JP2002518461A - 口蹄疫のための合成ペプチドワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は口蹄症ウィルス（ＦＭＤＶ）感染症の予防及び口蹄症（ＦＭＤ）の根絶のための免疫原としてのペプチド組成物の利用に関連し、ここでその中に含まれている各ペプチドは口蹄症ウィルス（ＦＭＤＶ）のＶＰ１カスピドタンパク質に由来する標的抗原部位を含んで成る。当該抗原部位はヘルパーＴ細胞エピトープ及び好ましくはその他の免疫刺激配列に、好ましくは直接合成を介する慣用のペプチド結合により共有結合されている。より詳しくは、本発明はブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ及び感受性な野生種を含む動物における、ＦＭＤＶの様々な株又は血清型をｉｎ ｖｉｔｒｏで効率的に中和することのできる高力価ポリクローナル抗体の産生を誘導するための免疫原としてのかかるペプチド組成物の利用、並びに血清型に関係なくＦＭＤＶ感染症の発症を予防及び／又は抑制し、その結果ＦＭＤを根絶するワクチンとしてのかかる組成物の利用に関する。本発明は更にかかる組成物において利用されるペプチド、並びに１又は複数種のこれらのペプチド又はそのセグメントを含むイムノアッセイ及び／又は診断キットに関連する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の分野 本発明は口蹄疫ウィルス（ＦＭＤＶ）感染症の予防及び口蹄疫（ＦＭＤ）の根
絶のための免疫原としてのペプチド組成物の利用に関連し、ここでその中に含ま
れている各ペプチドは口蹄疫ウィルス（ＦＭＤＶ）のＶＰ１カスピドタンパク質
に由来する標的抗原部位を含んで成り、当該抗原部位はヘルパーＴ細胞エピトー
プ及び好ましくはその他の免疫刺激配列に、好ましくは直接合成を介する慣用の
ペプチド結合により共有結合されている。

【０００２】 より詳しくは、本発明はブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ及び感受性な野生種を含む
動物における、ＦＭＤＶの様々な株又は血清型をｉｎ ｖｉｔｒｏで効率的に中
和することのできる高力価ポリクローナル抗体の産生を誘導するための免疫原と
してのかかるペプチド組成物の利用、並びに血清型に関係なくＦＭＤＶ感染症の
発症を予防及び／又は抑制するワクチンとしてのかかる組成物の利用に関する。

【０００３】 本発明は更にかかる組成物において利用されるペプチド、並びに１又は複数種
のこれらのペプチド又はそのセグメントを含むイムノアッセイ及び／又は診断キ
ットに関連する。

【０００４】 発明の背景 口蹄疫（ＦＭＤ）は家畜の最も経済的に大きな病気である。偶蹄類（Ａｒｔｉ
ｏｄａｃｔｙｌａ）目の偶蹄動物、例えばウシ、ブタ、ヒツジ及びヤギが感受性
である。その原因である口蹄疫ウィルス（ＦＭＤＶ）はピコルナビリデ（Ｐｉｃ
ｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）科のアプソウィルス（ａｐｈｔｈｏｖｉｒｕｓ）であ
り、４つのカスピドタンパク質（ＶＰ１〜ＶＰ４）及び非構造ポリペプチドをコ
ードするポジティブセンスＲＮＡゲノムを有する。カスピド及び非構造タンパク
質のコード領域であるＦＭＤＶゲノム並びにタンパク質が切断されるプロセシン
グ経路を図１に模式する（Tesar ら、Virus Genes, 1989 ; 3 : 29-44 から）。

【０００５】 ＦＭＤは感染及び曝露動物の隔離及び始末、並びに化学的に不活化されたウィ
ルス組成物による種痘により抑制されている。このようなワクチンの調剤の著し
い困難性はＦＭＤＶの著しい抗原的多様性にある。７通りの異なる血清型が発表
されている：Ａ，Ｏ，Ｃ、アジア、並びに南アフリカ型ＳＡＴ−１，２及び３。
各々は多数のサブタイプへと副分類できうる、血清型Ａ，Ｏ及びアジアのウィル
スが最も一般的である。血清型Ａウィルスが最も多彩であり、３０超のサブタイ
プがある。

【０００６】 血清型間での交差防御はなく、従って一の血清型ウィルスによる感染から回復
した又はそれに対して種痘された動物は残り６種の血清型由来のウィルスによる
感染に対して未だ感受性である。更に、血清型内での抗原変動の程度は、一のサ
ブタイプに対して有効なワクチンが同じ血清型内の別のサブタイプに対して防御
性でないことがあるほどである。従って、現行のワクチンは局所循環におけるウ
ィルス株のモニターによる決定に従う、関連の血清型又はサブタイプ各々の対照
株を含んで成る不活化ウィルスの混合物に基づく。出現変異体を含む圃場単離体
とワクチン調製のために利用されるウィルスとの間での抗原関係に対する定期的
な監視が疫病の発生の予防のために必要とされる。

【０００７】 従って、現行のワクチンの製造は複数種のウィルス株を増殖させて不活化しな
くてはならず、各々の効能は保障されず、そしてその製品は新たな変異体の出現
による防御効能の損失を防ぐために現行の圃場株により定期的に再処方しなくて
はならない。抗原の変異に直面した免疫原性効能の維持のための多数のウィルス
株の調製工程は、効能及び製造の際の収率における株間変差というめんどうな問
題をもたらす。

【０００８】 不活化ウィルスワクチンの定期的な改訂のニーズはワクチンの製造に新たな障
害をもたらす。ワクチンを新たに進化した圃場株による疫病発生の問題に合わせ
て改訂する場合、疫病発生株は人工的に組織培養での効率的な増殖に適合化され
なければならない。組織培養への適用のための選択工程は防御免疫力の低下をも
たらすことがあり、生産の更なる遅れに結びつく（Barteling and Vreeswijk, V
accine, 1991 ; 9 : 75-88 Brown, Vaccine, 1992 ; 10 : 1022-1026）。

【０００９】 不活化ＦＭＤＶワクチンのその他の著しい欠点は生物保障及び安定性の問題に
結びつく。ウィルスはすぐまわりの汚染を防ぐために高度に封じ込められた設備
の中で生産されなくてはならない。この潜在的なハザードは適任なワクチン供給
者をわずかな数に制約し、ワクチンの有用な供給者を制限し、そして今までＦＭ
ＤＶのなかった領域での発症に対して対処する作業の障害となる。不活化ウィル
ス製品の無毒性は絶対的に保障されるわけでない。ヨーロッパのいくつかの最近
の疫病例は不完全に不活化されたウィルスへとたどりつく。このハザードは病気
のない領域でのワクチンの利用を断念させ、過去に発症のない領域は免疫防御の
ないままとなる。

【００１０】 製品の不安定さ及びロット間差は不活化ウィルスワクチンの複雑で不定な組成
物を根幹とする。このような複雑な混合物は免疫能を保障するために規則的な間
隔で調査されなくてはならない。ある国ではこれは毎年３回ほどの頻度となりう
る。不安定な製品の効能を維持するには低温室が必要とされ、そして往々にして
これは一部の国では確保するのが困難である。

【００１１】 有害な作用の潜在性が複雑な組成物の更なる結果である。アナフィラキシーシ
ョックはあまり多くはない問題であるが、にもかかわらずそれは問題となるのに
十分な頻度で起きる。このような欠点はBrow, Chapter 11, Molecular Aspects
of Picornavirus Infection and Detection, Semler and EhrenFeld 編、Americ
an Society for Microbiology : Washington, DC, 1989, pp 179-191に記載され
ている。現行のＦＭＤＶワクチンの複雑な組成物に由来する更なる欠点は種痘を
施した動物を感染した動物から血清学試験で区別することが困難である点にある
（Lubroth ら、Vaccine, 1996 ; 14 : 419-427）。部位特異的免疫原に基づくワ
クチンはワクチン誘導抗体を感染により誘導された抗体から区別するための免疫
診断キットの設計を促進し、それ故ワクチンプログラムの効率が保障されるよう
になるであろう。

【００１２】 現在の商業的ワクチンの欠点はそれらをより安全でより良く規定されたサブユ
ニット製品に置き換える研究を促している。しかしながら、許容されるためには
、かかる製品は現行の有用な不活化ウィルスワクチンのそれと免疫原性が同等で
ある必要があり、そして抗原変異体に対する広い防御スペクトルを供する必要が
あるであろう。

【００１３】 ＦＭＤＶについての規定のサブユニットワクチンを設計する試みは図１に示す
ようにウィルス粒子の破壊及びその構成タンパク質の同定で始まる。これはイン
タクトな不活化ウィルス粒子と比べて免疫原活性の著しい損失をもたらす（Brow
n, 1989)。しかしながら、ＶＰ１と統一的に命名されている分離されたカスピド
タンパク質はウシ及びブタにおいてウィルス負荷から中和抗体及び免疫力を誘導
する能力を有するが、その活性はサブタイプ特異性であり、そしてインタクト不
活化ウィルスのそれと比べて何桁も弱い。どのその他のウィルスタンパク質も中
和活性を誘導しない（Laporte ら、C R Acad Sci Paris, 1973 ; 276 : 3399-34
01及びBachrachら、J. Immunol., 1975 ; 115 : 1636-1641)。

【００１４】 ＶＰ１の中和活性はこのタンパク質への関心を高め、そしてそれは当初遺伝子
操作サブユニットワクチンの候補として相当に考えられた（Kleid ら、Science,
1981 ; 214 : 1125-1129)。すぐに組換ＶＰ１の免疫原性は動物を保護するには
十分でないことが明白となった（Brown, 1989 ; Brown, 1992)。にもかかわらず
、この研究はＶＰ１上の免疫原決定基の発見、そして合成ペプチドに基づくより
強い部位特異的サブユニットワクチンの可能性へと結びついた。

【００１５】 ＶＰ１は免疫原部位についてStrohmaierら（J Gen Virol, 1982 ; 59 : 295-3
06）〔彼はシアノゲンブロミド及びタンパク質分解消化により作製したＶＰ１切
断生成物を試験した〕；Bittle and Lerner (WO83/03547）〔彼らは、最高の変
動領域に対応するアミノ酸配列の合成ペプチドを試験した〕；Acharyaら（Natur
e, 1989, 337 : 709-711）〔彼はＸ線結晶学によりＦＭＤＶ上の表層露出部位を
同定した〕；及びPfaff ら（EMBO J, 1982 ; 7 : 869-874）〔彼はＶＰ１におけ
る主要両親媒性らせんコンフォメーションの推定により中和抗体を誘導するペプ
チドを選別した〕によりマッピングされている。４通りのアプローチは全て中和
抗体を誘導する決定基を抱えるＶＰ１スパン残基１３７−１６０のループ領域に
集中する。

【００１６】 ７つの血清型全てに属するＦＭＤＶ単離体由来の「Ｇ−Ｈループ」とも呼ばれ
るＶＰ１の１４１−１６０領域に対応する血清型特異的ペプチドはモルモットに
おいて保護レベルの中和抗体を誘導することが示されている（Francis ら、Immu
nology, 1990 ; 69 : 171-176)。明らかに、この領域はウィルスの血清型特異性
をも担持する主要免疫原部位を含む。これら１４１−１６０ ＶＰ１ペプチドに
ついての免疫原性の当初の検討は担体タンパク質ＫＬＨ（キーホールリンペット
ヘモシアニン）に接合された合成ペプチドを利用して達成されるが、その手順は
十分に規定された合成免疫原を製造する利点を利用しない。しかしながら、ＶＰ
１合成免疫原の開発はDiMarchi and Brook（米国特許第４，７３２，９７１号）
により発展され、彼は２００−２１３ Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−１４１−１５
８−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙキメラ構築体において連結されたサブタイプＯ単離
体由来の２つのＶＰ１配列がウシをウィルス負荷から守る抗体レベルを誘導する
ことを示した。にもかかわらず、この効果の効能はペプチド免疫原の低い免疫原
性により制約される。ホモタイプ舌皮内負荷に対する保護を図るには１２５mgの
高い用量が必要とされ、そして５mgの用量を受容した３匹の動物のうちの１匹は
保護されなかった。実際の用途はより少ない量のペプチド免疫原によるホモタイ
プ及びヘテロタイプ負荷の両方からの完全な保護を供するワクチン製剤を必要と
する。

