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JP2002528088A - パルボウイルスベクターによる標的化遺伝子修飾 - Google Patents

パルボウイルスベクターによる標的化遺伝子修飾

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Publication number
JP2002528088A
JP2002528088A JP2000578469A JP2000578469A JP2002528088A JP 2002528088 A JP2002528088 A JP 2002528088A JP 2000578469 A JP2000578469 A JP 2000578469A JP 2000578469 A JP2000578469 A JP 2000578469A JP 2002528088 A JP2002528088 A JP 2002528088A
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JP
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cells
gene
target locus
cell
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Withdrawn
Application number
JP2000578469A
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Inventor
ダブリュ． ラッセル，デイビッド
ケー． ヒラタ，ロリー
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University of Washington
Original Assignee
University of Washington
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Filing date
Publication date
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、アデノ陏伴ウイルス（ＡＡＶ）を含む、パルボウイルス・ベクターを用いた 脊椎動物細胞において標的遺伝子修飾を獲得する方法を提供する。本発明に係る方法において使用される パルボウイルス。ベクターは、担同対合により、細胞ゲノム内の予備選定標的遺伝子座に対する特異的遺伝子修飾をターゲッティングすることができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 連邦政府後援研究に関する説明 本発明は、国立保健研究所により授与された認可第PO1HL53750号下で、政府後
援で成された。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００２】 発明の背景 技術分野 本発明は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を基礎にしたベクターを含めたパル
ボウイルスベクターを用いた相同対合による脊椎動物細胞における細胞ＤＮＡの
標的化修飾の分野に関する。
【０００３】 背景 遺伝子ターゲッティングにより哺乳類染色体に限定突然変異を導入するための
従来既知の方法は、トランスフェクション、エレクトロポレーションまたはマイ
クロインジェクションを包含する（Smithies et al.（1985）Nature 317:230-23
4; Thomas et al.（1986）Cell 44:419-428）。これらの方法は、マイクロイン
ジェクションを除いて、全細胞集団の小分画中でのみ、マウス胚性幹細胞の場合
には１０-6のオーダーで、相同組換え事象を生じる（Doetschman et al.（1987
）Nature 330:576-578; Thomas and Capecchi（1987）Cell 51:503-512）。した
がって、これらの方法のルーチン使用は、形質転換化細胞の予備選別を要するが
、これが正常細胞およびin vivo用途に当該技術を適用するのを難しくする。
【０００４】 これらの制限を克服するために、そして染色体遺伝子ターゲッティング実験を
