JP2002300874A - エシェリヒア属細菌を用いたｌ−アミノ酸の製造法 - Google Patents
エシェリヒア属細菌を用いたｌ−アミノ酸の製造法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 エシェリヒア属に属するＬ−アミノ酸生産菌
株の生産性を増強し、同菌株を用いてＬ−アミノ酸を効
率よく製造する方法を提供する。 【解決手段】 b2862およびb2683、又はb1242もしくはb
3434遺伝子にコードされるタンパク質の活性を増強する
ことにより、Ｌ−アミノ酸生産性が増強されたエシェリ
ヒア属細菌を培地中に培養し、生成、蓄積されたＬ−ア
ミノ酸を該培地中から採取することにより、Ｌ−アミノ
酸、例えばＬ−スレオニン、Ｌ−バリン、Ｌ−プロリ
ン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−メチオニン、又はＬ−アルギニ
ンを製造する。
株の生産性を増強し、同菌株を用いてＬ−アミノ酸を効
率よく製造する方法を提供する。 【解決手段】 b2862およびb2683、又はb1242もしくはb
3434遺伝子にコードされるタンパク質の活性を増強する
ことにより、Ｌ−アミノ酸生産性が増強されたエシェリ
ヒア属細菌を培地中に培養し、生成、蓄積されたＬ−ア
ミノ酸を該培地中から採取することにより、Ｌ−アミノ
酸、例えばＬ−スレオニン、Ｌ−バリン、Ｌ−プロリ
ン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−メチオニン、又はＬ−アルギニ
ンを製造する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、バイオテクノロジ
ーに関し、具体的には発酵法によるＬ−アミノ酸の製造
法に関し、さらに、具体的には、エシェリヒア・コリ由
来の遺伝子に関する。同遺伝子は、Ｌ−アミノ酸、例え
ば、Ｌ−スレオニン、Ｌ−バリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−
ロイシン、Ｌ−メチオニン、及びＬ−アルギニンの生産
性の改良に有用である。
ーに関し、具体的には発酵法によるＬ−アミノ酸の製造
法に関し、さらに、具体的には、エシェリヒア・コリ由
来の遺伝子に関する。同遺伝子は、Ｌ−アミノ酸、例え
ば、Ｌ−スレオニン、Ｌ−バリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−
ロイシン、Ｌ−メチオニン、及びＬ−アルギニンの生産
性の改良に有用である。
【０００２】
【従来の技術】従来、Ｌ−アミノ酸は、自然界より得ら
れる微生物、またはＬ−アミノ酸の生産性を増強するた
めに改変されたそれらの微生物の変異株を用いた発酵法
により産業的に生産されている。
れる微生物、またはＬ−アミノ酸の生産性を増強するた
めに改変されたそれらの微生物の変異株を用いた発酵法
により産業的に生産されている。
【０００３】Ｌ−アミノ酸生産性を増強する数多くの技
術が開示されており、例えば、組み換えＤＮＡによる微
生物の形質転換によるものがある（例えば、米国特許4,
278,765を参照）。これらの技術は、アミノ酸の生合成
に関与する酵素の活性を増加させること、および／また
は生成されたＬ−アミノ酸によるフィードバック阻害に
対して目的の酵素を脱感作させることに基づいている
（例えば、特開昭56-18596(1981) 公報、WO95/16042、
米国特許5,661,012および6,040,160参照）。
術が開示されており、例えば、組み換えＤＮＡによる微
生物の形質転換によるものがある（例えば、米国特許4,
278,765を参照）。これらの技術は、アミノ酸の生合成
に関与する酵素の活性を増加させること、および／また
は生成されたＬ−アミノ酸によるフィードバック阻害に
対して目的の酵素を脱感作させることに基づいている
（例えば、特開昭56-18596(1981) 公報、WO95/16042、
米国特許5,661,012および6,040,160参照）。
【０００４】他方では、Ｌ−アミノ酸の排出を増強させ
ることによっても、Ｌ−アミノ酸生産菌の生産性を増強
することができる。発現が増強されたＬ−リジン排出遺
伝子（lysE遺伝子）を有するコリネバクテリウム属細菌
の菌株が開示されている（WO9723597A2）。さらに、Ｌ
−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−アセチルセリンまた
はチアゾリジンの誘導体の分泌に適した流出タンパク質
をコードする遺伝子が開示されている（米国特許5,972,
663）。
ることによっても、Ｌ−アミノ酸生産菌の生産性を増強
することができる。発現が増強されたＬ−リジン排出遺
伝子（lysE遺伝子）を有するコリネバクテリウム属細菌
の菌株が開示されている（WO9723597A2）。さらに、Ｌ
−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−アセチルセリンまた
はチアゾリジンの誘導体の分泌に適した流出タンパク質
をコードする遺伝子が開示されている（米国特許5,972,
663）。
【０００５】現在、Ｌ−アミノ酸生産性を増強する推定
上の膜タンパク質をコードするいくつかのエシェリヒア
・コリの遺伝子が開示されている。rhtB遺伝子のコピー
数を増やすことにより、細菌は、Ｌ−ホモセリンに対し
てより耐性となり、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−スレオニン、
Ｌ−アラニン、Ｌ−バリンおよびＬ−イソロイシンの生
産性は増強される（欧州特許出願EP994190A2）。rhtC遺
伝子のコピー数を増やすことにより、細菌は、Ｌ−ホモ
セリンおよびＬ−スレオニンに対してより耐性となり、
Ｌ−ホモセリン、Ｌ−スレオニンおよびＬ−ロイシンの
生産性は増強される（欧州特許出願EP1013765A1）。yah
N、yeaS、yfiKおよびyggA遺伝子のコピー数を増やすこ
とにより、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオ
ニン、Ｌ−アラニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−プロリン、
Ｌ−アルギニン、Ｌ−バリンおよびＬ−イソロシンの生
産は増強される（欧州特許出願EP1016710A2）。尚、エ
シェリヒア・コリＫ−１２株の全ゲノム配列は明らかに
されているが（Blattner F.R., Plunkett G., Bloch C.
A. et al., Science, 227, 1453-1474, 1997; ftp://ft
p.genetics.wisc.edu/pub/sequence/ecolim52.seq.g
z）、機能が未だ不明のORFが数多くある。
上の膜タンパク質をコードするいくつかのエシェリヒア
・コリの遺伝子が開示されている。rhtB遺伝子のコピー
数を増やすことにより、細菌は、Ｌ−ホモセリンに対し
てより耐性となり、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−スレオニン、
Ｌ−アラニン、Ｌ−バリンおよびＬ−イソロイシンの生
産性は増強される（欧州特許出願EP994190A2）。rhtC遺
伝子のコピー数を増やすことにより、細菌は、Ｌ−ホモ
セリンおよびＬ−スレオニンに対してより耐性となり、
Ｌ−ホモセリン、Ｌ−スレオニンおよびＬ−ロイシンの
生産性は増強される（欧州特許出願EP1013765A1）。yah
N、yeaS、yfiKおよびyggA遺伝子のコピー数を増やすこ
とにより、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオ
ニン、Ｌ−アラニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−プロリン、
Ｌ−アルギニン、Ｌ−バリンおよびＬ−イソロシンの生
産は増強される（欧州特許出願EP1016710A2）。尚、エ
シェリヒア・コリＫ−１２株の全ゲノム配列は明らかに
されているが（Blattner F.R., Plunkett G., Bloch C.
A. et al., Science, 227, 1453-1474, 1997; ftp://ft
p.genetics.wisc.edu/pub/sequence/ecolim52.seq.g
z）、機能が未だ不明のORFが数多くある。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、Ｌ−アミノ
酸生産菌株の生産性を増強し、同菌株を用いて前記Ｌ−
アミノ酸、例えば、Ｌ−スレオニン、Ｌ−バリン、Ｌ−
プロリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−メチオニン、及びＬ−ア
ルギニンを製造する方法を提供することを課題とする。
酸生産菌株の生産性を増強し、同菌株を用いて前記Ｌ−
アミノ酸、例えば、Ｌ−スレオニン、Ｌ−バリン、Ｌ−
プロリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−メチオニン、及びＬ−ア
ルギニンを製造する方法を提供することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本課題は、目的とするＬ
−アミノ酸の生合成経路には関与していないが、それら
の生産性を増強するタンパク質をコードする遺伝子の同
定により達成された。これらのタンパク質の例として
は、Ｌ−アミノ酸の排出活性を有する膜タンパク質が挙
げられる。エシェリヒア・コリの全ゲノム配列の解析に
基づいて、４若しくはそれ以上の推定上の膜貫通部（Tr
ansmembrane segment）（TMS）を有するタンパク質を選
択した。入念なスクリーニングの結果、本発明者らはそ
れらの中からいくつかの遺伝子、すなわち、b2682およ
びb2683、b1242、並びにb3434を同定し、詳細に研究し
た。b2682およびb2683遺伝子は、機能が未知のタンパク
質をコードし得る推定上のＣＤＳとして知られている
（それぞれ、GenBank accessionNo. AE000353 U00096の
塩基配列の配列番号９２〜８２９および８１９〜１１５
４）。b2683遺伝子は、ygaHとしても知られている。
−アミノ酸の生合成経路には関与していないが、それら
の生産性を増強するタンパク質をコードする遺伝子の同
定により達成された。これらのタンパク質の例として
は、Ｌ−アミノ酸の排出活性を有する膜タンパク質が挙
げられる。エシェリヒア・コリの全ゲノム配列の解析に
基づいて、４若しくはそれ以上の推定上の膜貫通部（Tr
ansmembrane segment）（TMS）を有するタンパク質を選
択した。入念なスクリーニングの結果、本発明者らはそ
れらの中からいくつかの遺伝子、すなわち、b2682およ
びb2683、b1242、並びにb3434を同定し、詳細に研究し
た。b2682およびb2683遺伝子は、機能が未知のタンパク
質をコードし得る推定上のＣＤＳとして知られている
（それぞれ、GenBank accessionNo. AE000353 U00096の
塩基配列の配列番号９２〜８２９および８１９〜１１５
４）。b2683遺伝子は、ygaHとしても知られている。
【０００８】また、b1242遺伝子は、機能が未知のタン
パク質をコードし得る推定上のＣＤＳとして知られてい
る（GenBank accession No. AE000222 U00096の塩基配
列の配列番号８４３２〜９０７９）。b1242遺伝子は、y
chEとしても知られている。
パク質をコードし得る推定上のＣＤＳとして知られてい
る（GenBank accession No. AE000222 U00096の塩基配
列の配列番号８４３２〜９０７９）。b1242遺伝子は、y
chEとしても知られている。
【０００９】さらに、b3434遺伝子は、機能が未知のタ
ンパク質をコードし得る推定上のＣＤＳとして知られて
いる（GenBank accession No. AE000420 U00096の塩基
配列の配列番号１４６３〜２０５６）。b3434遺伝子
は、yhgNとしても知られている。
ンパク質をコードし得る推定上のＣＤＳとして知られて
いる（GenBank accession No. AE000420 U00096の塩基
配列の配列番号１４６３〜２０５６）。b3434遺伝子
は、yhgNとしても知られている。
【００１０】本発明者らは、また、b2682、b2683、b124
2又はb3434遺伝子によってコードされるタンパク質の活
性を増強することにより、Ｌ−アミノ酸生産菌の生産性
が増強されることを見いだした。かくして、本発明は完
成された。本発明は、以下のとおりである。
2又はb3434遺伝子によってコードされるタンパク質の活
性を増強することにより、Ｌ−アミノ酸生産菌の生産性
が増強されることを見いだした。かくして、本発明は完
成された。本発明は、以下のとおりである。
【００１１】（１）Ｌ−アミノ酸生産能を有するエシェ
リヒア属細菌であって、同細菌の細胞内において以下の
（Ａ）または（Ｂ）、および（Ｃ）または（Ｄ）に記載
のタンパク質の活性を増強することにより、Ｌ−アミノ
酸生産性が増強された前記エシェリヒア属細菌。 （Ａ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列を有す
るタンパク質、（Ｂ）配列表の配列番号３に記載のアミ
ノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、
置換、挿入または付加を含み、かつ、細菌のＬ−アミノ
酸および／またはそのアナログに対する耐性を増強させ
る活性を有するタンパク質。（Ｃ）配列表の配列番号５
に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、（Ｄ）配列
表の配列番号５に記載のアミノ酸配列において、１若し
くは数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入または付加を含
み、細菌のＬ−アミノ酸および／またはそのアナログに
対する耐性を増強させる活性を有するタンパク質。（以
下、前記（Ａ）または（Ｂ）、および（Ｃ）または
（Ｄ）に記載のタンパク質は、「第一の本発明のタンパ
ク質」と呼ぶことがある。また、前記（Ａ）または
（Ｂ）、および（Ｃ）または（Ｄ）に記載のタンパク質
の活性が増強されたエシェリヒア属細菌は、「第一の本
発明の細菌」と呼ぶことがある。） （２）（Ａ）または（Ｂ）、および（Ｃ）または（Ｄ）
に記載のタンパク質の活性は、（Ａ）または（Ｂ）、お
よび（Ｃ）または（Ｄ）に記載のタンパク質をコードす
るＤＮＡで前記細菌を形質転換するか、または、前記細
菌の染色体上の前記ＤＮＡの発現制御配列を改変するこ
とにより増強されたことを特徴とする前記細菌。 （３）前記形質転換はマルチコピーベクターを用いて行
われた前記細菌。 （４）前記細菌を培地中に培養し、生成、蓄積されたＬ
−アミノ酸を該培地中から採取する、Ｌ−アミノ酸の製
造法。 （５）Ｌ−アミノ酸がＬ−スレオニンである、前記の方
法。 （６）前記細菌のスレオニンオペロンの発現が増強され
た、前記の方法。 （７）Ｌ−アミノ酸がＬ−バリンである、前記の方法。 （８）前記細菌のilvオペロンの発現が増強された、前
記の方法。 （９）Ｌ−アミノ酸がＬ−プロリンである、前記の方
法。 （１０）前記細菌のプロリンの生合成に関与する遺伝子
の発現が増強された、前記の方法。 （１１）Ｌ−アミノ酸がＬ−ロイシンである、前記の方
法。 （１２）前記細菌のleuオペロンの発現が増強された、
前記の方法。 （１３）Ｌ−アミノ酸がＬ−メチオニンである、前記の
方法。 （１４）前記細菌のmetレギュロンの発現が増強され
た、前記の方法。
リヒア属細菌であって、同細菌の細胞内において以下の
（Ａ）または（Ｂ）、および（Ｃ）または（Ｄ）に記載
のタンパク質の活性を増強することにより、Ｌ−アミノ
酸生産性が増強された前記エシェリヒア属細菌。 （Ａ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列を有す
るタンパク質、（Ｂ）配列表の配列番号３に記載のアミ
ノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、
置換、挿入または付加を含み、かつ、細菌のＬ−アミノ
酸および／またはそのアナログに対する耐性を増強させ
る活性を有するタンパク質。（Ｃ）配列表の配列番号５
に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、（Ｄ）配列
表の配列番号５に記載のアミノ酸配列において、１若し
くは数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入または付加を含
み、細菌のＬ−アミノ酸および／またはそのアナログに
対する耐性を増強させる活性を有するタンパク質。（以
下、前記（Ａ）または（Ｂ）、および（Ｃ）または
（Ｄ）に記載のタンパク質は、「第一の本発明のタンパ
ク質」と呼ぶことがある。また、前記（Ａ）または
（Ｂ）、および（Ｃ）または（Ｄ）に記載のタンパク質
の活性が増強されたエシェリヒア属細菌は、「第一の本
発明の細菌」と呼ぶことがある。） （２）（Ａ）または（Ｂ）、および（Ｃ）または（Ｄ）
に記載のタンパク質の活性は、（Ａ）または（Ｂ）、お
よび（Ｃ）または（Ｄ）に記載のタンパク質をコードす
るＤＮＡで前記細菌を形質転換するか、または、前記細
菌の染色体上の前記ＤＮＡの発現制御配列を改変するこ
とにより増強されたことを特徴とする前記細菌。 （３）前記形質転換はマルチコピーベクターを用いて行
われた前記細菌。 （４）前記細菌を培地中に培養し、生成、蓄積されたＬ
−アミノ酸を該培地中から採取する、Ｌ−アミノ酸の製
造法。 （５）Ｌ−アミノ酸がＬ−スレオニンである、前記の方
法。 （６）前記細菌のスレオニンオペロンの発現が増強され
た、前記の方法。 （７）Ｌ−アミノ酸がＬ−バリンである、前記の方法。 （８）前記細菌のilvオペロンの発現が増強された、前
記の方法。 （９）Ｌ−アミノ酸がＬ−プロリンである、前記の方
法。 （１０）前記細菌のプロリンの生合成に関与する遺伝子
の発現が増強された、前記の方法。 （１１）Ｌ−アミノ酸がＬ−ロイシンである、前記の方
法。 （１２）前記細菌のleuオペロンの発現が増強された、
前記の方法。 （１３）Ｌ−アミノ酸がＬ−メチオニンである、前記の
方法。 （１４）前記細菌のmetレギュロンの発現が増強され
た、前記の方法。
【００１２】（１５）Ｌ−アミノ酸生産能を有するエシ
ェリヒア属細菌であって、同細菌の細胞内において以下
の（Ｅ）または（Ｆ）に記載のタンパク質の活性を増強
することにより、Ｌ−アミノ酸生産性が増強されたエシ
ェリヒア属細菌。 （Ｅ）配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有
するタンパク質、または、（Ｆ）配列表の配列番号１１
に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミ
ノ酸の欠失、置換、挿入または付加を含み、かつ、細菌
のＬ−アミノ酸および／またはそのアナログに対する耐
性を増強させる活性を有するタンパク質。（以下、前記
（Ｅ）または（Ｆ）に記載のタンパク質は、「第二の本
発明のタンパク質」と呼ぶことがある。また、前記
（Ｅ）または（Ｆ）に記載のタンパク質の活性が増強さ
れたエシェリヒア属細菌は、「第二の本発明の細菌」と
呼ぶことがある。） （１６）前記（Ｅ）または（Ｆ）に記載のタンパク質の
活性は、（Ｅ）または（Ｆ）に記載のタンパク質をコー
ドするＤＮＡで前記細菌を形質転換するか、または、前
記細菌の染色体上の前記ＤＮＡの発現制御配列を改変す
ることにより増強されたことを特徴とする前記細菌。 （１７）前記形質転換はマルチコピーベクターを用いて
行われた前記細菌。 （１８）前記細菌を培地中に培養し、生成、蓄積された
Ｌ−アミノ酸を該培地中から採集する、Ｌ−アミノ酸の
製造法。 （１９）Ｌ−アミノ酸がＬ−スレオニンである、前記の
方法。 （２０）前記細菌のスレオニンオペロンの発現が増強さ
れた、前記の方法。 （２１）Ｌ−アミノ酸がＬ−バリンである、前記の方
法。 （２２）前記細菌のilvオペロンの発現が増強された、
前記の方法。
ェリヒア属細菌であって、同細菌の細胞内において以下
の（Ｅ）または（Ｆ）に記載のタンパク質の活性を増強
することにより、Ｌ−アミノ酸生産性が増強されたエシ
ェリヒア属細菌。 （Ｅ）配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有
するタンパク質、または、（Ｆ）配列表の配列番号１１
に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミ
ノ酸の欠失、置換、挿入または付加を含み、かつ、細菌
のＬ−アミノ酸および／またはそのアナログに対する耐
性を増強させる活性を有するタンパク質。（以下、前記
（Ｅ）または（Ｆ）に記載のタンパク質は、「第二の本
発明のタンパク質」と呼ぶことがある。また、前記
（Ｅ）または（Ｆ）に記載のタンパク質の活性が増強さ
れたエシェリヒア属細菌は、「第二の本発明の細菌」と
呼ぶことがある。） （１６）前記（Ｅ）または（Ｆ）に記載のタンパク質の
活性は、（Ｅ）または（Ｆ）に記載のタンパク質をコー
ドするＤＮＡで前記細菌を形質転換するか、または、前
記細菌の染色体上の前記ＤＮＡの発現制御配列を改変す
ることにより増強されたことを特徴とする前記細菌。 （１７）前記形質転換はマルチコピーベクターを用いて
行われた前記細菌。 （１８）前記細菌を培地中に培養し、生成、蓄積された
Ｌ−アミノ酸を該培地中から採集する、Ｌ−アミノ酸の
製造法。 （１９）Ｌ−アミノ酸がＬ−スレオニンである、前記の
方法。 （２０）前記細菌のスレオニンオペロンの発現が増強さ
れた、前記の方法。 （２１）Ｌ−アミノ酸がＬ−バリンである、前記の方
