JP2002500041A - 炎症応答に関与するリゾ脂質受容体の同定 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 リゾ脂質受容体、ヒトEDG-4受容体、炎症応答に関与するリゾ脂質受容体の同定方法およびそのようにして同定されたリゾ脂質受容体、ならびにかかるリゾ脂質受容体と相互作用するリガンドの同定方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野 本発明は分子生物学の分野に含まれる。より詳しくは、本発明は、新規リゾ脂
質(lysolipid)受容体、ヒトEDG-4受容体、炎症応答に関与するリゾ脂質受容体の
同定方法およびそのように同定されたリゾ脂質受容体、ならびにかかるリゾ脂質
受容体と相互作用するリガンドの同定方法に関する。

【０００２】発明の背景 (a) EDG受容体 EDG受容体は、その内因性リガンドが知られていないことからオーファン受容 体に分類されている(例えばHla TおよびMaciag T(1990)J Biol. Chem. 265:9308
-13; 米国特許第5,585,476号を参照)。しかしながら、最近、リゾホスファチジ ン酸(LPA)がedg-2受容体の内因性リガンドであることが示された(Hechtら(1996)
J. Cell. Biol. 135:1071-1083; Anら(1997)Biochem. Biophys. Res. Comm. 213
:619-622)。

【０００３】 EDG受容体は7回膜貫通Gタンパク質結合受容体である(T7GまたはGPCR)。GPCPは
、20〜30個のアミノ酸からなる7個の疎水性ドメインによりそう呼ばれており、 それらのドメインは形質膜に広がっており、逆平行αヘリックスの束状構造を形
成している。これらの膜貫通セグメント(TMS)は、ローマ数字I〜VIIで示され、 受容体の構造的および機能的特徴の要因となる。大部分の場合、ヘリックスの束
状構造は結合ポケットを形成するが、結合部位がより嵩張る分子を収容しなけれ
ばならない場合、細胞外のN-末端セグメントまたは3個の細胞外ループのうちの1
個以上が結合に関与し、次いで受容体の細胞内部分のコンホメーション変化の誘
導に関与する。そして次に、活性化された受容体は、サイクリックAMP(cAMP)、 ホスホリパーゼC、イノシトール三リン酸などの第二メッセンジャーの産生、プ ロテインキナーゼの活性化、特定遺伝子の発現の変更のような細胞内シグナル伝
達活性をさらに媒介する細胞内Gタンパク質複合体と相互作用する。

【０００４】 受容体はリガンドの結合により活性化されると、受容体のコンホメーションが
変化してGタンパク質と相互作用し、Gタンパク質を活性化する。活性化Gタンパ ク質はグアノシン二リン酸(GDP)の分子を生じさせる。GDPはGタンパク質の表面 に結合し、グアノシン三リン酸(GTP)の分子で置換され、Gタンパク質のコンホメ
ーションにさらなる変化をもたらす。その表面にGTPが結合することにより、Gタ
ンパク質はエフェクターの活性を調節し得る。これらのエフェクターとしては、
アデニリルシクラーゼおよびホスホリパーゼCのような酵素、一定の輸送タンパ ク質ならびにカルシウムイオン、カリウムイオンまたはナトリウムイオンのよう
なイオンチャンネルが挙げられる。

【０００５】 GPCRは、多くの発育過程および病気過程中に発現され、活性化される。新規GP
CRを同定することでそのような過程における診断または介入の機会がもたらされ
る。受容体は、生理学的または薬学的分子（これらの分子は受容体の活性を引き
起こし、延長させ、もしくは阻害し、またはGPCRにより制御される別個の細胞内
経路を特異的にモジュレートする）を同定するためのスクリーニングアッセイに
用いることができる。しかしながら、GPCR（EDG受容体など）の多くはその受容 体によって媒介される生物学的プロセスが現在のところ知られていない。したが
ってこれらのGPCRにより媒介される生物学的プロセスを同定するための方法、な
らびにこれらのプロセスに関与し得るその他のGPCRの同定方法が必要とされてい
る。

【０００６】 GPCRの機能は多様であるので、GPCRの機能を改変することにより作用する治療
薬が多数存在することは驚くべきことではない。GPCRを改変する治療薬は、特定
の受容体およびそのシグナル伝達経路をオンにしたりオフにしたりするような特
定の特異性をもつ薬剤を設計することができるので特に魅力的である。

【０００７】(b) リゾリン脂質および炎症 LPAはEDG-2受容体の天然アゴニストである(Hechtら, J Cell Biol 135:1071,
1996)。LPAおよび他の多くのリゾリン脂質は、凝集および血栓形成に付随する炎
症関連細胞内シグナル伝達の結果として活性化された血小板によって産生される
。同様の炎症経路が多くの細胞型で生じ、典型的には、数秒〜数分以内にLLおよ
びその他の脂質媒介物質の産生がもたらされ、数分〜数時間以内に新たな遺伝子
発現の活性化がもたらされる。

【０００８】 その生物学的作用を確認するために、多数のリゾリン脂質が研究されている。
例えば、リゾリン脂質であるスフィンゴシン-1-リン酸(S1P)は、いくつかのCNS-
関連生物学的プロセスにおいて作用すると考えられる。これらには、アポトーシ
ス、有糸分裂誘発および細胞骨格再構成がある。S1Pは、PDGFおよびNGFの生物学
的機能のすくなくともいくつかを媒介すると考えられている。前者は、強力な有
糸分裂活性および創傷治癒活性を有する成長ホルモンである。後者は、神経栄養
因子であり、神経障害性疼痛においても作用すると考えられている。

【０００９】 さらに、U937細胞においてS1PによってNF-κBが活性化されることが報告され ている。しかしながら、その著者らは、S1Pが細胞内第二メッセンジャーである と仮定しており、この応答が受容体媒介型であるかどうかを確認する試みは行っ
ていない。さらに、例えば、炎症性サイトカイン、接着分子またはその他のNF- κB依存性遺伝子のアップレギュレーションの可能性を調べることなどによってN
F-κB活性化の機能的関連性を試験していない。S1Pに対して複数の受容体が存在
する場合、受容体の一つ、いくつかまたは全てがNF-κBを介して応答するので、
NF-κB活性化の発見はそれ自体有用性を提供するものではない。

【００１０】 さらに、NF-κB活性化カスケードの直接的なモジュレーションは、炎症または
アポトーシスの治療的メカニズムと考えられている。しかしながら、NF-κBは遍
在する微生物病原体に対する先天性免疫および抗原特異的免疫システムの動員に
おいて重要な役割を果たしている。したがって、この置き換えられない防御シス
テムを標的とするよりも、特定の炎症またはアポトーシスシグナル伝達事象によ
るNF-κBの不適切な活性化をブロックすることが好ましい。したがって、NF-κB
活性化をモジュレートし、それによって意図せざるアポトーシスを予防するか、
または受容体によりモジュレートされた経路により免疫無防備状態の宿主におけ
る免疫機能の増大させる治療剤の開発が非常に望まれている。

【００１１】発明の概要 今や、炎症応答シグナル伝達経路およびアポトーシスシグナル伝達経路に関与
するLL/EDG受容体が存在することを発見した。特に、EDG-2、EDG-3、EDG-4、EDG
-5およびEDG-6受容体がNF-κBおよび／またはIL-8産生を活性化することを発見 した。したがって、本発明は、NF-κB活性化とedg受容体との間の関連を提供し 、したがってNF-κB活性化を制御し、それによりアポトーシスおよび炎症応答を
制御するための手段を提供する。

【００１２】 本発明の一つの態様においては、EDG-2、EDG-5およびEDG-6受容体に対するア ゴニストがNF-κBおよび／またはIL-8の活性化／産生をもたらすことを発見した
。特に、LPAがEDG-2、EDG-5およびEDG-6受容体に対するアゴニストとして作用し
てNF-κBおよび／またはIL-8の活性化／産生をもたらすということを発見した。

【００１３】 本発明の別の態様においては、EDG-3およびEDG-4受容体に対するアゴニストが
NF-κBおよび／またはIL-8の活性化／産生をもたらすことを発見した。特に、S1
PおよびSPCがEDG-3およびEDG-4受容体に対するアゴニストとして作用してNF-κB
および／またはIL-8の活性化／産生をもたらすことを発見した。

【００１４】 本発明の別の態様においては、ヒトEDG-4受容体をコードする単離されたポリ ヌクレオチドが提供される。この単離されたポリヌクレオチドは、cDNAでもゲノ
ムクローンでもよい。

【００１５】 特に、本発明は、 (a) 図15A（配列番号１）のヌクレオチド38〜1099を含むヌクレオチド配列； (b) 図15B（配列番号２）のヌクレオチド配列； (c) (a)または(b)に対して少なくとも約95％の配列同一性を有し、配列(a)お よび(b)それぞれにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチ ド配列； (d)ヒトEDG-4受容体についての図16A（配列番号３）のアミノ酸配列をコード するヌクレオチド配列；および (e)ヒトEDG-4受容体についての図16B（配列番号４）のアミノ酸配列をコード するヌクレオチド配列 からなる群から選択される単離されたヌクレオチド配列を提供する。

【００１６】 また、そのようなヌクレオチド配列およびそのコードアミノ酸配列のための発
現ベクター、宿主細胞、精製アミノ酸配列、相補的核酸配列、生物学的に活性な
断片、およびハイブリダイゼーションプローブも提供する。

【００１７】 本発明の別の態様においては、適当なリガンドによる活性化におけるNF-κBお
よび／またはIL-8の誘導を測定することによって、あるDNA配列が炎症応答に関 与するedg受容体をコードするかどうかを確認する方法を提供する。

【００１８】 本発明の別の態様においては、エデルフォシン(edelfosine)などの適当なリガ
ンドによるNF-κBおよび／またはIL-8活性化の誘導を測定することによってある
DNA配列が炎症応答に関与するエデルフォシン受容体をコードするかどうかを確 認する方法を提供する。

【００１９】 本発明の別の態様においては、炎症応答に関与するedgまたはリゾ脂質受容体 と相互作用するリガンドを同定する方法を提供する。特に、本発明は、NF-κBお
よび／またはIL-8の誘導または誘導の欠如を測定することによってedgまたはリ ゾ脂質受容体と相互作用するリガンドを同定する方法を提供する。

【００２０】 本発明の別の態様においては、NF-κBおよび／またはIL-8モジュレート型EDG またはリゾ脂質受容体のアゴニストまたはアンタゴニストおよび製薬上許容され
る賦形剤を含む医薬組成物の有効量を、それぞれ炎症進行のアップレギュレーシ
ョンまたはダウンレギュレーションのために投与することにより、被験者におけ
る炎症進行状態をモジュレートまたは治療する方法を提供する。特に、EDG-2、E
DG-3、EDG-4、EDG-5および／またはEDG-6受容体のアゴニストおよびアンタゴニ ストが利用可能である。

【００２１】 本発明の別の態様においては、NF-κBおよび／またはIL-8をモジュレートした
EDGまたはリゾ脂質のアゴニストまたはアンタゴニストおよび製薬上許容される 賦形剤を含む医薬組成物の有効量を、それぞれ免疫応答のアップレギュレーショ
ンまたはダウンレギュレーションのために投与することにより、被験者において
免疫応答をモジュレートする方法を提供する。特に、EDG-2、EDG-3、EDG-4、EDG
-5および／またはEDG-6受容体のアゴニストおよびアンタゴニストが利用可能で ある。

【００２２】 本発明の別の態様においては、NF-κBの誘導を活性化するEDGまたはリゾ脂質 受容体を活性化することによってアポトーシスを制御する方法を提供する。特に
、EDG-2、EDG-3、EDG-4、EDG-5および／またはEDG-6受容体をアゴニストまたは アンタゴニストによってモジュレートすることによってアポトーシスを制御する
方法を提供する。

【００２３】 本発明におけるEDG受容体は、互いに、少なくとも27〜30％の同一性、好まし くは少なくとも30〜35％の同一性、より好ましくは少なくとも35〜40％の同一性
、さらにより好ましくは少なくとも40〜45％、最も好ましくは少なくとも45〜50
％の同一性を有する任意の受容体を意味する。当技術分野で公知のとおり、関連
受容体のアミノ酸配列の同一性のパーセンテージは、一般に、異なる種よりも同
一種のほうが高い。

【００２４】 添付の図面を用いて本発明をより詳細に説明する。

【００２５】発明の詳細な説明 EDG受容体は、7個の膜貫通領域などのG-タンパク質結合受容体クラスに共通す
る構造的特徴およびリゾリン脂質またはリゾフィンゴ脂質(lysophingolipids)を
選択的に結合する機能的特性によって特徴付けられる。宿主細胞において機能的
に、すなわち反応性第二メッセンジャー系と機能し得るように連結された状態で
発現する場合、EDG受容体はさらにリゾフィンゴ脂質に応答可能であり、シグナ ル伝達によって結合可能である。

【００２６】 本発明においては、EDG受容体が、NF-κBの活性化およびIL-8の産生によって 炎症応答シグナル伝達経路およびアポトーシスシグナル伝達経路に関与するとい
うことを発見した。

【００２７】 HeLa細胞において内因性LL受容体を活性化するとNF-κB/IL-8を誘導すること ができ、HeLa細胞においてエデルフォシン受容体を活性化するとNF-κB/IL-8を 誘導することができることも発見した。

【００２８】 さらに、NF-κB誘導受容体である受容体を同定する、特にリゾ脂質(LL)受容体
、EDG受容体およびエデルフォシン受容体を同定する機能的アッセイを開発した 。特に、NF-κB、IL-8またはIL-6産生を測定するアッセイを開発した。

【００２９】 LL受容体およびエデルフォシン受容体に関し、NF-κB/IL-8の活性化/産生を誘
導するための、LL（S1P、LPAなど）およびエデルフォシンに対するHeLa細胞の応
答をそれぞれ測定するアッセイを開発した。

【００３０】 下記に例示したように、293-EBNA細胞を用いてEDG受容体をトランスフェクト した。次いで、トランスフェクトした293EBNA細胞を特異的リガンド（すなわち 、S1P、SPCおよびLPA）に曝し、NF-κBまたはIL-8を炎症応答の指標として測定 した。したがって、これらの機能的アッセイを用いることにより、LPA、S1Pおよ
び／またはSPCがEDG-2、EDG-3、EDG-4、EDG-5およびEDG-6に結合してNF-κBおよ
び／またはIL-8を誘導することが確認された（図２５を参照）。NF-κBおよび／
またはIL-8は炎症応答経路の産物であり、またNF-κBは抗アポトーシス経路にも
関連しており、EDG-2、EDG-3、EDG-4、EDG-5およびEDG-6はこれらと同一の経路 に関連する受容体である。よって、これらのedg受容体またはNF-κBを活性化す る任意のedg受容体をモジュレートすることによって、炎症応答またはアポトー シスモジュレートシグナルをモジュレートすることができる。

【００３１】 本明細書に記載したアッセイは異種発現および内因性発現セッティングの両方
において炎症性EDG/LL受容体を同定でき、そのクローニングおよび特性付けを助
けることができる。したがって、EDG-2、EDG-3、EDG-4、EDG-5およびEDG-6は、 本発明においてこのアプローチにより炎症性LL受容体と同定された。同様に、エ
デルフォシンがHeLa細胞においてPTX感受性IL-8応答を誘発し得るという確認は 、エデルフォシン受容体がHeLa細胞に存在することを示唆するものであり、これ
はEDGまたはLL受容体に対応していてもしなくてもよい。この受容体およびその 他のEDG/LL受容体の単離は、現在の開示に鑑みて、率直な技術的課題である。LL
誘導抗新生物剤であるエデルフォシンは臨床上の効能が示されているので、その
ような単離された受容体およびそれに付随する機能的アッセイは大きな科学的、
商業的および医学的可能性をもたらす。

【００３２】 LLの非受容体依存性作用は、細胞障害を引き起こし、GPCR受容体を必要とせず
にNF-κBを活性化する可能性があると予想される。したがって、本発明の受容体
に対する機能的アッセイとしてNF-κB活性化を確認するために、細胞毒性と機能
的応答の平行した評価を、時間および濃度依存性およびリガンド特異性の明確な
立証ならびにシグナル伝達メカニズムの評価とともに行った（下記の実施例参照
）。

【００３３】 本発明は、ヒトEDG-4受容体をコードする、単離された形態のポリヌクレオチ ドにも関する。EDG-4受容体の活性は、種々の適切な機能的アッセイを用いて測 定できる。そのいくつかを下記に示す。より詳しくは、EDG-4受容体は、NF-κB およびIL-8を誘導するシグナル伝達のために、S1P、SPCなどのLLと結合可能であ
る。

【００３４】 本明細書において大文字の略語で示される場合、EDGは、天然または合成形態 の受容体を意味し、edgは受容体のヌクレオチド配列を意味する。特に、HEDG-4 は、天然または合成形態のヒトEDG-4受容体相同体を意味し、hedg-4は、ヒト受 容体のヌクレオチド配列を意味する。HEDG-4受容体は、S1PおよびSPCにより活性
化され、図16Aまたは図16Bのアミノ酸配列およびその生物学的に活性な断片を含
む。より詳しくは、HEDG-4受容体は好ましくは互いに少なくとも91％の配列同一
性を有し、より好ましくは互いに少なくとも95％の配列同一性を有する。

【００３５】定義 下記の定義は、本明細書において、本出願で用いられる特定の用語を説明する
目的で用いられる。特に定義されていない用語にはどれも本発明が属する技術分
野の当業者によって一般に理解された意味が付与されるべきである。

【００３６】 本明細書で用いられる場合、「単離された」とは、その他のタンパク質をコー
ドするヌクレオチド配列から分離されていることを意味する。ポリヌクレオチド
ライブラリーに関して、例えば、hedg-4受容体コードヌクレオチド配列は、それ
が選択された場合に「単離された」とみなされ、よってライブラリー内の他のヌ
クレオチド配列との関係が解除される。そのようなヌクレオチド配列は、RNAの 形態またはcDNA、ゲノムDNA、合成DNAなどのDNAの形態で存在し得る。

【００３７】 本明細書で用いられる場合、「精製された」とは、その天然環境から取り出さ
れ、そして単離または分離された配列を意味し、それらが天然で関連している他
の成分を少なくとも60％含まない、好ましくは75％含まない、最も好ましくは90
％含まないものを意味する。

【００３８】 「オリゴヌクレオチド」は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)においてオリゴマー 、アンプライマー(amplimer)またはプローブとして用いるのに十分な数の塩基を
有するヌクレオチド残基のストレッチである。オリゴヌクレオチドは、ゲノムま
たはcDNA配列から調製され、特定の細胞または組織における類似のDNAもしくはR
NAを増幅し、その存在を明らかにし、または確認するために用いられる。オリゴ
ヌクレオチドまたはオリゴマーは、少なくとも約10個のヌクレオチド、約35個の
ヌクレオチド、好ましくは約25個のヌクレオチドを有するDNA配列の一部分を含 む。

【００３９】 「プローブ」は、天然、組換え、または化学合成された1本鎖または2本鎖核酸
から誘導され得るか、化学的に合成され得る。プローブは同一または類似の配列
の存在を検出するのに有用である。

【００４０】 ヌクレオチド配列または核酸配列の「一部分」または「断片」には、約6kb以 下、好ましくは約1kb以下のヌクレオチドを含む配列の全部分または任意の部分 が含まれる。一部分または断片はプローブとして用いることができる。そのよう
なプローブは、ニックトランスレーション、クレノウフィルイン(fill-in)反応 、PCRまたは当技術分野で公知のその他の方法を用いてレポーター分子で標識し 得る。反応条件を最適化し、偽陽性体を排除するために、核酸プローブをサザン
、ノーザンまたはin situハイブリダイゼーションに用いて、HEDG-4をコードす るDNAまたはRNAが細胞型、組織または器官に存在するかどうかを確認することが
できる。

【００４１】 「レポーター」分子は、特定のヌクレオチドまたはアミノ酸配列と関連し、そ
の存在を証明し、その定量を可能にし得る放射性核種、酵素、蛍光物質、化学発
光物質または色素物質である。

