JP2002527039A

JP2002527039A - Ａｍｐデアミナーゼ

Info

Publication number: JP2002527039A
Application number: JP2000541288A
Authority: JP
Inventors: レルヒル，イェンス; ラインドル，アンドレアス
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 1998-04-01
Filing date: 1999-03-25
Publication date: 2002-08-27
Also published as: EP1070120A1; AU3702199A; WO1999050400A1; CA2325054A1

Abstract

(57)【要約】本発明はＡＭＰデアミナーゼ（EC 3.5.4.6アデノシン一リン酸アミノヒドラーゼ）活性を有し、ポリペプチドをコードするＤＮＡに関する。更に、本発明は、この核酸をテストシステム製造のために使用する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、ＡＭＰジアミナーゼ（ＥＣ３．５．４．６、アデノシン三リン酸
アミノヒドロラーゼ）活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡに関する。
また、本発明はＡＭＰデアミナーゼ作用を有する植物由来のタンパク質をコード
する核酸を、ＡＭＰデアミナーゼ抑制因子（インヒビター）を同定するために使
用する方法に関する。更に本発明は、ＡＭＰデアミナーゼ抑制因子に対して優れ
た耐性を有する植物を製造するために、植物のＡＭＰデアミナーゼをコードする
核酸の使用法に関する。

【０００２】植物は二酸化炭素、水および無機塩から、その細胞の成分を合成することがで
きる。

【０００３】この過程は、有機物質を合成する生化学的反応を用いてのみ可能とされるもの
である。更に植物は核酸構成成分としてのヌクレオチドをデノボ合成する必要が
ある。

【０００４】ヌクレオチドの効率的な生成、利用および分配は、植物の細胞分裂および生長
に影響を与えるものと考えられる。植物は、ヌクレオチドの代謝機能に依存する
ため、この代謝が除草剤の使用の狙い目と考えられる。公知薬剤（例えば５'−
ホスホヒダントシジン、アラノシンまたはハダシジン）はアデニロスクシネート
シンセターゼを阻害する（Stayton等著、1983、Cuur. Top. Cell. Regul., 22,
103-141；Siehl等、1996、Plant Physiol.,110,753-758）。アデノシンスクシネ
ートシンセターゼにより触媒される反応を図１に示す。この場合、ヒダントシジ
ンはプロドラッグとして作用する。この薬剤は５’ＯＨ基でのリン酸化により代
謝され、除草剤となる（Siehl等、1996, Plant Physiol., 100, 753-758)。
ヌクレオチド代謝を調整するための重要な原理としては、デノボプリン生合成の酵素反応（例えばアデニロスクシネートシンセターゼ）の他に、再循環プロセ
スおよび分解機構がある。しかしながら、ＡＭＰデアミナーゼは特別な位置を占
めるため、ＡＭＰ（アデノシン一リン酸）を更に脱アミノし、ＩＭＰ（イノシン
５’−リン酸）とすることも可能である。この酵素は以下の反応を触媒する。

【０００５】

【化１】

【０００６】このタンパク質は種々の植物から部分的に精製されて得られており、その調節
特性が調査された。例えば、ホウレンソウの葉（YoshinoおよびMurakami,198、Z
. Pflanzenphyziologie, 99. 331-338）、キクイモ（Le Floc'hおよびLafleurie
l,1983, Physiologie Vergetale, 21 (1) 15-2）、エンドウの種子（Turnerおよ
びTurner、1961、Biochem. J. 79, 143）、およびカタランツス・ロゼウス（Cat
harantus roseus）の細胞培養体、ニチニチソウ種（lesser periwinkle）（Yabu
ki等、1992、Phytochemistry、３１（６）、１９０５−１９０９）についての調
査が行われた。更に、この酵素は細胞中のアデニレートプールの調節に中心的な
役割を果たしているものと考えられている（ChapmanおよびAtkinson, 1973, J.
Biol. Chem., 248, 8309; Solano and Coffee, 1978; Yoshino等、1979）。

【０００７】公知の天然物質であるコフォマイシン（coformycin)は植物に除草作用を示し
、リン酸化された状態（５’−ホスホコフォマイシン）が実際のＡＭＰデアミナ
ーゼ阻害因子であることがわかっている（Frieden等、1989、Biochem. 5303; Me
rkler等、1990、Biochem. 29, 8358-8464; Dancer等、1997、Plant Physiol., 1
14(l), 119-129)。特許では、ＷＯ９６／０１３２６に、ＡＭＰデアミナーゼ酵
素アッセイにより除草剤を見出す方法が記載されている（Pillmoor Pestic. Sci
., 1998, 52, 75-80も参照されたい）。

【０００８】ＡＭＰデアミナーゼをコードする遺伝子が、多くの有機体から単離されている
。哺乳類では、ＡＭＰデアミナーゼの遺伝子ファミリーが存在するものと考えら
れている（Morisaki等、1990, J. Biol. Chem. 265 (20), 11482-11486)。他の
コード配列が分裂酵母菌属（Schizosaccharomyces)試料（承認P50998)およびビ
ール酵母菌（Saccharomyces cerevisiae)（承認P15274)から単離されている。バ
クテリアからはアデニンデアミナーゼのみが得られており、ＡＭＰデアミナーゼ
の単離は未だ成功していない。est配列と呼ばれる発現配列の標識が、配列の比
較によりイネ（Genbank Acc: C26026)、および酵母ＡＭＰデアミナーゼと類似性
を有するシロイヌナズナ(Arabidopsis)（T21250)から発見された。植物ＡＭＰデ
アミナーゼの完全なｃＤＮＡ配列に関する報告は未だなされていない。

【０００９】しかるに、本発明は酵素ＡＭＰデアミナーゼをコードする完全な植物ｃＤＮＡ
を単離すること、およびバクテリアまたは真核細胞でその機能的発現を行い、抑
制因子−酵素の結合の研究を行うために、単純かつ低コストの方法で同酵素を得
ることを、その目的とする。

【００１０】本発明の他の目的は、ＡＭＰデアミナーゼ抑制因子に耐性を有する植物を製造
するために、ＡＭＰデアミナーゼを植物中で過剰に発現させることである。

【００１１】本発明者等は、これらの目的が植物酵素ＡＭＰデアミナーゼをコードする遺伝
子を単離することにより達成されること、およびこれをバクテリアもしくは植物
細胞、または植物において機能的に発現させることにより達成されることを見出
した。