成し遂げるためにウイルスベクターの形質導入を用いる試みが、レトロウイルス
およびアデノウイルスベクターを用いて実施されてきたが、しかし結果は、相同
組換えが10-5〜10-6細胞で起きるというトランスフェクションにより得られた結
果より有意に良好であるというわけではなかった（Ellis and Bernstein（1989
）Mol. Cell. Biol. 9:1621-1627; Wang and Talor（1993）Mol. Cell. Biol. 1
3:918-927）。
【０００５】 アデノ随伴ウイルス２（ＡＡＶ）は、哺乳類染色体中に組み込まれ得る形質導
入ベクターとして開発された4.7kb一本鎖ＤＮＡウイルスである（Muzyczka（199
2）Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158:97-129）。組込み野生型ＡＡＶプロウ
イルスの３分の２は、特定のヒト第１９染色体部位19q13-qterで見出される（Ko
tin et al.（1991）Genomics 10:831-834; Kotin et al.（1990）Proc. Natl. A
cad. Sci. USA 87:2211-2215; Samulski et al.（1991）EMBO J. 10:3941-3950
）。部位特異的組込み事象は、ウイルスＲｅｐタンパク質により媒介されると考
えられる非相同組換え反応である（Giraud et al.（1995）J. Virol. 69:691769
24; Linden et al.（1996）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7966-7972）。この
特徴はいくつかの用途で有用であることがわかっているが、しかしウイルスrep
遺伝子に欠失を有するＡＡＶベクターはこの同一遺伝子座で組み込むことは判明
していない（Russell et al.（1994）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91::8915-89
19; Walsh et al.（1992）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89::7257-7261）。組込
みrep-ＡＡＶベクタープロウイルスのサザーン分析は、組込み部位が無作為であ
ることを示唆しており（Lebkowski et al.（1988）Mol. Cell. Biol. 8:3988-39
96; McLaughlin et al.（1988）J. Virol.62:1963-1973; Russell et al.（1994
）上記；Walsh et al.（1992）上記）、そして組込みベクター接合断片のシーケ
ンシングは、種々の染色体部位での非相同組換えにより組込みが起きることを確
証している。
【０００６】 真核生物ウイルスを基礎にしたベクターの組込みの開発は哺乳類染色体中への
遺伝子の有効な導入を可能にしてきたが、しかし特定の染色体配列を修飾するの
が好ましい多数の状況が存在する。例えば、遺伝子に対する元の遺伝子座以外の
染色体位置に矯正バージョンの遺伝子を導入するよりむしろ、元の遺伝子座の欠
陥対立遺伝子を矯正し得る。この能力は、望ましくない染色体遺伝子型を排除し
、遺伝子発現に及ぼす位置効果を回避し得る。先在遺伝子座を修飾するこのよう
な能力の必要性は、遺伝子療法に置いて特に急務であり、この場合、突然変異体
遺伝子は優性作用を有し得るし、そして発現に関する組織特異的制御はしばしば
重大である。
【０００７】 したがって、高頻度で脊椎動物細胞ゲノム中の選別標識部位での特定の遺伝子
修飾を得るための方法に対する必要性が存在する。本発明は、このおよびその他
の必要性を満たす。 発明の要約 本発明は、予備選定標的遺伝子座に修飾を有する脊椎動物細胞の産生方法を提
供する。方法は、ａ）修飾が導入されている以外は実質的に標的遺伝子座と同一
であるＤＮＡ配列を包含するターゲッティング構築物、およびｂ）少なくとも１
つのパルボウイルスＩＴＲまたは機能的等価物の全部または一部を包含する組換
えパルボウイルスベクターゲノムを細胞に接触させることを包含する。細胞中へ
のベクターの侵入時に、ターゲッティング構築物と標的遺伝子座との間に相同対
合が起きて、標的遺伝子座に導入されている修飾を生じる。修飾は、１つ又はそ
れ以上の欠失、挿入、置換またはそれらの組合せを含み得る。方法は、二次修飾
