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JP2002508193A - インフルエンザウイルスを検出および診断するためのスクリーニングアッセイ - Google Patents

インフルエンザウイルスを検出および診断するためのスクリーニングアッセイ

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JP2002508193A
JP2002508193A JP2000539177A JP2000539177A JP2002508193A JP 2002508193 A JP2002508193 A JP 2002508193A JP 2000539177 A JP2000539177 A JP 2000539177A JP 2000539177 A JP2000539177 A JP 2000539177A JP 2002508193 A JP2002508193 A JP 2002508193A
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JP
Japan
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influenza virus
neuraminidase
assay
specific
substrate
Prior art date
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Application number
JP2000539177A
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English (en)
Inventor
ヘッフナー，ドナルド，エル．
ゼップ，チャールズ，エム．
ルビン，ポール，ディー．
Original Assignee
セプラコア インコーポレーテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by セプラコア インコーポレーテッド filed Critical セプラコア インコーポレーテッド
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼの有無を評価することにより、インフルエンザウイルス感染を検出および診断するための迅速かつ特異的なアッセイ系を包含する。本発明はまた、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼ活性をモジュレートする新規な作用物質を同定するための、迅速かつ特異的なハイスループットアッセイ系を包含する。本発明はさらに、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼと相互作用する新規な作用物質を同定するための、迅速かつ特異的なハイスループットアッセイ系を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】１．発明の分野 本発明は、スクリーニングアッセイおよびスクリーニングキット、並びにこれ
らをインフルエンザウイルス感染の検出および診断に使用する方法に関する。特
に本発明は、インフルエンザノイラミニダーゼを検出する迅速かつ特異的なアッ
セイ系に基づく、インフルエンザウイルス感染の検出および診断用スクリーニン
グアッセイに関する。本発明はさらに、インフルエンザノイラミニダーゼの種特
異的検出に基づく、インフルエンザウイルス感染の診断用キットを包含する。さ
らに本発明は、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼと相互作用し、かつ抗
ウイルス剤として有用な可能性を秘めた作用物質(agent)をスクリーニングする ための、迅速かつ特異的なハイスループットアッセイ系に関する。
【０００２】２．発明の背景 2.1 インフルエンザウイルス感染 インフルエンザウイルス感染は、世界的にみて臨床上重要な課題である。イン
フルエンザは、何世紀にもわたって流行が繰り返されてきたことが知られており
、突然発生しては急速に広まって世界規模となることが度々である。事実、イン
フルエンザは、歴史上最も破壊的な伝染病の１つを引き起こすものであり、1917
〜1918年にはおよそ20,000,000の人々がインフルエンザ感染症のために亡くなっ
た。流行は周期的に起こるものであるが、インフルエンザの大発生は毎年起こっ
ている。米国に限っても、最大40,000,000の人々が毎年インフルエンザ感染症を
発症している。このうち、およそ150,000人が入院し、10,000〜40,000人がイン フルエンザまたはインフルエンザに伴う合併症のため亡くなっている(Welch, S.
, 1988, Gilead’s Oral Influenza Drug Proves Positive in Phase III, BioW
orld Today 9:1,3)。米国では、インフルエンザウイルス感染症のために、往診 、無駄な生産力および賃金に毎年およそ100億ドルが費やされている。
【０００３】 インフルエンザは全身症状を伴う急性の呼吸器疾患である。この疾患は、イン
フルエンザウイルスの感染によって上部気道、気管および気管支の内面を覆う細
胞が破壊されると生じる。インフルエンザウイルスは鼻咽頭より侵入し、特異的
なムコタンパク質受容体を発現する細胞へと広がる。ウイルスは、ウイルス粒子
に結合し得るムコタンパク質を含む気道分泌物(respiratory secretions)を必ず
通過せねばならないが、ウイルスのノイラミニダーゼがムコタンパク質を加水分
解し、ムコタンパク質をインヒビターとして無効にしてしまうため、感染を阻止
することができないのである。
【０００４】 インフルエンザウイルスによる急性感染はウイルスの複製を引き起こし、感染
細胞の壊死と気道上皮の大量剥離をもたらす。これは、急性感染に伴う呼吸症状
の直接の原因となる。急性インフルエンザウイルス感染に伴う全身症状としては
、発熱、悪寒、全身性の疼痛、頭痛、虚脱、および食欲不振が挙げられる。通常
、インフルエンザウイルス感染に起因する疾患は自己限定性(self-limited)であ
り、３〜７日間続く。二次細菌感染(例えば、Staphylococcus aureus, Hemophil
us influenzae, およびβ-溶血連鎖球菌)は、インフルエンザによる死因のほと んどを占めている。まれに、インフルエンザ単独の感染で死亡することもある。
【０００５】2.2 インフルエンザウイルス インフルエンザウイルスはエンベロープを有するウイルスであり、(-)センス の分節型一本鎖RNAゲノムを含んでいる。インフルエンザウイルスは、オルソミ クソウイルス科のメンバーとして分類される。インフルエンザウイルスは、その
ヌクレオカプシドとＭタンパク質抗原に基づいて、Ａ、ＢおよびＣの３つのタイ
プ(属)にさらに分類されている。Ａ型およびＢ型インフルエンザの新規変異体は
頻繁に現われ、免疫学的に異なる表面抗原、即ち、赤血球凝集素(HA)およびノイ
ラミニダーゼ(NA)糖タンパク質の発現に基づいてサブタイプ(種)に分類される。
これらの２つの表面抗原の抗原変異は抗原ドリフトによる。抗原ドリフトには、
小規模(minor)抗原ドリフトと大規模(major)抗原ドリフトの２つの異なる形態が
ある。小規模抗原ドリフトは、ウイルスのHAおよびNA遺伝子の突然変異による変
化を反映している。大規模抗原ドリフトは、インフルエンザウイルスのヒト株と
動物株との間の組換え(即ち、遺伝子の再組み合わせ)によるものである。従って
、ウイルスは、混合感染の際に遺伝子を再度組み合わせることが可能であり、世
界人口の大部分が免疫学的に防御できない新規なウイルス種を生み出す可能性が
ある。
【０００６】 インフルエンザビリオンは、一本鎖RNAゲノムを含む内部リボヌクレオタンパ ク質コア(らせん状のヌクレオカプシド)と、マトリックスタンパク質(Ｍ)で内側
を覆われた外部リポタンパク質エンベロープとから構成される。Ａ型およびＢ型
インフルエンザの分節型ゲノムは、(−)極性の線状一本鎖RNA８分子(Ｃ型インフ
ルエンザの場合には７分子)からなり、このRNA分子は、ヌクレオカプシドを形成
するRNA依存性RNAポリメラーゼタンパク質(PB2、PB1およびPA)とヌクレオタンパ
ク質(NP)；マトリックスタンパク質(M1、M2)；リポタンパク質エンベロープから
突出する核輸送タンパク質(nuclear export protein; NEP)である２つの表面糖 タンパク質、即ち赤血球凝集素(HA)およびノイラミニダーゼ(NA)；並びに非構造
タンパク質(NS1)等の10種のポリペプチドをコードしている。インフルエンザウ イルスの遺伝子とそのタンパク質産物をまとめて下記の表Ｉに示す。
【０００７】
【表１】 赤血球凝集素(HA)とノイラミニダーゼ(NA)は、インフルエンザウイルスによっ
て発現される２つの主要な表面糖タンパク質である。HAは、糖複合体(glycoconj
ugate)の末端シアル酸残基へ結合することによって、ウイルス感染の第１段階で
あるビリオンの宿主細胞への付着を媒介する。HAの活性とは対照的に、NAは、糖
タンパク質および糖脂質に結合した末端シアル酸の除去を触媒する。感染過程に
おけるNAの役割は不明である。NAの活性は、新しく形成されたウイルスを、HA受
容体のシアル酸を消化することで感染細胞から放出するのに必要であると推定さ
れている。さらに、NAは、気道粘膜を通過するウイルスの動きを促進することが
でき、その結果ウイルスの感染力が増強される。
【０００８】 Ａ型インフルエンザ株の場合には、NAは血清学的な特性に基づいて９つのサブ
タイプに分類されている。Ｂ型インフルエンザウイルスの場合にはサブタイプは
存在しない。Ａ型およびＢ型インフルエンザウイルスのNAは、30％のアミノ酸配
列相同性を共有しているに過ぎないが(Kim, C.H.ら, 1997, Journal of the Ame
rican Chemical Society 119:681)、異なる株間でNAの酵素活性が同一であり、 酵素の活性部位の性質が高度に保存されていることが分かる。NA分子は、先端に
箱型の頭部領域を有する細長い茎状の四量体スパイクを形成する。NAのＸ線結晶
解析による構造は、A/Tokyo、A/TernおよびB/Beijingの３つのインフルエンザサ
ブタイプについて求められている(Varghese, J.H.およびColeman, P.M., 1991,
Journal of Molecular Biology 221:473; Bossart-Whitaker, P.ら, 1993, Jour
nal of Molecular Biology 232:1069; Burmeister, W.P.ら, 1992, EMBO Journa
l 11:49)。これらの構造より、NAは、対称なフォールディングパターンを示す６
つの４本鎖逆平行βシートがプロペラの羽根状に配置されていることが判明した
。結晶解析の研究より、活性部位にある結合ポケットの壁の内側と周囲を覆うア
ミノ酸は、全ての被験インフルエンザウイルス株間で高度に保存されていること
が判明している。
【０００９】 多くの研究がインフルエンザウイルスノイラミニダーゼのインヒビターの発見
に向けられてきたが(von Itzstein, M.ら, 1993, Nature 363:418-423; Kim, C.
