JP2002524078A - 子宮頸がんの治療 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 子宮頸がんに対するＤＮＡ免疫用のベクターは、ＨＰＶ−１６などの子宮頸がんに関連するヒト・パピローマウィルス（ＨＰＶ）株のＥ６および／またはＥ７抗原の少なくとも１つの非毒性Ｔ細胞エピトープをコードする核酸分子と、このベクターが投与される宿主における、その核酸分子の発現のため、前記核酸と作動的に結合されているプロモーターとを含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の分野） 本発明は、がん、特に、子宮頸がんの免疫療法に関する。

【０００２】 （発明の背景） 子宮頸がんは、世界中の女性において、２番目に多いがん関連死の原因である
。子宮頸がんの病因を、１６型および１８型ヒト・パピローマウィルス（ＨＰＶ
）感染と関連付ける、疫学的、ならびに実験的なデータがともにある。ＨＰＶウ
ィルスは、若い女性の３５から４０％に広まっている。初期段階の疾患の治療は
、比較的に成功をおさめているものの、患者の１５％では、再発が認められてい
る。疾患の再発患者での成果は比較的によくない。したがって、新規な治療法に
対する要望がある（参考文献１、２、３；−本発明の属する技術分野の水準をよ
り十分に記述するため、様々な参考文献を括弧内に示す。各引用文献の完全な書
誌事項は、明細書の最後、請求の範囲の直前に示してある。これらの参考文献の
開示は、以後参照することによって、本発明の開示中に組み入れられる）。

【０００３】 ＨＰＶ感染と子宮頸がんの強い関連性は、ウィルス抗原に特異的な免疫療法的
アプローチが子宮頸がん治療の実施可能な戦略となりうることを示唆している。
特異的免疫療法の目標は、腫瘍の病巣を攻撃し、根絶させるため、腫瘍を有する
患者の免疫応答を刺激することにある。腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）が同定されたこ
とにより、この戦略が実施できるようになった。ＨＰＶ−１６感染と子宮頸がん
との強い関連性は、この疾患を免疫療法的な治療のよい候補としている（参考文
献４）。

【０００４】 ＨＰＶ ＤＮＡ陽性の子宮頸がんでは、Ｅ６およびＥ７がんタンパク質が発現
される。実験的証拠は、これらの２つのタンパク質は、その発現はヒト上皮細胞
培養物において、形質転換ならびに、不死化された状態に導き、子宮頸がんの発
がんの進行の要因であることを示唆されている（参考文献５）。したがって、こ
れらの２つのタンパク質は、ＨＰＶで誘発された子宮頸がんにおける、抗原特異
的免疫療法の有力な候補物質であり、以下に検証する。

【０００５】 天然のＨＰＶ感染、また、代わりに、子宮頸がんに対する免疫性の性質に関し
ては多くの疑問が残っているものの、免疫抑制された個体は子宮頸部悪性疾患発
症のリスクがより高くなっていることから、免疫成分が存在することは明らかで
ある（参考文献６）。さらに、この免疫性は、免疫応答の細胞性攻撃が介在して
いる可能性が極めて高い。子宮頸部腫瘍の自然退縮部の観察において、広範な細
胞浸潤が認められる（参考文献７）。したがって、抗原特異的な細胞応答は、子
宮頸がん患者を治療する上で、必要と思われる。

【０００６】 免疫療法的戦略の結果の性質は確認されているが、従来のワクチン技術を使用
して、この種の応答を誘導する能力は限られている。ＨＰＶに対する予防用ワク
チンの開発は、Ｌ１およびＬ２ビリオンの構造タンパク質からなる組換えサブユ
ニット製剤に焦点を当てていた。真核細胞では、Ｌ１（主要キャプシドタンパク
質）は、それ自体を、パピローマウィルス様粒子（ＶＬＰ）に構成する（参考文
献１７）。ＶＬＰのアセンブリにはＬ１のみで十分であるものの、Ｌ２（副キャ
プシドタンパク質）の同時発現により、より大きなキャプシド産生が提供される
（参考文献１８）。対照的に、治療用ワクチンの開発は、一般に、野生型Ｅ６お
よび／またはＥ７タンパク質の発現を対象としてきている。使用する発現ベクタ
ーには、ワクシニアウィルス（例えば、米国特許第５７４４１３３号、（参考文
献１９、２０）に記載されたもの）、アルファウィルス（例えば、米国特許第５
８４３７２３号）、その他のポックスウィルス（例えば、米国特許第５６７６９
５０号）が含まれる。したがって、疾患の発がんの進行に関わる、ＨＰＶ抗原を
コードするＤＮＡベクターは、免疫療法的戦略の成功を達成させることのできる
最適な方法であると、判断された。

【０００７】 しかし、上記のように、Ｅ６およびＥ７ＨＰＶ抗原は、発がん性であると推測
され、したがって、これらのタンパク質の一方または両方をコードするＤＮＡ構
築物による免疫は、別の悪性疾患の誘発を引き起こす可能性がある（参考文献５
、１０、１１）。したがって、毒性リスクを最小限に留めるために、ここでは、
遺伝子工学的に無毒化したＥ７分子をＤＮＡ構築物にコードした。この無毒化し
た分子は、網膜芽細胞腫（Ｒｂ）結合領域を欠失させることにより、改変される
（参考文献８、９）。がん原性の形質転換のリスクを伴うことなく、抗原特異的
な免疫性を達成する別の方法は、特異的免疫応答を誘導するため、分子の重要な
部分のみを投与するという、エピトープ戦略の利用である（参考文献１２〜１６
）。ここでは、Ｅ６およびＥ７の両者に由来するいくつかのＴ細胞エピトープが
互いに連結さえれている、ＤＮＡ−ポリエピトープ構築物の設計にこのアプロー
チを使用した。ここでは、ＨＰＶ関連子宮がんの齧歯類モデルで、これら２つの
アプローチの比較を行った。