以外は二次標的遺伝子座と少なくとも実質的に同一である二次ターゲッティング
構築物を有するパルボウイルスベクターを用いて細胞を形質導入することにより
二次標的遺伝子座での二次修飾を導入するために用いられ得る。さらに別の標的
遺伝子座は、適切なターゲッティング構築物を有するパルボウイルスベクターを
用いて形質導入することにより修飾され得る。１つより多いターゲッティング構
築物が、各パルボウイルスベクター上に含まれ得る。
【０００８】 さらに、修飾が導入されている以外は標的遺伝子座と実質的に同一であるＤＮ
Ａ配列を含むターゲッティング構築物を含む組換えウイルスゲノムを有するパル
ボウイルスベクターと細胞を接触させることにより、細胞または細胞の先祖に導
入された１つ又はそれ以上の予備選定標的遺伝子座での特定の遺伝子修飾を含有
する脊椎動物細胞も、本発明により提供される。これらの細胞はin vitro、ex v
ivoで培養され得るし、または生物体の一部として存在し得る。
【０００９】 本発明は、ａ）修飾が導入されている以外は実質的に標的遺伝子座と同一であ
るＤＮＡ配列を包含するターゲッティング構築物、およびｂ）少なくとも１つの
パルボウイルスＩＴＲまたはその機能的等価物の全部または一部を含む組換えパ
ルボウイルスベクターを細胞にex vivoに接触させることにより脊椎動物の細胞
中での標的遺伝子座の修飾の導入方法も提供する。組換えパルボウイルスベクタ
ーは細胞中に導入され、その後、ターゲッティング構築物と標的遺伝子座との間
に相同対合が起きて、標的遺伝子座の細胞ＤＮＡに導入されている修飾を生じる
。修飾細胞は次に、脊椎動物に導入される。
【００１０】 別の実施態様では、本発明は、組換えパルボウイルスベクターを脊椎動物に投
与することにより脊椎動物中の細胞における標的遺伝子座の修飾の作製方法を提
供する。これらの方法に用いられるパルボウイルスベクターは、ａ）修飾が導入
されている以外は実質的に標的遺伝子座と同一であるＤＮＡ配列を包含するター
ゲッティング構築物、およびｂ）少なくとも１つのパルボウイルスＩＴＲまたは
その機能的等価物の全部または一部を含む。組換えウイルスゲノムが細胞に導入
され、その後、ターゲッティング構築物と標的遺伝子座との間に相同対合が起き
て、標的遺伝子座の細胞ＤＮＡに導入されている修飾を生じる。
【００１１】 本発明は、当該標的遺伝子座の修飾を有する細胞を含む動物の作製方法も提供
する。本方法は、ａ）修飾が導入されている以外は実質的に標的遺伝子座と同一
であるＤＮＡ配列を包含するターゲッティング構築物、およびｂ）少なくとも１
つのパルボウイルスＩＴＲまたは機能的等価物の全部または一部を含む組換えパ
ルボウイルスベクターを、動物が再構成され得る細胞中に導入することを包含す
る。ターゲッティング構築物と標的遺伝子座との間に相同対合が起きて、標的遺
伝子座の細胞ＤＮＡに導入されている修飾を生じる。細胞および／または細胞の
子孫は次に、発生させれて胚となり、臨月を迎える。その結果生じる動物は、ト
ランスジェニックまたはキメラ動物であり得るが、これも本発明の一部である。
【００１２】 別の実施態様では、本発明の方法は、核移植に用いられる修飾核を得るために
用いられる。これらの方法は、核供与体として役立たせるために細胞のゲノムの
標的遺伝子座に所望の修飾を導入するために本発明の遺伝子ターゲッティング法
を用いることを包含する。所望の修飾を有する細胞からの核は、動物が再構成さ
れ得る二次細胞中に導入される。この細胞は次に、胚に発生させられて、臨月を
迎える。さらに、その結果生じる動物は、トランスジェニックまたはキメラであ
るが、これも本発明により提供される。
【００１３】 本発明は、細胞のゲノム中に組換えシグナルを導入するための方法も提供する
。これらの組換えシグナル、例えばlox部位は、特定のポリヌクレオチド配列（
例えばＣｒｅポリペプチド）を認識する組換え酵素のための基質として役立ち得
る。これらの実施態様では、ターゲッティング構築物は、標的遺伝子座と実質的
に同一であるポリヌクレオチド配列が側面に位置する組換えシグナルを含む。細
胞中へのターゲッティング構築物の導入時に、相同対合が標的遺伝子座に関して
起こり、標的遺伝子座に導入されている組換えシグナルを生じる。
【００１４】 遺伝子ターゲッティングの効率を増強するための方法も、本発明により提供さ
れる。いくつかの実施態様では、組換えパルボウイルスベクターはターゲッティ
ングエンハンサーを含む。エンハンサーは、例えばポリヌクレオチドに対する修
