HU223099B1 - Eljárás influenzavírus kimutatására és az eljárásban alkalmazható vegyületek - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya eljárás influenzavírus kimutatására olyanvegyületek alkalmazásával, amelyek az influenzavírus-- neuraminidázaktív helyeihez specifikusan tudnak kötődni, és amelyekneuraminidázzal nem hasíthatók. Az eljárásban használható újvegyületek szintén a találmány tárgyához tartoznak. ŕ

Description

A találmány diagnosztikai eljárásokra, főként influenzavírus-fertőzés diagnosztizálására alkalmas eljárásokra vonatkozik. A találmány szerinti új diagnosztikai eljárással az A és B típusú influenzavírus összes törzsei kimutathatók. Az eljárás neuraminidáz aktív helyeihez kötődni képes vegyületek alkalmazásán vagy ilyen vegyületek funkciós csoportokkal módosított származékainak az influenzavírus klinikai mintában történő kimutatására szolgáló kötő- és/vagy detektálószerként való alkalmazásán alapul. „Neuraminidázt megkötő vegyület” alatt a továbbiakban ezeket a vegyületeket és funkciós csoportokkal módosított származékaikat értjük. A találmány szerinti eljárás és vegyületek az influenzavírus-neuraminidázt nem specifikusan megkötő vegyületek jelenlétében vagy távollétében is használhatók.

A találmány elsősorban egy új vegyületcsaládra és ezek az A és B influenzavírus vizuális vagy műszeres kimutatásánál diagnosztikai szerként való alkalmazására vonatkozik. Közelebbről megjelölve a találmány olyan új neuraminsav (sziálsav)-származékokra vonatkozik, amelyek az influenza A- és B-neuraminázhoz kötődnek, és amelyek olyan funkciós csoportokkal rendelkeznek, amelyek lehetővé teszik e vegyületeknek valamely felülethez vagy kimutatható jelzőanyaghoz való kapcsolódását.

Az influenza A- és B-vírus az akut légzőszervi megbetegedések fő okozói, és csak az Egyesült Államokban évi 30-50 millióra becsülhető az általuk okozott fertőzések száma. Az influenza A felelős a nagy járványokért, így a sok millió ember halálát okozó 1919-es spanyolnátháért is. Sok bakteriális és vírusos fertőzés jelentkezhet az influenzáéhoz hasonló tünetekkel. A légzőszervi megbetegedést okozó vírusok gyors identifikálása lehetővé teszi, hogy az orvos a betegség korai stádiumában a legmegfelelőbb kezelést alkalmazza. Például egy korai és pontos diagnózis alapján eldönthető, hogy antibakteriális gyógymódra és a gyerekek és öregek kórházba szállítására van-e szükség.

Klinikai anyagokban lévő vírusok kimutatására széles körben alkalmaznak laboratóriumi vizsgálatokat, és számos különböző detektálási módszer áll rendelkezésre. így például a „Laboratory Diagnosis of Viral Infections” című szakkönyv (Marcel Dekker 1992, Ed. Ε. H. Lennete) általános ismertetést ad vírusok széles körének, így az influenzavírusnak a kimutatására alkalmas módszerekről.

Az influenza A és B diagnosztizálására számos teszt áll rendelkezésre. Az influenzavírusok azonosítása tradicionálisan sejttenyészetben történik, amely nagyon érzékeny és specifikus módszer. Sajnálatos módon az influenzavírus tenyésztéséhez, izolálásához és azonosításához 2-10 nap szükséges, és emiatt ez a módszer praktikusan hasznavehetetlen az orvos eligazítására a megfelelő terápia megválasztásában. Minthogy az influenzavírus-fertőzés normális körülmények között önkorlátozó, a diagnózisnak gyorsnak kell lennie ahhoz, hogy a gyógymód hatásos legyen. Más megfogalmazásban ez azt jelenti, hogy a sejttenyésztéses módszereknek az az egyedüli értelme, hogy visszamenőleges epidemiológiai információt szolgáltatnak.

Az influenza sejttenyésztéses módszerrel való kimutatásán kívül az utóbbi időben az influenza A specifikus kimutatására néhány gyors, közvetlen módszer vált ismertté. így például ismertettek egy monoklonális immunfluoreszcens vizsgálati (IFA) módszert [Spada, B. és munkatársai: J. Virol. Methods, 33, 305 (1991)] és legalább egy enzim immunológiai vizsgálati (EIA) módszert [Ryan-Poirier A. és munkatársai: Clin. Microbiol. 30, 1072 (1992)]. Ezeknek az influenza A kimutatására szolgáló gyors módszereknek az összehasonlításáról számos cikk jelent meg. így például Leonardi G. P. és munkatársai [J. Clin. Microbiol., 32, 70 (1994)] azt javasolták, hogy a minta direkt tesztelését és a tenyészetből történő izolálást együtt kellene alkalmazni, mert így a vírus gyors identifikálásával idejében tisztázható, milyen gyógymódra és a fertőzés elterjedésének megakadályozására milyen intézkedésekre van szükség, mimellett epidemiológiai célból tisztázható, hogy az adott közösségben terjedő influenzatörzseknek milyen az antigén-összetétele. Az IFA-módszerről azt írták, hogy munkaigényes, komoly technikai felkészültséget kíván, és gyakori eset, hogy az eredmények nehezen értelmezhetők. Az EIA-módszer (Direktigen FLU-A; Becton Dickinson Microbiology Systems) ugyanakkor sok esetben téves pozitív eredményt adott, és ezért azt javasolták, hogy ezt csak laboratóriumi célra használják a direkt immunfluoreszcens vizsgálatok kiegészítésére vagy ennek helyettesítésére [Waner, J. L. és munkatársai: J. Clin. Microbiol., 29, 479 (1991].

A gyors influenzatesztekkel kapcsolatos fenti problémákon kívül ezeknek a módszereknek egyéb hiányosságaik is vannak. Először is, a rendelkezésre álló módszerek egyikével sem lehet a B vírust kimutatni, és emiatt negatív eredmény esetében az orvos továbbra is bizonytalanságban van afelől, hogy milyen gyógymódot alkalmazzon. Másodszor, ha a gyorsteszt olyan immunológiai vizsgálaton alapul, amely az influenza A valamelyik proteinjére specifikus antitestek alkalmazásával jár, nehézséget fok okozni az olyan új vírustörzsek detektálása, amelyeknél az antigén proteinek szerkezetében genetikai sodródás (drift) vagy áthelyeződés (shift) történt. Márpedig az influenza A hírhedten hajlamos az ilyen változásokra.

Az influenzavírusok gyors identifikálására egy más típusú vizsgálati módszert egy sor szabadalmi leírás ismertet (például a WO 92/12256 számú nemzetközi szabadalmi bejelentés). A módszer az influenzavírus-neuraminidáz enzimjének egy kromogénszubsztrátját alkalmazza. A vizsgálatnak az az alapja, hogy ha az influenzaneuraminidáz felhasít egy speciális sziálsav-festék konjugált molekulát, így festődés válik láthatóvá. Ez a módszer nem elég specifikus, mert nem tud különbséget tenni a víruseredetű neuraminidáz és az enzim más formái, különösen a bakteriális eredetű neuraminidáz között. Valószínű, hogy a módszer nem is elég érzékeny, mert a víruseredetű neuraminidáz aktivitása viszonylag kicsi.

HU 223 099 Bl

A neuraminidáz az egyik legfontosabb, az influenzavírus felületén elhelyezkedő protein, és nagy szerepe van abban, hogy a vírus képes emberi sejteket megfertőzni. Régóta feltételezik, hogy azok a szerek, amelyek a neuraminidázenzimhez kötődnek, megakadályozhatják az influenzafertőzést, és komoly erőfeszítések történtek ilyen neuraminidázt megkötő anyagok felkutatására. Míg in vitro sok vegyület mutatkozott hatásosnak az influenzaneuraminidázzal szemben, csak az utóbbi időben vált bizonyossá, hogy az influenzafertőzéssel szemben in vivő védelmet nyújt olyan nagy hatású neuraminidázt megkötő anyagok alkalmazása, amelyek az enzim aktív centrumához kötődnek [Itzstein, M. és munkatársai: Natúré, 363, 418 (1993), valamint WO 92/06691 és WO 91/16320 számú saját korábbi nemzetközi szabadalmi bejelentéseink, amelyek részletes ismertetéseit a jelen leírás részének tekintjük]. Nevezetesen azt találták, hogy az (I) képletű, GG167 jelű, 2,3-didehidro-2,4-didezoxi-4-guanidinil-N-acetil-neuraminsav erősen kötődik az influenzaneuraminidázhoz, és in vivő erős antivirális hatással rendelkezik állatokon [Ryan, D. M. és munkatársai: Antimicrobal Agents and Chemotherapy, 38, 2270 (1994)] és humán önkénteseken [Hayden, F. G. és munkatársai: J. Am. Med. Assoc., 275, 295 (1996)].

Legújabban azt találták, hogy helyettesített ciklohexánrészt tartalmazó sziálsavszármazékok szintén erősen kötődnek az influenzavírus-neuraminidázhoz [Kim,

C. K. és munkatársai: J. Am. Chem. Soc. 119, 681 (1997)], különösen vonatkozik ez a (3R,4R,5S)-4-acetamido-5-amino-3-(l -etil-propoxi)-1 -ciklohexén-1 -karbonsavra (GS 4071).

A jelen találmány célja, hogy a korábbi ismert módszerek néhány hiányosságán túljusson, és egyszerű, érzékeny eljárást adjon az influenzavírusok kimutatására.

Azt találtuk, hogy azok a biológiailag aktív anyagok, amelyek Itzstein és munkatársai fenti cikke értelmében sztereokémiái szempontból komplementerek az influenzavírus-neuraminidáz aktív helyeivel, azaz a kötődés inhibiciós állandója (IC₅₀) ΙΟ⁶ M, vagy ennél kevesebb, így különösen az (I) képletű vegyület bizonyos származékai alkalmasak az influenzavírus kimutatására, egyrészt mert képesek a vírust szelektíven megkötni, másrészt mert ugyanakkor képesek valamely felülethez vagy detektálható összekötő csoporthoz kapcsolódni.

A találmány egyrészt eljárás influenzavírus kimutatására, oly módon, hogy a vélhetőleg vírust tartalmazó mintát egy olyan vegyület (neuraminidázt megkötő anyag) hatásának tesszük ki, amely vegyület képes az influenzavírus-neuraminidáz aktív helyeihez specifikusan kötődni, és amely neuraminidázzal nem hasítható.

A találmány szerinti eljárás az influenza A és influenza B összes ismert törzse esetében alkalmazható.

A neuraminidázt megkötő vegyület előnyösen egy térkitöltő csoporton (spacer) át egy felülethez vagy egy kimutatható jelzőanyaghoz kapcsolódik. A térkitöltő csoport elég hosszú kell hogy legyen ahhoz, hogy a vírusrészecske felületére a kimutatható jelzőanyag hatást gyakorolhasson.

A találmány szerinti eljárásban alkalmazhatunk olyan megoldást, hogy a vírust szelektíven befogjuk és betöményítjük, majd valamely szokványos eljárással a vírust detektáljuk; a detektálási módszernek nem feltétlenül kell szelektívnek lennie. így például a neuraminidázt megkötő vegyületet valamely hordozóanyagra, például egy membránra vagy polimerre visszük fel úgy, hogy amikor a vizsgálati anyag a hordozóra jut vagy a hordozón áthalad, az a vírusrészecskéket szelektíven befogja. A találmány egyik előnyös foganatosítási módja szerint a térkitöltő csoport olyan funkciós csoportban végződik, amely képes valamely felülethez kapcsolódni. A szakirodalom sok ilyen funkciós csoportot ismertet. A funkciós végcsoport például biotinilcsoport lehet, amely a neuraminidázt megkötő anyagot össze tudja kapcsolni egy olyan felülettel, amely avidinnel, sztreptavidinnel vagy biotin ellen termeltetett antitesttel van bevonva.

Egy másik megoldás például az lehet, hogy a funkciós végcsoport egy aminocsoport, amely a neuraminidázt megkötő vegyületet egy karboxilcsoportot tartalmazó felülethez tudja kapcsolni.

