JP2002281975A - 大豆のナイトレートトランスポーター１遺伝子ファミリーに属する遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 植物には、窒素源への暴露によって誘導され
る、ＮＲＴ１およびＮＲＴ２という２つのファミリーの
存在が知られているが、大豆においては、ＮＲＴ２のｃ
ＤＮＡがクローニングされているに過ぎない。本発明
は、ＮＲＴ１ファミリーに属する、大豆の新規な遺伝子
および遺伝子断片を提供することを目的とする。 【解決手段】 上記課題を解決するため、本発明者らは
鋭意研究を重ね、大豆のｃＤＮＡクローニングと遺伝子
発現解析の結果、ＮＲＴ１ファミリーに属する大豆の新
規な遺伝子および遺伝子断片を単離し、ヌクレオチド配
列を同定するに至った。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、大豆の遺伝子であ
って、窒素源への暴露によって誘導されるナイトレート
トランスポーター１遺伝子に属する遺伝子および遺伝子
断片に係わるものである。

【０００２】

【従来の技術】植物には、窒素源への暴露によって誘導
される、ナイトレート（ＮＯ₃ ^-）の取り込みに関与する
輸送体ナイトレートトランスポーター１（Nitrate Tran
sporter 1）とナイトレートトランスポーター２（Nitra
te Transporter 2）の２つのファミリーの存在が知られ
ている（以下、それぞれＮＲＴ１、ＮＲＴ２と略記す
る）。シロイヌナズナやトマトなどの植物では、両ファ
ミリーのｃＤＮＡが、既にクローニングされている。し
かし大豆では、ＮＲＴ２のｃＤＮＡが、クローニングさ
れているに過ぎない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ＮＲＴ１フ
ァミリーに属する、大豆の新規な遺伝子および遺伝子断
片を提供することが目的である。

【０００４】

【課題を解決するための手段】上記課題を解決するた
め、本発明者らは鋭意研究を重ね、大豆のｃＤＮＡクロ
ーニングと遺伝子発現解析の結果、ＮＲＴ１ファミリー
に属する大豆の新規な遺伝子および遺伝子断片を単離
し、ヌクレオチド配列を同定するに至った。

【０００５】窒素源は、多くの高等植物にとって必須の
栄養素であり、ナイトレート（ＮＯ ₃ ^-）は、それらの内
でもメインの窒素源である。ナイトレートの同化は、根
の細胞において、土壌中からナイトレートを取り込むこ
とにより開始される。それに引き続いて、細胞中でナイ
トライト（ＮＯ₂ ^-）を経由してアンモニウム（ＮＨ₄ ⁺）
へと還元される。根の表皮細胞および皮質細胞の原形質
膜を横断しての取り込みは、電気化学的なナイトレート
の勾配に対するエレクトロジェニック プロトン−ナイ
トレート（２Ｈ⁺／ＮＯ₃ ^-）シンポートによって行われ
る。

【０００６】ナイトレートトランスポーター（ＮＲＴ）
をコードする遺伝子の同定は、ナイトレート同化作用を
欠失している突然変異体に関する研究から始まった。そ
のような真核生物の突然変異体のほとんどはナイトレー
トの還元能が障害されていたが、残りの突然変異体はナ
イトレート取り込み能に欠陥を有していた。このナイト
レート取り込み能に欠陥を有する突然変異体のキャラク
タリゼーション、単離およびホモロジー解析の結果、真
核生物における２種類の遺伝子ファミリーの存在が明ら
かにされた（Crawford et al.，Trends Plant Sci. 199
8; 3:389-395）。これら２つの遺伝子ファミリーは、そ
れぞれＮＲＴ１、ＮＲＴ２と命名されたが、ファミリー
間のヌクレオチド配列の類似性はないという、大きな特
徴を有していた。ＮＲＴ１とＮＲＴ２の２つのファミリ
ーは高等植物間で保存されているが、ＮＲＴ２ファミリ
ーは菌類や藻類でも保存されている。

【０００７】Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ（大豆）において
は、高親和性のナイトレートトランスポーターのｃＤＮ
Ａがクローニングされ、ＮＲＴ２ファミリーに属する遺
伝子としてＧｍＮＲＴ２と命名されており、また、大豆
の根におけるＧｍＮＲＴ２の発現が、供給される窒素源
の種類によって異なるレギュレーションを受けること、
ＧｍＮＲＴ２遺伝子の発現増加に伴って、根における正
味のナイトレート取り込み量が増加することが報告され
ている（Amarasinghe et al., Planta 1998; 206: 44-5
2）。しかしながら、大豆のＮＲＴ１ファミリーのナイ
トレートトランスポーター遺伝子のクローニングに関し
ては、未だ報告はない。そこで本発明者らは、大豆のｃ
ＤＮＡクローニングと遺伝子発現解析の結果、ＮＲＴ１
ファミリーに属する大豆の新規な遺伝子および遺伝子断
片を単離し、ヌクレオチド配列を同定するに至った。

