JP2000189180A

JP2000189180A - Ｌ―アミノ酸の製造法

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Publication number: JP2000189180A
Application number: JP11373651A
Authority: JP
Inventors: Livshits Vitaly Arkadievich; ヴィタリー・アルカージエヴィッチ・リヴィシッツ; Pavlovna Zakataeva Nataliya; ナターリヤ・パーヴロヴナ・ザカタエヴァ; Kazuo Nakanishi; 一夫中西; Venijaminovich Aryoshin Vladimir; ヴラジーミル・ヴェニヤミノヴィッチ・アリョーシン; Vladimirovich Trosin Peter; ペートル・ヴラジミロヴィッチ・トローシン; Libovna Tokmakova Ilina; イリーナ・リヴォヴナ・トクマコーヴァ
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1998-12-30
Filing date: 1999-12-28
Publication date: 2000-07-11
Anticipated expiration: 2019-12-28
Also published as: KR20000048465A; EP1580262B1; ATE461271T1; CA2291895A1; CN1261626A; KR20070034022A; EP1589096B1; US7399617B1; EP1589096A1; CN1737121A; SK187099A3; CN100410366C; JP4221862B2; DE69942140D1; BR9906287B1; CN1228445C; BRPI9917718B1; ATE456648T1; AU6449399A; US20080050785A1

Abstract

(57)【要約】【課題】Ｌ−アミノ酸の生産性が向上したエシェリヒ
ア属細菌、及び、その細菌を用いたＬ−アミノ酸の製造
方法を提供する。【解決手段】 YeaS、YfiK及びYahNの遺伝子にコードさ
れるＬ−アミノ酸排出タンパク質の発現量を上昇させる
ことにより、Ｌ−アミノ酸の生産性を向上させる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、Ｌ−アミノ酸の製
造方法に関する。より詳しくは、Ｌ−アミノ酸生産性エ
シェリヒア細菌及びその細菌を用いるＬ−アミノ酸、特
にはＬ−グルタミン酸、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン、
Ｌ−アラニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ア
ルギニン、Ｌ−バリン及びＬ−イソロイシンの製造方法
に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、発酵法によりＬ−アミノ酸を生産
する場合、生産性を向上させるために、自然界から分離
した菌株または該菌株の人工変異株が用いられている。
例えば、Ｌ−リジンの場合には、Ｌ−リジンを生産する
人工変異株は数多く知られており、その多くはＳ−２−
アミノエチルシステイン(AEC)耐性変異株であり、ブレ
ビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、バチルス
属、またはエシェリヒア属に属している。また、組み換
えDNAを使用して得られた形質転換体の使用（米国特許
第4278765号）等、アミノ酸の生産を増加させる種々の
技術が提案されている。

【０００３】このような技術は主にアミノ酸の生合成経
路の酵素の活性増強や阻害解除型酵素への変換などによ
るものである（エシェリヒア属細菌においては、特開昭
56-18596号公報や国際公開第WO 95/16042号等参照）。

【０００４】一方、アミノ酸の排出タンパク質を増強す
ることによりアミノ酸の生産性を向上させた例として、
コリネバクテリウム属細菌のＬ−リジン排出遺伝子lysE
を増強したものが知られている。しかしエシェリヒア属
細菌に関してはＬ−アミノ酸排出タンパク質が存在する
のかさえ知られておらず、よってエシェリヒア属細菌を
用いたＬ−アミノ酸生産においてＬ−アミノ酸排出タン
パク質の増強が有効か否かも知られていない。

【０００５】またエシェリヒア属のE.coli K-12株の全
塩基配列が既に決定されているが（Science, 277, 1453
-1474 (1997)）、機能未知のタンパク質も多数存在す
る。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、Ｌ−アミノ
酸の排出に関与するタンパク質を取得し、それにより、
Ｌ−アミノ酸の生産性の改良された菌株、及び、改良さ
れた発酵法によるＬ−アミノ酸の製造法を提供すること
を課題とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、Ｌ−アミ
ノ酸の排出に関与するタンパク質を検索した結果、特定
の遺伝子を増強したときに、対消費糖当たりのＬ−アミ
ノ酸収率が増大することを見いだし、本発明を完成する
に至った。

【０００８】すなわち、本発明は、Ｌ−アミノ酸の生産
性を有するエシェリヒア属細菌であって、以下の（Ａ）
〜（Ｈ）のタンパク質からなる群から選ばれる１つ以上
のタンパク質の発現量が上昇することにより、前記Ｌ−
アミノ酸の生産性が向上していることを特徴とする細菌
（以下、本発明細菌ともいう）を提供する。（Ａ）配列表配列番号１０に示すアミノ酸配列を有する
タンパク質。（Ｂ）配列表配列番号１０に示すアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付
加、または逆位を含むアミノ酸配列からなるタンパク質
であって、そのタンパク質を有する細菌の前記Ｌ−アミ
ノ酸の生産性を向上させる活性を有するタンパク質。（Ｃ）配列表配列番号１２に示すアミノ酸配列を有する
タンパク質。（Ｄ）配列表配列番号１２に示すアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付
加、または逆位を含むアミノ酸配列からなるタンパク質
であって、そのタンパク質を有する細菌の前記Ｌ−アミ
ノ酸の生産性を向上させる活性を有するタンパク質。（Ｅ）配列表配列番号１４に示すアミノ酸配列を有する
タンパク質。（Ｆ）配列表配列番号１４に示すアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付
加、または逆位を含むアミノ酸配列からなるタンパク質
であって、そのタンパク質を有する細菌の前記Ｌ−アミ
ノ酸の生産性を向上させる活性を有するタンパク質。（Ｇ）配列表配列番号１６に示すアミノ酸配列を有する
タンパク質。（Ｈ）配列表配列番号１６に示すアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付
加、または逆位を含むアミノ酸配列からなるタンパク質
であって、そのタンパク質を有する細菌の前記Ｌ−アミ
ノ酸の生産性を向上させる活性を有するタンパク質。

【０００９】本発明細菌は、好ましくは、前記の（Ａ）
〜（Ｄ）、（Ｇ）及び（Ｈ）のタンパク質からなる群か
ら選ばれる１つ以上のタンパク質の発現量が上昇してい
るＬ−リジン生産性細菌、前記の（Ａ）〜（Ｈ）のタン
パク質からなる群から選ばれる１つ以上のタンパク質の
発現量が上昇しているＬ−グルタミン酸生産性細菌、前
記の（Ｃ）及び（Ｄ）のタンパク質からなる群から選ば
れる１つ以上のタンパク質の発現量が上昇しているＬ−
アラニン生産性細菌、前記の（Ｃ）及び（Ｄ）のタンパ
ク質からなる群から選ばれる１つ以上のタンパク質の発
現量が上昇しているＬ−バリン生産性細菌、前記の
（Ｃ）〜（Ｆ）のタンパク質からなる群から選ばれる１
つ以上のタンパク質の発現量が上昇しているＬ−ヒスチ
ジン生産性細菌、前記の（Ａ）〜（Ｆ）のタンパク質か
らなる群から選ばれる１つ以上のタンパク質の発現量が
上昇しているＬ−プロリン生産性細菌、前記の（Ｅ）及
び（Ｆ）のタンパク質からなる群から選ばれる１つ以上
のタンパク質の発現量が上昇しているＬ−スレオニン生
産性細菌、前記の（Ｇ）及び（Ｈ）のタンパク質からな
る群から選ばれる１つ以上のタンパク質の発現量が上昇
しているＬ−アルギニン生産性細菌、または、前記の
（Ｃ）〜（Ｄ）のタンパク質からなる群から選ばれる１
つ以上のタンパク質の発現量が上昇しているＬ−イソロ
イシン生産性細菌である。

【００１０】本発明細菌においては、前記タンパク質を
コードするＤＮＡの細胞内のコピー数が上昇しているこ
とが好ましい。また、このＤＮＡは、細胞中のマルチコ
ピーベクター上に保持されているか、または、細胞中の
トランスポゾン上に保持されていることが好ましい。

【００１１】本発明は、また、本発明細菌を培地で培養
し、該培地中にＬ−アミノ酸を生成蓄積せしめ、該培地
から前記Ｌ−アミノ酸を採取することを特徴とするＬ−
アミノ酸の製造法（以下、本発明方法ともいう）も提供
する。

【００１２】本発明方法は、好ましくは、前記の（Ａ）
〜（Ｄ）、（Ｇ）及び（Ｈ）のタンパク質からなる群か
ら選ばれる１つ以上のタンパク質の発現量が上昇してい
るＬ−リジン生産性細菌を用いるＬ−リジンの製造法、
前記の（Ａ）〜（Ｈ）のタンパク質からなる群から選ば
れる１つ以上のタンパク質の発現量が上昇しているＬ−
グルタミン酸生産性細菌を用いるＬ−グルタミン酸の製
造法、前記の（Ｃ）及び（Ｄ）のタンパク質からなる群
から選ばれる１つ以上のタンパク質の発現量が上昇して
いるＬ−アラニン生産性細菌を用いるＬ−アラニンの製
造法、前記の（Ｃ）及び（Ｄ）のタンパク質からなる群
から選ばれる１つ以上のタンパク質の発現量が上昇して
いるＬ−バリン生産性細菌を用いるＬ−バリンの製造
法、前記の（Ｃ）〜（Ｆ）のタンパク質からなる群から
選ばれる１つ以上のタンパク質の発現量が上昇している
Ｌ−ヒスチジン生産性細菌を用いるＬ−ヒスチジンの製
造法、前記の（Ａ）〜（Ｆ）のタンパク質からなる群か
ら選ばれる１つ以上のタンパク質の発現量が上昇してい
るＬ−プロリン生産性細菌を用いるＬ−プロリンの製造
法、前記の（Ｅ）及び（Ｆ）のタンパク質からなる群か
ら選ばれる１つ以上のタンパク質の発現量が上昇してい
るＬ−スレオニン生産性細菌を用いるＬ−スレオニンの
製造法、前記の（Ｇ）及び（Ｈ）のタンパク質からなる
群から選ばれる１つ以上のタンパク質の発現量が上昇し
ているＬ−アルギニン生産性細菌を用いるＬ−アルギニ
ンの製造法、または、前記の（Ｃ）及び（Ｄ）のタンパ
ク質からなる群から選ばれる１つ以上のタンパク質の発
現量が上昇しているＬ−イソロイシン生産性細菌を用い
るＬ−イソロイシンの製造法である。

【００１３】本発明方法においては、前記タンパク質を
コードするＤＮＡの、細菌の細胞内のコピー数が上昇し
ていることが好ましい。また、このＤＮＡは、細胞中の
マルチコピーベクター上に保持されているか、または、
細胞中のトランスポゾン上に保持されていることが好ま
しい。

