DE10055545A1

DE10055545A1 - Für Expression in Eukaryonten optimierte HPV 16-L1 und HPV 16-L2 kodierende DNA Sequenzen

Info

Publication number: DE10055545A1
Application number: DE10055545A
Authority: DE
Inventors: Martin Mueller; Christoph Leder; Juergen Kleinschmidt; Uwe Sonnewald; Sophia Biemelt
Original assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ; Institut fuer Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung
Current assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ; Institut fuer Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung
Priority date: 2000-11-09
Filing date: 2000-11-09
Publication date: 2002-07-25
Also published as: WO2002038769A3; WO2002038769A2; AU2002213806A1

Abstract

Beschrieben werden hinsichtlich der Codon-Verwendung optimierte DNA-Sequenzen, die ein HPV 16-Kapsidprotein L1 bzw. HPV 16-Kapsidprotein L2 kodieren. Diese DNA-Sequenzen umfassen die in den Figuren 5, 6 oder 7 gezeigten DNA-Sequenzen oder Fragmente oder Varianten dieser DNA-Sequenzen und erlauben die einfache rekombinante Herstellung von HPV 16-L1- bzw. L2-Kapsidproteinen oder Fragmenten davon mit hoher Ausbeute unter Vermeidung der Verwendung viraler Vektoren, vorzugsweise zur Herstellung von Vakzinen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft hinsichtlich der Codon- Verwendung optimierte DNA-Sequenzen, die für ein HPV16- Kapsidprotein L1 bzw. HPV16-Kapsidprotein L2 kodieren. Diese DNA-Sequenzen umfassen die in den Fig. 5, 6 oder 7 gezeigten DNA-Sequenzen oder Fragmente oder Varianten dieser DNA-Sequenzen. Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen erlauben die einfache rekombinante Herstellung von HPV16-L1- bzw. L2- Kapsidproteinen oder Fragmenten davon mit hoher Ausbeute unter Vermeidung der Verwendung viraler Vektoren, vorzugsweise zur Herstellung von Vakzinen.

Ein Teil der humanen Papilloma-Virus(HPV)-Typen ist für den Menschen relativ harmlos (z. B. HPV 1), während andere Typen humaner Papillomaviren eng mit der Entwicklung maligner Tumoren assoziiert sind. Besonders gut charakterisiert ist deren Beteiligung an der Entstehung des Zervixkarzinoms und verschiedene Befunde weisen darauf hin, daß HPVs eine kausale Ätiologie dieses Tumors spielen. Auf der molekularen Ebene sind in etwa 95% der Zervixkarzinom-Biopsien Sequenzen onkogener HPV-Typen (HPV16 in etwa 50-60% und HPV18 in etwa 10-20% der Fälle) nachweisbar. Die rekombinante Gewinnung von HPV-Kapsidproteinen, z. B. HPV16-L1 oder HPV16-L2, ist daher für die Herstellung von entsprechenden Vakzinen im kommerziellen Maßstab von großer Bedeutung. Allerdings ist es seit längerer Zeit bekannt, daß die Expression von HPV- Kapsidproteinen in höheren eukaryontischen Zellen, z. B. Säugetierzellen, ohne Verwendung bestimmter viraler Vektoren, wie Vakzinia Virus, Semliki Forest Virus (SFV), Adenovirus etc. praktisch nicht möglich ist. Es ist davon auszugehen, daß ein Grund dafür darin liegen dürfte, daß Papillomaviren Strategien entwickelt haben, die vorzeitige Expression der sehr immunogenen Kapsidproteine im Wirt zu vermeiden. Es wurden zwar bisher verschiedene Mechanismen, die dieser geringen Expression zugrunde liegen könnten diskutiert, z. B. sogenannte negativ-regulatorische Elemente auf der mRNA, allerdings konnte bisher keine der Hypothesen experimentell bestätigt werden. Auch durch Einsatz von mRNA-Export-Elementen war bisher nur eine geringe Expression von z. B. HPV16-L1 möglich. Durch die deshalb bedingte Notwendigkeit der Verwendung viraler Expressionssysteme wurde die bisherige Verwendungsmöglichkeit der vorstehenden HPV-Kapsidproteine für die Vakzine-Herstellung stark eingeschränkt.