【０００８】

【発明の実施の形態】発明の実施の形態を、実施例にも
とづき図面を参照して説明する。

【０００９】本発明の新規な遺伝子および遺伝子断片の
ｃＤＮＡクローニングは、市販の大豆ｃＤＮＡライブラ
リー用いて行った。また、ＤＮＡ操作法は、定法に従っ
た（Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laborato
ry Manual, 2^nd edn.，1989）。得られたｃＤＮＡクロ
ーンは、ヌクレオチド配列分析を行って遺伝子配列を明
らかにした後、既知の遺伝子配列とのホモロジー解析に
かけた。その結果、アミノ酸配列レベルでの比較におい
て、ＮＲＴ２ファミリーに属する遺伝子とのホモロジー
はなく、ＮＲＴ１ファミリーに属する遺伝子とのホモロ
ジーは高いことから、大豆のＮＲＴ１ファミリーに属す
る遺伝子であることを確認できた。また、既知の遺伝子
とのハイドロパシー解析の結果からも、ナイトレートト
ランスポーター遺伝子であることが推定できた。

【００１０】既知のナイトレートトランスポーター遺伝
子では、窒素源の種類によって、あるいは窒素源に対す
る暴露時間の違いによって、複雑な遺伝子発現パターン
を示すことが知られている。本発明の新規ＮＲＴ１遺伝
子の場合も、複雑な遺伝子発現パターンを示すという点
では同様であった。

【００１１】本発明のＮＲＴ１遺伝子が、既知のＮＲＴ
１遺伝子と異なる点は、発現している組織の違いにあ
る。既知のＮＲＴ１遺伝子、例えばシロイヌナズナ（Ar
abidopsis thaliana）、アブラナ（Brassica napus）、
トマト（Lycopersicon esculentum）の場合は、窒素源
によって遺伝子発現が誘導されるのは、主として根に限
定されている。本発明の大豆のＮＲＴ１遺伝子では、窒
素源による誘導条件によっては、根と葉の両方または葉
のみでの発現が確認できた点で、既知のＮＲＴ１遺伝子
とは明らかに異なっており、新規なＮＲＴ１遺伝子であ
ると言える。

【００１２】本発明の新規な遺伝子は、遺伝子組換えに
よる植物の品種改良に利用することが可能である。例え
ば、少量の窒素肥料で、あるいは窒素分の少ないやせた
土壌で生育可能な新規組換え植物創製への利用が考えら
れる。窒素肥料が、合成肥料として大量に使用されるよ
うになってから、食料増産には大きく貢献してきたが、
一方では、窒素肥料に由来する硝酸塩が農地からしみ出
て、湖沼や湾を富栄養化させていることによる環境汚
染、農地に残留している窒素化合物による土壌の酸性化
などのマイナス面も、近年は目立っている。少量の窒素
肥料で生育可能な遺伝子組換え植物は、このような害を
低減させるために役立つ。

【００１３】本発明の大豆ＮＲＴ１遺伝子を、植物品種
改良のための遺伝子操作に用いる場合は、植物の組織内
に、遺伝子を導入する必要がある。遺伝子導入には、エ
レクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法、
マイクロインジェクション法、マイクロプロジェクタイ
ル法などのベクターを用いない既知の方法が利用でき
る。また、ベクターを用いる形質転換法でも良い。

【００１４】また、本発明の大豆ＮＲＴ１遺伝子断片
は、完全長のｃＤＮＡクローンを得るためのプローブと
して利用することができる。

【００１５】

【実施例】以下に、本発明の具体的な実施態様を実施例
として示すが、本発明はこれらの実施例のみに限定され
るものではない。

【００１６】

【実施例１】大豆のｃＤＮＡライブラリーは、ストラタ
ジーン（Stratagene）社製を用いた。１２日目の大豆
（Glycine max cv. Williams 83）の、上胚軸（epicoty
l）由来のｍＲＮＡを用いて作製されたｃＤＮＡライブ
ラリーである。

