JP2003038173A - 抗体の選別方法、ハイブリドーマ、モノクローナル抗体及びその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】抗原の免疫測定法による分析、測定の際に、サ
ンプル中に共存してくる可能性の高い抗原抗体反応妨害
物質による影響を受けにくい抗体を選別し、それにより
免疫測定法での異常値の発生を抑制する方法の提供。 【解決手段】測定対象物の抗体を担体に固定化し、抗原
酵素複合体（標識抗原）、測定対象物質（抗原）および
反応妨害物質を固定化抗体に接触させ、酵素基質を添加
して発色させ発色後、標準曲線から抗原量を算出し、そ
の回収率から抗原抗体反応妨害物質耐性抗体を選別する
という方法により上記課題を解決した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は抗原抗体反応妨害物
質（以下、妨害物質を称することがある。）の存在下に
おいてもその影響をなるべく受けずに抗原と反応する性
質を有する抗体、すなわち妨害物質耐性抗体、その抗体
の選別方法、その抗体を産生するハイブリドーマおよび
その抗体の利用に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、環境測定分野などで、高価な機器
が不要であり、また、操作に習熟が不要であることか
ら、免疫測定法（イムノアッセイ、以下、ＩＡと略記す
ることがある。）が繁用されている。しかしながら、Ｉ
Ａで使用される測定対象物質に特異的に作用する抗体は
高分子量の蛋白質であるため、目的とする蛋白質に影響
を及ぼす種々の物質によりその抗体の活性が影響を受
け、その結果、測定対象物質の測定値が不正確となる場
合が生じてくることがある。一方、ppb（パートパービ
リオン、１０億分の１）やppt（パートパートリオン、
１兆分の１）のオーダーなど、ごく微量の測定対象物質
を測定するためには、高倍率の濃縮操作が必要となる場
合があり、そのような場合は固相抽出法を利用した濃縮
（以下固相濃縮と略記することがある）や溶媒抽出によ
る濃縮（以下、溶媒濃縮と略記することがある）などの
操作により濃縮したサンプルを使用して測定対象物質が
測定されている。しかし、検体サンプル中には測定対象
物質以外にも種々雑多な化合物が混在しているため、固
相濃縮や溶媒濃縮による濃縮操作を行うと、抗体に影響
を及ぼす化合物、すなわち抗原抗体反応妨害物質も濃縮
される結果、抗体の活性が影響を受け、測定対象物質の
測定値に異常を来すケースも発生する。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題の１つ
は、抗原のＩＡによる測定の際に、サンプル中に混在す
る可能性が高い抗原抗体反応妨害物質による影響を受け
にくい抗体を選別することにより、ＩＡでの異常値の発
生を抑制する方法を提供することにある。本発明の他の
課題は、本発明で選別された抗体の利用により、異常値
の発生が少ないＩＡキットを提供することにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、夾雑する
反応妨害物質の影響をなるべく受けないでＩＡにより種
々の物質を検出、測定する方法を確立すべく鋭意研究を
重ねた。その結果、ＩＡで使用する抗体を選別するに際
し、反応妨害物質、例えば環境汚染物質またはその分解
物、殺菌消毒剤、または溶媒等の存在下に抗原および標
識抗原を抗体と反応させ、その反応率から反応妨害物質
に対する耐性の高い目的抗体を選別することにより、測
定対象物質の存在量が少ないために高倍率に濃縮したサ
ンプルでも対象物質の測定が可能となることを見出し
た。かかる知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本
発明を完成させるに至った。

【０００５】すなわち、本発明は、（１）抗原抗体反応
を用いて測定対象物質に対する抗体を選別するに際し、
抗原抗体反応妨害物質の存在下に目的抗体を選別する抗
体の選別方法、（２）測定対象物質が環境汚染物質であ
る（１）記載の抗体の選別方法、（３）測定対象物質が
ホルモンである（１）記載の抗体の選別方法、（４）抗
体がモノクローナル抗体である（１）記載の抗体の選別
方法、（５）抗原抗体反応妨害物質が、環境汚染物質ま
たはその分解物、殺菌消毒剤または溶媒である（１）記
載の抗体の選別方法、（６）環境汚染物質が界面活性
剤、環境水またはその濃縮物、またはフミン物質である
（５）記載の抗体の選別方法、（７）界面活性剤が陰イ
オン界面活性剤、陽イオン界面活性剤または非イオン界
面活性剤である（６）記載の抗体の選別方法、（８）環
境水が、河川水、湖沼水、海水、上水処理工程水または
下水処理工程水である（６）記載の抗体の選別方法、
（９）殺菌消毒剤が塩素剤である（５）記載の抗体の選
別方法、（１０）溶媒が、アルコール類、ニトリル類、
ケトン類またはエステル類である（５）記載の抗体の選
別方法、（１１）測定対象物質又は測定対象物質のハプ
テンと蛋白質との複合体を抗原として免疫した動物から
得られるポリクローナル抗体、または測定対象物質又は
測定対象物質のハプテンと蛋白質との複合体を抗原とし
て免疫した動物の脾臓細胞またはリンパ節細胞と骨髄腫
細胞とを融合して得られる測定対象物質又は測定対象物
質のハプテンとその蛋白質との複合体に対するモノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマを培養して得られ
たモノクローナル抗体を、抗原抗体反応妨害物質の共存
下に抗原酵素複合体（標識抗原）、測定対象物又は測定
対象物質のハプテンとその蛋白質との複合体（抗原）を
反応させ、その反応率から抗原抗体反応妨害物質耐性抗
体を選別する（１）記載の抗体の選別方法、（１２）
（１１）記載の抗体の選別方法により選別された妨害物
質耐性モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、
（１３）ハイブリドーマが、マウスハイブリドーマＥＥ
２−２２７（ＦＥＲＭＢＰ−７５６７）、マウスハイブ
リドーマＥ１−４２０（ＦＥＲＭ ＢＰ−７５６８）又
はマウスハイブリドーマＥ２−７３（ＦＥＲＭ ＢＰ−
７５６９）である（１２）記載のハイブリドーマ、（１
４）（１１）記載の抗体の選別方法で選別された抗原抗
体反応妨害物質耐性抗体、（１５）（１２）記載のハイ
ブリドーマによって産生された抗原抗体反応妨害物質耐
性モノクローナル抗体、（１６）（１４）又は（１５）
記載の抗原抗体反応妨害物質耐性抗体を必須の構成成分
として含んでなる測定対象物質の免疫学的分析用キッ
ト、および（１７）（１４）又は（１５）記載の抗原抗
体反応妨害物質耐性抗体を必須の構成成分として含んで
なる測定対象物質の免疫学的濃縮用キット、を提供す
る。

【０００６】

【発明の実施の形態】本発明は、水性媒体中に、抗原抗
体反応における妨害物質と測定対象物質に対する抗体と
を共存させＩＡにより反応妨害物質耐性抗体を選別する
抗体の選別方法に関する。

【０００７】本発明に属するより具体的な抗体の選別方
法の例は次のとおりである。すなわち、測定対象物質に
対する抗体を含有する液を、そのまま、または予め担体
に固定化した種特異的抗体と接触させ、しかるべき時間
と温度で反応させることにより抗体含有液中の抗体を担
体に固定化する。固定化されなかった抗体含有液中の抗
体を洗浄液で洗浄除去後、抗原酵素複合体（標識抗
原）、測定対象物質（抗原）および反応妨害物質を固定
化抗体と接触させ反応させる。未反応の物質を洗浄除去
したのち、酵素基質を添加し発色させる。発色後または
発色停止後、吸光度や蛍光度を測定し、標準曲線から妨
害物質共存時と非共存時の測定濃度を比較し、妨害物質
耐性の度合いを計算する。計算の結果、反応妨害物質耐
性度の高い抗体を選別する。その抗体がモノクローナル
抗体である場合は、その抗体を産生するハイブリドーマ
を特定する。そのハイブリドーマを培養し、培養上清か
ら反応妨害物質耐性度の高い抗体を得る。これらの抗体
を利用して元の測定対象物質をＩＡにより分析する。

【０００８】本発明の選別対象とする抗体には、検出、
測定に使用されるいかなる抗体も含まれる。抗体として
は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体が挙
げられる。

【０００９】本発明のＩＡにおける測定対象物質として
は、その抗体を使用して検出、測定される全ての物質が
含まれ、例えば、環境汚染物質の測定などにおける全て
の測定対象物質が挙げられる。測定対象物質の具体例と
しては、各種ホルモン類、植物ホルモン類、環境汚染物
質類、合成界面活性剤類、農薬類、カビ毒類、トキシン
類、薬剤類、アレルゲン類、微生物類などが挙げられ
る。