【０００８】 （発明の概要） 本発明によれば、宿主において免疫応答を提供するための、宿主に対するＨＰ
Ｖ抗原の投与用の、新規なＤＮＡ構築物が提供される。本発明は、ＨＰＶにより
生じる腫瘍、特には子宮頸がんの免疫療法の方法まで及ぶ。

【０００９】 ＨＰＶ ＤＮＡ陽性子宮頸がんの免疫療法のために選択される抗原は、かかる
がんにより発現されるものとすることができる。このようなＨＰＶ抗原の１つは
、Ｅ７抗原であり、これはワクシニアベクター系において、防御能を有すること
が既に示されている。

【００１０】 Ｒｂタンパク質に結合し、そして、発がん性の状態を促進するその能力から、
ワクチンに天然型のＥ７の使用には、潜在的な毒性の懸念が存在する。ここでは
、 Ｅ７の新規な無毒化型を、Ｒｂ結合部位を欠失させることにより構築し、ｐ
ＣＭＶ３（図２）に導入することにより、免疫用のベクターｐＣＭＶ−ｄＥ７（
図１）を提供した。

【００１１】 この無毒化したＥ７をコードする配列は、アニールしたオリゴから形成された
ＤＮＡで約２１０ｂｐを置き換えることにより、未修飾のコード配列から調製し
た。置換配列は、網膜芽細胞腫（Ｒｂ）ファミリーの細胞性タンパク質との複合
体形成に関与するＥ７の領域、すなわち、アミノ酸２１から２６をコードする１
８ヌクレオチドを、天然のＥ７タンパク質から欠いている。

【００１２】 ｐＣＭＶ−ｄＥ７構築物による免疫は、野生型Ｅ７分子を発現する、生きてい
るＣ３腫瘍細胞の接種に引き続く、腫瘍増殖からの顕著な防御をもたらし、この
Ｅ７ＤＮＡ構築物は、付随する毒性リスクなしに、防御免疫性の刺激に有効に利
用できることを示している。

【００１３】 もう１つのこのようなＨＰＶ抗原は、Ｅ６抗原である。これらの抗原は、ＤＮ
Ａ構築物中において、全長タンパク質として、または特異的Ｔ細胞エピトープの
形で提供することができる。

【００１４】 Ｔ細胞によるアプローチを評価するために、ＨＰＶ−１６のＥ６およびＥ７タ
ンパク質の両者由来の、Ｔ細胞エピトープをコードする核酸配列を含む、合成ミ
ニ遺伝子を調製した（図５Ａ）。このミニ遺伝子を含むＤＮＡ構築物（ｐＣＭＶ
３−ＨＰＶＴ＃１）（図６）は、マウスの免疫に使用した。図６のＤＮＡ構築物
で免疫されたマウスは、腫瘍増殖から１００％防御された。

【００１５】 これら研究の結果は、ＤＮＡ免疫は、生きているＣ３腫瘍による誘発に対する
防御に、有効に利用でき、したがって、子宮頸がんの臨床的治療においても、効
果があるであろうことを示している。

【００１６】 したがって、本発明の１つの形態では、ＨＰＶ−１６などの子宮頸がんに関連
するヒト・パピローマウィルス（ＨＰＶ）株のＥ６および／またはＥ７抗原の少
なくとも１つの非毒性Ｔ細胞エピトープをコードする核酸分子と、ベクターを投
与する宿主における、その核酸分子の発現のため、前記核酸と作動的に結合され
ているプロモーターとを含むベクターが提供される。

【００１７】 プロモーターは、好ましくはサイトメガロウィルス・プロモーターである。核
酸分子は、エンハンサ配列およびイントロン配列を含む、非常に初期のサイトメ
ガロウィルス・プロモーターを、ウシ・成長ホルモンのポリＡテールおよびカナ
マイシン耐性遺伝子と共に含んでいるプラスミドＣＭＶ−３中に含まれているこ
とができる。ｐＣＭＶ−３の要素は、図２に示す。

【００１８】 １つの実施態様では、核酸分子は、宿主でのがん遺伝子の複製を防止するため
に無毒化したＥ７抗原のコード配列である。この無毒化は、ＨＰＶ−１６のアミ
ノ酸２１から２６をコードするものを含んでいる、Ｒｂ結合部位をコードする核
酸を、天然の配列から除去することを含む、任意の好都合な方法で実施すること
ができる。このような核酸分子を含むベクターは、図１に示す制限酵素マップお
よび構築要素を含んでいる、ｐＣＭＶ３−ｄＥ７と同一な特性を有することがで
きる。

【００１９】 別の実施態様では、核酸分子は、ＨＰＶ−１６の、アミノ酸１１から２０、４
９から５７、８２から９０および８６から９３を含むＥ７抗原エピトープ、なら
びにアミノ酸２９から３８を含むＥ６抗原エピトープをコードする。この実施態
様では、特には、核酸分子は、配列番号：４または５を有するものであってよく
、あるいは、配列番号：６を有するアミノ酸配列をコードするものであってよい
。このような核酸分子を含むベクターは、図６に示すような制限酵素マップおよ
び構築要素を含み、ｐＣＭＶ３−ＨＰＶＴ＃１と同一な特性を有することができ
る。