法。 （２２）前記細菌のilvオペロンの発現が増強された、
前記の方法。
【００１３】（２３）Ｌ−アミノ酸生産能を有するエシ
ェリヒア属細菌であって、同細菌の細胞内において以下
の（Ｇ）または（Ｈ）に記載のタンパク質の活性を増強
することにより、Ｌ−アミノ酸生産性が増強されたエシ
ェリヒア属細菌。 （Ｇ）配列表の配列番号１５に記載のアミノ酸配列を有
するタンパク質、または、（Ｈ）配列表の配列番号１５
に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミ
ノ酸の欠失、置換、挿入または付加を含み、かつ、細菌
のＬ−アミノ酸および／またはそのアナログ、例えば、
ＤＬ−ｏ−メチルセリン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ
−ノルロイシンおよびＤＬ−β−ヒドロキシ−ノルバリ
ンに対する耐性を増強させる、およびＳ−（２−アミノ
エチル）システインに対する感受性を増強させる活性を
有するタンパク質。（以下、前記（Ｇ）または（Ｈ）に
記載のタンパク質は、「第三の本発明のタンパク質」と
呼ぶことがある。また、前記（Ｇ）または（Ｈ）に記載
のタンパク質の活性が増強されたエシェリヒア属細菌
は、「第三の本発明の細菌」と呼ぶことがある。） （２４）前記（Ｇ）または（Ｈ）に記載のタンパク質の
活性は、（Ｇ）または（Ｈ）に記載のタンパク質をコー
ドするＤＮＡで前記細菌を形質転換するか、または、前
記細菌の染色体上の前記ＤＮＡの発現制御配列を改変す
ることにより増強されたことを特徴とする、前記細菌。 （２５）前記形質転換はマルチコピーベクターを用いて
行われた前記細菌。 （２６）前記細菌を培地中に培養し、生成、蓄積された
Ｌ−アミノ酸を該培地中から採取する、Ｌ−アミノ酸の
製造法。 （２７）Ｌ−アミノ酸がＬ−アルギニンである、前記の
方法。 （２８）前記細菌のアルギニンレギュロンの発現が増強
された、前記の方法。 （２９）Ｌ−アミノ酸がＬ−プロリンである、前記の方
法。 （３０）前記細菌のプロリンの生合成に関与する遺伝子
の発現が増強された、前記の方法。
ェリヒア属細菌であって、同細菌の細胞内において以下
の（Ｇ）または（Ｈ）に記載のタンパク質の活性を増強
することにより、Ｌ−アミノ酸生産性が増強されたエシ
ェリヒア属細菌。 （Ｇ）配列表の配列番号１５に記載のアミノ酸配列を有
するタンパク質、または、（Ｈ）配列表の配列番号１５
に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミ
ノ酸の欠失、置換、挿入または付加を含み、かつ、細菌
のＬ−アミノ酸および／またはそのアナログ、例えば、
ＤＬ−ｏ−メチルセリン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ
−ノルロイシンおよびＤＬ−β−ヒドロキシ−ノルバリ
ンに対する耐性を増強させる、およびＳ−（２−アミノ
エチル）システインに対する感受性を増強させる活性を
有するタンパク質。（以下、前記（Ｇ）または（Ｈ）に
記載のタンパク質は、「第三の本発明のタンパク質」と
呼ぶことがある。また、前記（Ｇ）または（Ｈ）に記載
のタンパク質の活性が増強されたエシェリヒア属細菌
は、「第三の本発明の細菌」と呼ぶことがある。） （２４）前記（Ｇ）または（Ｈ）に記載のタンパク質の
活性は、（Ｇ）または（Ｈ）に記載のタンパク質をコー
ドするＤＮＡで前記細菌を形質転換するか、または、前
記細菌の染色体上の前記ＤＮＡの発現制御配列を改変す
ることにより増強されたことを特徴とする、前記細菌。 （２５）前記形質転換はマルチコピーベクターを用いて
行われた前記細菌。 （２６）前記細菌を培地中に培養し、生成、蓄積された
Ｌ−アミノ酸を該培地中から採取する、Ｌ−アミノ酸の
製造法。 （２７）Ｌ−アミノ酸がＬ−アルギニンである、前記の
方法。 （２８）前記細菌のアルギニンレギュロンの発現が増強
された、前記の方法。 （２９）Ｌ−アミノ酸がＬ−プロリンである、前記の方
法。 （３０）前記細菌のプロリンの生合成に関与する遺伝子
の発現が増強された、前記の方法。
【００１４】前記Ｌ−アミノ酸の製造法は、本発明のタ
ンパク質、例えば、配列番号３および５に示されるアミ
ノ酸配列を有するタンパク質の活性が増強された、Ｌ−
スレオニン生産菌を用いたＬ−スレオニンの製造を含
む。
ンパク質、例えば、配列番号３および５に示されるアミ
ノ酸配列を有するタンパク質の活性が増強された、Ｌ−
スレオニン生産菌を用いたＬ−スレオニンの製造を含
む。
【００１５】また、本発明のＬ−アミノ酸の製造法は、
本発明のタンパク質、例えば、配列番号３および５に示
されるアミノ酸配列を有するタンパク質の活性が増強さ
れた、Ｌ−バリン生産菌を用いたＬ−バリンの製造を含
む。
本発明のタンパク質、例えば、配列番号３および５に示
されるアミノ酸配列を有するタンパク質の活性が増強さ
れた、Ｌ−バリン生産菌を用いたＬ−バリンの製造を含
む。
【００１６】さらに、前記Ｌ−アミノ酸の製造法は、本
発明のタンパク質、例えば、配列番号３および５に示さ
れるアミノ酸配列を有するタンパク質の活性が増強され
た、Ｌ−プロリン生産菌を用いたＬ−プロリンの製造を
含む。さらに、前記Ｌ−アミノ酸の製造法は、本発明の
タンパク質、例えば、配列番号３および５に示されるア
ミノ酸配列を有するタンパク質の活性が増強された、Ｌ
−ロイシン生産菌を用いたＬ−ロイシンの製造を含む。
さらに、前記Ｌ−アミノ酸の製造法は、本発明のタンパ
ク質、例えば、配列番号３および５に示されるアミノ酸
配列を有するタンパク質の活性が増強された、Ｌ−メチ
オニン生産菌を用いたＬ−メチオニンの製造を含む。
発明のタンパク質、例えば、配列番号３および５に示さ
れるアミノ酸配列を有するタンパク質の活性が増強され
た、Ｌ−プロリン生産菌を用いたＬ−プロリンの製造を
含む。さらに、前記Ｌ−アミノ酸の製造法は、本発明の
タンパク質、例えば、配列番号３および５に示されるア
ミノ酸配列を有するタンパク質の活性が増強された、Ｌ
−ロイシン生産菌を用いたＬ−ロイシンの製造を含む。
さらに、前記Ｌ−アミノ酸の製造法は、本発明のタンパ
ク質、例えば、配列番号３および５に示されるアミノ酸
配列を有するタンパク質の活性が増強された、Ｌ−メチ
オニン生産菌を用いたＬ−メチオニンの製造を含む。
【００１７】また、本発明のＬ−アミノ酸の製造法は、
本発明のタンパク質、例えば、配列番号１１に示される
アミノ酸配列を有するタンパク質の活性が増強された、
Ｌ−スレオニン生産菌を用いたＬ−スレオニンの製造を
含む。さらに、前記Ｌ−アミノ酸の製造法は、本発明の
タンパク質、例えば、配列番号１１に示されるアミノ酸
配列を有するタンパク質の活性が増強された、Ｌ−バリ
ン生産菌を用いたＬ−バリンの製造を含む。
本発明のタンパク質、例えば、配列番号１１に示される
アミノ酸配列を有するタンパク質の活性が増強された、
Ｌ−スレオニン生産菌を用いたＬ−スレオニンの製造を
含む。さらに、前記Ｌ−アミノ酸の製造法は、本発明の
タンパク質、例えば、配列番号１１に示されるアミノ酸
配列を有するタンパク質の活性が増強された、Ｌ−バリ
ン生産菌を用いたＬ−バリンの製造を含む。
【００１８】また、本発明のＬ−アミノ酸の製造法は、
本発明のタンパク質、例えば、配列番号１５に示される
アミノ酸配列を有するタンパク質の活性が増強された、
Ｌ−アルギニン生産菌を用いたＬ−アルギニンの製造を
含む。さらに、前記Ｌ−アミノ酸の製造法は、本発明の
タンパク質、例えば、配列番号１５に示されるアミノ酸
配列を有するタンパク質の活性が増強された、Ｌ−プロ
リン生産菌を用いたＬ−プロリンの製造を含む。
本発明のタンパク質、例えば、配列番号１５に示される
アミノ酸配列を有するタンパク質の活性が増強された、
Ｌ−アルギニン生産菌を用いたＬ−アルギニンの製造を
含む。さらに、前記Ｌ−アミノ酸の製造法は、本発明の
タンパク質、例えば、配列番号１５に示されるアミノ酸
配列を有するタンパク質の活性が増強された、Ｌ−プロ
リン生産菌を用いたＬ−プロリンの製造を含む。
【００１９】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の細菌は、エシェリヒア属に属するＬ−アミノ酸
生産菌であって、同細菌によるＬ−アミノ酸の生産性
は、同細菌細胞内で本発明のタンパク質の活性を増強す
ることにより増強される。
本発明の細菌は、エシェリヒア属に属するＬ−アミノ酸
生産菌であって、同細菌によるＬ−アミノ酸の生産性
は、同細菌細胞内で本発明のタンパク質の活性を増強す
ることにより増強される。
【００２０】本発明において「Ｌ−アミノ酸生産菌」と
は、前記細菌を培地中に培養したときに、Ｌ−アミノ酸
を培地中に蓄積させる能力を有する細菌を意味する。Ｌ
−アミノ酸生産能は、野生株の性質として細菌が保持し
ているものでよく、または、育種によって付与又は増強
されたものでもよい。
は、前記細菌を培地中に培養したときに、Ｌ−アミノ酸
を培地中に蓄積させる能力を有する細菌を意味する。Ｌ
−アミノ酸生産能は、野生株の性質として細菌が保持し
ているものでよく、または、育種によって付与又は増強
されたものでもよい。
【００２１】本発明の細菌は、目的のＬ−アミノ酸の生
産性を増強させるタンパク質の活性を増強させた、エシ
ェリヒア属に属するＬ−アミノ酸生産菌である。具体的
には、本発明の細菌は、本発明のタンパク質の少なくと
も１種又は２種の活性が増強された、エシェリヒア属に
属するＬ−アミノ酸生産菌である。
産性を増強させるタンパク質の活性を増強させた、エシ
ェリヒア属に属するＬ−アミノ酸生産菌である。具体的
には、本発明の細菌は、本発明のタンパク質の少なくと
も１種又は２種の活性が増強された、エシェリヒア属に
属するＬ−アミノ酸生産菌である。
【００２２】「タンパク質の活性の増強」という用語
は、細菌あたりの活性が、非改変株、例えば、エシェリ
ヒア属細菌の野生株の活性よりも高くなっていることを
意味する。例えば、細菌あたりのタンパク質分子の数が
増加している場合、又は、タンパク質当たりの比活性が
増加している場合等が挙げられる。さらに、比較対象と
されるエシェリヒア属細菌の野生株としては、例えば、
エシェリヒア・コリの野生株が挙げられる。
は、細菌あたりの活性が、非改変株、例えば、エシェリ
ヒア属細菌の野生株の活性よりも高くなっていることを
意味する。例えば、細菌あたりのタンパク質分子の数が
増加している場合、又は、タンパク質当たりの比活性が
増加している場合等が挙げられる。さらに、比較対象と
されるエシェリヒア属細菌の野生株としては、例えば、
エシェリヒア・コリの野生株が挙げられる。
【００２３】具体的には、第一の本発明の細菌は、染色
体ＤＮＡ上または細菌内のプラスミド上に、b2682およ
びb2683遺伝子の少なくとも一方、好ましくは両方を過
剰発現するＤＮＡを保持し、増強された、Ｌ−アミノ酸
生産能、例えば、Ｌ−スレオニン、Ｌ−バリン、Ｌ−プ
ロリン、Ｌ−ロイシンまたはＬ−メチオニンの生産能を
有する。第二の本発明の細菌は、染色体ＤＮＡ上または
細菌内のプラスミド上に、b1242遺伝子を過剰発現する
ＤＮＡを保持し、増強された、Ｌ−アミノ酸生産能、例
えば、Ｌ−スレオニンおよび／またはＬ−バリンの生産
能を有する。第三の本発明の細菌は、染色体ＤＮＡ上ま
たは細菌内のプラスミド上に、b3434遺伝子を過剰発現
するＤＮＡを保持し、増強されたＬ−アミノ酸生産能、
例えば、Ｌ−アルギニンおよび／またはＬ−プロリンの
生産能を有する。
体ＤＮＡ上または細菌内のプラスミド上に、b2682およ
びb2683遺伝子の少なくとも一方、好ましくは両方を過
剰発現するＤＮＡを保持し、増強された、Ｌ−アミノ酸
生産能、例えば、Ｌ−スレオニン、Ｌ−バリン、Ｌ−プ
ロリン、Ｌ−ロイシンまたはＬ−メチオニンの生産能を
有する。第二の本発明の細菌は、染色体ＤＮＡ上または
細菌内のプラスミド上に、b1242遺伝子を過剰発現する
ＤＮＡを保持し、増強された、Ｌ−アミノ酸生産能、例
えば、Ｌ−スレオニンおよび／またはＬ−バリンの生産
能を有する。第三の本発明の細菌は、染色体ＤＮＡ上ま
たは細菌内のプラスミド上に、b3434遺伝子を過剰発現
するＤＮＡを保持し、増強されたＬ−アミノ酸生産能、
例えば、Ｌ−アルギニンおよび／またはＬ−プロリンの
生産能を有する。
【００２４】第一の本発明のタンパク質は、以下の
（Ａ）または（Ｂ）、および（Ｃ）または（Ｄ）に記載
されたものを含む。 （Ａ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列を有す
るタンパク質。 （Ｂ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入また
は付加を含み、かつ、細菌のＬ−アミノ酸および／また
はそのアナログに対する耐性を増強させる活性を有する
タンパク質。 （Ｃ）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列を有す
るタンパク質、 （Ｄ）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入また
は付加を含み、かつ、細菌のＬ−アミノ酸および／また
はそのアナログに対する耐性を増強させる活性を有する
タンパク質。
（Ａ）または（Ｂ）、および（Ｃ）または（Ｄ）に記載
されたものを含む。 （Ａ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列を有す
るタンパク質。 （Ｂ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入また
は付加を含み、かつ、細菌のＬ−アミノ酸および／また
はそのアナログに対する耐性を増強させる活性を有する
タンパク質。 （Ｃ）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列を有す
るタンパク質、 （Ｄ）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入また
は付加を含み、かつ、細菌のＬ−アミノ酸および／また
はそのアナログに対する耐性を増強させる活性を有する
タンパク質。
【００２５】前記「数個」のアミノ酸の数は、アミノ酸
残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっ
て異なる。その数はそれぞれ、タンパク質（Ａ）につい
ては、２〜２４個、好ましくは２〜１２個、より好まし
くは２〜５個であり得、タンパク質（Ｃ）については、
２〜１１個、好ましくは２〜７個、より好ましくは２〜
５個であり得る。
残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっ
て異なる。その数はそれぞれ、タンパク質（Ａ）につい
ては、２〜２４個、好ましくは２〜１２個、より好まし
くは２〜５個であり得、タンパク質（Ｃ）については、
２〜１１個、好ましくは２〜７個、より好ましくは２〜
５個であり得る。
【００２６】第二の本発明のタンパク質は、以下の
（Ｅ）または（Ｆ）に記載されたものを含む。 （Ｅ）配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有
するタンパク質。 （Ｆ）配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸配列にお
いて、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入ま
たは付加を含み、かつ、細菌のＬ−アミノ酸および／ま
たはそのアナログに対する耐性を増強させる活性を有す
るタンパク質。前記「数個」のアミノ酸の数は、アミノ
酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によ
って異なる。その数は、タンパク質（Ｅ）については、
２〜２２個、好ましくは２〜１１個、より好ましくは２
〜５個であり得る。
（Ｅ）または（Ｆ）に記載されたものを含む。 （Ｅ）配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有
するタンパク質。 （Ｆ）配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸配列にお
いて、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入ま
たは付加を含み、かつ、細菌のＬ−アミノ酸および／ま
たはそのアナログに対する耐性を増強させる活性を有す
るタンパク質。前記「数個」のアミノ酸の数は、アミノ
酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によ
って異なる。その数は、タンパク質（Ｅ）については、
２〜２２個、好ましくは２〜１１個、より好ましくは２
〜５個であり得る。
【００２７】第三の本発明のタンパク質は、以下の
（Ｇ）または（Ｈ）に記載されたものを含む。 （Ｇ）配列表の配列番号１５に記載のアミノ酸配列を有
するタンパク質。 （Ｈ）配列表の配列番号１５に記載のアミノ酸配列にお
いて、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入ま
たは付加を含み、かつ、細菌のＬ−アミノ酸および／ま
たはそのアナログ、例えば、ＤＬ−ｏ−メチルセリン、
６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、および、
ＤＬ−β−ヒドロキシ−ノルバリンに対する耐性を増強
させる、およびＳ−（２−アミノエチル）システインに
対する感受性を増強させる活性を有するタンパク質。前
記「数個」のアミノ酸の数は、アミノ酸残基のタンパク
質の立体構造における位置や種類によって異なる。その
数は、タンパク質（Ｇ）については、２〜２０個、好ま
しくは２〜１０個、より好ましくは２〜５個であり得
る。
（Ｇ）または（Ｈ）に記載されたものを含む。 （Ｇ）配列表の配列番号１５に記載のアミノ酸配列を有
するタンパク質。 （Ｈ）配列表の配列番号１５に記載のアミノ酸配列にお
いて、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入ま
たは付加を含み、かつ、細菌のＬ−アミノ酸および／ま
たはそのアナログ、例えば、ＤＬ−ｏ−メチルセリン、
６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、および、
ＤＬ−β−ヒドロキシ−ノルバリンに対する耐性を増強
させる、およびＳ−（２−アミノエチル）システインに
対する感受性を増強させる活性を有するタンパク質。前
記「数個」のアミノ酸の数は、アミノ酸残基のタンパク
質の立体構造における位置や種類によって異なる。その
数は、タンパク質（Ｇ）については、２〜２０個、好ま
しくは２〜１０個、より好ましくは２〜５個であり得
る。
【００２８】Ｌ−アミノ酸および／またはそのアナログ
に対する耐性とは、Ｌ−アミノ酸またはそのアナログを
非改変株または野生株が生育できない濃度で含む最小培
地上で生育できるか、またはＬ−アミノ酸またはそのア
ナログを含む培地上で非改変株または野生株よりも早く
生育できる細菌の能力を意味する。
に対する耐性とは、Ｌ−アミノ酸またはそのアナログを
非改変株または野生株が生育できない濃度で含む最小培
地上で生育できるか、またはＬ−アミノ酸またはそのア
ナログを含む培地上で非改変株または野生株よりも早く
生育できる細菌の能力を意味する。
【００２９】より具体的には、エシェリヒア・コリの菌
株を、Ｌ−アミノ酸又はそのアナログを含むアダムス寒
天培地で適当な条件で培養したときに、３７℃、２〜４
日後に非改変株又は野生株よりも大きなコロニーを形成
した場合、前記菌株は、前記Ｌ−アミノ酸又はそのアナ
ログに耐性であるということができる。「適当な条件」
とは、培養されるエシェリヒア・コリの菌株のための、
温度、pH、給気、又は必要に応じて加える必須栄養素等
をいう。
株を、Ｌ−アミノ酸又はそのアナログを含むアダムス寒
天培地で適当な条件で培養したときに、３７℃、２〜４
日後に非改変株又は野生株よりも大きなコロニーを形成
した場合、前記菌株は、前記Ｌ−アミノ酸又はそのアナ
ログに耐性であるということができる。「適当な条件」
とは、培養されるエシェリヒア・コリの菌株のための、
温度、pH、給気、又は必要に応じて加える必須栄養素等
をいう。
【００３０】Ｌ−アミノ酸のアナログの例としては、
３，４−ジヒドロプロリン、ＤＬ−チアイソロイシン、
ＤＬ−ｏ−メチルセリン、４−アザロイシン、ノルロイ
シン、Ｌ−ｏ−フルオロフェニルアラニン、ホモセリ
ン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、およ
び、ＤＬ−β−ヒドロキシ−ノルバリンが挙げられる。
前記の非改変株又は野生株が生育できないＬ−アミノ酸
またはそのアナログの濃度は、使用する化合物の構造に
よって、かなり異なる（ＤＬ−チアイソロイシンの０．
５μｇ／ｍｌ〜ＤＬ−ｏ−メチルセリンの９６００μｇ
／ｍｌ）。例えば、この濃度は、３，４−ジヒドロプロ
リンの場合では、一般的には７〜７０μｇ／ｍｌ、好ま
しくは２０〜２５μｇ／ｍｌであり、ＤＬ−チアイソロ
イシンの場合では、一般的には０．５〜５μｇ／ｍｌ、
好ましくは０．９〜１．１μｇ／ｍｌであり、ＤＬ−ｏ
−メチルセリンの場合では、一般的には１１００〜９６
００μｇ／ｍｌ、好ましくは３０００〜３５００μｇ／
ｍｌであり、４−アザロイシンの場合では、一般的には
１５〜１５０μｇ／ｍｌ、好ましくは４０〜５０μｇ／
ｍｌであり、ノルロイシンの場合では、一般的には１５
０〜１５００μｇ／ｍｌ、好ましくは４５０〜５５０μ
ｇ／ｍｌであり、Ｌ−ｏ−フルオロフェニルアラニンの
場合では、一般的には０．６〜６μｇ／ｍｌ、好ましく
は１．５〜２μｇ／ｍｌであり、ＤＬ−ｏ−フルオロフ
ェニルアラニンの場合では、一般的には２〜２０μｇ／
ｍｌ、好ましくは５〜７μｇ／ｍｌであり、ホモセリン
の場合では、一般的には３３０〜３３００μｇ／ｍｌ、
好ましくは９００〜１１００μｇ／ｍｌであり、６−ジ
アゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシンの場合では、一般
