JP2002527039A - AMP deaminase - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】 本発明はＡＭＰデアミナーゼ（EC 3.5.4.6アデノシン一リン酸アミノヒドラーゼ）活性を有し、ポリペプチドをコードするＤＮＡに関する。更に、本発明は、この核酸をテストシステム製造のために使用する方法に関する。 (57) [Summary] The present invention relates to a DNA having AMP deaminase (EC 3.5.4.6 adenosine monophosphate aminohydrolase) activity and encoding a polypeptide. Furthermore, the invention relates to a method of using this nucleic acid for the production of a test system.
Description
【０００１】 本発明は、ＡＭＰジアミナーゼ（ＥＣ ３．５．４．６、アデノシン三リン酸
アミノヒドロラーゼ）活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡに関する。
また、本発明はＡＭＰデアミナーゼ作用を有する植物由来のタンパク質をコード
する核酸を、ＡＭＰデアミナーゼ抑制因子（インヒビター）を同定するために使
用する方法に関する。更に本発明は、ＡＭＰデアミナーゼ抑制因子に対して優れ
た耐性を有する植物を製造するために、植物のＡＭＰデアミナーゼをコードする
核酸の使用法に関する。The present invention relates to a DNA encoding a polypeptide having AMP diaminase (EC 3.5.4.6, adenosine triphosphate aminohydrolase) activity.
The present invention also relates to a method of using a nucleic acid encoding a plant-derived protein having an AMP deaminase activity to identify an AMP deaminase inhibitor (inhibitor). Furthermore, the present invention relates to the use of a nucleic acid encoding a plant AMP deaminase for producing a plant having excellent resistance to an AMP deaminase inhibitor.
【０００２】 植物は二酸化炭素、水および無機塩から、その細胞の成分を合成することがで
きる。[0002] Plants can synthesize cellular components from carbon dioxide, water and inorganic salts.
【０００３】 この過程は、有機物質を合成する生化学的反応を用いてのみ可能とされるもの
である。更に植物は核酸構成成分としてのヌクレオチドをデノボ合成する必要が
ある。[0003] This process is only possible using biochemical reactions that synthesize organic substances. Further, plants need to synthesize de novo nucleotides as nucleic acid components.
【０００４】 ヌクレオチドの効率的な生成、利用および分配は、植物の細胞分裂および生長
に影響を与えるものと考えられる。植物は、ヌクレオチドの代謝機能に依存する
ため、この代謝が除草剤の使用の狙い目と考えられる。公知薬剤（例えば５'−
ホスホヒダントシジン、アラノシンまたはハダシジン）はアデニロスクシネート
シンセターゼを阻害する（Stayton等著、1983、Cuur. Top. Cell. Regul., 22,
103-141；Siehl等、1996、Plant Physiol.,110,753-758）。アデノシンスクシネ
ートシンセターゼにより触媒される反応を図１に示す。この場合、ヒダントシジ
ンはプロドラッグとして作用する。この薬剤は５’ＯＨ基でのリン酸化により代
謝され、除草剤となる（Siehl等、1996, Plant Physiol., 100, 753-758)。
ヌクレオチド代謝を調整するための重要な原理としては、デノボプリン生合成 の酵素反応（例えばアデニロスクシネートシンセターゼ）の他に、再循環プロセ
スおよび分解機構がある。しかしながら、ＡＭＰデアミナーゼは特別な位置を占
めるため、ＡＭＰ（アデノシン一リン酸）を更に脱アミノし、ＩＭＰ（イノシン
５’−リン酸）とすることも可能である。この酵素は以下の反応を触媒する。[0004] Efficient production, utilization and distribution of nucleotides is thought to affect plant cell division and growth. Since plants depend on the metabolic function of nucleotides, this metabolism is considered the target of herbicide use. Known drugs (for example, 5'-
Phosphohydantosidine, alanosine or hadacidin) inhibits adenylosuccinate synthetase (Stayton et al., 1983, Cuur. Top. Cell. Regul., 22,
103-141; Siehl et al., 1996, Plant Physiol., 110, 753-758). The reaction catalyzed by adenosine succinate synthetase is shown in FIG. In this case, hydantosidine acts as a prodrug. This drug is metabolized by phosphorylation at the 5'OH group and becomes a herbicide (Siehl et al., 1996, Plant Physiol., 100, 753-758).
Important principles for regulating nucleotide metabolism include the enzymatic reactions of de novopurine biosynthesis (eg, adenylosuccinate synthetase), as well as recycling processes and degradation mechanisms. However, since AMP deaminase occupies a special position, AMP (adenosine monophosphate) can be further deaminated to IMP (inosine 5'-phosphate). This enzyme catalyzes the following reaction.
【０００５】[0005]
【化１】 Embedded image
【０００６】 このタンパク質は種々の植物から部分的に精製されて得られており、その調節
特性が調査された。例えば、ホウレンソウの葉（YoshinoおよびMurakami,198、Z
. Pflanzenphyziologie, 99. 331-338）、キクイモ（Le Floc'hおよびLafleurie
l,1983, Physiologie Vergetale, 21 (1) 15-2）、エンドウの種子（Turnerおよ
びTurner、1961、Biochem. J. 79, 143）、およびカタランツス・ロゼウス（Cat
harantus roseus）の細胞培養体、ニチニチソウ種（lesser periwinkle）（Yabu
ki等、1992、Phytochemistry、３１（６）、１９０５−１９０９）についての調
査が行われた。更に、この酵素は細胞中のアデニレートプールの調節に中心的な
役割を果たしているものと考えられている（ChapmanおよびAtkinson, 1973, J.
Biol. Chem., 248, 8309; Solano and Coffee, 1978; Yoshino等、1979）。This protein has been obtained by partial purification from various plants and its regulatory properties have been investigated. For example, spinach leaves (Yoshino and Murakami, 198, Z
Pflanzenphyziologie, 99. 331-338), Jerusalem artichoke (Le Floc'h and Lafleurie)
1, 1983, Physiologie Vergetale, 21 (1) 15-2), peas seeds (Turner and Turner, 1961, Biochem. J. 79, 143), and Catharanthus roseus (Cat
harantus roseus), periwinkle (lesser periwinkle) (Yabu
ki et al., 1992, Phytochemistry, 31 (6), 1905-1909). In addition, this enzyme is thought to play a central role in regulating the adenylate pool in cells (Chapman and Atkinson, 1973, J. Am.
Biol. Chem., 248, 8309; Solano and Coffee, 1978; Yoshino et al., 1979).
【０００７】 公知の天然物質であるコフォマイシン（coformycin)は植物に除草作用を示し
、リン酸化された状態（５’−ホスホコフォマイシン）が実際のＡＭＰデアミナ
ーゼ阻害因子であることがわかっている（Frieden等、1989、Biochem. 5303; Me
rkler等、1990、Biochem. 29, 8358-8464; Dancer等、1997、Plant Physiol., 1
14(l), 119-129)。特許では、ＷＯ９６／０１３２６に、ＡＭＰデアミナーゼ酵
素アッセイにより除草剤を見出す方法が記載されている（Pillmoor Pestic. Sci
., 1998, 52, 75-80も参照されたい）。[0007] Coformycin, a known natural substance, has herbicidal effects on plants, and its phosphorylated state (5'-phosphocofomycin) has been found to be the actual AMP deaminase inhibitor ( Frieden et al., 1989, Biochem. 5303; Me
rkler et al., 1990, Biochem. 29, 8358-8464; Dancer et al., 1997, Plant Physiol., 1
14 (l), 119-129). In the patent, WO 96/01326 describes a method for finding herbicides by an AMP deaminase enzyme assay (Pillmoor Pestic. Sci.
., 1998, 52, 75-80).
【０００８】 ＡＭＰデアミナーゼをコードする遺伝子が、多くの有機体から単離されている
。哺乳類では、ＡＭＰデアミナーゼの遺伝子ファミリーが存在するものと考えら
れている（Morisaki等、1990, J. Biol. Chem. 265 (20), 11482-11486)。他の
コード配列が分裂酵母菌属（Schizosaccharomyces)試料（承認P50998)およびビ
ール酵母菌（Saccharomyces cerevisiae)（承認P15274)から単離されている。バ
クテリアからはアデニンデアミナーゼのみが得られており、ＡＭＰデアミナーゼ
の単離は未だ成功していない。est配列と呼ばれる発現配列の標識が、配列の比
較によりイネ（Genbank Acc: C26026)、および酵母ＡＭＰデアミナーゼと類似性
を有するシロイヌナズナ(Arabidopsis)（T21250)から発見された。植物ＡＭＰデ
アミナーゼの完全なｃＤＮＡ配列に関する報告は未だなされていない。[0008] Genes encoding AMP deaminase have been isolated from many organisms. In mammals, it is believed that the AMP deaminase gene family exists (Morisaki et al., 1990, J. Biol. Chem. 265 (20), 11482-11486). Other coding sequences have been isolated from Schizosaccharomyces samples (approved P50998) and Saccharomyces cerevisiae (approved P15274). Only adenine deaminase has been obtained from bacteria, and isolation of AMP deaminase has not been successful yet. Labeling of the expressed sequence, called the est sequence, was found by sequence comparison in rice (Genbank Acc: C26026) and in Arabidopsis (T21250), which has similarity to yeast AMP deaminase. There is no report on the complete cDNA sequence of plant AMP deaminase.
【０００９】 しかるに、本発明は酵素ＡＭＰデアミナーゼをコードする完全な植物ｃＤＮＡ
を単離すること、およびバクテリアまたは真核細胞でその機能的発現を行い、抑
制因子−酵素の結合の研究を行うために、単純かつ低コストの方法で同酵素を得
ることを、その目的とする。Thus, the present invention provides a complete plant cDNA encoding the enzyme AMP deaminase.
And to obtain the same in a simple and inexpensive way to perform its functional expression in bacteria or eukaryotic cells and to study inhibitor-enzyme binding. I do.
【００１０】 本発明の他の目的は、ＡＭＰデアミナーゼ抑制因子に耐性を有する植物を製造
するために、ＡＭＰデアミナーゼを植物中で過剰に発現させることである。[0010] Another object of the present invention is to overexpress AMP deaminase in plants to produce plants that are resistant to AMP deaminase inhibitors.
【００１１】 本発明者等は、これらの目的が植物酵素ＡＭＰデアミナーゼをコードする遺伝
子を単離することにより達成されること、およびこれをバクテリアもしくは植物
細胞、または植物において機能的に発現させることにより達成されることを見出
した。The present inventors have achieved that these objects are achieved by isolating the gene encoding the plant enzyme AMP deaminase, and by expressing it functionally in bacteria or plant cells or plants. Found to be achieved.
