JP2002119291A - 核酸の測定方法、それに用いる核酸プローブ及びその方法によって得られるデータを解析する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 蛍光色素で標識された核酸プローブを用いる
核酸測定法、該法を利用するリアルタイム定量的ＰＣＲ
法、及び該ＰＣＲ法により得られるデータを解析する方
法において、短時間かつ正確に目的が達成できる方法を
提供する。 【解決手段】 蛍光色素で標識された核酸プローブ、ま
た、２−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチド、キメラオリゴ
ヌクレオチドなどからなるか、またはそれらが介在する
オリゴヌクレオチドからなる当該核酸プローブを標的核
酸にハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション前後
における蛍光色素の発光の減少量を測定する核酸の新規
測定法、該法を用いたリアルタイム定量的ＰＣＲ法、及
び該ＰＣＲ法で得られるデーターの解析の際、アニーリ
ング反応時の蛍光強度値を、変性反応時のもので補正す
る過程を有するデータ解析法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、標的核酸の濃度を
測定する方法、その方法のための核酸プローブ及びその
方法によって得られるデータを解析する方法に関する。
詳しくは蛍光色素で標識された核酸プローブを用いる各
種核酸の濃度の各種測定方法に関し、蛍光色素で標識さ
れた核酸プローブを標的核酸にハイブリダイズさせたと
きに、その蛍光色素の発光が減少するという原理に基づ
き、すなわち、ハイブリダイゼーション前後における蛍
光色素の発光の減少量を測定することによる各種核酸の
濃度の各種新規測定方法、それに用いる核酸プローブ及
びデバイス（ｄｅｖｉｃｅｓ）、それら測定方法の一つ
であるＰＣＲ方法によって得られるデータを解析する方
法、それぞれの解析方法を実施するための手段を備えた
解析装置、解析方法の各手順をプログラムとして記録し
たコンピュータ読み取り可能な記録媒体に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、蛍光色素で標識された核酸プロー
ブを用いて核酸濃度を測定する各種方法が知られてい
る。該方法には、以下のようなものがある。 （１）ドットブロッテング法 この方法は、標的核酸と蛍光色素で標識された核酸プロ
ーブをメンブラン上でハイブリダイズさせた後、未反応
の核酸プローブを洗い流し、標的核酸とハイブリダイズ
した核酸プローブに標識された蛍光色素分子のみの蛍光
強度を測定するものである。

【０００３】（２）インターカレーター方法(Glazer et
al., Nature 359:959,1992） この方法は、インターカレーターと称されるある種の蛍
光色素が核酸の二重鎖内にはまりこんだときに、強く発
光するのでその発光の増加量を測定する方法である。そ
の蛍光色素として、例えば、エチジウムブロマイド（実
験医学、１５巻、７号、４６〜５１ページ、１９９７
年、羊土社）、SYBR R グリーン(Green) I(LightCycler
^TM System；１９９９年４月５日、ロシュ・ダイアグノ
スティックス株式会社発行のパンフレット）を挙げるこ
とができる。

【０００４】（３）FRET(fluorescence energy transfe
r)を利用する方法（Mergney et al.,Nucleic Acid Re
s., 22: 920-928,1994.) この方法は、標的核酸に二つの核酸プローブをハイブリ
ダイズさせることからなる。二つの核酸プローブは、各
々異なった蛍光色素で標識されている。二つのプローブ
の内の一方の蛍光色素は、ＦＲＥＴ現象を通して、エネ
ルギーを他方のプローブの蛍光色素に送りこれを発光さ
せることができる。二つのプローブは、蛍光色素が向き
合うように、かつ１〜９塩基離れてハイブリダイズする
ように設計されている。それで、二つの核酸プローブが
標的核酸にハイブリダイズすると後者の蛍光色素の発光
が起こり、発光の強さが標的核酸の複製量に比例する。

【０００５】（４）分子ビーコン方法（Tyagi et al.,
Nature Biotech.,14:303-308,1996.) この方法で使用する核酸プローブは、核酸プローブの一
端にレポーター色素、他端にクエンチャー色素が標識さ
ている。そしてその両端部は塩基配列において互いに相
補性があるので、プローブ全体としてヘアーピン構造
（hairpin stem)を形成するように塩基配列が設計され
ている。その構造のために液中に浮遊している状態で
は、Forster共鳴エネルギーのため、レポーター色素の
発光は、クエンチャー色素により抑制されている。しか
し、標的核酸にハイブリダイズするとヘアーピン構造が
壊れるために、レポーター色素とクエンチャー色素の距
離が大きくなるので、Forster共鳴エネルギーの移動が
起こらなくなる。そのために、レポーター色素の発光が
起こるようになる。

【０００６】（５）デービスの方法（Davis et al.、 N
ucleic acids Res.24: 702-706、1996) デービスは、オリゴヌクレオチドの３’末端に蛍光色素
を、炭素原子１８個を有するスペサーを介して結合した
プローブを作成した。これをフローサイトメトリーに適
用した。３’末端に蛍光色素を直接に結合した場合よ
り、ハイブリダイズした場合、１０倍の蛍光強度が得ら
れることを報告した。これらの方法は、核酸の各種測定
方法、ＦＩＳＨ方法（fluorescent in situhybridizati
on assays)、ＰＣＲ方法、ＬＣＲ方法（ligase chain r
eaction)、ＳＤ方法( strand displacement assays)、
競合的ハイブリダイゼーション方法(competitive hybri
dization)などに適用されてめざましい発展をとげてい
る。

【０００７】これらの方法は、現在一般的に使用されい
るが、蛍光色素で標識した核酸プローブと標的核酸のハ
イブリダイゼーション反応を行った後、ハイブリダイズ
しなかった当該核酸プローブを反応系から洗い流す必要
があるという好ましくない手順を有している。このよう
な手順を除くと測定時間の短縮、測定の簡便性、測定の
正確性をもたらすことは明らかである。そこで、このよ
うな手順を有さない核酸測定方法の開発が望まれてい
た。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、前記
の状況に鑑み、蛍光色素で標識された核酸プローブを用
いる標的核酸濃度の測定方法において、より短時間に、
より簡便、より正確に標的核酸の濃度を測定できる方法
を提供することである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記課題
を解決するにあたり、核酸プローブを用いた核酸の濃度
を測定する方法について検討を重ねた。その結果、蛍光
色素で標識された核酸プローブが標的核酸にハイブリダ
イズしたときに、蛍光色素の発光が減少するという現象
（蛍光消光現象）があり、特定の色素においてはその減
少が顕著であり、特にその減少の程度は、蛍光色素が結
合した部分の塩基の種類又は塩基配列に依存するという
ことを発見した。本発明はかかる発見に基づいて完成さ
れたものである。

【００１０】即ち、本発明は、 １）蛍光色素で標識された核酸プローブを用いる核酸測
定方法において、前記核酸プローブが標的核酸にハイブ
リダイズしたときに、蛍光色素が、その発光を減少させ
る核酸プローブであり、前記核酸プローブを標的核酸に
ハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション前後にお
ける蛍光色素の発光の減少量を測定することを特徴とす
る標的核酸の濃度の測定方法、また、

【００１１】２）蛍光色素で標識された核酸プローブが
標的核酸にハイブリダイズしたときに、前記蛍光色素
が、その発光を減少させる核酸プローブであり、かつ、
当該プローブは、その末端部において前記蛍光色素で標
識されており、当該核酸プローブが当該末端部において
標的核酸にハイブリダイズしたとき、当該プローブにハ
イブリダイズした標的核酸の末端塩基から１ないし３塩
基離れて、標的核酸の塩基配列にＧ（グアニン）が少な
くとも１塩基存在するように、当該プローブの塩基配列
が設計されていることを特徴とする標的核酸の濃度測定
用の蛍光色素で標識された核酸プローブ、また、

【００１２】３）核酸プローブが３’末端において蛍光
色素で標識されている前記２）に記載の標的核酸の濃度
測定用の蛍光色素で標識された核酸プローブ、また ４）核酸プローブが５’末端において蛍光色素で標識さ
れている前記２）に記載の標的核酸の濃度測定用の蛍光
色素で標識された核酸プローブ、また、

【００１３】５）蛍光色素で標識された核酸プローブが
標的核酸にハイブリダイズしたときに、上記蛍光色素
が、その発光を減少させる核酸プローブであり、かつ、
当該プローブは、その末端部において前記蛍光色素で標
識されており、当該核酸プローブが、前記標的核酸にハ
イブリダイズしたとき、当該末端部分においてプローブ
−核酸ハイブリッド複合体の複数塩基対が少なくとも一
つのＧ（グアニン）とＣ（シトシン）のペアーを形成す
るように、当該プローブの塩基配列が設計されているこ
とを特徴とする標的核酸の濃度測定用の蛍光色素で標識
された核酸プローブ、また、

【００１４】６）核酸プローブの３’末端塩基がＧ又は
Ｃで、かつ３’末端が蛍光色素で標識されている前記
５）に記載の標的核酸の濃度測定用の蛍光色素で標識さ
れた核酸プローブ、また、 ７）核酸プローブの５’末端塩基がＧ又はＣで、かつ
５’末端が蛍光色素で標識されている前記５）に記載の
標的核酸の濃度測定用の蛍光色素で標識された核酸プロ
ーブ、また、

【００１５】８）核酸プローブが、３’末端のリボース
若しくはデオキシリボースの３’炭素の水酸基、又は
３’末端のリボースの３’若しくは２’炭素の水酸基が
リン酸化されている前記４）又は前記７）に記載の標的
核酸の濃度測定用の蛍光色素で標識された核酸プロー
ブ、また、

【００１６】９）核酸測定用核酸プローブのオリゴヌク
レオチドが、化学的に修飾した核酸であるである前記
１）〜８）の何れか１項に記載の標的核酸の濃度測定用
の蛍光色素で標識された核酸プローブ、また、 １０）化学的に修飾した核酸が2'-O-メチルオリゴヌク
レオチド、2'-O-エチルオリゴヌクレオチド、2'-O-ブチ
ルオリゴヌクレオチド又は2'-O-ベンジルオリゴヌクレ
オチドである前記９）に記載の標的核酸の濃度測定用の
蛍光色素で標識された核酸プローブ、また、 １１）核酸測定用核酸プローブのオリゴヌクレオチド
が、リボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドを含
むキメリックオリゴヌクレトチド（chimeric oligonucl
eotide）である前記２）〜８）の何れか１項に記載の標
的核酸の濃度測定用の蛍光色素で標識された核酸プロー
ブ、また、

【００１７】１２）キメリックオリゴヌクレトチドが、
2'-O-メチルオリゴリボヌクレオチド、2'-O-エチルオリ
ゴヌクレオチド、2'-O-ブチルオリゴヌクレオチド、2'-
O-アルキレンオリゴヌクレオチド又は2'-O-ベンジルオ
リゴヌクレオチドを介在するものである前記１１）に記
載の標的核酸の濃度測定用の蛍光色素で標識された核酸
プローブ、また、 １３）前記２）〜８）の何れか１項に記載の核酸測定用
核酸プローブを、標的核酸にハイブリダイズさせ、ハイ
ブリダイゼーション前後における蛍光色素の発光の減少
量を測定することを特徴とする標的核酸の濃度測定方
法、また、

【００１８】１４）前記９）〜１２）の何れか１項に記
載の核酸測定用核酸プローブを、標的核酸にハイブリダ
イズさせ、ハイブリダイゼーション前後における蛍光色
素の発光の減少量を測定することを特徴とする標的核酸
の濃度測定方法、また、 １５）標的核酸をその高次構造が十分に破壊されるに適
した条件で加熱処理後、核酸プローブと標的核酸をハイ
ブリダイズさせる前記１４）に記載の標的核酸の濃度測
定方法。 １６）ハイブリダイゼーション反応前にハイブリダイゼ
ーション反応実施のためのハイブリダイゼーション反応
系にヘルパープローブを添加する前記１４）又は前記１
５）に記載の標的核酸の濃度測定方法、また、

【００１９】１７）ヘルパープローブの塩基配列が
（5')TCCTTTGAGT TCCCGGCCGG A (3')又は／及び(5')CCC
TGGTCGT AAGGGCCATG ATGACTTGAC GT(3')である前記１
６）に記載の標的核酸の濃度測定方法、また、 １８）加熱処理条件が８０〜１００℃、１〜１５分であ
る前記１５）〜１７）のいずれか１項に記載の標的核酸
の濃度測定方法、また、 １９）標的核酸がＲＮＡである前記１３）〜１８）のい
ずれか１項に記載の標的核酸の濃度測定方法、また、 ２０）標的核酸の濃度を測定するキットにおいて、前記
２）〜１２）の何れか１項に記載の核酸プローブを含有
又は付帯することを特徴とする標的核酸の濃度測定用キ
ット、また、 ２１）ヘルパープローブを含有又は付帯する前記２０）
に記載の標的核酸の濃度測定用キット、また、

【００２０】２２）標的核酸の多型(polymorphism)又は
／及び変異（mutation)を解析若しくは測定する方法に
おいて、前記２）〜１２）の何れか１項に記載の核酸プ
ローブを標的核酸にハイブリダイズさせ、蛍光強度の変
化量を測定することを特徴とする標的核酸の多型又は／
及び変異を解析若しくは測定する方法、また、 ２３）標的核酸の多型又は／及び変異を解析若しくは測
定する測定キットにおいて、前記２）〜１２）の何れか
１項に記載の核酸プローブを含有又は付帯することを特
徴とする標的核酸の多型又は／及び変異を解析若しくは
測定するキット、また、

【００２１】２４）ハイブリダイゼーション反応系に添
加するためのヘルパープローブを含有又は付帯する前記
２３）に記載の標的核酸の多型又は／及び変異を解析若
しくは測定するキット、また、 ２５）前記２２）に記載の方法により得られるデータを
解析する方法において、標的核酸が蛍光色素で標識され
た核酸プローブとハイブリダイズしたときの反応系の蛍
光強度値を、前記のハイブリダイズしていないときの反
応系の蛍光強度値により補正処理する過程を有すること
を特徴とする標的核酸の多型又は／及び変異を解析若し
くは測定する方法のためのデータ解析方法、また、

【００２２】２６）標的核酸の多型又は／及び変異を解
析若しくは測定する測定装置において、前記２５）に記
載のデータ解析方法を実施するための手段を有すること
を特徴とする標的核酸の多型又は／及び変異を解析若し
くは測定する測定装置、また、 ２７）前記２５）に記載の補正処理過程をコンピュータ
に実行させるための手順をプログラムとして記録したコ
ンピュータ読取可能な記録媒体、また、

【００２３】２８）前記２）〜１２）の何れか１項に記
載の核酸プローブ、又は一つの分子内に二つの異なった
蛍光色素を有し、標的核酸にハイブリダイズしていない
ときは、二つの蛍光色素の相互作用により消光若しくは
発光しているが、標的核酸にハイブリダイズすると発光
若しくは消光するように設計された構造をもつ別の核酸
プローブを複数個固体支持体表面に結合させ、それに標
的核酸をハイブリダイズさせて標的核酸の濃度を測定す
ることができるようにしたことを特徴とする単数種若し
くは複数種の核酸の濃度をそれぞれ測定するためのデバ
イス、また、

【００２４】２９）前記２８）に記載の核酸測定用デバ
イスにおいて、核酸プローブが固体支持体表面にアレー
状に配列、結合させた単数種若しくは複数種の核酸の濃
度をそれぞれ測定するためのデバイス（チップ）、ま
た、 ３０）固体支持体表面に結合させられた核酸プローブ毎
に、反対側の表面に少なくとも一つの温度センサーとヒ
ーターが設置され、核酸プローブ結合領域が最適温度条
件になるように温度調節され得る前記２８）、又は前記
２９）に記載の単数種若しくは複数種の核酸の濃度をそ
れぞれ測定するためのデバイス、また、 ３１）核酸プローブを蛍光色素で標識していない端部で
固体支持体表面に結合させた前記２８）〜３０）の何れ
か１項に記載の単数種若しくは複数種の核酸の濃度をそ
れぞれ測定するためのデバイス、また、

【００２５】３２）前記２８）〜３０）の何れか１項に
記載の核酸測定用デバイスを用いて標的核酸を測定する
ことを特徴とする標的核酸の濃度測定方法、また、 ３３）前記１）、１３）〜１９）の何れか１項、又は前
記３２）に記載の核酸の測定方法において、標的核酸
が、純粋分離して得た微生物由来、又は動物由来である
ことを特徴とする標的核酸の濃度測定方法、また、 ３４）標的核酸が、複合微生物系、又は共生微生物系の
細胞内若しくは細胞のホモジネートに含まれる核酸であ
る前記１）、又は前記１３）〜１９）の何れか１項、又
は３２）に記載の標的核酸の濃度測定方法、また、

【００２６】３５）ＰＣＲ方法において、前記２）〜
３）、５）、６）、又は前記８）〜１２）の何れか１項
に記載の核酸プローブを用いて反応を行い、核酸伸長反
応時当該プローブがポリメラーゼにより分解除去されて
いる反応系又は核酸変性反応時若しくは核酸変性反応が
完了している反応系の蛍光強度値と標的核酸若しくは増
幅標的核酸が該核酸プローブとハイブリダイズしている
ときの反応系の蛍光強度値を測定し、前者からの蛍光強
度値の減少率を算出することを特徴とするＰＣＲで増幅
された標的核酸の濃度測定方法、また、

【００２７】３６）ＰＣＲ方法において、前記４）又は
前記７）に記載の核酸プローブをプライマーとして反応
を行い、当該プローブと標的核酸若しくは増幅標的核酸
がハイブリダイズしていない反応系の蛍光強度値と該核
酸プローブが標的核酸若しくは増幅標的核酸とハイブリ
ダイズしているときの反応系の蛍光強度値を測定し、前
者の蛍光強度値の減少率を算出することを特徴とするＰ
ＣＲで増幅された標的核酸の濃度測定方法、また、 ３７）ＰＣＲ方法がリアルタイム定量的ＰＣＲ方法であ
る前記３５）又は前記３６）に記載のＰＣＲ方法の標的
の増幅核酸の濃度測定方法、また、

【００２８】３８）前記１）、１３）〜１９）の何れか
１項、又は前記３２）〜３７）の何れか１項に記載の核
酸測定法で得られたデータを解析する方法において、標
的核酸が蛍光色素で標識された核酸プローブとハイブリ
ダイズした後の反応系の蛍光強度値を、そのように形成
されたプローブ−核酸ハイブリッド複合体が解離した後
で得られる反応系の蛍光強度値により補正することを特
徴とする標的核酸の濃度測定方法のためのデータ解析方
法、また、

【００２９】３９）前記３７）に記載のリアルタイム定
量的ＰＣＲ方法で得られたデータを解析する方法におい
て、各サイクルにおける増幅した核酸が蛍光色素と結合
した後、あるいは増幅した核酸が蛍光色素で標識された
核酸プローブとハイブリダイズした後の反応系の蛍光強
度値を、各サイクルにおける形成された蛍光色素−核酸
複合体、あるいはそのようにして形成されたプローブ−
核酸ハイブリッド複合体が解離した後で得られる反応系
の蛍光強度値により補正する演算処理過程（以下、補正
演算処理過程という。）を有することを特徴とするリア
ルタイム定量的ＰＣＲ方法のためのデータ解析方法、ま
た、

【００３０】４０）前記３９）に記載の補正演算処理過
程が、次の〔数式１〕あるいは〔数式２〕によるもので
ある前記３９）に記載のリアルタイム定量的ＰＣＲ方法
のためのデータ解析方法、また、 ｆ_n＝ｆ_hyb,n／ｆ_den,n 〔数式１〕 ｆ_n＝ｆ_den,n／ｆ_hyb,n 〔数式２〕 〔式中、 ｆ_n：〔数式１〕あるいは〔数式２〕により算出された
ｎ次サイクルにおける補正演算処理値、 ｆ_hyb,n：ｎ次サイクルにおいて、増幅した核酸が蛍光
色素と結合した後、あるいは増幅した核酸が蛍光色素で
標識された核酸プローブとハイブリダイズした後の反応
系の蛍光強度値、 ｆ_den,n：ｎ次サイクルにおける、形成された蛍光色素
−核酸複合体、あるいは形成されたプローブ−核酸ハイ
ブリッド複合体が解離した後の反応系の蛍光強度値〕、
また、

【００３１】４１）前記３７）に記載のリアルタイム定
量的ＰＣＲ方法で得られたデータを解析する前記４０）
記載の方法において、各サイクルにおける〔数式１〕あ
るいは〔数式２〕により算出された補正演算処理値を次
の〔数式３〕あるいは〔数式４〕に代入し、各サイクル
における各サンプル間の蛍光変化割合あるいは蛍光変化
率を算出し、それらを比較することを特徴とするリアル
タイム定量的ＰＣＲ方法のためのデータ解析方法、ま
た、 Ｆ_n＝ｆ_n／ｆ_a 〔数式３〕 Ｆ_n＝ｆ_a／ｆ_n 〔数式４〕 〔式中、 Ｆ_n：ｎ次サイクルにおける、〔数式３〕あるいは〔数
式４〕により算出された蛍光変化割合あるいは蛍光変化
率、 ｆ_n：〔数式１〕あるいは〔数式２〕による補正演算処
理値 ｆ_a：〔数式１〕あるいは〔数式２〕による補正演算処
理値で、ｆ_nの変化が観察される以前の任意のサイクル
数のもの〕、また、