的には５〜５０μｇ／ｍｌ、好ましくは１２〜１８μｇ
／ｍｌであり、ＤＬ−β−ヒドロキシ−ノルバリンの場
合では、一般的には２５〜２５０μｇ／ｍｌ、好ましく
は７０〜９０μｇ／ｍｌである。
３，４−ジヒドロプロリン、ＤＬ−チアイソロイシン、
ＤＬ−ｏ−メチルセリン、４−アザロイシン、ノルロイ
シン、Ｌ−ｏ−フルオロフェニルアラニン、ホモセリ
ン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、およ
び、ＤＬ−β−ヒドロキシ−ノルバリンが挙げられる。
前記の非改変株又は野生株が生育できないＬ−アミノ酸
またはそのアナログの濃度は、使用する化合物の構造に
よって、かなり異なる（ＤＬ−チアイソロイシンの０．
５μｇ／ｍｌ〜ＤＬ−ｏ−メチルセリンの９６００μｇ
／ｍｌ）。例えば、この濃度は、３，４−ジヒドロプロ
リンの場合では、一般的には７〜７０μｇ／ｍｌ、好ま
しくは２０〜２５μｇ／ｍｌであり、ＤＬ−チアイソロ
イシンの場合では、一般的には０．５〜５μｇ／ｍｌ、
好ましくは０．９〜１．１μｇ／ｍｌであり、ＤＬ−ｏ
−メチルセリンの場合では、一般的には１１００〜９６
００μｇ／ｍｌ、好ましくは３０００〜３５００μｇ／
ｍｌであり、４−アザロイシンの場合では、一般的には
１５〜１５０μｇ／ｍｌ、好ましくは４０〜５０μｇ／
ｍｌであり、ノルロイシンの場合では、一般的には１５
０〜１５００μｇ／ｍｌ、好ましくは４５０〜５５０μ
ｇ／ｍｌであり、Ｌ−ｏ−フルオロフェニルアラニンの
場合では、一般的には０．６〜６μｇ／ｍｌ、好ましく
は１．５〜２μｇ／ｍｌであり、ＤＬ−ｏ−フルオロフ
ェニルアラニンの場合では、一般的には２〜２０μｇ／
ｍｌ、好ましくは５〜７μｇ／ｍｌであり、ホモセリン
の場合では、一般的には３３０〜３３００μｇ／ｍｌ、
好ましくは９００〜１１００μｇ／ｍｌであり、６−ジ
アゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシンの場合では、一般
的には５〜５０μｇ／ｍｌ、好ましくは１２〜１８μｇ
／ｍｌであり、ＤＬ−β−ヒドロキシ−ノルバリンの場
合では、一般的には２５〜２５０μｇ／ｍｌ、好ましく
は７０〜９０μｇ／ｍｌである。
【００３１】Ｌ−アミノ酸および／またはそのアナログ
に対する感受性とは、Ｌ−アミノ酸またはそのアナログ
を所定の濃度で含む最小培地上で非改変株または野生株
よりも遅く生育するか、または、Ｌ−アミノ酸またはそ
のアナログを非改変株または野生株の親株が生育できる
濃度で含む最小培地上で生育できない、細菌の能力を意
味する。Ｌ−アミノ酸のアナログの例としては、Ｓ−
（２−アミノエチル）システインが挙げられる。前記記
載の濃度は、Ｓ−（２−アミノエチル）システインの場
合には、一般的には０．２〜２．０μｇ／ｍｌ、好まし
くは０．５〜１．０μｇ／ｍｌである。
に対する感受性とは、Ｌ−アミノ酸またはそのアナログ
を所定の濃度で含む最小培地上で非改変株または野生株
よりも遅く生育するか、または、Ｌ−アミノ酸またはそ
のアナログを非改変株または野生株の親株が生育できる
濃度で含む最小培地上で生育できない、細菌の能力を意
味する。Ｌ−アミノ酸のアナログの例としては、Ｓ−
（２−アミノエチル）システインが挙げられる。前記記
載の濃度は、Ｓ−（２−アミノエチル）システインの場
合には、一般的には０．２〜２．０μｇ／ｍｌ、好まし
くは０．５〜１．０μｇ／ｍｌである。
【００３２】本発明の細菌は、前記細菌を（Ａ）または
（Ｂ）、および（Ｃ）または（Ｄ）、または（Ｅ）もし
くは（Ｆ）、または（Ｇ）もしくは（Ｈ）に記載のタン
パク質をコードするＤＮＡで形質転換するか、または前
記細菌の染色体上の前記ＤＮＡの発現制御配列を改変す
ることによって増強された本発明のタンパク質のうち一
つを含む。
（Ｂ）、および（Ｃ）または（Ｄ）、または（Ｅ）もし
くは（Ｆ）、または（Ｇ）もしくは（Ｈ）に記載のタン
パク質をコードするＤＮＡで形質転換するか、または前
記細菌の染色体上の前記ＤＮＡの発現制御配列を改変す
ることによって増強された本発明のタンパク質のうち一
つを含む。
【００３３】本発明の細菌の改変に用いられるＤＮＡ
は、推定上の膜タンパク質をコードしている。具体的に
は、前記ＤＮＡは、４若しくはそれ以上の膜貫通部を有
するタンパク質をコードしている。このようなＤＮＡ
は、Ｌ−アミノ酸の排出活性を有するタンパク質をコー
ドし得る。さらに具体的には、前記ＤＮＡは、b2682、b
2683、b1242、及びb3434遺伝子に代表される。b2682遺
伝子のコード領域の728〜738と、b2683遺伝子のコード
領域の1〜11は、オーバーラップしていることに注目す
る必要がある。b2682およびb2683遺伝子は、例えば、配
列番号１および２に記載の塩基配列を有するプライマー
を用いたＰＣＲにより、単一ＰＣＲ産物として得られ
る。また、b1242遺伝子は、例えば、配列番号９および
１０に示される塩基配列を有するプライマーを用いたＰ
ＣＲによって得ることができる。b3434遺伝子は、例え
ば、配列番号１３および１４に示される塩基配列を有す
るプライマーを用いたＰＣＲによって得ることができ
る。
は、推定上の膜タンパク質をコードしている。具体的に
は、前記ＤＮＡは、４若しくはそれ以上の膜貫通部を有
するタンパク質をコードしている。このようなＤＮＡ
は、Ｌ−アミノ酸の排出活性を有するタンパク質をコー
ドし得る。さらに具体的には、前記ＤＮＡは、b2682、b
2683、b1242、及びb3434遺伝子に代表される。b2682遺
伝子のコード領域の728〜738と、b2683遺伝子のコード
領域の1〜11は、オーバーラップしていることに注目す
る必要がある。b2682およびb2683遺伝子は、例えば、配
列番号１および２に記載の塩基配列を有するプライマー
を用いたＰＣＲにより、単一ＰＣＲ産物として得られ
る。また、b1242遺伝子は、例えば、配列番号９および
１０に示される塩基配列を有するプライマーを用いたＰ
ＣＲによって得ることができる。b3434遺伝子は、例え
ば、配列番号１３および１４に示される塩基配列を有す
るプライマーを用いたＰＣＲによって得ることができ
る。
【００３４】エシェリヒア・コリの全ゲノム配列の分析
により、４若しくはそれ以上の推定上のTMSを有するタ
ンパク質をコードする遺伝子の選択が可能となった。Pa
ulsenI.T., Sliwinski M.I., Saier M.H. (J. Mol. Bio
l., 1998, 277, 573)およびLinton K.J., Higgins C.F.
(Molecular Microbiology, 1998, 28(1),5)により明ら
かにされた既知の機能を有するタンパク質およびトラン
スポーターは、スクリーニングする群から排除した。残
りの遺伝子の入念なスクリーニングの結果、推定上の膜
エキスポーターをコードするいくつかの遺伝子を選択し
た。そして、b2682、b2683、b1242、又はb3434遺伝子の
過剰発現が、Ｌ−アミノ酸生産菌のＬ−アミノ酸の生産
性を増強することを見いだした。
により、４若しくはそれ以上の推定上のTMSを有するタ
ンパク質をコードする遺伝子の選択が可能となった。Pa
ulsenI.T., Sliwinski M.I., Saier M.H. (J. Mol. Bio
l., 1998, 277, 573)およびLinton K.J., Higgins C.F.
(Molecular Microbiology, 1998, 28(1),5)により明ら
かにされた既知の機能を有するタンパク質およびトラン
スポーターは、スクリーニングする群から排除した。残
りの遺伝子の入念なスクリーニングの結果、推定上の膜
エキスポーターをコードするいくつかの遺伝子を選択し
た。そして、b2682、b2683、b1242、又はb3434遺伝子の
過剰発現が、Ｌ−アミノ酸生産菌のＬ−アミノ酸の生産
性を増強することを見いだした。
【００３５】本発明のＤＮＡは、前記タンパク質の活性
を失わない範囲で、前記タンパク質（Ａ）または（Ｃ）
上の１若しくはそれ以上の位置で、１若しくは数個のア
ミノ酸の欠失、置換、挿入または付加を含むタンパク質
をコードするＤＮＡを含む。「数個」のアミノ酸の数
は、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置
や種類によって異なるが、その数はそれぞれ、タンパク
質（Ａ）については、２〜２４個、好ましくは２〜１２
個、より好ましくは２〜５個であり得、タンパク質
（Ｃ）については、２〜１１個、好ましくは２〜７個、
より好ましくは２〜５個であり得る。
を失わない範囲で、前記タンパク質（Ａ）または（Ｃ）
上の１若しくはそれ以上の位置で、１若しくは数個のア
ミノ酸の欠失、置換、挿入または付加を含むタンパク質
をコードするＤＮＡを含む。「数個」のアミノ酸の数
は、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置
や種類によって異なるが、その数はそれぞれ、タンパク
質（Ａ）については、２〜２４個、好ましくは２〜１２
個、より好ましくは２〜５個であり得、タンパク質
（Ｃ）については、２〜１１個、好ましくは２〜７個、
より好ましくは２〜５個であり得る。
【００３６】また、本発明のＤＮＡは、前記タンパク質
の活性を失わない範囲で、前記タンパク質（Ｅ）上の１
若しくはそれ以上の位置で、１若しくは数個のアミノ酸
の欠失、置換、挿入または付加を含むタンパク質をコー
ドするＤＮＡを含む。「数個」のアミノ酸の数は、アミ
ノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類に
よって異なるが、その数は、タンパク質（Ｅ）について
は、２〜２２個、好ましくは２〜１１個、より好ましく
は２〜５個であり得る。さらに、本発明のＤＮＡは、前
記タンパク質の活性を失わない範囲で、前記タンパク質
（Ｇ）上の１若しくはそれ以上の位置で、１若しくは数
個のアミノ酸の欠失、置換、挿入または付加を含むタン
パク質をコードするＤＮＡを含む。「数個」のアミノ酸
の数は、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における
位置や種類によって異なるが、その数は、タンパク質
（Ｇ）については、２〜２０個、好ましくは２〜１０
個、より好ましくは２〜５個であり得る。
の活性を失わない範囲で、前記タンパク質（Ｅ）上の１
若しくはそれ以上の位置で、１若しくは数個のアミノ酸
の欠失、置換、挿入または付加を含むタンパク質をコー
ドするＤＮＡを含む。「数個」のアミノ酸の数は、アミ
ノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類に
よって異なるが、その数は、タンパク質（Ｅ）について
は、２〜２２個、好ましくは２〜１１個、より好ましく
は２〜５個であり得る。さらに、本発明のＤＮＡは、前
記タンパク質の活性を失わない範囲で、前記タンパク質
（Ｇ）上の１若しくはそれ以上の位置で、１若しくは数
個のアミノ酸の欠失、置換、挿入または付加を含むタン
パク質をコードするＤＮＡを含む。「数個」のアミノ酸
の数は、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における
位置や種類によって異なるが、その数は、タンパク質
（Ｇ）については、２〜２０個、好ましくは２〜１０
個、より好ましくは２〜５個であり得る。
【００３７】（Ａ）、（Ｃ）、（Ｅ）または（Ｇ）に記
載のタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードす
るＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の
部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆
位を含むように（Ａ）、（Ｃ）、（Ｅ）または（Ｇ）に
記載のタンパク質をコードする塩基配列を改変すること
によって得られる。また、このような改変されたＤＮＡ
は、従来知られている変異を生じさせる変異剤および条
件による処理によっても取得され得る。このような処理
としては、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡをヒ
ドロキシルアミンで処理する方法、または前記ＤＮＡを
保持する微生物を、紫外線照射またはN−メチル−N'−
ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸
等の変異剤による処理を含む。
載のタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードす
るＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の
部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆
位を含むように（Ａ）、（Ｃ）、（Ｅ）または（Ｇ）に
記載のタンパク質をコードする塩基配列を改変すること
によって得られる。また、このような改変されたＤＮＡ
は、従来知られている変異を生じさせる変異剤および条
件による処理によっても取得され得る。このような処理
としては、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡをヒ
ドロキシルアミンで処理する方法、または前記ＤＮＡを
保持する微生物を、紫外線照射またはN−メチル−N'−
ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸
等の変異剤による処理を含む。
【００３８】本発明のＤＮＡは、異なる菌株、及び自然
界の多様性によるエシェリヒア属に属する細菌のバリア
ントとして見い出され得る変異体を含む。このような変
異体をコードするＤＮＡは、ストリンジェントな条件下
でb2862、b2683、b1242、又はb3434遺伝子およびその遺
伝子の一部とハイブリダイズし、Ｌ−アミノ酸の生産性
を増強するタンパク質をコードするＤＮＡをクローニン
グすることによって得ることができる。ここでいう「ス
トリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的ハイブリ
ッドが形成され、非特異的ハイブリッドが形成されない
条件である。例えば、ストリンジェントな条件は、例え
ば７０％以上の高いホモロジーを互いに有するＤＮＡが
ハイブリダイズする条件を含む。あるいは、ストリンジ
ェントな条件としては、通常のサザンハイブリダイゼー
ションの洗いの条件である、例えば、６０℃、１×ＳＳ
Ｃ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、
０．１％ＳＤＳを含む条件が挙げられる。b2862、b268
3、b1242、又はb3434遺伝子とハイブリダイズする変異
体をコードするＤＮＡに対するプローブとしては、配列
番号３、５、１１または１５の塩基配列の一部の配列を
それぞれ用いることもできる。そのようなプローブは、
配列番号３、５、１１または１５の塩基配列に基づいて
作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、配列番
号３または５の塩基配列を含むＤＮＡ断片を鋳型とする
ＰＣＲによって作製することができる。プローブとし
て、３００ｂｐ程度の長さのＤＮＡ断片を用いる場合に
は、ハイブリダイゼーションの洗いの条件は、５０℃、
２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳが挙げられる。
界の多様性によるエシェリヒア属に属する細菌のバリア
ントとして見い出され得る変異体を含む。このような変
異体をコードするＤＮＡは、ストリンジェントな条件下
でb2862、b2683、b1242、又はb3434遺伝子およびその遺
伝子の一部とハイブリダイズし、Ｌ−アミノ酸の生産性
を増強するタンパク質をコードするＤＮＡをクローニン
グすることによって得ることができる。ここでいう「ス
トリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的ハイブリ
ッドが形成され、非特異的ハイブリッドが形成されない
条件である。例えば、ストリンジェントな条件は、例え
ば７０％以上の高いホモロジーを互いに有するＤＮＡが
ハイブリダイズする条件を含む。あるいは、ストリンジ
ェントな条件としては、通常のサザンハイブリダイゼー
ションの洗いの条件である、例えば、６０℃、１×ＳＳ
Ｃ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、
０．１％ＳＤＳを含む条件が挙げられる。b2862、b268
3、b1242、又はb3434遺伝子とハイブリダイズする変異
体をコードするＤＮＡに対するプローブとしては、配列
番号３、５、１１または１５の塩基配列の一部の配列を
それぞれ用いることもできる。そのようなプローブは、
配列番号３、５、１１または１５の塩基配列に基づいて
作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、配列番
号３または５の塩基配列を含むＤＮＡ断片を鋳型とする
ＰＣＲによって作製することができる。プローブとし
て、３００ｂｐ程度の長さのＤＮＡ断片を用いる場合に
は、ハイブリダイゼーションの洗いの条件は、５０℃、
２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳが挙げられる。
【００３９】タンパク質をコードするＤＮＡで細菌を形
質転換することは、前記ＤＮＡを細菌細胞に、例えば、
従来法で導入し、前記細菌細胞内での本発明のタンパク
質をコードする遺伝子の発現を増加させ、本発明のタン
パク質の活性を増強させることを意味する。
質転換することは、前記ＤＮＡを細菌細胞に、例えば、
従来法で導入し、前記細菌細胞内での本発明のタンパク
質をコードする遺伝子の発現を増加させ、本発明のタン
パク質の活性を増強させることを意味する。
【００４０】遺伝子発現の増強の方法には、遺伝子のコ
ピー数を増加させる方法が含まれる。エシェリヒア属細
菌内で機能できるベクターへの遺伝子の導入は、遺伝子
のコピー数を増加させる。このような目的には、マルチ
コピーベクターが好ましく使用できる。マルチコピーベ
クターとしては、pBR322、pMW119、pUC19、pET22b等が
挙げられる。
ピー数を増加させる方法が含まれる。エシェリヒア属細
菌内で機能できるベクターへの遺伝子の導入は、遺伝子
のコピー数を増加させる。このような目的には、マルチ
コピーベクターが好ましく使用できる。マルチコピーベ
クターとしては、pBR322、pMW119、pUC19、pET22b等が
挙げられる。
【００４１】さらに、遺伝子発現の増強は、例えば、相
同組み換え等の方法で細菌染色体へ遺伝子をマルチコピ
ーで導入することによっても達成することができる。２
又はそれ以上の遺伝子の発現を増強する場合は、それら
の遺伝子は同じプラスミドに同時に保持させるか、また
は違うプラスミドに個々に保持させてもよい。また、遺
伝子の一方を染色体上に保持させ、他方をプラスミド上
に保持させてもよい。
同組み換え等の方法で細菌染色体へ遺伝子をマルチコピ
ーで導入することによっても達成することができる。２
又はそれ以上の遺伝子の発現を増強する場合は、それら
の遺伝子は同じプラスミドに同時に保持させるか、また
は違うプラスミドに個々に保持させてもよい。また、遺
伝子の一方を染色体上に保持させ、他方をプラスミド上
に保持させてもよい。
【００４２】また、遺伝子発現の増強は、遺伝子の発現
制御配列を改変することによって達成することができ
る。遺伝子の発現制御配列の改変には、遺伝子固有のプ
ロモーターのような発現制御配列に、その発現が増強さ
れるように変異を導入すること、及び、本発明のＤＮＡ
を強力なプロモーターの制御下に置くことが含まれる。
例えば、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロ
モーター、ラムダファージのPLプロモーターは、強力な
プロモーターとして知られている。プロモーターの使用
は、遺伝子コピーの増幅と組み合わせることができる。
制御配列を改変することによって達成することができ
る。遺伝子の発現制御配列の改変には、遺伝子固有のプ
ロモーターのような発現制御配列に、その発現が増強さ
れるように変異を導入すること、及び、本発明のＤＮＡ
を強力なプロモーターの制御下に置くことが含まれる。
例えば、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロ
モーター、ラムダファージのPLプロモーターは、強力な
プロモーターとして知られている。プロモーターの使用
は、遺伝子コピーの増幅と組み合わせることができる。
【００４３】本発明の細菌は、Ｌ−アミノ酸生産能を元
々有する細菌へ前記ＤＮＡを導入することによって得る
ことができる。あるいは、本発明の細菌は、前記ＤＮＡ
を既に保持する細菌に、Ｌ−アミノ酸生産能を付与する
ことによっても得ることができる。本発明のタンパク質
の活性を増強させる親株として、エシェリヒア属に属す
るＬ−スレオニン生産菌としては、例えば、VL2054（VK
PM B-8067）、VNIIGenetika 472T23（米国特許5,631,15
7）、VKPM B-3996（米国特許5,175,107および5,976,84
3）、KCCM-10132（WO 009660A1）、KCCM-10133（WO 009
661A1）等が使用できる。また、本発明のタンパク質の
活性を増強させる親株として、エシェリヒア属に属する
Ｌ−バリン生産菌としては、例えば、H-81（VKPM B-806
6）、NRRLB-12287およびNRRL B-12288(米国特許4,391,9
07）、VKPM B-4411（米国特許5,658,766）、VKPM B-770
7（欧州特許出願1016710A2）等が使用できる。
々有する細菌へ前記ＤＮＡを導入することによって得る
ことができる。あるいは、本発明の細菌は、前記ＤＮＡ
