-Seiten der jeweiligen kodierenden Bereiche wurden neben die kodierenden Bereiche des IacZ-Gens plaziert. Diese Experimente definierten diejenigen Promotorsequenzen und regulatorischen Sequenzen, welche für die Galactoseinduktion erforderlich und ausreichend sind.
S. cerevisiae weist auch 3 Gene auf, von denen jedes für ein Isoenzym von ADH kodiert. Eines dieser Enzyme, ADHII, ist für die Fähigkeit von S. cerevisiae zur Verwertung von Ethanol als Kohlenstoffquelle während des oxidativen Wachstums verantwortlich. Die Expression des ADH2-Gens, welches für das ADHII-Isoenzym kodiert, wird durch Glucose katabolisch reprimiert, so daß es praktisch keine Transkription des ADH2-Gens während des fermentativen Wachstums in Gegenwart von Glucosespiegeln von 0,1% (Gew./Vol.) gibt. Nach Glucoseverarmung und in Gegenwart von nicht-reprimierenden Kohlenstoffquellen wird die Transkription des ADH2-Gens um das 100 bis 1000fache induziert. Dieses Gen wurde molekular kloniert und sequenziert und diejenigen regulatorischen Sequenzen und Promotorsequenzen, welche für die Derepression der Transkription erforderlich und ausreichend sind, wurden definiert.
Alpha-Mating-Faktor ist ein Sexualpheromon von S. cerevisiae, welches für das Mating zwischen MATα- und MATa-Zellen erforderlich ist. Dieses Tridecapeptid wird als ein Präpropheromon exprimiert, welches zum rauhen endoplasmatischen Retikulum dirigiert, glycosyliert und proteolytisch in seine endgültige reife Form prozessiert wird, welche von den Zellen sekretiert wird. Dieser biochemische Weg wurde als Expressionsstrategie für fremde Polypeptide ausgenutzt. Das Alpha-Mating-Faktor-Gen wurde molekular kloniert und dessen Promotor mit der Präpro-Leadersequenz wurde dazu genutzt, eine Vielfalt von Polypeptiden zu exprimieren und zu sekretieren. Gleichermaßen wurde gezeigt, daß der PHO5-Gen- Promotor durch niedrige Phosphatkonzentrationen induzierbar ist, und dieser ist ebenfalls für die physiologisch regulierte Expression fremder Proteine in Hefe einsetzbar.
Der Alpha-Mating-Faktor-Promotor ist nur in Zellen aktiv, welche phänotypisch α sind. Es gibt vier genetische Loci in S. cerevisiae, bekannt als SIR, welche Proteine synthetisieren, die für die Repression anderer, normalerweise stiller, Kopien von a- und α-Information erforderlich sind. Temperatursensitive (ts) Läsionen, welche diesen Repressionsvorgang stören, liegen im Genprodukt von mindestens einem dieser Loci vor. Bei dieser Mutante verhindert das Wachstum bei 35ºC die Repression, was zu phänotypischen a/α-Zellen führt, in denen der Alpha-Mating-Faktor-Promotor inaktiv ist. Nach Temperaturverschiebung auf 23ºC kehren die Zellen phänotypisch zu α zurück, so daß der Promotor aktiv wird. Die Verwendung von Stämmen mit einer ts-SIR-Läsion wurde für die kontrollierte Expression mehrerer fremder Polypeptide demonstriert.
Für Fachleute auf dem Gebiet ist unschwer ersichtlich, daß die Auswahl eines geeigneten Hefestamms zur Expression von PDI eine breite Vielfalt von Kandidaten umfaßt. Geeignete Hefestämme schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, diejenigen mit genetischen und phänotypischen Charakteristiken wie Proteasedefekten und veränderten Glycosylierungsvermögen.
Die Gattung Saccharomyces besteht aus einer Vielfalt von Spezies. S. cerevisiae wird am häufigsten als Wirt für die durch rekombinante DNA vermittelte Expression einer Vielfalt fremder Polypeptide eingesetzt. Jedoch sind die Unterschiede zwischen anderen Spezies der Gattung Saccharomyces nicht immer gut definiert. Viele dieser Spezies sind zur Kreuzung mit S. cerevisiae geeignet und es ist wahrscheinlich, daß sie Promotoren besitzen, welche zu Promotoren in S. cerevisiae analog oder damit identisch sind. Deshalb wird es für Fachleute auf dem Gebiet unschwer ersichtlich sein, daß die Auswahl eines Wirtsstammes für die Expression von PDI andere Spezies der Gattung Saccharomyces miteinbezieht, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, carlsbergensis, diastaticus, elongisporus, kluyveri, montanus, norbensis, oviformis, rouxii und uvarum.
Von mehreren Hefegattungen, wie z. B. Candida, Hansenula, Pichia und Torulopsis, wurde gezeigt, daß sie ähnliche Stoffwechselwege für die Verwertung von Methanol als einziger Kohlenstoffquelle für das Wachstum enthalten. Das Gen für Alkoholoxidase, ein Enzym, welches an diesem Stoffwechselweg beteiligt ist, wurde aus Pichia astoris isoliert. Der Alkoholoxidase-Promotor von P. pastoris wurde isoliert und von ihm gezeigt, daß er auf eine Methanolinduktion der Expression anspricht. Ein solcher induzierbarer Promotor ist für die Expression von Polypeptiden in Hefe von Nutzeh. Insbesondere wurde gezeigt, daß dieser Promotor auf einem Plasmid für die induzierbare Expression heterologer Gene in P. astoris aktiv ist. Diese Beobachtung unterstreicht die Verfügbarkeit anderer Hefegattungen für die Funktion als Wirte für die durch rekombinante DNA vermittelte Expression von Polypeptiden in aktiver Form. Deshalb wird es für Fachleute auf dem Gebiet unschwer ersichtlich sein, daß die Auswahl eines Wirtsstammes für die Expression von PDI Spezies aus anderen Hefegattungen der Familien Sacharomycetaceae und Crvptococcaceae, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Candidä, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyceopsis und Torulogsis, miteinbezieht.
Der Expressionsvektor kann in Wirtszellen mittels irgendeiner aus einer Vielzahl von Techniken eingeführt werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Transformation, Transfektion, Protoplastenfusion und Elektroporation. Die Zellen, welche Expressionsvektor enthalten, werden klonal vermehrt und individuell analysiert, um festzustellen, ob sie PDI- Protein produzieren. Die Identifizierung von PDI-exprimierenden Wirtszellklonen kann auf verschiedene Weise erfolgen, einschließlich der, jedoch nicht beschränkt auf die, immunologische(n) Reaktivität mit Anti-PDI-Antikörpern und Anwesenheit von wirtszell-assoziierter PDI-Aktivität.
Die Expression von PDI-DNA kann auch mit Hilfe von in vitro produzierter synthetischer mRNA durchgeführt werden. Synthetische mRNA kann sowohl effizient in verschiedenen zellfreien Systemen translatiert werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Weizenkeimextrakte oder Retikulozyten-Extrakte, als auch effizient in Systemen auf Zellbasis translatiert werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Mikroinjektion in Frosch-Oozyten.
Es ist für Fachleute unschwer ersichtlich, daß PDI in einem rekombinanten Wirt von einer rekombinanten Expressionskassette exprimiert werden kann, welche in das Wirtszellgenom in einer einzigen Kopie oder mehreren Kopien pro Zelle integriert ist. Es ist für Fachleuteauch unschwer ersichtlich, daß PDI von einer rekombinanten Expressionskassette, die auf einem autonom replizierenden Plasmid in einer einzigen Kopie oder in mehreren Kopien pro Zelle vorliegt, in einem rekombinanten Wirt exprimiert werden kann.
De rekombinante Wirtszelle, welche rekombinante PDI exprimiert, kann wiederum als Wirt zur Expression anderer rekombinanter Gene eingesetzt werden. Das neue Verfahren der vorliegenden Erfindung verbessert wesentlich die Ausbeute an rekombinanten disulfidgebundenen Proteinen durch Expression der DNA, welche für die rekombinanten disulfidgebundenen Proteine kodiert, in einer Wirtszelle, welche rekombinantes PDI produziert. Es ist für Fachleute unschwer ersichtlich, daß eine Vielfalt von disulfid-gebundenen Proteinen mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt werden kann. Die disulfid-gebundenen Proteine umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Proteine, welche sekretiert werden oder zellassoziiert bleiben. Rekombinante DNA-Konstrukte zur Expression von rekombinanten disulfid-gebundenen Proteinen können nach den Verfahren hergestellt werden, die oben für PDI ausführlich beschrieben wurden. Es ist für Fachleute unschwer ersichtlich, daß die DNA, welche für die rekombinanten disulfid-gebundenen Proteine kodiert, von einer rekombinanten Expressionskassette exprimiert werden kann, welche in einer einzigen Kopie oder mehreren Kopien pro Zelle in das Wirtszellgenom integriert ist. Es ist für Fachleute auf dem Gebiet auch unschwer ersichtlich, daß DNA, welche für das rekombinante disulfid-gebundene Protein kodiert, von einer rekombinanten Expressionskassette exprimiert werden kann, welche auf einem autonom replizierenden Plasmid in einer einzigen Kopie oder mehreren Kopien pro Zelle vorliegt. Darüber hinaus ist es für Fachleute auf dem Gebiet unschwer ersichtlich, daß die DNA, welche für PDI kodiert, und die DNA, welche für die rekombinanten disulfid-gebundenen Proteine kodiert, auf demselben Plasmid in einer einzigen Kopie oder mehreren Kopien pro Zelle vorliegen können. Ferner ist es für Fachleute auf dem Gebiet unschwer ersichtlich, daß zwei oder mehr disulfid-gebundene Proteine von entweder integrierten oder von einem Plasmid beherbergten Kassetten oder einer Kombination davon zusammen exprimiert werden können.
Nach der Expression von PDI in einer rekombinanten Wirtszelle kann das PDI-Protein gewonnen werden, um gereinigtes PDI in aktiver Form, imstande, die Bildung von Disulfidbindungen in Proteinen zu katalysieren, bereitzustellen. Es stehen mehrere Verfahren zur Reinigung von PDI zur Verfügung und sind zur Anwendung geeignet. Wie oben für die Reinigung von PDI aus natürlichen Quellen beschrieben, kann rekombinante PDI aus Zellysaten und -extrakten oder aus konditionierten Kulturmedium durch verschiedene Kombinationen oder individuelle Anwendung von Salzfraktionierung, Ionenaustauschchromatographie, Größenausschlußchromatographie, Hydroxylapatit-Adsorptionschromatographie und hydrophober Interaktionschromatographie gereinigt werden.
Ferner kann rekombinante PDI von anderen zellulären Proteinen mit Hilfe einer Immunaffinitätssäule abgetrennt werden, die mit monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern mit Spezifität für PDI hergestellt wurde.
Monospezifische Antikörper gegen PDI werden aus Säuger-Antiseren gereinigt, welche mit PDi reaktive Antikörper enthalten, oder werden als monoklonale, mit PDI reaktive Antikörper unter Verwendung der Technik von Kohler und Milstein, Nature 256: 495-497 (1975), hergestellt. Ein monospezifischer Antikörper, wie hier verwendet, ist definiert als eine einzelne Antikörper-Spezies oder multiple Antikörper-Spezies mit homogenen Bindungseigenschaften für PDI. Homogene Bindung, wie hier verwendet, bezieht sich auf die Fähigkeit der Antikörper-Spezies zur Bindung an ein spezifisches Antigen oder Epitop, wie z. B. diejenigen, welche mit PDI assoziiert sind, wie oben beschrieben. Enzymspezifische Antikörper werden induziert durch Immunisierung von Tieren wie Mäusen, Ratten, Meerschweinchen, Kaninchen, Ziegen, Pferden und dgl., wobei Kaninchen bevorzugt sind, mit einer geeigneten Konzentration von PDI mit oder ohne Immunadjuvans.
Vorimmunserum wird vor der ersten Immunisierung gewonnen. Jedes Tier erhält zwischen etwa 0,1 mg und etwa 1000 mg PDI, assoziiert mit einem annehmbaren Immunadjuvans. Solche annehmbaren Adjuvanzien umfassen, sirid jedoch nicht beschränkt auf, vollständiges Freund-Adjuvans, unvollständiges Freund-Adjuvans, Alaun-Präzipitat, Wasser-in-Öl-Emulsion, die Corynebacterium parvum und tRNA enthält. Die erste Immunisierung besteht aus dem Enzym in, vorzugsweise, vollständigem Freund-Adjuvans an mehreren Stellen, entweder subkutan (SC), intraperitoneal (IP) oder beides. Jedem Tier wird in regelmäßigen Abständen, vorzugsweise wöchentlich, Blut entnommen, um Antikörpertiter zu bestimmen. Die Tiere können nach der ersten Immunisierung Booster-Injektionen erhalten oder nicht. Diejenigen Tiere, welche Booster-Injektionen erhalten, bekommen gewöhnlich eine gleiche Menge des Enzyms in unvollständigem Freund-Adjuvans auf dem gleichen Weg. Booster- Injektionen werden in etwa dreiwöchigen Intervallen gegeben, bis maximale Titer erhalten werden. Nach etwa 7 Tagen nach jeder Booster-Immunisierung oder etwa wöchentlich nach einer Einzelimmunisierung wird den Tieren Blut entnommen, das Serum gewonnen und Aliquots bei etwa -20ºC gelagert.
Monoklonale Antikörper (mAb), die mit PDI reagieren können, werden durch Immunisierung von Inzucht-Mäusen, vorzugsweise Balblc, mit PDI hergestellt. Die Mäuse werden auf dem IP- oder SC-Weg mit etwa 0,1 mg bis etwa 10 mg, vorzugsweise etwa 1 mg, PDI in etwa 0,5 ml Puffer oder Salzlösung, inkorporiert in einem gleichen Volumen eines annehmbaren Adjuvans wie oben erörtert, immunisiert. Vollständiges Freund-Adjuvans ist bevorzugt. Die Mäuse erhalten eine erste Immunisierung am Tag 0 und etwa 3 bis etwa 30 Wochen Ruhe. Die immunisierten Mäuse erhalten eine oder mehrere Booster-Immunisierung(en) von etwa 0,1 bis etwa 10 mg PDI in einer Pufferlösung wie phosphatgepufferter Salzlösung auf dem intravenösen (IV) Weg. Lymphozyten aus antikörper-positiven Mäusen, vorzugsweise Milz- Lymphozyten, werden durch Entfernung der Milz aus immunisierten Mäusen nach auf diesem Gebiet bekannten Standardverfahren erhalten. Hybridomzellen werden erzeugt, durch Mischen der Milz-Lymphozyten mit einem geeigneten Fusionspartner, vorzugsweise Myelomzellen, unter Bedingungen, welche die Bildung stabiler Hybridome erlauben. Fusionspartner können umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf: Maus-Myelome P3/NS1/Ag 4-1; MPC-11; S-194 und Sp 2/0, wobei Sp 2/0 bevorzugt sind. Die antikörper-produzierenden Zellen und Myelomzellen werden in Polyethylenglycol mit einem Molekulargewicht von etwa 1000 bei Konzentrationen von etwa 30% bis etwa 50% fusioniert. Die fusionierten Hybridomzellen werden durch Wachstum in mit Hypoxanthin, Thymidin und Aminopterin ergänztem Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) nach im Stand der Technik bekannten Verfahren selektioniert. Überstandsflüssigkeiten werden aus Vertiefungen mit positivem Wachstum etwa an den Tagen 14, 18 und 21 gewönnen und durch einen Immunoassay, wie z. B. Festphasen-Immunoradioassay (SPIRA), unter Verwendung von PDI als Antigen auf Antikörperproduktion gescreent. Die Kulturflüssigkeiten werden auch in dem Ouchterlony- Präzipitationsassay getestet, um den Isotyp der mAb zu bestimmen. Hybridomzellen aus antikörper-positiven Vertiefungen werden nach einer Technik wie der Soft-Agar-Technik von MacPherson, Soft Agar Techniques, in Tissue Culture Methods and Applications, Kruse und Paterson, Hrsg., Academic Press, 1973, kloniert.
Monoklonale Antikörper werden in vivo produziert, indem Pristan-geprimten Balb/c-Mäusen, etwa 0,5 ml pro Maus, etwa 2 · 10&sup6; bis etwa 6 · 10&sup6; Hybridomzellen etwa 4 Tage nach dem Primen injiziert werden. Ascites-Flüssigkeit wird etwa 8-12 Tage nach dem Zelltransfer gewonnen und die monoklonalen Antikörper werden durch im Stand der Technik bekannte Verfahren gereinigt.
Die in vitro-Produktion von mAb erfolgt durch Züchtung der Hybridome in DMEM mit etwa 2 % fetalem Kalbsserum, um ausreichende Mengen der spezifischen mAb zu erhalten. Die mAb werden nach im Stand der Technik bekannten Verfahren gereinigt.
Die Antikörpertiter von Ascites- oder Hybridomkultur-Flüssigkeiten werden durch verschiedene serologische oder immunologische Assays bestimmt, welche umfassen, jedoch nicht beschränkt sind auf, Präzipitation, passive Agglutination, enzym-gekoppelte Immunosorbens-Antikörper (ELISA)-Technik und Radioimmunoassay (RIA)-Techniken. Ähnliche Assays werden eingesetzt, um die Anwesenheit von PDI in Körperflüssigkeiten oder Gewebe und Zellextrakten nachzuweisen.
Für Fachleute ist ohne weiteres ersichtlich, daß die oben beschriebenen Verfahren zur Herstellung monospezifischer Antikörper eingesetzt werden können, um Antikörper herzustellen, die für PDI-Polypeptidfragmente oder PDI-Polypeptid vollständiger Länge spezifisch sind.
PDI-Antikörper-Affinitätssäulen werden hergestellt durch Zugabe der Antikörper zu Affigel-10 (Biorad), einem Gelträger, der mit N-Hydroxysuccinimidester voraktiviert ist, so daß die Antikörper kovalente Verknüpfungen mit dem Agarosegelperlen-Träger bilden. Die Antikörper werden dann an das Gel über Amidbindungen mit dem Spacer-Arm gekoppelt. Die verbleibenden aktivierten Ester werden dann mit 1 M Ethanolamin-HCl (pH 8) gequericht. Die Säule wird mit Wasser, gefolgt von 0,23 M Glycin HCl (pH 2,6), gewaschen, um jeglichen nicht-konjugierten Antikörper oder Fremdprotein zu entfernen. Die Säule wird dann in phosphatgepufferter Salzlösung (pH 7,3) äquilibriert und die Zellkulturüberstände oder Zellextrakte, die PDI enthalten, werden langsam durch die Säule geleitet. Die Säule wird dann mit phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen, bis die optische Dichte (A&sub2;&sub8;&sub0;) bis zum Hintergrund abnimmt, dann das Protein mit 0,23 M Glycin-HCl (pH 2,6) eluiert. Das gereinigte PDI-Protein wird dann gegen phosphatgepufferte Salzlösung dialysiert.
Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung, ohne diese jedoch darauf zu beschränken.