【００１７】宿主菌は、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅを用い
た。ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）用として、
２つのプライマーＡＡＴ−ＮおよびＡＡＴ−Ｃ（表１）
を用いた時に、ＧｍＮＲＴ１−１ｃＤＮＡは増幅され、
大豆のｃＤＮＡライブラリーからクローニングできた。

【００１８】完全長のｃＤＮＡをクローニングするため
のＰＣＲは、大豆ｃＤＮＡライブラリー０．１μｇをテ
ンプレートとし、２．５ユニットのＴａｑ DNAポリメ
レ−ス、１００ｐｍｏｌのプライマーを用いた。ＧｍＮ
ＲＴ１−１ｃＤＮＡの５’−領域は、プライマー５’Ｖ
ＥＣと３’ＶＥＣのセット（表１）を用い、３’−領域
はプライマー５’ＳＢＯＮ１と３’ＳＢＯＮ１のセット
（表１）を用いて、それぞれのｃＤＮＡを増幅させた。
プライマー５’ＳＢＯＮ１と３’ＳＢＯＮ１の５’端に
は、それぞれ制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIIIの
切断部位を有している。増幅されたＰＣＲフラグメント
を、制限酵素ＢａｍＨＩまたはＨｉｎｄIIIで切断後、
ベクターｐＵＣ１１８のマルティプルクローニングサイ
トに挿入した。次に、それぞれのＰＣＲフラグメント
を、ＨｉｎｄIII切断部位を有するオーバーラッピング
領域で再結合させた後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクタ
ーのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII切断部位に挿入した。最
終的な組換え体は、ヌクレオチド配列分析により確認し
た。

【００１９】

【表１】

【００２０】ＧｍＮＲＴ１−１と相同性を有するｃＤＮ
Ａを探索するため、前述の大豆ｃＤＮＡライブラリーの
約１×１０⁵ファージクローンをスクリーニングした。
スクリーニング用のプローブは、ＧｍＮＲＴ１−１ｃＤ
ＮＡの８１６番目から１，２６７番目のヌクレオチドに
相当する４５２ｂｐのＤＮＡ断片を用い、ＥＣＬキット
（Amersham-Pharmacia Biotech 製）で検出した。その
結果、ＧｍＮＲＴ１−１およびＧｍＮＲＴ１−２の２つ
の完全長ｃＤＮＡを検出できた。それぞれのｃＤＮＡ塩
基配列を、配列表の配列番号１および配列番号２に示し
た。

【００２１】ＧｍＮＲＴ１−１ｃＤＮＡは、オープンリ
ーディングフレーム（ＯＲＦ）の上流の同じフレーム内
に、ストップコドンがヌクレオチド１７−１９番目のサ
イトに存在して、そのフレーム内に最初のメチオニン残
基（Ｍｅｔ）が存在することを示しており、また３’端
の非翻訳領域（3'-UTR）にポリ（A）テイルが存在する
ことから、完全長のｃＤＮＡであることが示された。
１，７９４ｂｐから成るＯＲＦには、５９７アミノ酸の
ペプチドがコードされており、その分子量は６５，８２
０Ｄａと計算された。

【００２２】ＧｍＮＲＴ１−２ｃＤＮＡも、オープンリ
ーディングフレーム（ＯＲＦ）の上流の同じフレーム内
の、開始コドンから１０５ヌクレオチド上流のサイトに
ストップコドンが存在しており、そのフレーム内に最初
のメチオニン残基（Ｍｅｔ）が存在することを示してお
り、また３’端の非翻訳領域（3'-UTR）にポリ（A）テ
イルが存在することから、完全長のｃＤＮＡであること
が示された。１，８１８ｂｐから成るＯＲＦには、６０
５アミノ酸のペプチドがコードされており、その分子量
は６６，７２０Ｄａと計算された。

【００２３】

【実施例２】大豆のＮＲＴ１ファミリーに属する遺伝子
が、ＧｍＮＲＴ１−１やＧｍＮＲＴ１−２以外にも存在
するのではないかと考え、さらなるｃＤＮＡクローニン
グを試みた。実験方法は、実施例１と実質的に同等であ
る。その結果、新たに３種類のｃＤＮＡを検出できた。