【００１０】各種ホルモン類の中で動物ホルモンとして
は、エストロゲン、エストラジオール（Ｅ２）、エスト
ロン（Ｅ１）、エストリオール（Ｅ３）などの女性ホル
モン類、アンドロゲン、テストステロン、デヒドロアン
ドロステロン、アンドロステンジオンなどの男性ホルモ
ン類、チロキシン（Ｔ３）、トリヨードチロニン（Ｔ
４）などの甲状腺ホルモン類、エチニルエストラジオー
ル、ジエチルスチルベストロール、ラロキシフェン、タ
モキシフェン、モキセストロール、アリルエストレノー
ル、メストラノール、リネストレノール、酢酸クロルマ
ジノン、ジドロゲステロン、メドロキシプロゲステロ
ン、ノルエチステロン、ノルゲストレル、レボノルゲス
トレル、プレグナンジオール、クロミフェンなどの合成
ホルモン類、プロゲストロン、ゼラノール、トレンボロ
ン、クレンブテロール（βアゴニスト）などのホルモン
類が挙げられ、また、これらの代謝物である抱合体（例
えば、グルクロン酸抱合体、硫酸抱合体など）およびそ
れらの分解物もこれらに包含される。

【００１１】植物ホルモン類としては、イソリクイリチ
ゲニン、フロレチン、クメストロール、ヘスペレチン、
ナリンゲニン、アピゲニン、バイカレイン、クリシン、
ルテオリン、ガランギン、ケンフェロール、ケルセチ
ン、エクオール、ビオカニンＡ、ダイゼイン、ホルムオ
ノネチン、ゲニステイン、ベツリンなどが挙げられ、ま
た、これらの代謝物、分解物もこれに包含される。

【００１２】測定対象物質としての環境汚染物質類とし
ては、フタル酸ベンジルブチル、フタル酸ジエチル、フ
タル酸ジ−n−ブチル、フタル酸ジイソブチル、フタル
酸ジ−ｎ−プロピル、フタル酸ジ−ｎ−ペンチル、フタ
ル酸ジ−ｎ−ヘキシル、フタル酸ジシクロヘキシル、フ
タル酸ジ（２−エチルヘキシル）、フタル酸ジオクチ
ル、フタル酸モノ（２−エチルヘキシル）、フタル酸ジ
イソノニル、フタル酸ジイソデシル、フタル酸ジ−ｎ−
オクチル、フタル酸ジトリデシルなどのフタル酸エステ
ル類、アジピン酸ジ（２−エチルヘキシル）などのアジ
ピン酸エステル類、４−エチルフェノール、３−ｔ−ブ
チルフェノール、４−ｓ−ブチルフェノール、４−ｔ−
ブチルフェノーエル、４−プロピルフェノール、４−イ
ソペンチルフェノール、４−ｔ−ペンチルフェノール、
オクチルフェノール、４−オクチルフェノール、４−ｔ
−オクチルフェノール、４−（１，１，３，３，−テト
ラメチルブチルフェノール）、４−ノニルフェノール
（直鎖）、４−ノニルフェノール（枝分かれ）、ノニル
フェノール（混合異性体）などのアルキルフェノール
類、ビスフェノールＡ、テトラブロモビスフェノールＡ
などのジフェニルアルカン類、ポリ臭素化ビフェニルな
どのＰＢＢ類、ポリ臭素化ビフェニルエーテル類、スチ
レン、スチレン２量体、スチレン３量体、２−クロロフ
ェノール、２，４−ジクロロフェノール、２，４，６−
トリクロロフェノール、ペンタクロロフェノールなどの
クロロフェノール類、ｔ−ブチル化ヒドロキシアニソー
ル（ＢＨＡ）、ｎ−ブチルベンゼン、ベンゾフェノン、
６−ブロモ−２−ナフトール、ジブロモ酢酸、２−ブロ
モプロパン、４−ニトロトルエン、オクタクロロスチレ
ンなどの内分泌攪乱化学物質などが挙げられ、また、こ
れらの代謝物、分解物もこれに包含される。

【００１３】さらに、２，３，７，８−テトラクロロダ
イオキシン(2,3,7,8-TCDD)などのダイオキシン類（Poly
chlorinated dibenzodioxins(PCDDs)）、２，３，７，
８−テトラクロロジベンゾフラン( 2,3,7,8-TCDF)など
のジベンゾフラン類（Polychlorinated dibenzofurans
(PCDFs)）、アロクロール1016、アロクロール1221、ア
ロクロール1232、 アロクロール1242、アロクロール124
8、アロクロール1254、アロクロール1260、アロクロー
ル1262、アロクロール1268、ビフェノクス、ハロワック
ス1000、ハロワックッス1051、ハロワックス1099などの
ＰＣＢ類（Polychlorinated Biphenyls(PCBs)）、アセ
ナフテン、アセナフチレン、アンスラセン、ベンゾ[a]
アンスラセン、ベンゾ[a]ピレン、ベンゾ[b]フルオラン
セン、ベンゾ[g.h.i]ペリレン、ベンゾ[k]フルオランセ
ン、ビフェニル、クリセン、クレオソート、１，２−ジ
クロロベンゼン、２−エチルトルエン、４−エチルトル
エン、ヘキサクロロベンゼン、ジベンゾ[a,h]アンスラ
セン、フルオランセン、フルオレン、ナフタレン、１−
メチルナフタレン、２−メチルナフタレン、１−クロロ
ナフタレン、o-クレゾール、フェナンスレン、n-プロピ
ルベンゼン、ピレン、１，２，４−トリメチルベンゼ
ン、１，３，５−トリメチルベンゼン、ガソリン、ケロ
セン、ジェットＡ燃料（Jet A fuel）、JP-4、JP-5、Fu
el oil #1、Fueloil #2、 Fuel oil #4、Fuel oil #6、
Heating fuel、ジーゼル油、タービン油、などの多環芳
香族炭化水素類（Polynuclear Aromatic Hydrocarbons
(PAHs)）、環状多環芳香族炭化水素類（C-PAH）、 全石
油炭化水素類（Total PetroleumHydrocarbons(TPH
s)）、BTEX(benzene,toluene,ethyl benzene,and xylen
s)、ベンゼン、２−アミノ−４，６−ジニトロトルエ
ン、４−アミノー２，６−ジニトロトルエン、２，４−
ジニトロアニリン、１，３−ジニトロベンゼン、２，４
−ジニトロフェノール、２−ニトロトルエン、３−ニト
ロトルエン、２，４−ジニトロトルエン、２，６−ジニ
トロトルエン、ピクリン酸、メチルー２，４，６−トリ
ニトロフェニルニトラミン、１，３，５−トリニトロベ
ンゼン、トリニトロトルエン（TNT）、オクタヒドロ−
１，３，５，７−テトラニトロ−１，３，５，７−テト
ラゾシン、ニトログリセリン、ニトログアニジン、ペン
タエリスリトール４硝酸、ＲＤＸ爆薬（RDX Explosive
s）、３塩化金、硝酸銀、水銀、トリハロメタン、トリ
クロロエチレン、テトラクロロエチレンなども含まれ
る。

【００１４】合成界面活性剤類としては、例えば直鎖ア
ルキルベンゼンスルホン酸及びその塩などの陰イオン界
面活性剤、ノニルフェノルエトキシレート、オクチルフ
ェノールエトキシレートなどの非イオン界面活性剤など
が挙げられ、又、これらの代謝物、分解物もこれに包含
される。