【００１７】 ＦＭＤＶのための有効なペプチドワクチンの重要な要素は中和抗体の誘導を担
うＢ細胞エピトープの提示に最適なＶＰ１のＧ−Ｈループドメインからの正確な
配列の選択にある。ペプチドによるドメインの最適提示のためのフレームは１個
のアミノ酸の位置ほどのわずかなシフトにより影響されうる（Moore, Chapter 2
, Synthetic Peptides A User's Guide, Grant編、WH Freeman and Company : N
ew York, 1992, pp 63-67)。免疫主要Ｇ−Ｈループ中和決定基を含んで成る好適
な合成免疫原、例えば残基１４１−１６０（WO83/0357 ; Francis ら、1990）、
１４１−１５８（米国特許第 4,732,971）、１４２−１５８（Parry ら、WO91/0
3255）、１３７−１６８（Morgan and Moore, Am J Vet Res, 1990 ; 51 : 40-4
5）、１３８−１５６（Tabogaら、J Virol, 1997 ; 71 : 2602-2614）並びに１
３０−１６０（WO83/03547）から選択された２０個のアミノ酸の任意の連続配列
が開示されている。明らかに、ＶＰ１の固有セグメント上にはＧ−ＨループＶＰ
１中和部位の提示のために最適な共通配列がない。

【００１８】 更に、従来のペプチドワクチンにおけるＢ細胞エピトープの制約されたバライ
エティーは高度に可変性のＦＭＤＶに対する保護のために必要な広域反応性中和
抗体を刺激するには適当でない。現在まで、比較的制約された特異性を有する抗
体だけが誘導され、そしてこのような制約された特異性でさえもその価値に対す
る更なる制限が逃避突然変異体をもたらす点突然変異の経時的な出現に基づき存
在する（Tabogaら、1997）。別の方法が多数の株間での抗原変動及び逃避突然変
異体の出現により生ずる一時的な変異に打ち勝つのに十分に広域な免疫原性を有
するペプチドワクチンの提供のために必要である。

【００１９】 ＦＭＤＶワクチンについての合成ペプチドの免疫原性に影響する別の重要な要
因は宿主のために適当なＴ−ヘルパー細胞エピトープの免疫系の提供にある。短
い合成ペプチドはワクチンとしてのその能力を、それらがヘルパーＴ細胞レセプ
ター及びクラスII ＭＨＣ分子と反応するドメインを抗体結合部位に加えて含む
ときにのみ発揮できる（Babbitt ら、Nature, 1985 ; 317 : 359-361）。１４１
−１６０ＶＰ１ペプチドだけがモルモット及びマウスに対して多少免疫原性であ
り、このような種に適当である配列内のＴ−細胞エピトープの存在を示唆する。
このような実験用動物での結果とは対照的に、ウシ及びブタでのワクチン試験は
このＶＰ１ドメインのＴ−細胞エピトープに対する免疫応答性がこのような経済
的に重要な異系交配種の個体間での適当な保護のためには可変性でありすぎるこ
とを示唆する（Rodriguez ら、Virology, 1994 ; 205 : 24-33；及びTabogaら、
J Virol, 1997 ; 71 : 2606-2614）。最近、Ｔ−ヘルパー細胞部位として作用す
るＦＭＤＶ構造タンパク質の領域に対応するその他の合成ペプチドが同定されて
いる。ＶＰ１アミノ酸２１−４０に対応するペプチドがウシにおいてＶＰ１中和
ループ配列に対してＴ細胞ヘルプを供することが見い出された（Collenら、J Im
munol, 1991 ; 146 : 749-755)；しかしながら、このＴ細胞エピトープの存在は
ウシにおいて一貫した保護を供するには不十分である（Tabogaら、1997）。未だ
適当なＴヘルパー細胞決定基の選択に関する情報はなく、又ＦＭＤＶペプチドに
おけるＢ−及びＴ−細胞エピトープの最適な配向に関する情報もない。

【００２０】 伝統的なワクチンに勝る効能及び広域性を有するＦＭＤＶについての合成ペプ
チドベースワクチンについてのニーズが残っている。上記の従来技術のペプチド
はこのニーズを適切に解決していない。

【００２１】 本発明の目的はこのニーズを満たす合成ペプチドＦＭＤワクチンの提供にある
。この目標を達成するために利用される方法は： １．高親和力エピトープの同定のための有効な手順； ２．コンビナトリアル化学を介する少ない数のペプチド合成体によるＢ細胞及
びＴ細胞エピトープの拡大されたレパートリーを供する手段； ３．Ｂ細胞標的エピトープを有能なＴヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープと組合
せ、そしてそのＴｈエピトープを集団の可変性免疫応答性に適合させることによ
るＢ細胞標的エピトープの免疫原力の強化のための手段、及び ４．環化拘束の導入による所望のコンフォメーション特性の安定化、 である。

【００２２】 合成ペプチドはタンパク質の表層上の免疫優性決定基又はエピトープの同定、
新たなワクチンの開発及び診断のために利用されている。エピトープマッピング
は抗体免疫原決定基相互作用に関与する部位を同定するため、注目のタンパク質
上の領域に対応する一連の重複ペプチドを採用する。最も一般的には、エピトー
プマッピングは線形決定基を正確に検出するため、比較的長さの短いペプチドを
採用する。「ＰＥＰＳＣＡＮ」として知られるエピトープマッピングの迅速な方
法は固相支持体にカップリングされた長さ８〜１４個のアミノ酸の数百の重複ペ
プチドの同時合成を基礎とする。このカップリングされたペプチドを抗体に結合
するその能力について試験する。このアプローチは線形決定基の位置決めに有効
であるが、そのワクチンの開発のために必要とされる免疫優性エピトープは通常
高度に親和性の不連続エピトープであり、そしてＰＥＰＳＣＡＮ法により同定す
るのは困難である（Meolenら、Ann Biol Clin, 1991 ; 49 : 231-242)。

【００２３】 別法は１組の１５〜６０残基の範囲の多数の長さを有するネステッド、重複ペ
プチドに頼る方法である。これらの長いペプチドは、急速な、同時のＰＥＰＳＣ
ＡＮ合成によりむしろ、労力を要する系列の独立の固相ペプチド合成により合成
することができる。次いで生ずる組のネステッド、重複ペプチドを、抗体結合研
究や実験的免疫化において使用して、簡単な不連続エピトープを包含する、免疫
優性決定因子を最もよく表す長いペプチドを同定することができる。この方法は
、ＨＴＬＶ Ｉ／II（米国特許第５，４７６，７６５号）およびＨＣＶ（米国特
許第５，１０６，７２６号）からの免疫優性部位のマッピングについてのWangの
研究により例示され、そしてＨＩＶ中和性エピトープを最適に提示するｇｐ１２
０配列上の正確な位置を選択するために使用された（Wang他、Science, 1991 ;
245 : 285-288)。

【００２４】 コンビナトリアルペプチドライブラリーが地理的又は集団的相違及び超可変抗
原の一時的な変異を包含する多種多様な配列をカバーするため並びに個々のペプ
チド免疫原の制約された能力を包括するためにデザインされている。例えば、特
定のペプチド抗原が、不変な残基の構造フレームワークのまわりに構成された多
重位置置換を含むようにデザインされうる。この組合せは免疫優性部位のコンフ
ォメーションを維持し、そして現状の及び期待の抗原変異に適合する。ＨＩＶ及
びＨＣＶの超可変免疫優性部位に対応するかかるコンビナトリアルペプチドはGr
as-Masseら（Peptide Research, 1992 ; 5 : 211-216）により「ミキソトープ」
として、そしてWangら（ＷＯ９５／１１９９８）により「構築合成抗原ライブラ
リー」又は「ＳＳＡＬ」として発表されている。

【００２５】 「構築合成抗原ライブラリー」又はＳＳＡＬは部位の抗原性、診断価値又は治
療的生物活性を維持できる大きな不変構造フレームワーク内に埋もれた順序だっ
た一連の関連ペプチド配列から成る。

【００２６】 式１はＳＳＡＬアミノ酸配列の表示である。 ＡＡ_1jＡＡ_2j…ＡＡ_ij…ＡＡ_xj（式１） 配列ＡＡ_ij〜ＡＡ_xjはＳＳＡＬ内のペプチドのＮ末端からＣ末端にかけてのア
ミノ酸配列を表わす。このライブラリー内の各ペプチドは長さｘを有し、そして
ｘは各ライブラリーについて一定である。各アミノ酸位置ｊにおいて、ｊは１か
らｎであり、ここでｎはｉ番目の位置にある既知の（又は所望の）様々なアミノ
酸の数を表わす。ギャップ又は挿入、例えば表１のＶＰ１配列アラインメントの
ものの計画的な導入又は自然的な発生は様々なｘ値を有する個々のＳＳＡＬの合
成により適応される。

【００２７】 式２はＳＳＡＬ配列内の所定の変異位置ｉにおいてのアミノ酸の相対比率の合
計を示す：

【数１】

【００２８】 式２は各位置ｉにおいて、ｎ通りの個々のアミノ酸のモル分率の合計が一定で
あることを示す。ｉ位においてｊ番目のアミノ酸〔ＡＡ_ij〕のモル分率は（１）
自然に見い出せるＦＭＤＶのサブタイプ株間でＡＡ_ijの頻度及び任意的に（２）
逃避突然変異体を予測するために類似のアミノ酸を含ませる要求、に基づき実施
者により選定される。アミノ酸ＡＡ_ijは通常天然アミノ酸から選定されるが、修
飾アミノ酸、例えばオルニチン及びノルロイシン並びに非天然アミノ酸、例えば
Ｄ−アミノ酸から選ばれるであろう。このような式に従うことにより、長さｘを
有するＳＳＡＬの変異配列全てが一回の合成において同時に調製できる。

【００２９】 ＳＳＡＬの配列は関連の抗原ファミリーの一次アミノ酸配列をアライニングし
、そしてそのアラインメント内の不変及び変異座を同定することにより決定する
。不変座は一般にＳＳＡＬの構造フレームワークを表わす。ＳＳＡＬ内の縮重は
任意のプロトタイプ配列に対して異なるアミノ酸残基を有するアラインメント内
の座により決定される。どのアミノ酸が各々の不変位置にあるかを決定した後、
ＳＳＡＬライブラリー内の可変位置についての縮重度を各代替アミノ酸を示す変
異体の数から決定する。次いで不変位置において１個のアミノ酸をもち、そして
可変位置において必須縮重をもつＳＳＡＬを合成する。

【００３０】 可変位置にあるアミノ酸の相対比率は互いと等しく設定するか、又は等しくな
い比率ｘにすることができる。好適な態様においては、１又は複数の可変位置に
あるアミノ酸の比率は天然配列において認められる各アミノ酸の相対頻度を反映
するように設定する。表２及び３に例示するＳＳＡＬライブラリーはかかる好適
な態様を示し、ここでその下付き記号はＳＳＡＬ内の各可変位置にある個々の残
基の相対量を表わす。ＳＳＡＬ内に存在するペプチドの大半は自然ではまだ見つ
かっていない可変アミノ酸の組合せを表わしうることに注目すべきである。ＳＳ
ＡＬのこの特徴は、ＦＭＤＶの新たな出現株によるＦＭＤＶ感染症に対する防御
が本発明のペプチド組成物により供される度合いを高める。

【００３１】 かくして、簡単な方法で、ＳＳＡＬ内の各位置での特定のアミノ酸及び任意的
にその出現頻度はアラインメントに利用される様々な抗原の一次配列により規定
される。逃避突然変異体の予測において、アライニングしたエピトープ内の可変
座にある自然に存在することの知られていないアミノ酸をライブラリーの中に任
意的に組込むことができる。例えば、特定のクラス（例えば疎水性、帯電、中性
又は極性）のアミノ酸のいくつか又は全ての残基を任意の可変座に組込んでよい
。特定の座に組込まれたアミノ酸のクラスは抗原アラインメント内の可変座に見
い出せる主要タイプのアミノ酸により決定できうる（ＷＯ９５／１１９９８）。

【００３２】 プロミスカスＴｈと命名するＴｈエピトープは効率よいＴ細胞ヘルパーを誘導
し、そしてそれら自体免疫原性が低過ぎて効力があるペプチドの免疫原を発生で
きない合成Ｂ細胞エピトープと組合わせることができる（米国特許第５，７５９
，５５１号）。よく設計されたプロミスカスＴｈ／Ｂ細胞エピトープキメラペプ
チドはＴｈの応答を誘導することができ、そして生ずる抗体は多様なＭＨＣハプ
ロタイプを発現する遺伝的に多様な集団の大部分のメンバーにおいて応答する。
プロミスカスＴｈは、ウィルス及び細菌起源の強い免疫原、例えば、麻疹ウィル
スＦタンパク質、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原、およびトラコーマクラミジア（Ch
lamydia trachomatis)主要外膜タンパク質（ＭＯＭＰ）に由来する特異的配列に
より提供されることができる。多数の既知のプロミスカスＴｈは、デカペプチド
ホルモンＬＨＲＨに対応する低い免疫原性のペプチドを強化するとき有効である
ことが示された（米国特許第５，７５９，５５１号）。