Alternatív megoldásként a szelektív detektálási megközelítés is alkalmazható; a vizsgálati mintában lévő vírusrészecskéket ilyenkor például a kimutatható jelzőanyaggal összekapcsolt neuraminidázt megkötő anyag hatásának tesszük ki úgy, hogy a neuraminidázt megkötő anyag szelektíven a vírusrészecske felületén lévő vírusneuraminidázhoz kötődjön. A kimutatható jelzőanyagot előnyösen kovalens kötéssel kapcsoljuk a neuraminidázt megkötő anyaghoz. Ezután a kimutatható jelzőanyagot valamely szokványos eljárással detektáljuk. Bizonyos detektálási eljárásoknál célszerű a mintát egy körülhatárolt területre koncentrálni, például egy adott felületen egy folt vagy egy csík formájában elhelyezni. Ezt többféleképpen is megtehetjük, például úgy, hogy a mintát szuszpendáljuk, vagy egy szűrőn vagy más hordozóanyagon nem szelektív módon befogjuk, majd a fent ismertetett módon, jelzett neuraminidázt megkötő anyag hatásának tesszük ki. Az influenzavírus nem szelektív befogására számos módszer ismeretes, így például a fetuinnal bevont felület [J. Virological Methods, 39, 111 (1992)], vagy egy alkalmas membrán [J. Virological Methods, 40, 77 (1992)] használata. Egy másik detektálási rendszer egy optikai vizsgálati eszköz alkalmazásán alapul (Miller, B. J. és munkatársai: 5 418 136 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás).

HU 223 099 Bl

További alternatíva a szelektív befogás és szelektív detektálás kombinációja, amely egy egyszerű kétlépcsős megoldás az influenzavírus kimutatására. Ez a megoldás azt a körülményt használja ki, hogy egy-egy influenzavírus-részecske gömb alakú felületén kb. 100 neuraminidázmolekula van szétszóródva [White, D. O.: Curr. Top. Microbiol. Immunoi., 63, 1-48 (1974)], s emiatt egyszerre egynél több neuraminidázt megkötő molekulával is összekapcsolódhat.

A neuraminidázt megkötő vegyület tehát felvihető egy hordozóra, például egy porózus membránra, hosszában egy vékony csík alakjában. Ezután visszük fel a vizsgálandó mintát a membrán másik végéről indulva, és hagyjuk, hogy végigfolyjon a megkötött vegyület sávján. A vizsgálandó mintában lévő bármely influenzavírus-részecskét a membránhoz kötött vegyület befogja és a keskeny sávban tartja. A teszt második lépcsőjében a neuraminidázt megkötő anyaggal összekapcsolt detektálható jelzőanyagot engedjük átfolyni a membránon a megkötött influenzavírus-részecskéket tartalmazó sáv mentén. Az influenzavírus jelenlétét az jelzi, hogy a megkötött vegyület helyén észrevehető változás történik a membránon. Alkalmas kromatográfiás módszert például a WO 92/21977 számú nemzetközi szabadalmi bejelentés (Chandler, Η. M.) ismertet.

A szakirodalom igen nagy számban ismertet alkalmas detektálási módszereket; ilyen például a biotinsztreptavidines módszer, az enzimek alkalmazásán alapuló módszerek (például torma-peroxidáz vagy alkalikus foszfatáz), a fluoreszcenciás, a kemilumineszcenciás módszerek, a kolloidális arany vagy a radioaktív izotóp alkalmazásán alapuló, valamint az agglutinációs módszerek. Valószínűsíthető, hogy a neuraminidázt megkötő anyaghoz egy térkitöltő csoporton át kapcsolódó kolloidális arany különösen alkalmas detektálható jelzőanyag lehet. Egy másik alkalmas detektálórendszerként a neuraminidázt megkötő anyaghoz kovalens kötéssel kapcsolódó torma-peroxidáz jöhet számításba. A szakember a szokásos próbálgatásos módszerrel könnyen találhat megfelelő detektálórendszert, és optimalizálhatja a módszer körülményeit.

Neuraminidázt megkötő anyagként minden olyan szer alkalmazható, amely az influenzavírus-neuraminidáz aktív helyeihez kötődik, feltéve, hogy nem tartalmaz olyan kimutatható jelzőanyagot vagy spacert, amelyet a neuraminidáz lehasíthat. A kötésnek nem kell irreverzíbilisnek lennie, és a kötődés mértékét kifejező állandó (IC₅₀) célszerűen 10~⁶ M vagy ennél jobb.

Megfelelő IC₅₀-értékkel rendelkező anyagokat ismertetnek például saját korábbi szabadalmi bejelentéseink (WO 92/06691 és WO 91/16320 számú nemzetközi szabadalmi bejelentések), továbbá az 5 453 533 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (Luo és társai), valamint a Gilead Science Inc. 5 512 596 számú amerikai egyesült államokbeli és WO 96/26933 számú nemzetközi szabadalmi bejelentései. Az ezekben a szabadalmi leírásokban ismertetett vegyületek alkalmazási területeként az influenzavírus-fertőzések kezelése és megelőzése szerepel, és nincs szó arról, hogy a vegyületeket diagnosztikai célra, az itt ismertetésre kerülő vizsgálati módszerek alkalmazásával is lehet hasznosítani,

A találmány tárgya kiterjed a találmány szerinti eljárásban hasznosítható neuraminidázt megkötő vegyületekre is, amelyek a neuraminsav (sziálsav) C₇- vagy azzal ekvivalens helyzetben a gyűrűhöz kapcsolódó elágazó oldalláncon valamely térkitöltő csoporttal szubsztituált analógjai, amely térkitöltő csoport valamely detektálható jelzőanyaghoz vagy felülethez kapcsolható, és amely analóg nem tartalmaz olyan detektálható jelzőanyagot vagy térkitöltő csoportot, amely neuraminidázzal lehasítható.

E vegyületek egyik előnyös csoportját a (II) általános képletű vegyületek alkotják,

ahol

R azidocsoportot, adott esetben szubsztituált guanidinocsoportot vagy adott esetben szubsztituált aminocsoportot,

R² COCHj-, COCF₃- vagy S0₂CH₃-csoportot,

X oxigénatomot vagy NH-csoportot,

W atomok - adott esetben az oxigén- és/vagy kénatomokat is beleértve - láncolatából felépülő olyan térkitöltő csoportot jelent, amelynek hossza 4 és 100 atom közötti, és adott esetben helyettesített szén- és/vagy nitrogénatomokat is tartalmaz,

Y jelentése OH, SH, NH₂, CH=O, CH=CH₂, CO₂H, CONHNH₂ vagy NH-biotinil-csoport vagy ezen végcsoportok valamelyikének védett formája;

és ha a guanidino- vagy az aminocsoporton szubsztituens van jelen, az adott esetben helyettesített 1-6 szénatomos alkil-, például metil- vagy etilcsoport, vagy aril-, például fenilcsoport, vagy amino-, hidroxil-, ciano- vagy alkoxi-karbonil-csoport lehet;

azzal a megszorítással, hogy az X-W-Y részlet jelentése OC(=Z)NR⁵R⁶ képletűtől eltérő, ahol Z oxigén- vagy kénatomot, R⁵ és R⁶ egymástól függetlenül hidrogénatomot vagy adott esetben amino-, hidroxilvagy merkaptocsoporttal helyettesített szénhidrogéncsoportot jelent, de R⁵ és R⁶ egyidejűleg nem lehet hidrogén.

A találmány szerinti neuraminidázt megkötő vegyületek egy másik előnyös csoportját a (HA) és (IIB) általános képletű vegyületek alkotják.

HU 223 099 Bl

(IIA)

Ezekben a képletekben R, R², W és Y a (II) általános képletnél megadottal egyező jelentésű, A és B oxigénatomot, CH₂-csoportot vagy egyes kötést jelent, és R¹ egy lipofil jellegű 1-12 szénatomos alkilcsoport, amely adott esetben 1 vagy több halogénatommal, cikloalkilcsoporttal, halogén-alkoxi- vagy alkoxicsoporttal vagy adott esetben helyettesített arilcsoporttal szubsztituált.

A térkitöltő csoport (W) alkalmas képviselői például a lineáris peptidek, oligoszacharidok, poliolok, polietilénglikol-csoportok, szénhidrogéncsoportok és az oxigén- vagy kénatommal, vagy karbonil, amido, karbamid vagy hidrazid funkciós csoporttal összekapcsolt szénhidrogéncsoportok. A W szubsztituens jelentheti ezen csoportok kombinációit is.

Az Y végcsoport megvédésére alkalmas védőcsoportok példái hidroxil-, merkapto- és karboxilcsoport esetén az észterezőcsoportok, aminocsoport és CONHNH₂-csoport esetén a karbamátképző csoportok és CH=O-csoport esetén a hidrazin- és acetálcsoport kialakítására alkalmas csoportok.

A „szénhidrogéncsoporf’-ba beleértjük a telített és telítetlen, egyenes és elágazóláncú szénhidrogéncsoportokat - az arilcsoportot is beleértve a megfogalmazásba ideértjük továbbá az ilyen csoportok kombinációit is.

A találmány szerinti (II) általános képletű vegyületek előnyös képviselői az R helyén guanidinocsoportot és R² helyén acetilcsoportot tartalmazó vegyületek.

A találmány szerinti vegyületek egy másik előnyös csoportjába azok a (II) általános képletű vegyületek tartoznak, amelyek X helyén oxigénatomot és Y helyén NH₂- vagy NH-biotinil-csoportot tartalmaznak.

A találmány szerinti vegyületek egy harmadik előnyös csoportjába azok a (IIA) általános képletű neuraminidázt megkötő anyagok tartoznak, amelyek R helyén amino-, R² helyén acetilcsoportot, X helyén oxigénatomot és R¹ helyén alkilcsoportot tartalmaznak.

A találmány szerinti (II) általános képletű vegyületek további előnyös képviselői azok a vegyületek, amelyekben a W térkitöltő csoport jelentése a következők valamelyike: CONH(CH₂)_n, CONH(CH₂)_nNHCONH(CH₂)_m, CHNH(CH₂)_n[NHCO(CH₂)₅]_m,

CO(CH₂)„NHCONH(CH₂)_m,

CO(CH₂)_nNHCO(CH₂)_qCOCH₂; és

CONH(CH₂)_nNHCO(CH₂)_q, ahol n és m értéke 2 és 12 közötti, és q értéke zéró vagy 1 és 12 közötti egész szám.

A szakember meg tudja választani a megfelelő detektálható jelzőanyagot és jelzőrendszert, és a fenti vegyületek alkalmasságát rutinmódszerekkel tudja tesztelni. A szakember tehát ki tudja választani a megfelelő módszert, például a fent leírt szelektív befogáson vagy szelektív detektáláson alapuló módszert. Szelektív befogás esetén a térkitöltő csoportnak olyan funkciós csoportban kell végződnie, amely képes arra, hogy szilárd hordozóanyagon megkötődjön. A szakirodalom sok ilyen funkciós csoportot ismertet.

A C₇- vagy azzal ekvivalens helyzetben végrehajtott W-Y szubsztitúció az alapvegyület neuraminidázt megkötő aktivitását nem csökkentheti szignifikáns mértékben; a kötődési hajlam nem csökkenhet 100-szorosnál nagyobb mértékben. A neuraminidázt megkötő képességet szokásos módszerekkel állapíthatjuk meg; egy in vitro biológiai vizsgálati módszert neuraminidázaktivitás meghatározására Warner és O’Brian ismertetnek [Biochemistry, 18, 2783-2787, (1979)]. In vitro biológiai vizsgálati módszert saját WO 91/16320 számú nemzetközi szabadalmi bejelentésünk is ismertet. Egy másik alternatíva, hogy radioaktív izotóppal jelzett, neuraminidázt megkötő vegyülethez kapcsolt neuraminidáz kötési aktivitását állapítják meg ismert módon.

A találmány szerinti eljárásban használható klinikai vizsgálati minták típusai például a torok- és orrkenet, a nasalis pharyngis-részből mosással nyert minta, az orr mosásával és öblítésével nyert minta, vagy ezek kombinációi. A mosással/öblítéssel nyert mintákat szükség esetén például ultracentrifugálással betöményíthetjük, de vélhetőleg erre csak akkor van szükség, ha a vírusrészecskék száma kicsi.