【００１２】第一に、本発明はシロイヌナズナ(Arabidopsis thalina)由来の植物ＡＭＰデ
アミナーゼのコード領域を含むＤＮＡ配列SEQ ID NO:1に関する（図２参照）。

【００１３】更に、本発明はこのSEQ ID NO:1から得られるＤＮＡ配列、またはこれとハイ
ブリッドし、ＡＭＰデアミナーゼの生物学的活性を有するタンパク質をコードす
るＤＮＡ配列に関する。

【００１４】更に、本発明は、その配列がシロイヌナズナ由来のＡＭＰデアミナーゼまたは
その機能的等価物をコードする発現カセットに関する。この核酸配列は、この場
合ＤＮＡまたはｃＤＮＡ配列等とされる。

【００１５】本発明の発現カセットは、宿主細胞におけるコード配列の発現を調整する、調
節核酸配列を付加的に含むものである。好ましい実施の形態において、本発明の
発現カセットは、上流、すなわちコード配列の５’端にプロモーターを、上流、
すなわち３’端にポリアデニル化シグナルを含み、必要に応じて更に、この間に
配置されＡＭＰデアミナーゼ遺伝子コード配列に作用的に連結される調節因子を
含む。ここで、「作用的に連結される」とはプロモーター、コード配列、ターミ
ネーター、および必要に応じて他の調節因子が、各調節因子がコード配列の発現
に関する機能を的確に行えるような順番に配列されていることを意味する。

【００１６】本発明の発現カセットは、適当なプロモーターを、適当なＡＭＰデアミナーゼ
ＤＮＡ配列とポリアデニルかシグナルに、例えばT. Maniatis, E. F. Fritschお
よびJ. Sambrook, Molecular Cloning: A Labratory Manual, Cold Spring Harb
or Laboratory, Cold Spring Harbor，NY(1989)および T.J. Silhavy, M.L. Ber
manおよびL.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, NY(1984)およびAusubel, F.M. 等、Current
Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc.およびWiley-Int
erscience (1987）等に記載の公知組換え技術およびクローニング技術による融
合により得られる。

【００１７】特に好ましい配列は、アポプラスト中を、色素体中、液胞、ミトコンドリア、
小胞体（ＥＲ）中に向かうものである。或いは適切な作用的配列が存在しないこ
とによりこれらの区画におけるサイトゾルの製造を滞らせることになる（Kermod
e, Crit. Res. Plant Sci．15.4(1996)、285-532）。例えば、植物発現カセッ
トはタバコの形質転換ベクターpBinAR-Hygに導入される（実施例５参照のこと）
。

【００１８】本発明の発現カセット用のプロモーターとして、原則的には植物の外来遺伝子
の発現を制御するあらゆるプロモーターが用いられる。植物プロモーターまたは
植物ウイルス由来のプロモーターを使用するのが特に好ましい。カリフラワーモ
ザイクウイルスのCaMV 35S-プロモーター（Franck等、Cell 21(1980) 285-294）
が特に好ましい。このプロモーターは、複数の転写エフェクター用の種々の認識
配列を含むものであり、これらが全体で、導入された遺伝子の永久の構成性発現
を行うものである(Benfey等、EMBO J. 8(1989)2195-2202)。

【００１９】本発明の発現カセットは、化学的に誘導されるプロモーターを含んでもよく、
これにより、植物において外因性ＡＭＰデアミナーゼの発現が適当な時期に行わ
れるように制御することが可能となる。この種のプロモーター、例えばPRP1プロ
モーター（Ward等、Plant. Mol. Biol. 22(1993), 361-366)、サリチル酸から誘
導可能なプロモーター（WO 95/1919443)、ベンゼンスルホンアミド−誘導性プロ
モーター（EP 388186)、テトラサイクリン−誘導性プロモーター（Gatz等、(199
2)Plant J. 2,397-404）、アブシン酸−誘導性プロモーター（EP 335528)、また
はエタノール−またはシクロヘキサノン誘導性プロモーター(WO 9321334)が文献
に記載されており、使用される。

【００２０】更に、特に好ましいプロモーターは、プリンまたはその前駆体の合成が起こる
組織または植物の部位においての発現を確実とするものである。葉に特異的な発
現を起こすプロモーターが特に好ましい。バレイショのサイトゾルのFBPaseまた
はバレイショのサイトゾルのST-LS1プロモーター（Stockhaus等、EMBO J. 8(198
9)２４４５−２４５）。

【００２１】種子に特異的なプロモーターを用い、外部タンパク質を、トランスジェニック
タバコ植物の種子中の全可溶性種子タンパク質の０．６７％まで安定に発現させ
ることが可能である（FiedlerおよびConrad, Bio/Techonology 10(1995)、1090
-1094)。従って、本発明の発現カセットは、例えば種子に特異的なプロモーター
（好ましくはファセオリンプロモーター、USPまたはLEB4プロモーター）、LEB4
シグナルペプチド、発現されるべき遺伝子、およびER残留シグナルを含む。

【００２２】多くのマメ科植物は固定窒素をウレイドの形態で根粒から上記組織に運搬する
（Schubert、1986、Ann. Rev. Plant Phys. 37, 539-574)。ウレイドはプリン生
合成により生成する。瘤−（根粒−）特異的なＡＭＰデアミナーゼのプロモータ
ーにより、マメ科植物における発現とこれによるウレイド生合成が特異的に修飾
される。すなわち、本発明による遺伝子発現カセットは、グリシンmaxからのホ
スホリボシル−ピロリン酸アミドトランスフェラーゼのプロモーター（Genbank
承認No.U87999参照）またはEP 249676に記載のような他の瘤特異的プロモーター
を含んでもよい。