【００２０】 本発明は、別の形態では、ここで提供されるベクターを含む、宿主にｉｎ ｖ
ｉｖｏで投与するための免疫原性組成物を提供し、それ用の薬学的に許容される
担体を含むことができる。本発明は、別の形態では、ヒト・ピペローマウィルス
（ＨＰＶ）により生じる子宮頸がんに対して、宿主を免疫する方法を提供し、そ
れは、有効量の本発明の免疫原性組成物の宿主への投与を含む。付加的な形態で
は、本発明は、子宮頸がんの宿主の治療方法を提供し、それは、有効量の本発明
の免疫原性組成物の宿主に対する投与を含む。

【００２１】 （発明の一般的な説明） 本発明は、ＤＮＡ免疫に基づく、ヒト・パピローマウィルス（ＨＰＶ）により
生じた子宮頸がんに対する免疫治療アプローチを提供する。

【００２２】 Ｃ３子宮頸がんモデル系において、一連の実験を実施した。ＤＮＡ送達プラッ
トフォームを使用して、いくつかのＥ７抗原をベースとするワクチンを、生きて
いる腫瘍細胞の感作に伴う、腫瘍増殖ふの防止能について評価した。Ｅ７抗原は
ワクシニアワクチン系において、いくらかの防御能を有することが示されている
ものの、上記のように、Ｒｂタンパク質に結合し、そして、発がん性の状態を促
進する能力から、ワクチンにおける天然型のＥ７の使用することについては、潜
在的な毒性の懸念が存在する。したがって、ＨＰＶ−１６のＥ７の「無毒化」型
（ｄＥ７）をコードするＤＮＡ構築物を構築した。ｄＥ７ ＤＮＡ構築物（ｐＣ
ＭＶ−ｄＥ７、図１）による免疫は、野生型Ｅ７分子を発現する生きているＣ３
腫瘍細胞の接種に続く、腫瘍増殖からの顕著な防御をもたらした。この知見は、
毒性リスクを伴うことなく、防御免疫を刺激するために、ｄＥ７ＤＮＡ構築物は
、有効に使用できることを示している。

【００２３】 エピトープ特異的なアプローチも評価した。ＨＰＶ−１６のＥ６タンパク質お
よびＥ７タンパク質の両者に由来するＴ細胞エピトープからなるＤＮＡ構築物は
、マウスの免疫に使用しした（ｐＣＭＶ３−ＨＰＶＴ＃１、図６）。このポリ・
エピトープ構築物で免疫したマウスの群において、著しい結果が認められ、そこ
では、腫瘍増殖からの１００％の防御が観察された。

【００２４】 本発明の様々な実施態様は、ＨＰＶ感染のワクチン接種、診断および治療の分
野で多くの用途を有することは、当業者には明らかである。このような用途の特
に非限定的な説明を以下に示す。

【００２５】 ワクチンの調製および使用 ワクチンとして使用するのに適する免疫原性組成物は、ここに開示するように
、ＨＰＶ遺伝子、エピトープおよびベクターから調製することができる。ワクチ
ンは、対象において、防御的または治療的な抗腫瘍応答を誘発するための、免疫
応答を引き起こす。核酸を含有する、ワクチンを含めた免疫原性組成物は、ポリ
ヌクレオチドを投与するための生理学的に許容される液体の溶液またはエマルジ
ョンの形で注射可能医薬品として調製することができる。許容できる液体中に溶
かした核酸を直接免疫剤として使用することができる（例えば、米国特許第５５
８９４６６号に一般的に記載されている。あるいは、核酸を、レシチンリポソー
ムおよび当技術分野で核酸リポソームとして知られている他のリポソーム（例え
ば、ＷＯ９３／２４６４０、参考文献２１に記載されている）などのリポソーム
と合わせることができ、または核酸をより詳細に以下に記述するアジュバントと
合わせることができる。カチオン性脂質を含むリポソームは自発的に、迅速に、
ＤＮＡおよびＲＮＡなどのポリアニアオンと相互作用して、ポリヌクレオチドを
１００％まで捕獲するリポソーム／核酸複合体となる。さらに、ポリカチオン性
複合体は細胞膜と融合して、リソソームコンパートメントの消化酵素をバイパス
するポリヌクレオチドの細胞内送達を生じる。公開されたＰＣＴ出願ＷＯ９４／
２７４３５はカチオン性脂質およびポリヌクレオチドを含む遺伝的免疫用組成物
を記載している。カルシウムイオン、ウィルスタンパク質および他のトランスフ
ェクション促進物質などの核酸の細胞取り込みを助ける物質を有利に使用するこ
とができる。

【００２６】 ポリヌクレオチドの免疫原性製剤は、生分解可能な徐放粒子を含むマイクロカ
プセルとして処方することもできる。すなわち、米国特許第５１５１２６４号は
、Ｂｉｏ Ｖｅｃｔｅｕｒｓ Ｓｕｐｒａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｉｒｅｓ（ＢＶＳ
Ｍ）と命名されているリン脂質／糖脂質／多糖の性質を有する粒状担体を記載し
ている。この粒状担体は、その層の１つの生物活性を有する多様な分子を輸送す
ることを意図している。

【００２７】 米国特許第５０７５１０９号は、５０：５０のポリ（ＤＬ−ラクチドコ−グリ
コライド）中に抗原、トリニトロフェニル化キーホールリンペットヘモシアニン
およびブドウ球菌エンテロトキシンＢをカプセル封入することを記載している。
ポリ（グリコライド）、ポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−グリコライド）、コポリオ
キサレート、ポリカプロラクトン、ポリ（ラクチド−コ−カプロラクトン）、ポ
リ（エステルアミド）、ポリオルトエステルおよびポリ８−ヒドロキシ酪酸）な
らびにポリ無水物などのカプセル封入用の他のポリマーが示唆されている。