【００１４】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態につい
て説明する。以下、特記しない限りアミノ酸の立体配置
はＬである。

【００１５】＜１＞本発明細菌本発明細菌は、エシェリヒア属細菌のアミノ酸の生産性
を向上させる活性又はアミノ酸もしくはアミノ酸アナロ
グに対する耐性を向上させる活性を有するタンパク質の
発現量が上昇している、アミノ酸の生産性を有するエシ
ェリヒア属細菌である。以下、このタンパク質を便宜的
に「アミノ酸排出タンパク質」と呼ぶ。しかし、この用
語は、これらのタンパク質の機能がアミノ酸排出に限定
されることを意味するものではない。

【００１６】アミノ酸排出タンパク質としては、配列表
配列番号１０、１２、１４または１６に示すアミノ酸配
列を有するタンパク質が挙げられる。

【００１７】アミノ酸排出タンパク質には、アミノ酸に
対する選択性を有するものがある。各アミノ酸について
適切なアミノ酸排出タンパク質は、アミノ酸の生産性を
有するエシェリヒア属細菌においてそのアミノ酸排出タ
ンパク質を発現させ、アミノ酸の収率の向上を測定する
こと又はアミノ酸もしくはアミノ酸アナログの最小阻止
濃度（ＭＩＣ）の増加を測定することによって選択する
ことができる。

【００１８】例えば、リジンの場合には、配列番号１
０、１２または１６に示すアミノ酸配列を有するタンパ
ク質が有効である。グルタミン酸の場合には、配列番号
１０、１２、１４または１６に示すアミノ酸配列を有す
るタンパク質が有効である。アラニンの場合には、配列
番号１２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質が有効
である。バリンの場合には、配列番号１２に示すアミノ
酸配列を有するタンパク質が有効である。ヒスチジンの
場合には、配列番号１２または１４に示すアミノ酸配列
を有するタンパク質が有効である。プロリンの場合に
は、配列番号１０、１０、１２または１４に示すアミノ
酸配列を有するタンパク質が有効である。スレオニンの
場合には、配列番号１４に示すアミノ酸配列を有するタ
ンパク質が有効である。アルギニンの場合には、配列番
号１６に示すアミノ酸配列を有するタンパク質が有効で
ある。イソロイシンの場合には、配列番号１２に示すア
ミノ酸配列を有するタンパク質が有効である。

【００１９】本明細書において、「発現量が上昇してい
る」とは、通常には、E.coliの野生株（例えばMG1655株
及びW3110株）よりも発現量が多いことを意味し、ま
た、遺伝子組換え技術等による改変により菌株を得た場
合には、改変前の菌株よりも発現量が多いことを意味す
る。アミノ酸排出タンパク質の発現量は、アミノ酸排出
タンパク質の定量により直接的に決定してもよいし、ア
ミノ酸排出タンパク質を有するエシェリヒア属細菌の、
アミノ酸もしくはアミノ酸アナログのＭＩＣの定量また
はアミノ酸の生産性の定量により間接的に決定してもよ
い。

【００２０】アミノ酸排出タンパク質の発現量を上昇さ
せる方法としては、アミノ酸排出タンパク質をコードす
るＤＮＡの、細菌の細胞内のコピー数を上昇させる方法
が挙げられる。

【００２１】細胞内のコピー数を上昇させるには、アミ
ノ酸排出タンパク質をコードするＤＮＡ断片を、エシェ
リヒア属細菌で機能するベクターと連結して組み換えＤ
ＮＡを作製し、これを宿主に導入して形質転換すればよ
い。形質転換株の細胞内のアミノ酸排出タンパク質をコ
ードする遺伝子（アミノ酸排出タンパク質遺伝子）のコ
ピー数が上昇する結果、アミノ酸排出タンパク質の発現
量が上昇する。上記ベクターとしては、マルチコピーベ
クターを用いることが好ましい。

【００２２】細胞内のコピー数の上昇は、アミノ酸排出
タンパク質遺伝子を上記宿主の染色体ＤＮＡ上に多コピ
ー存在させることによっても達成できる。エシェリヒア
属細菌に属する細菌の染色体ＤＮＡ上にアミノ酸排出タ
ンパク質遺伝子を多コピーで導入するには、染色体ＤＮ
Ａ上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換
えにより行う。染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列
としては、レペッティブＤＮＡ、転移因子の端部に存在
するインバーティッド・リピートが利用できる。あるい
は、特開平２−１０９９８５号公報に開示されているよ
うに、アミノ酸排出タンパク質遺伝子をトランスポゾン
に搭載してこれを転移させて染色体ＤＮＡ上に多コピー
導入することも可能であり、好ましい。いずれの方法に
よっても形質転換株内のアミノ酸排出タンパク質遺伝子
のコピー数が上昇する結果、アミノ酸排出タンパク質の
発現量が上昇する。

【００２３】マルチコピーベクターとしては、pBR322、
pMW118、pUC19等のプラスミドベクター、λ1059、λBF1
01、M13mp9等のファージベクターが挙げられる。また、
トランスポゾンとしては、Mu、Tn10、Tn5が挙げられ
る。

【００２４】エシェリヒア属細菌へのＤＮＡの導入は、
D. M. Morrisonの方法（Methods inEnzymology 68, 326
(1979)）あるいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理
してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel, M. and Higa,
A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)）等により行うこ
とができる。

【００２５】アミノ酸排出タンパク質の発現量の上昇
は、上記の遺伝子増幅による以外に、アミノ酸排出タン
パク質遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を強力な
ものに置換することによっても達成される（特開平１−
２１５２８０号公報参照）。たとえば、ｌａｃプロモー
ター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラム
ダファージのＰ_Rプロモーター、Ｐ_Lプロモーター等が強
力なプロモーターとして知られている。これらのプロモ
ーターへの置換により、アミノ酸排出タンパク質遺伝子
の発現が強化されることによってアミノ酸排出タンパク
質の発現量が上昇する。発現調節配列の増強は、アミノ
酸排出タンパク質遺伝子のコピー数を高めることと組み
合わせてもよい。

【００２６】本発明細菌においては、複数のアミノ酸排
出タンパク質の発現量を上昇させてもよい。

【００２７】アミノ酸排出タンパク質は、ｙａｈＮ遺伝
子、ｙｅａＳ遺伝子、ｙｆｉＫ遺伝子及びｙｇｇＡ遺伝
子として知られていた、今まで機能が不明であった遺伝
子にコードされている。従って、アミノ酸排出タンパク
質をコードするＤＮＡは、既知の塩基配列に基づいて
（例えば、エシェリヒア・コリK-12株の染色体の全塩基
配列は既に明らかにされている（Science, 277, 1453-1
474 (1997)））、プライマーを合成し、エシェリヒア属
細菌の染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ法により増幅を
行うことによって取得できる。また、既知の塩基配列に
基づいてプローブを調製し、エシェリヒア属細菌の染色
体ＤＮＡライブラリーからハイブリダイゼーションによ
り目的のＤＮＡ断片を選択することもできる。あるい
は、アミノ酸排出タンパク質をコードするＤＮＡを、既
知の塩基配列に基づいて化学的に合成してもよい。アミ
ノ酸排出タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列の例
としては、配列表配列番号９、１１、１３または１５に
示すものが挙げられる。

【００２８】染色体ＤＮＡの調製、染色体ＤＮＡライブ
ラリーの作製、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラ
スミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断及び連結、形質転
換、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設定
等の方法は、当業者によく知られている通常の方法を採
用することができる。これらの方法は、Sambrook, J.,F
ritsch, E. F., and Maniatis, T., "Molecular Clonin
g A Laboratory Manual, Second Edition," Cold Sprin
g Harbor Laboratory Press (1989)等に記載されてい
る。

【００２９】アミノ酸排出タンパク質は、そのタンパク
質を有するエシェリヒア属細菌のアミノ酸の生産性を向
上させる活性が損なわれない限り、１若しくは複数の位
置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、
付加、または逆位を含んでもよい。ここで、「数個」と
は、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置
や種類によっても異なる。それは、イソロイシンとバリ
ンのように、アミノ酸によっては、類縁性の高いアミノ
酸が存在し、そのようなアミノ酸の違いが、タンパク質
の立体構造に大きな影響を与えないことに由来する。

【００３０】上記のようなアミノ酸排出タンパク質と実
質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば
部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸残基
が置換、欠失、挿入、付加、または逆位を含むように塩
基配列を改変することによって得られる。また、上記の
ような改変されたＤＮＡは、従来知られている変異処理
によっても取得され得る。変異処理としては、アミノ酸
排出タンパク質をコードするＤＮＡをヒドロキシルアミ
ン等でインビトロ処理する方法、及びアミノ酸排出タン
パク質をコードするＤＮＡを保持する微生物、例えばエ
シェリヒア属細菌を、紫外線照射またはＮ−メチル−
Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（NG）もしくは
亜硝酸等の通常に変異処理に用いられている変異剤によ
って処理する方法が挙げられる。

【００３１】また、上記のようなアミノ酸残基の置換、
欠失、挿入、付加、または逆位等には、アミノ酸排出タ
ンパク質を保持する微生物の個体差、種や株の違いに基
づく場合などの天然に生じる変異（mutantionまたはvar
iantion）も含まれる。

【００３２】上記のような変異を有するＤＮＡを、適当
なエシェリヒア属細菌の細胞で発現させ、その細胞のア
ミノ酸の生産性の向上を調べることにより、アミノ酸排
出タンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードする
ＤＮＡが得られる。

【００３３】また、変異を有するアミノ酸排出タンパク
質をコードするＤＮＡまたはこれを保持する細胞から、
例えば配列表の配列番号９、１１、１３または１５に記
載の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件
下でハイブリダイズし、かつ、エシェリヒア属細菌のア
ミノ酸の生産性を向上させる活性を有するタンパク質を
コードするＤＮＡを単離することによっても、アミノ酸
排出タンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードす
るＤＮＡが得られる。ここでいう「ストリンジェントな
条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成さ
れ、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をい
う。この条件を明確に数値化することは困難であるが、
一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば７０％
以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、
それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしな
い条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーション
の洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤ
Ｓ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相
当する塩濃度の条件が挙げられる。

【００３４】このような条件でハイブリダイズする遺伝
子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活
性中心の変異により活性を失ったタンパク質をコードす
るものも含まれるが、それらについては、市販の活性発
現ベクターにつなぎ、エシェリヒア属細菌のアミノ酸の
生産性を向上させる活性を前記の方法で測定することに
よって容易に取り除くことができる。