【００４２】 HEDG-4をコードする「組換えヌクレオチド変異体」は、遺伝子コード中の「重
複性」を用いることにより合成され得る。特定の制限部位またはコドン利用特異
的突然変異をもたらすサイレント変異などの種々のコドン置換を、プラスミドも
しくはウイルスベクターへのクローニング、または特定の原核宿主系もしくは真
核宿主系における発現を、それぞれ最適化するために導入することができる。

【００４３】 「キメラ」分子は、HEDG-4特性、すなわち細胞位置、分布、リガンド結合親和
性、鎖間親和性、分解／代謝回転速度、シグナル伝達などのいずれか1つ（また は２以上）を変化させると考えられる追加の核酸配列を含むベクターに、本発明
のヌクレオチド配列の全部または一部分を導入することにより構築し得る。

【００４４】 「生物学的に活性なまたは活性な」とは、任意の天然HEDG-4の生物活性および
／または抗原活性の少なくとも一部を維持する任意のHEDG-4ポリペプチドの形態
、断片またはドメインを意味する。

【００４５】 「天然HEDG-4」とは、遺伝子工学的に操作されていない細胞により産生された
ポリペプチドを意味し、特に、ヒト集団内で見られる多型性から生じる種々のポ
リペプチド、並びに、ポリペプチドのRNA編集、別のスプライシング、または翻 訳後修飾（例えば限定するものではないがアセチル化、カルボキシル化、グリコ
シル化、リン酸化、脂質化(lipidation)およびアシル化など）から生じる種々の
ポリペプチドを意図するものである。

【００４６】 「誘導体」とは、化学的に修飾されたアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を
意味する。ポリペプチド誘導体についてのそのような技術としては、ユビキチン
化；標識化（上記参照）；peg化（ポリエチレングリコールを用いた誘導体化） ；およびヒトタンパク質では通常生じないオルニチンなどのアミノ酸の化学的挿
入または置換が挙げられる。ヌクレオチド配列誘導体は、天然分子のその本質的
な生物学的特性を維持するアミノ酸をコードするであろう。

【００４７】 「組換えポリペプチド変異体」とは、組換えDNA技術を用いて作成された、ア ミノ酸の挿入、欠失および／または置換によって天然HEDG-4とは異なる任意のポ
リペプチドを意味する。対象となる活性を破壊せずにどのアミノ酸残基を置換、
付加または欠失し得るかを決定するガイダンスは、HEDG-4の配列と関連ポリペプ
チドの配列とを比較し、高度に保存された領域でなされるアミノ酸配列の変異の
数を最小化することにより見出すことができるであろう。

【００４８】 アミノ酸「置換」は、1個のアミノ酸を、類似の構造特性および／または化学 特性をもつ別のアミノ酸で置換すること、例えばロイシンのイソロイシンまたは
バリンによる置換、アスパルテートのグルタメートによる置換、またはトレオニ
ンのセリンによる置換などにより生じる場合、性質が保存される。

【００４９】 「挿入」または「欠失」は、典型的には約１〜５個のアミノ酸の範囲である。
許容される変化は、ペプチドを合成的に製造するか、または組換えDNA技術を用 いてhedg-4配列内にヌクレオチドの挿入、欠失もしくは置換を系統的に行うこと
により、実験的に決定し得る。

【００５０】 所望により「シグナルまたはリーダー配列」を用いてポリペプチドを細胞の膜
を通過するよう誘導することができる。そのような配列は本発明のポリペプチド
上に天然に存在し得るか、または組換えDNA技術によって異種起源から得ること ができる。

【００５１】 「オリゴペプチド」は、アミノ酸残基の短いストレッチであり、オリゴヌクレ
オチドから発現され得る。オリゴペプチドは、ポリペプチドの「断片」、「一部
分」または「セグメント」と機能的に等価であり、長さが同一（またはかなり短
い）ものであり得る。そのような配列は、少なくとも約5個、多くの場合約17個 以上のアミノ酸、典型的には少なくとも約9〜13個のアミノ酸からなり、生物活 性および／または抗原活性を示すのに十分な長さをもつアミノ酸残基のストレッ
チを含む。

【００５２】 「インヒビター」は、生化学的、細胞性、または生理学的反応または応答を遅
らせるかまたは妨害する任意の物質である。一般的なインヒビタ−としては、限
定するものではないが、アンチセンス分子、抗体およびアンタゴニストが挙げら
れる。

【００５３】 「標準」とは、比較のための定量的または定性的測定値である。これは、統計
学的に適切な数の標準サンプルに基づくものであり、診断アッセイを行う場合、
臨床試験を行う場合、または患者の治療プロフィールを追跡する場合の比較の基
礎として用いるために作成される。

【００５４】 「ストリンジェントな条件」は、本明細書では、実質的に関連のある核酸配列
とハイブリダイズできる条件という意味で用いられる。そのようなハイブリダイ
ゼーション条件は、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第
2版, Cold Spring Harbor Press, 1989に記載されている。一般に、ストリンジ ェンシーは、プローブの融解温度よりも約5℃低い温度から該融解温度よりも約2
0〜25℃低い温度までの範囲内で生じる。当業者には理解されるように、ストリ ンジェンシー条件は、同一または関連ヌクレオチド配列を同定または検出するた
めに変更することができる。配列の長さおよび性質(DNA、RNA、塩基組成)、標的
の性質(DNA、RNA、塩基組成、溶液中の存在または固定化など）ならびに塩およ びその他の成分(例えばホルムアミド、硫酸デキストランおよび／またはポリエ チレングリコールの存在または不存在)の濃度のようなファクターが考えられ、 ハイブリダイゼーション溶液を変えることにより低または高ストリンジェンシー
のいずれかの条件を生じさせることができる。

【００５５】 「動物」とは、本明細書で用いられる場合、ヒト、家畜(ネコ、イヌなど）、 農業動物(ウシ、ウマ、ヒツジなど）または試験生物種(マウス、ラット、ウサギ
など）を含むものと定義され得る。

【００５６】 「核酸配列」は、本明細書で用いられる場合、オリゴヌクレオチド、ポリヌク
レオチド、およびそれらの断片もしくは一部分であり、ゲノムまたは合成起源の
DNAまたはRNA（1本鎖でも2本鎖でもよい）であり、センス鎖または相補鎖もしく
はアンチセンス鎖を示す。

【００５７】 「配列同一性」は、当技術分野で知られており、配列を比較することにより、
特に配列のストリング間のマッチ（一致）により決定されるような、２つ以上の
ポリペプチド配列間または２つ以上のポリヌクレオチド配列間の関係である。配
列同一性は、公知の方法(Computational Molecular Biology, Lesk, A.M.編, Ox
ford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Gen
ome Projects, Smith, D.W.編, Academic Press, New York, 1993; Computer An
alysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., およびGriffin, H.G.編, H
umana Press. New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, v
on Heinje, G., Academic Press, 1987; およびSequence Analysis Primer, Gri
bskov, M. およびDevereux, J.編, M. Stockton Press, New York, 1991)により
容易に計算することができる。２つの配列間の同一性を測定するための方法が多
数存在すると同時に、この用語は当業者には公知である(例えば、Sequence Anal
ysis in Molecular Biology; Sequence Analysis Primer; Carillo, H.および L
ipman, D., SIAM J. Applied Math, 48:1073(1988)を参照されたい)。配列間の 同一性を決定するのに一般的に用いられる方法としては、限定するものではない
が、Carillo, H.およびLipman, D., SIAM J. Applied Math., 48:1073(1988)ま たは好ましくはNeedlemanおよびWunsch, J. Mol. Biol., 48:443-445, 1970（こ
こで、このパラメータはDNASIS(Hitachi Software Engineering社, San Bruno,
CA)のバージョン2にセットされているとおりである）に開示された方法が挙げら
れる。同一性を決定するためのコンピュータプログラムは公的に入手可能である
。２つの配列間の同一性を決定するための好ましいコンピュータプログラム法と
しては、限定するものではないが、GCGプログラムパッケージ(Devereux, J.ら,
Nucleic Acids Research 12(1): 387(1984))、BLASTP、BLASTNおよびFASTA(Atsc
hul, S.F.ら, J. Molec. Biol. 215: 403-410(1990))が挙げられる。BLASTXプロ
グラムは、NCBI(blast@ncbi.nlm.mih.gov)およびその他の供給源(BLAST Manual,
Altschul, S.ら, NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S.ら, J. Mol
. Bio. 215: 403-410(1990))から公的に入手可能である。コンピュータ分子生物
学, Lesk, A.M.編。特許請求の範囲に特に記載しない限り、特許請求の範囲を解
釈する目的での同一性のパーセンテージは、DNASISのバージョン2にセットされ たパラメータを用いてNeedlemanおよびWucnschアルゴリズムにより計算されるで
あろう。

【００５８】 T7G受容体のEDG受容体ファミリーは、配列類似性およびゲノム組織性(genomic
organization)に基づいて、2つのサブグループにさらに分類されている（Chun,
Contos および Munroe, 印刷中）。本発明者等は、EDG-2、EDG-5(米国特許出願
第08/997,803号、参照により本明細書に組み入れる)およびEDG-6(Genbank 受託 番号 AF011466)がLPAに対してアゴニストとして応答し、それらのコード領域内
で共通のイントロン構造を共有していることを見出した。EDG-1、EDG-3、ラット
EDG-4/H218(受託番号 U10699)およびEDG-7（同時係属中の米国特許出願第60/070
,184号を参照）は、イントロンのないコード領域を有し、S1PおよびSPCにアゴニ
ストとして応答する。本発明のT7G受容体HEDG-4は、コード領域にイントロンを 有さない。

【００５９】 本発明の一つの態様は、組換えHEDG-4受容体をリガンドおよび薬剤となる可能
性のある候補のスクリーニングのためのアッセイにおいて使用する方法である。
T7G受容体の高スループットスクリーニングにおける使用は公知であるが、HEDG-
4受容体についてのこのようなスクリーニングはこれまでに報告されていない。 より具体的には、本明細書に提示された新規HEDG-4受容体は、アゴニストである
可能性を有するものの相対的能力および効率を同定しランク付けするために使用
できる。これらの化合物は、それらがHEDG-4アゴニストに対する細胞性応答もし
くは生理学的応答をモジュレートすること、または受容体が生じる細胞において
HEDG-4シグナル伝達を生じさせるかまたは補完することが期待される故に、有用
であり得る。同様に、一旦定量的かつ信頼できるアッセイが確立されると、アッ
セイは容易に、受容体アゴニストの相対的能力および効率を同定しランク付けす
るために応用できる。本明細書に記載されたスクリーニング方法の用途は、他の
態様を制限することなく、特に熟慮されており、そして本発明の範囲内に組み込
まれている。

【００６０】 S1PおよびSPCは、HEDG-4に関するアゴニストであることが見出された。

【００６１】 他のHEDG-4リガンドは、リン脂質クラスの化合物間で見出されると考えられる
。従って一実施形態において、リン脂質分子はリガンドを同定するためにスクリ
ーニングされ得る。特に、リガンドである可能性を有するものは、16、17、18、
19、20、22および24炭素単位等の種々の長さの脂肪酸鎖であって、1、2、3また は4個の不飽和炭素-炭素結合を有するか又は有さないものを含むと考えられる。

【００６２】 HEDG-4をコードするヌクレオチド配列（又はその相補体）は、分子生物学の当
業者に知られる技術において多数の応用を有している。これらの技術には、ハイ
ブリダイゼーションプローブとしての使用、PCR用オリゴマーの構築のための使 用、染色体及び遺伝子地図作成への使用、HEDG-4の組換えによる製造への使用、 並びにアンチセンスDNA若しくはRNA、それらの化学類似体などの作成への使用が
挙げられる。本明細書に開示されるHEDG-4をコードするヌクレオチドの使用は公
知の技術例であり、当業者に公知の技術へのそれらの使用を制限するものではな
い。さらに本明細書に開示されるヌクレオチド配列は未開発の分子生物学技術に
使用することも可能であるが、但しその新規の技術は例えばトリプレットの遺伝 暗号、特定の塩基対相互作用などの現在知られているヌクレオチド配列の性質に
依存するものとする。

【００６３】 遺伝暗号の縮重の結果、複数のhedg-4をコードするヌクレオチド配列が作成可
能であることは当業者には理解されるだろう。これらのなかには公知の及び天然
のhedg-4のヌクレオチド配列と最小の相同性しかもたないものもあるだろう。本
発明は特に、可能なコドン選択に基いて組合せを選択することによって為しうる
ヌクレオチド配列の可能な変異の各々及び全てを意図している。これらの組合せ
は、天然hedg-4のヌクレオチド配列に適用される標準トリプレット遺伝暗号にし
たがって作成され、そのような全ての変異は特定的に開示されているものと考え
られるべきである。

【００６４】 HEDG-4をコードするヌクレオチド配列、その誘導体又はその変異体は、好まし
くはストリンジェントな条件下で天然hedg-4のヌクレオチド配列とハイブリダイ
ズ可能であるが、実質的に異なるコドン使用を有する、HEDG-4若しくはその誘導
体をコードするヌクレオチド配列を作成することは有益であり得る。特定のコド
ンが宿主によって利用される頻度にしたがって特定の真核若しくは原核発現宿主
において前記ペプチドの発現が起こる割合が高まるように、コドンを選択するこ
とができる。コードされるアミノ酸配列を変えずに、HEDG-4及び/又はその誘導 体をコードするヌクレオチド配列を実質的に変更する他の理由として、天然配列
から産生された転写体と比べてより望ましい性質（例えば、より大きい半減期）
を有するRNA転写体の産生が挙げられる。

【００６５】 ヒト遺伝子はしばしば、無視できない実際的多型、即ち全ヒト人口のほんの一
部におけるヌクレオチド配列の変異、を示す。多くの場合、この多型の結果、1個
以上のアミノ酸置換が生じる。これらの置換のなかにはタンパク質機能の立証可
能な変化を全く示さないものもあるが、それ以外のものでは機能的作用の度合い
が変化する可能性がある。実際、多くの天然の又は人工的に作られた突然変異に
よって発現可能なHEDGタンパク質に導くことができる。天然に産生されても又は
人工的に作成されてもいずれの場合にも、これらの変異体の各々は等価物とみな
され、特に本発明に包含される。

【００６６】 HEDG-4をコードするヌクレオチド配列は、十分に確立された組換えDNA技術(Sa
mbrook Jら(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Har
bor Laboratory, Cold Spring Harbor NY;又はAusubel FMら(1989) Current Pro
tocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York City)によって種
々の他のヌクレオチド配列と結合させることができる。hedg-4と結合させるのに
有用なヌクレオチド配列には、各種のクローニングベクター、例えばプラスミド 、コスミド、ラムダファージ誘導体、ファージミドなどが含まれる。対象となる
ベクターには、発現用ベクター、複製用ベクター、プローブ作成用ベクター、配 列決定用ベクターなどが含まれる。一般に対象となるベクターは、少なくとも1 種の生物で機能する複製開始点、好都合な制限エンドヌクレアーゼ感受性部位、 及び1種以上の宿主細胞系用の選択マーカーを含むことができる。

【００６７】 本発明の別の態様は、HEDG-4をコードする天然のヌクレオチド配列とハイブリ
ダイズ可能なhedg-4特異的ハイブリダイゼーションプローブを提供することであ
る。このようなプローブはまた、類似のT7Gをコードする配列の検出のために使 用可能であり、hedg-4配列に対し少なくとも91%のヌクレオチド同一性、より好 ましくは少なくとも95%の同一性を含むべきである。本発明のハイブリダイゼー ションプローブは、hedg-4に関するものとして図面に示されるヌクレオチド配列
、又は天然遺伝子のプロモーター、エンハンサー、イントロン若しくは３'非翻訳
領域を含むゲノム配列、から誘導することができる。ハイブリダイゼーションプ
ローブは、当技術分野でよく知られた技術を用いて種々のレポーター分子で標識
されてもよい。好ましくは、ハイブリダイゼーションプローブは、hedg-4受容体
の、少なくとも15ヌクレオチド、好ましくは少なくとも25ヌクレオチドを含む。

【００６８】 HEDG-4の核酸配列の多くの欠失又は変異類似体はHEDG-4核酸用の有効なハイブ
リダイゼーションプローブである。従って、本発明はストリンジェントな条件下
でHEDG-4をコードする核酸配列とハイブリダイズする核酸配列に関する。

【００６９】 ストリンジェントな条件は一般に、少なくとも約70％同一性をもつ配列、好ま
しくは少なくとも約80〜85％配列同一性をもつ配列、より好ましくは少なくとも
約90％配列同一性をもつ配列、最も好ましくは少なくとも約95％配列同一性をも
つ配列のハイブリダイゼーションを可能にするだろう。ハイブリダイゼーション
条件及びプローブは十分に特徴付けられた方法で調整してヒト由来プローブの選
択的ハイブリダイゼーションを達成することができる。ストリンジェントな条件
下でHEDG-4をコードする核酸とハイブリダイズするであろう核酸分子は、上で概
説した方法を用いるか、あるいは、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laborat
ory Manual, 2版, Cold Spring Harbor Press, 1989に総説されている例えばハ イブリダイゼーション則を用いることによって、機能的に同定可能である。ハイ
ブリダイゼーションプローブの使用例には、HEDG-4を発現する組織を同定するこ
となどの組織化学的使用、例えば異常な量のHEDG-4を発現する細胞を同定したり
あるいはサンプルの組織型を同定するためのmRNA量の測定、並びにHEDG-4におけ
る多型性の検出が挙げられるが、これらに限定されない。RNAハイブリダイゼー ション手順は、Maniatisら, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold S
pring Habor Press, 1989)に記載されている。米国特許第4,683,195号明細書、 米国特許第4,800,195号明細書及び米国特許第4,965,188号明細書に記載されるよ
うなPCRは、本発明のEDG-4配列をコードするヌクレオチド配列に基いたオリゴヌ
クレオチドのさらなる使用を提供する。PCRに使用される上記のようなプローブ は、組換え起源のもの、化学合成されたもの、又はその両者の混合物でありうる
。オリゴマーは、特定の組織又は診断用途でのhedg-4の同定のための最適条件下
で使用する別々のヌクレオチド配列を含むことができる。同一の２つのオリゴマ
ー又はネステッドセットのオリゴマー、あるいはオリゴマーの縮重プールでさえ
も、近縁のDNA若しくはRNAの同定のために、より低いストリンジェント条件下で
使用できる。PCRプライマーを設計するための規則は、PCR Protocols, Cold Spr
ing Harbor Press, 1991によって総説されているように、現在確立されている。
縮重プライマー、即ち所与の配列位置に異種性があるプライマー調製物は、edg-4
と同一ではないが高度に相同である核酸配列を増幅するために設計することがで
きる。現在、プライマーのうちの1つのみが既知の配列と特異的にハイブリダイ ズするようにする戦略を利用できる。Fromanら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8
5:8998, 1988及びLohら, Science 243:217, 1989を参照のこと。例えば、適切な
核酸プライマーを、増幅されるべく探求される核酸に連結させてプライマーの１
つに対するハイブリダイゼーション相手を得ることができる。このように、必要
なプライマーのうちの1つのみが、増幅されるべく探求される核酸の配列に基づ くべきである。核酸を増幅するPCR法は少なくとも２つのプライマーを利用する ことになる。これらのプライマーの１つは、増幅される核酸の第1鎖にハイブリ ダイズすることが可能であり、また第1方向に酵素誘導の核酸合成を開始するこ とが可能である。他のプライマーは、第1鎖の逆方向配列とハイブリダイズする ことが可能であり（増幅される配列が一本鎖である場合、この配列は最初は仮想
的であるが第1の増幅サイクルにおいて合成されるだろう。）、また、第1方向と
反対で且つ第1プライマーのハイブリダイゼーション部位に向く方向にある鎖か ら核酸合成を開始することが可能である。特に好適なストリンジェントなハイブ
リダイゼーション条件下でこのような増幅を行うための条件はよく知られている
。例えばPCR Protocols, Cold Spring Habor Press, 1991を参照のこと。

【００７０】 hedg-4用の特異的ハイブリダイゼーションプローブを作成するための他の手段
には、mRNAプローブの作成のためのベクター中にHEDG-4又はHEDG-4誘導体をコー
ドする核酸配列をクローニングすることが含まれる。このようなベクターは当技
術分野で知られており、市販されているし、これを用いて、適切なRNAポリメラ ーゼ（例えばT7又はSP6 RNAポリメラーゼ）及び適切なレポーター分子の添加に
よりin vitroでRNAプローブを合成することができる。