【００２８】 公開されたＰＣＴ出願ＷＯ９１／０６２８２は、複数の生体接着性ミクロスフ
ェアおよび抗原を含む送達用ベヒクルを記載している。マクロスフェアは、デン
プン、ゼラチン、デキストラン、コラーゲンまたはアルブミン製である。この送
達用ベヒクルは、ワクチンを鼻粘膜を通る取込みを特に意図している。送達用ベ
ヒクルは、さらに吸収促進剤を含むことができる。

【００２９】 ベクターを相容性のある薬学的に許容される賦形剤と混合することができる。
このような賦形剤は、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール
およびそれらの組合せを含むことができる。免疫原性組成物およびワクチンはさ
らに、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ調整剤、有効性を高めるアジュバントなどの佐
剤物質をさらに含むことができる。

【００３０】 本発明で提供される免疫原性組成物およびワクチンは、おそらく注射部位を局
所麻酔剤で前処理した後に、皮下、静脈内、皮内または筋肉内注射により非経口
的に投与することができる。あるいは、本発明に従って処方した免疫原性組成物
は、粘膜表面で免疫応答を引き起こすように処方し、送達することができる。し
たがって、免疫原性組成物は、例えば、経鼻または経口（胃内）経路で粘膜表面
に投与することができる。あるいは、座薬および経口用処方を含む他の投与様式
も望ましいことがある。座薬用には、結合剤および担体は、例えばポリアルカレ
ングリコールまたはトリグリセリドを含むことができる。経口用処方は、例えば
、医薬用グレードのサッカリン、セルロースおよび炭酸マグネシウムなどの、通
常使用するインシピエントを含むことができる。

【００３１】 免疫原性製剤およびワクチンは、剤形に適した方法で、治療上有効で、防御的
で、免疫原性となる量で投与する。投与すべき量は、例えば、各自の免疫系が腫
瘍関連抗原およびそれに対する抗体を合成し、必要に応じ、細胞性免疫応答を生
じる能力を含め、治療する対象に依存する。投与すべき活性成分の正確な量は医
師の判断に依存する。しかし、適した用量の範囲は当業者には容易に決定でき、
ベクター約１μｇから約１ｍｇの程度とすることができる。初回投与および追加
投与に適した投与計画も様々でありうるが、初回投与後に複数回投与することが
できる。用量も投与経路に依存する可能性があり、宿主のサイズにより変化する
。

【００３２】 一般にリン酸緩衝食塩水の０．０５から０．１パーセント溶液として使用する
アジュバントと共にベクターを同時投与すると、免疫原性を顕著に改善すること
ができる。アジュバントは、抗原の免疫原性を高めるが、それ自体免疫原性であ
る必要はない。アジュバントは、抗原を投与部位の近くでの局在を維持すること
によって作用し、抗原の免疫系細胞への徐放を促進するデポ作用を生じることが
できる。アジュバントは免疫系の細胞を抗原デポに引きつけ、このような細胞を
刺激して、免疫応答を誘導することもできる。

【００３３】 免疫刺激剤またはアジュバントは長年にわたり、例えばワクチンに対する宿主
の免疫応答を改良するために使用されてきた。したがって、抗原に対する免疫応
答を増強するアジュバントが同定されている。しかし、これらのアジュバントの
一部は毒性であり、望ましくない副作用を引き起こす可能性があるため、ヒトお
よび多くの動物への使用に適さない。実際、水酸化アルミニウムおよびリン酸ア
ルミニウム（集合的に一般的にアラムと呼ばれている）のみが、ヒトおよび動物
用ワクチンのアジュバントとして日常的に使用されている。

【００３４】 広範な外因性アジュバントおよび他の免疫調整物質が抗原に対する強力な免疫
応答を誘起することができる。これらには、膜タンパク質抗原と複合体を形成し
て免疫刺激性複合体（ＩＳＣＯＭ）を生成するサポニン、鉱物油と共に使用する
プルロニックポリマー、鉱物油中の死滅マイコバクテリア、フロインド完全アジ
ュバント、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）およびリポ多糖（ＬＰＳ）などの細菌
生成物、ならびにモノホリル脂質Ａ、ＱＳ２１およびポリホスファゼンが含まれ
る。

【００３５】 本発明の特定の実施形態では、ベクターは、標的化分子と共に送達して、免疫
系の細胞を含む選択した細胞にベクターを向けることができる。

【００３６】 ポリヌクレオチドは様々な手順で宿主に送達することができ、例えば、Ｔａｎ
ｇ他（参考文献２２）は、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）をコードするＤＮＡでコ
ーティングした金のマイクロプロジェクチルをマウスの皮膚の導入して、マウス
で抗ＢＧＨ抗体を産生することを開示しており、一方、Ｆｕｒｔｈ他（参考文献
２３）はジェット・インジェクタを使用して、生きている動物の皮膚、筋肉、脂
肪組織および乳腺組織をトランスフェクトすることができることを示している。

【００３７】 実施例 上記の開示は、本発明を一般的に述べているものである。以下の特定の実施例
を参照することにより、より完全な理解を得ることができる。これらの実施例は
例示のために述べるものにすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。状況
により示唆されるか、または適切なものとなる可能性のあるとき、形態の変更お
よび等価物による代替が企図される。本明細書で特定の用語が用いられるが、そ
のような用語は説明的な意味で用いられるものであって、限定するものではない
。

【００３８】 本開示およびこれらの実施例で用いられているが、明確に記述されていない分
子遺伝学、タンパク質生化学、および免疫学の方法は、科学文献に詳細に報告さ
れており、十分に当業者の能力の範囲内である。