BEISPIEL 1

Stämme und Wachstumsbedingungen

Die Saccharomyces cerevisiae-Stämme MD40/4C (MATα, leu2-3-112, ura2, his3-11, -15, trp1) und A53324 (MATα/MAT"a" his3/his3, leu2/leu2, ura3/ura3, trp1/trp1) wurden bei 30ºC in entweder YEPD (1% Bactopepton, 1% Hefeextrakt, 2% Glucose) oder einem gepufferten Minimalmedium (0,67% Hefe-Stickstoff-Base ohne Aminosäuren, 2% Glucose, 1% Succinsäure, 0,6% NaOH, 50 ug/ml Mesoinosit) von pH 5,8, ergänzt mit dem erforderlichen Basen- und Aminosäurebedarf, gezüchtet.
Die S. cerevisiae-Stämme JRY188 (MATα, sir3-8, leu2-112, trp1, ura3-52, his4; Brake, A. J. et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, S. 4642-4646) und BJ1995 (MATα, leu2, trp1, ura3-52, prb1-1122, pep4-3, gal2; Jones, E. W., 1991, Methods Enzymol., 194, S. 428-453) wurden zur Beurteilung der PDI-Überexpression eingesetzt und wie in den entsprechenden Beispielen beschrieben gezüchtet.
Der Escherichia coli-Stamm DH5α (supE44ΔlacU169 (Φ80lacZΔM15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1) wurden für Plasmid-Screening-Manipulationen eingesetzt.

BEISPIEL 2

DNA-Manipulation

Restriktionsendonuklease-Verdauungen und DNA-Ligierungen wurden wie von den Enzym- Herstellern (BCL, BRL) empfohlen durchgeführt. Standardprotokolle für die E. coli- Transformation (Cohen et al., 1972, PNAS USA, 69, 3.2110-9) und S. cerevisiae-Transformation (Beggs, 1978, Nature, 275, S. 104-9; lto et al., 1983, J. Bacteriol., 153, S. 163-8) wurden durchgeführt. Genomische DNA wurde aus S. cerevisiae nach dem Verfahren von Holm et al. (1986, Gene, 42, S. 169-173) hergestellt.

BEISPIEL 3

Isolierung des PDI1-Gens

Eine genomische-Hefebank, enthaltend partielle Sau3A-Fragmente von DNA aus dem S. cerevisiae-Stamm SKQ2n [α/a ade1/+ ade2/+ his1/+; Gasion et al., oben], kloniert in die BamHI-Stelle des Leu2-d Vektors pMA3a auf 2-u-Basis mit einer hohen Kopienzahl (Crouzet und Tuite, 1987, oben), wurde zum Screenen hinsichtlich des PDI1-Gens eingesetzt. Ein 30- mer-Oligonukleotid (5'CTTAGAGTGACCACACCATGGAGCGTAGAA 3') (SEQ-ID-Nr. 5) wurde für die hochkonservierte "thioredoxin-ähnliche" aktive Stelle (FYAPWCGHCK) (SEQ- ID-Nr. 4), jedoch unter Verwendung einer Hefe-Codonbevorzugung (Sharp et al., 1986, oben) synthetisiert.
Zum Screenen der Bank wurden 50 ng des Oligonukleotids mit [γ-³²P]dATP [Amersham, 3000 Ci/mMol] und T4-Polynukleotidkinase endmarkiert, wobei DE-52-Chromatographie eingesetzt wurde, um das markierte Oligonukleotid von nicht-inkorporierten Nukleotiden zu trennen. Etwa 20.000 rekombinante DH5α-Kolonien wurden auf Nitrocellulosefiltern mittels Koloniehybridisierung wie folgt gescreent: jeder Nitrocellulosefilter wurde 16 Stunden lang bei 37ºC in 35% Formamid, 6 · SSC, 1 · Denhardts Lösung, 250 ug/ml denaturierter Lachssperma-DNA, 0,1% SDS, vorhybridisiert. Das markierte Oligonukleotid (spezifische Aktivität 4,8 · 10&sup9; dpm/ug) wurde 3 Minuten lang bei 90ºC denaturiert und dann auf 2 ng/ml in Vorhybridisierungspuffer verdünnt und den Filtern zugegeben. Nach Inkubation bei 37ºC für weitere 16 Stunden wurden die Filter entfernt und 2 Minuten lang in 4 · SSC, 0,1% SDS gespült. Die Filter wurden dann über Nacht einer Autoradiographie unterzogen.
39 potentiell positive Klone wurden identifiziert und durch zwei weitere Screening-Durchgänge wie oben beschrieben geschickt, wonach 10 positive Klone (als C1 bis C10 bezeichnet) erhalten wurden. Zwei dieser Klone (C7 und C10) wurden restriktionskartiert und der Klon C7 wurde für weitere Studien ausgewählt.

BEISPIEL 4

DNÄ-Seauenzanalyse

Zur Identifizierung eines Fragments geeigneter Größe für die Sequenzierung wurde der Klon C7 mit einem Spektrum von Restriktionsenzymen verdaut und die Fragmente auf einem 1 %igen Agarosegel aufgetrennt und auf eine Genescreen Plus Membran (DuPont) mit Hilfe eines Vakuum-Blot-Vorrichtung (Hybaid Ltd.) überführt. Der Filter wurde dann im wesentlichen wie von Maniatis et al., 1982, oben, beschrieben vorhybridisiert, gefolgt von der Zugabe der 30-mer-Oligonukleotid-Sonde, endmarkiert und denaturiert wie oben beschrieben. Die Hybridisierung erfolgte in 6 · SSC für 24 Stunden bei 43ºC, gefolgt von zwei Waschschritten in 200 ml 2 · SSC für fünf Minuten bei Raumtemperatur, zwei Waschschritten in 200 ml 2 · SSC, 0,1% SDS, für 1 Stunde bei 65ºC und einem letzten Waschschritt in 500 ml 0,1 · SSC bei Raumtemperatur. Der Filter wurde dann einer Autoradiographie bei -70ºC für 48 Stunden unterworfen.
Ein 2,4-kb-HincII-EcoRI-Fragment des Klons C7 wurde mit Hilfe des Didesoxykettenabbruchverfahrens (Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-67) vollständig sequenziert. Geeignete Restriktionsfragmente für die Sequenzierung wurden in pUC19 subkloniert und Plasmid-DNA unter Verwendung des Schnellverfahrens von Holmes und Quigley (1981, Anal. Biochem., S. 193-7) für die Sequenzierung präpariert. Darüber hinaus wurden einige Fragmente in die einzelsträngigen Vektoren mp12 oder mp13 (Messing, 1983, Methods Enzymol., 101, S. 20-78) kloniert. Ein Spektrum von Sequenzierungsprimern (15- 18-mere) wurden synthetisiert, welche entweder mit den Polylinker-Regionen der Klonierungsvektoren oder zuvor abgeleiteten internen C7-DNA-Sequenzen verschmolzen. Plasmid-DNA wurde vor der Primerverschmelzung in 0,2 M NaOH, 2 mM EDTA, 30 Minuten lang bei 37ºC denaturiert, durch die Zugabe von 0,1 Vol. 3 M Natriumacetat, pH 5,0, neutralisiert und mit 3 Vol. 95%igem Ethanol bei -70ºC für 15 Minuten gefällt. T7-DNA-Polymerase (Sequenase, US Biochemicals) wurde gemäß den Instruktionen des Herstellers für die in vitro-Kettenverlängerung eingesetzt, wobei [α-³²P]dATP (3000 Ci/mMol; ICN) zur Markierung eingesetzt wurde. Die Reaktionen wurden analysiert wie zuvor beschrieben (Bossier et al., 1989, Gene, 78, S. 323-30).

