CN111676227B

CN111676227B - 大豆核糖体蛋白编码基因GmRPL12的基因工程应用

Info

Publication number: CN111676227B
Application number: CN202010290595.4A
Authority: CN
Inventors: 王慧; 陈燕宁; 黄方; 喻德跃; 吴志医
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2020-04-14
Filing date: 2020-04-14
Publication date: 2022-04-29
Anticipated expiration: 2040-04-14
Also published as: CN111676227A

Abstract

本发明公开了大豆核糖体蛋白编码基因GmRPL12的基因工程应用。SEQ ID NO.1所示大豆核糖体蛋白编码基因GmRPL12在基因工程改造大豆对低硫耐性的应用。过表达GmRPL12能够提高大豆嵌合体对低硫的耐性，增加正常硫水平下和低硫水平下大豆嵌合体植株的无机硫含量。抑制该基因的表达，能够显著降低大豆嵌合体对低硫的耐性。本发明所述的大豆核糖体蛋白编码基因GmRPL12可通过基因工程转化到大豆毛状根中，并最终正向调控大豆对低硫的耐性。

Description

大豆核糖体蛋白编码基因GmRPL12的基因工程应用

技术领域

本发明涉及大豆核糖体蛋白编码基因GmRPL12的应用，属于基因工程领域。

背景技术

大豆[Glycine Max(L.)Merr.]在中国有着悠久的种植和食用历史，是人类和其它动物的主要蛋白质来源，世界上70％的蛋白质食物来自大豆。硫元素虽然仅占大豆干重的0.1％不到，但却有着无可替代的功效，是植物生长发育必需的第四大营养元素，是形成氨基酸和蛋白质所必须的组分。植物主要以硫酸根的形式从土壤中获得硫元素。然而，我国大约五分之一的耕地表现为缺硫或潜在性缺硫，包括大豆主产区东北三省、山东和山西等地。随着农业生产率的提高，作物高产品种的广泛应用，复种指数的提高和工业含硫废气排放的严格控制等，土壤中有效硫含量越来越低。因此，为培育硫高效利用的大豆品种应对土壤缺硫，探索大豆硫利用的机制，提高大豆硫利用效率刻不容缓。

越来越多的研究证明核糖体蛋白不仅作为核糖体主要参与蛋白的合成，而且还执行多种其它功能。这些功能包括直接参与植物的生长发育，比如拟南芥RPL14B基因与花粉育性相关，大豆RPS4参与开花调控。某些核糖体蛋白还参与多种胁迫反应，受发育和环境因素的调控，比如拟南芥的S5参与植物光合作用，生长发育，和冷害胁迫，水稻的叶绿体核糖体ASL2基因的表达受到光调控，大豆核糖体蛋白rpL2参与大豆对病害的抗性，GmRPS13、GmRPS6和GmRPL37基因应答大豆对低温的胁迫反应，小麦15个核糖体蛋白基因在杂种F₁和亲本中表达模式不同。但是不同的核糖体蛋白可能具备不同的功能，对于一个新的核糖体蛋白而言，无法基于现有的核糖体蛋白功能进行预测。目前公开的文献中，还没有大豆核糖体蛋白基因参与大豆低硫胁迫的报道。

发明内容

本发明的目的在于公开大豆核糖体蛋白编码基因GmRPL12耐低硫基因工程应用，该基因在大豆根、茎、叶、花、15d荚、45d荚、15d种子和45d种子中都有表达，根中表达量最高，并且在低硫胁迫诱导后在根和叶中下调表达，在茎中上调表达。GmRPL12可作为目的基因导入大豆毛状根中，正调控植株对低硫的耐性，该基因过量表达能显著增加低硫水平下大豆地上部、地下部的无机硫含量，以及正常硫水平下大豆地上部的无机硫含量。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

SEQ ID NO.1所示大豆核糖体蛋白编码基因GmRPL12在基因工程改造大豆对低硫耐性的应用。

在大豆中，过表达GmRPL12能够显著提高植株对低硫的耐性，抑制该基因的表达，能够显著降低大豆对低硫的耐性。

SEQ ID NO.1所示大豆核糖体蛋白编码基因GmRPL12的过表达载体在提高转基因大豆对低硫耐性中的应用。

有益效果

GmRPL12是一种50S核糖体蛋白L7/L12基因，在大豆中，我们则发现GmRPL12正向调控大豆嵌合体对低硫的耐性。通过大豆毛状根进行功能验证发现，该基因正向调控大豆对低硫的耐性，过表达时增加不同硫水平下大豆的无机硫含量。因此，GmRPL12可以作为调节大豆对硫吸收利用的靶点，用于大豆耐低硫性状的改造。