【００１２】 第一に、本発明はシロイヌナズナ(Arabidopsis thalina)由来の植物ＡＭＰデ
アミナーゼのコード領域を含むＤＮＡ配列SEQ ID NO:1に関する（図２参照）。First, the present invention relates to a DNA sequence SEQ ID NO: 1 comprising the coding region of a plant AMP deaminase from Arabidopsis thalina (see FIG. 2).
【００１３】 更に、本発明はこのSEQ ID NO:1から得られるＤＮＡ配列、またはこれとハイ
ブリッドし、ＡＭＰデアミナーゼの生物学的活性を有するタンパク質をコードす
るＤＮＡ配列に関する。Further, the present invention relates to a DNA sequence obtained from this SEQ ID NO: 1, or a DNA sequence which hybridizes therewith and encodes a protein having the biological activity of AMP deaminase.
【００１４】 更に、本発明は、その配列がシロイヌナズナ由来のＡＭＰデアミナーゼまたは
その機能的等価物をコードする発現カセットに関する。この核酸配列は、この場
合ＤＮＡまたはｃＤＮＡ配列等とされる。The invention further relates to an expression cassette whose sequence encodes an AMP deaminase from Arabidopsis thaliana or a functional equivalent thereof. This nucleic acid sequence is referred to as a DNA or cDNA sequence in this case.
【００１５】 本発明の発現カセットは、宿主細胞におけるコード配列の発現を調整する、調
節核酸配列を付加的に含むものである。好ましい実施の形態において、本発明の
発現カセットは、上流、すなわちコード配列の５’端にプロモーターを、上流、
すなわち３’端にポリアデニル化シグナルを含み、必要に応じて更に、この間に
配置されＡＭＰデアミナーゼ遺伝子コード配列に作用的に連結される調節因子を
含む。ここで、「作用的に連結される」とはプロモーター、コード配列、ターミ
ネーター、および必要に応じて他の調節因子が、各調節因子がコード配列の発現
に関する機能を的確に行えるような順番に配列されていることを意味する。[0015] The expression cassette of the present invention additionally comprises a regulatory nucleic acid sequence that regulates the expression of the coding sequence in a host cell. In a preferred embodiment, the expression cassette of the present invention comprises a promoter upstream, ie, at the 5 ′ end of the coding sequence,
That is, it contains a polyadenylation signal at the 3 'end, and optionally further comprises a regulatory element disposed therebetween and operably linked to the AMP deaminase gene coding sequence. Here, “operably linked” means that the promoter, coding sequence, terminator, and, if necessary, other regulatory elements are arranged in an order such that each regulatory element can properly perform the function related to expression of the coding sequence. Means that it is.
【００１６】 本発明の発現カセットは、適当なプロモーターを、適当なＡＭＰデアミナーゼ
ＤＮＡ配列とポリアデニルかシグナルに、例えばT. Maniatis, E. F. Fritschお
よびJ. Sambrook, Molecular Cloning: A Labratory Manual, Cold Spring Harb
or Laboratory, Cold Spring Harbor，NY(1989)および T.J. Silhavy, M.L. Ber
manおよびL.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, NY(1984)およびAusubel, F.M. 等、Current
Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc.およびWiley-Int
erscience (1987）等に記載の公知組換え技術およびクローニング技術による融
合により得られる。[0016] The expression cassette of the present invention comprises a suitable promoter, a suitable AMP deaminase DNA sequence and a polyadenyl or signal, for example, T. Maniatis, EF Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Labratory Manual, Cold Spring Harb.
or Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) and TJ Silhavy, ML Ber
man and LW Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) and Ausubel, FM etc., Current
Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. And Wiley-Int
erscience (1987) and the like, by fusion using known recombination techniques and cloning techniques.
【００１７】 特に好ましい配列は、アポプラスト中を、色素体中、液胞、ミトコンドリア、
小胞体（ＥＲ）中に向かうものである。或いは適切な作用的配列が存在しないこ
とによりこれらの区画におけるサイトゾルの製造を滞らせることになる（Kermod
e, Crit. Res. Plant Sci．15.4(1996)、285-532）。 例えば、植物発現カセッ
トはタバコの形質転換ベクターpBinAR-Hygに導入される（実施例５参照のこと）
。Particularly preferred sequences are those in apoplasts, in plastids, vacuoles, mitochondria,
It goes into the endoplasmic reticulum (ER). Alternatively, the lack of a suitable working sequence will slow down the production of cytosol in these compartments (Kermod
e, Crit. Res. Plant Sci. 15.4 (1996), 285-532). For example, the plant expression cassette is introduced into the tobacco transformation vector pBinAR-Hyg (see Example 5).
.
【００１８】 本発明の発現カセット用のプロモーターとして、原則的には植物の外来遺伝子
の発現を制御するあらゆるプロモーターが用いられる。植物プロモーターまたは
植物ウイルス由来のプロモーターを使用するのが特に好ましい。カリフラワーモ
ザイクウイルスのCaMV 35S-プロモーター（Franck等、Cell 21(1980) 285-294）
が特に好ましい。このプロモーターは、複数の転写エフェクター用の種々の認識
配列を含むものであり、これらが全体で、導入された遺伝子の永久の構成性発現
を行うものである(Benfey等、EMBO J. 8(1989)2195-2202)。As a promoter for the expression cassette of the present invention, in principle, any promoter that controls the expression of a foreign gene of a plant is used. It is particularly preferred to use plant promoters or promoters from plant viruses. CaMV 35S-promoter of cauliflower mosaic virus (Franck et al., Cell 21 (1980) 285-294)
Is particularly preferred. This promoter contains various recognition sequences for multiple transcription effectors, which, in their entirety, provide permanent, constitutive expression of the introduced gene (Benfey et al., EMBO J. 8 (1989). ) 2195-2202).
【００１９】 本発明の発現カセットは、化学的に誘導されるプロモーターを含んでもよく、
これにより、植物において外因性ＡＭＰデアミナーゼの発現が適当な時期に行わ
れるように制御することが可能となる。この種のプロモーター、例えばPRP1プロ
モーター（Ward等、Plant. Mol. Biol. 22(1993), 361-366)、サリチル酸から誘
導可能なプロモーター（WO 95/1919443)、ベンゼンスルホンアミド−誘導性プロ
モーター（EP 388186)、テトラサイクリン−誘導性プロモーター（Gatz等、(199
2)Plant J. 2,397-404）、アブシン酸−誘導性プロモーター（EP 335528)、また
はエタノール−またはシクロヘキサノン誘導性プロモーター(WO 9321334)が文献
に記載されており、使用される。[0019] The expression cassette of the present invention may comprise a chemically-inducible promoter,
This makes it possible to control the expression of exogenous AMP deaminase in plants at an appropriate time. Promoters of this type, such as the PRP1 promoter (Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993), 361-366), a promoter inducible from salicylic acid (WO 95/1919443), a benzenesulfonamide-inducible promoter (EP 388186), a tetracycline-inducible promoter (Gatz et al., (1992).
2) Plant J. 2,397-404), abscisic acid-inducible promoter (EP 335528), or an ethanol- or cyclohexanone-inducible promoter (WO 9321334) is described in the literature and used.
【００２０】 更に、特に好ましいプロモーターは、プリンまたはその前駆体の合成が起こる
組織または植物の部位においての発現を確実とするものである。葉に特異的な発
現を起こすプロモーターが特に好ましい。バレイショのサイトゾルのFBPaseまた
はバレイショのサイトゾルのST-LS1プロモーター（Stockhaus等、EMBO J. 8(198
9)２４４５−２４５）。Furthermore, particularly preferred promoters are those that ensure expression in the tissue or plant site where synthesis of the purine or its precursor takes place. Promoters that cause leaf-specific expression are particularly preferred. Potato cytosol FBPase or potato cytosol ST-LS1 promoter (Stockhaus et al., EMBO J. 8 (198
9) 2445-245).
【００２１】 種子に特異的なプロモーターを用い、外部タンパク質を、トランスジェニック
タバコ植物の種子中の全可溶性種子タンパク質の０．６７％まで安定に発現させ
ることが可能である（FiedlerおよびConrad, Bio/Techonology 10(1995)、1090
-1094)。従って、本発明の発現カセットは、例えば種子に特異的なプロモーター
（好ましくはファセオリンプロモーター、USPまたはLEB4プロモーター）、LEB4
シグナルペプチド、発現されるべき遺伝子、およびER残留シグナルを含む。Using a seed-specific promoter, it is possible to stably express external proteins to 0.67% of the total soluble seed protein in the seeds of transgenic tobacco plants (Fiedler and Conrad, Bio / Techonology 10 (1995), 1090
-1094). Therefore, the expression cassette of the present invention may be, for example, a seed-specific promoter (preferably a phaseolin promoter, USP or LEB4 promoter), LEB4
Contains the signal peptide, the gene to be expressed, and the ER residual signal.
【００２２】 多くのマメ科植物は固定窒素をウレイドの形態で根粒から上記組織に運搬する
（Schubert、1986、Ann. Rev. Plant Phys. 37, 539-574)。ウレイドはプリン生
合成により生成する。瘤−（根粒−）特異的なＡＭＰデアミナーゼのプロモータ
ーにより、マメ科植物における発現とこれによるウレイド生合成が特異的に修飾
される。すなわち、本発明による遺伝子発現カセットは、グリシンmaxからのホ
スホリボシル−ピロリン酸アミドトランスフェラーゼのプロモーター（Genbank
承認No.U87999参照）またはEP 249676に記載のような他の瘤特異的プロモーター
を含んでもよい。Many legumes transport fixed nitrogen from the nodules to the above tissues in the form of ureides (Schubert, 1986, Ann. Rev. Plant Phys. 37, 539-574). Ureide is produced by purine biosynthesis. The nodule- (nodule-) specific AMP deaminase promoter specifically modifies expression in legumes and thereby ureide biosynthesis. That is, the gene expression cassette according to the present invention comprises a promoter of phosphoribosyl-pyrophosphate amide transferase from glycine max (Genbank).
Approval No. U87999) or other knob-specific promoters as described in EP 249676.