【００１５】農薬類としては、カルプロパミド、チオカ
ルバマート系化合物、クロルフェナピル、プレチラクロ
ール、プロピザミド、クロルメコート、マラチオン、フ
ェニトロチオン、イミダクロプリド、カルバリル、イナ
ベンフィド、ブタミホス、プロベナゾール、イソプロチ
オラン、ベンタゾン、トルクロホスメチル、フェンスル
ホチオン、ベンダイオカルブ、イプロジオン、イソキサ
チオン、ピリミカーブ、オキサミル、ダミノジッド、ホ
キシム、イマザリル、ミクロブタニル、トリフルミゾー
ル、ダイアジノン、プロピコナゾール、ビテルタノー
ル、フェノキシ酢酸類、酸アミド系化合物の他、2,4-
D、2,4-DNT、2,4-D酪酸ブチル、アセトアニリド、アセ
トクロール、アラクロール、スルホン酸アラクロール、
アルディカルブ、アルディカルブスルホン、アルディカ
ルブスルフォキサイド、 アルドリン、アメトリン、ア
トラジン、アジンフォス、ベノミール、α−BHC、δ−B
HC、γ−BHC(リンデン)、ビオレスメトリン、キャプタ
ン、カルバリル、カルベンダジム、カルボフラン、クロ
ルダン、クロロタロニル、クロルピリホス、クロルピリ
ホスーメチル、クロロスルフロン、シアナジン、シクロ
ジエン、DDD、DDE、DDT、ディカンバ、ジクロルプロ
プ、ディルドリン、ディクアット、ドルスバン、エンド
スルファン、エンドリン、エチル化アトラジン、フェニ
トロチオン、ヘプタクロル、ヘキサジノン、ヒドロキシ
アトラジン、イマザキン、イマザピル、イソプロツロ
ン、メツルフロン、メタラキシル、メソミル、メソプレ
ン、メトラクロル、メトリブジン、モリネート、パラコ
ート、パラチオン、ピクロラム、ピリミホスメチル、プ
ロシミドン、プロメトン、プロメトリン、レルダン、シ
ルベックス、シルベックス2,4,5-TP、シマジン、チアベ
ンダゾール、トキサフェン、トリアスルフロン、トリア
ジン、トリクロロピリヂノール、トリクロピル、トリフ
ルラリン、尿素系除草剤などがも挙げられ、これらの代
謝物、分解物もこれに含まれる。

【００１６】カビ毒類としては、アフラトキシン、Ｔ２
トキシン、オクラトキシン、ゼアラレノン、ＤＯＮ（デ
オキシニバレノール、ボミトキシン）、フモニシンなど
が挙げられ、また、これらの代謝物、分解物もこれに包
含される。トキシン類としては、麻痺性貝毒、黄色ブド
ウ球菌エンテロトキシン（Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ）などが
挙げられ、また、これらの代謝物、分解物もこれに包含
される。

【００１７】薬剤類としては、ペニシリン、セファロス
ポリン、ペネム、モノバクタム、クラブラン酸などの骨
格を含有するβ−ラクタム系抗生物質、モネンシン、サ
リノマイシン、エンジュラサイジンなどのポリエーテル
系抗生物質、カナマイシンなどのアミノグリコシド系抗
生物質、エンロフロキサンなどのニューキノロン系合成
抗菌剤、サルファメタジン、サルファジメトキシンなど
のサルファ剤、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン
などの抗生物質、ジゴキシン、テオフィリン、フェノバ
ルビタール、トレンボロンなどの薬剤が挙げられ、また
これらの代謝物、分解物もこれに包含される。

【００１８】アレルゲン類としては、ハウスダスト、ダ
ニ、ネコ上皮、イヌ上皮、スギ、ヒノキ、ハンノキ、ハ
ルガヤ、カモガヤ、オオアワガエリ、ブタクサ、ヨモ
ギ、アスペルギルス、カンジダ、アルテルナリア、卵
白、牛乳、小麦、米、大豆、タラ、マグロ、カニ、エ
ビ、ペニシリウム、クラドスポリウム、チェダーチー
ズ、牛肉、鶏肉、サケなどのアレルゲンが挙げられ、ま
た、これらの代謝物、分解物もこれに包含される。

【００１９】微生物類としては、サルモネラ、リステリ
ア、大腸菌、クリプトスポリジウム、ジアルジア、カン
ピロバクター、黄色ブドウ球菌、エルシニア、腸炎ビブ
リオ、真菌などの病原菌が挙げられ、その構成成分もこ
れに包含される。

【００２０】一方、抗原抗体反応妨害物質としては抗体
や酵素などのたんぱく質に影響を与える物質、例えば環
境汚染物質類、その分解物、殺菌消毒剤類、溶媒類など
が挙げられる。環境汚染物質類やその分解物としては、
界面活性剤類、環境水およびその濃縮物、フミン物質類
等が挙げられる。

【００２１】界面活性剤類としては、油脂、脂肪酸など
のカルボン酸型、アルキルサルフェート、アルキルエー
テルサルフェートなどの硫酸エステル型および／または
アルキル（アリル）スルホネート、（アルキル）ナフタ
リン酸などのスルホン酸型やアルキルリン酸エステルな
どのリン酸エステル型などの陰イオン界面活性剤類、４
級アンモニウム型などの陽イオン界面活性剤類、ポリオ
キシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンア
ルキルアリルエーテル、その他のエーテルなどのエーテ
ル型、多価アルコール系エステル・エーテルやその他の
エステルエーテルなどのエステルエーテル型、多価アル
コール・エステルなどの非イオン界面活性剤類が挙げら
れる。フミン物質としては、フルボ酸、フミン酸、フミ
ンおよびまたはその塩などが挙げられる。

【００２２】環境水およびその濃縮物としては、河川
水、湖沼水、海水、上水処理工程水、下水処理工程水お
よびそれらの濃縮物が挙げられる。殺菌消毒剤類として
は塩素剤類である塩素ガスや次亜塩素酸とその塩が挙げ
られる。

【００２３】溶媒としては、アルコール類、ニトリル
類、ケトン類、エステル類などが挙げられ、アルコール
類としては、メタノール、エタノール、プロパノール、
ブタノール、ニトリル類としては、アセトニトリル、ケ
トン類としては、アセトン、メチルイソブチルケトン
（MIBK）、エステル類としては、酢酸エチル、などが挙
げられる。

【００２４】測定対象物質に対する抗体であるイムノグ
ロブリン（Ｉｇ）の製造や、該Ｉｇに対する抗体（即ち
抗Ｉｇ抗体）の製造は、自体公知の方法、例えば、エン
ザイムイムノアッセイ、第４６頁〜７１頁及び第８５頁
〜１１０頁（Ｐ.TIJSSEN著、石川栄治監訳、東京化学同
人（１９８９））に記載された方法あるいはこれに準じ
る方法により行うことができる。

【００２５】これらの方法において、自体免疫原と成り
うる測定対象物質はそのまま、自体免疫原性を持たない
測定対象物質はそのハプテンを作製した後キャリヤー蛋
白質との複合体（免疫原）を形成させて動物に接種す
る。複合体を形成させて免疫する際のキャリヤー蛋白質
としては、例えば、牛血清アルブミン（以下、ＢＳＡと
略す）、卵白アルブミン（以下、ＯＶＡと略す）、スカ
シ貝ヘモシアニン（以下、ＫＬＨと略す）、牛チログロ
ブリン（以下、ＢＴＧと略す）などが挙げあられる。

【００２６】測定対象物質とキャリヤー蛋白質との複合
体の形成は、例えば、式（１） Ａ−Ｒ （１） （式中、Ｒは、ＣＯＯＨ、ＮＨ_２又はＳＨを、Ａは、Ｒ
基の離脱により、測定対象物質となる基を示す。）で表
される化合物（ハプテン）を、自体公知の方法によりキ
ャリヤー蛋白質に融合させることにより行うことができ
る。例えば、ＲがＣＯＯＨで、Ａがポリオキシエチレン
アルキルフェニルエーテルとなる式（１）で表される化
合物は、ポリオキシアルキルフェニルエーテルと無水コ
ハク酸を脱水縮合（ハーフエステル）することにより製
造できる〔キャンサー・バイオケミストリー・バイオフ
ィジックス（Cancer Biochem. Biophys.），７，１７５
（１９８４）〕。ＲがＮＨ_２で、Ａがポリオキシエチレ
ンアルキルフェニルエーテルとなる式（１）で表される
化合物は、ポリオキシアルキルフェニルエーテルの水酸
基を塩化チオニルにより塩酸化した後〔ジャーナル・オ
ブ・アメリカン・ケミカル・ソサエティー（J. Am. Che
m. soc.)，６０，２５４０（１９３８）〕、アンモニア
で処理することにより製造できる〔オーガニック・ファ
ンクショナル・グループ・プレパレーションズ（Organi
c Functional Group Preparations)、第１巻、３８２
頁〕。

【００２７】ＲがＳＨで、Ａがポリオキシエチレンアル
キルフェニルエーテルとなる式（１）で表される化合物
は、ポリオキシアルキルフェニルエーテルの水酸基を塩
化チオニルにより塩酸化した後〔ジャーナル・オブ・ア
メリカン・ケミカル・ソサエティー（J. Am. Chem. So
c.），６０，２５４０（１９３８）〕、水酸化ナトリウ
ムと反応させることにより製造できる〔ジャーナル・オ
ブ・アメリカン・ケミカル・ソサエティー（J. Am. Che
m. Soc.），７２，１８４３，（１９５０）〕。