【００３９】 実施例１ 本実施例は、本明細書で用いられる免疫化プロトコルを説明する。

【００４０】 体重１８グラムから２０グラムの雌のＣ５７Ｂ１／６マウスを、Ｃｈａｒｌｅ
ｓ Ｒｉｖｅｒ（Ｓｔ．Ｃｏｎｓｔａｎｔ、Ｑｕｅｂｅｃ、Ｃａｎａｄａ）から
得た。Ｃａｎａｄｉａｎ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｏｎ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ（Ｃ
ＣＡＣ）によって立案されたガイドラインに従って、このマウスをマイクロアイ
ソレータに収容した。各処置群には１０匹の動物が含まれた。０日目に、前頸骨
筋の筋内経路（ｉ．ｍ．）または皮内経路（ｉ．ｄ．）のいずれかを経て、それ
ぞれのＤＮＡ構築物１００μｇで免疫化した。試験の２１日、および４２日目に
、各構築物の等量を投与し、この免疫化を繰り返した。２０日、４０日、および
５６日目に、マウスから血清試料を採取した。

【００４１】 実施例２ 本実施例は、腫瘍細胞チャレンジのプロトコルを説明する。

【００４２】 実施例１の手順によるＤＮＡ構築物での最後のブースタ投与２週間後、各マウ
スに生Ｃ３腫瘍細胞を５×１０⁵の用量で、頚部の項に皮下（ｓ．ｃ．）注射し
た。このＣ３腫瘍細胞ラインは、Ｒ．ＯｆｆｒｉｎｇａおよびＣ．Ｍｅｌｉｅｆ
から親切に提供された。このＣ３細胞ラインは、ｒａｓ癌遺伝子で形質転換した
ＨＰＶ−１６の完全ゲノムでＢ６マウス胚細胞をトランスフェクトすることによ
って作られた。ＨＰＶ１６腫瘍形成タンパク質Ｅ６およびＥ７の発現は、形質転
換状態を維持するために必要とされる。

【００４３】 注射を施した後、研究の継続期間、１週間につき３回マウスを検査した。腫瘍
測定は、バーニアカリパスを用いて行なった。腫瘍塊の体積は以下の式を用いて
算出した。体積＝ａｂ²／２で、式中ａ＝２つのうち長い径、ｂ＝小さい測定値
。初回の生腫瘍細胞のチャレンジから約３ヵ月の間、無腫瘍のままであったマウ
スは、その後、研究の１４１日目に、上述した５７日目の初回のチャレンジと同
じ投与量および同じ経路で再チャレンジを行なった。再チャレンジ後、前述のと
おり、腫瘍増殖の出現に関してモニターした。

【００４４】 実施例３ 本実施例は、Ｅ７およびｄＥ７特異的ＩｇＧイムノアッセイ（ＥＩＡ）を説明
する。

【００４５】 Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐイムノアッセイプレートを、５０ｍＭの炭酸塩緩
衝液ｐＨ９．６に希釈した濃度１０μｇ/ｍｌの組換えＥ７または組換えｄＥ７
抗原のいずれかで、１晩被覆した。翌日、プレートを０．０５％のＴｗｅｅｎ２
０含有ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）中で洗浄し、次に室温で１時間、１％の乳溶液でブ
ロックした。ブロック工程の後、プレートをＰＢＳ−Ｔ中で洗浄し、プレートに
多様な希釈度で血清試料を添加した。この試料を、４℃で１晩、プレート上でイ
ンキュベートした。翌日、ＰＢＳ−Ｔを用いて試料をプレートから洗い落とし、
ペルオキシダーゼ標識ヒツジ抗マウスＩｇＧコンジュゲートを１／２５０００の
希釈度で各ウェルに添加した。室温で１時間インキュベートした後、プレートを
ＰＢＳ−Ｔ中で洗浄し、ＴＭＢ基質（ＡＤＩ）を用いて比色反応を発現させた。
この反応を、Ｄｙｎａｔｅｃｈ ＭＲ５０００、９６ウェルのプレートリーダに
より、４５０ｎｍで読み取った。

【００４６】 実施例４ 本実施例は、ｐＣＭＶ−ｄＥ７の構築を説明する。

【００４７】 プラスミドｐＣＭＶ３は、種々の源からのセグメントを含んでおり、構築のエ
レメントを図２に示す。簡潔には、原核生物ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
ＳＫ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）は、ｐＣＭＶ３のバックボーンであり、Ｋａｎ^R
遺伝子でのＡｍｐ^R遺伝子の置換、ならびにｆ１およびＬａｃＺ領域の欠失によ
って改変された。この改変は、Ａｍｐ^R、ｆ１起点、およびＬａｃＺ配列を含む
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫの制限部位ＡｈｄＩ（ヌクレオチド２０４１）と
ＳａｃＩ（ヌクレオチド７５９）の間の配列を欠失することによって達成された
。Ｋａｎ^R遺伝子を含有するプラスミドｐＵＣ−４Ｋ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）か
らの１．２ｋｂＰｓｔＩフラグメントは、転写に関する反時計回り配向において
、改変ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫプラスミドのＡｈｄＩ部位にライゲートし
た平滑末端であった。最初期のヒト・サイトメガロウィルス遺伝子プロモーター
、エンハンサー、およびイントロンＡ配列（図２のＣＭＶに示す）を含む１．６
ｋｂＳｓｐＩ／ＰｓｔＩフラグメントは、時計回り配向でＣＭＶプロモーターか
らの転写が進むように、Ｋａｎ^R遺伝子の他端にライゲートした。この手順で、
図３に示したプラスミドｐＣＭＶ２Ｋが生成された。