H.ら, 1997, Journal of the American Chemical Society 119:681-690; Bischo
fberger, N.ら, 米国特許第5,763,483号、Kim, C.ら, 米国特許第5,512,596号、
Kim, C.ら, 国際特許出願第WO98/17647号、Bischofberger, N.ら, 国際特許出願
第WO96/26933号、Colman, P.ら, 国際特許出願第WO92/06691号、Luo, M.ら,米国
特許第5,453,533号)、依然として、インフルエンザの治療に使用できるノイラミ
ニダーゼの有効なインヒビターは存在しない。事実、目下インフルエンザの治療
に有効な薬物は存在しない。現在のところ、インフルエンザウイルス感染の治療
に利用し得る唯一の手段は、予防としてのワクチン接種である。しかしながら、
有効なワクチンの開発には、次の「インフルエンザの活動期」に流行する(endem
ic)インフルエンザ株を正確に予測することが必要である。従って、インフルエ ンザウイルス感染を有効に阻害する薬物が依然として求められているのである。
【００１０】2.3 インフルエンザウイルス感染の診断に利用し得る既存の方法 インフルエンザウイルス感染の臨床診断には、多岐にわたる方法が利用可能で
ある。古くは、細胞培養物へ生物学的サンプルを接種し、赤血球凝集阻止反応、
ELISA、または免疫蛍光アッセイを用いてウイルスの有無を判定することでイン フルエンザウイルスを検出していた。この方法は高感度で特異性も高いものであ
るが、培養、単離、および同定に要する時間が２〜10日間もかかってしまう。イ
ンフルエンザウイルス感染は通常自己限定性であるため、この方法は診断には有
用でない。
【００１１】 インフルエンザウイルス感染は、ウイルス特異的抗体またはウイルス特異的抗
原の有無を検出する免疫学的な方法で検出および診断することができる。ウイル
ス特異的抗体およびウイルス特異的抗原の検出には様々な免疫学的手法を用いる
ことができ、例えば、ELISA(酵素結合イムノソルベントアッセイ)、固相ラジオ イムノアッセイ、および免疫蛍光アッセイが挙げられる。ウイルス特異的抗体の
検出に基づくインフルエンザウイルス感染の臨床診断には、多くの個人が感染時
にインフルエンザウイルスに対する抗体を既に保有しているため、抗体価の上昇
を示すことが必要である。他方、免疫学的方法を用いるウイルス特異的抗原の検
出は、インフルエンザウイルス抗原を認識する抗体の使用に依存するため、従っ
てウイルスの新規株を検出することができない。さらに、インフルエンザウイル
スを検出する免疫学的方法には、アッセイを行うための検査室や専門技術の習熟
者が必要である。
【００１２】 インフルエンザウイルス感染は、ノイラミニダーゼの酵素活性に基づいて検出
および診断することもできる。これらのアプローチを利用する各種アッセイは、
文献に既述されている(例えば、Santer, U.V.ら, 1978, Biochimica et Biophys
ica 523:435-442; Potier, M.ら, 1979, Analytical Biochemistry 94:287-296;
Yolken, R.H.ら, 1980, Journal of Infectious Diseases 142:516-523; von I
tzstein, M.ら, 1993, Nature 363:418-423; Turner, G.ら, 国際特許出願第WO9
1/09975号、Turner, G.ら, 国際特許出願第WO91/09972号、Turner, G.ら, 国際 特許出願第WO91/10744号、Turner, G.ら, 国際特許出願第WO91/09971号、Reece,
P.A.ら, 国際特許出願第WO97/32214号、Liav, P.A.ら, 米国特許第5,719,020号
)。しかしながら、インフルエンザを診断するために上記のノイラミニダーゼの 酵素活性に基づくアッセイを利用することは、感度および／または特異性が低い
ため、問題点も多い。比色検出系および蛍光検出系は、いくつかの生物学的サン
プルで見られる低濃度のノイラミニダーゼを検出するには感度が不十分である。
蛍光検出系は比色検出系よりも感度が高いものの、生物学的材料の蛍光は、タン
パク質レベルが高いと蛍光シグナルが消光されるため、タンパク質レベルの影響
を受け易い。さらに、哺乳動物、細菌(Vibro Cholerae, Clostridium perfringe
ns, Streptococcus pneumoniae, およびArthrobacter sialophilus)並びにウイ ルス(パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、ニューカッスル病ウイ ルス、家禽ペストウイルスおよびセンダイウイルス)といった多岐にわたる生物 にノイラミニダーゼが含まれており、現在利用し得るノイラミニダーゼアッセイ
はこれらのウイルスを識別するには感度が不十分である。
【００１３】 検査室試験による臨床診断は、通常、個人や単独の場合にはコストが高くなり
過ぎてしまう。さらに、インフルエンザウイルス感染の診断に利用される試験は
時間がかかり、試験を行うための検査室が必要である。さらに、インフルエンザ
に感染した個人に適用できる信頼性の高い治療も今まで存在しなかった。従って
、インフルエンザウイルスに感染した個人は、医師によってなされた推定に基づ
く診断に頼るしかなく、信頼性の高い治療が行われることはほとんどなかった。
従って、インフルエンザウイルス感染のための単純で迅速かつ正確な診断キット
であって、医師の診療所で実施できるものが求められている。
【００１４】３．発明の概要 本発明は、インフルエンザウイルス感染の検出および診断並びに抗インフルエ
ンザウイルス活性を有する作用物質の同定に使用できるアッセイに関する。本発
明のアッセイは、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼ(NA)を標的として利
用し、インフルエンザウイルスNA、インフルエンザウイルスNAに特異的に結合す
るリガンドもしくは化合物、および／またはインフルエンザウイルスNAの酵素活
性を阻害するリガンドもしくは化合物を検出するための、高感度かつ高特異性の
アッセイ系を出願人が設計したことに一部基づくものである。本発明のアッセイ
は、ハイスループット様式で用いることができ、多様なコンビナトリアルライブ
ラリーに見られる多数の化合物をスクリーニングして候補の抗ウイルス薬を同定
したり化合物を誘導したりすることができ、また、フィンガープリントとして使
用できる活性プロフィールを取得して臨床サンプル中のインフルエンザウイルス
NAを検出することができる。本発明のアッセイ系はキットの形態にすることがで
き、このキットは、開業医が診察の時点でまたは患者自身が使用できるものであ
る。
【００１５】 一つの実施形態では、インフルエンザウイルスNAの存在またはNAの酵素活性の
存在を、臨床サンプル中のインフルエンザウイルスの検出用マーカーとして使用
する。このためには、検出可能なノイラミニダーゼインヒビター(例えば、標識 ノイラミニダーゼインヒビター)を臨床サンプルと接触させ、検出可能なノイラ ミニダーゼインヒビターがサンプルに結合すればNA(従って、インフルエンザウ イルス)が存在することを示すことができる。あるいは、ノイラミニダーゼで酵 素処理されると検出可能なシグナルを生成するNAに対する標識基質を使用してNA
の酵素活性を検出できる。少なくとも２つのアプローチが使用できる。即ち、サ
ンプルをインフルエンザNAに特異的な標識基質と組み合わせ、検出可能なシグナ
ルの生成によってインフルエンザNA(従って、インフルエンザウイルス)の存在を
直接示すことができる。あるいは、非特異的な標識基質をNA特異的インヒビター
の存在下または不在下で使用し、このアッセイで検出可能なシグナルが減衰すれ
ば、インフルエンザNA(従って、インフルエンザウイルス)の存在を間接的に示す
ことができる。
【００１６】 本発明の方法によれば、複雑な生物学的サンプル中に存在する何千もの潜在的
な結合部位に対する多様な分子のライブラリーの結合アフィニティーを評価し、
サンプルに特有なフィンガープリントとなるサンプルの結合アフィニティーのパ
ターンを形成することが可能である。本発明の一つの実施形態では、生物学的サ
ンプル中に存在する可能性のあるインフルエンザノイラミニダーゼの特異的およ
び非特異的基質とインヒビターとを含んでなる多様な分子のライブラリーの結合
アフィニティーを評価し、結合アフィニティーのパターンを形成してインフルエ
ンザの特定株を同定することが可能である。
【００１７】 別の実施形態では、本発明は、ノイラミニダーゼまたは別のウイルス成分との
相互作用能について新規な作用物質を同定するための迅速かつ特異的なハイスル
ープットスクリーニングアッセイに関する。一つの実施形態では、インフルエン
ザウイルスノイラミニダーゼと被験作用物質とを組み合わせ、被験作用物質の相
互作用を本発明のコンビナトリアルスクリーニング法を用いて検出することによ
って、ノイラミニダーゼと相互作用する作用物質を検出することができる。この
実施形態によれば、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼの特異的もしくは
非特異的標識基質をインフルエンザウイルスノイラミニダーゼおよび作用物質と
組み合わせることによって、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼ活性をモ
ジュレートする作用物質を検出することができる。基質の酵素処理を低下させる
作用物質は、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼ活性のインヒビターと考
えられる。
【００１８】 本発明はさらに、本明細書に記載のスクリーニングアッセイによって同定され
る新規な作用物質を包含する。本発明は、ノイラミニダーゼを介入(interventio
n)の標的として用いる、ウイルス感染症を治療するための治療様式および医薬組
成物に関する。本発明は、より具体的には、ノイラミニダーゼを標的にしてイン
フルエンザウイルス感染を治療するための治療様式および医薬組成物に関する。
本発明はまた、コンビナトリアル療法における本発明によって同定される抗ウイ
ルス剤とウイルス複製を阻害する他の既知の抗ウイルス剤との併用に関する。
【００１９】 本発明は、限定するわけではないが複雑な生物学的サンプル等のサンプル中に
含まれるNAの検出を可能にする高感度かつ迅速な均一アッセイ系を出願人が設計
したことに一部基づくものである。本発明の均一アッセイ系は、NAの検出に分離
工程を必要としない頑強な検出系を利用するものである。好適な検出系は蛍光偏
光と化学発光である。
【００２０】 本発明は、ノイラミニダーゼを一例として説明するが、これに限定されるもの
ではなく、本発明のコンビナトリアルスクリーニングアッセイは、ウイルス感染
の潜在的なインヒビターを同定するために、赤血球凝集素、核輸送タンパク質、
マトリックスタンパク質、ヌクレオタンパク質、およびRNA依存性RNAポリメラー
ゼタンパク質等の他のウイルスタンパク質のモジュレーターまたはインヒビター
の検出に適用することもできる。
【００２１】４．詳細な説明 本発明は、ウイルス性感染を検出および診断するための新規方法であって、非
常に多様化した化合物のライブラリーを生物学的サンプルと接触させることを包
含し、フィンガープリントを生成して生物学的サンプル間に存在する特異的な分
子の差異を検出する、本発明の検出法、およびコンビナトリアルスクリーニング
アッセイに基づく該方法に関する。本発明の検出法およびコンビナトリアルスク
リーニングアッセイの適用を成功させるには、少なくとも3つの要素が必要であ り、それらは、（1）多様なリガンドライブラリー（プローブ）、（2）臨床サン
プル供給源（コントロールおよび試験サンプル）、および（3）リガンド／受容 体相互作用の検出用高感度アッセイである。本発明のコンビナトリアルスクリー
ニング法は、ウイルス性感染症の診断のための非常に高感度のアッセイとして設
計することができる。他の実施形態において、本発明のコンビナトリアルスクリ
ーニングアッセイは、高感度のハイスループットのスクリーニング手法として、
ノイラミニダーゼと相互作用する新規作用物質の同定、例えば、インフルエンザ
ウイルス性感染症の治療に使用可能な作用物質の同定に用いられる。
【００２２】 本発明は、臨床サンプル中のインフルエンザウイルスのノイラミニダーゼを検