【００３２】４２）前記３７）に記載のリアルタイム定
量的ＰＣＲ方法で得られたデータを解析する前記４１）
に記載の方法において、 （ａ）〔数式３〕あるいは〔数式４〕により算出された
蛍光変化割合あるいは蛍光変化率のデータを用いて、
〔数式５〕、〔数式６〕あるいは〔数式７〕による演算
処理する過程、 ｌｏｇ_b（Ｆ_n）、ｌｎ（Ｆ_n） 〔数式５〕 ｌｏｇ_b｛（１−Ｆ_n）×Ａ｝、ｌｎ｛（１−Ｆ_n）×Ａ｝ 〔数式６〕 ｌｏｇ_b｛（Ｆ_n−１）×Ａ｝、ｌｎ｛（Ｆ_n−１）×Ａ｝ 〔数式７〕 〔式中、 Ａ、ｂ：任意の数値、 Ｆ_n：〔数式３〕あるいは〔数式４〕により算出された
ｎ次サイクルにおける蛍光変化割合あるいは蛍光変化
率〕、（ｂ）前記（ａ）の演算処理値が一定値に達した
サイクル数を求める演算処理過程、（ｃ）既知濃度の核
酸試料におけるサイクル数と反応開始時の標的核酸のコ
ピー数の関係式を計算する演算処理過程、（ｄ）未知試
料におけるＰＣＲ開始時の標的核酸のコピー数を求める
演算処理過程、を有することを特徴とするリアルタイム
定量的ＰＣＲ方法のためのデータ解析方法、また、

【００３３】４３）標的核酸について前記２）〜１２）
の何れか１項に記載の核酸プローブを用いてＰＣＲを行
い、標的核酸の融解曲線の分析を行って各増幅核酸のＴ
ｍ値を求めることを特徴とする標的核酸の融解曲線の分
析方法、また、 ４４）標的核酸について前記４）又は前記７）に記載の
核酸プローブをプライマーとして用いてＰＣＲを行い、
標的核酸の融解曲線の分析を行って各増幅核酸のＴｍ値
を求めることを特徴とする標的核酸の融解曲線の分析方
法、また、

【００３４】４５）前記３９）〜４２）の何れか１項に
記載のリアルタイム定量的ＰＣＲ方法のためのデータ解
析方法において、ＰＣＲ法により増幅された核酸を、低
い温度から核酸が完全に変性するまで、温度を徐々に上
げる過程、この過程において、所定の時間間隔で蛍光強
度を測定する過程、測定結果を時間に対する関数として
デスプレー上に表示して核酸の融解曲線をデスプレー上
に描く過程、この融解曲線を微分して微分した値（−ｄ
Ｆ／ｄＴ、Ｆ：蛍光強度、Ｔ：時間）得る過程、前記微
分した値を微分値としてデスプレー上に表示する過程、
その微分値から変曲点を求める過程、を有することを特
徴とするリアルタイム定量的ＰＣＲ方法のためのデータ
解析方法、また、 ４６）前記３９）に記載のデータ解析方法によりデータ
を解析する過程、前記４０）に記載のデータ解析方法に
よりデータを解析する過程、前記４１）に記載のデータ
解析方法によりデータを解析する過程、前記４２）に記
載のデータ解析方法によりデータを解析する過程、前記
４５）に記載のデータ解析方法によりデータを解析する
過程、を実施するための手段をそれぞれ有することを特
徴とするリアルタイム定量的ＰＣＲの測定及び／又は解
析装置、また、

【００３５】４７）前記３９）に記載のデータ解析方法
によりデータを解析する過程、前記４０）に記載のデー
タ解析方法によりデータを解析する過程、前記４１）に
記載のデータ解析方法によりデータを解析する過程、前
記４２）に記載のデータ解析方法によりデータを解析す
る過程、前記４５）に記載のデータ解析方法によりデー
タを解析する過程を、コンピュータに実行させるための
プログラムを記録したコンピュータ読取可能な記録媒
体、また、

【００３６】４８）核酸定量方法において、前記３９）
〜４２）何れか１項、又は前記４５）に記載のリアルタ
イム定量的ＰＣＲ方法のためのデータ解析方法を利用す
ることを特徴とする核酸の定量方法、また、 ４９）核酸定量方法において、前記４６）に記載の装置
を利用することを特徴とする核酸の定量方法、また、 ５０）核酸定量方法において、前記４７）に記載のコン
ピュータ読取可能な記録媒体を用いることを特徴とする
核酸の定量方法、を提供する。

【００３７】

【発明の実施の形態】次に好ましい実施の形態を挙げて
本発明を更に詳細に説明する。本発明の第一の特徴は、
蛍光色素で標識された核酸プローブを用いる標的核酸の
濃度を測定する方法において、当該核酸プローブが標的
核酸にハイブリダイズしたときに生ずる、ハイブリダイ
ゼーション前後における蛍光色素の発光の減少量を測定
することにある。本発明において、プローブ−核酸ハイ
ブリッド複合体とは、本発明の蛍光色素で標識された核
酸プローブが標的核酸とハイブリダイズした状態のもの
（複合体）のことを云う。そして簡便化のために、以
下、核酸ハイブリッド複合体と略称する。蛍光色素−核
酸複合体とは、蛍光色素が標的核酸と結合した複合体の
ことを云う。例えば、２重鎖核酸内にインターカレター
が結合した状態ものを挙げることができる。また、本発
明において、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒ
ＲＮＡ、ＸＴＰｓ、ｄＸＴＰｓ、ＮＴＰｓ、ｄＮＴＰ
ｓ、核酸プローブ、ヘルパー核酸プローブ（又は核酸ヘ
ルパープローブ、又は単にヘルパープローブ）、ハイブ
リダイズ、ハイブリダイゼーション、インターカレータ
ー、プライマー、アニーリング、伸長反応、熱変性反
応、核酸融解曲線、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡ−pr
imed ＰＣＲ、Stretch ＰＣＲ、逆ＰＣＲ、Ａｌｕ配列
を利用したＰＣＲ、多重ＰＣＲ、混合プライマーを用い
たＰＣＲ、ＰＮＡを用いたＰＣＲ法、ハイブリダイゼー
ションアッセイ方法（hybridization assays)、ＦＩＳ
Ｈ(fluorescent in situ hybridization assays)方法、
ＰＣＲ方法(polymerase chain assays ）、ＬＣＲ方法
（ligase chain reaction)、 ＳＤ方法(strand displac
ement assays)、競合的ハイブリダイゼーション方法( c
ompetitive hybridization)、ＤＮＡチップ、核酸検出
用（遺伝子検出用）デバイス，ＳＮＰ（スニップ：一塩
基置換多型）、複合微生物系等の用語は、現在、分子生
物学、遺伝子工学、微生物工学等で一般的に使用されて
いる用語と同じ意味である。

【００３８】本発明において標的核酸の濃度を測定する
とは、測定系の単数種若しくは複数種の核酸について、
濃度を定量をすること、定量的検出をすること、単なる
検出をすること、または、多型・変異などの解析をする
ことなどを云う。なお、複数種の核酸の場合は、同時に
複数種の核酸の定量的検出、同時に複数種の核酸の単な
る検出、または、同時に複数種の核酸の多型・変異など
の解析をすることなどは、当然本発明の技術的範囲内の
ものである。標的核酸濃度測定用デバイスとは各種のＤ
ＮＡチップなどのことをいう。その具体例としては、と
りもなおさず各種のＤＮＡチップを挙げることができ
る。本発明においては本発明の核酸プローブが適用でき
るならば、どのような形式のＤＮＡチップでもよい。蛍
光色素で標識された核酸プローブ（以下、単に本発明の
核酸プローブ又は本発明のプローブという。）を用い
て、標的核酸の濃度を測定する方法（以下、簡便化のた
めに、単に核酸測定方法という。）とは、ハイブリダイ
ゼーション方法(hybridization assays)、ＦＩＳＨ方法
(fluorescent in situ hybridizationassays)、ＰＣＲ
方法(polymerase chain assays）、ＬＣＲ方法(ligase
chain reaction)、ＳＤ方法(strand displacement ass
ays)、 競合的ハイブリダイゼーション方法(competitiv
e hybridization)などの方法により標的核酸の濃度を測
定することをいう。

【００３９】従来、これらの方法では、蛍光色素で標識
された核酸プローブを加えた後、標的核酸にハイブリダ
イズしなかった未反応の当該核酸プローブの蛍光色素を
測定系から洗浄等の方法で除去し、標的核酸にハイブリ
ダイズした当該核酸プローブに標識された蛍光色素を当
該プローブから直接的に、又は当該プローブに間接的な
手段を施して（例えば、酵素を作用させたりして）、発
光させて、その発光量を測定する方法である。本発明
は、これらの方法においてこのような複雑な操作をしな
いで目的核酸を測定することに特徴がある。

【００４０】本発明において標的核酸とは、濃度の測定
を目的とする核酸若しくは遺伝子のことを云う。精製の
有無を問わない。また、濃度の大小も問わない。各種の
核酸が混在していてもよい。例えば、複合微生物系（複
数微生物のＲＮＡ若しくは遺伝子ＤＮＡの混在系）又は
共生微生物系（複数の動植物及び／又は複数の微生物の
ＲＮＡ若しくは遺伝子ＤＮＡの混在系）における濃度の
測定を目的とする特定核酸である。尚、標的核酸の精製
が必要な場合は従来公知の方法で行うことができる。例
えば、市販されている精製キット等を使用して行うこと
ができる。上記の核酸の具体例として、ＤＮＡ、ＲＮ
Ａ、ＰＮＡ、オリゴデオキシリボヌクレオチド（oligod
eoxyribonucleotides)、オリゴリボヌクレオチド(oligo
ribonucleotides）等、また、前記核酸の化学的修飾核
酸を挙げることができる。化学的修飾核酸として2'-O-
メチル（Ｍｅ）ＲＮＡ等を例示することができる。

【００４１】本発明において蛍光色素は、一般に核酸プ
ローブに標識して、核酸の測定・検出に用いられるもの
が便利に使用できるが、蛍光色素で標識された核酸プロ
ーブが標的核酸にハイブリダイズしたときに、プローブ
に標識した当該蛍光色素が、その発光を減少させるもの
が好適に用いられる。例えば、フルオレセイン（fluore
scein）又はその誘導体類｛例えば、フルオレセインイ
ソチオシアネート（fluorescein isothiocyanate）（FI
TC）若しくはその誘導体等、Alexa 488、Alexa532、 cy
3、 cy5、 EDANS（5-(2'-aminoethyl)amino-1-naphthal
ene sulfonic acid）｝、ローダミン（rhodamine）6G
（R6G）又はその誘導体（例えば、テトラメチルローダ
ミン（teramethylrhodamine）（TMR）、テトラメチルロ
ーダミンイソチオシアネート（tetramethylrhodamine i
sothiocyanate)(TMRITC)、ｘ−ローダミン（x-rhodamin
e)、テキサスレッド(Texas red)、ボデピー(BODIPY)FL
(商標名;モレキュラー・プローブ(Molecular Probes)社
製、米国）、ボデピー(BODIPY)FL/C3（商標名；モレキ
ュラー・プローブ（Molecular Probes)社製、米国）、
ボデピー(BODIPY)FL/C6（商標名；モレキュラー・プロ
ーブ（Molecular Probes）社製、米国）、ボデピー(BOD
IPY)5-FAM（商標名；モレキュラー・プローブ（Molecul
ar Probes）社製、米国）、ボデピー（BODIPY）TMR（商
標名；モレキュラー・プローブ（Molecular Probes）社
製、米国）、又はその誘導体（例えば、ボデピー（BODI
PY）TR（商標名；モレキュラー・プローブ（Molecular
Probes）社製、米国）、デピー（BODIPY）R6G（商標
名；モレキュラー・プローブ（Molecular Probes）社
製、米国）、ボデピー（BODIPY）564（商標名；モレキ
ュラー・プローブ（Molecular Probes）社製、米国）、
ボデピー（BODIPY）581（商標名；モレキュラー・プロ
ーブ（Molecular Probes）社製、米国）等を挙げること
ができる。これらの中でも、FITC、EDANS、6-joe、TM
R、Alexa 488、Alexa 532、ボデピー（BODIPY） FL/C3
（商標名；モレキュラー・プローブ（Molecular Probe
s）社製、米国）、ボデピー（BODIPY） FL/C6（商標
名；モレキュラー・プローブ（Molecular Probes）社
製、米国）等を好適なものとして、また、FITC、TMR、6
-jeo、ボデピー（BODIPY） FL/C3（商標名；モレキュラ
ー・プローブ（Molecular Probes）社製、米国）、ボデ
ピー（BODIPY） FL/C6（商標名；モレキュラー・プロー
ブ（Molecular Probes）社製、米国）をより好適なもの
として挙げることができる。

【００４２】標的核酸にハイブリダイズさせる本発明の
核酸プローブは、オリゴデオキシリボヌクレオチドで構
成されていてもよいし、オリゴリボヌクレオチドで構成
されていてもよい。また、それらの両方を含むキメリッ
クオリゴヌクレオチド（chimeric oligonucleodite）で
もよい。それらのオリゴヌクレオチドは化学的修飾を受
けたものでもよい。化学的修飾を受けたオリゴヌクレオ
チドをキメリックオリゴヌクレオチドの鎖中に介在させ
てもよい。

【００４３】前記の化学的修飾を受けたオリゴヌクレオ
チドの修飾部位として、オリゴヌクレオチド末端部の末
端水酸基若しくは末端リン酸基、インターヌクレオシド
リン酸部位、ピリミジン環の５位の炭素、ヌクレオシド
の糖（リボース若しくはデオキシリボース）部位を挙げ
ることができる。好適にはリボース若しくはデオキシリ
ボース部位を挙げることができる。具体的には、2'-O-
アルキルオリゴリボヌクレオチド(2'-O-alkyloligoribo
nucleotideｓ）（以下、2'-O-を2-O-に略記する。）、2
-O-アルキレンオリゴリボヌクレオチド（2-o-alkyleneo
ligoribonucleotides)、 2-O-ベンジルオリゴリボヌク
レオチド(2-o-benzyloligoribonucleotides)を例示する
ことができる。当該オリゴヌクレオチドは、オリゴリボ
ヌクレオチドの任意の位置の単数若しくは複数のリボー
スの２’位炭素のＯＨ基がアルキル基、アルキレン基若
しくはベンジル基で修飾（エーテル結合で）されている
ものである。本発明においては、好適には、2-O-アルキ
ルオリゴリボヌクレオチドのなかでも、2-O-メチルオリ
ゴリボヌクレオチド、2-O-エチルオリゴリボヌクレオチ
ド、2-O-ブチルオリゴリボヌクレオチド、2-O-ベンジル
オリゴリボヌクレオチドが、2-O-アルキレンオリゴリボ
ヌクレオチドの中では、2-O-エチレンオリゴリボクレオ
チドが、及び2-O-ベンジルオリゴリボヌクレオチドが、
特に好適には、2-O-メチルオリゴリボヌクレオチド（以
下、単に2-O-Meオリゴリボヌクレオチドと略記する。）
が用いられる。このような化学的修飾を、オリゴヌクレ
オチドに施すことにより、標的核酸との親和性が高ま
り、本発明の核酸プローブのハイブリダイゼーション効
率が向上する。ハイブリダイゼーション効率が高まる
と、本発明の核酸プローブの蛍光色素の蛍光強度の減少
率が更に向上するので、標的核酸の濃度の測定が精度が
更に向上する。なお、本発明において、オリゴヌクレオ
チドなる用語は、オリゴデオキシリボヌクレオチド又は
オリゴリボヌクレオチド若しくはその双方を意味するも
ので、それらを総称するものとする。2-O-アルキルオリ
ゴリボヌクレオチド、2-O-アルキレンオリゴリボヌクレ
オチド、2-O-ベンジルオリゴリボヌクレオチドは、公知
の方法（Nucleic Acids Research、 ２６巻、２２２４
〜２２２９ページ、１９９８年）で合成できる。また、
GENSET(株式会社）（フランス）が委託合成を行ってい
るので、容易に入手できる。本発明者らは当該会社に当
該化合物の合成を委託して実験を行って、本発明を完成
した。

【００４４】尚、2-O-メチルオリゴリボヌクレオチド
（以下、単に2-O-Meオリゴリボヌクレオチドという。）
のような修飾されたＲＮＡをオリゴデオキシリボヌクレ
オチドの中に介在させた本発明の核酸プローブは主にＲ
ＮＡ特にｒＲＮＡの測定に用いると好ましい結果が得ら
れる。本発明の核酸プローブを使用してＲＮＡを測定す
る場合、当該プローブとハイブリダイズさせる前に、試
料であるＲＮＡ溶液を、８０〜１００℃、好ましくは９
０〜１００℃、最適には９３〜９７℃で、１〜１５分
間、好ましくは２〜１０分間、最適には３〜７分間、加
熱処理してＲＮＡの高次構造を破壊することがハイブリ
ダイゼーション効率を向上させるのに好適である。

【００４５】更に、本発明の核酸プローブの、ハイブリ
ダイゼーション配列領域へのハイブリダイゼーション効
率を更に上げるためにヘルパープローブ（helper prob
e）をハイブリダイゼーション反応溶液に添加すること
が好適である。この場合、ヘルパープローブのオリゴヌ
クレオチドはオリゴデオキシリボヌクレオチド、オリゴ
リボヌクレオチドでも、また、前記と同様な化学的修飾
を受けたオリゴヌクレオチドでもよい。前記のオリゴヌ
クレオチドの一例として、フォワード（forward）型と
して（5')TCCTTTGAGT TCCCGGCCGG A (3')、バックワー
ド（back ward）型若しくはリバース(reverse ward)型
として（5')CCCTGGTCGT AAGGGCCATG ATGACTTGAC GT(3')
なる塩基配列のものを挙げることができる。化学的修飾
を受けたオリゴヌクレオチドの好適な例として、2-O-ア
ルキルオリゴリボヌクレオチド、特に2-O-Meオリゴリボ
ヌクレオチドを例示できる。本発明の核酸プローブの塩
基鎖が３５塩基以下の場合、ヘルパープローブの利用
は、特に効果的である。３５塩基鎖を超える本発明の核
酸プローブを使用する場合は、標的のＲＮＡを熱変性す
るだけでよい場合もある。前記のようにして、本発明の
核酸プローブをＲＮＡにハイブリダイズさせると、ハイ
ブリダイゼーション効率が高まるので反応液中のＲＮＡ
の量に応じて蛍光強度が減少し、最終ＲＮＡ濃度が約１
５０ｐＭまでＲＮＡを測定できるようになる。かくし
て、本発明は、本発明の核酸プローブを含有若しくは付
帯する、標的核酸の濃度を測定する測定キットに前記の
ヘルパープローブを含有、付帯させるなる、標的核酸の
濃度を測定する測定キットでもある。

【００４６】核酸プローブを用いる従来のハイブリダイ
ゼーション方法によるＲＮＡの測定において、核酸プロ
ーブとしてオリゴデオキシリボヌクレオチド体又はオリ
ゴリボヌクレオチド体が用いられてきた。ＲＮＡはそれ
自体が強固な高次構造をとるため、プローブと標的ＲＮ
Ａとのハイブリダイゼーション効率が悪く、定量性に乏
しかった。そのために、ＲＮＡを変性させた後、メンブ
ランに固定してからハイブリダイゼーション反応を行う
という繁雑性を従来方法は有していた。これに対して、
前記の本発明方法は、ＲＮＡの特定構造部と高い親和性
を有するリボース部修飾核酸プローブを用いているの
で、従来方法に較べて高い温度でハイブリダイゼーショ
ン反応を行うことができる。それで、ＲＮＡの高次構造
の前記悪影響は、前処理としての加熱変性処理、ヘルパ
ープローブの併用だけで克服可能である。これにより本
発明方法においてハイブリダイゼーション効率は実質的
に１００％になり、定量性が向上する。また、従来方法
に較べて格段に簡便になる。

【００４７】本発明のプローブの塩基数は５〜５０であ
り、好ましくは１０〜２５、特に好ましくは１５〜２０
である。５０を超える場合は、ＦＩＳＨ方法に用いたと
き細胞膜の透過性が悪くなり、本発明の適用範囲を狭め
ることになる。５未満の場合は、非特異的ハイブリダイ
ゼーションが惹起し易くなり、測定誤差が大きくなる。

【００４８】そのプローブの塩基配列は、標的核酸に特
異的にハイブリダイズするものであればよく、特に限定
されない。好ましくは、蛍光色素で標識された核酸プロ
ーブが標的核酸にハイブリダイズしたとき、（１）当該
プローブにハイブリダイズした標的核酸の末端塩基部か
ら１ないし３塩基離れて、標的核酸の塩基配列にＧ（グ
アニン）がすくなとも１塩基以上存在するように、当該
プローブの塩基配列が設計されいる塩基配列、（２）当
該プローブの末端部分において核酸ハイブリッド複合体
の複数の塩基対が少なくとも１対のＧ（グアニン）とＣ
（シトシン）のペアーを形成するように、当該プローブ
の塩基配列が設計されている塩基配列、が好ましい。

【００４９】本発明の核酸プローブのオリゴヌクレオチ
ドは、通常の一般的オリゴヌクレオチドの製造方法で製
造できる。例えば、化学合成法、プラスミドベクター、
ファージベクター等を使用する微生物法等で製造できる
（Tetrahedron letters、 22巻、 1859〜1862頁、 1981
年; Nucleic acids Research、 14巻、6227〜6245頁、1
986年）。尚、現在、市販されている核酸合成機を使用
するのが好適である（例えば、ABI394(Perkin Elmer社
製、USA)）。

【００５０】オリゴヌクレオチドに蛍光色素を標識する
には、従来公知の標識法のうちの所望のものを利用する
ことができる（Nature Biotechnology、 14巻、 303〜3
08頁、 1996年; Applied and Environmental Microbiol
ogy、 63巻、 1143〜 1147頁、 1997年; Nucleic acids
Research、 24巻、 4532〜4535頁、 1996年）。例え
ば、５´末端に蛍光色素分子を結合させる場合は、先
ず、常法に従って５´末端のリン酸基にスペーサーとし
て、例えば、-(CH₂)_n-SHを導入する。これらの導入体は
市販されているので市販品を購入してもよい（メドラン
ド・サーテイファイド・レージント・カンパニー（Midl
and Certified Reagent Company））。この場合、ｎは
３〜８、好ましくは６である。このスペーサーにＳＨ基
反応性を有する蛍光色素又はその誘導体を結合させるこ
とにより標識したオリゴヌクレオチドを合成できる。こ
のようにして合成された蛍光色素で標識されたオリゴヌ
クレオチドは、逆相等のクロマトグラフィー等で精製し
て本発明の核酸プローブとすることができる。