【００２３】ＡＭＰデアミナーゼ用の挿入ヌクレオチド配列コードは、合成または天然に得
られるが、合成および天然の各ＤＮＡ成分の混合物を含んでもよい。一般に、合
成のヌクレオチド配列は植物に多く含まれるコドンから得られる。これらの、植
物に多く含まれるコドンは、最高タンパク質頻度を有し、所望の植物種の大部分
に発現されるコドンから選択される。発現カセットを製造するために、種々のＤ
ＮＡフラグメントを巧みに操作して、正しい方向に読め、正しい読み枠を有する
ヌクレオチド配列を得る。アダプターおよびリンカーをフラグメントに結合し、
更にこのＤＮＡフラグメントを互いに連結してもよい。

【００２４】酵母と植物のＡＭＰデアミナーゼのＤＮＡレベルでの配列相同性は、例えば配
列M30449（Genbank承認番号）の1345-2715塩基領域の選択された、高い相同性を
有する領域（５７％）によるものであるが、これはBLAST M30449を用いて構築さ
れたものである（Altschul等、(1990)、J. Mol. Biol.:215:403-419, Gish and
States,(1993) Nature Genet. §:266-272)。上記フラグメントでは、２０−３
０ヌクレオチド領域の相同性が非常に高いため、他の植物からのＡＭＰデアミナ
ーゼのオリゴヌクレオチドに基づくスクリーニングに成功する、十分な可能性が
ある。対照の配列と比較して、小さい領域でのみ優れた相同性を有するＤＮＡ配
列を検知するための、短いオリゴヌクレオチドを用いたハイブリダイズの方法が
Sambook等の論考（1989、Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969
-309-6)に記載されている。

【００２５】更に、本発明はＡＭＰデアミナーゼ遺伝子をコードし、遺伝子全長に対して、
SEQ ID NO:1のＤＮＡ配列と４０−１００％の配列相同性を有する機能的に等価
なＤＮＡ配列に関する。

【００２６】更に、本発明はＡＭＰデアミナーゼ遺伝子をコードし、遺伝子全長に対して、
SEQ ID NO:1のＤＮＡ配列と６０−１００％の配列相同性を有する機能的に等価
なＤＮＡ配列に関する。

【００２７】本発明による、ＡＭＰデアミナーゼ遺伝子をコードする機能的に等価な配列と
は、異なるヌクレオチド配列にも関わらず、所望の機能を保持している配列であ
る。つまり、機能的等価物とは、本明細書に記載の配列の自然に起こる変形配列
および人為的ヌクレオチド配列、例えば植物のコドン使用に適合した化学的合成
により得られる配列を含む。

【００２８】更に、機能的等価物とは、特にＡＭＰデアミナーゼをコードする元来単離され
ている配列の天然または人為的な突然変異体であって、所望の機能を保持するも
のである。突然変異とは、1個以上のヌクレオチド残基の置換、付加、欠失、転
座または挿入を含む。

【００２９】すなわち、例えばこのヌクレオチド配列を修飾して得られるヌクレオチド配列
も本願に含まれることを意味する。この様な修飾の目的は、ヌクレオチドに含ま
れるコード配列の更なる局在化等、例えば更に制限酵素切断部位を挿入すること
などである。

【００３０】機能的等価物は、更に元来の遺伝子または遺伝子フラグメントと比較して、そ
の機能に上下のみられる変形例も含まれる。

【００３１】人工のＤＮＡ配列も、上述のように農作物中のＡＭＰデアミナーゼ遺伝子の過
剰発現により植物中のＩＭＰ含有率を高めるという所望の性質を与えるものであ
る限り、好適に用いられる。この様なＤＮＡ配列は、ＡＭＰデアミナーゼ活性を
有するタンパク質の逆転写や分子設計により、或いはインビトロの選択により得
られる。特に適するコード化ＤＮＡ配列は、宿主植物に特有なコドン使用に従っ
て、そのポリペプチド配列を逆転写することにより得られる。特有のコドンの使
用は、植物遺伝学に精通した熟練者が、形質転換を受ける植物の他の公知の遺伝
子をコンピュータ分析すれば容易に見つけうる。

【００３２】本発明における他の等価な核酸配列としては、融合タンパク質をコードする配
列であり、この融合タンパク質の一成分が植物ＡＭＰデアミナーゼポリペプチド
またはこれと機能的に等価な部分である配列が挙げられる。この融合タンパク質
の第二の部分は、酵素活性を有する他のポリペプチド、またはＡＭＰデアミナー
ゼ発現の検知に使用可能な抗原ポリペプチド配列（例えばｍｙｃ標識またはｈｉ
ｓ標識）である。しかしながら、これがＡＭＰデアミナーゼを所望の作用部位に
導くシグナルペプチドまたはトランジットペプチド等の調節タンパク質配列であ
るのが好ましい。

【００３３】本発明のプロモーター領域とターミネーター領域は、この配列の挿入用の１カ
所以上の切断部位を有するリンカーまたはポリリンカーを転写方向に含むと有利
である。一般に、リンカーは１〜１０箇所、通常は１〜８箇所、好ましくは２〜
６箇所の切断部位を有する。この調節領域におけるリンカーのサイズは、一般に
１００ｂｐ未満、多くは６０ｂｐ未満であるが、５ｐｂ以上とされる。本発明で
使用されるプロモーターは宿主植物に固有(自生）または相同であっても、外来
または異種であってもよい。本発明の発現カセットは、５’−３’の転写方向に
、本発明のプロモーター、何らかの適する配列、および転写終止領域を含む。必
要に応じて種々の終了領域を互いに交換してもよい。

【００３４】また、適当な制限切断部位を施したり、過剰のＤＮＡまたは制限切断部位を取
り除く操作を行ってもよい。挿入、欠失、または置換、例えばトランジションま
たはトランスバージョンを考慮して、インビトロの変異生成、プライマー修復、
制限または結紮を行ってもよい。適当な操作、例えば制限、フラグメントの平滑
末端、相補的末端の突出部分（overhang）のチューイング・バックまたは充填を
結紮の際に行ってもよい。

【００３５】本発明の結果に関して、特異的なＥＲ残留シグナルSEKDELを取り付けることが
特に重要であり（Schouten, A.等、Plant Mol. Biol. 30 (1996), 781-792)、こ
れにより発現の平均水準が三倍ないし四倍とされる。植物や動物のタンパク質の
ERに天然に存在する他の残留シグナルを、カセットの構築に用いてもよい。

