JP2002518008A - アンジオスタチン結合性タンパク質 - Google Patents
アンジオスタチン結合性タンパク質Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、アンジオスタチン受容体として作用しうるタンパク質の配列およびその核酸配列を提供する。本発明はまた、アンジオスタチンと同じ有利な抗血管新生特性を示す新規物質を創製するスクリーニング方法におけるそれらの使用に関する。
Description
【０００１】 （技術分野） 本発明は、血管新生の分野、より詳しくは、新規抗血管新生物質の開発につな
がりうるタンパク質およびペプチドなどの新規分子に関する。また、本発明は、
そのような物質を開発するための方法に関する。
がりうるタンパク質およびペプチドなどの新規分子に関する。また、本発明は、
そのような物質を開発するための方法に関する。
【０００２】 （背景） 哺乳動物の身体組織のほとんどすべては、非常に細い血管（それらの各々は人
毛より細い）の微細網状組織を含む。通常、血管を覆う内皮細胞の分裂は遅く、
実際には数年にわたるため、これらの血管の数もサイズも増加しない。例外は、
例えば、血管が急速に成長する創傷治癒および月経中である。しかしながら、そ
れは、限られた期間にわたるものであり、その後、細胞分裂は停止する。
毛より細い）の微細網状組織を含む。通常、血管を覆う内皮細胞の分裂は遅く、
実際には数年にわたるため、これらの血管の数もサイズも増加しない。例外は、
例えば、血管が急速に成長する創傷治癒および月経中である。しかしながら、そ
れは、限られた期間にわたるものであり、その後、細胞分裂は停止する。
【０００３】 既存の血管からの新たな血管の生成は血管新生と呼ばれる。血管新生は、癌お
よび腫瘍形成ならびに他の状態、例えば糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチおよ
び更にはいくつかの炎症状態に関連している。したがって、血管新生過程を妨げ
抑制する方法を見出すために、世界中でかなりの研究努力がなされている。これ
が可能になれば、腫瘍増殖が抑制され、前記状態に関する有用な療法が開発され
うるであろう。
よび腫瘍形成ならびに他の状態、例えば糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチおよ
び更にはいくつかの炎症状態に関連している。したがって、血管新生過程を妨げ
抑制する方法を見出すために、世界中でかなりの研究努力がなされている。これ
が可能になれば、腫瘍増殖が抑制され、前記状態に関する有用な療法が開発され
うるであろう。
【０００４】 腫瘍は、数mm3以上の塊にまで拡大するには血管のデノボ（de novo）合成に依
存することが、多数の証拠から示されている。血管新生は、腫瘍細胞により分泌
される因子により誘発される。腫瘍は、抑制解除されたタンパク質分解活性によ
り、抗血管新生活性を示すペプチド断片を生成することが、最近見出された。そ
の一例は、プラスミノーゲンの断片である分子アンジオスタチンである。
存することが、多数の証拠から示されている。血管新生は、腫瘍細胞により分泌
される因子により誘発される。腫瘍は、抑制解除されたタンパク質分解活性によ
り、抗血管新生活性を示すペプチド断片を生成することが、最近見出された。そ
の一例は、プラスミノーゲンの断片である分子アンジオスタチンである。
【０００５】 プラスミノーゲンは、活性化されて、血液凝固に関与する酵素であるプラスミ
ンまたはフィブリノリシンを形成する血漿内物質である。プラスミノーゲン自体
は、検出可能な抗血管新生活性を欠く。この内因性タンパク質の一部、より詳し
くは、最初の4個のクリングルドメインは、内皮細胞の分裂を妨げうることが見
出されている（Judah Folkmanら, Harvard Medical School, Boston）。プラス
ミノーゲンのこの部分はアンジオスタチンと称されており、この分野におけるか
なりの研究がこの分子の周辺に集中している。先行技術は、アンジオスタチンが
インビトロでは内皮細胞を特異的に阻害しインビボでは血管新生を阻止すること
を示している。アンジオスタチンの皮下注射による全身治療は、SCIDマウスの広
範囲の腫瘍におけるインビボでの休眠状態を誘導する（O'Reillyら, Nature Med
., vol.2, p.689, 1996）。何ヵ月もの治療の後でさえ、検出可能な毒性はこれ
らの動物において検出されていない。アンジオスタチンは、2つのレベルの特異
性を示す。すなわち、それは、インビトロにおいては、内皮細胞において特異的
にアポトーシスを誘導し（Claesson-Welshら, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, v
ol.95. p.5579, 1998）、インビボにおいては、血管新生において活性な内皮細
胞に影響を及ぼすにすぎない。確立された血管内の細胞に負の影響を及ぼすこと
は示されていない。
ンまたはフィブリノリシンを形成する血漿内物質である。プラスミノーゲン自体
は、検出可能な抗血管新生活性を欠く。この内因性タンパク質の一部、より詳し
くは、最初の4個のクリングルドメインは、内皮細胞の分裂を妨げうることが見
出されている（Judah Folkmanら, Harvard Medical School, Boston）。プラス
ミノーゲンのこの部分はアンジオスタチンと称されており、この分野におけるか
なりの研究がこの分子の周辺に集中している。先行技術は、アンジオスタチンが
インビトロでは内皮細胞を特異的に阻害しインビボでは血管新生を阻止すること
を示している。アンジオスタチンの皮下注射による全身治療は、SCIDマウスの広
範囲の腫瘍におけるインビボでの休眠状態を誘導する（O'Reillyら, Nature Med
., vol.2, p.689, 1996）。何ヵ月もの治療の後でさえ、検出可能な毒性はこれ
らの動物において検出されていない。アンジオスタチンは、2つのレベルの特異
性を示す。すなわち、それは、インビトロにおいては、内皮細胞において特異的
にアポトーシスを誘導し（Claesson-Welshら, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, v
ol.95. p.5579, 1998）、インビボにおいては、血管新生において活性な内皮細
胞に影響を及ぼすにすぎない。確立された血管内の細胞に負の影響を及ぼすこと
は示されていない。
【０００６】 アンジオスタチンは、特にそれが内因性物質である場合には、実際にいくつか
の有利な特性を示す。しかしながら、医学目的のその可能な用途に関連した欠点
を無視することはできない。1つは、その半減期が非常に短く、数時間以内と考
えられうるため、その投与を頻繁に行う必要があることである。これまでのとこ
ろ、その効率はかなり低いことが判明しており、このため、その高用量の使用が
必要となる。これらの2つの欠点は基本的には、より小さく及び／又はより効率
的な別の医薬用分子を見出すことに更なる研究を導く強い動機づけとなっている
。
の有利な特性を示す。しかしながら、医学目的のその可能な用途に関連した欠点
を無視することはできない。1つは、その半減期が非常に短く、数時間以内と考
えられうるため、その投与を頻繁に行う必要があることである。これまでのとこ
ろ、その効率はかなり低いことが判明しており、このため、その高用量の使用が
必要となる。これらの2つの欠点は基本的には、より小さく及び／又はより効率
的な別の医薬用分子を見出すことに更なる研究を導く強い動機づけとなっている
。
【０００７】 （発明の概要） 本発明は、「ABP-1」と称されるヒトタンパク質（これは、プラスミノーゲン
の断片、好ましくはその最初の4個のクリングルドメイン（K1〜K4）に対するそ
の結合能により定められ、該断片は抗血管新生生物活性により特徴づけられる）
を提供することにより、前記のアンジオスタチンに関する課題を解決するもので
ある。
の断片、好ましくはその最初の4個のクリングルドメイン（K1〜K4）に対するそ
の結合能により定められ、該断片は抗血管新生生物活性により特徴づけられる）
を提供することにより、前記のアンジオスタチンに関する課題を解決するもので
ある。
【０００８】 ABP-1は、配列番号2に示すアミノ酸配列に実質的に類似したアミノ酸配列を含
む。ABP-1の変異体および断片は本発明に含まれる。
む。ABP-1の変異体および断片は本発明に含まれる。
【０００９】 他の種、特に他の哺乳動物のABP-1ホモログも本発明に含まれる。
【００１０】 もう1つの態様において、本発明は、ABP-1をコードする又はABP-1に実質的に
類似したポリペプチド（その変異体、断片およびホモログを含む）をコードする
配列を含む単離された核酸分子を提供する。
類似したポリペプチド（その変異体、断片およびホモログを含む）をコードする
配列を含む単離された核酸分子を提供する。
【００１１】 配列番号1に由来する配列を有する核酸プローブを提供することが、本発明の
もう1つの目的である。これらのプローブは、例えば組織および細胞内でのABP-1
の生合成を検出し測定するための研究手段として及び診断方法において使用する
ことができる。
もう1つの目的である。これらのプローブは、例えば組織および細胞内でのABP-1
の生合成を検出し測定するための研究手段として及び診断方法において使用する
ことができる。
【００１２】 したがって、組織および細胞内のABP-1またはその変異体および断片の存在お
よび量を検出するための診断方法を提供することが、本発明の1つの目的である
。
よび量を検出するための診断方法を提供することが、本発明の1つの目的である
。
【００１３】 本発明はまた、ABP-1またはその変異体および断片と相互作用しうる化合物を
同定するためのスクリーニング方法を含む。該スクリーニング方法は、当業者に
よく知られたいずれの形態であってもよい。
同定するためのスクリーニング方法を含む。該スクリーニング方法は、当業者に
よく知られたいずれの形態であってもよい。
【００１４】 ABP-1またはその変異体および断片の生物活性をモジュレーションしうる、該
スクリーニング方法により同定された化合物を提供することが、本発明のもう1
つの目的である。
スクリーニング方法により同定された化合物を提供することが、本発明のもう1
つの目的である。
【００１５】 前記スクリーニング方法により同定された化合物を有効成分として含む医薬組
成物を提供することが、本発明のもう1つの目的である。
成物を提供することが、本発明のもう1つの目的である。
【００１６】 ABP-1またはその変異体および断片内に存在するエピトープに対する抗体なら
びに該抗体を産生する細胞を提供することが、本発明の更にもう1つの目的であ
る。
びに該抗体を産生する細胞を提供することが、本発明の更にもう1つの目的であ
る。
【００１７】 ABP-1またはその変異体および断片のヌクレオチド配列を含むベクターを提供
することが、本発明のもう1つの目的である。
することが、本発明のもう1つの目的である。
【００１８】 前記ベクターを含有する細胞を提供することが、本発明のもう1つの目的であ
る。
る。
【００１９】 定義 本出願においては、以下の用語を、以下に定義する意味で使用する。
【００２０】 本発明で用いる「血管新生」なる語は、組織または器官内への新たな血管の生
成を意味する。前記のとおり、正常な生理的条件下では、ヒトおよび動物は、非
常に特異的な限られた状況において血管新生を受けるにすぎない。例えば、血管
新生は、通常、創傷治癒、胎児および胚発生ならびに黄体および胎盤の形成にお
いて認められる。
成を意味する。前記のとおり、正常な生理的条件下では、ヒトおよび動物は、非
常に特異的な限られた状況において血管新生を受けるにすぎない。例えば、血管
新生は、通常、創傷治癒、胎児および胚発生ならびに黄体および胎盤の形成にお
いて認められる。
【００２１】 「内皮」なる語は、漿膜腔、リンパ管および血管を裏打ちする平坦な上皮細胞
の薄い層を意味する。「内皮抑制活性」なる語は、内皮毛細血管内皮細胞の増殖
を抑制する能力を意味する。
の薄い層を意味する。「内皮抑制活性」なる語は、内皮毛細血管内皮細胞の増殖
