JP2001522244A

JP2001522244A - パルボウイルスベクターによる標的化した遺伝子改変

Info

Publication number: JP2001522244A
Application number: JP54625098A
Authority: JP
Inventors: ダブリュー．ラッセル，デイビッド; ケイ．ヒラタ，ロリ
Original assignee: University of Washington
Current assignee: University of Washington
Priority date: 1997-04-24
Filing date: 1998-04-20
Publication date: 2001-11-13
Also published as: ATE420157T1; CA2797661A1; US20110097804A1; DE69840439D1; AU744445B2; CA2289277A1; US20120070890A1; CA2289277C; WO1998048005A1; EP0981604A4; EP0981604A1; US7972856B2; CA2797661C; EP0981604B1; AU7252198A; US8846387B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、アデノ随伴ウイルス（AAV）を含むパルボウイルスを用いた脊椎動物細胞における標的化した遺伝子改変を得るための方法を提供する。本発明の方法において使用されるパルボウイルスベクターは、特定の遺伝子改変を、相同対合によって、細胞ゲノムにおける予め選択した標的遺伝子座へと標的化し得る。

Description

【発明の詳細な説明】パルボウイルスベクターによる標的化した遺伝子改変発明の背景発明の技術分野本発明は、パルボウイルスベクター（アデノ随伴ウイルス（AAV）に基づくベクターを含む）を用いた相同対合による、脊椎動物細胞における細胞DNAの標的化改変の分野に関する。背景真核生物ウイルスに基づく組込みベクターの開発は哺乳動物染色体への遺伝子の効率よい導入を可能にしたが、特定の染色体配列を改変して、それにより望ましくない染色体遺伝子型を除去し、そして遺伝子発現に対する位置効果を回避することが好ましい多くの場合が存在する。これは、遺伝子治療において特に真実であり、ここでは、変異遺伝子が優性効果を有し得、そして発現に対する組織特異的な制御がしばしば重要である。遺伝子標的化による規定された変異を哺乳動物染色体に導入するためのこれまでに公知の方法は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、またはマイクロインジェクションを含む（Smithiesら（1985）、Nature 317：230−234； Thomasら（1986）Cell 44：419−428）。これらの方法は、マイクロインジェクションを除いて、総細胞集団のほんの少しの割合において（マウス胚幹細胞の場合は10^-6のオーダーで相同組換え事象を引き起こす（Doetschmanら（1987）Natu re 330：576-578；ThomasおよびCapecchi（1987）Cell 51：503-512））。従って、これらの方法の日常的な使用は、形質転換された細胞の予め選択を必要とするので、正常細胞およびインビボ適用にこの技術を適用することは難しい。マイクロインジェクションは、同様に、日常的使用について適していない。なぜなら、各細胞が個々に、時間がかかり労働集約的な手順を用いて注射されねばならないからである。形質導入ウイルスベクターを使用してこれらの制限を克服し、そして染色体遺伝子標的化実験を達成する試みは、レトロウイルスおよびアデノウイルスベクターを用いて実施されているが、これらの結果は、相同組換えが10^-5〜10^-6細胞で生じるトランスフェクション（EllisおよびBernstein（1989）Mol.Cell.Biol.９：1621-1627；WangおよびTaylor（1993）Mol.Cell.Blol.13:918-927）によって得られ得るよりも有意に良好ではなかった。アデノ随伴ウイルス２（AAV）は、4.7kbの一本鎖DNAウイルスであって、これは哺乳動物染色体への組込みをし得る形質導入ベクターとして開発された（Muzy czka（1992）Curr.Top.Microbiol.Immunol.158：97-129）。3分の2の組込み野生型AAVプロウイルスは、特定のヒト第19染色体部位である19q13-qterに見出される（Kotinら、（1991）Genomics10：831-834；Kotinら（1990）Proc.Nat'l.Acad .Sci.USA 87：2211-2215；Samulskiら（1991）EMBO J．10：3941-3950）。部位特異的な組込み事象は、非相同組換え反応であって、これは、ウイルスRepタンパク質によって媒介されるようである（Giraudら（1995）J.Virol.69：6917-692 4；Lindenら（1996）Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 93:7966-7972）。この特徴は、いくつかの適用において有用であることが判明する一方、ウイルスrep遺伝子において欠失を有するAAVベクターが、同一の遺伝子座において組みこまれることは見い出されていない（Russellら、（1994）Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 91：891 5-8919、Walshら、（1992）Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 89：7257-7261）。組み込まれたrep-AAVベクタープロウイルスのサザン分析は、組込み部位がランダムであることを示唆し（Lebkowskiら（1988）Mol.Cell.Biol.8:3988-3996；McLaughl inら（1988）J.Virol.62:1963-1973；Russellら（1994）前出；Walshら（1992）前出）、そして組込まれたベクターの連結フラグメントの配列決定は、組込みが非相同組換えによって種々の染色体部位において生じることを確認した。従って、脊椎動物細胞ゲノムにおける、選択された標的部位に特異的な遺伝子改変を高頻度で得るための方法に対する必要性が存在する。本発明はこの必要性および他の必要性を満たす。発明の要旨本発明は、予め選択した標的遺伝子座における改変を有する脊椎動物細胞を産生する方法を提供する。この方法は、改変が導入されることを除いて、標的遺伝子座と実質的に同一であるDNA配列を含む標的化構築物を含む組換えウイルスゲノムを含むパルボウイルスベクターと、細胞とを接触させる工程を包含する。組換えウイルスゲノムは、形質導入によって脊椎動物細胞に進入させられ、これは、標的構築物と標的遺伝子座との間の相同対合の結果として、標的遺伝子座へとその改変が導入されることを生じる。この改変は、１つ以上の欠失、挿入、置換、またはそれらの組合せを含み得る。この方法は、第二の改変を除いて第二の標的遺伝子座と少なくとも実質的に同一である第二の標的化構築物を有するパルボウイルスベクターを用いて細胞を形質導入することによって第二の標的遺伝子座へと第二の改変を導入するために使用され得る。さらなる標的遺伝子座は、適切な標的化構築物を有するパルボウイルスベクターを用いる形質導入によって改変され得る。予め選択された標的遺伝子座において細胞またはその細胞の先祖に、その細胞を、導入される改変を除いてその標的遺伝子座と実質的に同一のDNA配列を含む標的化構築物を含む組換えウイルスゲノムを有するパルボウイルスベクターと接触させることによって導入される。特定の遺伝子改変を含む脊椎動物細胞もまた、本発明によって提供される。これらの細胞は、インビトロ、エキソビボで培養され得るか、または生物の部分であり得る。別の実施態様において、本発明は、予め決定された標的遺伝子座に部位特異的な遺伝子改変を有するトランスジェニック動物およびキメラ動物を作製する方法、ならびに、これらの方法を用いて産生されたトランスジェニック動物およびキメラ動物を提供する。本発明はまた、導入される改変を除いて標的遺伝子座と少なくとも実質的に同一であるDNA配列を含む標的化構築物を含む組換えウイルスゲノムを有するパルボウイルスベクターをエキソビボで細胞と接触させることによって、脊椎動物細胞における標的遺伝子座の改変を導入するための方法を提供する。組換えウイルスゲノムは、形質導入によって細胞に進入させられ、その後、標的化構築物と標的遺伝子座との間の相同対合が生じ、これは標的遺伝子座で細胞DNAに導入される改変を生じる。次いで、形質導入された細胞は、脊椎動物に導入される。別の実施態様において、本発明は、パルボウイルスベクターを脊椎動物に投与することによって脊椎動物における細胞において標的遺伝子座の改変を作製するための方法を提供する。これらの方法において使用されるパルボウイルスベクターは、導入される改変を除いて標的遺伝子座と少なくとも実質的に同一であるDN A配列を含む標的化構築物を含む組換えウイルスゲノムを有する。組換えウイルスゲノムは、形質導入によって細胞に進入させられ、その後、相同対合が、標的化構築物と標的遺伝子座との間に生じ、その結果、標的遺伝子座での細胞DNAへ改変が導入される。図面の簡単な説明図1Aは、実施例１に記載される、アデノ随伴ウイルスベクターAAV-SNoriの図である。このベクターは、SV40初期プロモーターおよび細菌性Tn５プロモーターの制御下に、２つのAAV末端反復(TR)、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードする細菌遺伝子（neo）、p15Aプラスミド複製起点、ならびに真核生物ポリアデニル化部位を含む。ベクターAAV-SN039およびAAV-SN0648もまた示し、これらは、それぞれ、neo遺伝子のbp 39およびbp 648において変異を有する。図 1Bは、実施例１において記載されるように改変されたG418耐性HeLa細胞クローン由来のBamHI消化ゲノムDNAのサザンブロット分析の結果を示すオートラジオグラムである。「HeLa」と見出しをつけたレーンは、改変されていないHeLa細胞由来のゲノムDNAに対するneo遺伝子プローブのハイブリダイゼーションを示し、「HS N039」と見出しをつけたレーンは、AAV-SN039の内部部分を含むプラスミドの３つのコピーを含むHSN039細胞に由来するゲノムDNAに対するこのプローブのハイブリダイゼーションを示し、そしてレーン１〜11は、パルボウイルスベクターAA V-SN0648を使用してHSN039細胞を改変することによって得られた11の異なるクローンに対するこのプローブのハイブリダイゼーションを示す。図2Aは、ヒトHPRT遺伝子座、ならびにヒトHPRT遺伝子座を改変するために使用したAAVベクターであるHPe2/3およびHPe2/3Xの図である。HPRT遺伝子の示された部分に加えて、これらのベクターは実施例２に記載され、そしてこれらは２つの AAV末端反復(TR)、および４つのAlu反復（Ｏ、Ｐ、ＱおよびＲと称する）を含む。図2Bおよび2Cは、HindIII（図２B）またはHindIIIおよびPvuI（図２Ｃ）で消化したHT-1080ヒト線維肉腫細胞ゲノムDNAのオートラジオグラムである。「HT10 80」と見出しをつけたレーンは、改変していないHT1080細胞に由来するゲノムDN Aに対する図2Aに示すプローブのハイブリダイゼーションを示し、そしてレーン1 〜13は、AAVベクターAAV-HPe2/3Xを用いた形質導入によって６TG耐性にされた13 個の異なるクローンに由来するゲノムDNAに対するこのプローブのハイブリダイゼーションを示す。図３は、実施例２に記載される実験の結果を示す。ここで、AAVベクターであるAAV-HPe2/3およびAAV-HPe2/3Xを使用して、HT-1080細胞におけるHPRT遺伝子座を改変した。得られた6TG耐性細胞の割合を示す。図４は、HeLa細胞に存在する欠損neo遺伝子がAAVベクターであるAAV-SN0648によって修正される頻度に対する感染多重度の効果の分析結果を示す。この実験は実施例３に記載されている。図５は、実施例４に記載されるような形質導入対トランスフェクションを用いて得られたHSN039細胞におけるneo遺伝子修正の頻度の比較を示す。形質導入はA AVベクターであるAAV-SON648を用いて行ったが、トランスフェクションはプラスミドpASN0648（これは、AAV-SN0648ゲノム全体を含む）、pASN039（これは、neo 遺伝子の塩基対39において変異を含む）、およびpASNori2（これは、neo変異を含まない）を用いて行った。図６は、実施例５に記載されるようなAAVベクターであるAAV-HPe2/3Xを用いる形質導入後の改変されたHPRT遺伝子を有する正常ヒト線維芽細胞の割合を示す。 HPRT改変細胞の割合は、１細胞あたりの感染するAAVゲノムの数に対してプロットする。図７は、４つの異なる正常ヒト線維芽細胞培養物を、AAV-HPe2/3（野生型HPRT 遺伝子）またはAAV-HPe2/3X（これは、HPRT遺伝子においてフレームシフト変異を導入する）のいずれかで形質導入した実験の結果を示す。HPRT遺伝子改変の割合を示す。発明の詳細な説明定義他に規定しない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって共通に理解されるのと同様の意味を有する。本明細書において記載されるのと類似または等価の任意の方法および材料が本発明の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法および材料を記載する。本発明の目的のために、以下の用語を以下に規定する。本明細書において使用される場合、用語「細胞株」とは、それらが言及される細胞株の細胞に由来する限り、個々の細胞、採集された細胞、および細胞を含む培養物をいう。細胞株は、その株が長期間、代表的には少なくとも約6ケ月にわたって生存する場合、「連続」、「不死化」、または「安定」であるといわれる。細胞株であるとみなされるためには、本明細書において使用される場合、細胞は、少なくとも50回の継代にわたって生存しなければならない。