出することに基づく、インフルエンザウイルス性感染症を診断するための迅速で
特異的なアッセイ系およびキットに関する。本発明によると、インフルエンザの
ノイラミニダーゼに特異的に結合する標識基質を臨床サンプルと混ぜ合わせ、ノ
イラミニダーゼによる基質の酵素的プロセッシングにより、検出可能なシグナル
が産生される。このアッセイは、インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ、
つまり該ウイルスの存在を直接的に示す。あるいは、インフルエンザのノイラミ
ニダーゼの標識非特異的基質を、臨床サンプル、およびノイラミニダーゼ特異的
インヒビターと混ぜ合わせる。
【００２３】 このアッセイにおける検出可能なシグナルの減衰は、インフルエンザウイルス
のノイラミニダーゼ、つまり該ウイルスの存在を間接的に示す。他のアッセイは
、標識ノイラミニダーゼ特異的インヒビターとインフルエンザウイルスノイラミ
ニダーゼとの相互作用を検出することにより、臨床サンプル中のインフルエンザ
ウイルスの存在を検出する。このアッセイにおいて、臨床サンプル中にインフル
エンザウイルスのノイラミニダーゼが存在する場合にのみ、検出可能なシグナル
は産生されるだろう。
【００２４】 本発明は更に、薬物、リガンド（天然もしくは合成）、リガンドアンタゴニス
ト、ペプチド、小有機分子などの新規作用物質を、ノイラミニダーゼまたはいく
つかの他のウイルス性成分と相互作用する能力について同定するための、迅速で
、特異的な、ハイスループットのスクリーニングアッセイに関する。記載のアッ
セイ系は、インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼと相互作用する作用物質
、およびインフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ活性をモジュレートする作
用物質を同定するための方法を提供する。本発明のアッセイ系において、既知リ
ガンド（すなわち、特異的および非特異的基質およびインヒビターの多様なセッ
ト）および未知リガンド（すなわち、試験化合物）の両方を含むプローブのライ
ブラリーと、試験サンプルを含む生物学的サンプルを接触させ、試験化合物の結
合活性を既知化合物と比較する。インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ活
性をモジュレートする新規作用物質を同定するアッセイ系は、インフルエンザウ
イルスのノイラミニダーゼとその基質との相互作用を妨げる作用物質についての
スクリーニングに関する。更に本発明の他の実施形態において、ハイスループッ
トのコンビナトリアルスクリーニング法を用いて、ノイラミニダーゼの酵素活性
の非常に特異的なインヒビターを検出しうる。該基質の酵素的プロセッシングを
阻害して検出可能なシグナルを減衰させる作用物質は、インフルエンザウイルス
のノイラミニダーゼ活性のインヒビターと考えられ、またインフルエンザウイル
ス性感染症の治療に使用しうる。
【００２５】 本発明は、本明細書に記載のスクリーニングアッセイにより同定された新規作
用物質を含む医薬組成物を包含する。本発明は、ノイラミニダーゼまたはいくつ
かの他のウイルス成分を介入の標的として用いる、ウイルス性感染症の治療のた
めの治療法および医薬組成物に関する。本発明はまた、このスクリーニングアッ
セイにおいて同定された抗ウイルス性作用物質の、ウイルスの増殖を阻害する他
の既知の抗ウイルス性作用物質と組み合わせた使用にも関する。
【００２６】4.1 リガンド／プローブ 本発明の1つの実施形態によると、唾液、血液、血清、組織サンプル、細胞、 ウイルス、微生物、またはRNA、DNA、ペプチドおよびタンパク質を含む小さな有
機分子などの既知生物学的サンプルを、既知作用物質一式に晒して結合相互作用
のパターンを反映する一群の値を生じた場合に、「フィンガープリント」が確立
される。ノイラミニダーゼに基づく本発明のアッセイによると、多様なリガンド
ライブラリーには、例えば、特異的なノイラミニダーゼ基質、非特異的なノイラ
ミニダーゼ基質、特異的なノイラミニダーゼインヒビター、非特異的なノイラミ
ニダーゼインヒビター、多様な種のウイルスおよび微生物から単離されたノイラ
ミニダーゼのサンプル、ノイラミニダーゼに対して特異的および非特異的な抗体
、または上記の任意の変異が含まれる。
【００２７】 本発明のリガンドまたはプローブは、天然または合成いずれかの任意の生物学
的分子が挙げられ、DNA若しくはRNAを含む核酸、小さな有機分子、ペプチド、タ
ンパク質、糖タンパク質、多糖類、糖類または無機分子からなり得る。
【００２８】 該アッセイにおいてプローブとして用いることのできるノイラミニダーゼ基質
としては、N−アセチルノイラミン酸（NANA）、並びに、インフルエンザAおよび
Bノイラミニダーゼに特異的な基質であるが、パラインフルエンザ1、2、3、4ウ イルス、おたふくかぜ、RSウイルス、アデノウイルス性または細菌性ノイラミニ
ダーゼとは相互作用しない4,7−ジアルコキシNeu5Ac、およびインフルエンザAお
よびBノイラミニダーゼに対して非特異的な基質である4−アルコキシ−Neu5Ac（
米国特許第5,719,020号に記載されており、参照によりその全文を本明細書に組 み入れる）を含む4,7−ジアルコキシ−N−アセチルノイラミン酸誘導体；並びに
、4位を改変したNANA（WO91/09972に記載されており、その全文を参照により本 明細書に組み入れる）、9位を改変したNANA（WO91/10744に記載されており、そ の全文を参照により本明細書に組み入れる）、5位を改変したNANA（WO91/09971 に記載されており、その全文を参照により本明細書に組み入れる）、および7ま たは8位を改変したNANA（WO91/09945に記載されており、その全文を参照により 本明細書に組み入れる）を含むNANAの発色性(chromagenic)誘導体などのNANAの 誘導体が含まれるが、これらに限定されない。本発明のアッセイに従って用いら
れるノイラミニダーゼ基質としては、NANAの三糖類誘導体、および4−メチルウ ンベリフェリルNANA（米国特許第5,453,533号に開示されており、参照によりそ の全文を本明細書に組み入れる）などのNANAの発蛍光性誘導体が含まれる。該ア
ッセイに用いられる基質の濃度は、力価測定試験から得た結果に基づくようにす
る。インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ活性の検出に対し最高の感度を
示す基質濃度を用いることになる。
【００２９】 インフルエンザA0、A1、A2のノイラミニダーゼを阻害するスタフィロコッカス
・アウレウス(Staphylococcus aureus)糖リポタンパク質（GB2,238,049に開示さ
れており、参照によりその全文を本明細書に組み入れる）、インフルエンザAお よびBのノイラミニダーゼのインヒビター（米国特許第5,453,533号に開示されて
おり、その全文を参照により本明細書に組み入れる）などの非炭水化物インヒビ
ター、ウイルス性および細菌性ノイラミニダーゼを阻害するピペリジン化合物（
WO98/17647に開示されており、参照によりその全文を本明細書に組み入れる）、
ウイルス性および細菌性ノイラミニダーゼを阻害する芳香族化合物（米国特許第
5,512,596号に開示されており、参照によりその全文を本明細書に組み入れる） 、ウイルス性および細菌性ノイラミニダーゼを阻害する炭素環式ベースの化合物
（米国特許第5,763,483号に開示されており、参照によりその全文を本明細書に 組み入れる）、抗オルトミクソウイルスおよび抗パラミクソウイルス活性を有す
る2−デオキシ化合物（WO92/06691に開示されており、参照によりその全文を本 明細書に組み入れる）、2−デオキシ−2,3−ジデヒドロ−Na−セチルノイラミン
酸誘導体および類似体（WO91/16320に開示されており、参照によりその全文を本
明細書に組み入れる）、6−カルボキシアミドジヒドロピラン誘導体（WO96/3662
8に開示されており、参照により本明細書に組み入れる）、ウイルス性および細 菌性ノイラミニダーゼの両方を阻害するピペリジン化合物などの一般種のインヒ
ビター（WO96/26933に開示されており、参照によりその全文を本明細書に組み入
れる）を含む天然のインヒビターを含むがこれらに限定されない該アッセイ系に
おいて、既知のインフルエンザウイルスNA特異的および非特異的インヒビターを
プローブとして用いることができる。該アッセイは、該インヒビターがインフル
エンザウイルスのノイラミニダーゼへ結合する特異的性質が既知である事実を利
用する。該アッセイにおいて用いられるインヒビターの濃度は力価測定試験から
得た結果に基づくようにする。インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼの検
出に対し最高の感度を示すインヒビターの濃度を該アッセイ系において用いるこ
とにする。更に、該アッセイ系において用いるプローブは、インヒビターまたは
基質でありうる化合物からなることができる。該化合物は、6位のスペーサー基 を有するノイラミン酸の類似体などであり、固体表面の濃度／検出に対し、スペ
ーサーの末端に表面結合パートナーまたは検出可能な標識を有する（WO97/32214
に記載されており、参照によりその全文を本明細書に組み入れる）。
【００３０】4.1.1 リガンド／プローブの標識 インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼと相互作用できる分子を検出可能
に標識する方法は本明細書に記載されている。上述のアッセイ系において用いら
れるノイラミニダーゼ相互作用分子、ノイラミニダーゼ基質およびインヒビター
を該分子がノイラミニダーゼと相互作用する場合にシグナルが産生されるよう標
識し、タグを付し、またはコンジュゲートしうる。該ラベル、タグ、またはコン
ジュゲートは、蛍光化合物、放射性基剤、および化学発光化合物が含まれるがこ
れらに限定されない。
【００３１】 プローブ／リガンドを、フルオレセイン(FL)4,4−ジフルオロ−5,7−ジメチル
−4−ボラ−3a,4a−ジアザ−s−インダセン−3−プロピオン酸（BOまたはBODIPY
）、4−メチルウンベリフェリル、フルオレセイン、イソチオシアネート、ロー ダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o−フタル アルデヒドおよびフルオレスカミンが限定されずに含まれる蛍光化合物に検出可
能にコンジュゲートしうる。ノイラミニダーゼと蛍光で標識されたノイラミニダ
ーゼと相互作用する作用物質との相互作用は、分光蛍光計により、または好まし
くは、蛍光偏光による混合物を分析することにより、検出しうる。
【００３２】 ノイラミニダーゼの基質を、クマリンなどの蛍光性および発色性化合物にもコ
ンジュゲートしうる。これらの化合物を該基質にコンジュゲートする場合、それ
らは検出不可能である。インフルエンザウイルスノイラミニダーゼによるコンジ
ュゲート化合物の加水分解により、視覚的に検出可能な色素または分光蛍光計に
より検出可能な蛍光性化合物が産生される。
【００３３】 ノイラミニダーゼ特異的インヒビターを32P、125I、または135Iなどの放射性 同位体で標識することもできる。ガンマカウンター若しくはシンチレーションカ
ウンターまたはオートラジオグラフィーを使用する方法などにより、ノイラミニ
ダーゼとノイラミニダーゼ特異的インヒビターとの相互作用を検出しうる。
【００３４】 好ましい実施形態において、ノイラミニダーゼ特異的または非特異的基質を、
ヒドロキシフェニルジオキセタンなどの化学発光性化合物にコンジュゲートする
。この場合、ノイラミニダーゼによる基質の酵素処理は、光電子増倍管または電
荷結合素子(CCD)カメラにより検出しうるフォトンの発光を導く。
【００３５】 プローブと生物学的サンプルの成分との結合相互作用はまた、ELISA（酵素結 合イムノソルベントアッセイ）により検出されうる。該プローブは標識でき、ま
たはビオチン、ストレプトアビジンもしくはジゴキシゲニンなどの分子にコンジ
ュゲートしうる。これらの分子で標識されたプローブを、酵素にコンジュゲート
した標識に特異的な抗体を用いて検出しうる。他に、該プローブを、酵素にコン
ジュゲートされた、またはされていない抗体で標識しうる。酵素にコンジュゲー
トされていない抗体を、酵素にコンジュゲートされた第二の抗体で検出しうる。
酵素にコンジュゲートされた抗体を、例えば分光測光法、蛍光分析または視覚手