【００２８】本発明における測定対象物質に対する抗体
は、自体公知の方法、すなわち測定対象物質または、上
記のような測定対象物質のハプテンとキャリアー蛋白質
との複合体（免疫原）で免疫した動物から得られるポリ
クローナル抗体又は該免疫した動物の脾細胞又はリンパ
節細胞と、骨髄腫細胞とを融合させて得られるモノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマに産生させること
により製造することができる。動物を免疫するには、測
定対象物質又は上記で得られたハプテンとキャリアー蛋
白質との複合体を動物に接種する。接種する動物として
は、例えば、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、ラット、マウス、
モルモット、ニワトリなどが用いられるが、測定対象物
質に対するモノクローナル抗体が所望の場合には、マウ
スが特に好ましく用いられる。接種方法としては、通常
実施される方法でよく、例えば、マウスに対し１回に約
１〜１００μｇ、好ましくは５０〜１００μｇを等容量
（０．１ｍｌ）の生理食塩水及びフロイントの完全アジ
ュバンド又はＲＩＢＩアジュバンドシステム^{Ｔ Ｍ}で乳化
して、背部、腹部の皮下あるいは腹腔内に２〜３週毎に
２〜６回接種する方法がとられる。ポリクローナル抗体
を得る場合には接種された動物の血清から、採取するこ
とにより行われる。モノクローナル抗体を得るには、さ
らに次の操作が行われる。これらの免疫動物、例えば、
マウスから抗体価の高い個体を選び、最終免疫３〜５日
後に脾臓あるいはリンパ節を採取し、それらに含まれる
抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させる。免疫する方法
としては、既知のインビトロ免疫法（ in vitro immuni
zation）やマウスフットパッド法（ Mouse Foot Pad ）
などを使用すれば、より短期間で抗体価が上昇する。

【００２９】融合操作は既知の方法に従って実施でき、
融合促進剤としては、ポリエチレングリコール（以下、
ＰＥＧと略す）や、センダイウイルスなどが挙げられる
が、好ましくは、ＰＥＧが用いられる。既知の電気パル
スを用いた方法（ Pulse Electric Fusion ）によって
も実施できる。骨髄腫細胞としてはＮＳ−１、Ｐ３Ｕ
１、Ｓｐ２／Ｏなどが用いられ、特にＰ３Ｕ１が好まし
い。例えば、脾細胞と骨髄腫細胞との好ましい比率は約
１：１〜１０：１で、これに分子量約１，０００〜６，
０００のＰＥＧが約１０〜８０％の濃度で添加され、約
２０〜３７℃、好ましくは３０〜３７℃で約３〜１０分
インキュベートするのがよい。ハイブリドーマによるモ
ノクローナル抗体の産生、精製も自体公知の方法で行う
ことが出来る。得られたモノクローナル抗体は、測定対
象物質や、式（１）で表される化合物に対する抗体とな
る。

【００３０】抗体の産生、精製方法の具体例としては、
例えば、前記「エンザイム・イムノアッセイ」第４６〜
７１頁、第８５〜１１０頁に記載され、塩析（Ｎａ_２Ｓ
Ｏ_４、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４）、イオン交換体（ＤＥＡ
Ｅ、ＱＡＥ、ＣＭ／セルロース、セファデックス、セフ
ァロースなど）、ゲル濾過(セファデックス G-200、Bio
-gel P-300など）、電気泳動（アガロースゲルによるゾ
ーン電気泳動、等電点電気泳動、等速電気泳動など）、
超遠心（ショ糖密度勾配遠心法）、アフィニティークロ
マトグラフィー（固定化プロテインＡ（Protein A Seph
arose、Protein ASuperose など） 固定化プロテインＧ
（Protein-Ｇ Sepharoseなど））などの方法が挙げられ
る。

【００３１】本発明で用いる抗体固定化用担体（以下、
担体と称することもある。）としては、免疫測定法にお
いて通常用いられるものを用いることができる。その例
としては、例えば、マイクロプレート（例、９６ウェル
マイクロプレート、２４ウェルマイクロプレート、１９
２ウェルマイクロプレート、３８４ウェルマイクロプレ
ートなど）、試験管（例、ガラス試験管、プラスチック
試験管）、ガラス粒子、ポリスチレン粒子、修飾ポリス
チレン粒子、ポリビニル粒子、ラテックス（例、ポリス
チレン・ラテックス）、ニトロセルロース膜、臭化シア
ン活性化濾紙、ＤＢＭ活性化濾紙、粒状固相（例、セフ
ァロース、セファデックス、アガロース、セルロース、
セファクリルなど）、鉄含有ポリカーボネート膜、マグ
ネット含有ビーズなどが挙げられる。担体に抗体を担持
させるには、自体公知の方法〔例、上記「エンザイムイ
ムノアッセイ」第２６８〜２９６頁、「アフィニティー
クロマトグラフィーハンドブック」（アマシャム ファ
ルマシア バイオテク株式会社（１９９８年１２月２０
日発行）〕などで担持できる。

【００３２】抗原抗体反応妨害物質耐性抗体を取得する
ときの抗体含有液としては、免疫中の動物の血清、HAT
スクリーニングにより融合細胞（ハイブリドーマ）のコ
ロニーが確認されたwellの培養上清、クローニング途中
のハイブリドーマの培養上清、クローニングにより純化
されたハイブリドーマの培養上清、マウス腹水で増殖し
た純化ハイブリドーマの腹水液、またはマウス腹水液か
ら精製された抗体液など、抗体取得行程のどの段階の抗
体含有液を使用しても良い。なお、抗体含有液の抗体濃
度により、抗体含有液を希釈して添加する場合もある。
この希釈倍数は、抗体濃度とアッセイ条件により異なる
が、通常数倍から数十万倍迄希釈して測定する必要が出
てくる場合もある。抗原酵素複合体（標識抗原）として
は、取得中の抗体と反応するものであれば、どのような
構造のものでも良い。また、酵素およびその基質として
は、通常の酵素免疫測定法で使用される酵素およびその
基質であればどの様なものでも良く、アルカリホスファ
ターゼ、アルコール脱水素酵素、β−D−ガラクトシダ
ーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、西洋わさび
ペルオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、グルコー
スオキシダーゼ、インベルターゼ、アセテートキナーゼ
やその基質などが好ましいが、測定感度の点から西洋わ
さびペルオキシダーゼとその基質が好ましい。

【００３３】抗原酵素複合体（標識抗原）の添加濃度
は、測定対象物質（抗原）および妨害物質を添加しない
ブランク時に吸光度が１〜２となるようにリン酸緩衝
液、生理的食塩水等で希釈しておくのがよい。添加する
測定対象物質は、妨害物質無添加時の阻害率が約50%と
なるよう緩衝液や10％メタノール等で希釈し、妨害物質
の添加濃度は、最終濃度で1〜1000 mg/Lとなるよう緩衝
液や10％メタノール等で段階希釈する。環境水およびそ
の濃縮物などの妨害物質は、原液またはその濃縮液を使
用する。環境水の濃縮液の作製は、溶媒濃縮、固相濃縮
や蒸発乾燥による濃縮など、既知のどのような方法でも
良く、その濃縮倍率は、用いる環境水の種類により異な
ってくるが、固化してしまい、緩衝液や溶媒等で溶解液
を作製することができなくなるような状態にならなけれ
ば、どのような濃縮倍率でも良い。なお、妨害物質とし
て溶媒を使用するときは100％未満の範囲で添加する。
抗原酵素複合体（標識抗原）、測定対象物質（抗原）、
妨害物質は混合後、固定化測定対象物質抗体または固定
化種特異的抗体と結合した測定対象物質抗体と反応させ
るが、反応温度および反応時間は、測定対象物質抗体や
種特異的抗体が変性しない温度および時間であればどの
様な条件でも良いが、4℃では一晩（16〜24時間）、室
温では0.1〜4時間が好ましい。未反応物質の洗浄液は、
上記抗体が変性しない洗浄液であればどのような液でも
良いが、pHの変動を押さえるために、リン酸緩衝化生理
食塩水（PBS）や、ツイーン−20を含むT−PBS等が好ま
しい。