【００２４】完全長のＧｍＮＲＴ１−３（配列表の配列
番号３）は、ＲＡＣＥ（Rapid Amplification of cDNA
Ends）法により得られたものであり、ＳＭＡＲＴ ＲＡ
ＣＥｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ
（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）およびプライマー 5'-TTGGATTC
ACAACGTTGGACACGG-3' を用いて行った。オープンリー
ディングフレーム（ＯＲＦ）の上流の同じフレーム内
に、ストップコドンがヌクレオチド１３８−１４０番目
のサイトに存在して、そのクローン内に最初のメチオニ
ン残基（Ｍｅｔ）が存在することを示しており、また
３’端の非翻訳領域（3'-UTR）にポリ（A）テイルが存
在することから、ＧｍＮＲＴ１−１およびＧｍＮＲＴ１
−２と同じく、完全長のｃＤＮＡであることが確認でき
た。１，７２８ｂｐから成るＯＲＦには、５７５アミノ
酸のペプチドがコードされており、その分子量は６４，
１２０Ｄａと計算された。

【００２５】一方、ＧｍＮＲＴ１−４（配列表の配列番
号４）とＧｍＮＲＴ１−５（配列表の配列番号５）は完
全長のｃＤＮＡではなく、遺伝子断片であった。ＧｍＮ
ＲＴ１−４は、５’端の非翻訳領域（5'-UTR）、３’端
の非翻訳領域（3'-UTR）およびポリ（A）テイルを欠失
していた。ＧｍＮＲＴ１−５は、５’端の非翻訳領域
（5'-UTR）を欠失していたが、３’端の非翻訳領域（3'
-UTR）とポリ（A）テイルは有していた。コーディング
領域に関しては、ＧｍＮＲＴ１−４はN末端側の約３０
０アミノ酸とＣ末端側の約５０アミノ酸を欠失してい
た。また、ＧｍＮＲＴ１−５のコーディング領域は、N
末端側の約２０アミノ酸が欠失していた。

【００２６】

【実施例３】得られた新規なｃＤＮＡ、ＧｍＮＲＴ１−
１〜ＧｍＮＲＴ１−５が、ＮＲＴ１遺伝子ファミリーに
属することを証明するため、既に知られている他の植物
のＮＲＴ１タンパク質とのホモロジー解析を行った。Ｇ
ｍＮＲＴ１−２の配列を基準として、それぞれのコーデ
ィング領域のアミノ酸配列を対象に、ソフトウエアＢＬ
ＡＳＴを用いて解析した（図１）。ホモロジーは、シロ
イヌナズナ（Arabidopsis thaliana）との比較ではAtNR
T1とは３１％、AtNRT3 とは３１％であり（図１）、ま
たトマト（Lycopersicon esculentum）の場合はLeNRT1-
1とは３１％、LeNRT1-2とは３２％であり（表２）、い
ずれも高い相同性を示した。また、大豆のＮＲＴ１ファ
ミリー間のホモロジーは、９７〜２９％という高い値で
あった（表２）。

【００２７】

【表２】

【００２８】また、ハイドロパシー解析の結果、シロイ
ヌナズナのＮＲＴ１ファミリーに属するAtNRT1タンパク
質と同様に、１２個の膜貫通セグメントを有するととも
に、中央部に疎水性が低い領域が存在するという２つの
特徴を有していた。ハイドロパシー解析の結果の一例
を、図２に示してある。

【００２９】一方、同じくＧｍＮＲＴ１−２を基準とし
た、大豆および他の植物のＮＲＴ２ファミリーとのホモ
ロジーは４〜３％と低く（表２）、実質的にはホモロジ
ーがないと言える。従って、ＮＲＴ１ファミリーとＮＲ
Ｔ２ファミリーとのアミノ酸配列には、明らかな違いが
存在することを証明できた。

【００３０】以上の結果を総合すると、アミノ酸配列レ
ベルでの比較により、本発明の新規遺伝子および遺伝子
断片は、大豆のＮＲＴ１ファミリーに属することが示さ
れた。

【００３１】

【実施例４】本発明の大豆ＮＲＴ１ファミリーに属する
遺伝子の発現パターンを確認するため、以下の試験を行
った。

【００３２】フォトチャンバー内において、大豆（Glyc
ine max cv. Williams）を２２℃、１６時間／８時間の
明暗サイクル条件下に栽培した。窒素源によるＮＲＴ１
遺伝子のインダクションの結果は、ＲＴ−ＰＣＲ（Reve
rse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction）によ
り確認した。