を既に保持する細菌に、Ｌ−アミノ酸生産能を付与する
ことによっても得ることができる。本発明のタンパク質
の活性を増強させる親株として、エシェリヒア属に属す
るＬ−スレオニン生産菌としては、例えば、VL2054（VK
PM B-8067）、VNIIGenetika 472T23（米国特許5,631,15
7）、VKPM B-3996（米国特許5,175,107および5,976,84
3）、KCCM-10132（WO 009660A1）、KCCM-10133（WO 009
661A1）等が使用できる。また、本発明のタンパク質の
活性を増強させる親株として、エシェリヒア属に属する
Ｌ−バリン生産菌としては、例えば、H-81（VKPM B-806
6）、NRRLB-12287およびNRRL B-12288(米国特許4,391,9
07）、VKPM B-4411（米国特許5,658,766）、VKPM B-770
7（欧州特許出願1016710A2）等が使用できる。
【００４４】また、本発明のタンパク質の活性を増強さ
せる親株として、エシェリヒア属に属するＬ−プロリン
生産菌としては、例えば、NRRL B-12403、およびNRRL B
-12404（英国特許2075056）、VKPM B-8012（ロシア特許
出願2000124295）、ドイツ特許3127361に記載のプラス
ミド変異株、Bloom F.R.等の文献（The 15th Miami win
ter symposium, 1983, p.34）に記載のプラスミド変異
株等が使用できる。また、本発明のタンパク質の活性を
増強させる親株として、エシェリヒア属に属するＬ−ロ
イシン生産菌としては、例えば、H-9070（FERM BP-470
4）およびH-9072（FERM BP-4706）（米国特許574433
1）、VKPM B-7386およびVKPM B-7388（ロシア特許21404
50）、W1485atpA401/pMWdAR6、W1485lip2/pMWdAR6およ
びAJ12631/pMWdAR6（欧州特許0872547）等が使用でき
る。また、本発明のタンパク質の活性を増強させる親株
として、エシェリヒア属に属するＬ−アルギニン生産菌
としては、例えば、AJ11539（NRRL B-12399）、AJ11540
（NRRL B-12400）、AJ11541（NRRLB-12401）およびAJ11
542（NRRL B-12402）（英国特許2075055）等が使用でき
る。
せる親株として、エシェリヒア属に属するＬ−プロリン
生産菌としては、例えば、NRRL B-12403、およびNRRL B
-12404（英国特許2075056）、VKPM B-8012（ロシア特許
出願2000124295）、ドイツ特許3127361に記載のプラス
ミド変異株、Bloom F.R.等の文献（The 15th Miami win
ter symposium, 1983, p.34）に記載のプラスミド変異
株等が使用できる。また、本発明のタンパク質の活性を
増強させる親株として、エシェリヒア属に属するＬ−ロ
イシン生産菌としては、例えば、H-9070（FERM BP-470
4）およびH-9072（FERM BP-4706）（米国特許574433
1）、VKPM B-7386およびVKPM B-7388（ロシア特許21404
50）、W1485atpA401/pMWdAR6、W1485lip2/pMWdAR6およ
びAJ12631/pMWdAR6（欧州特許0872547）等が使用でき
る。また、本発明のタンパク質の活性を増強させる親株
として、エシェリヒア属に属するＬ−アルギニン生産菌
としては、例えば、AJ11539（NRRL B-12399）、AJ11540
（NRRL B-12400）、AJ11541（NRRLB-12401）およびAJ11
542（NRRL B-12402）（英国特許2075055）等が使用でき
る。
【００４５】また、本発明のタンパク質の活性を増強さ
せる親株として、エシェリヒア属に属するＬ−メチオニ
ン生産菌としては、例えば、AJ11531およびAFJ11538
（特開昭56-106598）、AJ11593（FERM P-5616）およびA
J11594（FERM P-5617）（特開昭57-5693）等が使用でき
る。
せる親株として、エシェリヒア属に属するＬ−メチオニ
ン生産菌としては、例えば、AJ11531およびAFJ11538
（特開昭56-106598）、AJ11593（FERM P-5616）およびA
J11594（FERM P-5617）（特開昭57-5693）等が使用でき
る。
【００４６】本発明の細菌は、Ｌ−アミノ酸の生合成に
関与する１またはそれ以上の発現が増強された遺伝子を
有することができる。このような遺伝子として、Ｌ−ス
レオニン生産菌については、好ましくは、Ｌ−スレオニ
ンによるフィードバック阻害が解除されたアスパラギン
酸キナーゼ−ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする
遺伝子を含むスレオニンオペロン（特開平1-29559）が
挙げられる。前記遺伝子としては、Ｌ−バリン生産菌に
ついては、ilvオペロン、好ましくは、アテニュエーシ
ョンが抑制されたスレオニンデアミナーゼを発現しない
ilvGMEDAオペロン（特願平8-477397）が挙げられる。ま
た、Ｌ−プロリンの生合成に関与する遺伝子として、Ｌ
−プロリン生産菌については、Ｌ−プロリンによるフィ
ードバック阻害が解除されたグルタミン酸キナーゼをコ
ードするproB遺伝子（ドイツ特許312736）が好ましく挙
げられる。また、前記遺伝子として、Ｌ−ロイシン生産
菌については、好ましくは、Ｌ−ロイシンによるフィー
ドバック阻害が解除されたイソプロピルマレイン酸シン
ターゼをコードする遺伝子を含むロイシンオペロン、す
なわち、leuオペロン（ロシア特許出願99114325）が挙
げられる。また、前記遺伝子として、Ｌ−メチオニン生
産菌については、メチオニンレギュロンが挙げられる。
メチオニンレギュロンは、アミノ酸の生合成を抑制する
活性が低減したタンパク質をコードする変異遺伝子を含
んでいてもよい。また、前記遺伝子として、メチオニン
生合成における抑制活性が低減した、エシェリヒア・コ
リ由来のＬ−メチオニン生合成に関与するリプレッサー
タンパク質をコードする変異型metJ遺伝子（特開2000-1
57267）が挙げられる。さらに、前記遺伝子として、ア
ルギニンレギュロン、好ましくはＬ−アルギニンによる
フィードバック阻害が解除されたＮ−アセチルグルタミ
ン酸シンターゼをコードする遺伝子を含むアルギニンレ
ギュロン（Rajagopal B.S. et al, Appl. Environ. Mic
robiol., 1998, v.64, No.5, p.1805-1811）が挙げられ
る。
関与する１またはそれ以上の発現が増強された遺伝子を
有することができる。このような遺伝子として、Ｌ−ス
レオニン生産菌については、好ましくは、Ｌ−スレオニ
ンによるフィードバック阻害が解除されたアスパラギン
酸キナーゼ−ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする
遺伝子を含むスレオニンオペロン（特開平1-29559）が
挙げられる。前記遺伝子としては、Ｌ−バリン生産菌に
ついては、ilvオペロン、好ましくは、アテニュエーシ
ョンが抑制されたスレオニンデアミナーゼを発現しない
ilvGMEDAオペロン（特願平8-477397）が挙げられる。ま
た、Ｌ−プロリンの生合成に関与する遺伝子として、Ｌ
−プロリン生産菌については、Ｌ−プロリンによるフィ
ードバック阻害が解除されたグルタミン酸キナーゼをコ
ードするproB遺伝子（ドイツ特許312736）が好ましく挙
げられる。また、前記遺伝子として、Ｌ−ロイシン生産
菌については、好ましくは、Ｌ−ロイシンによるフィー
ドバック阻害が解除されたイソプロピルマレイン酸シン
ターゼをコードする遺伝子を含むロイシンオペロン、す
なわち、leuオペロン（ロシア特許出願99114325）が挙
げられる。また、前記遺伝子として、Ｌ−メチオニン生
産菌については、メチオニンレギュロンが挙げられる。
メチオニンレギュロンは、アミノ酸の生合成を抑制する
活性が低減したタンパク質をコードする変異遺伝子を含
んでいてもよい。また、前記遺伝子として、メチオニン
生合成における抑制活性が低減した、エシェリヒア・コ
リ由来のＬ−メチオニン生合成に関与するリプレッサー
タンパク質をコードする変異型metJ遺伝子（特開2000-1
57267）が挙げられる。さらに、前記遺伝子として、ア
ルギニンレギュロン、好ましくはＬ−アルギニンによる
フィードバック阻害が解除されたＮ−アセチルグルタミ
ン酸シンターゼをコードする遺伝子を含むアルギニンレ
ギュロン（Rajagopal B.S. et al, Appl. Environ. Mic
robiol., 1998, v.64, No.5, p.1805-1811）が挙げられ
る。
【００４７】本発明の方法は、第一の本発明の細菌を培
地に培養し、Ｌ−スレオニンを培地中に生成、蓄積させ
るステップと、該培地からＬ−スレオニンを採取するス
テップを含むＬ−スレオニンの製造法を含む。また、本
発明の方法は、本発明の細菌を培地に培養し、Ｌ−バリ
ンを培地中に生成、蓄積させるステップと、該培地から
Ｌ−バリンを採取するステップを含むＬ−バリンの製造
法を含む。また、本発明の方法は、第一の本発明の細菌
を培地に培養し、Ｌ−プロリンを培地中に生成、蓄積さ
せるステップと、該培地からＬ−プロリンを採取するス
テップを含むＬ−プロリンの製造法を含む。また、本発
明の方法は、本発明の細菌を培地に培養し、Ｌ−ロイシ
ンを培地中に生成、蓄積させるステップと、該培地から
Ｌ−ロイシンを採取するステップを含むＬ−ロイシンの
製造法を含む。また、本発明の方法は、本発明の細菌を
培地に培養し、Ｌ−メチオニンを培地中に生成、蓄積さ
せるステップと、該培地からＬ−メチオニンを採取する
ステップを含むＬ−メチオニンの製造法を含む。
地に培養し、Ｌ−スレオニンを培地中に生成、蓄積させ
るステップと、該培地からＬ−スレオニンを採取するス
テップを含むＬ−スレオニンの製造法を含む。また、本
発明の方法は、本発明の細菌を培地に培養し、Ｌ−バリ
ンを培地中に生成、蓄積させるステップと、該培地から
Ｌ−バリンを採取するステップを含むＬ−バリンの製造
法を含む。また、本発明の方法は、第一の本発明の細菌
を培地に培養し、Ｌ−プロリンを培地中に生成、蓄積さ
せるステップと、該培地からＬ−プロリンを採取するス
テップを含むＬ−プロリンの製造法を含む。また、本発
明の方法は、本発明の細菌を培地に培養し、Ｌ−ロイシ
ンを培地中に生成、蓄積させるステップと、該培地から
Ｌ−ロイシンを採取するステップを含むＬ−ロイシンの
製造法を含む。また、本発明の方法は、本発明の細菌を
培地に培養し、Ｌ−メチオニンを培地中に生成、蓄積さ
せるステップと、該培地からＬ−メチオニンを採取する
ステップを含むＬ−メチオニンの製造法を含む。
【００４８】また、本発明の方法は、第二の本発明の細
菌を培地に培養し、Ｌ−スレオニンを培地中に生成、蓄
積させるステップと、該培地からＬ−スレオニンを採取
するステップを含むＬ−スレオニンの製造法を含む。ま
た、本発明の方法は、本発明の細菌を培地に培養し、Ｌ
−バリンを培地中に生成、蓄積させるステップと、該培
地からＬ−バリンを採取するステップを含むＬ−バリン
の製造法を含む。
菌を培地に培養し、Ｌ−スレオニンを培地中に生成、蓄
積させるステップと、該培地からＬ−スレオニンを採取
するステップを含むＬ−スレオニンの製造法を含む。ま
た、本発明の方法は、本発明の細菌を培地に培養し、Ｌ
−バリンを培地中に生成、蓄積させるステップと、該培
地からＬ−バリンを採取するステップを含むＬ−バリン
の製造法を含む。
【００４９】さらに、本発明の方法は、第三の本発明の
細菌を培地に培養し、Ｌ−アルギニンを培地中に生成、
蓄積させるステップと、該培地からＬ−アルギニンを採
取するステップを含むＬ−アルギニンの製造法を含む。
また、本発明の方法は、本発明の細菌を培地に培養し、
Ｌ−プロリンを培地中に生成、蓄積させるステップと、
該培地からＬ−プロリンを採取するステップを含むＬ−
プロリンの製造法を含む。
細菌を培地に培養し、Ｌ−アルギニンを培地中に生成、
蓄積させるステップと、該培地からＬ−アルギニンを採
取するステップを含むＬ−アルギニンの製造法を含む。
また、本発明の方法は、本発明の細菌を培地に培養し、
Ｌ−プロリンを培地中に生成、蓄積させるステップと、
該培地からＬ−プロリンを採取するステップを含むＬ−
プロリンの製造法を含む。
【００５０】本発明における細菌の培養および培養液か
らのＬ−アミノ酸の採取、精製等は、従来の微生物を用
いた発酵法によるアミノ酸の製造法と同様にして行えば
よい。培養に使用する培地としては、炭素源、窒素源、
無機物を含有し、必要があれば使用微生物が生育に要求
する栄養素を適当量含有するものであれば、合成培地で
も天然培地でもよい。炭素源としては、グルコースやシ
ュークロースをはじめとする各種炭水化物、各種有機酸
が挙げられる。また使用する微生物の資化性によっては
エタノールやグリセロール等のアルコールを用いること
ができる。窒素源としては、アンモニアや硫酸アンモニ
ウム等の各種アンモニウム塩類や、アミン類その他の窒
素化合物や、ペプトン、大豆加水分解物、発酵菌体分解
物等の天然窒素源を用いることができる。無機物として
は、リン酸一カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリ
ウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化カルシウム等が
用いられる。
らのＬ−アミノ酸の採取、精製等は、従来の微生物を用
いた発酵法によるアミノ酸の製造法と同様にして行えば
よい。培養に使用する培地としては、炭素源、窒素源、
無機物を含有し、必要があれば使用微生物が生育に要求
する栄養素を適当量含有するものであれば、合成培地で
も天然培地でもよい。炭素源としては、グルコースやシ
ュークロースをはじめとする各種炭水化物、各種有機酸
が挙げられる。また使用する微生物の資化性によっては
エタノールやグリセロール等のアルコールを用いること
ができる。窒素源としては、アンモニアや硫酸アンモニ
ウム等の各種アンモニウム塩類や、アミン類その他の窒
素化合物や、ペプトン、大豆加水分解物、発酵菌体分解
物等の天然窒素源を用いることができる。無機物として
は、リン酸一カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリ
ウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化カルシウム等が
用いられる。
【００５１】培養は、振盪培養、通気撹拌培養等の好気
条件下で行うことが好ましく、培養温度は20〜40℃で、
好ましくは30〜38℃の範囲で行う。培養のpHは、通常は
5〜9の範囲であり、6.5〜7.2の範囲が好ましい。培養の
pHは、アンモニア、炭酸カルシウム、各種酸、各種塩基
および緩衝液などによって調整することができる。通
常、1〜5日の培養により液体培地中へ目的のＬ−アミノ
酸が蓄積する。
条件下で行うことが好ましく、培養温度は20〜40℃で、
好ましくは30〜38℃の範囲で行う。培養のpHは、通常は
5〜9の範囲であり、6.5〜7.2の範囲が好ましい。培養の
pHは、アンモニア、炭酸カルシウム、各種酸、各種塩基
および緩衝液などによって調整することができる。通
常、1〜5日の培養により液体培地中へ目的のＬ−アミノ
酸が蓄積する。
【００５２】培養終了後、培養液から菌体などの固形物
を、遠心分離や膜分離法で除去し、イオン交換法、濃縮
法、晶析法によって目的のＬ−アミノ酸を採収、精製す
ることができる。
を、遠心分離や膜分離法で除去し、イオン交換法、濃縮
法、晶析法によって目的のＬ−アミノ酸を採収、精製す
ることができる。
【００５３】
【実施例】本発明は以下の実施例を用いてさらに詳細に
説明される。実施例中アミノ酸は特に記載のない限りＬ
−型である。
説明される。実施例中アミノ酸は特に記載のない限りＬ
−型である。
【００５４】
【実施例１】プラスミドpΔlacZへのb2682、b2683、b12
42、又はb3434遺伝子のクローニング b2682およびb2683遺伝子のクローニングには、pΔlacZ
ベクターを用いた。pΔlacZベクターは、pET-22b(+)ベ
クター（Novagen, Madison, WI, USA）の誘導体であ
る。pET-22b(+)は、BglIIおよびXbaIで処理し、同じ酵
素で処理したPlacUV5プロモーターを保持するプラスミ
ドpMB9-lac（Fuller F., Gene, 19, 43-54, 1982）のポ
リメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）による増幅
断片と連結した。配列番号７および８に記載の配列を有
するプライマーを用いて、PlacUV5プロモーター断片を
増幅した。得られたプラスミドに、pJEL250プラスミド
（Dymakova E. et al, Genetika(rus), 35, 2, 181-18
6, 1999）のSalI-BamHI断片をクローニングすることに
より、lacZ遺伝子の構造部分（プロモーターを含まない
237bp）を追加した。pΔlacZベクターの取得手順を、図
１に示す。
42、又はb3434遺伝子のクローニング b2682およびb2683遺伝子のクローニングには、pΔlacZ
ベクターを用いた。pΔlacZベクターは、pET-22b(+)ベ
クター（Novagen, Madison, WI, USA）の誘導体であ
る。pET-22b(+)は、BglIIおよびXbaIで処理し、同じ酵
素で処理したPlacUV5プロモーターを保持するプラスミ
ドpMB9-lac（Fuller F., Gene, 19, 43-54, 1982）のポ
リメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）による増幅
断片と連結した。配列番号７および８に記載の配列を有
するプライマーを用いて、PlacUV5プロモーター断片を
増幅した。得られたプラスミドに、pJEL250プラスミド
（Dymakova E. et al, Genetika(rus), 35, 2, 181-18
6, 1999）のSalI-BamHI断片をクローニングすることに
より、lacZ遺伝子の構造部分（プロモーターを含まない
237bp）を追加した。pΔlacZベクターの取得手順を、図
１に示す。
【００５５】エシェリヒア・コリTG1株のＤＮＡを鋳型
として用いて得られたＰＣＲ断片を出発材料として、エ
シェリヒア・コリのb2682およびb2683の推定上のリーデ
ィングフレーム（b2682およびb2683遺伝子）をクローニ
ングした。この断片の合成には、配列番号１および２記
載の配列を有する２つのプライマーを用いた。ＰＣＲ
は、“Perkin Elmer GeneAmp PCR System 2400”で以下
の条件；95℃ 40秒、47℃ 40秒、72℃ 40秒、30サイ
クルで行った。このようにして、1158bpのb2682およびb
2683遺伝子を含む直鎖ＤＮＡ断片が得られた。このＰＣ
Ｒ断片を制限酵素XbaIおよびBamHIで処理し、事前に同
じ制限酵素で処理したpΔlacZマルチコピーベクターに
挿入した。
として用いて得られたＰＣＲ断片を出発材料として、エ
シェリヒア・コリのb2682およびb2683の推定上のリーデ
ィングフレーム（b2682およびb2683遺伝子）をクローニ
ングした。この断片の合成には、配列番号１および２記
載の配列を有する２つのプライマーを用いた。ＰＣＲ
は、“Perkin Elmer GeneAmp PCR System 2400”で以下
の条件；95℃ 40秒、47℃ 40秒、72℃ 40秒、30サイ
クルで行った。このようにして、1158bpのb2682およびb
2683遺伝子を含む直鎖ＤＮＡ断片が得られた。このＰＣ
Ｒ断片を制限酵素XbaIおよびBamHIで処理し、事前に同
じ制限酵素で処理したpΔlacZマルチコピーベクターに
挿入した。
【００５６】得られたＰＣＲ断片を有するプラスミド
は、pYGAZHと名付けた。このプラスミドは、ラクトース
プロモーター（PlacUV5）の制御下にb2682およびb2683
両遺伝子を有する。
は、pYGAZHと名付けた。このプラスミドは、ラクトース
プロモーター（PlacUV5）の制御下にb2682およびb2683
両遺伝子を有する。
【００５７】同様にして、エシェリヒア・コリTG1株の
ＤＮＡを鋳型として用いて得られたＰＣＲ断片を出発材
料として、エシェリヒア・コリのb1242の推定上のリー
ディングフレーム（b1242遺伝子）をクローニングし
た。この断片の合成には、配列番号９および１０記載の
配列を有する２つのプライマーを用いた。得られたＰＣ
Ｒ断片を有するプラスミドは、pYCHEと名付けた。この
プラスミドは、ラクトースプロモーター（PlacUV5）の
制御下にb1242遺伝子を有する。また、エシェリヒア・
コリTG1株のＤＮＡを鋳型として用いて得られたＰＣＲ
断片を出発材料として、エシェリヒア・コリのb3434の
推定上のリーディングフレーム（b3434遺伝子）をクロ
ーニングした。この断片の合成には、配列番号１３およ
び１４記載の配列を有する２つのプライマーを用いた。
得られたＰＣＲ断片を有するプラスミドは、pYHGNと名
付けた。このプラスミドは、ラクトースプロモーター
（PlacUV5）の制御下にb3434遺伝子を有する。
ＤＮＡを鋳型として用いて得られたＰＣＲ断片を出発材
料として、エシェリヒア・コリのb1242の推定上のリー
ディングフレーム（b1242遺伝子）をクローニングし
た。この断片の合成には、配列番号９および１０記載の
配列を有する２つのプライマーを用いた。得られたＰＣ
Ｒ断片を有するプラスミドは、pYCHEと名付けた。この
プラスミドは、ラクトースプロモーター（PlacUV5）の
制御下にb1242遺伝子を有する。また、エシェリヒア・