段などにより検出しうる化学的部分を産生するような方法で、適当な基質と反応
させる。抗体を検出可能に標識するのに用いることのできる酵素には、リンゴ酸
デヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカスヌクレアーゼ、δ−5−ステロイドイソ メラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロリン酸、デヒドロゲ
ナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカ
リホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクト
シダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−6−リン 酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼが
含まれるが、これらに限定されない。
【００３６】4.1.2 リガンドライブラリーの合成 本発明の方法は、当業者に公知の任意の方法に従って合成されるリガンドライ
ブラリーを使用することができる。好ましくは、従来の溶液相反応または固相合
成法を用いてそれらを作製する。第一級または第二級のアミン基、またはヒドロ
キシル基、またはチオール基、またはアルデヒド若しくはケトン、またはカルボ
ン酸を含む生物学的に活性な化合物などの目的の有機分子を、任意の蛍光性分子
（色素）で溶液中で直接的に標識し、対応する蛍光標識のリガンドを得ることが
できる。このような方法および色素は、Haugland, R.P.の「蛍光性プローブおよ
び研究化学物質のハンドブック（Handbook of Fluorescent Probes and Researc
h Chemicals）第6版（1996）」に記載されている。本発明の好ましい実施形態に
おいて、完全に標識するためにわずかに過剰の色素を用いて、DMF、DMSO、THFな
どの適当な極性有機溶媒または溶媒混合物中で溶液相合成を実施する。得られた
蛍光標識リガンドを、酸または塩基を用いる液−液抽出、結晶化およびクロマト
グラフィー（薄層またはカラム）などの有機合成の標準的な技術で精製する。ポ
リマーに結合するスカベンジャーを用いて、未反応の色素を除去し、続いて単純
濾過を行う液相−固相抽出などの他の精製法を以下の例に記載のように用いるこ
ともできる（Obrecht, DおよびVillalgordo, J. M.、Solid-Supported Combinat
orial and Parallel Synthesis of Small-Molecular-Weight Compond Libraries
、Pergamon、1998、Chapter 3を参照されたい）。
【００３７】スキームI 溶液相反応（生成物はスカベンジャー樹脂により精製される） 本発明の一つの実施形態において、この発明のライブラリーを従来の固相法を
用いて作製する。例えば、Bodanszky、Principles of Peptide Synthesis (Spri
nger-Verlag:1984)；Bodanszkyら、The Practice of Peptide Synthesis (Sprin
ger-Verlag:1984)；BaranyおよびMerrifield、The Peptides:Analysis, Synthes
is and Biology Vol. 2, Chapter 1 (Academic Press:1980)；Athertonら、Bioo
rg. Chem. Vol. 8(1979)を参照されたい。これは、固相合成が従来の合成方法体
系を超えるいくつかの利点を有するためである。例えば、大量の過剰試薬または
出発物質を用いて個々の反応を完結させることができ、また生成物が固相支持体
に結合しているので精製および単離を単純な濾過および洗浄により行うことがで
きる。更に、樹脂に結合する種の関連部位の単離は、多くの型の分子間副反応を
阻害する。
【００３８】 本発明のライブラリーを合成するのに特に適すると見られてきた固相合成法を
以下に記載する。蛍光標識リガンドの多様なライブラリーを迅速で効率的に形成
可能な方法は、2つの一般的なステップを含む。最初のステップにおいて、蛍光 性色素を固相支持体に共有結合で結合させる。第二のステップにおいて、必要に
応じて多数回繰り返すかもしれないが、固定色素を化合物または化合物の混合物
と反応させ、リガンドの所望の混合物を形成させる。本発明は、ライブラリーが
作製された固相支持体に結合するライブラリー、または異なる固相支持体に結合
するライブラリーを用いるアッセイを包含する。しかし、リガンドの混合物が第
三ステップにおいて該支持体から切断されるのが好ましい。この任意の第三ステ
ップは、スキームIIにおいて示される、本発明の合成法の好ましい実施形態に含
まれる： スキームII ここで、〈A〉、〈B〉、〈C〉、〈D〉および〈E〉は、所望の生成物または式(b) 〜(g)で示される中間生成物の形成に適当な反応条件を示し、カッコ（すなわち 、［ ］）は、任意の並列的または逐次的な反応、反応物、および／または生成
物を示す。
【００３９】 スキームIIに従って、式(a)の色素分子を選択する： 式(a) X−D−Y 式中、Dは蛍光部分であり、XおよびYは独立して、ハロゲン、アルコール、ニト ロ、チオール、エーテル、エステル、カルボン酸、α−ハロカルボン酸誘導体、
アミン、アミド、並びにそれらの保護および未保護誘導体からなる群より選択さ
れる官能基である。式(a)の色素分子の例として、ジクロロトリアジルアミノフ ルオレセイン(DTAF)、ジクロロスルホフルオレセイン(DCSF)、およびニトロフル
オレセインなどのフルオレセイン誘導体；トリプトファン誘導体；クマリン誘導
体；ナフチル誘導体；ビピリジン(bpy)誘導体；トリピリジン誘導体；シアニン ；ローダミンおよびRu(bpy)3などの有機金属複合体並びにそれらの誘導体が含ま
れるがこれらに限定されない。色素分子は、例えば大きさ、溶解性、固相反応条
件における分解に対する免疫性、吸収および発光波長、量子収量、並びに周囲の
化学的環境に対する量子収量および発光波長の感度など、多くの因子に依り選択
される。これらの因子の多くは、並びにこれらのおよび他の適当な化合物の合成
は、文献から容易に決定できる。Haugland, R.P.、Handbook of Fluorescent Pr
obes and Research Chemicals (6th ed. ;1996)を参照されたい。
【００４０】 また、スキームIIに従って、式(b)の反応基質を選択する： 式(b) 樹脂−L−E 式中、樹脂は固相合成に適当な任意の固相支持体を示し、Lは固相支持体に結合 するリンカーであり、EはLに結合する離脱基である。適当な固相支持体には、例
えば、ポリスチレン−ジビニルベンゼン(PS−DVB)コポリマーおよびポリエチレ ングリコール−PEG−PS−DVBコポリマーなどが含まれる。適当なリンカーが結合
した、および結合していないワング樹脂（ポリマーに結合された4−ベンジルオ キシベンジルアルコール）およびリンク樹脂は、Aldrich Chemical Co. (Milwau
kee, WI)、Novabiochem (San Diego, CA)およびAdvanced Chemtech (Louisville
, KY)から入手可能である。
【００４１】 リンカーL−Eは、固相支持体へのリンカーの結合がスキームIIにおける〈E〉 で示される反応条件において容易に切断されるように選択される。適当なリンカ
ーは、当業者には公知であり、例えば、ハロゲン、チオール、アルコール、エー
テル、エステル、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、ニトロ、アミン、アミド、
シラン、並びにそれらの保護および未保護誘導体などを含む。この種のリンカー
の固相支持体への結合は、当業者に公知の方法により行いうる。例えば、Bunin,
B. A.、The Combinatorial Index、Academic Press、1998を参照されたい。
【００４２】 上述の条件に加え、該リンカーL−Eは、反応条件〈A〉において式(a)の色素分
子の蛍光部分Dに共有結合を形成し、式(c)の固定色素を生じるように選択される
。
【００４３】 式(c) 樹脂−L−D−Y 樹脂、L、EおよびXに依存する適当な反応条件〈A〉は当業者に公知であるか、容
易に決定される。一般的に、これらには樹脂を増大させXと反応させる溶媒の使 用が含まれる。適当な溶媒には、例えば、ジメチルホルムアミド(DMF)、1−メチ
ル−2−ピロリジノン(NMP)、テトラヒドロフラン(THF)、CH2Cl2およびそれらの 混合物が含まれる。反応中に生成される酸を中和するために、反応条件〈A〉に は、ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)、トリエチルアミン、ジメチルアミノ ピリジン(DMAP)、またはN−メチルモルホリン(NMM)なども含まれうる。
【００４４】 式(c)の固定色素は、（スキームIIの式(g)により示される）ライブラリーのリ
ガンドを形成する上での土台として適している。しかし、反応部分Yが保護され ている場合、更なる反応の前に脱保護されなければならない。脱保護部分Y’を 形成する任意の脱保護は、スキームIIの〈B〉で示される反応条件において行わ れる。保護基に依り変化するこれらの条件は、当業者には公知である。Greene,
T. W.およびWuts, P.G.M.、有機化学の保護基（Protective Groups in Organic
Chemistry）(2nd ed. ;1991)を参照されたい。
【００４５】 その後、反応条件〈C〉において、固定色素を式E1R1G1の化合物と反応させ、 式(d)の化合物を得る。
【００４６】 式(d) 樹脂−L−D−R1−G1 式中、E1およびG1は同じであるか異なり、E1は離脱基または保護基であり、G1は
R1の末端または離脱基若しくは保護基のいずれかであり、R1は、適当な触媒およ
び／または脱保護条件において、R1を蛍光部分Dへ付加することを可能にする少 なくとも1つの保護または未保護の反応性部分を含む任意の化学断片を示してい る。適当な反応性部分には、ハロゲン、チオール、アルコール、エーテル、エス
テル、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、ニトロ、アミン、アミド、シラン、並
びにそれらの保護および未保護の誘導体などが含まれるがこれらに限定されない
。適当な反応条件〈C〉には、固相コンビナトリアルケミストリーにおいて開発 されてきたものが含まれる。例えば、Brown, R.、Contemporary Organic Synthe
sis、216 (1997)；Felder, E.R.およびPoppinger, D.、Adv. Drug Res.、30:111
(1997)；Balkenhohl, F.ら、Angew. Chem. Int. Ed. Engl.、35:2288 (1996)；
Hermkens, P.H.H.ら、Tetrahedron、52:4527 (1996)；Hermkens, P.H.H.ら、Tet
rahedron、53:5643 (1997)；Thompson, L.A.ら、Chem. Rev.、96:555 (1996)；C
hem. Rev.、97(2) (1997)を参照されたい。典型的な付加反応には、イミンを形 成するアルデヒドによる第一級アミンの付加が含まれる。該アミンは、例えば、
β−ラクタム、ピロリジン、チアゾリジノン（thiozolidinones）、およびアミ ドなどを含む多様で異なる部分と順番に反応しうる。酸性基は等しく順応性があ
り、Ugi多成分濃縮条件において、例えばアルデヒド、アミンおよびイソニトリ ルなどと共に用いて小さなアミドまたは複素環式化合物のどちらかを形成する。
【００４７】 スキームIIに示されているように、式(c)の固定色素分子を化合物の混合物と 反応させることもでき、それぞれの分子は異なっているが、一般式E1R1G1；すな
わち、E1R1G1＋(E1R1G1)’＋(E1R1G1)’’＋…＋(E1R1G1)ｉである。式中、ｉは
混合物中の化合物数であり、好ましくは、約50以下の整数である。このような場
合、式(d)の化合物の混合物が生成され、それぞれ異なるR1G1断片；すなわち樹 脂−L−D−R1G1＋樹脂−L−D−(R1G1)’＋樹脂−L−D−(R1G1)’’＋…＋樹脂−