BEISPIEL 5

Präparation und Analyse von RNA

Gesamt-RNA wurde aus exponentiell wachsenden Zellen (5 · 10&sup6;-1 · 10&sup7; Zellen/ml) oder Zellen in der stationären Phase (2 · 10&sup8; Zellen/ml) des Stammes MD40/4c hergestellt. RNA wurde auch aus exponentiell wachsenden Zellen von MD40/4c extrahiert, die einem 30- minütigen Hitzeschock (30ºC bis 42ºC) unterworfen worden waren. Gesamt-RNA wurde im wesentlichen wie von Dobson et al. (1983, Nucleic Acids Res., 11, 2287-2302) beschrieben extrahiert.
Eine Northernblot-Analyse wurde wie folgt durchgeführt. 20 ug Gesamt-RNA wurden in 20% Formaldehyd, 50% entionisiertem Formamid durch Erwärmung bei 55ºC für 15 Minuten denaturiert und dann in einem 1%igen Agarosegel, das 8% Formaldehyd enthielt, aufgetrennt. Die RNA wurde auf ein Nitrocellulosefilter (S&S. BA85) durch Vakuum-Blotting überführt und der Filter in 10 mM Tris-HCl für 5 Minutengekocht. Die Hybridisierung wurde über Nacht bei 42ºC in 10 · Denhardts Lösung, 2 · SSC, 50 mM Phosphatpuffer, pH 6,5, 40% Formamid, 0,1% SDS, 400 ug/ml hitze-denaturierter Lachssperma-DNA und 1-5 ng/ml der Sonde durchgeführt. Die Filter wurden einer Autoradiographie für 1-5 Tage bei -70ºC unterworfen. Die verwendeten Sonden waren: ein 0,8-kB-HindIII-StuI-Fragment aus dem PDI1- Gen (Farquhar, R., et al., oben, siehe Fig. 2) und das Plasmid Scp7, welches einen Teil der ribosomalen 18S- und 25S-RNA-Gene von S. cerevisiae, kloniert in pBR322, enthielt (erhalten von Dr. B. S. Cox, University of Oxford). Die Sonden wurden durch statistische Primer-Markierung (BCL) nach den Anweisungen des Herstellers markiert.

BEISPIEL 6

Konstruktion eines pdi1::HIS3-Allels

Ein 1,8-kb-BamHI-Fragment, welches das HIS3-Gen trug, wurde aus dem Plasmid pMA700 (Montiel et al., 1984, oben) freigesetzt und auf 1%iger Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (Sigma) gereinigt. Die kohäsiven BamHI-Enden des Fragments wurden unter Verwendung von dNTPs und des Klenow-Fragments von DNA-Polymerase I wie von Maniatis et al., 1982, oben, beschrieben aufgefüllt. Ein 1,2-kb-DraI-BgIII-Fragment des PDI1-Gens wurde dann in die SmaI-BamHI-Stellen innerhalb des Polylinkers des Plasmids pUC19 subkloniert. Schließlich wurde das aufgefüllte BamHI-Fragment, welches das HIS3-Gen enthielt, in eine nur einmal vorkommende EcoRV-Stelle innerhalb des PDI1-kodierenden Bereichs ligiert (Fig. 3). Das resultierende pdi1::HIS3-Allel wurde auf einem 3,0-kb-SaII-EcoRI-Fragment freigesetzt, auf niedrig schmelzender Agarose gereinigt und zur Transformation des diploiden Stammes AS3324 zu His&spplus;-Prototrophie unter Anwendung des Lithiumacetat-Transformationsprotokolls von Ito et al., (1983, oben) verwendet.

BEISPIEL 7

In vitro-PDI-Assay

Der Assay hinsichtlich PDI-Aktivität in Gesamtproteinextrakten war wie von Hillson et al. (1984, Methods Enzymol., 107, S. 281-92) beschrieben.

Vorbereitung von Substrat

Gemischte Ribonuklease ("scrambled ribonuclease") ist eine vollständig oxidierte Mischung, die statistisch gebildete Disulfidbindungen enthält. Sie wird aus im Handel erhältlicher (Sigma) Rinderpankreas-Ribonuklease A nach dem folgenden Verfahren präpariert.
Inkubation von Ribonuklease mit 30 mg/ml (etwa 2,2 mM) in 50 mM TRIS-HCl-Puffer, pH 8,6, 8,9 M Harnstoff, 130 mM Dithiöthreit (etwa 15facher molarer Überschuß von Dithiothreit gegenüber reduzierbaren Disulfidbindungen), bei Umgebungstemperatur für 18 bis 20 Stunden oder bei 35ºC für eine Stunde.
Isolierung von reduziertem Protein durch Ansäuerung der Reaktionsmischung auf pH 4 mit Eisessig, gefolgt von unmittelbarer Elution von einer Säule von Sephadex G-25 mit entgaster 0,1 M Essigsäure. Überwachung der eluierten Fraktionen bei 280 nm, Vereinigung proteinhaltiger Fraktionen und Schätzung der Proteinkonzentration entweder spektralphotometrisch oder chemisch unter Verwendung von nativer Ribonuklease A als Standard.
Verdünnung der Probe von reduzierter Ribonuklease auf etwa 0,5 mg/ml mit 0,1 M Essigsäure. Zugabe von festem Harnstoff, um eine Endkonzentration von 10 M zu ergeben, und Sarcosin-Hydrochlorid auf 0,1 M (Sarcosin ist eingeschlossen, um mit Cyanationen zu reagieren, welche in konzentrierten Lösungen von Harnstoff vorliegen und Ribonuklease durch Carbamylierung inaktivieren können). Einstellung des pH-Werts auf 8,5 mit 1 M TRIS und Inkubation bei Umgebungstemperatur für 2 bis 3 Tage im Dunkeln, während welcher Zeit das Protein statistisch durch atmosphärischem Sauerstoff reoxidiert wird. Nach dieser Inkubation zeigt die Bestimmung freier Thiolgruppen unter Verwendung von 5,5'-Dithiobis(2- nitrobenzoesäure), daß die Reoxidation vollständig ist (weniger als 0,1 freies Thiol pro Ribonukleasemolekül).
Rückgewinnung des gemischten Produkts durch Ansäuerung auf pH 4 mit Eisessig und Elution von Sephadex G-25 in 0,1 M Essigsäure. Vereinigung der proteinhaltigen Fraktionen, Einstellung auf pH 8 mit 1 M TRIS und Lagerung bei 4ºC.
Die Ausbeute an gemischter Ribonuklease bei diesem Verfahren ist typischerweise 90-100 %. Das Produkt ist bei 4ºC in Lösung bis zu 6 Monaten stabil oder kann alternativ in 50 mM NH&sub4;HCO&sub3;, pH 7,8, dialysiert und dann lyophilisiert werden, was einen weißen flaumigen Feststoff ergibt, der unbegrenzt bei -20ºC gelagert werden kann.

Assay-Verfahren

Das Substrat, gemischte Ribonuklease, ist im wesentlichen inaktiv bei der hydrolytischen Spaltung von RNA mit hohem Molekulargewicht und hat etwa 2% der Aktivität von nativer Ribonuklease. Die Wirkung von PDI bei der Katalyse des Austauschs von inter- und intramolekularen Disulfiden in gemischter Ribonuklease führt zu einer Wiederherstellung der nativen Disulfidpaarung, nativen Konfirmation und begleitenden Rückkehr von Ribonuklease- Aktivität gegenüber RNA. So wird die Aktivität von PDI durch eine Zeitverlaufs-Inkubation untersucht, während der Aliquots entnommen und die Ribonuklease-Aktivität gegenüber RNA gemessen wird.
Die Probe von Proteindisulfidisomerase wird zu 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,5, auf ein Endvolumen von 900 ul zugegeben und mit 10&sup5; M Dithiothreit (10 ul einer 1 mM Stammlösung, täglich frisch hergestellt) 2 bis 3 Minuten lang bei 30ºC vorinkubiert. TRIS-HCl-Puffer ist auch annehmbar, ergibt jedoch etwa um 25% niedrigere Aktivitäten. Der Assay wird dann gestartet durch die Zugabe eines 100-ul-Aliquots gemischter Ribonuklease (0,5 mg/ml Stammlösung in 10 mM Essigsäure, täglich frisch hergestellt) und die Inkubationsmischung wird bei 30ºC gehalten. Für die Arbeit in einem kleineren Maßstab können die obigen Volumina um das Zehnfache verringert werden, um ein Assay-Endvolumen von 100 ul zu ergeben. Aliquots von 10 ul werden nach 0,5 Minuten und dann in 2-3 minütigen Intervallen bis zu 18 Minuten entnommen, um die Reaktivität der gemischten Ribonuklease zu untersuchen. Jedes Aliquot wird sofort einer Assay-Mischung von 3 ml TKM-Puffer (50 mM TRIS- HCl-Puffer, pH 7,5, 25 mM KCl, 5 mM MgCl&sub2;), enthaltend 0,25 mg hochpolymerisierter Hefe- RNA (50 ul einer Stammlösung von 5 mg/ml) in einer Quarzküvette, die zuvor bei 30ºC äquilibriert wurde, zugegeben. Die Ribonuklease-Aktivität wird bei 30ºC überwacht unter Verwendung des Zwei-Wellenlängen-Modus eines Perkin-Elmer 356 Spektralphotometers (Bandbreite 2,5 nm) und Messung der A&sub2;&sub6;&sub0;-Änderung bezogen auf A&sub2;&sub8;&sub0; (ΔA). Die Rate der RNA-Hydrolyse (ΔA min&supmin;¹) ist über 1,5 bis 2 Minuten konstant; ein Diagramm dieser Rate gegen die Zeit der Entnahme des Aliquots aus der Inkubation ist bis zu 15 Minuten linear. Der Gradient dieses linearen Anteils des Zeitverlaufs (ΔA min&supmin;¹ min&supmin;¹) wird durch lineare Regressionsanalyse von Assays in Dreifachbestimmung (mit einem routinemäßigen Korrelationskoeffizienten ≥ 0,99) berechnet und als Maß der Proteindisulfidisomerase- Aktivität genommen.
Kontrollinkubationen werden durchgeführt, indem die Enzymprobe weggelassen wird, um die Rate der nicht-enzymatischen Reaktivierung von gemischter Ribonuklease durch Dithiothreit allein zu messen. Diese Raten betragen gewöhnlich weniger als 0,2 · 10&supmin;³ ΔA min&supmin;¹ min&supmin;¹ und werden bei der Berechnung der Proteindisulfidisomerase-Aktivitäten von Enzymproben subtrahiert.
Eine Einheit der Proteindisulfidisomerase-Aktivität ist definiert als diejenige Menge, welche die Reaktivität von gemischter Ribonuklease mit einer Rate von einer Ribonukleaseeinheit pro Minute katalysiert; eine Ribonukleaseeinheit ist definiert als diejenige Menge, welche eine Veränderung von A&sub2;&sub6;&sub0; gegenüber A&sub2;&sub8;&sub0; von einer Extinktionseinheit pro Minute ergibt.