対照的に、「初代細胞」または「正常細胞」とは、培養物中で長期に生存しない細胞をいう。用語「シス作用性核酸」とは、核酸配列の生物学的活性をコードするかまたは指向する核酸サブ配列をいう。例えば、シス作用性核酸は、宿主染色体における核酸配列の改変に必要な核酸サブ配列、転写因子をコードするか、または全長核酸配列の複製またはパッケージングを指向する核酸サブ配列、核酸配列のキャプシド化に必要な構造タンパク質をコードする核酸サブ配列、ならびに核酸複製起点を含む。用語「構成性プロモーター」とは、ほとんどの環境および発生条件下で活性であるプロモーターをいう。用語「等価な条件」とは、細胞および細胞による特定の遺伝子の発現に影響を与え得る、発生、環境、増殖期、および他の条件をいう。例えば、ホルモンによる遺伝子発現の誘導が試験される場合、ホルモンのレベルが各細胞についてほぼ同じであるときに２つの細胞は等価な条件下で存在する。同様に、遺伝子発現の細胞周期特異性が検査される場合、２つの細胞が細胞周期のほぼ同じ段階にあるときにその２つの細胞は等価な条件下にある。本明細書において使用される場合、用語「外因性」とは、直接または野生型細胞に存在しない遺伝子からの発現によるかのいずれかで、細胞に添加される部分をいう。細胞の親または初期の先祖に添加され、そして親の細胞から受け継がれた結果として目的の細胞に存在する部分は「外因性」の定義内に含まれる。対照的に、「野生型」とは、外因性部分を含まない細胞をいう。本明細書において使用される場合、「外因性DNA」は、野生型標的細胞におけるDNAと比較して、１つ以上の欠失、点変異、および／または挿入、あるいはそれらの組合せを有するDN Aを含む。本明細書において使用される場合、用語「相同対合」とは、互いに相補的であるかまたは実質的に相補的である、２つの核酸配列またはサブ配列の間に生じ得る対合をいう。２つの配列は、以下に定義するように、配列の一方が第二の配列に相補的な核酸と実質的に同一である場合、互いに実質的に相補的である。用語「宿主細胞」または「標的細胞」とは、特定のベクターで形質導入されるべき細胞をいう。細胞は、必要に応じて、インビトロ細胞（例えば、細胞培養物に由来する細胞）、エキソビボ細胞（例えば、生物に由来する細胞）、およびインビボ細胞（例えば、生物内の細胞）から選択される。２つの核酸またはポリペプチド配列の状況において用語「同一」とは、最大限一致するように整列した場合に、同じである２つの配列における残基をいう。比較のための配列の最適な整列は、例えば、SmithおよびWaterman（1981）Adv.App l.Math.2:482の局所相同性アルゴリズム、NeedlemanおよびWunsch（1970）J.Mol .Biol.48：443の相同性整列アルゴリズム、PearsonおよびLipman（1988）Proc.N atl.Acad.Sci.USA 85：2444の類似性についての検索の方法、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実施（GAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA、Wisco nsin Genetics Software Package、Genetics Computer Group、575 Science Dr. ，Madison、WI）、または検査によって実施し得る。２つの核酸配列が「実質的に同一」であるとの表示は、第一の核酸がコードするポリペプチドが第二の核酸によってコードされるポリペプチドと免疫学的に交叉反応性であることである。２つの核酸配列が実質的に同一であるとの別の表示は、２つの分子および／またはそれらの相補鎖がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。用語「に特異的にハイブリダイズする」とは、特定のヌクレオチド配列が複合混合（例えば、総細胞）DNAまたはRNA中に存在する場合に、ストリンジェントな条件下で特定のヌクレオチド配列にのみ、ある分子が結合、二重鎖形成、またはハイブリダイズすることをいう。用語「ストリンジェントな条件」とは、プローブがその標的サブ配列にハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしない条件をいう。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、そして異なる環境において異なる。長い配列ほど高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェント条件は、規定されたイオン強度およびpHにおける特定の配列についての熱融解点（Tm）より約５℃低く選択される。Tmは、標的配列に相補的なプローブの50％が平衡状態で標的配列に（規定されたイオン強度、pH、および核酸濃度の下で）ハイブリダイズする温度である。（標的配列は、一般に、過剰に存在するので、Tmでは、50％のプローブが平衡状態で占められる）。代表的に、ストリンジェント条件は、pH7.0〜8.3で塩濃度が約1.0Mナトリウムイオン未満、代表的には約0.01M〜1.0Mナトリウムイオン濃度（または他の塩）であり、そして温度が、短いプローブ（例えば、10〜50ヌクレオチド）について少なくとも約30℃、および長いプローブ（例えば、50ヌクレオチド超）について少なくとも約60℃である条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような不安定化剤の添加によって達成され得る。特異的ハイブリダイゼーションはまた、生存細胞内に生じ得る。「誘導性」プロモーターとは、環境調節または発生調節下にあるプロモーターである。用語「標識された核酸プローブ」とは、プローブの存在がプローブに結合した標識の存在を検出することによって検出され得るように、共有結合、リンカーを介するか、あるいはイオン性、ファンデルワールスまたは水素「結合」を介するかのいずれかで、標識に対して結合されている核酸プローブをいう。用語「標識」とは、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的手段によって検出可能である部分をいう。例えば、有用な標識は、³²P、³⁵S、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（例えば、ELISAにおいて一般に使用されるようなもの）、ビオチン、ジゴキシゲニン（dioxigenin）、またはハプテン、ならびに抗血清またはモノクローナル抗体が利用可能であるタンパク質を含む。用語「核酸」とは、一本鎖または二本鎖形態のいずれかのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーをいい、そして他に限定しない限り、天然に存在するヌクレオチドに類似の様式で核酸にハイブリダイズする天然のヌクレオチドの公知のアナログを包含する。他に表示しない限り、特定の核酸配列は、その相補配列を含む。用語「作動可能に連結される」とは、核酸発現制御配列（例えば、プロモーター、すなわち転写因子結合部位のアレイ）と第二の核酸配列との間の機能的な連結をいい、ここで、発現制御配列は、第二の配列に対応する核酸の転写を指向する。用語「組換えパルボウイルスベクター」とは、ウイルスDNAに加えて非ウイルスDNAを有するパルボウイルスに由来するベクターをいう。組換えウイルスゲノムは、代表的に少なくとも１つの標的化構築物を含む。用語「複製する細胞」とは、DNA合成および有糸分裂のS期およびM期を含む細胞周期を経過しつつある細胞をいう。特定の核酸配列の状況において、用語「サブ配列」とは、特定の核酸に等しいか、またはそれより小さな核酸の領域をいう。本明細書において使用される場合、「標的遺伝子座」とは、遺伝子改変が所望される細胞ゲノムの領域をいう。標的遺伝子座は、代表的には、改変されるべき特定のヌクレオチド、ならびに改変部位の片側または両側にさらなるヌクレオチドを含む。「標的化構築物」とは、本発明の方法において使用される組換えパルボウイルスベクターのゲノムに存在するDNA配列をいい、そして標的遺伝子座での宿主細胞ゲノムに導入されるべき改変（単数または複数）を除いて標的遺伝子座の領域と同一であるかまたは実質的に同一である領域を含む。改変は、標的化構築物の末端に存在し得るかまたは標的化構築物に内在的であり得るかのいずれかである。改変は、野生型標的細胞におけるDNAと比較して、１つ以上の欠失、点変異、および／または挿入、またはそれらの組合せであり得る。用語「形質導入」とは、組換えウイルスベクターによるレシピエント細胞への遺伝物質の移入をいう。ウイルスベクターDNAを受け、それによって、遺伝子改変を受ける細胞を、その子孫およびこのような細胞の他の子孫同様、本明細書において「形質導入された細胞」という。用語「トランスジェニック」とは、細胞、またはその細胞の先祖に導入された特定の改変を含む細胞をいう。このような改変は、１つ以上の点変異、欠失、挿入、またはそれらの組合せを含み得る。動物についていう場合、用語「トランスジェニック」とは、トランスジェニックである細胞を含む動物を意味する。トランスジェニック細胞および非トランスジェニック細胞の両方からなる動物を、本明細書において、「キメラ」動物という。用語「ベクター」とは、宿主細胞に核酸（または、複数の核酸）を移入するための組成物をいう。ベクターは、移入されるべき核酸をコードする核酸を含み、そして必要に応じてウイルスキャプシド、または核酸の宿主細胞への進入および／または宿主細胞におけるベクターの複製を容易にするための他の物質（例えば、キャプシド内にパッケージングされるか、またはキャプシドの部分として存在する逆転写酵素または他の酵素）を含む。用語「ウイルスベクター」とは、核酸およびウイルスキャプシドおよび／または複製機能を含むベクターをいう。好ましい実施態様の説明本発明は、標的遺伝子座の特異的な改変を有する脊椎動物細胞を産生する方法、およびこれらの方法を使用して産生された遺伝的に改変された細胞を提供する。本方法は、同種対合により、高頻度で特定の標的遺伝子座に遺伝的改変を標的化し得る、組換えパルボウイルスベクターの使用を包含する。本方法において使用されるパルボウイルスベクターの組換えウイルスゲノムは、所望の改変を組込むDNA配列、および改変が所望される標的遺伝子座の領域と実質的に同一であるD NA配列を含有する標的構築物を含む。細胞は、パルボウイルスベクター（これは、組換えウイルスゲノムを細胞に形質導入する）と接触され、標的構築物と標的遺伝子座との間の同種対合、および標的遺伝子座への特異的な遺伝的改変の同時導入を生じる。本発明の方法は、細胞のゲノムの正確な改変を可能にする。このことは、他のゲノム改変方法が使用される場合に起こり得る所望でない効果（例えば、外因性遺伝子の挿入による所望の遺伝子の破壊）を回避させる。さらに、遺伝子または制御領域での正確な変化を達成させ得、ゲノムの他の場所の遺伝子の正確なコピーを挿入する必要なく、内因性遺伝子の修正を可能にする。本方法は、外因性遺伝子の発現レベルが細胞のゲノムDNAにおける位置（ここで、外因性遺伝子が組込まれる）に高度に依存する、頻繁に観察される「ポジション効果」を回避する。本方法はまた、長すぎるために、他の方法によって細胞へ導入され得ない遺伝子の改変を可能にする。所望の改変を含む遺伝子のコピー全体を導入しなければいけない代わりに、本発明の方法を使用して遺伝子の所望の部分のみを改変し得る。本発明の方法は、所望の遺伝的改変を含むDNAを、改変されるべき脊椎動物細胞に挿入するために組換えパルボウイルスベクターを使用する。ヒトパルボウイルスの一般的な導入は、例えば、Pattison（1994）Principles and Practice of Clinical Virology（第23章）Zuckermanら編、John Wiley & Sons Led.に見られ、およびまた、Berns(1991)「Parvoviridae and their Replication」Fundame ntal Virology，Fields編、Raven Press，New York,817-837頁、ならびに各々に援用される参考文献にも見られる。最も良く特徴付けられたヒトパルボウイルスは、B19およびAAVであり、両方とも細胞形質導入ベクターの基礎として、例えば、遺伝子治療に使用される。使用され得る他のパルボウイルスベクターには、Lu IIIウイルス(Maxwellら(1993)Human Gene Ther．4:441-450)、およびマウスの微小ウイルス（mvm）（Russellら(1992)J．Virol．66:2821-2828）が含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施態様において、本方法は、アデノ随伴ウイルス（AAV）を使用する。AAVは、4.7kbのゲノムを有する一本鎖の複製欠損性DNAウイルスである。アデノ随伴ウイルスは容易に入手され、そして遺伝子送達のためのベクターとしての使用は、例えば、Muzyczka（1992）Curr．Top．Microblol．Immunol．158:97- 129、米国特許第4,797,368号、およびPCT出願WO 91/18088に記載された。Samuls ki（1993）Current Opinion in Genetic and Development 3:74-80およびそれらに援用される参考文献は、AAVライフサイクルの概要を提供する。AAV、およびアデノウイルスまたはヘルペスヘルパー機能の一般的な概要については、Berns およびBohensky（1987）Advances in Virus Research，Academic Press.，32:24 3-306を参照のこと。AAVのゲノムは、Srivastavaら（1983）J．Virol.，45:555- 564に記載されている。Carterら、米国特許第4,797,368号は、組換えAAVベクターを構築するための多くの関連した設計案を記載する。Carter WO 93/24641もまた参照のこと。AAVベクターを記載するさらなる参考文献には、例えば、Westら（1987）Virology 160:38-47;Kotin（1994）Human Gene Therapy 5:793-801;およびMuzyczka（1994）J.Clin.Invest.94:1351が含まれる。