附图说明

图1.PCR克隆GmRPL12后琼脂糖凝胶电泳图。目的片段大小576bp。Marker：DL2000

图2.GmRPL12组织表达模式。

图3.GmRPL12能响应低硫胁迫诱导。低硫诱导后10d的大豆根、茎和叶中GmRPL12表达量的变化。

图4.GmRPL12基因过表达与干扰植株阳性苗鉴定。(A)目的基因的PCR检测。M：DL2000；1-2：水；3-4：过表达对照；5-6：干扰对照；7-12：部分转干扰载体GmRPL12-pB7GWIWG2(II)大豆嵌合体株系，片段大小为399bp；13-19：转过表达载体pMDC83-GmRPL12大豆嵌合体株系，片段大小为636bp。(B)标记基因的PCR检测。M:DL2000；1-8：过表达载体中Kana抗性标记基因，片段大小为121bp；9：过表达对照；10-15：干扰载体中bar标记基因，片段大小为150bp；16：干扰对照；17：水。

图5.GmRPL12过表达与干扰转基因嵌合株系相对表达量。OE表示过表达株系，OE-EV表示过表达空载株系；Ri表示干扰株系；Ri-EV表示干扰空载株系；+S表示正常营养液生长；-S表示缺硫营养液中生长。两尾测验，*：P<0.05,**：P<0.01，误差线表示±SEM。

图6.GmRPL12过表达株系与干扰株系表型。低硫处理10天的大豆过表达毛状根OE、过表达空载毛状根OE-EV、干扰毛状根Ri和干扰空载毛状根Ri-EV。+S表示正常营养液生长；-S表示缺硫营养液中生长。

图7.GmRPL12过表达与干扰株系倒一、倒二位叶片叶绿素含量以及株高。大豆过表达毛状根OE和过表达空载毛状根OE-EV正常和低硫诱导生长下的倒一、倒二位叶片叶绿素含量以及株高。大豆干扰毛状根Ri和干扰空载毛状根Ri-EV正常和低硫诱导生长下的倒一、倒二位叶片叶绿素含量以及株高。两尾测验，*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001。误差线表示±SEM。

图8.GmRPL12过表达与干扰株系的地上部和地下部鲜重、干重。大豆过表达毛状根OE和过表达空载毛状根OE-EV正常和低硫诱导生长下的地上部鲜重、地下部鲜重、地上部干重和地下部干重。大豆干扰毛状根Ri和干扰空载毛状根Ri-EV正常和低硫诱导生长下的地上部鲜重、地下部鲜重、地上部干重和地下部干重。两尾测验，*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001。误差线表示±SEM。

图9.GmRPL12过表达转基因嵌合株系中无机硫的浓度。大豆过表达毛状根OE和过表达空载毛状根OE-EV正常和低硫诱导生长下的地上部和地下部植株硫含量。大豆干扰毛状根Ri和干扰空载毛状根Ri-EV正常和低硫诱导生长下的地上部和地下部植株硫含量。两尾测验，*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001。误差线表示±SEM。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。

下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。

实施例1

1)大豆核糖体蛋白编码基因GmRPL12的克隆

以大豆品种科丰一号为取材对象，取其根部，用研钵研碎，加入盛有裂解液的1.5mL EP管，充分振荡后，移至1.5mL EP管中，抽提总RNA(Total RNA Kit(天根，北京，中国)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，分光光度计测定RNA含量。以获得的总RNA为模板，按照日本TaKaRa公司提供的反转录试剂盒(TaKaRa Primer Script^TM RT reagent kit，日本)的说明书进行反转录，得到cDNA第一链后，进行PCR扩增，PCR程序如下PCR程序如下：95℃预变性3分钟，95℃变性15秒，60℃退火15秒，72℃延伸45秒，共35个循环，最后72℃保温5分钟，随后12℃恒温，获得科丰一号的cDNA。