【００４８】 ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）のポリアデニル化シグナル配列を含む０．２ｋｂ
フラグメントを、ＸｂａＩ消化、それに続く平滑末端を生成するためのクレノウ
処理、およびＢａｍＨＩ消化によって、プラスミドｐＥＮ−３から除去した。Ｂ
ＧＨｐＡフラグメントを含む１９２ｂｐフラグメントを、アガロースゲル電気泳
動によって分離した。プラスミドｐＥＮ−３は、ｂＧＨｐＡのｐＥＮ−１へのク
ローニングによって調製した（図４）。

【００４９】 次にプラスミドｐＣＭＶ２Ｋに、ＢｇｌＩＩ消化、クレノウ処理、およびＢａ
ｍＨＩ消化を行なった。この４．２ｋｂフラグメント（図３参照）を次に分離し
、前に分離した１９２ｂｐＢＧＨｐＡフラグメントにライゲートし、プラスミド
ｐＣＭＶ３を生成した。

【００５０】 このｄＥ７遺伝子を次に、５’末にＰｓｔＩ部位（配列番号２−ＣＴＧＣＡＧ
ＣＡＧＧＣＴＡＧＣＡＴＧＣＡＴＧＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣＴ）、３’末にＳａｌ
Ｉ部位（配列番号１２−ＧＴＣＧＡＣＴＴＡＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧＡＡＣＡＧ
ＡＴＧＧＧＧＣＡＣＡ）を導入したプライマを用いてプラスミドｐＳＥ８５９．
２からＰＣＲ増幅した。増幅した配列を図１Ｂに示すが、これはＨＰＶ−１６の
無毒化Ｅ７タンパク質を含む。このＰＣＲフラグメントをＰｓｔＩおよびＳａｌ
Ｉで消化したｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入し、この挿入物を配
列した（図１Ｂ）。ＰｓｔＩからＳａｌＩまでのフラグメントを次に、ＰｓｔＩ
からＳａｌＩまでのｐＣＭＶ３にサブクローンし、図１Ａに示したプラスミドｐ
ＣＭＶ−ｄＥ７を生成した。

【００５１】 実施例５ 本実施例は、野生型ＨＰＶ−１６Ｅ７を発現する腫瘍細胞ラインの移植後の腫
瘍増殖から動物を守るためのｐＣＭＶ−ｄＥ７の使用を例示する。

【００５２】 実施例１のプロトコルに従って、筋内経路で、無毒化Ｅ７タンパク質をコード
するＤＮＡ構築物（ｐＣＭＶ−ｄＥ７、実施例４に記載のとおり調製、図１）、
ＤＮＡコントロール（ｐＣＭＶ−３、図２）、またはＰＢＳのいずれかを用いて
マウスを免疫化した。３回の連続免疫化の後、野生型Ｅ７タンパク質を発現する
生Ｃ３腫瘍細胞を、実施例２のプロトコルに従って、５×１０⁵細胞の用量で移
植した。生細胞のチャレンジ後、無腫瘍のマウスの数を下の表１に示す。

【００５３】 チャレンジの約１ヵ月後（３０日目）、コントロール群（ｐＣＭＶ−３コント
ロールおよびＰＢＳ群）のすべてのマウスは、触知可能な腫瘍を有した。しかし
ながら、対照的に、ｐＣＭＶ−ｄＥ７免疫化群のマウスはいずれも触知可能な腫
瘍を示さなかった。６０日目までに、前に腫瘍陰性であったｐＣＭＶ−ｄＥ７免
疫化群のマウス１匹が、触知可能な腫瘍の初期徴候を示した。９０日目までに、
このマウスは大きな腫瘍のため安楽死させた。しかしながら、ｐＣＭＶ−ｄＥ７
免疫化群の残りのマウスは、無腫瘍のままであった。このように、ｄＥ７免疫化
群とコントロール群の間の、無腫瘍の状況には著しい相違が観察された。この結
果はしたがって、遺伝子的に無毒化されたＥ７分子（ｄＥ７）をコードするＤＮ
Ａ構築物を用いた免疫化が、生腫瘍細胞の移植後から動物を守ることのできる免
疫応答を誘発したことを示している。

【００５４】

【表１】

【００５５】 実施例６ 本実施例は、ｐＣＭＶ−ｄＥ７構築物で免疫化したマウスから得られた血清が
無毒化Ｅ７および野生型Ｅ７組換えタンパク質の両方に反応性であることを例示
する。

【００５６】 実施例５によって、遺伝子的無毒化Ｅ７タンパク質で免疫化されたマウスが野
生型Ｅ７タンパク質と交差反応性の免疫性を生じることができたという血清学的
な証拠を提供するために、免疫化マウスの血清を実施例３の手順に従ってＥＩＡ
によって分析した。アッセイした血清試料は、生腫瘍細胞チャレンジの１日前、
最後の追加免疫の２週間後である５６日目に採取した血液試料から得た。

【００５７】 血清の反応性抗体滴定量は、下の表２に見られるように、ｄＥ７特異的ＥＩＡ
またはＥ７特異的ＥＩＡのアッセイのいずれも等量であった。このように、抗体
レベルにおいて、ｄＥ７での免疫化によって生じた抗体はＥ７タンパク質に交差
反応性であった。