を抑制する能力を意味する。
【００２２】 「血管新生関連タンパク質」なる語は、血管新生において相互作用しうるタン
パク質（例えば、抗血管新生性物質に結合する受容体）を意味する。
パク質（例えば、抗血管新生性物質に結合する受容体）を意味する。
【００２３】 配列番号2、配列番号3および配列番号4のアミノ酸配列に関して用いる「実質
的に類似（している）」なる語は、あるアミノ酸配列が配列番号2、配列番号3お
よび配列番号4に対する高度の配列相同性を有することを意味する。高度の相同
性は、少なくとも約80％のアミノ酸相同性、好ましくは少なくとも約90％のアミ
ノ酸相同性、より好ましくは少なくとも約95％のアミノ酸相同性、最も好ましく
は少なくとも約98％のアミノ酸相同性を意味する。
的に類似（している）」なる語は、あるアミノ酸配列が配列番号2、配列番号3お
よび配列番号4に対する高度の配列相同性を有することを意味する。高度の相同
性は、少なくとも約80％のアミノ酸相同性、好ましくは少なくとも約90％のアミ
ノ酸相同性、より好ましくは少なくとも約95％のアミノ酸相同性、最も好ましく
は少なくとも約98％のアミノ酸相同性を意味する。
【００２４】 「特異的にハイブリダイズ（する）」なる語は、特定のヌクレオチド配列がDN
AまたはRNAの複雑な混合物（例えば、全細胞）中に存在する場合にはストリンジ
ェントな条件下、ある分子がその特定のヌクレオチド配列のみと結合し二本鎖形
成し又はハイブリダイズすることを意味する。「ストリンジェントな条件」なる
語は、プローブがその標的亜配列にハイブリダイズするがその他の配列にはハイ
ブリダイズしない条件を意味する。ストリンジェントな条件は配列依存的であり
、状況によって様々となるであろう。より長い配列は、より高い温度で特異的に
ハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、一定のイオン強度お
よびpHにおける該特異的配列の熱融解点（Tm）より約5℃低い温度に選ばれる。T
mは、該標的配列に相補的なプローブの50％が該標的配列に平衡状態にてハイブ
リダイズする温度（一定のイオン強度、pHおよび核酸濃度におけるもの）である
（該標的配列は一般には過剰に存在するため、Tmにおいては、該プローブの50％
が平衡状態において占拠されている）。典型的には、ストリンジェントな条件は
、pH7.0〜8.3で塩濃度が約1.0M未満のNaイオン濃度、典型的には約0.01〜1.0Mの
Naイオン（または他の塩）であり、温度が、短いプローブ（例えば、10〜50ヌク
レオチド）の場合には少なくとも約30℃、より長いプローブの場合には少なくと
も約60℃である条件となろう。ストリンジェントな条件は、不安定化剤（例えば
、ホルムアミド）の添加によっても達成されうる。
AまたはRNAの複雑な混合物（例えば、全細胞）中に存在する場合にはストリンジ
ェントな条件下、ある分子がその特定のヌクレオチド配列のみと結合し二本鎖形
成し又はハイブリダイズすることを意味する。「ストリンジェントな条件」なる
語は、プローブがその標的亜配列にハイブリダイズするがその他の配列にはハイ
ブリダイズしない条件を意味する。ストリンジェントな条件は配列依存的であり
、状況によって様々となるであろう。より長い配列は、より高い温度で特異的に
ハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、一定のイオン強度お
よびpHにおける該特異的配列の熱融解点（Tm）より約5℃低い温度に選ばれる。T
mは、該標的配列に相補的なプローブの50％が該標的配列に平衡状態にてハイブ
リダイズする温度（一定のイオン強度、pHおよび核酸濃度におけるもの）である
（該標的配列は一般には過剰に存在するため、Tmにおいては、該プローブの50％
が平衡状態において占拠されている）。典型的には、ストリンジェントな条件は
、pH7.0〜8.3で塩濃度が約1.0M未満のNaイオン濃度、典型的には約0.01〜1.0Mの
Naイオン（または他の塩）であり、温度が、短いプローブ（例えば、10〜50ヌク
レオチド）の場合には少なくとも約30℃、より長いプローブの場合には少なくと
も約60℃である条件となろう。ストリンジェントな条件は、不安定化剤（例えば
、ホルムアミド）の添加によっても達成されうる。
【００２５】 （発明の詳細な記載） 本発明は、プラスミノーゲンの断片（好ましくは、N末端断片、例えば、クリ
ングルドメイン1〜4および／またはクリングル5）に結合しうる単離されたヒト
血管新生関連タンパク質に関する。したがって、本発明のタンパク質は、プラス
ミノーゲン断片の受容体、特に、アンジオスタチンおよび／またはプラスミノー
ゲンクリングル5ドメインの受容体として作用する。本発明のタンパク質は、生
物学的または化学的方法（例えば、組換え遺伝子発現およびペプチド合成）によ
り合成することができる。組換え技術には、遺伝子クローニング、またはインビ
トロ法、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、リガーゼ連鎖反応（LCR）、転写
に基づく増幅系（TAS）またはセルフ・サステインド（self-sustained）配列複
製系（SSR）による増幅が含まれる。多種多様なクローニングおよびインビトロ
増幅方法が当業者によく知られている。これらの技術の具体例は、例えば、Berg
erおよびKimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymo
logy 152 Academic Press. Inc., San Diego, CA（Berger）に記載されている。
本発明は、配列番号2、配列番号3および配列番号4に示すアミノ酸配列に実質的
に類似したアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。入手可能なすべてのデータベ
ースに存在する配列と配列番号2のタンパク質配列との比較は、土壌線虫（Caeno
rhabditis elegans）の第3染色体の中央クラスターに位置する推定オープンリー
ディングフレームにコードされる該生物の仮想的タンパク質に対して23.7％の相
同性を示した（R. Wilsonら, Nature, vol.368, 1994年3月3日, 1994, p.32-38
に記載されている）。現在のところ、いずれの機能も、この仮想的タンパク質に
起因するとは考えられていない。
ングルドメイン1〜4および／またはクリングル5）に結合しうる単離されたヒト
血管新生関連タンパク質に関する。したがって、本発明のタンパク質は、プラス
ミノーゲン断片の受容体、特に、アンジオスタチンおよび／またはプラスミノー
ゲンクリングル5ドメインの受容体として作用する。本発明のタンパク質は、生
物学的または化学的方法（例えば、組換え遺伝子発現およびペプチド合成）によ
り合成することができる。組換え技術には、遺伝子クローニング、またはインビ
トロ法、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、リガーゼ連鎖反応（LCR）、転写
に基づく増幅系（TAS）またはセルフ・サステインド（self-sustained）配列複
製系（SSR）による増幅が含まれる。多種多様なクローニングおよびインビトロ
増幅方法が当業者によく知られている。これらの技術の具体例は、例えば、Berg
erおよびKimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymo
logy 152 Academic Press. Inc., San Diego, CA（Berger）に記載されている。
本発明は、配列番号2、配列番号3および配列番号4に示すアミノ酸配列に実質的
に類似したアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。入手可能なすべてのデータベ
ースに存在する配列と配列番号2のタンパク質配列との比較は、土壌線虫（Caeno
rhabditis elegans）の第3染色体の中央クラスターに位置する推定オープンリー
ディングフレームにコードされる該生物の仮想的タンパク質に対して23.7％の相
同性を示した（R. Wilsonら, Nature, vol.368, 1994年3月3日, 1994, p.32-38
に記載されている）。現在のところ、いずれの機能も、この仮想的タンパク質に
起因するとは考えられていない。
【００２６】 前記の定義によれば、配列番号2、3または4に対して少なくとも約80％の配列
相同性、好ましくは約90％の配列相同性、より好ましくは約95％の配列相同性、
最も好ましくは約98％の配列相同性を有するアミノ酸配列を有しプラスミノーゲ
ンの断片に結合しうるすべてのペプチドが本発明に含まれると意図されると理解
されるべきである。これらの変異形態は、例えば、選択的スプライシングまたは
差次的発現（同一起源生物の異なる組織におけるもの）から生じうる。該変異形
態は、例えば、アミノ酸の挿入、欠失または置換により特徴づけられうる。ABP-
1の好ましい変異形態を配列番号3に例示する（後記を参照されたい）。
相同性、好ましくは約90％の配列相同性、より好ましくは約95％の配列相同性、
最も好ましくは約98％の配列相同性を有するアミノ酸配列を有しプラスミノーゲ
ンの断片に結合しうるすべてのペプチドが本発明に含まれると意図されると理解
されるべきである。これらの変異形態は、例えば、選択的スプライシングまたは
差次的発現（同一起源生物の異なる組織におけるもの）から生じうる。該変異形
態は、例えば、アミノ酸の挿入、欠失または置換により特徴づけられうる。ABP-
1の好ましい変異形態を配列番号3に例示する（後記を参照されたい）。
【００２７】 本発明の特に好ましい実施形態は、ABP-1のアンジオスタチン結合ドメインを
含む後記で更に詳しく説明するBig-3と称されるABP-1の断片（配列番号4）であ
る。
含む後記で更に詳しく説明するBig-3と称されるABP-1の断片（配列番号4）であ
る。
【００２８】 もう1つの実施形態において、本発明は、配列番号2の少なくとも約5個、好ま
しくは少なくとも約10個の連続したアミノ酸残基を含むペプチドまたはそれらの
任意の変異体または断片を提供する。しかしながら、該ペプチドの最も有利なサ
イズは、その意図される将来的な用途に左右され、本発明は、前記のアミノ酸残
基数に限定されるものではない。
しくは少なくとも約10個の連続したアミノ酸残基を含むペプチドまたはそれらの
任意の変異体または断片を提供する。しかしながら、該ペプチドの最も有利なサ
イズは、その意図される将来的な用途に左右され、本発明は、前記のアミノ酸残
基数に限定されるものではない。
【００２９】 他の種、特に他の哺乳動物のABP-1およびBig-3のホモログも、本発明に含まれ
る。「ホモログ」なる語は、対応するアミノ酸配列間に存在する相同性とは無関
係に、本発明のタンパク質と実質的に同じ生物学的機能を発揮するタンパク質を
意味する。
る。「ホモログ」なる語は、対応するアミノ酸配列間に存在する相同性とは無関
係に、本発明のタンパク質と実質的に同じ生物学的機能を発揮するタンパク質を
意味する。
【００３０】 もう1つの態様において、本発明は、本発明のタンパク質およびペプチド（前
記の変異体、断片およびホモログを含む）をコードする配列を含む単離された核
酸分子に関する。好ましい実施形態においては、該核酸分子は配列番号1の配列
を有する。この配列は、5'（ヌクレオチド1〜ヌクレオチド796）および3'（ヌク
レオチド2825〜ヌクレオチド6463）非翻訳領域を有する。もう1つの好ましい実
施形態においては、該核酸分子は、配列番号1のヌクレオチド797〜ヌクレオチド
2824の配列を有する。もう1つの好ましい実施形態においては、該核酸配列は、B
ig-3（配列番号4に示す）と称されるABP-1断片をコードしており、それは、配列
番号1の2180位〜2608位のヌクレオチド配列を含む。本発明のポリペプチドをコ
ードしており遺伝暗号の縮重により配列番号1またはその断片とは異なるヌクレ
オチド配列はすべて、本発明の一部とみなされる。配列決定分析は、配列番号1