【００３３】 有能なＴｈエピトープは約１５〜約５０アミノ酸残基長さの範囲であり（米国
特許第５，７５９，５５１号）、しばしば普通の構造的特徴を共有し、特異的ラ
ンドマーク配列を含有することがある。例えば、普通の特徴は両親媒性らせんで
あり、これらのらせんはらせんの１つの面を支配する疎水性アミノ酸残基と、取
り囲む面を支配帯電した極性残基とを有するアルファ−らせん構造である（Ceas
e 他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987 ; 84 : 4249-4253)。Ｔｈエピトープ
はしばしば追加の一次アミノ酸パターン、例えば、Ｇｌｙまたは帯電した残基お
よび引き続く２〜３つの疎水性残基、引き続いて帯電したまたは極性の残基を含
有する。このパターンはロトバード（Ｒｏｔｈｂａｒｄ）配列と呼ぶものを定め
る。また、Ｔｈエピトープはしばしば１，４，５，８ルールに従い、ここで正に
帯電した残基に引き続いて帯電した残基後に疎水性残基が第４、第５および第８
に存在する。これらの構造のすべては、普通の疎水性の、帯電した、極性アミノ
酸残基から構成され、各構造は単一のＴｈエピトープ内に同時に存在することが
できる（Partidos他、J. Gen. Virol., 1991 ; 72 : 1293-1299)。プロミスカス
Ｔ細胞エピトープのすべてではないにしても大部分は、前述の周期性の少なくと
も１つに適合する。これらの特徴、例えば様々なＭＨＣ分子の認識に関わる位置
において縮重性を供することができ、且つ不変位置を保持するＳＳＡＬ Ｔｈエ
ピトープを「理想化された人工的Ｔｈ部位」の設計の中に組込むことができる。
可変の、好ましいアミノ酸のリストはＭＨＣ結合モチーフのために入手可能であ
る（Meister 他、Vaccine, 1995 (13 : 581-591 ; Alexander 他、Immunity, 19
94, 1 : 751-761)。例えば、ＷＯ９５／１１９９８号に「ＳＳＡＬ１ＴＨ１」と
して記載されている縮重Ｔｈエピトープは、プロミスカスエピトープを麻疹ウィ
ルスのＦタンパク質から取った後、モデル化された（Partidos他、1991）。ＳＳ
ＡＬ１ＴＨ１はＬＨＲＨターゲットペプチドとタンデムで使用するように設計さ
れた。麻疹エピトープと同様に、ＳＳＡＬ１ＴＨ１はロトバード（Ｒｏｔｈｂａ
ｒｄ）配列および１，４，５，８ルールに従う：

【化１】

【００３４】 帯電した残基ＧｌｕまたはＡｓｐを位置１に付加して、Ｔｈの疎水性面を取り
囲む電荷を増加させる。次いで両親媒性らせんの疎水性面は２，５，８，９，１
０，１３および１６における疎水性残基により維持され、２，５，８，９，１０
，１３および１６における変動性は広い範囲のＭＨＣ制限因子に対する結合能力
を有する見かけを提供する。ＳＳＡＬの特徴の正味の効果は、人工的Ｔｈに対す
る免疫応答性の範囲を拡大することである（ＷＯ９５／１１９９８）。かかるＳ
ＳＡＬ内の変異体全ては標的化Ｂ細胞エピトープ及びその他の配列とタンデムで
単一の固相ペプチド合成において同時に製造される。

【００３５】 ペプチドの免疫原は一般にタンパク質よりも柔軟性であり、好ましい構造を保
持する傾向がない。したがって、環の拘束の導入により、ペプチドの免疫原を安
定化することは有効である。正しく環化されたペプチドの免疫原はターゲッテッ
ドエピトープのコンフォメーションを模擬し、保存することができ、これにより
真性分子上の部位と交差反応性の抗体を誘導することができる（Moore, Chapter
2, Synthetic Peptides : A User's Guide, Grant編、WH Freeman and Company
: New York, 1992, pp.63-67)。これはＦＭＤＶ免疫優性ＶＰ１ループを有する
ペプチドについて、アミノ及びカルボキシ末端の双方にシステイン残基を付加し
、そしてこの２つのシステイン残基の酸化による環化により達成できる（ＷＯ８
３／０３５４７）。しかしながら、ＶＰ１ループドメインのより効率的なペプチ
ドアナログのニーズが残っている。

【００３６】 より免疫学的に有効なコンフォメーションを有するペプチドが本発明により提
供される。これらは天然エピトープのより正確なイミテーションをもたらすシス
テイン残基の位置の発見により得られる（Valeroら、Biomedical Peptides, Pro
teins and Nucleic Acids, 1995 ; 1 : 133-140)。

【００３７】 発明の概要 本発明はペプチド工学及び上記のペプチドデザイン要素、即ち、正確なマッピ
ング、ＳＳＡＬライブラリーペプチド、有能なＴｈのデザイン及び環化拘束によ
りデザインされた。これらのペプチド免疫原は有効な合成ＦＭＤＶワクチンの基
礎となる。かかるペプチドは最適な配置及びコンフォメーション拘束を有するＶ
Ｐ１中和部位の提供、ＦＭＤＶ血清型変異により必須とされる多種多様な配列の
提供、及びその幅広く反応性なＴｈ応答性のために好適である。 本発明は更にＦＭＤＶ感染症の予防及びＦＭＤの根絶のための免疫原としての
かかるペプチド組成物の利用に関連し、ここでその中に含まれている各ペプチド
は口蹄疫ウィルス（ＦＭＤＶ）のＶＰ１カスピドタンパク質に由来する標的抗原
部位を含んで成り、好ましくは当該抗原部位はヘルパーＴ細胞エピトープ及び好
ましくはその他の免疫刺激配列に、好ましくは直接合成を介する慣用のペプチド
結合により共有結合されている。

【００３８】 より詳しくは、本発明はブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ及びＦＭＤＶ感受性な野生
種を含む動物における、ＦＭＤＶの様々な株又は血清型をｉｎ ｖｉｔｒｏで効
率的に中和することのできる高力価ポリクローナル抗体の産生を誘導するための
免疫原としてのかかるペプチド組成物の利用、並びに抗原の多様性に関係なくＦ
ＭＤＶ感染症の発症を予防及び／又は抑制し、その結果ＦＭＤを根絶するワクチ
ンとしてのかかる組成物の利用に関する。

【００３９】 本発明は更にかかる組成物において利用されるペプチド、並びに１又は複数種
のこれらのペプチド又はそのセグメントを含むイムノアッセイ及び／又は診断キ
ットに関連する。

【００４０】 本発明の標的病原部位はＦＭＤＶ Ａ₁₂株のＶＰ１タンパク質に由来するアミ
ノ酸配列情報に基づくエピトープマッピングを介して選別され、そしてＦＭＤＶ
ＶＰ１タンパク質上の中和決定基、アミノ酸１３４〜１６８の最適な提示のた
めのフレームを有する。これらの残基はアラインメントの目的のために導入され
た１４２位のギャップの存在に基づき表１のアミノ酸「１３４−１６９」（ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：１）として認められる。これらは本明細書において便宜上アミ
ノ酸１３４−１６９と称するが、前記１３４−１６８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１
）が論述の実際のフラグメントであることが理解されるであろう。

【００４１】 本発明の標的抗原部位は好ましくはＧ−Ｈループ領域の天然ＦＭＤＶ ＶＰ１
配列のそれから、２個の天然アミノ酸のシステインによる置換、及びこれらのシ
ステイン間でジスルフィド結合を形成させてシステイン間に約２０〜約２５残基
ある環式構造を作ることによって改質される（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）。その
他の血清型のＶＰ１についての対応の標的部位は関連の血清型の相同Ｇ−Ｈルー
プ領域セグメントに由来しうる。

【００４２】 本発明は更に不変構造フレームワーク内に埋もれた高度に可変性な位置を有す
るＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の最適化フレームに係る共通配列をもつＦＭＤＶ Ｖ
Ｐ１標的抗原部位を提供し、ここで各々の高度に可変性な位置について最も頻繁
に採用されているアミノ酸を、特定のＦＭＤＶ血清型に関連するＦＭＤＶサブグ
ループ由来のＶＰ１配列の分析による決定に従い、提示する。

【００４３】 本発明は更にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の最適化標的抗原ペプチドに係る構築合
成抗原ライブラリー（又はＳＳＡＬ）を提供し、ここで各ＳＳＡＬは標的抗原ペ
プチドの抗原性を維持することができる不変な構造フレームワークに基づく配列
を有する単一ペプチド合成において同時に製造される関連のペプチドの順序立っ
た組から成る。

【００４４】 更に、本発明のペプチド及びそのアナログの標的部位はエルシニア（Ｙｅｒｓ
ｉｎｉａ）からとった免疫刺激性インベーシンペプチド（Ｉｎｖ）、外来タンパ
ク質由来のプロミスカスＴｈエピトープ；ＦＭＤＶタンパク質由来の自己Ｔｈエ
ピトープ（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４、表５）、人工Ｔｈエピトープ（
例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５及び２６、表６）、その他を含む合成免疫刺激
性因子に対する直接合成によるタンデム結合における共有結合を介し、免疫原性
となっている。本発明のペプチドは次式により表わすことができうる： （Ａ）_n −（ＦＭＤＶ抗原）−（Ｂ）_o −（Ｔｈ）_m −Ｘ 又は （Ａ）_n −（Ｔｈ）_m −（Ｂ）_o −（ＦＭＤＶ抗原）−Ｘ 又は （ＦＭＤＶ抗原）−（Ｂ）_o −（Ｔｈ）_m −（Ａ）_n −Ｘ 又は （Ｔｈ）_m −（Ｂ）_o −（ＦＭＤＶ抗原）−（Ａ）_n −Ｘ （式中、 各Ａは独立してアミノ酸又は一般的な免疫刺激性配列であり； 各Ｂは独立してアミノ酸又は更に以下に定義する化学リンカーであり； 各Ｔｈは独立してヘルパーＴ細胞エピトープを構成するアミノ酸の配列、又は
その免疫増強アナログもしくはセグメントであり； 「ＦＭＤＶ抗原」は更に以下に定義する合成ペプチド抗原であり； Ｘはアミノ酸α−ＣＯＯＨ又はα−ＣＯＮＨ₂ であり； ｎは０〜約１０であり； ｍは１〜約４であり；そして ｏは０〜約１０である）。

【００４５】 更に、ワクチン製剤の中に通常組込まれるアジュバント及び／又はデリバリー
ビヒクル、並びにＦＭＤＶ ＶＰ１標的抗原部位に対して特異的なポリクローナ
ル抗体が構築される用量についての説明を提供する。

【００４６】 本発明はブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ及びＦＭＤＶ感受性野生種等の動物におい
ての高力価のポリクローナル抗体の産生を誘導する免疫原としてのペプチド組成
物の利用に関する。抗体により媒介され且つ本発明のペプチド組成物により誘導
されるＦＭＤＶ防御メカニズムは血清型又はサブタイプに関係なくＦＭＤＶの様
々な株をｉｎ ｖｉｔｒｏで効率的に中和し、それ故ＦＭＤＶ感染症からの防御
免疫力を供し、ＦＭＤの根絶に役立つ。

【００４７】 発明の詳細な説明 本発明は免疫原としてのペプチド組成物の利用に関連し、ここで当該組成物は
１又は複数種のペプチドを含んで成り、その中に含まれている各ペプチドは口蹄
疫ウィルス（ＦＭＤＶ）のＶＰ１カスピドタンパク質に由来する標的抗原部位を
含んで成り、当該抗原部位は好ましくはヘルパーＴ細胞エピトープ及び任意的に
その他の免疫刺激配列に共有結合している。この共有結合は好ましくは直接合成
により構築されたペプチド結合を介する。

【００４８】 このペプチド組成物は動物のＦＭＤＶ感染症の予防のために有用であり、そし
てＦＭＤの根絶に役立つものと予測される。 より詳しくは、本発明はブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ及び感受性な野生種を含む
動物における、ＦＭＤＶの様々な株又は血清型をｉｎ ｖｉｔｒｏで効率的に中
和することのできる高力価ポリクローナル抗体の産生を誘導するための免疫原と
してのかかるペプチド組成物の利用、並びに血清型に関係なくＦＭＤＶ感染症の
発症を予防し、その結果ＦＭＤを根絶するワクチンとしてのかかる組成物の利用
に関する。