【００３３】窒素源に対する短時間暴露の場合は、大豆
の種子は、滅菌した湿潤バーミキュライト（vermiculit
e）のトレイ中で発芽させた。６日後の実生を、栄養液
を含んだ水栽培用ポットに移し、３〜６時間処理した。
実質的に窒素源を含まない栄養液は、２ｍＭ ＣａＳＯ
₄，１ｍＭ ＭｇＳＯ₄，０．９４ｍＭ ＣａＣｌ₂，
０．５ｍＭ Ｋ₂ＳＯ₄，０．１６ｍＭ Ｋ₂ＨＰＯ₄，
０．０８２ｍＭ ＫＨ₂ＰＯ₄，０．０２４ｍＭ Ｆｅ−
ＥＤＴＡ，１．０８ｍＭ ＭＥＳ バッファー，０．８
ｍＭ ＫＯＨ，５μＭ Ｈ₃ＢＯ₃，２μＭ ＭｎＳ
Ｏ₄，０．８μＭ ＺｎＳＯ₄，０．０３３μＭ ＣｏＣ
ｌ，０．６５ｎＭ （ＮＨ₄）₆ＭＯ₇Ｏ₂₄ の組成であ
る。窒素源補充栄養液には、１０ｍＭ ＫＮＯ₃ また
は １０ｍＭＮＨ₄Ｃｌまたは１０ｍＭ ＫＮＯ₃ と
１０ｍＭ ＮＨ₄Ｃｌの両方を、実質的に窒素源を含ま
ない栄養液に添加した。培養液のｐＨは、６．０に調整
した。

【００３４】窒素源に対する長期間暴露の場合は、大豆
の種子を滅菌した湿潤バーミキュライト（vermiculit
e）のトレイ中で発芽させ、３種類の栄養液の１種類を
添加した後、７〜１４日間成長させた。ナイトレートお
よびアンモニウム（NH₄ ⁺）補充液の組成は、２５ｍＭ
ＮＨ₄ＮＯ₃，２ｍＭ ＣａＣｌ₂，３ｍＭ ＫＣｌ，
１．６ｍＭ ＭｇＣｌ₂，０．３７５ｍＭ ＭｇＳＯ₄，
０．３７５ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄，０．０５ｍＭ Ｆｅ−
ＥＤＴＡ，０．０１ｍＭ ホウ酸，０．０４５ｍＭ Ｍ
ｎＳＯ₄，０．７μＭ ＺｎＳＯ₄，０．２μＭ ＣｕＳ
Ｏ₄，０．２μＭＫＩである。アンモニウム補充液の組
成は、ＮＨ₄ＮＯ₃の代わりに、２５ｍＭコハク酸アンモ
ニウムを含有している他には、ナイトレートおよびアン
モニウム補充液と同じである。培養液のｐＨは、６．０
に調整した。

【００３５】ＲＴ−ＰＣＲは、宝酒造のｍＲＮＡ Ｓｅ
ｌｅｃｔｉｖｅ ＲＴ−ＰＣＲキットを用いた。トータ
ルＲＮＡは、ＴＲＩｚｏｌ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ製）を
用いて単離した。窒素源への短時間暴露の場合は、トー
タルＲＮＡを大豆の根から単離した。また、窒素源への
長期間暴露の場合は、大豆の根と葉からトータルＲＮＡ
を単離した。

【００３６】ＧｍＮＲＴ１−１およびＧｍＮＲＴ１−２
の両方の発現を解析するためには、５’ＳＢＯＮ１と
３’ＳＢＯＮ１のプライマーセット（表１）を用いた。
逆転写反応は、０．１μｇのトータルＲＮＡと３’ＳＢ
ＯＮ１プライマーを用いて、５０℃、１５分間行った。
続くＰＣＲ反応は、５’ＳＢＯＮ１と３’ＳＢＯＮ１の
プライマーセットを用いて、２５〜４０サイクルの反応
を行った（後述の図３および４には、２５、３０、３
５、４０の各サイクルのサンプルでの結果を示してあ
り、ＲＴ−ＰＣＲ産物の経時変化を見ることができ
る）。１サイクル毎の反応は、８５℃、１分間の熱変性
（denature）、４５℃、１分間のアニ−リング（aneali
ng）、７２℃、１分間の伸長（extension）反応を行っ
た。反応生成物を１．５％アガロースゲル電気泳動によ
り分離し、エチジウム ブロマイドで染色した。ゲル上
のバンドの濃度は、デンシトメーター（Bio-Rad製 Mole
cular Imager）で定量した。

【００３７】ＧｍＮＲＴ１−１とＧｍＮＲＴ１−２の発
現を区別するためには、５’Ｎｄｉｆと３’Ｎｄｉｆ
（表１）という別のプライマーセットを用いた。これら
はそれぞれ、ＧｍＮＲＴ１−２のヌクレオチド配列の１
２７〜１４３番目と３１３〜３２９番目に対応してい
る。この反応の生成物は、１２％ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動により分離した。