【００７１】 合成化学によって完全にDNA配列又はその一部を製造することができる。合成 後、当技術分野で公知の技術を用いて、核酸配列を多くの入手し得るDNAベクタ ーやそれらの個々の宿主細胞中に挿入することができる。さらに、合成化学を用
いて、ヌクレオチド配列中に突然変異を導入することができる。あるいは、突然
変異を望む配列部分を合成し、存在するゲノム又は組換え配列のより長い部分と
組換えることができる。

【００７２】 hedg-4のヌクレオチド配列をアッセイに用いて、異常なレベルのHEDG-4発現に
関わる炎症又は疾患を検出することができる。そのcDNAを当技術分野で公知の方
法で標識し、患者からの体液、細胞若しくは組織サンプルに加え、ハイブリダイ
ゼーション条件下でインキュベートすることができる。インキュベーション期間
の後、サンプルを、場合によりレポーター分子を含む相容性液体で洗浄する。相 容性液体を濯いで除いた後、レポーター分子を定量し、予め規定しておいた標準
と比較する。

【００７３】 HEDG-4の異常発現の診断検査は、例えば心臓、腎臓、肺及び精巣の異常症状の
診断や適正な治療の促進を可能にする。HEDG-4の異常発現が関与する症状の具体
例には、成人呼吸困難症、喘息、慢性関節リウマチ、心虚血、急性膵炎、敗血症性 ショック、乾癬、急性シクロスポリン腎毒性、初期糖尿病性糸球体症、並びにタ
バコの煙、アスベスト又はシリカに暴露した後の肺損傷が含まれる。

【００７４】 hedg-4をコードするヌクレオチド配列を用いて、組換えDNA技術の公知方法を 用いて精製オリゴペプチド若しくはポリペプチドを製造することができる。Goed
del（1990, Gene Expression Technology, Methods and Enzymology, Vol. 185,
Academic Press, San Diego CA）は、単離ヌクレオチド配列の発現を教示する 多数の刊行物のうちの1つである。このオリゴペプチドは種々の宿主細胞（真核 又は原核のいずれか一方）内で発現させうる。宿主細胞はヌクレオチド配列が由
来する同じ種か又は異なる種に由来しうる。組換えDNA技術によってオリゴヌク レオチドを製造する利点には、精製のために適当量のタンパク質を得ること、及 び簡素化された精製法を利用できることが含まれる。

【００７５】 HEDG-4をコードするDNAを用いて形質転換した細胞を、T7G、それらの細胞外、
膜貫通または細胞内ドメインの発現および細胞培養物からのそのようなペプチド
の回収に適した条件において培養しうる。組換え細胞により産生されるHEDG-4（
またはその任意のドメイン）は、用いられる特定の遺伝子構築物に依り、分泌、
細胞膜上で発現されるか、または細胞内に含まれうる。一般的に、分泌形態で組
換えタンパク質を調製するのがより好都合である。精製工程は製造方法および製
造される特定のタンパク質で異なる。しばしば、オリゴペプチドはキメラのヌク
レオチド配列から製造しうる。これは、hedg-4またはそのポリペプチドの所望の
部分に由来するヌクレオチドを、タンパク質精製を容易にするポリペプチドドメ
インをコードする核酸配列にライゲートすることにより達成される（Kroll DJら
(1993) DNA Cell Biol. 12:441-43）。

【００７６】 組換え法による製造に加え、HEDG-4の断片を固相法（例えば、Stewartら(1969
) Solid-Phase Peptide Synthesis, WH Freeman Co., San Francisco QA; Merri
field J(1963) J Am Chem. Soc. 85:2149-2154）を用いる直接ペプチド合成によ
り製造しうる。例えばApplied Biosystems 431Aペプチド合成器(Foster City, C
A)を製造業者により与えられる指示に従って用いて、自動合成を達成しうる。更
に、HEDG-4の特定の部分を直接合成の間に変異させ、化学的方法を用いてペプチ
ドの他の部分と結合させることができる。

【００７７】 抗体を誘導するためのHEDG-4は生物学的活性を必要としないが、タンパク質は
抗原性でなければならない。特異の抗体を誘導するのに用いられるペプチドは、
少なくとも5個のアミノ酸、好ましくは少なくとも10個のアミノ酸からなるアミ ノ酸配列を有しうる。ペプチドは該タンパク質のアミノ酸配列の一部分を模倣す
べきであるが、HEDG-4などの小さな天然分子のアミノ酸配列の全体を含んでもよ
い。HEDG-4の抗原性部分をキーホールリンペットヘモシアニンなどの他のタンパ
ク質、および抗体産生に用いられるキメラ分子に融合しうる。

【００７８】 HEDG-4に特異的な抗体を、該ポリペプチドまたは抗原性断片を用いて適当な動
物に接種することにより産生しうる。抗体が該ポリペプチドのエピトープに対し
て産生され、天然または組換えタンパク質の少なくとも一部に結合する場合、抗
体はHEDG-4に特異的である。抗体産生には、動物に注射することによる免疫応答
の刺激だけでなく、合成抗体の作成、特異的に結合する分子についての組換え免
疫グロブリンライブラリーのスクリーニング（例えば、Orlandi Rら(1989) PNAS
86:3833-3837、またはHuse WDら(1989) Science 256:1275-1281）、またはリン
パ球集団のin vitro刺激などの類似の方法も含まれる。現在の技術（Winter Gお
よびMistein C(1991) Nature 349:293-299）により、抗体形成の原理に基づいて
、多数の非常に特異的な結合試薬が得られる。これらの技術を適用し、HEDG-4を
特異的に結合する分子を産生しうる。

【００７９】 本発明の更なる実施形態は、HEDG-4に特異的な抗体、インヒビター、リガンド
またはそれらの類似体を生物活性剤として用いて、ウイルス性、細菌性若しくは
真菌性感染症；アレルギー反応；外傷に関連する機械的傷害；遺伝病；リンパ腫
若しくは癌；または腎臓、肺、心臓、リンパ若しくは神経系の組織の遺伝子を活
性化する他の病状を含むがこれらに限定されない疾患あるいは炎症を治療するこ
とである。

【００８０】 HEDG-4のアゴニスト、アンタゴニスト、受容体またはインヒビターを含む生物
活性組成物を、哺乳動物種における最大許容用量を決定する臨床試験または正常
ヒト被験者における安全用量を決定する臨床試験を含む数種の方法のいずれかに
よって決定した適当な治療用量で投与しうる。更に、該生物活性剤を、半減期な
どの薬理学的特性または安定性を強化する、十分に確立された多様な組成物また
は化合物と共に複合体形成させることもできる。治療的および生物活性組成物を
、血流に静脈内注入することにより、あるいはEDG-4遺伝子の異常発現に関係す る問題を処理するために用い得る任意の他の有効手段により送達しうる。

【００８１】 本明細書で言及した刊行物および特許出願は全て、特に手法、細胞系およびベ
クターを説明する目的で参照により組み込まれる。しかしながら、ここで、本発
明が、例えば先行発明によるそのような開示に先行する権利を有するものではな
いことを認めるものと解釈されるべきものはない。

【００８２】 本発明を実証するために以下に実施例を提供する。これらの実施例は例示によ
り提供されるものであって、本発明を限定するためのものではない。

【００８３】実施例1： HeLa細胞中でのS1Pに対するIL-8応答は濃度および反応時間依存性で ある。 S1Pに対するIL-8およびIL-6の応答について細胞系を予備的に調べたところHeL
a細胞が強力な応答性を持つものとして同定されたが(図1B)、HL-60細胞は反応性
を示さず、これはHL-60細胞にはS1P受容体が欠如しているとの報告と一致してい
た(図5)。IL-8およびIL-6は、TNF-α、ホルボールエステル(TPA) などの種々の 炎症誘発性作用物質(proinflammatory agents)、および紫外線照射によって強力
に誘導される。これらの作用物質による誘導は、特定の実験モデルにおいてはNF
-IL6およびAP-1も役割を果たしてはいるが、NF-κBによる転写のアップレギュレ
ーションに依存している。市販されているIL-8 ELISAキットは適度に高いスルー
プットで確実かつ単純な測定法であるので、本発明者らはまず最初にIL-8応答に
焦点を当てることとした。その後の研究ではNF-κBのレポーター遺伝子について
も調べている。しかし本発明の新規性と有用性はedg/LL受容体による炎症性シグ
ナル伝達を幅広く包含するので、本発明者らは、例えばNF-κBを含むがそれに限
定されない他の受容体依存性炎症誘発性レポーターを含め、NF-IL6およびAP-1の
活性化は本発明の範囲内である。

【００８４】 HeLa細胞を用いる試験方法#1 A. 細胞の播種と細胞プレーティング密度 細胞：HeLa(腺癌、ヒト) 培地：DMEM/F12＋10% FBS 付着細胞 1) 細胞を6-ウエルのプレートに0.2 x 10⁶個/ウエル蒔いた。 2) 24-32時間後の細胞のコンフルエンシーは60%から70%の間であった。

【００８５】 B. 一晩血清飢餓にした。

【００８６】 1) 培地を吸引した(PBSによる洗浄は行わなかった)。 2) 1.5mLの0.5%PBS培地を各ウエルに添加した。

【００８７】 C. 処理と回収 1) 必要な溶液は全て0.5%FBS培地(対照)中に作る。NF-κB実験で用いるためのLL
の操作では、通常LPAを再懸濁するために用いられる超音波処理は用いない。NF-
κBは激しく泡立てることによって生成される過酸化脂質によって活性化されう る。

【００８８】 溶液： TPA 100ng/mL, ストック液はDMSO中にTPAを0.1mg/mL含有する液(Sigma, カタロ グNo.P-1585)、 1:1000希釈 LPA 10μM、ストック液は0.2% Albumin Bovine(Sigma, カタログNo.A-0281)をPB
S中に含む液にLPAを10mM含有、1:1000希釈 LPA 1μM、10μMの液を1:10希釈 S1P 10μM、ストック液は10mMをメタノール中に含有するもの(Sigma, カタログN
o.S-9666)、1:1000希釈 S1P 1μM、10μMの液を1:10希釈 注記：ストック溶液は全てピペッティングで溶解し−20℃で保存する。

【００８９】 2) 培地を吸引した。 3) 各ウエルに1.5mLの適切な処理剤を添加した。 4) プレートは全て1、6、もしくは24時間のいずれかの時間、37℃/5% CO₂に置い
た。 5) 一定時間後細胞上清を1.5mLのエッペンドルフ管に集め、14000rpmで5分間遠 心して沈殿させ、後にELISA測定するために−20℃で保存した。

【００９０】 D. インターロイキン-8(IL-8) ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)を用いるIL-8 の検出 1) Quantikine Human IL-8 ImmunoAssay Kitは R&D Systemsから得た(カタログN
o.D8050)。 2) そのキットと全てのサンプルは使用前に室温で平衡化させた。 3) 試薬は全てそのキット中に含まれており、付属の説明書に従って調製した。 4) アッセイ方法はそのキットで細胞培養上清サンプルに対して推奨されている ものに従った。 5) ELISAは50μLの培養上清サンプルで行い、各ウエルについて重複測定を行っ た。各処理条件について3つのウエルを用いて3重測定した。 6) プレートをUVmax kinetic microplate reader(Molecular Devices)で、450nm
にセットし、補正を575nmにセットし、Wsoftmaxソフトウエアversion 2.34を用 いた。

【００９１】 結果：この実験ではHeLa細胞で、S1Pに対するIL-8の応答は時間および濃度依存 性であったがLPAではそうでないことを示した(図1B参照)。

【００９２】実施例2: S1PおよびSPCは双方とも、HeLa細胞中での濃度依存性でPTX-感受性の IL-8応答を誘導する。 ある種の細胞型においてはS1PおよびSPCは双方ともPTX感受性で機能的応答を 示した。しかし、いくつかの細胞型ではS1PはSPCの10倍もしくはそれ以上の効力
を示したが、別の細胞型ではS1PとSPCはほぼ同じ効力であった。S1PおよびSPCに
対するIL-8応答が受容体を介するものであるとすれば、双方のリガンドでPTX-感
受性が認められ、およびおそらくはSPCでの効力は同等かもしくは低いものとな ることが期待された。

【００９３】 HeLa細胞を用いる試験方法#2 A. 細胞の播種と細胞プレーティング密度 細胞：HeLa(腺癌、ヒト)、培地：DMEM/F12＋10% FBS 付着細胞 1) 細胞を24-ウエルのプレートに2.5 x 10⁴個/ウエル蒔いた。 2) 24-32時間後の細胞のコンフルエンシーは60%から70%の間であった。

【００９４】 B. 一晩の血清飢餓とPTX前処理 1) 培地を吸引した(PBSによる洗浄は行わなかった)。 2) 0.5mLの0.5%FBS培地をPTX前処理を必要としないウエル全てに添加した。 3) PTXを必要とするウエルに対しては、50ng/mLのPTXを含有する0.5% FBS培地(1
倍量のPTX(RBI カタログNo.P140):1倍量DTT、37℃で30分インキュベートした後5
0ng/mLに希釈)を0.5mL添加した。

【００９５】 C. 処理と回収 1) 必要とされる溶液は全て0.5%FBS培地(対照)中に作製する。

【００９６】 溶液： S1P 3,10,30,100,300,1000,3000,10000 nM SPC 10μM ストック溶液はSPC 10mMをメタノール中に含む液(Sigma, カタログN
o.S-4257)、1:1000希釈 SPC 1,3,10,30,100,300,1000,および3000 nM 2) 培地を吸引した。 3) 適切な処理剤0.5mLを添加した。 4) プレートは全て6時間、37℃/5% CO₂においた。 5) 一定時間後、細胞上清を1.5mLのエッペンドルフ管に集め、14000rpmで5分間 遠心して沈殿させ、後にELISA測定するために−20℃で保存した。

【００９７】 D. HeLa細胞を用いる試験方法#1の(D)を参照せよ。

【００９８】 結果：この実験では、HeLa細胞中でS1PとSPCは双方ともIL-8を濃度依存性様式で
誘導することができ(図2A)、それらの応答はG_i結合受容体であることから予測さ
れたとおりPTX感受性であること(図2B参照)が明確に示された。

【００９９】実施例3： HeLa細胞中でのS1PおよびTNF-αに対するIL-8応答におけるPTXの作 用 PTXトキシンの作用はヘテロ3量体性のGタンパク質のG_i/oファミリーについて の要求事項を反映しているが、それはGPCRの多様な作用において重要な役割を果
たしている。しかし、S1Pが誘導するIL-8応答のPTXによる阻害が、GPCRに直接的
に結合されたGタンパク質におけるS1Pへの作用よりはむしろ、下流のシグナル伝
達イベントに対する間接的な作用を反映している可能性がある。HeLa細胞内でPT
XによってIL-8産生の総体的なブロックがなされるならば、TNF-αによるIL-8産 生も阻害されるはずである。TNF-αはIL-8をそれ自身の受容体を通じて誘導し、
その受容体はGPCRではなく、シグナル伝達にG_i/oを必要としない。他方、もしTN
F-αへのIL-8応答が影響されないのであれば、PTXによるブロックはS1Pに特異的
で、TNF-αシグナル伝達経路には特異的でない。

【０１００】 HeLa細胞を用いる試験方法#3 下記の点を除いてはHeLa細胞を用いる試験方法#2に従って行う。

【０１０１】 1) C節に必要な溶液は下記のとおり： S1P 5μM TNF-α 50ng/mL、 ストック溶液はPBS中に0.1% Albumin Bovine R&D, カタログN
o.210-TA(Albumin:Sigma; カタログNo.A-0281)を含む液中に10μg/mL含有する液
、 1:200希釈 結果：この実験の結果は、PTXはIL-8のS1Pに対する応答を強力にブロックするが
、TNF-αに対する応答には顕著な影響を与えないことを明確に示した(図3参照) 。このように、HeLa細胞においてIL-8の応答を導くS1Pのシグナル伝達にはG_i/o 経路が必要である。

【０１０２】実施例4A: HeLa細胞内でのS1Pに対するIL-8の応答はリガンド選択的であり、一 般的なLL応答ではない。 S1Pは界面活性剤様構造を他のLLと同様に有している(図1A参照)。細胞障害も しくはS1Pの膜作用によるNF-κBの非特異的活性化は他の多数のLLでも生ずるは ずである。さらに、HeLa細胞で発現されている任意の一般的な非選択性LL受容体
は、数種の異なるLLによってそのどれを用いても活性化されるはずである。ある
いはまた、リガンド選択的なNF-κBの活性化は、将来的な医薬品の発見に適用で
きるような受容体媒介機構を提起するものである。

【０１０３】 HeLa細胞を用いる試験方法#4 下記の点を除いてはHeLa細胞を用いる試験方法#2に従って行う。

【０１０４】 1) B節ではPTXの前処理は必要としない。 2) C節で必要とされる溶液は次のとおり。

【０１０５】 LPC ストック溶液はメタノール中に10mM含有(Sigma, カタログNo.L-1381) LPE ストック溶液はクロロホルム中に10mM含有(Sigma, カタログNo.L-4754) LPG ストック溶液はメタノール中に10mM含有(Sigma, カタログNo.L-4525) LPI ストック溶液はPBS中に1%Albumin Bovineを含む液中に10mM含有(Sigma, カタログNo.L-7635) LPS ストック溶液はPBS中に0.2%Albumin Bovineを含む液中に10mM含有(Sigma,
カタログNo.L-5772) リゾ-PAF ストック溶液はPBS中に1%Albumin Bovineを含む液中に10mM含有(Sig
ma, カタログNo.L-7890) リゾスルファチド ストック溶液はDMSO中に10mM含有(Sigma, カタログNo.L-36
40) スフィンゴシン ストック溶液はメタノール中に10mM含有(Sigma, カタログNo.
S-6136) スフィンゴミエリン(SM) ストック溶液はメタノール中に10mM含有(Sigma, カタ ログNo.S-7004) LPC、LPE、LPG、LPS、スフィンゴシン、およびSMの濃度は10,50,100,1000,およ び5000nMを用いた。LPI、リゾ-PAF、およびリゾスルファチドの濃度は0.3および
3μMを用いた。

【０１０６】 結果：S1PおよびSPCのみがIL-8産生を顕著に誘導し、これはリガンド選択的受容
体がPTX感受性IL-8応答経路を媒介することを強く示唆している。スフィンゴシ ンはS1Pと共にIL-8応答のリガンド選択性の例を示しているが、その他の全ての 上述の化合物ではHeLa細胞で同様な応答の欠如が観察され、それらはグラフ上に
は示していない(図4参照)。

【０１０７】実施例4B： 初代培養ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)でのS1P、LPA、およびその他 のリゾ脂質に対するIL-8応答 HeLa細胞は実験的に均一なアッセイシステムの基礎をなすが、HeLa細胞は長年
培養し続けられてきたものである。さらに、それらの細胞は形質転換された(す なわち腫瘍性の)細胞系であり、そのため多数の染色体および遺伝子の異常を有 している。細胞生物学および分子生物学分野の当業者であれば容易に理解できる
ように、HeLa細胞での知見は非形質転換細胞、好ましくは初代培養ヒト細胞で確
認すべきである。本発明者らは一般に入手しうるヒト初代細胞培養物であるHUVE
Cを選択した。これらの細胞は臍静脈の内皮層由来のものであるので、これらの 細胞は多くの特徴および反応経路を、ヒト体内の他の場所にみられる内皮細胞と
共有している。より特定して述べれば、HUVEC細胞はGPCRによるNF-κBの活性化 の研究に用いられてきた(Ishizaka T.ら, トロンボキサンA2(TXA2) 受容体アゴ ニストでの刺激はヒト血管内皮細胞によるICAM-1、VCAM-1、もしくはELAM-1発現
を増大させる(Stimmulation with thromboxane A2(TXA2) receptor agonist enh
ances ICAM-1, VCAM-1, or ELAM-1 expression by human vascular endothelial
cells), Clin. Exp. Immunol. 1998 Jun, 112(3):464-470; Munoz C.ら, ピロ リジンジチオカルバメートはヒト内皮細胞の炎症メディエーターに応答して起こ
るインターロイキン-6、インターロイキン-8、および顆粒球-マクロファージコ ロニー刺激因子の産生を阻害する:NF-κBおよびAP-1転写因子活性の改変(Pyrrol
idine dithiocarbamate inhibits the production of interleukin-6, interleu
kin-8, and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor by human end
othelial in resonse to inflammatory mediators: modulation of NF-κB and
AP-1 transcription factors activity), Blood 1996 Nov. 1;88(9):3482-3490)
。この細胞型中でのNF-κBの活性化の結果として報告されていることとしては、
IL-8、IL-6、およびGM-CSFなどのサイトカインの産生が挙げられる。さらにVCAM
-1、ELAM-1、およびICAM-1などの細胞接着分子はアップレギュレートされ、傷害
部位もしくは炎症部位での末梢血白血球の付着と血管外遊走に明確な役割を果た
す。下記の実験はS1P、LPA、もしくはその他のリゾ脂質に暴露された培養HUVEC 中でのIL-8産生を調べるために行った。