Somit liegt der vorliegenden Erfindung das technische Problem zugrunde, DNA-Sequenzen bereitzustellen, die eine einfache und hocheffiziente rekombinante Herstellung der HPV16- Kapsidproteine L1 und L2 erlauben.

Die Lösung dieses technischen Problems wird durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen erzielt.

Es zeigte sich, daß durch einen Austausch bestimmter Codons in der HPV16-L1 bzw. HPV16-L2 kodierenden DNA-Sequenz unter Beibehaltung der ursprünglichen Aminosäuresequenz die Expression in höheren eukaryontischen Zellen sehr stark verbessert werden kann, wobei auch nicht länger der Einsatz von viralen Vektoren erforderlich ist. In den zu der vorliegenden Erfindung führenden Experimenten wurden die HPV 16-L1 und -L2 kodierenden DNA-Sequenzen vollständig neusynthetisiert, wobei dazu überlappende 85mer Primer verwendet und die entsprechenden DNA-Sequenzen (ohne Matrize) über PCR hergestellt wurden. Es wurden für L1 kodierende neue DNA-Sequenzen hergestellt, die für die Expression in Pflanzen und Säugerzellen optimiert worden waren und eine für L2 kodierende neue DNA-Sequenz, die ebenfalls für die Expression in Säugerzellen optimiert worden war. Dabei wurden mehr als 60% aller Codons verändert. Die Expression erfolgte in dem Vektor pUF3 unter Kontrolle des humanen Cytomegalovirus "immediate early promotors" (pCMV), wobei es sich zeigte, daß alle Konstrukte eine wesentlich bessere Expression zeigten im Vergleich zu den Ausgangs-DNA-Sequenzen, wobei eine Erhöhung der Expressionsrate bis zu einem Faktor von 10000 gefunden wurde. Desweiteren wurde gefunden, daß eine derart hohe Expression auch erzielt wird, wenn das HPV16-L1 oder -L2 in Fusionsproteinen, z. B. mit E7 von HPV16 oder Teilen davon, vorliegt, wobei die DNA-Sequenzen der mit HPV16-L1 oder -L2 fusionierten Polypeptide in Wildtyp-Form vorliegen können.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit eine DNA- Sequenz, die für ein HPV16-Kapsidprotein L1 kodiert und die in Fig. 5 oder 6 gezeigte DNA-Sequenz umfaßt, oder für ein HPV16-Kapsidprotein L2 kodiert und die in Fig. 7 gezeigte DNA-Sequenz umfaßt.

Die vorliegende Erfindung umfaßt auch eine DNA-Sequenz, die für ein Protein mit den biologischen Eigenschaften eines HPV-16-Kapsidproteins L1 oder eines HPV16-Kapsidproteins L2 kodiert und die ein Fragment oder eine Variante der in Fig. 5, 6 oder 7 gezeigten DNA-Sequenz ist.

Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff "Fragment" umfaßt DNA-Sequenzen, die sich gegenüber den in den Fig. 5, 6 und 7 angegebenen DNA-Sequenzen dadurch unterscheiden, daß sie nur einen Teil davon oder Teile davon umfassen, die jedoch noch Polypeptide mit einer biologischen Aktivität des von der Gesamtsequenz kodierten Proteins kodieren, wobei sich in diesem Zusammenhang der Begriff "biologische Aktivität" vorzugsweise auf die Wirksamkeit als Vakzine bezieht. Der Fachmann kann mittels üblicher Verfahren solche Fragmente herstellen bzw. auswählen, die noch über diese Eigenschaft verfügen.

Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff "Variante" umfaßt DNA-Sequenzen, die sich gegenüber den in den Fig. 5, 6 und 7 angegebenen DNA-Sequenzen dadurch unterscheiden, daß sie nicht alle der in den Figuren angegebenen veränderten Codons, d. h. weniger im Vergleich zu den Ausgangs-DNA-Sequenzen veränderte Codons, also noch mehr WT-Codons enthalten. Dabei beträgt die Rate der gegenüber den ursprünglichen DNA-Sequenzen veränderten Codons mindestens 10-40%, vorzugsweise mindestens 50% und am meisten bevorzugt mindestens 55%. Diese Codonveränderungen führen nicht dazu, daß die Wirkung der davon translatierten Polypeptide als Vakzine wesentlich beeinträchtigt wird, vorzugsweise führen sie nicht zu einer Veränderung der Aminosäuresequenz.

Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen können auch mit weiteren DNA-Sequenzen fusioniert sein, die die Synthese von Fusionsproteinen bewirken, wobei diese Fusionsproteine neben HPV16-L1 oder -L2 oder Teilen davon vorzugsweise ein weiteres HPV16-Protein oder ein Teil davon, z. B. ein Kapsidprotein oder ein Strukturprotein, wie E7, umfassen, was u. U. zu einer verbesserten Vakzine führen kann. Günstig kann es sein, wenn das HPV16-L1 oder -L2 kein Kernwanderungssignal (NLS) aufweist, daß ein solches dann z. B. in Form jenes von SV40, im Fusionsprotein vorliegt. Bevorzugte Fusionsproteine sind HPV16-L1-human delta C E7 1-60, HPV16-L1 human delta C NLS-E7 (short) und HPV16-L1 human delta C NLS-E7 (long). Es wird auf die Fig. 8-10 verwiesen.

Verfahren zur Erzeugung der vorstehenden Änderungen in der DNA-Sequenz sind dem Fachmann bekannt und in Standardwerken der Molekularbiologie beschrieben, beispielsweise in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1989)). Der Fachmann ist auch in der Lage, zu bestimmen, ob ein von einer so veränderten DNA-Sequenz kodiertes Protein noch über die biologischen Eigenschaften des Ausgangsproteins verfügt.

Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen können auch in einen Vektor bzw. Expressionsvektor inseriert werden. Somit umfaßt die vorliegende Erfindung auch diese DNA-Sequenzen enthaltende Vektoren bzw. Expressionsvektoren. Die Bezeichnung "Vektor" bezieht sich auf ein Plasmid (pBR322, pBlueScript, pGEMEX, pUC-Derivate, pGEX-2T, pET3b und pQE-8, etc.) oder ein anderes geeignetes Vehikel.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen im Vektor mit regulatorischen Elementen funktionell verknüpft, die dessen Expression, vorzugsweise in höheren eukaryontischen Wirtszellen erlauben. Solche Vektoren enthalten neben den regulatorischen Elementen, beispielsweise einem Promotor, typischerweise einen Replikationsursprung und spezifische Gene, die die phänotypische Selektion einer transformierten Wirtszelle erlauben. Zu den regulatorischen Elementen für die Expression in Prokaryonten, beispielsweise E.coli, zählen der lac-, trp- Promotor oder T7-Promotor, und für die Expression in Eukaryonten der AOX1- oder GAL1-Promotor in Hefe und der CMV-, SV40-, RVS-40, MMTV- oder Metallothionein I-Promoter für die Expression in tierischen Zellen, insbesondere Tieren. Als Vektoren für letztere Expression eignen sich z. B. pMSXND, pKCR, pEFBOS, cDM8, pCEV4, insbesondere pUF3. Bevorzugt liegen die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen in einem Expressionsvektor, z. B. pUF3 (Zolotukhin et al., J. Virol. Vol. 70, (1906), 4646-4654) unter der Kontrolle des humanen Cytomegalovirus "immediate early" Promoters (pCMV) vor. Ferner können die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen auch in einen AAV- Vektor, z. B. der Serotypen AAV1-6, wobei AAV2 bevorzugt ist, inseriert sein, wodurch z. B. eine Vakzinierung über die Mund/Rachen-Schleimhäute ermöglicht ist, was u. U. zur Induktion von anti-HPV16-L1 bzw. -L2 IgA Antikörper führt. Desweiteren können auch andere Viren oder abgeschwächte bzw. inaktivierte Bakterien als Vektor für die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen verwendet werden. Solche sind z. B. Vakzinia Viren, Herpes Simplex Viren oder Adenoviren bzw. Salmonellen oder Listerien. Darüberhinaus zählen zu den erfindungsgemäßen Expressionsvektoren auch von Baculovirus abgeleitete Vektoren für die Expression in Insektenzellen, beispielsweise pAcSGHisNT-A.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen in pflanzlichen Zellen, Vektoren, wie pUC-Derivate, verwendet werden, die für pflanzliche Zellen geeignete regulatorische Elemente enthalten. Solche Elemente umfassen z. B. Promotoren, wie den Couliflower Mosaic Virus 35S Promotor, den Agrobacterium tumefaciens Nopalin Synthase Promotor und den Mannopin Synthase Promotor. Sollten aus den transfizierten pflanzlichen Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, ist es günstig, wenn ferner ein selektierbarer Marker, wie das Neomycinphosphotransferase II-Gen aus E.coli, das Sulfonamid- Resistenzgen oder das Hygromydin-Resistenzgen vorliegt.