【００２３】 ＡＭＰデアミナーゼ用の挿入ヌクレオチド配列コードは、合成または天然に得
られるが、合成および天然の各ＤＮＡ成分の混合物を含んでもよい。一般に、合
成のヌクレオチド配列は植物に多く含まれるコドンから得られる。これらの、植
物に多く含まれるコドンは、最高タンパク質頻度を有し、所望の植物種の大部分
に発現されるコドンから選択される。発現カセットを製造するために、種々のＤ
ＮＡフラグメントを巧みに操作して、正しい方向に読め、正しい読み枠を有する
ヌクレオチド配列を得る。アダプターおよびリンカーをフラグメントに結合し、
更にこのＤＮＡフラグメントを互いに連結してもよい。The inserted nucleotide sequence code for AMP deaminase is obtained synthetically or naturally, but may include a mixture of synthetic and natural DNA components. Generally, synthetic nucleotide sequences are derived from codons that are abundant in plants. These plant-rich codons are selected from those that have the highest protein frequency and are expressed in most of the desired plant species. To produce an expression cassette, various D
The NA fragment can be manipulated to read in the correct orientation and obtain a nucleotide sequence with the correct reading frame. Attaching an adapter and a linker to the fragment,
Further, the DNA fragments may be ligated to each other.
【００２４】 酵母と植物のＡＭＰデアミナーゼのＤＮＡレベルでの配列相同性は、例えば配
列M30449（Genbank承認番号）の1345-2715塩基領域の選択された、高い相同性を
有する領域（５７％）によるものであるが、これはBLAST M30449を用いて構築さ
れたものである（Altschul等、(1990)、J. Mol. Biol.:215:403-419, Gish and
States,(1993) Nature Genet. §:266-272)。上記フラグメントでは、２０−３
０ヌクレオチド領域の相同性が非常に高いため、他の植物からのＡＭＰデアミナ
ーゼのオリゴヌクレオチドに基づくスクリーニングに成功する、十分な可能性が
ある。対照の配列と比較して、小さい領域でのみ優れた相同性を有するＤＮＡ配
列を検知するための、短いオリゴヌクレオチドを用いたハイブリダイズの方法が
Sambook等の論考（1989、Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969
-309-6)に記載されている。Sequence homology at the DNA level of yeast and plant AMP deaminase is due to a selected, highly homologous region (57%) of the 1345-2715 base region of sequence M30449 (Genbank accession number), for example. Which was constructed using BLAST M30449 (Altschul et al., (1990), J. Mol. Biol.:215:403-419, Gish and
States, (1993) Nature Genet. §: 266-272). In the above fragment, 20-3
The very high homology of the 0 nucleotide region has ample potential for successful oligonucleotide-based screening for AMP deaminase from other plants. Hybridization methods using short oligonucleotides to detect DNA sequences that have excellent homology only in small regions compared to control sequences
(Sambook et al. (1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969)
-309-6).
【００２５】 更に、本発明はＡＭＰデアミナーゼ遺伝子をコードし、遺伝子全長に対して、
SEQ ID NO:1のＤＮＡ配列と４０−１００％の配列相同性を有する機能的に等価
なＤＮＡ配列に関する。Further, the present invention encodes the AMP deaminase gene,
It relates to a functionally equivalent DNA sequence having 40-100% sequence homology to the DNA sequence of SEQ ID NO: 1.
【００２６】 更に、本発明はＡＭＰデアミナーゼ遺伝子をコードし、遺伝子全長に対して、
SEQ ID NO:1のＤＮＡ配列と６０−１００％の配列相同性を有する機能的に等価
なＤＮＡ配列に関する。Furthermore, the present invention encodes the AMP deaminase gene,
It relates to a functionally equivalent DNA sequence having 60-100% sequence homology to the DNA sequence of SEQ ID NO: 1.
【００２７】 本発明による、ＡＭＰデアミナーゼ遺伝子をコードする機能的に等価な配列と
は、異なるヌクレオチド配列にも関わらず、所望の機能を保持している配列であ
る。つまり、機能的等価物とは、本明細書に記載の配列の自然に起こる変形配列
および人為的ヌクレオチド配列、例えば植物のコドン使用に適合した化学的合成
により得られる配列を含む。A functionally equivalent sequence encoding the AMP deaminase gene according to the present invention is a sequence which retains a desired function despite different nucleotide sequences. Thus, functional equivalents include naturally occurring variants of the sequences described herein and artificial nucleotide sequences, such as those obtained by chemical synthesis compatible with plant codon usage.
【００２８】 更に、機能的等価物とは、特にＡＭＰデアミナーゼをコードする元来単離され
ている配列の天然または人為的な突然変異体であって、所望の機能を保持するも
のである。突然変異とは、1個以上のヌクレオチド残基の置換、付加、欠失、転
座または挿入を含む。Further, functional equivalents are, in particular, natural or artificial mutants of the originally isolated sequence encoding AMP deaminase, which retain the desired function. Mutations include substitutions, additions, deletions, translocations or insertions of one or more nucleotide residues.
【００２９】 すなわち、例えばこのヌクレオチド配列を修飾して得られるヌクレオチド配列
も本願に含まれることを意味する。この様な修飾の目的は、ヌクレオチドに含ま
れるコード配列の更なる局在化等、例えば更に制限酵素切断部位を挿入すること
などである。That is, it means that, for example, a nucleotide sequence obtained by modifying this nucleotide sequence is also included in the present application. The purpose of such modifications is to further localize the coding sequence contained in the nucleotide, for example, to insert additional restriction sites.
【００３０】 機能的等価物は、更に元来の遺伝子または遺伝子フラグメントと比較して、そ
の機能に上下のみられる変形例も含まれる。[0030] Functional equivalents also include variants that are up or down in function as compared to the original gene or gene fragment.
【００３１】 人工のＤＮＡ配列も、上述のように農作物中のＡＭＰデアミナーゼ遺伝子の過
剰発現により植物中のＩＭＰ含有率を高めるという所望の性質を与えるものであ
る限り、好適に用いられる。この様なＤＮＡ配列は、ＡＭＰデアミナーゼ活性を
有するタンパク質の逆転写や分子設計により、或いはインビトロの選択により得
られる。特に適するコード化ＤＮＡ配列は、宿主植物に特有なコドン使用に従っ
て、そのポリペプチド配列を逆転写することにより得られる。特有のコドンの使
用は、植物遺伝学に精通した熟練者が、形質転換を受ける植物の他の公知の遺伝
子をコンピュータ分析すれば容易に見つけうる。[0031] Artificial DNA sequences are also preferably used as long as they provide the desired property of increasing the IMP content in plants by overexpression of the AMP deaminase gene in crops as described above. Such a DNA sequence can be obtained by reverse transcription or molecular design of a protein having AMP deaminase activity, or by in vitro selection. Particularly suitable coding DNA sequences are obtained by reverse transcribing the polypeptide sequence according to codon usage specific to the host plant. The use of unique codons can be readily found by those skilled in plant genetics by computer analysis of other known genes of the plant to be transformed.
【００３２】 本発明における他の等価な核酸配列としては、融合タンパク質をコードする配
列であり、この融合タンパク質の一成分が植物ＡＭＰデアミナーゼポリペプチド
またはこれと機能的に等価な部分である配列が挙げられる。この融合タンパク質
の第二の部分は、酵素活性を有する他のポリペプチド、またはＡＭＰデアミナー
ゼ発現の検知に使用可能な抗原ポリペプチド配列（例えばｍｙｃ標識またはｈｉ
ｓ標識）である。しかしながら、これがＡＭＰデアミナーゼを所望の作用部位に
導くシグナルペプチドまたはトランジットペプチド等の調節タンパク質配列であ
るのが好ましい。Another equivalent nucleic acid sequence in the present invention is a sequence encoding a fusion protein, and a sequence in which one component of the fusion protein is a plant AMP deaminase polypeptide or a functionally equivalent part thereof. Can be The second portion of the fusion protein may be another polypeptide having enzymatic activity, or an antigenic polypeptide sequence (eg, myc-tag or hi) that can be used to detect AMP deaminase expression.
s-label). However, it is preferred that this is a regulatory protein sequence such as a signal peptide or transit peptide that directs AMP deaminase to the desired site of action.
【００３３】 本発明のプロモーター領域とターミネーター領域は、この配列の挿入用の１カ
所以上の切断部位を有するリンカーまたはポリリンカーを転写方向に含むと有利
である。一般に、リンカーは１〜１０箇所、通常は１〜８箇所、好ましくは２〜
６箇所の切断部位を有する。この調節領域におけるリンカーのサイズは、一般に
１００ｂｐ未満、多くは６０ｂｐ未満であるが、５ｐｂ以上とされる。本発明で
使用されるプロモーターは宿主植物に固有(自生）または相同であっても、外来
または異種であってもよい。本発明の発現カセットは、５’−３’の転写方向に
、本発明のプロモーター、何らかの適する配列、および転写終止領域を含む。必
要に応じて種々の終了領域を互いに交換してもよい。The promoter region and the terminator region of the present invention advantageously comprise, in the direction of transcription, a linker or polylinker having one or more cleavage sites for insertion of this sequence. Generally, 1-10 linkers, usually 1-8, preferably 2-
It has six cleavage sites. The size of the linker in this regulatory region is generally less than 100 bp, often less than 60 bp, but is greater than 5 pb. The promoter used in the present invention may be native (autologous) or homologous to the host plant, exogenous or heterologous. An expression cassette of the present invention comprises a promoter of the present invention, any suitable sequence, and a transcription termination region in the 5'-3 'direction of transcription. The various end regions may be exchanged with one another as needed.
【００３４】 また、適当な制限切断部位を施したり、過剰のＤＮＡまたは制限切断部位を取
り除く操作を行ってもよい。挿入、欠失、または置換、例えばトランジションま
たはトランスバージョンを考慮して、インビトロの変異生成、プライマー修復、
制限または結紮を行ってもよい。適当な操作、例えば制限、フラグメントの平滑
末端、相補的末端の突出部分（overhang）のチューイング・バックまたは充填を
結紮の際に行ってもよい。[0034] In addition, an appropriate restriction cleavage site may be provided, or an operation of removing excess DNA or restriction cleavage site may be performed. In consideration of insertions, deletions, or substitutions, such as transitions or transversions, in vitro mutagenesis, primer repair,
Restrictions or ligations may be performed. Appropriate manipulations, such as restriction, blunt ends of fragments, chewing back or filling of overhangs of complementary ends, may be performed during ligation.
【００３５】 本発明の結果に関して、特異的なＥＲ残留シグナルSEKDELを取り付けることが
特に重要であり（Schouten, A.等、Plant Mol. Biol. 30 (1996), 781-792)、こ
れにより発現の平均水準が三倍ないし四倍とされる。植物や動物のタンパク質の
ERに天然に存在する他の残留シグナルを、カセットの構築に用いてもよい。With regard to the results of the present invention, it is particularly important to mount a specific ER residual signal SEKDEL (Schouten, A. et al., Plant Mol. Biol. 30 (1996), 781-792), thereby allowing expression of The average level is tripled or quadrupled. Of plant and animal proteins
Other residual signals that are naturally present in the ER may be used in the construction of the cassette.