のコドン1199-1201における可能な多型の存在を示した。この場合、Asn、Serま
たはAspのコドンが存在することが可能であり、配列番号1のヌクレオチド1238-1
246位に対応するもう1つの領域は、トリペプチドGlu-Leu-Alaまたはトリペプチ
ドThr-Trp-Proをコードすることが判明している。本発明のもう1つの好ましいタ
ンパク質を構成するABP-1のアミノ酸配列内のこれらの変異を配列番号3に示す。
また、ABP-1のホモログをコードするヌクレオチド分子またはその断片も本発明
に含まれる。
記の変異体、断片およびホモログを含む）をコードする配列を含む単離された核
酸分子に関する。好ましい実施形態においては、該核酸分子は配列番号1の配列
を有する。この配列は、5'（ヌクレオチド1〜ヌクレオチド796）および3'（ヌク
レオチド2825〜ヌクレオチド6463）非翻訳領域を有する。もう1つの好ましい実
施形態においては、該核酸分子は、配列番号1のヌクレオチド797〜ヌクレオチド
2824の配列を有する。もう1つの好ましい実施形態においては、該核酸配列は、B
ig-3（配列番号4に示す）と称されるABP-1断片をコードしており、それは、配列
番号1の2180位〜2608位のヌクレオチド配列を含む。本発明のポリペプチドをコ
ードしており遺伝暗号の縮重により配列番号1またはその断片とは異なるヌクレ
オチド配列はすべて、本発明の一部とみなされる。配列決定分析は、配列番号1
のコドン1199-1201における可能な多型の存在を示した。この場合、Asn、Serま
たはAspのコドンが存在することが可能であり、配列番号1のヌクレオチド1238-1
246位に対応するもう1つの領域は、トリペプチドGlu-Leu-Alaまたはトリペプチ
ドThr-Trp-Proをコードすることが判明している。本発明のもう1つの好ましいタ
ンパク質を構成するABP-1のアミノ酸配列内のこれらの変異を配列番号3に示す。
また、ABP-1のホモログをコードするヌクレオチド分子またはその断片も本発明
に含まれる。
【００３１】 本発明は更に、ストリンジェントな条件下で前記の本発明の核酸分子のいずれ
かに特異的にハイブリダイズしうる核酸を含む。
かに特異的にハイブリダイズしうる核酸を含む。
【００３２】 本発明の核酸をプローブとして使用する場合には、検出可能なマーカーで該配
列を標識するのが望ましいことが多い。そのようなマーカーは、分光学的、光化
学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的手段により検出可能
な任意の組成物を含みうる。該マーカーは、当業者によく知られた多数の手段の
いずれかにより組込まれうる。また、そのようなマーカーの検出方法は、当業者
によく知られており、文献に開示されている。該プローブは、診断用途、例えば
、組織および細胞内のABP-1の生合成の検出および測定に有用である。
列を標識するのが望ましいことが多い。そのようなマーカーは、分光学的、光化
学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的手段により検出可能
な任意の組成物を含みうる。該マーカーは、当業者によく知られた多数の手段の
いずれかにより組込まれうる。また、そのようなマーカーの検出方法は、当業者
によく知られており、文献に開示されている。該プローブは、診断用途、例えば
、組織および細胞内のABP-1の生合成の検出および測定に有用である。
【００３３】 もう1つの態様において、本発明は、アンジオスタチンおよび／またはクリン
グル5と同じ特性を示す分子に関してスクリーニングするスクリーニング方法ま
たはアッセイを提供する。典型的なスクリーニング方法においては、アンジオス
タチンシグナル伝達経路を活性化しうる化合物を、細胞に基づくハイスループッ
ト・スクリーニングにより同定する。そのようなスクリーニングは、アンジオス
タチン応答細胞系内に安定にトランスフェクトされたアンジオスタチン応答要素
に駆動されるレポーター遺伝子に基づく。該応答要素はレポーター遺伝子（例え
ば、ルシフェラーゼ遺伝子）に結合しており、本発明のタンパク質に該化合物が
結合すると、細胞内経路が活性化されて、検出されうるレポーター遺伝子活性が
増加する。
グル5と同じ特性を示す分子に関してスクリーニングするスクリーニング方法ま
たはアッセイを提供する。典型的なスクリーニング方法においては、アンジオス
タチンシグナル伝達経路を活性化しうる化合物を、細胞に基づくハイスループッ
ト・スクリーニングにより同定する。そのようなスクリーニングは、アンジオス
タチン応答細胞系内に安定にトランスフェクトされたアンジオスタチン応答要素
に駆動されるレポーター遺伝子に基づく。該応答要素はレポーター遺伝子（例え
ば、ルシフェラーゼ遺伝子）に結合しており、本発明のタンパク質に該化合物が
結合すると、細胞内経路が活性化されて、検出されうるレポーター遺伝子活性が
増加する。
【００３４】 本明細書に記載のスクリーニング方法により同定された化合物は、本発明の範
囲内に含まれる。そのような化合物は、好ましくは、ペプチドまたは非ペプチド
性の低分子量分子である。それらは小さなサイズを有するため、医学目的の用途
には、アンジオスタチンより実用的である。これらの分子およびそれらの用途を
、後記で更に詳しく説明する。
囲内に含まれる。そのような化合物は、好ましくは、ペプチドまたは非ペプチド
性の低分子量分子である。それらは小さなサイズを有するため、医学目的の用途
には、アンジオスタチンより実用的である。これらの分子およびそれらの用途を
、後記で更に詳しく説明する。
【００３５】 本発明のタンパク質およびペプチドは、標準的な化学ペプチド合成技術を用い
て合成することができる。固相合成に関しては、例えば、BaranyおよびMerrifie
ld, Solid-Phase Peptide Synthesis, The Peptideのpp 3-284: Analysis, Synt
hesis Biology, Vol.2: Special Methods in Peptide Synthesis, Part Aを参照
されたい。
て合成することができる。固相合成に関しては、例えば、BaranyおよびMerrifie
ld, Solid-Phase Peptide Synthesis, The Peptideのpp 3-284: Analysis, Synt
hesis Biology, Vol.2: Special Methods in Peptide Synthesis, Part Aを参照
されたい。
【００３６】 好ましくは、本発明のタンパク質、ペプチドおよびポリペプチドは、組換えDN
A法を用いて合成する。該方法は、一般には、該タンパク質またはペプチドをコ
ードするDNA配列を調製し、特定のプロモーターの制御下で発現カセット内に該D
NAを配置し、該タンパク質またはペプチドを宿主内で発現させ、該発現タンパク
質またはペプチドを単離し、必要に応じて、該産物を再生させることを含む。発
現されたら、該組換えペプチドまたはタンパク質を、当技術分野における標準的
な方法に従い精製することができる。したがって、本発明のもう1つの態様は、
本発明の核酸を含むベクター（例えば、ウイルスまたはプラスミド）である。さ
らに、本発明はまた、本タンパク質またはペプチドを発現するベクターで形質転
換またはトランスフェクトされた組換え細胞、および後記で更に詳しく説明する
抗体を発現する組換え細胞を含む。本発明のペプチドおよびタンパク質をコード
するベクターは、抗体産生用の免疫原を与える分子の発現に有用である。また、
本発明のベクターは、本ペプチドおよびタンパク質を発現させるためにインビト
ロまたはインビボで細胞を形質転換するのに有用である。本核酸（例えば、配列
番号1で定義される遺伝子）のいずれかを発現する細胞は、多種多様な状況で使
用することができ、また、本発明の範囲内に含まれる。そのような細胞は真核性
であっても原核性であってもよい。
A法を用いて合成する。該方法は、一般には、該タンパク質またはペプチドをコ
ードするDNA配列を調製し、特定のプロモーターの制御下で発現カセット内に該D
NAを配置し、該タンパク質またはペプチドを宿主内で発現させ、該発現タンパク
質またはペプチドを単離し、必要に応じて、該産物を再生させることを含む。発
現されたら、該組換えペプチドまたはタンパク質を、当技術分野における標準的
な方法に従い精製することができる。したがって、本発明のもう1つの態様は、
本発明の核酸を含むベクター（例えば、ウイルスまたはプラスミド）である。さ
らに、本発明はまた、本タンパク質またはペプチドを発現するベクターで形質転
換またはトランスフェクトされた組換え細胞、および後記で更に詳しく説明する
抗体を発現する組換え細胞を含む。本発明のペプチドおよびタンパク質をコード
するベクターは、抗体産生用の免疫原を与える分子の発現に有用である。また、
本発明のベクターは、本ペプチドおよびタンパク質を発現させるためにインビト
ロまたはインビボで細胞を形質転換するのに有用である。本核酸（例えば、配列
番号1で定義される遺伝子）のいずれかを発現する細胞は、多種多様な状況で使
用することができ、また、本発明の範囲内に含まれる。そのような細胞は真核性
であっても原核性であってもよい。
【００３７】 本発明のタンパク質およびペプチドは、それらに対する抗体を産生させるため
の抗原として使用することができる。したがって、本発明はまた、本発明のペプ
チドに特異的に結合する抗体を含む。そのような抗体は、ペプチドまたはポリペ
プチドの単離のためのイムノアッセイに有用である。本発明のペプチドは、増幅
特異的アッセイ、免疫学的アッセイなどのアッセイにおいても使用することがで
きる。
の抗原として使用することができる。したがって、本発明はまた、本発明のペプ
チドに特異的に結合する抗体を含む。そのような抗体は、ペプチドまたはポリペ
プチドの単離のためのイムノアッセイに有用である。本発明のペプチドは、増幅
特異的アッセイ、免疫学的アッセイなどのアッセイにおいても使用することがで
きる。
【００３８】 本発明の抗体はモノクローナルであってもポリクローナルであってもよく、そ
れらの天然に存在する（完全長）形態および組換え形態の両方における個体変異
体、対立遺伝子変異体、株または種変異体またはその断片を含む。したがって、
該抗体は、本ペプチドまたはポリペプチドに対して、それらの天然立体配置また
は非天然立体配置におけるものとして産生される。抗イディオタイプ抗体を産生
させることもできる。抗体の多数の製造方法が当業者に公知である。モノクロー
ナル抗体の製造技術に関しては、例えば、Stiitesら(編), Basic and Clinical
Immunology (第4版), Lange Medical Publications, Los Altos, CAおよびこれ
に引用されている参考文献を参照されたい。ファージまたは同様のベクターにお
ける組換え抗体のライブラリーの選択に関連した技術に関しては、例えば、Huse
ら (1989) Science 246:1275-1281を参照されたい。
れらの天然に存在する（完全長）形態および組換え形態の両方における個体変異
体、対立遺伝子変異体、株または種変異体またはその断片を含む。したがって、
該抗体は、本ペプチドまたはポリペプチドに対して、それらの天然立体配置また
は非天然立体配置におけるものとして産生される。抗イディオタイプ抗体を産生
させることもできる。抗体の多数の製造方法が当業者に公知である。モノクロー
ナル抗体の製造技術に関しては、例えば、Stiitesら(編), Basic and Clinical
Immunology (第4版), Lange Medical Publications, Los Altos, CAおよびこれ
に引用されている参考文献を参照されたい。ファージまたは同様のベクターにお
ける組換え抗体のライブラリーの選択に関連した技術に関しては、例えば、Huse
ら (1989) Science 246:1275-1281を参照されたい。
【００３９】 本発明の分子は、特に、血管新生関連障害の治療および／または予防のために
医薬製剤中で使用することができる。したがって、本発明は、医薬として使用す
るためのペプチド、ポリペプチド、タンパク質または抗体に関する。また、本発