【００３８】ＲＴ−ＰＣＲの生成物が、ＧｍＮＲＴ１−
１とＧｍＮＲＴ１−２のどちらに由来するかを決定する
ためには、同じトータルＲＮＡ、同じプライマーセット
５’Ｎｄｉｆと３’Ｎｄｉｆを用いて、同じ宝酒造製の
ＲＮＡ ＰＣＲキット（ＡＭＶ）によるＲＴ−ＰＣＲを
行った。この反応の生成物は、Ｔ−ベクター（Promega
製）にクローニングした後、ヌクレオチド配列分析を行
った。

【００３９】ＧｍＮＲＴ２の転写物を検出する場合に
は、ＲＴ−ＰＣＲ用のプライマーセットとして、５’−
ＧＮＴと３’−ＧＮＴ（表１）を用いた。ｍＲＮＡ Ｓ
ｅｌｅｃｔｉｖｅ ＲＴ−ＰＣＲキットを用いた本発明
の実験条件下においては、逆転写酵素を除いた条件下で
は、いかなるバンドも検出されなかった。従って、本実
施例において増幅されたバンドは、ＲＮＡ由来であるこ
とが示された。図３に結果を示したが、目的のバンドの
位置は、楔形の矢印マークで示してある。

【００４０】窒素源に短時間（３時間）暴露した場合
は、ＧｍＮＲＴ１−１および／またはＧｍＮＲＴ１−２
の増幅バンドが検出されたのは、窒素源なし（Nitrogen
-free）、ナイトレート存在下での成長（Nitrate）、ナ
イトレートとアンモニウム共存下での成長（Nitrate/Am
monium）の３つのケースであり、アンモニウム存在下で
成長させた場合（Ammonium）には、増幅バンドは検出さ
れなかった（図３ Ａ））。増幅バンドの相対的な強度
は、ナイトレート存在下、窒素源なし、ナイトレートと
アンモニウム共存下の順に大きかった。

【００４１】コントロールとして、ＮＲＴ２ファミリー
のＧｍＮＲＴ２の発現を、同じトータルＲＮＡを用いて
調べてみた。その結果、ＧｍＮＲＴ２の増幅バンドは、
ナイトレート存在下で最も高く、窒素源なしの条件下が
次に高かったが、アンモニウム存在下では増幅バンドは
検出されなかった（図３ Ｂ））。このＧｍＮＲＴ２の
結果は、文献値と一致していた（Amarasinghe et al.,
Planta 1998; 206: 44-52）。窒素源に長時間（６時
間）暴露した時のトータルＲＮＡを用いた場合は、Ｇｍ
ＮＲＴ１−１および／またはＧｍＮＲＴ１−２およびＧ
ｍＮＲＴ２に対して、ほとんど同様の結果が得られた。

【００４２】ＧｍＮＲＴ１−１とＧｍＮＲＴ１−２の発
現を区別するために、プライマーセット５’Ｎｄｉｆと
３’Ｎｄｉｆ（表１）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。
この場合には、ＧｍＮＲＴ１−１からは１７９ｂｐのバ
ンドが、ＧｍＮＲＴ１−２からは２０３ｂｐのバンドが
検出される。ナイトレート存在下で成長させた根からの
トータルＲＮＡでは、プライマー セット５’Ｎｄｉｆ
と３’Ｎｄｉｆを用いたＲＴ−ＰＣＲにより、２０３ｂ
ｐのバンドだけが検出された（図３ Ｃ））。さらに、
ヌクレオチド配列分析により、確かにＧｍＮＲＴ１−２
の転写物であることを確認できた。従って、ナイトレー
ト存在下で成長させた大豆の根では、ＧｍＮＲＴ１−２
だけが発現されていることが判明した。同様にして、窒
素源なしとナイトレートとアンモニウム共存下のケース
も、ＧｍＮＲＴ１−２の増幅バンドだけが観察された。

【００４３】窒素源への１４日間の長期間暴露において
は、アンモニウム存在下で成長させた根だけに、ＧｍＮ
ＲＴ１−２のバンドだけが観察され、ヌクレオチド配列
分析からもＧｍＮＲＴ１−２由来であることが確認でき
たが、ナイトレートとアンモニウム共存下では、バンド
は観察されなかった（図３ Ｄ）のレーン１および
２）。一方、葉からは、ＧｍＮＲＴ１−１とＧｍＮＲＴ
１−２の２つのバンドが観察され、ヌクレオチド配列分
析からも確認できた（図３ Ｄ）のレーン４および
５）。以上の結果から、ＧｍＮＲＴ１−１とＧｍＮＲＴ
１−２は、組織における発現パターンが異なっており、
ＧｍＮＲＴ１−１は葉で発現されており、ＧｍＮＲＴ１
−２は根と葉の両方で発現されていることが明らかにな
った。