組換えAAVベクターの構築もまた、Lebkowski,米国特許第5,173,414号;Lebkowskiら（1988）Mol.Cell. Biol.8:3988-3996;Tratschinら（1985）Mol.Cell.Biol.5(11):3251-3260;Tratsc hinら（1984）Mol.Cell.Biol.,4:2072-2081;HermonatおよびMuzyczka（1984）Pr oc．Nat'l．Acad．Sci．USA，81:6466-6470；McLaughlinら（1988）、ならびにS amulskiら(1989)J．Virol.，63:03822-3828を含む多数のさらなる刊行物に記載されている。AAVは、欠損性ヒトパルボウイルスであり、このことは、ウイルスが、ヘルパーウイルスにも感染されている細胞内でのみウイルス粒子を複製し且つ形成し得ることを意味する。哺乳動物細胞にAAVゲノムを組込ませるために、細胞を、ヘルパーウイルスの非存在下で、AAVで感染させる。パルボウイルスゲノムは、各末端に逆末端反復配列（ITR）を有する。本発明の方法における使用のために、組換えパルボウイルスベクターゲノムは、代表的には、少なくとも１つのITRの全てまたは一部、あるいは機能的等価物を有し、これは、一般的に、パルボウイルスベクターが複製するのに必要であり、そしてパルボウイルス粒子にパッケージされる。両方のITRは、しばしば、本発明の方法において使用される組換えパルボウイルスベクターDNAに存在する。脊椎動物細胞を遺伝的に改変するために本発明の方法において使用されるパルボウイルスベクターの組換えウイルスゲノムにはまた、所望の改変を除いて、遺伝的改変が所望される標的遺伝子座と同一（または実質的に同一）である、標的化構築物が含まれる。標的化構築物には、一般的に、標的遺伝子座の対応領域のヌクレオチド配列に同一（または実質的に同一）である、少なくとも約20ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約100、そしてより好ましくは約1000〜5000ヌクレオチド以上が含まれる。「実質的に同一」によって、標的化構築物のこの部分が、標的遺伝子座の対応領域に対して、少なくとも約80％同一；より好ましくは少なくとも約90％、そして最も好ましくは少なくとも約99％同一であることが意味される。標的化構築物にはまた、標的遺伝子座に導入されるべき遺伝的改変が含まれる。この改変には、標的遺伝子座のDNA配列に関連して、１つ以上の挿入、欠失、または点変異、あるいはそれらの組み合わせが含まれ得る。例えば、点変異を導入することによって標的遺伝子座を改変するために、標的化構築物は、導入されるべき特異的点変異を除く、標的遺伝子座に少なくとも実質的に同一であるDNA 配列を含有する。細胞への組換えウイルスゲノムの形質導入の際に、同種対合は、標的化構築物のDNA配列が標的遺伝子座のDNA配列を置換した後に、標的遺伝子座の対応領域に実質的に同一である標的化構築物の部分間で生じる。標的化構築物は、いずれかの末端で、または標的遺伝子座と同一（または実質的に同一）である標的化構築物の領域内に、遺伝的改変を有し得る。標的遺伝子座の一部を欠失するために、例えば、遺伝的改変は、一般には、標的遺伝子座に実質的に同一な２つの領域によって隣接される標的化構築物内にある。実質的に同一な２つの領域と標的遺伝子座のそれらに対応する領域との間の同種対合は、標的遺伝子座に組込まれる欠失を含む標的化構築物の配列を生じる。欠失は、本方法によって所望される位置に正確に標的化され得る。同様に、標的遺伝子座へのDNA配列の部位特異的挿入を含む遺伝的改変は、標的遺伝子座に実質的に同一な領域に隣接して、またはその隣に挿入されるべきDNAR配列を有する標的化構築物の使用によって作製され得る。標的化構築物と標的遺伝子座の対応領域との間の同種対合の後、標的遺伝子座に挿入配列が組込まれる。本発明の方法は、１つ以上の標的遺伝子座で改変を導入するために使用され得る。例えば、１つ以上の改変を細胞ゲノムにおける第２の標的遺伝子座に導入するために、細胞は、所望の改変を除いて、第２の標的遺伝子座に少なくとも実質的に同一である標的化構築物を有する組換えウイルスゲノムを有するパルボウイルスベクターと接触され得る。第２の標的遺伝子座のための標的化構築物は、第１の標的遺伝子座のための標的化構築物と同様なパルボウイルスベクターに存在し得るか、または第２のパルボウイルスベクターに存在し得る。第１および第２の標的化構築物が異なるパルボウイルスベクターに存在する場合、細胞は、ベクターとともに、連続的または同時のいずれかで形質導入され得る。２つ以上の標的遺伝子座での改変を得るために、このプロセスは所望されるように単に反復される。構造遺伝子、調節領域、および脊椎動物細胞のゲノムDMA内の他の配列は、本発明の方法を使用して改変される。例えば、遺伝子の遺伝子産物を変化させ得る構造遺伝子内での特異的な変化を導入し得るか、または遺伝子産物の発現を妨げ得る。この実施態様において、組換えウイルスゲノムは、導入されるべき特異的ヌクレオチド変化を除いて、標的遺伝子座に同一（または実質的に同一）である標的化構築物を含み得る。標的化構築物と細胞DNAにおける標的遺伝子座との間の同種対合は、標的遺伝子座に組込まれる標的化構築物に存在する改変を生じる。遺伝子産物がポリペプチドである場合、例えば、本発明の方法を使用して、ネイティブの遺伝子によってコードされるポリペプチドと比較して、１つ以上の特異的なアミノ酸置換、挿入、または欠失を有するポリペプチドをコードする遺伝子を得ることが出来る。本発明の方法によって、不活化であるか、または所望されるよりも活性でないポリペプチドを生じるアミノ酸をコードするコドンを、そのポリペプチドに対する正常な活性を回復させるアミノ酸を特定するコドンと置換し得る。アミノ酸変化を生じる１つ以上の変異によって特徴付けられる多くの遺伝的疾患は、本発明の方法を使用して修正可能である。別の例として、標的領域は、グリコシル化部位を特定するコドンを、グリコシル化部位の部分ではないアミノ酸をコードするコドンと置換する（またはその逆）ことによって、改変され得る。プロテアーゼ切断部位は、なお別の実施例のように作製または破壊され得る。標的遺伝子座に存在するナンセンスコドンはセンスコドンに変化され得るか、またはポリペプチドの破壊が所望される場合、ナンセンス変異を標的遺伝子座に導入し得る。内因性タンパク質に結合されるべき融合タンパク質の部分をコードする外因性DNAを標的化構築物に組込むことによって、融合タンパク質を得ることが出来る；外因性DNAは、標的遺伝子座での細胞ゲノムへの標的化構築物のDNA 配列の組込みの際の、融合タンパク質の翻訳に適したリーディングフレーム内にある。同様に、遺伝子産物が核酸である場合、本方法は遺伝子産物を改変するために使用され得る。本発明の方法を使用して改変され得るRNA遺伝子には、tRNA、リボソームRNA、リボザイム、テロメラーゼサブユニットなどが含まれる。あるいは、本方法は、遺伝子産物が外因性核酸に連結した内因性核酸から成る遺伝子を構築するために使用され得る。例えば、触媒性RNAをコードする外因性DNAは、内因性遺伝子に連結され得る。この融合遺伝子から転写されるRNAは、融合遺伝子の内因性部分に実質的に相補的である内因性核酸にハイブリダイズし得、その後、外因性DNAから発現されるハイブリッドリボザイムの部分がその通常の反応を触媒し得る。従って、本発明の方法を使用して得られる融合遺伝子は、リボザイムを標的化するための手段を提供する。本発明の方法はまた、目的の遺伝子の発現に関与する調節領域を作製するヌクレオチドを置換、欠失、または挿入するために有用である。改変された調節領域は、例えば、非改変細胞における条件と等価な条件下での発現レベルと比較して遺伝子の発現レベルを増加または減少することによって、遺伝子の発現を変化し得る。改変は、例えば、遺伝子が代表的には発現されない状況下で遺伝子の発現を生じ得るか、または特定の環境下で正常に発現される遺伝子の発現を妨げ得る。本発明の方法を使用して、異種転写制御エレメントを挿入するか、またはプロモーター、エンハンサー、転写終結シグナルのような内因性制御エレメントを、遺伝子の発現に影響を及ぼすに適した目的の遺伝子に関する位置で、改変し得る。構成プロモーターを誘導性プロモーターと置換することによって、例えば、遺伝子の発現を、特定の環境刺激または発達刺激の存在または非存在に結び付け得る。同様に、転写後修飾（例えば、RNAスプライシング、ポリアデニル化、翻訳）に関与する領域、ならびに翻訳後修飾に関与するアミノ酸配列をコードする領域が、挿入、欠失、または改変され得る。本発明の方法を使用して改変または置換され得る転写制御エレメントの例には、応答エレメント、プロモーター、エンハンサー、遺伝子座調節領域、他の転写開始シグナル、転写伸長シグナル、イントロン、 RNA安定配列、転写終結シグナル、ポリアデニル化部位、およびスプライス部位が含まれるが、これらに限定されない。遺伝子の発現もまた、本発明の方法を使用することによって、DNAメチル化部位を導入または破壊するために調節され得る。１つの実施態様において、本発明の方法は、細胞内の核酸の選択的な発現を得るために使用される。核酸の選択的な発現は、核酸の、所望の細胞型および/または所望の条件下（例えば、誘導）で発現されるが、所望でない細胞型および/ または所望でない条件下で実質的に発現されない能力をいう。従って、特定の核酸配列の発現の部位および程度は、所望の様式で調節される。これは、例えば、所望の細胞型および/または所望の条件下で選択的に発現される制御エレメントを含むヌクレオチド配列を作製するための、部位特異的ヌクレオチドの置換、欠失または挿入を導入することによって達成される。これは、標的遺伝子座に既に存在するヌクレオチドを変化することによって、または制御エレメントの全てまたは一部として機能する配列を含む外因性DNAを標的遺伝子座に組込むことによって、またはこれらの改変の組み合わせによって、全体的に達成され得る。例えば、本発明の方法を、トランス活性化またはトランス抑制化合物（通常、タンパク質または別の物質と複合体化されたタンパク質）と相互作用してそれぞれ転写を刺激または抑制するシス作用性核酸配列である応答エレメントを、導入または破壊するために使用し得る。本発明の方法を使用して導入または除去され得る応答エレメントには、細胞選択的応答エレメント、ホルモンレセプター応答エレメント、炭水化物応答エレメント、抗生物質応答エレメントなどが含まれる。細胞選択的応答エレメントは、目的の細胞型において選択的に産生されるトランス活性化調節エレメントによって活性化され得る。本発明の方法において使用される細胞選択的応答エレメントの選択は、発現の導入または抑制が所望される細胞が応答エレメントにおいて作用するトランスアクチベーターを産生するか否かに依存する。例えば、膵臓腺房細胞、水晶体組織、Ｂ細胞、肝細胞、およびHI V非感染細胞における遺伝子の選択的な発現は本発明の方法を用いることによって、それぞれ、エラスターゼIエンハンサー、γクリスタリン遺伝子応答エレメント、イムノグロブリン重鎖および/または軽鎖エンハンサー、肝臓エンハンサー（例えば、I-1-アンチトリプシンまたは血清アルブミンエンハンサー）、慢性ゴナドトロピンI-鎖またはθ-鎖エンハンサー、インターロイキン-2（IL-2）エンハンサー、IL-2レセプターエンハンサー、またはヒト免疫不全ウイルス（HIV）応答エレメント（例えば、TAR部位）を導入するために達成され得る。ホルモンレセプター応答エレメント（これは、ホルモン、またはその機能的等価物がそのホルモンに対する細胞レセプターと相互作用する場合、活性化または抑制され得る）は、本発明の方法を使用して所望の位置に導入され得る。ホルモン-レセプター複合体は、細胞によって内部移行され、ここで、複合体は、（直接または間接的のいずれかで）適切なホルモンレセプター応答エレメントと選択的に相互作用され、それによって、エレメントに作動可能に連結された遺伝子の発現は、活性化または抑制される。発現のホルモン応答性の誘導または抑制を得るために、本発明の方法は、調節されるべき遺伝子の上流のホルモン応答エレメントを生成するために使用される。遺伝子の発現は、所定のホルモンのレセプターを発現する細胞内のホルモンによって調節される。抗生物質応答エレメントは、抗生物質の存在または非存在によって調節される。例えば、テトラサイクリン応答エレメントは、テトラサイクリンに応答性である。同様に、炭水化物応答エレメントは、特定の炭水化物またはそのアナログの存在または非存在によって調節される。他の応答エレメント、ならびにプロモーター、エンハンサー、および他の調節領域は、当業者に周知である。これらもまた、本発明の本方法の使用によって作製または破壊され得る。本発明の方法はまた、DNA複製（例えば、KornbergおよびBaker，DNA Replicat ion，第２版、WH Freeman & Co.，1991を参照のこと）、およびマトリックス結合領域（例えば、Bodeら（1996）Crit．Rev．Eukaryot．Gene．Expr．6:115-38; Boulikas，(1993)J．Cell．Biochem．52:14-22を参照のこと）、クロマチン組換えホットスポット（例えば、Smith（1994）Experientia 50:234-41を参照のこと）などのような、他の細胞プロセスに関与する核酸配列を改変するために使用され得る。細胞に組換えウイルスゲノムを送達するためのパルボウイルスの使用により、本発明の方法は、所望の特異的遺伝的改変事象を、脊椎動物細胞におけるDNAの部位特異的改変の他の方法による以前の可能性よりもはるかに高い効率で生じさせる。0.01％以上の所望の改変頻度は、本発明の方法を使用して代表的に得られる；実際、0.1％より大きい、そしてさらに１％よりも大きい頻度が本方法を使用して得られ得る。遺伝的改変の効率は、形質導入に使用される感染の多重度（ M0I；本明細書中で細胞あたりのベクター粒子の単位に規定される）、および形質導入される細胞の型に部分的に依存する。代表的な実施態様において、約１〜 10¹²のM0Iを使用して、継続的な細胞株から得られた細胞を形質導入する；より好ましくは、M0Iは少なくとも約10⁴、そして最も好ましくは、本発明の方法において使用されるM0Iは、細胞あたり少なくとも約10⁶ベクター粒子である。遺伝子改変を、組換えパルボウイルスベクターによる形質導入に感受性である任意の細胞に導入する方法は有用である。