L−D−(R1G1)ｌを有している。しかし、式(c)の化合物が式E1R1G1の1つの化合物
とだけ反応するのが好ましい。
【００４８】 多くの薬理学的に活性な化合物がアミンおよびカルボン酸などの反応性部分を
含むので、本発明はそのような化合物が式E1R1G1に包含されることを意図し、そ
の場合、更なる反応が所望となる場合もならない場合もあり得る。しかし、式(d
)の化合物のR1断片が反応性部分である場合、n−1の連続する付加反応を、スキ ームIIの〈D〉でひとまとめに示した反応条件において行いうる。〈D〉において
、nは蛍光部分Dに結合する部分の数を示し、約100以下の整数が好ましい。
【００４９】 上記の通り、これらの連続する付加反応のそれぞれは、単一化合物または式Ek RkGkの化合物の混合物の両方を用いることができる。ここで、kは2〜n−1の整数
であり、Rkは固定蛍光部分Dに結合するk番目の部分であり（Dに既に結合してい るk−1部分を介する）、EkおよびGkは同じであるか、または異なり、Eｋは離脱 基または保護基であり、GkはRｋの末端または離脱基若しくは保護基であり、Rk は、Rkの固定化合物への付加を可能にする少なくとも1つの反応性部分を含む任 意の化学断片を示している。適当な反応条件〈C〉には、Rkの固定蛍光性化合物 への付加を促進させる触媒、脱保護体などの使用が含まれている。
【００５０】 上述の反応の完結は、式(f)の固定化合物： 式(f) 樹脂−L−D−Rｎ または式(f)の固定化合物の混合物；すなわち樹脂−L−D−(R1R2R3…Rn)＋樹脂 −L−D−(R1R2R3…Rn)’＋樹脂−L−D−(R1R2R3…Rn)’’＋…＋樹脂−L−D−(R 1 R2R3…Rn)mのどちらかを形成する。ここで、mは、ｉが化合物の最大数を有する
EkRkGk混合物においてその化合物数に等しい場合、約ｉ×ｎの最高値を有する。
簡素化するために、リガンドの末端（例えばRn）はこれ以上付加反応を受けない
ので、Gｎを式(f)から省略する。
【００５１】 スキームIIの最終ステップにおいて、色素−リガンド化合物を反応条件〈E〉 において固相支持体から切断し、式(g)の化合物のライブラリーを得る： 式(g) P−D−Rn ここで、式(g)が、スキームIIにおいて示される反応により生成される可能性の ある全ての化合物および化合物の混合物を包含することを理解されよう。適当な
切断条件〈E〉は当業者に公知であり、樹脂とLとの間の結合に左右されるもので
ある。切断は酸性のまたは塩基性の条件において行われるか、または光誘発され
うる。多くの適当な切断法が文献により報告されている。例えば、いくつかの切
断反応は、スキームIIIに示されるように、塩化メチレン中で、式(f)の改変樹脂
をトリフルオロ酢酸(TFA)で処理することにより行う： ここで(j)はワング樹脂の誘導体であり、(k)はワングカルバミン酸樹脂の誘導体
であり、(l)はワングアミノ酸樹脂の誘導体であり、(m)はリンク樹脂の誘導体で
あり、(n)はリンクアミノ酸樹脂の誘導体であり、(o)はトリチルアミン若しくは
クロロトリチルアミン（すなわちX＝NH）またはアルコール（すなわちX＝O）樹 脂誘導体であり、L1は、固相反応条件において安定である任意の側鎖またはスペ
ーサーを示している。適当な側鎖の例には、置換および非置換アルキル基、アリ
ール基およびアラルキル基が含まれるが、これらに限定されない。
【００５２】 切断後、前記溶媒を好ましく除去して蛍光体ライブラリーを単離する。その後
、該ライブラリーを、ジメチルスルホキシド(DMSO)などの本発明のアッセイにお
いて用いるのに適当な溶媒に溶解する。
【００５３】 スキームIIの方法の特定の実施形態をスキームIV〜VIIIに示す。明確にするた
め、これらのスキームは混合物の反応および形成は示さない。しかし、個々の反
応それぞれが、数多くの並行反応の可能性を示すことを理解されよう。
【００５４】 スキームIIの一般的なアプローチの、簡易化した特定の実施形態をスキームIV
に示す： ここで、L1は、示されている反応条件において、結合反応を立体的に妨げず、あ
るいは阻害しない任意の部分であり、Pは、固相支持体から切断された後のL1の 末端を示し、R1およびR2は同じであるか、または異なり、好ましい構造および反
応の特性を有するライブラリーを提供するために望まれる任意の部分でありうる
。適当な部分の例として、置換および非置換アルキル、アリールおよびアラルキ
ルが含まれるが、これらに限定されない。
【００５５】 スキームIVに従って、ジアミノカルバミン酸ワング樹脂またはアミノ酸リンク
樹脂あるいはジアミノ／アミノ アルコール トリチル／クロロトリチル樹脂を
用いてDTAFを固相支持体に固定し、モノクロロトリアジルアミノフルオレセイン
樹脂を得る。この反応を、好ましくは室温で行う。約0.5〜約3当量の塩基（DIPE
A、トリエチルアミン、DMAPまたはNMMなど）と共に、DMF、NMP、THF、塩化メチ レン、またはそれらの混合物などの適当な溶媒中に、DTAFを溶解する。例えば、
DMFまたはNMP中で、室温においてトリアジン環の残存している塩化物を、過剰の
対称的なジアミン（好ましくは、約2〜約6当量）で置換することにより、更なる
合成のための新しい反応性基が生じる。この過程を所望の、多数の異なる反応物
と共に多数回繰返し、その後で、得られた蛍光性化合物または化合物の混合物を
反応性支持体から切断する。
【００５６】 スキームIIの一般的アプローチの他の実施形態をスキームVに示す： ここでDCSFは、樹脂に結合された第二級アルキルアミン（好ましくは環状第二級
アミン）による塩化原子の置換を介して固相支持体に結合する。従って、L1は環
状ジアミンの一部を形成する。適当な環状ジアミンには、例えば、ピペラジン、
ホモピペラジン、4,4’−トリメチレンジピペリジン、並びにそれらの誘導体お よび異性体が含まれる。示される通り、R1もまた環状ジアミンの一部を形成する
が、HNR1NHは適当な反応性基を有する任意の化合物で置き換えてもよい。R2およ
びR3は、本発明のライブラリーの蛍光性リガンド中に組み込むのに適当な任意の
部分を示し、例えば、天然アミノ酸の側鎖、置換および非置換アルキル、アリー
ルおよびアラルキルなどを含む。
【００５７】 スキームIVに示されるように、N−Fmocで保護されたアミノ酸を、標準的なア ミド形成条件において（すなわち、PyBrOP/DMAP/DMF中）、Fmocアミノ酸と蛍光 性化合物の遊離アミノ基との反応によって蛍光性樹脂に結合させる。DMF中でピ ペリジンを用いてFmoc基を除去した後に、例えば、酸塩化物、クロロホルメート
（chloroformate）またはイソシアネートなどを用いて、アミノ酸により生じる 新しいアミノ基を誘導化し、多様な蛍光標識化合物を得ることができる。適当な
イソシアン化化合物の限定されない例をスキームVIに示す： 当業者に容易に理解されるように、アミノ酸、酸塩化物、クロロホルメートおよ
びイソシアネートなどの反応性部分を含む、数多くの他の部分（すなわち、R4、
R5、…、Rn）を用いて、DCSFに結合するリガンドを形成しうる。同様に、スキー
ムIVのR2およびR3基が結合する化学断片は、反応条件を適当な方法で改変させた
場合に、色素分子に結合する側鎖を伸長させる任意の他のもので置き換えてもよ
い。
【００５８】 スキームIIの一般的アプローチの最終実施形態を、スキームVIIに示す： ここで、DTAFは、リンクアミノ酸樹脂に結合し、その後上述の方法により連続し て誘導化される。L1、R1およびR2は上記で定義される。
【００５９】 上述の方法に加え、蛍光標識リガンドライブラリーを、一般的な固相合成法に よっても作製しうる（Obrecht, D.およびVillalgordo, J.M.、Solid-Supported
Combinatorial and Parallel Synthesis of Small-Molecular-Weight Compound
Libraries、Pergamon、1998；およびBunin, B.A.、The Combinatorial Index、A
cademic Press、1998を参照されたい）。本発明の好ましい実施形態において、文
献に記載されている方法に従って、所望の化合物を固相支持体上で合成する。固
相支持体から切断する前に、固相支持体上の化合物を適当な色素で処理し、樹脂上
で蛍光標識リガンドを得る。その後、該リガンドを樹脂から切断し、蛍光標識リ
ガンドを得る。
【００６０】 一つのアプローチにおいて、固体に支持される反応性ブロックと、異なる反応
性ブロックとの段階的な反応により、該リガンドを線状形態で合成する。その後
、色素を最終ステップにおいて添加し、続いて切断して、スキームVIIIに示され
るような標識リガンドを得る。このスキームにおいて、蛍光標識N−ヒドロキシ キンゾリノン（N-hydroxyquinzolinone）を調製する。キンザリノン（quinzalin
ones）は最も一般的な、生物活性を有する窒素含有複素環式化合物の一つである
（Sinha, S.およびSrivastava, M.、in Progress in Drug Research、1994、vol
.43、143-238を参照されたい）。キンザリノンはヒトおよび動物において、生物
学的および薬理学的活性のスペクトルを幅広く示し、抗痙攣薬、抗細菌薬および
抗糖尿病薬として用いられてきた。従って、蛍光標識キンゾリン（quinzolines ）は、診断の適用および薬物の発見に有効でありうる。
【００６１】 他のアプローチにおいて、Ugi濃縮（Tempest, P.A.ら、Angew. Chem. Int. Ed
. Engl.、1996、vol.35、640-642を参照されたい）などの多成分濃縮反応を用い
た収束性の方法（convergent manner）で、前記リガンドを調製する。このアプ ローチを用いて、リンクアミン樹脂のような固相支持体上にアミン成分を固定化
する。そしてアルデヒド、Fmocで保護されたアミノ酸、およびイソシアン化合物
を、増大した樹脂に過剰にMeOH/DCMの混合物中で添加する（1：2 v/v）（スキ ームIX）。種々のアルデヒド、酸およびイソシアニドを組み合わせて使用するこ
とにより、多数のリガンドを合成しうる。
【００６２】 4.2 生物学的サンプル 本発明は、多種多様な供給源から入手しうるウイルス性ノイラミニダーゼを含
む、複合生物学的混合物またはサンプルを「フィンガープリント」する方法を提
供する。ノイラミニダーゼは、患者のサンプル、ノイラミニダーゼを発現するウ
イルスに感染した細胞、組換えにより発現されるノイラミニダーゼまたは標準的
な分子生物学およびタンパク質精製法を用いて得られる精製ノイラミニダーゼか
ら入手できる。本発明の方法を使用して、正常と異常（例えば、非感染または感
染細胞および／または組織）との間にある特異的な表現型の差異を同定しうる。
また本発明の方法を適用して、微生物、ウイルス、細菌、真菌類または寄生生物
の間の種を同定または区別しうる。
【００６３】 本発明の方法は、全ての型のリガンド／受容体相互作用を検出し、それにより
、ノイラミニダーゼ受容体は、精製タンパク質、NAまたはNA制御要素をコードす
る核酸、またはノイラミニダーゼを提示できる（すなわち、ノイラミニダーゼ特
異的プローブ若しくはリガンドと相互作用する）形の任意の分子でありうる。本
明細書において用いられるように、標的受容体――ノイラミニダーゼを、――「
生物学的受容体」、「受容体」、「生物学的標的」、「標的」および「生物学的
サンプルの成分」として意味する。
【００６４】 従って、本発明の一態様は、インフルエンザウイルス性感染症を特徴付ける方
法であり、該方法は、生物学的サンプル中に存在する標的またはノイラミニダー
ゼ受容体と、およびリガンドまたはプローブのライブラリーとの結合相互作用の
パターンを同定することを含み、ここで該結合相互作用のパターンは病理学の特
有のフィンガープリントを示す。
【００６５】 本発明に従って、「受容体」または「標的」は、ノイラミニダーゼ結合親和性
または酵素活性を提示するかまたは模倣する生物学的分子であり、酵素を含むタ
ンパク質、抗原、抗体、脂質、DNAおよびRNAを含む核酸、レクチンを含む炭水化
物、細胞表面タンパク質若しくは受容体などが含まれるがこれらに限定されない
。
【００６６】 前記方法において利用される生物学的サンプルは、血液血清、組織サンプル、
細胞抽出物、in vitro転写および翻訳系からの産物（例えば、Kingらに与えられ