Világosan kell látni, hogy a térkitöltő csoporthoz kapcsolt jelzőanyag lehet antitestes detektáláshoz használható kitben alkalmazható epitóp, mint amilyeneket a 4 943 522 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (szabadalmas: Quindel) ismertet; hogy a detektáláshoz olyan optikai vizsgálati eszközt használhatunk, amelynek aktív receptív felülete van, mint amilyet például az 5 418 136 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás ismertet (szabadalmas: Biostar Inc.); hogy a detektálást olyan agglutinációs rendszerrel is végezhetjük, mint amilyet a 4 894 347 számú amerikai egyesült államokbeli és a WO 91/04492 számú nemzetközi szabadalmi bejelentés ismertet (mindkettőben a szabadalmas: Agen Limited). Úgy véljük, hogy a találmány szerinti eljárásban bioszenzorok is alkalmazhatók.

HU 223 099 Bl így például Nilsson, K. G. I. és C. F. Mandenius szénhidrát bioszenzorfelületen baktériumokat detektáltak [Biotechnology, 12, 1376-1378 (1994)].

A találmány szerinti néhány vegyület különösen erősen kötődik az influenzavírus-neuraminidázhoz (IC₅₀=10 ⁸ M, vagy jobb), ezek a vegyületek tehát terápiás célra is hasznosíthatók lehetnek.

A találmány szerinti vegyületek többféleképpen is előállíthatok. A (II) általános képletű vegyületek előállítására szolgáló eljárások is a találmány tárgyához tartóz- 10 nak. Az X helyén oxigénatomot tartalmazó (II) általános képletű vegyületek előállítási módjait az 1. reakcióvázlat mutatja. A reakcióvázlaton feltüntetett képletekben R, R² és Y a már megadott jelentésű, R’ alkilcsoportot és W térkitöltő csoportot jelent. Tehát a (III) általá- 15 nos képletű sziálsavszármazékot a 8,9-helyzetben védett (IV) általános képletű vegyületté alakítjuk. A védett forma például gyűrűs karbonát (A=C=O) vagy acetonid (A-CMe₂) lehet. A szabadon maradt 7-helyzetű hidroxilcsoportot vagy OCN-W’-Y képletű izocianátcsoporttal, vagy egy acil-kloriddal (CCCOL) acilezzük, ahol L kilépőcsoportot jelent, majd az L kilépőcsoportot 5 H₂N-W’-Y aminocsoportra cseréljük. A W’ általában 4-10 atom hosszúságú térkitöltő csoport, amelynek jelentése rendszerint W definícióján belül van, és W CONHW’ ekvivalense lehet. A W’ térkitöltő csoportot ezután kiteijeszthetjük vagy funkciós csoporttal egészíthetjük ki, például biotincsoportot toldva a lánc végéhez, mint ahogy a (VI) általános képletnél.

Végül az A és R’ védőcsoportokat, valamint az R és Y szubsztituenseken lévő bármely védőcsoportot standard módszerekkel eltávolítva kapjuk a (II) általános képletű vegyületet. A szakirodalom számos, a hidroxilés karbonilcsoport megvédésére alkalmas védőcsoportot ismertet, lásd például T. H. Green: Protecting Groups in Organic Synthesis (Wiley & Sons).

védőcsoport bevitel >

A (III) és (IV) általános képletű vegyületek ismertek, és előállításukat leírták, például a WO 91/16320 számú nemzetközi szabadalmi bejelentésben.

A találmány szerinti X helyén NH-csoportot tartalmazó vegyületeket sziálsavszármazékból kiindulva állítjuk elő egy olyan reakciósorral, amelynek során a C_T helyzet konfigurációja kétszer is változik. így például a (IV) általános képletű intermedierből a Mitsunobu-reakció körülményei között egy olyan, alkalmas kilépő csoporttal alkotott észter keletkezik a C₇-helyzetben, melynek a térállása megfordult [Anderson, N. G. és munkatársai: J. Org. Chem. 61, 7955 (1996)]. A C₇-észtert vala6

HU 223 099 ΒΙ mely nukleofil reagenssel, például egy aziddal lecserélve olyan, C₇-helyzetben nitrogénnel helyettesített származékot kapunk, amelynek újra megfelelő a konfigurációja.

Kong és von Itzstein [Tetrahedron Letters, 36, 957 (1995)] alternatív megoldást ismertet, amellyel sziálsavszármazékok C₇-helyzetébe nitrogént lehet bevinni.

Az (V) és (VI) általános képletű intermedierek többsége új vegyület, és ezek szintén a jelent találmány tárgyához tartoznak.

A találmányt a következő példákkal és ezekre való hivatkozással ismertetjük részletesen, anélkül, hogy igényünket a példákra korlátoznánk.

Az X helyén oxigénatomot tartalmazó (II) általános 5 képletű vegyületeket az 1. táblázat foglalja össze, és a (IIC) általános képlet szemlélteti. Azokban a vegyületekben, amelyekben az Y szubsztituens biotint tartalmaz, ott az Y amidvégződése kapcsolódik a biotin karboxilcsoportjához.

1. táblázat

^CO»^H

R

A vegyület száma	R	R2	w	Y
8	NHC(=NH)NH2	Ac	CONH(CH2)6NHCONH(CH2)6	nh2
11	NHC(=NH)NH2	Ac	CONH(CH2)6	nh2
13	NHC(=NH)NH2	Ac	CONH(CH2)6	NHBoc
17	NHC(=NH)NH2	Ac	CONH(CH2CH2O)2CH2CH2	nh2
19	NHC(=NH)NH2	Ac	CONH(CH2)6	NH-biotin
20	nh2	Ac	CONH(CH2)6(NHCONH(CH2)6	NHBoc
21	NHC(=NH)NH2	Ac	CONH(CH2)6(NHCOCH2)3	NH-biotin
22	NHC(=NH)NH2	Ac	CONH(CH2)6NHCO(CH2),!	NH-biotin
23	NHC(=NH)NH2	Ac	CONH(CH2)6NHCO(CH2)5	NH-biotin
25	NHC(=NH)NH2	Ac	CONH(CH2)6[NHCO(CH2)5]4	nh2
26	NHC(=NH)NH2	Ac	CONH(CH2)6[NHCO(CH2)s]4	NH-biotin
27	NHC(=NH)NH2	Ac	CONH(CH2)6NHCO(CH2)5NHCOCH2(OCH2CH2)i6	NH-biotin
28	NHC(=NH)NH2	Ac	CONH(CH2)6[NHCO(CH2)5]2	nh2
29	NHC(=NH)NH2	Ac	CONH(CH2)6[NHCO(CH2)5]4NH-COCH2CH2	CONHNHBoc
30	NHC(=NH)NH2	Ac	CONH(CH2)6[NHCO(CH2)5]4NH-COCH2CH2	conhnh7
31	NHC(=NH)NH2	Ac	CONH(CH2)6NHCOCH2CH2	co2h

Az (V) és (VI) általános képletű vegyületeket a 2. lélteti. A táblázatokban szereplő Boc butoxi-karboniltáblázat foglalja össze, és a (Via) általános képlet szem- 45 csoportot jelent.

A vegyület száma	A	R	W’	Y’
3	C=O	N3	CONH(CH2)6	NHBoc
4	c=o	n3	CONH(CH2)6	nh2

HU 223 099 Bl

2. táblázat (folytatás)

A vegyület száma	A	R	W’	Y’
5	C=O	N3	CONH(CH2)6(NHCONH(CH2)6	NHBoc
6	c=o	nh2	CONH(CH2)6NHCOH(CH2)6	NHBoc
7	c=o	NHC(=NH)NH2	CONH(CH2)6NHCONH(CH2)6	NHBoc
9	c=o	nh2	CONH(CH2)6	NHBoc
10	c=o	NHC(=NBoc)NHBoc	CONH(CH2)6	NHBoc
12	c=o	NHC(=NH)NH2	CONH(CH2)6	NHBoc
14	c=o	n3	CONH(CH2CH2O)2CH2CH2	NHBoc
15	c=o	nh2	CONH(CH2CH2O)2H2CH2	NHBoc
16	c=o	NHC(=NBoc)NHBoc	CONH(CH2CH2O)2CH2CH2	NHBoc
18	c=o	NHC(=NH)NH2	CONH(CH2)6	nh2
24	c=o	NHC(=NH)NH2	CONH(CH2)6[NHCO(CH2)5]4	NHBoc
32	c=o	NHC(=NH)NH2	CONH(CH2)6NHCOCH2CH2	CO2H

1. példa

5-Acetamido-7-{[6’-(6”-amino-hexil-ureido)-hexil]karbamoil-oxi}-guanidin-2,3,4,5-tetradezoxi-Dglicero-D-galakto-non-2-eno-piranozonsav (8) előállítása (A) Metil-[5-acetamido-4-azido-8,9-(monokarbonildioxi)-2,3,4,5-tetradezoxi-D-glicero-D-galakto-non-2-eno-piranozonát] (2)

1,32 g (4,03 mmol) metil-[5-acetamido-4-azido2,3,4,5-tetradezoxi-D-glicero-D-galakto-non-2-enopiranozonát]-ot (1) 32 ml vízmentes diklór-metán és 1,6 ml (12,45 mmol) Ν,Ν-dimetil-anilint tartalmazó 16 ml acetonitril elegyében szuszpendálunk. A szuszpenzióhoz jéghűtés közben, argonatmoszférában 20 perc alatt 3 ml 20%-os toluolos foszgénoldatot (6,06 mmol) csepegtetünk. A tiszta reakcióelegyet 2 órán át jégfiirdőn, majd 16 órán át szobahőmérsékleten keveijük, mielőtt szárazra párolnánk. A maradékot 300 ml etil-acetáttal és 50 ml vízzel összerázzuk, a szerves fázist először 32 ml 0,5 M sósavoldattal kb. 5-10 °C-on, majd háromszor 30 ml telített nátrium-klorid-oldattal mossuk, nátrium-szulfáttal vízmentesítjük és szárazra pároljuk. A maradékot flashkromatográfiával (oszloptöltet: szilikagél, eluens: etil-acetát/hexán 8:1) tisztítva kapjuk a (2) vegyületet fehér hab formájában. Kitermelés: 1,035 g (71%).

MS(FAB): 357 (M+1)⁺

IR (CHC1₃) cm-·: 3314, 2101,1774,1734,1654. •H-NMR (CDDI3) δ (ppm): 2,13 (s, 3H), 3,81 (s, 3H),

3,82 (d, 1H), 3,90 (d, 1H), 4,08 (dd, 1H), 4,21 (dd,

1H), 4,72 (d, 2H), 4,97 (ddd, 1H), 5,95 (d, 1H), 6,55 (d, 1H).

(B) Metil-{5-acetamido-4-azido-7-([6’(t-butoxi-karbonil-amino)-hexil]-karbamoil-oxi)-8,9-(monokarbonildioxi)-2,3,4,5-tetradezoxi-D-glicero-D-galakto-non-2eno-piranozonát} (3)

577 mg (1,62 mmol) (2) számú vegyületet 8 ml vízmentes piridinben oldunk, az oldathoz 275 mg (2,25 mmol) 4-(dimetil-amino)-piridint és 424 mg (2,11 mmol) 4-nitro-fenil-(klór-formiát)-ot adunk argonatmoszférában. A reakcióelegyet 3,5 órán át 30-35 °C hőmérsékleten keverjük, majd 567 mg (2,63 mmol) 6(t-butoxi-karbonil-amino)-hexil-amint és 405 mg (3,32 mmol) 4-(dimetil-amino)-piridint adunk hozzá. Az elegyet 24 órán át argonatmoszférában, szobahőmérsékleten keveijük, majd 400 ml etil-acetáttal hígítjuk. Az etil-acetátos oldatot háromszor 40 ml vízzel, majd 5-10 °C hőmérsékleten 40 ml 2 M sósavoldattal és végül háromszor 20 ml vízzel mossuk. A szerves fázist szárazra párolva 1,103 g nyersterméket kapunk, amelyet flashkromatográfiás módszerrel tisztítunk (szilikagél; először etil-acetát/hexán 2:1 arányú elegye, majd etil-acetát), így kapjuk a (3) számú vegyületet fehér hab formájában. Kitermelés: 726 mg (75%).