このような細胞は、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類などを含む多くの脊椎動物種から得られ得る。例えば、ヒト、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、齧歯類などのような哺乳動物由来の細胞は、これらの方法を使用して改変され得る。本発明の方法を使用して改変され得る細胞は、脳、筋肉、肝臓、肺、骨髄、心臓、神経細胞、胃腸、腎臓、脾臓などを含む。また本発明の方法を使用して遺伝子改変を受けやすいものは、生殖細胞（卵細胞および精子を含む）、受精卵細胞、胚幹細胞、および生物または生物の一部（例えば、器官）へと発達し得る他の細胞である。初代細胞（本明細書中で「正常細胞」とも呼ぶ）および細胞株から得られる細胞の両方は、本発明の方法を使用する改変に感受性である。初代細胞には、生物から直接得られる細胞、または生物中に存在する細胞、ならびにこれらの供給源から得られそして培養において増殖するが、培養において連続的に（例えば、多くの世代）増殖し得ない細胞が含まれる。例えば、初代線維芽細胞は、初代細胞と考えられる。この方法はまた、連続的な、または不死化された細胞株（例えば、腫瘍細胞など、ならびに生物から得られる腫瘍細胞を含む）から得られる細胞のゲノムを改変するのに有用である。このような細胞は、インビトロ、エキソビボ、またはインビボで改変され得る。この方法は、脊椎動物細胞のオルガネラのゲノム、ならびに核ゲノムを改変するために有用である。本発明の方法を、例えば、所望の改変を除きミトコンドリアゲノムにおける標的遺伝子座に少なくとも実質的に同一である標的化構築物を、組換えウイルスゲノムに含めることによって、細胞のミトコンドリアゲノムにおける標的遺伝子座を改変するために使用し得る。Ａ．ベクターの調製本発明の実施には、組換えウイルスゲノムを有するパルボウイルスの構築およびこれらのウイルスゲノムのウイルス粒子へのパッケージングが含まれる。これらの目的を達成するための方法は、当該分野で公知である。組換えウイルスゲノムの構築に適切な広範な種々のクローニングおよびインビトロ増幅方法は、当業者に周知である。多くのクローニングの実施へと当業者を導くのに十分なこれらの技術および取り扱い説明は、BergerおよびKimmel，Guide to Molecular Cloni ng Techniques，Methods in Enzymology 152 Academic Press，Inc.，San Diego ，CA(Berger);Sambrookら(1989)Molecular Cloning-A Laboratory Manual （第２版）Vol．1-3，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Press ，NY．(Sambrook);Current Protocols in Molecular Biology，F.M．Ausubelら編、Current Protocols，Greene Publishing Associates，Inc.とJohn Wiley & Sons，Inc.との間の合併事業（1994補遺）(Ausubel);Cashionら、米国特許第5,0 17,478号；およびCarr、欧州特許第0,246,864号に見出される。当業者をインビトロ増幅法へと導くのに十分なこれらの技術および教示の例は、Berger，SambrookおよびAusubel、ならびにMullisら(1987)の米国特許第4,683 ,202号；PCR Protocols A Guide to Methods and Applications（Innisら、編） Academic Press Inc．San Diego，CA(1990)(Innis);Arnheim & Levinson(Octobe r 1，1990）C&EN 36-47;The Journal Of NIH Research(1991)3:81-94;Kwohら、（1989）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86:1173;Guatelliら(1990)Proc．Natl．A cad．Sci．USA 87:1874;Lomellら(1989)J.Clin．Chem 35:1826;Landergrenら(19 88)Science 241:1077-1080;Van Brunt（1990）Biotechnology 8:291-294;WuおよびWallace(1989)Gene 4，560;およびBarringerら（1990）Gene 89:117に見出される。核酸をクローニングまたは増幅するのに有用なオリゴヌクレオチド合成は、代表的には、市販の固相オリゴヌクレオチド合成機において行われるか（Needham-VanDevanterら(1984)Nucleic Acids Res．12:6159-6168）、またはBeaucageら（1981）TetrahedronLetts．22(20):1859-1862によって記載される固相ホスホルアミダイトトリエステル法を使用して化学的に合成される。代表的には、組換えウイルスゲノムは、標準的なクローニング技術を使用して、最初にプラスミドとして構築される。標的化構築物を、２つの逆方向末端反復配列もしくはその機能的等価物の少なくとも１つ、ならびに組換えウイルスゲノムのビリオン中への複製およびパッケージングに必要なウイルス配列を含むウイルスゲノム中に挿入される。組換えウイルスゲノムは、プラスミドとして増殖され、そして標準的な方法によってビリオン中にパッケージングされる。例えば、 Muzyczka、前出、Russellら（1994）Proc.Nat'l．Acad．Sci.USA 91:8915-8919 ，Alexanderら(1996)Human Gene Ther．7:841-850;Koeberlら(1997)Proc．Nat'l ．Acad．Sci.USA 94:1426-1431;Samulskiら(1989)J．Virol．63:3822-3828;Trat schinら（1985）Mol．Cell．Biol．5:3251-3260：およびHermonatおよびMuzyczk a(1984)Proc．Nat'l．Acad．Sci．USA 81:6466-6470。脊椎動物細胞における遺伝子をトランスフェクトおよび発現する方法は、当該分野で公知である。ウイルスベクターでの細胞の形質導入は、例えば、ベクターを、ウイルス宿主範囲内で、形質導入を引き起こすのに必要な条件および濃度下で細胞とインキュベートすることを含み得る。例えば、Methods in Enzymology ，vol．185，Academic Press，Inc.，San Diego，CA（D.V．Goeddel、編）（199 0）またはM．Krieger，Gene Transfer and Expression--A Laboratory Manual， Stockton Press，New York，NY;およびMuzyczka（1992）Curr．Top．Microbiol ．Immunol．158:97-129、ならびに各々にて引用される参考文献を参照のこと。細胞（細胞株および組織サンプルから培養された細胞を含む）の培養は、当該分野で周知である。Freshney(Culture of Animal Cells，a Manual of Basic Tech niquie，third edition Wiley-Liss，New York(1994))は、細胞の培養物に対する一般的な指針を提供する。Ｂ．遺伝子改変を有する細胞の同定本発明の方法を使用して生じる特定の遺伝子改変が生じる頻度が高いため、所望の改変を含む個々の細胞について選択またはスクリーニングすることは、多くの使用のために不可欠ではない。所望の遺伝子改変を組み込んだ細胞を同定するのが所望である場合、当業者に周知の技術を使用し得る。例えば、PCRおよび関連する方法（例えば、リガーゼ連鎖反応）は、核酸における特定の変化を検出するために日常的に使用される(PCR技術の一般的な記載についてはInnis、前出を参照のこと)。適切なストリンジェンシーの条件下でのハイブリダイゼーション分析はまた、特定の遺伝子改変を検出するために適切である。Tijssen(1993)Lab oratory Technlques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes，I部およびII部、Elsevler，New York;およびChoo（編）（1994）Methods in Molecular Biology Volume 33-In Situ Hybridization Protocols，Humana Press Inc.，New Jersey（Methods in Molecular Biology シリーズの他の本もまた参照のこと）に総説されるものを含む多くのアッセイ形式が適切である。種々の自動化固相検出技術もまた適切である。例えば、非常に大規模の固定化ポリマーアレイ（VLSIPS^TM）が、核酸における特定の変異の検出のために使用される。Tijssen（前出）、Fodorら(1991)Science，251:767-777およびSheldonら(1993)Clinical Chemistry 39(4):718-719を参照のこと。これらの方法は、特定の遺伝子改変自体を検出するために使用し得るか、または改変から生じる変化を検出するために使用され得る。例えば、ハイブリダイゼーションまたは他の方法を使用して、プロモーター領域に改変を有する細胞中での特定のmRNAの存在または非存在を検出し得る。他の方法によって、細胞の表現型における変化もまた検出し得る。例えば、遺伝子改変が、改変されていない細胞がポリペプチドを発現しない条件下で、改変された細胞において発現されるポリペプチドを生じる場合またはその逆の場合、ポリペプチドに対する抗体は、発現を検出するために使用され得る。改変された細胞が、脊椎動物にある場合、抗体は、例えば、血流または他の組織におけるタンパク質の存在または非存在を検出するために使用され得る。遺伝子改変が、ポリペプチドの構造を変化させる場合、改変されたバージョンは認識しないが改変されていないポリペプチドを認識する抗体、またはその逆である抗体を得ることができる。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を産生する方法は、当業者に公知であり、そして多くの抗体が利用可能である。例えば、Coligan(199l )Current Protocols in Immunology Wiley/Greene，NY;およびHarlowおよびLane (1989)Antibodies:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，NY;Stite Sら（編）Basic and Clinical Immunology（第４版）Lange Medical Publicatio ns，Los Altos，CAおよびそこで引用される参考文献；Goding(1986)Monoclonal Antibodies:Principles and Practice（第２版）Academic Press，New York，NY ;ならびにKohlerおよびMilstein（1975）Nature 256:495-497を参照のこと。抗体調製の他の適切な技術には、ファージまたは類似のベクターにおける組換え抗体のライブラリーの選択が含まれる。Huseら（1985）Science 246:1275-1281およびWardら(1989)Nature 341:544-546を参照のこと。Vaughanら(1996)Nature Bi otechnology，14:309-314は、大きな非免疫化ファージディスプレイライブラリーから単離されたナノモル未満のアフィニティーを有するヒト抗体を記載する。 Chhabinathらは、抗体構造モデリングについての、知識ベースの自動化アプローチを記載する（(1996)Nature Biotechnology 14:323-328）。特定のモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体および抗血清は、通常、少なくとも約0.1mM のK_D、より通常には少なくとも約１TM、好ましくは少なくとも約0.1TMもしくはそれ未満、そして最も代表的でありそして好ましくは0.01TMもしくはそれ未満の K_Dを有するその対応する抗原に結合する。改変された酵素の酵素活性（またはその欠失）もまた検出し得る。遺伝子的に改変された細胞はまた、細胞ゲノム中に組み込まれた選択マーカーまたはスクリーニングマーカーを使用することによって同定され得る。選択マーカーは、細胞の生存または増殖に必要とされるタンパク質をコードする遺伝子であり得るので、マーカーを含む宿主細胞のみが、選択条件下で増殖し得る。例えば、本発明の方法が、細胞増殖に必要な遺伝子を誘導性プロモーターの制御下に置く遺伝子改変を導入するために使用される場合、所望の改変を取り込んだ細胞が、遺伝子の発現もまた誘導する選択条件下で細胞を増殖させることによって選択され得る。代表的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒性物質（例えば、ガンシクロビル、ネオマイシン、ハイグロマイシン、G418、メトトレキサートなど）に対する耐性を付与するか：（ｂ）栄養要求性の欠乏を補うか、または（ｃ）複合培地からは利用可能でない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。適切な選択マーカーの選択は、宿主細胞に依存し、そして異なる宿主に対する適切なマーカーは、当該分野で周知である。スクリーニングマーカーは、その活性が容易に検出されるタンパク質をコードする遺伝子であり、そのようなマーカーを発現する細胞を容易に同定可能にする。このようなマーカーには、例えば、β-ガラクトシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、およびルシフェラーゼが含まれる。Ｃ．インビトロでの使用本発明の方法は、多くの目的のために有用である細胞および細胞株を構築するために有用である。遺伝子的に改変された細胞は、そうでない細胞によって産生されるよりも大きいレベルの所望の遺伝子産物を生成するため、またはそうでない細胞から産生される産物から改変された遺伝子産物を生成するために使用され得る。