从NCBI数据库和Phytozome v12大豆数据库，找到GmRPL12所对应的基因(Glyma.09g029000，GeneID:100816926)，根据数据库提供的核苷酸序列设计特异引物引物，引物序列见SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，从大豆品种科丰一号扩增基因，PCR克隆后随后进行PCR产物割胶纯化，PCR产物连接T载体(pClone007)得到含有目的基因CDS的T载体，转化大肠杆菌感受态，挑取阳性单克隆测序，测序后获得具有完整编码区的长度为576bp的大豆GmRPL12基因的CDS序列，其中编码区序列见SEQ ID NO.1，大小为576bp(图1)，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2)GmRPL12的组织表达分析

为了鉴定GmRPL12在不同组织中的表达水平，采集大豆品种科丰一号不同发育阶段的根、茎、叶、花、荚和种子：根、茎和叶为V4期；成熟花为R2期；种子和荚在开花后15天和45天采集。样品于液氮速冻后-80℃保存。总RNA的提取同步骤1)。以上述各组织取样获得的总RNA为模板，反转为cDNA。GmRPL12荧光定量引物序列见SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，检测GmRPL12基因在各组织的表达量变化以大豆组成内参基因Tubulin作为内部参照，引物序列见SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8，进行实时荧光定量PCR反应(Real-time RT-PCR)。

GmRPL12主要在大豆根、茎、叶、花和45天荚组织中表达，在15天荚和15天种子中的表达量较低(图2)，表明GmRPL12在植物的各器官中起着重要的作用。

3)GmRPL12在低硫胁迫诱导下的表达分析

将科丰一号放于正常营养液和减硫营养液中生长，每株3次重复。正常营养液(+S)即1/2浓度Hoagland完全营养液培养(表1)，将1/2浓度Hoagland营养液培养中MgSO₄、ZnSO₄·7H₂O、CuSO₄·5H₂O用MgCl₂、ZnCl₂、CuCl₂代替即为减硫营养液。10d后将大豆苗取出，诱导处理完成。诱导处理后的植株(诱导组)和对照组(未诱导)分别取新鲜的根、茎和叶片，液氮速冻后于-80℃保存。总RNA的提取同步骤1)。以上述诱导组和对照组取样获得的总RNA为模板，反转为cDNA，并进行实时荧光定量PCR反应(Real-time RT-PCR)。GmRPL12荧光定量引物序列和内参基因Tubulin引物序列同步骤2)。

低硫诱导处理科丰一号后，GmRPL12表达量在不同组织间存在不同反应，GmRPL12在科丰一号的根和叶片中经过诱导发生显著下调，而在茎中呈现上调，表明GmRPL12基因在科丰一号中的表达受低硫胁迫诱导(图3)。

表1 Hoagland平衡溶液的配方(1/2)

实施例2

1)植物表达载体的构建

设计含有BamHⅠ和KpnⅠ双酶切位点接头和仅包含候选基因全长的引物，以含有目的基因的CDS质粒为模板进行PCR扩增(引物序列见SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10)。PCR程序如下：95℃预变性3分钟，95℃变性15秒，60℃退火15秒，72℃延伸45秒，共35个循环，最后72℃保温5分钟，随后4℃恒温，测序后获得具有完整编码区的长度为576bp的大豆GmRPL12基因的CDS序列，其序列见SEQ ID NO.1。对扩增产物和pMDC83空载用BamHⅠ和KpnⅠ进行双酶切，纯化酶切后的载体。将PCR产物与酶切后的pMDC83线性载体按照诺唯赞

Entry One Step Cloning Kit(Vazyme，C114-01)说明书构建含有目的基因的过表达载体pMDC83-GmRPL12，并进行菌液PCR测序验证，引物序列见SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11，得到pMDC83-GmRPL12植物过量表达载体。植物转化载体pMDC83含有2x 35S强启动子，可强烈诱导目的基因GmRPL12在受体中的表达。然后通过冻融法将载体转入根癌农杆菌菌株K599中，同时将空载pMDC83也转化到K599中，作为空载对照。

构建RNA干扰载体时，GmRPL12基因CDS全长576bp，不符合干扰片段的长度，因此扩增其高度特异的399bp长度的CDS序列连接干扰载体(引物序列见SEQ ID NO.14和SEQ IDNO.15)，PCR程序如下：95℃预变性3分钟，95℃变性15秒，60℃退火15秒，72℃延伸35秒，共35个循环，最后72℃保温5分钟，随后4℃恒温。测序后获得具有高度特异的399bp长度的大豆GmRPL12基因序列，其序列见SEQ ID NO.20。将GmRPL12基因序列与Invitrogen公司的