【００５１】また、オリゴヌクレオチドの３’末端に蛍
光色素を結合させることもできる。この場合は、リボー
ス又はデオキシリボースの３’位ＣのＯＨ基にスペーサ
ーとして、例えば、-(CH₂)_n-NH₂を導入する。これらの
導入体も前記と同様にして市販されているので市販品を
購入してもよい（メドランド・サーテイファイフド・レ
ージント・カンパニー（Midland Certified Reagent Co
mpany））。また、リン酸基を導入して、リン酸基のＯ
Ｈ基にスペサーとして、例えば、-(CH₂)_n-SHを導入す
る。これらの場合、ｎは３〜８、好ましくは４〜７であ
る。このスペーサーにアミノ基、ＳＨ基に反応性を有す
る蛍光色素又はその誘導体を結合させることにより標識
したオリゴヌクレオチドを合成できる。このようにして
合成された蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチド
は、逆相等のクロマトグラフィー等で精製して本発明の
核酸プローブとすることができる。このアミノ基を導入
する場合、キット試薬（例えば、Uni-link aminomodif
ier（CLONTECH社製、米国）、フルオ・リポターキット
（FluoReporter Kit) F-6082、 F-6083、 F-6084、 F-1
0220（いずれもモレクキュラー・プローベ（Molecular
Probes）社製、米国））を用いるのが便利である。そし
て、常法に従って当該オリゴリボヌクレオチドに蛍光色
素分子を結合させることができる。また、プローブ核酸
の鎖内に蛍光色素分子を導入することも可能である（AN
ALYTICAL BIOCHEMISTRY 225, 32-38頁（1998年））。

【００５２】以上のようにして本発明の核酸プローブが
調製できるが、好ましいプローブの形態は、３’又は
５’末端が蛍光色素が標識されたものであり、その標識
されている末端の塩基がＧ又はＣであるものである。
５’末端が標識され、３’末端が標識されていない場
合、３’末端のリボース又はデオキシリボースの３’位
炭素のＯＨ基をリン酸基等、また３’末端のリボースの
２’位炭素のＯＨ基をリン酸基等で修飾してもよく何ら
制限されない。

【００５３】本発明の核酸プローブは、単に核酸測定だ
けでなく、標的核酸の多型（polymorphism）又は／及び
変異（mutation）を解析若しくは測定する方法に好適に
利用できる。特に標的核酸濃度測定用デバイス｛ＤＮＡ
チップ（蛋白質 核酸 酵素、43巻、2004〜2011ペー
ジ、1998年）｝に応用することによりより便利な標的核
酸濃度測定用デバイスを提供する。また、当該デバイス
を用いて標的核酸の多型（polymorphism）又は／及び変
異（mutation）を解析若しくは測定する方法は極めて便
利な方法である。すなわち、本発明の核酸プローブとの
ハイブリダイゼーションにおいて、ＧＣペアーを形成す
るかどうかにより、蛍光強度が変化する。それで、本発
明の核酸プローブを標的核酸にハイブリダイズさせ、発
光強度を測定することにより、標的核酸の多型（polymo
rphism）又は／及び変異（mutation）を解析若しくは測
定することができる。具体的方法は、実施例１４、１５
に記した。この場合、標的核酸は各種の核酸増幅方法の
うちの一つの方法により増幅された増幅物でもよいし、
抽出されたものでもよい。また標的核酸はその種類を問
わない。ただ、鎖中又は末端にグアニン塩基又はシトシ
ン塩基が存在しておればよい。鎖中又は末端にグアニン
塩基又はシトシン塩基が存在しないと蛍光強度が減少し
ない。よって、本発明方法により、Ｇ→Ａ、Ｇ←Ａ、
Ｃ→Ｔ、Ｃ←Ｔ、Ｇ→Ｃ、Ｇ←Ｃの変異、又は置換、す
なわち、１塩基多型（single nucleotide polymorphism
(SNP)）などの多型（polymorphism ）等を解析若しく
は測定することができる。なお、現在、多型分析は、マ
キサム・ギルバート（Maxam-Gilbert)法、ジデオキシ
（dideoxy）法を用いて標的核酸の塩基配列を決定する
ことにより行われているのが現状である。

【００５４】それで、本発明の核酸プローブを標的核酸
の多型（polymorphism）及び変異（mutation）を解析若
しくは測定する測定キットに含有させることにより、標
的核酸の多型（polymorphism）又は／及び変異（mutati
on）を解析若しくは測定する測定キットとして好適に使
用することができる。

【００５５】本発明の標的核酸の多型（polymorphism）
又は／及び変異（mutation）を解析若しくは測定する方
法により得られるデータを解析する場合に、標的核酸が
本発明の核酸プローブとハイブリダイズしたときの反応
系の蛍光強度値を、前記のものがハイブリダイズしてい
ないときの反応系の蛍光強度値により補正する処理過程
を設けると、処理されたデータは信頼性の高いものにな
る。それで本発明は、標的核酸の多型（polymorphism）
又は／及び変異（mutation)を解析若しくは測定する方
法のためのデータ解析方法を提供する。

【００５６】また、本発明の特徴は、標的核酸の多型
（polymorphism）又は／及び変異（mutation）を解析若
しくは測定する測定装置において、標的核酸が本発明の
核酸プローブとハイブリダイズしたときの反応系の蛍光
強度値を、前記のものがハイブリダイズしていないとき
の反応系の蛍光強度値により補正処理する手段を有する
ことを特徴とする標的核酸の多型（polymorphism）又は
／及び変異（mutation）を解析若しくは測定する測定装
置である。

【００５７】また、本発明の特徴は、標的核酸の多型
（polymorphism）又は／及び変異（mutation）を解析若
しくは測定する方法により得られるデータを解析する場
合に、標的核酸が本発明の核酸プローブとハイブリダイ
ズしたときの反応系の蛍光強度値を、前記のものがハイ
ブリダイズしていないときの反応系の蛍光強度値により
補正する処理過程をコンピュータに実行させるための手
順をプログラムとして記録したコンピュータ読取可能な
記録媒体である。

【００５８】本発明の核酸プローブは固体（支持層）表
面、例えばスライドガラスの表面に固定されていてもよ
い。この場合、蛍光色素で標識されていない端が固定さ
れているのが好ましい。この形式は現在ＤＮＡチップと
言われる。遺伝子発現（geneexpression）のモニタリン
グ、塩基配列（base sequence）の決定，変異解析（mu
tation analysis），１塩基多型（single nucleotide p
olymorphism (SNP)）などの多型解析（polymorphism an
alysis）等に使用できる。勿論、核酸測定用デバイス
（チップ）として使用することもできる。

【００５９】本発明の核酸プローブを例えばスライドガ
ラスの表面に結合させるには、ポリリジン、ポリエチレ
ンイミン、ポリアルキルアミンなどのポリ陽イオンをコ
ートしたスライドガラス、アルデヒド基を導入したスラ
イドガラス、アミノ基を導入したスライドガラスを先ず
用意する。そして、i)ポリ陽イオンをコートしたスライ
ドガラスには、プローブのリン酸基を反応させる、ii)
アルデヒド基を導入したスライドガラスには、アミノ基
を導入したプローブを反応させる、iii)アミノ基を導入
したスライドガラスには、ＰＤＣ（pyridinium dichrom
ate）導入、アミノ基又はアルデヒド基導入したプロー
ブを反応させる、などにより達成できる(Fodor,P.A.,et
al.,Science,251,767-773(1991); Schena,M.,et al.,P
roc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.,93,10614-10619(1996);McG
al,G.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.,93,13555-1
3560(1996);Blanchad,A.P.,et al.,Biosens.Bioelectro
n.,11,687-690(1996))。

【００６０】本発明の核酸プローブを固体表面にアレー
状に配列、結合させたデバイスは核酸測定がより便利に
なる。この場合、塩基配列の異なる多くの本発明の核酸
プローブを、個別に同一固体表面上に結合しているデバ
イスをつくることにより、同時に多種類の標的核酸を測
定できる。このデバイスにおいては、プローブ毎に、前
記固体の本発明の核酸プローブを結合した面と反対側の
面に少なくとも一つの温度センサーとヒーターが設け、
そのプローブを結合した前記固体の領域が最適温度条件
になるように温度調節され得るように設計されているの
が好適である。

【００６１】このデバイスにおいては、本発明の核酸プ
ローブ以外のプローブ、例えば、一つの分子内に二つの
異なった蛍光色素を有し、標的核酸にハイブリダイズし
ていないときは、二つの蛍光色素の相互作用により、消
光若しくは発光しているが、標的核酸にハイブリダイズ
すると発光若しくは消光するように設計された構造をも
つ核酸プローブ、即ち、前記の分子ビーコン(Tyagi et
al., Nature Biotech.,14:303-308,1996)等を結合した
ものも好適に使用できる。それで、このようなデバイス
も本発明の技術的範囲内に含まれる。

【００６２】本発明のデバイスを用いる測定方法の基本
的操作は、核酸プローブを結合した固体表面上にｍＲＮ
Ａ、ｃＤＮＡ、ｒＲＮＡ等の標的核酸を含む溶液をの
せ、ハイブリダイズさせるだけである。これにより、標
的核酸量に応じて蛍光量の変化がおこり、その蛍光変化
量から標的核酸の測定が可能となる。また、一つの固体
表面上に塩基配列の異なる本発明の核酸プローブを多数
種結合させることにより、一度に多くの標的核酸の濃度
を測定することができる。それで、ＤＮＡチップと全く
同じ用途で標的核酸の測定に使用できるので新規のＤＮ
Ａチップである。最適の反応条件では標的核酸以外の核
酸は蛍光の発光量を変化させないために、未反応な核酸
を洗浄する操作は必要がない。更に、微小ヒーターにて
本発明の核酸プローブ毎に温度コントロールすることに
より、当該プローブ毎に最適反応条件にコントロールで
きるために正確な濃度の測定が可能となる。また、微小
ヒーターにて温度を連続的に変化させ、その間、蛍光量
を測定することにより、本発明の核酸プローブと標的核
酸との解離曲線を解析することができる。その解離曲線
の違いからハイブリダイズした核酸の性質の判定や、Ｓ
ＮＰの検出ができる。

【００６３】従来の標的核酸の濃度測定用デバイスは、
蛍光色素で修飾されていない核酸プローブを固体表面に
結合（固定：fix）し、それに蛍光色素で標識した標的
核酸をハイブリダイズさせた後、ハイブリダイズしてい
ない標的核酸を洗い流して、残存している蛍光色素の蛍
光強度を測定していた。蛍光色素で標的核酸を標識する
には、例えば、特定ｍＲＮＡを標的とした場合、次のス
テップ（steps）を取る：（１）細胞から抽出されたｍ
ＲＮＡ全部を抽出する。（２）それから、逆転写酵素
（reverse transcriptase）を用いて、蛍光色素で修飾
されヌクレオサイドをとり込ませながらｃＤＮＡを合成
する。本発明ではこのような操作は必要がない。

【００６４】当該デバイスには各種のプローブが多数ス
ポットしてあるが、その各々のプローブにハイブリダイ
ズする核酸の最適ハイブリダイゼーション条件、例え
ば、温度等は各々異なる。よって本来であれば、プロー
ブ毎（スポット毎）に、ハイブリダイゼーション反応、
洗浄操作を最適な条件で行う必要がある。しかし、それ
は物理的に不可能であるので、すべてのプローブ毎に同
一の温度でハイブリダイゼーションを行い、また、洗浄
も同一温度で同一洗浄液で行われている。それで、ハイ
ブリダイゼーションが期待されている核酸がハイブリダ
イズしなかったり、ハイブリダイズしてもハイブリダイ
ゼーションが強固でないので容易に洗い流されてしまう
等の欠点を有していた。そのような原因で核酸の定量性
が低いものであった。本発明ではこの洗浄操作が必要な
いのでこのような欠点を有しない。また、スポットの底
に微小ヒータを設け、ハイブリダイゼーション温度をコ
ントロールすることで、本発明のプローブ毎に最適温度
でハイブリダイゼーション反応を行わせることができ
る。それで、本発明は定量性が格段に向上したものであ
る。

【００６５】本発明においては、前記した本発明の核酸
プローブ又はデバイスを使用することで、標的核酸の濃
度を短時間で、簡便かつ特異的に測定することができ
る。以下に測定法を述べる。本発明の測定方法におい
て、先ず、測定系に本発明の核酸プローブを添加し、標
的核酸にハイブリダイズさせる。その方法は、通常の既
知方法で行なうことができる（Analytical Biochemistr
y、 183巻、 231〜244頁、 1989年; Nature Biotechnol
ogy、 14巻、 303〜308頁、 1996年; Applied and Envi
ronmental Microbiology、 63巻、 1143-1147頁、 1997
年）。例えば、ハイブリダイゼーションの条件は、塩濃
度が０〜２モル濃度、好ましくは０．１〜１．０モル濃
度、ｐＨは６〜８、好ましくは６．５〜７．５である。

【００６６】反応温度は、本発明の核酸プローブが標的
核酸の特異的部位にハイブリダイズして得られる核酸ハ
イブリッド複合体のＴｍ値±１０℃の範囲内であるのが
好ましい。このようにすることにより非特異的なハイブ
リダイゼーションを防止することができる。Ｔｍ−１０
℃未満のときは、非特異的ハイブリダイゼーション起こ
り、Ｔｍ＋１０℃を越えるときは、ハイブリダイゼーシ
ョンが起こらない。尚、Ｔｍ値は本発明の核酸プローブ
を設計するのに必要な実験と同様にして求めることがで
きる。すなわち、本発明の核酸プローブとハイブリダイ
ズする（当該核酸プローブに対して相補する塩基配列
の）オリゴヌクレオチドを前記の核酸合成機等で化学合
成し、当該核酸プローブとの核酸ハイブリッド複合体の
Ｔｍ値を通常の方法で測定する。

【００６７】また、その反応時間は１秒間〜１８０分
間、好ましくは５秒間〜９０分間である。１秒間未満の
ときは、ハイブリダイゼーションにおいて未反応の本発
明の核酸プローブが多くなる。また、反応時間を余り長
くしても特に意味がない。なお、反応時間は核酸種、す
なわち、核酸の長さ、あるいは塩基配列によって大きく
影響を受ける。前記のようにして、本発明の核酸プロー
ブを標的核酸にハイブリダイズさせる。そして、ハイブ
リダイゼーションの前後で、蛍光色素の発光量を蛍光光
度計で測定し、発光の減少量を計算する。その減少量の
大きさは標的核酸の濃度と比例するので、標的核酸の濃
度を求めることができる。

【００６８】反応液中の標的核酸の濃度：０．１〜１
０．０ｎＭであるのが好ましい。反応液中の本発明の核
酸プローブの濃度：１．０〜２５．０ｎＭであるが好ま
しい。検量線を作成する場合は、標的核酸に対して、本
発明の核酸プローブを１．０〜２．５の比率で用いるの
が望ましい。

【００６９】実際、試料中の未知濃度の標的核酸を測定
する場合、上記の条件で先ず、検量線を作成する。そし
て、複数の濃度の対応する本発明の核酸プローブを試料
に添加して、それぞれ蛍光強度値の減少を測定する。そ
して、測定された蛍光強度の減少値のうちの最大なもの
に対応するプローブ濃度を好ましいプローブ濃度とす
る。好ましい濃度のプローブで測定された蛍光強度の減
少値もって、検量線から標的核酸の定量値を求めること
になる。

【００７０】本発明の核酸測定法の原理は、前記のごと
くであるが、本発明は各種の核酸測定方法、例えば、Ｆ
ＩＳＨ方法、ＰＣＲ方法、ＬＣＲ方法、ＳＤ方法, 競合
的ハイブリダイゼーション方法、ＴＡＳ方法、 などに
適用できる。

【００７１】以下にその例を記す。 ａ）ＦＩＳＨ方法に適用した場合 即ち、本発明は色々の種類の微生物が混在するか、若し
くは一種類以上の微生物が動物や植物由来の細胞と共に
混在していて、相互に単離できない微生物系（複合微生
物系、共生微生物系）の細胞内若しくは細胞のホモジネ
ート等の核酸測定に好適に適用できる。ここでいう微生
物とは一般的にいう微生物のことで、特に限定されるも
のではない。例えば、真核微生物、原核微生物、その
他、マイコプラズマ、ウイルス、リッケチャ等を挙げる
ことができる。そして、ここの系でいう標的核酸とは、
これらの微生物系において、例えば、どのように活躍し
ているのか調べたい菌株の細胞に特異性を有する塩基配
列をもつ核酸のことである。例えば、特定菌株の５Ｓｒ
ＲＮＡ、１６ＳｒＲＮＡ若しくは２３ＳｒＲＮＡ又はそ
れらの遺伝子ＤＮＡの特定配列である。

【００７２】本発明の核酸プローブを複合微生物系又は
共生微生物系に添加し、特定菌株の５ＳｒＲＮＡ、１６
ＳｒＲＮＡ若しくは２３ＳｒＲＮＡ又はそれらの遺伝子
ＤＮＡの量を測定することにより、当該系における特定
菌株の存在量を測定することできる。尚、複合微生物系
又は共生微生物系のホモジネートに前記核酸プローブを
添加して、ハイブリダイゼーション前後における蛍光色
素の発光の減少量を測定して特定菌株の存在量を測定す
る方法も、本発明の技術的範囲内とする。

【００７３】前記の測定方法は、例えば、以下の如くで
ある。即ち、本発明の核酸プローブを添加する前に、複
合微生物系又は共生微生物系の温度、塩濃度、ｐＨを前
記の条件に調整する。複合微生物系又は共生微生物系に
おける特定菌株は、細胞数として１０⁷〜１０¹²個／ｍ
ｌ、好ましくは１０⁹〜１０¹⁰個／ｍｌに調整すること
が好適である。それは希釈、又は遠心分離等による濃縮
等で行うことができる。細胞数が１０⁷個／ｍｌ未満の
ときは、蛍光強度が弱く、測定誤差が大きくなる。１０
¹²個／ｍｌを超えるときは、複合微生物系又は共生微生
物系の蛍光強度が強すぎるため、特定微生物の存在量を
定量的に測定することができなくなる。

【００７４】添加する本発明の核酸プローブの濃度は、
複合微生物系又は共生微生物系における特定菌株の細胞
数に依存する。細胞数１×１０⁸／ｍｌに対して０．１
〜１０．０ｎＭ濃度、好ましくは０．５〜５ｎＭ濃度、
より好ましくは１．０ｎＭ濃度である。０．１ｎＭ未満
のときは、特定微生物の存在量を正確に反映したデータ
にならない。しかし、最適な本発明の核酸プローブの量
は、細胞内の標的核酸量に依存するために一概にはいえ
ない。

【００７５】次に本発明において前記核酸プローブと特
定菌株の５ＳｒＲＮＡ、１６ＳｒＲＮＡ若しくは２３Ｓ
ｒＲＮＡ又はその遺伝子ＤＮＡにハイブリダイズさせる
ときの反応温度は、前記した条件と同様である。また、
その反応時間も前記の条件と同様である。前記のような
条件で本発明の核酸プローブを特定菌株の５ＳｒＲＮ
Ａ、１６ＳｒＲＮＡ若しくは２３ＳｒＲＮＡ又はそれの
遺伝子ＤＮＡにハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼー
ション前後の複合微生物系又は共生微生物系の蛍光色素
の発光の減少量を測定する。

【００７６】前記のようにして測定された蛍光色素の発
光の減少量は、複合微生物系又は共生微生物系における
特定菌株の存在量と比例する。それは５ＳｒＲＮＡ、１
６ＳｒＲＮＡ若しくは２３ＳｒＲＮＡ又はそれらの遺伝
子ＤＮＡの量と特定菌株の存在量とが比例するからであ
る。

【００７７】尚、本発明において、複合微生物系又は共
生微生物系における微生物以外の成分は、本発明の核酸
プローブと特定菌株の５ＳｒＲＮＡ、１６ＳｒＲＮＡ若
しくは２３ＳｒＲＮＡ又はそれらの遺伝子ＤＮＡとのハ
イブリダイゼーションを阻害しない限り、また、本発明
の核酸プローブの蛍光色素の発光を阻害をしない限り、
特に限定されない。例えば、KH₂PO₄、K₂HPO₄、NaH₂P
O₄、Na₂HPO₄等のリン酸塩、硫安、硝安、尿素等の無機
窒素類、マグネシウム、ナトリウム、カリウム、カルシ
ウムイオン等の金属イオンの各種塩類、マンガン、亜
鉛、鉄、コバルトイオン等の微量金属イオンの硫酸塩、
塩酸塩、炭酸塩等の各種塩類、更にビタミン類等が適当
に含まれていてもよい。もし、上記の阻害が観察される
場合は、遠心分離等の操作で複数の微生物が混在する細
胞系から細胞を分離し、再び緩衝液系等に懸濁すればよ
い。

【００７８】上記の緩衝液としては、リン酸緩衝液、炭
酸緩衝液、トリス・塩酸緩衝液、トリス・グリシン緩衝
液、クエン酸緩衝液、グット緩衝液等の各種緩衝液をも
用いることができる。緩衝液の濃度は、ハイブリダイゼ
ーション、ＦＲＥＴ現象、蛍光色素の発光を阻害しない
濃度である。その濃度は緩衝液の種類に依存する。緩衝
液のｐＨは４〜１２、好ましくは５〜９である。

【００７９】ｂ）ＰＣＲ 方法に適用する場合 ＰＣＲ 方法であればどのような方法でも適用できるの
であるが、リアルタイム定量的ＰＣＲ方法に適用する場
合を以下に記す。即ち、リアルタイム定量的ＰＣＲ方法
において、本発明の特定の核酸プローブを用いてＰＣＲ
を行い、反応前後の蛍光色素の発光の減少をリアルタイ
ムで測定するものである。本発明のＰＣＲとは各種方法
のＰＣＲを意味するものである。例えば、ＲＴ−ＰＣ
Ｒ、ＲＮＡ−primed ＰＣＲ、Stretch ＰＣＲ、逆ＰＣ
Ｒ、Ａｌｕ配列を利用したＰＣＲ、多重ＰＣＲ、混合プ
ライマーを用いたＰＣＲ、ＰＮＡを用いたＰＣＲ法等を
も含む。また、定量的とは、本来の定量測定の他に、検
出程度の定量測定をも意味するのは前記同様である。