明は、血管新生関連疾患または障害に対する医薬の製造における該分子の使用に
関する。本発明はまた、本発明の分子と医薬上許容される担体とを含んでなる医
薬製剤に関する。本発明の医薬として使用する分子は、前記の任意のペプチド、
ポリペプチド、タンパク質または抗体、ならびにそれを使用する及び前記のスク
リーニング法において同定された任意の新規物質であってもよい。
医薬製剤中で使用することができる。したがって、本発明は、医薬として使用す
るためのペプチド、ポリペプチド、タンパク質または抗体に関する。また、本発
明は、血管新生関連疾患または障害に対する医薬の製造における該分子の使用に
関する。本発明はまた、本発明の分子と医薬上許容される担体とを含んでなる医
薬製剤に関する。本発明の医薬として使用する分子は、前記の任意のペプチド、
ポリペプチド、タンパク質または抗体、ならびにそれを使用する及び前記のスク
リーニング法において同定された任意の新規物質であってもよい。
【００４０】 したがって、本分子の最も好ましい用途は、新規物質に関してスクリーニング
するアッセイにおけるものである。アンジオスタチンおよび／またはクリングル
5と同様の血管新生作用を示すがアンジオスタチンより小さくかつ有効であり、
好ましくは、ヒトまたは動物の体内で、より長い半減期を示す化合物を同定する
ことができる。より短い半減期は、プロテアーゼにより分解される傾向が、より
低いことによるものであるかもしれない。ある有機化合物を設計する場合に、本
発明の分子は「リード」化合物として使用される。公知の医薬上活性な化合物の
模擬体の設計は、そのような「リード」化合物に基づく医薬の開発においてよく
知られたアプローチである。模擬体の設計、合成および試験は、一般には、目的
とする特性に関して多数の分子をランダムにスクリーニングすることを回避する
ために用いられる。
するアッセイにおけるものである。アンジオスタチンおよび／またはクリングル
5と同様の血管新生作用を示すがアンジオスタチンより小さくかつ有効であり、
好ましくは、ヒトまたは動物の体内で、より長い半減期を示す化合物を同定する
ことができる。より短い半減期は、プロテアーゼにより分解される傾向が、より
低いことによるものであるかもしれない。ある有機化合物を設計する場合に、本
発明の分子は「リード」化合物として使用される。公知の医薬上活性な化合物の
模擬体の設計は、そのような「リード」化合物に基づく医薬の開発においてよく
知られたアプローチである。模擬体の設計、合成および試験は、一般には、目的
とする特性に関して多数の分子をランダムにスクリーニングすることを回避する
ために用いられる。
【００４１】 したがって、そのような新規分子は、好ましくは、アンジオスタチンよりはる
かに低い用量で投与されうる医薬として、およびより低い頻度、例えば、14日に
1回（これは、約10倍短いアンジオスタチンの半減期と比較される）で投与され
うる医薬として使用する。特定の実施形態において、本発明のスクリーニング法
により同定される新規分子は低分子量の有機分子であり、この場合、その医薬製
剤は経口摂取用に（例えば、錠剤として）製造することができる。
かに低い用量で投与されうる医薬として、およびより低い頻度、例えば、14日に
1回（これは、約10倍短いアンジオスタチンの半減期と比較される）で投与され
うる医薬として使用する。特定の実施形態において、本発明のスクリーニング法
により同定される新規分子は低分子量の有機分子であり、この場合、その医薬製
剤は経口摂取用に（例えば、錠剤として）製造することができる。
【００４２】 しかしながら、本発明の医薬製剤は、任意の投与経路（例えば、経口、静脈内
、皮膚または皮下、鼻腔内、筋肉内または腹腔内）用に製造することができる。
担体または他の成分の性質は、具体的な投与経路に左右されるであろう（この場
合に有用な技術およびプロトコールの具体例は、とりわけ、Remington's Pharma
ceutical Sciences, 第16版, Osol, A (編), 1980に記載されている）。
、皮膚または皮下、鼻腔内、筋肉内または腹腔内）用に製造することができる。
担体または他の成分の性質は、具体的な投与経路に左右されるであろう（この場
合に有用な技術およびプロトコールの具体例は、とりわけ、Remington's Pharma
ceutical Sciences, 第16版, Osol, A (編), 1980に記載されている）。
【００４３】 これらの低分子量化合物の投与量は、治療すべき病態または状態および他の臨
床的因子、例えば、ヒトまたは動物の体重および状態、および該化合物の投与経
路に左右されるであろう。ヒトまたは動物の治療には、約0.5mg/Kg体重〜500mg/
Kg体重の該化合物を投与することができる。
床的因子、例えば、ヒトまたは動物の体重および状態、および該化合物の投与経
路に左右されるであろう。ヒトまたは動物の治療には、約0.5mg/Kg体重〜500mg/
Kg体重の該化合物を投与することができる。
【００４４】 本化合物および方法は、あらゆる種類の血管新生関連障害および／または疾患
、例えば、腫瘍状態、糖尿病、慢性関節リウマチ、および更にはいくつかの炎症
疾患、例えば乾癬、慢性腸炎、喘息などに関して有利に使用される。また、それ
らは、肥満の処置および治療または予防に使用しうると示唆される。
、例えば、腫瘍状態、糖尿病、慢性関節リウマチ、および更にはいくつかの炎症
疾患、例えば乾癬、慢性腸炎、喘息などに関して有利に使用される。また、それ
らは、肥満の処置および治療または予防に使用しうると示唆される。
【００４５】 特定の実施形態において、本分子は遺伝子治療に使用される。遺伝子治療法の
総説としては、例えば、Anderson. Science (1992) 256:808-813を参照されたい
。
総説としては、例えば、Anderson. Science (1992) 256:808-813を参照されたい
。
【００４６】 本発明のもう1つの有利な用途は、体内の本アンジオスタチンおよび／または
クリングル5受容体のシグナリングの調節方法の開発である。したがって、本発
明はまた、血管新生関連疾患または障害に罹患したヒトまたは動物患者の治療方
法、およびそのような状態の予防方法に関する。
クリングル5受容体のシグナリングの調節方法の開発である。したがって、本発
明はまた、血管新生関連疾患または障害に罹患したヒトまたは動物患者の治療方
法、およびそのような状態の予防方法に関する。
【００４７】 実験 以下、図面を参照して本発明を更に詳しく開示する。
【００４８】 本開示および前記におけるすべての参照文献を参照により本出願に組み入れる
こととする。
こととする。
【００４９】 アンジオスタチンが内皮細胞に結合するという証拠 アンジオスタチンと血管新生因子VEGFおよびbFGFとの間の競合結合アッセイに
より、本発明者らは、アンジオスタチンがこれらの分子のリガンド受容体相互作
用に影響を及ぼさないことを示している。未標識アンジオスタチンの存在下また
は不存在下で同レベルの結合が検出されうるであろう。したがって、アンジオス
タチンが血管新生因子と内皮細胞との相互作用を遮断することにより作用するこ
とは除外することができる。
より、本発明者らは、アンジオスタチンがこれらの分子のリガンド受容体相互作
用に影響を及ぼさないことを示している。未標識アンジオスタチンの存在下また
は不存在下で同レベルの結合が検出されうるであろう。したがって、アンジオス
タチンが血管新生因子と内皮細胞との相互作用を遮断することにより作用するこ
とは除外することができる。
【００５０】 アンジオスタチンおよびその前駆体プラスミノーゲンの直接的結合を、ヨウ素
化タンパク質を使用しウシ微小毛細血管（microcapillary）内皮細胞とのそれら
の相互作用を分析する結合アッセイにより研究した。図1を参照されたい。
化タンパク質を使用しウシ微小毛細血管（microcapillary）内皮細胞とのそれら
の相互作用を分析する結合アッセイにより研究した。図1を参照されたい。
【００５１】 特に、ヒトアンジオスタチン（クリングルドメイン1〜4）またはプラスミノー
ゲンを、製造業者（Pierce Inc.）のプロトコールに従うIodogen法によりヨウ素
125で標識した。ついで該標識タンパク質をG50セファロースカラム（Pharmacia
Inc.）上で精製した。該比活性は90000cpm/ngタンパク質と見積もられた。結合
アッセイのために、12ウェルプレート内でウシ毛細血管内皮細胞をコンフルエン
トになるまで増殖させた。該細胞を、1mg/mlのウシ血清アルブミン（BSA）を含
有するPBSで洗浄した。ついで該細胞を10ng/mlの放射能標識アンジオスタチンま
たはプラスミノーゲンと共にインキュベートした。該結合を、次第に増加する濃
度の未標識リガンドと競合させた。細胞を氷上で2時間インキュベートした。つ
いで細胞をPBS+1mg/ml BSAと共に5回洗浄した。該細胞をPBS中の1％ Triton X10
0で溶解し、放射能をガンマカウンターで測定した。解離定数および受容体数を
、RBINDINGプログラム（van Zoelen EJ. Anal. Biochem. 1992 1992年2月1日 :2
00 (2): 393-9）を使用して評価した。
ゲンを、製造業者（Pierce Inc.）のプロトコールに従うIodogen法によりヨウ素
125で標識した。ついで該標識タンパク質をG50セファロースカラム（Pharmacia
Inc.）上で精製した。該比活性は90000cpm/ngタンパク質と見積もられた。結合
アッセイのために、12ウェルプレート内でウシ毛細血管内皮細胞をコンフルエン
トになるまで増殖させた。該細胞を、1mg/mlのウシ血清アルブミン（BSA）を含
有するPBSで洗浄した。ついで該細胞を10ng/mlの放射能標識アンジオスタチンま
たはプラスミノーゲンと共にインキュベートした。該結合を、次第に増加する濃
度の未標識リガンドと競合させた。細胞を氷上で2時間インキュベートした。つ
いで細胞をPBS+1mg/ml BSAと共に5回洗浄した。該細胞をPBS中の1％ Triton X10
0で溶解し、放射能をガンマカウンターで測定した。解離定数および受容体数を
、RBINDINGプログラム（van Zoelen EJ. Anal. Biochem. 1992 1992年2月1日 :2
00 (2): 393-9）を使用して評価した。
【００５２】 酵母ツーハイブリッド系を使用するアンジオスタチン結合分子の同定 アンジオスタチンは、還元後でさえも活性を保有する。このことは、3次元の
フォールディングが結合および活性に重要でないことを示唆している。このこと
は、タンパク質の再生がそれほど正確でないかもしれないが多数のクローンがス
クリーニングされうるスクリーニング法にとって有利に働く。
フォールディングが結合および活性に重要でないことを示唆している。このこと
は、タンパク質の再生がそれほど正確でないかもしれないが多数のクローンがス
クリーニングされうるスクリーニング法にとって有利に働く。
【００５３】 プラスミノーゲンのクリングルドメイン1〜4に結合する分子に関するスクリー
ニングに、酵母ツーハイブリッド系を使用した。これを、図2を参照して以下に
更に詳しく開示する。ヒト満期（term）胎盤由来のツーハイブリッドcDNAライブ
ラリー（Stratagene）からの約2×106個のクローンをスクリーニングした。陽性
クローンを以下のとおりに同定した。
ニングに、酵母ツーハイブリッド系を使用した。これを、図2を参照して以下に
更に詳しく開示する。ヒト満期（term）胎盤由来のツーハイブリッドcDNAライブ
ラリー（Stratagene）からの約2×106個のクローンをスクリーニングした。陽性
クローンを以下のとおりに同定した。
【００５４】 （1）選択的条件下（His-、Leu-およびTrp-）でのスクリーニングは酵母株CG1
945において37個の陽性クローンを与えた。 （2）ONPG（SIGMA）と共に30℃で2時間インキュベートした後、37個中7個のク
ローンが高いβガラクトシダーゼ活性を示した。 （3）高いβ-gal活性を含有する7個のコロニーからのDNAを精製し、酵母株Y19