た米国特許第5,654,150号の方法により入手できる）などの生物学的物質を含む がこれらに限定されない、生物学的分子の供給源である任意のサンプルでありう
る。更に、細菌、酵母、真菌類、ウイルス、原生動物などの病原性の生物を含む
体液またはそれら由来の抽出物を用いることもできる。これらの例において、病
原体中でタンパク質または他の受容対に対し特異性および高親和性を示すリガン
ドは新しい標的を示すことができ、病原体に対する抑制作用について試験されう
る。
【００６７】 本発明の方法に従ってスクリーニングされうる生物学的サンプルは多種多様の
供給源から入手しうる。例として、しかし限定されるものではないが、生物学的
サンプルまたは混合物は、患者から入手することができ、体液、血液、血清、粘
液（口、直腸、若しくは腸管の粘膜を含む）、尿、排泄物などを含みうる。更に
、生物学的サンプルは、骨髄細胞、リンパ球、免疫細胞、粘膜細胞（口、直腸、
若しくは腸管の粘膜系から得た）などを含む細胞サンプル、組織サンプル、生検
組織などを含みうる。更に他の実施形態において、生物学的サンプルまたは混合
物は、細胞溶解物若しくはそれらの一部、レクチンを含む炭水化物、タンパク質
（糖タンパク質、細胞表面受容体、ペプチドを含む）、DNA若しくはRNAを含む核
酸などを包含しうる。更に他の実施形態において、生物学的サンプルは、ウイル
ス、細菌、微生物若しくは寄生生物、または生物学的サンプル（例えば、微生物
含有物について試験する貯蓄水）などを含む体液でありうる、またはそれらから
入手される。
【００６８】 本発明の生物学的サンプルは、病気、疾患の病状を負った個体、またはウイル
ス、細菌若しくは他の微生物に病理学的に感染した個体から入手しうる。更に他
の実施形態において、組織、培地中の細胞、細胞抽出物などを毒素または病原性
作用物質に曝露することにより、あるいは培地中の細胞のゲノムを遺伝的に組換
えて、所与の、任意の病理または疾患に関連すると知られているタンパク質また
はペプチドをコードさせることにより、生物学的サンプルを生成しうる。
【００６９】 臨床サンプルの供給源とする生物学的物質のコレクションは、病院または国立
研究所施設から入手しうる。
【００７０】4.3 臨床サンプル中のインフルエンザウイルスノイラミニダーゼを検出するた めのスクリーニングアッセイ 所与の病状について、臨床材料がしばしば限られた量でしか入手できないこと
を認識すると、本発明の第3の要素である高感度アッセイ系は、僅か数μｌのサ ンプル中で生じている結合相互作用を検出可能でなくてはならず、さらにそれに
加えて、最適な親和性を下回る結合相互作用をも検出可能でなくてはならない。
本発明のアッセイ系はまた、サンプル中に存在する、リガンドのレセプターへの
非特異的結合を排除するかまたは大幅に減少することが可能でなければならない
。これらのファクターを認識すると、本発明のコンビナトリアルアッセイ系およ
び検出方法は、既存の系、例えば蛍光偏光、シンチレーション近接アッセイ（SP
A）、および酵素結合イムノソルベントアッセイ（ELISA）等に改善をもたらすも
のである。
【００７１】 本発明は、インフルエンザウイルスを検出および診断するための高速で特異的
なアッセイを提供する。より詳細には、本発明はインフルエンザウイルスノイラ
ミニダーゼ（NA）の検出方法を提供するものである。
【００７２】 インフルエンザウイルス感染をNAに基づいて検出するために利用できるアプロ
ーチは少なくとも3つある。1つのアプローチは、インフルエンザウイルスノイラ
ミニダーゼに対する標識化特異的基質（酵素処理の際に検出可能なシグナルを発
生する）を利用するものである。このアプローチは、ノイラミニダーゼ、および
したがってウイルスの存在を直接的に示すものである。別のアプローチは、イン
フルエンザウイルスNAに対する標識化非特異的基質（インフルエンザウイルスNA
特異的インヒビターが存在する場合を除き、酵素処理の際に検出可能なシグナル
を発生する）を利用するものである。このシグナルはインフルエンザウイルスNA
特異的インヒビターの存在により減衰される。このアプローチは、ノイラミニダ
ーゼ、およびしたがってウイルスの存在を直接的に示すものである。第3のアプ ローチはウイルスNAの標識化特異的インヒビター（NAとの相互作用の際に検出可
能なシグナルを発生する）を利用するものである。このアプローチは、ノイラミ
ニダーゼ、およびしたがってウイルスの存在を直接的に示すものである。
【００７３】4.3.1 インフルエンザウイルス感染の診断 インフルエンザ感染に関して、鼻（または咽頭）をぬぐった分泌液または吸引
液を個体から得ることにより個体を診断できる。続いて、これを少量の担体液中
に混合できる。好ましい実施形態においては、そのぬぐい液または吸引液を、約
0.5mlの担体液中に希釈する。標識化特異的または標識化非特異的NA基質を、担 体液中に添加するかまたは含有させることができる。NA基質と臨床サンプルとの
組み合わせは、インフルエンザウイルスNAによる酵素処理の際に検出可能なシグ
ナルを発生させ得る。非特異的基質を使用した場合に、検出された酵素活性がイ
ンフルエンザウイルスノイラミニダーゼによることを確実とするために、インフ
ルエンザウイルスノイラミニダーゼの特異的インヒビターを反応混合物中に添加
しなくてはならない。インフルエンザウイルスノイラミニダーゼの特異的インヒ
ビターを、インフルエンザNAに対する非特異的基質および臨床サンプルを含む反
応混合物中に添加することにより、検出可能シグナルが減衰するであろう。イン
フルエンザウイルス感染の診断におけるこれらの2つのアプローチは、インフル エンザノイラミニダーゼの酵素的活性を利用するものである。
【００７４】 インフルエンザウイルス感染の診断における別のアプローチは、鼻をぬぐった
分泌液または吸引液を個体から得て、ノイラミニダーゼに特異的である標識化イ
ンヒビターとともに担体液中に混合するものである。ノイラミニダーゼ特異的イ
ンヒビターと臨床サンプルの組み合わせは、ノイラミニダーゼが臨床サンプル中
に存在する場合には検出可能なシグナルを発生させるであろう。このアッセイに
おけるシグナルの検出がインフルエンザウイルスの存在を指示する。
【００７５】 好ましい実施形態では、これらのアッセイを医師の診療室で実施し、インフル
エンザウイルス感染を診断することができる。記載のアッセイ系は、高速、特異
的かつ正確な、インフルエンザウイルス感染の診断方法を医師に提供するもので
ある。別の好ましい実施形態においては、ノイラミニダーゼの検出方法は、およ
そ100またはそれに満たない粒子を検出可能とするのに十分な感度を有する。
【００７６】4.4 ノイラミニダーゼ活性をモジュレートする新規作用物質を同定するための ハイスループットスクリーニングアッセイ 別の態様においては、ノイラミニダーゼ活性をモジュレートする新規作用物質
を、ハイスループットアッセイ系で同定できる。これらの新規作用物質としては
、これらに限定されるものではないが、薬物、リガンド（天然または合成）、リ
ガンドアンタゴニスト、ペプチド、小有機分子等が挙げられる。ノイラミニダー
ゼ活性をモジュレートする新規作用物質の同定のために使用される1つのアプロ ーチは、インフルエンザウイルスまたはインフルエンザノイラミニダーゼ、およ
びインフルエンザNAの基質を含む担体溶液中に作用物質を混合することからなる
ものである。検出可能なシグナルは、作用物質がインフルエンザウイルスNA活性
を阻害しない場合に発生するであろう。一方ノイラミニダーゼ活性を阻害する作
用物質は、非特異的または特異的インフルエンザNA基質をインフルエンザウイル
スNAによって酵素処理することにより発生するシグナルを減衰させる、それらの
能力により検出されるであろう。
【００７７】4.5 ノイラミニダーゼと相互作用する新規作用物質を同定するためのハイスル ープットスクリーニングアッセイ 別の態様においては、ノイラミニダーゼと相互作用する新規作用物質は、高速
、特異的、ハイスループットのアッセイ系で同定できる。これらの新規作用物質
としては、これらに限定されるものではないが、薬物、リガンド（天然または合
成）、リガンドアンタゴニスト、ペプチド、小有機分子等が挙げられる。インフ
ルエンザウイルスノイラミニダーゼと相互作用する新規作用物質の同定のための
1つのアプローチは、作用物質を標識すること、およびノイラミニダーゼと相互 作用するそれらの作用物質をスクリーニングすることからなるものである。別の
アプローチは、ノイラミニダーゼを標識すること、およびノイラミニダーゼと相
互作用する作用物質をスクリーニングすることからなるものである。数多くの異
なるアッセイ系を作用物質とノイラミニダーゼとの間の相互作用を検出するため
に利用でき、限定するものではないが、シンチレーション近接アッセイ（SPA） 、DNA妨害(obstruction)アッセイ、蛍光偏光アッセイなどが挙げられる。
【００７８】4.5.1 シンチレーション近接アッセイ SPAアッセイにおいて、ノイラミニダーゼまたは作用物質は、シンチラント(sc
intillant)充填ビーズに結合され得る。標準的なSPAアッセイにおいては、ノイ ラミニダーゼはシンチラント充填ビーズに付加され、溶液中で放射性標識された
作用物質に対してスクリーニングされ得る。しかしながら、この配置の逆、すな
わち作用物質をビーズに結合し、ノイラミニダーゼを放射性標識することもまた
可能である。複数の作用物質を1つのビーズ上に合成できる。そのような系にお いては、シンチラントが充填され作用物質でコートされたビーズは、放射性標識
されたノイラミニダーゼを含む液相に浸される。標識されたノイラミニダーゼが
、付加された作用物質に親和性を有し、この2つが結合した場合には、その結果 としての放射性標識されたノイラミニダーゼとビーズ中のシンチラントとの近接
は、シンチラントの活性化および発光という結果となる。標識されたインフルエ
ンザウイルスノイラミニダーゼが作用物質に対する親和性を僅かに有するかまた
は有しない場合には、放射性標識物は、放射性崩壊に続いてエネルギー転移を起
こし得るほどシンチラントの十分近傍には蓄積しないであろう。SPAは洗浄ステ ップを要しないため、比較的低い親和性の作用物質/ノイラミニダーゼ結合相互 作用の検出も可能である。好ましい実施形態においては、ビーズはブロッキング
剤、例えばアルブミン、界面活性剤または粉ミルク等でブロックされているが、
それは非特異的吸着に関わる部位をブロックするためである。
【００７９】 SPAアッセイの改変型を競合型スクリーニング手順で使用できる。その場合に は、ノイラミニダーゼはシンチラント充填ビーズへ固定化され、続いて、ノイラ
ミニダーゼと相互作用することが知られている放射性標識作用物質を含む溶液中
に置かれる。続いて、ノイラミニダーゼに対する親和性が未知である作用物質を
混合物に添加されると、固定化されたレセプターに関して既知の作用物質と成功
裡に競合する基質は、いずれも発光量を減衰させるであろう。ハイスループット
スクリーニングにおけるSPAの使用は、Wang, P. Target Identification, Assay
Development and High Throughput Screening in Drug Discovery, in Sino-Am
erican Pharmaceutical Professionals Association (SAPA), The 5th Regional
Symposium on Drug Discovery and Development, 1997, Kenilworth, NJに記載
されている。
【００８０】4.5.2 DNA妨害アッセイ この系の原理は、単一の制限酵素部位および作用物質レポーター系を含むよう
に合成されたDNA構築物に対する制限酵素活性の存在また不在に基づいている。 構築物をノイラミニダーゼと接触させた場合、作用物質/ノイラミニダーゼ相互 作用は、制限酵素がその制限酵素部位へ接近することをブロックし、該部位にお
ける構築物の加水分解を防げる。インタクトのままである構築物を分離すること
ができ、作用物質/ノイラミニダーゼの相互作用が同定される。
【００８１】 以下は、DNA制限部位アッセイ系の説明である。5’末端にビオチンを有し3’ 末端にジゴキシゲニンを有する一本鎖DNAオリゴヌクレオチドを相補的なオリゴ ヌクレオチドとアニーリングさせるが、アニーリングした二本鎖オリゴヌクレオ
チドは、単一の制限エンドヌクレアーゼ部位を中央に位置するように含む。相補
的オリゴヌクレオチドは、末端アミノ基を有するリンカーを含むように改変する
。このアミノ基の位置は、この場合には、5’末端から5番目のAと6番目のTとの 間であり、二本鎖オリゴヌクレオチドに対する制限酵素の活性を妨害しないもの