【００３６】 好ましいポリアデニル化シグナルは、植物のポリアデニル化シグナル、好まし
くはアグロバクテリウム・ツメファシエンス由来のＴ−ＤＮＡポリアデニル化シ
グナル、特に、ＴｉプラスミドｐＴｉＡＣＨ５（Gielen等、EMBO J.3(1984)835
ページ以降）のＴ−ＤＮＡの第３遺伝子（オクトピン合成）に対応するＴ−ＤＮ
Ａポリアデニル化シグナルまたはその機能的等価物である。Preferred polyadenylation signals are plant polyadenylation signals, preferably T-DNA polyadenylation signals from Agrobacterium tumefaciens, especially the Ti plasmid pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984) 835).
T-DN corresponding to the third gene of T-DNA (octopine synthesis)
A polyadenylation signal or a functional equivalent thereof.
【００３７】 ＡＭＰデアミナーゼをコードするＤＡＮを有する宿主植物をトランスフォーム
するためには、本発明の発現カセットを、ベクターＤＮＡが他の機能的調節シグ
ナル、例えば複製または組み込みのための配列を含む組換えベクターに挿入する
。適するベクターは、特に「Methods in Plant Molecular Biology and Biotech
nology」（CRC出版）、第6／7章、７１−１１９ページに記載されている。To transform a host plant having a AMP deaminase-encoding DNA, the expression cassette of the present invention can be transformed with a recombinant vector vector DNA containing other functional regulatory signals, such as sequences for replication or integration. Insert into vector. Suitable vectors are particularly those described in Methods in Plant Molecular Biology and Biotech.
nology "(CRC Publishing), Chapter 6/7, pp. 71-119.
【００３８】 外来遺伝子を植物ゲノムに導入することを形質転換（トランスフォーメーショ
ン）という。このために用いられる方法は、一時的または安定な形質転換をもた
らすための、植物の形質転換、または植物組織もしくは植物細胞からの植物の再
生に関して開示されたものである。適する方法は、ポロエチレングリコール−誘
導ＤＮＡ取り込みによるプロトプラスト形質転換、遺伝子銃、電気泳動、ＤＮＡ
含有溶液での乾燥胚の培養、顕微注射、およびアグロバクテリウム仲介による遺
伝子導入である。これらの方法は、例えばTransgenic Plants, 第1巻におけるB.
Jenes等著、Techniques for Gene Transfer、Engineering and Utilization, S
.D. KungおよびR. Wu編、Academic Press (1993) 128-143およびPotrykus, Annu
. Rev. Plant Physol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225)に記載されてい
る。発現すべき構成をアグロバクテリウム・ツメファシエンスの形質転換に適す
るベクター、例えばpBin19にクローニングするのが好ましい（Bevan等、Nucl. A
cads Res. 12 (1984) 8711)。The introduction of a foreign gene into the genome of a plant is called “transformation”. The methods used for this are those disclosed for the transformation of plants, or the regeneration of plants from plant tissues or plant cells, to effect transient or stable transformation. Suitable methods include protoplast transformation by polyethylene glycol-induced DNA incorporation, gene gun, electrophoresis, DNA
Culture of dried embryos in containing solution, microinjection, and Agrobacterium-mediated gene transfer. These methods are described, for example, in B. Transgenic Plants, Volume 1.
Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, Engineering and Utilization, S
.D. Kung and R. Wu eds., Academic Press (1993) 128-143 and Potrykus, Annu
Rev. Plant Physol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225). The construct to be expressed is preferably cloned into a vector suitable for transformation of Agrobacterium tumefaciens, for example, pBin19 (Bevan et al., Nucl. A
cads Res. 12 (1984) 8711).
【００３９】 本発明の発現カセットにより形質転換を受けたアグロバクテリアも、同様に公
知方法での植物の形質転換、特に農作物、例えば穀物、トウモロコシ、大豆、イ
ネ、綿花、サトウキビ、キャノーラ、ヒマワリ、アマ、アサ、バレイショ、タバ
コ、トマト、アブラナ、アルファルファ、レタスおよび種々の樹木、木の実、ツ
ル植物、マメ科植物の形質転換に使用可能である。例えば損傷を受けた葉または
葉の断片をアグロバクテリア溶液に浸し、適する媒体中で培養する。Agrobacteria transformed with the expression cassettes of the present invention can also be used to transform plants in a known manner, especially agricultural crops, such as cereals, corn, soybeans, rice, cotton, sugarcane, canola, sunflower, flax. , Hemp, potato, tobacco, tomato, rape, alfalfa, lettuce and various trees, nuts, vines, legumes. For example, a damaged leaf or leaf fragment is immersed in an Agrobacterium solution and cultured in a suitable medium.
【００４０】 プリン生合成の行われる部位は一般に葉部の組織であるため、ＡＭＰデアミナ
ーゼ遺伝子の葉に特異的な発現は認識できる。しかしながら、プリン合成は葉部
組織に限られる必要はなく、植物のあらゆる他の部分、例えば油を含む種等で組
織特異的に起こり得ることは明白である。Since the site where purine biosynthesis is performed is generally a leaf tissue, leaf-specific expression of the AMP deaminase gene can be recognized. However, it is clear that purine synthesis need not be restricted to leaf tissue, but can occur tissue-specifically in any other part of the plant, such as oil-containing species.
【００４１】 多くのマメ科植物は固定窒素をウレイドの形態で根粒から上記基本組織に運搬
する（Schubert、1986、Ann. Rev. Plant Phys. 37, 539-574)。ウレイドはプリ
ン生合成により生成する。瘤−（根粒−）特異的なＡＭＰデアミナーゼのプロモ
ーターにより、マメ科植物における発現とこれによるウレイド生合成が特異的に
修飾される。すなわち、本発明による遺伝子発現カセットは、グリシンmax（Ben
bank承認No. U87999参照）からのホスホリボシル−ピロリン酸アミドトランスフ
ェラーゼのプロモーターまたはEP 249676に記載のような他の瘤特異的プロモー
ターを含んでもよい。Many legumes carry fixed nitrogen in the form of ureides from the nodules to the above basic tissues (Schubert, 1986, Ann. Rev. Plant Phys. 37, 539-574). Ureide is produced by purine biosynthesis. The nodule- (nodule-) specific AMP deaminase promoter specifically modifies expression in legumes and thereby ureide biosynthesis. That is, the gene expression cassette according to the present invention comprises glycine max (Ben
(see Bank Approval No. U87999) or other knob-specific promoters as described in EP 249676 from Phosphoribosyl-pyrophosphate amide transferase.
【００４２】 更に、外部ＡＭＰデアミナーゼ遺伝子の構成性発現は有利であるが、一方で誘
導性発現も望ましいと考えられる。In addition, while constitutive expression of the external AMP deaminase gene is advantageous, inducible expression may be desirable.
【００４３】 上述の組換え技術とクローニング技術により、本発明の発現カセットを複製可
能な、E. coli等における適当なベクターにクローンしてもよい。適するクロー
ニング・ベクターは、特にｐBR332、ｐUC系列、M13mp系列、およびｐACYC184で
ある。E. coliとアグロバクテリアの双方において複製可能な二元性ベクターが
特に好ましい。By the above-described recombination technique and cloning technique, the expression cassette of the present invention may be cloned into an appropriate replicable vector in E. coli or the like. Suitable cloning vectors are, inter alia, pBR332, pUC series, M13mp series, and pACYC184. Particularly preferred are dual vectors that are replicable in both E. coli and Agrobacteria.
【００４４】 本発明は更に、本発明の発現カセットを、植物、植物細胞、植物組織、または
植物の部分を形質転換するために用いる方法に関する。この使用の目的は、植物
中のＡＭＰデアミナーゼ含有量を向上させることである。The present invention further relates to methods of using the expression cassettes of the present invention to transform plants, plant cells, plant tissues, or plant parts. The purpose of this use is to increase the AMP deaminase content in the plant.
【００４５】 本発明の発現カセットは、使用するプロモーターに応じて、植物の葉部、種子
または他の部分での特異的な発現に関与するものとされる。本発明は、更にこの
様なトランスジェニック植物、その増殖材料、およびこの様な植物の植物細胞、
組織または部分に関する。The expression cassettes of the present invention are intended to be involved in specific expression in leaves, seeds or other parts of plants, depending on the promoter used. The present invention further relates to such transgenic plants, their propagation material, and plant cells of such plants,
Regarding organization or part.
【００４６】 また、本発明の発現カセットを、適当な量の酵素ＡＭＰデアミナーゼを製造す
るために、バクテリア、シアノバクテリア、酵母、繊維状菌、藻類の形質転換に
使用することも可能である。Further, the expression cassette of the present invention can be used for transformation of bacteria, cyanobacteria, yeast, filamentous fungi, and algae in order to produce an appropriate amount of the enzyme AMP deaminase.
【００４７】 更に、本発明は、ＡＭＰデアミナーゼ活性を有する、アミノ酸配列SEQ ID NO:
2を有するシロイヌナズナ(Arabidopsis thalina)由来のタンパク質、誘導体、ま
たはこのタンパク質の一部に関する。ビール酵母菌（Saccharomyces cerevisiae
)と比較すると、アミノ酸レベルの相同性は４３−４７％同一である（図４参照
）。Further, the present invention provides an amino acid sequence having AMP deaminase activity, SEQ ID NO:
2. A protein, derivative, or part of this protein from Arabidopsis thalina having 2. Saccharomyces cerevisiae
), The homology at the amino acid level is 43-47% identical (see FIG. 4).
【００４８】 本発明は、ビール酵母菌ＡＭＰデアミナーゼとのアミノ酸配列相同性が２０−
１００％同一の、ＡＭＰデアミナーゼ活性を有する植物タンパク質に関する。[0048] The present invention provides amino acid sequence homology with brewer's yeast AMP deaminase of 20-.
100% identical to a plant protein having AMP deaminase activity.
【００４９】 シロイヌナズナＡＭＰジアミナーゼとアミノ酸相同性が５０〜１００％同一の
ＡＭＰジアミナーゼ活性を有する植物タンパク質が好ましく用いられる。A plant protein having AMP diaminase activity having 50 to 100% amino acid homology to Arabidopsis AMP diaminase is preferably used.
【００５０】 更に、シロイヌナズナＡＭＰジアミナーゼとアミノ酸相同性が８０〜１００％
同一のＡＭＰジアミナーゼ活性を有する植物タンパク質が、特に好ましく用いら
れる。Further, the amino acid homology with Arabidopsis AMP diaminase is 80 to 100%.