【００３６】好ましいポリアデニル化シグナルは、植物のポリアデニル化シグナル、好まし
くはアグロバクテリウム・ツメファシエンス由来のＴ−ＤＮＡポリアデニル化シ
グナル、特に、ＴｉプラスミドｐＴｉＡＣＨ５（Gielen等、EMBO J.3(1984)835
ページ以降）のＴ−ＤＮＡの第３遺伝子（オクトピン合成）に対応するＴ−ＤＮ
Ａポリアデニル化シグナルまたはその機能的等価物である。

【００３７】ＡＭＰデアミナーゼをコードするＤＡＮを有する宿主植物をトランスフォーム
するためには、本発明の発現カセットを、ベクターＤＮＡが他の機能的調節シグ
ナル、例えば複製または組み込みのための配列を含む組換えベクターに挿入する
。適するベクターは、特に「Methods in Plant Molecular Biology and Biotech
nology」（CRC出版）、第6／7章、７１−１１９ページに記載されている。

【００３８】外来遺伝子を植物ゲノムに導入することを形質転換（トランスフォーメーショ
ン）という。このために用いられる方法は、一時的または安定な形質転換をもた
らすための、植物の形質転換、または植物組織もしくは植物細胞からの植物の再
生に関して開示されたものである。適する方法は、ポロエチレングリコール−誘
導ＤＮＡ取り込みによるプロトプラスト形質転換、遺伝子銃、電気泳動、ＤＮＡ
含有溶液での乾燥胚の培養、顕微注射、およびアグロバクテリウム仲介による遺
伝子導入である。これらの方法は、例えばTransgenic Plants, 第1巻におけるB.
Jenes等著、Techniques for Gene Transfer、Engineering and Utilization, S
.D. KungおよびR. Wu編、Academic Press (1993) 128-143およびPotrykus, Annu
. Rev. Plant Physol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225)に記載されてい
る。発現すべき構成をアグロバクテリウム・ツメファシエンスの形質転換に適す
るベクター、例えばpBin19にクローニングするのが好ましい（Bevan等、Nucl. A
cads Res. 12 (1984) 8711)。

【００３９】本発明の発現カセットにより形質転換を受けたアグロバクテリアも、同様に公
知方法での植物の形質転換、特に農作物、例えば穀物、トウモロコシ、大豆、イ
ネ、綿花、サトウキビ、キャノーラ、ヒマワリ、アマ、アサ、バレイショ、タバ
コ、トマト、アブラナ、アルファルファ、レタスおよび種々の樹木、木の実、ツ
ル植物、マメ科植物の形質転換に使用可能である。例えば損傷を受けた葉または
葉の断片をアグロバクテリア溶液に浸し、適する媒体中で培養する。

【００４０】プリン生合成の行われる部位は一般に葉部の組織であるため、ＡＭＰデアミナ
ーゼ遺伝子の葉に特異的な発現は認識できる。しかしながら、プリン合成は葉部
組織に限られる必要はなく、植物のあらゆる他の部分、例えば油を含む種等で組
織特異的に起こり得ることは明白である。

【００４１】多くのマメ科植物は固定窒素をウレイドの形態で根粒から上記基本組織に運搬
する（Schubert、1986、Ann. Rev. Plant Phys. 37, 539-574)。ウレイドはプリ
ン生合成により生成する。瘤−（根粒−）特異的なＡＭＰデアミナーゼのプロモ
ーターにより、マメ科植物における発現とこれによるウレイド生合成が特異的に
修飾される。すなわち、本発明による遺伝子発現カセットは、グリシンmax（Ben
bank承認No. U87999参照）からのホスホリボシル−ピロリン酸アミドトランスフ
ェラーゼのプロモーターまたはEP 249676に記載のような他の瘤特異的プロモー
ターを含んでもよい。

【００４２】更に、外部ＡＭＰデアミナーゼ遺伝子の構成性発現は有利であるが、一方で誘
導性発現も望ましいと考えられる。

【００４３】上述の組換え技術とクローニング技術により、本発明の発現カセットを複製可
能な、E. coli等における適当なベクターにクローンしてもよい。適するクロー
ニング・ベクターは、特にｐBR332、ｐUC系列、M13mp系列、およびｐACYC184で
ある。E. coliとアグロバクテリアの双方において複製可能な二元性ベクターが
特に好ましい。

【００４４】本発明は更に、本発明の発現カセットを、植物、植物細胞、植物組織、または
植物の部分を形質転換するために用いる方法に関する。この使用の目的は、植物
中のＡＭＰデアミナーゼ含有量を向上させることである。

【００４５】本発明の発現カセットは、使用するプロモーターに応じて、植物の葉部、種子
または他の部分での特異的な発現に関与するものとされる。本発明は、更にこの
様なトランスジェニック植物、その増殖材料、およびこの様な植物の植物細胞、
組織または部分に関する。

【００４６】また、本発明の発現カセットを、適当な量の酵素ＡＭＰデアミナーゼを製造す
るために、バクテリア、シアノバクテリア、酵母、繊維状菌、藻類の形質転換に
使用することも可能である。

【００４７】更に、本発明は、ＡＭＰデアミナーゼ活性を有する、アミノ酸配列SEQ ID NO:
2を有するシロイヌナズナ(Arabidopsis thalina)由来のタンパク質、誘導体、ま
たはこのタンパク質の一部に関する。ビール酵母菌（Saccharomyces cerevisiae
)と比較すると、アミノ酸レベルの相同性は４３−４７％同一である（図４参照
）。

【００４８】本発明は、ビール酵母菌ＡＭＰデアミナーゼとのアミノ酸配列相同性が２０−
１００％同一の、ＡＭＰデアミナーゼ活性を有する植物タンパク質に関する。

【００４９】シロイヌナズナＡＭＰジアミナーゼとアミノ酸相同性が５０〜１００％同一の
ＡＭＰジアミナーゼ活性を有する植物タンパク質が好ましく用いられる。

【００５０】更に、シロイヌナズナＡＭＰジアミナーゼとアミノ酸相同性が８０〜１００％
同一のＡＭＰジアミナーゼ活性を有する植物タンパク質が、特に好ましく用いら
れる。