【００３５】なお、「タンパク質をコードするＤＮＡ」
とは、ＤＮＡが二本鎖の場合にはそのいずれか一方の鎖
がタンパク質をコードすることを意味する。

【００３６】アミノ酸の生産性を有するエシェリヒア属
細菌において、上記のようにしてアミノ酸排出タンパク
質の発現量を上昇させると、そのアミノ酸の生産量を増
大させることができる。アミノ酸排出タンパク質の発現
量を上昇させるエシェリヒア属細菌としては、目的とす
るアミノ酸を産生する能力（アミノ酸の生産性）を有す
る菌株を用いる。また、アミノ酸排出タンパク質の発現
量が上昇したエシェリヒア属細菌に、アミノ酸の生産性
を付与してもよい。エシェリヒア属に属するアミノ酸生
産菌の例としては、E. coli AJ13199（フランス特許第
２７４７６８９号）、公知の材料から得られる細菌（例
えば、後記実施例に記載したE. coli W3110(tyrA)/pCAB
D2、E. coli VL614、E. coli VL2054、E. coli VL216
0、E. coliVL2151、E. coli W3350 argE::Tn10/pKA10）
が挙げられる。

【００３７】なお、本発明におけるアミノ酸排出タンパ
ク質は、以下のようにして本発明者らによって初めて同
定されたものである。

【００３８】本発明者らはエシェリヒア属細菌のスレオ
ニン排出タンパク質の遺伝子としてrhtB、rhtCを同定し
ている。本発明者らは、アミノ酸排出タンパク質には共
通する構造が存在するかもしれないという仮説に基づき
データベースの検索を行った。すなわち、rhtBのコード
するタンパク質に対するホモロジー検索をBLAST、及びP
SI-BLAST(Altschul, S. F. et al., Nucleic Acids Re
s., 25, 3389-3402(1997))を用いて、GenBank CDS、PD
B、SWISS-PROT、Spupdate、PIRに対して行った。またtb
lastn searchを微生物ゲノムの部分配列に対して行っ
た。またBLITZ search(Sturrock, S. S., and Collins,
J. F., MPsch version 1.3. Biocomputing research u
nit University of Edinburgh, UK(1993))をSWALL data
baseに対して、SMART search(Ogiwara, I. et al., Pro
tein Sci., 5, 1991-1999(1996))を翻訳データベースや
SWISS-PROTに対して行った。その結果得られた６０以上
の候補の中からE.coli由来のものとしてYeaS（GenBank
のACCESSION No.AE000274のf212に対応）、YahN（GenBa
nkのACCESSION No.AE000140のf223に対応）、YfiK（Gen
BankのACCESSION No.AE000344のo195に対応）及びYggA
（GenBankのACCESSION No.AE000375のf211に対応）がRh
tBと機能的に類似する可能性のあるタンパク質として残
った。これらの機能はいずれも不明であったため、実際
にこれらの遺伝子を取得し、その活性を高めることによ
りアミノ酸及びアミノ酸アナログのＭＩＣ並びにL-リジ
ン生産に与える影響を確認した。その結果、YeaS、Yfi
K、YahN及びYggAにアミノ酸及びアミノ酸アナログのい
くつかのＭＩＣを増大させる効果が見いだされた。さら
に検討した結果、これらの遺伝子のコードするタンパク
質は、アミノ酸特異性があるものの、アミノ酸の蓄積を
増大させる効果があることが判明した。

【００３９】＜２＞本発明方法本発明方法は、本発明細菌を培地で培養し、該培地中に
アミノ酸を生産蓄積せしめ、該培地からアミノ酸を採取
することを特徴とする。

【００４０】好適なアミノ酸としては、リジン、グルタ
ミン酸、アラニン、バリン、ヒスチジン、プロリン、ス
レオニン、アルギニン、イソロイシンなどが挙げられ
る。

【００４１】本発明方法におけるエシェリヒア属細菌の
培養および培養液からのアミノ酸の採取、精製等は、従
来の微生物を用いた発酵法によるアミノ酸の製造法と同
様にして行えばよい。培養に使用する培地としては、炭
素源、窒素源、無機物を含有し、必要があれば使用菌株
が生育に要求する栄養源を適当量含有するものであれ
ば、合成培地でも天然培地でもよい。炭素源としては、
グルコースやシュークロースをはじめとする各種炭水化
物、各種有機酸があげられる。また使用する微生物の資
化性によってはエタノールやグリセロール等のアルコー
ルを用いることが出来る。窒素源としては、アンモニア
や、硫酸アンモニウム等の各種のアンモニウム塩類や、
アミン類その他の窒素化合物や、ペプトン、大豆加水分
解物、発酵菌体分解物等の天然窒素源を用いることが出
来る。無機物としては、燐酸一カリウム、硫酸マグネシ
ウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、炭
酸カルシウム等が用いられる。

【００４２】培養は、振盪培養、通気撹拌培養等の好気
的条件下で行うことが好ましく、培養温度は通常には２
０〜４０℃で、好ましくは３０〜３８℃の範囲で行う。
培地のｐＨは通常には５〜９の範囲であり、６．５〜
７．２の範囲が好ましい。培地のｐＨは、アンモニア、
炭酸カルシウム、各種酸、各種塩基、緩衝液などによっ
て調整することができる。通常、１〜３日の培養によっ
て、培養液中に目的とするアミノ酸が蓄積する。

【００４３】培養終了後、培養液から菌体などの固形物
を遠心分離や膜分離法で除去し、イオン交換法、濃縮
法、晶析法等によって目的とするアミノ酸を採取、精製
することが出来る。

【００４４】

【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。

【００４５】

【実施例１】アミノ酸排出タンパク質をコードするＤＮ
Ａ断片の調製エシェリヒア・コリ(E. coli)K-12株の染色体の全塩基
配列は既に明らかにされている（Science, 277, 1453-1
474 (1997)）。報告されている塩基配列に基づいてプラ
イマーを合成し、yahN、yfiK、yeaS及びyggAの遺伝子を
ＰＣＲ法により増幅した。

【００４６】（１）エシェリヒア・コリMG1655株の染色
体ＤＮＡを鋳型として用いての調製染色体ＤＮＡを常法（Sambrook, J., Fritsch E. F. an
d Maniatis T. (1989)Molecular cloning: a laborator
y manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Pr
ess, Cold Spring Harbor, N. Y.）により調製した。Ｐ
ＣＲ反応には、"PCR protocols. Current methods and
applications". (White, B.A., ed. Humana Press, Tot
owa, New Jersey, 1993)に記載の標準条件を用いた。得
られたＰＣＲ産物は常法により精製し、下記のように制
限酵素で切断した。

【００４７】yahN遺伝子は以下のプライマー１及び２を
用いて増幅した。プライマー１：gtgtggaaccgacgccggat （GenBankのACC
ESSION No. AE000140の塩基配列の塩基番号1885〜1904
の配列に相補的な配列；配列番号１７）プライマー２：tgttgtatggtacggggttcgag （同塩基配列
の塩基番号223〜245の配列；配列番号１８）

【００４８】精製したＰＣＲ産物を制限酵素PstI及びSt
uIで切断し、制限酵素PstI及びEcoRVで切断したベクタ
ーpUC21（Vieira, Messing, Gene, 100, 189-194, 199
1）にライゲーションキットを用いて連結した。生成物
によりエシェリヒア・コリTG1のコンピテントセルを形
質転換し（Sambrook, J., Fritsch E. F. and Maniatis
T. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual,
2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor, N. Y.）、細胞を、IPTG（イソプロピル
−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）10μg/ml、X-Gal
（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−
ガラクトシド）40μg/ml及びアンピシリン100μg/mlを
含むＬ培地（バクトトリプトン10 g/L、イーストエキス
トラクト5 g/L、NaCl 5 g/L、寒天15 g/L、pH7.0）に塗
布し、一晩培養した。出現した白色のコロニーを釣り上
げ、単コロニー分離し、形質転換株を得た。形質転換株
からアルカリ抽出法によりプラスミドを調製し、pYAHN
と名付けた。

【００４９】yeaS遺伝子は以下のプライマー３及び４を
用いて増幅した。プライマー３：ctttgccaatcccgtctccc（GenBankのACCES
SION No. AE000274の塩基配列の塩基番号7683〜7702の
配列に相補的な配列；配列番号１９）プライマー４：gccccatgcataacggaaag（同塩基配列の塩
基番号5542〜5561の配列；配列番号２０）

【００５０】精製したＰＣＲ産物を制限酵素AvaIで切断
し、ベクターpUC19に連結した。上記と同様にエシェリ
ヒア・コリTG1を形質転換し、pYEASと名付けたプラスミ
ドを得た。

【００５１】yfiK遺伝子は以下のプライマー５及び６を
用いて増幅した。プライマー５：gaagatcttgtaggccggataaggcg（5'末端に
制限酵素BglII部位を付加した、GenBankのACCESSION N
o. AE000344の塩基配列の塩基番号4155〜4177の配列；
配列番号２１）プライマー６：tggttttaccaattggccgc（同塩基配列の塩
基番号6307〜6326の配列に相補的な配列；配列番号２
２）

【００５２】精製したＰＣＲ産物を制限酵素BglII及びM
unIで切断し、制限酵素BglII及びEcoRIで切断したベク
ターpUC21に連結した。上記と同様にエシェリヒア・コ
リTG1を形質転換し、pYFIKと名付けたプラスミドを得
た。

【００５３】yggA遺伝子は以下のプライマー７及び８を
用いて増幅した。プライマー７：（GenBankのACCESSION No. AE000375の
塩基配列の塩基番号9606〜9626の配列に相補的な配列；
配列番号２３）プライマー８：（同塩基配列の塩基番号8478〜8498の配
列；配列番号２４）

【００５４】精製したＰＣＲ産物を制限酵素HindIII及
びClaIで切断し、同制限酵素で切断したベクターpOK12
（Vieira, Messing, Gene, 100, 189-194, 1991）に連
結した。上記と同様にエシェリヒア・コリTG1を形質転
換し、pYGGAと名付けたプラスミドを得た。

【００５５】（２）エシェリヒア・コリW3110株の染色
体ＤＮＡを鋳型として用いての調製 yahN遺伝子は、プライマー９（配列番号１）及びプライ
マー１０（配列番号２）を用いて増幅した。

【００５６】yeaS遺伝子は、プライマー１１（配列番号
３）及びプライマー１２（配列番号４）を用いて増幅し
た。

【００５７】yfiK遺伝子は、プライマー１３（配列番号
５）及びプライマー１４（配列番号６）を用いて増幅し
た。

【００５８】yggA遺伝子は、プライマー１５（配列番号
７）及びプライマー１６（配列番号８）を用いて増幅し
た。

【００５９】生成したＰＣＲ産物を精製後、制限酵素Sa
cI及びXbaI（yggAに対してはEcoRI及びPstI）で切断
し、プラスミドpMW118（日本ジーン製）と連結した。報
告されている塩基配列と一致するＤＮＡ断片が挿入され
ているプラスミドを下記のように名付けた。