【０１０８】 HUVECのプレーティング、前処理および処理 実験方法は下記の点を除いて上記の「HeLa細胞を用いる試験方法#1」に詳述した
方法に従って行った。

【０１０９】 細胞：HUVEC(Clonetics, カタログNo.CC-2519)は供給者の説明書に従って継代培
養し、３代目のものを用いた。細胞を24-ウエルのプレートに20,000個/ウエル蒔
いた。翌日、0.5%FBSを含むEBM培地(Clonetics)中で一晩血清飢餓にし、次いでF
BSを含まないEBM中で下記のリゾ脂質で6時間処理した。

【０１１０】 1) 対照(リゾ脂質なし) 2) アナンダミド 3) エデルフォシン 4) LPA 5) S1P 6) SPC 7) サイコシン 上清を集め、IL-8レベルを既述のとおりELISAを用いて測定した。

【０１１１】 結果：図4Bに示すとおり、5μMのS1Pで6時間処理後、IL-8レベルは非処理の対照
に比べ約5倍に増加した。 LPAはこの濃度でIL-8を3倍増加させた。SPCおよびサ イコシン処理ではやや増加がみられたが、アナンダミドもしくはエデルフォシン
では応答は見られなかった。従って、初代培養ヒト内皮細胞中ではIL-8産生はS1
Pに起因しており、それはHeLa細胞でみられた結果と同様であった。さらに、LPA
はHeLa細胞内ではIL-8を誘導しないが、HUVEC細胞ではIL-8産生を誘導し、この ことは、LPAに対する炎症性受容体がHUVEC細胞型中で発現されていることを示唆
している。下記の図23に示すとおり、3種のクローン化されたedg受容体はアゴニ
ストとしてのLPAに応答し、3種類の受容体全てがアゴニスト依存性の様式でNF- κBの活性化を伝達すると考えられる。

【０１１２】実施例5：HL-60細胞中でのS1Pに対するIL-8応答の欠如 HL-60細胞はS1P受容体を有していないと報告されている。それと矛盾する報告
が1つ公表されているが、その研究では10μMの濃度のS1Pが用いられ、その濃度 は他のS1P受容体研究での濃度より10-1000倍高いものであった。そのような報告
はあったが、ここでHL-60細胞のS1Pに対するIL-8応答を調べた。対照として、TN
F-αでの処理後のHL-60細胞からのIL-8の放出を調べたが、これは非GPCR細胞表 面受容体を経由して働くものである。

【０１１３】 HL-60細胞を用いる試験方法 A. 細胞の播種と細胞プレーティング密度 細胞：HL-60(前骨髄性、ヒト)懸濁細胞 培地：2mMのL-グルタミンを含有し、4.5g/L グルコース、10mM HEPES、および1.
0mM ピルビン酸ナトリウム＋10% FBSを含有するように調節したRPMI 1640培地 1) 細胞を0.25 x 10⁶個/mL蒔いた。 2) 48-56時間後の細胞密度は約1 x 10⁶個/mLであった。

【０１１４】 B. 一晩の前処理 1) 細胞を1000rpmで5分間遠心して沈殿させた。 2) 細胞ペレットを0.5%FBS培地中に約1 x 10⁶個/mLの密度に再懸濁した。

【０１１５】 C. 処理と回収 1) 必要な溶液は全て0.5%FBS培地(対照)中に作製した。

【０１１６】 TNF-α 10ng/mL LPA 10および1 μM S1P 10および1 μM 2) 6-ウエルのプレートの各ウエルに1.4mLの適切な処理剤を添加した。 3) 細胞を1000rpmで5分間遠心して沈殿させた。 4) 細胞を0.5%の培地に再懸濁してその密度を約1 x 10⁶個/100μLとした。 5) 細胞懸濁液100μLを各ウエルに添加した。 6) 全プレートを37℃/5% CO₂で1、6、もしくは24時間置いた。 7) 一定時間後、細胞の上清を1.5mlのエッペンドルフ管に集め、14000rpmで5分 間遠心して沈殿させ、−20℃で保存した。

【０１１７】 D. HeLa細胞を用いる試験方法#1の(D)を参照せよ。

【０１１８】 結果：HL-60細胞はTNF-αに応答して6もしくは24時間後にIL-8を放出するが、S1
PもしくはLPAに応答するそのような放出はそれらの濃度が3μMでも起こらない( 図5参照)。この濃度はHeLa細胞でIL-8産生を確実に誘導する最低濃度の100倍で ある。このようにS1Pに対するIL-8応答が全ての細胞型で発現されるわけではな いが、いくつかの細胞型では発現される。

【０１１９】実施例6： S1Pに対するHeLa細胞のIL-8応答は細胞傷害性によるものではない。 LLについて、細胞傷害性を生ずる濃度よりはるかに低い濃度でシグナル伝達を
示すことは重要である。この目的でIL-8応答と並行して細胞傷害性を測定するた
めの実験を行った。細胞傷害性を測定する厳格な尺度を適用し、それではIL-8応
答はS1P処理の6時間後に測定し、その際、培地は通常の培地と置換し、生細胞数
を24時間後に計測した。従ってIL-8の産生は6時間の時点で観察し得るほど強力 なものでなければならず、一方、ごくわずかな毒性であってももしくは遅延毒性
であっても24時間後の生細胞数の減少となって認められるであろう。

【０１２０】 HeLa細胞を用いる試験方法#5 下記の点を除いてはHeLa細胞を用いる試験方法#2に従って行うこと。

【０１２１】 1) B節においてはPTX前処理は必要でない。 2) C節で必要とされる溶液は下記のとおり。 S1P 0.3,1,3,10,および30μM 3) C節に細胞傷害性測定を追加した；ステップ5の後に全ウエルに0.5%FBS/培地0
.5mlを添加し、37℃/5% CO₂で一晩置いた。 4) 最初の処理の24時間後に生細胞数を計測した。

【０１２２】 結果：S1Pの10μMまでの濃度での処理の24時間後にHeLa細胞の生細胞数には減少
はみられなかった。これに対して、S1Pの0.3μM、この濃度はほぼプラトーに近 い値であるが、このレベルでもIL-8産生はみられた(図6参照)。反復実験におい ては確実にIL-8を誘導する最低S1P濃度は約30nMであり、これは細胞傷害を生ず る閾値の100分の1未満であった。他方、HL-60細胞では10μMのS1Pで毒性を示し 始めたが細胞傷害性の閾値未満ではIL-8を産生しなかった。このように、S1Pに 対するIL-8応答は細胞傷害もしくは切迫した細胞死に対する非特異的細胞性応答
を反映するものではない。

【０１２３】実施例7： HeLa細胞でのS1Pに対するIL-8応答におけるスラミンの作用 スラミンは、細胞内の標的が知られていない、細胞外リガンド-受容体相互作 用の非選択的なインヒビターである。この薬剤はLPAおよびS1Pの双方の細胞外作
用部位の証拠を提供するために用いられる。IL-8応答がこの細胞外部位でブロッ
クされうるか調べるために試験した。

【０１２４】 HeLa細胞を用いる試験方法#6 下記の点を除いてはHeLa細胞を用いる試験方法#2にしたがって行うこと。

【０１２５】 1) B節ではPTXの前処理は必要としない。 2) C節で必要な溶液は下記のとおり： 3) スラミン 1mg/mL、ストック溶液は蒸留水中に100mg/ml含有のもの(Calbioche
m, カタログNo.574625)、1:100希釈 S1P 1μM S1P 1μM＋スラミン1mg/mL 4) 対照およびS1P 1μMを除く全てのウエルについてC節のステップ3の前に1mg/m
Lのスラミン0.5mLを用いて37℃/5% CO₂で30分間前処理した。

【０１２６】 結果：スラミンはS1Pに対するIL-8応答を鈍くすることに非常に有効であった(図
7参照)。従って、S1P作用部位としては細胞外受容体である可能性が高い。

【０１２７】実施例8： HeLa細胞でのS1Pに対するIL-8応答におけるNDGAおよびNACの作用 NF-κBおよびIL-8の産生は多数の異なる炎症性作用物質で誘導することができ
る。これらの多様な作用物質のほとんど全てが、究極的には細胞内リプレッサー
IκBの破壊に収斂するシグナル伝達経路を開始させるものであり、IκBは休止細
胞内でNF-κB機能を抑制する。しかし、IκBを標的とするために用いられる上流
の経路はインデューサーの性質によって異なる。炎症性サイトカインおよびTPA は細胞内反応性酸素種(ROS)を第二メッセンジャーとして用いるが、TNF-αおよ びIL-1はROSを通常は用いない。ROS経路およびそれに続くNF-κBの活性化はNDGA
、NAC、およびその他のある種の抗酸化剤で阻害することができる。それ故、S1P
によって誘導されるIL-8応答のそれらの抗酸化剤に対する感受性を評価した。

【０１２８】 HeLa細胞を用いる試験方法#7 下記の点を除いてはHeLa細胞を用いる試験方法#2に従って行うこと。

【０１２９】 1) B節ではPTXの前処理は必要としない。 2) C節で必要な溶液は下記のとおり： 3) NDGA 40μM ストック溶液はエタノール中に10mM含有のもの(Sigma, カタロ グNo.N-5023)、1:250希釈 NAC 30mM ストック溶液はPBS,pH7.4中に0.3M含有のもの(Calbiochem, カタ ログNo.106425)、1:10希釈 S1P 1μM S1P 1μM＋NDGA 40μM S1P 1μM＋NDGA 10μM S1P 1μM＋NAC 30mM 4) 対照およびS1P 1μMを除く全てのウエルについてC節のステップ3の前にNDGA もしくはNACのいずれかの0.5mLを用いて37℃/5% CO₂で30分間前処理した。

【０１３０】 結果：S1Pに対するIL-8応答は2種の抗酸化剤双方によって顕著に阻害された(図8
参照)。文献で指摘されているとおり、親油性の抗酸化剤であるNDGAは親水性のN
ACより強力であった。しかし、NDGAでは、S1Pに対するIL-8の応答を完全に阻害 する濃度である40μMでは毒性が認められた。そのような結果ではあるが、これ らの構造的には無関係の抗酸化剤が双方ともS1Pに対するIL-8の応答を阻害した ことは、サイトカイン様の経路がS1Pのシグナル伝達を媒介することを示唆して いる。

【０１３１】実施例9： HeLa細胞における、アルキルエーテルリゾリン脂質であるエデルフ ォシンに対するスラミンおよびPTX感受性IL-8応答 エデルフォシンは強力かつ選択的な抗腫瘍活性を有するアルキルエーテルリゾ
リン脂質である。エデルフォシンが遺伝子発現およびシグナル伝達に変化を生じ
させることに焦点を当てた多数の研究があるにもかかわらず、その作用機作につ
いては矛盾するデータが報告されている。エデルフォシンはプロテインキナーゼ
Cを阻害するのでおそらく細胞内の作用部位を有するのであろう。エデルフォシ ンはまた、少なくともいくつかの細胞型中ではNF-κBを阻害することもできる。
最も重要なことは、エデルフォシンは腫瘍細胞を殺す濃度で正常な骨髄細胞は殺
さないことである。そのような識別が生じるメカニズムは不明である。しかし、
LPAとの構造的類似性をみれば、エデルフォシンがedgファミリーもしくはLL受容
体に働いているのではないかという可能性が考えられる。それ故、PTXもしくは スラミンの存在下もしくは不在下でのHeLa細胞におけるエデルフォシンに対する
IL-8応答を調べた。

【０１３２】 HeLa細胞を用いる試験方法#8 下記の点を除いてはHeLa細胞を用いる試験方法#2に従って行う。

【０１３３】 1) C節で必要な溶液は下記のとおり： スラミン 1mg/mL ET-18-OCH₃ 10μM ストック溶液はエタノール中に10mM含有するもの(Calbioche
m, カタログNo.341207)、1:1000希釈 ET-18-OCH₃ 1μM 1:10希釈 ET-18-OCH₃ 3μM ET-18-OCH₃ 3μM＋スラミン 1mg/mL 2) 対照および、PTXとET-18-OCH₃とを含むウエルを除く全てのウエルについてC 節のステップ3の前にスラミン0.5mLを用いて37℃/5% CO₂で30分間前処理した。

【０１３４】 結果：エデルフォシンはS1P同様、HeLa細胞で毒性を示さない濃度でIL-8応答を 誘導した(図9参照)。その上、この応答はPTXおよびスラミンによって強力に阻害
され、このことはエデルフォシンによるIL-8の誘導がG_i/o結合細胞表面受容体に
よって媒介され得ることを示唆している。この受容体は、既に同定されているPA
F受容体との相互作用を除外してしまうことはできないが、おそらくedgもしくは
LL GPCRであろう。この知見は、種々の細胞型において先に報告されているエデ ルフォシンによるNF-κBの阻害と矛盾するものであった。本発明はHeLa細胞のエ
デルフォシン受容体を同定し特徴づける方法を提供するものである。エデルフォ
シンに対しての細胞傷害性とNF-κB応答性の異なる細胞でこの受容体の発現を比
較することができる。

【０１３５】実施例10A： COS-1細胞におけるEDG-4/H218の異種発現はS1Pに対するIL-8の応 答を再構成する。 本発明者らは、Swiss 3T3、マウス神経B-103、およびハムスターCHO Pro5の各
細胞中の機能的S1P受容体の存在を示すためにcAMP阻害アッセイを用いた。7種類
の既に同定されているedg受容体の発現プロフィールに対するこれらの細胞のcAM
P応答を比較することにより、本発明者らはEDG-3およびEDG-4の双方がS1P受容体
であろうと推定した。しかし、COS細胞およびHEK-293細胞の双方ともEDG-3のRNA
を豊富に発現しているにも関わらず、どちらの細胞系もS1Pに対するIL-8応答を 示さなかった。このことはEDG-4は選択的にS1Pに対するIL-8応答を媒介すること
を示唆していた。不運にも、EDG-4はHeLa、COS-1、もしくはその他の霊長類細胞
の由来した種からクローン化されていないので、これらの細胞中ではこれまで測
定できなかった。本発明はこのような状況に対してクローン化したHEDG-4の配列
を提供することによって解決法を提供するものである。しかし、完全長のラット
edg-4 cDNAを発現している真核細胞の発現ベクターでの一過性のトランスフェク
ションによって、このedg受容体がCOS-1細胞においてS1Pに対するIL-8応答を再 構成することができるかどうかが測定しうる。この実験にはIL-8応答と並行して
、CATレポーター遺伝子の誘導を調べるためにNF-κBレポーターDNAも含めた。

【０１３６】 A. DEAE/デキストラン細胞懸濁液の一過性トランスフェクション トランスフェクションはAnal.Biochem.218:460(1994)の記載に従って行った。

【０１３７】 a) 溶液： RSC: 49mL RPMI 1640(GibcoカタログNo.21870-076)＋1mL ウシ胎児血清＋50μL の100mM クロロキン(SigmaカタログNo.C6628) DEAE/RSC: 18.4mL RSC＋1.6mLの10mg/mL DEAE/デキストラン(PromegaカタログNo
. E112A) b) トランスフェクション操作法： 1) 6mL RSCを4-50mLの試験管に添加した。下記の量のDNAを添加した。

【０１３８】

【表１】 試験管をDEAE/RSC溶液ができるまで37℃でインキュベートした。

【０１３９】 2) 各試験管に6mLのDEAE/RSC溶液を添加し37℃で2分間インキュベートした。 3) RSC中にCOS-1細胞を含む懸濁液1.5mL(合計で5.5 x 10⁶個の細胞)を各試験管 に添加し37℃のインキュベーターで105分インキュベートした。試験管は20分毎 に混合した。 4) インキュベーション後、試験管を5分間遠心し、細胞ペレットをDMEM/F12＋10
%FBSで1回洗い、10mLの培地に再懸濁した。細胞を24-ウエルのプレートに0.2 x
10⁶個/ウエル蒔いた。

【０１４０】 B. 処理 2日後(〜40時間)、細胞を、少なくとも6時間、PTXを含有する(50ng/mL)もしく
は含有しない血清飢餓条件(0.5%FBS培地)とし、0.5% FBS培地、S1P(5μM)を0.5%
FBS培地中に含むもの、もしくはTPA(100ng/mL)を0.5%FBS培地中に含むもので一 晩処理した。処理容量は500μLとした。上清を14000rpmで10分間微量遠心し、新
しいエッペンドルフ管に移し、後のIL-8ELISA測定のために−20℃で保存した。

【０１４１】 C. IL-8 ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ) HeLa細胞を用いる試験方法(D)に概説した方法に従って、ELISA測定あたり50μ
Lのサンプルを用いて重複測定した。

【０１４２】 結果：EDG-4発現プラスミドでトランスフェクトしたCOS-1細胞は5μM S1Pで処理
した場合には非処理細胞に比べIL-8の放出が2倍増加した(図10A参照)。空の発現
ベクターpcDNA3でトランスフェクトした対照の細胞ではS1Pに対するIL-8の応答 は認められなかった。さらに、対照およびEDG-4でトランスフェクトした細胞はP
TXの存在下では同様に低レベルのIL-8を示したので、EDG-4でトランスフェクト した細胞でのS1Pに対するIL-8応答は百日咳トキシン感受性であった。予測され たとおり、PTXはTPAに対するIL-8応答を阻害しなかったが、この応答はGPCRによ
って媒介されるものではない。内因性EDG-3 RNAが豊富に発現されて存在してい るにもかかわらずCOS-1細胞はS1Pに対するIL-8応答を示さない。しかし、ラット
のEDG-4の異種発現はS1Pに対するPTX感受性のIL-8応答を、HeLa細胞に発現され ている内因性受容体と類似のものへ再構成する。従って、ここに述べている機能
アッセイは、特異的edgおよび/もしくはLL受容体の発現に高度に依存しており、
それはHeLa細胞で内生的に発現されており、EDG-4の形態およびおそらくは他の 関連GPCRの形態でも異種発現することができる。

【０１４３】実施例10B： 293-EBNA細胞における内因性Edg受容体の発現 edg cDNA受容体でトランスフェクションするためのより適切な細胞を決定する
ために、ノーザンブロット実験をHeLa、COSおよび293-EBNA細胞で行った。図10B
からわかるように、ノーザンブロットの結果は、293-EBNA細胞はEDG-5が可能性 がある他はedg受容体のいかなるものも目に見えるような発現がないことを示し ていた。ノーザンブロット実験と共に、HeLa、COS、および293-EBNAの各々の細 胞をTPA、LPA、およびS1Pに暴露し、IL-8産生を測定した。293-EBNA細胞はLPAお
よびS1Pに対してIL-8産生を示さず、このことはいかなるEDG受容体も発現してい
ないことを示している。