0内に再トランスフェクトした。それらの7個中3個のコロニーが、その新たな酵
母株において活性を保有していた。これらのクローンの配列決定分析は、それら
が同一遺伝子に由来することを示した。 （4）50mMの3-アミノトリアゾールの存在下での増殖（図3）およびβ-gal活性
（以下の表を参照されたい）をBig-3クローンにおいて評価し、陽性および陰性
対照と比較した。
945において37個の陽性クローンを与えた。 （2）ONPG（SIGMA）と共に30℃で2時間インキュベートした後、37個中7個のク
ローンが高いβガラクトシダーゼ活性を示した。 （3）高いβ-gal活性を含有する7個のコロニーからのDNAを精製し、酵母株Y19
0内に再トランスフェクトした。それらの7個中3個のコロニーが、その新たな酵
母株において活性を保有していた。これらのクローンの配列決定分析は、それら
が同一遺伝子に由来することを示した。 （4）50mMの3-アミノトリアゾールの存在下での増殖（図3）およびβ-gal活性
（以下の表を参照されたい）をBig-3クローンにおいて評価し、陽性および陰性
対照と比較した。
【００５５】
【表１】
【００５６】 Big3（アンジオスタチン結合ドメイン）の配列 胎盤酵母ツーハイブリッドライブラリー（Stratagene Inc.）からのbig3クロ
ーンの単離後、本発明者らは、pGAD活性化ドメインベクターからのcDNAインサー
トをGAL4 AD配列決定プライマーで直接配列決定した。アダプターからのEcoRI部
位を使用して該cDNAインサートをpUC18ベクター内に再クローニングし、汎用お
よびリバースプライマーを使用して配列決定を繰返した。ALF自動シークエンサ
ー（Pharmacia）で配列を分析した。Big3の配列を配列番号4に示す。
ーンの単離後、本発明者らは、pGAD活性化ドメインベクターからのcDNAインサー
トをGAL4 AD配列決定プライマーで直接配列決定した。アダプターからのEcoRI部
位を使用して該cDNAインサートをpUC18ベクター内に再クローニングし、汎用お
よびリバースプライマーを使用して配列決定を繰返した。ALF自動シークエンサ
ー（Pharmacia）で配列を分析した。Big3の配列を配列番号4に示す。
【００５７】 Big3およびBig3-GST融合タンパク質の発現および精製 Big3配列は、日本住血吸虫（Schistosoma japonicum）からのグルタチオンSト
ランスフェラーゼ（GST）ドメインとの融合タンパク質として大腸菌（E. coli）
内で発現されている。
ランスフェラーゼ（GST）ドメインとの融合タンパク質として大腸菌（E. coli）
内で発現されている。
【００５８】 ・ベクターの構築 pUC18-Big3プラスミドを鋳型として使用するPCR増幅により、Big3断片（429bp
）を得た。プライマー配列は以下のとおりであった。 BamHI-NH2 5'TAC GGA TCC GAA TCG AAC AAA ACT GCA GCT G 3'（配列番号5） XhoI-COOH 5'ATA CTC GAG TCA TGG AGC TGG AGT TGG AGC CA 3'（配列番号6）
）を得た。プライマー配列は以下のとおりであった。 BamHI-NH2 5'TAC GGA TCC GAA TCG AAC AAA ACT GCA GCT G 3'（配列番号5） XhoI-COOH 5'ATA CTC GAG TCA TGG AGC TGG AGT TGG AGC CA 3'（配列番号6）
【００５９】 用いたサイクリングプロトコールは以下のとおりであった。 94℃ 3'、60℃ 1'、72℃ 1'：1サイクル 94℃ 30''、60℃ 1'、72℃ 2'：30サイクル 94℃ 30''、60℃ 1'、72℃ 5'：1サイクル Taqポリメラーゼ：天然Pfu DNAポリメラーゼ（Stratgene）
【００６０】 PCR断片をBamHIおよびXhoIで消化し、精製し、同じ制限酵素で消化されたPGEX
-6P-2プラスミド（Pharmacia Biotech）に連結した。連結混合物を使用してXL1-
Blue細胞（Stratagene）を形質転換した。制限分析および自動配列決定により組
換えプラスミドを確認した。
-6P-2プラスミド（Pharmacia Biotech）に連結した。連結混合物を使用してXL1-
Blue細胞（Stratagene）を形質転換した。制限分析および自動配列決定により組
換えプラスミドを確認した。
【００６１】 ・発現および精製 DH5α細胞（Clontech）を、pGEX-Big3と称される確認された1つのクローンで
形質転換し、0.1mM IPTGで室温で6時間誘導した。
形質転換し、0.1mM IPTGで室温で6時間誘導した。
【００６２】 該発酵ブロスを4000×rpmで15分間遠心分離し、該細胞ペレットを10％ w/vの
溶解バッファー（50mM TRIS.HCl pH8.0, 100mM NaCl, 20mM DTT, 1mM EDTA, プ
ロテアーゼ阻害剤混合物）に再懸濁させ、超音波処理により溶解した。該全ライ
セートを15000×g、4℃で20分間遠心分離した。該清澄化上清を、溶解バッファ
ーで予め平衡化されたグルタチオン-セファロースカラム（ライセート20ml当た
り1ml）にアプライした。該樹脂を10カラム容積（CV）の溶解バッファーで洗浄
し、該融合タンパク質を3 CVの溶出バッファー（100mM TRIS.HCl pH8.0, 20mM還
元グルタチオン）で溶出した。
溶解バッファー（50mM TRIS.HCl pH8.0, 100mM NaCl, 20mM DTT, 1mM EDTA, プ
ロテアーゼ阻害剤混合物）に再懸濁させ、超音波処理により溶解した。該全ライ
セートを15000×g、4℃で20分間遠心分離した。該清澄化上清を、溶解バッファ
ーで予め平衡化されたグルタチオン-セファロースカラム（ライセート20ml当た
り1ml）にアプライした。該樹脂を10カラム容積（CV）の溶解バッファーで洗浄
し、該融合タンパク質を3 CVの溶出バッファー（100mM TRIS.HCl pH8.0, 20mM還
元グルタチオン）で溶出した。
【００６３】 50mM TRIS.HCl pH7.0、100mM NaCl、1mM EDTA、1mM DTT、1mM PMSFを含有する
PSバッファー中の20μl/ml樹脂のPreScissionプロテアーゼと共にグルタチオン-
セファロース結合融合タンパク質をインキュベートすることにより、GST-Big3タ
ンパク質を切断した。
PSバッファー中の20μl/ml樹脂のPreScissionプロテアーゼと共にグルタチオン-
セファロース結合融合タンパク質をインキュベートすることにより、GST-Big3タ
ンパク質を切断した。
【００６４】 溶出したタンパク質は、rp-HPLC（水 + 0.1％ TFA中のアセトニトリルの10〜9
0％勾配）において単一のピークのように振る舞い、質量分析（エレクトロスプ
レー）において予想分子サイズを、および正しいNH2配列を示す。SDS-PAGEにお
いては、混入物は80kDの見掛け分子量で出現する。それはDnaK（これは、HiTrap
Qカラム上のイオン交換クロマトグラフィーを実施することにより除去されうる
細菌シャペロンである）であることが示された。
0％勾配）において単一のピークのように振る舞い、質量分析（エレクトロスプ
レー）において予想分子サイズを、および正しいNH2配列を示す。SDS-PAGEにお
いては、混入物は80kDの見掛け分子量で出現する。それはDnaK（これは、HiTrap
Qカラム上のイオン交換クロマトグラフィーを実施することにより除去されうる
細菌シャペロンである）であることが示された。
【００６５】 1リットルの発酵から得られた収量は、約10mgのGST-Big3融合タンパク質およ
び約3mgの切断されたBig3である。
び約3mgの切断されたBig3である。
【００６６】 アンジオスタチンに対する組換えGSTタグ化Big3のインビトロ結合 結合に用いたプロトコールを以下に説明する。
【００６７】 pGEX-Big3形質転換体の1つのコロニーを10mlのLB培地＋アンピシリン内に接種
し、37℃で一晩増殖させた。
し、37℃で一晩増殖させた。
【００６８】 該一晩培養物を100mlの新鮮な培地内に1:10で希釈し、37℃で1時間のインキュ
ベーションの後、IPTGを0.5mMの最終濃度まで加え、インキュベーションを3〜7
時間継続した。
ベーションの後、IPTGを0.5mMの最終濃度まで加え、インキュベーションを3〜7
時間継続した。
【００６９】 ついで該培養を5000gで10分間遠心分離し、該ペレットを3〜5mlの氷冷PBSに再
懸濁させ、細胞を超音波処理により溶解した。Triton X100を0.5〜1％の最終濃
度まで加え、1.5mlのアリコートの該懸濁液を14000rpmで10分間遠心分離した。
懸濁させ、細胞を超音波処理により溶解した。Triton X100を0.5〜1％の最終濃
度まで加え、1.5mlのアリコートの該懸濁液を14000rpmで10分間遠心分離した。
【００７０】 グルタチオン-アガロースビーズの50％スラリーの0.1〜0.3mlを該上清に加え
、4℃で3〜5時間混合した。ついで該ビーズを遠心分離により集め、氷冷PBSで5
回、50mM Tris pH7.5、150mM NaCl、0.5mM EDTA、1mM DTT、1mM PMSFよりなる結
合溶液（B.S.）で2回洗浄した。
、4℃で3〜5時間混合した。ついで該ビーズを遠心分離により集め、氷冷PBSで5
回、50mM Tris pH7.5、150mM NaCl、0.5mM EDTA、1mM DTT、1mM PMSFよりなる結
合溶液（B.S.）で2回洗浄した。
【００７１】 結合アッセイ：0.7mlのB.S.、0.1％仔ウシ血清、500ngのアンジオスタチンを
、Big3固定化グルタチオン-アガロースビーズの50％スラリーの30〜50μlと4℃
で1〜3時間混合した。
、Big3固定化グルタチオン-アガロースビーズの50％スラリーの30〜50μlと4℃
で1〜3時間混合した。
【００７２】 該樹脂を氷冷B.S.で5〜7回洗浄し、ついで抗ヒトプラスミノーゲン抗体（Dako
Inc.）を使用するウエスタンブロット分析に使用した。
Inc.）を使用するウエスタンブロット分析に使用した。
【００７３】 図4は、精製された組換えBig3がアンジオスタチンにインビトロでいかに結合
するかを示している。興味深いことに、プラスミノーゲンの結合も検出可能であ
ったが、これは、それをDTTで処理することによるジスルフィド結合の還元後に
おいてのみ認められた。
するかを示している。興味深いことに、プラスミノーゲンの結合も検出可能であ
ったが、これは、それをDTTで処理することによるジスルフィド結合の還元後に
おいてのみ認められた。
【００７４】 完全長配列のクローニング 図5は、ABP-1の完全長配列のクローニングに関するスキームを示す。ヒト臍帯
内皮細胞由来のmRNAを使用する5' RACE PCR（Gibco）と共に、Big3プローブでの
胎盤cDNAライブラリーのスクリーニング（反復配列は除去した）を用いて、全遺
伝子をクローニングした。該cDNAクローンの全配列を配列番号1に開示し、該コ
ード化タンパク質を配列番号2に示す。実験プロトコールの詳細を以下に説明す
る。
内皮細胞由来のmRNAを使用する5' RACE PCR（Gibco）と共に、Big3プローブでの
胎盤cDNAライブラリーのスクリーニング（反復配列は除去した）を用いて、全遺
伝子をクローニングした。該cDNAクローンの全配列を配列番号1に開示し、該コ
ード化タンパク質を配列番号2に示す。実験プロトコールの詳細を以下に説明す
る。
【００７５】 Big3のHinfI断片をプローブとして使用して、胎盤ラムダファージライブラリ
ー（Stratagene, Inc.）のクローン1000万個をスクリーニングした。DNAの単離
およびサザンブロット法を、確立されたプロトコール（Sambrookら, 1989）に従
い行った。本発明者らは、Big3と重複する配列を有する5個のクローン（7-1、7-
2、8-2、9-3、9-5）を単離した。5'RACE PCR（Gibco Life technologies, Inc.