【００６０】yahNを搭載しているもの：pMW118::yahN yeaSを搭載しているもの：pMW118::yeaS yfiKを搭載しているもの：pMW118::yfiK yggAを搭載しているもの：pMW118::yggA

【００６１】

【実施例２】アミノ酸及びアミノ酸アナログに対するエ
シェリヒア・コリTG1株の耐性に対する、yahN、yeaS、y
fiK及びyggAのＤＮＡ断片の増幅の効果 yeaS、yfiK、yahN及びyggA遺伝子産物の、コリネバクテ
リウム・グルタミカムのリジン輸送体lysE（Vrljic et
al., Mol. Microbiol., 22, 815-826, 1996）及びホモ
セリン排出に関与するRhtBタンパク質に対する相同性
は、これらのタンパク質が同様な機能を有することを示
唆する。抗生物質及び重金属の排出に関与する遺伝子の
発現の増強が薬物に対する耐性のレベルを上昇させるこ
とが知られている（Nikaido, H. J. Bacteriology, 17
8, 5853-5859, 1996）。従って、pYEAS、pYAHN、pYFIK
及びpYGGAプラスミドの、TG1株のアミノ酸酸及びアミノ
酸アナログへの感受性に対する影響を試験した。エシェ
リヒア・コリTG1/pYEAS株、TG1/pYAHN株、TG1/pYFIK
株、TG1/pYGGA株並びに対照株のTG1/pUC21株、TG1/pUC1
9及びTG1/pOK12株を、適切な抗生物質を加えたＭ９最少
培地でロータリーシェーカーにより培養した一夜培養物
（10⁹cfu/ml）を、Ｍ９最少培地で1:100に希釈し、同
培地で５時間培養した。このようにして得られた対数増
殖期の培養液を希釈し、約10⁴の生存細胞を、２倍づつ
増加させた量のアミノ酸又はアミノ酸アナログを含む、
よく乾かしたＭ９寒天培地にプレーティングした。この
ようにして、これらの化合物の最小阻止濃度（ＭＩＣ）
を調べた。

【００６２】結果を表１に示す。表１から分かるよう
に、yfiK遺伝子の多コピーにより、プロリン、ホモセリ
ン、ヒスチジン、スレオニン、グルタミン酸、リジン、
α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸（ＡＨＶＡ）、Ｓ−
（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン（ＡＥＣ）及び
α−アミノ酪酸に対する耐性が増大し、yahN遺伝子の多
コピーにより、プロリンに対する耐性が増大し、yeaS遺
伝子の多コピーにより、スレオニン、ホモセリン、リジ
ン、グルタミン酸、ヒスチジン、プロリン及びα−アミ
ノ酪酸に対する耐性が増大し、yggA遺伝子の多コピーに
より、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン（Ａ
ＥＣ）、リジン及びアルギニンに対する耐性が増大し
た。これらの結果は、yahNを除いて、推定の輸送体が数
種の基質（アミノ酸及びアミノ酸アナログ）に対して特
異性を有すること、または、増幅の結果、非特異性を示
す可能性があることを示している。

【００６３】

【表１】表１ ──────────────────────────────────── 下記プラスミドを保持するエシェリヒア・コリ TG1株の最小阻止濃度（μg/ml）基質 ────────────────────── pUC21 pYFIK pYANH pYEAS pYGGA ──────────────────────────────────── ホモセリン 500 1000 500 1000 500 スレオニン 30000 40000 30000 50000 30000 リジン 5000 7500 5000 7500 15000 グルタミン酸ナトリウム 5000 10000 5000 20000 5000 ヒスチジン 5000 10000 5000 30000 5000 バリン 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 プロリン 1000 5000 2000 2000 1000 アルギニン 10000 10000 10000 10000 20000 ＡＨＶＡ 100 200 100 100 100 ＡＥＣ 5 10 5 5 200 α−アミノ酪酸 2500 5000 2500 >10000 2500 ４−アザ−DL−ロイシン 100 100 100 100 100 ────────────────────────────────────

【００６４】

【実施例３】グルタミン酸生産に対する、yeaS、yahN及
びyfiKのＤＮＡ断片の増幅の効果エシェリヒア・コリAJ13199株（フランス特許第2747689
号）を、ベクターpUC21並びにpYAHN、pYEAS及びpYFIKの
それぞれで形質転換し、AJ13199/pUC21株（VKPM B-772
8）、AJ13199/pYAHN株（VKPM B-7729）、AJ13199/pYEAS
株（VKPM B-7731）及びAJ13199/pYFIK株（VKPM B-773
0）を得た。

【００６５】これらの株のそれぞれを、100 mg/lアンピ
シリンを含む栄養ブイヨンで37℃において18時間培養し
た。得られた培養物の0.3 mlを、20×200 mm試験管中
の、100 mg/lアンピシリンを含む発酵培地の3 mlに接種
し、ロータリーシェーカーで37℃において48時間培養し
た。培養後、培地中に蓄積したグルタミン酸の量を公知
の方法により測定した。

【００６６】発酵培地の組成を以下に示す（単位g/
l）。

【００６７】グルコース 80 (NH₄)₂SO₄ 22 K₂HPO₄ 2 NaCl 0.8 MgSO₄・7H₂O 0.8 FeSO₄・7H₂O 0.02 MnSO₄・5H₂O 0.02 チアミン塩酸 0.0002 イーストエキストラクト 1.0 CaCO₃ 30.0（180℃で２時間乾熱滅菌したもの）（グルコース、K₂HPO₄は別殺）

【００６８】結果を表２に示す。表２から分かるよう
に、AJ13199/pYAHN株、AJ13199/pYEAS株及びAJ13199/pY
FIK株は、アミノ酸排出タンパク質の発現量が増大して
いないAJ13199/pUC21株と比較して多量のグルタミン酸
を蓄積した。

【００６９】

【表２】表２ ────────────────── 菌株グルタミン酸蓄積量(g/l) ────────────────── AJ13199/pUC21 21.9 AJ13199/pYAHN 27.9 AJ13199/pYEAS 29.7 AJ13199/pYFIK 28.4 ──────────────────

【００７０】

【実施例４】リジン生産に対する、yeaS、yahN及びyfiK
のＤＮＡ断片の増幅の効果（１）リジン生産性エシェリヒア属細菌として、国際公
開第WO95/16042号記載の、プラスミドpCABD2が導入され
たE. coli W3110(tyrA)株（欧州特許第488424号記載）
を用いた。具体的には、E. coli W3110(tyrA)株に、プ
ラスミドpCABD2と共にプラスミドpMW118::yahN、pMW11
8::yeaS、pMW118::yfiK及びpMW118のいずれかを導入
し、以下の菌株を得た。

【００７１】W3110(tyrA)/pCABD2+pMW118::yahN W3110(tyrA)/pCABD2+pMW118::yeaS W3110(tyrA)/pCABD2+pMW118::yfiK W3110(tyrA)/pCABD2+pMW118

【００７２】これら菌株のリジン生産性について培養評
価を行った。用いた培地の組成を以下に示す（単位g/
l）。

【００７３】グルコース 40.0 MgSO₄・7H₂O 1.0 (NH₄)₂SO₄ 16.0 K₂HPO₄ 1.0 FeSO₄・7H₂O 0.01 MnSO₄・7H₂O 0.01 イーストエキストラクト(Difco) 2.0 チロシン 0.1 KOHでpH7.0に調整し、115℃で10分オートクレーブ（但
しグルコース及びMgSO₄・7H₂Oは別殺）局方CaCO₃ 25g/l（180℃で２時間乾熱滅菌したもの）

【００７４】抗生物質として、プラスミドの種類に応じ
てストレプトマイシン20 mg/l及びアンピシリン50 mg/l
を添加した。培養は、温度３７℃、攪拌115rpmの条件下
で３０時間行った。結果を表３に示す。

【００７５】

【表３】表３ ─────────────────────────────────── 菌株リジンの蓄積量(g/l) 対消費糖収率(%) ─────────────────────────────────── W3110(tyrA) 0.08 0.2 W3110(tyrA)/pCABD2+pMW118 12.2 30.5 W3110(tyrA)/pCABD2+pMW118::yahN 13.8 34.5 W3110(tyrA)/pCABD2+pMW118::yeaS 12.7 31.8 W3110(tyrA)/pCABD2+pMW118::yfiK 12.2 30.5 ───────────────────────────────────

【００７６】表３の結果から、YahN及びYeaSの増強によ
り、リジンの蓄積量及び対消費糖収率が向上することが
示される。

【００７７】（２）リジン生産性エシェリヒア属細菌と
して、E. coli VL614株を用いた。この株は、公知のE.
coli VL613株（ロシア特許第1354458号）の誘導体であ
る。VL613株は、公知のGif102株（Theze, J. and Saint
Girons. J.Bacteriol., 118,990-998, 1974）から以下
の三段階の工程で得られた。

【００７８】第１段階で、2 mg/mlのＳ−（２−アミノ
エチル）−Ｌ−システインに耐性の変異体が選択され、
その中に、リジンを生産できるVL611株が見い出され
た。

【００７９】第２段階で、シュークロースの資化性に関
与し、トランスポゾンTn2555に位置する遺伝子（Dorosh
enko et al., Mol. Biologiya, 22, 645-658, 1988）
が、ファージＰ１媒介形質導入によりVL611株に導入さ
れ、VL612株が得られた。

【００８０】第３段階で、スレオニン及びホモセリンに
対する耐性を付与する、VKPM B-3996株由来のrhtA23変
異（米国特許第5,175,107号）が、ファージＰ１媒介形
質導入によりVL612株に導入され、VL613株が得られた。

【００８１】E. coli VL614株は、E. coli VKPM B-6204
株（MG1655 zbi3058::Tn10）由来のrhtA遺伝子の野生型
対立遺伝子の、VL613株への形質導入により得られた。
形質導入体は、10 mg/lテトラサイクリンを含むＬ培地
で選択され、その中に、10 g/lホモセリンに感受性のVL
614株（rhtA⁺）が見い出された。

【００８２】VL614株を、プラスミドpYGGA又はベクター
pOK12で形質転換し、VL614/pYGGA株（VKPM B-7719）及
びVL614/pOK12株（VKPM B-7722）を得た。

【００８３】これらの株のそれぞれを、50 mg/lカナマ
イシンを含む栄養ブイヨンで37℃において18時間培養し
た。得られた培養物の0.3 mlを、20×200 mm試験管中
の、0.3 g/lメチオニン及び50 mg/lカナマイシンを含む
発酵培地（実施例３）の3 mlに接種し、ロータリーシェ
ーカーで37℃において48時間培養した。培養後、培地中
に蓄積したリジン及びグルタミン酸の量を公知の方法に
より測定した。結果を表４に示す。