【００５８】

【表２】

【００５９】 実施例７ 本実施例は、免疫化の特定の経路が保護免疫性の誘発に著しい影響を及ぼすこ
とを例示する。

【００６０】 ＤＮＡ免疫化の皮内（ｉ．ｄ．）経路に対する筋内（ｉ．ｍ．）経路の、抗腫
瘍免疫性誘発に及ぼす影響を調査した。簡潔には、実施例１で上述した用量およ
び頻度で、両群のマウスを同じ構築物（ｐＣＭＶ−ｄＥ７、実施例４に記載のと
おり調製、図１）を用いて免疫化した。しかしながら、１群はｉ．ｍ．経路で免
疫化し、もう一方の群はｉ．ｄ．経路で免疫化した。実施例２の手順に従った生
Ｃ３腫瘍細胞チャレンジ後、無腫瘍のままであったｉ．ｍ．経路で免疫化した群
とはまったく対照的に、ｉ．ｄ．群によって免疫化した群は腫瘍増殖を示した。
このように、免疫化がｉ．ｍ．経路で行われたときにだけ、ｄＥ７ＤＮＡ構築物
によるＤＮＡワクチン接種が腫瘍細胞チャレンジに対する保護免疫性を引き出し
たことが確かめられた。結果を以下の表３に示す。

【００６１】

【表３】

【００６２】 実施例８ 本実施例は、プラスミドｐＣＭＶ３−ＨＰＶＴ＃１の調製を説明する。

【００６３】 ５つのＴ細胞エピトープ型ＨＰＶ−１６Ｅ６およびＥ７タンパク質をコードす
る合成ミニ遺伝子（図５Ａ）を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３Ａ
Ｂ ＤＮＡシンセサイザを用いて、オリゴヌクレオチド合成によって構築した。
５つの合成オリゴヌクレオチド（ＩからＶ、図５Ｂ）を用いて集成された合成ミ
ニ遺伝子は、５’端にＳａｌＩ制限部位、３’端にＥｃｏＲＩ部位を含有した。
この集成遺伝子（図５）を、ＳａｌＩ／ＥｃｏＲＩ制限プラスミドｐＣＭＶ３に
クローンし、図６に示したプラスミドｐＣＭＶ３−ＨＰＶＴ＃１を生成した。ｐ
ＣＭＶ３の構築は実施例３に記載し、エレメントは図２に示す。

【００６４】 実施例９ 本実施例は、保護抗腫瘍免疫性を誘発するためのｐＣＭＶ３−ＨＰＶＴ＃１の
使用を例示する。

【００６５】 Ｃ５７Ｂ１／６マウスを、ＨＰＶ−１６Ｅ６およびＥ７タンパク質の多数のエ
ピトープをコードするＤＮＡ構築物（ｐＣＭＶ３−ＨＰＶＴ＃１、実施例８に記
載のとおりに調製、図６）またはコントロール（ｐＣＭＶ−３ベクター単独、図
２、またはＰＢＳ）のいずれかで、実施例１のプロトコルに従って免疫化した。
実施例２のプロトコルに従ったＤＮＡポリエピトープ構築物での予防的免疫化は
、チャレンジしたマウスの１００％で保護抗腫瘍免疫性を誘発した。対照的に、
コントロール群では無腫瘍のマウスはいなかった。結果を以下の表４に示す。

【００６６】

【表４】

【００６７】 実施例１０ 本実施例は、初回の生腫瘍細胞のチャレンジ後、３ヵ月無腫瘍であったマウス
における、生Ｃ３腫瘍細胞による２回目の再チャレンジの影響を例示する。

【００６８】 実施例７に見られる、実施例４に記載のとおり調製されたｐＣＭＶ−ｄＥ７構
築物（図１）、または実施例９に見られる、実施例８に記載のとおり調製された
ｐＣＭＶ−ポリエピトープ構築物（図６）のいずれかによって誘発された保護抗
腫瘍免疫性が持続性であるかどうかを判定するために、初回の腫瘍細胞のチャレ
ンジで生存し、３ヵ月の間無腫瘍のままであったマウスに、生Ｃ３腫瘍細胞を再
移植した。次にこのマウスを、腫瘍の発生に関してモニターした。

【００６９】 下の表５に示したように、２回目のチャレンジ投与の後、ｐＣＭＶ−ｄＥ７群
の動物１匹が腫瘍を生じた。しかしながら、ＤＮＡ−ポリエピトープ免疫化群の
マウスはいずれも無腫瘍のままであった。このように、腫瘍細胞チャレンジから
の保護は、ポリエピトープ免疫化群において最大レベルであるように見えた。

【００７０】

【表５】

【００７１】 （開示の概要） 本開示を要約すると、本発明は、子宮頚癌に関わるＨＰＶ株のＥ６および／ま
たはＥ７抗原の、少なくとも１つのＴ細胞エピトープをコードする核酸を含有す
るある種の新規のベクター、ならびに、かかるベクターを用いる免疫化法を提供
する。本発明の技術的範囲内において、変更を施すこもの可能である。

【００７２】 参考文献

【００７３】

【表６】

【００７４】

【表７】

【００７５】

【表８】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１Ａは、ＨＰＶ−１６由来の無毒化したＥ７の挿入されたプラスミドｐＣＭ
Ｖ−３からなるプラスミドｐＣＭＶ−ｄＥ７のマップである。 図１Ｂは、ＨＰＶ−１６（ｐＳＥ８５９．２）由来のＰＣＲ増幅されたｄＥ７
のヌクレオチド配列（配列番号：１）を示す。５’ＰＣＲプライマーおよび３’
ＰＣＲプライマー（配列番号：２、３）は、この図中にボックスにて示す。

【図２】 エンハンサ配列およびイントロン配列を含む、非常に初期のサイトメガロウィ
ルスのプロモーター、ウシ・成長ホルモンポリＡ（ＢＧＨ ＰＡ）ならびにカナ
マイシン耐性遺伝子（ＫＮ（Ｒ））を含むプラスミドベクターｐＣＭＶ３のマッ
プである。