BEISPIEL 8

Konstruktion von Vektoren zur Integration von PDI-Expressionskassetten an Hefe-LYS2- oder -URA3-Loci

Ein Vektor wurde zur Integration an LYS2 nach dem folgenden Verfahren konstruiert. Das Plasmid pUC19 wurde mit HindIII verdaut und das lineare Vektorfragment wurde gelgereinigt. Dieses Fragment wurde dann mit EcoRI verdaut und das resultierende 2,7-kbp- EcoRI-HindIII-Vektorfragment wurde gelgereinigt. Das gereinigte Fragment wurde dann mit dem folgenden synthetischen Oligonukleotid:
ligiert, welches ein kohäsives EcoRI-Ende, eine NotI-Stelle, HindIII-Stelle, NotI-Stelle und ein kohäsives HindIII-Ende in dieser Reihenfolge enthält. Das resultierende Plasmid, pUC-Not, enthält eine nur einmal vorkommende HindIII-Stelle, welche auf beiden Seiten unmittelbar von NotI-Stellen flankiert wird.
Ein Plasmid zur zielgerichteten Integration von Expressionskassetten an dem URA3-Locus wurde wie unten beschrieben konstruiert. Die Quelle des Hefe-URA3-Gens war das 1,1-kbp- HindIII-Fragment aus YRp10 [Parent, S. A. et al., 1985, Yeast, 1, S. 83-138]. Das Plasmid pUC-Not wurde mit HindIII verdaut, mit alkalischer Kalbsdarmphosphatase dephosphoryliert und mit dem 1,1-kbp-HindIII-URA3-Fragment ligiert, was das Plasmid pUC-Not-URA3 ergab.
Ein Plasmid zur zielgerichteten Integration von Expressionskassetten in den LYS2-Locus wurde wie folgt konstruiert. Das Plasmid Ylp600 [Barnes, D. A. und Thorner, J., 1986, Mol. Cell. Biol 6, S. 2828-2838], welches das Hefe-LYS2-Gen trägt, wurde mit EcoRI plus HindIII verdaut und das EcoRI-HindIII-Fragment von 4,5 kbp, welches das LYS2-Gen trägt, wurde in pUC19 kloniert, welches zuvor mit EcoRI plus HindIII verdaut worden war, was pUKC171 ergab. Dieses Plasmid wurde dann mit PvuII plus BgIII verdaut und das 3,7-kbp-PvuII-BgII- Fragment, welches das LYS2-Gen trug, wurde gelgereinigt und glattendig gemacht. Das Plasmid pUC-Not wurde mit HindIII verdaut, mit alkalischer Kalbsdarmphosphatase dephosphoryliert, glattendig gemacht und dann mit dem 3,7-kbp-LYS2-Fragment ligiert. Das resultierende Plasmid mit dem erwarteten Aufbau wurde als pUC-Not-LYS2 bezeichnet (auch als pNL bezeichnet).
Ein zweiter Vektor für die Integration an LYS2 wurde ebenfalls konstruiert. Das Plasmid YIp600 wurde mit NcoI verdaut und das 3,0-kbp-NcoI-Fragment, welches einen Hauptteil der für das LYS2-Protein kodierenden Sequenz trug, wurde gelgereinigt und glattendig gemacht. Das Plasmid pUC13 wurde mit BamHI verdaut, glattendig gemacht und mit dem 3,0-kbp- LYS2-Fragment ligiert, was den Integrationsvektor pUC13-LYS2 ergab.

BEISPIEL 9

Konstruktion von Hefestämmen, welche Human-PDI, fusioniert mit der sekretorischen Leaderseauenz des Hefe-Alphafaktors, überproduzieren

Die Quelle der für Human-PDI kodierenden Sequenz waren die überlappenden partiellen cDNA-Klone p210 und p1, beschrieben von Pihlajaniemi et al. (1987, oben). Das 0,45-kbp- EcoRI-PstI-Fragment aus p210, welches den 5'-Terminus der Human-PDI-cDNA trägt, wurde in pUC18 subkloniert, was das Plasmid pUKC150 ergab. Das Plasmid pUKC150 wurde dann mit EcoRI plus AvaI verdaut (AvaI spaltet an der Position, die der dritten Aminosäure in der kodierenden Sequenz für reife Human-PDI entspricht). Das resultierende 3,1-kbp-Vektorgerüstfragment wurde gelgereinigt und mit einem Oligonukleotid-Adapter ligiert, welcher die folgende Struktur aufwies:
Dieser Adapter rekonstituiert das 5'-Ende der für reife PDI kodierenden Sequenz und enthält eine HindIII-Stelle in einer solchen Position, daß die präzise Fusion der reifen Human-PDI- Sequenz mit einer gewünschten sekretorischen Leadersequenz ermöglicht wird.
Das resultierende Plasmid, pUKC159, wurde dann mit PstI verdaut, mit alkalischer Kalbsdarmphosphatase behandelt und mit dem 1,5-kbp-PstI-PstI-Fragment aus dem Plasmid p1 (Pihlajaniemi et al., 1987, oben) ligiert, welches den Rest der für Human-PDI kodierenden Sequenz enthält, was das Plasmid pUKC160 ergab. Das Plasmid pUKC160 wurde dann mit HindIII verdaut (welches innerhalb des obengenannten Oligo-Adapters spaltet), gefolgt von Verdauung mit HindIII. Das resultierende 1,9-kbp-HindIII-HindIII-Fragment, welches die für reife Human-PDI kodierende Sequenz trägt, wurde gelgereinigt und in das Plasmid pGS4 subkloniert, welches zuvor mit StuI plus HindIII verdaut worden war (pGS4 trägt den Hefe- GAL1-Promotor, fusioniert mit der sekretorischen Präpro-Leadersequenz des Alpha-Mating- Faktors (MFα1); Shaw, .J. et al., 1988, DNA, 7, 117-126). Die zwischen den glattendigen StuI- und HindIII-Enden gebildete Verbindungsstelle rekonstruiert eine präzise Fusion im Leserahmen zwischen der MFα1-Präpro-Leadersequenz und dem reifen Teil von Human- PDI (das resultierende Plasmid wurde als pUKCl61 bezeichnet; Fig. 4).
Der an LYS2 integrierende Vektor pNL (pUC-NotI-LYS2) wurde mit StuI plus XhoI verdaut und durch Behandlung mit T4-DNA-Polymerase glattendig gemacht. Das Plasmid pUKC161 wurde mit EcoRI plus HindIII verdaut und das resultierende EcoRI-HindIII-Fragment von 2,8 kbp, welches die GAL10-Promotor - Alphafaktor-Präpro-Leadersequenz - Human-PDI-Expressionskassette trug, wurde gelgereinigt und durch Behandlung mit T4-DNA-Polymerase glattendig gemacht. Das obige glattendige pNL-Vektorfragment und dieses Expressionskassettenfragment wurden miteinander ligiert und die Ligierungsmischung zur Transformation des E. coli-Stammes ATCC 35691 eingesetzt. Transformanten wurden hinsichtlich derjenigen gescreent, welche ein Plasmid mit dem erwarteten Aufbau enthielten, und das resultierende Plasmid, pNL-MFα1-hPDI, wurde in großen Mengen hergestellt. Bei Verdauung mit NotI ergab pNL-MFα1-hPDI eine 6,2-kbp-Expressionskassette, die an jedem Ende vonv LYS2-DNA-Sequenzen flankiert war. Die verdaute DNA wurde zur Transformation der S. cerevisiae-Stämme BJ1995 und JRY188 mit Hilfe des Sphäroplasten-Verfahrens eingesetzt (Hinnen A. et al 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, S. 1929-1933). Als Zielvorrichtung wirkend, lenkten die NotI-Enden die Expressionskassette zu dem chromosomalen LYS2- Locus, wo die Kassette durch homologe Rekombination integrierte. Die Transformanten wurden hinsichtlich derjenigen gescreent, welche auf festen Medien wuchsen, die Alpha- Aminoadipinsäure enthielten (Chattoo, B. B. et al., 1979, Genetics, 93, S. 51; Barnes und Thorner, 1986, oben), wodurch angezeigt wurde, daß die Stämme lys sind. Eine Southernblat-Analyse der klonalen Isolate mit Hilfe einer LYS2-Sonde bestätigte, daß die Expressionskassette am LYS2-Locus integriert war. Chromosomale DNA-Präparationen, die mit BgII verdaut worden waren, zeigten die erwartete Größenverschiebung von 5,0 auf 7,8 kbp für die Bande, die mit der LYS2-Sonde hybridisierte. Die resultierenden, mit BJ1995 und JRY188 verwandten Stämme, welche die integrierte Expressionskassette enthielten, erhielten die Bezeichnung BJ1995/Alpha-hPDI bzw. JRY188/Alpha-hPDI (Stamm #1072A).

BEISPIEL 10

Konstruktion von Hefestämmen, welche Human-PDI überexprimieren, unter Verwendung der Hefe-PDI- oder Human-PDI-Signalseauenzen

Der PDI-cDNA-Klon p1 (Pihlajaniemi et al., 1987, oben) wurde mit PstI verdaut und das 1,5- kbp-PstI-PstI-Fragment, welches den 3'-Bereich der Human-PDI-cDNA trug, wurde geigereinigt. Dieses Fragment wurde dann in die PstI-Stelle von pUKC150 (in Beispiel 9 oben beschrieben) inseriert, was das Plasmid pUKC151 ergab, welches die intakte, vollständige Human-PDI-cDNA enthält. pUKC151 wurde mit HindIII verdaut und mit einem geeigneten Oligonukleotid-Adapter (enthaltend eine EcoRI-Erkennungssequenz) ligiert, um die am 3'- Ende der PDI-cDNA befindliche HindIII-Stelle in eine EcoRI-Stelle umzuwandeln. Das resultierende Plasmid, pUKC153, enthält die intakte, für Human-PDI kodierende Sequenz auf einem 2,1-kbp-EcoRI-Fragment. Das Plasmid pUKC153 wurde mit EcoRI plus PstI verdaut. Die resultierenden 0,47-kbp-EcoRI-PstI- und 1,7-kbp-PstI-EcoRI-Fragmente, welche die 5'- bzw. 3'-Abschnitte der Human-PDi-Sequenz trugen, wurden gelgereinigt. pUC19 wurde mit EcoRI plus PstI verdaut und das 2,7-kbp-Vektorfragment wurde gelgereinigt und dann mit dem vorgenannten 0,47-kbp-EcoRI-PstI-Fragment ligiert. Die Ligierungsmischung wurde zur Transformation von E. coli ATCC 35691 eingesetzt. Plasmid-DNA wurde aus Transformanten hergestellt, die ein Plasmid mit dem erwarteten Aufbau enthielten. Diese DNA wurde mit AvaI plus PstI verdaut und ein 0,38-kbp-Fragment, welches den 5'-Abschnitt der Human-PDI-Sequenz trug, wurde gelgereinigt.
pUC19 wurde mit EcoRI plus BamHI verdaut und das 2,7-kbp-Vektorfragment wurde gelgereinigt. Es wurden die folgenden Oligonukleotide synthetisiert:
Die Oligonukleotide #15165-220 und 15165-249 wurden mit Kinase behandelt und dann mit den Oligonukleotiden #15165-221 bzw. 15165-250 verschmolzen. Zur Rekonstruktion von Human-PDI mit der Human-PDI-Signalpeptidsequenz wurde die folgende Ligierung durchgeführt: das 2,7-kbp-BamHI-EcoRI-Fragment aus pUC19 wurde mit dem 1,7-kbp-PstI-EcoRI- hPDI-3'-Fragment, dem 0,38-kbp-PstI-AvaI-5'-hPDI-Fragment und den verschmolzenen Linkem 15165-220 plus 15165-221 ligiert.
Zur Rekonstruktion von Human-PDI mit der Hefe-PDI-Signalsequenz wurde die folgende Ligierungsmischung gebildet: das 2,7-kbp-BamHI-EcoRI-Fragment aus pUC19 wurde mit dem 1,7-kbp-PstI-EcoRI-hPDI-3'-Fragment, dem 0,38-kbp-PstI-AvaI-5'-hPDI-Fragment und den verschmolzenen Linkem 15165-249 plus 15165-250 ligiert. (Die verschmolzenen Linker enthalten kohäsive BamHI- und AvaI-Enden und kodieren für die angegebene Signalpeptidsequenz plus 5'-untranslatierte Hefe-Leadersequenz).
Mit den Ligierungsmischungen wurde E. coli ATCC 35691 transformiert und die Transformanten wurden hinsichtlich derjenigen gescreent, welche Plasmide mit dem erwarteten Aufbau enthielten. Die DNA-Sequenz über die Region, einschließlich der Oligonukleotid- Linker und der flankierenden DNA, wurde durch Didesoxysequenzierungsverfahren bestätigt. Die für Human-PDI kodierenden Sequenzen mit den Sequenzen, die entweder für Hefe-PDI- Signalpeptid oder Human-PDI-Signalpeptid kodierten, wurden als ySP-hPDI bzw. hSP-hPDI bezeichnet. Die beiden resultierenden Plasmide, welche diese Kassetten (pUC-ySP-hPDI [Fig. 5] bzw. pUC-hSP-hPDI) enthielten, wurden mit SmaI plus BamHI verdaut und die resultierenden 1,5-kbp-Fragmente, welche die hPDI-Kassetten trugen, wurden gelgereinigt und glattendig gemacht.
Das Plasmid p401 (welches den GAL10-Promotor und ADH1-Transkriptionsterminator, getrennt von einer einmal vorkommenden BamHI-Stelle, enthält; Fig. 6) wurde mit BamHI verdaut, glattendig gemacht und mit den vorgenannten Kassetten ligiert, um die Plasmide pGAL-ySP-hPDI bzw. pGAL-hSP-hPDI zu ergeben. Diese beiden Plasmide wurde mit SmaI, SphI und ScaI verdaut und die resultierenden 3,2-kbp-SmaI-SphI-Fragmente, welche die GAL10p-ySP-hPDI- und GAL10p-hSP-hPDI-Expressionskassetten trugen, wurden gelgereinigt, glattendig gemacht und dann in die XhoI-Stelle (glattendig gemacht) des an LYS2 integrierenden Vektors pUC&sub1;&sub3;-LYS2 inseriert. Die resultierenden Plasmide wurden als pLYS2-hSP-hPDI bzw. pLYS2-ySP-hPDI bezeichnet.
Für die integrative Transformation wurden die letzteren beiden Plasmide mit XbaI plus SacI verdaut, um lineare Fragmente mit flankierenden LYS2-Enden zu erzeugen, und die linearen Fragmente wurden zur Transformation der Hefestämme BJ1995 und JRY188 eingesetzt. Transformanten, welche die gewünschten Expressionskassetten an LYS2 integriert hatten, wurden durch Southernblots von genomischer DNA identifiziert, welche mit BgII verdaut und dann mit einer LYS2-Sonde hybridisiert worden war. Die resultierenden Stämme waren BJ1995/hSP-hPDI, BJ1995/ySP-hPDI, JRY188/hSP-hPDI (Stamm #1148) und JRY188/ySP- hPDI (Stamm #1157).