Plant proteins having the same AMP diaminase activity are particularly preferably used.
【００５１】 上記のように、ＡＭＰデアミナーゼは除草剤の適当な標的となる。更に効率的
なＡＭＰデアミナーゼ抑制因子を探すためには、抑制因子−酵素結合の研究に用
いられる適当な試験システムを提供することが必要である。このためには、例え
ば、シロイヌナズナ由来のＡＭＰデアミナーゼの完全なｃＤＮＡ配列を発現ベク
ターにクローンし（pQE, Qiagen）、E. coliで過剰に発現させる。As noted above, AMP deaminase is a suitable target for herbicides. In order to search for more efficient AMP deaminase inhibitors, it is necessary to provide a suitable test system for studying inhibitor-enzyme binding. For this purpose, for example, the complete cDNA sequence of AMP deaminase from Arabidopsis thaliana is cloned into an expression vector (pQE, Qiagen) and overexpressed in E. coli.
【００５２】 本発明の発現カセットを用いることにより発現するＡＭＰデアミナーゼタンパ
ク質は、ＡＭＰデアミナーゼに特異的な抑制因子を見つけるために特に適当であ
る。The AMP deaminase protein expressed by using the expression cassette of the present invention is particularly suitable for finding an inhibitor specific to AMP deaminase.
【００５３】 この目的で、ＡＭＰデアミナーゼは、例えば試験対象の薬剤存在下または不存
在下にＡＭＰデアミナーゼの活性を測定する酵素アッセイで使用される。２種類
の活性測定の比較により、試験対象の薬剤の抑制挙動についての定性的、定量的
記述が可能となる（実施例４参照）。For this purpose, AMP deaminase is used, for example, in an enzyme assay which measures the activity of AMP deaminase in the presence or absence of the drug to be tested. By comparing the two types of activity measurements, a qualitative and quantitative description of the inhibitory behavior of the drug under test can be made (see Example 4).
【００５４】 本発明の被検システムを用いると、大量の化合物の除草特性を迅速かつ率直に
調べることができる。この方法により、更なる徹底的な試験のために、大量の、
特に有効物質からの再現的選択が可能となる。この試験は当業者に周知の方法で
あり、これらの物質を用いて行われる。Using the test system of the present invention, the herbicidal properties of large amounts of compounds can be quickly and frankly investigated. In this way, large quantities, for further thorough testing,
In particular, reproducible selection from active substances is possible. This test is a method well known to those skilled in the art and is performed using these substances.
【００５５】 更に、本発明は上記試験システムを用いて同定可能な除草剤に関する。The invention further relates to a herbicide identifiable using the test system described above.
【００５６】 植物におけるＡＭＰデアミナーゼをコードするSEQ ID NO:1の遺伝子配列が過
剰発現すると、ＡＭＰデアミナーゼ抑制因子への耐性が向上する。本発明は、更
にこのように得られたトランスジェニック植物に関する。Overexpression of the gene sequence of SEQ ID NO: 1 encoding AMP deaminase in plants increases resistance to AMP deaminase inhibitors. The invention further relates to the transgenic plants thus obtained.
【００５７】 形質転換により発現したＡＭＰデアミナーゼの発現効率は、例えばインビトロ
の苗条分裂組織増殖、または発芽試験により測定可能である。更に、ＡＭＰデア
ミナーゼ遺伝子の発現の性質と水準の変化と、そのＡＭＰデアミナーゼに対する
耐性についての効果を、温室実験により被検植物について調べることができる。The expression efficiency of AMP deaminase expressed by transformation can be measured, for example, by in vitro shoot meristem growth or germination test. Further, changes in the nature and level of expression of the AMP deaminase gene and its effect on resistance to AMP deaminase can be examined for test plants by greenhouse experiments.
【００５８】 本発明は、更に本発明の発現カセットにより形質転換されたトランスジェニッ
ク植物、トランスジェニック細胞、組織、部分、およびこの様な植物の増殖材料
に関する。これに関して、例えば大麦、小麦、ライ麦、トウモロコシ、大豆、イ
ネ、綿花、サトウキビ、キャノーラ、ヒマワリ、アマ、アサ、バレイショ、タバ
コ、トマト、アブラナ、アルファルファ、レタスおよび種々の樹木、木の実、ツ
ル植物、マメ科植物を用いるのが好ましい。The invention further relates to transgenic plants, transgenic cells, tissues, parts and transgenic materials of such plants, which have been transformed with the expression cassettes according to the invention. In this regard, for example, barley, wheat, rye, corn, soy, rice, cotton, sugar cane, canola, sunflower, flax, hemp, potato, tobacco, tomato, rape, alfalfa, lettuce and various trees, nuts, vines, beans It is preferable to use family plants.
【００５９】 更に、本発明はＤＮＡ−SEQ ID NO:1の発現により、ＩＭＰ含有率が向上する
植物に関する。Further, the present invention relates to a plant whose IMP content is improved by expression of DNA-SEQ ID NO: 1.
【００６０】 本発明における、イノシン５’−リン酸（ＩＭＰ）含有量の増加とは、少なく
とも一植物世代の間に遺伝子操作を行わなかった植物と比較して、植物内のＡＭ
Ｐデアミナーゼ遺伝子の機能的過剰発現によりＩＭＰ生合成効率が改善された人
工的に得られた能力を意味する。In the present invention, an increase in the content of inosine 5′-phosphate (IMP) refers to an increase in the amount of AM in a plant as compared to a plant that has not been genetically modified for at least one plant generation.
It refers to the artificially obtained ability of improving the IMP biosynthesis efficiency by functional overexpression of the P deaminase gene.
【００６１】 以下に、実施例により本発明を更に説明する。本発明は以下の実施例に限定さ
れるものではない。 ［実施例］ Ａ．実施例で用いる遺伝子操作法 ［一般的なクローニング法］ クローニング法、例えば制限酵素による切断、アガロース・ゲル電気泳動、ＤＮ
Ａフラグメントの精製、ニトロセルロースおよびナイロン膜への核酸の転移、Ｄ
ＮＡフラグメントの結合、Escherichia Coli細胞の形質転換、バクテリアの培養
、組換えＤＮＡの配列分析は、Sambook等の論考に従って行った（1998)（Cold S
pring Harbor Labratory Press: ISBN 0-87969-309-6)。 ［組換えＤＮＡの配列解析］ 組換えＤＮＡ分子をＡＢＩ社製、2レーザー蛍光ＤＮＡシーケンサーを用い、S
angerの方法により配列した（Sanger等、(1977)Proc. Natl. Acad. Sci. USA74,
5463-5467)。ポリメラーゼ連鎖反応により得られたフラグメントを配列し、発
現に用いられる構成物中のポリメラーゼエラーを回避すべくチェックした。 ［植物組織からの完全なＲＮＡの分析］ 植物の組織から、完全なＲＮＡをLogemann等の論考、((1987)Anal. Biochem.
163.21)に記載のように単離した。この分析用にそれぞれ２０ｍｇのＲＮＡをホ
ルムアルデヒド含有１．５％アガロースゲルで分画し、ナイロン膜に移行させた
（Hybond,Amersham)。Amasinoの論考に記載されているように特異的な転写が検
知された（(1986)Anal. Biochem. 152, 304)。試料として使用するｃＤＮＡフラ
グメントをランダムプライムドＤＮＡ標識キットにより放射線標識し（Boehring
er、マンハイム）、標準的方法でハイブリッドした(Hybond information for us
ers, Amersham)。ハイブリダイゼーションシグナルを、コダック社製、X-OMAT A
Rフィルムを用いたオートラジオグラフィーで可視化した。Hereinafter, the present invention will be further described with reference to examples. The present invention is not limited to the following examples. Example A. Gene Manipulation Methods Used in Examples [General Cloning Method] Cloning methods, such as restriction enzyme digestion, agarose gel electrophoresis, and DN
Purification of A fragment, transfer of nucleic acid to nitrocellulose and nylon membrane, D
Ligation of NA fragments, transformation of Escherichia Coli cells, cultivation of bacteria, and sequence analysis of recombinant DNA were performed according to Sambook et al. (1998) (Cold S.
pring Harbor Labratory Press: ISBN 0-87969-309-6). [Sequence Analysis of Recombinant DNA] The recombinant DNA molecule was analyzed using an ABI 2-laser fluorescent DNA sequencer.
Sequenced by the method of anger (Sanger et al., (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74,
5463-5467). The fragments obtained by the polymerase chain reaction were sequenced and checked to avoid polymerase errors in the constructs used for expression. [Analysis of Complete RNA from Plant Tissue] From plant tissue, complete RNA was analyzed by Logemann et al. ((1987) Anal. Biochem.
163.21). For this analysis, 20 mg of each RNA was fractionated on a 1.5% agarose gel containing formaldehyde and transferred to a nylon membrane (Hybond, Amersham). Specific transcription was detected as described in Amasino's article ((1986) Anal. Biochem. 152, 304). A cDNA fragment used as a sample is radiolabeled with a random primed DNA labeling kit (Boehring
er, Mannheim) and hybridized by standard methods (Hybond information for us
ers, Amersham). The hybridization signal is obtained from Kodak X-OMAT A
Visualization was performed by autoradiography using R film.
【００６２】 以下に用いるバクテリア株(E. coli、XL-I Blue)は、NP66の場合に、Stratage
neまたはPharmaciaから購入したものである。植物の形質転換に用いたアグロバ
クテリウム株（Agrobacterium tsumefaciens, C58C1,プラスミドpGV2260またはp
GV3850kan含有）についてはDeblaereによる報告がある（Nucl. Acids Res. 13(1
985) 4777)。或いは、アグロバクテリウム株、LBA4404（Clontech)または他の適
する株も使用可能である。クローニングに使用可能なベクターはpUC19（Yanishi
-Perron, Gene 33(1985),１０３−１１９）、pBluescript SK-（Stratagene)、
pGEM-T（Promega)、ｐZerO(Invitrogen)、pBin19(Bevan等、Nucl. Acids Res. 1
2(1984) 8711-8720）およびpBinAR（HoefgenおよびWillmitzer、Plant Science
66(1990)221-230)である。Bacterial strains (E. coli, XL-I Blue) used below are Stratage in the case of NP66.