MS (FAB): 599 (M+1)+, 607 (m+9)+, (M+1+2H₂O-N₂)

IR (CHClj cm-·: 3328, 2734, 2099,1799,1732,1682. •H-NMR (CDClj) δ (ppm): 1,20-1,40 (m, 4H),

1,40-1,60 (m, 13H), 2,07 (s, 3H), 3,01-3,42 (m,

5H), 3,84 (s, 3H), 4,50-4,85 (m, 4H), 4,93 (m, 2H),

5,03 (m, 1H), 5,41 (m, 1H), 5,95 (d, 1H), 6,48 (d, 1H).

(C) Metil-(5-acetamido-7-[ {6’-[6’ ’-(t-butoxi-karbonilamino)-hexil-ureido]-hexil}-karbamoil-oxi]-4-azido8,9-(monokarbonil-dioxi)-2,3,4,5-tetradezoxi-Dglicero-D-galakto-non-2-eno-pirazonoát) (5)

200 mg (0,334 mmol) (3) számú vegyületet 2 ml trifluor-ecetsavban oldunk, és az oldatot 1 órán át argonatmoszférában, szobahőmérsékleten keverjük, majd csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A maradékot 5 ml metanolban oldjuk, és az oldatot újra szárazra párolva kapjuk a (4) számú vegyületet fehér hab formájában. •H-NMR (CDClj) δ (ppm): 1,25-1,70 (m, 8H), 2,08 (s, 3H), 3,0-3,5 (m, 4H), 3,81 (s, 3H), 3,88 (dd, 1H),

4,4-4,8 (m, 4H), 5,01 (ddd, 1H), 5,30 (dd, 1H), 5,51 (dd, 1H), 5,86 (d, 1H), 6,73 (d, 1H), 7,34 (d, 1H).

HU 223 099 Bl

A (4) számú vegyületet 30 mg (0,246 mmol) 4(dimetil-amino)-piridint és 0,15 ml (0,434 mmol) 6-(tbutoxi-karbonil-amino)-hexil-izocianátot tartalmazó piridinben (2 ml) oldjuk. A reakcióelegyet 18-20 °C hőmérsékleten, argonatmoszférában 72 órán át keverjük, majd 0,2 ml metanol hozzáadása után szobahőmérsékleten 3 órán át keverjük, majd 0,2 ml metanol hozzáadása után szobahőmérsékleten 3 órán át keverjük. A kapott reakcióelegyet szárazra pároljuk, és a maradékot 200 ml etil-acetáttal és 50 ml 1 M nátrium-dihidrogénfoszfát-oldattal összerázzuk. A szerves fázist kétszer 50 ml 1 M nátrium-dihidrogén-foszfát-oldattal, majd háromszor 25 ml vízzel mossuk, és csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A maradékot flashkromatográfiás módszerrel tisztítjuk (szilikagél: először etilacetát/hexán 8:1 arányú elegye, majd etil-acetát/metanol 10:1 arányú elegye), így kapjuk az (5) számú vegyületet fehér hab formájában. Kitermelés: 180 mg (72%).

Ή-NMR (CDC1₃+CD₃OD) δ (ppm): 1,12-1,42 (m,

25H), 1,80 (s, 3H), 2,90-3,18 (m, 9H), 3,70 (s,

3H), 3,90 (dd, 1H), 4,18 (dd, 1H), 4,32 (dd, 1H),

4.55 (d, 2H), 4,91 (m, 1H), 5,21 (sz, 1H), 5,35 (dd,

1H), 5,45 (sz d, 1H), 5,82 (d, 1H), 6,05 (dd, 1H),

7,82 (d, 1H).

(D) Metil-(5-acetamido-4-amino-7-[{6’-[6”-(t-butoxikarbonil-amino)-hexil-ureido] -hexil} -karbamil-oxi] 8,9-(monokarbonil-dioxi)-2,3,4,5-tetradezoxi-Dglicero-D-galakto-non-2-eno-pirazonát) (6)

180 mg (0,246 mmol) (5) számú vegyület, 35 mg (0,58 mmol) ecetsav és 30 mg 10%-os csontszenes palládium keverékét 10 ml metanol és 6 ml toluol elegyében keverés közben, szobahőmérsékleten 1 órán át hidrogénezzük. A reakcióelegyet ezután celiten átszűijük, a szűrőn maradt anyagot 30 ml metanollal mossuk, a mosófolyadékot a szűrlettel egyesítjük, és csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A maradékot szilikagél oszlopon flashkromatográfiás módszerrel tisztítjuk (etil-acetát/2-propanol/víz=5:2:1), így kapjuk a (6) számú vegyületet fehér hab formájában (46 mg; 47,5%), valamint a visszanyert kiindulási anyagot (80 mg; 44%).

Ή-NMR (CD₃IC) δ (ppm): 1,15-1,55 (m, 25H), 1,87 (s, 3H, AcOH), 1,92 (s, 3H), 2,90-3,10 (m, 8H),

3.56 (dd, 1H), 3,69 (s, 3H), 3,91 (dd, 1H), 4,20 (dd,

1H), 4,62 (d, 2H), 5,05 (dd, 1H), 5,46 (dd, 1H), 5,85 (dd, 1H).

(E) Metil-(5-acetamido-7-[{6’-[6’ ’-(t-butoxi-karbonilamino)-hexil-ureido]-hexil}-karbamoil-oxi]-4-[2,3bisz(t-butoxi-karbonil)]-guanidino-8,9-(monokarbonildioxi)-2,3,4,5-tetradezoxi-D-glicero-D-galakto-non-2-eno-piranozonát) (7) mg (0,065 mmol) (6) számú vegyületet 10 ml metanolban oldunk, az oldatot 100 mg Amberlite IRA-400 (OH) gyantával 30 másodpercig kezeljük, majd leszűqük. A gyantát 20 ml metanollal mossuk. A szűrletet a mosófolyadékkal egyesítjük és szárazra pároljuk. A maradék 41 mg szilárd anyag, amelyhez 5 ml metanollal elegyített 103 mg (0,332 mmol) N,N’-bisz(tbutoxi-karbonil)-lH-pirazol-1 -karboxamidint adunk. A reakcióelegyet argonatmoszférában, 30-35 °C hőmérsékleten 5 napon át keverjük, majd szárazra pároljuk. A maradékot flashkromatográfiás eljárással tisztítjuk (szilikagél; először etil-acetát/hexán 8:1 arányú elegye, majd etil-acetát) és kapjuk a (7) számú vegyületet fehér hab formájában. Kitermelés: 47 mg (88,8%).

IR (CHC1₃) cm-¹: 3312, 2933, 1802, 1728, 1643,

1564.

Ή-NMR (CDC1₃) δ (ppm): 1,20-1,60 (m, 43H), 1,87 (s, 3H), 2,19 (s, 1H), 2,90-3,20 (m, 8H), 3,73 (s,

3H), 4,17 (dd, 1H), 4,33 (sz d, 1H), 4,53-5,20 (m,

8H), 5,51 (sz, 21H), 5,88 (d, 1H), 6,66 (sz, 1H),

8,38 (d, 1H).

(F) 5-Acetamido-7-{[6’-(6”-amino-hexil-ureido)-hexil]-karbamoil-oxi}-4-guanidino-2,3,4,5-tetradezoxiD-glicero-D-galakto-non-2-eno-piranozonsav (8) mg (0,058 mmol) (7) számú vegyületet 5 ml metanol, 5 ml víz és 0,8 ml trietil-amin elegyében oldunk, az oldatot argonatmoszférában, szobahőmérsékleten 6 órán át keverjük, majd csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A maradékot 5 ml metanol és 5 ml víz elegyében oldjuk, és 1 g Dowex 50WX8 (H⁺) gyantával (CAS referenciaszám: 11 119-67-8; erősen savas ioncserélő gyanta) szobahőmérsékleten 1 órán át keverjük. A gyantát kiszűrjük, 1:1 arányú metanol-víz eleggyel mossuk, 20 ml 2 M ammónium-hidroxid-oldattal 2 órán át szobahőmérsékleten keveqük, majd leszűqük. A szűrletet szárazra pároljuk, a maradékot 5 ml vízben oldjuk és ismét bepároljuk. A szilárd maradékot 2 ml vízben oldjuk és fagyasztva szárítjuk. 16 mg (45,7%) (8) számú vegyületet kapunk fehér szilárd anyag formájában, amely pozitív guanidin (Sakaguchi)-reakciót ad. MS(FAB): 617(M+1)⁺

Ή-NMR (D₂O) δ (ppm): 1,10-1,17 (m, 18H), 2,07 (s, 3H), 2,85-3,20 (m, 6H), 3,50 (dd, 1H), 3,70 (dd,

1H), 4,10 (m, 2H), 4,45 (dd, 1H), 4,52 (dd, 1H),

4,95 (dd, 1H), 5,65 (d, 1H).

2. példa

5-Acetamido-7-[(6’-amino-hexil)-karbamoil-oxi]-4guanidino-2,3,4,5-tetradezoxi-D-glicero-D-galaktonon-2-eno-piranozonsav trifluor-ecetsawal alkotott sója (11) (A) Metil- {5-acetamido-4-amino-7-([6 ’-(t-butoxi-karbonil-amino)-hexil]-karbamoil-oxi)-8,9-(monokarbonil-dioxi)-2,3,4,5-tetradezoxi-D-glicero-D-galakto-non-2-eno-piranozonát} (9)

500 mg (0,836 mmol) (3) számú vegyületet [J. példa (B) rész] az 1. példa (D) részében leírt módon hidrogénezünk. 285 mg (59,6%) (9) számú vegyületet kapunk fehér hab formájában.

MS(FAB): 573 (M+1)⁺

IR (CHC1₃) cm-¹: 3385, 2935, 1794, 1725, 1670,

1542.

Ή-NMR (CD₃OD) δ (ppm): 1,15-1,48 (m, 17H),

1,91 (s, 3H), 2,96 (m, 4H), 3,51 (dd, 1H), 3,70 (s,

3H), 3,88 (dd, 1H), 4,21 (dd, 1H), 4,62 (d, 2H), 5,05 (ddd, 1H), 5,45 (dd, 1H), 5,87 (d, 1H).

(B) Metil-{5-acetamido-7-([6’-(t-butil-oxi-karbonilamino)-hexil]-karbamil-oxi)-4-[2’,3”-bisz(t-butoxikarbonil)]-guanidino-8,9-(monokarbonil-dioxi)9

HU 223 099 Bl

2,3,4,5-tetradezoxi-D-glicero-D-galakto-non-2eno-piranozonát} (10)

A (10) számú vegyületet (149 mg, 83,4%) fehér hab alakjában nyerjük 125 mg (0,219 mmol) (9) számú vegyületből az 1. példa (E) részében leírt eljárással. MS(FAB): 815(M+1)+

IR (CHC1₃) cm-·: 3313, 2978, 1805, 1727, 1643,

1610,1558.

‘H-NMR (CDC1₃) 6 (ppm): 1,11-1,82 (m, 35H), 1,91 (s, 3H), 2,98-3,21 (m, 4H), 4,13 (dd, 1H), 4,32 (dd,

1H), 4,50-4,80 (m, 3H), 4,91-5,22 (m, 3H), 5,45 (dd, 1H), 5,89 (d, 1H), 6,69 (sz d, 1H), 7,63 (d, 1H),

8,48 (d, 1H).

(C) 5-Acetamido-7-(6’-amino-hexil)-karbamoil-oxi-4guanidino-2,3,4,5-tetradezoxi-D-glicero-D-galakto-non-2-eno-piranozonsav trifluor-ecetsavval alkotott sója (11) mg (0,06 mmol) (10) számú vegyület 25 ml metanol, 25 ml víz és 5 ml trietil-amin elegyében argonatmoszférában, szobahőmérsékleten 6 órán át keverünk, majd az elegyet csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A maradékot kromatografáljuk (szilikagél; etil-acetát/2-propanol/víz 5:2:1 arányú elegye) a 0,4 Rpértékű frakciókat egyesítjük és szárazra pároljuk. A maradékot 2 ml trifluor-ecetsavval argonatmoszférában, szobahőmérsékleten 1 órán át keverjük, majd szárazra pároljuk. A maradékot 3 ml vízben oldjuk és fagyasztva szárítjuk. Kitermelés: 27 mg (69%) cím szerinti (11) számú vegyület.