BEISPIEL 11

Konstruktion von Hefestämmen welche eine C-terminale HDEL-Mutante von Human-PDI überproduzieren, unter Verwendung des Human-PDI- oder Hefe-PDI-Signalpeptids

Hefeproteine, welche im endoplasmatischen Retikulum verbleiben, enthalten normalerweise eine C-terminale HDEL-Aminosäuresequenz, welche das Signal für die Retention im ER ist (Pelham et al., 1988, oben). Im Gegensatz dazu besitzt Human-PDI eine C-terminale KDEL- Sequenz (Pihlajaniemi et al., 1987, oben), von der bereits gezeigt wurde, daß sie für die ER- Retention in Hefe schlecht funktioniert (Lewis, M. J., et al., 1990, Cell, 61, S. 1359-1363). Deshalb war es erwünscht, eine modifizierte Human-PDI zu konstruieren, bei der das C- terminale KDEL zu HDEL verändert war. Dies wurde wie folgt erreicht.
Die beiden Plasmide pUC-ySP-hPDI und pUC-hSP-hPDI (Beispiel 9) wurden mit EcoRI und XhoI verdaut und das resultierende 4,0-kbp-EcoRI-XhoI-Fragment, enthaltend Vektorsequenzen plus den 5'-Abschnitt der hPDI-Sequenz, und ein 0,5-kbp-XhoI-XhoI-Fragment, enthaltend den mittleren Abschnitt der für hPDI kodierenden Sequenz, wurden gelgereinigt. Dann wurde der folgende Oligonukleotid-Adapter synthetisiert:
Nach dem Verschmelzen der beiden Oligomere wurde dieser Adapter mit XhoI verdaut (was nunmehr kohäsive EcoRI- und XhoI-Enden ergab) und in zwei separaten Reaktionen mit den EcoRI-XhoI-Vektorfragmenten von 4,0 kbp, enthaltend entweder die 5'-ySP-hPDI- oder die 5'-hSP-hPDI-Sequenzen, ligiert. Die resultierenden beiden Plasmide wurden dann mit XhoI verdaut und mit dem vorgenannten 0,5-kbp-XhoI-XhoI-Fragment, enthaltend den mittleren Abschnitt der für hPDI kodierenden Sequenz, ligiert, was die Plasmide pUC-ySP-hPDI (HDEL) bzw. pUC-hSP-hPDI(HDEL) ergab, in welche das XhoI-Fragment in der richtigen Orientierung inseriert war, um die für Human-PDI kodierende Sequenz zu rekonstruieren. Diese beiden Plasmide wurden dann mit BamHI verdaut und die beiden verschiedenen 1,5- kbp-BamHI-Fragmente, welche die Expressionskassetten trugen, wurden gelgereinigt und dann in die BamHI-Stelle von p401 inseriert, was pUC-GAL10p-ySP-hPDI(HDEL) bzw. pUC- GAL10p-hSP-hPDI(HDEL) ergab. Diese beiden Plasmide wurden dann mit SmaI, SphI und PvuI verdaut. Die resultierenden beiden 2,5-kbp-SmaI-SphI-Fragmente wurden gelgereinigt, glattendig gemacht und dann mit pUC13-LYS2 ligiert, welches zuvor mit XhoI verdaut und glattendig gemacht worden war. Die resultierenden beiden Plasmide, pLYS2-ySP-hPDI (HDEL) und pLYS2-hSP-hPDI(HDEL) wurden durch Verdauung mit HpaI plus EcoRV linearisiert und dann in separaten Reaktionen zur Transformation der Stämme BJ1995 und JRY188 eingesetzt. Lys&supmin;-Transformanten wurden auf festen Medien selektioniert, die Alpha- Aminoadipinsäure enthielten. Isolate, welche die gewünschte Expressionskassette am LYS2- Locus integriert enthielten, wurden durch Southernblot-Analyse von genomischer DNA identifiziert. Die resultierenden Stämme wurden als BJ1995/ySP-hPDI(HDEL), BJ1995/hSPhPDI(HDEL), JRY18/ySP-hPDI(HDEL) (Stamm #1268) und JRY18B/hSP-hPDI(HDEL) (Stamm #1267) bezeichnet.

BEISPIEL 12

Konstruktion von Hefestämmen, welche eine C-terminale HDEL-Mutante von Human-PDI überproduzieren, unter Verwendung der sekretorischen Hefe-Alphafaktor-Leaderseauenz

Das Plasmid pUKC161 (Fig. 4) wurde mit BamHI plus CIaI verdaut und das 0,7-kbp-BamHI- ClaI-Fragment, welches die Alphafaktor-Präpro-Leadersequenz und das 5'-Segment von hPDI trug, wurde gelgereinigt. Das Plasmid pUC-ySP-hPDI(HDEL) (in Beispiel 11 beschrieben) wurde mit CIaI und EcoRI verdaut und das 1,0-kbp-ClaI-EcoRI-Fragment, welches das 3'-Segment von hPDI mit der C-terminalen HDEL-Modifizierung trug, wurde gelgereinigt. pUC19 wurde mit BamHI plus EcoRI verdaut und das resultierende Vektorfragment wurde mit sowohl dem 0,7-kbp-BamHI-ClaI-Fragment als auch dem 1,0-kbp-CIaI-EcoRI-Fragment ligiert, um das Plasmid pUC-MFα1-hPDI(HDEL) zu ergeben. Dieses Plasmid wurde mit BamHI verdaut und das 1,7-kbp-BamHI-BamHI-Fragment, welches die PDI-Kassette trug, wurde gelgereinigt und in die BamHI-Stelle des Plasmids p401 inseriert (Fig. 6), was das Plasmid pGAL-MFα1-hPDI(HDEL) ergab. Dieses Plasmid wurden dann mit den Enzymen SmaI, SphI und PvuI verdaut und das resultierende 2,6-kbp-SmaI-SphI-Fragment, welches die Expressionskassette trug, wurde gelgereinigt und glattendig gemacht. Der pUC13-LYS2- Vektor wurde mit XhoI verdaut, glattendig gemacht und dann mit dem obigen glattendigen 2,6-kbp-Fragment ligiert. Das resultierende Plasmid, pLYS2-MFα1-hPDI(HDEL), wurde mit HpaI plus EcoRV verdaut und dann zur Transformation der Stämme JRY188 und BJ1995 eingesetzt. Die resultierenden Transformanten wurden mittels Southernblots von genomischer DNA (wie in Beispiel 9 beschrieben) beurteilt, um zu bestätigen, daß die gewünschte Expressionskassette am LYS2-Locus integriert war. Die JRY188-Transformante wurde als Stamm #1279 bezeichnet.

BEISPIEL 13

Konstruktion von Hefestämmen, welche das Hefe-PDI-Protein von einer integrierten Expressionskassette am LYS2-Locus überexprimieren

Das Plasmid C7 (in Beispiel 4 beschrieben), welches das vollständige Hefe-PDI1-Gen trägt, wurde mit EcoRV verdaut und das 1,3-kbp-EcoRV-EcoRV-Fragment, enthaltend den Cterminalen Abschnitt des offenen Leserahmens (ORF) von Hefe-PDI (von Aminosäure 223 bis zum Ende des ORF) plus die 3'-untranslatierte Sequenz, wurde gelgereinigt und in die EcoRV-Stelle des Plasmids pAT153 inseriert [Twigg, A. G. und Sherratt, D., 1980, Nature, 283 S. 216-218], was pUKC169 ergab. Das Plasmid C7 wurde dann mit BanI plus EcoRV verdaut und das 0,67-kbp-BanI-EcoRV-Fragment, kodierend für die Aminosäuren 6-222 des Hefe-PDI-ORF, wurde gelgereinigt und mit dem folgenden synthetischen Oligonukleotid- Adapter ligiert:
welcher kohäsive BamHI- bzw. BanI-Enden enthält und für die Aminosäuren 1-5 des Hefe- PDI-ORF plus 12 Basenpaare von 5'-untranslatierter Hefe-Leadersequenz kodiert. (Das ATG-Initiationskodon ist unterstrichen.) Das resultierende 0,7-kbp-BamHI-EcoRV-Fragment wurde gelgereinigt und dann in pAT153 subkloniert, welches zuvor mit EcoRV plus BamHI verdaut worden war, was das Plasmid pUKC170 ergab.
Das Plasmid pUKC169 wurde mit EcoRV verdaut und das resultierende 1,3-kbp-EcoRV- EcoRV-Fragment, welches den vorgenannten C-terminaten Abschnitt von Hefe-PDI trug, wurde gelgereinigt und dann in die nur einmal vorkommende EcoRV-Stelle von pUKC170 inseriert, wodurch das intakte Hefe-PDI (yPDI)-Gen regeneriert wurde. Das resultierende Plasmid wurde als pUKC175 bezeichnet.
pUKC175 wurde mit EcoNI verdaut und das resultierende 2,1-kbp-Fragment, welches das yPDI-Gen trug, wurde glattendig gemacht und gelgereinigt. pUC19 wurde mit SacI plus SmaI verdaut, glattendig gemacht und mit dem obigen glattendigen EcoNI-yPDI-Fragment ligiert. Die Ligierungsmischung wurde zur Transformation von E. coli-DH5-Zellen eingesetzt und die resultierenden Transformanten wurden hinsichtlich derjenigen gescreent, welche Plasmide mit dem yPDI-Insert in der richtigen Orientierung enthielten, so daß sich eine BamHI-Stelle in dem pUC19-Polylinker neben dem 3'-Ende der für yPDI kodierenden Sequenz befand. Nachdem eine BamHI-Stelle bereits am 5'-Ende des yPDI-ORF auf dem EcoNI-Fragment vorlag, enthält dieses Konstrukt (als pUC19-yPDI bezeichnet) nun den yPDI-ORF auf einem 1,9-kbp-BamHI-Fragment. pUC19-yPDI wurde mit BamHI verdaut und das 1,9-BamHI-kbp- Fragment, welches das yPDI-Gen trug, wurde gelgereinigt und dann in die BamHI-Stelle des Vektors pUC18-GAL10p(B)ADH1t (Stamm #4401) (Fig. 6) subkloniert. Das resultierende Plasmid, pUC18-GAL10p-yPDI-ADH1t (Fig. 7), ist Stamm #1015. Das Plasmid pUC18- GAL10p-yPDI-ADH1t wurde mit SmaI, SphI, plus SacI verdaut und das 2,7-kbp-SmaI-SphI- Fragment, welches die Expressionskassette trug, wurde gelgereinigt, glattendig gemacht und dann in die nur einmal vorkommende StuI-Stelle von pUKC171 kloniert (pUKC171 enthält das 4,5-kbp-EcoRI-HindIII-LYS2-Fragment von YIp600 (Barnes und Thorner, 1986, oben), subkloniert in pUC19, welches zuvor mit EcoRI plus HindIII verdaut worden war). Der resultierende pUKC171-GAL10p-yPDI-Vektor wurde dann mit EcoRI plus PvuII verdaut, um die LYS2-GAL10p-yPDI-ADH1t-LYS2-Kassette auszuschneiden, welche dann zur Transformation der S. cerevisiae-Stämme JRY188 und BJ1995 eingesetzt wurde. Die resultierenden Lys-Transformanten wurden durch Southernblots genomischer DNA-Präparationen wie in Beispiel 9 beschrieben beurteilt. Isolate eines jeden Stammes wurden gefunden, welche die GAL10p-yPDI-Kassette an dem LYS2-Locus integriert aufwiesen. Die resultierenden Stämme wurden als BJ1995/yPDI und JRY188/yPDI (Stamm #1152) bezeichnet.