【００８４】

【表４】表４ ────────────────────────────── 菌株リジン蓄積量(g/l) グルタミン酸蓄積量(g/l) ────────────────────────────── VL614/pOK12 2.6 0.8 VL614/pYGGA 3.6 2.2 ──────────────────────────────

【００８５】表４から分かるように、VL614/pYGGA株
は、yggA遺伝子が増強されていないVL614/pOK12株と比
較して多量のリジンを蓄積した。さらに、VL614/pYGGA
株は、VL614/pOK12株よりも多量にグルタミン酸を蓄積
した。

【００８６】

【実施例５】スレオニン、アラニン、バリン及びイソロ
イシン生産に対する、yeaS、yahN及びyfiKのＤＮＡ断片
の増幅の効果スレオニン生産性エシェリヒア属細菌とし
て、E. coli VL2054株を用いた。この株は公知のE. col
i VKPM B-3996株（米国特許第5,175,107号）から以下の
ように誘導された。

【００８７】まず、新規な受容株を数段階の工程で構築
した。・VKPM B-3996株のプラスミド非保持誘導体を、プラス
ミドpVIC40の自然排除(spontaneous elimination)によ
り選択した。・E. coli VKPM B-6204株(MG1655 zbi3058::Tn10)由来
のrhtA遺伝子の野生型対立遺伝子を、上記で得られた株
に、実施例４と同様にファージＰ１媒介形質導入により
導入した。・tdh遺伝子に挿入されたTn5トランスポゾンのkan遺伝
子を不活化する変異を、NG突然変異誘発及びスレオニン
を分解できないカナマイシン感受性細胞の選択により得
た。このようにしてVL2053株が得られた。

【００８８】一方、pVIC40からのスレオニンオペロン
を、組込みMudベクターへファージλのＰ_Rプロモーター
の制御下にクローニングした。さらに、クロラムフェニ
コールに対する耐性を付与するTn9のcat遺伝子を同ベク
ターにクローニングした。得られた構築物を、公知の方
法（米国特許第5,595,889号）により、E. coli C600株
の染色体に挿入した。このようにして得られた株からVL
2053株に形質導入を行い、プラスミド非保持スレオニン
生産性VL2054株を得た。この株は、培養液中に、アラニ
ン、バリン及びイソロイシンも蓄積した。

【００８９】VL2054株を、プラスミドpYEAS、pYFIK、及
び、ベクターpUC21のそれぞれにより形質転換し、E. co
li VL2054/pYEAS株（VKPM B-7707）、VL2054/pYFIK株
（VKPM B-7712）及びVL2054/pUC21株（VKPM B-7708）を
得た。

【００９０】これらの株のそれぞれを、100 mg/lアンピ
シリンを含む栄養ブイヨンで37℃において18時間培養し
た。得られた培養物の0.3 mlを、20×200 mm試験管中
の、100 mg/lアンピシリンを含む発酵培地（実施例３）
の3 mlに接種し、ロータリーシェーカーで37℃において
48時間培養した。培養後、培地中に蓄積したスレオニ
ン、アラニン、バリン及びイソロイシンの量を公知の方
法により測定した。結果を表５に示す。

【００９１】表５から分かるように、VL2054/pYFIK株
は、yfiK遺伝子が増強されていないVL2054/pUC21株と比
較して多量のスレオニンを蓄積した。また、VL2054/pYE
AS株は、yeaS遺伝子が増強されていないVL2054/pUC21株
と比較して多量のアラニン、バリン及びイソロイシンを
蓄積した。

【００９２】

【表５】表５ ────────────────────────────── アミノ酸蓄積量(g/l) 菌株スレオニンアラニンバリンイソロイシン ────────────────────────────── VL2054/pUC21 5.8 0.4 0.31 0.15 VL2054/pYEAS 5.2 1.4 0.52 0.45 VL2054/pYFIK 8.8 0.5 0.22 0.14 ──────────────────────────────

【００９３】

【実施例６】ヒスチジン生産に対する、yeaS及びyfiKの
ＤＮＡ断片の増幅の効果ヒスチジン生産性エシェリヒア属細菌として、E. coli
VL2160株を用いた。この株は、公知のNK5526 hisG::Tn1
0株（VKPM B-3384）に基づき、CC46株由来のATP-ホスホ
リボシルトランスフェラーゼを非感受性にするhisG^R変
異（Astvatsaturianz et al., Genetika, 24, 1928-193
4, 1988）のファージＰ１媒介形質導入により得られ
た。

【００９４】VL2160株を、プラスミドpYEAS、pYFIK、及
び、ベクターpUC21のそれぞれにより形質転換し、E. co
li VL2160/pYEAS株（VKPM B-7753）、VL2160/pYFIK株
（VKPM B-7754）及びVL2160/pUC21株（VKPM B-7752）を
得た。

【００９５】これらの株のそれぞれを、100 mg/lアンピ
シリンを含む栄養ブイヨンで37℃において18時間培養し
た。得られた培養物の0.3 mlを、20×200 mm試験管中
の、イーストエキストラクトの量を増加し(3 g/l)、100
mg/lアンピシリンを含む発酵培地（実施例３）の3 ml
に接種し、ロータリーシェーカーで34℃において68時間
培養した。

【００９６】培養後、培地中に蓄積したヒスチジンの量
を公知の方法により測定した。結果を表６に示す。

【００９７】

【表６】表６ ──────────────────── 菌株ヒスチジン蓄積量(g/l) ──────────────────── VL2160/pUC21 1.2 VL2160/pYEAS 1.8 VL2160/pYFIK 1.4 ────────────────────

【００９８】表６から分かるように、VL2160/pYEAS株及
びVL2160/pYFIK株は、yeaS遺伝子及びyfiK遺伝子が増強
されていないVL2160/pUC21株と比較して多量のヒスチジ
ンを蓄積した。

【００９９】

【実施例７】プロリン生産に対する、yahN、yfiK及びye
aSのＤＮＡ断片の増幅の効果プロリン生産性エシェリヒア属細菌として、E. coli VL
2151株(W3110 proB*ΔputAP Tn10)を用いた。この株
は、Tn10にリンクしたΔputAP変異をW3350株に形質導入
し、単独の炭素源としてプロリンを使用できないテトラ
サイクリン耐性形質導入体を選択することにより得られ
た。このようにして得られたW3350 ΔputAP Tn10株をNG
で変異誘発処理し、20 mg/lの3,4-デヒドロ-DL-プロリ
ンに耐性の変異体を選択した。この中に、プロリンを生
産できるVL2151株（W3350 proB* ΔputAP Tn10）が見い
出された。

【０１００】VL2151株を、プラスミドpYEAS、pYFIK、pY
AHN及び、ベクターpUC21のそれぞれにより形質転換し、
E. coli VL2151/pYEAS株（VKPM B-7714）、VL2151/pYFI
K株（VKPM B-7713）、VL2151/pYAHN株（VKPM B-7748）
及びVL2151/pUC21株（VKPM B-7715）を得た。

【０１０１】これらの株のそれぞれを、100 mg/lアンピ
シリンを含む栄養ブイヨンで37℃において18時間培養し
た。得られた培養物の0.3 mlを、20×200 mm試験管中
の、100 mg/lアンピシリンを含む発酵培地（実施例３）
の3 mlに接種し、ロータリーシェーカーで37℃において
48時間培養した。

【０１０２】培養後、培地中に蓄積したプロリンの量を
公知の方法により測定した。結果を表７に示す。

【０１０３】

【表７】表７ ──────────────────── 菌株プロリン蓄積量(g/l) ──────────────────── VL2151/pUC21 1.8 VL2151/pYAHN 2.2 VL2151/pYEAS 2.1 VL2151/pYFIK 2.5 ────────────────────

【０１０４】表７から分かるように、VL2151/pYFIK株、
VL2151/pYAHN株及びVL2151/pYEAS株は、yfiK遺伝子、ya
hN遺伝子及びyeaS遺伝子が増強されていないVL2151/pUC
21株と比較して多量のプロリンを蓄積した。yfiK遺伝子
の増幅が最も顕著な効果を示した。

【０１０５】

【実施例８】アルギニン生産に対する、yggAＤＮＡ断片
の増幅の効果アルギニン生産性エシェリヒア属細菌として、E. coli
W3350 argE::Tn10/pKA10株を用いた。この株は、E. col
i K-12株の受容株において少なくともargA及びargE変異
を相補する、コリネバクテリウム（ブレビバクテリウ
ム）・フラバム由来のＤＮＡ領域を含むプラスミドpKA1
0（Kharitonov A. and Tarasov A.P. Molecular Geneti
cs, Microbiology and Virology. No.9, 29-33, 1986）
を保持する。

【０１０６】W3350 argE::Tn10/pKA10株を、プラスミド
pYGGA又はベクターpOK21により形質転換し、E. coli W3
350 argE::Tn10/pKA10, pYGGA株（VKPM B-7716）及びW3
350argE::Tn10/pKA10, pOK12株（VKPM B-7718）を得
た。

【０１０７】これらの形質転換体のそれぞれを、100 mg
/lアンピシリン及び50 mg/lカナマイシンを含む栄養ブ
イヨンで37℃において18時間培養した。得られた培養物
の0.3 mlを、20×200 mm試験管中の、100 mg/lアンピシ
リン及び50 mg/lカナマイシンを含む発酵培地（実施例
３）の3 mlに接種し、ロータリーシェーカーで37℃にお
いて48時間培養した。

【０１０８】培養後、培地中に蓄積したアルギニンの量
を公知の方法により測定した。結果を表８に示す。

【０１０９】

【表８】表８ ─────────────────────────── 菌株アルギニン蓄積量(g/l) ─────────────────────────── W3350 argE::Tn10/pKA10, pOK12 0.11 W3350 argE::Tn10/pKA10, pYGGA 0.46 ───────────────────────────

【０１１０】表８から分かるように、W3350 argE::Tn10
/pKA10, pYGGA株は、yggA遺伝子が増強されていないW33
50 argE::Tn10/pKA10, pOK12株と比較して多量のアルギ
ニンを蓄積した。

【０１１１】以下のE. coliの株は、ルシアン・ナショ
ナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイク
ロオーガニズムズ（Russian National Collection of I
ndustrial Microorganisms；ＶＫＰＭ）に、1998年12月
29日から、括弧内に示した受託番号で（ブタペスト条約
に基づく国際寄託に従い）寄託されている。