）用の遺伝子特異的プライマー（Gene-Specific Primers：GSP）を設計するため
に、該7-2クローンの5'配列を使用した。ヒト臍帯内皮細胞から単離したmRNAを
使用して、5'配列を同定した。
ー（Stratagene, Inc.）のクローン1000万個をスクリーニングした。DNAの単離
およびサザンブロット法を、確立されたプロトコール（Sambrookら, 1989）に従
い行った。本発明者らは、Big3と重複する配列を有する5個のクローン（7-1、7-
2、8-2、9-3、9-5）を単離した。5'RACE PCR（Gibco Life technologies, Inc.
）用の遺伝子特異的プライマー（Gene-Specific Primers：GSP）を設計するため
に、該7-2クローンの5'配列を使用した。ヒト臍帯内皮細胞から単離したmRNAを
使用して、5'配列を同定した。
【００７６】 第1 RACE PCRに使用したプライマー： プライマー：GSP1-(5'から3') GCTGACAGTTGCCCTGACGCTGCT（配列番号10） GSP2-(5'から3') CGGAGACGGTGCTCTAGCTGCTCA（配列番号11） GSP3-(5'から3') TCCTTCCAACTCTTGCCTCAAGTTCCG（配列番号12）
【００７７】 GSP2およびGSP3とmRNA ABP-1の5'末端との間の未知配列の増幅およびクローニ
ングに、RACE法が用いられている。ついで、この配列を使用して、後続のセット
のRACE PCR用の新たなプライマーを設計した。
ングに、RACE法が用いられている。ついで、この配列を使用して、後続のセット
のRACE PCR用の新たなプライマーを設計した。
【００７８】 プライマー：GSP1-(5'から3') GGTGGCAGCGGACAGGCAGGATAC（配列番号13） GSP2 GAGGCGGAGAGAACTAAGAGAAGA（配列番号14） GSP3 GAGCGGAGATGGAGGAGTAATTCA（配列番号15）
【００７９】 重複配列を有するクローンA2-2、A2-1およびA1-Cを単離した。胎盤ファージラ
イブラリーの第2スクリーニング用のプローブとして、A2-1配列を使用した。こ
のスクリーニングから、本発明者らは、別の2個のクローン（7-10および6-5）を
単離した。図6に示すとおり、可能な6個のフレームのうち、完全なオープンリー
ディングフレームを与える唯一のフレームは、675アミノ酸残基の推定タンパク
質を与えるフレーム2である。
イブラリーの第2スクリーニング用のプローブとして、A2-1配列を使用した。こ
のスクリーニングから、本発明者らは、別の2個のクローン（7-10および6-5）を
単離した。図6に示すとおり、可能な6個のフレームのうち、完全なオープンリー
ディングフレームを与える唯一のフレームは、675アミノ酸残基の推定タンパク
質を与えるフレーム2である。
【００８０】 mRNA発現パターン 商業的（Clontech, Inc.）に入手される複数のヒト成人および胎児組織（#776
0-1および#7756-1）mRNAブロット（2mg mRNA/ウェル）をABP-1に関してプローブ
した。該ブロットを、製造業者のプロトコールに従いExpressHybハイブリダイゼ
ーション溶液（Clontech, Inc.）でハイブリダイズさせた。該ブロットを7-2の5
'Pst/断片でプローブした。図7は該実験の結果を示す。サイズは9.5および7.5kb
である。
0-1および#7756-1）mRNAブロット（2mg mRNA/ウェル）をABP-1に関してプローブ
した。該ブロットを、製造業者のプロトコールに従いExpressHybハイブリダイゼ
ーション溶液（Clontech, Inc.）でハイブリダイズさせた。該ブロットを7-2の5
'Pst/断片でプローブした。図7は該実験の結果を示す。サイズは9.5および7.5kb
である。
【００８１】 ABP-1はヒト臍帯、ウシ大動脈およびウシ微小毛細血管内皮細胞においても検
出された。不死化内皮細胞系EaHy926およびヒト胎児繊維芽細胞においては、発
現はほとんど又は全く検出されなかった。該細胞系はアンジオスタチンに応答せ
ず、FITC標識アンジオスタチンの結合を示さなかった。
出された。不死化内皮細胞系EaHy926およびヒト胎児繊維芽細胞においては、発
現はほとんど又は全く検出されなかった。該細胞系はアンジオスタチンに応答せ
ず、FITC標識アンジオスタチンの結合を示さなかった。
【００８２】 リアルタイムRT-PCR 5'ヌクレアーゼアッセイ（TaqManアッセイ）は、非伸長性オリゴヌクレオチド
ハイブリダイゼーションプローブ（TaqMan Probe）を使用するものである。TaqM
anプローブは、5'レポーター色素と3'クエンチャー色素とを有するオリゴヌクレ
オチドよりなる。該プローブが無傷な場合には、該レポーター色素が該クエンチ
ャー色素に接近しているため、レポーターの蛍光は、主としてFoster型エネルギ
ー転移により抑制される。PCR中、フォワードおよびリバースプライマーが標的D
NAの特異的配列にハイブリダイズする。TaqManプローブは、該PCR産物内の標的
配列にハイブリダイズする。Taqポリメラーゼは、その5'-3'ヌクレアーゼ活性に
よりTaqManプローブを切断する。切断されると、レポーター色素とクエンチャー
色素とが分離し、その結果、該レポーターの蛍光が増加する。
ハイブリダイゼーションプローブ（TaqMan Probe）を使用するものである。TaqM
anプローブは、5'レポーター色素と3'クエンチャー色素とを有するオリゴヌクレ
オチドよりなる。該プローブが無傷な場合には、該レポーター色素が該クエンチ
ャー色素に接近しているため、レポーターの蛍光は、主としてFoster型エネルギ
ー転移により抑制される。PCR中、フォワードおよびリバースプライマーが標的D
NAの特異的配列にハイブリダイズする。TaqManプローブは、該PCR産物内の標的
配列にハイブリダイズする。Taqポリメラーゼは、その5'-3'ヌクレアーゼ活性に
よりTaqManプローブを切断する。切断されると、レポーター色素とクエンチャー
色素とが分離し、その結果、該レポーターの蛍光が増加する。
【００８３】 リアルタイムRT-PCR分析 RNAの調製 以下に挙げる組織および細胞由来の全RNAの単離および精製を、Ultraspec RNA
単離系（Biotex）を使用して行った。
単離系（Biotex）を使用して行った。
【００８４】
【表２】
【００８５】 cDNA合成 RTプライマーとしてのランダムヘキサマーと共にTaqMan逆転写試薬（Reverse
Transcription Reagent）（PE Applied Biosystems）を使用して、RT反応を行っ
た。逆転写工程の反応容積は100μlであり、サンプルの全RNA量は1μgであった
。
Transcription Reagent）（PE Applied Biosystems）を使用して、RT反応を行っ
た。逆転写工程の反応容積は100μlであり、サンプルの全RNA量は1μgであった
。
【００８６】 以下のサイクリングパラメーターを用いて、該RTを行った。 25℃で10' 48℃で45' 95℃で5'。
【００８７】 PCR反応 プライマー濃度の最適化の後、TaqMan Universal PCR Master Mix（PE Applie
d Biosystems）および以下のオリゴヌクレオチドを使用して10ngの該cDNA上でPC
R反応を行った。
d Biosystems）および以下のオリゴヌクレオチドを使用して10ngの該cDNA上でPC
R反応を行った。
【００８８】 ・ABP-1フォワードプライマー：5' GTTTGACCTGCAATCCAGACAA 3'（配列番号7）
、最終濃度300nM ・ABP-1リバースプライマー：5' CCCAGGATCTGAATGGGAGTT 3'（配列番号8）、
最終濃度900nm ・ABP-1 TaqManプローブ：5'(FAM色素)-CAGATGGGCCTGTGTTCCACTCCAA-(TAMRA色
素)3'（配列番号9）、最終プローブ濃度200nM
、最終濃度300nM ・ABP-1リバースプライマー：5' CCCAGGATCTGAATGGGAGTT 3'（配列番号8）、
最終濃度900nm ・ABP-1 TaqManプローブ：5'(FAM色素)-CAGATGGGCCTGTGTTCCACTCCAA-(TAMRA色
素)3'（配列番号9）、最終プローブ濃度200nM
【００８９】 該サイクリングプロトコールは以下のとおりであった。 50℃で2'；95℃で10' 1サイクル 95℃で15''；60℃で1' 40サイクル。
【００９０】 遺伝子発現の相対的定量 比較法では、標準曲線の必要なしに相対的定量の結果を得るために数式を用い
る。
る。
【００９１】 図8に示す結果は、標的の最低レベルの発現を示すサンプルである基準体（Cal
ibrator）に対してサンプルXが標的を何倍発現するかを示している。この実験で
は、EaHY926サンプルを基準体として選択した。
ibrator）に対してサンプルXが標的を何倍発現するかを示している。この実験で
は、EaHY926サンプルを基準体として選択した。
【００９２】 Big-3に対する抗体 New Zealand Whiteウサギの免疫のために、100マイクログラムのBig3-GST融合
タンパク質を1mlのリン酸緩衝食塩水（PBS）に溶解し、1mlのフロイント完全ア
ジュバント（Gibco）と共にホモジナイズした。得られたエマルションを第0日に
皮下注射し、この処理を第15日および第28日に繰返した。血液をウサギから第35
日に採取し、4℃で一晩凝固させ、得られた血清を-20℃で保存した。
タンパク質を1mlのリン酸緩衝食塩水（PBS）に溶解し、1mlのフロイント完全ア
ジュバント（Gibco）と共にホモジナイズした。得られたエマルションを第0日に
皮下注射し、この処理を第15日および第28日に繰返した。血液をウサギから第35
日に採取し、4℃で一晩凝固させ、得られた血清を-20℃で保存した。
【００９３】 特異的抗体の精製のために、樹脂に固定化されたリガンドを以下のとおりに調
製した。Big3ポリペプチドを、全容積2ml中の最終濃度が5mg/mlとなるよう、0.1
M炭酸水素ナトリウム、0.5M NaCl（pH8.3）に溶解した。これを2mlの臭化シアン
活性化セファロースCL-4B樹脂（Sigma Chemical Co. St Louis, MO）と室温で2
時間反応させた。反応後、10容積の100mM Tris、500mM NaCl（pH7.5）中で該樹