【００８０】前記のとおり、標的核酸とは、存在量を測
定する核酸のことを云う。精製の有無を問わない。ま
た、濃度の大小も問わない。各種の核酸が混在していて
もよい。例えば、複合微生物系（複数微生物のＲＮＡ若
しくは遺伝子ＤＮＡの混在系）又は共生微生物系（複数
の動植物及び／又は複数微生物のＲＮＡ若しくは遺伝子
ＤＮＡの混在系）における増幅目的の特定核酸である。
尚、標的核酸の精製が必要な場合は従来公知の方法で行
うことができる。例えば、市販されている精製キット等
を使用して行うことができる。

【００８１】従来公知の定量的ＰＣＲ方法はｄＡＴＰ、
ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ若しくはｄＵＴＰ、標的
核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）、Ｔａｑポリメラーゼ、プラ
イマー、並びに蛍光色素で標識した核酸プローブ若しく
はインターカレーターを用いてＭｇイオンの存在下に、
温度を低温、高温を繰り返しつつ標的核酸を増幅し、増
幅過程の蛍光色素の発光の増加量をリアルタイムでモニ
タリングするものである（実験医学、１５巻、７号、４
６〜５１ページ、１９９７年、羊土社）。

【００８２】本発明の定量的ＰＣＲ方法は、本発明の核
酸プローブを用いて標的核酸を増幅させ、増幅過程にお
いて、蛍光色素の発光の減少量を測定することを特徴と
するものである。本発明の定量的ＰＣＲにおいて、好ま
しい本発明の核酸プローブとしては、その塩基数は５〜
５０であり、好ましくは１０〜２５、特に好ましくは１
５〜２０で、ＰＣＲサイクル中に標的核酸の増幅産物と
ハイブリダイズするものであれば、どのようなものでも
よい。また、フォワード（forward）型、リバース（rev
erse）型のどちらに設計してもよい。

【００８３】例えば、以下のものを挙げることができ
る。 （１）核酸プローブの末端部、好ましくは末端が、本発
明の蛍光色素で標識されており、当該核酸プローブが標
的核酸にハイブリダイズしたとき、当該プローブの蛍光
色素で標識された末端部もしくは末端にハイブリダイズ
した標的核酸の末端塩基から１ないし３塩基離れて、標
的核酸の塩基配列にＧ（グアニン）が少なくとも１塩基
存在するように、当該プローブの塩基配列が設計されて
いる。 （２）前記（１）のうち、核酸プローブが３’末端にお
いて蛍光色素で標識されている。

【００８４】（３）前記（１）のうち、核酸プローブが
５’末端において蛍光色素で標識されている。 （４）核酸プローブが、標的核酸にハイブリダイズした
とき、プローブ末端部分において核酸ハイブリッド複合
体の複数塩基対が少なくとも一つのＧ（グアニン）とＣ
（シトシン）のペアーを形成するように、当該プローブ
の塩基配列が設計されている。 （５）前記（４）のうち、核酸プローブの３’末端塩基
がＧ又はＣで、かつ３’末端が蛍光色素で標識されてい
る。 （６）前記（４）のうち、核酸プローブの５’末端塩基
がＧ又はＣで、かつ５’末端が蛍光色素で標識されてい
る。 （７）前記（１）〜（６）の核酸プローブが、３’末端
のリボース若しくはデオキシリボースの３’位炭素の水
酸基、又は３’末端のリボースの３’位若しくは２’位
炭素の水酸基がリン酸化されている。 （８）前記（１）〜（６）の核酸プローブのオリゴヌク
レオチドが、化学的に修飾されている。

【００８５】前記（６）の場合、標的核酸の塩基配列か
ら、どうしても３’若しくは５’末端がＧ又はＣに設計
できない場合は、標的核酸の塩基配列から設計したプラ
イマーであるオリゴヌクレオチドの５’末端に、５’−
グアニル酸若しくはグアノシン又は５’−シチジル酸若
しくはシチジンを付加しても、本発明の目的は好適に達
成できる。３’末端に５’−グアニル酸若又は５’−シ
チジル酸を付加しても、本発明の目的は好適に達成でき
る。よって、本発明において、３’、又は５’末端の塩
基がＧ又はＣになるように設計した核酸プローブとは、
標的核酸の塩基配列から設計したプローブの他に、当該
のプローブの５’末端に５’−グアニル酸若しくはグア
ノシン又は５’−シチジル酸もしくはシチジンを付加し
てなるプローブ、並びに当該のプローブの５’末端に
５’−グアニル酸又は５’−シチジル酸を付加してなる
プローブを含むものと定義する。

【００８６】特に上記の（７）の本発明の核酸プローブ
はプライマーとして利用されないように設計したもので
ある。ＦＲＥＴ現象を用いるリアルタイム定量的ＰＣＲ
方法において使用する（蛍光色素で標識した）二つのプ
ローブの代わりに、一つの本発明の核酸プローブを用い
てＰＣＲを行うものである。ＰＣＲの反応系に当該プロ
ーブを添加し、ＰＣＲを行う。核酸伸長反応時、標的核
酸若しくは増幅標的核酸にハイブリダイズしていた当該
プローブがポリメラーゼにより分解され、核酸ハイブリ
ッド複合体から分解除去される。このときの反応系又は
核酸変性反応が完了した反応系の蛍光強度値を測定す
る。また、標的核酸若しくは増幅した増幅標的核酸が当
該プローブとハイブリダイズしている反応系（アニーリ
ング反応、若しくはポリメラーゼにより当該プローブが
核酸ハイブリッド複合体から除かれるまでの核酸伸長反
応時の反応系）の蛍光強度値を測定する。そして、前者
からの蛍光強度値の減少率を算出することにより増幅さ
れた核酸を測定する。当該プローブが標的核酸若しくは
増幅標的核酸から、核酸変性反応により完全に解離する
か、又は核酸伸長時にポリメラーゼにより当該プローブ
と標的核酸若しくは増幅標的核酸との核酸ハイブリッド
複合体から分解除去されたときは蛍光強度値は大きい。
しかし、当該プローブが標的核酸若しくは増幅標的核酸
に十分にハイブリダイズしているアニーリング反応が完
了している反応系若しくは核酸伸長反応時にポリメラー
ゼにより当該プローブと標的核酸若しくは増幅標的核酸
との核酸ハイブリッド複合体から分解除去されるまでの
反応系の蛍光強度値は前者より減少している。蛍光強度
値の減少は増幅された核酸量に比例する。

【００８７】この場合、当該プローブが標的核酸とハイ
ブリダイズしたときのその核酸ハイブリッド複合体のＴ
ｍが、プライマーの核酸ハイブリッド複合体のＴｍ値の
±１５℃、好ましくは±５℃の範囲になるように、
（７）のプローブの塩基配列が設計されることが望まし
い。プローブのＴｍ値が、プライマーのＴｍ値−５℃、
特に−１５℃未満であると、プローブがハイブリダイズ
しないために、蛍光色素の発光の減少は起こらない。反
対にプライマーのＴｍ値＋５℃、特に＋１５℃を超える
と、プローブが標的核酸以外の核酸ともハイブリダイズ
するので、プローブの特異性が失われる。

【００８８】上記（７）以外のプローブ、特に（６）の
プローブは、プライマーとしてＰＣＲの反応系に添加す
るものである。蛍光色素で標識されたプライマーを用い
るＰＣＲ方法は本発明以外未だ知られていない。ＰＣＲ
の反応が進むに従い、増幅された核酸は本発明の実施に
有用な蛍光色素で２次標識される。それで、核酸変性反
応が完了している反応系の蛍光強度値は大きいが、アニ
ーリング反応が完了しているか若しくは核酸伸長反応時
の反応系においては、反応系の蛍光強度は前者の蛍光強
度より減少する。

【００８９】ＰＣＲの反応は通常のＰＣＲ方法と同様の
反応条件で行うことができる。それで、Ｍｇイオン濃度
が低濃度（１〜２ｍＭ）である反応系で標的核酸の増幅
を行うことができる。勿論、従来公知の定量的ＰＣＲに
おいて使用されている高濃度（２〜４ｍＭ）のＭｇイオ
ン存在下の反応系でも本発明は実施できる。

【００９０】尚、本発明のＰＣＲ方法において、本発明
のＰＣＲを行い、その増幅産物について核酸の融解曲線
を分析を行ってＴｍ値を求めるできる。この方法は新規
な核酸の融解曲線の分析方法である。本方法において本
発明のＰＣＲ方法に用いた核酸プローブ又はプライマー
として用いた本発明の核酸プローブが好適に利用でき
る。この場合、本発明の核酸プローブの塩基配列を、Ｓ
ＮＰ（スニップ；一塩基置換多型）を含む領域と相補的
な配列にすることで、ＰＣＲ終了後、その核酸の本発明
の核酸プローブから解離曲線を解析することにより、そ
の解離曲線の違いからＳＮＰの検出ができる。本発明の
核酸プローブの配列としてＳＮＰを含む配列と相補的な
塩基配列を使用すれば、プローブ配列とＳＮＰを含む配
列との解離曲線より得られるＴｍ値は、ＳＮＰを含まな
い配列との解離曲線から得られるＴｍ値より高くなる。

【００９１】本発明の第二の特徴は、前記のリアルタイ
ム定量的ＰＣＲ方法ので得られるデータを解析する方法
の発明である。リアルタイム定量的ＰＣＲ方法は、現
在、ＰＣＲを行わせる反応装置、蛍光色素の発光を検出
する装置、ユーザーインターフェース、即ち、データ解
析方法の各手順をプログラム化して、それを記録したコ
ンピュータ読み取り可能な記録媒体（別称：Sequence D
etection Software System）、及びそれらを制御し、
データ解析するコンピュータから構成される装置で、リ
アルタイムで測定されている。それで、本発明の測定も
このような装置で行われる。

【００９２】以下に、先ず、リアルタイム定量的ＰＣＲ
の解析装置から説明する。本発明において用いる装置
は、ＰＣＲをリアルタイムでモニタリングできる装置で
あればどのような装置でもよいが、例えば、ABI PRISM
^TM 7700 塩基配列検出システム（Sequence Detection S
ystem SDS 7700)(パーキン・エルマー・アプライド・バ
イオシステム社(Perkin Elmer Applied Biosytems社、
USA))、ライトサイクラー^TM システム（ロシュ・ダイア
グノスティックス株式会社、ドイツ）等を特に好適なも
のとして挙げることができる。

【００９３】尚、前記のＰＣＲ反応装置は、標的核酸の
熱変性反応、アニーリング反応、核酸の伸長反応を繰り
返し行う装置（例えば、温度を９５℃、６０℃、７２℃
に繰り返し行うことができる。）である。また、検出シ
ステムは、蛍光励起用アルゴンレーザー、スペクトログ
ラフ並びにＣＣＤカメラからなっている。更に、データ
解析方法の各手順をプログラム化して、それを記録した
コンピュータ読み取り可能な記録媒体は、コンピュータ
にインストールされて使用され、コンピュータを介して
上記のシステムを制御し、検出システムから出力された
データを解析処理するプログラムを記録したものであ
る。

【００９４】コンピュータ読み取り可能な記録媒体に記
録されているデータ解析用プログラムは、サイクルごと
の蛍光強度を測定する過程、測定された蛍光強度を、サ
イクルの関数として、すなわちＰＣＲのamplification
plotとしてコンピュータのデスプレー上に表示する過
程、蛍光強度が検出され始めるＰＣＲサイクル数（thre
shold cycle number:Ct）を算出する過程、Ｃｔ値から
試料核酸のコピー数を求める検量線を作成する過程、前
記各過程のデータ、プロット値を印字する過程、からな
っている。ＰＣＲが指数的に進行している場合、ＰＣＲ
開始時の標的核酸のコピー数のＬｏｇ値と、Ｃｔとの間
には直線関係が成り立つ。従って標的核酸の既知量のコ
ピー数を用いて検量線を作成し、未知コピー数の標的核
酸を含有するサンプルのＣｔを検出することにより、標
的核酸のＰＣＲ開始時のコピー数を計算できる。

【００９５】上記のデータ解析方法等のＰＣＲ関連発明
は、前記のようなリアルタイム定量的ＰＣＲ方法で得ら
れたデータを解析する方法である。以下に各特徴につい
て記す。第一の特徴は、リアルタイム定量的ＰＣＲ方法
で得られたデータを解析する方法において、各サイクル
における増幅した核酸が蛍光色素と結合したとき、ある
いは増幅した核酸が本発明の核酸プローブとハイブリダ
イズしたときの反応系の蛍光強度値を、各サイクルにお
ける前記の蛍光色素と核酸が結合したもの、すなわち蛍
光色素−核酸複合体、あるいは前記本発明の核酸プロー
ブと標的核酸がハイブリダイズしたもの、すなわち核酸
ハイブリッド複合体が解離したときの反応系の蛍光強度
値により補正する演算処理過程、即ち、補正演算処理過
程である。

【００９６】「増幅した標的核酸が蛍光色素と結合した
とき、あるいは増幅した標的核酸が本発明の核酸プロー
ブとハイブリダイズしたときの反応系」とは、具体的に
例示すると、ＰＣＲの各サイクルにおける４０〜８５
℃、好ましくは５０〜８０℃の反応温度を有する核酸伸
長反応あるいはアニーリングのときの反応系を挙げるこ
とができる。そして、反応が完了した反応系を意味す
る。実際の温度は増幅した核酸の長さに依存する。ま
た、「前記の蛍光色素−核酸複合体、あるいは前記の核
酸ハイブリッド複合体が解離したときの反応系」とは、
ＰＣＲの各サイクルにおける核酸の熱変性の反応系、具
体的には、反応温度９０〜１００℃、好ましくは９４〜
９６℃のときのもので、反応が完了した系を例示でき
る。

【００９７】補正演算処理過程の補正演算処理としては
本発明の目的に合致するものであればどのようなもので
もよいのであるが、具体的には、次の〔数式１〕あるい
は〔数式２〕による処理過程を含むものを例示すること
ができる。 ｆ_n＝ｆ_hyb,n／ｆ_den,n 〔数式１〕 ｆ_n＝ｆ_den,n／ｆ_hyb,n 〔数式２〕 〔式中、 ｆ_n：〔数式１〕あるいは〔数式２〕により算出された
ｎ次サイクルにおける補正演算処理値、 ｆ_hyb,n：ｎ次サイクルにおける、増幅した核酸が蛍光
色素と結合したとき、あるいは増幅した核酸が本発明の
核酸プローブとハイブリダイズしたときの反応系の蛍光
強度値、 ｆ_den,n：ｎ次サイクルにおける、前記の蛍光色素−核
酸複合体、あるいは核酸ハイブリッド複合体が解離した
ときの反応系の蛍光強度値〕 尚、本過程においては、上記の処理で得られた補正演算
処理値をコンピュータのデスプレー上に表示及び／又は
当該値を各サイクル数の関数としてグラフの形で同様に
表示及び／又は印字するサブステップを含むものであ
る。

【００９８】第二の特徴は、各サイクルにおける〔数式
１〕あるいは〔数式２〕による補正演算処理値を次の
〔数式３〕あるいは〔数式４〕に代入し、各サンプル間
の蛍光変化割合あるいは蛍光変化率を算出し、それらを
比較するデータ解析方法である。

【００９９】Ｆ_n＝ｆ_n／ｆ_a 〔数式３〕 Ｆ_n＝ｆ_a／ｆ_n 〔数式４〕 〔式中、 Ｆ_n：ｎ次サイクルにおける、〔数式３〕あるいは〔数
式４〕により算出された蛍光変化割合あるいは蛍光変化
率、 ｆ_n：ｎ次サイクルにおける〔数式１〕あるいは〔数式
２〕による補正演算処理値 ｆ_a：〔数式１〕あるいは〔数式２〕による補正演算処
理値で、ｆ_nの変化が観察される以前の任意のサイクル
数のものであるが、通常は、例えば、１０〜４０サイク
ルのもの、好適には１５〜３０サイクルのもの、より好
適には２０〜３０サイクルのものが採用される。〕 尚、本過程においては、上記処理で得られた算出値コン
ピュータのデスプレー上に表示及び／又は印字する、又
は比較値若しくは当該値を各サイクル数の関数としてグ
ラフの形で同様に表示及び／又は印字するサブステップ
を含むものであるが、〔数式１〕あるいは〔数式２〕に
よる補正演算処理値については、上記サブステップを適
用しても、しなくともよい。

【０１００】第三の特徴は、 （３．１）〔数式３〕あるいは〔数式４〕により算出さ
れた蛍光変化割合あるいは蛍光変化率のデータを用い
て、〔数式５〕、〔数式６〕あるいは〔数式７〕による
演算処理する過程、 ｌｏｇ_b（Ｆ_n）、ｌｎ（Ｆ_n） 〔数式５〕 ｌｏｇ_b｛（１−Ｆ_n）×Ａ｝、ｌｎ｛（１−Ｆ_n）×Ａ｝ 〔数式６〕 ｌｏｇ_b｛（Ｆ_n−１）×Ａ｝、ｌｎ｛（Ｆ_n−１）×Ａ｝ 〔数式７〕

【０１０１】〔式中、 Ａ、ｂ：任意の数値、好ましくは整数値、より好ましく
は自然数である。そして、Ａ＝１００、ｂ＝１０のとき
は、｛（Ｆ_n−１）×Ａ｝は百分率（％）で表わされ
る。 Ｆ_n：〔数式３〕あるいは〔数式４〕により算出された
ｎサイクルにおける蛍光変化割合あるいは蛍光変化
率〕、 （３．２）前記（３．１）の演算処理値が一定値に達し
たサイクル数を求める演算処理過程、 （３．３）既知濃度の核酸試料におけるサイクル数と反
応開始時の標的核酸のコピー数の関係式を計算する演算
処理過程、 （３．４）未知試料におけるＰＣＲ開始時の標的核酸の
コピー数を求める演算処理過程、 を有するデータ解析方法である。そして、（３．１）→
（３．２）→（３．３）→（３．４）の順からなる過程
が好適である。

【０１０２】前記（３．１）〜（３．３）の各過程は、
それぞれの処理で得られた演算処理値をコンピュータの
デスプレー上に表示及び／又は当該値を各サイクル数の
関数としてグラフの形で前記同様に表示及び／又は印字
するサブステップを含むものであってもよい。前記
（３．４）の過程で得られた演算処理値は、少なくとも
印字される必要があるので、当該過程は印字するサブス
テップを含む。前記（３．４）で得られた演算処理値を
更にコンピュータのデスプレイ上に表示してもよい。
尚、〔数式１〕あるいは〔数式２〕による補正演算処理
値、〔数式３〕あるいは〔数式４〕による算出処理値
を、各サイクル数の関数としてにグラフの形でコンピュ
ータのデスプレー上に表示及び／又は印字しても、しな
くてもよいので、それらの表示及び／又は印字のサブス
テップは必要に応じて追加すればよい。

【０１０３】前記データ解析方法は、リアルタイム定量
的ＰＣＲ方法が蛍光色素の発光の減少量を測定するもの
である場合に特に有効である。その具体例として、前記
の本発明のリアルタイム定量的ＰＣＲ方法である。

【０１０４】第４の特徴は、リアルタイム定量的ＰＣＲ
の解析装置において、前記本発明のリアルタイム定量的
ＰＣＲ方法のためのデータ解析方法を実行する演算及び
記憶手段を有するリアルタイム定量的ＰＣＲの測定及び
／又は解析装置である。

【０１０５】第５の特徴は、リアルタイム定量的ＰＣＲ
の解析装置を用いてＰＣＲを解析するデータ解析方法の
各手順をプログラム化して、そのプログラムを記録した
コンピュータ読取可能な記録媒体において、前記本発明
のデータ解析方法の各手順をコンピュータに実行させる
ことができるようにしたプログラムを記録したコンピュ
ータ読取可能な記録媒体である。

【０１０６】第６の特徴は、核酸測定方法において、前
記本発明のデータ解析方法、測定及び／又は解析装置、
記録媒体を利用する新規な核酸の測定方法である。

【０１０７】また、第７の特徴は、前記の本発明の核酸
の融解曲線の分析方法、即ち、本発明のＰＣＲ方法を行
って核酸のＴｍ値を求める方法によって得られるデータ
を解析する方法である。即ち、本発明のＰＣＲ法により
増幅された核酸について、低い温度から核酸が完全に変
性するまで、温度を徐々に上げる過程（例えば、５０℃
から９５℃まで）、この過程において、短い時間間隔
（例えば、０．２℃〜０．５℃の温度上昇に相当する間
隔）で蛍光強度を測定する過程、測定結果を時間の関数
としてデスプレー上に表示する過程、即ち、核酸の融解
曲線を表示する過程、この融解曲線を微分して微分値
（−ｄＦ／ｄＴ、Ｆ：蛍光強度、Ｔ：時間）を得る過
程、その値を微分値としてデスプレー上に表示する過
程、その微分値から変曲点を求める過程からなる、解析
方法である。本発明においては、蛍光強度は温度が上が
るごとに増加する。本発明においては、各サイクルにお
ける核酸伸長反応時、好ましくはＰＣＲ反応終了時の蛍
光強度値を熱変性反応時の蛍光強度値を用いて割る演算
処理する過程を上記の過程に追加することにより、より
好ましい結果が得られる。

【０１０８】前記の本発明の新規なＰＣＲ方法のデータ
解析方法に、本発明の核酸の融解曲線の分析をする方法
を追加してなる本発明のリアルタイム定量的ＰＣＲの測
定及び／又は解析装置も本発明の技術的範囲内である。