コリTG1株のＤＮＡを鋳型として用いて得られたＰＣＲ
断片を出発材料として、エシェリヒア・コリのb3434の
推定上のリーディングフレーム（b3434遺伝子）をクロ
ーニングした。この断片の合成には、配列番号１３およ
び１４記載の配列を有する２つのプライマーを用いた。
得られたＰＣＲ断片を有するプラスミドは、pYHGNと名
付けた。このプラスミドは、ラクトースプロモーター
（PlacUV5）の制御下にb3434遺伝子を有する。
【００５８】
【実施例２】エシェリヒア・コリTG1株のアミノ酸およ
びそのアナログに対する耐性における増幅されたb268
2、b2683、b1242、及びb3434遺伝子の効果 エシェリヒア・コリTG1（pYGAZH）株、TG1（pYCHE）
株、TG1（pYHGN）株および挿入断片を含まないベクター
を有するTG1株（コントロール株）を、アンピシリン（1
00μg/ml）を添加したＬＢ培地中で一晩培養した。全て
の菌株を一晩培養したものは、アンピシリン（100μg/m
l）およびIPTG（0.5mM）を添加した新鮮なＬＢ培地で25
倍に希釈し、37℃、通気下で２時間培養した。対数増殖
期培養物は、0.9%塩化ナトリウム溶液で希釈し、約1000
個の細胞を、アンピシリン（100μg/ml）、IPTG（0.5m
M）およびアミノ酸またはそのアナログを含む固体アダ
ムス培地プレートに接種した。37℃で2〜4日間の培養
後、ハイブリッドプラスミドを有するTG1株とコントロ
ールのTG1株との間のコロニーの大きさ、およびコロニ
ー数についての差違を記録した。実験結果を表１に示
す。
びそのアナログに対する耐性における増幅されたb268
2、b2683、b1242、及びb3434遺伝子の効果 エシェリヒア・コリTG1（pYGAZH）株、TG1（pYCHE）
株、TG1（pYHGN）株および挿入断片を含まないベクター
を有するTG1株（コントロール株）を、アンピシリン（1
00μg/ml）を添加したＬＢ培地中で一晩培養した。全て
の菌株を一晩培養したものは、アンピシリン（100μg/m
l）およびIPTG（0.5mM）を添加した新鮮なＬＢ培地で25
倍に希釈し、37℃、通気下で２時間培養した。対数増殖
期培養物は、0.9%塩化ナトリウム溶液で希釈し、約1000
個の細胞を、アンピシリン（100μg/ml）、IPTG（0.5m
M）およびアミノ酸またはそのアナログを含む固体アダ
ムス培地プレートに接種した。37℃で2〜4日間の培養
後、ハイブリッドプラスミドを有するTG1株とコントロ
ールのTG1株との間のコロニーの大きさ、およびコロニ
ー数についての差違を記録した。実験結果を表１に示
す。
【００５９】
【表１】
【００６０】
【実施例３】プラスミドpYGAZHを保持する菌株によるス
レオニンの製造 スレオニン生産菌であるVL2054を、PlacUV5プロモータ
ーの制御下にb2682およびb2683両遺伝子を含むpYGAZHで
形質転換した。得られた菌株は、VL2054（pYGAZH）と名
付けた。VL2054株は、VKPM B-3996株の誘導体であり、
その染色体上に、(a)PRプロモーターの制御下に組み込
まれたスレオニンオペロン、(b)野生型rhtA遺伝子、(c)
Tn5中の不活性化トランスヒドロゲナーゼをコードする
染色体上の遺伝子（tdh遺伝子）および不活性化カナマ
イシン耐性遺伝子（kan遺伝子）（tdh::Tn5，KanS）、
(d)変異型ilvA442、を、保持している。
レオニンの製造 スレオニン生産菌であるVL2054を、PlacUV5プロモータ
ーの制御下にb2682およびb2683両遺伝子を含むpYGAZHで
形質転換した。得られた菌株は、VL2054（pYGAZH）と名
付けた。VL2054株は、VKPM B-3996株の誘導体であり、
その染色体上に、(a)PRプロモーターの制御下に組み込
まれたスレオニンオペロン、(b)野生型rhtA遺伝子、(c)
Tn5中の不活性化トランスヒドロゲナーゼをコードする
染色体上の遺伝子（tdh遺伝子）および不活性化カナマ
イシン耐性遺伝子（kan遺伝子）（tdh::Tn5，KanS）、
(d)変異型ilvA442、を、保持している。
【００６１】VL2054株は、ルシアン・ナショナル・コレ
クション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニ
ズム（Russian National Collection of Industrial Mi
croorganisms）（住所：1, Dorozhny Proezd., 1, 1135
45, Moscow, Russia）(VKPM)に、2001年1月30日にVKPM
B-8067の寄託番号で寄託され、2002年2月1日にブダペ
スト条約に基づく国際寄託に移管されている。VL2054
株、挿入断片を含まないプラスミドを有するコントロー
ル株としてのVL2054（pΔlacZ）株およびVL2054(pYGAZ
H)株からそれぞれ５つのコロニーを、20mlの試験管中の
2mlの最小培地（（NH4)2SO4 11g/l ; NaCl 0.4g/l ; Mg
SO4 0.4g/l ; K2HPO4 1g/l ; FeSO4 10mg/l ; MnSO4 10
mg/l ; チアミン 0.1mg/l ; イーストエキストラクト
0.5g/l ; グルコース 40g/l ; アンピシリン 300mg/l
（必要な場合））に懸濁し、32℃、通気下で一晩培養し
た。一晩培養した培養物は、IPTGを含むか、又は含まな
い新鮮な発酵培地2mlを入れた３つの20ml試験管に、0.2
mlずつ移し、32℃で45または70時間、ロータリーシェー
カーで培養した。
クション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニ
ズム（Russian National Collection of Industrial Mi
croorganisms）（住所：1, Dorozhny Proezd., 1, 1135
45, Moscow, Russia）(VKPM)に、2001年1月30日にVKPM
B-8067の寄託番号で寄託され、2002年2月1日にブダペ
スト条約に基づく国際寄託に移管されている。VL2054
株、挿入断片を含まないプラスミドを有するコントロー
ル株としてのVL2054（pΔlacZ）株およびVL2054(pYGAZ
H)株からそれぞれ５つのコロニーを、20mlの試験管中の
2mlの最小培地（（NH4)2SO4 11g/l ; NaCl 0.4g/l ; Mg
SO4 0.4g/l ; K2HPO4 1g/l ; FeSO4 10mg/l ; MnSO4 10
mg/l ; チアミン 0.1mg/l ; イーストエキストラクト
0.5g/l ; グルコース 40g/l ; アンピシリン 300mg/l
（必要な場合））に懸濁し、32℃、通気下で一晩培養し
た。一晩培養した培養物は、IPTGを含むか、又は含まな
い新鮮な発酵培地2mlを入れた３つの20ml試験管に、0.2
mlずつ移し、32℃で45または70時間、ロータリーシェー
カーで培養した。
【００６２】発酵培地の組成 (NH4)2SO4 22 g/l NaCl 0.8 g/l MgSO4 0.8 g/l K2HPO4 2 g/l FeSO4 20 mg/l MnSO4 20 mg/l チアミン 0.2 mg/l イーストエキストラクト 1 g/l CaCO3 30 g/l グルコース 80 g/l アンピシリン 300 mg/l（必要な場合） IPTG 0.5 mM（必要な場合）
【００６３】培養終了後、プラスミドの安定性と540nm
における培地の吸光度を従来法で決定した。培地中のス
レオニンの蓄積量は、薄層クロマトグラフィー(TLC)に
より決定した。TLC用の液層の組成は以下の通りである
: イソプロパノール 50ml、アセトン 50ml、NH4OH(30
%) 12ml、H2O 8ml。結果を、表２に示す。ハイブリッド
プラスミドpYGAZHが、スレオニン生産菌株であるVL2054
のスレオニンの蓄積を改良したことが分かる。
における培地の吸光度を従来法で決定した。培地中のス
レオニンの蓄積量は、薄層クロマトグラフィー(TLC)に
より決定した。TLC用の液層の組成は以下の通りである
: イソプロパノール 50ml、アセトン 50ml、NH4OH(30
%) 12ml、H2O 8ml。結果を、表２に示す。ハイブリッド
プラスミドpYGAZHが、スレオニン生産菌株であるVL2054
のスレオニンの蓄積を改良したことが分かる。
【００６４】
【表２】
【００６５】
【実施例４】プラスミドpYGAZHを保持する菌株によるバ
リンの製造 バリン生産株であるH-81は、PlacUV5プロモーターの制
御下にb2682およびb2683両遺伝子を有するプラスミドpY
GAZHで形質転換した。H-81株は、ルシアン・ナショナル
・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオ
ーガニズム（Russian National Collection of Industr
ial Microorganisms (VKPM)（住所：1,Dorozhny Proez
d., 1, 113545, Moscow, Russia）に、2001年1月31日に
VKPM B-8066の寄託番号で寄託され、2002年2月1日にブ
ダペスト条約に基づく国際寄託に移管されている。
リンの製造 バリン生産株であるH-81は、PlacUV5プロモーターの制
御下にb2682およびb2683両遺伝子を有するプラスミドpY
GAZHで形質転換した。H-81株は、ルシアン・ナショナル
・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオ
ーガニズム（Russian National Collection of Industr
ial Microorganisms (VKPM)（住所：1,Dorozhny Proez
d., 1, 113545, Moscow, Russia）に、2001年1月31日に
VKPM B-8066の寄託番号で寄託され、2002年2月1日にブ
ダペスト条約に基づく国際寄託に移管されている。
【００６６】H-81株、挿入断片を含まないプラスミドを
有するコントロール株としてのH-81（pΔlacZ）株およ
びH-81(pYGAZH)株からそれぞれ５つのコロニーを、20ml
の試験管中の2mlの最小培地（（NH4)2SO4 18g/l ; K2HP
O4 1.8g/l ; MgSO4 1.2g/l ;チアミン 0.1mg/l ; イー
ストエキストラクト 0.5g/l ; グルコース 60g/l ;アン
ピシリン 300mg/l（必要な場合））に懸濁し、32℃、通
気下で一晩培養した。一晩培養した培養物は、IPTGを含
むか、又は含まない新鮮な発酵培地2mlを入れた３つの2
0ml試験管に0.2mlずつ移し、32℃で45または70時間、ロ
ータリーシェーカーで培養した。
有するコントロール株としてのH-81（pΔlacZ）株およ
びH-81(pYGAZH)株からそれぞれ５つのコロニーを、20ml
の試験管中の2mlの最小培地（（NH4)2SO4 18g/l ; K2HP
O4 1.8g/l ; MgSO4 1.2g/l ;チアミン 0.1mg/l ; イー
ストエキストラクト 0.5g/l ; グルコース 60g/l ;アン
ピシリン 300mg/l（必要な場合））に懸濁し、32℃、通
気下で一晩培養した。一晩培養した培養物は、IPTGを含
むか、又は含まない新鮮な発酵培地2mlを入れた３つの2
0ml試験管に0.2mlずつ移し、32℃で45または70時間、ロ
ータリーシェーカーで培養した。
【００６７】発酵培地の組成 (NH4)2SO4 18 g/l K2HPO4 1.8 g/l MgSO4 1.2 g/l CaCO3 20 g/l チアミン 0.1 mg/l グルコース 60 g/l アンピシリン 300 mg/l（必要な場合） IPTG 0.5 mM（必要な場合）
【００６８】培養終了後、プラスミドの安定性と540nm
における培地の吸光度を従来法で決定した。培地中のバ
リンの蓄積量は、TLCにより決定した。TLC用の液層の組
成は以下の通りである : イソプロパノール 80ml、酢酸
エチル 80ml、NH4OH(30%) 15ml、H2O 45ml。結果を、表
３に示す。ハイブリッドプラスミドpYGAZHが、バリン生
産菌株であるH-81株のバリンの蓄積を改良したことが分
かる。
における培地の吸光度を従来法で決定した。培地中のバ
リンの蓄積量は、TLCにより決定した。TLC用の液層の組
成は以下の通りである : イソプロパノール 80ml、酢酸
エチル 80ml、NH4OH(30%) 15ml、H2O 45ml。結果を、表
３に示す。ハイブリッドプラスミドpYGAZHが、バリン生
産菌株であるH-81株のバリンの蓄積を改良したことが分
かる。
【００６９】
【表３】
【００７０】
【参考例１】ilvA欠損Ｌ−プロリン生産株によるＬ−プ
ロリンの製造 野生型エシェリヒア・コリK12株（VKPM B-7）を、変異
剤Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン
（0.1mg/ml）で、３７℃で２０分間処理した後、洗浄
し、トリプトン 1.25 mg/ml、Ｌ−プロリン 10 mg/ml、
および２，３，５−トリフェニル塩化テトラゾリウム
0.05 mg/mlを添加したＭ９最小寒天培地上で培養した。
３７℃での培養３日目以降に出現したコロニーの多く
は、赤色であった。Ｌ−プロリンを酸化できないいくつ
かのコロニーが白色であった。このようなコロニーのう
ちの一つを親株として用い、プロリンアナログ（３，４
−デヒドロキシプロリンおよびアザチジン−２−カルボ
キシレート）に対して耐性の変異株を得た。Ｍ９寒天培
地に、プロリンアナログは、それぞれ、2 mg/mlの濃度
で加えた。
ロリンの製造 野生型エシェリヒア・コリK12株（VKPM B-7）を、変異
剤Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン
（0.1mg/ml）で、３７℃で２０分間処理した後、洗浄
し、トリプトン 1.25 mg/ml、Ｌ−プロリン 10 mg/ml、
および２，３，５−トリフェニル塩化テトラゾリウム
0.05 mg/mlを添加したＭ９最小寒天培地上で培養した。
３７℃での培養３日目以降に出現したコロニーの多く
は、赤色であった。Ｌ−プロリンを酸化できないいくつ
かのコロニーが白色であった。このようなコロニーのう
ちの一つを親株として用い、プロリンアナログ（３，４
−デヒドロキシプロリンおよびアザチジン−２−カルボ
キシレート）に対して耐性の変異株を得た。Ｍ９寒天培
地に、プロリンアナログは、それぞれ、2 mg/mlの濃度
で加えた。
【００７１】出現した変異株のうちのいくつかがＬ−プ
ロリンを生産した。最も優れたＬ−プロリン生産株であ
る702を、ilvA遺伝子がクロラムフェニコール（Cm）耐
性（Cmr）遺伝子の挿入により破壊されているTG1株の細
胞上で培養したＰ１バクテリオファージで処理した。得
られたCm耐性形質導入株のうちの一つである702ilvA
は、Ｌ−イソロイシン栄養要求株となり、Ｌ−イソロイ
シン原栄養株である親株702株と比べ、非常に効果的な
Ｌ−プロリン生産株となった（表４）。発酵培地の組成
は、以下のものを含む：グルコース 60g/l、硫酸アンモ
ニウム 25g/l、KH 2PO4 2 g/l、MgSO4 1 g/l、チアミン
0.1mg/l、Ｌ−イソロイシン 50mg/l、炭酸カルシウム 2
5g/l（pH 7.2）。グルコースと炭酸カルシウムは別々に
滅菌した。培地2 mlを試験管に入れ、試験する微生物を
一白金耳殖菌し、３７℃で２日間振とう下で培養した。
ロリンを生産した。最も優れたＬ−プロリン生産株であ
る702を、ilvA遺伝子がクロラムフェニコール（Cm）耐
性（Cmr）遺伝子の挿入により破壊されているTG1株の細
胞上で培養したＰ１バクテリオファージで処理した。得
られたCm耐性形質導入株のうちの一つである702ilvA
は、Ｌ−イソロイシン栄養要求株となり、Ｌ−イソロイ
シン原栄養株である親株702株と比べ、非常に効果的な
Ｌ−プロリン生産株となった（表４）。発酵培地の組成
は、以下のものを含む：グルコース 60g/l、硫酸アンモ
ニウム 25g/l、KH 2PO4 2 g/l、MgSO4 1 g/l、チアミン
0.1mg/l、Ｌ−イソロイシン 50mg/l、炭酸カルシウム 2
5g/l（pH 7.2）。グルコースと炭酸カルシウムは別々に
滅菌した。培地2 mlを試験管に入れ、試験する微生物を
一白金耳殖菌し、３７℃で２日間振とう下で培養した。
【００７２】
【表４】
【００７３】702および702ilvA株は、ルシアン・ナショ
ナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイク
ロオーガニズム（Russian National Collection of Ind
ustrial Microorganisms）(VKPM) に、2000年7月25日に
VKPM B-8011およびVKPM B-8012の寄託番号でそれぞれ
寄託されている。
ナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイク
ロオーガニズム（Russian National Collection of Ind
ustrial Microorganisms）(VKPM) に、2000年7月25日に
VKPM B-8011およびVKPM B-8012の寄託番号でそれぞれ
寄託されている。
【００７４】
【実施例５】プラスミドpYGAZHを保持する菌株によるプ
ロリンの製造 プロリン生産菌であるエシェリヒア・コリ702ilvAを、P
lacUV5プロモーターの制御下にb2682およびb2683両遺伝
子を有するpYGAZHで形質転換した。
ロリンの製造 プロリン生産菌であるエシェリヒア・コリ702ilvAを、P
lacUV5プロモーターの制御下にb2682およびb2683両遺伝
子を有するpYGAZHで形質転換した。
【００７５】702ilvA株、挿入断片を含まないプラスミ
ドを有するコントロール株としての702ilvA（pΔlacZ）
株および702ilvA(pYGAZH)株からそれぞれ５つのコロニ
ーを、20mlの試験管中の2mlの最小培地（（NH4)2SO4 18
g/l ; K2HPO4 1.8 g/l ; MgSO 4 1.2 g/l ; チアミン
0.1 mg/l ; イーストエキストラクト 0.5 g/l ; グルコ
ース 60 g/l ; イソロイシン 50 mg/l ; アンピシリン
300 mg/l（必要な場合））に懸濁し、32℃、通気下で一
晩培養した。一晩培養した培養物は、IPTGを含むか、又
は含まない新鮮な発酵培地2mlを入れた３つの20ml試験
管に0.2mlずつ移し、32℃で40時間、ロータリーシェー
カーで培養した。
ドを有するコントロール株としての702ilvA（pΔlacZ）
株および702ilvA(pYGAZH)株からそれぞれ５つのコロニ
ーを、20mlの試験管中の2mlの最小培地（（NH4)2SO4 18
g/l ; K2HPO4 1.8 g/l ; MgSO 4 1.2 g/l ; チアミン
0.1 mg/l ; イーストエキストラクト 0.5 g/l ; グルコ
ース 60 g/l ; イソロイシン 50 mg/l ; アンピシリン
300 mg/l（必要な場合））に懸濁し、32℃、通気下で一
晩培養した。一晩培養した培養物は、IPTGを含むか、又
は含まない新鮮な発酵培地2mlを入れた３つの20ml試験
管に0.2mlずつ移し、32℃で40時間、ロータリーシェー
カーで培養した。
【００７６】（発酵培地の組成） (NH4)2SO4 18 g/l K2HPO4 1.8 g/l MgSO4 1.2 g/l CaCO3 20 g/l チアミン 0.1 mg/l グルコース 60 g/l イソロイシン 50 mg/l アンピシリン 300 mg/l（必要な場合） IPTG 0.5 mM （必要な場合）
【００７７】培養終了後、プラスミドの安定性と540nm
における培地の吸光度を従来法で決定した。培地中のプ
ロリンの蓄積量は、薄層クロマトグラフィー(TLC)によ
り決定した。TLC用の液層の組成は以下の通りである :
エタノール 80ml、NH4OH(30%) 5ml、H2O 25ml。結果
を、表５に示す。ハイブリッドプラスミドpYGAZHが、プ
ロリン生産菌株である702ilvAのプロリンの蓄積を改良
したことが分かる。
における培地の吸光度を従来法で決定した。培地中のプ
ロリンの蓄積量は、薄層クロマトグラフィー(TLC)によ
り決定した。TLC用の液層の組成は以下の通りである :
エタノール 80ml、NH4OH(30%) 5ml、H2O 25ml。結果
を、表５に示す。ハイブリッドプラスミドpYGAZHが、プ
ロリン生産菌株である702ilvAのプロリンの蓄積を改良
したことが分かる。
【００７８】
【表５】
【００７９】
【参考例２】ilvE欠損Ｌ−ロイシン生産株によるＬ−ロ
イシンの製造 野生型エシェリヒア・コリK12株（VKPM B-7）を、変異
剤Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン
（0.05 mg/ml）で、３７℃で２０分間処理した後、生理
食塩水で４回洗浄し、ＤＬ−４−アザロイシン 4 mg/ml
を添加したＭ９最小寒天培地上で、３７℃で５日間培養
した。プレート上に出現したコロニーを拾い、Ｌ−寒天
培地上にストリークして単離した。得られたＤＬ−４−
アザロイシンに対して耐性の変異株のうちの一つを用い
て、Ｌ−イソロイシンおよびＬ−バリン二重栄養要求性
の誘発を行った。Ｌ−イソロイシンおよびＬ−バリンを
生育に必要とする二重栄養要求性株が多数得られた。こ
のことにより、Ｌ−イソロイシンおよびＬ−バリン栄養
要求性は、ilvE遺伝子における変異により引き起こされ
たことが示された。得られた二重栄養要求株のうち、最
も優れたＬ−ロイシン生産株であり、Ｌ−ロイシンを1.