例えば、コードされるタンパク質のアミノ酸配列が、タンパク質のヒト形態の配列に対応するように、所望のタンパク質をコードする非ヒト細胞遺伝子を改変し得る。あるいは、アミノ酸配列は、タンパク質をより活性に、より安定に、より長い治療的半減期を有するように、異なるグリコシル化パターンを有するように、などのために変化され得る。この方法は、シグナル配列をタンパク質のアミノ末端に導入するために使用され得、これは、通常は分泌されないタンパク質を細胞が分泌することを引き起こすことによってタンパク質の精製を容易にし得る。別の例として、本発明の方法を使用して、例えば、毒性の化合物の分解に関与するポリペプチドを発現するように細胞を改変し得る。所望の場合には、発現は、毒性化合物の存在によって誘導性にされ得る。このような細胞は、毒性廃棄物流路（toxic waste stream）のバイオレメデイエーションのため、および汚染された場所の洗浄のために使用され得る。本発明の方法を使用して改変された細胞はまた、特定の変異の効果を研究するために有用である。例えば、特定の遺伝子の発現を破壊し得、そして細胞の増殖および/または発生、ならびに細胞の他の細胞との相互作用に対する変異の効果を決定し得る。腫瘍形成および他の疾患のような疾患に関与することが疑われる遺伝子は、疾患の発症に対する効果を決定するために破壊され得る。あるいは、疾患に関連する遺伝子の発現は、オンされるかまたは上昇され得、そしてその効果が評価され得る。特定の遺伝子を所与の条件下で発現するように改変された細胞を使用して、遺伝子の発現を阻害し得る化合物をスクリーニングし得る。例えば、細胞増殖に必要とされる遺伝子を誘導性のプロモーターの制御下に置くように、細胞を改変し得る。試験化合物は、遺伝子の発現を誘導する部分とともに増殖培地に添加される；誘導性部分と誘導性プロモーターとの間の相互作用を阻害する試験化合物の存在下で、細胞は増殖しない。従って、これらの細胞は、遺伝子発現を調節する化合物のための簡単なスクリーニング系を提供する。遺伝子変異を導入する本発明の方法の多くの他の使用は、当業者に明らかである。Ｄ．トランスジェニック動物およびキメラ動物の構築本発明はまた、トランスジェニック動物およびキメラ動物を産生する方法、およびこれらの方法を使用して産生されるトランスジェニック動物およびキメラ動物を提供する。「キメラ動物」は、この方法を使用して導入された１つ以上のゲノム改変を含むいくつかの細胞および改変を含まない他の細胞を含む。対照的に、「トランスジェニック動物」は、すべて特定の改変を組み込んでいる細胞で作製されている。トランスジェニック動物は、改変された標的遺伝子座をその子孫に伝達することが可能であるが、キメラ動物の、改変を伝達する能力は、改変された標的遺伝子座が、動物の生殖細胞中に存在するか否かに依存する。改変には、例えば、１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換が含まれ得る。本発明の方法は、ほとんどの脊椎動物種のトランスジェニック動物およびキメラ動物を産生するために有用である。このような種には、非ヒト哺乳動物（マウスおよびラットのような齧歯類、ウサギ、ヒツジ（sheep）およびヤギのようなヒツジ類（ovine）、ブタ（pig）のようなブタ（porcine）、およびウシ（cattl e）およびバッファローのようなウシ類（bovine）が含まれるが、これらに限定されない。トランスジェニック動物を得る方法は、例えば、Puhler，A.,編、Gen etic Engineering of Animals，VCH Publ.，1993;MurphyおよびCarter、編、Tra nsgenesis Techniques:Principles and Protocols（Methods in Molecular Biol ogy、第18巻）、1993;ならびにPinkert，CA、編、Transgenic Animal Technolog y:A Laboratory Handbook，Academic Press，1994に記載される。特定の遺伝子改変を有するトランスジェニック魚はまた、本発明の方法を使用して作製され得る。トランスジェニック魚を作製するための一般的な方法については、例えば、 Iyengarら（1996）Transgenic Res．5:147-166を参照のこと。そのゲノムにおける特定の改変を有するトランスジェニック動物またはキメラ動物を得る１つの方法は、受精卵母細胞を、所望の改変を有する標的化構築物を含むパルボウイルスベクターと接触させることである。マウスのようないくつかの動物については、受精は、インビボで行われ、そして受精した卵は、外科的に取り出される。他の動物（特に、ウシ）においては、生きている動物または屠殺場の動物から卵を取り出し、そしてその卵をインビトロで受精させることが好ましい。DeBoerら、WO91/08216を参照のこと。インビトロでの受精は、改変が実質的に同時発生的な細胞中に導入されることを可能にする。次いで、受精卵母細胞を、約16〜150の細胞を含む前移植胚が得られるまで、インビトロで培養する。胚の16〜32細胞段階は、桑実胚として記載される。32より多い細胞を含む前移植胚は、胚盤胞と呼ばれる。これらの胚は、代表的に64細胞段階の胞胚腔（blasto coel cavity）の発達を示す。所望である場合、胚細胞における所望の改変の存在は、当業者に公知の方法によって検出され得る。受精卵母細胞を前移植段階まで培養するための方法は、Gordonら（1984）Methods Enzymol．101:414;Hoganら、Manipulation of the Mouse Embryo:A Laboratory Manual，C.S.H.L．N.Y.(19 86)(マウス胚);Hammerら(1985)Nature 315:680(ウサギおよびブタ胚);Gandolfi ら(1987)J．Reprod．Fert．81:23-28;Rexroadら(1988)J．Anim．Sci．66:947-95 3（ヒツジ胚）、ならびにEyestoneら(1989)J．Reprod．Fert．85:715-720;Camou sら（1984）J．Reprod．Fert．72:779-785;ならびにHeymanら（1987）Theriogen ology 27:5968（ウシ胚）に記載されている。ときどき、前移植胚は、移植が継続している期間中、凍結保存される。前移植胚は、適切な雌に移入され、トランスジーンが組み込まれた場合に、発達の段階に依存して、トランスジェニック動物またはキメラ動物が誕生する。キメラ哺乳動物は、真の生殖系列のトランスジェニック動物を形成するように繁殖され得る。あるいは、パルボウイルスベクターは、特定の遺伝子改変を胚幹細胞(ES)に導入するために使用され得る。これらの細胞は、インビトロで培養された前移植胚から得られる。例えば、Hooper，ML，Embryonal Stem Cells:Introducing Plann ed Changes into the Animal Germline(Modern Genetics，v.1)，Int'l．Pub．D istrib.，Inc.，1993;Bradleyら(1984)Nature 309，255-258を参照のこと。形質転換したES細胞は、非ヒト動物由来の胚盤胞と組み合わされる。ES細胞は、胚にコロニー形成し、そしていくつかの胚において、生じるキメラ動物の生殖系列を形成する。Jaenisch，Science，240:1468-1474(1988)を参照のこと。あるいは、生物を再構築し得るES細胞または体細胞（「体細胞再集団化細胞（somatic repo pulating cells)」）は、トランスジェニック哺乳動物を生じる脱核した受精卵母細胞に移植するための核の供給源として使用され得る。例えば、Wilmutら（19 97）Nature 385:810-813を参照のこと。２つ以上の改変された標的遺伝子座を含有するトランスジェニック動物の産生のために、２つの標的化構築物を含有するパルボウイルスベクターが使用され得るか、またはより好ましくは、２つの異なるパルボウイルスベクター（各々異なる標的化構築物を含有する）は、単一の標的遺伝子座を改変するための手順と同じ手順を使用して、同時に導入される。あるいは、各々の改変は、最初に別々の動物に導入され得、次いで、動物を交配することによって同じゲノムに組み合わされ得る。あるいは、所望の改変の１つを含む第一のトランスジェニック動物が産生され、その後、第二の改変が、その動物由来の受精卵または胚幹細胞中に導入される。 E.エキソビボ適用本発明の方法はエキソビボ治療に有用である。ここで、細胞は、生物体から取り出され、これらの細胞は、本発明の方法を使用して遺伝的に改変され、そして生物体に再導入される。いくつかの適用において、遺伝的改変された培養細胞株は生物体に導入される。遺伝的に改変された細胞は、本来得られるか、または同じかもしくは異なる種の異なる生物体に導入され得る細胞から同じ生物体に導入され得る。エキソビボ治療は、例えば、血友病および地中海貧血病の特定型、ならびに細胞(これは、動物から取り出され、本発明の方法を使用して改変され、そして生物体に再導入され得る)中の欠損によって特徴付けられる他の疾患のような遺伝子疾患の処置において有用である。例えば、細胞は、造血幹細胞(これは、骨髄または胎児臍請帯血由来である)、Tリンパ球、Bリンパ球、単核球、肝細胞、筋細胞、線維芽細胞、間質細胞、皮膚細胞、または幹細胞であり得る。細胞は患者から培養され得るか、または細胞バンク(例えば血液バンク)に保存された細胞であり得る。これらの方法はヒトの処置に有用であり、そしてまたは獣医学的目的のために有用である。形質導入された細胞は、患者の体積および全体的な健康に適用される場合、形質導入された細胞型のLD₅₀、および種々の濃度での細胞型の副作用によって決定された割合で、動物または患者に投与される。投与は単回用量または分割用量により達成され得る。エキソビボ遺伝子治療のための動物モデルおよび臨床プロトコルは、造血細胞について確立されている(Blaeseら(1995)Science 270:475〜480;Kohnら、（1995 ）Nature Med.1:1017〜1023)、肝細胞(Grossmanら(1994)Nature Genet.6 335-34 1)、筋細胞ら(Bonhamら(1996)Human Gene Ther.7:1423-1429)、皮膚細胞(Choate ら（1996）Nature Med.2:1263〜1267)および線維芽細胞（Palmerら(1989)Blood 73:438〜445）。 F.インビボ治療本発明の方法は、インビボにおける遺伝子欠損を修正することに有用である。筋ジストロフィは、しばしば発現される異常なポリペプチド(これは、その機能特性を実施し得ない)を生じる1つまたは２、３の変異の結果である遺伝子疾患のまさに１つの例である。これらの多くの改変体または他の遺伝子疾患に関しての正確な変異は、所望されない遺伝子変異を同定するための方法であるとして当業者に公知である。実施例は、シャルコー・マリー・ツース病、コフィンローリー症候群、嚢胞性線維症、脆弱X染色体症候群、血友病、遺伝性血栓素因(ファクターＶ変異)ハンチントン病、中位鎖アシル補酵素デヒドロゲナーゼ欠損(mcad)、筋ジストロフィ、神経線維腫症(nfl)、鎌形赤血球疾患およびグロブリン鎖改変体、脊髄筋萎縮症、運動失調、Iおよびθ地中海貧血症、およびフォンヒッペルリンダ病などを含むが、これらに限定されない。遺伝子疾患は、例えばShaw,DJ編, Molecular Genetics of Human Inherited Disease、JohnおよびWiley Sons,1995 ;DaviesおよびRead、Molecular Basis of Inherited Disease,第2編，IRL Press ，1992に総説される。ヒト遺伝子疾患は、他の脊椎動物の疾患と同様に、本発明の方法を使用して処置可能である。組換えウイルスゲノムを含むパルボウイルスは、インビボにおける細胞の形質導入のために生物体に直接投与され得る。投与は、ウイルスを血液または組織細胞との最終的な接触へ導入することのための通常使用される任意の経路によってなされ得る。本発明の方法で使用されるウイルスベクターは、任意の適切な様式（好ましくは薬学的に受容可能なキャリアとともに）で投与される。本発明の文脈における、このようなウイルスベクターを患者に投与する適切な方法は、利用可能であり、そして１つを超える経路が特定のウイルスベクターを投与するために使用され得るが、特定の経路がしばしば別の経路よりも即効性でそして効果的な反応を提供される。薬学的に受容なキャリアは、投与される特定のウイルスベクターによって、そして組成物を投与するために使用される特定の方法によって部分的に決定される。従って、本発明の薬学的組成物の広範な種々の適切な処方物がある。経口投与のために適切な処方物は、(a)液体溶液（例えば、希釈液(例えば、水、生理食塩水またはPEG400)に溶解した有効量のベクター）；(b)カプセル、袋または錠剤（各々はあらかじめ決定された量の有効成分(液体、固体、顆粒またはゼラチンとして)を含む）；(c)適切な液体における懸濁液；および(d)適切な乳剤から成り得る。錠剤形態は、１つ以上のラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、リン酸カルシウム、コーンスターチ、ポテトスターチ、トラガント、微結晶性セルロース、アカシア、ゼラチン、コロイドシリコン二酸化物、クロスカメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、および他の賦形剤、顔料、充填剤、結合剤、希釈剤、緩衝化剤、湿剤、防腐剤、芳香剤、色素、崩壊剤、および薬学的適合可能なキャリアを含み得る。ロゼンジ（lozenge）形態は、芳香剤、通常はスクロースおよびアカシアまたはトラガカント、ならびに不活性基材(例えば、ウイルスベクターに加えて、当該分野に公知のキャリア中に含まれる、例えば、ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシア乳液、ゲルなど)中に有効成分を含む錠剤を含み得る。ウイルスベクター（単独または他の適切な成分と組み合わせて）は、エアロゾル処方物に作製され、吸入を介して投与され得る。