BEISPIEL 14

Konstruktion eines Hefestamms, welcher Hefe-PDI von einer integrierten Expressionskassette am URA3-Locus überproduziert

Das Plasmid pUC-Not-URA3 (Beispiel 8) wurde mit ApaI plus NcoI verdaut (um einen Teil des URA3-Gens zu deletieren) und glattendig gemacht. Das Plasmid pUC18-GAL10p-yPDI- ADH1t wurde mit EcoRI, ScaI und SphI verdaut und das 2,8-kbp-EcoRI-SphI-Fragment, welches die GAL10p-yPDI-ADH1t-Expressionskassette trug, wurde gelgereinigt, glattendig gemacht und mit dem obigen Vektorfragment ligiert, was das Plasmid pNU-GAL10p-yPDI ergab. Die URA3-GAL10p-yPDI-ADH1t-URA3-lntegrationskassette wurde aus pNU-GAL10p- yPDI durch Verdauung mit NotI ausgeschnitten. Das resultierende lineare Fragment wurde zur Transformation des Hefestamms KHY107 eingesetzt. Ura&supmin;-Transformanten wurden auf festen Medien selektioniert, die 5-Fluororotsäure enthielten (Boeke et al., 1984, Mol. Gen. Genet., 197, S. 345). Genomische DNA von den resultierenden Ura&supmin;-Transformanten wurde mit BgII verdaut und durch Southernblots unter Verwendung eines radioaktiv markierten EcoRI-PvuII-Fragments aus der GAL10p-yPDI-ADH1t-Kassette als Sonde beurteilt. Es wurden Isolate identifiziert, welche die gewünschte GAL10p-yPDI-ADH1t-Expressionskassette an URA3 integriert hatten. Das Isolat K-Y1 wies mehrere Kopien an URA3 integriert auf (Stamm #1136). Das Isolat K-Y3 wies eine Kopie an URA3 integriert auf (Stamm #1137).

BEISPIEL 15

Beurteilung von PDI-Proteinniveaus in rekombinanten Wirten

Hefestämme wurden in flüssigem 3 · YEPD-Medium 24 h lang bei 23ºC wachsen gelassen. Nach diesem Zeitraum wurden die Kulturen mit Galactose bis zu einer Endkonzentration von 4,8% ergänzt. Die Kulturen wurden dann erneut bei 23ºC für einen weiteren Zeitraum von 24 h inkubiert. Alternativ wurden Hefestämme in 3 · YEPD für 24 h bei 30ºC kultiviert. Die Zellen wurde geerntet und mit kaltem sterilem Wasser gewaschen und im gleichen Volumen von 3 · YEPD-Galactose-Medium resuspendiert. Die Hefestämme wurden für einen weiteren Zeitraum zwischen 16 und 25 h inkubiert, wonach sie geerntet und Protein nach dem Extraktionsverfahren 2 (unten) extrahiert wurde.

Proteinextraktion:

Proteine wurden aus exponentiell wachsenden Zellen oder Zellen in der stationären Phase mittels Glasperlenaufbruch im wesentlichen wie von Mellor et al. (1983, Gene, 24, S. 1-14) beschrieben extrahiert.

Verfahren 1:

Protein wurde durch Glasperlenaufbruch der Zellwände in Gegenwart von PMSF (0,5 mM) in einem 25 mM Phosphatpuffer, pH 7,0, gefolgt von einem Einfrier-Auftau- Zyklus, extrahiert und lösliches Protein durch Zentrifugation für 10 Minuten bei 13.000 UpM gewonnen. Die Sekretion wurde zuerst durch Analyse der verbrauchten Kulturflüssigkeit beurteilt, entweder vor oder nach der Konzentration mit PEG (fest), Ammoniumsulfat (0-80 %) oder einer Ultrafiltrationsmembran (< 100 kD). Die Proteinkonzentration wurde nach dem Verfahren von Bradford (1976, Anal. Biochem., 72, S. 248-254) bestimmt.

Verfahren 2:

Intrazelluläre Proben wurden wie im Verfahren 1 hergestellt, jedoch wurde das Kulturmedium mit NaOH und β-Mercaptoethanol (Endkonzentrationen von 0,2 M bzw. 1%) ergänzt, für etwa 10 Minuten auf Eis belassen, wonach TCA bis zu einer Endkonzentration von 6% zugegeben wurden. Nach 30 Minuten Stehenlassen auf Eis wurde Protein durch Zentrifugation gewonnen, mit kaltem Aceton gewaschen und in SDS-PAGE-Auftragspuffer resuspendiert.
50 ug des gesamten löslichen Proteins wurden durch eindimensionale SDS-PAGE (12% Polyacrylamid) und Coomassieblau-Anfärbung im wesentlichen wie von Schultz et al. (1987, Gene, 54, S. 113-23) beschrieben analysiert.
Eine Elektrophorese wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: 10%iges SDS- Polyacrylamidgel und 10 ug Protein pro Spur aufgetragen (Proteinextraktionsverfahren 1). Vorgefärbte Molekulargewichtsstandards von Sigma wurden in allen Gelen laufen gelassen. Die Gele wurden in einem BioRad-Mini-Protein II-Gelsystem laufen gelassen. Extrazelluläre Extrakte wurden mit 15-20 ul pro Spur ohne Abschätzung der Proteinkonzentration aufgetragen. Die Spannung wurde während der Elektrophorese unter 200 Volt gehalten.
Die Proteine wurden auf Nitrocellulose überführt, wobei ein halbtrockenes Biometra- Westernblot-System verwendet wurde. Nitrocellulosemembranen wurden mit 5% (Gew./- Vol.) Milchpulver für eine Stunde blockiert, gewaschen, mit polyklonalem Anti-Human-PDI- Antikörper bei Verdünnungen im Bereich von 1 : 500 bis 1 : 750 für 3 h bis über Nacht inkubiert. Die Membranen wurden gewaschen und mit Peroxidase-konjugierter Anti-Kaninchen-IgG wurde in einer Endverdünnung von 1 : 1000 zugegeben und die Inkubation eine Stunde lang fortgesetzt. Nach dem Waschen wurden die Blots mit Hilfe eines Amersham ECL-Kits wie vom Hersteller beschrieben entwickelt.
Erste Assays zeigten, daß der Stamm 1072A sekretierte hPDI in Niveaus produzierte, die mit einem Westernblot nachweisbar waren. Das Nachweisniveau betrug bei dem eingesetzten ECL-Protokoll 0,05 ug an gereinigter Rinder-PDI. Es wurde gezeigt, daß dieses sekretierte PDI ein Dimer war, da es durch eine 100-kD-Ausschluß-Ultrafiltrationsmembran zurückgehalten wurde. Als der Stamm 1072A und dessen entsprechende HDEL-Variante (1279) verglichen würden, wurde festgestellt, daß die Human-PDI von beiden sekretiert wurde. In diesem Experiment wurden die endgültigen Kultur/Induktionsbedingungen hinsichtlich Temperatur (ºC) des Wachstums und der Induktionsperiode optimiert. Die beiden Stämme zeigten ein höheres Maß an PDI-Synthese, wenn sie bei 23ºC kultiviert und dann 16 h lang bei 30ºC induziert wurden oder wenn sie bei 30ºC 16 h lang kultiviert und induziert wurden.

BEISPIEL 16

Herstellung eines Vektors für die Expression von Antistasin in Hefe

Antistasin ist ein wirksamer Proteininhibitor des Blutgerinnungsfaktors Xa. Antistasin (ALS) wurde aus den Speicheldrüsen des Mexikanischen Egels Haementeria officinalis isoliert (Nutt, E. et al 1988, J. Biol. Chem., 263, S. 10162-10167). Die für ALS kodierende cDNA wurde anschließend von Han, J. H. et al. (1989, Gene, 75, S. 47-57) isoliert und charakterisiert. ALS ist ein ideales Reporterprotein für die Beurteilung der Wirkungen erhöhter Niveaus an PDI-Aktivität hinsichtlich der Faltung und Bildung korrekter Disulfidbindungen in einem heterologen Protein, das von rekombinanter Hefe sekretiert wird, da ALS 10 Disulfidbindungen aufweist, welche korrekt gepaart sein müssen, damit das Protein biologische Aktivität aufweist.
ALS wurde in Hefe unter Verwendung des Expressionsvektors pKH4α2 (Jacobson, M. A. et al., 1989, Gene, 85, S. 511-516) exprimiert, welcher den durch Galactose induzierbaren GAL10-Ptomotor und die sekretorische Hefe-MFα1-Präpro-Leadersequenz enthält, um die Sekretion heterologer Proteine zu steuern. Die kodierende Sequenz für ALS wurde durch Polymerasekettenreaktions (PCR)-Verfahren unter Verwendung von subklonierter ATS- cDNA aus dem Klön λ5C-4 (Han, J. H. et al.; oben) als Substrat und der folgenden Oligonukleotid-Primer isoliert:
Beide Primer enthalten eine BamHI-Stelle, um die Subklonierung des PCR-Produkts zu erleichtern. Der erste Primer inseriert eine Hefe-KEX2-yscF-Endoprotease-Spaltstelle (Lys- Arg) N-terminal des ersten Aminosäurerests von reifem ALS (die Hefe-yscF-Endoprotease spaltet auf der C-terminalen Seite der Lys-Arg-Stelle in dieser Sequenz). Das PCR-Produkt wurde mit BamHI verdaut, gelgereinigt und dann in mit BamHI verdautes pKH4α2 ligiert, um pKH4α2/ALS (K991) zu ergeben (Fig. 8). Dieser Expressionsvektor wurde dann zur Transformation der in Tabelle 1 aufgeführten Hefewirtsstämme nach dem Sphäroplasten- Verfahren eingesetzt (Hinnen et al., 1978, oben).
Transformanten wurden auf synthetischen festen Medien selektioniert, denen Leucin fehlte, (Schultz L. et al., 1987; Gene 61, S. 123-133) und für klonale Isolate ausgestrichen, welche in nachfolgenden Analysen eingesetzt wurden. Die Stämme wurden durch Lagerung bei -70ºC in synthetischen Medien, die 17% Glycerin enthielten, aufbewahrt. TABELLE 1
&spplus;PDI-Kassetten und Stämme sind in den Beispielen wie folgt beschrieben: Alpha-hPDI, Beispiel 9; ySP-hPDI und hSP-hPDI, Beispiel 10; hSP-hPDI(HDEL) und ySP-hPDI(HDEL), Beispiel 11; Alpha-hPDI(HDEL), Beispiel 12; yPDI, Beispiel 13; yPDI-A1 und yPDI-A3, Beispiel 14.
*Transformierte Stämme enthalten den K991-Antistasin-Expressionsvektor.