【図３】 ｐＣＭＶ２Ｋからの、プラスミドベクターｐＣＭＶ３の組み立てを示す。

【図４】 プラスミドベクターｐＥＮ−１のマップである。

【図５】 図５Ａは、５個のＨＰＶ１６のＴ細胞エピトープ（ＮＨ₂からＣＯＯＨ端に向
かって）Ｅ７：４９〜５７、１１〜２０、８２〜９０、８６〜９３およびＥ６：
２９〜３８からなるタンパク質をコードする合成ＨＰＶミニ遺伝子のヌクレオチ
ド（配列番号：４に全長；配列番号；５にコーディング配列）ならびに由来する
アミノ配列（配列番号：６）を示す。スペーサとして、３個のアラニンが各エピ
トープ間に導入されている。 図５Ｂは、図５Ａのミニ遺伝子を形成するための、Ｅ６およびＥ７由来のＨＰ
Ｖ−１６エピトープを含む合成オリゴヌクレオチドのアセンブリを示す。５個の
各オリゴヌクレオチドは、ＩからＶ（配列番号：７、８、９、１０、１１）で示
す。Ｅ６およびＥ７由来のエピトープは、その特異的な配列の上に表示され、そ
の番号はＨＰＶ−１６の全長Ｅ６およびＥ７タンパク質のアミノ酸配列に対応す
る。

【図６】 図３のｐＣＭＶ３ベクターのＳａｌＩとＥｃｏＲＩ部位の間のポリリンカー中
に、図５Ａに示す合成ミニ遺伝子を挿入することによるｐＣＭＶ３−ＨＰＶＴ＃
１のアセンブリを示す。

【手続補正書】

【提出日】平成１３年３月５日（２００１．３．５）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ヤオ、フェイ−ロング カナダ国 エム２ジェイ ４エイチ８ オ ンタリオ州 ノース ヨーク エルザ バ インウェイ 81 (72)発明者 カオ、シ−シーアン カナダ国 エム９シー ４エックス６ オ ンタリオ州 エトビコーク ザ ウエスト モール 716 アパートメント 408 (72)発明者 クレイン、マイケル、エイチ． カナダ国 エム２ピー １ビー９ オンタ リオ州 ウイロウデール モンロー ブー ルヴァード 16 (72)発明者 タータグリア、ジェームス アメリカ合衆国 12303 ニューヨーク州 スケネクタディ クリスティーナ ドラ イヴ ７ (72)発明者 モウェンジェオン、フィリップ フランス国 エフ−ポミィエ シュマン サン ジァン （番地なし) (72)発明者 ロヴィンスキー、ベンジャミン カナダ国 エル４ジェイ ５エイチ６ オ ンタリオ州 ソーンヒル ウィンディング レイン 70 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA32 CA05 DA02 EA04 FA02 HA01 4C084 AA02 AA13 CA53 NA14 ZB261 4C085 AA02 BA83 CC29 DD62 DD88

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 子宮頸がんに関連するヒトパピローマウィルス（ＨＰＶ）株
   のＥ６および／またはＥ７抗原の少なくとも１つの非毒性Ｔ細胞エピトープをコ
   ードする核酸分子と、かかるベクターが投与された宿主中でその核酸分子の発現
   をさせるため、前記核酸分子に対して作動的に結合されているプロモーターとを
   含んでなるベクター。
2. 【請求項２】 前記プロモーターは、サイトメガロウィルス・プロモーター
   である請求項１に記載のベクター。
3. 【請求項３】 前記核酸分子は、プラスミドＣＭＶ−３中に入れられている
   請求項１に記載のベクター。
4. 【請求項４】 前記核酸分子は、宿主中でのがん遺伝子の複製を防ぐことを
   目的とし、無毒化がなされたＥ７抗原のコード配列である請求項１に記載のベク
   ター。
5. 【請求項５】 ＨＰＶ−１６のアミノ酸２１から２６をコードする核酸を、
   その本来の配列から除去することにより、前記無毒化が施されている請求項４に
   記載のベクター。
6. 【請求項６】 前記ベクターは、ｐＣＭＶ−ｄＥ７と同一の特徴を有する請
   求項５に記載のベクター。
7. 【請求項７】 前記核酸分子は、ＨＰＶ−１６のアミノ酸１１から２０、４
   ９から５７、８２から９０、ならびに８６から９３を含んでなるＥ７抗原エピト
   ープと、アミノ酸２９から３８を含むＥ６抗原エピトープとコードしている請求
   項１に記載のベクター。
8. 【請求項８】 前記核酸分子は、配列番号４または５の配列を有する請求項
   ７に記載のベクター。
9. 【請求項９】 前記核酸分子は、配列番号６の配列を有するアミノ酸配列を
   コードしている請求項７に記載のベクター。
10. 【請求項１０】 前記ベクターは、ｐＣＭＶ３−ＨＰＶＴ＃１と同一の特徴
    を有する請求項７に記載のベクター。
11. 【請求項１１】 請求項１に記載のベクターを含んでなる、宿主に対してｉ
    ｎ ｖｉｖｏ投与用の免疫原性組成物。
12. 【請求項１２】 ヒト・ピペローマウィルスにより引き起こされる子宮頸が
    んに対して、宿主を免疫する方法であって、宿主に対する、有効量の請求項１１
    に記載の免疫原性組成物の投与を含んでなる方法。
13. 【請求項１３】 ヒト・ピペローマウィルスにより引き起こされる子宮頸が
    んを患う宿主の治療方法であって、宿主に対する、有効量の請求項１１に記載の
    免疫原性組成物の投与を含んでなる方法。