Allgemeine, auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren können zur Konstruktion von Expressionsvektoren, die die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen und geeignete Kontrollsequenzen enthalten, verwendet werden. Zu diesen Verfahren zählen beispielsweise in vitro- Rekombinationstechniken, synthetische Verfahren, sowie in vivo-Rekombinationsverfahren, wie sie beispielsweise in Sambrook et al., supra, beschrieben sind.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch die vorstehend beschriebenen DNA-Sequenzen oder Vektoren enthaltende Wirtszellen. Zu diesen Wirtszellen zählen vorzugsweise pflanzliche Zellen, insbesondere Zellen von Weizen, Gerste, Reis, Mais, Zuckerrübe, Zuckerrohr, Brassicaceen, Leguminosen, Tabak, Kartoffel, Pilze, Moose und Algen, sowie tierische Zellen, insbesondere Säugerzellen. Bevorzugte Säugerzellen sind CHO-, VERO-, BHK-, HeLa-, COS-, MDCK, 293T-, 911- und WI38-Zellen. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung auch die aus den Wirtszellen generierbaren Wirte, insbesondere Pflanzen. Verfahren zur Transformation vorstehender Wirtszellen, zur phänotypischen Selektion von Transformanten und zur Expression der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vektoren sind auf dem Fachgebiet bekannt.

Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Herstellung eines HPV16-Kapsidproteins L1 oder eines HPV 16-Kapsidproteins L2, das die Kultivierung der vorstehend beschriebenen Wirtszellen unter Bedingungen umfaßt, die die Expression des Proteins (bzw. Fusionsproteins) erlauben (vorzugsweise stabile Expression), und die Gewinnung des Proteins aus der Kultur oder aus den Wirtszellen. Dem Fachmann sind Bedingungen bekannt, transformierte bzw. transfizierte Wirtszellen zu kultivieren. Geeignete Reinigungsverfahren (beispielsweise präparative Chromatographie, Affinitätschromatographie, beispielsweise Immunoaffinitätschromatographie, HPLC etc.) sind ebenfalls allgemein bekannt.

Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen in exprimierbarer Form, z. B. in rekombinanten AAVs, sowie mit den erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen rekombinant hergestellten HPV16-Kapsidproteine erlauben die einfache und kostengünstige Herstellung eines Vakzinierungsmittels gegen HPV16-Infektionen, das gegebenenfalls zusätzlich einen pharmazeutisch verträglichen Träger enthält. Geeignete Träger und die Formulierung derartiger Arzneimittel sind dem Fachmann bekannt. Zu geeigneten Trägern zählen beispielsweise Phosphat-gepufferte Kochsalzlösungen, Wasser, Emulsionen, beispielsweise Öl/Wasser-Emulsionen, Netzmittel, sterile Lösungen etc. Die Verabreichung des Vakzinierungsmittels kann oral oder parenteral erfolgen. Zu den Verfahren für die parenterale Verabreichung gehören die topische, intra-arterielle, intramuskuläre, subkutane, intramedulläre, intrathekale, intraventrikuläre, intravenöse, intraperitoneale oder intranasale Verabreichung. Die geeignete Dosierung wird von dem behandelnden Arzt bestimmt und hängt von verschiedenen Faktoren ab, beispielsweise von dem Alter und dem Gewicht des Patienten, der Art der Verabreichung etc.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1 Vergleich der Expression von HPV16 L1 - original (L1ori), optimiert für Pflanzenexpression (pL1) und Expression in humanen Zellen (hL1) nach transienter Transfektion der entsprechenden Expressionsplasmide in humane Zellen
Extrakte der transfizierten Zellen (293T Zellen) wurden in SDS-PAGE aufgetrennt, geblottet und mit einem monoklonalen anti-L1 Antikörper nachgewiesen. Entsprechend den Angaben über der Figur wurden von Extrakt hL1 im Vergleich zu dem Extrakt von pL1 und L1ori nur 1/10 bzw. 1/100 der Menge aufgetragen. Kontrolle: mock transfizierte Zellen. L1ori: Original-Sequenz von HPV16-L1.