【０１０９】更に、本発明の特徴の一つは、本発明の核
酸の融解曲線の分析をする方法の各手順をコンピュータ
に実行させることができるようにしたプログラムを記録
したコンピュータ読取可能な記録媒体、また、前記本発
明のＰＣＲ方法のデータ解析方法の各手順をコンピュー
タに実行させることができるようにしたプログラムを記
録したコンピュータ読取可能な記録媒体において、本発
明の核酸の融解曲線の分析をする方法の各手順をコンピ
ュータに実行させることができるようにしたプログラム
を追加して記録したコンピュータ読取可能な記録媒体で
ある。

【０１１０】本発明の前記のデータ解析方法、装置、及
び記録媒体は、医学、法医学、人類学、古代生物学、生
物学、遺伝子工学、分子生物学、農学、植物育種学等の
各種の分野で利用できる。また、複合微生物系、共生微
生物系と云われ、色々の種類の微生物が混在するか若し
くは少なくとも一種類の微生物が他の動物、植物由来の
細胞と共に混在していて相互に単離できない微生物系等
に好適に利用できる。ここで云う微生物とは一般的に云
う微生物のことで、特に限定されるものではない。例え
ば、真核微生物、原核微生物、その他マイコプラズマ、
ウイルス、リッケチャ等を挙げることができる。

【０１１１】また、本発明の前記データ解析方法、装置
及び記録媒体の一つ又はそれ以上を用いて、複合微生物
系又は共生微生物系における特定菌株の５ＳｒＲＮＡ、
１６ＳｒＲＮＡ若しくは２３ＳｒＲＮＡ又はそれらの遺
伝子ＤＮＡのコピー数を定量することにより、当該系に
おける特定菌株の存在量を測定することができる。それ
は、５ＳｒＲＮＡ、１６ＳｒＲＮＡ若しくは２３ＳｒＲ
ＮＡの遺伝子ＤＮＡのコピー数は菌株よって一定である
からである。本発明においては、複合微生物系又は共生
微生物系のホモジネートを用いて、本発明のリアルタイ
ム定量的ＰＣＲを行い、特定菌株の存在量を測定するこ
とが可能である。この方法も、本発明の技術的範囲内と
する。

【０１１２】

【実施例】次に実施例及び比較例を挙げて本発明を更に
具体的に説明する。 実施例１ 大腸菌（Escherichia coli）の１６ＳｒＲＮＡの核酸塩
基配列にハイブリダイズする、即ち、(3')CCGCTCACGC A
TC(5')の塩基配列を有する核酸プローブの調製を以下の
通りに行った。

【０１１３】核酸プローブの調製：(3')CCGCTCACGC ATC
(5')の塩基配列をもつオリゴデオキシリボヌクレオチド
の３’末端のデオキシリボースの３’位炭素のＯＨ基
に、−（ＣＨ₂）₇−ＮＨ₂を結合したものを、メドラン
ド・サーテイファイド・レージント・カンパニー社（Mi
dland Certified Reagent Company、 米国）から購入し
た。更に、モレキュラープローブ（Molecular Probes）
社からフロオ・リポーターキット（FluoReporter Kit）
F-6082（ボデピーＦＬのプロピオン酸サクシニミジルエ
ステル（BODIPY FL propionic acid succinimidyl este
r）の他に、当該化合物をオリゴヌクレオチドのアミン
誘導体に結合する試薬を含有するキット）を購入した。
当該キットを前記購入のオリゴヌクレオチドに作用させ
て、本実施例で使用するボデピーＦＬで標識した核酸プ
ローブを合成した。

【０１１４】合成物の精製：得られた合成物を乾固し乾
固物を得た。それを０．５Ｍ ＮａＨＣＯ₃／Ｎａ₂ＣＯ
₃緩衝液（ｐＨ９．０）に溶解した。当該溶解物をＮＡ
Ｐ−２５カラム（ファルマシア社製）でゲルろ過を行
い、未反応物を除去した。更に逆相HPLC（B gradient：
１５〜６５％、２５分間）を以下の条件で行った。そし
て、溶出するメインピークを分取した。分取した画分を
凍結乾燥して、最初のオリゴヌクレオチド原料２ｍＭよ
り２３％の収率で核酸プローブを得た。

【０１１５】

【０１１６】実施例２ 殺菌したニュウトリエントブロス（ＮＢ）（Difco社
製）液体培地５０ｍｌ（組成：ＮＢ、０．０８ｇ／１０
０ｍｌ）が添加された２００ｍｌ容の（殺菌された）三
角フラスコを用いて、大腸菌ＪＭ１０９株を３７℃で一
晩振蘯培養した。次に、本培養液に９９．７％エタノー
ルを当量添加した。このエタノール添加培養液２ｍｌを
２．０ｍｌ容量のエッペンドルフ遠心チューブで遠心分
離し、菌体を得た。３０ｍＭリン酸緩衝液（ソーダ塩）
（ｐＨ：７．２）１００μｌで菌体を一回洗浄した。菌
体を１３０ｍＭのＮａＣｌ含有の前記リン酸緩衝液１０
０μｌに懸濁した。当該懸濁液を氷冷中で４０分間超音
波処理し（出力：３３ｗ、発振周波数：２０ｋＨｚ、発
振法：０．５秒発振、０．５秒休止）、ホモジネートを
作製した。

【０１１７】前記ホモジネートを遠心分離した後、上澄
液を採取し蛍光光度計のセルに移した。それを３６℃に
温調した。それに３６℃に予め加温した前記核酸プロー
ブの溶液を最終濃度で５ｎＭとなるように添加した。３
６℃に温調しながら９０分間大腸菌１６ＳｒＲＮＡと核
酸プローブとをハイブリダイズさせた。そして蛍光光度
計で蛍光色素の発光量を測定した。

【０１１８】ハイブリダイゼーション前の蛍光色素の発
光量は、上記の上澄液の代りに、１３０ｍＭのＮａＣｌ
含有の３０ｍＭのリン酸緩衝液（ソーダ塩）（ｐＨ：
７．２）を用いて測定した値を採用した。核酸プローブ
の量と上澄液の量の比を変えて発光量を測定した（励起
光５０３ｎｍ；測定蛍光色５１２ｎｍ）。その結果を図
１に示した。図１から分かるように、上澄液の量比が増
加することにより蛍光色素の発光が減少した。即ち、本
発明においては、核酸プローブにハイブリダイズする標
的核酸量に比例して、蛍光色素の発光の減少量の大きさ
が大きくなることが分かる。

【０１１９】実施例３ 核酸プローブの調製：大腸菌ＪＭ１０９株の２３ＳｒＲ
ＮＡにハイブリダイズする(5')CCCACATCGTTTTGTCTGGG
(3')の塩基配列をもつオリゴヌクレオチドの５’末端ヌ
クレオチドの３’位炭素のＯＨ基に、−（ＣＨ₂)₇−Ｎ
Ｈ₂を結合したものを、実施例１と同様にメドランド・
サーテイファイド・レージント・カンパニー社（Midlan
d Certified Reagent Company、米国）から購入した。
更に、実施例１と同様にモレキュラープローブ（Molecu
lar Probes）社からフロオ・リポーターキット（FluoRe
porter Kit) F-6082 (ボデピーＦＬのプロピオン酸サク
シニミジルエステル(BODIPY FL propionic acid succin
imidyl ester）の他に、当該化合物をオリゴヌクレオチ
ドのアミン誘導体に結合する試薬を含有するキット）を
購入した。当該キットを前記オリゴヌクレオチドに作用
させて、ボデピーＦＬで標識した核酸プローブを合成し
た。得られた合成物を実施例１と同様に精製して、最初
のオリゴヌクレオチド原料２ｍＭより２５％の収率でボ
デピーＦＬで標識した核酸プローブを得た。

【０１２０】実施例４ 実施例２で得られた大腸菌ＪＭ１０９株の菌体に実施例
２と同一の培地及び培養条件で調製したシュウドモナス
・プウシモビルス ４２１Ｙ株（Pseudomonaspaucimobi
lis）（現在名：スフィンゴモナス・プウシモビルス）
（FERM P-5122）の菌体をＯＤ６６０値で大腸菌ＪＭ１
０９株と同濃度混合し、複合微生物系を調製した。得ら
れた混合液（大腸菌ＪＭ１０９株の菌体濃度は実施例２
と同一）について実施例２と同じ方法によりホモジネー
トを調製した。実施例３で調製した核酸プローブを用い
て、励起光を５４３ｎｍ、また、測定蛍光色を５６９ｎ
ｍにする以外は、実施例２と同様な実験を行った結果、
実施例２と同様な結果を得た。

【０１２１】実施例５ 蛍光消光現象における標的核酸の塩基選択性、即ち、本
発明の塩基特異性を検討した。下記に示す標的合成デオ
キシリボオリゴヌクレオチド（３０mer）の１０種類（p
oly a〜poly j）をＤＮＡ合成機ABI394（Perkin Elmer
社製、米国)で調製した。

【０１２２】更に、上記の合成ＤＮＡに対応するデオキ
シリボオリゴヌクレオチドの５’末端にボデピーＦＬで
標識した下記に示す本発明のプローブを調製した。上記
の合成ＤＮＡに対応するプライマーＤＮＡの５’末端の
リン酸基に、−（CH₂)₆-NH₂を結合したものをメドラン
ド・サーテイファイド・レージント・カンパニー社（Mi
dland Certified Reagent Company、米国）から購入し
た。更に、モレキュラープローブ（Molecular Probes）
社からフロオ・リポーターキット（FluoReporter Kit）
F-6082（ボデピーFL/C6のプロピオン酸サクシニジルエ
ステル（BODIPY FL propionic acid succinidyl ester)
の他に、当該化合物をオリゴヌクレオチドのアミン誘導
体に結合させる試薬を含有するキット）を購入した。当
該キットを前記購入のプライマーＤＮＡに作用させて下
記のボデピーＦＬで標識した本発明のプローブprobe a
〜d、及びf〜hのを合成した。そして対応する合成デオ
キシリボオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしたとき
に、蛍光色素の発光がどの程度減少するかを下記の条件
下に調べ、本発明のプローブの特異性を検討した。

【０１２３】

【０１２４】

【０１２５】

【０１２６】

【０１２７】

【０１２８】

【０１２９】その結果を表１に示した。表１から分かる
ように、蛍光色素で標識された核酸プローブが標的ＤＮ
Ａ（オリゴデオキシリボヌクレオチド）にハイブリダイ
ズしたときに、当該末端部において、当該プローブと標
的ＤＮＡとがハイブリダイズした末端塩基部から１〜３
塩基離れて、標的ＤＮＡの塩基配列にＧ（グアニン）が
少なくとも１塩基以上存在するように、当該プローブの
塩基配列が設計されていることが好適である。また、蛍
光色素で標識された核酸プローブが標的ＤＮＡにハイブ
リダイズしたときに、当該末端部において核酸ハイブリ
ッド複合体の複数の塩基対がＧとＣのペアーを少なくと
も一対以上形成するように、当該プローブの塩基配列が
設計されていることが好適であることが表１から分か
る。

【０１３０】実施例６ 下記のような塩基配列の標的核酸と本発明の核酸プロー
ブを調製した。標的核酸内のＧ及び本発明の核酸プロー
ブ内のＧの数の影響について、前記実施例と同様にして
調べた。

【０１３１】

【０１３２】

【０１３３】

【０１３４】

【０１３５】

【０１３６】表２から分かるように、標的核酸内のＧの
数、本発明のプローブ内のＧの数はそれほど蛍光強度の
減少に影響しないことが認識される。

【０１３７】実施例７ 前記と同様にして下記のような塩基配列の標的核酸と本
発明の核酸プローブを調製した。なお、本実施例におけ
る本発明の核酸プローブはオリゴヌクレオチドの５’末
端部をボデピーFL/C6で標識したものである。標的核酸
内の塩基種及び本発明の核酸プローブ内の塩基種の影響
について、前記実施例と同様にして調べた。

【０１３８】

【０１３９】

【０１４０】

【０１４１】表３及び前記の実施例から分かるように、
(i)蛍光色素で標識される本発明のプローブの末端がＣ
で構成され、標的核酸がハイブリダイズしたとき、ＧＣ
ペアーを形成するとき、(ii)蛍光色素で標識される本発
明のプローブの末端がＣ以外の塩基で構成された場合、
蛍光色素で標識されている個所の塩基と、標的核酸の塩
基との塩基ペアーより、標的核酸の３’末端側にＧが少
なくとも１個以上存在する場合に、蛍光強度の減少率が
大きい。

【０１４２】実施例８ 本発明の核酸プローブに標識する色素の種類について、
前記実施例と同様にして調べた。なお、本発明のプロー
ブは、前記実施例７のプローブｚを、また、標的核酸は
前記実施例７のオリゴヌクレオチドｚを用いた。その結
果を、表４に示した。表から分かるように、本発明に用
いる蛍光色素として好適なものは、FITC、 BODIPY FL、
BODIPY FL/C3、 6-joe、TMRなどを挙げることができ
る。

【０１４３】

【０１４４】実施例９（標的核酸（１６ＳｒＲＮＡ）の
加熱処理の効果の実験） 本発明の核酸プローブの調製：大腸菌ＪＭ１０９株の１
６ＳｒＲＮＡの１１５６塩基目から１１９０塩基の塩基
配列に相当するＫＹＭ−７株の１６ＳｒＲＮＡ塩基配列
に特異的にハイブリダイズする(5')CATCCCCACC TTCCT C
CGAG TTGACCCCGG CAGTC(3')（３５塩基対）の塩基配列
をもち、１〜１６及び２５〜３５塩基目がデオキシリボ
ヌクレオチド、１７〜２４塩基目が２’位炭素のＯＨ基
をメチル基で修飾（エーテル結合で修飾）したリボオリ
ゴヌクレオチドからなり、その５’末端のリン酸基のＯ
Ｈ基を-(CH₂)₇-NN₂で修飾して結合したオリゴヌクレオ
チドを、実施例１と同様にメドランド・サーテイファイ
ド・レージント・カンパニー社（Midland Certified Re
agent Company、米国）から購入した。また、2-O-Meプ
ローブ（2-O-Meオリゴヌクレオチドからなるプローブを
単に2-O-Meプローブという。）に使用する2-O-Meオリゴ
ヌクレオチドは、ＧＥＮＳＥＴ株式会社（フランス）に
合成を委託し、得たものである。更に実施例１と同様に
モレキュラープローブ（Molecular Probes）社からフロ
オ・リポーターキット（FluoReporter Kit) F-6082
（ボデピーFL/C6のプロピオン酸サクシニミジルエステ
ル（BODIPY FL/ C6 propionic acid succinimidyleste
r）の他に、当該化合物をオリゴヌクレオチドのアミン
誘導体に結合する試薬を含有するキット）を購入した。
当該キットを前記オリゴヌクレオチドに作用させて、ボ
デピーFL/C6で標識した本発明の核酸プローブを合成し
た。得られた合成物を実施例１と同様に精製して、最初
のオリゴヌクレオチド原料２ｍＭより２３％の収率でボ
デピーFL/C6で標識した本発明の核酸プローブを得た。
このプローブを３５塩基鎖2-O-Meプローブと名づけた。

【０１４５】5')TCCTTTGAGT TCCCGGCCGG A (3')の塩基
配列を有するオリゴリボヌクレオチドを前記同様にして
ＤＮＡ合成機を用いて合成して、フォワード（forwar
d）型のヘルパープローブとした。一方、(5')CCCTGGTCG
T AAGGGCCATG ATGACTTGAC GT(3')の塩基配列を有するオ
リゴリボヌクレオチドを前記同様にしてＤＮＡ合成機を
用いて合成して、バックワード(back ward) 型すなわち
リバース型ヘルパープローブとした。

【０１４６】３５塩基鎖2-O-Meプローブ、フォワード型
のヘルパープローブ及びリバース型ヘルパープローブを
各々25nMになるように下記に示す組成の緩衝液に溶解さ
せ、７５℃に加温した（プローブ溶液）。前記の１６Ｓ
ｒＲＮＡを９５℃で５分加熱処理した後、それを下記に
示す反応条件においた前記のプローブ溶液に添加した
後、蛍光測定機器パーキンエルマー（Perkin Elmer) L
S-50Bで蛍光強度を測定した。その結果を図２に示し
た。尚、上記の加熱処理しない１６ＳｒＲＮＡを用いた
ものをコントロールとした。加熱処理した実験区におい
ては、蛍光強度の減少が大きいことが図２から分かる。
この結果は、１６ＳｒＲＮＡを９５℃で加熱処理するこ
とで本発明のプローブとより強いハイブリダイゼーショ
ンをしていることを示している。

【０１４７】実施例１０（2'-O-Meオリゴヌクレオチド
及びヘルパープローブのハイブリダイゼーション効率向
上への寄与の実験） 前記の１６ＳｒＲＮＡにハイブリダイズする下記の各種
の本発明の核酸プローブ及び各種のヘルパープローブを
前記実施例９と同様にして調製した。また、2-O-Meプロ
ーブに使用する2-O-Meオリゴヌクレオチドは、すべてGE
NSET株式会社(フランス)に合成を委託し、得たものであ
る。そして下記の条件にて、本発明の2-O-Meプローブの
効果、当該プローブの塩基鎖の長さの影響、及びヘルパ
ープローブの効果について、下記の図３Ａ、Ｂ、Ｃ、及
びＤの実験系で前記実施例９と同様にして検討した。そ
の結果を図３に示した。図から、本発明の2-O-Meプロー
ブがハイブリダイゼーション効率に寄与していることが
分かる。また、2-O-Meプローブの塩基鎖が短い場合にヘ
ルパープローブがハイブリダイゼーション効率を高める
のに役立っている。

【０１４８】１）３５塩基鎖2-O-Meプローブ： 前記実
施例９と同じプローブ、 ２）３５塩基鎖ＤＮＡプローブ： 前記１）の３５塩基
鎖2-O-Meプローブと同じ塩基配列であるが、オリゴヌク
レオチドがデオキシリボースで構成されているプロー
ブ、 ３）１７塩基鎖2-O-Meプローブ： 前記１）の３５塩基
鎖2-O-Meプローブと同じ塩基配列であるが、５’末端か
ら８塩基分、３’末端から１０塩基分のヌクレオチドを
削除したプローブ、 ４）１７塩基鎖ＤＮＡプローブ： 前記２）の３３塩基
鎖DNAプローブと同じ塩基配列であるが、３’末端から
１６塩基分のヌクレオチドを削除したプローブ、

【０１４９】５）フォワード型2-O-Meヘルパープロー
ブ: 前記実施例９のフォワード型ヘルパープローブの
中央８塩基分（５’末端から数えて９塩基〜１６塩基
分）のリボースの２’位炭素のＯＨ基を、メチル基で修
飾（エーテル結合）したヘルパープローブ、 ６）リバース型2-O-Meヘルパープローブ： 前記実施例
９のリバース型ヘルパープローブの中央８塩基分（５’
末端から数えて９塩基〜１６塩基分）のリボースの２’
位炭素のＯＨ基を、メチル基で修飾（エーテル結合）し
たヘルパープローブ、 ７）フォワード型ＤＮＡヘルパープローブ: 前記実施
例９のフォワード型ヘルパープローブの塩基配列と同じ
塩基配列であるが、オリゴヌクレオチドがデオキシリボ
ヌクレオチドで構成されているヘルパープローブ、 ８）リバース型ＤＮＡヘルパープローブ: 前記 前記
実施例９のリバース型ヘルパープローブの塩基配列と同
じ塩基配列であるが、オリゴヌクレオチドがデオキシリ
ボヌクレオチドで構成されているヘルパープローブ、 ９）３５塩基オリゴリボヌクレオチド: (5')CATCCCCAC
C TTCCTCCGAG TTGA CCCCGG CAGTC(3')なる塩基配列を
有するオリゴリボヌクレオチド、 １０）１７塩基鎖オリゴリボヌクレオチド： (5')CCTT
CCTCCG AGTTGAC(3')なる塩基配列を有するオリゴリボヌ
クレオチド。

【０１５０】

【０１５１】

【０１５２】

【０１５３】

【０１５４】

【０１５５】実施例１１（ｒＲＮＡ測定のための検量線
の作成） 前記ｒＲＮＡを、０．１〜１０ｎＭの範囲のさまざまな
濃度において、９５℃で５分間加熱後、得られた核酸溶
液を予め下記反応条件においた反応液に添加し、１００
０秒後、蛍光強度の減少をパーキンエルマーLS-50Bを使
用して測定した。その結果を図４に示した。図から検量
線は０．１〜１０ｎＭにおいて直線性を示すことが分か
る。なお、下記の３５塩基鎖2-O-Meプローブは実施例９
と同じプローブである。

【０１５６】実施例１２(FISH方法) セルロモナス（Cellulomonas）sp.KYM-7（FERM P-1133
9）及びアグロバクテリウム（Agrobacterium) sp. KYM-
8(FERM P-16806)の各々のｒＲＮＡにハイブリダイズす
る下記の本発明の35又は36塩基鎖オリゴデオキシリボヌ
クレオチド 2-O-Meプローブを前記と同様にして調製し
た。各プローブの塩基配列は下記の通りである。

【０１５７】セルロモナス sp.KYM-7のｒＲＮＡ測定の
ための３５塩基鎖オリゴデオキシリボヌクレオチド2-O-
Meプローブ：（5')CATCCCCACC TTCCTCCGAG TTGACCCCGG
CAGTC(3')（アンダーライン部分がメチル基で修飾され
ている。）。 アグロバクテリウム sp. KYM-8のｒＲＮＡ測定のための
３６塩基鎖オリゴデオキシリボヌクレオチド2-O-Meプロ
ーブ：(5')CATCCCCACC TTCCTCTCGG CTTATCACCG GCAGTC
(3')（アンダーライン部分がメチル基で修飾されてい
る。）。