Technology with Clonase^TM II试剂盒中的pDONR221载体进行BP反应，并进行菌液PCR测序验证，引物序列见SEQ ID NO.16/17和SEQ ID NO.15。获得入门克隆。接下来将pDONR221载体换成pB7GWIWG2(II)载体。将构建好的载体GmRPL12-pB7GWIWG2(II)和空载pB7GWIWG2(II)转化到K599中。

2)转基因大豆毛状根的获得

对生长5天的大豆幼苗子叶节进行创伤处理，用注射器扎穿大豆子叶节，将步骤1)中获得的分别含pMDC83-GmRPL12和GmRPL12-pB7GWIWG2(II)载体以及相应空载对照的根癌农杆菌菌株K599菌液注入创伤处。将接种后的大豆幼苗置于高温高湿的密闭环境中，培养2周左右后，毛状根会从子叶节伤口处长出。当毛根约长到5cm左右，此时将大豆主根剪去放入营养液中养毛根4d左右。再将养好的大豆植株分别放入正常营养液和减硫营养液(1/2霍格兰营养液)中进行低硫诱导10d(N＝5)，每隔3d更换一次营养液。诱导结束后对植株的倒一叶叶绿素、倒二叶叶绿素、株高、地上部鲜重、地下部鲜重、地上部干重和地下部干重等表型进行测定并取样备用。将GmRPL12基因过表达毛状根称为OE，其空载对照为OE-EV；将GmRPL12基因干扰毛状根称为Ri，其空载对照为Ri-EV。为检测是否为阳性毛状根，利用特异性引物对提取的DNA片段进行PCR检测。过表达毛状根目的基因GmRPL12检测引物序列见SEQID NO.10和SEQ ID NO.11，PCR阳性毛状根检测胶图见图4A。转过表达空载毛状根阳性鉴定使用Kana抗性标记基因序列检测引物序列见SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13(图4B)。RNA干扰毛状根目的基因GmRPL12检测引物序列见SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16，PCR阳性毛状根检测见图4A。转干扰空载的毛状根阳性鉴定使用bar基因作为标记基因，其检测引物序列见SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19(图4B)。实时荧光定量qPCR发现在过表达毛状根(OE)中GmRPL12基因表达量要显著高于OE-EV的，而在RNA干扰的毛状根中(Ri)中GmRPL12基因表达量要显著低于Ri中的(图5)。GmRPL12基因和大豆内参Tubulin的荧光定量引物序列同上。

OE和Ri转基因毛根经过低硫诱导处理后，在低硫条件下，4个转基因株系中只有GmRPL12基因过表达大豆嵌合体根量增加(图6)。测量大豆嵌合体的倒一位叶的叶绿素(SPAD值)、倒二位叶的叶绿素(SPAD值)和株高。与+S相比，在-S条件下，GmRPL12基因过表达嵌合体株系的倒一位叶的叶绿素含量显著增加，株高显著升高，倒二位叶叶绿素含量也表现为增加，但没有达到显著水平。RNA干扰下调GmRPL12基因表达的嵌合体中，三个指标在-S条件下的表现显著或极显著低于在+S条件下的表现。两个转空载嵌合体株系，除了倒一位叶的叶绿素含量显著增加外，其它两个指标在-S下的表现都显著或极显著低于在+S条件下的表现(图7)。分析地上部和地下部鲜重、干重发现，与对照正常硫水平条件下相比，在低硫处理条件下，GmRPL12基因过表达株系的地上部鲜重和干重，地下部鲜重和干重都显著增加。相反的，低硫条件下GmRPL12基因干扰株系的地上部鲜重和干重，地下部鲜重和干重都显著低于正常硫条件下的测定结果。对于两个转空载株系，在-S条件下的地上部和地下部鲜重、干重也都显著或极显著低于+S水平下测定的结果(图8)。进一步测定无机硫含量发现，GmRPL12基因的过量表达能显著增加-S时地上部、地下部的无机硫含量，以及+S时地上部的无机硫含量(图9)。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 大豆核糖体蛋白编码基因GmRPL12的基因工程应用