【００５１】上記のように、ＡＭＰデアミナーゼは除草剤の適当な標的となる。更に効率的
なＡＭＰデアミナーゼ抑制因子を探すためには、抑制因子−酵素結合の研究に用
いられる適当な試験システムを提供することが必要である。このためには、例え
ば、シロイヌナズナ由来のＡＭＰデアミナーゼの完全なｃＤＮＡ配列を発現ベク
ターにクローンし（pQE, Qiagen）、E. coliで過剰に発現させる。

【００５２】本発明の発現カセットを用いることにより発現するＡＭＰデアミナーゼタンパ
ク質は、ＡＭＰデアミナーゼに特異的な抑制因子を見つけるために特に適当であ
る。

【００５３】この目的で、ＡＭＰデアミナーゼは、例えば試験対象の薬剤存在下または不存
在下にＡＭＰデアミナーゼの活性を測定する酵素アッセイで使用される。２種類
の活性測定の比較により、試験対象の薬剤の抑制挙動についての定性的、定量的
記述が可能となる（実施例４参照）。

【００５４】本発明の被検システムを用いると、大量の化合物の除草特性を迅速かつ率直に
調べることができる。この方法により、更なる徹底的な試験のために、大量の、
特に有効物質からの再現的選択が可能となる。この試験は当業者に周知の方法で
あり、これらの物質を用いて行われる。

【００５５】更に、本発明は上記試験システムを用いて同定可能な除草剤に関する。

【００５６】植物におけるＡＭＰデアミナーゼをコードするSEQ ID NO:1の遺伝子配列が過
剰発現すると、ＡＭＰデアミナーゼ抑制因子への耐性が向上する。本発明は、更
にこのように得られたトランスジェニック植物に関する。

【００５７】形質転換により発現したＡＭＰデアミナーゼの発現効率は、例えばインビトロ
の苗条分裂組織増殖、または発芽試験により測定可能である。更に、ＡＭＰデア
ミナーゼ遺伝子の発現の性質と水準の変化と、そのＡＭＰデアミナーゼに対する
耐性についての効果を、温室実験により被検植物について調べることができる。

【００５８】本発明は、更に本発明の発現カセットにより形質転換されたトランスジェニッ
ク植物、トランスジェニック細胞、組織、部分、およびこの様な植物の増殖材料
に関する。これに関して、例えば大麦、小麦、ライ麦、トウモロコシ、大豆、イ
ネ、綿花、サトウキビ、キャノーラ、ヒマワリ、アマ、アサ、バレイショ、タバ
コ、トマト、アブラナ、アルファルファ、レタスおよび種々の樹木、木の実、ツ
ル植物、マメ科植物を用いるのが好ましい。

【００５９】更に、本発明はＤＮＡ−SEQ ID NO:1の発現により、ＩＭＰ含有率が向上する
植物に関する。

【００６０】本発明における、イノシン５’−リン酸（ＩＭＰ）含有量の増加とは、少なく
とも一植物世代の間に遺伝子操作を行わなかった植物と比較して、植物内のＡＭ
Ｐデアミナーゼ遺伝子の機能的過剰発現によりＩＭＰ生合成効率が改善された人
工的に得られた能力を意味する。

【００６１】以下に、実施例により本発明を更に説明する。本発明は以下の実施例に限定さ
れるものではない。［実施例］Ａ．実施例で用いる遺伝子操作法［一般的なクローニング法］クローニング法、例えば制限酵素による切断、アガロース・ゲル電気泳動、ＤＮ
Ａフラグメントの精製、ニトロセルロースおよびナイロン膜への核酸の転移、Ｄ
ＮＡフラグメントの結合、Escherichia Coli細胞の形質転換、バクテリアの培養
、組換えＤＮＡの配列分析は、Sambook等の論考に従って行った（1998)（Cold S
pring Harbor Labratory Press: ISBN 0-87969-309-6)。［組換えＤＮＡの配列解析］組換えＤＮＡ分子をＡＢＩ社製、2レーザー蛍光ＤＮＡシーケンサーを用い、S
angerの方法により配列した（Sanger等、(1977)Proc. Natl. Acad. Sci. USA74,
5463-5467)。ポリメラーゼ連鎖反応により得られたフラグメントを配列し、発
現に用いられる構成物中のポリメラーゼエラーを回避すべくチェックした。［植物組織からの完全なＲＮＡの分析］植物の組織から、完全なＲＮＡをLogemann等の論考、((1987)Anal. Biochem.
163.21)に記載のように単離した。この分析用にそれぞれ２０ｍｇのＲＮＡをホ
ルムアルデヒド含有１．５％アガロースゲルで分画し、ナイロン膜に移行させた
（Hybond,Amersham)。Amasinoの論考に記載されているように特異的な転写が検
知された（(1986)Anal. Biochem. 152, 304)。試料として使用するｃＤＮＡフラ
グメントをランダムプライムドＤＮＡ標識キットにより放射線標識し（Boehring
er、マンハイム）、標準的方法でハイブリッドした(Hybond information for us
ers, Amersham)。ハイブリダイゼーションシグナルを、コダック社製、X-OMAT A
Rフィルムを用いたオートラジオグラフィーで可視化した。

【００６２】以下に用いるバクテリア株(E. coli、XL-I Blue)は、NP66の場合に、Stratage
neまたはPharmaciaから購入したものである。植物の形質転換に用いたアグロバ
クテリウム株（Agrobacterium tsumefaciens, C58C1,プラスミドpGV2260またはp
GV3850kan含有）についてはDeblaereによる報告がある（Nucl. Acids Res. 13(1
985) 4777)。或いは、アグロバクテリウム株、LBA4404（Clontech)または他の適
する株も使用可能である。クローニングに使用可能なベクターはpUC19（Yanishi
-Perron, Gene 33(1985),１０３−１１９）、pBluescript SK-（Stratagene)、
pGEM-T（Promega)、ｐZerO(Invitrogen)、pBin19(Bevan等、Nucl. Acids Res. 1
2(1984) 8711-8720）およびpBinAR（HoefgenおよびWillmitzer、Plant Science
66(1990)221-230)である。