BEISPIEL 17

Wachstum von Ausgangsstämmen und PDI-überproduzierenden Stämmen und Beurteilung hinsichtlich der Sekretion von Antistäsin

Der K991-transformierte JRY188-Ausgangsstamm plus die verschiedenen transformierten Derivate, welche entweder Hefe- oder Human-PDI überproduzieren, wurden hinsichtlich Sekretion von Antistasin nach dem folgenden Verfahren beurteilt. Die angegebenen Stämme wurden aus den bei -70ºC eingefrorenen Glycerin-Stammlösungen auf synthetische Leucinminus-Agarplatten ausgestrichen und 3 Tage lang bei 30ºC wachsen gelassen. Kulturröhrchen (18 · 150 mm), enthaltend 5 ml an 3 · YEHD-Medien [60 g Difco-Hefeextrakt, 30 g HySoy-Pepton, 48 g Glucose pro Liter], wurden mit einer kleinen Impföse voll Zellen angeimpft und etwa 18 h lang bei 23ºC auf einer Gewebekultur-Rolltrommel inkubiert. In diesem Stadium wurden die Zellen durch Zugabe von Galactose auf eine Endkonzentration von 4,8 % (Gew./Vol.) induziert und die Kulturen wurden weitere 5 Tage lang bei 23ºC inkubiert. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugation geerntet und der geklärte Medienüberstand wurde für einen Assay der Antistasin-Aktivität zurückbehalten, welche durch Inhibierung der Faktor Xa-Aktivität gemessen wurde [Nutt, E. et al., 1988, oben]. Das Experiment wurde als Dreifachbestimmung durchgeführt und die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst. TABELLE 2

BEISPIEL 18

Beurteilung der Antistasin-Sekretion durch JRY188 und verwandte Stämme, welche die HDEL-Mutantenversion von Human-PDI überproduzieren

Der K991-transformierte JRY188 und die transformierten Derivatstämme, welche die HDEL- Mutantenversion von Human-PDI mit den drei verschiedenen sekretorischen Leadersequenzen überproduzieren, wurden wie in Beispiel 17 beschrieben gezüchtet und die geklärten Medienüberstände wurden hinsichtlich der Niveaus an sekretiertem ALS mit dem Faktor Xa-Inhibierungsassay wie in Beispiel 17 beschrieben beurteilt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt. TABELLE 3

BEISPIEL 19

Sekretion von Antistasin durch den Hefestamm KHY107 und Derivate, welche Hefe-PDI überproduzieren

Der K991-transformierte KHY107 und dessen transformierte Derivate, welche Hefe-PDI überproduzieren, wurden hochgezüchtet und geklärte Medienüberstände wurden hinsichtlich der Niveaus an sekretiertem ALS mit Hilfe des Faktor Xa-Inhibierungsassays wie in Beispiel 17 beschrieben beurteilt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengefasst. TABELLE 4
K-Y1 ist KHY107 mit mehreren Kopien von GAL-yPDI an URA3. K-Y3 ist KHY107 mit einer einzigen Kopie von GAL-yPDI an URA3. A1, A2 und A3 beziehen sich auf verschiedene klonale Isolate des angegebenen Stammes, die parallel beurteilt wurden. Eine Überexpression von Hefe-PDI führt zu einer 4fach höheren Sekretion an ALS-Aktivität auf einer Basis pro Zelle und einer etwa 9fach höheren Sekretion auf Volumenbasis für das Isolat K-Y3-A1.

BEISPIEL 20

Konstruktion von Hefe-Wirtsstämmen, welche entweder Hefe-PDI oder Human-PDI von einem Mehrfachkopien-Plasmid überproduzieren

Der Mehrfachkopien-Hefe-Shuttlevektor YEp24 (Botstein, D. et al., 1979, Gene, 8, S. 17-24) enthält den Hefe-2-Mikron-DNA-Replikationsursprung und das Hefe-URA3-Gen für die Selektion auf synthetischen Uracil-minus-Medien. YEp24 wurde mit BamHI verdaut und das resultierende 7,8-kbp-BamHI-Vektorfragment wurde gelgereinigt (Fragment a). Das Plasmid pUC18-GAL10p-yPDI-ADH1t (#1015) wurde mit EcoRI, SphI und ScaI verdaut, das resultierende 2,8-kbp-EcoRI-SphI-Fragment, welches die GAL10p-yPDI-ADH1t-Expressionskassette trug, wurde gelgereinigt (Fragment b). Das Plasmid pUKC161 wurde mit EcoRI plus HindIII verdaut und das 2,8-kbp-EcoRI-HindIII-Fragment, welches die GAL1p - MFα1-Präpro- Human-PDI-Expressionskassette trug, wurde gelgereinigt (Fragment c). Die obigen drei Fragmente wurden glattendig gemacht und dann miteinander wie folgt ligiert: (1) das Vektorfragment a und das Fragment b wurden miteinander (igiert, um das Plasmid YEp24-GAL10p- yPDI (Fig. 9) zu ergeben: (2) das Vektorfragment a und das Fragment c wurden miteninander ligiert, um das Plasmid YEp24-GAL1p-MFα-hPDI zu ergeben (Fig. 10). Es wurden CsCl-Präparationen der beiden resultierenden Plasmid-DNAs in großem Maßstab hergestellt. In zwei separaten Transformationsreaktionen wurde der Hefestamm JRY188 mit dem ALS-Expressionsvektor K991 (Beispiel 16) und entweder YEp24-GAL10p-yPDI oder YEp24- GAL1p-MFα-hPDI cotransformiert. Transformanten, die beide Plasmide enthielten, wurden auf synthetischen Medien selektioniert, denen sowohl Leucin als auch Uracil fehlte, und isolierte Einzelkolonien wurden auf denselben Medien zur Selektion klonaler Isolate erneut ausgestrichen. Fünf solcher klonalen Isolate für jede der beiden ursprünglichen Cotransformationen wurden in 5 ml 3 · YEHD-Medium in Kulturröhrchen angeimpft und 24 h bei 23ºC in einer Gewebekultur-Rolltrommel inkubiert. Am Ende dieser Zeit wurde Galactose bis zu einer Endkonzentration von 4,8% zugegeben und die Kulturen wurden weitere 5 Tage lang bei 23ºC inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation entfernt und die geklärten Medienüberstände hinsichtlich der Niveaus an ALS-Aktivität mit dem Faktor Xa-Inhibierungsassay untersucht. Die Cotransformanten, welche das YEp24-GAL10p-yPDI-Plasmid plus den ALS-Expressionsvektor enthielten, zeigten, in Abhängigkeit von dem Isolat, im Vergleich mit dem JRY188-Ausgangsstamm, der nur den ALS-Expressionsvektor enthielt, 3- bis 26fach höhere Niveaus an sekretierter ALS-Aktivität. Die Cotransformanten, welche das YEp24- GAL1p-MFα-hPDI-Plasmid plus den ALS-Expressionsvektor enthielten, zeigten im Vergleich zu dem JRY188-Ausgangsstamm, der nur den ALS-Expressionsvektor enthielt, 2- bis 3fach höhere Niveaus an sekretierter ALS-Aktivität.

BEISPIEL 21

Konstruktion und Beurteilung von Hefe-Wirtsstämmen, welche entweder Hefe- oder Human- PDI von dem gleichen Expressionsvektor, der zur Exoression eines gewünschten heterologen Proteins eingesetzt wurde, überproduzieren

Die S. cerevisiae-GAL1- und -GAL10-Gene werden divergent von einem Bereich zwischen den beiden Strukturgenen transkribiert, welcher die divergenten GAL1- und GAL10-Promotoren und eine gemeinsame GAL4-Bindungsdomäne, lokalisiert zwischen den TATA-Boxen für die beiden Promotoren, enthält. Das Plasmid pBM272 (Johnston, M. und Davis, R., 1984, Mol. Cell. Biol., 4, S. 1440) enthält diesen divergenten Hefe-GAL1-GAL10-Promotor auf einem 0,85-kbp-EcoRI-HindIII-Fragment (auch mit einer internen BamHI-Stelle neben der HindIII-Stelle). Dieses Promotor-Fragment wurde zur Konstruktion eines Vektors mit einer divergenten Promotorkassette, pUC-GAL1/10, eingesetzt, welcher die folgenden Eigenschaften aufweist: Hefe-GAL10-Promotor, getrennt von dem Hefe-ADH1-Transkriptionsterminator (0,35-kbp-HindIII-SphI-Fragment) durch nur einmal vorkommende EcoRI- und SmaI-Stellen in dieser Reihenfolge. Der Hefe-GAL1-Promotor ist von einer zweiten Kopie des ADH1-Transkriptionsterminators durch nur einmal vorkommende BamHI- und HindIII- Stellen getrennt. Das 3'-Ende beider ADH1-Terminatorelemente ist von SphI-Stellen flankiert, um die Isolierung der gesamten divergenten Promotor-Expressionskassette als SphI-Fragment zu erlauben. Das Vektorgerüst in diesem Plasmid ist pUC18, bei dem die obige Expressionskassette anstelle des Polylinkers vorliegt.
Das Plasmid pUC-GAL1/10 wurde mit BamHI verdaut und gelgereinigt, um das Fragment "a" zu erzeugen. Das Plasmid pUKC161 wurde mit BamHI verdaut und das 1,9-kbp-BamHI- Fragment, welches die Alphafaktor-Präpro-Leadersequenz im Leserahmen fusioniert mit der für reife Human-PDI kodierenden Sequenz enthält, wurde gelgereinigt und mit dem Vektorfragment a ligiert, was das Plasmid pUC-GAL1/10-hPDI ergab, worin die Expression der Alphafaktor-Präpro - hPDI-Fusion unter der Kontrolle des GAL1-Promotors steht. Das Plasmid pUC18-GAL10p-yPDI-ADH1t (Beispiel 13) wurde mit BamHI verdaut und das resultierende 1,7-kbp-BamHI-Fragment, welches die für Hefe-PDI kodierende Sequenz trägt, wurde gelgereinigt und dann mit dem Vektorfragment a ligiert, was das Plasmid pUC- GAL1/10-yPDI ergab, worin der GAL1-Promotor die Expression von Hefe-PDI steuert. Diese beiden resultierenden Plasmide wurden dann mit EcoRI verdaut und glattendig gemacht, was die Vektorfragmente b und c ergab, welche die hPDI- bzw. yPDI-Kassetten trugen.
Der ALS-Expressionsvektor (K991) wurde mit SaII plus BgIII verdaut und das SaII-BgIII- Fragment, welches die Alphafaktor-Präpro-Leadersequenz im Leserahmen mit der kodierenden Sequenz für reifes ALS fusioniert trug, wurde gelgereinigt, glattendig gemacht und in separaten Reaktionen mit den beiden glattendigen Vektorfragmenten b und c ligiert. Die resultierenden Plasmide mit dem richtigen Aufbau, wie mittels Restriktionskartierung festgestellt, erhielten die Bezeichnungen pUC-GAL1/10-hPDI/ALS (Fig. 11) bzw. pUC- GAL1/10-yPDI/ATS (Fig. 12). Diese beiden Plasmide wurden dann mit SphI verdaut, um die Expressionskassetten freizusetzen, und die Fragmente, welche entweder die hPDf- oder yPDI-bezogene Expressionskassette trugen, würden mit dem Hefe-Shuttlevektor pC1/1 (Rosenberg, S. et al., 1984, Nature, 312, S. 77-80) ligiert, welcher zuvor mit SphI verdaut worden war. Dies ergab die resultierenden beiden Plasmide pC1/1-GAL1/10-hPDI/ALS und pC1/1-GAL1/10-yPDI/ALS, worin die ALS- und PDI-bezogenen Expressionskassetten auf demselben Vektor mit hoher Kopienzahl unter der Kontrolleder GAL10- bzw. GAL1- Promotoren vorlagen.
Diese beiden Expressionsvektoren wurden dann zur Transformation der Hefestämme JRY188, BJ1995 und anderer geeigneter Hefe-Wirtsstämme eingesetzt. Transformanten wurden auf Leucin-minus-Medien selektioniert und die resultierenden Transformanten hinsichtlich Expression/Sekretion von ALS und PDI wie in den vorgehenden Beispielen beschrieben beurteilt.
Die in Tabelle 5 (unten) präsentierten Ergebnisse zeigen eindeutig, daß die Isolate, welche hPDI überproduzieren, mehrfach höhere Niveaus an Antistasin sekretieren als der Kontrollstamm, der nur pKH4α2/ATS enthielt. Ferner sekretierten die Isolate, welche Hefe-PDI überexprimieren, 3- bis 17fach höhere Niveaus an Antistasin als der Kontrollstamm.

TABELLE 5

Konstrukt Antistasin (mg/l)*

pC1/1-GAL1/10-hPDI/ALS

Isolat 1 4,7
Isolat 2 5,3
Isolat 3 3,9
Isolat 4 4,6
Isolat 5 5,1

pC1/1-GAL1/10-yPDI/ALS

Isolat 1 3,9
Isolat 2 11,7
Isolat 3 5,8

Tabelle 5 fortgesetzt:

Isolat 4 26,0
Isolat 5 8,2
JRY188-Kontrolle 1,5
*Ausbeuten für 5 Tage nach der Induktion bei 23ºC.