脂を3回洗浄した。免疫血清を該アフィニティー樹脂と共に4℃で2時間インキュ
ベートし、ついで樹脂を5mlのガラスクロマトグラフィーカラム（Bio-Rad, Rich
mond CA）中、25容積の100mM Tris、500mM NaCl（pH7.5）で洗浄した。特異的抗
体を100mMのグリシン/HCl（pH2.8）で1mlのアリコート中で溶出した。抗体の溶
出後、光学密度を280nM（OD280）でモニターし、1を超えるOD280を有する画分を
プールし、バッファーを3回交換しながら1リットルのPBSに対して4℃で36時間透
析（Slide-A-lyzerカセット, Pierce）した。
製した。Big3ポリペプチドを、全容積2ml中の最終濃度が5mg/mlとなるよう、0.1
M炭酸水素ナトリウム、0.5M NaCl（pH8.3）に溶解した。これを2mlの臭化シアン
活性化セファロースCL-4B樹脂（Sigma Chemical Co. St Louis, MO）と室温で2
時間反応させた。反応後、10容積の100mM Tris、500mM NaCl（pH7.5）中で該樹
脂を3回洗浄した。免疫血清を該アフィニティー樹脂と共に4℃で2時間インキュ
ベートし、ついで樹脂を5mlのガラスクロマトグラフィーカラム（Bio-Rad, Rich
mond CA）中、25容積の100mM Tris、500mM NaCl（pH7.5）で洗浄した。特異的抗
体を100mMのグリシン/HCl（pH2.8）で1mlのアリコート中で溶出した。抗体の溶
出後、光学密度を280nM（OD280）でモニターし、1を超えるOD280を有する画分を
プールし、バッファーを3回交換しながら1リットルのPBSに対して4℃で36時間透
析（Slide-A-lyzerカセット, Pierce）した。
【００９４】 ABP-1タンパク質を介したアンジオスタチンの結合およびシグナリング 図9Aおよび9Bは、ABP-1をトランスフェクトしたHeLa細胞およびベクター対照
をトランスフェクトしたEaHy926細胞に対するFITC標識アンジオスタチンの結合
のデータを示す。特に、図9Aは、一過性にトランスフェクトされた細胞における
、グリーン蛍光タンパク質（GFP）と融合したABP-1の細胞局在を示す。該タンパ
ク質は小胞体および細胞膜において検出されうる。DABP-1は、該遺伝子の5'末端
に5000bpの欠失を含有し、これは、ABP-1の既に記載されている局在を損なう。
をトランスフェクトしたEaHy926細胞に対するFITC標識アンジオスタチンの結合
のデータを示す。特に、図9Aは、一過性にトランスフェクトされた細胞における
、グリーン蛍光タンパク質（GFP）と融合したABP-1の細胞局在を示す。該タンパ
ク質は小胞体および細胞膜において検出されうる。DABP-1は、該遺伝子の5'末端
に5000bpの欠失を含有し、これは、ABP-1の既に記載されている局在を損なう。
【００９５】 図9Bは、ABP-1 GFPをトランスフェクトしたHeLa細胞を示す。2.5mgのアンジオ
スタチンと共に0℃で60分間インキュベートし、ついで37℃で15分間インキュベ
ートすると、ABP-1-GFPのインターナリゼーションが誘導される。
スタチンと共に0℃で60分間インキュベートし、ついで37℃で15分間インキュベ
ートすると、ABP-1-GFPのインターナリゼーションが誘導される。
【００９６】 図9Cは、ABP-1に対するアンジオスタチンの結合を示す。本発明者らは、フル
オレセインイソチオシアナート（FITC）標識アンジオスタチンが内皮細胞に特異
的に結合することを示した（データは示していない）。本発明者らは、HeLa細胞
をABP-1発現構築物またはベクター対照（p RC/CMV. In Vitrogen, Inc.）でトラ
ンスフェクトした。DMEM+10％ウシ胎仔血清中、生きたHeLa細胞をFITC標識アン
ジオスタチン（10μg/ml）と共に0℃で60分間インキュベートした。ついで該細
胞を37℃で15分間インキュベートして、結合アンジオスタチンを凝集させた。結
合を蛍光顕微鏡で分析した。アンジオスタチンの結合は、ABP-1トランスフェク
ト化細胞においては検出されたが、該ベクター対照においては検出されなかった
。
オレセインイソチオシアナート（FITC）標識アンジオスタチンが内皮細胞に特異
的に結合することを示した（データは示していない）。本発明者らは、HeLa細胞
をABP-1発現構築物またはベクター対照（p RC/CMV. In Vitrogen, Inc.）でトラ
ンスフェクトした。DMEM+10％ウシ胎仔血清中、生きたHeLa細胞をFITC標識アン
ジオスタチン（10μg/ml）と共に0℃で60分間インキュベートした。ついで該細
胞を37℃で15分間インキュベートして、結合アンジオスタチンを凝集させた。結
合を蛍光顕微鏡で分析した。アンジオスタチンの結合は、ABP-1トランスフェク
ト化細胞においては検出されたが、該ベクター対照においては検出されなかった
。
【００９７】 図9Dは、ヒト臍帯内皮（HUVE）細胞におけるABP-1の免疫染色、およびローダ
ミン標識ファロイジンでのFアクチンに対する染色を示す。
ミン標識ファロイジンでのFアクチンに対する染色を示す。
【００９８】 ・免疫染色プロトコール HUVE細胞を4％ホルムアルデヒド中で固定し、PBS中で洗浄し、5％ウシ血清中
で予めブロッキングした。該ブロッキング溶液を除去し、5％ウシ血清中で希釈
されたアンジオスタチン結合ドメインBig3に対するウサギポリクローナル抗体で
置換した。ポジティブ染色を蛍光標識2次抗体（Dako, Inc.）で可視化した。ロ
ーダミン共役ファロイジン（Molecular Probes, Inc.）を該2次抗体と同時に染
色した（1％ Triton X100で1分間、透過性を増加した後）。グリーン蛍光タンパ
ク質に対するウサギポリクローナル抗体を陰性対照として使用した。また、ポジ
ティブ染色はヒト繊維芽細胞においては検出することができなかった。
で予めブロッキングした。該ブロッキング溶液を除去し、5％ウシ血清中で希釈
されたアンジオスタチン結合ドメインBig3に対するウサギポリクローナル抗体で
置換した。ポジティブ染色を蛍光標識2次抗体（Dako, Inc.）で可視化した。ロ
ーダミン共役ファロイジン（Molecular Probes, Inc.）を該2次抗体と同時に染
色した（1％ Triton X100で1分間、透過性を増加した後）。グリーン蛍光タンパ
ク質に対するウサギポリクローナル抗体を陰性対照として使用した。また、ポジ
ティブ染色はヒト繊維芽細胞においては検出することができなかった。
【００９９】 図9Dにおいて認められうるとおり、ABP-1は、フォーカルアドヒージョンおよ
び膜ラッフル（矢印）に局在している。
び膜ラッフル（矢印）に局在している。
【０１００】 インビトロキナーゼデータ Huve細胞を、5cmペトリ皿中、サブコンフルエントになるまでプレーティング
した。翌日、アンジオスタチンを2.5mg/mlで種々の時点で加えた。対照を含むす
べてのプレートを同時に収穫した。該細胞を氷冷PBS中でリンスし、1mlの溶解バ
ッファー中でインキュベートした。該細胞をエッペンドルフチューブに移し、14
000rpm、4℃で5分間遠心分離した。該上清を別のエッペンドルフチューブに移し
、2μgのBig3ウサギポリクローナル抗体を加えた。該サンプルを4℃で60分間イ
ンキュベートし、ついで50μlのプロテインAセファロース（Pharmacia, Inc.）
スラリーを加え、回転インキュベーター中で更に60分間インキュベートした。該
免疫沈降物を手短な遠心分離により集め、溶解バッファー中で2回、洗浄バッフ
ァー中で1回、キナーゼバッファー中で1回洗浄した。残留バッファーをシリンジ
で除去した。25μlのキナーゼバッファーを1μCiのγATP（Amersham, Inc.）と
共に各チューブに加えた。該サンプルを室温で20分間インキュベートした。2×S
DS PAGEのサンプルバッファーを加えることにより、該反応を停止した。該サン
プルを変性条件下で煮沸し、ついでSDS PAGEにより分析した。
した。翌日、アンジオスタチンを2.5mg/mlで種々の時点で加えた。対照を含むす
べてのプレートを同時に収穫した。該細胞を氷冷PBS中でリンスし、1mlの溶解バ
ッファー中でインキュベートした。該細胞をエッペンドルフチューブに移し、14
000rpm、4℃で5分間遠心分離した。該上清を別のエッペンドルフチューブに移し
、2μgのBig3ウサギポリクローナル抗体を加えた。該サンプルを4℃で60分間イ
ンキュベートし、ついで50μlのプロテインAセファロース（Pharmacia, Inc.）
スラリーを加え、回転インキュベーター中で更に60分間インキュベートした。該
免疫沈降物を手短な遠心分離により集め、溶解バッファー中で2回、洗浄バッフ
ァー中で1回、キナーゼバッファー中で1回洗浄した。残留バッファーをシリンジ
で除去した。25μlのキナーゼバッファーを1μCiのγATP（Amersham, Inc.）と
共に各チューブに加えた。該サンプルを室温で20分間インキュベートした。2×S
DS PAGEのサンプルバッファーを加えることにより、該反応を停止した。該サン
プルを変性条件下で煮沸し、ついでSDS PAGEにより分析した。
【０１０１】 図10に示すデータは、アンジオスタチンの添加がABP-1関連キナーゼ活性を30
分以内にダウンレギュレーションすることを示している。これは、ABP-1により
媒介されるシグナリング経路にアンジオスタチンが影響を及ぼすという直接的な
証拠である。
分以内にダウンレギュレーションすることを示している。これは、ABP-1により
媒介されるシグナリング経路にアンジオスタチンが影響を及ぼすという直接的な
証拠である。
【０１０２】 ABP-1は、アンジオスタチンに誘導されるフォーカルアドヒージョンキナーゼ
活性を媒介する 図11に示すデータは、2.5μg/mlのアンジオスタチンの添加が添加後1時間以内
にFAK活性をアップレギュレーションすることを示している。
活性を媒介する 図11に示すデータは、2.5μg/mlのアンジオスタチンの添加が添加後1時間以内
にFAK活性をアップレギュレーションすることを示している。
【０１０３】 EaHy926細胞を、5cmペトリ皿中、サブコンフルエントになるまでプレーティン
グした。翌日、アンジオスタチンを2.5μg/mlで種々の時点で加えた。対照を含
むすべてのプレートを同時に収穫した。該細胞を氷冷PBS中でリンスし、1mlの溶
解バッファー中でインキュベートした。該細胞をエッペンドルフチューブに移し
、14000rpm、4℃で5分間遠心分離した。該上清を別のエッペンドルフチューブに