【００４９】 本発明は更にかかる組成物において利用されるペプチド、並びに１又は複数種
のこれらのペプチド又はそのセグメントを含むイムノアッセイ及び／又は診断キ
ットに関連する。１もしくは複数種のペプチド又はそのセグメントを含むイムノ
アッセイ及び／又は診断キットはワクチン誘導化抗体及び感染症により誘導され
る抗体を同定するために有用であり、それ故ＦＭＤＶ感染症の存在のためのスク
リーニング及び／又は種痘プログラムの効果のモニターのために利用できる。

【００５０】 本発明は哺乳動物のＦＭＤＶ感染症を診断する方法であって、 （ａ）請求項１記載のペプチドを固相支持体に付加させ、 （ｂ）当該固相支持体に付加された前記ペプチドを前記哺乳動物由来の抗体を
含むサンプルに、当該ペプチドに対する当該抗体の結合が誘導される条件下で曝
露し、そして （ｃ）前記固相支持体に付加された前記ペプチドに結合した抗体の存在を検出
する、 ことを含んで成る方法を提供する。

【００５１】 ＦＭＤＶ ＶＰ１の主要中和決定基を含んで成る標的化抗原配列（Ｇ−Ｈルー
プ）はＦＭＤＶ ＶＰ１の三次構造（Brookhaven National Laboratory、インタ
ーネットアドレスhttp://www.pdb.bnl.gov./pdb.bin/pdbidsにより入手でき、且
つAcharya ら、Nature 337 : 709-711, 1989において報告）から推定される潜在
的なループ化コンフォメーション及びＧ−Ｈループの残基の表層曝露の検討に基
づいて最適化した。環化のための候補位置をペプチド構築体のデザインの中に組
込み、そして修飾及び非修飾配列を免疫原として、連続合成により、プロミスカ
スＴｈエピトープに対するその他の免疫刺激因子と伴って又は伴わないでの共有
結合により合成した。この修飾ペプチド構築体は特定のジスルフィド結合を組込
みながら環式ペプチドとして合成し、かくして機動性ペプチドを潜在的により生
物学的に関係するコンフォメーションへと安定化させる。対応の免疫原性のＶＰ
１抗原部位を含んで成る合成構築体は超免疫血清の調製及びＦＭＤＶ中和アッセ
イにおけるその血清の効能の試験により同定される。詳しくは、本発明の標的抗
原部位はＦＭＤＶ株Ａ₁₂のＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列に基づくエピトープ
マッピングを介して選別した（実施例２）。

【００５２】 表１にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示す標的抗原ペプチドＡＡ１３４−１６９の
フレームがＦＭＤＶ ＶＰ１上のＧ−Ｈループ中和決定基の免疫原提示のために
最適であることが見い出された。この抗原ペプチドの標的抗原部位は天然ＦＭＤ
Ｖ ＶＰ１配列のそれから、１３４位の天然アスパラギン及び１５７位のグルタ
ミンのシステインによる置換、並びにそれらの置換システイン間でジスルフィル
ド結合の形成、その結果としての環化構造の作製（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）に
より修飾できうる。かかる環式構造は、単一のジスルフィドループ化構造が表１
においてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示すように保存されている限り、ＶＰ１の１
３４−１５７セグメントのいずれかの末端からとった１〜１３個の追加のアミノ
酸も含んで成る。本発明の標的抗原ペプチドの例として下記の配列を有するＦＭ
ＤＶ ＶＰ１についての標的部位が提供される（システイン置換基は太字で示す
）。

【化２】

【００５３】 同様に、その他の血清型のＶＰ１の対応の標的部位を対応の血清型の相同セグ
メントから誘導することができる。例えば、置換ペプチドアナログは対応の配列
に従ってＦＭＤＶ血清型Ｏ及びアジアから配列アラインメントを通じ、下記の対
応配列を有する表１に示すように調製できる：

【化３】

【００５４】 本発明は更に環化及び線形のＦＭＤＶ ＶＰ１標的抗原ペプチドを提供し、そ
れは不変構造フレームワークに基づく高度に可変性の位置を有するＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１の最適化フレーム（ＡＡ１３４−１６９）に係る共通配列を有し、こ
こでこの高度に可変性の位置各々について最も頻繁に採用されるアミノ酸を、特
定のＦＭＤＶ血清型に関連するウィルスの群からのＶＰ１配列の分析による決定
に従い示す。本発明のかかる共通配列の例として、表１に示す血清型Ａ（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：８，９）、血清型Ｏ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０，１１）及び血
清型アジア（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２，１３）のＦＭＤＶ変異体に由来する６
通りの共通配列を提供する。

【００５５】 本発明は更にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の最適化標的抗原ペプチドフレームに係
る環化及び線形の構築合成抗原ライブラリー（又はＳＳＬＡ）を提供し、ここで
各々のＳＳＡＬは標的抗原ペプチドの抗原性を維持することのできる不変構造フ
レームワークに基づく配列を有する単一のペプチド合成において同時に製造され
た関連のペプチドの順序立った組から成る。本発明のかかるＳＳＡＬの例として
、表２，３，４及び１０にそれぞれ示す血清型Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４−
１７）、血清型Ｏ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８，１９）及び血清型アジア（ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：２０，２１，３５）のコンパイルしたＦＭＤＶサブタイプグル
ープに由来する複合配列を有する９通りのＳＳＡＬを提供する。

【００５６】 標的ＶＰ１部位は短いペプチド配列である。それ自体を本発明のペプチドとし
て合成した場合、かかるペプチドは通常弱い免疫原である。このような短いペプ
チドは限定することなく下記の外来病原体に由来するプロミスカスＴｈエピトー
プに対する化学結合により免疫強化されうる：Ｂ型肝炎の表面およびコアの抗原
ヘルパーＴ細胞エピトープ（ＨＢｓ ＴｈおよびＨＢｃ Ｔｈ）、百日咳トキシ
ンヘルパーＴ細胞エピトープ（Ｐｔ Ｔｈ）、破傷風トキシンヘルパーＴ細胞エ
ピトープ（ＴＴ Ｔｈ）、麻疹ウィルスＦタンパク質ヘルパーＴ細胞エピトープ
（ＭＶＦ Ｔｈ）、トラコーマクラミジア（Chlamydia trachomatis)主要外膜タ
ンパク質ヘルパーＴ細胞エピトープ（ＣＴ Ｔｈ）、ジフテリアトキシンヘルパ
ーＴ細胞エピトープ（ＤＴ Ｔｈ）、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falcipa
rum)サーカムスポロゾイト（circumsporozoite）ヘルパーＴ細胞エピトープ（Ｐ
Ｆ Ｔｈ）、シストソマ・マンソニ（Schistosoma mansoni)トリオースリン酸イ
ソメラーゼヘルパーＴ細胞エピトープ（ＳＭ Ｔｈ）、および大腸菌（Escheric
hia coli）ＴｒａｔヘルパーＴ細胞エピトープ（ＴｒａＴ Ｔｈ)。病原体に由
来するＴｈは米国特許第５，７５９，５５１号の中に配列番号２〜９および４２
〜５２として列挙された；クラミジア（Chlamydia)ヘルパー部位Ｐ１１として、
Stagg 他、Immunology, 1993 ; 79 : 1-9 に記載された；そしてＨＢｃペプチド
５０〜６９として、Ferrari 他、J. Clin. Invest., 1991 ; 88 : 214-222 に記
載された。これらは引用することで本明細書に組入れる。 プロミスカスＴｈはＦＭＤＶタンパク質に由来する自己Ｔｈエピトープ（表５
、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）又は表６の例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２
５，２６，３６，３７及び３８に示すデザイン化人工Ｔｈエピトープも含む。

【００５７】 本発明の免疫原はＦＭＤＶの主要中和決定基の正確なターゲッティングを供す
るよう自己部位特異的免疫反応性である。本発明のペプチドの態様として特定の
例を提供する。例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２，１１。更なる例を本発明の好適
なペプチドとして提供し、それらはＦＭＤＶ ＶＰ１抗原部位に対する合成免疫
刺激因子の結合を供し（例えば表７〜１０のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７〜３４）
、かくしてＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質上の標的化部位に対する広域反応性の有
能な中和抗体が遺伝的に多様な宿主集団において構築される。このような抗−Ｖ
Ｐ１抗体はＦＭＤＶの有効な中和、それ故ＦＭＤＶ感染症からの防御に結びつく
。

【００５８】 活性免疫の場合、本明細書で言及する「免疫原」とはＦＭＤＶのＶＰ１タンパ
ク質上に存在するＧ−Ｈループ部位に対する抗体を誘導することができ、様々な
血清型のＦＭＤＶの有効な中和、それ故ＦＭＤＶ感染症の予防に結びつくペプチ
ド組成物を意味する。本発明のペプチド組成物は好ましくはプロミスカスヘルパ
ーＴ細胞エピトープ（Ｔｈエピトープ）及び任意的にその他の免疫刺激因子を含
む合成ペプチドを含む。ＴｈペプチドはＦＭＤＶ ＶＰ１標的抗原部位（例えば
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜２１，３５）に対してスペーサー（例えばＧｌｙ−Ｇ
ｌｙ）により共有結合されており、かくして標的抗原部位のＮ又はＣ末端のいず
れかに隣接することで有効な抗体応答を誘導する。この免疫原は更に一般の免疫
刺激アミノ酸配列、例えば細菌エルシニア種由来のインベーシンタンパク質のド
メイン（Brett ら、Eur J Immunol, 1993, 23 : 1608-1614)（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：２２）に対応するものを含んで成ってよい。存在しているとき、この一般的
な免疫刺激ドメインはペプチドを介する付加のためのスペーサーを含みうる。

【００５９】 本発明のペプチドは次式により表わすことができうる： （Ａ）_n −（ＦＭＤＶ抗原）−（Ｂ）_o −（Ｔｈ）_m −Ｘ 又は （Ａ）_n −（Ｔｈ）_m −（Ｂ）_o −（ＦＭＤＶ抗原）−Ｘ 又は （ＦＭＤＶ抗原）−（Ｂ）_o −（Ｔｈ）_m −（Ａ）_n −Ｘ 又は （Ｔｈ）_m −（Ｂ）_o −（ＦＭＤＶ抗原）−（Ａ）_n −Ｘ （式中、 各Ａは独立してアミノ酸又は一般的な免疫刺激性配列であり； 各Ｂは独立してアミノ酸、−ＮＨＣＨ（Ｘ）ＣＨ₂ ＳＣＨ₂ ＣＯ−，−ＮＨＣ
Ｈ（Ｘ）ＣＨ₂ ＳＣＨ₂ ＣＯ（ε−Ｎ）Ｌｙｓ−，−ＮＨＣＨ（Ｘ）ＣＨ₂ −ス
クシニミジル（ε−Ｎ）Ｌｙｓ−及び−ＮＨＣＨ（Ｘ）ＣＨ₂ Ｓ−（スクシニミ
ジル）−から成る群から選ばれ； 各Ｔｈは独立してヘルパーＴ細胞エピトープを構成するアミノ酸の配列、又は
その免疫増強アナログもしくはセグメントであり； 「ＦＭＤＶ抗原」は更に以下に定義する合成ペプチド抗原であり； Ｘはアミノ酸α−ＣＯＯＨ又はα−ＣＯＮＨ₂ であり； ｎは０〜約１０であり； ｍは１〜約４であり；そして ｏは０〜約１０である）。 本発明のペプチド免疫原は、約３５〜約１００アミノ酸残基、好ましくは約４
５〜約９０アミノ酸残基、より好ましくは約５０〜約７５アミノ酸残基のペプチ
ドの免疫原を含んでなる。

【００６０】 Ａがアミノ酸であるとき、それは任意の天然に存在しないアミノ酸または任意
の天然に存在するアミノ酸であることができる。天然に存在しないアミノ酸は下
記のものを包含するが、これらに限定されない：β−アラニン、オルニチン、ノ
ルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、チロキシン、γ−アミノ酪酸、
ホモセリン、シトルリンおよびその他。天然に存在するアミノ酸は下記のものを
包含する：アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン
、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン
、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、ト
リプトファン、チロシンおよびバリン。そのうえ、ｍが１超であり、そして２以
上のＡがアミノ酸であるとき、各アミノ酸は独立して同一であるか、あるいは異
なることができる。