Ne or purchased from Pharmacia. Agrobacterium strains used for plant transformation (Agrobacterium tsumefaciens, C58C1, plasmid pGV2260 or pGV2260
GV3850kan) is reported by Deblaere (Nucl. Acids Res. 13 (1
985) 4777). Alternatively, an Agrobacterium strain, LBA4404 (Clontech) or other suitable strain can be used. Vectors that can be used for cloning are pUC19 (Yanishi
-Perron, Gene 33 (1985), 103-119), pBluescript SK- (Stratagene),
pGEM-T (Promega), pZerO (Invitrogen), pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 1
2 (1984) 8711-8720) and pBinAR (Hoefgen and Willmitzer, Plant Science)
66 (1990) 221-230).
【００６３】 ［実施例１］ 合成によるオリゴヌクレオチドを用いたＡＭＰデアミナーゼのＲＣＰ増幅 ＡＭＰデアミナーゼをコードするシロイヌナズナｅｓｔクローンをArbidopsis
Biological Resorce Center(オハイオ州立大学）から購入した。これは部分的
なｃＤＮＡのクローン（Ｔ２１２５０）であり、ＡＭＰデアミナーゼの全長にわ
たる転写に対応するものではない。シロイヌナズナのＡＭＰデアミナーゼのＰＣ
Ｒ増幅は、Perkin Elmer製のＤＮＡ熱循環器中で行った。使用したオリゴヌクレ
オチド、５’プライマーＣＧＡＧＡＴＡＧＣＴＣＧＴＡＡＣおよび３’プライマ
ーＡＧＣＣＣＡＣＴＣＡＴＡＴＴＡＴＴを、完成した配列から取り出した。反応
混合物は８ｎｇ／μｌのEscherichia coli由来のゲノムＤＮＡ、０．５μＭの適
当なオリゴヌクレオチド、２００μＭヌクレオチド(Pharmacia)、５０ｍＭのＫ
Ｃｌ、１０ｍＭのｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃におけるｐＨ８．３、１．５ｍＭ
ＭｇＣｌ2）および０．０２Ｕ／μｌのTaqポリメラーゼ（Perkin Elmer）を含む
ものである。Example 1 RCP Amplification of AMP Deaminase Using Synthetic Oligonucleotides Arabidopsis est clone encoding AMP deaminase was cloned into Arbidopsis
Purchased from Biological Resorce Center (Ohio State University). This is a partial cDNA clone (T21250) and does not correspond to full-length transcription of AMP deaminase. Arabidopsis AMP deaminase PC
R amplification was performed in a DNA heat circulator from Perkin Elmer. The oligonucleotides used, 5 ′ primer CGAGATAGCTCGTAAC and 3 ′ primer AGCCCACTCATATTATT were removed from the completed sequence. The reaction mixture was 8 ng / μl genomic DNA from Escherichia coli, 0.5 μM of the appropriate oligonucleotide, 200 μM nucleotides (Pharmacia), 50 mM K
Cl, 10 mM tris-HCl (pH 8.3 at 25 ° C., 1.5 mM
MgCl 2 ) and 0.02 U / μl Taq polymerase (Perkin Elmer).
【００６４】 増幅条件を以下の通りに設定した。The amplification conditions were set as follows.
【００６５】 アニーリング温度： ５２℃、１分 変性温度： ９２℃、1分 伸長温度： ７２℃、1．5分 サイクル数： ４０ 得られたフラグメントは、estクローンT21250の小さい部分を有し、シロイヌ
ナズナｃＤＮＡバンク（Stratagene)の異種スクリーニングを行うために使用し
た。シロイヌナズナｃＤＮＡライブラリー（Stratagene)の３．０×１０5のラム
ダファージをバクテリア株としてのE. coliのXLI-Blueと共に寒天プレート上に
載置した。ファージＤＮＡを標準的方法により（Sambrok等（1989)；Cold Sprin
g Harbor Laboratory Press:ISBN 0-87969-309-6)、ニトロセルロースフィルタ
ー（Gelman Scineces)に移行させ、このフィルター上に固定した。使用したハイ
ブリダイゼーション試料は、上述のＰＣＲフラグメントであり、マルチプライム
ＤＮＡ標識システム（Amersham Buchler)によりα−32Ｐ−ｄＣＰＴ（特異的活
性３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の存在下に、製造社による指示により放射線標識し
たものである。３×ＳＳＰＥ、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ｗ／ｖ）、０
．０２％ポリビニルピロリドン（ｗ／ｖ）、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ ４００（
ｗ／ｖ）および５０ｍｇ／ｍｌのコウシ胸腺ＤＮＡ中、６０℃で１２〜１６時間
のプレハイブリダイゼーションを行った後、膜のハイブリダイゼーションが起き
た（Sambrook等、(1989)、Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-8796
9-6)。次いでこのフィルターを２×SSPE、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ｗ
／ｖ）中、６０℃で６０分間洗浄した。オートラジオグラフィーにより、ハイブ
リダイズしているファージが可視化さため、これを標準的な方法で精製、単離し
た。Annealing temperature: 52 ° C., 1 minute Denaturation temperature: 92 ° C., 1 minute Extension temperature: 72 ° C., 1.5 minutes Number of cycles: 40 The fragment obtained has a small part of est clone T21250, It was used to perform heterogeneous screening of cDNA banks (Stratagene). 3.0 × 10 5 lambda phage of the Arabidopsis thaliana cDNA library (Stratagene) were mounted on an agar plate together with XLI-Blue of E. coli as a bacterial strain. Phage DNA was prepared by standard methods (Sambrok et al. (1989); Cold Sprin
g Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6), transferred to a nitrocellulose filter (Gelman Scineces) and fixed on this filter. The hybridization sample used was the PCR fragment described above and was radiolabeled by a multi-primed DNA labeling system (Amersham Buchler) in the presence of α- 32 P-dCPT (specific activity 3000 Ci / mmol) according to the manufacturer's instructions. It was done. 3 × SSPE, 0.1% sodium dodecyl sulfate (w / v), 0
. 02% polyvinylpyrrolidone (w / v), 0.02% Ficoll 400 (
(w / v) and 50 mg / ml calf thymus DNA, after hybridization for 12-16 hours at 60 ° C., followed by membrane hybridization (Sambrook et al., (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press). : ISBN 0-8796
9-6). The filter was then washed with 2 × SSPE, 0.1% sodium dodecyl sulfate (w
/ V), and washed at 60 ° C. for 60 minutes. The hybridizing phage was visualized by autoradiography and was purified and isolated by standard methods.
【００６６】 ［実施例２］ ＡＭＰデアミナーゼ活性を有するタンパク質をコードするｃＤＮＡクローンの
配列解析 酵母ＡＭＰデアミナーゼと高い相同性を有するポリペプチドをコードする６４
のｃＤＮＡクローンが得られた（図４参照）。２本の最も長いクローンは同一で
あり、制限分解物中に２８８０塩基対の長さのＥｃｏＲＩフラグメントがあった
。シロイヌナズナ由来のＡＭＰデアミナーゼをコードする最長のクローンをＡＭ
Ｐ１とする。このプラスミドをｐＢＳ−ＡＭＰ１と呼ぶ。ｃＤＮＡ（図２参照）
は、２５７８ｂｐの読み枠を有し、終止コドンを２５７９−２５８１位に有して
いた。アミノ酸配列は三番目の読み枠のリンカー配列（図２の配列の太字で示さ
れた末端）の後の三番目の塩基で開始し、８６０アミノ酸長のポリペプチドに翻
訳されるか、または初めのメチオニン開始コドンから８３９アミノ酸のポリペプ
チドに翻訳される（図３参照）。この他には、４６位のメチオニンを用い、８２
４のアミノ酸から成るポリプチドが得られることも考えられる。Example 2 Sequence Analysis of cDNA Clone Encoding a Protein Having AMP Deaminase Activity 64 Encoding a Polypeptide Having High Homology with Yeast AMP Deaminase
Was obtained (see FIG. 4). The two longest clones were identical, with a 2880 base pair long EcoRI fragment in the restriction digest. The longest clone encoding AMP deaminase from Arabidopsis thaliana
P1. This plasmid is called pBS-AMP1. cDNA (see Figure 2)
Had an open reading frame of 2578 bp and a stop codon at positions 2579-2581. The amino acid sequence starts at the third base after the linker sequence in the third reading frame (the terminal shown in bold in the sequence of FIG. 2) and is translated into a polypeptide of 860 amino acids in length or It is translated into a polypeptide of 839 amino acids from the methionine start codon (see FIG. 3). In addition, using methionine at position 46,
It is also conceivable that a polypeptide consisting of four amino acids could be obtained.
【００６７】 酵母のサイトゾルにタンパク質活性がある一方で、植物についてのサイトゾル
の活性、およびミトコンドリアで得られると予測される活性についての報告がな
されている（YoshinoおよびMurakami, 198, Z. Planzenphysiologie, 99, 331-3
38)。この実験におけるｃＤＮＡ配列の読み枠によると、それぞれ異なる開始コ
ドンを用いることによりミトコンドリア形態とサイトゾル形態の可能性が推論さ
れる。コード配列の第３塩基から読み枠の読みとりを開始すると、大量の親水性
のセリンとスレオニン残基が交互に現れ、脂肪族アミノ酸残基がメチオニンコド
ンの前に存在し、ミトコンドリアまたはプラスチドへのトランジット配列を示し
ていることがわかる。プリン合成はプラスチドで起こっていると一般に推論され
ている。しかしながら、プリン合成の酵素がミトコンドリアにも存在することも
近年示されている（Atkins等、1997、Plant Physiol. 113, 127-135)。本実験で
使用しているｃＤＮＡ配列の読み枠によると、異なる開始コドンを用いることに
より、ミトコンドリア、プラスチドまたはサイトゾルのいずれかの形態である可
能性が明確に示されていると考えられる。この２種類の最長のクローンは、Ｎ末
端に、可能な２種類の開始コドンを有する連続的な読み枠を有するものである。
酵母の配列と比較すると、２番目の開始コドンが、酵母の配列の場合での開始位
置にほぼ一致している（図４）。このタンパク質の全長にわたり、植物の配列は
酵母の配列と約５９−６３％類似し、約４３−４７％同一である。これらの数値
は比較のパラメータを変更することにより異なる（Lasergene Software，MegAli
gn Program)。更に、植物ＡＭＰデアミナーゼのＮ末端が、酵母の配列における
Ｃ末端に比較してかなりわずかな相同性しか示していないことも注目に値する。While there is protein activity in the yeast cytosol, there have been reports of cytosolic activity for plants and activities expected to be obtained in mitochondria (Yoshino and Murakami, 198, Z. Planzenphysiologie). , 99, 331-3
38). According to the reading frame of the cDNA sequence in this experiment, the possibility of mitochondrial form and cytosolic form is inferred by using different start codons. When reading frame reading is started from the third base of the coding sequence, a large amount of hydrophilic serine and threonine residues alternate, aliphatic amino acid residues precede methionine codon, and transit to mitochondria or plastid. It can be seen that the sequence is shown. It is generally inferred that purine synthesis occurs in plastids. However, it has recently been shown that purine synthesis enzymes are also present in mitochondria (Atkins et al., 1997, Plant Physiol. 113, 127-135). According to the reading frame of the cDNA sequence used in this experiment, it is considered that the use of different initiation codons clearly indicates the possibility of mitochondrial, plastid or cytosolic forms. The two longest clones have a continuous open reading frame with two possible start codons at the N-terminus.