【００３４】発色用の酵素基質は、使用した酵素の基質
であればどのようなものでも良い。例えば、アルカリホ
スファターゼの場合は、比色法では、p−ニトロフェニ
ルリン酸、フェニルリン酸／４−アミノアンチピリン、
蛍光法では、４−メチルウンベリフェリルリン酸、o−
メチルフルオレッセイン酸、フラボン−３−ジリン酸、
化学発光法では、オキシデレクターゼ／エタノール／AD
H／NADH、イソルミノール／マイクロペルオキシダ−
ゼ、アスコルビン酸−２−リン酸／ルシゲニン／OH^-、B
CIP（５−ブロム−４−クロロ−３−インドキシリル）
リン酸）／イソルミノール／マイクロペルオキシダ−
ゼ、AMPPD（３−（２′−スピロアダマンタン）−４−
メトキシ−（３′−ホスホリルオキシ）フェニル１，２
−ジオキセタン）、CSPD（３−（２−クロリナルドアダ
マンタン）−４−メトキシ−（３′−ホスホリルオキ
シ）フェニル１，２−ジオキセタン）、生物発光法で
は、D−ルシフェリンリン酸／ルシフェラーゼなどが、
ペルオキシダーゼの場合は、比色法では、５−アミノサ
リチル酸／過酸化水素、ABTS（２，２′−アジノジ（３
−エチルベンズチアゾリン）−６−スルホン酸）／過酸
化水素、テトラメチルベンチジン／過酸化水素、o−フ
ェニレンジアミン／過酸化水素、蛍光法では、ホモバニ
リン酸／過酸化水素、チラミン／過酸化水素、p−ヒド
ロキシフェニルプロピオン酸／過酸化水素、化学発光法
では、ルミノール／過酸化水素、ルミノール／過酸化水
素／p−ヨードフェノールなどが、グルコースオキシダ
ーゼの場合は、比色法では、グルコース／西洋わさびペ
ルオキシダ−ゼ／ABTS（２，２′−アジノジ（３−エチ
ルベンズチアゾリン）−６−スルホン酸）、蛍光法で
は、グルコース／西洋わさびペルオキシダ−ゼ／p−ヒ
ドロキシフェニルプロピオン酸、化学発光法では、グル
コース／ルミノール／Fe(CN)₆ ³⁺、グルコース／TCPO
（ビス（２，４，６−トリクロロフェニル）オキザレー
ト）／ANS（８−アニリノナフタレンスルホン酸、グル
コース／イソルミノール／マイクロペルオキシダ−ゼ、
グルコース／ルシゲニン／OH^-／塩化銅などが、β−D−
ガラクトシダーゼの場合は、比色法では、o−ニトロフ
ェニルβ−D−ガラクトピラノシド、蛍光法では、４−
メチルウンベリフェリルβ−D−ガラクトシド、化学発
光法では、ラクトース／グルコースオキシダーゼ／イソ
ルミノール／マイクロペルオキシダ−ゼ、ラクトース／
グルコースオキシダーゼ／TCPO（ビス（２，４，６−ト
リクロロフェニル）オキザレート）／ANS（８−アニリ
ノナフタレンスルホン酸）、AMPGD（３−（４−メトキ
シスピロ（１，２−デオキシジオキシタン−３，２′−
トリデカン−４−フェニル）、o−NPGal（o−ニトロ−
β−D−がラクトシド）／GalDH（ガラクト−スデハイド
ロゲナーゼ）／NAD⁺／NADH、生物発光法では、o−NPGal
（o−ニトロ−β−D−がラクトシド）／GalDH（ガラク
ト−スデハイドロゲナーゼ）／NAD⁺／NADHなどが、グル
コース−６−リン酸脱水素酵素の場合は、吸光度法で
は、グルコース−６−リン酸／NADP⁺、化学発光法で
は、グルコース−６−リン酸／NAD(P)⁺／NAD(P)Hなど、
数多くの基質が知られており、使用する酵素の基質であ
ればどのような基質でも使用可能である。

【００３５】発色後は、そのまま、または反応停止液を
添加して、所定の波長で測定する。例えば、アルカリフ
ォスファターゼの場合は、p−ニトロフェニルリン酸基
質では比色法405nmで、４−メチルウンベリフェリルリ
ン酸基質では蛍光法で、AMPPDやCSPDでは化学発光法
で、ペルオキシダ−ゼの場合は、５−アミノサリチル酸
基質では比色法492nmで、ABTS基質では比色法340nmまた
は414nm（酸化物）で、o−フェニレンジアミン基質では
比色法492nm（pH1.0）または445nm（pH5.0）で、テトラ
メチルベンチジン基質では比色法655nmまたは450nm（塩
酸や硫酸で反応停止時）、p−ヒドロキシフェニルプロ
ピオン酸では蛍光法で、ルミノール／過酸化水素基質で
は、化学発光法で測定する。測定後は、市販のデータ処
理ソフトウェア−（例えばデルタソフト）などを使用
し、妨害物質を添加したものと添加しないものについて
濃度を算出する。得られた濃度を下記のとおり妨害物質
の有無による回収率により比較し、より高濃度の妨害物
質の添加時でも回収率が１００％に近くなるもの（５０
〜２００％）を、妨害物質耐性の高い抗体として選択す
る。回収率は次の計算式により算出する。 回収率（％）＝測定対象物質算出濃度／添加した測定対
象物質濃度ｘ１００ 所望の抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングは、種
々の方法が使用できるが、例えば、測定対象物質のハプ
テンを結合させたＯＶＡを吸着させたマイクロプレート
にハイブリドーマ培養上清を添加し、ついで、西洋わさ
びペルオキシダーゼ（以下、ＨＲＰと略す）標識した抗
マウス免疫グロブリン抗体を加え、プレート固相に結合
した抗体を検出するＥＬＩＳＡ法などが挙げられる。抗
体活性陽性のハイブリドーマを直ちにクローニングに供
するが、通常これは即知の限界希釈法などで容易に実施
される。

【００３６】クローン化されたハイブリドーマ上清の抗
体価を上記の方法で測定し、安定的に力価の高い抗体を
産生するハイブリドーマを選別し、目的とするモノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマを取得することが
できる。このような方法により得られるハイブリドーマ
としては、例えば、後述の実施例１において得られたマ
ウス−ハイブリドーマＥＥ２−２２７、Ｅ１−４２０及
びＥ２−７３が挙げられる。これらは独立行政法人産業
技術総合研究所 特許生物寄託センターに、２００１年
４月２５日、それぞれ受託番号ＦＥＲＭ−ＢＰ７５６
７、ＦＥＲＭ−ＢＰ７５６８およびＦＥＲＭ−ＢＰ７５
６９として寄託されている。

【００３７】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明
する。 実施例１ １．モノクローナル抗体の取得 １−１ ハプテンの作成 （１）エチニルエストラジオール抗体用ハプテンの作成 エチニルエストラジオール（EE2）1.0ｇとナトリウムメ
チラート0.76gをエタノール35mlに溶解し、更にモノク
ロル酢酸0.41gを添加した後、22時間加熱還流した、減
圧濃縮後、水、酢酸エチル各約100mlを加えて分液し
た。水層を酢酸エチル50mlで洗浄後、濃塩酸で水層を酸
性化した(pH1-2)。酢酸エチル100mlおよび50mlで抽出
後、有機層を飽和食塩水30mlで洗浄し、無水硫酸ナトリ
ウムにて脱水した。減圧濃縮液を-20℃で２日間静置す
ることにより一部が結晶化した。この一部を採取し、種
結晶とした。濃縮液を少量のアセトンに溶解し、ヘキサ
ンおよび種結晶を加え結晶を沈殿させた。濾取した結晶
を減圧乾燥することにより目的物EE2-3-カルボキシメチ
ルエーテル（ＥＥ２−３ＣＭＥ）を取得した。

【００３８】（２）17β-エストラジオール抗体用ハプ
テンの作成 17β-エストラジオール(E2)1.0ｇとナトリウムメチラー
ト0.82gをエタノール35mlに溶解し、更にモノクロル酢
酸0.45gを添加した後、2日間加熱還流した、減圧濃縮
後、水約300ml、酢酸エチル約200mlを加えて分液した。
水層を酢酸エチル50mlで洗浄後、濃塩酸で水層を酸性化
した(pH1-2)。酢酸エチル100mlで2回抽出後、有機層を
飽和食塩水30mlで洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて脱水
した。減圧濃縮液を少量のアセトンに溶解し、イソプロ
ビルエーテル（IPE）を加え結晶を沈殿させた。濾取し
た結晶をIPEにて洗浄後、減圧乾燥することにより目的
物E2-3-カルボキシメチルエーテル（Ｅ２−３ＣＭＥ）
を取得した。