飾、例えば付加生成物、ピリミジンダイマー、糖および／または塩基の欠失、あ
るいはＤＮＡ主鎖のその他の修飾等を含み得る。ターゲッティングエンハンサー
は、遺伝子ターゲッティングを増強し得るポリペプチド、例えば組換えポリペプ
チド、ＤＮＡ修復酵素等も含み得る。これらは、例えばウイルス粒子内に含まれ
得る。
【００１５】 遺伝子ターゲッティングの効率を増強するために本発明により提供されるその
他の方法は、ターゲッティング効率を増強する作用物質で標的細胞を処理するこ
とを包含する。これらの作用物質としては、例えば１つ又はそれ以上の細胞周期
モジュレーター、ＤＮＡ修復モジュレーター、ＤＮＡ組換えモジュレーター、ク
ロマチンパッケージングのモジュレーター、アポトーシスの阻害剤およびＤＮＡ
メチル化阻害剤が挙げられる。
【００１６】 本発明は、パルボウイルスベクター介在性遺伝子ターゲッティングの効率の確
定方法も提供する。これらの方法は、欠陥レポーター遺伝子を含む組込みレトロ
ウイルスプロウイルスを有する細胞を提供することを包含する。レポーター遺伝
子は、検出可能表現型を有するレポーター遺伝子生成物の発現を妨げる一次突然
変異を有するという点で欠陥がある。レトロウイルスプロウイルスは、どの細胞
でも均一である標的遺伝子座として役立つ。組換えパルボウイルスベクターは次
に、細胞に導入される。組換えパルボウイルスベクターは、レポーター遺伝子の
少なくともポリヌクレオチド亜細胞を包含するが、この場合、ポリヌクレオチド
亜配列は一次突然変異の位置と重複するが、しかし一次突然変異を含まない。パ
ルボウイルスベクター中に存在するレポーター遺伝子亜配列は、検出可能表現型
を有するレポーター遺伝子生成物の発現を妨げる二次突然変異のために、あるい
は亜配列が全長レポーター遺伝子生成物をコードしないために、機能性レポータ
ー遺伝子生成物をコードしない。相同対合は、ポリヌクレオチド亜配列とレポー
ター遺伝子との間に起きて、一次突然変異の矯正およびレポーター遺伝子の発現
を生じる。次に、レポーター遺伝子生成物の存在または非存在を検出することに
より、遺伝子ターゲッティングの効率が確定される。
【００１７】 本発明のさらに別の実施態様は、標的遺伝子座で遺伝子ターゲッティングが起
きた細胞に関して濃縮するための方法を提供する。その方法は、ａ）検出可能表
現型を有するレポーター遺伝子生成物の発現を妨げる一次突然変異を包含するレ
ポーター遺伝子、およびｂ）修飾が望まれる標的遺伝子座を有する細胞を提供す
ることを包含する。組換えパルボウイルスベクターは、以下の素子を有するこれ
らの細胞中に導入される：ａ）レポーター遺伝子のポリヌクレオチド亜配列を包
含する選別構築物であって、ここで、ポリヌクレオチド亜配列は一次突然変異の
位置と重複するが、しかし一次突然変異を含まず、そして検出可能表現型を有す
るレポーター遺伝子生成物の発現を妨げる二次突然変異を包含し、そしてｂ）修
飾が導入されている以外は標的遺伝子座と実質的に同一であるＤＮＡ配列を包含
するターゲッティング構築物。次に、レポーター遺伝子生成物が発現される細胞
を同定する。レポーター遺伝子生成物を発現する細胞は、相同対合がポリヌクレ
オチド亜配列とレポーター遺伝子との間で起きて、一次突然変異の矯正とレポー
ター遺伝子の発現を生じた細胞の集団を包含する。細胞のこの集団は次に、ター
ゲッティング構築物と標的遺伝子座との間で相同対合が起きて、標的遺伝子座に
導入されている修飾を生じたものを同定するためにスクリーニングされる。
【００１８】 発明の詳細な説明 定義 別記しない限り、本明細書中で用いられる技術的および科学的用語はすべて、
本発明が属する業界の当業者により一般的に理解されているのと同一の意味を有
する。本明細書中に記載されたものと同様のまたは等価のあらゆる方法および物
質が本発明の実施または試験に用いられ得るが、しかし好ましい方法および物質
が記載される。本発明のために、以下の用語は下記のように定義される。
【００１９】 「細胞株」という用語は、本明細書中で用いられる場合、それらが属する細胞
株の細胞から得られる限り、個々の細胞、収穫細胞および細胞を含有する培養を
指す。細胞株は、その下部が長期間、典型的には少なくとも約６ヶ月間、依然と
して生育可能である場合には、「連続」、「不死」または「安定」といわれる。
細胞株が考察されるためには、本明細書中では、細胞は、少なくとも約50継代の
間ずっと生育可能でなければならない。「一次細胞」または「正常細胞」とは、