【０１１２】AJ13199/pUC21 (VKPM B-7728) AJ13199/pYAHN (VKPM B-7729) AJ13199/pYEAS (VKPM B-7731) AJ13199/pYFIK (VKPM B-7730) VL614/pYGGA (VKPM B-7719) VL614/pOK12 (VKPM B-7722) VL2054/pYEAS (VKPM B-7707) VL2054/pYFIK (VKPM B-7712) VL2054/pUC21 (VKPM B-7708) VL2160/pYEAS (VKPM B-7753) VL2160/pYFIK (VKPM B-7754) VL2160/pUC21 (VKPM B-7752) VL2151/pYFIK (VKPM B-7713) VL2151/pYEAS (VKPM B-7714) VL2151/pYAHN (VKPM B-7748) VL2151/pUC21 (VKPM B-7715) W3350 argE::Tn10/pKA10, pYGGA (VKPM B-7716) W3350 argE::Tn10/pKA10, pOK12 (VKPM B-7718)

【０１１３】

【発明の効果】本発明により、エシェリヒア属細菌のＬ
−アミノ酸の生産能を向上させることができる。また、
Ｌ−アミノ酸の製造方法においてＬ−アミノ酸の生産速
度を改善することができる。

【０１１４】

【配列表】 <110> 味の素株式会社(Ajinomoto Co., Inc.) <120> Ｌ−アミノ酸の製造法 <130> P-6167F <150> RU 98124016 <151> 1998-12-30 <150> RU 99104431 <151> 1999-03-09 <160> 24 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for amplifying Escheric hia coli yahN gene <400> 1 ggcgagctcc cagtaaccgg aaataag 27 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for amplifying Escheric hia coli yahN gene <400> 2 cgctctagaa aggaccacgc attacgg 27 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for amplifying Escheric hia coli yeaS gene <400> 3 ggcgagctca gattggttag catattc 27 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for amplifying Escheric hia coli yeaS gene <400> 4 cggtctagaa tcagcgaaga atcaggg 27 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for amplifying Escheric hia coli yfiK gene <400> 5 ggcgagctca tgttccgtgt cgggtac 27 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for amplifying Escheric hia coli yfiK gene <400> 6 ggctctagat agcaagttac taagcgg 27 <210> 7 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for amplifying Escheric hia coli yggA gene <400> 7 ctctgaattc tctcttatta gtttttctga ttgcc 35 <210> 8 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for amplifying Escheric hia coli yggA gene <400> 8 cgtgacctgc agcgttctca cagcgcggta gcctttaa 38 <210> 9 <211> 672 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (1)..(672) <400> 9 atg atg cag tta gtt cac tta ttt atg gat gaa atc act atg gat cct 48 Met Met Gln Leu Val His Leu Phe Met Asp Glu Ile Thr Met Asp Pro 1 5 10 15 ttg cat gcc gtt tac ctg acc gta gga ctg ttc gtg att act ttt ttt 96 Leu His Ala Val Tyr Leu Thr Val Gly Leu Phe Val Ile Thr Phe Phe 20 25 30 aat ccg gga gcc aat ctc ttt gtg gta gta caa acc agc ctg gct tcc 144 Asn Pro Gly Ala Asn Leu Phe Val Val Val Gln Thr Ser Leu Ala Ser 35 40 45 ggt cga cgc gca ggg gtg ctg acc ggg ctg ggc gtg gcg ctg ggc gat 192 Gly Arg Arg Ala Gly Val Leu Thr Gly Leu Gly Val Ala Leu Gly Asp 50 55 60 gca ttt tat tcc ggg ttg ggt ttg ttt ggt ctt gca acg cta att acg 240 Ala Phe Tyr Ser Gly Leu Gly Leu Phe Gly Leu Ala Thr Leu Ile Thr 65 70 75 80 cag tgt gag gag att ttt tcg ctt atc aga atc gtc ggc ggc gct tat 288 Gln Cys Glu Glu Ile Phe Ser Leu Ile Arg Ile Val Gly Gly Ala Tyr 85 90 95 ctc tta tgg ttt gcg tgg tgc agc atg cgc cgc cag tca aca ccg caa 336 Leu Leu Trp Phe Ala Trp Cys Ser Met Arg Arg Gln Ser Thr Pro Gln 100 105 110 atg agc aca cta caa caa ccg att agc gcc ccc tgg tat gtc ttt ttt 384 Met Ser Thr Leu Gln Gln Pro Ile Ser Ala Pro Trp Tyr Val Phe Phe 115 120 125 cgc cgc gga tta att acc gat ctc tct aac ccg caa acc gtt tta ttt 432 Arg Arg Gly Leu Ile Thr Asp Leu Ser Asn Pro Gln Thr Val Leu Phe 130 135 140 ttt atc agt att ttc tca gta aca tta aat gcc gaa aca cca aca tgg 480 Phe Ile Ser Ile Phe Ser Val Thr Leu Asn Ala Glu Thr Pro Thr Trp 145 150 155 160 gca cgt tta atg gcc tgg gcg ggg att gtg ctc gca tca att atc tgg 528 Ala Arg Leu Met Ala Trp Ala Gly Ile Val Leu Ala Ser Ile Ile Trp 165 170 175 cga gtt ttt ctt agt cag gcg ttt tct ttg ccc gct gtg cgt cgt gct 576 Arg Val Phe Leu Ser Gln Ala Phe Ser Leu Pro Ala Val Arg Arg Ala 180 185 190 tat ggg cgt atg caa cgc gtt gcc agt cgg gtt att ggt gca att att 624 Tyr Gly Arg Met Gln Arg Val Ala Ser Arg Val Ile Gly Ala Ile Ile 195 200 205 ggt gta ttc gcg cta cgc ctg att tac gaa ggg gtg acg cag cgg tga 672 Gly Val Phe Ala Leu Arg Leu Ile Tyr Glu Gly Val Thr Gln Arg 210 215 220 <210> 10 <211> 223 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 10 Met Met Gln Leu Val His Leu Phe Met Asp Glu Ile Thr Met Asp Pro 1 5 10 15 Leu His Ala Val Tyr Leu Thr Val Gly Leu Phe Val Ile Thr Phe Phe 20 25 30 Asn Pro Gly Ala Asn Leu Phe Val Val Val Gln Thr Ser Leu Ala Ser 35 40 45 Gly Arg Arg Ala Gly Val Leu Thr Gly Leu Gly Val Ala Leu Gly Asp 50 55 60 Ala Phe Tyr Ser Gly Leu Gly Leu Phe Gly Leu Ala Thr Leu Ile Thr 65 70 75 80 Gln Cys Glu Glu Ile Phe Ser Leu Ile Arg Ile Val Gly Gly Ala Tyr 85 90 95 Leu Leu Trp Phe Ala Trp Cys Ser Met Arg Arg Gln Ser Thr Pro Gln 100 105 110 Met Ser Thr Leu Gln Gln Pro Ile Ser Ala Pro Trp Tyr Val Phe Phe 115 120 125 Arg Arg Gly Leu Ile Thr Asp Leu Ser Asn Pro Gln Thr Val Leu Phe 130 135 140 Phe Ile Ser Ile Phe Ser Val Thr Leu Asn Ala Glu Thr Pro Thr Trp 145 150 155 160 Ala Arg Leu Met Ala Trp Ala Gly Ile Val Leu Ala Ser Ile Ile Trp 165 170 175 Arg Val Phe Leu Ser Gln Ala Phe Ser Leu Pro Ala Val Arg Arg Ala 180 185 190 Tyr Gly Arg Met Gln Arg Val Ala Ser Arg Val Ile Gly Ala Ile Ile 195 200 205 Gly Val Phe Ala Leu Arg Leu Ile Tyr Glu Gly Val Thr Gln Arg 210 215 220 <210> 11 <211> 639 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (1)..(639) <400> 11 gtg ttc gct gaa tac ggg gtt ctg aat tac tgg acc tat ctg gtt ggg 48 Met Phe Ala Glu Tyr Gly Val Leu Asn Tyr Trp Thr Tyr Leu Val Gly 1 5 10 15 gcc att ttt att gtg ttg gtg cca ggg cca aat acc ctg ttt gta ctc 96 Ala Ile Phe Ile Val Leu Val Pro Gly Pro Asn Thr Leu Phe Val Leu 20 25 30 aaa aat agc gtc agt agc ggt atg aaa ggc ggt tat ctt gcg gcc tgc 144 Lys Asn Ser Val Ser Ser Gly Met Lys Gly Gly Tyr Leu Ala Ala Cys 35 40 45 ggt gta ttt att ggc gat gcg gta ttg atg ttt ctg gca tgg gct gga 192 Gly Val Phe Ile Gly Asp Ala Val Leu Met Phe Leu Ala Trp Ala Gly 50 55 60 gtg gcg aca tta att aag acc acc ccg ata tta ttc aac att gta cgt 240 Val Ala Thr Leu Ile Lys Thr Thr Pro Ile Leu Phe Asn Ile Val Arg 65 70 75 80 tat ctt ggt gcg ttt tat ttg ctc tat ctg ggg agt aaa att ctt tac 288 Tyr Leu Gly Ala Phe Tyr Leu Leu Tyr Leu Gly Ser Lys Ile Leu Tyr 85 90 95 gcg acc ctg aag ggt aaa aat agc gag gcc aaa tcc gat gag ccc caa 336 Ala Thr Leu Lys Gly Lys Asn Ser Glu Ala Lys Ser Asp Glu Pro Gln 100 105 110 tac ggt gct att ttt aaa cgc gcg tta att ttg agc ctg act aat ccg 384 Tyr Gly Ala Ile Phe Lys Arg Ala Leu Ile Leu Ser Leu Thr Asn Pro 115 120 125 aaa gcc att ttg ttc tat gtg tcg ttt ttc gta cag ttt atc gat gtt 432 Lys Ala Ile Leu Phe Tyr Val Ser Phe Phe Val Gln Phe Ile Asp Val 130 135 140 aat gcc cca cat acg gga att tca ttc ttt att ctg gcg gcg acg ctg 480 Asn Ala Pro His Thr Gly Ile Ser Phe Phe Ile Leu Ala Ala Thr Leu 145 150 155 160 gaa ctg gtg agt ttc tgc tat ttg agc ttc ctg att ata tct ggt gct 528 Glu Leu Val Ser Phe Cys Tyr Leu Ser Phe Leu Ile Ile Ser Gly Ala 165 170 175 ttt gtc acg cag tac ata cgt acc aaa aag aaa ctg gct aaa gtt ggc 576 Phe Val Thr Gln Tyr Ile Arg Thr Lys Lys Lys Leu Ala Lys Val Gly 180 185 190 aac tca ctg att ggt ttg atg ttc gtg ggt ttc gct gcc cga ctg gcg 624 Asn Ser Leu Ile Gly Leu Met Phe Val Gly Phe Ala Ala Arg Leu Ala 195 200 205 acg ctg caa tcc tga 639 Thr Leu Gln Ser 210 <210> 12 <211> 212 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 12 Met Phe Ala Glu Tyr Gly Val Leu Asn Tyr Trp Thr Tyr Leu Val Gly 1 5 10 15 Ala Ile Phe Ile Val Leu Val Pro Gly Pro Asn Thr Leu Phe Val Leu 20 25 30 Lys Asn Ser Val Ser Ser Gly Met Lys Gly Gly Tyr Leu Ala Ala Cys 35 40 45 Gly Val Phe Ile Gly Asp Ala Val Leu Met Phe Leu Ala Trp Ala Gly 50 55 60 Val Ala Thr Leu Ile Lys Thr Thr Pro Ile Leu Phe Asn Ile Val Arg 65 70 75 80 Tyr Leu Gly Ala Phe Tyr Leu Leu Tyr Leu Gly Ser Lys Ile Leu Tyr 85 90 95 Ala Thr Leu Lys Gly Lys Asn Ser Glu Ala Lys Ser Asp Glu Pro Gln 100 105 110 Tyr Gly Ala Ile Phe Lys Arg Ala Leu Ile Leu Ser Leu Thr Asn Pro 115 120 125 Lys Ala Ile Leu Phe Tyr Val Ser Phe Phe Val Gln Phe Ile Asp Val 130 135 140 Asn Ala Pro His Thr Gly Ile Ser Phe Phe Ile Leu Ala Ala Thr Leu 145 150 155 160 Glu Leu Val Ser Phe Cys Tyr Leu Ser Phe Leu Ile Ile Ser Gly Ala 165 170 175 Phe Val Thr Gln Tyr Ile Arg Thr Lys Lys Lys Leu Ala Lys Val Gly 180 185 190 Asn Ser Leu Ile Gly Leu Met Phe Val Gly Phe Ala Ala Arg Leu Ala 195 200 205 Thr Leu Gln Ser 210 <210> 13 <211> 588 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (1)..