Fig. 2 Direkte und indirekte Effekte der modifizierten Leserahmen
Um der Frage nachzugehen, ob die Codons oder regulatorische Elemente die Expression von L1 beeinflussen, wurden bi cistronische Vektoren analysiert. (siehe bezüglich des schematischen Aufbaus der Vektoren den unteren Teil der Figur.) Hinter den jeweiligen L1-Genen befindet sich das eGFP- Gen, dessen Translation unabhängig von der L1-Translation von einer "internal ribosome binding site" (IRES) erfolgen kann. Ergebnis: Die eGFP-Expression wird vom jeweiligen vorgeschalteten L1-Gen beeinflußt. Kontrolle: mock transfizierte Zellen. L1ori: Original-Sequenz von HPV16-L1.

Fig. 3 HPV16-L2-Expression durch Modifikation des Leserahmens
Die "Humanisierung" der Codons von L2 ermöglicht die Expression in Säugetierzellen (293T) nach transienter Transfektion. Die Figur. zeigt die Ergebnisse eines Western- Blot mit Verwendung eines polyklonalen anti-L2-Antiserums. Kontrolle: mock transfizierte Zellen Fig. 4 Partikelbildung nach Expression von HPV16-L1 in 911-Zellen
Die Figur zeigt die Bildung von Virus-artigen Partikeln (VLPs) nach transienter Expression von hL1 in humanen Zellen (911- Zellen). Die Zellen wurden 2 Tage nach der DNA-Transfektion fixiert, geschnitten und gefärbt. Die Abbildung zeigt eine elektronenmikroskopische Aufnahme der VPLs im Zellkern einer transfizierten Zelle. A: Übersicht; B: stärker vergrößerter Bereich

Fig. 5 DNA-Sequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz von pL1

Fig. 6 DNA-Sequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz von hL1

Fig. 7 DNA-Sequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz von hL2

Fig. 8 DNA-Sequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz von HPV-16-L1 human delta C E7 1-60 (AS 1-474 von HPV16-L1 und AS 1-60 von HPY16-E7)

Fig. 9 DNA-Sequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz von HPV-16-L1 human delta C NLS-E7 (short) (AS 1-474 von HPV16-L1, AS 1 und 2 von HPV16-E7, 7 AS von SV40 NLS und AS 11-60 von HPY16-E7)

Fig. 10 DNA-Sequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz von HPV16-L1 human delta C NLS-E7 (long) (AS 1-474 von HPV16- L1, AS 1 und 2 von HPY16-E7, 7 AS von SV40 NLS und AS 1-60 von HPV16-E7)

Fig. 11 Immunisierung von Tieren mittels erfindungsgemäßer DNA- Sequenzen.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Herstellung der optimierten HPV16-L1- und L2-DNA-Sequenzen

Zur Herstellung der optimierten Sequenzen wurde ein PCR Verfahren nach Kim et al., Gene 199, (1997), 293-301 verwendet. Hierzu wurden 85mer Oligonukleotide (jeweils 25 Primer für pL1 und hL1, 24 Primer für hL2) synthetisiert, die das HPV16-L1- bzw. -L2-Gen umfassen. Die Oligonukleotide überlappen in 20-23 Basenpaaren und sind alternierend vom kodierenden bzw. nicht kodierenden DNA Strang abgeleitet (z. B. 1: kodierend, 2: nicht kodierend, 3: kodierend, 4: nicht kodierend). Das hat zur Folge, daß die 5'-3' Richtung geradzahliger Oligonukleotide entgegen der 5'-3' Richtung ungeradzahliger Oligonukleotide verläuft. Für die PCR Synthese wurden zunächst jeweils Gruppen aus 4 Oligonukleotiden verwendet (1, 2, 3, 4 und 3, 4, 5, 6 und 5, 6, 7, 8 etc). Das molare Verhältnis der innenliegenden Oligonukleotide (z. B. 2 und 3) zu den aussenliegenden Oligonukleotiden (z. B. 1 und 4) wurden auf 1 : 100 eingestellt. Durch anschließende PCR wurden doppelsträngige DNA Produkte erhalten, die die Bereiche der eingesetzten Primer enthielten (z. B. Produkt a: 1-4, Produkt b: 3-6 etc.). In einem zweiten Amplifikationszyklus wurden dann durch Verwendung der Produkte aus Runde 1 längere doppelsträngige DNA Bereiche hergestellt. Dazu wurden beispielsweise Primer 1 und 6 mit den Produkten a und b der ersten Runde eingesetzt. Auf diese Weise wurden größere Bereiche der optimierten Gene hergestellt. Beim Design der rekombinanten Gene wurden die Erkennungssequenzen bestimmter Restriktionsendonukleasen eingeführt, ohne allerdings die Sequenz der kodierten HPV16-L1- bzw. -L2-Gene zu verändern. Diese Schnittstellen wurden bei der Synthese verwendet, um PCR Zwischenprodukte zu klonieren und deren Korrektheit mittels pNA Sequenzierung zu prüfen. Nach Zusammensetzen der Gene aus diesen Fragmenten wurde die Sequenz nochmals durch DNA- Sequenzierung überprüft (Tabelle 1: Codonstatistik für HPV16-L1 and -L2).