移し、1μgのFAKモノクローナル抗体（Transduction Lab. Inc.）を加えた。該
サンプルを4℃で60分間インキュベートし、ついでウサギ抗マウスIgG + 50μlの
プロテインAセファロース（Pharmacia, Inc.）スラリーを加え、回転インキュベ
ーター中で更に60分間インキュベートした。該免疫沈降物を手短な遠心分離によ
り集め、溶解バッファー中で2回、洗浄バッファー中で1回、キナーゼバッファー
中で1回洗浄した。残留バッファーをシリンジで除去した。25μlのキナーゼバッ
ファーを1μCiのγATP（Amersham, Inc.）と共に各チューブに加えた。該サンプ
ルを室温で20分間インキュベートした。2×SDS PAGEのサンプルバッファーを加
えることにより、該反応を停止した。該サンプルを変性条件下で煮沸し、ついで
SDS PAGEにより分析した。
グした。翌日、アンジオスタチンを2.5μg/mlで種々の時点で加えた。対照を含
むすべてのプレートを同時に収穫した。該細胞を氷冷PBS中でリンスし、1mlの溶
解バッファー中でインキュベートした。該細胞をエッペンドルフチューブに移し
、14000rpm、4℃で5分間遠心分離した。該上清を別のエッペンドルフチューブに
移し、1μgのFAKモノクローナル抗体（Transduction Lab. Inc.）を加えた。該
サンプルを4℃で60分間インキュベートし、ついでウサギ抗マウスIgG + 50μlの
プロテインAセファロース（Pharmacia, Inc.）スラリーを加え、回転インキュベ
ーター中で更に60分間インキュベートした。該免疫沈降物を手短な遠心分離によ
り集め、溶解バッファー中で2回、洗浄バッファー中で1回、キナーゼバッファー
中で1回洗浄した。残留バッファーをシリンジで除去した。25μlのキナーゼバッ
ファーを1μCiのγATP（Amersham, Inc.）と共に各チューブに加えた。該サンプ
ルを室温で20分間インキュベートした。2×SDS PAGEのサンプルバッファーを加
えることにより、該反応を停止した。該サンプルを変性条件下で煮沸し、ついで
SDS PAGEにより分析した。
【０１０４】 図11において認められうるとおり、アンジオスタチンの添加はFAK活性を1時間
以内にアップレギュレーションする。逆転写PCR分析により示されるとおり、EaH
y926細胞はABP1を発現していないことに注目すべきである。
以内にアップレギュレーションする。逆転写PCR分析により示されるとおり、EaH
y926細胞はABP1を発現していないことに注目すべきである。
【配列表】
【図１】 インビトロにおけるウシ微小毛細血管（microcapillary）内皮細胞に対する12 5 I-標識アンジオスタチンおよびプラスミノーゲンの結合を示す。
【図２】 アンジオスタチン結合性タンパク質の単離方法を示す。
【図３】 選択条件下での陽性酵母クローンの増殖を示す。
【図４】 アンジオスタチンおよびプラスミノーゲンに対する組換え「Big-3」の結合の
比較を示す。
比較を示す。
【図５】 「Big-3」に関する地図である。
【図６】 本発明のアンジオスタチン受容体をコードする遺伝子のオープンリーディング
フレーム（フレーム2）を示す。
フレーム（フレーム2）を示す。
【図７】 胎児および成人mRNAおよび内皮細胞の発現パターンを示す。
【図８】 種々の組織におけるABP-1遺伝子発現の相対的定量を示す。
【図９Ａ】 一過性にトランスフェクトされたHeLa細胞におけるGFPタグ化（tagged）ABP-1
受容体の細胞局在を示す。
受容体の細胞局在を示す。
【図９Ｂ】 アンジオスタチンと共にインキュベートした後のGFP標識ABP-1の再構成を示す
。
。
【図９Ｃ】 ABP-1に対するアンジオスタチンの結合を示す。
【図９Ｄ】 ヒト臍帯内皮（HUVE）細胞におけるABP-1の免疫染色、およびローダミン標識
ファロイジンでのF-アクチンに対する染色である。
ファロイジンでのF-アクチンに対する染色である。
【図１０】 アンジオスタチンの添加後のABP-1関連キナーゼ活性のダウンレギュレーショ
ンを示す。
ンを示す。
【図１１】 アンジオスタチンにより誘導されたフォーカルアドヒージョンキナーゼ活性を
ABP-1が媒介することを示すSDS-PAGEのオートラジオグラフィーである。
ABP-1が媒介することを示すSDS-PAGEのオートラジオグラフィーである。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年８月７日（２０００．８．７）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ０７Ｋ 16/28 Ｃ０７Ｋ 14/71 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/28 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 1/21 33/50 Ｚ 5/10 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｐ 21/08 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/02 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (31)優先権主張番号 ９８０４３７２−２ (32)優先日 平成10年12月17日(1998．12．17) (33)優先権主張国 スウェーデン（ＳＥ） (31)優先権主張番号 ６０／１１４，３８６ (32)優先日 平成10年12月29日(1998．12．29) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＤ，ＧＥ，ＨＲ，ＨＵ， ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＰ，ＫＲ，Ｌ Ｃ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ
Claims (30)
- 【請求項１】 プラスミノーゲンのN末端断片に結合しうる単離されたヒト
血管新生関連タンパク質。 - 【請求項２】 プラスミノーゲンのN末端断片がプラスミノーゲンのクリン
グルドメイン1〜4により構成される、請求項１に記載のタンパク質。 - 【請求項３】 配列番号2、3または4に対して少なくとも約80％の配列相同
性、好ましくは約90％の配列相同性、より好ましくは約95％の配列相同性、最も
好ましくは約98％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１または２
に記載のタンパク質。 - 【請求項４】 配列番号2のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のタンパ
ク質。 - 【請求項５】 135位のアミノ酸残基がAsn、SerまたはAspであり148〜150位
の3個のアミノ酸残基がトリペプチドGlu-Leu-AlaまたはトリペプチドThr-Trp-Pr
oである配列番号3のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のタンパク質。 - 【請求項６】 配列番号4のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のタンパ
ク質。 - 【請求項７】 配列番号2の少なくとも5個の連続したアミノ酸残基を含むア
ミノ酸配列を有しプラスミノーゲンのN末端断片に結合しうるペプチド。 - 【請求項８】 配列番号2の少なくとも10個の連続したアミノ酸残基を含む
アミノ酸配列を有する、請求項７に記載のペプチド。 - 【請求項９】 請求項３〜８のいずれか1項に記載のタンパク質またはペプ
チドをコードする配列を含んでなる単離された核酸分子。 - 【請求項１０】 請求項４に記載のタンパク質をコードする、請求項９に記
載の単離された核酸分子。 - 【請求項１１】 請求項５に記載のタンパク質をコードする、請求項９に記
載の単離された核酸分子。 - 【請求項１２】 請求項６に記載のタンパク質をコードする、請求項９に記
載の単離された核酸分子。 - 【請求項１３】 少なくとも配列番号1のヌクレオチド2177〜ヌクレオチド2
608の配列を含む、請求項１０〜１２のいずれか1項に記載の単離された核酸分子
。 - 【請求項１４】 配列番号1のヌクレオチド797〜ヌクレオチド2824の配列を
含む、請求項９に記載の単離された核酸分子。 - 【請求項１５】 配列番号1の配列よりなる、請求項１４に記載の単離され
た核酸分子。 - 【請求項１６】 請求項７または8に記載のペプチドをコードする核酸分子
。 - 【請求項１７】 請求項９〜１６のいずれか1項に記載の核酸に、ストリン
ジェントな条件下で特異的にハイブリダイズしうる核酸。 - 【請求項１８】 請求項９〜１７のいずれか1項に記載の核酸を含んでなる
ベクター。 - 【請求項１９】 プラスミドである、請求項１８に記載のベクター。
- 【請求項２０】 ウイルスである、請求項１８に記載のベクター。
- 【請求項２１】 請求項１８に記載のベクターで形質転換またはトランスフ
ェクトされた組換え細胞。 - 【請求項２２】 請求項３〜８のいずれか1項に記載のタンパク質またはペ
プチドに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント。 - 【請求項２３】 モノクローナル抗体またはそのフラグメントである、請求
項２２に記載の抗体。 - 【請求項２４】 医薬として使用するための、請求項２２または２３に記載
の抗体。 - 【請求項２５】 請求項２２また２３に記載の抗体を発現する組換え細胞。
- 【請求項２６】 請求項１〜６のいずれか1項に記載のタンパク質と相互作
用しうる化合物を同定するためのスクリーニング方法。 - 【請求項２７】 請求項２６に記載のスクリーニング方法により同定された
化合物。 - 【請求項２８】 医薬として使用するための、請求項１〜８および２７のい
ずれか1項に記載のタンパク質、ペプチドまたは化合物。 - 【請求項２９】 血管新生関連疾患または障害に対する医薬の製造における
、請求項１〜８および２７のいずれか1項に記載のタンパク質、ペプチドまたは
化合物の使用。 - 【請求項３０】 請求項１〜８および２７のいずれか1項に記載のタンパク
質、ペプチドまたは化合物と医薬上許容される担体とを含んでなる医薬製剤。
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