【０１５８】セルロモナス sp. KYM-7及びアグロバクテ
リウム sp. KYM-8を下記の培地組成の培地で下記の培
養条件で混合培養し、培養時間毎に培養物を採取した。
それらから、ｒＲＮＡをRNeasy Maxikit（QIAGEN社）を
用いて調製した。当該ｒＲＮＡを９５℃で５分加熱後、
予め反応条件においた反応液に添加し、７０℃、１００
０秒間反応させた後、蛍光強度をパーキンエルマーLS-5
0Bを使用して測定した。その結果を図５に示した。尚、
全rＲＮＡはリボグリーン（RiboGreen) totalRNA Quant
ification Kit （会社名：モレキュラープローブ（mole
cular probes)、所在地名：Eugene,Oregon, USA）を用
いて測定した。図から分かるように、各菌株のｒＲＮＡ
の動態は全 rＲＮＡの動態と一致した。また、各菌株の
ｒＲＮＡの合計量は全ｒＲＮＡと一致した。このこと
は、本発明方法はFISH方法において有効な方法になるこ
とを示している。

【０１５９】・培地組成（g/l）：デンプン，10.0；ア
スパラギン酸，0.1； K₂HPO₄，5.0;KH ₂PO₄,2.0;MgSO₄
・7H₂O ,0.2;NaCl，0.1; (NH₄)₂SO₄;0.1. ・培地１００ｍｌを５００ｍｌ容のコニカルフラスコに
分注し、該フラスコを１２０℃で１０分間、オートクレ
ーブ釜を用いて殺菌した。 ・培養条件：前記の菌株を斜面培地で予め培養した。該
斜面培地より１白金耳の菌体をとり、前記の殺菌したコ
ニカルフラスコの培地に接種した。３０℃、１５０ｒｐ
ｍで撹拌培養した。

【０１６０】

【０１６１】以下実施例１３に、標的核酸の多型及び変
異を解析若しくは測定する方法を記す。 実施例１３ 下記に示した塩基配列をもつ４種類のオリゴヌクレオチ
ドを前記実施例５のＤＮＡ合成機を用いて合成した。ま
た、前記実施例５と同様にして、下記の塩基配列の本発
明の核酸プローブを合成した。該プローブと各々のオリ
ゴヌクレオチドを溶液中でハイブリダイズさせた後、蛍
光強度の変化から１塩基置換の評価ができるかどうか検
討した。本発明の核酸プローブの塩基配列は、標的オリ
ゴヌクレオチドのうちのいずれかの３’末端にＧが存在
する場合に、そのオリゴヌクレオチドの塩基配列に１０
０％マッチするように設計されている。ハイブリダイゼ
ーション温度は、プローブと標的オリゴヌクレオチドと
の間の全塩基対（base-pairs）が１００％ハイブリダイ
ズできる４０℃に設定した。プローブ及び標的オリゴヌ
クレオチドの濃度、緩衝液の濃度，蛍光測定装置、蛍光
測定条件、実験操作などは、前記実施例５と同様であ
る。

【０１６２】

【０１６３】その結果を表５に示した。表から、標的オ
リゴヌクレオチドＮｏ．１〜３においては、蛍光強度に
変化は観察されなかったが、標的オリゴヌクレオチドＮ
ｏ．４においては８４％の減少が観察された。

【０１６４】

【０１６５】本発明において、標的核酸（例えば上記標
的オリゴヌクレオチドＮｏ．１〜４）の多型及び／又は
変異を解析若しくは測定する方法により得られるデータ
（例えば表５のカラムＡ及びＢのデータ）を解析する方
法において、標的核酸が本発明の核酸プローブ（上記の
核酸プローブ）とハイブリダイズしたときの反応系の蛍
光強度値を、前記のハイブリダイズしていないときの反
応系の蛍光強度値により補正演算処理するとは、表３の
（Ａ−Ｂ）／Ｂの計算をいう。以上の結果より、標的核
酸が２本鎖の場合、Ｇ→Ａ、Ｇ←Ａ、Ｃ→Ｔ、Ｃ←Ｔ、
Ｇ→Ｃ、Ｇ←Ｃの置換を検出できることが明らかになっ
た。

【０１６６】実施例１４ 図６に本発明のＤＮＡチップのモデルの一例を図示し
た。先ず、実施例１３で調製した本発明のプローブであ
る3'TTTTTTTTGGGGGGGGC5'BODIPY FL/C6のの３’末端の
リボースの３’位炭素のＯＨ基にアミノ基を導入して調
製した修飾プローブ、また、スライドガラスを反応基と
してエポキシ基を有するシランカップリン剤でスライド
ガラスの表面を処理した表面処理済スライドガラスを用
意した。上記の修飾プローブを含む溶液をＤＮＡチップ
作成装置GMS^TM417ARRAYER(TAKARA)で該表面処理済スラ
イドガラス上にスポットした。そうすると、３’末端で
上記修飾プローブがガラス面に結合した。該スライドガ
ラスを密閉容器内に４時間位おき反応を完結させた。そ
して該スライドガラスを０．２％ＳＤＳ溶液、水に１分
程度交互に２回づつ漬けた。更にホウ素溶液（水３００
ｍｌにNaBH₄１．０ｇを溶かしたもの。）に５分位つけ
た。９５℃の水に２分つけてから、素早く０．２％ＳＤ
Ｓ溶液、水に１分程度交互に２回づつ漬けて試薬を洗い
流した。室温で乾燥した。このようにして本発明のＤＮ
Ａチップを調製した。

【０１６７】更に、ガラスの下面の修飾プローブの各ス
ポットに対応する位置に図のような微小な温度センサー
とヒータを設けることにより、本発明のＤＮＡチップに
高性能を付与することができた。このＤＮＡチップを用
いて標的核酸を測定する場合を説明する。該プローブに
標的核酸がハイブリダイズしていないとき、又はハイブ
リダイズしても蛍光色素標識末端でＧＣペアーを形成し
ないとき、若しくは当該プローブと標的核酸とがハイブ
リダイズした末端塩基部分から１ないし３塩基離れて、
標的核酸の塩基配列にＧ（グアニン）又はシトシン
（Ｃ）が少なくとも１つ存在しないときは、蛍光強度に
変化ない。しかし、その反対に、該プローブに標的核酸
がハイブリダイズしているとき、又はハイブリダイズし
ても蛍光色素標識末端でＧＣペアーを形成していると
き、若しくは当該プローブと標的核酸とがハイブリダイ
ズした末端塩基部分から１ないし３塩基離れて、標的核
酸の塩基配列にＧ（グアニン）又はシトシン（Ｃ）が少
なくとも１つ存在するときは蛍光強度が減少する。この
蛍光強度はＤＮＡチップ解析装置ＧＭＳ^TM４１８アレー
スキャナー（Array Scanner）（TAKARA）を使用して測
定できる。

【０１６８】実施例１５：本発明のＤＮＡチップを用い
た一塩基多型（ＳＮＰｓ）の検出実験 Ｉ）標的核酸の調製：(5')AAACGATGTG GGAAGGCCCA GACA
GCCAGG ATGTTGGCTT AGAAGCAGCC(3')の塩基配列をもつオ
リゴデオキシリボヌクレオチドを、ＤＮＡ合成機ABI394
(Perkin Elmer社製、米国）を用いて合成し、標的核酸
とした。 II）核酸プローブの調製：標的核酸の５’末端から１５
塩基の配列（アンダーライン部）にハイブリダイズする
塩基配列をもつ、下記の６個のオリゴデオキシリボヌク
レオチドを、ＤＮＡ合成機ABI394(Perkin Elmer社製、
米国）を用いて合成した。そして、3'-Amino-Modifier
C7 CPG（グレンリサーチ、カタログ番号20ー2957）を用
いて、３’末端のデオキシリボースの３’位のＯＨ基を
アミノ化した。更に５’末端のリン酸基を実施例５と同
様な方法でBODIPY FLで標識した。

【０１６９】 １）プローブ100（１００％マッチ）：（5')CCTTCCCACA
TCGTTT(3')、 ２）プローブ−T（１塩基ミスマッチ）：(5')CCTTCCCAT
A TCGTTT(3')、 ３）プローブ−A（１塩基ミスマッチ）: (5')CCTTCCCAA
A TCGTTT(3')、 ４）プローブ−G（１塩基ミスマッチ）: (5')CCTTCCCAG
A TCGTTT(3')、 ５）プローブ−TG（２塩基ミスマッチ）:(5')CCTTCCCTG
A TCGTTT(3')、 ６）プローブ−TGT（３塩基ミスマッチ）:(5')CCTTCCCT
GT TCGTTT(3')、

【０１７０】III）ＤＮＡチップの調製 全てのＤＮＡプローブを、滅菌蒸留水に溶解して、１μ
Ｍ濃度の溶液にした。ＤＮＡマイクロアレイヤー装置
（ＤＮＡマイクロアレイヤーNo.439702、３２ピン型、
およびＤＮＡスライドインデックスNo.439701からなる
手動式のチップアレイヤーである。greiner社）を用い
て、ＤＮＡチップ用スライドグラス（Blacksilylated s
lides、greiner社）の上に、前記プローブ溶液をスポテ
イング（spotting）した。スポット終了後１０分間反応
させ、プローブをスライドグラス上に固定化した。その
後、５０ｍＭのＴＥ緩衝液（ｐＨ：７．２）にて洗浄し
た。なお、各プローブ溶液につき、４スポットづつスポ
ッテングした。本発明のＤＮＡチップの模式図を図６に
示した。スライドグラス上に固定化された本発明のプロ
ーブは、標的核酸にハイブリダイズしないときはBODIPY
FLは発色しているが、ハイブリダイズしているときは
発色が、ハイブリダイズしないときのものよりも少な
い。すなわち減少する。スライドグラスはマイクロヒー
ターで加熱されるようになっている（本発明では、下記
に示すように顕微鏡用透明加熱板（MP-10MH-PG、（株式
会社）北里サプライ）で行われた。）。

【０１７１】IV）ＳＮＰｓの検出測定 １００μＭ濃度の標的核酸溶液｛５０ｍＭのＴＥ緩衝液
（ｐＨ：７．２）使用｝を上記のごとくに調製したＤＮ
Ａチップの上にのせた。カバーグラスで覆い、標的核酸
が漏れないようにマニキュアにてカバーグラスをシール
した。検出測定のための装置類の概略は図７に示した。
先ず、オリンパス正立顕微鏡（AX80型）の試料台に顕微
鏡用透明加熱板（MP-10MH-PG、（株式会社）北里サプラ
イ）をのせた。当該板上に前記に調製した本発明のＤＮ
Ａチップを置き、９５℃から３３℃まで３℃刻みで変化
させ、３０分かけて反応させた。各スポットの反応過程
の蛍光強度変化を、冷却ＣＣＤカメラ（C5810型、浜松
フォトニクス社）にて画像取り込み形式で測定した。取
り込み画像を画像解析装置（画像解析ソフト（TPlab s
pectrum； SignalAnalytics社，Verginia）がインスト
ールされたパソコン（NEC））にて解析し、各スポット
の輝度を算出し、温度と輝度の関係を求めた。

【０１７２】実験結果を図８に示した。図から全てのプ
ローブで蛍光強度が減少していることが分かる。従っ
て、本発明の方法により、本発明のプローブと標的核酸
との解離曲線を簡便にモニタリングすることができる。
また、標的核酸と１００％マッチするプローブ100と一
塩基ミスマッチするプローブとのＴｍ値の差は１０℃以
上あるので、解離曲線から両者を容易に識別することが
できる。すなわち本発明のＤＮＡチップを使用すること
によりＳＮＰｓの解析が容易にできることがわかる。

【０１７３】以下、実施例１６〜１９に本発明のＰＣＲ
方法を記す。 実施例１６ 大腸菌のゲノムＤＮＡにおける１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を
標的核酸として、当該核酸の増幅のための（BODIPY FL/
C6で標識した）プライマー（本発明の核酸プローブ）を
調製した。

【０１７４】プライマー１（Eu800R：リバース型）の調
製：(5')CATCGTTTAC GGCGTGGAC(3')の塩基配列をもつオ
リゴデオキシリボヌクレオチドを、ＤＮＡ合成機ABI394
(Perkin Elmer社製、米国）を用いて合成し、更に当該
オリゴデオキシリボヌクレオチドの５’末端のリン酸基
をホスファターゼ処理してシトシンとし、そのシトシン
の５’位の炭素OH基に、-(CH₂)₉-NH₂を結合したオリゴ
ヌクレオチドを、ミドランド・サーテイファイド・レー
ジンド・カンパニー社（米国）から購入した。更に、モ
レキュラープローブ社からフロオ・リポーターキット
（FluoReporter Kits)F-6082（ボデピーFL/C6のプロピ
オン酸サクシニミジルエステル（BODIPY FLpropionic a
cid succinimidyl ester）の他に、当該化合物をオリゴ
ヌクレオチドのアミン誘導体に結合させる試薬を含有す
るキット）を購入した。前記購入したオリゴヌクレオチ
ドに当該キットを作用させて、本発明のボデピーFL/C6
で標識したプライマー１を合成した。

【０１７５】合成物の精製：得られた合成物を乾固し乾
固物を得た。それを0.5M Na₂CO₃/NaHCO₃緩衝液（ｐＨ
９．０）に溶解した。当該溶解物をＮＡＰ−２５カラム
（ファルマシア社製）でゲルろ過を行い、未反応物を除
去した。更に逆相HPLC（B gradient：１５〜６５％、２
５分間）を以下の条件で行った。そして、溶出するメイ
ンピークを分取した。分取した画分を凍結乾燥して本発
明のプライマー１を、最初のオリゴヌクレオチド原料２
ｍＭより５０％の収率で得た。

【０１７６】

【０１７７】実施例１７ プライマー２（Eu500R/forward：フォワード型）の調
製：(5')CCAGCAGCCG CGGTAATAC(3')の塩基配列をもつオ
リゴデオキシリボヌクレオチドの５’末端に蛍光色素
（BODIPY FL/C6）で標識したプライマー２を実施例１４
と同様にして収率５０％で調製した。

【０１７８】実施例１８ 殺菌したニュトリエントブロス(NB)（Difco社製）液体
培地５ml（組成：NB、0.08g/100ml）を含有する試験管
を用いて、大腸菌JM109株を３７℃で一晩振蘯培養し
た。培養液１．５mlを１．５ml容量の遠心チューブで遠
心分離し、菌体を得た。この菌体から、DNeasy Tissue
Kit（キアゲン（QIAGEN）社、ドイツ国）を用いてゲノ
ムＤＮＡを抽出した。その抽出は本キットのプロトコル
に従った。その結果、17ng/μlのＤＮＡ溶液を得た。

【０１７９】実施例１９ 上記の大腸菌のゲノムＤＮＡ、プライマー１及び／又は
プライマー２を使用して、ロシュ・ダイアグノスティッ
クス株式会社発売のライトサイクラー^TMシステム（Ligh
tCycler^TM System）を用いて常法通りにＰＣＲ反応を行
った。操作は当該システム機器の手順書に従った。ま
た、上記システムにおいてＰＣＲは、当該手順書に記さ
れている核酸プローブ（FRET現象を利用する二個のプロ
ーブ）と通常のプライマー（蛍光色素で標識されていな
い通常のプライマー）の代りに本発明プライマー１及び
／又は２を用いる以外は当該手順書通りに行った。

【０１８０】ＰＣＲは次のコンポーネントのハイブリダ
イゼーション溶液中で行った。 尚、標的核酸である大腸菌１６ＳｒＤＮＡは、図９の説
明欄に示される実験区の濃度で、また、プライマーは、
同様に図９の説明欄に示される実験区のプライマー１及
び／又は２の組合せで実験を行った。

【０１８１】また、上記のTaq溶液は次の試薬の混合液
である。

【０１８２】尚、Taq 溶液、 Taq DNAポリメラーゼ溶液
はロシュ・ダイアグノスティックス株式会社発売のＤＮ
Ａマスターハイブリダイゼーションプローブ（DNA Mast
er Hybridization Probes)キットのものである。特にTa
q DNA ポリメラーゼ溶液は10×conc.（赤いキャップ）
を１０倍に希釈して用いた。また、Taq スタートは、ク
ローンテック社（ＵＳＡ）より販売されているTaq DNA
ポリメラーゼ用の抗体で、これを反応液に添加すること
で７０℃までTaq DNAポリメラーゼの活性を抑えること
ができる。即ち、ホット・スタート(hot start)を行う
ことができるものである。

【０１８３】 測定は、ライトサイクラー^TMシステムを用いて行った。
その際、該システムにあるＦ１〜３の検出器にうち、Ｆ
１の検出器を用い、その検出器のゲインは１０、励起強
度は７５に固定した。

【０１８４】その結果を図９及び１０に示した。図９及
び１０から、蛍光色素の発光の減少が観察される時点の
サイクル数と標的核酸の大腸菌１６ＳｒＤＮＡのコピー
数が比例していることが分かる。尚、図においては、蛍
光色素の発光の減少量を蛍光強度の減少値として表現し
た。図１１は、サイクル数の関数として、大腸菌１６Ｓ
ｒＤＮＡのコピー数を表現した大腸菌１６ＳｒＤＮＡの
検量線を示す。相関係数は０．９９７３で、極めてよい
相関を示した。以上の結果から分かるように、本発明の
定量的ＰＣＲ方法を用いると標的核酸の当初のコピー数
を測定できるようになる。即ち、標的核酸の濃度の測定
ができる。

【０１８５】実施例２０ 実施例１９においては、本発明のプローブをプライマー
としてＰＣＲを行ったが、本実施例では従来法に用いる
ＦＲＥＴ現象を利用する二個のプローブの代わりに本発
明のプローブを用いて下記の条件で本発明のＰＣＲを行
った。 ａ）標的核酸：大腸菌の１６Ｓ−ｒＤＮＡ ｂ）使用プライマー： ・フォワードプライマー E8F：(5')AGAGTTTGAT CCTGGC
TCAG(3') ・リバースプライマー E1492R：(5')GGTTACCTTG TTACG
ACTT(3') ｃ）使用プローブ：BODIPY FL-(5')CGGGCGGTGT GTAC
(3') ｄ）使用ＰＣＲ測定機器：ライトサイクラー^TMシステム ｅ）ＰＣＲの条件： 変性反応 ：９５℃、１０秒（第一回のみ、６０
秒間、９５℃） アニーリング反応：５０℃、５秒 核酸伸長反応 ：７２℃、７０秒 全サイクル数 ：７０サイクル

【０１８６】

【０１８７】その結果を図１２に示した。図から、蛍光
色素の発光の減少が観察される時点のサイクル数と標的
核酸の大腸菌１６ＳｒＤＮＡのコピー数が比例している
ことが分かる。以上の結果から分かるように、本発明の
定量的ＰＣＲ方法を用いると標的核酸の当初のコピー数
を測定できるようになる。即ち、標的核酸の測定ができ
る。

【０１８８】次に以下の実施例に、上記の本発明の定量
的ＰＣＲ方法を用いて得られるデータを解析する本発明
のデータ解析方法について記す。 実施例２１ ヒトゲノムＤＮＡ（ヒトβ−グロビン（globin）（TaKa
Raカタログ商品番号９０６０）（TaKaRa株式会社製）
（以下、ヒトゲノムＤＮＡという。）を標的核酸とし
て、当該核酸の増幅のためのボデピー FL/C6で標識した
プライマーを調製した。

【０１８９】プライマーKM38+C（リバース型）の調製：
（5')CTGGTCTCCT TAAACCTGTC TTG(3')の塩基配列をもつ
オリゴデオキシリボヌクレオチドを、ＤＮＡ合成機ABI3
94(Perkin Elmer社製、米国）を用いて合成し、更に当
該オリゴデオキシリボヌクレオチドの５’末端のリン酸
基をホスファターゼ処理してシトシンとし、そのシトシ
ンの５’位の炭素ＯＨ基に、-(CH₂)₉-NH₂を結合したも
のを、ミドランド・サーテイファイド・レージンド・カ
ンパニー社から購入した。更に、モレキュラープローブ
社からリポーターキット（FluoReporter Kit)F-6082
（ボデピーFL/C6のプロピオン酸サクシニミジルエステ
ル(BODIPY FL propionic acid succinimidylesters)の
他に、当該化合物をオリゴヌクレオチドのアミン誘導体
に結合させる試薬を含有するキット）を購入した。前記
購入したオリゴヌクレオチドに当該キットを作用させ
て、本発明のボデピーFL/C6で標識したプライマーKM38+
Cを合成した。

【０１９０】合成物の精製：得られた合成物を乾固し乾
固物を得た。それを0.5M Na₂CO₃/NaHCO₃緩衝液(pH9.0)
に溶解した。当該溶解物をNAP-25カラム（ファルマシア
社製）でゲルろ過を行い、未反応物を除去した。更に逆
相HPLC(B gradient:15〜65%、25分間）を以下の条件で
行った。そして、溶出するメインピークを分取した。分
取した画分を凍結乾燥して本発明のプライマーKM38+C
を、最初のオリゴヌクレオチド原料2mMより５０％の収
率で得た。

【０１９１】

【０１９２】実施例２１ プライマーKM29（フォワード型）の調製：(5')GGTTGGCC
AA TCTACTCCCA GG(3')の塩基配列をもつオリゴデオキシ
リボヌクレオチドを実施例１８と同様に合成した。

【０１９３】比較実験例１ 本比較実験例は、核酸伸長反応時の蛍光強度値を、熱変
性反応時の蛍光強度値を用いて割る演算処理過程（数式
（１）の処理）を有しないデータ解析用ソフトウエアの
使用に係るものである。上記のヒトゲノムＤＮＡ、プラ
イマーKM38+C及びプライマーKM29を使用して、ライトサ
イクラー ^TMシステムを用いてＰＣＲ反応を行い、各サ
イクル毎の蛍光強度を測定した。尚、本比較実施例のＰ
ＣＲは、前記に説明した蛍光色素色素で標識したプライ
マーを用いるものであり、蛍光発光の増加でなく、減少
を測定する新規なリアルタイム定量的ＰＣＲ方法であ
る。データ解析は当該システムのソフトウエアを用いて
行った。本比較実験例のＰＣＲは、当該手順書に記され
ている核酸プローブ（ＦＲＥＴ現象を利用する二個のプ
ローブ）と通常のプライマー（蛍光色素で標識されてい
ない通常のプライマー）の代りに本発明プライマーKM38
+C及びKM29を用いる以外は当該装置の手順書通りに行っ
た。