Beispiel 2 Herstellung der Expressionsvektoren zur Expression von HPV16-pL1, HPV16-hL1 und HPV 16-hL2 in Säugerzellen

Die in Beispiel 1 synthetisierten DNA-Sequenzen wurden in den Vektor pUF3 (Zolotukhin et al., supra) unter der Kontrolle des Cytomegalovirus "immediate early" Promotors (pCMV) inseriert. Hierzu wurden die Gene pL1, hL1 und hL2 zunächst über XbaI und HindIII (auf jeweils dem ersten bzw. letzten Primer) in pBluescript KS kloniert (pBKSpL1, pBKShL1, pBKShL2). Die erhaltenen Klone wurden bei der DMSZ (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen als E.coli #713; 16L1 plant Blspt (pL1) unter DSM 13745, als E.coli #835; 16L1 human Blspt (hL1) unter DSM 13746 bzw. als E.coli #886; 16L2 human Blspt (hL2) unter DSM 13747 am 28. Sept. 2000 hinterlegt. Desweiteren wurden die Gene pL1, hL1 und hL2 mit Xba1 und Hindill aus den Vektoren ausgeschnitten und in pBKCMV über XbaI, HindIII kloniert. Aus den erhaltenen Vektoren wurden die Gene wiederum über NotI, SalI ausgeschnitten und in NotI, SalI gespaltenen pUF3 kloniert. Es wurden die Expressionsvektoren pUF3-pL1, pUF3-hL1 und pUF3-hL2 erhalten.

Beispiel 3 Ergebnisse der Expression der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen in humanen Zellen

a) Humane 293 T Zellen wurden einer transienten Tranfektion mit den in Beispiel 2 hergestellten Expressionsvektoren pUF3-pL1, pUF3-hL1 und pUF3-hL2 unterzogen. Nach drei Tagen wurden aus den Zellen Extrakte gewonnen, einer SDS-PAGE unterzogen und in einem Westernblot mittels eines käuflichen monoklonalen anti-L1-Antikörpers nachgewiesen.
Es zeigte sich, daß durch die erfindungsgemäßen DNA- Sequenzen eine stark erhöhte Expression von HPV16-L1 erreicht wird (Fig. 1).
b) Humane 293 T Zellen wurden einer transienten Tranfektion mit einem bi-cistronischen Expressionsvektor unterzogen, der neben dem HPV16-L1- Gen auch ein dahinter liegendes eGFP-Gen enthält, dessen Translation von einer "internal ribosome binding site (IRES) erfolgt. Nach einem Tag wurde von einem Teil der Zellen eine FACS-Analyse durchgeführt. Von den restlichen Zellen wurden Extrakte gewonnen, einer SDS- PAGE unterzogen und in einem Westernblot mittels eines käuflichen monoklonalen anti-L1-Antikörpers nachgewiesen.
Es zeigte sich, daß durch die erfindungsgemäßen DNA- Sequenzen eine stark erhöhte Expression von HPV16-L1 erreicht wird, die genutzt werden kann, um eine weitere in cis vorliegende DNA-Sequenz ebenfalls hoch zu exprimieren (Fig. 2).
c) Humane 293 T Zellen wurden einer transienten Transfektion mit dem erfindungsgemäßen Expressionsvektor pUF3-hL2 unterzogen. Nach drei Tagen wurden aus den Zellen Extrakte gewonnen, einer SDS-PAGE unterzogen und in einem Westernblot mittels eines polyklonalen anti-L2-Serums nachgewiesen.
Es zeigte sich, daß durch die erfindungsgemäßen DNA- Sequenzen eine stark erhöhte Expression von HPV16-L2 erreicht wird (Fig. 3).