対照的に、培養中で長期間、ずっと生育可能でない細胞を指す。
【００２０】 「シス−活性核酸」とは、核酸配列の生物学的活性をコードするかまたは指図
する核酸亜配列を指す。例えば、シス−活性核酸は、宿主染色体中の核酸配列の
修飾に必要な核酸亜配列、および核酸複製の起点を含む。 「構成性プロモーター」という用語は、ほとんどの環境および発生条件下で活
性であるプロモーターを指す。
【００２１】 「等価条件」という用語は、細胞および細胞による特定の遺伝子の発現に影響
を及ぼし得る発生的、環境的、増殖相およびその他の条件を指す。例えば、ホル
モンによる遺伝子発現の誘導可能性が実験される場合、２つの細胞は、ホルモン
のレベルが各細胞に関してほぼ同一である場合、等価条件下にある。同様に、遺
伝子の発現の細胞周期特異性が研究中である場合、２つの細胞は、細胞周期のほ
ぼ同一段階にある場合、同一条件下にある。
【００２２】 「外因性」という用語は、本明細書中で用いる場合、直接的に、あるいは野生
型細胞中に存在しない遺伝子からの発現により細胞に付加される部分を指す。「
外因性」というこの定義内に含まれるのは、親または細胞の初期先祖に付加され
た、そして親細胞から継代された結果として当該細胞中に存在する部分である。
対照として、「野生型」とは、外因性部分を含有しない細胞を指す。「外因性Ｄ
ＮＡ」は、本明細書中で用いる場合、野生型標的細胞中のＤＮＡ配列、ならびに
野生型細胞またはウイルスゲノム中に存在しないＤＮＡ配列と比較して、１つ又
はそれ以上の欠失、点突然変異および／または挿入、あるいはそれらの混合物を
有するＤＮＡ配列を含む。 「相同対合」という用語は、本明細書中で用いる場合、互いに相補的であるかま
たは実質的に相補的である２つの核酸配列または亜配列間で起こり得る対合を指
す。下記のように、２つの配列は、配列の一方が二次配列と相補的である核酸と
実質的に同一である場合、互いに実質的に相補的である。
【００２３】 「宿主細胞」または「標的細胞」という用語は、特殊化ベクターで形質導入さ
れる細胞を指す。細胞は、任意に、in vitro細胞、例えば細胞培養から得られる
もの、ex vivo細胞、例えば生物体から得られるもの、およびin vivo細胞、例え
ば生物体内の細胞から選択される。 「同一の」という用語は、２つの核酸またはポリペプチド配列の情況では、最
大相似点に関して整列された場合に同一である２つの配列中の残基を指す。比較
のための最適アラインメントは、例えばSmith and Waterman（1981）Adv. Appl.
Math. 2:482の局所相同算法により、Needleman and Wunsch（1970）J. Mol. Bi
ol.48:443の相同アラインメント算法により、Pearson and Lipman（1988）Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 85:2444の類似性に関する探索法により、これらの算法
のコンピューター処理実行（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics
Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩ
Ｔ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）により、または点検により実行され得る。
【００２４】 ２つの核酸配列が「実質的に同一である」ということは、一次核酸がコードす
るポリペプチドが、二次核酸によりコードされるポリペプチドと免疫学的に交差
反応するということである。２つの核酸配列が実質的に同一であるということの
別の意味は、２つの分子および／またはそれらの相補鎖が緊縮条件下で互いにハ
イブリダイズすることである。
【００２５】 「特異的にハイブリダイズする」という語句は、配列が複合体混合物（例えば
全細胞）ＤＮＡまたはＲＮＡ中に存在する場合、緊縮条件下での特定のヌクレオ
チド配列とだけの分子の結合、二重化、ハイブリダイゼーションを指す。「緊縮
条件」とは、プローブがその標的亜配列とハイブリダイズするが、他の配列とは
ハイブリダイズしない条件を指す。緊縮条件は配列依存性であり、異なる環境で
は異なる。配列が長いほど、特異的にハイブリダイズする温度は高い。一般的に
、緊縮条件は、限定イオン強度およびｐＨでの特定の配列に関する加熱融点（Ｔ
ｍ）より約5℃低いように選択される。Ｔｍは、平衡状態で、標的配列と相補的