MS (FAB): 475 (M+l)+ 589 (M+1+TFA)+ ‘H-NMR (D₂O) δ (ppm): 1,27-1,81 (m, 8H), 1,98 (s,

3H), 2,89-3,21 (m, 4H), 3,51 (dd, 1H), 3,69 (dd,

1H), 4,04 (m, 1H), 4,18 (dd, 1H), 4,46 (dd, 1H),

4,57 (dd, 1H), 4,96 (dd, 1H), 6,01 (d, 1H).

3. példa

5-Acetamido-7- {[6’-(t-butoxi-karbonil-amino)-hexil]karbamoil-oxi}-4-guanidino-2,3,4,5-tetradezoxi-Dglicero-D-galakto-non-2-eno-piranozonsav (13) mg (0,042 mmol) (9) számú vegyületet 5 ml vízben oldunk, és az oldathoz 44 mg (0,30 mmol) lH-pirazol-l-karboxamidint és 43 mg (0,63 mmol) imidazolt adunk szobahőmérsékleten. A reakcióelegyet argonatmoszférában 90-95 °C hőmérsékleten 22 órán át keverjük, majd szárazra pároljuk. A maradék - a nyers (12) számú vegyület - erős pozitív Sakaguchi-reakciót adott, jelezve a guanidincsoport jelenlétét. A maradékhoz 0,5 ml trietil-amint tartalmazó 5 ml vizet adunk, és argonatmoszférában, szobahőmérsékleten 16 órán át keverjük, majd szárazra pároljuk. A maradékot kromatografáljuk (szilikagél; 2-propanol/víz 3:1 arányú elegye). A 0,2 R_rértékű frakciókat egyesítjük, szárazra pároljuk és fagyasztva szárítjuk. 9 mg (37%) (13) számú vegyületet kapunk fehér szilárd anyag formájában. Kitermelés : 9 mg (37%).

MS(FAB): 575 (M+1)+ ‘H-NMR (D₂O) δ (ppm): 1,25-1,83 (m, 17H), 1,95 (s, 3H), 2,95-3,25 (m, 4H), 3,52 (dd, 1H), 3,63 (dd,

1H), 3,72 (dd, 1H), 3,98 (dd, 1H), 4,10 (m, 1H),

4,46 (dd, 1H), 4,52 (dd, 1H), 5,62 (d, 1H).

4. példa

5-Acetamido-7-({2-[2-(2-amino-etoxi)-etoxi]etil}-karbamoil-oxi)-4-guanidino-2,3,4,5-tetradezoxi-D-glicero-D-galakto-non-2-eno-piranozonsav (17) (A) Metil-(5-acetamido-4-azido-7-[ {2’-[2”-(2”’-[tbutoxi-karbonil-amino]-etoxi)-etoxi]-etil}-karbamoil-oxi]-8,9-(monokarbonil-dioxi)-2,3,4,5-tetradezoxi-D-glicero-D-galakto-non-2-eno-piranozonát) (14)

Az 1. példa (B) részében leírtakhoz hasonlóan 356 mg (1 mmol) (2) számú vegyületből kiindulva és reaktánsként 2-[2’-[2”-(t-butoxi-karbonil-amino)-etoxi]-etoxi]etil-amint alkalmazva 420 mg (67%) (14) számú vegyületet állítottunk elő fehér hab formájában.

MS (FAB): 631 (M+l)+ 639 (M+9)+

IR (CHC1₃) cm ’: 3328, 2934, 2099, 1802, 1734, 1658,1537.

‘H-NMR (CDC1₃) δ (ppm): 1,41 (s, 9H), 1,97 (s, 3H), 3,12-3,64 (m, 12H), 3,78 (s, 3H), 4,41-4,71 (m, 4H), 5,01 (d, 2H), 5,12 (m, 1H), 5,43 (dd, 1H), 5,67 (sz, 1H), 5,91 (d, 1H), 6,83 (sz d, 1H).

(B) Metil-(5-acetamido-4-amino-7-[{2’-[2”-(2”’-[t-butoxi-karbonil-amino]-etoxi)-etoxi]-etil}-karbamoiloxi]-8,9-(monokarbonil-dioxi)-2,3,4,5-tetradezoxi-dglicero-D-galakto-non-2-eno-piranozonát) (15).

Az 1. példa (D) részében leírt módon 400 mg (0,634 mmol) (14) számú vegyület katalitikus hidrogénezésével állítottuk elő a (15) számú vegyületet, amely kromatografálást (szilikagél; etil-acetát/2-propanol/víz 5:2:1 arányú elegye) követően fehér hab. Kitermelés: 144 mg (37,5%).

‘H-NMR (CD₃OD) δ (ppm): 1,32 (s, 9H), 1,82 (s, 3H), 1,89 (s, 3H), AcOH), 3,04-3,22 (m, 4H), 3,36-3,53 (m, 8H), 3,68 (s, 3H), 3,72 (sz d, 1H),

3,98 (dd, 1H), 4,25 (dd, 1H), 4,62 (d, 2H), 5,03 (ddd, 1H), 5,43 (dd, 1H), 5,84 (d, 1H).

(C) Metil-(5-acetamido-7-[{2 ’-[2 ”-(2 ’ ”-[t-butoxi-karbonil-amino]-etoxi)-etoxi]-etil}-karbamoil-oxi]-4[2’ ,3 ”-bisz(t-butoxi-karbonil]-guanidino-8,9-(monokarbonil-dioxi)-2,3,4,5-tetradezoxi-D-glicero-D-galakto-non-2-eno-piranozonát) (16).

Az 1. példa (E) részében leírt módon 101 mg (0,167 mmol) (15) számú vegyületbe guanidincsoportot viszünk be, és a (16) számú vegyületet fehér hab formájában kapjuk. Kitermelés: 72 mg (51%).

‘H-NMR (CDC1₃) δ (ppm): 1,42 (s, 9H), 1,49 (sz, s,

18H), 1,89 (s, 3H), 3,12-3,65 (m, 12H), 3,78 (s, 3H), 4,07 (m, 1H), 4,32 (sz d, 1H), 4,55-4,75 (m, 2H), 490-5,35 (m, 3H), 5,40-5,68 (m, 2H), 5,91 (d, 1H), 6,38 (d, 1H), 8,42 (d, 1H).

(D) 5-Acetamido-7-[{2’-[2”-(2”’-amino-etoxi)-etoxietil}-karbamoil-oxi]-4-guanidino-2,3,4,5-tetradezoxiD-glicero-D-galakto-non-2-eno-piranozonsav (17)

Az 1. példa (F) részében leírt módon 70 mg (0,082 mmol) (16) számú vegyületről a védőcsoportot eltávolítjuk, és fehér szilárd anyag formájában 25 mg (60%) (17) számú vegyületet kapunk, amely pozitív Sakaguchi-reakciót ad.

MS(FAB): 507 (M+l)+

HU 223 099 Bl

Ή-NMR (D₂O) δ (ppm): 1,96 (s, 3H), 3,14-3,78 (m,

14H), 4,12 (m, 2H), 4,41 (dd, 1H), 4,52 (dd 1H),

4,93 (dd, 1H), 5,68 (d, 1H).

5. példa

5-Acetamido-7-{[6’-(biotinil-amino)-hexil]-karbamoil-oxi} -4-guanidino-2,3,4,5-tetradezoxi-D-gliceroD-galakto-non-2-eno-piranozonsav (19)

176 mg (0,216 mmol) (10) számú vegyületet 5 ml trifluor-ecetsavban argonatmoszférában, szobahőmérsékleten 1 órán át keverünk. Az elegyet csökkentett nyomáson bepárolva kapjuk a (18) számú vegyületet, amelyet N-hidroxi-szukcinimid biotinnal alkotott észterével 27 mg (0,32 mmol) nátrium-hidrogén-karbonátot és 34 mg (0,32 mmol) nátrium-karbonátot tartalmazó vizes acetonban (7,5 ml víz és 15 ml aceton) 5 órán át szobahőmérsékleten reagáltatunk. A reakcióelegyet szárazra pároljuk, a maradékot 25 ml metanol, 25 ml víz és 4 ml trietil-amin elegyével argonatmoszférában, szobahőmérsékleten 16 órán át keveijük, majd a reakcióelegyet csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A maradékot kromatográfiásan tisztítjuk (először etil-acetát/2-propanol/víz 5:2:1 arányú elegye, majd 2-propanol/víz 2:1 arányú elegye). A második oldószerelegyben 0,25 R_rértékkel lejövő frakciókat egyesítjük és szárazra pároljuk.

A maradékot vízben oldjuk, az oldatot 0,5 órán át szobahőmérsékleten 0,5 g Dowex 50x8 (H⁺) gyantával kezeljük. A gyantát 50 ml vízzel, majd 20 ml metanollal és újra 10 ml vízzel mossuk, majd 2 M ammónium-hidroxiddal eluáljuk. Az eluátumot szárazra pároljuk, a maradékot fagyasztva megszárítjuk. A kapott (19) számú vegyület fehér hab, amely pozitív Sakaguchi-reakciót ad. Kitermelés: 60 mg (39,7%).

MS (FAB): 701 (M+l)⁺

IRcm-i; 3330,2934,1674,1616,1429.

Ή-NMR (D₂O) δ (ppm): 1,25-1,80 (m, 14H), 2,01 (s, 3H), 2,23 (dd, 2H), 2,78 (d, 1H), 2,98 (dd, 1H),

3,08-3,26 (m, 4H), 3,35 (m, 1H), 3,51 (dd, 1H),

3,68 (dd, 1H), 4,02-4,28 (m, 2H), 4,32-4,08 (m,

4H), 4,92 (dd, 1H), 5,76 (d, 1H).

6. példa

5-Acetamido-4-amino-7-[{6’-[6”-(t-butoxi-karbonilamino)-hexil-ureido]-hexil}-karbamoil-oxi-2,3,4,5-tetradezoxi-D-glicero-D-galakto-non-2-piranozonsav (20) mg (0,07 mmol) (6) számú vegyületet 30 ml metanol, 15 ml víz és 4 ml trietil-amin elegyében argonatmoszférában, szobahőmérsékleten 16 órán át keverünk. A reakcióelegyet ezután csökentett nyomáson szárazra pároljuk, és a maradékot kromatografálva (szilikagél; 2-propanol és víz 3:1 arányú elegye) 30 mg (63,5%) cím szerinti, (20) számú vegyületet kapunk fehér hab formájában.

MS(FAB): 675 (M+1)+

IRcm-i.· 3333, 2932,1710,1633,1557.

Ή-NMR (D₂O) δ (ppm): 1,22-1,57 (m, 25H), 1,98 (s, 3H), 2,98-3,18 (m, 8H), 3,49 (dd, 1H), 3,64 (dd,

1H), 4,02-4,28 (m, 3H), 4,53 (sz d, 1H), 4,92 (dd,

1H), 5,72 (d, 1H).