【００６１】 Ａがインベーシンドメインであるとき、それはエルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ
）種のインベーシンタンパク質からの免疫刺激性エピトープである。この免疫刺
激性は、Ｔ細胞、特に活性化された免疫または記憶Ｔ細胞上に存在するβ１イン
テグリン分子と相互作用するこのインベーシンドメインの能力から生ずる。β１
インテグリンと相互作用することが見出されたインベーシンドメインの特定の配
列は、Brett 他（Eur. J. Immunol., 1993）により記載された。プロミスカスＴ
ｈエピトープに対する結合についてのインベーシンドメイン（Ｉｎｖ）の好まし
い態様は、以前に米国特許第５，７５９，５５１号（これは引用することによっ
て本明細書の一部とされる）に記載された。Ｉｎｖドメインは配列Ｔｈｒ−Ａｌ
ａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈ
ｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）を
有するか、あるいは他のエルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）種のインベーシンタン
パク質中の対応する領域からのその免疫刺激性相同体である。こうして、このよ
うな相同体は、免疫刺激性を保持するかぎり、株の変動に適合するために、アミ
ノ酸残基の置換、欠失または挿入を含有することができる。 （Ａ）_n は好ましくはスペーサー、例えばＧｌｙ−Ｇｌｙを含み、それを通じ
てＩｎｖドメインはペプチドに連結される。好適な態様において、（Ａ）３は、
下記の順序において、インベーシンドメイン（Ｉｎｖ）、グリシンおよびグリシ
ン、即ち、（Ｉｎｖ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｙである。

【００６２】 Ｂはスペーサーであり、前述の天然に存在するか、あるいは天然に存在しない
アミノ酸であってよい。各Ｂは独立して同一であるか、あるいは異なる。Ｂのア
ミノ酸は、また、プロミスカスＴｈエピトープとＦＭＤＶ ＶＰ１抗原部位（例
えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜２１及び３５）又はその交差反応性および機能的
免疫学的アナログの間にスペーサー、例えば、Ｇｌｙ−Ｇｌｙを有することがで
きる。Ｇｌｙ−Ｇｌｙスペーサーは、ＴｈエピトープをＢ細胞エピトープから分
離することに加えて、ＴｈエピトープをＦＭＤＶ ＶＰ１抗原と結合し、これに
よりＴｈおよび／またはＢ細胞の応答間の干渉を排除することによってつくられ
た人工的二次構造を崩壊することができる。Ｂのアミノ酸配列は、また、Ｔｈお
よびＦＭＤＶ ＶＰ１標的抗原部位の分離を増強する柔軟なヒンジとして作用す
るスペーサーを形成することができる。柔軟なヒンジをコードする配列の例は、
免疫グロブリン重鎖のヒンジ領域の中に見出される。柔軟なヒンジ配列はしばし
ばプロリンに富んでいる。１つの特に有効な柔軟なヒンジは配列Ｐｒｏ−Ｐｒｏ
−Ｘａａ−Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｐｒｏ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）により提供さ
れ、ここでＸａａは任意のアミノ酸、好ましくはアスパラギン酸である。Ｂのア
ミノ酸により提供されるコンフォメーション分離は、提示されたペプチド免疫原
と適当なＴｈ細胞およびＢ細胞との間のいっそう効率よい相互作用を可能とし、
こうして、Ｔｈエピトープおよび抗体誘導エピトープに対する免疫応答を増強す
る。

【００６３】 ＴｈはＴｈエピトープを含んでなるアミノ酸配列（自然または非自然のアミノ
酸）である。Ｔｈエピトープは連続的または非連続的エピトープから成ることが
できる。それゆえ、Ｔｈのすべてのアミノ酸が必ずしもエピトープの一部である
必要はない。したがって、Ｔｈエピトープのアナログおよびセグメントを包含す
るＴｈエピトープは、ＦＭＤＶ ＶＰ１抗原部位（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１〜２１，３５）およびそれらの免疫学的機能性アナログに対する免疫応答を
増強または刺激することができる。免疫優性およびプロミスカスであるＴｈエピ
トープは、広く多様性のＭＨＣ型を有する動物およびヒトの集団において高度に
かつ広く反応性である（Partidos他、1991；米国特許第５，７５９，５５１号）
。主題のペプチドのＴｈドメインは、約１０〜約５０アミノ酸、好ましくは約１
０〜約３０アミノ酸を有する。多数のＴｈエピトープが存在するとき（すなわち
、ｍ≧２）、各Ｔｈエピトープは独立して同一であるか、あるいは異なる。Ｔｈ
セグメントは、ＦＭＤＶ ＶＰ１抗原部位に対する免疫応答を増強または刺激す
るために十分であるＴｈエピトープの連続的部分である。

【００６４】 本発明のＴｈエピトープには、限定することなく、外来病原体、例えばＨＢｓ Ｔｈ，ＨＢｃ Ｔｈ，ＰＴ Ｔｈ，ＴＴ Ｔｈ，ＭＶＦ Ｔｈ，ＣＴ Ｔｈ，
ＤＴ Ｔｈ，ＤＦ Ｔｈ，ＳＭ Ｔｈ及びＴｒａ Ｔｈ；ＦＭＤＶタンパク質由
来の自己Ｔｈ（表５、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）、デザイン化人工Ｔｈ
（例えば、表６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５，２６，２７，３６，３７及び３８
）、並びに免疫学的機能性Ｔｈアナログが挙げられる。免疫学的機能性Ｔｈアナ
ログには免疫増強アナログ、反応性アナログ及びこのようなＴｈエピトープの任
意のセグメントが挙げられる。免疫学的機能性Ｔｈアナログは好ましくは、Ｔｈ
エピトープのＴｈ刺激機能を本質的に改変しないＴｈエピトープ内の１〜約１０
個のアミノ酸残基の保存的置換、付加、欠失及び挿入を含む。

【００６５】 「ＦＭＤＶ ＶＰ１抗原部位」とはＦＭＤＶ Ａ₁₂株のＶＰ１タンパク質のア
ミノ酸１３４−１６８（即ち、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、及びＦＭＤＶ Ａ₁₂ 株のＶＰ１タンパク質のアミノ酸１３４−１６８と相同なＦＭＤＶ Ａ₁₂株以外
のＦＭＤＶ株のＶＰ１タンパク質のフラグメントであるペプチドを意味する。Ｆ
ＭＤＶ ＶＰ１抗原部位はＦＭＤＶ Ａ₁₂株のＶＰ１タンパク質のアミノ酸１３
４−１６８に対応する血清型Ａ，Ｏ又はアジアのＦＭＤＶ株のＶＰ１タンパク質
のアミノ酸配列に由来する共通配列を有するペプチド、並びにＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１４，１６，１８及び２０の一般定義に合うペプチドをも意味する。ＦＭＤ
Ｖ ＶＰ１抗原部位は本明細書において定義するＳＳＡＬの構成員であるペプチ
ドをも意味する。

【００６６】 本発明に係るＦＭＤＶ ＶＰ１抗原部位（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜２
１，３５）の反応性且つ免疫学的機能性アナログは更に、このペプチドアナログ
がＦＭＤＶ ＶＰ１抗原部位（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜２１及び３５）
と反応性な免疫応答を誘導できる限り、１〜約４個のアミノ酸残基の保存性置換
、付加、欠失又は挿入を含んで成ってよい。この保存性置換、付加及び挿入は本
明細書において定義する天然又は非天然アミノ酸により達成できる。

【００６７】 標的抗原部位は好ましくはＧ−Ｈループ領域の天然ＦＭＤＶ ＶＰ１配列のそ
れから１３４位の天然アスパラギン及び１５７位のグルタミンのシステインによ
る置換、並びにこれらのシステイン間でジスルフィド結合を形成して環式構造を
作ることにより修飾される（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）。このような環式構造は
単一ジスルフィドループ化構造が保存されている限り、ＶＰ１の１３４−１５７
セグメントのいずれかの末端からとった１〜１３個の追加のアミノ酸を更に含ん
で成ってよい（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）。天然配列からの修飾は表１の中では
（Ｎ→Ｃ）、（Ｑ→Ｃ）、（Ｒ→Ｃ）及び下線付きアミノ酸で示す。導入システ
インを含む配列はＳＳＡＬ、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５，１７及び１９と
して供することができ、そしてこれらのＳＳＡＬは同様にＦＭＤＶ ＶＰ１抗原
部位として利用されうる。

【００６８】 従って、本発明の好適なペプチド免疫原はＦＭＤＶ ＶＰ１抗原部位を含むペ
プチド（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜２１及び３５）又はその免疫学的機能
性アナログ及びＴｈペプチドを含むペプチドである。より好適なペプチド免疫原
はＦＭＤＶ ＶＰ１抗原部位又はその反応性且つ免疫学的機能性アナログ；スペ
ーサー（例えばＧｌｙ−Ｇｌｙ）；Ｔｈエピトープ、即ち、ＨＢｓ Ｔｈ，ＨＢ
ｃ Ｔｈ，ＭＶＦ Ｔｈ，ＰＴ Ｔｈ，ＴＴ Ｔｈ、自己ＦＭＤＶ Ｔｈ（例え
ばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）又は人工Ｔｈ（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５
，２６，３６，３７及び３８）、又はその類似体；並びに任意的にＩｎｖドメイ
ン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）又はそのアナログを含む構築体である。

【００６９】 主題のペプチド免疫原と２またはそれ以上のＴｈエピトープとの混合物を含有
するペプチド組成物は、より広い集団において免疫効率を増強することができ、
こうして、ＦＭＤＶ ＶＰ１抗原部位に対する改良された免疫応答を提供するこ
とができる。

【００７０】 本発明のペプチド免疫原は、当業者によく知られている化学的合成法により製
造することができる。例えば、下記の文献を参照のこと：Fields他、Chapter 3,
Synthetic Peptides : A User's Guide, Grant, W.H. 編、Freeman & Co., New
York, NY, 1992, p. 77。それゆえ、ｔ−ＢｏｃまたはＦｍｏｃ化学により保護
されたα−ＮＨ₂ を用いる固相合成の自動化メリフィールド（Merrifield）技術
に従い、例えば、アプライド・バイオシステムス（Applied Biosystems）ペプチ
ド合成装置４３０Ａまたは４３１で側鎖保護されたアミノ酸を使用して、ペプチ
ドを合成することができる。Ｂ及びＴ細胞エピトープのいずれかについての構築
合成抗原ライブラリー（ＳＳＡＬ）を含んで成るペプチド構築体の製造は所定の
可変位置に代替アミノ酸の混合物をそのデザインにおいて特定する適当な比率で
供与することにより成し遂げることができる。

【００７１】 所望のペプチド免疫原が組立てが完結した後、標準的手順に従い樹脂を処理し
た樹脂からペプチドを切断し、アミノ酸側鎖上の官能基を脱ブロックする。遊離
ペプチドをＨＰＬＣにより精製し、例えば、アミノ酸分析または配列決定により
生化学的に特性決定する。ペプチドを精製し、特性決定する方法は当業者によく
知られている。

【００７２】 ＶＰ１ Ｇ−ＨループおよびＴｈ部位を含有する本発明の合成ペプチド構築体
を作る他の化学的手段は、「チオエーテル」結合の形成によりハロアセチル化お
よびシステイン化ペプチドの結合を包含する。例えば、システインをＴｈ含有ペ
プチドのＣ末端に付加し、そしてシステインのチオール基を使用して、求電子性
基、例えば、ＦＭＤＶ ＶＰ１抗原部位（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜２
１）または交差反応性および機能的免疫学的アナログのＮ末端に結合したリシン
残基のＮ αクロロアセチル修飾またはマレイミド誘導化α−またはε−ＮＨ₂
基に対する共有結合を形成することができる。この方法において、Ｔｈ−（ＦＭ
ＤＶ ＶＰ１抗原部位）またはその逆方向（ＦＭＤＶ ＶＰ１抗原部位）−Ｔｈ
を有する構築体を得ることができる。

【００７３】 主題の免疫原をまた重合することができる。重合は、日常的方法に従い、例え
ば、免疫原を架橋剤と反応させることによって、例えば、グルタルアルデヒドを
リシン残基の−ＮＨ₂ 基と反応させることによって達成することができる。他の
方法に従い、合成免疫原、例えば、「Ａ−Ｔｈｍ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−（ＦＭＤＶ
ＶＰ１抗原部位）」を重合するか、あるいは合成免疫原のＮ末端に付加した追
加のシステインを利用することによって、他の免疫原と共重合させることができ
る。ハロアセチル修飾アミノ酸または分枝鎖状ポリ−リシルコア分子（例えば、
Ｋ₂ Ｋ，Ｋ₄ Ｋ₂ Ｋ，Ｋ₈ Ｋ₄ Ｋ₂ ）のＮ末端に結合されたリシン残基のマレイ
ミド誘導化α−ＮＨ₂ またはε−ＮＨ₂ 基と「チオエーテル」結合を形成するた
めに、Ｎ末端のシステインのチオール基を使用することができる。また、分枝鎖
状ポリ−リシルコア樹脂上に直接的に所望のペプチド構築体を合成することによ
って、分枝鎖状ポリマーとして、主題の免疫原を製造することができる（Wang他
、Science, 1991 ; 254 : 285-288)。