【００６３】［実施例１］合成によるオリゴヌクレオチドを用いたＡＭＰデアミナーゼのＲＣＰ増幅ＡＭＰデアミナーゼをコードするシロイヌナズナｅｓｔクローンをArbidopsis
Biological Resorce Center(オハイオ州立大学）から購入した。これは部分的
なｃＤＮＡのクローン（Ｔ２１２５０）であり、ＡＭＰデアミナーゼの全長にわ
たる転写に対応するものではない。シロイヌナズナのＡＭＰデアミナーゼのＰＣ
Ｒ増幅は、Perkin Elmer製のＤＮＡ熱循環器中で行った。使用したオリゴヌクレ
オチド、５’プライマーＣＧＡＧＡＴＡＧＣＴＣＧＴＡＡＣおよび３’プライマ
ーＡＧＣＣＣＡＣＴＣＡＴＡＴＴＡＴＴを、完成した配列から取り出した。反応
混合物は８ｎｇ／μｌのEscherichia coli由来のゲノムＤＮＡ、０．５μＭの適
当なオリゴヌクレオチド、２００μＭヌクレオチド(Pharmacia)、５０ｍＭのＫ
Ｃｌ、１０ｍＭのｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃におけるｐＨ８．３、１．５ｍＭ
ＭｇＣｌ₂）および０．０２Ｕ／μｌのTaqポリメラーゼ（Perkin Elmer）を含む
ものである。

【００６４】増幅条件を以下の通りに設定した。

【００６５】アニーリング温度：５２℃、１分変性温度：９２℃、1分伸長温度：７２℃、1．5分サイクル数：４０得られたフラグメントは、estクローンT21250の小さい部分を有し、シロイヌ
ナズナｃＤＮＡバンク（Stratagene)の異種スクリーニングを行うために使用し
た。シロイヌナズナｃＤＮＡライブラリー（Stratagene)の３．０×１０⁵のラム
ダファージをバクテリア株としてのE. coliのXLI-Blueと共に寒天プレート上に
載置した。ファージＤＮＡを標準的方法により（Sambrok等（1989)；Cold Sprin
g Harbor Laboratory Press:ISBN 0-87969-309-6)、ニトロセルロースフィルタ
ー（Gelman Scineces)に移行させ、このフィルター上に固定した。使用したハイ
ブリダイゼーション試料は、上述のＰＣＲフラグメントであり、マルチプライム
ＤＮＡ標識システム（Amersham Buchler)によりα−³²Ｐ−ｄＣＰＴ（特異的活
性３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の存在下に、製造社による指示により放射線標識し
たものである。３×ＳＳＰＥ、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ｗ／ｖ）、０
．０２％ポリビニルピロリドン（ｗ／ｖ）、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ４００（
ｗ／ｖ）および５０ｍｇ／ｍｌのコウシ胸腺ＤＮＡ中、６０℃で１２〜１６時間
のプレハイブリダイゼーションを行った後、膜のハイブリダイゼーションが起き
た（Sambrook等、(1989)、Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-8796
9-6)。次いでこのフィルターを２×SSPE、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ｗ
／ｖ）中、６０℃で６０分間洗浄した。オートラジオグラフィーにより、ハイブ
リダイズしているファージが可視化さため、これを標準的な方法で精製、単離し
た。

【００６６】［実施例２］ＡＭＰデアミナーゼ活性を有するタンパク質をコードするｃＤＮＡクローンの
配列解析酵母ＡＭＰデアミナーゼと高い相同性を有するポリペプチドをコードする６４
のｃＤＮＡクローンが得られた（図４参照）。２本の最も長いクローンは同一で
あり、制限分解物中に２８８０塩基対の長さのＥｃｏＲＩフラグメントがあった
。シロイヌナズナ由来のＡＭＰデアミナーゼをコードする最長のクローンをＡＭ
Ｐ１とする。このプラスミドをｐＢＳ−ＡＭＰ１と呼ぶ。ｃＤＮＡ（図２参照）
は、２５７８ｂｐの読み枠を有し、終止コドンを２５７９−２５８１位に有して
いた。アミノ酸配列は三番目の読み枠のリンカー配列（図２の配列の太字で示さ
れた末端）の後の三番目の塩基で開始し、８６０アミノ酸長のポリペプチドに翻
訳されるか、または初めのメチオニン開始コドンから８３９アミノ酸のポリペプ
チドに翻訳される（図３参照）。この他には、４６位のメチオニンを用い、８２
４のアミノ酸から成るポリプチドが得られることも考えられる。

【００６７】酵母のサイトゾルにタンパク質活性がある一方で、植物についてのサイトゾル
の活性、およびミトコンドリアで得られると予測される活性についての報告がな
されている（YoshinoおよびMurakami, 198, Z. Planzenphysiologie, 99, 331-3
38)。この実験におけるｃＤＮＡ配列の読み枠によると、それぞれ異なる開始コ
ドンを用いることによりミトコンドリア形態とサイトゾル形態の可能性が推論さ
れる。コード配列の第３塩基から読み枠の読みとりを開始すると、大量の親水性
のセリンとスレオニン残基が交互に現れ、脂肪族アミノ酸残基がメチオニンコド
ンの前に存在し、ミトコンドリアまたはプラスチドへのトランジット配列を示し
ていることがわかる。プリン合成はプラスチドで起こっていると一般に推論され
ている。しかしながら、プリン合成の酵素がミトコンドリアにも存在することも
近年示されている（Atkins等、1997、Plant Physiol. 113, 127-135)。本実験で
使用しているｃＤＮＡ配列の読み枠によると、異なる開始コドンを用いることに
より、ミトコンドリア、プラスチドまたはサイトゾルのいずれかの形態である可
能性が明確に示されていると考えられる。この２種類の最長のクローンは、Ｎ末
端に、可能な２種類の開始コドンを有する連続的な読み枠を有するものである。
酵母の配列と比較すると、２番目の開始コドンが、酵母の配列の場合での開始位
置にほぼ一致している（図４）。このタンパク質の全長にわたり、植物の配列は
酵母の配列と約５９−６３％類似し、約４３−４７％同一である。これらの数値
は比較のパラメータを変更することにより異なる（Lasergene Software，MegAli
gn Program)。更に、植物ＡＭＰデアミナーゼのＮ末端が、酵母の配列における
Ｃ末端に比較してかなりわずかな相同性しか示していないことも注目に値する。