気管支通路が特定のウイルスにとって通常の経路の選択であるために、対応するベクターはこの方法によって適切に投与される。エアロゾル処方物は、加圧された受容可能な噴霧剤(例えば、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素など)に配置され得る。直腸投与のための適切な処方は、例えば、座剤基材を有する活性ウイルスベクターからなる座剤を含む。適切な座剤基材は、天然もしくは合成トリグリセライドまたはパラフィンハイドロカーボンを含む。さらに、基材(例えば、液体トリグリセリド、ポリエチレングリコールおよびパラフィン炭化水素を含む)とウイルスベクターとの組み合わせからなるゼラチン直腸カプセルを使用することもまた可能である。非経口投与(例えば、関節内(関節中に)、静脈内、筋内、皮内、腹腔内、くも膜下腔内(脳脊髄液中に)、および皮下経路)に適した処方物は、水溶性および非水溶性、等張性滅菌注射溶液（抗酸化薬、緩衝剤、静菌薬、および処方物を意図される受容体の血液と等張性にする溶質を含み得る）安定化剤ならびに水性および非水性滅菌懸濁液(懸濁剤、可溶化剤、濃厚剤、および防腐剤を含み得る)を含む。処方物はまた、単回用量または複数回用量を密閉したコンテナ(例えば、アンプルおよびバイアル)において提供され得、そしていくつかの実施態様において、使用直前に、滅菌液体キャリア(例えば、注射については水)の添加のみを必要とする、凍結乾燥した(凍結乾燥された)状態で保存され得る。即興的な注射溶液および懸濁液は、滅菌パウダー、顆粒、および以前に記載した種類の錠剤から調製され得る。本発明の文脈において、患者に投与される用量は、長い間に患者において有益な治療応答をもたらすために十分であるはずである。用量は、使用される特定のウイルスベクターの効力、および患者または動物の状態、ならびに処置されるべき患者の体重または表面積によって決定される。用量の大きさもまた、特定の患者によっては動物における特定のベクターまたは形質導入される細胞型の投与に伴う任意の有害な副作用の存在、性質、および程度によって決定される。特定の疾患の処置または予防において投与されるためのウイルスベクターの有効量を決定することにおいて、内科医または獣医師は循環する血漿レベル、ベクター毒性、および疾患の進行を評価することを必要とする。本発明の実施において、パルボウイルスベクターは、例えば、エアロゾル適用および吸入、経口的に、局所的に、筋肉内に、腹腔内に、膀胱内にまたはくも膜下腔内に静脈内注入によって投与され得る。投与の好ましい方法はしばしば、静脈注射でありまたは吸入によるが、パルボウイルスはウイルス媒介条件の局部および局所的処置のための適切なビヒクルにおいて適用され得る。投与に関して、本発明のパルボウイルスおよび形質導入された細胞型は、患者の容積および全体的な健康に適用される場合、パルボウイルスのLD₅₀および種々の濃度でのパルボウイルスベクターまたは細胞型の副作用によって決定された割合で投与され得る。投与は単回または分割された用量を介して達成され得る。アデノ随伴ウイルスベクターを使用してインビボ遺伝子治療のためのプロトコルが、脳(Alexanderら(1996)Human Gene Ther.7:841〜850)、肝(Koeberlら(1997 ）Proc，Nat'l．Acad．Sci．USA 94:1426〜1431)肺(Flotteら(1993)Proc．Nat'l Acad．Sci USA 90:10613〜10617)、および筋(Xiaoら(1996)J．Virol.70:8098〜 8108)に関して記載される。これらの方法は、当業者の方法によって他の標的器官へ適合され得る。実施例以下の実施例は例示のためであり、本発明を限定するためではない。実験手順Ａ．細胞培養 HeLa細胞(Schererら、(1953)J.Exp.Med.97:695〜709)、HT-1080細胞(Rasheed ら、(1974)Cancer33:1027〜33)、および293細胞(Graha・ら、(1977)J.Gen.Virol .36、59〜74)を、10%CO₂大気中37℃で、10%熱非働化(30分間56℃)胎児ウシ血清( HyClone，Logan，UT)、1.25Tg/mlアンホテリシン、100U/mlのペニシリン、および100Tg/mlのストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中で培養した。HT-1080細胞を、形質導入実験において、これらを使用する前に、HAT 培地(13.61Tg/mlヒポキサンチン、0.176Tg/mlアミノプテリンおよび3.875Tg/ml チミジンを含むDMEM)で保持し、集団におけるHPRT-細胞数を最小にした。 HSN039細胞をSV40複製起点およびプロモーター、変異neo遺伝子およびp15A起点(pASN039に存在するものと同じフラグメント；図１Ａおよび以下を参照のこと )、ならびにpLHL(モロニーマウス白血病ウイルス長末端反復プロモーターおよびハイグロマイシン耐性遺伝子を含む)のBstYIフラグメントを含むBamHIフラグメントを有するHeLa細胞の同時トランスフェクションによって作製した。トランスフェクトした細胞を0.2mg/mlハイグロマイシン(Calbiochem，San Diego，CA)における増殖によって選択した。HSN039細胞を単一のハイグロマイシン耐性コロニーから誘導し、そして1細胞あたり３コピーのneo遺伝子を含むことをサザン分析から示した。HSNO39細胞を、形質導入実験においてこれらを使用する前に0.2mg/ mlのハイグロマイシンを含む培地で培養した。Ｂ．プラスミドプラスミドpAAV/Ad(Samulskiら、（1989）J．Virol.63:3822〜8)、pACYC184(C hangら、（1978）J．Bacteriol．134:1141〜56)、pBluescript（Stratagene, La Jolla，CA)、psub201（Samulskiら、(1987）J．Virol．61:3096〜101)、pSV2ne o(SouthernおよびBerg（1982）J．Mol．Appl．Genet．1:327〜41)およびpTR(Rya nら(1996)J．Virol.70:1542-53)が記載される。pLHLは、A．D Miller（Fred Hut chinson Canser Research Center，Seattle，WA)からの贈与物であった。pRepCa p2は、psub201(pBluescriptのXbaI部位にAAV2 repおよびcap遺伝子を含む)のXba Iフラグメントを含む。pASNori2を、neo遺伝子の下流のBstBI部位(DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメントで末端を埋めた)のpSV2neo(pACYC184由来のSspI-B stl107I起点フラグメントを含む)のBamHI-Esp3I neoフラグメントを、 pSV2neoEsp3I部位へのBamHIリンカーの結合後、pTRのAAVベクター骨格のBglII部位へ挿入することによって構築した。これと同様のneoフラグメントはまたHSN03 9細胞株を構築するために使用した。pASN039は、末端を埋めたEagI部位のSanlI リンカー(5-CGGTCGACCG)を除いて、pASNori2と同一である。pASN0648は、末端を埋め、且つ再連結されたCspI部位を除いてpASNori2と同一である。pAHPe2/3は、 DNA配列決定によって決定されたように、pTRのBglII部位にヒトHPRT遺伝子座(Ge nBank HUMHPRTB)の14,057〜17,809ｂｐを含む。pAHPe2/3Xは、末端を埋め、且つ再連結されたXhoI部位を除いて、pAHPe2/3と同一である。pTR骨格に関連するHPR T配列の両方の向きを得、そして対応するベクターの相同組換え率において差異は明らかでなかった。ヒトHPRT配列は、以前に記載された(Patelら(1986)Mol．C ell．Biol．6:393-403)HuΣ３λファージ由来であった。Ｃ．ベクター産生ＡＡＶベクターストックを以下の様に調製した。２９３細胞を24デッシュ(10c m)に4×10⁶細胞個/ディッシュの密度でプレートした。翌日、各ディッシュを5.6 ×10⁷プラーク形成単位のアデノウイルス5型(ATCCVR-5)で感染させ、そして2時間後、リン酸カルシウム法（Sambrook、前出）によって、４Tgのベクタープラスミドおよび16Tgのヘルパープラスミドで同時トランスフェクトした。3日後細胞および培地を採集し、3回の凍結融解し、4℃で30分間、Sorvall HS4ローターにおいて5800×g(5500rpm)での遠心分離によって分類し、1時間37℃にて68単位/ml の小球菌ヌクレアーゼ（Pharmacia,Piscataway,NJ）で消化し、30分間37℃にて5 0ng/mlのトリプシンで処理し、そして4℃にて16時間27,000rpmでBeckman SW 28 ローターにおいて40%スクロースのリン酸緩衝化生理食塩水を介して遠心分離した。ペレットを8mlのCsClの0.51g/ml溶液に再懸濁し、そして4℃にて20時間35,0 00rpmでBeckmanSW41ローターにて遠心分離した。AAVビリオンを含む勾配の領域を回収し、50,000分子量カットオフ膜(Spectrum,Houston,TX)を通してDMEMに対して透析し、そしてCentricon100フイルター(Amicon,Inc.,Beverly,MA)で遠心分離することによって濃縮した。使用したベクタープラスミドは、AAV-SNoriについてはpASNor12、AAV-SN0648についてはpASN0648、AAV-SN039についてはpASN039 、 AAV-HPe2/3についてはpAHPe2/3、そしてAAV-HPe2/3XについてはpAHPe2/3Xであった。使用したヘルパープラスミドは、pAAV/Ad(Samulskiら(1989)前出)またはpRe pCap2（これは等価のストックカ価を生じる）であった。各ベクターストックの力価を以下のようなアルカリゲルのサザンブロットによって決定した。10のTIストック希釈を10%SDSの2 TI(10分間100℃で加熱した)と混合し、1.2％アルカリアガロースゲル(Sambrook、前出)を通して電気泳動し、H ybon-N膜(Amersham，Buckinghamshire，England)へブロットし、ベクター配列についてプローブした。各サンプル中に存在する全長線状ベクターDNAの量を、Mol ecular Dynamics Phosphorlmager 400S(Sunnyvale，CA)を使用して、同じゲル上に存在する標準との比較によって決定し、そして1mlのストックあたりのベクターゲノムの数をこの測定値から計算した。同様のアッセイを使用して、10TIの各勾配画分を電気泳動することによってCsCl勾配におけるベクター粒子の位置を決定した。1mlのストックあたりの完全なベクタープラスミドの数は、ベクター粒子数について使用された値(これは代表的には>10¹¹/ml)であった。Ｄ．DNA技術酵素を、New England BioLabs，(Beverly，MA)Boehringer Mannhelm，（India napolis，IN)またはStratagene(La Jolla，CA)から得、そして反応物を製造者奨励の条件を使用することによって実施した。プラスミド構築、DNA精製、サザンブロット分析および細菌培養を標準的手順(Sambrookら、前出)によって実施した。プラスミドを、Qiagen columns(Chatsworth，CA)を使用することによって調製した。色素末端サイクル配列決定を、ABI PRISM sequencing kit（Perkin Elmer ，Foster City，CA)を使用して実施し、そしてApplied Biosystems Inc．sequen cer(Foster City，CA)で分析した。オリゴヌクレオチドは、Cruachem，Inc．(Du lles．VA)からであった。組み込まれたneo遺伝子を、高分子量のゲノムDNA仔ウシ腸のホスファターゼを消化することによって形質導入されたHSN039細胞からレスキューし、サンプル中の遊離末端の連結を妨げ、熱非働化し、フェノールおよびクロロホルムで抽出し、そしてエタノールで沈殿させた。再懸濁したDNAをBamHIで消化し、フェノールおよびクロロホルムで抽出し、そしてエタノールで沈殿させた。生じるDNAフラグメントを再懸濁し、14℃にて一晩T4DNAリガーゼで環状化させ、そしてエレクトロポレーションまたは高効率化学形質転換によってE.coliへ移入させた。細菌コロニーをカナマイシンプレート上での増殖によって選択した。細菌プラスミドとして回復させた正確なneo遺伝子の39塩基対および648塩基対変異の配列決定をプライマー9606D（dATGGCTTTCTTGCCGCCA）(配列番号1)および9 607A(dATACGCTTGATCCGGCTAC)(配列番号2)で、それぞれ実施した。HPRTエキソン3 配列を、以下のように、以前に刊行された手順(Rossiterら、（1991）「Detecti on of deletions and point mutations」In PCR．A practical approach，M.J． McPhersonら、編(Oxford，England:IRL Press，67〜83頁))の改変を使用することによって、高分子量のゲノムDNAから増幅した。PCRを、2.1ピコモルの5プライマー(dCCTTATGAAACATGAGGGCAAAGG)(配列番号3)および3プライマー(TGTGACACAGGC AGACTGTGGATC)(配列番号4)の両方、6mM MgSO₄、1.25mMの各デオキシヌクレオシド三リン酸、および0.4単位のVent DNAポリメラーゼ(New England Biolabs，Bev erly，MA)を含む20TI反応容積中で100ngのゲノムDNAについて実施した。反応を、4.5分間94℃の変性、引き続き30秒間94℃、50秒間61℃、そして2分間72℃で30 サイクル、次いで最後の重合反応を5分間72℃で、PTC-200 thermocycler（MJ Re search，Watertown，MA)にて実施した。