【０１９４】ＰＣＲは次のコンポーネントのハイブリダ
イゼーション溶液中で行った。 尚、ヒトゲノムＤＮＡは、図１３の簡単な説明欄に示さ
れる実験区の濃度で実験を行った。MgCl₂の最終濃度は2
mMであった。

【０１９５】また、上記のTaq溶液は次に試薬の混合液
である。

【０１９６】尚、Taq溶液、 Taq DNA ポリメラーゼ溶液
はロシュ・ダイアグノスティックス株式会社発売のＤＮ
Ａマスターハイブリダイゼーションプローブ（DNA Mast
er Hybridization Probes）キットのものである。特に
Ｔaq DNA ポリメラーゼ溶液は10×conc.（赤いキャッ
プ）を１０倍に希釈して用いた。また、Ｔaqスタート
は、クローンテック社（ＵＳＡ）より販売されているTa
q DNA ポリメラーゼ用の抗体で、これを反応液に添加す
ることで７０℃までTaq DNAポリメラーゼの活性を抑え
ることができる。即ち、ホット・スタートを行うことが
できるものである。

【０１９７】反応条件は次の如くである。 測定は、ライトサイクラー^TMシステムを用いて行った。
その際、該システムにあるＦ１〜３の検出器にうち、Ｆ
１の検出器を用い、その検出器のゲインは１０、励起強
度は７５に固定した。

【０１９８】前記の如くにＰＣＲを行って、各サイクル
の蛍光強度を実測した。その結果を図１３に示す。即
ち、各コピー数のヒトゲノムＤＮＡについて、各サイク
ルの変性反応時及び核酸伸長反応時の蛍光強度を測定
し、印字したものである。どのサイクルにおいても変性
反応時には蛍光強度値は一定であるが、核酸伸長反応時
には、２５サイクル目当たりから蛍光強度が減少してい
るのが観察される。そうして、減少はヒトゲノムＤＮＡ
のコピー数が多い順に起こることが分かる。

【０１９９】図１３に示すようにヒトゲノムＤＮＡの各
コピー数について初期のサイクル数の蛍光強度値が一様
でなかった。それで、本比較例で使用するデータ解析方
法に以下の過程（ｂ）〜（ｊ）を追加した。 （ｂ）１０サイクル目の蛍光強度値を１として各サイク
ルの蛍光強度値を換算する過程、即ち、下記の〔数式
８〕による計算をする過程、 Ｃ_n＝Ｆ_n（７２）／Ｆ₁₀（７２） 〔数式８〕 ただし、Ｃ_n＝各サイクルにおける蛍光強度値の換算
値、Ｆ_n（７２）＝各サイクルの７２℃の蛍光強度値、
Ｆ₁₀（７２）＝１０サイクル目の７２℃における伸長反
応後の蛍光強度値。 （ｃ）前記（ｂ）の過程で得られた各換算値を、サイク
ル数の関数として、デスプレー上に表示及び／又は印字
する過程、

【０２００】（ｄ）前記（ｂ）の過程で得られた各サイ
クルの換算値から下記の〔数式９〕による蛍光強度の変
化率（減少率、消光率）を計算をする過程、 〔数式９〕 Ｆ_dn ＝ｌｏｇ₁₀｛１００−Ｃ_n×１００）｝ Ｆ_dn ＝２ｌｏｇ₁₀｛１−Ｃ_n｝ ただし、Ｆ_dn＝蛍光強度変化率（減少率、消光率）、Ｃ
_n＝〔数式８〕で得られた値。 （ｅ）前記（ｄ）の過程で得られた各換算値を、サイク
ル数の関数として、デスプレー上に表示及び／又は印字
する過程、

【０２０１】（ｆ）前記（ｄ）の過程で処理されたデー
タを、スレッシュホールド（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）とし
ての０．５と比較し、その値に達したサイクル数を計数
する過程、 （ｇ）前記（ｆ）の過程で計数した値をＸ軸に、反応開
始前のコピー数をＹ軸にプロットしたグラフを作成する
過程、 （ｈ）前記（ｇ）の過程で作成したグラフをデスプレー
上に表示及び／又は印字する過程、 （ｉ）前記（ｈ）の過程で描かれた直線の相関係数又は
関係式を計算する過程、 （ｊ）前記（ｉ）の過程で計算された相関係数又は関係
式をデスプレー上に表示及び／又は印字する過程。

【０２０２】上記のデータ解析用ソフトウエアを用い
て、前記図１３で得られたデータを前記に引き続いて以
下のように処理した。図１４は、上記（ｂ）の過程で処
理されたデータを印字した（前記（ｃ）過程）したもの
である。即ち、１０サイクル目の蛍光強度値を１として
各サイクルの蛍光強度を換算し、その換算値を対応する
サイクル数に対してプロットしたものである。図１５
は、前記（ｄ）の過程で処理したデータを印字した（前
記（ｅ）過程）ものである。即ち、図１４の各プロット
値から蛍光強度の減少率（消光率）を計算して、各計算
値を各サイクル数に対してプロットしたものである。

【０２０３】図１６は、前記（ｆ）の過程で処理したデ
ータについて、前記（ｇ）の過程で作成したグラフを印
字した（前記（ｈ）の過程）ものである。即ち、蛍光強
度減少率＝０．５をスレッシュホールド（threshold）
し、その値に達したサイクル数をＸ軸に、ヒトゲノムＤ
ＮＡの反応開始前のコピー数をＹ軸にプロットしたグラ
フである。このグラフの直線の相関係数（Ｒ２）を前記
（ｉ）の過程で計算し、印字した（前記（ｊ）の過程）
もので、０．９５１４であった。このように、この相関
係数では正確なコピー数を求めるは無理であった。

【０２０４】実施例２３（本発明のデータ解析方法を用
いてデータ処理がなされた実験例）ＰＣＲは比較実験例
１と同様に行った。データ処理は、比較実験例１の
（ｂ）の過程の前に下記の（ａ）の過程をおき、
（ｂ）、（ｄ）の過程を以下のように変更する以外は比
較実験例１と同様な過程で行った。 （ａ）各サイクルにおける増幅した核酸が本発明の核酸
プローブである（蛍光色素で標識された）核酸プライマ
ーとハイブリダイズしたときの反応系の蛍光強度値（即
ち、核酸伸長反応時（７２℃）の蛍光強度値）を、核酸
ハイブリッド複合体（増幅した核酸が核酸プライマーと
ハイブリダイズしたもの）が解離したときに測定された
反応系の蛍光強度値（即ち、核酸熱変性反応完了時（９
５℃）の蛍光強度値）で割る補正演算処理過程、即ち、
実測の蛍光強度値を次の〔数式１〕で補正した。 ｆ_n＝ｆ_hyb,n／ｆ_den,n 〔数式１〕 ［式中、ｆ_n＝サイクルの蛍光強度の補正値、ｆ_hyb,n＝
各サイクルの７２℃の蛍光強度値、ｆ_den,n＝各サイク
ルの９５℃の蛍光強度値］ 得られた値を各サイクル数に対してプロットしたのが図
１７である。

【０２０５】（ｂ）各サイクルにおける〔数式１〕にお
ける補正演算処理値を〔数式３〕に代入し、各サイクル
における各サンプル間の蛍光変化率（減少率又は消光
率）を算出する演算処理過程、即ち、下記の〔数式１
０〕で演算処理する過程、 Ｆ_n＝ｆ_n／ｆ₂₅ 〔数式１０〕 ［式中、Ｆ_n＝各サイクルの演算処理値、ｆ_n＝〔数式
１〕で得られた各サイクルの値、ｆ₂₅＝〔数式１〕で得
られた値で、サイクル数が２５回目のもの］。〔数式１
０〕は〔数式３〕において、ａ＝２５とした場合におけ
るものである。

【０２０６】（ｄ）前記（ｂ）の過程で得られた各サイ
クルの演算処理値を〔数式６〕による蛍光強度の変化率
（減少率又は消光率）の対数値を得るための演算処理に
付す過程、即ち、下記の〔数式１１〕で演算処理する過
程、 ｌｏｇ₁₀｛（１−Ｆ_n）×１００｝ 〔数式１１〕 ［式中、Ｆ_n＝［数式１０］で得られた値］。〔数式１
１〕は〔数式６〕において、ｂ＝１０、Ａ＝１００とし
た場合におけるものである。

【０２０７】上記の結果を図１８及び１９に示した。図
１８は、前記（ａ）及び（ｂ）の過程で処理された値を
サイクル数に対してプロットし、印字したものである。
図１９は、図１８で得られた値を前記（ｄ）の過程のよ
うに処理して得られた値を、サイクル数に対してプロッ
トし、印字したものである。

【０２０８】次に、図１９のグラフを基に、前記
（ｆ）、（ｇ）、及び（ｈ）の過程で処理した。即ち、
図１９のグラフを基に比較実験例１と同様に、ｌｏｇ₁₀
（蛍光強度変化率）のスレッシュホールド値として、
０．１、０．３、０．５、０．７、０．９、１．２を選
び、その値に達したサイクル数をＸ軸に、ヒトゲノムＤ
ＮＡの反応開始前のコピー数をＹ軸にプロットし、検量
線を描かせた。その結果を図２０に示した。これらの検
量線について前記（ｉ）及び（ｊ）の過程で処理して求
めた相関係数（Ｒ²）は、前記各スレッシュホールド値
に対して、各々０．９９８、０．９９９、０．９９９
３、０．９９８５、０．９９８９、０．９９８８であっ
た。これらの相関係数から、スレッシュホールド値とし
て０．５（相関係数０．９９９３）を採用することが望
ましいことが認識できた。この相関係数をもつ検量線で
あれば、未知コピー数の核酸試料について反応開始前の
コピー数を精度よく求めることができることが分かる。

【０２０９】実施例２４（核酸の融解曲線分析及びＴｍ
値分析の例） 本発明の新規なＰＣＲ法により増幅された核酸につい
て、５１）低い温度から核酸が完全に変性するまで、温
度を徐々に上げるあるいは下げる過程（例えば、５０℃
から９５℃まで）、５２）前記５１）過程において、短
い時間間隔（例えば、０．２℃〜０．５℃の温度上昇に
相当する間隔）で蛍光強度を測定する過程、５３）前記
５２）過程の測定結果を時間の関数としてデスプレー上
に表示する過程、即ち、核酸の融解曲線を表示する過
程、５４）前記５３）過程の融解曲線を一次微分する過
程、５５）前記５４）過程の微分値（−ｄＦ／ｄＴ、
Ｆ：蛍光強度、Ｔ：時間）をデスプレー上に表示する過
程、５６）前記５５）から得られる微分値から変曲点を
求める過程からなるソフトウエアを作成し、前記本発明
のデータ解析用ソフトウエアに合体した。当該データ解
析用ソフトウエアを記録したコンピューター読み取り可
能な記録媒体をインストールした前記ライトサイクラー
^TMシステムを用いて本発明の新規リアルタイム定量的Ｐ
ＣＲ反応を行い、核酸融解曲線の分析を行った。本発明
においては、蛍光強度は温度が上がるごとに増加する。

【０２１０】実施例２３と同じヒトゲノムＤＮＡの１コ
ピーと１０コピーについて、実施例２１と同様のＰＣＲ
を行い、前記５１）、５２）、５３）、５４）及び５
５）の過程で処理されたデータを印字したものが図２１
である。１コピーと１０コピーの７５回目の増幅産物に
ついて、本実施例の５１）、５２）及び５３）の過程で
処理した核酸融解曲線の図が図２２である。５４）の過
程でこの曲線を微分し、５５）及び５６）の過程で変曲
点（Ｔｍ値）を求めたものが図２３である。図２３か
ら、１コピーと１０コピーの増幅産物のＴｍ値が異なる
故に、各増幅産物は異なる産物であることが判明した。

【０２１１】

【発明の効果】本発明は次のような効果を有する。 １）本発明の標的核酸の濃度を測定する方法、本発明の
各種の核酸プローブ、特に2-O-アルキルオリゴヌクレオ
チド若しくは2-O-アルキレンオリゴヌクレオチド、2-O-
ベンジルオリゴヌクレオチドなど化学的修飾オリゴヌク
レオチドなどからなる本発明の核酸プローブ、またオリ
ゴリボヌクレオチドとオリゴデオキシリボヌクレオチド
が介在するキメリックオリゴヌクレオチドなどからなる
本発明の核酸プローブ、それらの本発明の核酸プローブ
を含有若しくは付帯する、標的核酸の濃度を測定する測
定キット、及び前記の本発明の核酸プローブを結合して
なるＤＮＡチップなどの核酸チップ若しくは核酸デバイ
スを用いると、測定系から未反応の核酸プローブを除く
等の操作をすることがないので、標的核酸の濃度を短時
間でかつ簡便に測定できる。また、複合微生物系又は共
生微生物系に適用すると、当該系における特定菌株の存
在量を特異的かつ短時間に測定できる。また、本発明は
標的核酸若しくは遺伝子のＳＮＰなどの多型又は変異な
どの解析若しくは測定する簡便な方法を提供している。

【０２１２】２）また、本発明の定量的ＰＣＲ方法は、
次のような効果を有する。 ａ．ＴａｑＤＮＡポリメラーゼによる標的核酸の増幅に
阻害的に作用する因子が添加されていないことから、従
来公知の特異性のある通常のＰＣＲと同様の条件で定量
的ＰＣＲを行うことができる。 ｂ．また、ＰＣＲの特異性を高く保つことができるの
で、プライマーダイマーの増幅が遅くなることから、従
来公知の定量的ＰＣＲと比較すると定量限界が約１桁の
オーダー低くなる。 ｃ．複雑な核酸プローブを用意する必要がないので、そ
れに要する時間と費用が節約できる。 ｄ．標的核酸の増幅効果も大きく、増幅過程をリアルタ
イムでモニタリングすることができる。

【０２１３】３）また、リアルタイム定量的ＰＣＲ方法
で得られたデータを解析する際、本発明のデータ解析方
法を用いて、未知核酸コピー数の核酸試料について核酸
のコピー数を求める検量直線を作成すると、検量線の相
関係数は従来の方法により得られたものに較べて格段に
高い。それで、本発明のデータ解析方法を用いると核酸
の正確なコピー数を求めることができる。

【０２１４】４）また、本発明のリアルタイム定量的Ｐ
ＣＲ方法によって得られたデータの解析方法に係るデー
タ解析用ソフトウエア、また、その解析方法の手順をプ
ログラムとして記録したコンピュータ読み取り可能な記
録媒体、また、それを用いたリアルタイム定量的ＰＣＲ
の測定若しくは解析装置を用いると、相関係数の高い検
量直線を自動的に作成することができる。

【０２１５】５）また、本発明の新規な核酸の融解曲線
の分析方法を用いると、精度の高い、核酸のＴｍ値を求
めることができる。更に、当該方法に係るデータ解析用
ソフトウエア、また、その分析方法の手順をプログラム
として記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体、
また、それを用いたリアルタイム定量的ＰＣＲの測定若
しくは解析装置を用いると、正確なＴｍ値を求めること
ができる

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１で得た核酸プローブを用いて大腸菌の
１６ＳｒＲＮＡの５´末端から数えて３３５から３５８
番目の核酸塩基配列を測定した場合の蛍光強度測定デー
タを示す図。

【図２】３５塩基鎖2-O-Meプローブの標的核酸へのハイ
ブリダイゼーションに対する熱処理の効果 点線：rRNAを加熱処理後，標的核酸が添加された。 実線：非加熱処理rRNA．

【図３】プローブと標的核酸１６ＳｒＲＮＡのハイブリ
ダイゼーションに対するプローブの塩基鎖の塩基数、ヘ
ルパープローブ及びプローブの５’末端のリボースの
２’位炭素ＯＨ基のメチル基修飾の効果

【図４】本発明方法によるｒＲＮＡ測定のための検量線

【図５】ＫＹＭ７株及びＫＹＭ８株の複合培養系のｒＲ
ＮＡ量の時間経過についての本発明のＦＩＳＨ方法によ
る分析

【図６】本発明のＤＮＡチップを説明する図。

【図７】本発明のＤＮＡチップを用いるＳＮＰｓ検出測
定のための装置類を説明する図。

【図８】本発明のＤＮＡチップを用いるＳＮＰｓ検出測
定の実験結果を示す図。

【図９】ボデピーFL/C6で標識したプライマー１及び２
を用いた定量的ＰＣＲ方法：サイクル数と蛍光色素の発
光の減少量の関係を示す図。図中の〜なる記号は、
下記の意味を表す。

【図１０】ボデピーFL/C6で標識したプライマー１及び
２を用いた定量的ＰＣＲ方法：サイクル数と蛍光色素の
発光の減少量の対数値の関係を示す図。図中の〜な
る記号は、図９と同じ意味を表す。

【図１１】本発明の定量的ＰＣＲ方法を用いて作成した
大腸菌１６ＳｒＤＮＡの検量線を示す図。ｎ：１０ⁿ

【図１２】上図は、ＦＲＥＴ現象を用いるリアルタイム
定量的ＰＣＲ方法において使用する蛍光色素で標識した
二つのプローブの代わりに、本発明の一つのプローブを
用いてリアルタイム定量的ＰＣＲを行った場合の蛍光強
度の減少率の変化を示す図である。下図は蛍光強度の減
少が有為に観察され始めるサイクル数（thresholdnumbe
r：Ct値）を算出し、検量線を作成した図である。

【図１３】本発明の補正演算処理しない場合の、本発明
のボデピーFL/C6で標識したプライマーを用いたリアル
タイム定量的ＰＣＲによって得られた蛍光減少曲線を示
す図。 ■：標的核酸＝１０コピー；蛍光強度測定の反応系の温
度＝７２℃ ●：標的核酸＝１００コピー；蛍光強度測定の反応系の
温度＝７２℃ ▲：標的核酸＝１０００コピー；蛍光強度測定の反応系
の温度＝７２℃ ◆：標的核酸＝１００００コピー；蛍光強度測定の反応
系の温度＝７２℃ □：標的核酸＝１０コピー；蛍光強度測定の反応系の温
度＝９５℃ ○：標的核酸＝１００コピー；蛍光強度測定の反応系の
温度＝９５℃ △：標的核酸＝１０００コピー；蛍光強度測定の反応系
の温度＝９５℃ ◇：標的核酸＝１００００コピー；蛍光強度測定の反応
系の温度＝９５℃

【図１４】各曲線の１０サイクル目の値を１として補正
する以外は、図１３の曲線の場合と同様にしたリアルタ
イム定量的ＰＣＲによって得られた蛍光減少曲線を示す
図。 ■：標的核酸＝１０コピー；蛍光強度測定温度＝７２℃ ●：標的核酸＝１００コピー；蛍光強度測定温度＝７２
℃ ▲：標的核酸＝１０００コピー；蛍光強度測定温度＝７
２℃ ◆：標的核酸＝１００００コピー；蛍光強度測定温度＝
７２℃ ５：標的核酸＝１００００コピー；蛍光強度測定温度＝
７２℃

【図１５】図１４の各曲線の各プロット値について、
［数式９］の蛍光強度減少率（変化率）を計算し、計算
値をプロットした曲線を示す図。 ■：標的核酸＝１０コピー ●：標的核酸＝１００コピー ▲：標的核酸＝１０００コピー ◆：標的核酸＝１００００コピー

【図１６】図１５のデータから求めたヒトゲノムＤＮＡ
の検量直線を示す図。 ｙ＝ヒトβ−グロビン遺伝子コピー数 ｘ＝サイクル数（Ｃｔ） Ｒ²＝相関係数

【図１７】図１３の各サイクルの測定値を〔数式１〕で
補正演算処理した値を各サイクル数に対してプロットし
た曲線を示す図。 ■：標的核酸＝１０コピー ●：標的核酸＝１００コピー ▲：標的核酸＝１０００コピー ◆：標的核酸＝１００００コピー

【図１８】図１７の各サイクルの演算処理値を〔数式
３〕で演算処理した値をサイクル数に対してプロットし
た曲線を示す図。 ■：標的核酸＝１０コピー ●：標的核酸＝１００コピー ▲：標的核酸＝１０００コピー ◆：標的核酸＝１００００コピー

【図１９】図１８の各サイクルの演算処理値を〔数式
６〕の式で演算処理した値をサイクル数に対してプロッ
トした曲線を示す図。 ■：標的核酸＝１０コピー ●：標的核酸＝１００コピー ▲：標的核酸＝１０００コピー ◆：標的核酸＝１００００コピー

【図２０】図１８の各log（蛍光変化率）値からＣｔ値
の候補として、０．１、０．３、０．５、０．７、０．
９、１．２を適当に選んで、それに対応する検量直線を
描かせた場合の図。尚、各検量線における相関係数を下
記に示した。 ▲：log₁₀（蛍光変化率）＝０．１；相関係数＝０．９
９８ ■：log₁₀（蛍光変化率）＝０．３；相関係数＝０．９
９９ ●：log₁₀（蛍光変化率）＝０．５；相関係数＝０．９
９９３ △：log₁₀（蛍光変化率）＝０．７；相関係数＝０．９
９８５ □：log₁₀（蛍光変化率）＝０．９；相関係数＝０．９
９８９ ○：log₁₀（蛍光変化率）＝１．２；相関係数＝０．９
９８８

【図２１】１コピー及び１０コピーのヒトゲノムＤＮＡ
について、本発明のボデピーFL/C6で標識したプライマ
ーを用いてリアルタイム定量的ＰＣＲを行った場合の蛍
光減少曲線を示す図。ただし、〔数式１〕の補正演算処
理を施した。 １：標的核酸＝０コピー ２：標的核酸＝１コピー ３：標的核酸＝１０コピー

【図２２】図２１に示されるＰＣＲの増幅産物について
の核酸の融解曲線分析を行った場合の核酸の融解曲線を
示す図。 １：標的核酸＝０コピー ２：標的核酸＝１コピー ３：標的核酸＝１０コピー