【００７４】 あるいは、より長い合成ペプチド免疫原をよく知られている組換えＤＮＡ技術
により合成することができる。分子クローニング技術に関する多数の標準的マニ
ュアルは、組換えＤＮＡおよびＲＮＡの発現により本発明のペプチドを製造する
詳細なプロトコルを提供する。本発明のペプチドをコードする遺伝子を構築する
ために、好ましくは遺伝子が発現される生物について最適化されたコドンを使用
して、アミノ酸配列を核酸配列に逆翻訳する。次に、典型的にはペプチドをコー
ドするオーバーラッピングオリゴヌクレオチドおよび必要な調節因子を合成する
ことによって、ペプチドをコードする遺伝子を作る。合成遺伝子を組立て、所望
の発現べクターの中に挿入する。本発明に含まれる合成核酸配列は、免疫学的に
機能的な相同体、およびそれによりコードされるペプチドの免疫原性を変更しな
い非コーディング配列の変化により特徴づけられる合成核酸構築体を包含する。
本発明のペプチドをコードする配列を含んでなる核酸もまた提供される。合成遺
伝子を適当なベクターの中に挿入し、組換え体を形成し、特性決定する。次いで
選択した発現系および宿主に適当な条件下に、ペプチドを発現させる。標準的方
法により、ペプチドを精製し、特性決定する。

【００７５】 本発明のペプチド組成物の効能は実施例に例示するように動物、例えばモルモ
ットやブタに免疫原（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７〜３４，３６）の製剤を
注射し、次いでＦＭＤＶ ＶＰ１の抗原部位（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜
２１，３５並びにその反応性且つ免疫学的機能性相同体）に対する体液性免疫応
答をモニターすることにより確立できる。

【００７６】 本発明の他の面は、薬学上許容されるデリバリーシステム中に免疫学的に有効
量の本発明の１またはそれ以上のペプチド免疫原を含んでなるペプチド組成物を
提供する。したがって、主題のペプチドは、アジュバント、薬学上許容される担
体、またはワクチン組成物において日常的に提供される他の成分を使用してワク
チン組成物として処方することができる。本発明において使用することができる
成分の例は、アジュバントまたは乳化剤、例えば、明礬、不完全フロインドアジ
ュバント、リポシン、サポニン、スクアレン、Ｌ１２１、エマルシゲン、モノホ
スホリル脂質Ａ（ＭＡＬ）、ＱＳ２１，ＩＳＡ５１，ＩＳＡ３５，ＩＳＡ２０６
、およびＩＳＡ７２０、ならびに他の既知の有効なアジュバントおよび乳化剤で
ある。処方物は、即時放出および／または持続放出、および全身的免疫の誘導お
よび／または局在化粘膜免疫の誘導のために処方することができ、これらは、例
えば、免疫原の捕捉または微小粒子との同時投与により達成することができる。
このような処方物は当業者により容易に決定され、そしてこのような処方物を製
造し、保存し、滅菌する方法はこの分野において知られている。本発明のワクチ
ンは、任意の好都合な経路、例えば、皮下、経口、筋肉内、または他の非経口ま
たは腸内経路により投与することができる。同様に、薬品は、単一の投与量また
は多数の投与量として投与することができる。当業者は免疫化のスケジュールを
容易に決定する。

【００７７】 本発明の核酸はそれら自体いわゆる「ＤＮＡワクチン」の成分として有効であ
る。本発明のこの態様において、本発明の免疫原性ペプチドの発現は、ペプチド
をコードする核酸を細胞の中に導入することによって、患者自身の細胞において
誘導される。ＤＮＡワクチンを製造し、使用する方法は、下記の文献に記載され
ている；米国特許第５，５８０，８５９号、米国特許第５，５８９，４６６号、
および米国特許第５，７０３，０５５号；また、ＷＯ９７／０２８４０号および
W. McDonnellおよびF. Askari, New Engl. J. Med., 1996, 334 : 2-45、これら
すべては引用することによって本明細書の一部とされる。このような本発明のペ
プチドおよびペプチドコンジュゲートを製造し、使用する方法は、本発明の範囲
内に包含される。 本発明のワクチン組成物は、有効量の１またはそれ以上の本発明のペプチド免
疫原と、薬学上許容される担体とを含有する。このような組成物は適当な投与単
位形態において一般に約０．５μｇ〜約１mgの免疫原／kg体重を含有する。多数
の投与回数で導入するとき、組成物は好都合には適当量／投与単位形態に分割す
ることができる。例えば、最初の投与量は、本発明のペプチド組成物として提供
される、例えば、０．２〜２．５mg、好ましくは１mgの免疫原の注射により、好
ましくは筋肉内注射として投与し、次いで反復（ブースター）投与する。投与は
、ワクチンおよび療法の分野においてよく知られているように、年齢、患者の体
重および一般的健康状態に依存するであろう。

【００７８】 O'Hagan 他（Vaccine, 1991 ; 9 : 768-771)が記載する生物分解性微小粒子の
中にまたはその上に捕捉させる導入により、ＦＭＤＶ ＶＰ１抗原部位に対する
免疫応答を改良することができる。免疫原を生物分解性の微小粒子の中にアジュ
バントの存在または非存在下にカプセル化して、免疫応答、例えば、局在化粘膜
免疫を増強し、そして持続したまたは周期的応答、経口投与、および局所投与の
ための時間調節的放出を提供することができる（O'Hagan 他、1991 ; Eldridge
他、Molec. Immunol., 1991 ; 28 : 287-294)。

【００７９】 かかるペプチド組成物はＦＭＤＶに対する中和抗体の誘導及びＦＭＤの予防又
は根絶のためのワクチンとして有用である。

【００８０】 特定のペプチド免疫原及び組成物は、本発明を例示するために下記の実施例に
おいて提供される。これらの実施例は例示のみを目的とし、本発明をいかなる方
法においても限定すると解釈すべきではない。

【００８１】 本実施例の標的抗原ペプチドは実施例１に概略する固相方法により合成した。
ＦＭＤＶ ＶＰ１抗原部位はその他のＦＭＤＶ血清型及びサブタイプ（例えばＳ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜７）由来のアナログ及びペプチド相同体並びに共通部位
（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８〜１３）及びＳＳＡＬペプチド（例えばＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１４〜２１及び３５）等の既知のウィルス単離体に適合させた線
形及び環化ペプチドにより例示する。このような実施例に用いた各ペプチドは免
疫原因子（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０〜３２）の間にＧｌｙ−Ｇｌｙスペ
ーサーを有するが、本発明のペプチドはその他のスペーサー（例えばＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：２３）を有しても、スペーサーを有しなくてもよい。Ｔｈには外来病
原体、例えばＢ型肝炎ウィルス及び本明細書に記載のその他に由来するプロミス
カスヘルパー部位、ＦＭＤＶ由来の自己Ｔｈ（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４
）、及び人工Ｔｈ（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５，２６、及び３６−３８）
が挙げられる。これらの実施例のペプチドは任意的な一般の免疫刺激部位（例え
ばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）も含む。

【００８２】 実施例１ 標的抗原ペプチドの評価のための典型的な手順 ＦＭＤＶ関連合成ペプチド ＶＰ１のＦＭＤＶ Ｇ−Ｈループドメイン由来の配列を有するペプチドをメリ
フィールド固相合成技術により、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ自動化
ペプチドシンセサイザー（モデル４３０，４３１及び４３３Ａ）でＦｍｏｃ化学
を利用して合成した。Ｂ又はＴ細胞エピトープのいずれかについての構築合成抗
原ライブラリー（ＳＳＡＬ）を含んで成るペプチド構築体、例えば「０ ＳＳＡ
Ｌ」（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）又は「１，４，９ ＰＡＬＩＮＤＲＯＭＩＣ
Ｔｈ」（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）の調製は、所定の可変位置でのカップリ
ングのための代替アミノ酸の混合物を表２，３，４，６、及び１０に示すように
ＳＳＡＬについてのデザイン式に特定する適当な比率で、又はデザイン式におい
て特定されていないときは等モル比で供与することにより行う。所望のペプチド
の組立ての完了後、樹脂をトリフルオロ酢酸を利用する標準の手順に従って処理
することで樹脂からペプチドを切断し、そしてアミノ酸側鎖上の保護基を脱ブロ
ッキングする。環式ペプチドの場合、切断したペプチドを１５％のＤＭＳＯ水溶
液に４８時間溶解しておいてシステイン間のジスルフィド間結合の形成を促進さ
せる。切断、抽出、洗浄ペプチドをＨＰＬＣにより精製し、そしてマススペクト
ル及び逆相ＨＰＬＣにより特性決定した。これらをワクチンの開発のための免疫
原として又は免疫動物から得た血清との反応性の評価のための抗原基質として使
用した。

【００８３】モルモット及びブタの免疫 ３匹のＤｕｎｃａｎ Ｈａｒｔｌｅｙモルモット（雌、生後９週、４５０ｇ、
無ウイルス）及びブタ（雌、生後９週）の実験動物を合成ＦＭＤＶ ＶＰ１標的
抗原ペプチド免疫原の免疫原性研究に用いた。各動物を０及び３週目に、特定の
アジュバント製剤に乳化された単独の標的抗原ペプチド又はその混合物のいずれ
かの本発明のペプチド組成物を含むＦＭＤＶワクチンの投与１回当り１００μｇ
で筋肉内免疫した。これらの動物から免疫原試験のために０，３，５、及び８又
は１０週目に採血を行った。

【００８４】免疫原性の評価 合成標的抗原ペプチド免疫原の免疫原性試験は固相抗原として標的中和部位だ
けを含む対応のＦＭＤＶ ＶＰ１標的抗原ペプチドを利用する合成ＦＭＤＶ Ｖ
Ｐ１ペプチドベースＥＬＩＳＡによる、系列希釈した実験動物血清を試験し、そ
して陽性力価をLog₁₀ 相互希釈率として示す。血清陽性サンプルをグループ毎に
プールし、そして免疫原性試験は下記のＦＭＤＶの様々な単離体に対する中和活
性の決定により行った。

【００８５】合成ＶＰ１（ＡＡ１３４−１６８）ペプチドベースＥＬＩＳＡ ペプチドベースＥＬＩＳＡは１０mLのＮａＨＣＯ₃ バッファー、pH９．５の中
の５μｇ／mLのＦＭＤＶ ＶＰ１部位ペプチドでウェル当り１００mLを利用して
３７℃で１ｈインキュベーションすることによりコーティングを施したペプチド
コート化９６穴プレートで行った。ペプチドコート化ウェルをＰＢＳ中の３重量
％のゼラチン２５０mLと３７℃で１ｈインキュベーションして非特異的タンパク
質結合部位をブロッキングし、０．０５容量％のＴＷＥＥＮ ２０を含むＰＢＳ
で３回洗浄し、そして乾かした。試験サンプルを何らかのことわりのない限り２
０容量％の正常ヤギ血清、１重量％のゼラチン及び０．０５容量％のＴＷＥＥＮ
を含むＰＢＳにより１：２０の希釈率に希釈した。１００mLの希釈サンプルを各
ウェルに加え、そして３７℃で１時間反応させた。次いでウェルをＰＢＳ中の０
．０５容量％のＴＷＥＥＮ ２０で６回洗って未結合のラベル化抗体を除去した
。ＰＢＳ中の１％容量％の正常ヤギ血清、０．０５容量％のＴＷＥＥＮ ２０中
の所定の最適希釈率の１００mLの西洋ワサビペルオキシダーゼラベル化ヤギ抗モ
ルモット又は抗ブタＩｇＧを各ウェルに加え、そして３７℃で１５分インキュベ
ーションした。これらのウェルを０．０５容量％のＴＷＥＥＮ ２０ ＰＢＳで
６回洗って未結合ラベル化抗体コンジュゲートを除去し、そして０．０４重量％
のオルトフェンレンジアミン（ＯＰＤ）及び０．１２容量％の過酸化水素クエン
酸ナトリウムバッファーpH５．０を含む基質溶液１００mLと１５分反応させた。
反応は１００mLの１．０ＭのＨ₂ ＳＯ₄ の添加により停止させ、そして４９２nm
（Ａ₄₉₂ ）の吸収を測定した。Log₁₀ で表示するＥＬＩＳＡ力価は吸収の縁形回
帰分析に基づき計算し、カットオフＡ₄₉₂ は０．５に設定した。