When compared to the yeast sequence, the second start codon is almost identical to the start position in the case of the yeast sequence (FIG. 4). Over the entire length of this protein, the plant sequence is about 59-63% similar and about 43-47% identical to the yeast sequence. These numbers are different by changing the parameters of the comparison (Lasergene Software, MegAli
gn Program). Furthermore, it is noteworthy that the N-terminus of plant AMP deaminase shows significantly less homology compared to the C-terminus in yeast sequences.
【００６８】 ［実施例３］ E. coliにおける過剰発現ベクターの製造 以下のオリゴヌクレオチド配列を、完成した配列から誘導し、BamHI制限切断
部位と突出塩基(protruding bases)を有する配列を得た。図２で、これらのオリ
ゴヌクレオチドに下線と符号（数値）を施した。潜在的なメチオニン開始コドン
を太字で示す。Example 3 Production of Overexpression Vector in E. coli The following oligonucleotide sequence was derived from the completed sequence to obtain a sequence having a BamHI restriction cleavage site and protruding bases. In FIG. 2, these oligonucleotides are underlined and marked (numerical value). Potential methionine start codons are shown in bold.
【００６９】[0069]
【化２】 Embedded image
【００７０】 ３種類の異なる５’プライマーを３’プライマーと組合わせて用いることによ
り、異なる長さのＰＣＲ生成物（フラグメントＩ，ＩＩ，ＩＩＩ）を得た。これ
らは完全な読み枠を有する配列（フラグメントＩ、プライマー１＋４）、Ｍｅｔ
開始コドンからの配列（フラグメントＩＩ、プライマー２＋４）、および二番目
の開始コドンからの配列（フラグメントＩＩＩ、プライマー３＋４）に相当する
。The use of three different 5 ′ primers in combination with the 3 ′ primer resulted in PCR products of different lengths (fragments I, II, III). These are sequences with a complete reading frame (fragment I, primers 1 + 4), Met
Corresponds to the sequence from the start codon (fragment II, primer 2 + 4) and the sequence from the second start codon (fragment III, primer 3 + 4).
【００７１】 ＰＣＲ反応混合物は、８ｎｇ／μｌのｐＢＳ−ＡＭＰ１ ＤＮＡ、０．５μＭ
の適するオリゴヌクレオチド、２００μＭのヌクレオチド（Pharacia)、５０ｍ
ＭのＫＣｌ、１０ｍＭのｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．３、１．５ｍＭの
ＭｇＣｌ2Ｕ／μｌのＴａｑポリメラーゼ（Perkin Elmer)を含むものである。
増幅条件を以下の通りに設定した。The PCR reaction mixture contained 8 ng / μl pBS-AMP1 DNA, 0.5 μM
Suitable oligonucleotides, 200 μM nucleotides (Pharacia), 50 m
M KCl, 10 mM tris-HCl (pH 8.3 at 25 ° C., 1.5 mM MgCl 2 U / μl containing Taq polymerase (Perkin Elmer).
The amplification conditions were set as follows.
【００７２】 アニーリング温度： ５２℃、１分 変性温度： ９２℃、1分 伸長温度： ７２℃、２．５分 サイクル数： ３０ ＰＣＲフラグメントを、過剰発現ベクターｐＥＴ１５ｂ、ｐＥＴ１１ａおよび
ｐＱＥ９にクローンし、標準的方法でのＩＰＴＣ誘導によるタンパク質の製造に
用いた（ハンドブック：The Quiaexpressionist (1992), Quiagen, Hilden参照)
。Annealing temperature: 52 ° C., 1 minute Denaturing temperature: 92 ° C., 1 minute Extension temperature: 72 ° C., 2.5 minutes Number of cycles: 30 The PCR fragment was cloned into the overexpression vectors pET15b, pET11a and pQE9 and standardized. (See Handbook: The Quiaexpressionist (1992), Quiagen, Hilden)
.
【００７３】 ［実施例４］ 過剰発現培養体から得られたE. coli由来の植物ＡＭＰデアミナーゼの酵素ア
ッセイ French Pressに記載の加圧粉砕法（pressure disruption method）により、最
大圧下、２０ｍｌ加圧チャンバーまたはガラスビーズミル（ＩＭＡ粉砕器）でE.
coliを粉砕した。セルペレット１ｇあたり、１０ｍｌのバッファ（０．１Ｍの
ＫＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．５、０．４Ｍの蔗糖、０．１ｍＭ ＤＤＴ）を用いた。こ
のペレットをガラスビーズ（ｄ＝０．５ｍｍ）の２．５倍量としてガラスビーズ
ミルに添加し、４℃、２５００ｒｐｍで２０分間粉砕した。粉砕した材料を４℃
にて、１０００００ｇあたり２０分の遠心分離に付した。酵素活性を、測光法（
photometric assey）を用いた、光度計（Uvikon933、Kontron）における２６０
ｎｍでの測定により測定した。過剰発現ベクターを選択することにより、ＤＴＴ
を粉砕バッファから除いても、標準的方法により、ヒスチジンアンカーを用いた
一工程でＡＭＰデアミナーゼを精製し、相同とすることが可能となった（ハンド
ブック：The Quiaexpressionist, Quiagen, Hildenも比較のこと）。Example 4 Enzyme Assay of Plant AMP Deaminase Derived from E. coli Obtained from Overexpressed Cultures A 20 ml pressurized chamber under maximum pressure was obtained by the pressure disruption method described in French Press. Or use a glass bead mill (IMA grinder) to
coli was crushed. For each gram of cell pellet, 10 ml of buffer (0.1 M KH 2 PO 4 , pH 7.5, 0.4 M sucrose, 0.1 mM DDT) was used. The pellets were added to a glass bead mill as 2.5 times the amount of glass beads (d = 0.5 mm) and crushed at 4 ° C. and 2500 rpm for 20 minutes. 4 ℃ of ground material
At 100,000 g for 20 minutes. Enzyme activity is measured by photometry (
260 in a photometer (Uvikon933, Kontron) using a photometric assey
Measured by measurement in nm. By selecting an overexpression vector, the DTT
AMP deaminase can be purified and homologous in a single step using a histidine anchor by standard methods, even if is removed from the grinding buffer (compare also Handbook: The Quiaexpressionist, Quiagen, Hilden) .
【００７４】 このホモジネート・バッファを、４０ｍＭのクエン酸塩（ｐＨ６．５）（５Ｎ ＮａＯＨにより調整）、０．０５％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）、１００ｍＭのＫＣｌ中
を透析させることにより、以下の媒体に装填した。The homogenate buffer was dialyzed in 40 mM citrate (pH 6.5) (adjusted with 5N NaOH), 0.05% BSA (w / v), 100 mM KCl to give the following medium: Was loaded.
【００７５】 装填されたバッファにおける１０−１００μｌずつの酵素画分をバッファと、
１００μｌの１ｍＭのＡＭＰ溶液、０．５ｍＭのＡＴＰ溶液および１ｍＭジアデ
ノシン五リン酸溶液の添加により７００μｌとした。７００μｌの反応バッファ
と形質転換を行っていないE. coliの培養体から得られたタンパク質ホモジネー
ト１００μｌを含む参照キュベットを用い、吸光度の減少を２〜１０分間測定し
た。同量の全タンパク質を測定値に対する参照の測定用に用いた。The enzyme fraction of 10-100 μl in the loaded buffer is referred to as buffer,
The volume was made up to 700 μl by adding 100 μl of a 1 mM AMP solution, a 0.5 mM ATP solution and a 1 mM diadenosine pentaphosphate solution. Absorbance loss was measured for 2-10 minutes using a reference cuvette containing 700 μl of reaction buffer and 100 μl of protein homogenate obtained from untransformed E. coli cultures. The same amount of total protein was used as a reference to the measurement.
【００７６】 ［実施例５］ 植物発現カセットの製造 ３５Ｓ ＣａＭＶプロモータをEcoRI-KpnIフラグメント（カリフラワーモザイ
クウイルスのヌクレオチド６９０９−７４３７（Franck等 (1980) Cell 21、28
5）に対応）としてプラスミドpBin19（Bevan等 (1980) Nucl. Acads Res. 12、8
711）に挿入した。ＴｉプラスミドpTiACH5のT-DNAの第３遺伝子のポリアデニル
化シグナル（Gielen等、(1984)EMBO J. 3,835）、ヌクレオチド11749-11939をPv
uII-HindIIIフラグメントとして単離し、SphIリンカーの添加後にベクターのSpH
I-HindIII切断部位との間のPvuII切断部位にクローンした。結果としてプラスミ
ドpBinAR（HoefgenおよびWillmitzer（1990）Plant Science 66、221-230）が得
られた。ＰＣＲフラグメントＩ、ＩＩおよびＩＩＩ（上記参照）を両方向につい
て、pBinARのBamHI切断部位にクローンし、タバコ植物の形質転換に用いた。Example 5 Production of Plant Expression Cassette The 35S CaMV promoter was replaced with the EcoRI-KpnI fragment (nucleotide 6909-7737 of cauliflower mosaic virus (Franck et al. (1980) Cell 21, 28)
5)) as plasmid pBin19 (Bevan et al. (1980) Nucl. Acads Res. 12, 8)
711). The polyadenylation signal of the third gene of the T-DNA of the Ti plasmid pTiACH5 (Gielen et al., (1984) EMBO J. 3,835), nucleotides 11749-11939 in Pv
isolated as a uII-HindIII fragment and, after addition of the SphI linker,
It was cloned into the PvuII cleavage site between the I-HindIII cleavage site. The result was the plasmid pBinAR (Hoefgen and Willmitzer (1990) Plant Science 66, 221-230). PCR fragments I, II and III (see above) were cloned in both directions into the BamHI cleavage site of pBinAR and used to transform tobacco plants.