(588) <400> 13 gtg aca ccg acc ctt tta agt gct ttt tgg act tac acc ctg att acc 48 Met Thr Pro Thr Leu Leu Ser Ala Phe Trp Thr Tyr Thr Leu Ile Thr 1 5 10 15 gct atg acg cca gga ccg aac aat att ctc gcc ctt agc tct gct acg 96 Ala Met Thr Pro Gly Pro Asn Asn Ile Leu Ala Leu Ser Ser Ala Thr 20 25 30 tcg cat gga ttt cgt caa agt acc cgc gtg ctg gca ggg atg agt ctg 144 Ser His Gly Phe Arg Gln Ser Thr Arg Val Leu Ala Gly Met Ser Leu 35 40 45 gga ttt ttg att gtg atg tta ctg tgt gcg ggc att tca ttt tca ctg 192 Gly Phe Leu Ile Val Met Leu Leu Cys Ala Gly Ile Ser Phe Ser Leu 50 55 60 gca gtg att gac ccg gca gcg gta cac ctt ttg agt tgg gcg ggg gcg 240 Ala Val Ile Asp Pro Ala Ala Val His Leu Leu Ser Trp Ala Gly Ala 65 70 75 80 gca tat att gtc tgg ctg gcg tgg aaa atc gcc acc agc cca aca aag 288 Ala Tyr Ile Val Trp Leu Ala Trp Lys Ile Ala Thr Ser Pro Thr Lys 85 90 95 gaa gac gga ctt cag gca aaa cca atc agc ttt tgg gcc agc ttt gct 336 Glu Asp Gly Leu Gln Ala Lys Pro Ile Ser Phe Trp Ala Ser Phe Ala 100 105 110 ttg cag ttt gtg aac gtc aaa atc att ttg tac ggt gtt acg gca ctg 384 Leu Gln Phe Val Asn Val Lys Ile Ile Leu Tyr Gly Val Thr Ala Leu 115 120 125 tcg acg ttt gtt ctg ccg caa aca cag gcg tta agc tgg gta gtt ggc 432 Ser Thr Phe Val Leu Pro Gln Thr Gln Ala Leu Ser Trp Val Val Gly 130 135 140 gtc agc gtt ttg ctg gcg atg att ggg acg ttt ggc aat gtg tgc tgg 480 Val Ser Val Leu Leu Ala Met Ile Gly Thr Phe Gly Asn Val Cys Trp 145 150 155 160 gcg ctg gcg ggg cat ctg ttt cag cga ttg ttt cgc cag tat ggt cgc 528 Ala Leu Ala Gly His Leu Phe Gln Arg Leu Phe Arg Gln Tyr Gly Arg 165 170 175 cag tta aat atc gtg ctt gcc ctg ttg ctg gtc tat tgc gcg gta cgc 576 Gln Leu Asn Ile Val Leu Ala Leu Leu Leu Val Tyr Cys Ala Val Arg 180 185 190 att ttc tat taa 588 Ile Phe Tyr 195 <210> 14 <211> 195 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 14 Met Thr Pro Thr Leu Leu Ser Ala Phe Trp Thr Tyr Thr Leu Ile Thr 1 5 10 15 Ala Met Thr Pro Gly Pro Asn Asn Ile Leu Ala Leu Ser Ser Ala Thr 20 25 30 Ser His Gly Phe Arg Gln Ser Thr Arg Val Leu Ala Gly Met Ser Leu 35 40 45 Gly Phe Leu Ile Val Met Leu Leu Cys Ala Gly Ile Ser Phe Ser Leu 50 55 60 Ala Val Ile Asp Pro Ala Ala Val His Leu Leu Ser Trp Ala Gly Ala 65 70 75 80 Ala Tyr Ile Val Trp Leu Ala Trp Lys Ile Ala Thr Ser Pro Thr Lys 85 90 95 Glu Asp Gly Leu Gln Ala Lys Pro Ile Ser Phe Trp Ala Ser Phe Ala 100 105 110 Leu Gln Phe Val Asn Val Lys Ile Ile Leu Tyr Gly Val Thr Ala Leu 115 120 125 Ser Thr Phe Val Leu Pro Gln Thr Gln Ala Leu Ser Trp Val Val Gly 130 135 140 Val Ser Val Leu Leu Ala Met Ile Gly Thr Phe Gly Asn Val Cys Trp 145 150 155 160 Ala Leu Ala Gly His Leu Phe Gln Arg Leu Phe Arg Gln Tyr Gly Arg 165 170 175 Gln Leu Asn Ile Val Leu Ala Leu Leu Leu Val Tyr Cys Ala Val Arg 180 185 190 Ile Phe Tyr 195 <210> 15 <211> 636 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (1)..(636) <400> 15 gtg ttt tct tat tac ttt caa ggt ctt gca ctt ggg gcg gct atg atc 48 Met Phe Ser Tyr Tyr Phe Gln Gly Leu Ala Leu Gly Ala Ala Met Ile 1 5 10 15 cta ccg ctc ggt cca caa aat gct ttt gtg atg aat cag ggc ata cgt 96 Leu Pro Leu Gly Pro Gln Asn Ala Phe Val Met Asn Gln Gly Ile Arg 20 25 30 cgt cag tac cac att atg att gcc tta ctt tgt gct atc agc gat ttg 144 Arg Gln Tyr His Ile Met Ile Ala Leu Leu Cys Ala Ile Ser Asp Leu 35 40 45 gtc ctg att tgc gcc ggg att ttt ggt ggc agc gcg tta ttg atg cag 192 Val Leu Ile Cys Ala Gly Ile Phe Gly Gly Ser Ala Leu Leu Met Gln 50 55 60 tcg ccg tgg ttg ctg gcg ctg gtc acc tgg ggc ggc gta gcc ttc ttg 240 Ser Pro Trp Leu Leu Ala Leu Val Thr Trp Gly Gly Val Ala Phe Leu 65 70 75 80 ctg tgg tat ggt ttt ggc gct ttt aaa aca gca atg agc agt aat att 288 Leu Trp Tyr Gly Phe Gly Ala Phe Lys Thr Ala Met Ser Ser Asn Ile 85 90 95 gag tta gcc agc gcc gaa gtc atg aag caa ggc aga tgg aaa att atc 336 Glu Leu Ala Ser Ala Glu Val Met Lys Gln Gly Arg Trp Lys Ile Ile 100 105 110 gcc acc atg ttg gca gtg acc tgg ctg aat ccg cat gtt tac ctg gat 384 Ala Thr Met Leu Ala Val Thr Trp Leu Asn Pro His Val Tyr Leu Asp 115 120 125 act ttt gtt gta ctg ggc agc ctt ggc ggg caa ctt gat gtg gaa cca 432 Thr Phe Val Val Leu Gly Ser Leu Gly Gly Gln Leu Asp Val Glu Pro 130 135 140 aaa cgc tgg ttt gca ctc ggg aca att agc gcc tct ttc ctg tgg ttc 480 Lys Arg Trp Phe Ala Leu Gly Thr Ile Ser Ala Ser Phe Leu Trp Phe 145 150 155 160 ttt ggt ctg gct ctt ctc gca gcc tgg ctg gca ccg cgt ctg cgc acg 528 Phe Gly Leu Ala Leu Leu Ala Ala Trp Leu Ala Pro Arg Leu Arg Thr 165 170 175 gca aaa gca cag cgc att atc aat ctg gtt gtg gga tgt gtt atg tgg 576 Ala Lys Ala Gln Arg Ile Ile Asn Leu Val Val Gly Cys Val Met Trp 180 185 190 ttt att gcc ttg cag ctg gcg aga gac ggt att gct cat gca caa gcc 624 Phe Ile Ala Leu Gln Leu Ala Arg Asp Gly Ile Ala His Ala Gln Ala 195 200 205 ttg ttc agt tag 636 Leu Phe Ser 210 <210> 16 <211> 211 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 16 Met Phe Ser Tyr Tyr Phe Gln Gly Leu Ala Leu Gly Ala Ala Met Ile 1 5 10 15 Leu Pro Leu Gly Pro Gln Asn Ala Phe Val Met Asn Gln Gly Ile Arg 20 25 30 Arg Gln Tyr His Ile Met Ile Ala Leu Leu Cys Ala Ile Ser Asp Leu 35 40 45 Val Leu Ile Cys Ala Gly Ile Phe Gly Gly Ser Ala Leu Leu Met Gln 50 55 60 Ser Pro Trp Leu Leu Ala Leu Val Thr Trp Gly Gly Val Ala Phe Leu 65 70 75 80 Leu Trp Tyr Gly Phe Gly Ala Phe Lys Thr Ala Met Ser Ser Asn Ile 85 90 95 Glu Leu Ala Ser Ala Glu Val Met Lys Gln Gly Arg Trp Lys Ile Ile 100 105 110 Ala Thr Met Leu Ala Val Thr Trp Leu Asn Pro His Val Tyr Leu Asp 115 120 125 Thr Phe Val Val Leu Gly Ser Leu Gly Gly Gln Leu Asp Val Glu Pro 130 135 140 Lys Arg Trp Phe Ala Leu Gly Thr Ile Ser Ala Ser Phe Leu Trp Phe 145 150 155 160 Phe Gly Leu Ala Leu Leu Ala Ala Trp Leu Ala Pro Arg Leu Arg Thr 165 170 175 Ala Lys Ala Gln Arg Ile Ile Asn Leu Val Val Gly Cys Val Met Trp 180 185 190 Phe Ile Ala Leu Gln Leu Ala Arg Asp Gly Ile Ala His Ala Gln Ala 195 200 205 Leu Phe Ser 210 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for amplifying Escheric hia coli yahN gene <400> 17 gtgtggaacc gacgccggat 20 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for amplifying Escheric hia coli yahN gene <400> 18 tgttgtatgg tacggggttc gag 23 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for amplifying Escheric hia coli yeaS gene <400> 19 ctttgccaat cccgtctccc 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for amplifying Escheric hia coli yeaS gene <400> 20 gccccatgca taacggaaag 20 <210> 21 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for amplifying Escheric hia coli yfiK gene <400> 21 gaagatcttg taggccggat aaggcg 26 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for amplifying Escheric hia coli yfiK gene <400> 22 tggttttacc aattggccgc 20 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for amplifying Escheric hia coli yggA gene <400> 23 acttctcccg cgagccagtt c 21 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for amplifying Escheric hia coli yggA gene <400> 24 ggcaagctta gcgcctctgt t 21