【００８６】ＦＭＤＶウィルス ＦＭＤＶの様々なウィルス（例えば血清型ＡのＡ₁₂及びＡ₂₄；血清型ＯのＯ₁
，Ｏ₂ 、等）をベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞の単層の中で塩殖させ、そ
してBrown and Cartwright（J Gen Microbiol, 1963;31:179-186）により本質的
に発表されているPlum Island Animal Disease Center, USDA（Greenport, NY）
の拘束の下で、１％のＳＤＳ又は１％のＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０のいずれかに
よるパレットの処理、しかる後の１５〜４５％のスクロース勾配を介する遠心分
離により、精製した。精製ウィルスのピークを各遠沈管内の中身を２６０nmに設
定した光度計のフローセルに通すことにより同定して単離した。

【００８７】ＦＭＤＶ中和活性の血清学的評価 ブタ（頭部大静脈）及びモルモット（心臓穿刺）から集めた血液由来の血清サ
ンプルを処理し、そして試験まで−２０℃で保存した。１：１００の希釈率の血
清サンプルにより中和されたウィルスの一覧は一連の仕込み量の塩加していくウ
ィルス負荷に基づく中和決定により、上記の通りに調製した様々な血清型のアリ
コート（１０，０００ＭＰＤ₅₀）を利用して成し遂げた。実施した試験方法によ
り（Morgan and Moore, Am J Vet Res, 1990;51-40-45）、１：１００の希釈率
において２．５ Log₁₀のＦＭＤＶマイクロプラークの低下を供するような血清を
生起した動物がＦＭＤＶ感染症に対して防御免疫であると高く予測される。

【００８８】 実施例２ 配列コンフォメーション及び免疫刺激因子によるＦＭＤＶ標的抗原ペプチドの 最適化 ７通りのＦＭＤＶ ＶＰ１血清型Ａペプチドが表７に記載されている。それら
の対応のＶＰ１アミノ酸配列をアライニングし、そして表１に番号付けした。こ
のグループのＴｈ担持ペプチドは下記の配列の表５に記載のＶＰ１ ２１−４０
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）として同定された自己ＦＭＤＶ Ｔｈを有する：
Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ
−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ａｒｇ
−Ｐｈｅ−Ｖａｌ(ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）。 Ｉｎｖはインベーシンドメイン配列である（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）。

【００８９】 表７の７つの構築体のうちの５つの配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１，２及び２
７〜２９に従って詳細する。これらのペプチドを合成し、そして免疫原性評価の
ために免疫血清を構築した。一次免疫の５週後に得た血清をペプチド−ＥＬＩＳ
ＡによりそのＦＭＤＶ ＶＰ１ペプチド反応性についてアッセイし、そして血清
型ＡのＦＭＤＶを中和する能力については標的ウィルスとして株Ａ_FPを利用する
標準ＦＭＤＶ中和アッセイによりアッセイした。

【００９０】 血清の効能は Log₁₀抗−ＦＭＤＶ ＶＰ１ ＥＬＩＳＡ力価及び１：１００の
血清希釈率で中和されたＦＭＤＶ Ａ_FP（ＭＰＤ₅₀）のLog₁₀で示す。

【００９１】結果： Ｔｈ及び環化なしのＡ₁₂（１３４−１５９）ペプチドｐ２２２８ａ及び環化な
しのｐ２２２９ｃはそれぞれ３匹の動物のうちの１匹及び３匹の動物のうちの１
匹において抗ペプチド抗体応答を誘導した。対照的に、長めのペプチドｐ２２２
４ａ，Ａ₁₂（１３４−１６９）及び長めの環化ペプチドは３匹の動物のうち３匹
において免疫原性であった。また、環化Ａ₁₂（１３４−１５９）ペプチドｐ２２
３３ｃは３匹のモルモットのうち３匹において免疫原性であった。免疫反応性血
清サンプルの間で、ＥＬＩＳＡ力価は７つのペプチド構築体全てについて似かよ
っていた。

【００９２】 しかしながら、血清中和活性による評価に従いペプチド構築体間で有意差が観
察され（表７に示す）、そしてｐ２２２８ａ＜ｐ２２２４ａ＜ｐ２２２９ｃ＜ｐ
２２２５ｃ＜ｐ２２２３ａ＜ｐ２２３６ｃと等級付けられる。

【００９３】 この中和効能の等級付けに基づき、以下の所見がＦＭＤＶ ＶＰ１抗原ペプチ
ドの最適化に関して引き出せる。 （１）１３４−１６９のＡＡ残基を包含する長めのペプチド構築体は高度な中
和効能を供し、それ故短めの配列（ＡＡ１３４−１５９）のそれよりも好ましい
（例えばｐ２２２４ａ＞ｐ２２２８ａ＞ｐ２２２５ｃ＞ｐ２２２９ｃ及びｐ２２
３６ｃ＞ｐ２２３３ｃ）； （２）人工環式合成構築体はより良いコンフォメーションを供し、それ故その
対応の非環式構築体よりも好ましい（例えば、ｐ２２２３ａ＞ｐ２２２９ｃ及び
ｐ２２３６ｃ＞ｐ２２２２５ｃ）； （３）免疫刺激因子を含む合成構築体はより高度な中和効能を供し、それ故そ
れのないものよりも好ましい（例えば、ｐ２２３６ｃ＞ｐ２２２３ａ＞ｐ２２２
９ｃ＞ｐ２２２８ａ；及びｐ２２２５ｃ＞ｐ２２２４ａ）。

【００９４】 実施例３ 広域ＦＭＤＶ中和を供するＶＰ１タンパク質の超可変領域についての共通配列 を採用する合成構築体 共通ＶＰ１標的抗原部位を採用する２つの合成環式構築体を表１に示す共通血
清型Ｏ配列に従ってデザインした（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）。一方の共通ペ
プチドをＩｎｖドメイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）及び表６に示す人工ＳＳ
ＡＬ Ｔｈ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）を含む免疫刺激因子で合成した。他方
は追加の免疫刺激配列抜きで合成した。これらＦＭＤＶ ＶＰ１構築体の全体構
造を表８ａにおけるｐ２５６９ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）及び表８ｂにお
けるｐ２５７０ｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）として示す。

【００９５】 一次免疫の３及び５週後の超免疫モルモットから得た血清をペプチド−ＥＬＩ
ＳＡによるそのＦＭＤＶ ＶＰ１ペプチド反応性並びに標的ウィルスとしてＡ_FP ，Ｏ−１Ｐ１，Ｏ−１Ｔａｉｗａｎ，Ｏ_Fran，Ｏ_Taiwan，Ｏ_Kanf及びアジア１を
利用する標準ＦＭＤＶ中和アッセイにより多数の血清型Ｏ，Ａ及びアジアのＦＭ
ＤＶを中和する能力について評価した。

【００９６】 １回の免疫の３週間後に高い抗−ＦＭＤＶ ＶＰ１ペプチド抗体力価が観察さ
れ、双方のＦＭＤＶ免疫原についての高い免疫能力が実証された。ところで、一
次免疫の３週後ほどの早期において認められる血清の高い中和活性並びに血清型
Ａ，Ｏ及びアジア間でのその特異性の幅は予想されないものである。かかる広域
な中和活性は不活性ウィルスストックから調製した最良のＦＭＤＶワクチンでさ
えもほとんど観察されなかった。

【００９７】 ＦＭＤＶ標的抗原ペプチドについての共通デザインは、反応性の広い中和活性
のＦＭＤＶワクチンの基礎を提供する。

【００９８】 実施例４ 向上したＦＭＤＶ ＶＰ１免疫原性及び広いＦＭＤＶ中和のための人工Ｔｈ及 びＳＳＡＬ標的抗原ペプチド ２つの標的抗原ペプチドｐ１５２２ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）及びｐ１
５９２ｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）をデザインした。各々は構築合成抗原ラ
イブラリー（ＳＳＡＬ）として調製したＦＭＤＶ標的抗原部位を有する。これら
２つのペプチドを表９に示す。ｐ１５２２ｂのＳＳＡＬ標的抗原部位（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：３１）は表３における血清型Ｏのサブタイプからコンパイリングし
たＧ−ＨループＶＰ１領域の完全代表物である。この標的抗原部位は表３にＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：１９で示す「Ｏ ＳＳＡＬ（ＣＯＭＰＬＥＴＥ）」配列に従っ
てデザインした。同様に、ｐ１５９２ｃは血清型アジアのサブタイプについて表
４に挙げるＧ−Ｈループ配列全てを代表するＳＳＡＬ標的抗原部位を含んで成る
。アジアについてのこのＳＳＡＬ部位は表４に「ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１」で
示す「ＡＳＩＡ ＳＳＡＬ」配列に従ってデザインした。表６の「Ｓｙｎ Ｔｈ
（１，２，４）」（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）で表示する人工Ｔｈは免疫原性
のために１５２２ｂ及び１５９２ｃに連結され、そしてＩｎｖ免疫刺激部位（Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）はｐ１５９２ｃにカップリングされている。

【００９９】 これら２つのＳＳＡＬ標的抗原ペプチドを合成し、そして上記の通りにして（
実施例１）３匹のモルモットのグループを超免疫するのに用いた。一次免疫して
５及び１０週後に得た血清をペプチド−ＥＬＩＳＡによりそのＦＭＤＶ ＶＰ１
ペプチド反応性について評価し、そして標的ウィルスとしてＦＭＤＶ株Ａ₁ ，Ａ
12_FP，Ａ_FL，Ａ₂₃，Ｏ−１_JH，Ｏ−１ｐ２及びアジア１を用いる標準ＦＭＤＶ中
和アッセイによる血清型Ｏ，Ａ及びアジアのＦＭＤＶを中和する能力について評
価した。結果を表９に示す。

【０１００】 標的抗原部位に対する高い抗ペプチド力価（＞５．０Log₁₀ ）が一次免疫の５
週後にｐ１５２２ｂ及びｐ１５９２ｃの双方により誘導された（早期採血は行わ
なかった）。３通りの血清型（即ち、Ａ，Ｏ及びアジア）に属する７つのＦＭＤ
Ｖ株全ての広く且つ有効なＦＭＤＶ中和が、このような株及び血清型間での配列
の大幅な変動にもかかわらず、双方の抗血清について観察された。これは可変性
の高い標的抗原／機能部位に対して特異的な合成ペプチドベースワクチンのデザ
インにおけるＳＳＡＬの有用性を実証する。

【０１０１】 ＦＭＤＶ標的抗原ペプチドについてのＳＳＡＬデザインは反応性の広い中和活
性のＦＭＤＶワクチンの基礎を供する。

【０１０２】 実施例５ 有効なＦＭＤＶ中和のための多重血清型混合物 合成ペプチドｐ１５２０ｂ，ｐ１５２２ｂ及びｐ１８８８ｂ（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：３３，３１及び３４）を有する３種のＳＳＡＬ標的抗原ペプチドの混合物
を表１０に記載する。この混合物は人工Ｔｈエピトープ「Ｓｙｎ Ｔｈ（１，２
，４）」（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）に連結した血清型Ａ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１５、表２）、血清型Ｏ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、表３）及び血清型ア
ジア（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５、表１０）を提示するＳＳＡＬ標的抗原部位を
含んで成る。この混合物を３匹のブタのグループの免疫に用いた。１００μｇの
用量を０週目にてフロインド完全アジュバントで、そして３週目にてフロインド
不完全アジュバントで３週間あけて投与した。一次免疫の後に得られる血清をＦ
ＭＤＶ ＶＰ１抗原部位についてペプチドＥＬＩＳＡ及び未知のＶＰ１配列の株
、即ち、最近発生したＯ１−Ｔａｉｗａｎを標的ウィルスとして採用するＦＭＤ
Ｖ中和アッセイにより免疫原性について評価した。３匹のブタは全て高い抗ペプ
チド反応性で免疫に応答した（３．７Log₁₀ の平均ＦＭＤＶ ＶＰ１ ＥＬＩＳ
Ａ力価）。ＦＭＤＶ Ｏ１−Ｔａｉｗａｎ ＶＰ１配列の未知の性質にもかかわ
らず、３匹の免疫宿主から得た１：１００に希釈したプール血清は４．５Log₁₀
の有意な中和活性を示した。この中和活性のレベルはＦＭＤＶ感染症の防御免疫
力を示唆する。ワクチンのＦＭＤＶ防御性の示唆についてのPlum Island Animal
Disease Center, USDA(Morgan and Moore, 1990)において蓄積した豊かな経験
に基づき、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで２Log₁₀ のＦＭＤＶ（ＭＰＤ₅₀）を中和
できる血清が種痘を施した宿主におけるＦＭＤＶ感染症の有効な防御と示唆され
る。