６つのTIの産物を、20サイクル同じ条件下において100TI容積中でさらに増幅させ、そしてPCR産物を、製造者のプロトコルに従って、QIAquick kit(Qiagen，Chatsworth，CA)を使用して精製し、そして 75ngの精製産物をプライマーdACCTACTGTTGCCACTA(配列番号5)でDNA配列決定するために使用した。Ｅ．形質導入アッセイ標準的な形質導入実験を、それぞれ、５×10³または１×10⁴のHSN039細胞／ウェルを96ウェルプレート(Nunc、Naperville，IL)または48ウェルプレート(Costa r、Cambridge、MA)、あるいは２×10⁴のHT−1080細胞を１日目に４８ウェルプレートにプレーティングすることによって行った。２日目に、培地を交換し、そしてベクターストック（DMEM中に調製した）をウェルに加えた。M0Iを、もとのプレーティングからの１つの細胞の倍加を仮定して計算した。３日目に、各ウェルをトリプシンで処理し、そして細胞を１０ｃｍディッシュにプレーティングした。４日目に、アッセイを各細胞株について変えた。 neo遺伝子修正実験について、９０％、9.5％、および0.5％の各ウェルからの細胞を、異なるディッシュにプレーティングした。４日目に、G418（1mg／ml活性化合物）を、90％ディッシュおよび9.5％ディッシュに添加し、そして選択を３〜４日ごとに培地を交換しながら10〜12日間継続した。G418を、0.5％ディッシュには添加せず、これを各々のもとのウェルからのコロニー形成単位（CFU）の総数についてのコントロールとして使用した。各ディッシュに存在するコロニーを、クーマシーブリリアントブルーGでの染色後に計数した。neo遺伝子修正率を、各々のもとのウェルについて、G418耐性CFU／総CFUの数値として計算した。 HPRT実験について、各ウェルからのすべての細胞を、3日目の10cmディッシュへプレーティングした後、10〜14日間選択せずに培養して、HPRT細胞に存在する HPRTタンパク質の除去を可能にした。培地を３〜４日毎に交換し、そしてディッシュが密集し過ぎるようになった場合には、細胞をトリプシン処理し、そして希釈物を新たなディッシュにプレーティングした。この表現型発現時期の後、10⁵ 、10⁴および10²の細胞の各培養物を、新たな10cmディッシュにプレーティングし、そして翌日に６TG（５Tg／ml）を10⁵および10⁴細胞ディッシュに添加した。10² の細胞ディッシュには６TG選択を適用しなかった。なぜなら、これらを使用して、プレーティング効率を計算したからである。細胞をさらに10日間培養し、クーマシーブリリアントブルーGで染色し、そして生存コロニーを計数した。6TG耐性CFUのパーセントを、プレーティング効率について補正した後決定した。実施例１：アデノ随伴ウイルスベクターを用いた変異体neo遺伝子の修正この実施例は、アデノ随伴ウイルス（AAV）に基づくベクターが、ヒト細胞における特定の染色体標的配列を効率よく改変し得ることを実証する。本発明者らは、選択可能なネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ne o）をマーカーとして用いて、形質導入による遺伝子修正を研究した。これらの実験のために構築したベクターは、AAVシャトルベクターAAV-SNori（図1A）に基づいた。このベクターは、細菌Tn5プロモーターおよびSV40初期プロモーターの両方の制御下にneo遺伝子を、ならびにEscherichia coliにおける安定な複製を支持するp15Aプラスミド複製起点を含む（Cozzarelliら（1968）Proc.Nat'l.Aca d.Sci.USA 60：992−999）。AAV2末端反復は、これらの内部配列に隣接し、そしてベクターゲノムの複製およびパッケージングに必要なすべてのシス作用性配列を含む（McLaughlinら（1988）J.Virol.62：1963−1973；Samulskiら、前出）。 AAV-SNoriによって形質導入された哺乳動物細胞は、G418に耐性であり、そして組み込まれたプロウイルスは、カナマイシン耐性を発現する細菌プラスミドとして回収され得る。変異を、AAV-SNorlベクターへ、neo遺伝子（bp 1は翻訳開始コドンである）のbp39（14ヌクレオチド挿入）にて、およびbp648にて（3ヌクレオチド挿入）導入して、ベクターAAV-SN039およびAAV-SN0648を生成した。両方の変異は、neo遺伝子の機能を破壊するが、２つの変異遺伝子の間の相同組換えは機能遺伝子を再生し得、そしてG418耐性を付与し得る。 HeLa細胞をヒトモデル系として使用して、AAVベクターによる相同組換えを研究した。AAV-SN039ゲノムの内部部分の組み込まれたコピー（末端反復を欠失する）を含むHeLa細胞株を、ハイグロマイシン選択マーカーとこのフラグメントとの同時トランスフェクションによって作製した（実験手順を参照のこと）。いくつかのハイグロマイシン耐性クローンを単離し、そしてサザン分析によって変異 neo遺伝子カセットの存在についてスクリーニングした。１つの細胞株（HSN039 と称する）は、異なる位置に組み込まれたneoカセットを１細胞当たり３つのインタクトコピー含むようであり、そしてこれをさらなる実験のために選択した。Ａ．neo遺伝子修正の頻度 HSN039細胞をAAV-SN0648ベクターストックに感染させ、トリプシンで処理し、そして翌日に異なる希釈でプレーティングし、次いで、感染２日後にG418中で選択した。希釈物をまた、選択なしで増殖させて、サンプル中のコロニー形成単位の総数を決定した。変異染色体neo遺伝子の流入するベクターゲノムによる修正を、G418に対する耐性のコロニーの割合として測定した。表１に示すように、AA V-SN0648での感染後に、約0.1％のHSN039細胞がG418に耐性であった。これは、最小neo遺伝子修正率を表す。なぜなら、いくつかの細胞が不適切な発現レベルを伴うサイレンス化された遺伝子を含み得るからである。HeLa細胞のAAV-SN0648 での感染は、G418耐性コロニーを産生しない。このことは、ベクター中のbp648 変異の復帰が検出可能な率で生じていないことを実証する。同様に、G418耐性コロニーは、感染していないHSN039細胞またはAAV-SN0 39で感染させたHSN039細胞において検出されない。このことは、染色体bp39変異の復帰が生じていなかったことを示す。約0.6％のHeLa細胞は、AAV-SNoriベクターで形質導入した後、G418 に対して耐性であった。このベクターは、機能的neo遺伝子を含み、そして非相同組換えによってランダムな染色体位置に組み込まれ得るからである。従って、 neo遺伝子修正率は、同様のベクターのランダムベクター組込み率よりも約５分の１であった。Ｂ．染色体neo遺伝子の構築 AAV-SN0648をHSN039細胞に感染させることによって得られたいくつかのG418耐性コロニーを単離し、約２×10⁷細胞に増殖させ、そしてサザンブロットによって分析した。BamHIでの消化後、親HSN039細胞からのゲノムDNAは、2.7、5.0、および＞20kbの３つの主要なneoにハイブリダイズしたバンドを含んでいた。これは、neo遺伝子カセットの３つの組み込まれたコピーを示す（図1B）。2.7kb Bam HIneoフラグメントを使用して、HSN039株を同時トランスフェクションによって生成した。かすかな8.0kbのバンドもまた、１細胞あたり１コピー未満で観察され、そしてこれはHSN039細胞のサブセットにおけるBamHI部位の１つでのメチル化または変異に起因し得た。１１のHSN039/AAV-SN0648 G418耐性クローンのうち４つ（１，２，９および10）は、親株と同じ３つの主要なバンドを含み、さらなるフラグメントを含まなかった。クローン４および５の8.0kbのバンドは、親株における同じサイズのかすかなバンドを表し得た。クローンのうち４つで新たなバンドが観察され、これは、ランダムベクター組込みもまた、ベクターに曝露された細胞のサブセットに生じていたことを示唆する。３つのクローンが親株に存在するバンドを欠失していた（３、４および７）。これは、再構成されたneoカセットというよりはBamHIの部位の改変によって説明され得る。なぜなら、これらのクローンにおいてなんら新規のバンドが観察されなかったからである。ベクターと染色体neoカセットとの間の相同性は、BamHIの部位まで及び、そしてこの部位でベクターDNAによって染色体配列の改変がこの部位を破壊してい得る。これらの結果は、単離されたG418耐性クローンの大部分が、少なくとも１つの修正されたneo遺伝子をベクターの組込みに起因するさらなる再構成なしに、含んでいたことを実証する。 C.修正されたneo遺伝子の配列相同組換えプロセスの信頼性を評価するために、本発明者らは、細菌プラスミドにおいていくつかの修正されたneo遺伝子を回収し、そして関連領域を配列決定した。HSN039細胞およびAAV-SN0648ベクターに存在するneo遺伝子カセットは、E.coliにおいて複製し得、そしてカナマイシン耐性を付与し得（図1A）、これにより、本発明者らが、細菌プラスミドとして修正されたneo遺伝子を回収することが可能になった。図１Bに示すG418耐性HSN039／AAV-SN0648クローン由来の染色体DNAをBamHIで消化し、DNAリガーゼで環状化し、そして細菌に移入し、次いでこの細菌をカナマイシン耐性について選択した。表２に示すように、修正されたneo遺伝子を7／11クローンから細菌プラスミドとして回収した。残りの４クローンからプラスミドを回収する、より永続的な試みもまた成功する可能性もある。これらの細菌から単離されたプラスミドを、BamHIで消化し、そして独特の部位を有するもののみが正しいとみなされる。2.7kbプラスミドを、７つのクローンの各々から回収した。このクローンは、制限消化によれば、bp39変異が存在しないことを除いて、HSN039株を産生するのに使用されたフラグメントと同一の環状化BamHIフラグメントであるようであった。第二の20kbプラスミドもまた、クローン11から回収し、これは、サザンブロットで観察された最高の分子量バンドに対応するようであった。この細胞株に存在する見かけ上少なくとも２つのne o遺伝子が修正されていた。回収されたプラスミドは、BsiEIでの消化に基づく野生型neo遺伝子を含み，bp39変異およびbp648変異を同定し得る（図1Aを参照のこと）。本発明者らは、回収された各プラスミドのbp39およびbp648変異の周囲の領域を配列決定した。200bpより長い配列を、各領域から得、そしてすべての場合において配列が野生型neo遺伝子の配列に正確に対応していた。従って、遺伝子修正プロセスは、染色体bp39変異に存在する14ヌクレオチド挿入の正確な欠失を、さらなる遺伝子変化を伴わず、そしてベクター中に存在するbp648変異の挿入なしに、導いた。しかし、本発明者らのアッセイは、機能的neo遺伝子の存在を必要とするので、neo遺伝子機能を破壊した組換え事象の間に作製されたさらなる変異は、本発明者らの分析から排除した。実施例２：AAVベクターによるヒトHPRT遺伝子の改変本発明者らはまた、ヒトヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子座（HPRT）におけるAAVベクターによる相同組換えを研究した。HPRT遺伝子は変異を研究するのによく使用される。なぜなら、HPRT^-細胞は、６チオグアニン（6TG）の存在下での増殖によってについて選択され得、そして単一のコピーX 連鎖遺伝子座での変異誘発が、二倍体雄性細胞において測定され得る。本発明者らは、HT-1080ヒト線維肉腫細胞を用いてHPRT遺伝子における組換えを研究した。なぜなら、この細胞株は偽二倍体雄性核型を有し（Rasheedら、（1974）Cance r 33：1027-1033）そしてHPRT遺伝子標的化実験において以前に使用されているからである（Pikaartら、（1992）Mol.Cell.Biol.12:5785-92；Zhengら(1991)Pr oc．Nat'l.Acad.Sci.USA88：8067-71）。エキソン２および３を包含するヒトHPRT遺伝子座の領域を含むAAVベクターを使用して、HT-1080細胞のHPRT遺伝子へ特定の変異を導入した（図2A）。AAV-HPe 2/3ベクターは、野生型ゲノム配列を含むが、AAV-HPe2/3Xベクターは、エキソン２に4ヌクレオチド挿入を含む。これは、HPRTコード配列においてフレームシフトを起こす。HT-1080細胞を、両方のベクターに感染させ、そして選択をしない時間の間、細胞を培養した後に6TG耐性について選択して、存在するHPRTタンパク質の除去を可能にした（実験手順を参考のこと）。図３に示すように、変異AA V-HPe2/3Xベクターに感染させた約1/2000のHT-1080細胞が6TG耐性であった。これは、最小のHPRT遺伝子改変頻度を示す。なぜなら、HT-1080細胞は、均一には二倍体ではなく、そしてさらなるX染色体を含み得るからである（Rasheedら、前出）。AAV-HPe2/3Xベクター標的化頻度は、バックグラウンド変異率より約30倍高かった。野生型ベクターでの感染は、バックグラウンドレベルより上のHPRT変異率には上昇しなかった。 AAV-HPe2/3Xでの感染後のいくつかの６TG耐性クローンのサザン分析は、ベクター変異が染色体HPRT遺伝子座に導入されたことを確証する。図２Bは、HindIII での消化の結果を示し、これは、ベクター配列の外側を切断し、そしてHT-1080 細胞においてエキソン２および３を含む6.8kbの染色体フラグメントを生成する。このバンドは、分析されるクローンのすべてにおいて不変であった。このことは、この領域での主要な再構成が存在しないことを実証する。５つの株は、おそらく、ランダムベクター組込みに起因して、さらなるバンドを含んでいた。PvuI でのさらなる消化は、10/13クローンが、染色体に対するベクターPvuI部位挿入変異の移入から予測される2.2kbのバンドを含んでいたことを示した(図2C)。今日までに、本発明者らは、AAV-HPe2/3Xに感染させた、24の独立した６TG耐性HT-1080クローンを分析し、そのうち18がサザン分析によって決定される場合、エキソン３に予測されるPvuI部位挿入を有していた。本発明者らは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて、これらのクローンの６つのゲノムDNAからエキソン３を増幅し、そしてPCR産物を配列決定した（実験手順を参照のこと）。