とされている。その結果得られた構築物は、配列 GGATCC CCTAGG （配列番号＿＿）が制限部位であり、以下に示されるものである：
【化１】 このアミノ基は多様性ライブラリーの作用物質によって誘導され、下記の構築
物を形成することができる：
【化２】 アミノ基の誘導は、オリゴマーをCPGビーズに結合させたままでの一本鎖オリ ゴマーの合成と、続く該オリゴマーをビーズから分離するために用いるアルカリ
切断の際に実施することが可能であり、続いてオリゴマーは、相補的なビオチン
-ジゴキシゲニンオリゴマーにアニーリングさせることができる。作用物質を結 合させるための別の方法として、相補的なオリゴヌクレオチドの合成の際に誘導
させた塩基を取り込ませることも可能である。
【００８２】 前記制限部位に関して特異的な制限酵素とともに、当分野で周知の手順に従っ
てインキュベートした場合、誘導された構築物は制限部位で加水分解され、以下
に示された2つの部分になる：
【化３】 加水分解された混合物と、ストレプトアビジンまたはアビジンでコートされた
表面との反応により、ビオチン標識部分が固定化され、ジゴキシゲニン標識部分
は洗浄により排除される。固定化された混合物と抗ジゴキシゲニンペルオキシダ
ーゼ抗体との反応によって、ネガティブな結果が提供されるが、それはジゴキシ
ゲニン標識部分が、制限酵素による加水分解とそれに続く洗浄によって混合物か
ら除去されてしまっているためである。
【００８３】 インタクトな作用物質誘導構築物をインフルエンザウイルスノイラミニダーゼ
と混合した場合、ノイラミニダーゼに対して高い親和性を有する作用物質は、そ
れに結合するであろう。インキュベーション期間のあと、反応混合物を好適な緩
衝液で希釈し、制限酵素で処理し、ストレプトアビジンでコートされた表面とと
もにインキュベートして、ビオチン分子を固定化した。作用物質とノイラミニダ
ーゼとの間の相互作用は、制限酵素のその制限部位への接近をブロックし、DNA スカフォールドの加水分解を防げるであろう。
【００８４】
【化４】 作用物質とノイラミニダーゼとの間の相互作用が存在しない場合は、制限酵素
はDNAスカフォールドを加水分解し、スカフォールドのジゴキシゲニン標識部分 を遊離するであろう。標準的な酵素結合イムノソルベントアッセイ(ELISA）（抗
ジゴキシゲニン抗体を使用する）を、ストレプトアビジン表面上のジゴキシゲニ
ンの存在を検出するために使用することができる。検出可能なシグナルは、作用
物質とノイラミニダーゼとの相互作用が、制限酵素がその制限部位へ接近するこ
とをブロックしたことを示すものである。
【００８５】 このアッセイはいくつかの方法で改変され得る。第1には、ノイラミニダーゼ を作用物質の代わりにDNAスカフォールドに結合させてもよい。第2には、塩基の
欠失を二本鎖DNAスカフォールドの1つの鎖に挿入し、制限酵素の代わりにエンド
ヌクレアーゼを利用することができる。前述の例と同様に、作用物質とノイラミ
ニダーゼとの相互作用は、エンドヌクレアーゼ（すなわちマングマメヌクレアー
ゼまたはSIヌクレアーゼ）をギャップへの接近からブロックし、かくしてDNAス カフォールドの加水分解を防ぐであろう。アッセイを改変する別の方法は、DNA スカフォールドの3’末端をジゴキシゲニンの代わりに放射性塩基で標識するこ とである。さらに、このDNAスカフォールドは、特定の酵素または他の機構によ って切断できる結合を中央に位置するように有する任意のポリマー、またはペプ
チド、またはペプトイドによって構成される主鎖で置き換えることができ、その
切断はノイラミニダーゼと作用物質との相互作用によってブロックさせることが
できる。
【００８６】4.5.3 蛍光偏光 インフルエンザウイルスノイラミニダーゼに対して親和性を有する作用物質を
同定するために使用できる、別のアッセイ系は、蛍光偏光である。蛍光偏光アッ
セイは、蛍光標識された化合物の標識されていない生物分子への結合を測定する
ように設計されている。蛍光偏光をベースとしたアッセイでは、分子量約10,000
までの蛍光標識化合物を利用し、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼとの
相互作用を検出することができる。使用できる蛍光標識化合物のタイプとしては
、これらに限定されるものではないが、小有機分子、ペプチド、小タンパク質、
核酸、脂質および多糖類が挙げられる。蛍光分子は、水平（plan）偏光で励起さ
れた場合、固定平面において、励起および発光の間の期間に回転しない場合のみ
発光する。発光された光の偏光解消の度合は分子の回転量に依存し、分子の回転
量は分子のサイズに依存する。小さい分子は、それらが励起される時間とそれら
が蛍光を発光する時間との間に、より大きな分子よりも大きく回転する。このア
ッセイの最適条件は、標識された化合物が、それが結合する標識されていないノ
イラミニダーゼよりもはるかに小さい場合に存在するであろう。結合していない
小蛍光標識化合物は高速に回転し、発光される光は偏光解消する。インフルエン
ザウイルスノイラミニダーゼと蛍光標識化合物との間の相互作用は、蛍光標識化
合物の実効サイズ（effective size）を増加させ、それにより化合物の回転を減
少させ、発光された光は偏光されたままであるという結果となるであろう。発光
された、偏光された光の強度は可動偏光フィルターを検出器の正面に挿入するこ
とにより測定できる。強度は、90°離れた平面において測定し、多くの場合水平
強度および垂直強度と呼ばれる。いくつかの装置においては、励起フィルターが
可動式である一方、発光フィルターは固定されている。ある他の機械においては
、水平強度および垂直強度をファイバーオプティックスにより同時に測定する。
3つの会社、Pan Vera、BMG Lab Technologies、およびLJL Biosystemsは、研究 グレードの蛍光偏光装置を市販し、Abottは臨床検査室用装置を提供している。 蛍光偏光値は以下の等式で決定される。
【００８７】 偏光＝（垂直強度-水平強度）/（垂直強度+水平強度） 蛍光偏光値は、最も一般的には1000で割られ、ミリ偏光単位(mP)として表され
る。
【００８８】５．実施例 5.1 インフルエンザウイルス感染の診断 5.1.1 インフルエンザ診断のためのノイラミニダーゼ活性のアッセイ インフルエンザ様症状を患っている個体を、医師の診療室で診断することがで
きる。医師は、個体の鼻道を綿棒でぬぐい、そのぬぐい液を、N-アセチルノイラ
ミン酸（インフルエンザウイルスノイラミニダーゼの非特異的基質）を含む担体
溶液に混合する。臨床サンプル中にノイラミニダーゼが存在すれば、コンジュゲ
ートされる基質は加水分解されるであろう。該コンジュゲートされる非特異的基
質の加水分解が、インフルエンザウイルスの存在によるものであることを保証す
るため、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼの特異的インヒビターが混合
物に添加される。インフルエンザウイルスノイラミニダーゼの特異的インヒビタ
ー（例えばGR 217029またはGS4104等）を、コンジュゲートされるN-アセチルノ イラミン酸および臨床サンプルを含む担体溶液に添加することにより、ノイラミ
ニダーゼがこの基質を加水分解することを防げ、光は検出されないであろう。こ
のように、臨床サンプル中のインフルエンザウイルスの特異的な存在は、特異的
ノイラミニダーゼインヒビターを添加した際の検出可能なシグナルの減衰によっ
て示される。
【００８９】 あるいは、臨床サンプル中のインフルエンザウイルスノイラミニダーゼの存在
を、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼの特異的基質を使用して診断する
ことができる。この場合は、N-アセチルノイラミン酸のグリセリル側鎖を変えて
特異性をもたらすことができる。臨床サンプル中のインフルエンザウイルスノイ
ラミニダーゼの存在により、特異的基質は加水分解されるであろうし、さらに検
出可能なシグナルが発生されるであろう。
【００９０】 ノイラミニダーゼの特異的基質または非特異的基質は、化学発光化合物（例え
ばヒドロキシフェニルジオキセタン等）とコンジュゲートさせることができる。
ヒドロキシフェニルジオキセタンコンジュゲートN-アセチルノイラミン酸は、臨
床サンプル中のノイラミニダーゼ活性の存在下では、ヒドロキシフェニルジオキ
セタンのN-アセチルノイラミン酸酸素結合を切断し、それによりジオキセタンを
不安定化してフォトンの発光へつながる（スキーム10）。解放されたフォトンは
、光電子増倍管（ルミノメーター；luminometer）または電荷結合素子（CCD）カ
メラにより検出できる。検出された酵素活性が、インフルエンザウイルスノイラ
ミニダーゼによるものであることを保証するため、インフルエンザウイルスノイ
ラミニダーゼの特異的インヒビターを混合物に添加できる。インフルエンザウイ
ルスノイラミニダーゼの特異的インヒビターを添加することにより、ヒドロキシ
フェニルジオキセタンのN-アセチルノイラミン酸酸素結合の切断を防げ、それに
より発生されるシグナルを減衰させるであろう（スキーム10）。
【００９１】
【化５】 5.1.2 インフルエンザノイラミニダーゼの存在に基づくインフルエンザの診断の ためのアッセイ インフルエンザ様症状を患っている個体を、医師の診療室で診断することがで
きる。医師は、個体の鼻道を綿棒でぬぐい、そのぬぐい液を、蛍光標識された特
異的インヒビター（例えばGR 217029またはGS4104）を含む担体溶液に混合する 。サンプルを標識された特異的インヒビターとともに所定の時間にわたってイン
キュベートする。インヒビターとインフルエンザウイルスノイラミニダーゼとの
間の相互作用は、蛍光偏光アッセイにおいて検出される光の偏光に影響するであ
ろう。
【００９２】 臨床サンプルに関して検出された蛍光偏光値は、偏光の有意性を評価するため
に決定される必要があるであろう。臨床サンプルに関する偏光値は、陽性対照（
インフルエンザウイルスノイラミニダーゼおよび蛍光標識された特異的インヒビ
ターからなる）および陰性対照（クマリン標識された特異的インヒビターからな
る）と比較されるであろう。陽性対照に近い蛍光偏光値は、個体がインフルエン
ザウイルスに感染していることを示す。
【００９３】5.2 新規作用物質同定のためのハイスループットアッセイ 5.2.1 インフルエンザウイルスノイラミニダーゼをモジュレートする新規作用 物質同定のためのアッセイ インフルエンザウイルスノイラミニダーゼ活性をモジュレートする新規作用物
質を、作用物質とインフルエンザウイルスノイラミニダーゼおよびノイラミニダ
ーゼに対する標識化基質とを組み合わせることにより同定できる。用いられる基
質は、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼに対して非特異的（すなわちN-
アセチルノイラミン酸）であっても、または特異的であってもよい。インフルエ
ンザウイルスノイラミニダーゼをモジュレートする作用物質が存在しなければ、
コンジュゲートされる基質が加水分解されるという結果となるであろう。他方、
ノイラミニダーゼ活性をモジュレートする作用物質は、ノイラミニダーゼが基質
を加水分解することを防げ、さらに検出可能なシグナルが検出されるであろう。
【００９４】 ノイラミニダーゼの特異的基質または非特異的基質は、化学発光化合物（例え
ばヒドロキシフェニルジオキセタン等）とコンジュゲートさせることができる。
ヒドロキシフェニルジオキセタンコンジュゲートN-アセチルノイラミン酸は、イ
ンフルエンザウイルスノイラミニダーゼ活性の存在下では、ヒドロキシフェニル
ジオキセタンのN-アセチルノイラミン酸酸素結合を切断し、それによりジオキセ
タンを不安定化してフォトンの発光につながる。解放されたフォトンは、光電子
増倍管（ルミノメーター）または電荷結合素子（CCD）カメラにより検出できる 。インフルエンザウイルスノイラミニダーゼの活性部位と相互作用する作用物質
またはインフルエンザウイルスノイラミニダーゼと非競合的に相互作用する作用
物質は、ヒドロキシフェニルジオキセタンのN-アセチルノイラミン酸酸素結合の
切断を防げ、それによりシグナルを減衰させるであろう。
【００９５】5.2.2 インフルエンザウイルスノイラミニダーゼと相互作用する新規作用物質 同定のためのアッセイ インフルエンザウイルスノイラミニダーゼと相互作用する新規作用物質を、蛍
光結合インフルエンザウイルスノイラミニダーゼと作用物質と組み合わせること