【００７７】 得られたプラスミドをpBinAMP-20、ｐBinαAMP-0、pBinAMP-0、ｐBinαAMP-0
、ｐBinAMP+26、pBinαAMP＋26と呼ぶが、これらは上記ＰＣＲ混合物のうち、実
施例３に記載のフラグメントＩ、ＩＩ、ＩＩＩに対応するものである。The obtained plasmid was used for pBinAMP-20, pBinαAMP-0, pBinAMP-0, pBinαAMP-0
, PBinAMP + 26 and pBinαAMP + 26, which correspond to the fragments I, II and III described in Example 3 in the above PCR mixture.
【００７８】 ［実施例６］ トランスジェニックタバコ植物の製造 プラスミドpBinAMP-20、ｐBinαAMP-0、pBinAMP-0、ｐBinαAMP-0、ｐBinAMP+
26、pBinαAMP＋26をアグロバクテリウム・ツメファシエンスC58C1:pGV2260（De
blaere等、１９８４，Nucl. Acads．Res. 13, 4777-4788）にトランスフォーム
した。タバコ植物（Nicotina tabacum cv. Samsun NN）を、形質転換を受けたア
グロバクテリウム・コロニーを一晩培養した培養体の２％蔗糖含有のMurashige-
Skoog媒体(2MS媒体）（(1962)Physiol. Plant. 15473)中の１：５希釈物を用い
て形質転換した。無菌植物の葉盤（それぞれ約１ｃｍ2）を１：５０アグロバク
テリウム希釈物を含むペトリ皿で５〜１０分間培養した。この後、０．８％Bact
o agarを含む２ＭＳ媒体上、２５℃の暗所で２日間培養を行った。更に、１６時
間明所／８時間暗所に２日間保った後、培養を続け、更に５００ｍｌのクラフォ
ラン（セフォタキシムナトリウム）、５０ｍｇ／ｌのカナマイシン、１ｍｇ／ｌ
のベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、０．２ｍｇ／ｌのナフチル酢酸および１．
６ｇ／ｌのグルコースを含むＭＳ媒体上で週間的リズムを与えた培養を継続した
。成長段階の苗条を２％の蔗糖、２５０ｍｇ／ｌのクラフォランおよび０．８％
のBacto agarを含むＭＳ媒体上に移植した。Example 6 Production of Transgenic Tobacco Plants Plasmids pBinAMP-20, pBinαAMP-0, pBinAMP-0, pBinαAMP-0, pBinAMP +
26, pBinαAMP + 26 was transformed into Agrobacterium tumefaciens C58C1: pGV2260 (DeG
blaere et al., 1984, Nucl. Acads. Res. 13, 4777-4788). A tobacco plant (Nicotina tabacum cv. Samsun NN) was transformed with a 2% sucrose-containing Murashige-culture of an overnight culture of transformed Agrobacterium colonies.
Transformation was performed with a 1: 5 dilution in Skoog medium (2MS medium) ((1962) Physiol. Plant. 15473). The leaf discs (about 1 cm 2 each) of the sterile plants were cultured for 5-10 minutes in a Petri dish containing a 1:50 Agrobacterium dilution. After this, 0.8% Bact
Culture was performed for 2 days in a dark place at 25 ° C. on a 2MS medium containing ogar. After keeping the cells in a light place for 16 hours / 8 hours in a dark place for 2 days, the culture was continued, and further 500 ml of claforan (cefotaxime sodium), 50 mg / l kanamycin, 1 mg / l
Benzylaminopurine (BAP), 0.2 mg / l naphthylacetic acid and 1.
Weekly rhythm cultures were continued on MS medium containing 6 g / l glucose. Growing stage shoots with 2% sucrose, 250 mg / l claforan and 0.8%
Were transplanted onto MS media containing Bacto agar.
【００７９】 カナマイシンとクラフォランを含む２ＭＳ媒体上で、再生した苗条を得、根付
け後、土壌に移植し、１６時間明所／８時間暗所のリズムの湿度６０％の気候調
整チャンバーで２週間培養した後、外部遺伝子の発現または変化のあった代謝産
物成分および表現型の生長の特徴を調べた。変化のあったヌクレオチド含有率を
、Stitt等の方法（1982、FEBS Letters, 145,217-222）により測定した。Regenerated shoots were obtained on a 2MS medium containing kanamycin and claforan, rooted, transplanted to soil, and cultured for 2 weeks in a climate-controlled chamber with a rhythm of 16 hours light / 8 hours dark, 60% humidity. After that, the growth characteristics of metabolite components and phenotypes in which the expression or alteration of external genes was changed were examined. The changed nucleotide content was measured by the method of Stitt et al. (1982, FEBS Letters, 145, 217-222).
【００８０】 ［実施例７］ ＡＭＰデアミナーゼ過剰表現のトランスジェニックタバコ植物のＡＭＰデアミ
ナーゼ抑制因子に対する耐性を示すために、ＡＭＰデアミナーゼ抑制因子を、コ
フォルマイシンまたは他のＡＭＰデアミナーゼ抑制因子の使用量を変えて用い、
処理した。温室実験では、ＡＭＰデアミナーゼ過剰発現の植物が、使用した抑制
因子に対してあらゆる場合に、対照よりも優れた耐性を有することを明らかにす
ることができた。Example 7 In order to demonstrate the resistance of AMP deaminase overexpressing transgenic tobacco plants to the AMP deaminase inhibitor, the amount of AMP deaminase inhibitor was changed by using coformycin or another AMP deaminase inhibitor. Used
Processed. Greenhouse experiments could show that plants overexpressing AMP deaminase had better tolerance to the inhibitors used in all cases than the control.
【配列表】 [Sequence list]
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 5/10 5/00 Ｃ 15/09 ＺＮＡ Ａ 15/00 ＺＮＡＡ Ｆターム(参考） 2B030 AD08 CA15 CA17 CA19 4B024 AA08 BA79 CA04 CA05 DA01 4B050 CC03 DD13 LL03 LL10 4B065 AA88Y AB01 BA02 BA12 CA31 CA53 4H011 AB01 BA01 BB22 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) C12N 1/21 C12N 1/21 5/10 5/00 C 15/09 ZNA A 15/00 ZNAA F term ( Reference) 2B030 AD08 CA15 CA17 CA19 4B024 AA08 BA79 CA04 CA05 DA01 4B050 CC03 DD13 LL03 LL10 4B065 AA88Y AB01 BA02 BA12 CA31 CA53 4H011 AB01 BA01 BB22
Claims (23)
ナーゼのコード領域を含むＤＮＡ配列。1. A DNA sequence having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and comprising a coding region for plant AMP deaminase.
はこの配列から、挿入、欠失または置換により得られる誘導体とハイブリダイズ
し、ＡＭＰデアミナーゼの生物学的活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
配列。2. The biological activity of AMP deaminase, which hybridizes with the DNA sequence according to claim 1, SEQ ID NO: 1, a part thereof, or a derivative obtained by insertion, deletion or substitution from this sequence. DNA encoding a protein having
Array.
含む発現カセット。3. An expression cassette comprising a regulatory nucleic acid sequence and the DNA sequence according to claim 1 or 2.
１００以上のアミノ酸の部分的配列に相当するアミノ酸配列を有するタンパク質
。4. A protein having AMP deaminase activity and having an amino acid sequence corresponding to a partial sequence of 100 or more amino acids obtained from SEQ ID NO: 2.
含む、請求項４に記載のタンパク質。5. The protein according to claim 4, wherein the protein comprises a partial sequence of SEQ ID NO: 2 from 50 to 750 as an amino acid sequence.
項５に記載のタンパク質。6. The protein according to claim 5, comprising the sequence of SEQ ID NO: 2 as an amino acid sequence.
配列から、挿入、欠失または置換により得られる誘導体を含むバクテリア。7. A bacterium comprising the DNA sequence according to claim 1 or 2, a part thereof or a derivative obtained by insertion, deletion or substitution from this sequence.
配列から、挿入、欠失または置換により得られる誘導体を含む酵母。8. A yeast comprising the DNA sequence according to claim 1 or 2, a part thereof or a derivative obtained by insertion, deletion or substitution from this sequence.
の配列から、挿入、欠失または置換により得られる誘導体を、原核細胞または真
核細胞へ導入し、必要に応じてこれらの配列を前記細胞における転写および翻訳
を行う因子を制御するために連結し、ＡＭＰデアミナーゼの合成を行う翻訳可能
なｍＲＮＡの発現を行うための、使用法。11. A DNA sequence according to claim 1 or 2, a part thereof or a derivative obtained by insertion, deletion or substitution from this sequence, is introduced into a prokaryotic cell or a eukaryotic cell, if necessary. A method of linking these sequences to control transcriptional and translational factors in said cells, and expressing translatable mRNAs that effect AMP deaminase synthesis.
の使用法。12. Use of the expression cassette according to claim 3 for transforming a plant.
制因子を同定するテストシステムを製造するための使用法。13. Use of the expression cassette according to claim 3 for producing a test system for identifying an AMP deaminase inhibitor.
デアミナーゼ製造のための使用法。14. An AMP of a plant containing the expression cassette according to claim 3.
Use for deaminase production.
載のＤＮＡ配列の発現の改良により、ＡＭＰデアミナーゼ抑制因子に対する耐性
が向上した植物を製造するための使用法。15. Use of the expression cassette according to claim 3 for producing a plant having improved resistance to an AMP deaminase inhibitor by improving the expression of the DNA sequence according to claim 1 or 2.
た植物を製造するための使用法。16. Use of the expression cassette according to claim 3 for producing a plant having an increased IMP content.
ミナーゼ抑制因子を同定するテストシステム。17. A test system for identifying an AMP deaminase inhibitor by expressing the expression cassette according to claim 3.
剤。18. A herbicide identified by the test system according to claim 17.
植物全体または植物細胞から得られたプロトプラストに導入する工程を含む、植
物の形質転換方法。19. The expression cassette according to claim 3, wherein the expression cassette is a plant cell, a callus tissue,
A method for transforming a plant, comprising a step of introducing a plant into a protoplast obtained from a whole plant or a plant cell.
ＡＭＰデアミナーゼ抑制因子に対する耐性が向上した植物を製造する方法。20. A method for producing a plant having improved resistance to an AMP deaminase inhibitor by improving the expression of the DNA sequence according to claim 1 or 2.
ＩＭＰ含有量の増大した植物を製造する方法。21. A method for producing a plant having an increased IMP content by improving the expression of the DNA sequence according to claim 1 or 2.
抑制因子に対して優れた耐性を有する植物。A plant having excellent resistance to an AMP deaminase inhibitor comprising the expression cassette according to claim 3.
大した植物。23. A plant having an increased IMP content, comprising the expression cassette according to claim 3.
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