BEISPIEL 22

Wirkung der Temperatur auf die erhöhte Antistasin-Sekretion durch PDI-überproduzierende Hefe-Wirtsstämme

Ausgewählte Isolate des Stammes JRY188, cotransformiert mit dem Antistasin-Expressionsvektor pKH4α2/ALS und entweder YEp24-GAL1p-MFα-hPDI oder YEp24-GAL10p-yPDI, wurden hinsichtlich Antistasin-Sekretion nach Wachstum bei entweder 23ºC oder 30ºC beurteilt. Der Ausgangsstamm JRY188, der nur mit dem Antistasin-Expressionsvektor transformiert war, wurde parallel gezüchtet. Nach Züchtung über Nacht in 3 · YEHD-Medium bei entweder 23ºC oder 30ºC wurden die Zellkulturen durch die Zugabe von Galactose bis zu einer Endkonzentration von 4,8% induziert und weitere fünf Tage lang bei entweder 23º C oder 30ºC, wie angemessen, vermehrt. Medienproben, die 3 bis 5 Tage nach der Induktion geerntet worden waren, wurden hinsichtlich der Niveaus an sekretiertem Antistasin mit dem Faktor Xa-Inhibierungsassay beurteilt. Die in Tabelle 6 präsentierten Ergebnisse zeigen eindeutig, daß die Antistasin-Expression für alle Isolate, die PDI überexprimierten, sowohl 3 als auch 5 Tage nach der Induktion bei 23ºC signifikant höher als bei 30ºC war. TABELLE 6
*Die verschiedenen hPDI-Isolate enthielten sowohl den Antistasin-Expressionvektor K991 als auch YEp24-GAL1p-MFα-hPDI. Die yPDI-Isolate enthielten sowohl den Vektor K991 als auch YEp24-GAL10p-yPDI.

BEISPIEL 23

Sekretion von Zecken-Antikoagulationspeptid (TAP) durch rekombinante Hefestämme, welche PDI überproduzieren

Zecken-Antikoagulationspeptid (TAP) ist ein wirkungsvoller, hochselektiver Lnhibitor des Blutgerinnungsfaktors Xa (Waxman, L. et al., 1990, Science, 248, S. 593-596). TAP ist ein neuer Serinprotease-Inhibitor, der aus der Zecke Ornithidoros moubata isoliert wurde. TAP besteht aus 60 Aminosäuren, die 6 Cysteinreste umfassen (Waxman et al.; 1990, oben). TAP wurde in Hefe mit Hilfe des Expressionsvektors pKH4-TAP exprimiert, welcher den mit Galactose induzierbaren GAL10-Promotor und die sekretorische Hefe-MFα1-Präpro- Leadersequenz im Leserahmen mit dem synthetischen Gen, das für TAP kodiert, fusioniert enthält (Neeper, M. et al., 1990, J. Biol. Chem., 265, S. 17746-17752). Dieser Vektor enthält eine leicht modifizierte MFα1-Präpro-Leadersequenz aufgrund der Anwesenheit einer BamHI-Klonierungsstelle, die sich an der Position von Aminosäure 79 der Präpro-Leadersequenz befindet (Neeper et al 1990, oben).
Ein zweiter TAP-Expressionsvektor, pKH4-3B/TAP, wurde konstruiert, welcher die authentische MFα1-Präpro-Leadersequenz im Leserahmen mit dem für TAP kodierenden synthetischen Gen fusioniert enthält. Das Plasmid pKH4-TAP, welches das synthetische TAP-Gen enthält (Neeper et al., 1990, oben), wurde als DNA-Matrize in einer Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung der folgenden beiden Oligonukleotid-Primer eingesetzt, um die 5'- bzw. 3'-Termini des synthetischen TAP-Gens zu modifizieren:
Die PCR-Reaktion wurde nach Verfahren durchgeführt, welche Durchschnittsfachleuten wohlbekannt sind (Innis, M. A. et al., Herausgeber, 1990, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc., San Diego, CA). Das resultierende PCR-Produkt wurde mit T4-Pofynukleotidkinase phosphoryliert, mit BamHI verdaut und dann gelgereinigt, um ein glattendiges 0,2-kbp-BamHI-Fragment zu ergeben, welches das glatte Ende am exakten 5'-Ende der für TAP kodierenden Sequenz und ein kohäsives BamHI-Ende auf der 3'-Seite des Translationsterminationscodons enthielt.
Der Vektor pKH4-3B (Hofmann, K. und Schultz, L. D., 1991, Gene, 101, S. 105-111) enthält eine nur einmal vorkommende SphI-Stelle am 3'-Ende der für die MFα1-Präpro-Leadersequenz kodierenden Sequenz. pKH4-3B wurde mit SphI verdaut, durch Behandlung mit T4- DNA-Polymerase glattendig gemacht und dann mit BalII verdaut. Das resultierende glattendige BgIII-Vektorfragment wurde gelgereinigt und mit dem vorgenannten glattendigen 0,2-kbp- BamHI-TAP-Fragment ligiert, um den Vektor pKH4-3B/TAP zuergeben.
In separaten Transformationsreaktionen wurden die Hefestämme BJ1995, JRY188 und U9 mit den Vektoren YEp24-GAL10p-yPDI plus entweder pKH4-TAP oder pKH4-3B/TAP cotransformiert. Cotransformanten, die beide Plasmide enthielten, wurden auf synthetischem Medium, dem sowohl Leucin als auch Uracil fehlte, selektioniert und isolierte Einzelkolonien wurden auf dem gleichen Medium zur Selektion von klonalen Isolaten erneut ausgestrichen. Drei solcher klonalen Isolate für jede der verschiedenen Vektor/Wirt-Cotransformationen wurden in 5 ml von modifiziertem 5 · Leu&supmin;-Medium, dem Uracil fehlte (5 · Leu&supmin;Ura&supmin;) und das 4% Glucose enthielt, in Kulturröhrchen angeimpft. Die Kulturen wurden 24 h lan bei 30ºC in einer Gewebekultur-Rolltrommel inkubiert. Am Ende dieser Zeit wurden die Zellen durch Zentrifugation gewonnen und in 5 ml 5 · Leu&supmin;Ura&supmin;-Medium, das 4% Galactose enthielt, resuspendiert. Die resultierenden Kulturen wurden weitere 48 h lang bei 30ºC inkubiert. Die Zellen werden dann durch Zentrifugation entfernt und geklärte Medienproben hinsichtlich der Niveaus an sekretiertem TAP durch SCX-HPLC oder Faktor Xa-Inhibierungsassay (Waxman et al., 1990, oben) beurteilt. Als alternative Vorgehensweise werden die rekombinanten Hefezellen 24 h lang bei 23ºC gezüchtet, durch Zugabe von Galactose auf eine Endkonzentration von 4% induziert und dann weitere 5 Tage lang bei 23ºC inkubiert. Geklärte Medienproben werden dann hinsichtlich der Niveaus an sekretiertem TAP wie oben beschrieben beurteilt.

SEQUENZVERZEICHNIS

(1) ALLGEMEINE INFORMATION:

(i) ANMELDER: Ellis, Ronald W.
Schultz, Loren D.
Marcus, Henry Z.
Tuite, Michael H.
Freedman, Robert
Montgomery, Donna L.
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: Verfahren zur Erhöhung der Sekretion von disulfid-gebundenen rekombinanten Proteinen durch Saccharomyces cerevisiae
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 21
(iv) KORRESPONDENZADRESSE:
(A) ADRESSAT: Merck & Co., Inc.
(B) STRASSE: P. O. Box 2000
(C) STADT: Rahway
(D) STAAT: New Jersey
(E) LAND: USA
(F) PLZ: 07065
(v) COMPUTER-LESBARE FORM:
(A) MEDIUMTYP: Diskette
(B) COMPUTER: IBM-PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PG-DOSIMS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Version #1.25
(vi) GEGENWÄRTIGE ANMELDUNGSDATEN:
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(C) KLASSIFIZIERUNG:
(viii) ANWALTNERTRETERINFORMATION:
(A) NAME: Wallen, John W.
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(C) REFERENZ/AKTENZEICHEN: 18469
(ix) TELEKOMMUNIKATIONSINFORMATION:
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Claims

1. In vitro-Verfahren zur Herstellung disulfid-gebundener rekombinanter Proteine, umfassend:

(a) Überexpression von rekombinanter Proteindisulfidisomerase von einer rekombinanten Expressionskassette, die ein für Proteindisulfidisomerase kodierendes Gen enthält, in einer rekombinanten Wirtszelle, und

(b) Expression von einem oder mehreren rekombinanten Gen(en), kodierend für ein anderes oder mehrere andere disulfid-gebundene(s) Protein(e) als Proteindisulfidisomerase, in der rekombinanten Wirtszelle,

mit der Maßgabe, daß dis rekombinante Wirtszelle eine andere als E. coli ist und daß das Gen, welches für Proteindisulfidisomerase kodiert, kein DNA- Fragment umfaßt, das für eine Humanserumalbumin-Präprosequenz kodiert,

und daß das Verfahren nicht die Expression von einer rekombinanten Expressionskassette eines Gens umfaßt, das für das Rezeptorprotein ERD2 von Hefe kodiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Expressionskassetten, die für Proteindisulfidisomerase kodieren, in das Genom der Wirtszelle integriert sind.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Expressionskassetten, die für Proteindisulfidisomerase kodieren, auf autonom replizierenden Plasmiden enthalten sind.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die rekombinanten Gene, die für ein oder mehrere disulfid-gebundene(s) Protein(e) kodieren, auf einem oder mehreren Plasmid(en) enthalten sind.

5. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 3, wobei die rekombinanten Gene, die für ein oder mehrere disulfid-gebundene(s) Protein(e) kodieren, in das Genom der Wirtszelle integriert sind.

6. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Expressionskassetten, die für die Proteindisulfidisomerase kodieren, und das rekombinante Gen auf demselben Plasmid enthalten sind.

7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die rekombinante Wirtszelle eine Säugerzelle ist.

8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die rekombinante Wirtszelle eine Hefezelle ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Hefe ein Stamm einer Spezies der Familien Saccharomycetaceae oder Cryptococcaceae ist.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Hefe eine Spezies der Gattung Saccharomyces ist.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Hefe Saccharomyces cerevisiae ist.

12. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das eine oder die mehreren rekombinante(n) Gen(e) von Schritt (b) für Antistasin kodiert/kodieren.

13. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das eine oder die mehreren rekombinante(n) Gen(e) von Schritt (b) für antikoagulierendes Zeckenprotein kodieren.

14. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das rekombinante Proteindisulfidisomerase-Gen ein Hefe-Proteindisulfidisomerase-Gen ist.

15. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das rekombinante Proteindisulfidisomerase-Gen ein Säuger-Proteindisuifidisomerase-Gen ist.

16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei das rekombinante Proteindisulfidisomerase- Gen ein Human-Proteindisulfidisomerase-Gen ist.

17. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1-6 und 8-16, wobei der rekombinante Wirt Hefe ist und das disulfid-gebundene Protein sekretiert wird.

18. In vitro-Verfahren zur Herstellung von disulfid-gebundenen rekombinanten Proteinen, umfassend:

(a) Überexpression von rekombinanter Proteindisulfidisomerase von einer rekombinanten Expressionskassette, die ein für Hefe-Proteindisulfidisomerase kodierendes Gen enthält, in einer rekombinanten Wirtszelle, und

(b) Expression von einem oder mehreren rekombinanten Gen(en), kodierend für ein anderes oder mehrere andere disulfid-gebundene(s) Protein(e) als Proteindisulfidisomerase, in der rekombinante Wirtszelle.

19. Verfahren nach Anspruch 17 oder Anspruch 18, wobei der rekombinante Hefewirt bei einer Temperatur von weniger als 30ºC zur Expression von einem oder mehreren disulfid-gebundenen Protein(en) gezüchtet wird.

20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei der rekombinante Hefewirt bei einer Temperatur zwischen etwa 20ºC und 26ºC zur Expression von einem oder mehreren disulfid-gebundenen Protein(en) gezüchtet wird.

21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei das disulfid-gebundene Protein Antistasin ist.

22. Verfahren nach Anspruch 20, wobei das disulfid-gebundene Protein antikoagulierendes Zeckenprotein ist.

23. Stamm der Hefe Saccharomyces cerevisiae, welcher rekombinante Proteindisulfidisomerase von einer rekombinanten Expressionskassette, die ein für Proteindisulfidisomerase kodierendes Gen enthält, und ein oder mehrere rekombinante(s) Gen(e), kodierend für ein anderes oder mehrere andere disulfidgebundene(s) Protein(e) als Proteindisulfidisomerase, von einer rekombinanten Expressionskassette überexprimiert,

mit der Maßgabe, daß das Gen, welches für Proteindisulfidisomerase kodiert, kein DNA-Fragment umfaßt, das für eine Humanserumalbumin-Präprosequenz kodiert, und daß die Hefe kein Gen, welches für das Rezeptorprotein ERD2 von Hefe kodiert, von einer rekombinanten Expressionskassette exprimiert.

24. Stamm der Hefe Saccharomyces cerevisiae, welcher rekombinante Proteindisulfidisomerase von einer rekombinanten Expressionskassette, die ein für Hefe- Proteindisulfidisomerase kodierendes Gen enthält, und ein oder mehrere rekombinante(s) Gen(e), kodierend für ein anderes oder mehrere andere disulfidgebundene(s) Protein(e) als Proteindisulfidisomerase, von einer rekombinanten Expressionskassette überexprimiert.