<140> 2020102905954

<141> 2020-04-14

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 576

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 1

atgaggttta tgcccctttc cagattaatt tgccgtctcc ctcggccgca tacacgtggg 60

cctttgcaat ctcgtgcctt acagagtgat tctgttccta aagatccaca ggctaagcca 120

ataaagtaca gaatccctca attctatgat ccctatggcc ccagacctcc accctcagaa 180

aaaattgttc agcttgcaga acgaattgga gcactatcgg aagaagaacg tggtcaaatt 240

atgcctactt tgtcagaaag attaaaactt ccaaagttgc agccaatttc cacagatggc 300

atgggcatgg gtacagaagg tggtactgct ggaccaaagg ttgaggagaa aaaggcagag 360

aaaacagctt ttgatgtgaa gttggagaaa tttgatgctg ccgcaaagat caaggtgatt 420

aaggaggtaa gagcatttac taacctagga ttgaaagagg ccaaagatct tgttgaaaaa 480

gttccagttg tgctaaaaca aggaatcaca aaagaggagg caaatgaaat aatagaaaaa 540

ataaaagctg ctggaggagt tgcagtcatg gagtag 576

<210> 2

<211> 191

<212> PRT

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 2

Met Arg Phe Met Pro Leu Ser Arg Leu Ile Cys Arg Leu Pro Arg Pro

1 5 10 15

His Thr Arg Gly Pro Leu Gln Ser Arg Ala Leu Gln Ser Asp Ser Val

20 25 30

Pro Lys Asp Pro Gln Ala Lys Pro Ile Lys Tyr Arg Ile Pro Gln Phe

35 40 45

Tyr Asp Pro Tyr Gly Pro Arg Pro Pro Pro Ser Glu Lys Ile Val Gln

50 55 60

Leu Ala Glu Arg Ile Gly Ala Leu Ser Glu Glu Glu Arg Gly Gln Ile

65 70 75 80

Met Pro Thr Leu Ser Glu Arg Leu Lys Leu Pro Lys Leu Gln Pro Ile

85 90 95

Ser Thr Asp Gly Met Gly Met Gly Thr Glu Gly Gly Thr Ala Gly Pro

100 105 110

Lys Val Glu Glu Lys Lys Ala Glu Lys Thr Ala Phe Asp Val Lys Leu

115 120 125

Glu Lys Phe Asp Ala Ala Ala Lys Ile Lys Val Ile Lys Glu Val Arg

130 135 140

Ala Phe Thr Asn Leu Gly Leu Lys Glu Ala Lys Asp Leu Val Glu Lys

145 150 155 160

Val Pro Val Val Leu Lys Gln Gly Ile Thr Lys Glu Glu Ala Asn Glu

165 170 175

Ile Ile Glu Lys Ile Lys Ala Ala Gly Gly Val Ala Val Met Glu

180 185 190

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgaggttta tgcccctttc cagat 25

<210> 4

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctactccatg actgcaactc 20

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcaatctcgt gccttaca 18

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<211> 19

<212> DNA

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<400> 6

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<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cacttacgca tcacatagc 19

<210> 9

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

caggtcgact ctagaggatc cgccaccatg aggtttatgc ccctttccag at 52

<210> 10

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gggaaattcg agctcggtac cctactccat gactgcaact c 41

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gaggacctcg actctagaac ta 22

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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atcgaccgga cgcagaaggc aatg 24

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctc cgcaatctcg tgccttaca 49

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

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<211> 20

<212> DNA

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<400> 17

gacgcacaat cccactatcc 20

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<213> 大豆(Glycine max)

<400> 20

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gtacagaatc cctcaattct atgatcccta tggccccaga cctccaccct cagaaaaaat 120

tgttcagctt gcagaacgaa ttggagcact atcggaagaa gaacgtggtc aaattatgcc 180

tactttgtca gaaagattaa aacttccaaa gttgcagcca atttccacag atggcatggg 240

catgggtaca gaaggtggta ctgctggacc aaaggttgag gagaaaaagg cagagaaaac 300

agcttttgat gtgaagttgg agaaatttga tgctgccgca aagatcaagg tgattaagga 360

ggtaagagca tttactaacc taggattgaa agaggccaa 399

Claims

1.SEQ ID NO. 1所示大豆核糖体蛋白编码基因GmRPL12在基因工程改造大豆对低硫耐性中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于过表达GmRPL12后，增强大豆嵌合体对低硫的耐性，降低低硫胁迫对大豆嵌合体生长发育的影响，大豆嵌合体无机硫含量增加。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于抑制基因GmRPL12表达后，降低大豆嵌合体对低硫的耐性。

4.SEQ ID NO. 1所示大豆核糖体蛋白编码基因GmRPL12的过表达载体在提高转基因大豆对低硫耐性中的应用。