8 g/l生産する505株を選択した。発酵培地の組成は以下
のものを含む：グルコース 60g/l、硫酸アンモニウム 2
5g/l、KH2PO42 g/l、MgSO4 1 g/l、チアミン 0.1mg/l、
Ｌ−イソロイシン 100 mg/l、Ｌ−バリン 100 mg/l、炭
酸カルシウム 25g/l（pH 7.2）。グルコースと炭酸カル
シウムは別々に滅菌した。培地2 mlを試験管に入れ、試
験する微生物を一白金耳殖菌し、３７℃で２日間振とう
下で培養した。
イシンの製造 野生型エシェリヒア・コリK12株（VKPM B-7）を、変異
剤Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン
（0.05 mg/ml）で、３７℃で２０分間処理した後、生理
食塩水で４回洗浄し、ＤＬ−４−アザロイシン 4 mg/ml
を添加したＭ９最小寒天培地上で、３７℃で５日間培養
した。プレート上に出現したコロニーを拾い、Ｌ−寒天
培地上にストリークして単離した。得られたＤＬ−４−
アザロイシンに対して耐性の変異株のうちの一つを用い
て、Ｌ−イソロイシンおよびＬ−バリン二重栄養要求性
の誘発を行った。Ｌ−イソロイシンおよびＬ−バリンを
生育に必要とする二重栄養要求性株が多数得られた。こ
のことにより、Ｌ−イソロイシンおよびＬ−バリン栄養
要求性は、ilvE遺伝子における変異により引き起こされ
たことが示された。得られた二重栄養要求株のうち、最
も優れたＬ−ロイシン生産株であり、Ｌ−ロイシンを1.
8 g/l生産する505株を選択した。発酵培地の組成は以下
のものを含む：グルコース 60g/l、硫酸アンモニウム 2
5g/l、KH2PO42 g/l、MgSO4 1 g/l、チアミン 0.1mg/l、
Ｌ−イソロイシン 100 mg/l、Ｌ−バリン 100 mg/l、炭
酸カルシウム 25g/l（pH 7.2）。グルコースと炭酸カル
シウムは別々に滅菌した。培地2 mlを試験管に入れ、試
験する微生物を一白金耳殖菌し、３７℃で２日間振とう
下で培養した。
【００８０】エシェリヒア・コリ505株は、ルシアン・
ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・
マイクロオーガニズム（Russian National Collection
of Industrial Microorganisms）（住所：1, Dorozhny
Proezd., 1, 113545, Moscow, Russia）(VKPM) に、200
1年5月14日にVKPM B-8124の寄託番号で寄託され、2002
年2月1日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され
ている。
ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・
マイクロオーガニズム（Russian National Collection
of Industrial Microorganisms）（住所：1, Dorozhny
Proezd., 1, 113545, Moscow, Russia）(VKPM) に、200
1年5月14日にVKPM B-8124の寄託番号で寄託され、2002
年2月1日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され
ている。
【００８１】
【実施例６】プラスミドpYGAZHを保持する菌株によるロ
イシンの製造 ロイシン生産菌であるエシェリヒア・コリ505を、Plac
UV5プロモーターの制御下にb2682およびb2683両遺伝子
を有するpYGAZHで形質転換した。
イシンの製造 ロイシン生産菌であるエシェリヒア・コリ505を、Plac
UV5プロモーターの制御下にb2682およびb2683両遺伝子
を有するpYGAZHで形質転換した。
【００８２】505株、挿入断片を含まないプラスミドを
有するコントロール株としての505（pΔlacZ）株および
505(pYGAZH)株からそれぞれ20個コロニーを、を20mlの
試験管中のアンピシリンを含むか、又は含まないＬＢ培
地に白金耳で移し、32℃、通気下で一晩培養した。一晩
培養した培養物は、IPTGを含むか、又は含まない発酵培
地2mlを入れた20ml試験管に0.1mlずつ移し、32℃で72時
間、ロータリーシェーカーで培養した。
有するコントロール株としての505（pΔlacZ）株および
505(pYGAZH)株からそれぞれ20個コロニーを、を20mlの
試験管中のアンピシリンを含むか、又は含まないＬＢ培
地に白金耳で移し、32℃、通気下で一晩培養した。一晩
培養した培養物は、IPTGを含むか、又は含まない発酵培
地2mlを入れた20ml試験管に0.1mlずつ移し、32℃で72時
間、ロータリーシェーカーで培養した。
【００８３】（発酵培地の組成） (NH4)2SO4 15 g/l K2HPO4 1.5 g/l MgSO4・7H2O 1.0 g/l CaCO3 20 g/l (個別に滅菌) チアミン 0.1 mg/l グルコース 60 g/l (個別に滅菌) イソロイシン 0.3 g/l バリン 0.3 g/l アンピシリン 150 mg/l（必要な場合） IPTG 0.5 mM（必要な場合）
【００８４】培養終了後、プラスミドの安定性を従来法
で決定した。培地中のロイシンの蓄積量は、TLCにより
決定した。TLC用の液層の組成は以下の通りである : イ
ソプロパノール 80 ml、酢酸エチル 80 ml、NH4OH(30%)
25 ml、H2O 50 ml。結果を、表６に示す。ハイブリッ
ドプラスミドpYGAZHが、ロイシン生産菌株である505株
のロイシンの蓄積を改良したことが分かる。
で決定した。培地中のロイシンの蓄積量は、TLCにより
決定した。TLC用の液層の組成は以下の通りである : イ
ソプロパノール 80 ml、酢酸エチル 80 ml、NH4OH(30%)
25 ml、H2O 50 ml。結果を、表６に示す。ハイブリッ
ドプラスミドpYGAZHが、ロイシン生産菌株である505株
のロイシンの蓄積を改良したことが分かる。
【００８５】
【表６】
【００８６】
【参考例３】ノルロイシン耐性Ｌ−メチオニン生産株に
よるＬ−メチオニンの製造 プラスミドを持たないスレオニンおよびロイシン欠損株
であるエシェリヒア・コリC600株を親株として用いた。
まず、エシェリヒア・コリC600株のLeu+変異株は、エシ
ェリヒア・コリK-12株上で培養させたＰ１ファージの形
質導入により得られた。Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ
−ニトロソグアニジン（NTG）による処理の後、8 g/lの
Ｌ−ホモセリンに対して耐性の変異株である44株が得ら
れた。44株はＬ−スレオニン欠損性であり、高濃度のＬ
−スレオニンに耐性である。44株は、ルシアン・ナショ
ナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイク
ロオーガニズム（Russian National Collection of Ind
ustrial Microorganisms）(VKPM) に、VKPM B-2175の
寄託番号で寄託されている。
よるＬ−メチオニンの製造 プラスミドを持たないスレオニンおよびロイシン欠損株
であるエシェリヒア・コリC600株を親株として用いた。
まず、エシェリヒア・コリC600株のLeu+変異株は、エシ
ェリヒア・コリK-12株上で培養させたＰ１ファージの形
質導入により得られた。Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ
−ニトロソグアニジン（NTG）による処理の後、8 g/lの
Ｌ−ホモセリンに対して耐性の変異株である44株が得ら
れた。44株はＬ−スレオニン欠損性であり、高濃度のＬ
−スレオニンに耐性である。44株は、ルシアン・ナショ
ナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイク
ロオーガニズム（Russian National Collection of Ind
ustrial Microorganisms）(VKPM) に、VKPM B-2175の
寄託番号で寄託されている。
【００８７】メチオニンアナログであるノルロイシンに
耐性の変異株を、NTGを用いた変異誘発により44株から
誘発した。ＬＢ培地中で一晩培養して生育させた細菌の
培養物を遠心分離し、NTG 50mg/mlを含む生理食塩水
（0.9% NaCl）中に再懸濁した。３７℃で３０分間NTGに
曝した後、細菌を遠心分離し、生理食塩水で４回洗浄
し、スレオニン 0.5 mg/ml、およびノルロイシン 2.5 m
g/mlまたは5.0 mg/mlを含むM9最小培地上で培養した。
プレートを３７℃で５日間インキュベートした。プレー
ト上に出現したコロニーを拾い、Ｌ−寒天培地上にスト
リークして単離した。それらのうち最も優れたＬ−メチ
オニン生産株は218株であった。新規な218株の試験管培
養を３２℃で３日間振とう下で行った結果、約1 g/lの
Ｌ−メチオニンが培地中に蓄積された。発酵培地とし
て、4% グルコース、2.5% 硫酸アンモニウム、0.5 g/l
スレオニン、25 g/l 炭酸カルシウムを含むＭ９最小培
地を用いた。グルコースと炭酸カルシウムは別々に滅菌
した。
耐性の変異株を、NTGを用いた変異誘発により44株から
誘発した。ＬＢ培地中で一晩培養して生育させた細菌の
培養物を遠心分離し、NTG 50mg/mlを含む生理食塩水
（0.9% NaCl）中に再懸濁した。３７℃で３０分間NTGに
曝した後、細菌を遠心分離し、生理食塩水で４回洗浄
し、スレオニン 0.5 mg/ml、およびノルロイシン 2.5 m
g/mlまたは5.0 mg/mlを含むM9最小培地上で培養した。
プレートを３７℃で５日間インキュベートした。プレー
ト上に出現したコロニーを拾い、Ｌ−寒天培地上にスト
リークして単離した。それらのうち最も優れたＬ−メチ
オニン生産株は218株であった。新規な218株の試験管培
養を３２℃で３日間振とう下で行った結果、約1 g/lの
Ｌ−メチオニンが培地中に蓄積された。発酵培地とし
て、4% グルコース、2.5% 硫酸アンモニウム、0.5 g/l
スレオニン、25 g/l 炭酸カルシウムを含むＭ９最小培
地を用いた。グルコースと炭酸カルシウムは別々に滅菌
した。
【００８８】218株は、ルシアン・ナショナル・コレク
ション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズ
ム（Russian National Collection of Industrial Micr
oorganisms）(VKPM) に、2001年5月14日にVKPM B-8125
の寄託番号で寄託され、2002年2月1日にブダペスト条約
に基づく国際寄託に移管されている。
ション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズ
ム（Russian National Collection of Industrial Micr
oorganisms）(VKPM) に、2001年5月14日にVKPM B-8125
の寄託番号で寄託され、2002年2月1日にブダペスト条約
に基づく国際寄託に移管されている。
【００８９】さらに、218株のppc遺伝子をＰ１ファージ
を用いて欠失させ、続いて、バチルス・サブチリス由来
のpycA遺伝子を組込んだ（ロシア特許出願99121636）。
得られた218pycA株はノルロイシンに対する耐性を失っ
た。したがって、ノルロイシンに対する耐性は、上記記
載の様にして同株に再度付与された。得られた株のう
ち、最も優れたＬ−メチオニン生産株は、上記の条件下
で約1 g/lのＬ−メチオニンを生産するエシェリヒア・
コリ73株であった。
を用いて欠失させ、続いて、バチルス・サブチリス由来
のpycA遺伝子を組込んだ（ロシア特許出願99121636）。
得られた218pycA株はノルロイシンに対する耐性を失っ
た。したがって、ノルロイシンに対する耐性は、上記記
載の様にして同株に再度付与された。得られた株のう
ち、最も優れたＬ−メチオニン生産株は、上記の条件下
で約1 g/lのＬ−メチオニンを生産するエシェリヒア・
コリ73株であった。
【００９０】エシェリヒア・コリ73株は、ルシアン・ナ
ショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マ
イクロオーガニズム（Russian National Collection of
Industrial Microorganisms）（住所：1, Dorozhny Pr
oezd., 1, 113545, Moscow,Russia）(VKPM) に、2001年
5月14日にVKPM B-8126の寄託番号で寄託され、2002年2
月1日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管されて
いる。
ショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マ
イクロオーガニズム（Russian National Collection of
Industrial Microorganisms）（住所：1, Dorozhny Pr
oezd., 1, 113545, Moscow,Russia）(VKPM) に、2001年
5月14日にVKPM B-8126の寄託番号で寄託され、2002年2
月1日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管されて
いる。
【００９１】
【実施例７】プラスミドpYGAZHを保持する菌株によるメ
チオニンの製造 メチオニン生産菌であるエシェリヒア・コリ73株を、P
lac UV5プロモーターの制御下にb2682およびb2683両遺
伝子を有するpYGAZHで形質転換した。
チオニンの製造 メチオニン生産菌であるエシェリヒア・コリ73株を、P
lac UV5プロモーターの制御下にb2682およびb2683両遺
伝子を有するpYGAZHで形質転換した。
【００９２】73株、挿入断片を含まないプラスミドを有
するコントロール株としての73（pΔlacZ）株および73
(pYGAZH)株からそれぞれ５つのコロニーを、20mlの試験
管中の2mlの最小培地（(NH4)2SO4 18 g/l ; K2HPO4 1.8
g/l ; MgSO4 1.2 g/l ; チアミン 0.1 mg/l ; イース
トエキストラクト 10 g/l ; グルコース 60g/l ; スレ
オニン 400 mg/l ; アンピシリン 300 mg/l（必要な場
合））に懸濁し、32℃、通気下で一晩培養した。一晩培
養した培養物は、IPTGを含むか、又は含まない新鮮な発
酵培地2mlを入れた３つの20ml試験管に0.2mlずつ移し、
32℃で48時間、ロータリーシェーカーで培養した。
するコントロール株としての73（pΔlacZ）株および73
(pYGAZH)株からそれぞれ５つのコロニーを、20mlの試験
管中の2mlの最小培地（(NH4)2SO4 18 g/l ; K2HPO4 1.8
g/l ; MgSO4 1.2 g/l ; チアミン 0.1 mg/l ; イース
トエキストラクト 10 g/l ; グルコース 60g/l ; スレ
オニン 400 mg/l ; アンピシリン 300 mg/l（必要な場
合））に懸濁し、32℃、通気下で一晩培養した。一晩培
養した培養物は、IPTGを含むか、又は含まない新鮮な発
酵培地2mlを入れた３つの20ml試験管に0.2mlずつ移し、
32℃で48時間、ロータリーシェーカーで培養した。
【００９３】（発酵培地の組成） (NH4)2SO4 18 g/l K2HPO4 1.8 g/l MgSO4 1.2 g/l CaCO3 20 g/l チアミン 0.1 mg/l グルコース 60 g/l スレオニン 400 mg/l イーストエキストラクト 1.0 g/l アンピシリン 300 mg/l（必要な場合） IPTG 0.5 mM（必要な場合）
【００９４】培養終了後、プラスミドの安定性と540nm
における培地の吸光度を従来法で決定した。培地中のメ
チオニンの蓄積量は、TLCにより決定した。TLC用の液層
の組成は以下の通りである : イソプロパノール 80 m
l、酢酸エチル 80 ml、NH4OH(30%) 15 ml、H2O 45 ml。
結果を、表７に示す。ハイブリッドプラスミドpYGAZH
が、メチオニン生産菌株である73株のメチオニンの蓄積
を改良したことが分かる。
における培地の吸光度を従来法で決定した。培地中のメ
チオニンの蓄積量は、TLCにより決定した。TLC用の液層
の組成は以下の通りである : イソプロパノール 80 m
l、酢酸エチル 80 ml、NH4OH(30%) 15 ml、H2O 45 ml。
結果を、表７に示す。ハイブリッドプラスミドpYGAZH
が、メチオニン生産菌株である73株のメチオニンの蓄積
を改良したことが分かる。
【００９５】
【表７】
【００９６】
【実施例８】プラスミドpYCHEを保持する菌株によるス
レオニンの製造 スレオニン生産菌であるVL2054株を、PlacUV5プロモー
ターの制御下にb1242遺伝子を有するプラスミドpYCHEで
形質転換した。得られた菌株は、VL2054（pYCHE）と名
付けた。
レオニンの製造 スレオニン生産菌であるVL2054株を、PlacUV5プロモー
ターの制御下にb1242遺伝子を有するプラスミドpYCHEで
形質転換した。得られた菌株は、VL2054（pYCHE）と名
付けた。
【００９７】VL2054株、挿入断片を含まないプラスミド
を有するコントロール株としてのVL2054（pΔlacZ）株
およびVL2054(pYCHE)株からそれぞれ５つのコロニー
を、20mlの試験管中の2mlの最小培地（（NH4)2SO4 11g/
l ; NaCl 0.4g/l ; MgSO4 0.4g/l; K2HPO4 1g/l ; FeSO
4 10mg/l ; MnSO4 10mg/l ; チアミン 0.1mg/l ; イー
ストエキストラクト 0.5g/l ; グルコース 40g/l ; ア
ンピシリン 300mg/l（必要な場合））に懸濁し、32℃、
通気下で一晩培養した。一晩培養した培養物は、IPTGを
含むか、又は含まない新鮮な発酵培地2mlを入れた３つ
の20ml試験管に0.2mlずつ移し、32℃で45時間、ロータ
リーシェーカーで培養した。
を有するコントロール株としてのVL2054（pΔlacZ）株
およびVL2054(pYCHE)株からそれぞれ５つのコロニー
を、20mlの試験管中の2mlの最小培地（（NH4)2SO4 11g/
l ; NaCl 0.4g/l ; MgSO4 0.4g/l; K2HPO4 1g/l ; FeSO
4 10mg/l ; MnSO4 10mg/l ; チアミン 0.1mg/l ; イー
ストエキストラクト 0.5g/l ; グルコース 40g/l ; ア
ンピシリン 300mg/l（必要な場合））に懸濁し、32℃、
通気下で一晩培養した。一晩培養した培養物は、IPTGを
含むか、又は含まない新鮮な発酵培地2mlを入れた３つ
の20ml試験管に0.2mlずつ移し、32℃で45時間、ロータ
リーシェーカーで培養した。
【００９８】（発酵培地の組成） (NH4)2SO4 22 g/l NaCl 0.8 g/l MgSO4 0.8 g/l K2HPO4 2 g/l FeSO4 20 mg/l MnSO4 20 mg/l チアミン 0.2 mg/l イーストエキストラクト 1 g/l CaCO3 30 g/l グルコース 80 g/l アンピシリン 300 mg/l（必要な場合） IPTG 0.5 mM（必要な場合）
【００９９】培養終了後、プラスミドの安定性と540nm
における培地の吸光度を従来法で決定した。培地中のス
レオニンの蓄積量は、薄層クロマトグラフィー（TLC）
により決定した。TLC用の液層の組成は以下の通りであ
る : イソプロパノール 50 ml、アセトン 50 ml、NH4OH
(30%) 12 ml、H2O 8 ml。結果を、表８に示す。ハイブ
リッドプラスミドpYCHEが、スレオニン生産菌株であるV
L2054株のスレオニンの蓄積を改良したことが分かる。
における培地の吸光度を従来法で決定した。培地中のス
レオニンの蓄積量は、薄層クロマトグラフィー（TLC）
により決定した。TLC用の液層の組成は以下の通りであ
る : イソプロパノール 50 ml、アセトン 50 ml、NH4OH
(30%) 12 ml、H2O 8 ml。結果を、表８に示す。ハイブ
リッドプラスミドpYCHEが、スレオニン生産菌株であるV
L2054株のスレオニンの蓄積を改良したことが分かる。
【０１００】
【表８】
【０１０１】
【実施例９】プラスミドpYCHEを保持する菌株によるバ
リンの製造 バリン生産菌であるH-81株を、Plac UV5プロモーターの
制御下にb1242遺伝子を有するプラスミドpYCHEで形質転
換した。H-81株、挿入断片を含まないプラスミドを有す
るコントロール株としてのH-81（pΔlacZ）株およびH-8
1(pYCHE)株からそれぞれ５つのコロニーを、20mlの試験
管中の2mlの最小培地（（NH4)2SO4 18 g/l ; K2HPO4 1.