【００３９】（３）エストロン抗体用ハプテンの作成 エストラジオール-3.17-ジアセテート(E2-3,17-diAce)2
0gを酢酸25mlに溶解し、これを冷やしながら無水クロム
酸9g、酢酸27ml、水4mlの混液の４／５を徐々に加え
る。一夜攪拌後、水を加えてクロロホルムで抽出し、炭
酸カリウム溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水後、減
圧濃縮した。濃縮液をベンゼンに溶解後、カラムクロマ
トグラフィー(Wako gel 2w)にかけ、熱ベンゼンで溶出
し、粗6-オキソ- E2-3,17-diAceを分取した（TLCで確認
しながら原料を除去）。本物質を2-メトキシ-エタノー
ルに溶解し、20%NaOHを同量加え、100℃、1時間反応さ
せた。希塩酸にて酸性化後、酢酸エチルで溶出し、硫酸
ナトリウムで脱水後、減圧濃縮し、メタノールから再結
晶させた(6オキソ-E2)。6オキソ-E2 300mgをエタノール
2mlに溶解し、炭酸カリウム微細粉末を50mg添加し、ベ
ンジルブロマイド50μlを添加し、撹拌（70℃, 2時間）
し、濃縮物をメタノールを用い、再結晶化した (6-オキ
ソ- E2-3-ベンジルエーテル)。6-オキソ- E2-3-ベンジ
ルエーテルをメタノールに溶解し、カルボキシメトキシ
ルアミン・1/2HClとナトリウムメトキシド(1.2モル量)
を少量の水で溶かし、メタノールで薄めて加えた。 室
温で１時間反応させ、2/3を蒸発させ、水とHClで酸性化
後、酢酸エチル抽出、硫酸ナトリウムで脱水した。ヘキ
サンに溶解後、シリカゲルカラムに供与し、メタノール
で溶出することにより、精製後、メタノールから再結晶
させた。再結晶した物質0.6gをアセトン2mlに溶解し、
無水クロム酸1g、酢酸5ml、水1mlの混液の半分を加え、
発熱が終了後、酢酸エチルにより、抽出し、蒸発乾固し
た（6-オキソ-E1-3-ベンジルエーテル）。6-オキソ-E1-
3-ベンジルエーテル 400mgをメタノール5mlに溶解し、5
% Pd・C 100mgを加え水素を通して攪拌した。１時間反
応後蒸発乾固させ、メタノールから再結晶させることに
より、目的物6-オキソ-E1-6カルボキシメチルオキシム
（E1−６ＣＭＯ）を取得した。

【００４０】１−２ 免疫原の調製 １−１で得られた３種のハプテンについてそれぞれ、ハ
プテン0.1モル、水溶性カルボジイミド0.14モル、N-ヒ
ドロキシコハク酸イミド0.14モルをジメチルスルホキシ
ド2ml中で一晩反応させて、活性化エステルを作成し
た。次にスカシガイヘモシアニン(KLH)10mgを0.13モル
重炭酸ナトリウム(NaHCO₃)溶液に溶解し、本活性化エス
テル200μｌを添加後、一晩4℃で反応させた。ダルベッ
コリン酸緩衝液(PBS)に対する透析により未反応の試薬
を除去し、免疫原として凍結保存した

【００４１】１−３ 免疫 １−２で得られた免疫原を500μg/mlとなるようにPBSに
溶解し、等量のフロイントアジュバントまたはRIBIアジ
ュバントシステムに添加した。充分乳濁後、BALB/Cマウ
ス（メス）に100μg/マウスで皮下投与し、２週間（フ
ロインド）もしくは３週間（RIBI）間隔で追加免疫を実
施した。5〜6回の追加免疫後、最大の血清抗体価を示し
た個体について、同免疫原を静脈投与し(50μg/0.1ml P
BS/マウス)最終免疫とした。

【００４２】１−４ 細胞融合 １−３で最終免疫を実施したマウスから脾臓を摘出し
（最終免疫から３日後）、脾臓細胞を調製した。別途培
養したマウスミエローマ細胞と脾臓細胞を１：５の割合
でポリエチレングリコール（平均分子量4000）存在下で
接触させ、細胞融合を実施し、融合細胞（ハイブリドー
マ）を得た。このハイブリドーマをHAT培地に懸濁後、9
6wellマイクロプレートに巻き込み、炭酸ガスインキュ
ベーター（37℃、5%CO2）中で培養した。

【００４３】１−５ ハイブリドーマのスクリーニング (1)アッセイプレートの作成 ヤギ抗マウスIgAGM抗体(ICN／Cappel製、#55461)をPBS
に50μg/mlで溶解し、マイクロプレートに100μl/well
で添加した。4℃で一晩反応させた後、0.05%Tween20を
含むPBS(T-PBS)にて洗浄後(300μl/wellで2回)、PBSに
て4倍稀釈したブロックエース（雪印乳業（株）、東
京）を200μl/well添加した。４℃で一晩以上反応させ
た後、使用時まで冷蔵で保存した。

【００４４】(2)抗原酵素複合体（標識抗原）の作成 １−１で作成した３種のハプテンについてそれぞれ、ハ
プテン0.1モル、水溶性カルボジイミド0.14モル、N-ヒ
ドロキシコハク酸イミド0.14モルをジメチルスルホキシ
ド2ml中で一晩反応させて、活性化エステルを作成し
た。次に西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)10mgを0.13
モル重炭酸ナトリウム(NaHCO₃)溶液10mlに溶解し、本活
性化エステル15μｌを添加後、一晩4℃で反応させた。
限外ろ過により未反応の試薬を除去し、3mg/mlの濃度で
冷蔵保存した。

【００４５】(3)１次スクリーニング（抗原結合能試
験） １−４で細胞を巻き込んだマイクロプレートについて、
細胞の増殖が確認されたwellの培養液100μlを(1)で作
成したアッセイプレート（使用前にPBS(またはT-PBS)に
て洗浄後(300μl/wellで2回)）へ添加した。室温で１時
間反応後、T-PBSにて洗浄し(300μl/wellで3回)、１−
５(2)で作成した目的抗体の標識抗原をT-PBSに5000倍希
釈して、マイクロプレートに添加した。室温で１時間反
応後、T-PBSにて洗浄し(300μl/wellで3回)、TMBハ゜ーオキシ
タ゛ーセ゛基質キット（日本バイオ・ラッド、東京、#172-10
66： 以下発色基質）を100μl/wellで添加した。３０
分室温で反応後、１Ｎリン酸を100μl/wellで添加し、
発色反応を停止させた。450nmの波長で吸光度を読みと
り、吸光度１を越える細胞については24wellマイクロプ
レートへスケールアップした。

【００４６】(4)２次スクリーニング（女性ホルモン妨
害試験） １−５(3)で24wellマイクロプレートへスケールアップ
した細胞について、充分な細胞増殖が確認されたwellの
培養液を(1)で作成したアッセイプレート（使用前にPBS
(またはT-PBS)にて洗浄後(300μl/wellで2回)）へ100μ
lずつ複数のwellに添加した。室温で１時間反応後、T-P
BSにて洗浄し(300μl/wellで3回)、測定対象とする女性
ホルモン(1ng/ml in 10%メタノール（以下MeOH）)、も
しくは10% MeOHのみ（対照）と目的抗体の標識抗原(T-P
BSで5000倍希釈)を等量混合し、マイクロプレートに添
加した。室温で１時間反応後、T-PBSにて洗浄し(300μl
/wellで3回)、発色基質を100μl/wellで添加した。３０
分室温で反応後、１Ｎリン酸を100μl/well添加し、発
色反応を停止させた。450nmの波長で吸光度を読みと
り、対照と比較して、女性ホルモンの存在により吸光度
の低下が20%以上確認された細胞について常法に従いク
ローニングを実施し、以下に示す目的抗体産生ハイブリ
ドーマ候補株を取得した。

【００４７】１−６ 精製抗体の取得 細胞培養上清については４５−５０％飽和硫酸アンモニ
ウムで分画後、マウス腹水はそのまま常法により、プロ
テインGアフィニティークロマトグラフィーにて抗体を
取得、精製した。

【００４８】２．妨害物質耐性抗体の選別 １−５(4)で取得した細胞の培養上清を用いて、各抗体
の妨害物質耐性試験を実施した。なお、妨害物質として
は環境中に高濃度で存在し、かつ測定試料前処理段階で
測定物質と共に濃縮される可能性のある物質である、界
面活性剤およびフミン物質を使用した。