【００６８】［実施例３］ E. coliにおける過剰発現ベクターの製造以下のオリゴヌクレオチド配列を、完成した配列から誘導し、BamHI制限切断
部位と突出塩基(protruding bases)を有する配列を得た。図２で、これらのオリ
ゴヌクレオチドに下線と符号（数値）を施した。潜在的なメチオニン開始コドン
を太字で示す。

【００６９】

【化２】

【００７０】３種類の異なる５’プライマーを３’プライマーと組合わせて用いることによ
り、異なる長さのＰＣＲ生成物（フラグメントＩ，ＩＩ，ＩＩＩ）を得た。これ
らは完全な読み枠を有する配列（フラグメントＩ、プライマー１＋４）、Ｍｅｔ
開始コドンからの配列（フラグメントＩＩ、プライマー２＋４）、および二番目
の開始コドンからの配列（フラグメントＩＩＩ、プライマー３＋４）に相当する
。

【００７１】ＰＣＲ反応混合物は、８ｎｇ／μｌのｐＢＳ−ＡＭＰ１ＤＮＡ、０．５μＭ
の適するオリゴヌクレオチド、２００μＭのヌクレオチド（Pharacia)、５０ｍ
ＭのＫＣｌ、１０ｍＭのｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．３、１．５ｍＭの
ＭｇＣｌ₂Ｕ／μｌのＴａｑポリメラーゼ（Perkin Elmer)を含むものである。
増幅条件を以下の通りに設定した。

【００７２】アニーリング温度：５２℃、１分変性温度：９２℃、1分伸長温度：７２℃、２．５分サイクル数：３０ＰＣＲフラグメントを、過剰発現ベクターｐＥＴ１５ｂ、ｐＥＴ１１ａおよび
ｐＱＥ９にクローンし、標準的方法でのＩＰＴＣ誘導によるタンパク質の製造に
用いた（ハンドブック：The Quiaexpressionist (1992), Quiagen, Hilden参照)
。

【００７３】［実施例４］過剰発現培養体から得られたE. coli由来の植物ＡＭＰデアミナーゼの酵素ア
ッセイ French Pressに記載の加圧粉砕法（pressure disruption method）により、最
大圧下、２０ｍｌ加圧チャンバーまたはガラスビーズミル（ＩＭＡ粉砕器）でE.
coliを粉砕した。セルペレット１ｇあたり、１０ｍｌのバッファ（０．１Ｍの
ＫＨ₂ＰＯ₄、ｐＨ７．５、０．４Ｍの蔗糖、０．１ｍＭＤＤＴ）を用いた。こ
のペレットをガラスビーズ（ｄ＝０．５ｍｍ）の２．５倍量としてガラスビーズ
ミルに添加し、４℃、２５００ｒｐｍで２０分間粉砕した。粉砕した材料を４℃
にて、１０００００ｇあたり２０分の遠心分離に付した。酵素活性を、測光法（
photometric assey）を用いた、光度計（Uvikon933、Kontron）における２６０
ｎｍでの測定により測定した。過剰発現ベクターを選択することにより、ＤＴＴ
を粉砕バッファから除いても、標準的方法により、ヒスチジンアンカーを用いた
一工程でＡＭＰデアミナーゼを精製し、相同とすることが可能となった（ハンド
ブック：The Quiaexpressionist, Quiagen, Hildenも比較のこと）。

【００７４】このホモジネート・バッファを、４０ｍＭのクエン酸塩（ｐＨ６．５）（５ＮＮａＯＨにより調整）、０．０５％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）、１００ｍＭのＫＣｌ中
を透析させることにより、以下の媒体に装填した。

【００７５】装填されたバッファにおける１０−１００μｌずつの酵素画分をバッファと、
１００μｌの１ｍＭのＡＭＰ溶液、０．５ｍＭのＡＴＰ溶液および１ｍＭジアデ
ノシン五リン酸溶液の添加により７００μｌとした。７００μｌの反応バッファ
と形質転換を行っていないE. coliの培養体から得られたタンパク質ホモジネー
ト１００μｌを含む参照キュベットを用い、吸光度の減少を２〜１０分間測定し
た。同量の全タンパク質を測定値に対する参照の測定用に用いた。

【００７６】［実施例５］植物発現カセットの製造３５ＳＣａＭＶプロモータをEcoRI-KpnIフラグメント（カリフラワーモザイ
クウイルスのヌクレオチド６９０９−７４３７（Franck等 (1980) Cell 21、28
5）に対応）としてプラスミドpBin19（Bevan等 (1980) Nucl. Acads Res. 12、8
711）に挿入した。ＴｉプラスミドpTiACH5のT-DNAの第３遺伝子のポリアデニル
化シグナル（Gielen等、(1984)EMBO J. 3,835）、ヌクレオチド11749-11939をPv
uII-HindIIIフラグメントとして単離し、SphIリンカーの添加後にベクターのSpH
I-HindIII切断部位との間のPvuII切断部位にクローンした。結果としてプラスミ
ドpBinAR（HoefgenおよびWillmitzer（1990）Plant Science 66、221-230）が得
られた。ＰＣＲフラグメントＩ、ＩＩおよびＩＩＩ（上記参照）を両方向につい
て、pBinARのBamHI切断部位にクローンし、タバコ植物の形質転換に用いた。

【００７７】得られたプラスミドをpBinAMP-20、ｐBinαAMP-0、pBinAMP-0、ｐBinαAMP-0
、ｐBinAMP+26、pBinαAMP＋26と呼ぶが、これらは上記ＰＣＲ混合物のうち、実
施例３に記載のフラグメントＩ、ＩＩ、ＩＩＩに対応するものである。