【００４４】図３のＥ）のデータは、試験に用いたトー
タルＲＮＡの品質チェックと、結果の定量性の保証を目
的として行ったものであるが、ｒＲＮＡ（ribosomal RN
A）の２８Ｓおよび１８Ｓバンドの状態を指標として判
定した結果、問題はないことが示された。

【００４５】

【実施例５】ＧｍＮＲＴ１−３およびＧｍＮＲＴ１−４
についても、遺伝子の発現パターンを確認するための試
験を行った。特にことわらない限り、試験条件は実施例
４と同等である。

【００４６】３時間処理後の根から得られたトータルＲ
ＮＡの場合は、すべての条件において、ＧｍＮＲＴ１−
３の増幅バンドが検出された（図４ Ａ））。この結果
は、ＧｍＮＲＴ１−３遺伝子は、構成的（constitutiv
e）に発現されていることを示している。ＧｍＮＲＴ２
に関しては、実施例４と一致した結果が得られた（図４
Ｂ）および図３ Ｂ））。また、６時間処理後の根から
得られたトータルＲＮＡの場合も、ＧｍＮＲＴ１−３と
ＧｍＮＲＴ２のどちらについても、ほぼ同等の結果が得
られた。図４のＣ）のデータは、試験に用いたトータル
ＲＮＡの品質チェックと、結果の定量性の保証を目的と
して行ったものであるが、ｒＲＮＡの２８Ｓおよび１８
Ｓバンドの状態を指標として判定した結果、問題はない
ことが示された。

【００４７】窒素源への長期間暴露の場合は、アンモニ
ウム存在下およびナイトレートとアンモニウム共存下の
２つの条件下で行った。トータルＲＮＡは、大豆の根か
らは５、７、１１、１４日目に調製し、葉からは１１、
１４日目に調製した後に、ＲＴ−ＰＣＲにかけた。プラ
イマーセットとしては、ＧｍＮＲＴ１−３用には５’Ｓ
ＢＯＮ２と３’ＳＢＯＮ２（表１）を、ＧｍＮＲＴ１−
４用には５’ＳＢＯＮ３と３’ＳＢＯＮ３（表１）を用
いた。

【００４８】根においては、ＧｍＮＲＴ１−３の増幅バ
ンドが、すべてのサンプルで同等に検出された（図５の
Ａ））。この結果からも、ＧｍＮＲＴ１−３遺伝子は構
成的に発現されていることが示された。ＧｍＮＲＴ１−
２のバンドは、アンモニウム存在下に成長させた大豆の
すべての試料において観察されたが、ナイトレートとア
ンモニウム共存下の場合は、バンドは観察されなかった
（図５のＢ））。バンドの強度は成長と共に徐々に増加
しており、明らかにバンドの強度の増加は、根の成長と
対応していることが示された。

【００４９】ＧｍＮＲＴ１−４の発現は弱く、アンモニ
ウム存在下の５日目と７日目の試料だけに観察された
（図５のＣ））。従って、この結果は、アンモニウム存
在下に成長させた大豆では、ＧｍＮＲＴ１−４遺伝子は
成長の初期段階で発現しており、ＧｍＮＲＴ１−２遺伝
子の発現は、根の成長と共に増加して行くことが示され
た。ＧｍＮＲＴ１−５の増幅バンドは、すべての試験サ
ンプルにおいて観察できなかった。恐らく、今回の試験
条件下では、発現が低すぎるものと考えられる。ＧｍＮ
ＲＴ２のバンドは、アンモニウム存在下の７日目と１１
日目の試料で見られたが、ナイトレートとアンモニウム
共存下では１１日目の試料だけに、非常に弱いバンドが
観察された（図５のＤ））。図５のＥ）のデータは、試
験に用いたトータルＲＮＡの品質チェックと、結果の定
量性の保証を目的として行ったものであるが、ｒＲＮＡ
の２８Ｓおよび１８Ｓバンドの状態を指標として判定し
た結果、問題はないことが示された。