により同定できる。作用物質を、蛍光標識ノイラミニダーゼとともに所定の時間
にわたってインキュベートする。作用物質とインフルエンザウイルスノイラミニ
ダーゼとの間の相互作用は、蛍光偏光アッセイにおいて検出される光の偏光に影
響するであろう。
【００９６】 作用物質に関して検出された蛍光偏光値は、偏光の有意性を評価するために決
定される必要があるであろう。作用物質に関する偏光値は、陽性対照（蛍光標識
インフルエンザウイルスノイラミニダーゼおよびノイラミニダーゼと相互作用す
る既知の作用物質からなる）および陰性対照（蛍光標識インフルエンザウイルス
ノイラミニダーゼからなる）と比較されるであろう。陽性対照に近い蛍光偏光値
は、作用物質がインフルエンザウイルスノイラミニダーゼと相互作用することを
示すであろう。このアッセイはまた、蛍光色素と結合されたインフルエンザウイ
ルスノイラミニダーゼではなく、蛍光色素と結合された作用物質についても実施
できる。
【００９７】 他のアッセイ系、例えばDNAスカフォールド妨害アッセイを利用して、作用物 質とインフルエンザウイルスノイラミニダーゼとの間の相互作用を測定できる。
さらには、これらのアッセイ系においては、作用物質またはインフルエンザウイ
ルスノイラミニダーゼを放射性塩基または化学蛍光化合物と結合することもまた
可能である。インフルエンザウイルスノイラミニダーゼと作用物質との間の相互
作用は、一方または他方が放射性塩基と結合している場合には、ガンマカウンタ
ーまたはシンチレーションカウンターによって検出できる。さらに、作用物質と
ノイラミニダーゼとの間の相互作用は、一方または他方が化学蛍光化合物によっ
て標識されている場合には、ルミノメーターにより検出できる。
【００９８】 本発明は、記載された特定の実施形態によって範囲を制限されるものではなく
、それらは本発明の個別の態様を単に説明するものとして意図されている。事実
、本明細書において示され記載されたものに加えて、様々な本発明の改変が、こ
れまでの記述および添付の図面から当業者には明白となるであろう。このような
改変は、本発明の範囲内に該当するものと意図されている。
【００９９】 本明細書において引用された全ての文献は、全ての目的のために、参照によっ
て全体として本明細書に組み入れられている。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｌ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ， ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，Ｌ Ｔ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ルビン，ポール，ディー． アメリカ合衆国 01776 マサチューセッ ツ州，サドバリー，グレイストーン レー ン 37 Ｆターム(参考） 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ02 QQ03 QQ05 QQ06 QQ07 QQ08 QQ10 QQ35 QQ42 QQ52 QQ79 QR14 QR32 QR43 QR48 QR50 QR56 QR58 QR66 QR67 QX02 4C084 AA17 ZB332 ZC202

Claims (29)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 インフルエンザウイルス感染を検出および／または診断する
    方法であって、 (a)生物学的サンプルを、化学発光標識したインフルエンザウイルスノイラミ ニダーゼに特異的な基質と接触させ、 (b)前記基質の酵素処理を化学発光シグナルの生成によって検出する ことを含んでなり、前記シグナルが生成することでインフルエンザウイルスの存
    在が示される前記方法。
  2. 【請求項２】 インフルエンザウイルス感染を検出および／または診断する
    方法であって、 (a)生物学的サンプルを、化学発光標識したインフルエンザウイルスノイラミ ニダーゼに非特異的な基質と接触させ、 (b)反応混合物へ、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼに特異的なイン ヒビターを添加し、 (c)前記基質の酵素処理を化学発光シグナルの生成によって検出する ことを含んでなり、前記シグナルが減衰することでインフルエンザウイルスの存
    在が示される前記方法。
  3. 【請求項３】 インフルエンザウイルス感染を検出および／または診断する
    方法であって、 (a)生物学的サンプルを、化学発光標識したインフルエンザウイルスノイラミ ニダーゼに非特異的な基質およびインフルエンザウイルスノイラミニダーゼの特
    異的インヒビターと接触させ、 (b)前記基質の酵素処理を化学発光シグナルの生成によって検出する ことを含んでなり、前記シグナルが減衰することでインフルエンザウイルスの存
    在が示される前記方法。
  4. 【請求項４】 インフルエンザウイルス感染を検出および／または診断する
    方法であって、 (a)生物学的サンプルを、蛍光標識したインフルエンザウイルスノイラミニダ ーゼの特異的インヒビターと接触させ、 (b)ノイラミニダーゼの存在を蛍光シグナルの生成によって検出する ことを含んでなり、前記シグナルが生成することでインフルエンザウイルスの存
    在が示される前記方法。
  5. 【請求項５】 前記シグナルの生成を蛍光偏光によって検出する、請求項４
    記載の方法。
  6. 【請求項６】 個体の鼻道もしくは咽頭を綿棒でぬぐってまたは吸引してサ
    ンプルを得る、請求項１、２、３または４記載の方法。
  7. 【請求項７】 適切な陽性対照および陰性対照を前記アッセイに使用する、
    請求項１、２、３または６記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記基質を化学発光化合物の前駆体へコンジュゲートさせる
    、請求項１、２または３記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記ノイラミニダーゼ特異的インヒビターが薬物、リガンド
    (天然もしくは合成)、ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、多糖、糖、または
    無機分子である、請求項２、３または４記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記生物学的サンプルが、インフルエンザウイルス感染の
    症状を示す患者から得られる臨床サンプルである、請求項１、２、３または４記
    載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記蛍光化合物が、4,4-ジフルオロ-5,7-ジメチル-4-ボラ
    -3a,4a-ジアザ-s-インダセン-3-プロピオン酸、フルオレセイン、イソチオシア ネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン
    、o-フタルアルデヒド(phthaldehyde)、フルオレスカミンまたはクマリンである
    、請求項４記載の方法。
  12. 【請求項１２】 インフルエンザウイルスノイラミニダーゼの活性をモジュ
    レートする新規な作用物質を同定するためのハイスループットアッセイであって
    、 (a)化学発光標識したインフルエンザウイルスノイラミニダーゼの基質と、イ ンフルエンザウイルスノイラミニダーゼとを被験作用物質の存在下で接触させ、 (b)前記基質の酵素処理を化学発光シグナルの生成によって検出する ことを含んでなり、前記シグナルが減衰することで前記作用物質がインフルエン
    ザウイルスノイラミニダーゼのインヒビターであることが示される前記アッセイ
    。
  13. 【請求項１３】 インフルエンザウイルスノイラミニダーゼと相互作用する
    作用物質を同定するためのハイスループットアッセイであって、 (a)化学発光標識した被験作用物質を、インフルエンザウイルスノイラミニダ ーゼと接触させ、 (b)ノイラミニダーゼと作用物質との相互作用を化学発光シグナルの生成によ って検出する ことを含んでなる前記アッセイ。
  14. 【請求項１４】 インフルエンザウイルスノイラミニダーゼと相互作用する
    作用物質を同定するためのハイスループットアッセイであって、 (a)蛍光標識した被験作用物質を、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼ と接触させ、 (b)ノイラミニダーゼと作用物質との相互作用を検出可能なシグナルの生成に よって検出する ことを含んでなる前記アッセイ。
  15. 【請求項１５】 前記シグナルの生成を蛍光偏光で検出する、請求項１４記
    載のアッセイ。
  16. 【請求項１６】 前記被験作用物質をインフルエンザウイルスノイラミニダ
    ーゼの代わりに標識する、請求項１２、１３または１４記載のアッセイ。
  17. 【請求項１７】 前記作用物質が、薬物、リガンド(天然もしくは合成)、ペ
    プチド、糖タンパク質、タンパク質、多糖、糖、または無機分子である、請求項
    １２、１３または１４記載のアッセイ。
  18. 【請求項１８】 前記基質が、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼに
    対して特異的または非特異的である、請求項１２、１３または１４に記載のアッ
    セイ。
  19. 【請求項１９】 精製インフルエンザウイルスまたは精製インフルエンザウ
    イルスノイラミニダーゼを用いる、請求項１２、１３または１４記載のアッセイ
    。
  20. 【請求項２０】 アッセイ系が、 (a)切断部位を有するスカフォールドをインフルエンザウイルスノイラミニダ ーゼと接触させ、その際、作用物質とノイラミニダーゼが相互作用すれば、スカ
    フォールドの切断部位がブロックされて検出可能なシグナルが生成され、 (b)特異的な触媒を混合物へ添加し、その際、相互作用が起こらなければ、ス カフォールドが切断されて検出可能なシグナルは生成されず、 (c)インフルエンザウイルスノイラミニダーゼと作用物質との相互作用を、検 出可能なシグナルの生成に基づいて同定する ことを含んでなる、請求項１２、１３または１４記載のアッセイ。
  21. 【請求項２１】 前記スカフォールドが二本鎖DNA、ポリペプチドまたは任 意のポリマーである、請求項２０記載のアッセイ。
  22. 【請求項２２】 前記DNAスカフォールド中の切断部位が、エンドヌクレア ーゼまたは制限酵素部位によって認識される、請求項２１記載のアッセイ。
  23. 【請求項２３】 サンプル中のインフルエンザノイラミニダーゼの有無を検
    出および／または診断するためのキットであって、 (a)化学発光標識したノイラミニダーゼの基質またはインヒビター、および (b)サンプル中における前記基質へのノイラミニダーゼの結合を検出する手段 を含んでなる前記キット。
  24. 【請求項２４】 前記基質がノイラミニダーゼに対して特異的である、請求
    項２３記載のキット。
  25. 【請求項２５】 前記インヒビターがノイラミニダーゼに対して特異的であ
    る、請求項２４記載のキット。
  26. 【請求項２６】 請求項１２、１３または１４記載のアッセイによって同定
    される、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼ活性を阻害する作用物質を、
    生理学上許容される担体中に含んでなる医薬組成物。
  27. 【請求項２７】 請求項１２、１３または１４記載のアッセイによって同定
    される、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼ活性と相互作用する作用物質
    を、生理学上許容される担体中に含んでなる医薬組成物。
  28. 【請求項２８】 前記作用物質が、薬物、リガンド(天然もしくは合成)、ペ
    プチド、糖タンパク質、タンパク質、多糖、糖、または無機分子である、請求項
    ２６記載の医薬組成物。
  29. 【請求項２９】 インフルエンザウイルス感染によって発症する疾患を治療
    するために投与される、請求項２７記載の医薬組成物。
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