8 g/l ; MgSO4 1.2 g/l; チアミン 0.1 mg/l ; イース
トエキストラクト 0.5 g/l ; グルコース 60 g/l; アン
ピシリン 300 mg/l（必要な場合））に懸濁し、32℃、
通気下で一晩培養した。一晩培養した培養物は、IPTGを
含むか、又は含まない新鮮な発酵培地2mlを入れた３つ
の20ml試験管に0.2mlずつ移し、32℃で45時間、ロータ
リーシェーカーで培養した。
リンの製造 バリン生産菌であるH-81株を、Plac UV5プロモーターの
制御下にb1242遺伝子を有するプラスミドpYCHEで形質転
換した。H-81株、挿入断片を含まないプラスミドを有す
るコントロール株としてのH-81（pΔlacZ）株およびH-8
1(pYCHE)株からそれぞれ５つのコロニーを、20mlの試験
管中の2mlの最小培地（（NH4)2SO4 18 g/l ; K2HPO4 1.
8 g/l ; MgSO4 1.2 g/l; チアミン 0.1 mg/l ; イース
トエキストラクト 0.5 g/l ; グルコース 60 g/l; アン
ピシリン 300 mg/l（必要な場合））に懸濁し、32℃、
通気下で一晩培養した。一晩培養した培養物は、IPTGを
含むか、又は含まない新鮮な発酵培地2mlを入れた３つ
の20ml試験管に0.2mlずつ移し、32℃で45時間、ロータ
リーシェーカーで培養した。
【０１０２】（発酵培地の組成） (NH4)2SO4 18 g/l K2HPO4 1.8 g/l MgSO4 1.2 g/l CaCO3 20 g/l チアミン 0.1 mg/l グルコース 60 g/l アンピシリン 300 mg/l（必要な場合） IPTG 0.5 mM（必要な場合）
【０１０３】培養終了後、プラスミドの安定性と540nm
における培地の吸光度を従来法で決定した。培地中のバ
リンの蓄積量は、TLCにより決定した。TLC用の液層の組
成は以下の通りである : イソプロパノール 80 ml、酢
酸エチル 80 ml、NH4OH(30%)15 ml、H2O 45 ml。結果
を、表９に示す。ハイブリッドプラスミドpYCHEが、バ
リン生産菌株であるH-81株のバリンの蓄積を改良したこ
とが分かる。
における培地の吸光度を従来法で決定した。培地中のバ
リンの蓄積量は、TLCにより決定した。TLC用の液層の組
成は以下の通りである : イソプロパノール 80 ml、酢
酸エチル 80 ml、NH4OH(30%)15 ml、H2O 45 ml。結果
を、表９に示す。ハイブリッドプラスミドpYCHEが、バ
リン生産菌株であるH-81株のバリンの蓄積を改良したこ
とが分かる。
【０１０４】
【表９】
【０１０５】
【実施例１０】プラスミドpYHGNを保持する菌株による
アルギニンの製造 アルギニン生産菌である382株を、Plac UV5プロモータ
ーの制御下にb3434遺伝子を有するプラスミドpYHGNで形
質転換した。382株は、ルシアン・ナショナル・コレク
ション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズ
ム（Russian National Collection of Industrial Micr
oorganisms）（住所：1, Dorozhny Proezd., 1, 11354
5, Moscow, Russia）(VKPM)に、2000年4月10日にVKPM
B-7926の寄託番号で寄託されている。
アルギニンの製造 アルギニン生産菌である382株を、Plac UV5プロモータ
ーの制御下にb3434遺伝子を有するプラスミドpYHGNで形
質転換した。382株は、ルシアン・ナショナル・コレク
ション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズ
ム（Russian National Collection of Industrial Micr
oorganisms）（住所：1, Dorozhny Proezd., 1, 11354
5, Moscow, Russia）(VKPM)に、2000年4月10日にVKPM
B-7926の寄託番号で寄託されている。
【０１０６】382株、挿入断片を含まないプラスミドを
有するコントロール株としての382（pΔlacZ）株および
382(pYHGN)株からそれぞれ５つのコロニーを、20mlの試
験管中の2mlの最小培地（（NH4)2SO4 25 g/l ; K2HPO4
2.0 g/l ; MgSO4 7H2O 1.0 g/l ; チアミン 0.2 mg/l ;
イーストエキストラクト 5 g/l ; グルコース 60 g/l
; アンピシリン 100 mg/l（必要な場合））に懸濁し、
32℃、通気下で一晩培養した。一晩培養した培養物は、
IPTGを含むか、又は含まない新鮮な発酵培地2mlを入れ
た３つの20ml試験管に0.2mlずつ移し、32℃で72時間、
ロータリーシェーカーで培養した。
有するコントロール株としての382（pΔlacZ）株および
382(pYHGN)株からそれぞれ５つのコロニーを、20mlの試
験管中の2mlの最小培地（（NH4)2SO4 25 g/l ; K2HPO4
2.0 g/l ; MgSO4 7H2O 1.0 g/l ; チアミン 0.2 mg/l ;
イーストエキストラクト 5 g/l ; グルコース 60 g/l
; アンピシリン 100 mg/l（必要な場合））に懸濁し、
32℃、通気下で一晩培養した。一晩培養した培養物は、
IPTGを含むか、又は含まない新鮮な発酵培地2mlを入れ
た３つの20ml試験管に0.2mlずつ移し、32℃で72時間、
ロータリーシェーカーで培養した。
【０１０７】（発酵培地の組成） (NH4)2SO4 25 g/l K2HPO4 2.0 g/l MgSO4・7H2O 1.0 g/l チアミン 0.2 mg/l イーストエキストラクト 5 g/l グルコース 60 g/l CaCO3 20 g/l アンピシリン 100 mg/l（必要な場合） IPTG 0.5 mM（必要な場合
【０１０８】培養終了後、プラスミドの安定性と540nm
における培地の吸光度を従来法で決定した。培地中のア
ルギニンの蓄積量は、TLCにより決定した。TLC用の液層
の組成は以下の通りである : イソプロパノール 80 m
l、酢酸エチル 40 ml、NH4OH(30%) 25 ml、H2O 50 ml。
結果を、表１０に示す。ハイブリッドプラスミドpYHGN
が、アルギニン生産菌株である382株のアルギニンの蓄
積を改良したことが分かる。
における培地の吸光度を従来法で決定した。培地中のア
ルギニンの蓄積量は、TLCにより決定した。TLC用の液層
の組成は以下の通りである : イソプロパノール 80 m
l、酢酸エチル 40 ml、NH4OH(30%) 25 ml、H2O 50 ml。
結果を、表１０に示す。ハイブリッドプラスミドpYHGN
が、アルギニン生産菌株である382株のアルギニンの蓄
積を改良したことが分かる。
【０１０９】
【表１０】
【０１１０】
【実施例１１】プラスミドpYHGNを保持する菌株による
プロリンの製造 プロリン生産菌であるエシェリヒア・コリ702ilvAを、P
lac UV5プロモーターの制御下にb3434遺伝子を有するプ
ラスミドpYHGNで形質転換した。
プロリンの製造 プロリン生産菌であるエシェリヒア・コリ702ilvAを、P
lac UV5プロモーターの制御下にb3434遺伝子を有するプ
ラスミドpYHGNで形質転換した。
【０１１１】702ilvA株、挿入断片を含まないプラスミ
ドを有するコントロール株としての702ilvA（pΔlacZ）
株および702ilvA(pYHGN)株からそれぞれ５つのコロニー
を、20mlの試験管中の2mlの最小培地（（NH4)2SO4 18 g
/l ; K2HPO4 1.8 g/l ; MgSO4１．２ 1.2g/l ; チアミ
ン 0.1 mg/l ; イーストエキストラクト 0.5 g/l ; グ
ルコース 60 g/l ; イソロイシン 50 mg/l ; アンピシ
リン 300 mg/l（必要な場合））に懸濁し、32℃、通気
下で一晩培養した。一晩培養した培養物は、IPTGを含む
か、又は含まない新鮮な発酵培地2mlを入れた３つの20m
l試験管に0.2mlずつ移し、32℃で40時間、ロータリーシ
ェーカーで培養した。
ドを有するコントロール株としての702ilvA（pΔlacZ）
株および702ilvA(pYHGN)株からそれぞれ５つのコロニー
を、20mlの試験管中の2mlの最小培地（（NH4)2SO4 18 g
/l ; K2HPO4 1.8 g/l ; MgSO4１．２ 1.2g/l ; チアミ
ン 0.1 mg/l ; イーストエキストラクト 0.5 g/l ; グ
ルコース 60 g/l ; イソロイシン 50 mg/l ; アンピシ
リン 300 mg/l（必要な場合））に懸濁し、32℃、通気
下で一晩培養した。一晩培養した培養物は、IPTGを含む
か、又は含まない新鮮な発酵培地2mlを入れた３つの20m
l試験管に0.2mlずつ移し、32℃で40時間、ロータリーシ
ェーカーで培養した。
【０１１２】（発酵培地の組成） (NH4)2SO4 18 g/l K2HPO4 1.8 g/l MgSO4 1.2 g/l CaCO3 20 g/l チアミン 0.1 mg/l グルコース 60 g/l イソロイシン 50 mg/l アンピシリン 300 mg/l（必要な場合） IPTG 0.5 mM（必要な場合）
【０１１３】培養終了後、プラスミドの安定性と540nm
における培地の吸光度を従来法で決定した。培地中のプ
ロリンの蓄積量は、TLCにより決定した。TLC用の液層の
組成は以下の通りである : エタノール 80 ml、NH4OH(3
0%) 5 ml、H2O 25 ml。結果を、表１１に示す。ハイブ
リッドプラスミドpYHGNが、プロリン生産菌株である702
ilvA株のプロリンの蓄積を改良したことが分かる。
における培地の吸光度を従来法で決定した。培地中のプ
ロリンの蓄積量は、TLCにより決定した。TLC用の液層の
組成は以下の通りである : エタノール 80 ml、NH4OH(3
0%) 5 ml、H2O 25 ml。結果を、表１１に示す。ハイブ
リッドプラスミドpYHGNが、プロリン生産菌株である702
ilvA株のプロリンの蓄積を改良したことが分かる。
【０１１４】
【表１１】
【０１１５】
【発明の効果】本発明により、Ｌ−アミノ酸、例えば、
Ｌ−スレオニン、Ｌ−バリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ロイ
シン、Ｌ−メチオニン、及びＬ−アルギニンの生産性が
向上したエシェリヒア属細菌、及び同細菌を利用したＬ
−アミノ酸の製造法が提供される。
Ｌ−スレオニン、Ｌ−バリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ロイ
シン、Ｌ−メチオニン、及びＬ−アルギニンの生産性が
向上したエシェリヒア属細菌、及び同細菌を利用したＬ
−アミノ酸の製造法が提供される。
【０１１６】
【配列表】 <110> Ajinomoto Co., Inc. <120> エシェリヒア属細菌を用いたＬ−アミノ酸の製造法 <130> P-8260F <140> <141> 2002-02-13 <150> RU 2001103865 <151> 2001-02-13 <150> RU 2001104998 <151> 2001-02-26 <150> RU 2001104999 <151> 2001-02-26 <150> RU 2001117632 <151> 2001-06-28 <150> RU 2001117633 <151> 2001-06-28 <160> 16 <170> PatentIn Ver. 2.0
【０１１７】 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 1 ggtctagaca atcgttaagc gtacac 26
【０１１８】 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 2 ccggatccga tatagtaacg acagtg 26
【０１１９】 <210> 3 <211> 738 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (1)..(735) <400> 3 atg gaa agc cct act cca cag cct gct cct ggt tcg gcg acc ttc atg 48 Met Glu Ser Pro Thr Pro Gln Pro Ala Pro Gly Ser Ala Thr Phe Met 1 5 10 15 gaa gga tgc aaa gac agt tta ccg att gtt att agt tat att ccg gtg 96 Glu Gly Cys Lys Asp Ser Leu Pro Ile Val Ile Ser Tyr Ile Pro Val 20 25 30 gcc ttt gcg ttc ggt ctg aat gcg acc cgt ctg gga ttc tct cct ctc 144 Ala Phe Ala Phe Gly Leu Asn Ala Thr Arg Leu Gly Phe Ser Pro Leu 35 40 45 gaa agc gtt ttt ttc tcc tgc atc att tat gca ggc gcg agc cag ttc 192 Glu Ser Val Phe Phe Ser Cys Ile Ile Tyr Ala Gly Ala Ser Gln Phe 50 55 60 gtc att acc gcg atg ctg gca gcc ggg agt agt ttg tgg att gct gca 240 Val Ile Thr Ala Met Leu Ala Ala Gly Ser Ser Leu Trp Ile Ala Ala 65 70 75 80 ctg acc gtc atg gca atg gat gtt cgc cat gtg ttg tat ggc ccg tca 288 Leu Thr Val Met Ala Met Asp Val Arg His Val Leu Tyr Gly Pro Ser 85 90 95 ctg cgt agc cgt att att cag cgt ctg caa aaa tcg aaa acc gcc ctg 336 Leu Arg Ser Arg Ile Ile Gln Arg Leu Gln Lys Ser Lys Thr Ala Leu 100 105 110 tgg gcg ttt ggc ctg acg gat gag gtt ttt gcc gcc gca acc gca aaa 384 Trp Ala Phe Gly Leu Thr Asp Glu Val Phe Ala Ala Ala Thr Ala Lys 115 120 125 ctg gta cgc aat aat cgc cgc tgg agc gag aac tgg atg atc ggc att 432 Leu Val Arg Asn Asn Arg Arg Trp Ser Glu Asn Trp Met Ile Gly Ile 130 135 140 gcc ttc agt tca tgg tca tcg tgg gta ttt ggt acg gta ata ggg gca 480 Ala Phe Ser Ser Trp Ser Ser Trp Val Phe Gly Thr Val Ile Gly Ala 145 150 155 160 ttc tcc ggc agc ggc ttg ctg caa ggt tat ccc gcc gtt gaa gct gca 528 Phe Ser Gly Ser Gly Leu Leu Gln Gly Tyr Pro Ala Val Glu Ala Ala 165 170 175 tta ggt ttt atg ctt ccg gca ctc ttt atg agt ttc ctg ctc gcc tct 576 Leu Gly Phe Met Leu Pro Ala Leu Phe Met Ser Phe Leu Leu Ala Ser 180 185 190 ttc cag cgc aaa caa tct ctt tgc gtt acc gca gcg tta gtt ggt gcc 624 Phe Gln Arg Lys Gln Ser Leu Cys Val Thr Ala Ala Leu Val Gly Ala 195 200 205 ctt gca ggc gta acg cta ttt tct att ccc gtc gcc att ctg gca ggc 672 Leu Ala Gly Val Thr Leu Phe Ser Ile Pro Val Ala Ile Leu Ala Gly 210 215 220 att gtc tgt ggc tgc ctc act gcg tta atc cag gca ttc tgg caa gga 720 Ile Val Cys Gly Cys Leu Thr Ala Leu Ile Gln Ala Phe Trp Gln Gly 225 230 235 240 gcg ccc gat gag cta tga 738 Ala Pro Asp Glu Leu 245
【０１２０】 <210> 4 <211> 245 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 4 Met Glu Ser Pro Thr Pro Gln Pro Ala Pro Gly Ser Ala Thr Phe Met 1 5 10 15 Glu Gly Cys Lys Asp Ser Leu Pro Ile Val Ile Ser Tyr Ile Pro Val 20 25 30 Ala Phe Ala Phe Gly Leu Asn Ala Thr Arg Leu Gly Phe Ser Pro Leu 35 40 45 Glu Ser Val Phe Phe Ser Cys Ile Ile Tyr Ala Gly Ala Ser Gln Phe 50 55 60 Val Ile Thr Ala Met Leu Ala Ala Gly Ser Ser Leu Trp Ile Ala Ala 65 70 75 80 Leu Thr Val Met Ala Met Asp Val Arg His Val Leu Tyr Gly Pro Ser 85 90 95 Leu Arg Ser Arg Ile Ile Gln Arg Leu Gln Lys Ser Lys Thr Ala Leu 100 105 110 Trp Ala Phe Gly Leu Thr Asp Glu Val Phe Ala Ala Ala Thr Ala Lys 115 120 125 Leu Val Arg Asn Asn Arg Arg Trp Ser Glu Asn Trp Met Ile Gly Ile 130 135 140 Ala Phe Ser Ser Trp Ser Ser Trp Val Phe Gly Thr Val Ile Gly Ala 145 150 155 160 Phe Ser Gly Ser Gly Leu Leu Gln Gly Tyr Pro Ala Val Glu Ala Ala 165 170 175 Leu Gly Phe Met Leu Pro Ala Leu Phe Met Ser Phe Leu Leu Ala Ser 180 185 190 Phe Gln Arg Lys Gln Ser Leu Cys Val Thr Ala Ala Leu Val Gly Ala 195 200 205 Leu Ala Gly Val Thr Leu Phe Ser Ile Pro Val Ala Ile Leu Ala Gly 210 215 220 Ile Val Cys Gly Cys Leu Thr Ala Leu Ile Gln Ala Phe Trp Gln Gly 225 230 235 240 Ala Pro Asp Glu Leu 245
【０１２１】 <210> 5 <211> 336 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (1)..(333) <400> 5 atg agc tat gag gtt ctg ctg ctt ggg tta cta gtt ggc gtg gcg aat 48 Met Ser Tyr Glu Val Leu Leu Leu Gly Leu Leu Val Gly Val Ala Asn 1 5 10 15 tat tgc ttc cgc tat ttg ccg ctg cgc ctg cgt gtg ggt aat gcc cgc 96 Tyr Cys Phe Arg Tyr Leu Pro Leu Arg Leu Arg Val Gly Asn Ala Arg 20 25 30 cca acc aaa cgt ggc gcg gta ggt att ttg ctc gac acc att ggc atc 144 Pro Thr Lys Arg Gly Ala Val Gly Ile Leu Leu Asp Thr Ile Gly Ile 35 40 45 gcc tcg ata tgc gct ctg ctg gtt gtc tct acc gca cca gaa gtg atg 192 Ala Ser Ile Cys Ala Leu Leu Val Val Ser Thr Ala Pro Glu Val Met 50 55 60 cac gat aca cgc cgt ttc gtg ccc acg ctg gtc ggc ttc gcg gta ctg 240 His Asp Thr Arg Arg Phe Val Pro Thr Leu Val Gly Phe Ala Val Leu 65 70 75 80 ggt gcc agt ttc tat aaa aca cgc agc att atc atc cca aca ctg ctt 288 Gly Ala Ser Phe Tyr Lys Thr Arg Ser Ile Ile Ile Pro Thr Leu Leu 85 90 95 agt gcg ctg gcc tat ggg ctc gcc tgg aaa gtg atg gcg att ata taa 336 Ser Ala Leu Ala Tyr Gly Leu Ala Trp Lys Val Met Ala Ile Ile 100 105 110
【０１２２】 <210> 6 <211> 111 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 6 Met Ser Tyr Glu Val Leu Leu Leu Gly Leu Leu Val Gly Val Ala Asn 1 5 10 15 Tyr Cys Phe Arg Tyr Leu Pro Leu Arg Leu Arg Val Gly Asn Ala Arg 20 25 30 Pro Thr Lys Arg Gly Ala Val Gly Ile Leu Leu Asp Thr Ile Gly Ile 35 40 45 Ala Ser Ile Cys Ala Leu Leu Val Val Ser Thr Ala Pro Glu Val Met 50 55 60 His Asp Thr Arg Arg Phe Val Pro Thr Leu Val Gly Phe Ala Val Leu 65 70 75 80 Gly Ala Ser Phe Tyr Lys Thr Arg Ser Ile Ile Ile Pro Thr Leu Leu 85 90 95 Ser Ala Leu Ala Tyr Gly Leu Ala Trp Lys Val Met Ala Ile Ile 100 105 110