Beispiel 4 Nach-transienter Expression von hL1 in 911- Zellen werden Virus-artige Partikel (VLPs) gebildet

911-Zellen wurden transient mit pUF3-hL1 DNA transfiziert. Drei Tage nach der Transfektion wurden die Zellen fixiert und Ultradünnschnitte angefertigt, die einer elektronenmikroskopischen Analyse unterzogen wurden.

Es zeigte sich, daß sich aus den erfindungsgemäßen DNA- Sequenzen HPV16-L1-Kapside bilden.

Beispiel 5 Immunisierung von Tieren mittels erfindungsgemäßer DNA-Sequenzen

Um zu testen, ob eine erfindungsgemäße HPV16-L1-DNA-Sequenz eine humorale Immunantwort auslösen kann, wurden Mäuse mit pUF3-hL1 immunisiert. Die Mäuse wurden zweimal, im Abstand von vier Wochen mit je 100 Mikrogramm pUF3-hL1 intra-muskulär immunisiert. Vier Wochen nach der zweiten Immunisierung wurde Serum entnommen. Um Anti-HPV16-L1 spezifische Antikörper im Serum der Mäuse nachzuweisen, wurden ELISA-Platten mit gereinigtem HPV16-L1-Virus-artigen Partikeln (2,5 Mikrogramm/Vertiefung) beschichtet. Die Seren wurde in unterschiedlichen Verdünnungen (1 : 10-1 : 12800) getestet. Als Negativkontrolle dienten ELISA-Platten, die nur mit PBS beschichtet waren. An die Platten gebundene HPV16-L1 spezifische Antikörper wurden durch einen Sekundär-Antikörper (Ziege-Anti-Maus-Peroxidase) und entsprechender Peroxidase vermittelter Farbreaktion nachgewiesen.

Es zeigte sich, daß Mäuse, die mit erfindungsgemäßem pUF3-hL1 immunisiert wurden, große Mengen von HPV16-L1 spezifischen Antikörpern produzieren. Im Gegensatz dazu ist die Menge der HPV16-L1 spezifischen Antikörper sehr gering, wenn Original- Sequenzen von HPV16-L1 verwendet werden.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. DNA-Sequenz, die für ein HPV16-L1 mit der in Fig. 5 oder 6 gezeigten DNA-Sequenz oder für ein HPV16-L2 mit der in Fig. 7 gezeigten DNA-Sequenz kodiert.

2. DNA-Sequenz, die für ein Protein mit den biologischen Eigenschaften eines HPV16-L1 oder eines HPV16-L2 kodiert und die ein Fragment oder eine Variante der in Fig. 5, 6 oder 7 gezeigten DNA-Sequenz ist.

3. DNA-Sequenz, die für ein Fusionsprotein aus einem HPV16-L1 und einem HPV16-E7 kodiert und die in Fig. 8, 9 oder 10 gezeigte DNA-Sequenz aufweist.

4. Expressionsvektor, enthaltend die DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1-3.

5. Expressionsvektor nach Anspruch 4, wobei die DNA- Sequenz mit einem pCMV-Promotor funktionell verknüpft ist.

6. Expressionsvektor nach Anspruch 4, nämlich pL1 (DSM 13745), hL1 (DSM 13746) bzw. hL2 (DMS 13747).

7. Wirtszelle, transfiziert mit einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1-3 oder einem Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 4 bis 6.

8. Wirtszelle nach Anspruch 7, wobei die Wirtszelle eine tierische Zelle ist.

9. Wirtszelle nach Anspruch 7, wobei die Wirtszelle eine pflanzliche Zelle ist.

10. Vakzinierungsmittel, enthaltend den Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 4-6 oder ein durch diesen kodiertes Protein.

11. Verfahren zur Herstellung eines HPV16-L1 oder eines HPV 16-L2, das die Züchtung der Wirtszelle nach einem der Ansprüche 7-9 unter geeigneten Bedingungen und die Gewinnung des Proteins aus der Zelle oder dem Zuchtmedium umfaßt.