7. példa

5-Acetamido-7- {[6’-(biotinil-amino)-(triglicinamido)-hexil]-karbomil-oxi}-4-guanidino-2,3,4,5tetradezoxi-D-glicero-D-galakto-non-2-enopiranozonsav (21)

101 mg (0,24 mmol) 6-(biotinil-amino)-triglicint 0,4 ml víz és 4 ml aceton elegyében oldunk. Az oldathoz -10 °C hőmérsékleten először 24,6 mg (0,24 mmol) trietil-amint, majd 7 mg (0,06 mmol) N-metil-morfolint és végül 35 mg (0,256 mmol) izobutil-(klór-formiát)-ot adunk, és az elegyet argonatmoszférában, -10 °C hőmérsékleten keveijük. A reakcióelegyhez ezután 1 ml víz, 1 ml aceton és 24,6 mg (0,24 mmol) trietil-amin elegyében oldott 92 mg (0,156 mmol) (18) számú vegyületet adunk 0-5 °C hőmérsékleten. A reakcióelegyet 4 órán át 15-20 °C hőmérsékleten keveijük, majd csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A maradékot kétszer 25 ml acetonban felvesszük, majd szüljük. A kapott 69 mg szilárd anyagot 10 ml metanol, 10 ml víz és 5 ml trietil-amin elegyében 16 órán át argonatmoszférában, szobahőmérsékleten keveijük. Az oldatot szárazra pároljuk, 20 ml vízben újra oldjuk és ismét szárazra pároljuk. Ezt a műveletet ötször megismételve 60 mg (21) számú nyersterméket kapunk, amelyet flashkromatográfiával tisztítunk (szilikagél oszlop; először 2-propanol/víz 5:1 arányú, majd 2-propanol/víz 3:1 arányú elegye). 17 mg (12,5%) cím szerinti (21) számú vegyületet kapunk fehér szilárd anyag formájában. A tennék pozitív Sakaguchi-reakciót (guanidin-színreakciót) és pozitív biotin-színreakciót ad.

MS (FAB): 872 (M+l)+ 871, (M+)

IRcm-U 3287 (sz), 1651 (sz).

Ή-NMR (D₂O) δ (ppm): 1,22-1,81 (m, 14H), 1,98 (s, 3H), 2,37 (m, 2H), 2,78 (d, 1H), 2,95-3,55 (m,

7H), 3,61-4,16 (m, 9H), 4,39-4,67 (m, 4H), 4,92 (dd, 1H), 5,67 (d, 1H).

8. példa

5-Acetamido-7-{[6’-(biotinil-amino-dodekanoil-amino)-hexil]-karbamoil-oxi}-4-guanidino-2,3,4,5-tetradezoxi-D-glicero-D-galakto-non-2-eno-piranozonsav (22)

A cím szerinti vegyületet biotinil-amino-dodekánsav és a (18) számú vegyület karbonil-diimidazol segítségével történő összekapcsolásával, a Methods in Enzymology, 184, 664 (1990) szerint állítjuk elő.

Ή-NMR (CD₃OD) δ (ppm): 1,28-1,85 (m, 33H),

1,98 (s, 3H), 2,22 (m, 4H), 2,75 (d, 1H), 2,97 (dd,

1H), 3,03-3,28 (m, 6H), 3,49 (dd, 1H), 3,64 (dd,

1H), 4,07 (m, 1H), 4,20 (m, 1H), 4,34 (m, 2H), 4,50 (m, 2H), 5,57 (d, 1H).

9. példa

5-Acetamido-7-{[6’-(biotinil-amino-kaproil-amino)-hexil]-karbamoil-oxi}-4-guanidino-2,3,4,5-tetradezoxiD-glicero-D-galakto-non-2-enopiranozonsav (23)

A cím szerinti vegyületet biotinil-amino-kapronsav és a (18) számú vegyület reagáltatása útján a 8. példában megadott módon állítjuk elő.

HU 223 099 Bl

Ή-NMR (CDjOD) δ (ppm): 1,30-1,85 (m, 21H),

1,99 (s, 3H), 2,24 (m, 4H), 2,76 (d, 1H), 2,98 (dd,

1H), 3,05-3,3 (m, 7H), 3,50 (dd, 1H), 3,66 (m,

1H), 4,07 (m, 1H), 4,21 (m, 1H), 4,37 (m, 2H), 4,52 (m, 2H), 5,58 (d, 1H).

10. példa

5-Acetamido-7-[{6’-[6’ ’-(6” ’-amino-kaproil)trisz(amino-kaproil)]-amino-hexil}-karbamoil-oxi]-4guanidino-2,3,4,5-tetradezoxi-D-glicero-Dgalakto-non-2-eno-piranozonsav (25) (A) Metil-{5-acetamido-7-({6’-[6”-6”’-[t-butoxi-karbonil-amino]-kaproil)-trisz(amino-kaproil)]-amino-hexil}-karbamoil-oxi)-4-guanidino-8,9-(monokarbonildioxi)-2,3,4,5-tetradezoxi-D-glicero-D-galakton-non-2-eno-piranozonát} (24)

150 mg (0,263 mmol) 6-{6’-[6”-(t-butoxi-karbonil-amino)-kaproil]-bisz(amino-kaproil)-(amino-kapronsav)-at 5 ml metanolban oldunk. Az oldathoz -20 °C-on először 30 mg (0,267 mmol) kálium-(t-butoxid)-ot, majd 15 mg (0,148 mmol) N-metil-morfolint és végül 40 mg (0,293 mmol) izobutil-(klór-formiát)-ot adunk. A reakcióelegyet argonatmoszférában -15 °C és -20 °C közötti hőmérsékleten 20 percig keverjük, majd 140 mg (0,238 mmol) (18) számú vegyületet adunk hozzá 0-5 °C hőmérsékleten 1,5 ml metanol, 1,5 ml víz és 38 mg (0,372 mmol) elegyében. A reakcióelegyet 15-20 °C hőmérsékleten 4 órán át erőteljesen keverjük, majd csökkentett nyomáson bepároljuk. A maradékot kétszer 50 ml acetonnal felvesszük, szűrjük, és a kapott fehér szilárd anyagot (levegőn megszáritva 224 mg) szilikagélen kromatografáljuk (etil-acetát/2-propanol/víz 5:2:1 arányú elegye). Kitermelés: 80 mg (31,5%) (24) számú vegyület.

MS (FAB): 1068 (M+l)+ 1067 (M+)

Ή-NMR (CD₃OD) δ: 1,21-1,72 (m, 41H), 1,99 (s,

3H), 2,18 (t, 8H), 2,92-3,24 (m, 12H), 3,79 (s, 3H),

4,14 (dd, 1H), 4,51-4,78 (m, 4H), 5,19 (ddd, 1H),

5,59 (dd, 1H), 5,92 (d, 1H).

(B) A (25) számú vegyület előállítása

29,5 mg (0,027 mmol) (24) számú vegyületet argonatmoszférában 2 ml trifluor-ecetsavban oldunk. Az oldatot 1 órán át szobahőmérsékleten keveijük, majd csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A maradékot 5 ml vízben oldjuk, csökkentett nyomáson újra szárazra pároljuk, végül 2 ml vízben oldjuk és fagyasztva szárítjuk. A kapott fehér szilárd anyagot 10 ml metanol, 10 ml víz és 5 ml trietil-amin elegyében oldjuk, argonatmoszférában, szobahőmérsékleten 16 órán át erőteljesen keverjük, majd szárazra pároljuk. A maradékot 10 ml vízben oldjuk, és az oldatot újra szárazra pároljuk. A maradékot 3 x 20 ml acetonnal, majd 20 ml etanollal eldörzsöljük, és fagyasztva megszárítjuk. A termék a (25) számú vegyület, mely fehér szilárd anyag, és pozitív Sakaguchi-, valamint pozitív ninhidrinreakciót ad. Kitermelés: 14 mg (56%). MS(FAB): 927(M+1)+

Ή-NMR (D₂O) δ 1,15-1,69 (m, 32H), 1,90 (s, 3H),

2,11-2,23 (m, 8H), 2,91-3,21 (m, 12H),

3,41-3,70 (m, 2H), 3,85-4,12 (m, 2H), 4,48-4,52 (m, 2H), 4,92 (dd, 1H), 5,58 (d, 1H).

11. példa

5-Acetamido-7-({6’-[6”-(6” ’-[biotinil-amino]kaproil)-trisz(amino-kaproil)]-amino-hexil}-karbamoil-oxi)-4-guanidino-2,3,4,5-tetradezoxi-D-gliceroD-galakto-non-2-eno-piranozonsav (26)

71,4 mmg (0,0447 mmol) (24) számú vegyületet 2 ml trifluor-ecetsavban oldunk, az oldatot argonatmoszférában, szobahőmérsékleten 1 órán át keveijük, majd csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A maradékot 5 ml vízben oldjuk, és csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A maradékot 36 mg (0,105 mmol) biotin-N-hidroxiszukcinimidet tartalmazó 6 ml piridinben oldjuk. Az elegyet argonatmoszférában, 40-50 °C hőmérsékleten 48 órán át keveijük, majd csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A maradékot 30 ml acetonnal 4 órán át keverjük, majd a reakciókeveréket leszűrjük. A csapadékot kétszer 10 ml acetonnal mossuk és levegőn megszárítjuk. A kapott 72 mg fehér szilárd anyagot 25 ml metanol, 25 ml víz és 5 ml trietil-amint tartalmazó eleggyel argonatmoszférában, szobahőmérsékleten 16 órán át keveijük, majd csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A maradékot kromatografáljuk (szilikagél; először etil-acetát/2-propanol/víz 5:2:1 arányú, majd 2-propanol/víz 2:1 arányú elegye). 30,4 mg (39,5%) cím szerinti, (26) számú vegyületet kapunk fehér szilárd anyag formájában. Sakaguchireakció: pozitív; biotin-színreakció: pozitív.

MS(FAB): 1153(M+1)+

IR: 3292,2931, 1638, 1541 cm-'.

Ή-NMR (D₂O) δ (ppm): 1,12-1,62 (m, 38H), 1,91 (s, 3H), 2,12 (m, 10H), 2,65 (d, 1H), 2,82-3,15 (m,

13H), 3,30-3,62 (m, 3H), 3,81-4,18 (m, 3H),

4,25-4,56 (m, 4H), 5,51 (d, 1H).

12. példa

5-Acetamido-7-({6’-[6-(6”’-[hidrazido-szukcinil-amino]-kaproil)-trisz(amino-kaproil)]-amino-hexil}karbanoil-oxi)-6-guanidino-2,3,4,5-tetradezoxi-Dglicero-D-galakto-non-2-eno-piranozonsav (30)

100 mg (0,146 mmol) 6-{6’-6”-(N-Boc-hidrazidoszukcinil)-amino-kaproil]-bisz(amino-kaproil)}-aminokapronsavat 4 ml vízmentes metanolban oldunk és az oldathoz -20 °C hőmérsékleten 16,4 mg (0,146 mmol) kálium-t-butoxidot, majd 14,7 mg (0,146 mmol) N-metilmorfolint és végül 24 mg 0,176 mmol) izobutil-(klór-formiát)-ot adunk. A reakcióelegyet -15 °C hőmérsékleten 12 percig keverjük, majd az oldathoz 5 °C hőmérsékleten 76,6 mg (0,13 mmol) 5-acetamido-7-]6’-(amino-hexil)-karbamoil-oxi]-4-guanidino-2,3,4,5-tetradezoxi-Dglicero-D-galakto-non-2-eno-piranozonsav trifluor-ecetsawal alkotott sóját [(11) számú vegyület] adjuk 1,5 ml metanol, 1,5 ml víz és 16 mg (0,158 mmol) trietil-amin elegyében. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 2 órán át keverjük, majd csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A maradékot 50 ml acetonban felvesszük és szűrjük. A szilárd anyagot 10 ml acetonnal mossuk és levegőn megszárítjuk, majd oszlopkromatografáljuk (szilikagél; először etil-acetát/2-propanol/víz 5:2:1 arányú, majd 2propanol/víz 3:1 arányú elegye). Kitermelés: 63 mg (42,5%) (29) számú vegyület fehér szilárd anyag formájában.

HU 223 099 Bl ‘H-NMR (CD₃OC) δ (ppm): 1,21-1,72 (m, 41H),

1,95 (s, 3H), 2,17 (m, 8H), 2,48 (AB, 4H), 3,0-3,28 (m, 12H), 3,51 (dd, 1H), 3,62 (dd, 1H), 4,13 (m,

1H), 4,17 (dd, 1H), 4,35 (dd, 1H), 4,46 (dd, 1H),

4,98 (dd, 1H), 5,56 (d, 1H).

mg (0,0526 mmol) (29) számú vegyületet 2 ml trifluor-ecetsavban argonatmoszférában, szobahőmérsékleten 1 órán át keverünk, majd az elegyet csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A maradékot 5 ml vízben oldjuk, az oldatot csökkentett nyomáson szárazra pároljuk, majd liofilizáljuk. A kapott fehér szilárd anyag a (34) számú vegyület trifluor-acetátja. Ezt 10 ml vízben oldjuk, Amberlite IRA-400(OH^_) gyantával (CAS referenciaszám: 9002-24-8; erősen bázikus ioncserélő gyanta) a trifluor-ecetsavat eltávolítjuk, a keveréket leszűijük. A szűrletet szárazra pároljuk, a maradékot 15 ml acetonnal eldörzsöljük és fagyasztva megszárítjuk. A kapott (30) számú vegyület fehér kristályos anyag, mely argonatmoszférában tárolható. Kitermelés: 40 mg (73%).