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｐ 13/04 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者ヴィタリー・アルカージエヴィッチ・リヴィシッツロシア連邦，モスクワ，113545，１，ドロズニィプロエズド，１ステートリサーチインスティテュートオブジェネティックスアンドセレクションオブインダストリアルマイクロオーガニズムズ（ジーオーエスエヌアイアイジェネティカ）内 (72)発明者ナターリヤ・パーヴロヴナ・ザカタエヴァロシア連邦，モスクワ，113545，１，ドロズニィプロエズド，１ステートリサーチインスティテュートオブジェネティックスアンドセレクションオブインダストリアルマイクロオーガニズムズ（ジーオーエスエヌアイアイジェネティカ）内 (72)発明者中西一夫神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素株式会社中央研究所内 (72)発明者ヴラジーミル・ヴェニヤミノヴィッチ・アリョーシンロシア連邦，モスクワ，113545，１，ドロズニィプロエズド，１ステートリサーチインスティテュートオブジェネティックスアンドセレクションオブインダストリアルマイクロオーガニズムズ（ジーオーエスエヌアイアイジェネティカ）内 (72)発明者ペートル・ヴラジミロヴィッチ・トローシンロシア連邦，モスクワ，113545，１，ドロズニィプロエズド，１ステートリサーチインスティテュートオブジェネティックスアンドセレクションオブインダストリアルマイクロオーガニズムズ（ジーオーエスエヌアイアイジェネティカ）内 (72)発明者イリーナ・リヴォヴナ・トクマコーヴァロシア連邦，モスクワ，113545，１，ドロズニィプロエズド，１ステートリサーチインスティテュートオブジェネティックスアンドセレクションオブインダストリアルマイクロオーガニズムズ（ジーオーエスエヌアイアイジェネティカ）内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】Ｌ−アミノ酸の生産性を有するエシェリ
ヒア属細菌であって、以下の（Ａ）〜（Ｈ）のタンパク
質からなる群から選ばれる１つ以上のタンパク質の発現
量が上昇することにより、前記Ｌ−アミノ酸の生産性が
向上していることを特徴とする細菌。（Ａ）配列表配列番号１０に示すアミノ酸配列を有する
タンパク質。（Ｂ）配列表配列番号１０に示すアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付
加、または逆位を含むアミノ酸配列からなるタンパク質
であって、そのタンパク質を有する細菌の前記Ｌ−アミ
ノ酸の生産性を向上させる活性を有するタンパク質。（Ｃ）配列表配列番号１２に示すアミノ酸配列を有する
タンパク質。（Ｄ）配列表配列番号１２に示すアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付
加、または逆位を含むアミノ酸配列からなるタンパク質
であって、そのタンパク質を有する細菌の前記Ｌ−アミ
ノ酸の生産性を向上させる活性を有するタンパク質。（Ｅ）配列表配列番号１４に示すアミノ酸配列を有する
タンパク質。（Ｆ）配列表配列番号１４に示すアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付
加、または逆位を含むアミノ酸配列からなるタンパク質
であって、そのタンパク質を有する細菌の前記Ｌ−アミ
ノ酸の生産性を向上させる活性を有するタンパク質。（Ｇ）配列表配列番号１６に示すアミノ酸配列を有する
タンパク質。（Ｈ）配列表配列番号１６に示すアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付
加、または逆位を含むアミノ酸配列からなるタンパク質
であって、そのタンパク質を有する細菌の前記Ｌ−アミ
ノ酸の生産性を向上させる活性を有するタンパク質。
【請求項２】前記Ｌ−アミノ酸がＬ−リジンであり、
前記の（Ａ）〜（Ｄ）、（Ｇ）及び（Ｈ）のタンパク質
からなる群から選ばれる１つ以上のタンパク質の発現量
が上昇している請求項１記載の細菌。
【請求項３】前記Ｌ−アミノ酸がＬ−グルタミン酸で
あり、前記の（Ａ）〜（Ｈ）のタンパク質からなる群か
ら選ばれる１つ以上のタンパク質の発現量が上昇してい
る請求項１記載の細菌。
【請求項４】前記Ｌ−アミノ酸がＬ−アラニンであ
り、前記の（Ｃ）及び（Ｄ）のタンパク質からなる群か
ら選ばれる１つ以上のタンパク質の発現量が上昇してい
る請求項１記載の細菌。
【請求項５】前記Ｌ−アミノ酸がＬ−バリンであり、
前記の（Ｃ）及び（Ｄ）のタンパク質からなる群から選
ばれる１つ以上のタンパク質の発現量が上昇している請
求項１記載の細菌。
【請求項６】前記Ｌ−アミノ酸がＬ−ヒスチジンであ
り、前記の（Ｃ）〜（Ｆ）のタンパク質からなる群から
選ばれる１つ以上のタンパク質の発現量が上昇している
請求項１記載の細菌。
【請求項７】前記Ｌ−アミノ酸がＬ−プロリンであ
り、前記の（Ａ）〜（Ｆ）のタンパク質からなる群から
選ばれる１つ以上のタンパク質の発現量が上昇している
請求項１記載の細菌。
【請求項８】前記Ｌ−アミノ酸がＬ−スレオニンであ
り、前記の（Ｅ）及び（Ｆ）のタンパク質からなる群か
ら選ばれる１つ以上のタンパク質の発現量が上昇してい
る請求項１記載の細菌。
【請求項９】前記Ｌ−アミノ酸がＬ−アルギニンであ
り、前記の（Ｇ）及び（Ｈ）のタンパク質からなる群か
ら選ばれる１つ以上のタンパク質の発現量が上昇してい
る請求項１記載の細菌。
【請求項１０】前記Ｌ−アミノ酸がＬ−イソロイシン
であり、前記の（Ｃ）及び（Ｄ）のタンパク質からなる
群から選ばれる１つ以上のタンパク質の発現量が上昇し
ている請求項１記載の細菌。
【請求項１１】前記タンパク質をコードするＤＮＡの
細胞内のコピー数が上昇している、請求項１〜１０のい
ずれか一項に記載の細菌。
【請求項１２】前記ＤＮＡが細胞中のマルチコピーベ
クター上に保持された請求項１１記載の細菌。
【請求項１３】前記ＤＮＡが細胞中のトランスポゾン
上に保持された請求項１１記載の細菌。
【請求項１４】請求項１記載の細菌を培地で培養し、
該培地中にＬ−アミノ酸を生成蓄積せしめ、該培地から
前記Ｌ−アミノ酸を採取することを特徴とするＬ−アミ
ノ酸の製造法。
【請求項１５】前記Ｌ−アミノ酸がＬ−リジンであ
り、前記細菌が前記の（Ａ）〜（Ｄ）、（Ｇ）及び
（Ｈ）のタンパク質からなる群から選ばれる１つ以上の
タンパク質の発現量が上昇しているものである請求項１
４記載の方法。
【請求項１６】前記Ｌ−アミノ酸がＬ−グルタミン酸
であり、前記細菌が前記の（Ａ）〜（Ｈ）のタンパク質
からなる群から選ばれる１つ以上のタンパク質の発現量
が上昇しているものである請求項１４記載の方法。
【請求項１７】前記Ｌ−アミノ酸がＬ−アラニンであ
り、前記細菌が前記の（Ｃ）及び（Ｄ）のタンパク質か
らなる群から選ばれる１つ以上のタンパク質の発現量が
上昇しているものである請求項１４記載の方法。
【請求項１８】前記Ｌ−アミノ酸がＬ−バリンであ
り、前記細菌が前記の（Ｃ）及び（Ｄ）のタンパク質か
らなる群から選ばれる１つ以上のタンパク質の発現量が
上昇しているものである請求項１４記載の方法。
【請求項１９】前記Ｌ−アミノ酸がＬ−ヒスチジンで
あり、前記細菌が前記の（Ｃ）〜（Ｆ）のタンパク質か
らなる群から選ばれる１つ以上のタンパク質の発現量が
上昇しているものである請求項１４記載の方法。
【請求項２０】前記Ｌ−アミノ酸がＬ−プロリンであ
り、前記細菌が前記の（Ａ）〜（Ｆ）のタンパク質から
なる群から選ばれる１つ以上のタンパク質の発現量が上
昇しているものである請求項１４記載の方法。
【請求項２１】前記Ｌ−アミノ酸がＬ−スレオニンで
あり、前記細菌が前記の（Ｅ）及び（Ｆ）のタンパク質
からなる群から選ばれる１つ以上のタンパク質の発現量
が上昇しているものである請求項１４記載の方法。
【請求項２２】前記Ｌ−アミノ酸がＬ−アルギニンで
あり、前記細菌が前記の（Ｇ）及び（Ｈ）のタンパク質
からなる群から選ばれる１つ以上のタンパク質の発現量
が上昇しているものである請求項１４記載の方法。
【請求項２３】前記Ｌ−アミノ酸がＬ−イソロイシン
であり、前記細菌が前記の（Ｃ）及び（Ｄ）のタンパク
質からなる群から選ばれる１つ以上のタンパク質の発現
量が上昇しているものである請求項１４記載の方法。
【請求項２４】前記タンパク質をコードするＤＮＡの
細胞内のコピー数が上昇している、請求項１４〜２３の
いずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】前記ＤＮＡが細胞中のマルチコピーベ
クター上に保持された請求項２４記載の方法。
【請求項２６】前記ＤＮＡが細胞中のトランスポゾン
上に保持された請求項２４記載の方法。