【００４９】実験方法 １−５(4)に準じて、女性ホルモン測定感度が最も高く
なる培養上清の希釈倍率を求めた。次に、その濃度で培
養上清中の抗体を抗マウスＩｇＧプレートに結合させて
おいたフ゜レートに対し、以下のサンプルと対象抗体の標識
抗原（T-PBSで5000倍希釈）を等量混合後、100μl添加
した。サンプルとしては直鎖アルキルベンゼンスルホン
酸ナトリウム(LAS)、アルキルフェノールエトキシレー
ト(APE)、アルキルエトキシレート(AE)（各0, 1, 10, 1
00, 1000mg/L in 10%MeOH）、フミン酸ナトリウム(0,
1, 10, 100mg/L in 10%MeOH)溶液に測定対象の女性ホル
モンを0.5μg/Lとなるように添加したもの、および添加
しないものを使用した。１−５(4)に準じてELISA測定を
行い、既知濃度の標準液により作製した標準曲線と比較
することによりサンプル中の女性ホルモン濃度を算出し
た。その算出値を添加した女性ホルモン濃度（0.5μg/
L）で割り１００倍して回収率を算出した。

【００５０】結果

【表１】

【００５１】抗EE2抗体では、本選択法で選出した抗EE2
-227抗体が、本選択法によらずに取得した抗EE2-8抗体
(対照)と比べて、約１０〜１００倍高濃度の妨害物質を
添加しても回収率が５０〜２００％程度であったことか
ら、その反応妨害物質に対する耐性度の高い抗体を産生
するマウスハイブリドーマＥＥ２−２２７株（ＦＥＥＭ
ＢＰ−７５６７）を選別した。また、抗E2抗体では、
本選択法で選出した抗E2-73抗体が、本選択法によらず
に取得された３種（E2-CC, E2-NG, E2-RB)の市販ELISA
キット使用抗体に比べて、約１０〜１００倍高濃度の妨
害物質（界面活性剤）を添加しても、回収率が５０〜２
００％であったことから、その反応妨害物質に対する高
い耐性度を有する抗体を産生するマウスハイブリドーマ
としてＥ２−７３株（ＦＥＥＭ ＢＰ−７５６９）を選
別した。また、本選択法で選出した抗Ｅ１−４２０抗体
も抗Ｅ２−７３抗体に匹敵する高い界面活性剤耐性を有
することから、その抗Ｅ１−４２０抗体を産生するマウ
スハイブリドーマとしてＥ１−４２０株（ＦＥＲＭ−Ｂ
Ｐ−７５６８）を選別した。

【００５２】実施例２ EE2-ELISAキットの作製 （１）「固相化プレート」の作製 Dulbecco'sPBS(-)（和光純薬 CodeNo.041-20211）に溶
解したヤギ抗マウスIgG抗体（ICN／Cappel社 CodeN0.55
479）を0.5μg／wellになるよう固相化プレート（Costa
r, EIA/RIA plate strip8, #2592）に分注し、４℃で
一晩静置後、洗浄液（T-PBS）300μLで３回洗浄した。
ブッロキング液（1%BlockAce（雪印乳業）+0.05%スラオフ72
N（武田薬品）in PBS）200 μL／wellを添加し、4℃で
一晩静置後、洗浄液（T-PBS）300μLで３回洗浄した。
ついで、PBS（含0.05%スラオフ72N+0.1%BSA）に溶解したエ
チニルエストラジオール抗体（EE2-227）を0.002μg／w
ellずつ添加し、4℃で一晩静置後、洗浄液（T-PBS）300
μLで３回洗浄した。ブッロキング液（1%BlockAce（雪
印乳業）+0.05%スラオフ72N（武田薬品）in PBS）200
μl/wellを添加し、4℃で一晩静置後、アスピレーター
で全量を吸引後、タッピングにより水分を除去した。脱
水乾燥した固相化プレートをアルミ袋に封入し、真空乾
燥機により脱気およびシールをして、2〜8℃の冷蔵庫に
保存した。

【００５３】（２）「EE2標準原液」(0.1mgEE2/L 10%Me
OH)の作製 原液１（1000mgEE2／L）の調製：エチニルエストラジオ
ール標準品（和光純薬CodeNo.055-05011）を、その含量
100%に対して100mgを正確に秤量し、100mlメスフラスコ
に入れ、メタノールでメスアップした。原液２（10mgEE
2／L）の調製：原液１ 1mlをホールピペットで正確に
秤り取り、100mlメスフラスコに入れ、メタノールでメ
スアップする。標準原液（0.1mgEE2／L）の調製：原液
２ 1mlをホールピペットで正確に秤取り、100mlメスフ
ラスコに入れ、メタノール、蒸留水でメスアップし最終
10%メタノール溶液となるよう調製した。適切な容器に4
mlの標準原液を入れ、2〜8℃の冷蔵庫に保存した。

【００５４】（３）「抗原酵素複合体溶液」の作製 水溶性カルボジイミド（WSC 同仁化学 ヘ゜フ゜チト゛合成用
CodeNo.348-03631）26mgとNヒドロキシサクシンイミ
ド（NHSI 和光純薬 ヘ゜フ゜チト゛合成用 CodeNo.089-0403
2）16mgをジメチルスルホキシド（DMSO和光純薬 特
級）2mlに溶解した。その内の0.5mlと実施例１で作成し
たハプテン（EE2-3CME）10mgを1mlのDMSOに溶解し、室
温で一晩反応させた。得られた反応液13μLと10ml の
1.1%NaHCO3に溶解したペルオキシダーゼ（POD ヘ゛ーリンカ゛
ー EIA用 CodeNo.814393）10mgを4℃で一晩撹拌しなが
ら反応させ、得られた反応液を分画分子量 30,000の限
外濾過膜で濾過し、0.05%スラオフ72N含有PBSで最終30m
lとすることにより、抗原酵素複合体溶液を得た。この
溶液２００μｌを適切な容器に分注後キャップをして２
〜８℃の冷蔵庫に保存した。

【００５５】（４）「抗原酵素複合体溶解液」の作製 500μLのTween-20（和光純薬 化学用 CodeNo.160-115
22）を4.5mlの蒸留水に溶解し、10% Tween-20溶液を作
製する。Na2HPO4・12H2O 13.26 g、NaH2PO4・2H2O 2.
02 g、NaCl 14.61 g、10%Tween-20溶液 10ml、スラオフ72
N 200 μlを、蒸留水1Lに溶解後、その8mlを適切な容
器に分注後キャップをして、2〜8℃の冷蔵庫に保存し
た。

【００５６】（５）「６倍濃縮洗浄液」の作製 20mlTween-20を200ml蒸留水に溶解し、１０％Tween-20
溶液を作製した。Dulbecco'sPBS(-)（和光 生化学用
CodeNo.041-20211）１２袋、スラオフ72N 0.3ml、10%T
ween-20 30mlを1Lの蒸留水に溶解後、５０mlずつ、適
切な容器に分注後キャップをして、2〜8℃の冷蔵庫に保
存した。

【００５７】（６）「発色基質溶液-A」の作製 5,5'−テトラメチルベンチジン（TMBZ 同仁化学 試験
研究用 CodeNo.346-040301）13.4mgを、ジメチルホル
ムアミド（DMF 和光純薬 試薬特級 CodeNo.045-0291
6）1mlに溶解し、0.1 g/L Tween 20を含む0.1M酢酸ナト
リウム緩衝液(pH5.5)100mlと混合し、適切な褐色容器に
１０ｍｌずつ分注後キャップをして、2〜8℃の冷蔵庫に
保存した。

【００５８】（７）「発色基質溶液-B」の作製 30%過酸化水素水（和光 試薬特級Code No. 081-0421
5）を蒸留水により0.1g/Lまで希釈し、適切な容器に５
ｍｌずつ分注後キャップをして、2〜8℃の冷蔵庫に保存
した。

【００５９】（８）「発色停止液」の作製 1Nリン酸溶液を調製し、15mlずつ適切な容器に分注後キ
ャップをして、室温で保存する。以上のようにして作製
した（１）から（８）迄のキット構成品を、箱詰めする
ことにより、EE2-ELISAキットが完成した。