【０１４４】実施例11： ルシフェラーゼアッセイを用いる異種発現研究 前述の実験で観察されたCATレポーター遺伝子の2倍の誘導をさらに改善するた
めに、2つの変更を加えた。第1はNF-κB応答エレメントを、霊長類細胞中でエピ
ゾームとして安定に維持するために適した新規のレポーター構築物(p4Luc)中に 再構築した。第2に、HEK-293のEBNA-1を発現している誘導体である293-EBNA細胞
(Invitrogen, カタログNo.R620-07)において一過性のトランスフェクションを行
った。p4Lucレポーターは、pREP4(Invitrogen, カタログNo.V-004-50)の骨格を 用いたもので、それは複製のEBV起点(EBV_ori)を有し、ならびにEBV_ori含有プラ スミドを霊長類細胞中で安定なエピゾームとして維持するために必要なEBNA-1ウ
イルス抗原、および原核細胞選択マーカーを用いている。ゼオシン(zeocin)耐性
についての主要真核細胞選択マーカーをpREP4のneoマーカーと置換し、ルシフェ
ラーゼカセットをpREP4中での発現のためにマルチクローニングサイトにクロー ン化した。次いでpREP4のプロモーターを切り取り、プロモーター/エンハンサー
インサートの導入のためのマルチクローニングサイトで置き換えた。以前のCAT レポーターのNF-κB-tkインサートをこの部位へサブクローン化し、NF-κB-tk-p
4Lucと呼ぶプラスミドの構造を確認するためにクローニング結合部は全てその配
列を調べた。

【０１４５】アッセイ#1 293-EBNAを用いる単層一過性トランスフェクションプロトコール 1日目： 1) Invitrogenから得た293-EBNA(カタログNo.R620-07)を〜80%コンフルエンシー
とした150mmのプレートをトランスフェクションに用いた。 2) 6.6μgのNF-κB-tk-p4LucレポーターDNAおよび6.6μgのpC3-redg4(ラットEDG
4を発現している)、もしくはpcDNA3 DNAを、500μLのOPTI-MEM(Gibco, カタログ
No.31985-062)で希釈した。 3) 96.8μLのリポフェクタミンLipofectamine(Gibco, カタログNo.18324-020)を
500μLのOPTI-MEMで希釈した。 4) 2種の溶液を穏やかに混合し、試験管を室温で30分間インキュベートした。 5) 293-EBNAのプレートをPBSで1度洗い、各プレートにOPTI-MEM 13mLを添加した
。 6) 各トランスフェクション試験管に6mLのOPTI-MEMを添加し、それを293-EBNA細
胞のプレートに添加した。プレートを5% CO_２インキュベーター中で37℃で4時間
放置した。 7) 4時間後、培地を除去し新鮮な10% FBS培地と置換した。

【０１４６】 2日目： 1) トランスフェクトされた細胞を洗い、1 x トリプシンでトリプシン処理し、1
0mLの培地中に再懸濁し、細胞数を計測した。 2) ポリD-リジンでコートした96-ウエルのBlackviewプレートの各ウエルあたり0
.02 x 10⁶細胞を蒔いた。96ウエルプレートの外側のウエルには細胞を蒔かなか った。各トランスフェクションについて96-ウエルのプレート2枚に蒔いた。

【０１４７】 3日目： 1) 細胞をPBSで洗い、140μLの無血清培地(SFM)を各ウエルに添加した。プレー トを37℃インキュベーター中で6時間インキュベートした。 2) 6時間後、培地を除去し細胞を0.5%FBS培地中で希釈した化合物で処理した(各
ウエルに140μL添加した)。

【０１４８】 下記の処理法を用いた。 pcDNA3: 非処理、LPA 10μM、LPA ５μM、S1P 10μM、S1P 2μM、SPC 3μM、SPC 1μM、
エデルフォシン 1μM、エデルフォシン 500nM、LPC 1μM、LPC 500nM、20% FBS(
GibcoカタログNo.10437-028)、TPA(50ng/mL)、TPA(25ng/mL) pC3-EDG-4 非処理、LPA 10μM、LPA ５μM、S1P 10μM、S1P 5μM、S1P 1μM、SPC 3μM、S
PC 1μM、エデルフォシン 1μM、エデルフォシン 500nM、LPC 1μM、LPC 500nM 、20% FBS、TPA(50ng/mL)、TPA(25ng/mL) 3) 細胞は24時間処理した。

【０１４９】 4日目： ルシフェラーゼアッセイ 1) ルシフェラーゼアッセイにはLucliteキット(Packard, カタログNo.6016911) を用いた。試薬は全て使用前に室温に戻した。 2) 上清を新しい96-ウエルのプレートに移し、後のIL-8測定のために−20℃で保
存した。 3) 96-ウエルプレートの全てのウエルに50μLの0.5M HEPES pH7.8 バッファー(1
mM MgCl₂、1mM CaCl₂) を添加した。黒色の粘着性の裏板(Polyfitronics)を観察
プレート(viewplate)の底部に並べた。 4) 10mLの基質溶解液を1バイアルの凍結乾燥基質に添加してLuclite基質を作製 した。再構成した基質は遮光容器に保存した。50μLの基質を各ウエルに添加し た。 5) 透明の粘着性プレートシーラーで観察プレート上を覆い、プレートを覆うシ ーラーをキムワイプでこすった。プレートをプレートシェーカー上で500rpm、5 秒間右側を上にして振盪させ、次いで反対側を上にして振盪させた。停止プレー
トを暗視(blackview)プレートの上部に重ねて置き、プレートを暗所で保持した 。 6) プレートを室温で30分間インキュベートした。 7) インキュベーション後、12-検出器付Packard Top Countで暗所遅延のないプ ログラムを用いてプレートを計数した。

【０１５０】 結果：pC3-redg4およびNF-κB-tk-p4Lucレポーターで同時トランスフェクトした
293-EBNA細胞は、細胞を5μMもしくは10μM S1Pで処理した場合には4ないし4.5 倍のルシフェラーゼ活性の増加を示した(図11参照)。1μMのS1Pで処理したEDG-4
発現細胞はルシフェラーゼ活性の2倍の増加を示した。PTXを用いた前処理はS1P に対する応答を供試した全ての濃度で阻害した。空の発現ベクターpcDNA3および
ルシフェラーゼレポーターで同時トランスフェクトした細胞ではルシフェラーゼ
活性の増加は認められず、これらの細胞ではPTXでの前処理したものでもルシフ ェラーゼ活性には変化はみられなかった。SPCもEDG-4発現細胞中でレポーター遺
伝子を誘導したが、対照の細胞では誘導せず、この応答もPTX感受性であった。 精密には測定していないが、SPCの効力はS1Pよりも明らかに低い。予測どおり、
TPAはNF-κBレポーターを強力に誘導し、PTXはこの誘導に影響を及ぼさない。ア
ッセイしたその他のリガンドでは、pC3-redg4もしくはpcDNA3でトランスフェク トされた細胞でいずれもレポーターの誘導は観察されなかった。

【０１５１】 これらの結果は、EDG-4がPTX感受性S1P受容体としての役割を担わされている ことを強く支持するものであり、その受容体はNF-κBおよび炎症遺伝子発現を経
由してシグナル伝達を行う。さらに、これらの結果は受容体依存性の機能アッセ
イの決定的な認証を付与するが、これは本発明の１つの態様をなすものである。

【０１５２】 単離された受容体、それはHeLa細胞で内生的に発現されるものであるが、それ
もまた本発明の１つの実施形態をなす。分子生物学と発現クローニングの当業者
であればよく知っている多数の方法をedgもしくはLL GPCRを単離するために利用
可能であり、それらは本発明者らがここで確立した判断基準を満足する。そのよ
うなものとしては、EDG-4、EDG-1/EDG-3/EDG-4サブファミリー、もしくはEDG-1 およびEDG-2のパラログ(paralog)を含むより広範囲のedgファミリーから由来す る縮重もしくは特異的オリゴヌクレオチドを用いたHeLa cDNAライブラリー(Invi
trogen, カタログNo.A550-26)のスクリーニング、ならびにラットEDG-4コード領
域DNAとのハイブリダイゼーションによるスクリーニングを含む。発現クローニ ングによってedg/LL受容体cDNAも容易に同定されるはずで、そのDNAは適切な発 現ベクター中にクローン化されており、293-EBNA細胞にS1P、SPCおよび/もしく はLPAに応答してPTX感受性の様式でIL-8産生能もしくはNF-κBレポーター誘導能
を与える。

【０１５３】アッセイ＃２ IL-8/NF-κ応答は、EDG/LL受容体の、受容体依存性の確固とした(robust)再現性
のある機能アッセイの全ての基準を満たしていた。このアッセイを、天然のLLに
対する応答性について種々のクローン化EDG受容体に、ならびにウシ胎児血清な どの複合混合物に適用した。このようにして、オーファンEDG受容体のアゴニス トリガンドを同定し、炎症応答をする能力を有するEDG受容体を同定する。

【０１５４】293-EBNAについての一過性トランスフェクションのプロトコル １日目 ： 以下の変更点以外は上記のアッセイ１のプロトコルを実施した。

【０１５５】 １）集密度が〜80％の293-EBNAの100mm径プレートをトランスフェクションに用 いた。 ２）３μgのNFκB-tk-p4LucレポーターDNAおよび３μgのpC3-hedg1、pC3-hedg3 、pC3-redg4、pC3-hedg5もしくはpcDNA3のDNAを240μlのOPTI-MEM（Gibco; Cat.
31985-062）に希釈した。 ３）22μlのリポフェクタミン（Gibco; Cat.18324-020）を240μlのOPTI-MEMに 希釈した。 ４）上記の293-EBNAプレートをPBSで一回洗浄し、７mlのOPTI-MEMを各プレート に添加した。 ５）DNA／リポフェクタミン混合物を293-EBNA細胞の各プレートに添加した。こ れらのプレートを５％CO₂インキュベーター内で37℃にて４時間放置した。

【０１５６】２日目 ： １）ポリD-リシンで被覆した96ウェルのBlackviewプレートのウェル当たり0.01 ×10⁶個の細胞をプレートした。96ウェルプレートの外側のウエルには細胞はプ レートしなかった。

【０１５７】３日目 ： 全てのトランスフェクションについて次の処理を行った。

【０１５８】 未処理、S1P ３μM、LPA ３μM、サイコシン３μM［Sigma; Cat. P-9256,スト
ック10mM（メタノール中）］、SPC ３μM、LPC １μM、スフィンゴシン３μM、2
0％FBS、TPA（20ng/ml）、エデルフォシン(edelfosine)１μM、リゾスルファチ ド(lysosulfatide)３μM。

【０１５９】結果 ：pC3-redg４構築物でトランスフェクトした293-EBNA細胞は、該細胞を３μ
MのS1Pで処理した場合に、3.5倍のルシフェラーゼ活性の増大を示した（図12参 照）。この実験において、３μMのSPCは４倍のルシフェラーゼ活性の増大を示し
た。先のことからわかるように、PTXはS1PおよびSPCに対する応答を効率的に阻 害した。pcDNA3でトランスフェクトした293-EBNA細胞では、S1Pに対する応答もS
PCに対する応答も全く見られず、先の結果を裏付けている。このことは、S1Pお よびSPCに対するルシフェラーゼ応答が、293-EBNA細胞におけるEDG-4の異種発現
に重大に依存することを証明するものである。

【０１６０】 ラットEDG-4またはヒトEDG-5でトランスフェクトし20％FBSで処理したた細胞 もまた〜２倍のルシフェラーゼ活性の増大を示し、PTXがこの応答を効率的に阻 害した。そのような応答は、pcDNA3でトランスフェクトした細胞における20％FB
Sに対しては全くみられず、PTXは20％FBSの存在下もしくは不在下で対照細胞の ルシフェラーゼ発現に全く影響を及ぼさなかった。S1Pは、凝固した血小板から の遊離によってFBS中に存在し、20％血清で処理したEDG-4発現細胞において見ら
れるルシフェラーゼの増大を説明することができる。本発明者らは結論として、
20％血清はEDG-5のアゴニストを１つ以上含み、これはLPAまたは関連するLLから
なる可能性がある、と考える。さらに、EDG-5は、EDG-４同様に、前炎症(proinf
lammatory)NF-κBシグナル伝達経路を介して応答できる。

【０１６１】 これらの結果は、先の実験を立証するだけでなく、この確固とした再現性のあ
る機能アッセイが、edg受容体およびLL受容体のアゴニストおよびアンタゴニス トのスクリーニングにおいて広範に適用できることを支持している。IL-8産生ま
たはNF-κBレポーター遺伝子のような陽性の受容体誘導リードアウトの場合、実
験は一過性にトランスフェクトした細胞について行うことができ、標的edg／LL 受容体の迅速かつ適応性のあるスクリーニングを可能にする。これは、フォルス
コリン(forskolin)によるcAMP産生のG_i媒介性阻害のような阻害アッセイとは対 照的である。後者のタイプのアッセイでは、低減が非トランスフェクト細胞の阻
害されない応答によって隠蔽されないような適切な細胞系が必要である。

【０１６２】 さらに、このアプローチは、オーファンedg／LL受容体のアゴニストを同定で きるが、但しこの場合、該受容体は本明細書中に記載の炎症経路を介して応答す
る。edg受容体の天然のアゴニストが未知である場合であっても、これらの確固 たる再現性のあるリードアウトを用いればアゴニストのスクリーニングが可能で
ある。このアプローチを用いれば、化学的に純粋な物質やリガンドクリップとし
て適用されたとしても、あるいは血清のような生物学的調製物中で適用されたと
しても、異種的（あるいは内在的）に発現されたedg／LL受容体に対してアゴニ ストを同定できる。本発明の(in hand)この信頼性のあるバイオアッセイを用い れば、血清から活性なLLを精製、単離、特性決定および合成することはたやすい
ことである。

【０１６３】アッセイ＃３ NF-κBは、この炎症に関連する転写因子により制御される遺伝子のプロモータ
ー内に見られる特定のDNA配列に結合することにより遺伝子発現を活性化する。 別の配列である血清応答エレメント（SRE）は、血清飢餓細胞に血清を添加する ことによってアップレギュレートされる遺伝子のプロモーター内に見出される。
LPAおよびS1Pの双方は血清中にマイクロモルの濃度で見られ、血清により引き起
こされるSREアップレギュレーションの重要な部分を媒介することが示されてい る。SREの活性化は、NF-κB活性化へと導く経路とは別の異なる経路を反映する ので、EDG-4ならびに密接に関連するEDG-1およびEDG-3受容体をS1PまたはSPCに よるSREレポーター遺伝子の誘導について試験した。SREレポーターは、NF-κB結
合部位が２つのSRE部位に置き換わっている以外はNF-κBレポーターと同一であ った。この新規なレポーターは2XSREtk-p4Luc-zeoと呼ばれた。

【０１６４】293-EBNAについての一過性トランスフェクションのプロトコル（アッセイ３） ：1日目 ： 以下の変更点以外は、実施例11のアッセイ１で記載したプロトコルを実施した
。

【０１６５】 １）集密度が〜80％の293-EBNAの100mm径プレートをトランスフェクションに用 いた。 ２）SREの同時トランスフェクション：0.5μgの2XSREtk-p4Luc-zeoレポーターDN
Aおよび3.5μgのpcDNA3、EDG-1、EDG-3（pC3-hE3HP2、実施例11のアッセイ２で 用いたクローンとは異なる）または新たにクローニングしたヒトEDG-4（pC3-hed
g4#36）；NF-κBの同時トランスフェクション：２μgの6XNFκBtk-p4Luc-zeoレ ポーターDNAおよび2.0μgのpcDNA3、EDG-1、EDG-3（pC3-hE3HP2）またはEDG-4（
pC3-hedg4#36）。発現プラスミドおよびレポータープラスミドのDNAサンプルを 混ぜ合わせ、750μlのDMEM／F12（無血清培地）および20μlのPlus Reagent（Li
pofectamine Plus Kit, Life Technologies Cat. 10964-013）中に希釈し、室温
で15分間インキュベートした。 ３）30μlのリポフェクタミン試薬（Lipofectamine Reagent）（Lipofectamine
Plus Kit）を750μlのDMEM／F12中に希釈した。この希釈リポフェクタミンを次 いでDNA／Plus混合物と混ぜ合わせ、室温で15分間インキュベートした。 ４）293-EBNAプレートをPBSで一回洗浄し、５mlのDMEM／F12を各プレートに添加
した。 ５）DNA／Plus／リポフェクタミン混合物を293-EBNA細胞の各プレートに添加し た。これらのプレートを５％CO₂インキュベーター内で37℃にて３時間放置した 。 ６）トランスフェクション培地を、2XSREtk-p4Luc-zeoレポーターDNAでトランス
フェクトした細胞については無血清DMEM／F12で、そして6XNFκBtk-p4Luc-zeoレ
ポーターDNAでトランスフェクトした細胞については10％FBSを含むDMEM／F12で 交換した。

【０１６６】２日目 ： ２）トランスフェクト細胞をトリプシン処理(tripsinization)によって収集し、
ウェル当たり50,000個の細胞を、ポリD-リシンで被覆した96ウェルのBlackview プレート（Becton Dickinson Labware, Cat. 40640）にプレートした。96ウェル
プレートの外側のウェルには細胞はプレートしなかった。

【０１６７】３日目 ： １）6XNFκBtk-p4Luc-zeoレポーターDNAでトランスフェクトした細胞についての
培地を、0.5％FBSを含むDMEM／F12で交換した。

【０１６８】４日目 ： １）培地を取り除き、細胞をDMEM／F12培地中に希釈した化合物で処理した。全 てのトランスフェクションについて次の処理を行った。 未処理：無血清培地のみ、S1P（３μM）、SPC（３μM）。 ２）細胞を６時間処理した。 ３）ルシフェラーゼアッセイを実施した。

【０１６９】 EDG-１および2XSREtk-p4Luc-zeoレポーターの同時トランスフェクションによ り、３μMのS1Pで処理した後ではルシフェラーゼ活性は８倍増大し、３μMのSPC
で処理した後では６倍増大した（図13A）。これとは対照的に、EDG-１および6XN
FκBtk-p4Luc-zeoレポーターで同時トランスフェクトしたS1P処理細胞またはSPC
処理細胞ではルシフェラーゼ活性の増大は全く見られなかった（図13B）。かく して、EDG-1受容体は十分機能性であり、アゴニストとしてS1PおよびSPCを認識 するが、NF-κBレポーターは誘導されなかった。この結果は、EDG-１がS1P/SPC 受容体の非炎症サブタイプである、という知見を確認するものである。

【０１７０】 元来のヒトEDG-3クローンは、S1PまたはSPCに対するNF-κB応答を起こさなか ったが、ヒト膵臓由来の異なるヒトEDG-3クローン（pC3-E3HP2）をSREレポータ ーとともに同時トランスフェクトしたところ、このクローンは３μM S1Pに対し ては強い12倍のSRE応答を、そして３μM SPCに対しては11倍の応答を示した（図
13A）。空の発現ベクターpcDNA3のSREレポーターとの対照同時トランスフェクシ
ョンは、S1Pに対して小さいが再現性のある応答（約1.5倍）を示したが、SPCに 対しては示さなかった（図13A）。膵臓EDG-3クローンのこの強いSRE応答は、密 接に関連のあるEDG-4に加えてEDG-1およびEDG-3の双方がS1P／SPC受容体サブタ イプとして機能する、という本発明者らの仮説を立証している。さらに、未処理
の対照と比較した場合、EDG-3で同時トランスフェクトした後で、S1P処理細胞お
よびSPC処理細胞の双方において同様のNF-κBレポーター遺伝子の誘導（約８倍 ）が見られた（図13B）。そのような誘導は、pcDNA3およびNF-κBレポーター遺 伝子で同時トランスフェクトした細胞では見られず（図13B）、これはEDG-3トラ
ンスフェクト細胞におけるS1PおよびSPCに対するNF-κB応答が内因性の受容体に
よるものではないことを示唆している。したがって、（EDG-1ではなく）EDG-3は
、S1Pおよび他のリゾスフィンゴ脂質(lysosphingolipid)に対する炎症応答を行 うことができる別のedg／リゾ脂質(lysolipid)受容体サブタイプであると考える
べきである。

【０１７１】 EDG-1およびEDG-3と同様に、ヒトEDG-4（実施例12、13および14のHEDG-4の同 定およびクローニングを参照）もまた、SRE受容体レポーター遺伝子を介して応 答し、未処理の対照細胞と比較してS1Pに対しては8倍の応答を、SPCに対しては ９倍の応答をそれぞれ示した（図13A）。実施例11で試験したラットEDG-4発現構
築物について観察したように、ヒトEDG-4はまた強いNF-κB応答を媒介し、S1Pお
よびSPCに対してそれぞれ4.5倍および９倍の該レポーター遺伝子の誘導を示した
（図13B）。したがって、炎症遺伝子発現経路の誘導はヒトおよびラットにおけ るEDG-4の保存された特徴であり、おそらく受容体機能の基本的な生物学的側面 を反映する。