少なくとも330bpの確実な配列を、各クローンから得、これには、エキソン３のすべてが含まれた。すべての場合で、配列全体は、エキソン３に予測された４ヌクレオチド挿入を除いて公開されたHPRT配列と同一であった。さらなるベクター組込み事象のないクローンを配列決定して、連結していないベクターDNAの増幅を避けた。親HT-1080 細胞株からの配列は、この挿入変異を含んでいなかった。実施例３：遺伝子修正に対するベクター用量の効果 HSN039細胞における変異neo遺伝子を、ある範囲の感染多重度を用いてAAV-SN0 648ベクターで修正した。図４は、１細胞当たりの感染ベクターゲノム対修正されたneo遺伝子を有する細胞の割合としてプロットしたいくつかの実験の結果を示す。この遺伝子修正率は、ベクター用量を40から２×10⁶ベクター粒子／細胞へ増加させるにつれ、約0.001から0.1％を超えるまでに増加した。これらの結果は、この遺伝子修正反応が、細胞に進入するベクター分子の数に限定されることを示唆する。実施例４：形質導入およびトランスフェクション相同組換え率の比較本発明者らは、AAV-SN0648ベクターストックで形質導入されたかまたはプラスミドpASN0648（これは、AAV-SN0648ゲノム全体を含む）でトランスフェクトされたHSN039細胞におけるneo遺伝子修正率を比較した（図５）。形質導入率は、トランスフェクションによって得られるものの少なくとも400倍であった。pASN039 プラスミド（これは、HSN039細胞株と同じ変異を含む）を用いたさらなるトランスフェクション実験は、pASN0648と類似の結果を与えた。このことは、pASN06 48の遺伝子修正率が、実際に、相同対合というよりはむしろ復帰に起因していたことを示唆する。従って、形質導入による相同対合率は、トランスフェクションによって得られるものの400倍をはるかに超えることがあり得た。これらの差異に対する１つの潜在的な説明は、プラスミド取り込みがほんのわずかの割合のトランスフェクトされた細胞において生じる一方、ベクターゲノムがおそらくすべての細胞に進入することである。HSN039細胞の安定なトランスフェクション効率は、pASNor12（これは、機能的neo遺伝子を含むことを除いてpASN0648と同一である）でのトランスフェクションにより決定した場合には、約７％であった。おそらく、さらに高い割合の細胞が、一過的にトランスフェクトされていた。７％のトランスフェクトされた細胞が機能的なプラスミド分子を含んでおり、そしてすべてのG418耐性コロニーがpASN0648をトランスフェクトすることによって得られるという控えめな推測を行った後でさえも、遺伝子修正率はなお、プラスミド DNA（1.7×10^-3対5.7×10^-5）を取り込んだ細胞の亜集団において観察されるものよりも形質導入された細胞において30倍高い。実施例５：正常ヒト線維芽細胞におけるHPRT遺伝子の改変標準的な形質導入実験を、1ウェル当たり５×10⁴の正常ヒト線維芽細胞を24ウェルプレートにプレーティングすることによって行った。2日目に、培地を交換し、そしてベクターストック（AAV-HPe2/3またはAAV-Hpe2/3X、DMEM中に調製した）をウェルに添加した。3日目に、各ウェルをトリプシンで処理し、そして細胞を10cmディッシュへとプレーティングした。4日目に、各ウェルからの細胞のすべてを12から14日間選択なしで培養して、HPRT細胞において存在するHPRTタンパク質の除去を可能にした。培地を3〜4日毎に交換し、そして細胞が密集しすぎるようになった場合に、細胞をトリプシンで処理し、そして希釈物を新たなディッシュにプレーティングした。この表現型発現期間の後、各培養物の10⁵、10⁴、および10²の細胞を新たな10cmディッシュにプレーティングし、そして翌日に6TG （10Tg/mg）を、10⁵および10⁴細胞ディッシュに添加した。10²細胞ディッシュには６TG選択を適用しなかった。なぜなら、これらを使用してプレーティング効率を計算したからである。細胞を、さらに10日間培養し、クーマシーブリリアントブルーGで染色し、そして生存コロニーを計数した。６TG耐性コロニー形成単位の割合を、プレーティング効率について補正した後に決定した。４つの異なる正常線維芽細胞株を研究した：MHF1、MHF2,およびMHF3は、正常雄からであり、そしてFHF1は、正常雌からであった。図６に示すように、HPRT遺伝子の改変は、1細胞あたりの感染するウイルスゲノムの数に比例していた。改変は、４つすべての線維芽細胞株のHPRT遺伝子に導入され得た（図７）。実施例のまとめこれらの実施例は、アデノ随伴ウイルス（AVV）に基づくウイルスが効率的にかつ特異的に脊椎動物染色体標的配列を改変することを実証する。組み込まれたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子および正常X連鎖ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子の両方がAAVベクターによって標的化された。部位特異的な遺伝子改変は、トランスフェクションによって達成され得るよりも有意により高い率である、総細胞集団の＞0.1％に導入され得、そしてこの改変は、正常な初代細胞に導入され得る。改変された細胞の大部分は、他の検出可能な遺伝子変化を含まず、そしてDNA配列決定は、このプロセスの高い信頼性を実証した。これらの結果は,パルボウイルスベクターが広範な種々の脊椎動物細胞のゲノムDNAへの特定の遺伝子変化を導入するのに有用であることを示唆する。本明細書において記載された実施例および実施態様は例示の目的のためのみであり、そして種々の改変または変更がそれらを参酌して当業者に示唆され、そして本願の精神および範囲ならびに添付の請求の範囲の範囲内に含まれることが理解される。本明細書において引用されたすべての刊行物、特許、および特許出願は、本明細書中で、すべての目的で参考として援用される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．予め選択された標的遺伝子座に改変を有する脊椎動物細胞を産生する方法であって、以下： a）導入される該改変を除いて該標的遺伝子座と実質的に同一のDNA配列を含む標的化構築物；および b）少なくとも１つのパルボウイルスITRまたは機能的等価物の全部または一部、を有する組換えパルボウイルスベクターを脊椎動物細胞に導入する工程であってここで、相同対合が該標的化構築物と該標的遺伝子座との間に生じ、これにより該改変が該標的遺伝子座に導入される、工程を包含する、方法。２．形質導入によって前記脊椎動物に前記組換えウイルスゲノムを進入させる工程を包含する、請求項１に記載の方法。３．前記組換えパルボウイルスベクターが、前記脊椎動物細胞にとって外因性であるDNAをさらに含み、ここで該外因性DNAが前記標的遺伝子座の改変について予め選択されている、請求項１に記載の方法。４．前記外因性DNAが前記脊椎動物細胞において機能的である選択マーカーを含む、請求項３に記載の方法。５．前記改変が１つ以上の欠失、挿入、置換、またはそれらの組合せを含む、請求項１に記載の方法。６．１つ以上のさらなる予め選択された標的遺伝子座に、該導入される改変を除いて、該さらなる標的遺伝子座の各々と実質的に同一であるDNA配列を含む標的化構築物を含む組換えパルボウイルスベクターを、前記脊椎動物細胞に導入することによって、改変を導入する工程、をさらに包含する、請求項１に記載の方法。７．前記標的化構築物の両方が単一のパルボウイルスベクターに存在する、請求項６に記載の方法。８．前記標的遺伝子座が、転写調節領域、スプライスシグナル、DNA複製に関与する配列、マトリクス接着点、染色体組換えホットスポット、構造遺伝子、またはシグナル配列のためのコード領域、およびそれらの部分からなる群から選択されるDNA配列を含む、請求項１に記載の方法。９．前記DNA配列が構造遺伝子を含み、そして前記改変がアミノ酸置換、欠失、挿入、またはそれらの組合せを、前記遺伝子によってコードされるポリペプチドにおいて生じる、請求項８に記載の方法。１０．前記DNA配列が、プロモーター、エンハンサー、応答エレメント、転写終結シグナル、および遺伝子座制御領域からなる群から選択される転写調節領域を含む、請求項８に記載の方法。１１．改変された前記転写調節領域の制御下の遺伝子が、該遺伝子が改変されていない該転写調節領域の制御下にある等価な条件下で該遺伝子が発現されるレベルとは異なるレベルで発現される、請求項１０に記載の方法。１２．改変された前記転写調節領域の制御下にある前記遺伝子が、該遺伝子が改変されていない該転写調節領域の制御下にある等価な条件下で該遺伝子が発現されるレベルより高いレベルで発現される、請求項１１に記載の方法。１３．改変された前記転写調節領域の制御下にある前記遺伝子が、改変されていない該転写調節領域の制御下にある場合に該遺伝子の発現をもたらさない条件下で発現される、請求項１２に記載の方法。１４．前記転写調節領域が前記改変によって誘導性にされる、請求項１１に記載の方法。１５．改変された前記転写調節領域の制御下にある前記遺伝子が、該遺伝子が改変されていない該転写調節領域の制御下にある等価な条件下で該遺伝子が発現されるレベルより低いレベルで発現される、請求項１１に記載の方法。１６．前記転写調節領域の制御下にある遺伝子が改変されていない該転写調節領域の制御下にある場合に該遺伝子の発現をもたらす条件下では該改変を有する細胞によって発現されない、請求項１５に記載の方法。１７．前記脊椎動物が複製する細胞である、請求項１に記載の方法。１８．前記脊椎動物が哺乳動物細胞である、請求項１に記載の方法。１９．前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項１８に記載の方法。２０．前記ヒト細胞がヒト線維芽細胞である、請求項１９に記載の方法。２１．前記脊椎動物細胞が細胞株から得られる、請求項１に記載の方法。２２．前記脊椎動物細胞が初代細胞である、請求項１に記載の方法。２３．前記脊椎動物細胞が形質転換、不死化、または悪性化した細胞である、請求項１に記載の方法。２４．前記脊椎動物細胞が、該細胞から生物が再構成され得る細胞である、請求項１に記載の方法。２５．核が前記脊椎動物細胞から除去され、そして該細胞から生物が再構成され得る細胞に移植されている、請求項１に記載の方法。２６．前記細胞が、胚幹細胞、精子細胞、卵細胞、受精卵細胞、および体細胞再増殖細胞からなる群より選択される、請求項２４に記載の方法。２７．前記パルボウイルスベクターがアデノ随伴ウイルスベクターである、請求項１に記載の方法。２８．前記組換えパルボウイルスベクターが、少なくとも１つのパルボウイルス末端反復セグメントをさらに含む、請求項１に記載の方法。２９．複数の細胞が前記形質導入方法に供され、そして該細胞が少なくとも約0. 01％の割合で形質導入される、請求項１に記載の方法。３０．前記細胞が少なくとも約0.1％の割合で形質導入される、請求項２９に記載の方法。３１．請求項１に記載の方法によって、予め決定した標的遺伝子座に、特定の遺伝子改変が導入された細胞。３２．前記細胞が脊椎動物内に存在する、請求項３１に記載の細胞。３３．請求項３１に記載の細胞を含む脊椎動物。３４．標的遺伝子座の改変を有する細胞を含む動物を作製する方法であって、以下の工程：以下：（a）導入される該改変を除いて、該標的遺伝子座と実質的に同一であるDNA配列を含む標的化構築物；（b）少なくとも１つのパルボウイルスITRまたは機能的等価物の全部または一部、を含む組換えパルボウイルスベクターを、再構成され得る動物に由来する細胞へ導入する工程であって；ここで、相同対合が、該標的化構築物と該標的遺伝子座との間に生じ、それによって該改変が該標的遺伝子座へ導入される、工程；ならびに、分娩まで該細胞および／または該細胞の子孫を該得られた胚を有する雌中で培養および再移植する工程、を包含する、方法。３５．標的遺伝子座の改変を有する細胞を含む動物を作製する方法であって、以下の工程：以下：（c）導入される該改変を除いて、該標的遺伝子座と実質的に同一であるDNA配列を含む標的化構築物；および（d）少なくとも１つのパルボウイルスITRまたは機能的等価物の全部または一部、を含む組換えパルボウイルスベクターを、脊椎動物細胞へ導入する工程であって；ここで、相同対合が、該標的化構築物と該標的遺伝子座との間に生じ、それによって該改変が該標的遺伝子座へ導入される、工程；該細胞由来の核を、再構成され得る動物に由来する第二の細胞に導入する工程；ならびに、分娩まで該細胞および／または該第二の細胞の子孫を該得られた胚を有する雌中で培養および再移植する工程、を包含する、方法。３６．前記動物が、トランスジェニック動物である、請求項３４または３５に記載の方法。３７．前記動物が、キメラ動物である、請求項３４または３５に記載の方法。３８．標的遺伝子座の改変を、脊椎動物における細胞に導入するための方法であって、以下の工程：以下：（a）導入される該改変を除いて、該標的遺伝子座と実質的に同一であるDNA配列を含む標的化構築物；（b）少なくとも１つのパルボウイルスITRまたは機能的等価物の全部または一部、を含む組換えパルボウイルスベクターを、エキソビボで細胞へ導入する工程であって；ここで、相同対合が、該標的化構築物と該標的遺伝子座との間に生じ、それによって該改変が該標的遺伝子座へ導入される、工程；ならびに、該改変された細胞を脊椎動物へ導入する工程、を包含する、方法。３９．前記改変された細胞が、該改変された細胞が得られた脊椎動物と同一の脊椎動物に導入される、請求項３８に記載の方法。４０．前記脊椎動物が哺乳動物である、請求項３８に記載の方法。４１．前記哺乳動物がヒトである、請求項４０に記載の方法。４２．前記細胞が、肝細胞、筋肉細胞、線維芽細胞、間質細胞、皮膚細胞、幹細胞、造血細胞、胎児臍帯血細胞、Tリンパ球、Bリンパ球、または単球である、請求項３８に記載の方法。４３．脊椎動物における細胞において標的遺伝子座に改変を導入するための方法であって、以下：該導入される改変を除いて該標的遺伝子座と実質的に同一であるDNA配列を含む標的化構築物を含む組換えウイルスゲノムを有するパルボウイルスベクターを該脊椎動物に投与する工程であって、相同対合が、該標的化構築物と該標的遺伝子座との間に生じ、それにより該改変が該標的遺伝子座へ導入される、工程、を包含する方法。４４．前記脊椎動物が哺乳動物である、請求項４３に記載の方法。