【００６０】実施例３ EE2-ELISA キットによる定量 実施例２により作成したEE2-ELISAキットを使用した定
量法は下記の通りである。 （１）「エチニルエストラジオール（EE2）標準液」の
調製 メタノールおよび蒸留水を用いてEE2標準原液（0.1mg/L
10%メタノール溶液）を希釈し、必要な濃度 （例え
ば0, 0.05, 0.1, 0.3 , 1.0, 3.0μg/L 10%メタノール
中）のEE2標準液を調製する。 （２）「抗原酵素複合体溶液」の調製 「抗原酵素複合体溶液」14μLに、「抗原酵素複合体溶
解液」 7mLを加えて溶解し、「抗原酵素複合体溶液」
を調製する。 （３）「混合液」の調製 測定試料または「EE2標準液」（いずれも10% メタノー
ル溶液）100μL/wellと「抗原酵素複合体溶液」100μL/
wellを「混合用マイクロプレート」上で混合する。 （４）抗原抗体反応（競合反応） 「抗EE2モノクローナル抗体固相化プレート」に（３）
で調製した「混合液」を100μL/wellずつ分注し、室温
で60分間反応させる。 （５）「洗浄液」の調製 抗原抗体反応時間中に、「6倍濃縮洗浄液」と蒸留水を
1:5の割合で混合し、「洗浄液」を調製する。 （６）未反応物の除去 抗原抗体反応液を捨て、「洗浄液」300μL/wellを用い
てwell内を3回洗浄する。 （７）「発色試薬」の調製 「発色基質溶液-A」と「発色基質溶液-B」を3:1の割合
で混合し、「発色試薬」を調製する。 （８）発色反応／反応停止 （７）で調製した「発色試薬」を100μL/well加え、室
温で30分間反応させた後、「発色停止液」を100μL/wel
l添加し反応を停止する。 （９）比色および濃度計算 プレートリーダーを用い、波長450nmで吸光度を測定
し、標準曲線から試料中のEE2濃度を算出する。

【００６１】実施例４ EE2-ELISA キットによる標準
曲線の作成 実施例３に従い作成した標準曲線を図１に示す。なお、
EE2濃度を縦軸に、EE2濃度0μg/Lの時の吸光度と各濃度
での吸光度の比率（阻害率、B/B0%）を横軸にプロット
している。この結果からEE2の定量可能範囲は0.05-3μg
/L程度と考えられた。

【００６２】実施例５ 交差反応性試験 〔表２〕に示すエストロゲン類について実施例４と同様
にそれぞれの標準曲線を作成し、阻害率=50%となるとき
のEE2濃度（IC₅₀）を求め下式により交差反応性を求め
た結果を〔表２〕に示す。 交差反応性（％）＝求めるエストロゲンのIC₅₀／EE2のI
C₅₀ｘ１００

【００６３】

【表２】

【００６４】抗EE2-227抗体はEE2に対する特異性が非常
に高く、他のエストロゲン類とは殆ど反応しなかった。

【００６５】実施例６ 下水処理水測定におけるLC-MS/
MSとELISA測定値の比較 下水処理水１０Ｌについて、カ゛ラス繊維ろ紙でろ過後、1M
酢酸緩衝液(pH5.0)によりpHを5に調整した。ついでメタノー
ル5ml、蒸留水10mlでコンディショニングしたC-18固相カ
ートリッジに通水後、カートリッジを蒸留水、ヘキサン各5m
lで洗浄した。EE2をC-18固相カートリッジからジクロロ
メタン5mlで溶出後、溶出液を窒素気流下（４０℃）で
蒸発乾固し、１０%MeOHに溶解濃縮後、実施例−３によ
り、サンプル中のEE2濃度を定量した。なお、ELISA測定
には市販のEE2用ELISAキット(R-Biopharm GmbH、German、
#04330)も対照として用い、同封の操作説明書に従って
定量した。また、同様に処理したサンプルについて、辻
村らの方法（化学品検査協会創立５０周年記念講演およ
び第４回研究発表会講演要旨集、１９９９、１７−２
６）によりLC-MS/MS分析を行い、ELISA測定値と比較し
た。結果を〔表３〕に示す。

【００６６】

【表３】

【００６７】本選択法により妨害物質耐性抗体として選
択取得したEE2-227抗体を用いたELISAキットでの測定値はL
C-MS/MS測定値と近似したが、本選択法を適用せずに取
得した抗体を使用した市販ELISAキットでの測定値はLC-
MS/MSの約８倍となり、濃縮液中に存在する反応妨害物
質の影響を受けているものと考えられた。

【００６８】

【発明の効果】本発明の方法により選別された抗原抗体
反応妨害物質耐性抗体は、測定対象物を含む検体サンプ
ル中に抗原抗体反応妨害物質が夾雑していても、それに
影響されることなく測定対象物質を分析、測定すること
ができ、また測定対象物質の濃縮にも利用することがで
きる有用な抗体である。

【図面の簡単な説明】

【図１】 EE2-227抗体標準曲線

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/531 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ 33/577 5/00 Ｂ (72)発明者 小林 綾子 大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目17番85 号 武田薬品工業株式会社生活環境カンパ ニー内 (72)発明者 廣部 将人 大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目17番85 号 武田薬品工業株式会社生活環境カンパ ニー内 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA41 DA02 GA03 HA15 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA13 4B065 AA92X AB05 AC14 CA25 CA46 4H045 AA11 AA20 AA30 DA76 EA50 FA74

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】抗原抗体反応を用いて測定対象物質に対す
   る抗体を選別するに際し、抗原抗体反応妨害物質の存在
   下に目的抗体を選別する抗体の選別方法。
2. 【請求項２】測定対象物質が環境汚染物質である請求項
   １記載の抗体の選別方法。
3. 【請求項３】測定対象物質がホルモンである請求項１記
   載の抗体の選別方法。
4. 【請求項４】抗体がモノクローナル抗体である請求項１
   記載の抗体の選別方法。
5. 【請求項５】抗原抗体反応妨害物質が、環境汚染物質ま
   たはその分解物、殺菌消毒剤、または溶媒である請求項
   １記載の抗体の選別方法。
6. 【請求項６】環境汚染物質が界面活性剤、環境水または
   その濃縮物、またはフミン物質である請求項５記載の抗
   体の選別方法。
7. 【請求項７】界面活性剤が陰イオン界面活性剤、陽イオ
   ン界面活性剤または非イオン界面活性剤である請求項６
   記載の抗体の選別方法。
8. 【請求項８】環境水が河川水、湖沼水、海水、上水処理
   工程水または下水処理工程水である請求項６記載の抗体
   の選別方法。
9. 【請求項９】殺菌消毒剤が塩素剤である請求項５記載の
   抗体の選別方法。
10. 【請求項１０】溶媒が、アルコール類、ニトリル類、ケ
    トン類またはエステル類である請求項５記載の抗体の選
    別方法。
11. 【請求項１１】測定対象物質又は測定対象物質のハプテ
    ンと蛋白質との複合体を抗原として免疫した動物から得
    られたポリクローナル抗体、または測定対象物質又は測
    定対象物質のハプテンと蛋白質との複合体を抗原として
    免疫した動物の脾臓細胞またはリンパ節細胞と骨髄腫細
    胞とを融合して得られる測定対象物質又は測定対象物質
    のハプテンとその蛋白質との複合体に対するモノクロー
    ナル抗体を産生するハイブリドーマを培養して得られた
    モノクローナル抗体を、抗原抗体反応妨害物質の共存下
    に抗原酵素複合体（標識抗原）、測定対象物質又は測定
    対象物質のハプテンとその蛋白質との複合体（抗原）を
    反応させ、その反応率から抗原抗体反応妨害物質耐性抗
    体を選別する請求項１記載の抗体の選別方法。
12. 【請求項１２】請求項１１記載の抗体の選別方法により
    選別された抗原抗体反応妨害物質耐性モノクローナル抗
    体を産生するハイブリドーマ。
13. 【請求項１３】ハイブリドーマが、マウスハイブリドー
    マＥＥ２−２２７（ＦＥＲＭ ＢＰ−７５６７）、マウ
    スハイブリドーマＥ１−４２０（ＦＥＲＭ ＢＰ−７５
    ６８）又はマウスハイブリドーマＥ２−７３（ＦＥＲＭ
    ＢＰ−７５６９）である請求項１２記載のハイブリド
    ーマ。
14. 【請求項１４】請求項１１記載の抗体の選別方法で選別
    された抗原抗体反応妨害物質耐性抗体。
15. 【請求項１５】請求項１２記載のハイブリドーマによっ
    て産生された抗原抗体反応妨害物質耐性モノクローナル
    抗体。
16. 【請求項１６】請求項１４又は１５記載の抗原抗体反応
    妨害物質耐性抗体を必須の構成成分として含んでなる測
    定対象物質の免疫学的分析用キット。
17. 【請求項１７】請求項１４又は１５記載の抗原抗体反応
    妨害物質耐性抗体を必須の構成成分として含んでなる測
    定対象物質の免疫学的濃縮用キット。