【図２３】図２２の曲線を微分して得られた、Ｔｍ値を
示す曲線を示す図（谷がＴｍ値）。 ２：標的核酸＝１コピー ３：標的核酸＝１０コピー

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 37/00 １０２ ５Ｂ０５６ 33/566 Ｇ０６Ｆ 17/10 Ｚ 33/58 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 37/00 １０２ Ｆ Ｇ０６Ｆ 17/10 Ｇ０１Ｎ 1/28 Ｋ Ｊ (72)発明者 倉根 隆一郎 茨城県つくば市東１−１−１ 独立行政法 人産業技術総合研究所 つくばセンター内 (72)発明者 金川 貴博 茨城県つくば市東１−１−１ 独立行政法 人産業技術総合研究所 つくばセンター内 (72)発明者 鎌形 洋一 茨城県つくば市東１−１−１ 独立行政法 人産業技術総合研究所 つくばセンター内 (72)発明者 鳥村 政基 茨城県つくば市東１−１−１ 独立行政法 人産業技術総合研究所 つくばセンター内 (72)発明者 蔵田 信也 東京都千代田区東神田１−９−８ 環境エ ンジニアリング株式会社内 (72)発明者 山田 一隆 東京都千代田区東神田１−９−８ 環境エ ンジニアリング株式会社内 (72)発明者 横幕 豊一 東京都千代田区東神田１−９−８ 環境エ ンジニアリング株式会社内 Ｆターム(参考） 2G045 AA35 AA40 BB20 CB17 CB20 CB21 DA12 DA13 DA14 FA16 FA19 FA29 FA33 FB02 FB06 FB13 FB16 GC15 JA01 JA02 JA04 JA20 2G052 AA35 AA36 AA37 AB20 AD46 DA08 EB11 GA20 GA23 GA30 GA31 HA17 HB07 HB08 HB10 HC03 HC04 HC22 HC44 JA03 JA07 JA09 JA16 4B024 AA11 AA20 CA01 CA09 CA12 HA14 HA19 4B029 AA23 BB20 CC03 4B063 QA01 QA08 QA13 QA17 QQ42 QQ53 QR08 QR55 QR58 QR62 QR82 QS25 QS34 QX02 5B056 AA04 BB00 HH00

Claims (50)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 蛍光色素で標識された核酸プローブを用
   いる核酸測定方法において、前記核酸プローブが標的核
   酸にハイブリダイゼーションしたときに、蛍光色素が、
   その発光を減少させる核酸プローブであり、前記核酸プ
   ローブを標的核酸にハイブリダイゼーションさせ、ハイ
   ブリダイゼーション前後における蛍光色素の発光の減少
   量を測定することを特徴とする標的核酸の濃度の測定方
   法。
2. 【請求項２】 蛍光色素で標識された核酸プローブが標
   的核酸にハイブリダイゼーションしたときに、前記蛍光
   色素が、その発光を減少させる核酸プローブであり、か
   つ、当該プローブは、その末端部において前記蛍光色素
   で標識されており、当該核酸プローブが当該末端部にお
   いて標的核酸にハイブリダイゼーションしたとき、当該
   プローブにハイブリダイゼーションした標的核酸の末端
   塩基から１ないし３塩基離れて、標的核酸の塩基配列に
   Ｇ（グアニン）が少なくとも１塩基存在するように、当
   該プローブの塩基配列が設計されていることを特徴とす
   る標的核酸の濃度測定用の蛍光色素で標識された核酸プ
   ローブ。
3. 【請求項３】 核酸プローブが３’末端において蛍光色
   素で標識されている請求項２に記載の標的核酸の濃度測
   定用の蛍光色素で標識された核酸プローブ。
4. 【請求項４】 核酸プローブが５’末端において蛍光色
   素で標識されている請求項２に記載の標的核酸の濃度測
   定用の蛍光色素で標識された核酸プローブ。
5. 【請求項５】 蛍光色素で標識された核酸プローブが標
   的核酸にハイブリダイゼーションしたときに、上記蛍光
   色素が、その発光を減少させる核酸プローブであり、か
   つ、当該プローブは、その末端部において前記蛍光色素
   で標識されており、当該核酸プローブが、前記標的核酸
   にハイブリダイゼーションしたとき、当該末端部分にお
   いてプローブ−核酸ハイブリッドの複数塩基対が少なく
   とも一つのＧ（グアニン）とＣ（シトシン）のペアーを
   形成するように、当該プローブの塩基配列が設計されて
   いることを特徴とする標的核酸の濃度測定用の蛍光色素
   で標識された核酸プローブ。
6. 【請求項６】 核酸プローブの３’末端塩基がＧ又はＣ
   で、かつ３’末端が蛍光色素で標識されている請求項５
   に記載の標的核酸の濃度測定用の蛍光色素で標識された
   核酸プローブ。
7. 【請求項７】 核酸プローブの５’末端塩基がＧ又はＣ
   で、かつ５’末端が蛍光色素で標識されている請求項５
   に記載の標的核酸の濃度測定用の蛍光色素で標識された
   核酸プローブ。
8. 【請求項８】 核酸プローブが、３’末端のリボース若
   しくはデオキシリボースの３’炭素の水酸基、又は３’
   末端のリボースの３’若しくは２’炭素の水酸基がリン
   酸化されている請求項４又は７に記載の標的核酸の濃度
   測定用の蛍光色素で標識された核酸プローブ。
9. 【請求項９】 核酸測定用核酸プローブのオリゴヌクレ
   オチドが、化学的に修飾した核酸であるである請求項１
   〜８の何れか１項に記載の標的核酸の濃度測定用の蛍光
   色素で標識された核酸プローブ。
10. 【請求項１０】 化学的に修飾した核酸が2'-O-メチル
    オリゴヌクレオチド、2'-O-エチルオリゴヌクレオチ
    ド、2'-O-ブチルオリゴヌクレオチド、2'-O-エチレンオ
    リゴヌクレオチド、又は2'-O-ベンジルオリゴヌクレオ
    チドである請求項９に記載の標的核酸の濃度測定用の蛍
    光色素で標識された核酸プローブ。
11. 【請求項１１】 核酸測定用核酸プローブのオリゴヌク
    レオチドが、リボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオ
    チドを含むキメリックオリゴヌクレトチド（chimeric o
    ligonucleotide)である請求項２〜８の何れか１項に記
    載の標的核酸の濃度測定用の蛍光色素で標識された核酸
    プローブ。
12. 【請求項１２】 キメリックオリゴヌクレトチドが、2'
    -O-メチルオリゴリボヌクレオチド、2'-O-エチルオリゴ
    ヌクレオチド、2'-O-ブチルオリゴヌクレオチド又は2'-
    O-ベンジルオリゴヌクレオチドを介在するものである請
    求項１１に記載の標的核酸の濃度測定用の蛍光色素で標
    識された核酸プローブ。
13. 【請求項１３】 請求項２〜８の何れか１項に記載の核
    酸測定用核酸プローブを、標的核酸にハイブリダイゼー
    ションさせ、ハイブリダイゼーション前後における蛍光
    色素の発光の減少量を測定することを特徴とする標的核
    酸の濃度測定方法。
14. 【請求項１４】 請求項９〜１２の何れか１項に記載の
    核酸測定用核酸プローブを、標的核酸にハイブリダイゼ
    ーションさせ、ハイブリダイゼーション前後における蛍
    光色素の発光の減少量を測定することを特徴とする標的
    核酸の濃度測定方法。
15. 【請求項１５】 標的核酸をその高次構造が十分に破壊
    されるに適した条件で加熱処理後、核酸プローブと標的
    核酸をハイブリダイゼーションさせる請求項１４に記載
    の標的核酸の濃度測定方法。
16. 【請求項１６】 ハイブリダイゼーション反応前にハイ
    ブリダイゼーション反応系にハイブリダイゼーション反
    応実施のためのヘルパープローブを添加する請求項１４
    又は１５に記載の標的核酸の濃度測定方法。
17. 【請求項１７】 ヘルパープローブの塩基配列が（5')T
    CCTTTGAGT TCCCGGCCGG A(3')又は／及び(5')CCCTGGTCGT
    AAGGGCCATG ATGACTTGAC GT(3')である請求項１６に記
    載の標的核酸の濃度測定方法。
18. 【請求項１８】 加熱処理条件が８０〜１００℃、１〜
    １５分である請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の
    標的核酸の濃度測定方法。
19. 【請求項１９】 標的核酸がＲＮＡである請求項１３〜
    １８のいずれか１項に記載の標的核酸の濃度測定方法。
20. 【請求項２０】 標的核酸の濃度を測定するキットにお
    いて、請求項２〜１２の何れか１項に記載の核酸プロー
    ブを含有又は付帯することを特徴とする標的核酸の濃度
    測定用キット。
21. 【請求項２１】 ヘルパープローブを含有又は付帯する
    請求項２０に記載の標的核酸の濃度測定用キット。
22. 【請求項２２】 標的核酸の多型（polymorphism）又は
    ／及び変異（mutation）を解析若しくは測定する方法に
    おいて、請求項２〜１２の何れか１項に記載の核酸プロ
    ーブを標的核酸にハイブリダイゼーションさせ、蛍光強
    度の変化量を測定することを特徴とする標的核酸の多型
    又は／及び変異を解析若しくは測定する方法。
23. 【請求項２３】 標的核酸の多型又は／及び変異を解析
    若しくは測定する測定キットにおいて、請求項２〜１２
    の何れか１項に記載の核酸プローブを含有することを特
    徴とする標的核酸の多型又は／及び変異を解析若しくは
    測定するための測定キット。
24. 【請求項２４】 ヘルパープローブを含有又は付帯する
    請求項２３に記載の標的核酸の多型又は／及び変異を解
    析若しくは測定するための測定キット。
25. 【請求項２５】 請求項２２に記載の方法により得られ
    るデータを解析する方法において、標的核酸が蛍光色素
    で標識された核酸プローブとハイブリダイズしたときの
    反応系の蛍光強度値を、前記のハイブリダイズしていな
    いときの反応系の蛍光強度値により補正処理する過程を
    有することを特徴とする標的核酸の多型又は／及び変異
    を解析若しくは測定する方法のためのデータ解析方法。
26. 【請求項２６】 標的核酸の多型又は／及び変異を解析
    若しくは測定する測定装置において、請求項２５に記載
    のデータ解析方法を実施するための手段を有することを
    特徴とする標的核酸の多型又は／及び変異を解析若しく
    は測定する測定装置。
27. 【請求項２７】 請求項２５に記載の補正処理過程をコ
    ンピュータに実行させるための手順をプログラムとして
    記録したコンピュータ読取可能な記録媒体。
28. 【請求項２８】 請求項２〜１２の何れか１項に記載の
    核酸プローブ、又は一つの分子内に二つの異なった蛍光
    色素を有し、標的核酸にハイブリダイゼーションしてい
    ないときは、二つの蛍光色素の相互作用により消光若し
    くは発光しているが、標的核酸にハイブリダイゼーショ
    ンすると発光若しくは消光するように設計された構造を
    もつ別の核酸プローブを複数個固体支持体表面に結合さ
    せ、それに標的核酸をハイブリダイゼーションさせて標
    的核酸の濃度を測定することができるようにしたことを
    特徴とする単数種若しくは複数種の核酸の濃度をそれぞ
    れ測定するためのデバイス。
29. 【請求項２９】 請求項２８に記載の核酸測定用デバイ
    スにおいて、核酸プローブが固体支持体表面にアレー状
    に配列、結合させた単数種若しくは複数種の核酸の濃度
    をそれぞれ測定するためのデバイス（チップ）。
30. 【請求項３０】 固体支持体表面に結合させられた核酸
    プローブ毎に、反対側の表面に少なくとも一つの温度セ
    ンサーとヒーターが設置され、核酸プローブ結合領域が
    最適温度条件になるように温度調節され得る請求項２８
    又は２９に記載の単数種若しくは複数種の核酸の濃度を
    それぞれ測定するためのデバイス。
31. 【請求項３１】 核酸プローブを蛍光色素で標識してい
    ない端部で固体支持体表面に結合させた請求項２８〜３
    ０の何れか１項に記載の単数種若しくは複数種の核酸の
    濃度をそれぞれ測定するためのデバイス。
32. 【請求項３２】 請求項２８〜３０の何れか１項に記載
    の核酸測定用デバイスを用いて標的核酸を測定すること
    を特徴とする標的核酸の濃度測定方法。
33. 【請求項３３】 請求項１、１３〜１９の何れか１項、
    又は請求項３２に記載の核酸の測定方法において、標的
    核酸が、純粋分離して得た微生物由来、又は動物由来で
    あることを特徴とする標的核酸の濃度測定方法。
34. 【請求項３４】 標的核酸が、複合微生物系、又は共生
    微生物系の細胞内若しくは細胞のホモジネートに含まれ
    る核酸である請求項１、１３〜１９の何れか１項、又は
    請求項３２に記載の標的核酸の濃度測定方法。
35. 【請求項３５】 ＰＣＲ方法において、請求項２、３、
    ５、６、又は請求項８〜１２の何れか１項に記載の核酸
    プローブを用いて反応を行い、核酸伸長反応時当該プロ
    ーブがポリメラーゼにより分解除去されている反応系又
    は核酸変性反応時若しくは核酸変性反応が完了している
    反応系の蛍光強度値と標的核酸若しくは増幅標的核酸が
    該核酸プローブとハイブリダイズしているときの反応系
    の蛍光強度値を測定し、前者からの蛍光強度値の減少率
    を算出することを特徴とするＰＣＲで増幅された標的核
    酸の濃度測定方法。
36. 【請求項３６】 ＰＣＲ方法において、請求項４又は７
    に記載の核酸プローブをプライマーとして反応を行い、
    当該プローブと標的核酸若しくは増幅標的核酸がハイブ
    リダイズしていない反応系の蛍光強度値と該核酸プロー
    ブが標的核酸若しくは増幅標的核酸とハイブリダイズし
    ているときの反応系の蛍光強度値を測定し、前者の蛍光
    強度値の減少率を算出することを特徴とするＰＣＲで増
    幅された標的核酸の濃度測定方法。
37. 【請求項３７】 ＰＣＲ方法がリアルタイム定量的ＰＣ
    Ｒ方法である請求項３５又は３６に記載のＰＣＲ方法の
    標的の増幅核酸の濃度測定方法。
38. 【請求項３８】 請求項１、１３〜１９の何れか１項、
    又は請求項３２〜３７の何れか１項に記載の核酸測定法
    で得られたデータを解析する方法において、標的核酸が
    蛍光色素で標識された核酸プローブとハイブリダイズし
    た後の反応系の蛍光強度値を、そのように形成されたプ
    ローブ−核酸ハイブリッド複合体が解離した後で得られ
    る反応系の蛍光強度値により補正することを特徴とする
    標的核酸の濃度測定方法のためのデータ解析方法。
39. 【請求項３９】 請求項３７に記載のリアルタイム定量
    的ＰＣＲ方法で得られたデータを解析する方法におい
    て、各サイクルにおける増幅した核酸が蛍光色素と結合
    した後、あるいは増幅した核酸が蛍光色素で標識された
    核酸プローブとハイブリダイズした後の反応系の蛍光強
    度値を、各サイクルにおける形成された蛍光色素−核酸
    複合体、あるいはそのようにして形成されたプローブ−
    核酸ハイブリッド複合体が解離した後で得られる反応系
    の蛍光強度値により補正する演算処理過程（以下、補正
    演算処理過程という。）を有することを特徴とするリア
    ルタイム定量的ＰＣＲ方法のためのデータ解析方法。
40. 【請求項４０】 請求項３９に記載の補正演算処理過程
    が、次の〔数式１〕あるいは〔数式２〕によるものであ
    る請求項３９に記載のリアルタイム定量的ＰＣＲ方法の
    ためのデータ解析方法。 ｆ_n＝ｆ_hyb,n／ｆ_den,n 〔数式１〕 ｆ_n＝ｆ_den,n／ｆ_hyb,n 〔数式２〕 〔式中、 ｆ_n：〔数式１〕あるいは〔数式２〕により算出された
    ｎサイクルにおける補正演算処理値、 ｆ_hyb,n：ｎ次サイクルにおいて、増幅した核酸が蛍光
    色素と結合した後、あるいは増幅した核酸が蛍光色素で
    標識された核酸プローブとハイブリダイズした後の反応
    系の蛍光強度値、 ｆ_den,n：ｎ次サイクルにおける、形成された蛍光色素
    −核酸複合体、あるいは形成されたプローブ−核酸ハイ
    ブリッド複合体が解離した後の反応系の蛍光強度値〕
41. 【請求項４１】 請求項３７に記載のリアルタイム定量
    的ＰＣＲ方法で得られたデータを解析する請求項４０記
    載の方法において、各サイクルにおける〔数式１〕ある
    いは〔数式２〕により算出された補正演算処理値を次の
    〔数式３〕あるいは〔数式４〕に代入し、各サイクルに
    おける各サンプル間の蛍光変化割合あるいは蛍光変化率
    を算出し、それらを比較することを特徴とするリアルタ
    イム定量的ＰＣＲ方法のためのデータ解析方法。 Ｆ_n＝ｆ_n／ｆ_a 〔数式３〕 Ｆ_n＝ｆ_a／ｆ_n 〔数式４〕 〔式中、 Ｆ_n：ｎ次サイクルにおける、〔数式３〕あるいは〔数
    式４〕により算出された蛍光変化割合あるいは蛍光変化
    率、 ｆ_n：〔数式１〕あるいは〔数式２〕による補正演算処
    理値 ｆ_a：〔数式１〕あるいは〔数式２〕による補正演算処
    理値で、ｆ_nの変化が観察される以前の任意のサイクル
    数のもの〕
42. 【請求項４２】 請求項３７に記載のリアルタイム定量
    的ＰＣＲ方法で得られたデータを解析する請求項４１に
    記載の方法において、 １）〔数式３〕あるいは〔数式４〕により算出された蛍
    光変化割合あるいは蛍光変化率のデータを用いて、〔数
    式５〕、〔数式６〕あるいは〔数式７〕による演算処理
    する過程、 ｌｏｇ_b（Ｆ_n）、ｌｎ（Ｆ_n） 〔数式５〕 ｌｏｇ_b｛（１−Ｆ_n）×Ａ｝、ｌｎ｛（１−Ｆ_n）×Ａ｝ 〔数式６〕 ｌｏｇ_b｛（Ｆ_n−１）×Ａ｝、ｌｎ｛（Ｆ_n−１）×Ａ｝ 〔数式７〕 〔式中、 Ａ、ｂ：任意の数値、 Ｆ_n：〔数式３〕あるいは〔数式４〕により算出された
    ｎ次サイクルにおける蛍光変化割合あるいは蛍光変化
    率〕、 ２）前記１）の演算処理値が一定値に達したサイクル数
    を求める演算処理過程、 ３）既知濃度の核酸試料におけるサイクル数と反応開始
    時の標的核酸のコピー数の関係式を計算する演算処理過
    程、 ４）未知試料におけるＰＣＲ開始時の標的核酸のコピー
    数を求める演算処理過程、を有することを特徴とするリ
    アルタイム定量的ＰＣＲ方法のためのデータ解析方法。
43. 【請求項４３】 標的核酸について請求項２〜１２の何
    れか１項に記載の核酸プローブを用いてＰＣＲを行い、
    標的核酸の融解曲線の分析を行って各増幅核酸のＴｍ値
    を求めることを特徴とする標的核酸の融解曲線の分析方
    法。
44. 【請求項４４】 標的核酸について請求項４又は７に記
    載の核酸プローブをプライマーとして用いてＰＣＲを行
    い、標的核酸の融解曲線の分析を行って各増幅核酸のＴ
    ｍ値を求めることを特徴とする標的核酸の融解曲線の分
    析方法。
45. 【請求項４５】 請求項３９〜４２の何れか１項に記載
    のリアルタイム定量的ＰＣＲ方法のためのデータ解析方
    法において、ＰＣＲ法により増幅された核酸を、低い温
    度から核酸が完全に変性するまで、温度を徐々に上げる
    過程、この過程において、所定の時間間隔で蛍光強度を
    測定する過程、測定結果を時間に対する関数としてデス
    プレー上に表示して核酸の融解曲線をデスプレー上に描
    く過程、この融解曲線を微分して微分した値（−ｄＦ／
    ｄＴ、Ｆ：蛍光強度、Ｔ：時間）得る過程、前記微分し
    た値を微分値としてデスプレー上に表示する過程、その
    微分値から変曲点を求める過程、を有することを特徴と
    するリアルタイム定量的ＰＣＲ方法のためのデータ解析
    方法。
46. 【請求項４６】 請求項３９に記載のデータ解析方法に
    よりデータを解析する過程、請求項４０に記載のデータ
    解析方法によりデータを解析する過程、請求項４１に記
    載のデータ解析方法によりデータを解析する過程、請求
    項４２に記載のデータ解析方法によりデータを解析する
    過程、請求項４５に記載のデータ解析方法によりデータ
    を解析する過程、を実施するための手段をそれぞれ有す
    ることを特徴とするリアルタイム定量的ＰＣＲの測定及
    び／又は解析装置。
47. 【請求項４７】 請求項３９に記載のデータ解析方法に
    よりデータを解析する過程、請求項４０に記載のデータ
    解析方法によりデータを解析する過程、請求項４１に記
    載のデータ解析方法によりデータを解析する過程、請求
    項４２に記載のデータ解析方法によりデータを解析する
    過程、請求項４５に記載のデータ解析方法によりデータ
    を解析する過程を、コンピュータに実行させるための手
    順をプログラムとして記録したコンピュータ読取可能な
    記録媒体。
48. 【請求項４８】 核酸定量方法において、請求項３９〜
    ４２、４５の何れか１項に記載のリアルタイム定量的Ｐ
    ＣＲ方法のためのデータ解析方法を利用することを特徴
    とする核酸の定量方法。
49. 【請求項４９】 核酸定量方法において、請求項４６に
    記載の装置を利用することを特徴とする核酸の定量方
    法。
50. 【請求項５０】 核酸定量方法において、請求項４７に
    記載のコンピュータ読取可能な記録媒体を用いることを
    特徴とする核酸の定量方法。