MS (FAB): 1041 (M+l)⁺ 1042 (M+2)+ •H-NMR (D₂O) δ (ppm) (trifluor-ecetsavas só):

1,15-1,68 (m, 32H), 1,93 (s, 3H), 2,18 (m, 8H),

2,52 (AB, 4H), 2,98-3,23 (m, 12H), 3,40-4,20 (m,

4H), 4,42 (dd, 1H), 4,52 (dd, 1H), 4,92 (dd, 1H),

5,88 (d, 1H).

13. példa

Metil-(5-acetamido-7-{[6’-(3”-karboxil-propionil)amino-hexil]-karbamoil-oxi}-4-guanidino-8,9-(monokarbonil-dioxi)-2,3,4,5-tetradezoxi-D-glicero-Dgalakto-non-2-eno-piranozonát) (32)

100 mg (0,159 mmol) metil-{5-acetamido-7-[(6’amino-hexil)-karbamoil-oxi]-4-guanidino-8,9-(monokarbonil-dioxi)-2,3,4,5-tetradezoxi-D-glicero-D-galakto-non-2-eno-piranozonát} trifluor-ecetsavas sóját [(18) számú vegyület] 2,5 ml vízmentes piridinben oldjuk, és az oldathoz 24 mg (0,195 mmol) dimetil-amino-piridint és 19,5 mg (0,195 mmol) borostánykősavanhidridet adunk. A reakcióelegyet argonatmoszférában, 45 °C hőmérsékleten 20 órán át keveijük, majd a piridint csökkentett nyomáson eltávolítjuk. A maradékot 10 ml metanolban oldjuk, az oldat pH-értékét 2 n sósavval 2-re állítjuk be, és a savas oldatot szárazra pároljuk. A maradékot flashkromatográfiás módszerrel tisztítva (szilikagél; először etil-acetát/metanol 10:1 arányú, majd etil-acetát/2-propanol/víz 5:2:1 arányú elegye) kapjuk a (33) számú vegyületet. Kitermelés: 42 mg (40%).

MS (FAB): 615(M+1)⁺ •H-NMR (CD₃OD) δ (ppm): 1,25-1,62 (m, 8H), 1,93 (s, 3H), 2,48 (AB, 4H), 2,95-3,21 (m, 4H), 3,80 (s,

3H), 4,10-4,30 (m, 1H), 4,50-4,80 (m, 3H),

5,0-5,25 (m, 2H), 5,59 (dd, 1H), 5,92 (dd, 1H).

14. példa

A találmány szerinti vegyületek influenzavírushoz való kötődésének mértéke

A vegyületek képességét a teljes influenzavírus-neuraminidáz megkötésére két influenza A-vírus törzsön és egy influenza B-víruson teszteltük. Az alkalmazott influenza A-törzsek: NWS/G70C és NWS/Tokyo: az influenza B-törzs: B/Vic/02/87. A neuraminidáz megkötésére vonatkozó vizsgálatot Petier, M. és munkatársai publikált módszerével [Anal. Biochem., 94, 287 (1979)] végeztük, és a mért inhibíciós állandókat (IC₅₀) a 3. táblázatban foglaltuk össze.

3. táblázat

A találmány szerinti vegyületek és az influenzavírusok közötti kötési állandók (M)

A vegyület száma	NSW/Tokyo	NSW/G70C	BA/Vic/02/87
8	4xl0-8	lxlO-8	7x10-8
11	2x10-8	2x10-8	nem mértük
13	2x10-8	2x10-8	8x10-8
17	2x10-8	2x10-8	5xl0-7
19	1 χ ΙΟ’8	5xl0-9	2x10-8
20	1x10-5	lxlO-5	nem mértük
21	4x10-8	2x10-8	lxlO7
22	3x10-8	5x10-’	5x10-8
23	2x10-8	5x10-’	6x10-8
25	5x10-8	4x10-8	1 χ 10-7
26	2x10-8	2x10-8	4x10-8
DANA	4xl0-5	1 χ ΙΟ 5	2x10-5
GG167 (I)	1x10-’	1 χ 10-’	3x10-’

15. példa

Influenzavírus befogása a (21) számú vegyülettel avidinnel bevont ELISA-lemezen lyukú ELISA-lemezen egy éjszakán át 10 pg/ml koncentrációjú avidin- (Sigma) oldattal bevonatot alakítottunk ki. A lemezmélyedéseket ezután Pbs (foszfáttal pufferolt sóoldat) és Tween 20 oldat elegy ével blokkoljuk. A lemez egyik mélyedéssorába (végig minden mélyedésbe) ΙμΜ, egy másik sorba 10 μΜ (21) számú vegyületet adunk. Egy újabb sor minden mélyedésébe 10 μΜ (8) számú vegyületet (kontroll) adunk. A lemezt 1 órán át szobahőmérsékleten inkubáljuk, a meg nem kötött konjugátumot eltávolítjuk, és a lemezt PBS-Tween 20 eleggyel mossuk. Ezután a mélyedésekbe NWS/G70C influenza A-vírust (H1N9 altípus) adunk. Az indulókoncentráció 2,5 χ 10⁶ vírusrészecske (az első mélyedésben), amely 5 χ 10⁷ pfú/ml-nek felel meg (pfú=plakk-képző egység), majd sorozathígításos módszerrel kétszeres hígításokat készítünk, és adjuk a lemezen lévő mélyedésekbe. A vírust közelítőleg 30 percig inkubáljuk, majd a meg nem kötött vírust mosással eltávolítjuk. A kötött vírust poliklonális nyúl-antihemagglutinin antitesttel reagáltatjuk, a kötött antihemagglutinin antitestet birka-antinyúl antitest-tormaperoxidáz konjugátummal (Ab-HRPO) kimutatjuk. Az

HU 223 099 Bl egyes lépések között a felesleget kimossuk. A vírushoz kötött Ab-HRPO detektálása céljából ABTS (Sigma) HRPO-szubsztrátot adunk a tenyészetekhez, és a lemezt újabb 30 percig inkubáljuk.

A (21) számú vegyület mindkét koncentrációban (1 és 10 μΜ) hasonló eredményt adott: markáns abszorpció a legnagyobb víruskoncentrációnál, és csökkenő mértékű abszorpciós szignál a vírus hígításával párhuzamosan, annak jeléül, hogy a vírus befogása valóban megtörtént. A kimutatási határ legalább 1,6xlO⁵ pfu/teszt. Ezzel szemben a (8) számú kontrollvegyületnél csak gyenge adszorpció volt észlelhető, amely minden víruskoncentráció esetén változatlan.

16. példa

Influenzavírus kimutatása ELISA-lemezen 21. számú vegyülettel

NSW/G70C influenzavírus A PBS-sel készült, közelítőleg 1 χ 10⁸ pfu/ml indulókoncentrációjú oldatából sorozathígításos módszerrel kétszeres hígítású oldatokat készítünk, és az ELISA-lemezek (Dynatech) minden egyes mélyedésébe 50 μΐ oldatot adunk (direkt hozzáadás a lemezre), majd a lemezt egy éjszakán át állni hagyjuk. A lemezt ezután mossuk, a tenyészetet PBS-Tween 20 eleggyel blokkoljuk, majd a lemez egyik sorába 1 μΜ, a másik sorába 10 μιη (21) számú vegyületet, egy harmadik sorba pedig kontrollként 10 μΜ (8) számú vegyületet adunk. 1 órás inkubálás után a lemezről a meg nem kötött vegyületet mosással eltávolítjuk, majd a vírust streptavidin-HRPO (Boehringer-Mannheim) és ABTS kromogénszubsztrát alkalmazásával kb. 30 perc inkubálást követően detektáljuk.

A (21) számú vegyület mindkét koncentrációja esetében kimutatható a vírus : az abszorpciós szignál a víruskoncentráció növekedésével párhuzamosan erősödik. A (21) számú vegyület esetében minimum kb. 10⁵ vírusrészecske/mélyedés könnyen kimutatható. Ezzel szemben a biotint nem tartalmazó (8) számú vegyület (kontroll) egyik víruskoncentrációnál sem adott abszorpciós szignált.

17. példa

Az influenzavírus és a (21) számú vegyület között létrejött komplex befogása és kimutatása

Vírusrészecskéknek GG167-biotin-származékkal történő bevonása céljából az NWS/G70C influenza Avírus 1 χ 10⁸ pfu/ml törzsoldatából 10,2,5 és 0,625 μΐ-ΐ adtunk az ELISA-lemez külön-külön sorainak minden mélyedésébe, és a tenyészeteket 1 órán át inkubáltuk. A (21) számú vegyületből fél log₁₀ hígításokat készítettünk 1 μΜ-tói indulva egészen 0,00001 μΜ-ig, és ezeket a vírustenyészetekhez adtuk. Az így kapott vírusvegyület komplexeket ezután avidinnel előzetesen bevont lemezre visszük át (mint a 15. példában), és a lemezt 1 órán át (a befogás lejátszódásáig) inkubáljuk. A lemezeket PBS-Tween 20 eleggyel mossuk, és a befogott vírust a 15. példában leírt módon vírushemagglutininnel szemben képződött poliklonális nyúlantitest segítségével detektáljuk.

A legjobb eredményt a (21) számú vegyület 0,01 μΜ-os koncentrációja esetében kaptuk, mellyel akár 0,65 χ 10⁵ pfu koncentrációjú vírus is kimutatható. Nagyobb koncentrációban a (21) vegyület gyengébb szignált adott, vélhetőleg amiatt, hogy a meg nem kötött (21) számú vegyület az avidines kötőhelyek egy részét blokkolja; alacsonyabb koncentráció (<0,0001 μΜ) esetén a szignál szintén gyengébb, valószínűleg amiatt, hogy a jelen lévő vegyület kevés az összes vírusrészecskék megkötéséhez.

A megkötött vírus streplavidin-HRPO konjugátummal is kimutatható, de ez esetben a szignál gyengébb.

18. példa

Az influenzavírus és a (26) számú vegyület között létrejött komplex befogása és kimutatása

A 17. példában leírtak szerint járunk el, de GG167származékként a (26) számú vegyületet alkalmazzuk. Azt találtuk, hogy az influenza A két altípusa, az NWS/G70C és NWS/Tokyo (H1N2) 2,5xlO⁵ pfu/mélyedés koncentrációban is könnyen kimutatható. A (26) számú vegyületet 0,001 nM és 10 μΜ koncentrációtartományban teszteltük, és a vírus mindkét altípusa esetén 0,1 μΜ koncentrációnál kaptuk a legjobb eredményt.

A szakember számára nyilvánvaló, hogy bár a találmányt a világos megértéshez szükséges részletek mértékéig ismertettük, ezek módozatai és változatai is az itt ismertetett találmányi gondolat körébe tartoznak.

Claims (20)

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás influenzavírus kimutatására, azzal jellemezve, hogy a vélhetőleg vírust tartalmazó mintát egy olyan vegyület (neuraminidázt megkötő anyag) hatásának tesszük ki, amely képes az influenzavírus-neuraminidáz aktív helyeihez specifikusan kötődni, és amely neuraminidázzal nem hasítható.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a neuraminidázt megkötő anyagot úgy visszük fel egy hordozóra, hogy amikor a minta a hordozóra jut vagy azon áthalad, akkor az anyag a vírusrészecskéket szelektíven befogja és koncentrálja.

3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzaljellemezve, hogy a neuraminidázt megkötő anyag egy térkitöltő csoporton át kapcsolódik a hordozó felületéhez.

4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a térkitöltő csoport egy olyan funkciós csoportban végződik, amely képes a hordozó felületéhez való kapcsolódásra.

5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a funkciós végcsoport biotinilcsoport, és a hordozó felülete avidinnel, streptavidinnel vagy egy biotinnal szemben képződött antitesttel van bevonva.

6. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a funkciós végcsoport aminocsoport, és a felület karboxilcsoportot tartalmaz.

HU 223 099 Bl

7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a neuraminidázt megkötő anyag egy detektálható jelzőanyaggal van összekapcsolva.

8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a detektálható jelzőanyag kovalens kötéssel kap- 5 csolódik a neuraminidázt megkötő anyaghoz.

9. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a mintában lévő vírusrészecskéket olyan körülmények között tesszük ki a detektálható jelzőanyaghoz kapcsolódó neuraminidázt megkötő anyag hatásának, 10 hogy a neuraminidázt megkötő anyag szelektíven a vírusrészecske felületén lévő vírusneuraminidázhoz kapcsolódjon.

10. A 7. vagy 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vírust szelektíven befogjuk és koncent- 15 ráljuk.

11. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az influenzavírust szelektíven befogjuk és szelektíven detektáljuk.

12. All. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemez- 20 ve, hogy

a) a mintát hordozóhoz kötött neuraminidázt megkötő anyag hatásának tesszük ki, és

b) a hordozón visszatartott influenzavírus-részecskéket detektálható jelzőanyaggal összekap- 25 csőit neuraminidázt megkötő anyag hatásának tesszük ki.

13. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a neuraminidázt megkötő anyag kötési állandóját kifejező IC₅₀-érték 10~⁶ alatti. 30

14. Neuraminidázt megkötő anyag, amely a neuraminsav (sziálsav) C₇- vagy azzal ekvivalens helyzetben a gyűrűhöz kapcsolódó elágazó oldalláncon valamely térkitöltő csoporttal szubsztituált analógja, amely térkitöltő csoport valamely detektálható jelző- 35 anyaghoz vagy felülethez kapcsolható, és amely analóg nem tartalmaz olyan detektálható jelzőanyagot vagy térkitöltő csoportot, amely neuraminidázzal lehasítható.

15 OCN-W’-Y képletű izocianátcsoporttal acilezzük, ahol W’ térkitöltő csoportot jelent, egyezően a W-re a 15. vagy 18. igénypontban megadott definícióval, és Y jelentése a 15. vagy 19. igénypontban megadottal egyező.

15. A 14. igénypont szerinti neuraminidázt megkö- 40 tő anyag, amely neuraminsavanalógonként valamely (II) általános képletű vegyületet tartalmaz, ahol

R azidocsoport, adott esetben szubsztituált guanidinocsoport vagy adott esetben szubsztituált ami- 55 nocsoport,

R² COCH₃-, COCFj- vagy SO₂CH₃-csoportot,

X oxigénatomot vagy NH-csoportot,

W atomok - adott esetben az oxigén- és/vagy kénatomokat is beleértve - láncolatából felépülő 60 olyan térkitöltő csoportot jelent, amelynek hossza 4 és 100 atom közötti, és adott esetben helyettesített szén- és/vagy nitrogénatomokat is tartalmaz,

Y jelentése OH, SH, NH₂, CH=O, CH=CH₂, CO₂H, CONHNH₂ vagy NH-biotinil-csoport vagy ezen végcsoportok valamelyikének védett formája;

és ha a guanidino- vagy az aminocsoporton szubsztituens van jelen, az adott esetben helyettesített 1-6 szénatomos alkil-, például metil- vagy etilcsoport, vagy aril-, például fenilcsoport, vagy amino-, hidroxil-, cianovagy alkoxi-karbonil-csoport lehet;

azzal a megszorítással, hogy az X-W-Y részlet jelentése OC(=Z)NR⁵R⁶ képletűtől eltérő, ahol Z oxigénvagy kénatomot, R⁵ és R⁶ egymástól függetlenül hidrogénatomot vagy adott esetben amino-, hidroxil- vagy merkaptocsoporttal helyettesített szénhidrogéncsoportot jelent, de R⁵ és R⁶ egyidejűleg nem lehet hidrogén.

16. A 15. igénypont szerinti neuraminidázt megkötő anyag, amelyben a 7-helyzetű X-W-Y csoport egy végcsoportján funkciós csoportot tartalmazó N-szubsztituált alkil-karbamát.

17. A 14. igénypont szerinti neuraminidázt megkötő anyag, mely neuraminsavanalógonként valamely (IIA) vagy (IIB)

R (HA) általános képletű vegyületet tartalmaz - ezekben a képletekben R, R², W és Y jelentése a 15. igénypontban megadottakkal egyező, A és B oxigénatomot, CH₂-csoportot vagy egyes kötést jelent, és R¹ lipofil jellegű 1-12 szénatomos alkilcsoport, mely adott esetben egy vagy több halogénatommal, cikloalkil-, alkoxi-, halogén-alkoxi-, vagy adott esetben szubsztituált arilcsoporttal helyettesített.

18. A 17. igénypont szerinti neuraminidázt megkötő anyag, melyben a W térkitöltő csoport lineáris peptideket, oligoszacharidokat, poliolokat, polietilénglikol-csoportot, vagy oxigén- vagy kénatommal, vagy

HU 223 099 Bl karbonil, amido, karbamid vagy hidrazid funkciós csoporttal összekapcsolt szénhidrogéncsoportokat jelent; jelenti továbbá ezen csoportok kombinációit.

19. A 15-18. igénypontok bármelyike szerinti neuraminidázt megkötő anyag, amelyben az Y funkciós végcsoport megvédésére alkalmas csoportok hidroxil-, merkapto- vagy karboxilcsoport esetében az észterezőcsoportok, amino- és CONHNH₂-csoport esetében a karbamátképző csoportok és CH=O-csoport esetében az acetálcsoport kialakítására alkalmas csoportok.

20. A 15. igénypont szerinti neuraminidázt megkötő anyag, amely R helyén guanidino- és R² helyén acetilcsoportot tartalmaz.

21. A 15. vagy 20. igénypont szerinti neuraminidázt megkötő anyag, amely X helyén oxigénatomot és Y helyén amino- vagy NH-biotinil-csoportot tartalmaz.

22. A 15., 20. vagy 21. igénypontok bármelyike szerinti neuraminidázt megkötő anyag, amely a W térkitöltő csoport helyén CONH(CH₂)_n,

CONH(CH₂)_nNHCONH(CH₂)_m,

CONH(CH2)_n[NHCO(CH₂)₅]_m, CO(CH₂)„,

CO(CH₂)_nNHCONH(CH₂)_m, CO(CH₂)_nNHCO(CH₂)_q, CONH(CH2)_nNH(COCH₂NH)_qCOCH₂; CONH(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂NHCO(CH₂)_q vagy CONH(CH₂)_nNHCO(CH₂)_q-csoportot tartalmaz, ahol n és m értéke 2 és 12 közötti, és q értéke zéró, vagy 1 és 12 közötti egész szám.

23. A 14-18. igénypontok bármelyike szerinti neuraminidázt megkötő anyag, amelynek IC₅₀-értéke 10~⁶ M-nál kevesebb.

24. A 23. igénypont szerinti neuraminidázt megkötő anyag, amelynek IC₅₀-értéke 10^⁸ M-nál kevesebb.

25. A 14-17. igénypontok bármelyike szerinti neuraminidázt megkötő anyag, amely az 1. táblázatban szerepel, kivéve a (11) számú vegyületet.

26. 5-Acetamido-7- {[6’-(biotinil-amino)-(triglicinamido)-hexil]-karbamoil-oxi}-4-guanidino-2,3,4,5-tetradezoxi-D-glicero-D-galakto-non-2-eno-piranozonsav (21).

27. 5-Acetamido-7-({6’-[6”-(6”’-amino-kaproil)trisz(amino-kaproil)]-amino-hexil}-karbamoil-oxi)-4guanidino-2,3,4,5-tetradezoxi-D-glicero-D-galakto-non-2-eno-piranozonsav (25).

28. 5-Acetamido-7-( {6’-[6’ ’-(6” ’-[biotinil-amino]kaproil)-trisz(amino-kaproil)]-amino-hexil}-karbamoil-oxi)-4-guanidino-2,3,4,5-tetradezoxi-D-gliceroD-galakto-non-2-eno-piranozonsav (26).

29. 5-Acetamido-7-({6’-[6”-(6”’-[hidrazido-szukcinil-amino]-kaproil)-trisz(amino-kaproil)]-amino-hexil}-karbamoil-oxi)-4-guanidino-2,3,4,5-tetra-dezoxiD-glicero-D-galakto-non-2-eno-piranozonsav (30).

30. A 14-29. igénypontok bármelyike szerinti neuraminidázt megkötő anyag, amely detektálható jelzőanyaghoz van kapcsolva.

31. A 30. igénypont szerinti neuraminidázt megkötő anyag, amelyben a detektálható jelzőanyaggal való kapcsolat kovalens kötés.

32. A 30. igénypont szerinti neuraminidázt megkötő anyag, amelyben a detektálható jelzőanyag egy epitóp, amely antitestes detektálókitben használható, vagy egy olyan optikai vizsgálati eszközben detektálható, amelynek aktív receptív felülete van, vagy valamely agglutinációs kimutatási rendszerben.

33. A 14. igénypont szerinti neuraminidázt megkötő anyag valamely detektálható jelzőanyaggal összekapcsoltan, ahol a neuraminidázt megkötő anyag (3R,4R,5S)-4acetamido-5-amino-3-( 1 -etil-propoxi)-1 -ciklohexén-1 karbonsav.

34. Diagnosztikai készítmény, amely a 14-33. igénypontok bármelyike szerinti vegyületet valamely diagnosztikai célra alkalmas vivőanyaggal együtt tartalmazza.

35. Eljárás a 15. igénypont szerinti (II) általános képletű, X helyén oxigénatomot tartalmazó, neuraminidázt megkötő vegyületek előállítására, azzal jellemezve, hogy

a) egy (III) általános képletű sziálsavszármazékot egy (IV) általános képletű 8,9-védett vegyületté alakítunk OH (III)

OH

R (IV) ezekben a képletekben R és R² jelentése a (II) általános képletnél megadottal egyező, R¹ alkilcsoportot és A védőcsoportot jelent -, majd

b) a 7-helyzetű hidroxilcsoportot acilezzük,

c) a W térkitöltő csoportot adott esetben kiterjesztjük vagy funkciós csoport bevitelével kiegészítjük, és

d) a védőcsoportokat eltávolítjuk.

36. Eljárás a 15. igénypont szerint (II) általános képletű, X helyén NH-csoportot tartalmazó neuraminidázt megkötő vegyületek előállítására, azzal jellemezve, hogy

a) egy (IV) általános képletű vegyületet - ahol a szubsztituensek jelentése a 35. igénypontban megadottakkal egyező - a Mitsonobu-reakció körülményei között egy kilépőcsoportot tartalmazó észterré alakítjuk, amelynek térállása (C₇helyzet) megfordult, és

b) a C₇-észtert valamely nukleofil csoportra cseréljük.

HU 223 099 Bl

37. Az (V) vagy (VI) általános képletű vegyületek,

O-CONH-W-Y /O^/CC^R· ” XT rWT (V) (VI) ahol

A védőcsoportot,

W és W’ térkitöltő csoportot jelent egyezően a W-re a 15. vagy 18. igénypontban megadott definícióval;

R és R² a 15. igénypontban megadott jelentésű;

R’ alkilcsoport; és

Y a 15. vagy 19. igénypontban megadott jelentésű.

38. A 35. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy A C=O vagy CMe₂ csoportot jelent.

39. A 37. igénypont szerinti vegyületek, amelyekben A jelentése C=O vagy CMe₂.

40. A 35. vagy 36. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 7-helyzetű hidroxilcsoportot egy

20 41. A 35. vagy 36. igénypont szerinti eljárás, azzaljellemezve, hogy a 7-helyzetű hidroxilcsoportot egy CICOL képletű acil-kloriddal acilezzük, ahol L kilépőcsoportot jelent, majd az L kilépőcsoportot egy NH₂-W-Y képletű aminnal NH-W’-Y-csoportra cseréljük, ahol W’ je25 lentése a W-re a 15. vagy 18. igénypontban megadott jelentésű, és Y jelentése a 15. vagy 19. igénypontban megadottal egyező.