【０１７２】 総合すると、これらの結果は、SRE応答が、多数の異なるedg／リゾ脂質受容体
の共通する特徴であることを示唆しており、それらの同系のアゴニストに対する
インタクト機能性受容体の応答を確認するのに用い得る。一方、NF-κB応答は、
炎症遺伝子発現および免疫系の漸増を起動するように特殊化したedg／リゾ脂質 受容体のサブセットに共通している。EDG-1、EDG-3、EDG-4およびEDG-7は全てS1
P／SPC受容体なので、炎症シグナル伝達のサブタイプ特異性を理解しない限り、
それらの一様でない、さらには重複しさえする組織分布および誘導性のために、
抗炎症S1P類似体の有意義な設計、スクリーニングおよび治療試験はうまくいか ない。この複雑さのために、本明細書中で特定する組換え炎症リゾ脂質受容体お
よび機能アッセイの価値および有用性が一層明確になる。

【０１７３】実施例12：ラットH218（EDG-4）に相同なヒト・エクスプレスド・シーケンス・ タグ（EST）の同定 オリゴヌクレオチドRE4 181Fの配列［5’-GAGAAGGTTCAGGAACACTACAATTACACCAA
GGA-3’］を用いて、ラットEDG-4の配列に基づいて、全GenBankデータベースのB
LAST検索を行った。この検索では、ラットEDG-4 cDNA（GenBank受託番号U10699 ）の対応領域に88％同一であるヒトEST（GenBank受託番号AA804628）を同定した
。続いて、（受託番号U10699による）ラットEDG-4 cDNAの推定ポリペプチド産物
を用いてESTデータベースのTBLASTN検索を行ったところ、元のヒトESTに加えて ２つの別のマッチするEST（受託番号AA827835およびAA834537）が明らかになっ た。これら３つのESTは、ヒトEDG-4の推定転写開始部位（ラットEDG-4に対する 類似性に基づく）を含んでおり、互いに幅広く重複しており、一緒になってヒト
EDG-4ポリペプチドのＮ末端部分のある109個のコドンにわたるものであった（図
14）。ヒトEDG-4ポリペプチドの推定断片は、ラットEDG-4の対応する断片に対し
て90.1％の同一性および93.3％の類似性を示したが、これは、ヒト・ポリペプチ
ドがラットEDG-4遺伝子産物のオーソログ体（ortholog）であり、密接に関連す る遺伝子産物ではないことを示唆している。次いで、ラットEDG-4 cDNAの全配列
（受託番号U10699）を用いて、ESTデータベースに対してBLAST検索を行った。先
に同定したESTに加えて、ポリ(A)テイルに隣接するヒトEDG-4 cDNAの3’側非翻 訳領域に明らかに由来すると思われる２つのESTを見出した（AA767046およびN93
714）。同定された合計５つのヒトESTの中で、N93714だけが1998年２月19日以前
の公開データベースに存在していた。このESTは、コード領域を含まない1421 bp
のcDNAインサートの3’末端に由来するものであった。DBESTデータベースエント
リーに登録されている最も近い適合体（受託番号500502）はcGMPホスホジエステ
ラーゼであった。このクローンの5’末端は既に配列決定されており、GenBank受
託番号W21101を取得している。しかし、他のcDNAに対する類似性は、Alu配列の 存在のために不明瞭になった。

【０１７４】実施例13：5’末端および3’末端診断PCRを用いた潜在的cDNA供給源の調査 HeLa細胞（炎症S1P／SPC受容体を発現する）および肺（ラットではEDG-4発現 の最も重要な部位）由来のヒトEDG-4 cDNAの可能性のある供給源を、所望のcDNA
断片の存在について評価するために、5’末端EST（AA804628、AA834537およびAA
827835）ならびに3’末端EST（N93714およびAA767046）のクラスターから診断PC
Rプライマーを設計した。

【０１７５】 5’末端プライマー： HE4-DF1 ［5’-ATTATACCAAGGAGACGCTGGAAAC-3’］ HE4-DR1 ［5’-AGAGAGCAAGGTATTGGCTACGAAG-3’］ 3’末端プライマー： HE4-DF2 ［5’-TCCTCTCCTCGTCACATTTCCC-3’］ HE4-DR2 ［5’-GCATTCACAAGAAATTACTCTGAGGC-3’］ テンプレートの供給源：１）WI-38肺繊維芽細胞由来のcDNAライブラリー（Orige
ne Technologies Inc., Cat. DLH-102）；２）ヒト肺由来のcDNAライブラリー（
Clontech, Cat. 7114-1）；３）HeLa細胞由来のcDNAライブラリー（Invitrogen,
Cat. A550-26）；4)HeLa細胞の全RNAから社内（in-house）で調製した第1鎖cDN
A。各テンプレートをBoehringer Mannheim社製（Cat. 1681-842）のExpand（登 録商標）PCRシステムを用いて各プライマー対で増幅した。

【０１７６】 各反応物は次の試薬を含むものとした。

【０１７７】 ２μl 10×PCR緩衝液３ 0.4μl 25mM dNTP混合物 0.6μl プライマーHE4-DF1またはHE4-DF2（10μM） 0.6μl プライマーHE4-DR1またはHE4-DR2（10μM） 0.3μl Expand（登録商標）酵素（３ユニット） 15.1μl 水 １μl cDNAテンプレート PCR条件： インキュベート： 94℃で２分間 30サイクル： 94℃で40秒間 55℃で１分間 68℃で40秒間 インキュベート： 68℃で８分間 保持： ４℃ WI-38肺cDNA（Origene）から、およびHeLa細胞から社内で調製した第1鎖cDNA から、予想される〜200bpの5’PCR産物がうまく増幅された。ヒト肺cDNAライブ ラリー（OrigeneおよびClontech）およびHeLa cDNAライブラリー（Invitrogen）
から〜200bpの3’PCR産物がうまく増幅されたが、ランダムヘキサマーでプライ ムしたHeLa第1鎖cDNAからは増幅されなかった。かくして、WI-38ヒト肺繊維芽細
胞cDNAライブラリー（Origene）は、全長ヒトEDG-4 cDNAクローンの最も有望な 供給源であると思われた。さらに重要なことに、このHeLaからのヒトEDG-4 cDNA
の断片の成功裏の増幅は、このS1P／SPC応答性の細胞系におけるEDG-4発現の具 体的な証明となり、EDG-4、およびHeLa細胞から単離された炎症S1P／SPC受容体 についての本願の組成のクレームを直接支持している。後述する全長配列の情報
と共に、HeLa細胞からの炎症EDG-4受容体の全長クローニングおよび発現は、当 業者にとっては簡易な技術の実行へと変わる。

【０１７８】実施例14：ヒトedg-4 cDNAの全コード領域のクローニング ２つの新規なプライマーを設計して、全コード領域および3’側非翻訳領域の 大部分を増幅した。これらのプライマーは、翻訳開始部位にまで及ぶEST配列お よびヒトedg-4の推定3’非翻訳配列を提示するEST配列をベースとするものであ った。これらのプライマーが共通のテンプレート（すなわち、ヒトedg-4 cDNA）
に適切に結合するならば、全コード領域を含む〜2.4kbのPCR断片が増幅されるは
ずである。以下のように、これらのプライマーを、WI-38ヒト肺繊維芽細胞cDNA ライブラリー（Origene）を用いたPCR反応に用いた。

【０１７９】 HE4-DF3 ［5’-GAGCCCCACCATGGGCAGCTTGTACT-3’］ HE4-DR2 ［5’-GCATTCACAAGAAATTACTCTGAGGC-3’］ 各反応物は次の試薬を含むものとした。

【０１８０】 ５μl 10×PCR緩衝液３ 1.0μl 25mM dNTP混合物 1.5μl プライマーHE4-DF3（10μM） 1.5μl プライマーHE4-DR2（10μM） 0.75μl Expand（登録商標）酵素（２ユニット） 39.25μl 水 １μl cDNAテンプレート（250ngまたは500ngのDNA） PCR条件： インキュベート： 94℃で２分間 10サイクル： 94℃で40秒間 60℃で40秒間 68℃で５分間 25サイクル： 94℃で40秒間 60℃で40秒間 68℃で３分間 インキュベート： 68℃で８分間 保持： ４℃ 250ng（チューブ227〜45）および500ng（227〜50）のcDNAテンプレートからの
増幅反応物の各々は２kbまたはそれより大きい３つのPCR産物を含んでいた。PCR
反応物およびゲルからのDNA断片はそれぞれQIAquick PCR精製キット（Quiagen,
Cat. 28106）およびQIAquickゲル抽出キット（Qiagen, Cat. 28704）を用いて精
製した。３つのPCR産物のそれぞれについて診断PCR反応を行い、それら３つの全
てから、5’末端プライマー対および3’末端プライマー対の両方を用いて、予想
される診断PCR産物を得た。それらはサイズが異なり（〜２kb、2.2kbおよび2.4k
b）、翻訳開始領域および3’側非翻訳領域からのプライマーを用いて増幅したの
で、３つは全て、異なる、別々に（alternatively）スプライシングされたedg-4
転写産物を提示し得る。

【０１８１】 これら３つのPCR産物をテンプレートとして用いて、発現ベクターへのクロー ニングに適する制限部位を含むプライマーを用いてヒトedg-4を再増幅した。長 い方（HE4-DR3）または短い方（HE4-DR4）の3’側非翻訳領域を用いて２つの異 なる3’末端プライマーを選択した。以下のPCRプライマーおよびPCR条件を用い た。

【０１８２】 HE4-DF4 ［5’-TTTAAAAAGCTTCCCACCATGGGCAGCTTGTACT-3’］ HE4-DR3 ［5’-TATATATCTAGACATTCACAAGAAATTACTCTGAGGC-3’］ HE4-DR4 ［5’-TATATATCTAGAGGAAATGTGACGAGGAGAGG-3’］ 各反応物は次の試薬を含むものとした。

【０１８３】 ５μl 10×PCR緩衝液３ 1.0μl 25mM dNTP混合物 1.5μl プライマーHE4-DF4（10μM） 1.5μl プライマーHE4-DR3またはHE4-DR4（10μM） 0.75μl Expand（登録商標）酵素（５ユニット） 39.25μl 水 １μl DNA PCR条件： インキュベート： 94℃で２分間 28サイクル： 94℃で40秒間 60℃で40秒間 68℃で3.5分間 インキュベート： 68℃で８分間 保持： ４℃ 増幅した断片をQIAquick PCR精製キット（Qiagen, Cat. No. 28106）を用いて
精製した。このDNAをHind IIIおよびXbaIで制限消化し、QIAquick PCR精製キッ ト（Qiagen, Cat. No. 28106）およびQIAquickゲル抽出キット（Qiagen, Cat. N
o. 28704）を用いて精製し、Hind IIIおよびXbaIで制限消化したpcDNA3（Invitr
ogen; 不連続）へサブクローニングした。蛍光色素標識ジデオキシターミネータ
ーおよびPerkin-Elmer/ABI377自動配列決定装置を用い、edg-4インサートに隣接
するベクター配列または既知のラットもしくはヒトedg-4配列から設計したプラ イマーを用いて配列決定を行った。ヒトedg-4配列は適合化されており、Laserge
ne DNA StarコンポーネントSeqManを用いて組み立てた。Wisconsin GroupのGCG モジュールFRAMESEARCH、GAP、FASTAおよびBLASTを用いてラットedg-4との比較 を行った。

【０１８４】 〜2.4kbのヒトedg-4 cDNAインサートの1,170bpのスパンを広範にわたって配列
決定した。クローンpC3-hedg4#5およびpC3-hedg4#36に由来するcDNAの配列を図1
5Aに示す。この領域は、37bpの推定5’側非翻訳領域、全ヒトedg-4コード領域に
対応する1059bpのオープンリーディングフレーム（終結コドンを除く）、および
コード領域に隣接する74bpの3’側非翻訳領域を含んでいた。このcDNA配列は、G
enBankエントリーU10699のラットedg-4 cDNA配列に対して、それぞれラットおよ
びヒトedg-4ポリペプチドの全オープンリーディングフレームにまで及ぶ1129bp の領域にわたって82.1％の同一性を示した。

【０１８５】 推定ヒトedg-4翻訳産物（図16A）は、ラットEDG-4ポリペプチドに対して90.1 ％の同一性および92.3％の類似性を示し、これはラットEDG-4のヒト・オーソロ グ体としてのその同一性と一致していた。ラットおよびヒトEDG-4のアミノ酸配 列のアライメントを図17Aに示す。ヒトEDG-4ポリペプチド配列は、Ｇタンパク質
結合受容体に典型的な特徴を有し、７つの推定膜貫通ドメイン、複数の可能性の
ある細胞内リン酸化部位および単一の可能性のある細胞外N-グリコシル化部位を
含む。これらの特徴の存在位置を図16Aに示す。

【０１８６】 図15Bおよび16Bはそれぞれ、クローンpC3-hEdg4#36のHEDG-4受容体のcDNA配列
およびアミノ酸配列を示す。図17Bは、図16A、16BおよびラットEDG-4のアミノ酸
配列のアライメントを示す。

【０１８７】実施例15A：クローニングしたヒトEDG-4受容体のS1P活性化および機能的応答 新規に同定したヒトEDG-4遺伝子産物が、そのラットの対応物と同様に、血清 応答エレメント（SRE）レポーター遺伝子の活性化を介してSPCに応答できるかど
うかを判定するために、発現クローンpC3-hedg4#36を、血清応答因子の共通結合
配列を２コピー保有するルシフェラーゼ・レポーターと共に293-EBNA細胞にトラ
ンスフェクトした。トランスフェクションはLipofectamine Plusキット（Life T
echnologies, Cat. 10964-013）を用い、製造業者の推奨条件を用いて行った。 処理時（すなわち、トランスフェクションの72〜96時間後）に100％集密的にな るように細胞を接種した場合に、最適なSRE誘導が見られた。処理直前の72時間 にわたって０％〜0.15％の血清を含む培地中で細胞を血清飢餓にし、次いで、無
血清培地で３μMのSPCを用いて、もしくは無血清培地だけで６時間処理した。こ
れらの条件下において、空の発現ベクター(empty expression vector)pcDNA3と の対照の同時トランスフェクションでは約2.5倍のSREレポーターの誘導がもたら
され、低レベルのS1P／SPC受容体が293-EBNA細胞により内因的に発現されたこと
を示唆している。これとは対照的に、ヒトEDG-4発現では、３μMのSPCにより26.
3倍のSREレポーター遺伝子の誘導が起こった（図18A）。同様に、SREレポーター
とのラットedg-4の同時トランスフェクションでは、３μMのSPCにより35.6倍の ルシフェラーゼ活性の誘導が起こった。したがって、ヒトedg-4 cDNAは機能性S1
P／SPC受容体をコードし、その発現は293-EBNA細胞において容易に検出できる。

【０１８８】実施例15B：ヒトEDG-4受容体アゴニストの相対的な効力および有効性の測定 本発明の１つの形態は、薬物スクリーニングプログラムにおける組換えヒトED
G-4受容体の使用方法である。ハイスループット・スクリーニングにおけるGPCR の使用は公知であるが、edg受容体についてはそのようなスクリーニングは報告 されていない。さらに詳細に言えば、本明細書中で提示する新規なヒトEDG-4受 容体は、可能性のあるアゴニストの相対的な効力および有効性を同定およびラン
ク付けするのに用い得る。これらの化合物は、NF-κB誘導に関連する生存関連シ
グナル伝達経路を起動させることが予想されるので、非常に有用であり得る。同
様に、一旦定量的で信頼性の高いアッセイが確立されれば、それは受容体アゴニ
ストの相対的な効力および有効性の同定およびランク付けに容易に適用できる。
本明細書中に記載のスクリーニング方法のこの適用は、他の形態を制限せずに、
本発明の範囲内で特に意図され組み込まれる。

【０１８９】 EDG-4のトランスフェクション、組換えヒトEDG-4を発現する293-EBNA細胞の発
現、前処理および処理は、本質的に「実施例11、ルシフェラーゼアッセイを用い
る異種発現研究」に記載のようにして行う。種々の濃度のS1P、SPC、サイコシン
、グルコサイコシンまたはジヒドロスフィンゴシン1-ホスフェート（ヒジドロ-S
1P）を96ウェル・プレート中で細胞に３連で適用し、６時間処理した後でルシフ
ェラーゼ・レベルを測定した。結果はMicrosoft Excelで表にし、GraphPad Pris
mソフトウエアで解析した。EC₅₀値は、傾きを変更するとデータに対する適合性 （fit）が有意に改善される場合以外は、固定ヒル・スロープ方程式（fixed Hil
l-slope equation）を用いて求めた。ルシフェラーゼ応答は、化合物の所与濃度
にてpcDNA3トランスフェクト細胞におけるあらゆる内因性の応答を差し引いた後
で、応答倍率（fold response）として表わした。この実験を３回繰り返したと ころ、類似の結果が得られた。代表的な実験を図18Bに示す。

【０１９０】結果 ：表２は被験化合物の相対的な効力および有効性をまとめたものである。

【０１９１】

【表２】 ^ａ10μM以上の濃度で細胞傷害性が見られ、EC₅₀又はE_maxの定量的測定を妨げた 。

【０１９２】結果 ：ここで得られた結果から、EDG-4はS1PおよびSPCの双方に対して十分なア ゴニストとして応答し、その効力および有効性はほぼ同様である、と結論づける
ことができる。これに対し、ジヒドロ-S1Pは、見かけ上の効力はS1PおよびSPCと
ほぼ同等であったにかかわらず、これらのアッセイ条件下では部分的アゴニスト
であった。したがって、ホスフェートのヘッド基へのコリン置換基の付加は活性
に大きく影響を及ぼさなかったが、不飽和炭素−炭素結合が十分なアゴニスト活
性の役割を果たすと思われる。サイコシンおよびグルコサイコシンは共に、低い
効力および有効性を示し、さらに高濃度で細胞傷害性を示した。それにもかかわ
らず、これらの化合物は受容体を活性化した（この理由は、pcDNA3活性が各濃度
において1.0と設定されたからである）。公表されている文献は、S1Pに対して複
数の受容体が存在すること、およびこれらのうちの少なくとも幾つかがSPC受容 体サブタイプと同一であることを支持している。

【０１９３】実施例16：神経増殖因子媒介性炎症および神経栄養性シグナル伝達における炎症 性リゾ脂質受容体の役割 プログラム細胞死の抑制においてスフィンゴシン1-ホスフェート（S1P）を使 用することは公知である（Cuvillierら, 1996; Spiegel, 1998）。しかし、S1P は細胞内の第二メッセンジャーとして作用すると考えられていたので、受容体と
してのデータはなかった。本発明者ら自身の研究は、Ｇタンパク質共役型受容体
（GPCR）であるEDG-1（Hla & Maciag, 1990）、EDG-3（Yamaguchiら, 1996）、E
DG-4［刊行文献ではAGR16として（Okazakiら, 1993）またはH218として（MacLen
nanら, 1994）述べられている］および本発明においてクローニングしたHEDG4、
ならびにEDG-7（Munroeら, 未発表; 米国特許出願第60/070,185号に対応、引用 により本明細書に組み入れる）がアゴニストとしてS1Pおよびスフィンゴシルホ スホリルコリン（SPC）に応答することを示している。しかし、先の実施例およ び後記の実施例18で示すように、それら４つのS1P／SPC受容体のうち、２つだけ
、つまりEDG-3およびEDG-4、がNF-κBの活性化を介してシグナル伝達する。S1P は、有糸分裂誘発、神経突起の退縮、細胞の運動性の阻害、アポトーシスの抑制
、そして本発明者らが見出した炎症性遺伝子発現を含む複数の生物学的活性を有
する。したがって、S1Pまたはその類似体をうまく治療に用いられるかどうかは 、どの受容体が発現され、そして薬剤にさらされる組織内でのそれらの作用は何
なのか、の理解にかかっている。