【０１０３】 この所見は本発明のペプチド組成物による種痘をワクチンの標的宿主の一つ、
ブタにおける感染症からの防御を相関させる。それは本発明のＦＭＤＶ ＶＰ１
ペプチド組成物の有効な万能ワクチンとして機能する能力（即ち、多数の血清型
の抗原変異性単離体に対して有効）を証明し、それは１９５０年代初期の不活性
化ＦＭＤＶワクチンの導入以来達成されていなかった成果である。

【０１０４】 実施例６ 免疫学的状態の評価のためのペプチド 本発明のペプチドはＦＭＤＭに対する曝露及び種痘についての状態のわかって
いる家畜の群の血清学的反応性の評価のためのＥＬＩＳＡ試験を組込んだ。使用
したペプチドは種痘に用いるＦＭＤＶ株の代表となるように選定し、そしてその
動物が曝露されうる圃場株と同一の血清型であると信じられている。

【０１０５】 診断試験のためのキットを実施例１の「合成ＶＰ１（ＡＡ１３４−１６８）ペ
プチドベースＥＬＩＳＡ」の章に記載の通りに準備して用いた。プレートを固相
抗原としての株Ｏ１ Ｃａｍｐｏｓ（ｐ２４６３＝ＡＡ１２８−１５８（Ｔ→Ｃ
）−１６９）及び株Ｏ１ Ｍａｎｉｓａ（ｐ２４６６＝ＡＡ１２８−１５８（Ｔ
→Ｃ）−１６９）に対応するＶＰ１ペプチドでコーティングした。これらのキッ
トは９ケ月前にＦＭＤの発症した国の家畜の群から集めた血清サンプルを試験す
るために用いた。家畜の群は「感染症と予測」及び「種痘による感染症と予測」
（発症した領域）、「種痘」及び「正常」（ＦＭＤＶのないものと信じられてい
る領域）の既知の状態により分類した。強力な反応性コントロールの吸収の０．
２倍のカットオブ値以上の吸収を示すサンプルを反応性と評価した。結果を表１
１に示す。

【０１０６】 これらの結果はペプチドベースＥＬＩＳＡに対する反応性が家畜群の曝露の指
標となることを示す。曝露された家畜群は約２０％の有意な反応性を示し、一方
正常な家畜群由来の動物は反応性を有さなかった。曝露された家畜群についての
２０％の反応性はこの試験を発症時に９ヶ月よりも近い時期に実施すればもっと
高いことがありうる。種痘を施した家畜群についての結果は驚くべき可変性の値
を示し、複数の供給者から得られる汎用のワクチンを利用する様々な種痘プログ
ラムの効能における高度な変動を反映する。

【０１０７】

【表１】

【０１０８】

【表２】

【０１０９】

【表３】

【０１１０】

【表４】

【０１１１】

【表５】

【０１１２】

【表６】

【０１１３】

【表７】

【０１１４】

【表８】

【０１１５】

【表９】

【０１１６】

【表１０】

【０１１７】

【表１１】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 ＦＭＤＶゲノムの構造、翻訳生成物がウィルスタンパク質へと切断されるプロ
セシング経路、並びにカスピド及び非構造タンパク質の命名を示す。

【図２Ａ】 構築合成抗原ライブラリー「Ａ ＳＳＡＬ（１）（完全）（１３４−１６９）
」のアミノ酸組成を示す。下記記号は対応の位置にある各アミノ酸の相対量を示
す。

【図２Ｂ】 構築合成抗原ライブラリー「Ａ ＳＳＡＬ（１）（完全）〔１３４（Ｎ→Ｃ）
−１５８（Ｑ→Ｃ）−１６９〕のアミノ酸組成を示す。

【図３Ａ】 構築合成抗原ライブラリー「Ａ ＳＳＡＬ（２）（完全）（１３４−１６９）
」のアミノ酸組成を示す。

【図３Ｂ】 構築合成抗原ライブラリー「Ａ ＳＳＡＬ（２）（完全）〔１３４（Ｎ→Ｃ）
−１５８（Ｑ→Ｃ）−１６９〕のアミノ酸組成を示す。

【図４Ａ】 構築合成抗原ライブラリー「Ｏ ＳＳＡＬ（完全）（１３４−１６９）」のア
ミノ酸組成を示す。

【図４Ｂ】 構築合成抗原ライブラリー「Ｏ ＳＳＡＬ（完全）〔１３４−１５８（Ｔ→Ｃ
）−１６９〕」のアミノ酸組成を示す。

【手続補正書】

【提出日】平成１３年８月２日（２００１．８．２）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，Ｚ Ｗ

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の群から選ばれるペプチド： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１； （ａ）ＦＭＤＶ Ａ₁₂株以外のＦＭＤＶ株のＶＰ１タンパク質のフラグメント
   であり、且つＦＭＤＶ Ａ₁₂株のＶＰ１タンパク質のアミノ酸１３４−１６８に
   対して相同性であるペプチド； （ｂ）血清型Ａ，ＯもしくはアジアのＦＭＤＶ株のＶＰ１タンパク質のアミノ
   酸配列に由来する共通配列を有し、ＦＭＤＶ Ａ₁₂株のＶＰ１タンパク質のアミ
   ノ酸１３４−１６８に対応するペプチド； （ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４，１６，１８及び２０の定義を満たすペプチ
   ド；及び （ｄ）（ｉ）〜（iv）に規定のペプチドであって、ＦＭＤＶ Ａ₁₂株のＶＰ１
   タンパク質のアミノ酸１３４及び１５７に対応する位置にあるアミノ酸がシステ
   インにより置き換えられているペプチド。
2. 【請求項２】 （ａ）請求項１記載のペプチドのアミノ酸配列及び（ｂ）ヘ
   ルパーＴ細胞エピトープ（Ｔｈ）のアミノ酸配列を含んで成るアミノ酸配列を有
   するペプチド。
3. 【請求項３】 （ａ）請求項２記載のペプチドのアミノ酸配列及び（ｂ）一
   般的な免疫刺激性配列のアミノ酸配列を含んで成るアミノ酸配列を有するペプチ
   ド。
4. 【請求項４】 ＦＭＤＶ Ａ₁₂株のＶＰ１タンパク質のアミノ酸１３４及び
   １５７に対応する位置にあるアミノ酸がシステインにより置き換えられている、
   請求項１記載のペプチド。
5. 【請求項５】 少なくとも一のペプチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２及びＦＭ
   ＤＶのその他の株に由来する相同配列から成る群から選ばれる、請求項４記載の
   ペプチド。
6. 【請求項６】 前記ペプチドが更にＶＰ１の１３４−１５７セグメントのい
   ずれかの末端に由来する１〜１３個の追加のアミノ酸を含んで成る、請求項４記
   載のペプチド。
7. 【請求項７】 少なくとも一のペプチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３及びＦＭ
   ＤＶのその他の株に由来する相同配列から成る群から選ばれる、請求項６記載の
   ペプチド。
8. 【請求項８】 前記ＦＭＤＶ ＶＰ１標的抗原部位がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
   １，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
   ５，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
   ８，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
   ：１１，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３，ＳＥＱ ＩＤ
   ＮＯ：２７，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９及びＳＥ
   Ｑ ＩＤ ＮＯ：３０から成る群から選ばれる、請求項１記載のペプチド。
9. 【請求項９】 構築合成抗原ライブラリーであって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
   １４，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６，ＳＥＱ ＩＤ
   ＮＯ：１７，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９，ＳＥＱ
   ＩＤ ＮＯ：２０，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５か
   ら成る群から選ばれる複数のペプチドを含んで成るライブラリー。
10. 【請求項１０】 次式により表わされるペプチドコンジュゲート： （Ａ）_n −（ＦＭＤＶ抗原）−（Ｂ）_o −（Ｔｈ）_m −Ｘ 又は （Ａ）_n −（Ｔｈ）_m −（Ｂ）_o −（ＦＭＤＶ抗原）−Ｘ 又は （ＦＭＤＶ抗原）−（Ｂ）_o −（Ｔｈ）_m −（Ａ）_n −Ｘ 又は （Ｔｈ）_m −（Ｂ）_o −（ＦＭＤＶ抗原）−（Ａ）_n −Ｘ （式中、 各Ａは独立してアミノ酸又は一般的な免疫刺激性配列であり、 各Ｂは独立してアミノ酸、 −ＮＨＣＨ（Ｘ）ＣＨ₂ ＳＣＨ₂ ＣＯ−， −ＮＨＣＨ（Ｘ）ＣＨ₂ ＳＣＨ₂ ＣＯ（ε−Ｎ）Ｌｙｓ−， −ＮＨＣＨ（Ｘ）ＣＨ₂ Ｓ−スクシニミジル（ε−Ｎ）Ｌｙｓ−及び −ＮＨＣＨ（Ｘ）ＣＨ₂ Ｓ−（スクシニミジル）− から成る群から選ばれ； 各Ｔｈは独立してヘルパーＴ細胞エピトープを構成するアミノ酸配列又はその
    免疫増強アナログもしくはセグメントであり； 「ＦＭＤＶ」抗原は （ｉ）請求項１記載のペプチドの配列並びに （ii）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５，ＳＥＱ ＩＤ
    ＮＯ：１６，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８，ＳＥＱ
    ＩＤ ＮＯ：１９，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１及
    びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５から成る群から選ばれるアミノ酸配列であり； Ｘはアミノ酸α−ＣＯＯＨ又はα−ＣＯＮＨ₂ であり； ｎは０〜約１０であり； ｍは１〜約４であり；そして ｏは０〜約１０である）。
11. 【請求項１１】 前記Ｔｈエピトープが公知のＦＭＤＶ Ｔｈ、外来病原体
    由来の公知のＴｈ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５，２６，３６及び３７、並びにそ
    の免疫刺激性アナログ又はセグメントから成る群から選ばれる請求項１０記載の
    ペプチド又はペプチドコンジュゲート。
12. 【請求項１２】 少なくとも一のＡがインベーシンドメイン（Ｉｎｖ）であ
    る、請求項１０記載のペプチド又はペプチドコンジュゲート。
13. 【請求項１３】 前記インベーシンドメインがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２並び
    にその免疫刺激性アナログ及びセグメントから成る群から選ばれる、請求項１２
    記載のペプチド又はペプチドコンジュゲート。
14. 【請求項１４】 少なくとも一のＢがＰｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｐｒｏ−Ｘ
    ａａ−Ｐｒｏ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）であり、ここでＸａａは任意のアミ
    ノ酸である、請求項１０記載のペプチド又はペプチドコンジュゲート。
15. 【請求項１５】 ｎが３であり、そして（Ａ）₃ が（インベーシンドメイン
    ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｙである、請求項１０記載のペプチド又はペプチドコンジュゲ
    ート。
16. 【請求項１６】 免疫学的に有効な量の１又は複数種の請求項１１記載のペ
    プチドと医薬的に許容される担体とを含んで成る医薬組成物。
17. 【請求項１７】 前記免疫学的に有効な量が一回の投与当り体重１kgにつき
    約０．５μｇ〜約１mgである、請求項１６記載の医薬組成物。
18. 【請求項１８】 少なくとも一のペプチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜２１
    及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５から成る群から選ばれる、請求項１６記載の医薬
    組成物。
19. 【請求項１９】 前記１又は複数種のペプチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜
    ２１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５から成る群から選ばれる、請求項１６記載の
    医薬組成物。
20. 【請求項２０】 哺乳動物において抗−ＦＭＤＶ抗体を誘導するための方法
    であって、当該動物に請求項１６記載の医薬組成物を当該動物において当該抗体
    が産生される時間及び条件下で投与することを含んで成る方法。
21. 【請求項２１】 前記哺乳動物がウシ、ブタ、ヒツジ及びヤギから成る群か
    ら選ばれる、請求項１９記載の方法。
22. 【請求項２２】 請求項１記載のペプチドをコードする配列を有する核酸。
23. 【請求項２３】 哺乳動物のＦＭＤＶ感染症を診断する方法であって、 （ａ）請求項１記載のペプチドを固相支持体に付加させ、 （ｂ）当該固相支持体に付加された前記ペプチドを前記哺乳動物由来の抗体を
    含むサンプルに、当該ペプチドに対する当該抗体の結合が誘導される条件下で曝
    露し、そして （ｃ）前記固相支持体に付加された前記ペプチドに結合した抗体の存在を検出
    する、 ことを含んで成る方法。