【０１２３】 <210> 7 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 7 cctttggtac cagatctgcg ggcagtgagc gcaacgc 37
【０１２４】 <210> 8 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 8 ctgtttctag atcctgtgtg aaattgttat ccgc 34
【０１２５】 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 9 ggtctagata tggctaacat tatccggc 28
【０１２６】 <210> 10 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 10 ccggatccaa acggagcatg gcagctcc 28
【０１２７】 <210> 11 <211> 648 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (1)..(645) <400> 11 gtg att cag acc ttt ttt gat ttt ccc gtt tac ttc aaa ttt ttc atc 48 Met Ile Gln Thr Phe Phe Asp Phe Pro Val Tyr Phe Lys Phe Phe Ile 1 5 10 15 ggg tta ttt gcg ctg gtc aac ccg gta ggg att att ccc gtc ttt atc 96 Gly Leu Phe Ala Leu Val Asn Pro Val Gly Ile Ile Pro Val Phe Ile 20 25 30 agc atg acc agt tat cag aca gcg gca gcg cga aac aaa act aac ctt 144 Ser Met Thr Ser Tyr Gln Thr Ala Ala Ala Arg Asn Lys Thr Asn Leu 35 40 45 aca gcc aac ctg tct gtg gcc att atc ttg tgg atc tcg ctt ttt ctc 192 Thr Ala Asn Leu Ser Val Ala Ile Ile Leu Trp Ile Ser Leu Phe Leu 50 55 60 ggc gac acg att cta caa ctt ttt ggt ata tca att gat tcg ttc cgt 240 Gly Asp Thr Ile Leu Gln Leu Phe Gly Ile Ser Ile Asp Ser Phe Arg 65 70 75 80 atc gcc ggg ggt atc ctg gtg gtg aca ata gcg atg tcg atg atc agc 288 Ile Ala Gly Gly Ile Leu Val Val Thr Ile Ala Met Ser Met Ile Ser 85 90 95 ggc aag ctt ggc gag gat aaa cag aac aag caa gaa aaa tca gaa acc 336 Gly Lys Leu Gly Glu Asp Lys Gln Asn Lys Gln Glu Lys Ser Glu Thr 100 105 110 gcg gta cgt gaa agc att ggt gtg gtg cca ctg gcg ttg ccg ttg atg 384 Ala Val Arg Glu Ser Ile Gly Val Val Pro Leu Ala Leu Pro Leu Met 115 120 125 gcg ggg cca ggg gcg atc agt tct acc atc gtc tgg ggt acg cgt tat 432 Ala Gly Pro Gly Ala Ile Ser Ser Thr Ile Val Trp Gly Thr Arg Tyr 130 135 140 cac agc att agc tat ctg ttt ggt ttc ttt gtg gct att gca ttg ttc 480 His Ser Ile Ser Tyr Leu Phe Gly Phe Phe Val Ala Ile Ala Leu Phe 145 150 155 160 gct tta tgt tgt tgg gga ttg ttc cgc atg gca ccg tgg ctg gta cgg 528 Ala Leu Cys Cys Trp Gly Leu Phe Arg Met Ala Pro Trp Leu Val Arg 165 170 175 gtt tta cgc cag acc ggc atc aac gtg att acg cgt att atg ggg cta 576 Val Leu Arg Gln Thr Gly Ile Asn Val Ile Thr Arg Ile Met Gly Leu 180 185 190 ttg ctg atg gca ttg ggg att gaa ttt atc gtt act ggt att aag ggg 624 Leu Leu Met Ala Leu Gly Ile Glu Phe Ile Val Thr Gly Ile Lys Gly 195 200 205 att ttc ccc ggc ctg ctt aat taa 648 Ile Phe Pro Gly Leu Leu Asn 210 215
【０１２８】 <210> 12 <211> 215 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 12 Met Ile Gln Thr Phe Phe Asp Phe Pro Val Tyr Phe Lys Phe Phe Ile 1 5 10 15 Gly Leu Phe Ala Leu Val Asn Pro Val Gly Ile Ile Pro Val Phe Ile 20 25 30 Ser Met Thr Ser Tyr Gln Thr Ala Ala Ala Arg Asn Lys Thr Asn Leu 35 40 45 Thr Ala Asn Leu Ser Val Ala Ile Ile Leu Trp Ile Ser Leu Phe Leu 50 55 60 Gly Asp Thr Ile Leu Gln Leu Phe Gly Ile Ser Ile Asp Ser Phe Arg 65 70 75 80 Ile Ala Gly Gly Ile Leu Val Val Thr Ile Ala Met Ser Met Ile Ser 85 90 95 Gly Lys Leu Gly Glu Asp Lys Gln Asn Lys Gln Glu Lys Ser Glu Thr 100 105 110 Ala Val Arg Glu Ser Ile Gly Val Val Pro Leu Ala Leu Pro Leu Met 115 120 125 Ala Gly Pro Gly Ala Ile Ser Ser Thr Ile Val Trp Gly Thr Arg Tyr 130 135 140 His Ser Ile Ser Tyr Leu Phe Gly Phe Phe Val Ala Ile Ala Leu Phe 145 150 155 160 Ala Leu Cys Cys Trp Gly Leu Phe Arg Met Ala Pro Trp Leu Val Arg 165 170 175 Val Leu Arg Gln Thr Gly Ile Asn Val Ile Thr Arg Ile Met Gly Leu 180 185 190 Leu Leu Met Ala Leu Gly Ile Glu Phe Ile Val Thr Gly Ile Lys Gly 195 200 205 Ile Phe Pro Gly Leu Leu Asn 210 215
【０１２９】 <210> 13 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 13 ggtctagagt ccgcggcaat tatcaggg 28
【０１３０】 <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 14 ccagatctgg tagttgtgac gctaccggg 29
【０１３１】 <210> 15 <211> 594 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (1)..(591) <400> 15 atg aat gaa atc att tct gca gca gtt tta ttg atc ctg att atg gat 48 Met Asn Glu Ile Ile Ser Ala Ala Val Leu Leu Ile Leu Ile Met Asp 1 5 10 15 ccg ctc gga aac cta cct att ttc atg tcc gta ctg aaa cat act gaa 96 Pro Leu Gly Asn Leu Pro Ile Phe Met Ser Val Leu Lys His Thr Glu 20 25 30 ccg aaa aga cgg cgg gca atc atg gtg cga gag ttg ctt att gct ctc 144 Pro Lys Arg Arg Arg Ala Ile Met Val Arg Glu Leu Leu Ile Ala Leu 35 40 45 ctg gtg atg ctg gtg ttc ctg ttt gcg ggt gag aaa att ctg gca ttt 192 Leu Val Met Leu Val Phe Leu Phe Ala Gly Glu Lys Ile Leu Ala Phe 50 55 60 ctt agc cta cga gca gaa acc gtc tcc att tct ggc ggc atc att ctg 240 Leu Ser Leu Arg Ala Glu Thr Val Ser Ile Ser Gly Gly Ile Ile Leu 65 70 75 80 ttt ctg atc gcc att aaa atg att ttc ccc agc gct tca gga aat agc 288 Phe Leu Ile Ala Ile Lys Met Ile Phe Pro Ser Ala Ser Gly Asn Ser 85 90 95 agc ggg ctt ccg gca ggt gaa gag cca ttt atc gtg ccg ttg gca att 336 Ser Gly Leu Pro Ala Gly Glu Glu Pro Phe Ile Val Pro Leu Ala Ile 100 105 110 ccg tta gtc gcc ggg ccg act att ctc gcc acg ctg atg ttg ttg tct 384 Pro Leu Val Ala Gly Pro Thr Ile Leu Ala Thr Leu Met Leu Leu Ser 115 120 125 cat cag tac ccg aat cag atg ggg cat ctg gtg att gct ctg ctg ctg 432 His Gln Tyr Pro Asn Gln Met Gly His Leu Val Ile Ala Leu Leu Leu 130 135 140 gcc tgg ggc ggc acc ttt gtc atc ctg cta cag tct tcg cta ttt tta 480 Ala Trp Gly Gly Thr Phe Val Ile Leu Leu Gln Ser Ser Leu Phe Leu 145 150 155 160 cgt ctg ctg ggc gag aaa ggg gtg aac gca ctt gaa cgc ctg atg gga 528 Arg Leu Leu Gly Glu Lys Gly Val Asn Ala Leu Glu Arg Leu Met Gly 165 170 175 ttg att ctg gtg atg atg gca acc cag atg ttc ctc gac ggc att cga 576 Leu Ile Leu Val Met Met Ala Thr Gln Met Phe Leu Asp Gly Ile Arg 180 185 190 atg tgg atg aag ggg taa 594 Met Trp Met Lys Gly 195
【０１３２】 <210> 16 <211> 197 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 16 Met Asn Glu Ile Ile Ser Ala Ala Val Leu Leu Ile Leu Ile Met Asp 1 5 10 15 Pro Leu Gly Asn Leu Pro Ile Phe Met Ser Val Leu Lys His Thr Glu 20 25 30 Pro Lys Arg Arg Arg Ala Ile Met Val Arg Glu Leu Leu Ile Ala Leu 35 40 45 Leu Val Met Leu Val Phe Leu Phe Ala Gly Glu Lys Ile Leu Ala Phe 50 55 60 Leu Ser Leu Arg Ala Glu Thr Val Ser Ile Ser Gly Gly Ile Ile Leu 65 70 75 80 Phe Leu Ile Ala Ile Lys Met Ile Phe Pro Ser Ala Ser Gly Asn Ser 85 90 95 Ser Gly Leu Pro Ala Gly Glu Glu Pro Phe Ile Val Pro Leu Ala Ile 100 105 110 Pro Leu Val Ala Gly Pro Thr Ile Leu Ala Thr Leu Met Leu Leu Ser 115 120 125 His Gln Tyr Pro Asn Gln Met Gly His Leu Val Ile Ala Leu Leu Leu 130 135 140 Ala Trp Gly Gly Thr Phe Val Ile Leu Leu Gln Ser Ser Leu Phe Leu 145 150 155 160 Arg Leu Leu Gly Glu Lys Gly Val Asn Ala Leu Glu Arg Leu Met Gly 165 170 175 Leu Ile Leu Val Met Met Ala Thr Gln Met Phe Leu Asp Gly Ile Arg 180 185 190 Met Trp Met Lys Gly 195
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、プラスミドpΔlacZの構築を示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 13/12 Ｃ１２Ｐ 13/12 Ａ 13/24 13/24 Ａ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19 (Ｃ１２Ｐ 13/04 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 13/06 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 13/12 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 13/24 Ｃ１２Ｒ 1:19） (31)優先権主張番号 ２００１１１７６３２ (32)優先日 平成13年６月28日(2001．6．28) (33)優先権主張国 ロシア（ＲＵ） (31)優先権主張番号 ２００１１１７６３３ (32)優先日 平成13年６月28日(2001．6．28) (33)優先権主張国 ロシア（ＲＵ） (72)発明者 コンスタンチン ヴャチェスラヴォヴィッ チ ルイバク ロシア連邦、113149 モスクワ市、シヴァ シュスカヤ通り４番地、３号棟、61号室 (72)発明者 エヴゲーニ モイセエヴィッチ フルゲス ロシア連邦、109651 モスクワ市、バタイ スキ通り５番地、48号室 (72)発明者 エリヴィラ ボリソヴナ ヴォロシロヴァ ロシア連邦、113646、モスクワ市、セヴェ ルノエ チェルタノヴォ４番地、403号棟、 217号室 (72)発明者 ミハイル マルコヴィッチ グシャチネル ロシア連邦、113646、モスクワ市、セヴェ ルノエ チェルタノヴォ４番地、403号棟、 217号室 Ｆターム(参考） 4B064 AE03 AE05 AE06 AE10 AE16 AE35 CA02 CA19 CC24 CD30 DA01 DA10 DA20 4B065 AA26X AA26Y AB01 AC10 AC14 AC15 BA02 BA23 BB40 BD50 CA17
Claims (30)
- 【請求項１】 Ｌ−アミノ酸生産能を有するエシェリヒ
ア属細菌であって、同細菌の細胞内において以下の
（Ａ）または（Ｂ）、および（Ｃ）または（Ｄ）に記載
のタンパク質の活性が増強されたことにより、Ｌ−アミ
ノ酸生産性が増強されたエシェリヒア属細菌。 （Ａ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列を有す
るタンパク質、または、（Ｂ）配列表の配列番号３に記
載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸
の欠失、置換、挿入または付加を含み、かつ、細菌のＬ
−アミノ酸および／またはそのアナログに対する耐性を
増強させる活性を有するタンパク質。（Ｃ）配列表の配
列番号５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、
（Ｄ）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入また
は付加を含み、かつ、細菌のＬ−アミノ酸および／また
はそのアナログに対する耐性を増強させる活性を有する
タンパク質。 - 【請求項２】 前記（Ａ）または（Ｂ）、および（Ｃ）
または（Ｄ）に記載のタンパク質の活性は、（Ａ）また
は（Ｂ）、および（Ｃ）または（Ｄ）に記載のタンパク
質をコードするＤＮＡで前記細菌を形質転換するか、ま
たは、前記細菌の染色体上の前記ＤＮＡの発現制御配列
を改変することにより増強されたことを特徴とする請求
項１に記載の細菌。 - 【請求項３】 前記形質転換はマルチコピーベクターを
用いて行われた請求項２に記載の細菌。 - 【請求項４】 請求項１〜３のいずれか一項に記載の細
菌を培地中に培養し、生成、蓄積されたＬ−アミノ酸を
該培地中から採取する、Ｌ−アミノ酸の製造法。 - 【請求項５】 Ｌ−アミノ酸がＬ−スレオニンである請
求項４に記載の方法。 - 【請求項６】 前記細菌のスレオニンオペロンの発現が
増強された、請求項５に記載の方法。 - 【請求項７】 Ｌ−アミノ酸がＬ−バリンである請求項
４に記載の方法。 - 【請求項８】 前記細菌のilvオペロンの発現が増強さ
れた、請求項７に記載の方法。 - 【請求項９】 Ｌ−アミノ酸がＬ−プロリンである請求
項４に記載の方法。 - 【請求項１０】 前記細菌のプロリンの生合成に関与す
る遺伝子の発現が増強された、請求項９に記載の方法。 - 【請求項１１】 Ｌ−アミノ酸がＬ−ロイシンである請
求項４に記載の方法。 - 【請求項１２】 前記細菌のｌｅｕオペロンの発現が増
強された、請求項１１に記載の方法。 - 【請求項１３】 Ｌ−アミノ酸がＬ−メチオニンである
請求項４に記載の方法。 - 【請求項１４】 前記細菌のｍｅｔレギュロンの発現が
増強された、請求項１３に記載の方法。 - 【請求項１５】 Ｌ−アミノ酸生産能を有するエシェリ
ヒア属細菌であって、同細菌の細胞内において以下の
（Ｅ）または（Ｆ）に記載のタンパク質の活性を増強す
ることにより、Ｌ−アミノ酸生産性が増強されたエシェ
リヒア属細菌。 （Ｅ）配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有
するタンパク質、または、（Ｆ）配列表の配列番号１１
に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミ
ノ酸の欠失、置換、挿入または付加を含み、かつ、細菌
のＬ−アミノ酸および／またはそのアナログに対する耐
性を増強させる活性を有するタンパク質。 - 【請求項１６】 前記（Ｅ）または（Ｆ）に記載のタン
パク質の活性は、（Ｅ）または（Ｆ）に記載のタンパク
質をコードするＤＮＡで前記細菌を形質転換するか、ま
たは、前記細菌の染色体上の前記ＤＮＡの発現制御配列
を改変することにより増強されたことを特徴とする請求
項１５に記載の細菌。 - 【請求項１７】 前記形質転換はマルチコピーベクター
を用いて行われた請求項１６に記載の細菌。 - 【請求項１８】 請求項１５〜１７のいずれか一項に記
載の細菌を培地中に培養し、生成、蓄積されたＬ−アミ
ノ酸を該培地中から採集する、Ｌ−アミノ酸の製造法。 - 【請求項１９】 Ｌ−アミノ酸がＬ−スレオニンである
請求項１８に記載の方法。 - 【請求項２０】 前記細菌のスレオニンオペロンの発現
が増強された、請求項１９に記載の方法。 - 【請求項２１】 Ｌ−アミノ酸がＬ−バリンである請求
項１８に記載の方法。 - 【請求項２２】 前記細菌のilvオペロンの発現が増強
された、請求項２１に記載の方法。 - 【請求項２３】 Ｌ−アミノ酸生産能を有するエシェリ
ヒア属細菌であって、同細菌の細胞内において以下の
（Ｇ）または（Ｈ）に記載のタンパク質の活性を増強す
ることにより、Ｌ−アミノ酸生産性が増強されたエシェ
リヒア属細菌。 （Ｇ）配列表の配列番号１５に記載のアミノ酸配列を有
するタンパク質、または、（Ｈ）配列表の配列番号１５
に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミ
ノ酸の欠失、置換、挿入または付加を含み、かつ、細菌
のＬ−アミノ酸および／またはそのアナログ、例えば、
ＤＬ−ｏ−メチルセリン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ
−ノルロイシンおよびＤＬ−β−ヒドロキシ−ノルバリ
ンに対する耐性を増強させる、およびＳ−（２−アミノ
エチル）システインに対する感受性を増強させる活性を
有するタンパク質。 - 【請求項２４】 前記（Ｇ）または（Ｈ）に記載のタン
パク質の活性は、（Ｇ）または（Ｈ）に記載のタンパク
質をコードするＤＮＡで前記細菌を形質転換するか、ま
たは、 前記細菌の染色体上の前記ＤＮＡの発現制御配
列を改変することにより増強されたことを特徴とする請
求項２３に記載の細菌。 - 【請求項２５】 前記形質転換はマルチコピーベクター
を用いて行われた請求項２４に記載の細菌。 - 【請求項２６】 請求項２３〜２５のいずれか一項に記
載の細菌を培地中に培養し、生成、蓄積されたＬ−アミ
ノ酸を該培地中から採取する、Ｌ−アミノ酸の製造法。 - 【請求項２７】 Ｌ−アミノ酸がＬ−アルギニンである
請求項２６に記載の方法。 - 【請求項２８】 前記細菌のアルギニンレギュロンの発
現が増強された、請求項２７に記載の方法。 - 【請求項２９】 Ｌ−アミノ酸がＬ−プロリンである請
求項２６に記載の方法。 - 【請求項３０】 前記細菌のプロリンの生合成に関与す
る遺伝子の発現が増強された、請求項２９に記載の方
法。
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