【０１９４】 NF-κB活性化カスケードの直接的なモジュレーションは、炎症またはアポトー
シスの治療メカニズムとして提案されている。しかし、NF-κBは、いたるところ
に存在する微生物病原体に対する先天免疫において、そして抗原特異的免疫系の
起動において極めて重要な役割を担っている。したがって、炎症性S1P／SPC受容
体のアゴニストおよび／または受容体のシグナリングが過度であったり不適切で
あったりする場合には、この取り替えのきかない防御系を標的とするのではなく
、炎症性S1P／SPC受容体を介してのNF-κBの不適切な活性化を遮断する方が好ま
しいであろう。あるいはまた、NF-κBが免疫無防備状態の宿主において望ましく
ないアポトーシスを防止できるか免疫機能を増強できる場合には、これらの受容
体のアゴニストが、特に薬化学特性および選択的薬理学的観点から望ましいであ
ろう。

【０１９５】 スフィンゴシンをリン酸化する酵素であるスフィンゴシンキナーゼ（Edsallら
, 1997）およびNF-κB（Riusら, 1997）が共に、明確なPC12神経芽細胞腫モデル
におけるNGFの神経栄養性作用において重要な役割を担っていることが示されて いることから、NGFの抗アポトーシス性シグナリング経路がS1PおよびNF-κBの双
方に依存することが推測できる。EDG-4は、NGF処理前、NGF処理時およびNGF処理
後にPC12細胞内で発現されることが示されている（MacLennanら, 1994）。CNSに
おいては、胚形成の間に最も高レベルのedg-4 RNAが検出される。CNS EDG-4タン
パク質の免疫組織化学的位置決定により、若く分化しているニューロンの細胞体
および軸索が標識され、これは神経栄養性機能において提案される役割（MacLen
nanら, 1997）と一致している。

【０１９６】 EDG-4はNF-κBを活性化することによりS1P／SPCに応答するので、PC12細胞内 ではS1P産生（Edsallら, 1997）とNF-κB活性（Riusら, 1997）との間に因果関 係が存在する、と推定できる。EDG-3は、発現されると同様の役割を果たし得る 。NGFシグナリングにおける多くのステップが記載されているが、この系におい てどれがS1PをNF-κBと結びつけるのか、についての報告はない。U937細胞では 、一つの報告が、S1P処理によりNF-κB活性化が起こることを示している(Shatro
vら, 1997)。しかし、この著者らは、IL-8またはIL-6のような炎症性遺伝子発現
が起こるのかどうかについて示していなかったし、細胞表面受容体が関与し得る
ことを認識してもいなかった。その代わり、まさに米国特許第5,712,262号にあ るように、彼らは、S1Pが細胞内の第二メッセンジャーであると考えていた（Cuv
illierら, 1996; Spiegel, 1998）。本発明者らは、ここで、これらのシグナリ ングステップ間の関連について分子的な説明を提供している。S1PはEDG-4または
EDG-3のような炎症性受容体サブタイプに作用する。これはひいてはＧ_ｉ／ｏヘ テロトリマータンパク質複合体の活性化へとつながり、チロシンキナーゼおよび
反応性酸素種に依存する下流の事象を引き起こす。最終的に、NF-κBは活性化さ
れ、抗アポトーシス性の遺伝子発現が起こる。

【０１９７】 PC12細胞および多くの他の神経細胞型もしくは非神経細胞型上のNGFに対する ２つの受容体が存在する。これらの一方であるTrkAは高親和性NGF受容体であり 、古典的な二量体膜貫通チロシンキナーゼ受容体機構を介してシグナル伝達する
。他方のp75^NGFRはNGFおよび幾つかの他のニューロトロフィンに対する低親和性
受容体であり、TNFR、Fas／CD95およびCD28を含む「細胞死受容体(death recept
or)」遺伝子ファミリーに属し、重要なプロ-アポトーシス性中間体としてセラミ
ドおよび／またはスフィンゴシンを用いてスフィンゴミエリナーゼ経路を通じて
シグナル伝達する。実際、TrkA不在下でのp75^NGFR発現により、NGFはPC12細胞の
生存ではなくアポトーシスを誘導するようになる。TrkAとp75^NGFRの共発現は、P
C12細胞内でNGFが神経栄養活性を示す上で必要である。TrkAだけの発現では、ア
ポトーシスに効果がない。

【０１９８】 理論に拘束されるものではないが、TrkAは次のようにNGFに対し神経栄養活性 を付与すると考えられる。スフィンゴシンキナーゼ（SK）は、プロ-アポトーシ ス性スフィンゴシンをS1Pへと変換する酵素である。S1Pは、細胞死受容体リガン
ドまたはセラミドによって誘導されるプログラム細胞死を積極的に抑制すること
が示されている（Cuvillierら, 1996；Spiegel, 1998）。SKは、TrkAおよびp75^{N GFR} を共発現するPC12細胞内でNGFによって誘導されるが、TrkAのチロシンキナー
ゼ活性がK252aによって阻害される場合には誘導されない（Edsallら, 1997）。 したがって、スフィンゴシンキナーゼの誘導はp75^NGFR細胞死シグナル（セラミ ド／スフィンゴシン）を生存シグナル(S1P)へと変換すると思われる。PC12細胞 内にEDG-4（および、おそらくはEDG-3）が存在するならば、スフィンゴシンキナ
ーゼを介するS1Pの産生によりGPCRの活性化が引き起こされ、それによりNF-κB が活性化されると予想される。そしてまた、NF-κBはNGFに対する神経栄養性応 答に必須であることが既に知られている（Riusら, 1997）。したがって、炎症性
S1P受容体は、NGF神経栄養性シグナリングにおいてこれら２つの必須のステップ
を直接結び付ける上で中心的な役割を担っている。

【０１９９】 75^NGFRと同様に、幾つかの他の細胞死受容体が、細胞型および与えられる副刺
激(costimulus)に応じてアポトーシスおよび／またはNF-κB活性化を誘導するこ
とが示されている。シグナリングカスケードにおけるスフィンゴミエリナーゼ、
セラミド／スフィンゴシンおよびスフィンゴシンキナーゼの関与もまた、TNFR、
Fas／CD95および他のファミリーメンバーを用いて何度も示されている。NGF系と
のもう１つの類似点は、特定の細胞死受容体を発現する幾つかの細胞型はそれら
のリガンドの存在にも関わらず生存するが、それ以外の細胞型は生存しない、と
いう観察である。ここでもまた、プロテインキナーゼＣが生存経路に関与してい
る。S1Pが、Fas／CD95に対しては生存、TNFRに対しては炎症性遺伝子発現におい
て同様の役割を担うという直接的な証拠さえある。したがって、細胞死受容体リ
ガンドがアポトーシス／炎症を引き起こす可能性をモジュレートする上での、炎
症性リゾスフィンゴ脂質／edg受容体の広範にわたる役割が予想できる。そうで あるならば、これらのGPCRは細胞の生存、分化および炎症において基本的な役割
を担い得る。したがって、そのような受容体を単離する方法、およびこれらの活
性をモジュレートするリガンドの同定方法は、本明細書中に記載の本発明の態様
を構成する。

【０２００】 NF-κBを活性化することが知られている他のGPCRのリガンドは通常、非常に限
られた範囲の細胞型において産生されるペプチドまたは小分子である。しかし、
いたるところに分布するスフィンゴ脂質およびスフィンゴミエリナーゼを用いて
、edg受容体のリガンドを生成することができる。したがって、潜在的にあらゆ る細胞型がこれらの受容体に対するリガンドを作ることができる。さらに、セラ
ミドおよび／またはスフィンゴシンは細胞死受容体シグナリング経路の必須な一
部分として合成されるが、これは適当なS1P受容体が存在する場合には、生存に はS1Pへのさらなる代謝変換が少なくとも一度は必要となり得るためである。一 方TrkAはPC12細胞内でSKを誘導するためのシグナルを生じるが、プロテインキナ
ーゼＣの他の誘導物質もまたSK発現を誘導することが示されている。これらのう
ちの１つは、強力な腫瘍促進剤であるホルボールエステルである。したがって、
別の副刺激物質が、炎症性S1P／SPC受容体を介する細胞死受容体シグナリングの
結果を飛躍的に変化させるか、あるいは逆転さえさせる可能性がある。

【０２０１】 個々のS1P／SPC受容体のスクリーニングは、アポトーシスおよび炎症をモジュ
レートするのに使用するための選択的リガンドの同定および最適化を可能にする
。例えば、SPCはEDG-4に作用する際にS1Pよりも高い活性を示すが、これら２つ の化合物はEDG-3受容体に対しては同様の活性を有する。これらの標的に対する 抗アポトーシス性化合物は受容体アッセイを行わないと同定が困難であり、選択
的プロ-アポトーシス性化合物は標的とすることさえ困難である。この理由は、 多くの酵素阻害物質がアポトーシス経路を起動させるからである。さらに、現在
ではedg受容体誘導NF-κBはS1Pによってアポトーシスが抑制される１つの機構で
あると考えられるので、炎症性遺伝子発現も起こると予想される。さらには、S1
PおよびSPCを含むEDG-3アゴニストまたはEDG-4アゴニストによる免疫刺激の可能
性を含む。一方、アンタゴニストは移植拒絶反応または自己免疫疾患の治療に用
いることができるであろう。それらにおいては、炎症性の応答および自己／他者
（異種）反応性Ｔ細胞の不十分なアポトーシスの双方がある役割を果たしている
。

【０２０２】実施例17：リゾホスファチジン酸（LPA）受容体の３つの炎症性サブタイプ LPAはS1P同様に、血清中に多量に存在するが、血漿中ではそうではない。さら
に、LPAは、（リン脂質基質に依存して）ホスホリパーゼＤの寄与の存在下また は不在下でのホスホリパーゼＡ_２の結果として生じる。５μM LPAにさらされたH
UVECにおけるIL-8産生を示す本発明者らの結果はさらに、炎症性の応答が幾つか
の、あるいは全てのLPA受容体によって媒介され得ることを示唆する。現在まで に、本発明者らは、アゴニストとしてLPAに応答するedg受容体の３つのサブタイ
プを同定している。これらはEDG-2、EDG-6およびEDG-5（それぞれ、LP_A1、LP_{A2 、} LP_A3とも言う）である［Chun, J, Contos, JJAおよびMunroe, DG, 1998. A gr
owing family of receptor genes for lysophosphatidic acid (LPA) and other
lyso-phospholipids. Cell Biochem. Biophys（印刷中）］。EDG-5受容体は同 時係属中の米国特許出願整理番号第08/997,803号（MUNROEら；引用により本明細
書に組み入れる）に述べられており、EDG-6受容体のアミノ酸配列およびcDNA配 列はそれぞれ図21および図22に示す。これらの受容体が炎症性の応答を媒介する
かどうかを判定するために、各々をSRE、NF-κBまたはAP-1レポーター遺伝子そ れぞれと同時トランスフェクトした。このAP-1受容体は約１kbのヒト・コラゲナ
ーゼIIプロモーターおよびコラゲナーゼII転写単位の5’側非翻訳領域の最初の5
0bpを含んでいた（Angel P.ら, 1987）。ホルボールエステル誘導性遺伝子は、T
PA調節性トランス作用性因子により認識される共通シスエレメント（Cell 49:72
9-739）、つまりその誘導性発現がAP-1によって制御されることが示されている 領域を含む。この転写因子は、NF-κBと同様に、炎症および新生物性シグナル伝
達に関係しているが、但し、その作用する遺伝子標的はNF-κBのものとは大きく
異なる（Adcock IM. 1997. Transcription factors as activators of gene tra
nscription: AP-1 and NF-κB. Monaldi Arch Chest Dis 52:178-186. 総説）。

【０２０３】 293-EBNA細胞を増殖させ、単層培養物にリポフェクションし、NF-κBおよびAP
1レポーターでトランスフェクトした細胞を0.5％FBSを含有する培地中で６時間 前処理した以外は実施例11のアッセイ#1で上記したように前処理し、次いで10μ
M LPA含有または不含の同じ培地中で一晩処理した。

【０２０４】 結果：図23に示すように、３つの受容体は全て、10μM LPAの存在下でNF-κBレ ポーターを強く活性化したが（約３〜４倍）、NF-κBレポーターを空の発現ベク
ターpcDNA3で同時トランスフェクトした場合にはLPAに対する応答は全く見られ なかった。SREおよびAP-1レポーター遺伝子を用いた場合、LPAに対して多少の内
因性の応答が見られた（未処理の対照細胞に対して約1.5倍）。しかし、EDG-6は
両方のレポーターを強く誘導し、一方、EDG-2およびEDG-5はLPAにより２倍より 強くSREおよびAP-1レポーターの誘導を生じた。したがって、ここで試験した３ つのLPA受容体は全て、NF-κBならびにおそらくはAP-1を介して炎症性遺伝子転 写を誘導することができる。述べてきたように、これらの２つの炎症性転写因子
は、別の遺伝子セットを誘導することにより異なるシグナリング経路に応答する
。しかし、幾つかの遺伝子は、両方の因子が協調して作用することにより、強力
にかつ相乗的に活性化される（Stein Bら, 1993. Cross-coupling of the NF-κ
B p65 and Fos/Jun transcription factors produces potentiated biological
function. EMBO J 12:3879-3891）。したがって、LPA受容体であるEDG-2、EDG-5
およびEDG-6は、NF-κBおよびAP-1によって制御される遺伝子標的の一方または 両方のセットを活性化することにより、LPAまたは他のリゾ脂質アゴニストに応 答すると思われる。ホスホリパーゼ作用およびNF-κB／AP-1活性化は炎症または
免疫成分が存在する多くの疾患に共通する特徴なので、edg／LPA受容体はリゾ脂
質に対するそれらの炎症性応答によって先に存在している疾患または傷害を悪化
させる可能性もある。したがって、これらの炎症性受容体の１つ以上のアンタゴ
ニストは、そのような疾患の治療に有用であり得る。開示した発明の意図する範
囲を限定しようとするものではないが、例として、リウマチ様関節炎、脳卒中、
神経外傷、アルツハイマー病、ALS、喘息、内毒素性ショック、アテローム硬化 症および多くの他の疾患が挙げられる。炎症に加えて、NF-κBの活性化は、プロ
-アポトーシス性シグナル（例えばTNF受容体または他の「細胞死受容体」により
誘導される）に逆らって生存を促進すると思われる（Van Antwerp DJら, 1998.
Inhibition of TNF-induced apoptosis by NF-κB. 総説. Trends Cell Biol 8:
107-111）。これにより、LPA処理した卵巣癌細胞において観察される化学療法誘
導アポトーシスの効果の低下が説明され得る（Frankel A.ら, 1996. Peptide an
d lipid growth factors decrease cis-diamminedichloroplatinum-induced cel
l death in human ovarian cancer cells. Clin. Cancer Res 2:1307-1313）。 本開示によれば、炎症性LPA受容体のアンタゴニストを発見し、化学療法剤のア ポトーシス誘導効果に対して免疫がある癌細胞集団の発生を低減または遅延させ
るように最適化され得る。そのような療法は、自己免疫疾患、または過度もしく
は不適当な細胞の生存が起こる他の疾患の治療にも用い得る。あるいはまた、炎
症性LPA受容体のアゴニストは、神経保護性(neuroprotective)であり得るし、あ
るいは不適切または過度の細胞死が起こる疾患における他の細胞型の生存を促進
することもあり得る。例としていくつか挙げてみると、HIV／AIDS、脊髄形成異 常症、内毒素性ショック、肝硬変が挙げられる。

【０２０５】実施例18：EDG受容体機能的応答のリアルタイム・リードアウトとしてのカルシ ウムマイクロ蛍光分析 レポーター遺伝子アッセイは非常に有用であるが、終点アッセイの結果を出す
ものであり、そのためEDG受容体によって誘導される一時的で可逆的なまたは減 感性の応答についての情報を得ることはできない。カルシウムマイクロ蛍光分析
は、そのような情報を集積できる別のアプローチの一例である。S1PまたはLPAの
受容体を内因的に発現する細胞においてはS1PまたはLPAに対するCa²⁺応答が見ら
れるので（Tornquist Kら, 1997. Sphingosine 1-phosphate mobilizes sequest
ered calcium, activates calcium entry, and stimulates deoxyribonucleic a
cid synthesis in thyroid FRTL-5 cells. Endocrinology 138:4049-4057；Holt
sberg FWら, 1997. Lysophosphatidic acid induces a sustained elevation of
neuronal intracellular calcium. J Neurochem. 69:68-75）、本発明者らは、
カルシウムマイクロ蛍光分析により、異なるEDG受容体で一時的にトランスフェ クトした293-EBNA細胞を機能的応答について試験した。

【０２０６】 レポーター遺伝子ベクターをDNAミックス中に含有させなかった以外は上記の 通りにして、293-EBNA細胞においてEDG受容体によるトランスフェクションを行 った。トランスフェクションの２日後に、細胞をトリプシン処理により収集し、
0.5％FBSを含有する培地100μl中のポリ-D-リシン被覆カバーガラス上に細胞200
,000個の密度でプレートした。細胞を一時的に付着させた後、２mlのFBS不含培 地を添加し、細胞を一晩インキュベートした。翌日、細胞に５μMのフラ-2 AMエ
ステル（Molecular Probes）を加えて室温で60分間混合させ、次いで洗浄し、カ
ルシウムマイクロ蛍光分析に用いた。S1Pは100％エタノール中の10mMストックと
して調製し、ACSF中に最終濃度２μMに希釈した。PMAは最終濃度25ng/mlで用い た。重力加重還流装置（gravity-fed perfusion apparatus）を用いて処理剤を アプライした。蛍光発光を連続的にモニターし、PTI 2.060aソフトウエアを用い
て記録し、Sigma Plotソフトウエアを用いて解析した。細胞内のカルシウム濃度
は、カルシウム希釈系列におけるフラ-2蛍光から得られた比率測定蛍光曲線（ra
tiometric fluorescence curve）の補間法により算出した。

【０２０７】 結果：図19は、pcDNA3でトランスフェクトし２μMのS1Pで処理した対照細胞の応
答を示す。２μMのS1Pを用いた場合、細胞内カルシウム濃度のわずかな増大が見
られ、この応答は２回目のS1Pの適用に対する応答を完全に減感した。図20は、E
DG-3トランスフェクト細胞におけるS1Pに対するカルシウム応答を示す。pcDNA3 トランスフェクト細胞では細胞内カルシウムが約60nM変化したのに対して、２μ
MのS1Pで処理したEDG-3トランスフェクト細胞では300nMの増大が観察された。2 回目のS1Pの適用ではわずかな応答が誘導されたが、減感が明らかに起こった。 下記の表は、適当なアゴニストを２または10μMの濃度で添加した後で、各EDG受
容体を発現する細胞から本発明者らが得た予備データの定性分析を示す。

【０２０８】

【表３】 これらの受容体サブタイプが細胞内カルシウムを増加させる能力を定量的に評
価するためにはさらなる実験が必要であるが、最初の結果がカルシウムシグナリ
ングと炎症性応答経路の誘導との相関関係を強く示唆している。この結論を支持
すれば、EDG-1およびEDG-7は共にSREレポーターを介してS1Pに応答するが、NF- κBレポーターを介するシグナル伝達または細胞内カルシウムの増大にも応答し なくなる。同定された４つのS1P受容体のうち２つだけがNF-κBを介してシグナ ル伝達をする、という事実は、本明細書に開示の発明を用いて有効な抗炎症性の
治療法または生存をモジュレートする治療法を最適に開発できることを示してお
り、それらは関連する受容体サブタイプおよび経路を、治療上の有効性の指標と
して明確に評価する。したがって、NF-κBレポーター遺伝子、炎症性のシグナル
伝達または遺伝子発現を測定する他の終点アッセイ、およびedg／LL受容体によ る炎症性シグナリングをモニターするリアルタイムの機能アッセイは特に本発明
の範囲に包含される。