【００５０】葉では、ＧｍＮＲＴ１−３遺伝子の増幅バ
ンドが、アンモニウム存在下およびナイトレートとアン
モニウム共存下の両方の試料において同様に検出され、
１１日目と１４日目の試料のバンド強度は、ほとんど同
等であった（図６のＡ））。しかしながら、ＧｍＮＲＴ
１−１および／またはＧｍＮＲＴ１−２のバンドもまた
両方の条件下で検出され、１４日目のバンドの強度は１
１日目の試料よりもずっと強かった（図６のＢ））。図
６のＣ）のデータは、試験に用いたトータルＲＮＡの品
質チェックと、結果の定量性の保証を目的として行った
ものであるが、ｒＲＮＡの２８Ｓおよび１８Ｓバンドの
状態を指標として判定した結果、問題はないことが示さ
れた。

【００５１】

【発明の効果】本発明は、大豆のｃＤＮＡクローニング
と遺伝子発現解析の結果、ＮＲＴ１ファミリーに属する
大豆の新規な遺伝子および遺伝子断片を単離し、ヌクレ
オチド配列を同定するに至った。既知のＮＲＴ１ファミ
リー遺伝子との比較、特に発現組織の違いなどから、本
発明の遺伝子および遺伝子断片は、確かに新規な遺伝子
であることを同定できた。

【００５２】

【表３】

【００５３】

【表４】

【００５４】

【表５】

【００５５】

【表６】

【００５６】

【表７】

【図面の簡単な説明】

【図１】大豆のＧｍＮＲＴ１−１およびＧｍＮＲＴ１−
２と、シロイヌナズナ（Arabidopsis）、アブラナ(Bras
sica)、トマト(Lycopersicon) のＮＲＴ１ファミリーと
のアミノ酸配列の比較である。ＧｍＮＲＴ１−１と一致
しているアミノ酸は点（．）で示し、対応するアミノ酸
が存在しない部分は−マークで示し、すべてで保存され
ているアミノ酸は＊マークで示している。

【図２】タンパク質のハイドロパシープロットを示して
ある。Ａ）は大豆のＧｍＮＲＴ１−２、Ｂ）はシロイヌ
ナズナのＮＲＴ１のハイドロパシープロットである。図
の上方に示したバー（−）は、１２個の膜貫通領域を示
している。

【図３】ＧｍＮＲＴ１および／またはＧｍＮＲＴ１−２
とＧｍＮＲＴ２との発現解析結果を示す電気泳動写真で
ある。主要なバンドの位置を、楔形の矢印で示してあ
る。

【図４】窒素源への短時間（３時間）暴露条件下での、
大豆の根におけるＧｍＮＲＴ１−３とＧｍＮＲＴ２との
発現の比較である。Ａ）はＧｍＮＲＴ１−３、Ｂ）はＧ
ｍＮＲＴ２の結果であり、目的のバンドの位置を、楔形
の矢印で示してある。

【図５】窒素源への長期間暴露条件下での、大豆の根に
おける発現の比較である。Ａ）はＧｍＮＲＴ１−３、
Ｂ）はＧｍＮＲＴ１−２、Ｃ）はＧｍＮＲＴ１−４、
Ｄ）はＧｍＮＲＴ２の結果である。それぞれ、窒素源へ
の暴露期間が、５日目、７日目、１１日目および１４日
目の結果を示してある。目的のバンドの位置を、楔形の
矢印で示してある。また、バンドが薄くて確認し難い部
分があるため、図５のＡ）〜Ｄ）のデータでは、楔形の
矢印がある場合はバンドの存在を示しており、楔形の矢
印がない場合はバンドが存在しないことを示している。

【図６】窒素源への長期間暴露条件下での、大豆の葉に
おける発現の比較である。Ａ）はＧｍＮＲＴ１−３、
Ｂ）はＧｍＮＲＴ１−１および／またはＧｍＮＲＴ１−
２の結果である。それぞれ、窒素源への暴露期間が１１
日目および１４日目の結果であり、目的のバンドの位置
を楔形の矢印で示してある。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 大豆の遺伝子であって、窒素源への暴露
   によって誘導されるナイトレートトランスポーター１遺
   伝子ファミリーに属する遺伝子。
2. 【請求項２】 ヌクレオチド配列が配列表の配列番号
   １、配列番号２、配列番号３のいずれかで示される請求
   項１に記載の大豆の遺伝子。
3. 【請求項３】 ヌクレオチド配列が配列表の配列番号４
   または配列番号５で示される請求項１に記載の大豆の遺
   伝子断片。