【００７８】［実施例６］トランスジェニックタバコ植物の製造プラスミドpBinAMP-20、ｐBinαAMP-0、pBinAMP-0、ｐBinαAMP-0、ｐBinAMP+
26、pBinαAMP＋26をアグロバクテリウム・ツメファシエンスC58C1:pGV2260（De
blaere等、１９８４，Nucl. Acads．Res. 13, 4777-4788）にトランスフォーム
した。タバコ植物（Nicotina tabacum cv. Samsun NN）を、形質転換を受けたア
グロバクテリウム・コロニーを一晩培養した培養体の２％蔗糖含有のMurashige-
Skoog媒体(2MS媒体）（(1962)Physiol. Plant. 15473)中の１：５希釈物を用い
て形質転換した。無菌植物の葉盤（それぞれ約１ｃｍ²）を１：５０アグロバク
テリウム希釈物を含むペトリ皿で５〜１０分間培養した。この後、０．８％Bact
o agarを含む２ＭＳ媒体上、２５℃の暗所で２日間培養を行った。更に、１６時
間明所／８時間暗所に２日間保った後、培養を続け、更に５００ｍｌのクラフォ
ラン（セフォタキシムナトリウム）、５０ｍｇ／ｌのカナマイシン、１ｍｇ／ｌ
のベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、０．２ｍｇ／ｌのナフチル酢酸および１．
６ｇ／ｌのグルコースを含むＭＳ媒体上で週間的リズムを与えた培養を継続した
。成長段階の苗条を２％の蔗糖、２５０ｍｇ／ｌのクラフォランおよび０．８％
のBacto agarを含むＭＳ媒体上に移植した。

【００７９】カナマイシンとクラフォランを含む２ＭＳ媒体上で、再生した苗条を得、根付
け後、土壌に移植し、１６時間明所／８時間暗所のリズムの湿度６０％の気候調
整チャンバーで２週間培養した後、外部遺伝子の発現または変化のあった代謝産
物成分および表現型の生長の特徴を調べた。変化のあったヌクレオチド含有率を
、Stitt等の方法（1982、FEBS Letters, 145,217-222）により測定した。

【００８０】［実施例７］ＡＭＰデアミナーゼ過剰表現のトランスジェニックタバコ植物のＡＭＰデアミ
ナーゼ抑制因子に対する耐性を示すために、ＡＭＰデアミナーゼ抑制因子を、コ
フォルマイシンまたは他のＡＭＰデアミナーゼ抑制因子の使用量を変えて用い、
処理した。温室実験では、ＡＭＰデアミナーゼ過剰発現の植物が、使用した抑制
因子に対してあらゆる場合に、対照よりも優れた耐性を有することを明らかにす
ることができた。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 5/10 5/00 Ｃ 15/09 ＺＮＡＡ 15/00 ＺＮＡＡＦターム(参考） 2B030 AD08 CA15 CA17 CA19 4B024 AA08 BA79 CA04 CA05 DA01 4B050 CC03 DD13 LL03 LL10 4B065 AA88Y AB01 BA02 BA12 CA31 CA53 4H011 AB01 BA01 BB22

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】 SEQ ID NO:1のヌクレオチド配列を有し、植物ＡＭＰデアミ
ナーゼのコード領域を含むＤＮＡ配列。
【請求項２】請求項１に記載のＤＮＡ配列SEQ ID NO:1、その一部、また
はこの配列から、挿入、欠失または置換により得られる誘導体とハイブリダイズ
し、ＡＭＰデアミナーゼの生物学的活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
配列。
【請求項３】調節核酸配列と、請求項１または２に記載のＤＮＡ配列とを
含む発現カセット。
【請求項４】ＡＭＰデアミナーゼ活性を有し、SEQ ID NO:2から得られる
１００以上のアミノ酸の部分的配列に相当するアミノ酸配列を有するタンパク質
。
【請求項５】アミノ酸配列としてSEQ ID NO:2の部分配列５０−７５０を
含む、請求項４に記載のタンパク質。
【請求項６】アミノ酸配列としてSEQ ID NO:2に記載の配列を含む、請求
項５に記載のタンパク質。
【請求項７】請求項１または２に記載のＤＮＡ配列、その一部またはこの
配列から、挿入、欠失または置換により得られる誘導体を含むバクテリア。
【請求項８】請求項１または２に記載のＤＮＡ配列、その一部またはこの
配列から、挿入、欠失または置換により得られる誘導体を含む酵母。
【請求項９】請求項３に記載の発現カセットを含む植物細胞。
【請求項１０】請求項３に記載の発現カセットを含む植物。
【請求項１１】請求項１または２に記載のＤＮＡ配列、その一部またはこ
の配列から、挿入、欠失または置換により得られる誘導体を、原核細胞または真
核細胞へ導入し、必要に応じてこれらの配列を前記細胞における転写および翻訳
を行う因子を制御するために連結し、ＡＭＰデアミナーゼの合成を行う翻訳可能
なｍＲＮＡの発現を行うための、使用法。
【請求項１２】請求項３に記載の発現カセットの、植物の形質転換のため
の使用法。
【請求項１３】請求項３に記載の発現カセットの、ＡＭＰデアミナーゼ抑
制因子を同定するテストシステムを製造するための使用法。
【請求項１４】請求項３に記載の発現カセットを含有する植物の、ＡＭＰ
デアミナーゼ製造のための使用法。
【請求項１５】請求項３に記載の発現カセットの、請求項１または２に記
載のＤＮＡ配列の発現の改良により、ＡＭＰデアミナーゼ抑制因子に対する耐性
が向上した植物を製造するための使用法。
【請求項１６】請求項３に記載の発現カセットの、ＩＭＰ含有率が増大し
た植物を製造するための使用法。
【請求項１７】請求項３に記載の発現カセットの発現により、ＡＭＰデア
ミナーゼ抑制因子を同定するテストシステム。
【請求項１８】請求項１７に記載のテストシステムにより同定される除草
剤。
【請求項１９】請求項３に記載の発現カセットを植物細胞、カルス組織、
植物全体または植物細胞から得られたプロトプラストに導入する工程を含む、植
物の形質転換方法。
【請求項２０】請求項１または２に記載のＤＮＡ配列の発現の改良により
ＡＭＰデアミナーゼ抑制因子に対する耐性が向上した植物を製造する方法。
【請求項２１】請求項1または２に記載のＤＮＡ配列の発現の改良により
ＩＭＰ含有量の増大した植物を製造する方法。
【請求項２２】請求項３に記載の発現カセットを含むＡＭＰデアミナーゼ
抑制因子に対して優れた耐性を有する植物。
【請求項２３】請求項３に記載の発現カセットを含む、ＩＭＰ含有量の増
大した植物。