【０２０９】実施例19：クラゲのグリーン蛍光タンパク質（GFP）を用いたヒトEDG-4融合タン パク質の構築および機能試験 キメラタンパク質を用いてタンパク質の構造、機能、活性化機構や生物学的役
割を調べることができる。edg受容体の場合、それらの細胞内での輸送（traffic
king）、翻訳後プロセッシングまたは他のタンパク質との物理的相互作用はほと
んど知られていない。生細胞内で種々の融合タンパク質を直接的に視覚化するた
めに、アエクオレア ビクトリア（Aequorea victoria）由来のグリーン蛍光タ ンパク質（GFP）をツールとして用いている。これは、蛍光を得るために固定も 基質の添加も必要ないからである。少なくとも幾つかのGPCRを含め、GFPに融合 した後で機能を保持する各種タンパク質の多数の例が存在する（Kallal Lら, 19
98. Visualization of agonist-induced sequestration and down-regulation o
f a green fluorescent protein-tagged beta2-adrenergic receptor. J Biol C
hem 273:322-328）。EDG-4の輸送およびタンパク質−タンパク質相互作用の問題
に取り組むために、本発明者らはヒトEDG-4 cDNAとのGFP融合体を構築し、SREレ
ポーター遺伝子をリードアウトとして用いてS1Pに対する機能的応答について試 験した。

【０２１０】 ヒトedg-4 cDNA配列のリーディングフレームの２つの末端から一対のプライマ
ーを設計して、GFP融合タンパク質の発現用に設計したベクターにedg-4オープン
リーディングフレームを作製し、全長EDG-4ポリペプチドのカルボキシ末端にGFP
タグを付けた。

【０２１１】5’末端プライマー： KpnI酵素部位および最適化（Kozak）翻訳開始配列を含む。

【０２１２】 HE4-ATGKpnF：［5’-TTTAAAGGTACCGCCACCATGGGCAGCTTGTAC-3’］3’末端プライマー： XbaI酵素部位を含み、天然に存在するedg-4終結コドンを欠
く。

【０２１３】 HE4-xba/1096R：［5’-TATATATCTAGAGACCACCGTGTTGCCCTCCAG-3’］ 上記のプライマー対を用いて以下のPCR増幅条件下で、Boehringer Mannheim社
製のExpand（商標）PCRシステム（Cat.1681-842）を用いてpc3-hedg4#36プラス ミドDNAを増幅した。

【０２１４】 反応物は以下の試薬を含むものとした。

【０２１５】 ５μlの10×PCR緩衝液３ 1.0μlの25mM dNTPミックス 1.5μlのプライマーHE4-ATGKpnF（10μM） 1.5μlのプライマーHE4-xba/1096R（10μM） 0.75μlの酵素（２単位） 39.25μlの水 １μlのDNA PCR条件： インキュベート： 94℃で２分間 10サイクル： 94℃で１分間 50℃で１分間 68℃で２分間 20サイクル： 94℃で１分間 68℃で３分間 インキュベート： 68℃で８分間 保持： ４℃ 増幅反応物（サンプル80727-3と命名）をQIAquick PCR精製キット（Qiagen, C
at. 28106）を用いて精製した。このDNAをKpnIおよびXbaIの酵素で制限消化し、
KpnIおよびXbaIで制限消化したpcDNA3.1/CT-GFP（Invitrogen, Cat. K4820-01）
にサブクローニングした。３つの陽性クローン、すなわちE4-GFP#8-3、E4-GFP#1
5-3およびE4-GFP#17-3を同定し、配列決定して予想されるインサートおよびクロ
ーニング結合部を確認し、ヒトedg-4 cDNAについて上記に従い293-EBNA細胞への
リポフェクションにより調べた。

【０２１６】 結果：フルオレセインフィルターセットを用いて蛍光顕微鏡下で細胞を観察した
。EDG-4／GFP融合タンパク質を発現する細胞は、それらの明るい緑色の蛍光によ
り容易に同定された。未処理の血清飢餓細胞では、蛍光の大部分は周辺部に局在
しており、明らかに細胞膜に存在していた。しかし、トランスフェクションの72
時間後、分散したクラスターに高レベルのGFP融合タンパク質が蓄積されており 、これは細胞表面に「キャップ」されているか、あるいは小胞体内に内在化して
いると思われる。非融合GFP構築物を用いた対照のトランスフェクションからは 、GFPの蛍光が細胞質に散らばって位置していることだけがわかった。重要なこ とは、特別な固定や展開を行わずに生細胞内でEDG-4／GFP受容体が直接的に視覚
化できたことである。つまり、EDG-4／GFPの種々のオルガネラとの相互作用およ
び輸送は、生細胞内で、アゴニストおよび／または薬理学的治療剤の添加前、添
加時および添加後にたどることが可能である。もちろん、そのような局在化は、
該受容体がリガンドと結合してシグナル伝達経路を正常に活性化する場合に極め
て有意義であろう。SREレポーター遺伝子の同時トランスフェクションおよび１ もしくは５μMのS1Pに対する応答の結果を図24に示す。EDG-4／GFPの３つのクロ
ーンは全て、S1Pに対するSRE応答において、EDG-4親発現ベクターとは有意には 相違していなかった。したがって、かなり大きな融合ドメインがGFPによって提 示されたにもかかわらず、明らかに正常なリガンド応答性および細胞内シグナリ
ングが保持された。融合受容体内在の視覚化および定量は、例えばEDG-4の部分 アゴニストの薬理学的評価において、EDG-4受容体の機能的活性化を評価するも う１つの手段を提供する。

【０２１７】 本発明の記載の方法および系についての種々の変更および改変は、本発明の範
囲および精神を逸脱することなしに、当業者には明らかであろう。本発明は特定
の好ましい実施形態に関連させて説明したが、特許請求した本発明はそのような
特定の実施形態に不当に限定されるべきものではないと理解すべきである。

【０２１８】References An, S, Bleu, T, Huang, W, Hallmark, OG, Coughlin, SR and Goetzl, EJ. 199
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ス中にポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼおよびラミンを切断するカスパス(caspa
ses)の活性化を阻害する(Sphingosine 1-phosphate inhibits activation of ca
spases that cleave poly(ADP-ribose) polymerase and lamins during Fas- an
d ceramide-mediated apoptosis in Jurkat T lymphocytes)」. J Biol Chem 27
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ードする(An abundant transcript induced in differentiating human endothe
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phingosine-1-phosphate mobilizes intracellular calcium and activates tra
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8. Biochem J 330

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図1Aは、LPA、S1P、SPCおよびサイコシンの化学構造を示す図である。 図1Bは、HeLa細胞におけるS1PおよびLPAに対する時間および濃度依存性のIL-8
応答を示す図である。

【図２】 図2Aは、HeLa細胞におけるS1PおよびSPCに対する濃度依存性のIL-8応答を示す
図である。 図2Bは、HeLa細胞におけるS1PおよびSPCに対する濃度依存性のIL-8応答および
かかる応答のPTX感受性を示す図である。

【図３】 図３は、HeLa細胞におけるS1PおよびTNF-αに対するIL-8応答およびかかる応 答のPTXおよびゲニステイン感受性を示す図である。

【図４】 図4Aは、HeLa細胞におけるS1P、スフィンゴシンおよびスフィンゴミエリンに 対する濃度依存性のIL-8応答を示す図である。 図4Bは、一次培養ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)におけるリゾ脂質に対するIL-8 応答を示す図である。

【図５】 図５は、HL-60細胞におけるTNF-α、S1PおよびLPAに対する時間および濃度依 存性のIL-8応答を示す図である。

【図６】 図６は、HeLaおよびHL-60細胞におけるS1Pに対する濃度依存性のIL-8応答、な
らびに各S1P濃度レベルにおける細胞生存度を示す図である。

【図７】 図７は、HeLa細胞でのS1Pに対するIL-8応答におけるスラミンの作用を示す図 である。

【図８】 図８は、HeLa細胞でのS1Pに対するIL-8応答における抗酸化剤NDGAおよびNACの
作用を示す図である。

【図９】 図９は、HeLa細胞におけるエデルフォシンに対するIL-8応答およびこの応答の
PTXおよびスラミン感受性を示す図である。

【図１０】 図10Aは、ラットEDG-4発現プラスミドでトランスフェクトした293-EBNA細胞に
おけるS1Pに対するIL-8応答およびこの応答のPTX感受性を示す図である。 図10Bは、HeLa、COSおよび293-EBNA細胞における内因性edg受容体の発現を示 す図である。

【図１１】 図11は、edg4発現プラスミドおよびNF-κB-tk-p4Lルシフェラーゼレポーター プラスミドで同時トランスフェクトした293-EBNA細胞におけるS1P、LPAおよびSP
Cに対するNF-κBレポーター応答を示す図である。

【図１２】 図12は、EDG-4発現プラスミドおよびNF-κB-tk-p4Lルシフェラーゼレポーター
プラスミドで同時トランスフェクトした293-EBNA細胞におけるS1P、LPA、サイコ
シン、SPC、LPC、スフィンゴシン、20％FBS、TPA、リゾスルファチドおよびエデ
ルフォシンに対するNF-κBレポーター応答、ならびにこの応答のPTX感受性を示 す図である。

【図１３】 図13は、(A)SREレポーター遺伝子アッセイまたは(B) NF-κB-tk-p4Lルシフェ ラーゼレポーターアッセイを用いたS1PまたはSPCに対するEDG-1、EDG-3およびED
G-4受容体応答を示す図である。

【図１４】 図14は、ヒトEDG-4 cDNAのオープンリーディングフレームの5'末端を示す複数
のEST配列を並べたものである。配列は、Wisconsin Package Version 9.0(Genet
ics Computer Group(GCG), Madison, Wisc.)のPILEUPプログラムを用いて並べた
。ラット翻訳開始部位との類似性に基づいて予測したヒトEDG-4の翻訳開始部位 は、その複数の配列のnt45である。

【図１５】 図15Aの配列番号１は、ヒトEDG-4 cDNAおよびEDG-4予測アミノ酸配列を示す。
cDNA配列は、ヒト肺繊維芽細胞系WI-38 cDNAライブラリー(Origene Technologie
s Inc.)からPCRによって単離されたクローンpC3-hedg4#5およびpC3-hedg4#36由 来のものである。 図15Bの配列番号２は、クローンpC3-Hedg4#36のヒトEDG-4 cDNAを示す。

【図１６】 図16Aの配列番号３は、図15AのヒトEDG-4 cDNAの予測ポリペプチド産物のアミ
ノ酸配列および特徴を示す。 図16Bの配列番号４は、pC3-hEdg-4#36によってコードされるEDG-4ポリペプチ ドのアミノ酸配列を示す。

【図１７】 図17Aは、予測ヒト対ラットEDG-4ポリペプチドのGAP配列である。２つのポリ ペプチドの予測アミノ酸配列は、GCG GAPプログラムを用いて並べた。 図17Bは、PILEUPプログラムを用いてクローンpC3-Hedg4#5およびpC3-Hedg4#36
由来のEDG-4のアミノ酸配列（図16A）と、pC3-Hedg4#36（図16B）と、ラットEDG
-4/H218とを並べたものである。

【図１８】 図18Aは、ヒトまたはラットedg4発現プラスミドおよびSREレポータープラスミ
ドで同時トランスフェクトした293-EBNA細胞におけるSPCに対するSREレポーター
応答を示す図である。 図18Bは、EDG-4トランスフェクト細胞におけるS1P類似体に対するSRE応答の濃
度依存性を示す図である。

【図１９】 図19は、空の発現ベクターpcDNA3でトランスフェクトした細胞におけるS1Pに 対する細胞内カルシウム応答を示す図である。

【図２０】 図20は、ヒトEDG-3発現ベクターでトランスフェクトした細胞におけるS1Pに対
する細胞内カルシウム応答を示す図である。

【図２１】 図21は、ヒトEDG-6受容体のアミノ酸配列を示す図である。

【図２２】 図22は、ヒトEDG-6受容体のcDNA配列を示す図である。

【図２３】 図23は、NF-BおよびAP-1遺伝子による３つのLPA受容体サブタイプシグナルを 示す図である。

【図２４】 図24は、クラゲ緑色蛍光タンパク質(GFP)とのヒトEDG-4融合タンパク質に対す
るSRE応答を示す図である。

【図２５】 NF-κBの活性化に関係するedg受容体を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/50 5/00 Ａ (31)優先権主張番号 ６０／１０９，８８５ (32)優先日 平成10年11月25日(1998．11．25) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 カンボジ，ラジェンダー カナダ国 エル５エヌ ６エヌ９ オンタ リオ州，ミシソーガ，ビショップ ストラ チャン コート 3723 (72)発明者 ピータース，ダイアナ カナダ国 エム４エス １シー３ オンタ リオ州，トロント，バリオル ストリート 45，アパートメント ナンバー210 (72)発明者 コーシェッシュ，ファテメ カナダ国 エム９エー ４ワイ１ オンタ リオ州，エトビコーク，マベル アベニュ ー 25，アパートメント ナンバー2708 (72)発明者 ヴヤス，デジャル，ビー． カナダ国 エル５ビー ３ケー１ オンタ リオ州，ミシソーガ，リエル ドライブ 275 (72)発明者 グプタ，アシュワニ，ケー． カナダ国 エル５エヌ ６ワイ４ オンタ リオ州，ミシソーガ，ダンロビン ウェイ 7031

Claims (28)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 単離されたリゾ脂質(LL)受容体／EDG受容体であって、HeLa 細胞で内生的に発現され、活性化されると、該単離されたEDG受容体がEDG-2また
   はラットEDG-4受容体ではないという条件付きでIL-8またはNF-κBの誘導の増大 をもたらす上記受容体。
2. 【請求項２】 単離されたEDG受容体であって、活性化されると、該単離さ れたEDG受容体がEDG-2またはラットEDG-4受容体ではないという条件付きでIL-8 またはNF-kBの誘導の増大をもたらす、上記受容体。
3. 【請求項３】 LPA、S1Pおよび／またはSPCからなる群の１種以上から選択 されるリゾ脂質によって活性化される請求項２に記載の単離されたEDG受容体。
4. 【請求項４】 前記受容体がヒトEDG-4受容体であり、該受容体がS1Pおよび
   SPCによって活性化される、請求項３に記載の単離された受容体。
5. 【請求項５】 HeLa細胞で内生的に発現され、エデルフォシン(edelfosine)
   により活性化されるとIL-8またはNF-κBの誘導の増大をもたらす、単離された受
   容体。
6. 【請求項６】 請求項１〜５のいずれか１項に記載の受容体をコードする単
   離されたヌクレオチド配列。
7. 【請求項７】 (a) 配列番号１のヌクレオチド38〜1099を含むヌクレオチド
   配列； (b) 配列番号３のヌクレオチド配列； (c) (a)または(b)に対して少なくとも約95％の配列同一性を有し、配列(a)お よび(b)それぞれにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチ ド配列； (d) 配列番号２のヒトEDG-4受容体のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド 配列；および (e) 配列番号４のヒトEDG-4受容体のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド 配列 からなる群から選択される単離されたヌクレオチド配列。
8. 【請求項８】 請求項７に記載のヌクレオチド配列によってコードされるヒ
   トEDG-4受容体。
9. 【請求項９】 請求項６または７に記載のヌクレオチド配列を含む発現ベク
   ター。
10. 【請求項１０】 請求項９に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞
    。
11. 【請求項１１】 請求項１〜５のいずれか１項または請求項８に記載の受容
    体に対するアゴニストである化合物の同定方法であって、 (a) 請求項１〜５のいずれか１項または請求項８に記載の受容体を発現する細
    胞を、低血清の培地またはNF-κB活性化の基底レベルを低下させるようにデザイ
    ンされた特定培地中で培養する工程； (b) 該培養細胞を、前記受容体に対するアゴニスト活性について試験される化
    合物と接触させる工程；および (c) NF-κB活性化の程度の指標となる応答を測定する工程 を含む、上記同定方法。
12. 【請求項１２】 前記受容体が、EDG-2、EDG-3、EDG-4、EDG-5およびEDG-6 からなる群の1種以上から選択される、請求項１１に記載の方法。
13. 【請求項１３】 請求項１〜５のいずれか１項または請求項８に記載の受容
    体に対するアゴニストである化合物の同定方法であって、 (a) 請求項１〜５のいずれか１項または請求項８に記載の受容体を発現する細
    胞を、低血清の培地またはIL-8産生の基底レベルを低下させるようにデザインさ
    れた特定培地中で培養する工程； (b) 該培養細胞を、該受容体に対するアゴニスト活性について試験される候補
    化合物と接触させる工程；および (c) IL-8産生の程度の指標となる応答を測定する工程 を含む、上記同定方法。
14. 【請求項１４】 前記受容体が、EDG-2、EDG-3、EDG-4、EDG-5およびEDG-6 からなる群の1種以上から選択される、請求項１３に記載の方法。
15. 【請求項１５】 請求項１１、１２、１３または１４に記載の方法により同
    定されたアゴニスト。
16. 【請求項１６】 請求項１５に記載のアゴニストおよび製薬上許容される賦
    形剤を含む医薬組成物。
17. 【請求項１７】 請求項１〜５のいずれか１項または請求項８に記載の受容
    体に対するアンタゴニストである化合物の同定方法であって、 (a) 請求項１〜５のいずれか１項または請求項８に記載の受容体を発現する細
    胞を、低血清の培地またはNF-κB活性化の基底レベルを低下させるようにデザイ
    ンされた特定培地中で培養する工程； (b) 該細胞を、アゴニストおよび該受容体に対するアンタゴニスト活性につい
    て試験される前記化合物を含む混合物と接触させる工程（ここで該アゴニストは
    LLまたは20％FBSから選択される）；および (c) NF-κB活性化の程度の指標となる応答を測定する工程 を含む、上記同定方法。
18. 【請求項１８】 前記受容体が、EDG-2、EDG-3、EDG-4、EDG-5およびEDG-6 からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
19. 【請求項１９】 請求項１〜５のいずれか１項または請求項８に記載の受容
    体に対するアンタゴニストである化合物の同定方法であって、 (a) 請求項１〜５のいずれか１項または請求項８に記載の受容体を発現する細
    胞を、低血清の培地またはIL-8産生の基底レベルを低下させるようにデザインさ
    れた特定培地中で培養する工程； (b) 該細胞を、アゴニストおよび該受容体に対するアンタゴニスト活性につい
    て試験される該化合物を含む混合物と接触させる工程（ここで該アゴニストはS1
    P、SPC、LLまたは20％FBSから選択される）；および (c) IL-8産生の程度の指標となる応答を測定する工程 を含む、上記同定方法。
20. 【請求項２０】 前記受容体が、EDG-2、EDG-3、EDG-4、EDG-5およびEDG-6 からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
21. 【請求項２１】 請求項１７、１８、１９または２０に記載の方法によって
    同定されたアンタゴニスト。
22. 【請求項２２】 請求項２１に記載されたアンタゴニストを含む医薬組成物
    。
23. 【請求項２３】 被験者における炎症進行状態を治療する方法であって、有
    効量の請求項１６または２２に記載の医薬組成物を、それぞれ炎症進行のアップ
    レギュレーションまたは炎症進行のダウンレギュレーションのために投与するこ
    とを含む、上記方法。
24. 【請求項２４】 被験者における免疫応答をモジュレートする方法であって
    、有効量の請求項１６または２２に記載の医薬組成物を、それぞれ免疫応答のア
    ップレギュレーションまたは免疫応答のダウンレギュレーションのために投与す
    ることを含む、上記方法。
25. 【請求項２５】 請求項１〜５のいずれか１項または請求項８に記載の受容
    体を含む細胞におけるアポトーシスを制御する方法であって、該細胞と有効量の
    請求項１５に記載のアゴニストを接触させる工程を含む、上記方法。
26. 【請求項２６】 請求項１〜５のいずれか１項または請求項８に記載の受容
    体を含む細胞におけるアポトーシスを制御する方法であって、該細胞を有効量の
    請求項２１に記載のアンタゴニストと接触させる工程を含む、上記方法。
27. 【請求項２７】 発現可能なDNA配列が、適当なEDG受容体リガンドにより活
    性化されるとNF-κBまたはIL-8の活性化の増大をもたらすEDG受容体をコードす るかどうかを確認する方法であって、 (a) 該リガンドと接触した場合にNF-κB活性化の増大を示さない細胞を同定し
    ； (b) 該細胞を該発現可能なDNA配列でトランスフェクトし；そして (c) 該トランスフェクトされた細胞を該リガンドと接触させ、生じたNF-κBま
    たはIL-8の活性化を測定することを含む、上記方法。
28. 【請求項２８】 前記リガンドが、LPA、S1P、SPC、サイコシン、グルコサ イコシン、ジヒドロ-S1Pおよびエデルフォシンからなる群の1種以上から選択さ れる、請求項２７に記載の方法。