なプローブの50％が標的配列とハイブリダイズする温度（限定イオン強度、ｐＨ
および核酸濃度下で）である（標的配列は一般的に余分に存在するので、Ｔｍで
は、平衡状態でプローブの５０％が占有される）。典型的には、緊縮条件は、ｐ
Ｈ7.0〜8.3で塩濃度が約1.0 M未満の、典型的には約0.01〜1.0 Mナトリウムイオ
ン（またはその他の塩）、そして温度が短プローブ（例えば10〜50ヌクレオチド
）に関しては少なくとも約30℃、長プローブ（例えば50ヌクレオチドより長い）
に関しては少なくとも約60℃である条件である。緊縮条件は、ホルムアミドのよ
うな不安定剤の付加によっても達成され得る。
【００２６】 「誘導可能」プロモーターとは、環境的または発生的調節下にあるプロモータ
ーである。 「標識化核酸プローブ」という用語は、プローブと結合した標識の存在を検出
することによりプローブの存在が検出され得るように、リンカーにより、または
イオン、ファンデルワールスまたは水素「結合」により、共有的に標識に結合さ
れる核酸プローブを指す。
【００２７】 「標識」という用語は、分光学的、放射線学的、光化学的、生化学的、免疫科
学的または化学的手段により検出可能な部分を指す。例えば、有用な標識として
は、32Ｐ、35Ｓ、蛍光染料、高電子密度試薬、酵素（例えばＥＬＩＳに一般的に
用いられるような）、ビオチン、ジオキシゲニン、グリーン蛍光タンパク質（Ｇ
ＦＰ）、または抗血清またはモノクローナル抗体が利用可能であるハプテンおよ
びタンパク質がが得られる。
【００２８】 「核酸」という用語は、一本鎖または二本鎖継代のデオキシリボヌクレオチド
またはリボヌクレオチドポリマーを指し、限定されない限り、天然ヌクレオチド
と同様の方法で核酸とハイブリダイズする天然ヌクレオチドの既知の類似体を包
含する。別記しない限り、特定の核酸配列は、その相補的配列を含む。 「操作可能的に連結される」という用語は、核酸発現制御配列（例えば、プロ
モーターまたは転写因子結合部位のアレイ）と二次核酸配列との間の機能的連結
を指すが、この場合、発現制御配列は、二次配列に対応する核酸の転写を指図す
る。
【００２９】 「組換えパルボウイルスベクターゲノム」という用語は、パルボウイルスＤＮ
Ａの他に非パルボウイルスＤＮＡを保有するパルボウイルス由来のベクターゲノ
ムを指す。組換えベクターゲノムは、典型的には少なくとも１つのターゲッティ
ング構築物を含む。 「複製中細胞」という用語は、ＤＮＡ合成のＳおよびＭ期ならびに有糸分裂を
含めた細胞周期を経過中の細胞を指す。
【００３０】 「亜配列」という用語は、特定核酸配列の情況では、特殊核酸と等しいかまた
はそれより小さい核酸の領域を指す。 「標的遺伝子座」とは、本明細書中で用いる場合、遺伝子修飾が望まれる細胞
ゲノムの領域を指す。標的遺伝子座は、典型的には、修飾される特殊ヌクレオチ
ド、ならびに修飾部位の片側または両側の付加的ヌクレオチドを含む。
【００３１】 「ターゲッティング構築物」とは、本発明の方法に用いられる組換えパルボウ
イルスベクター中に存在するＤＮＡ分子を指し、標的遺伝子座で宿主ゲノム中に
導入されるものである単数または複数の修飾以外は、標的遺伝子座の領域と同一
であるかまたは実質的に同一である領域を含む。修飾はターゲッティング構築物
の末端のどちらかに存在し得るか、あるいはターゲッティング構築物に対して内
部的であり得る。修飾は、野生型標的細胞中のＤＮＡと比較した場合の、１つ又
はそれ以上の欠失、点突然変異および／または挿入あるいはそれらの組合せであ
り得る。
【００３２】 「形質導入」という用語は、組換えウイルスベクターによる受容体細胞の感染
による遺伝物質の伝達を指す。 組換えパルボウイルスベクターＤＮＡを受容し、それにより遺伝し修飾を施さ
れた細胞は、ここでは、このような細胞の子孫およびその他の後裔の場合と同様
に、「形質導入化細胞」、「トランスフェクト化細胞」、「修飾化細胞」または
「組換え細胞」と呼ばれる。
【００３３】 「トランスジェニック細胞」という用語は、細胞の染色体またはその他の核酸
の特殊修飾を含む細胞を指し、この特殊修飾は細胞、または細胞の先祖に導入さ
れたものである。このような修飾は、１つ又はそれ以上の点突然変異、欠失、挿
入またはそれらの組合せを含み得る。動物に関して言及する場合、「トランスジ
ェニック」という用語は、動物がトランスジェニックである細胞を含むことを意
味する。トランスジェニック細胞および非トランスジェニック細胞の両方から成
る動物は、本明細書中では「キメラ」動物と呼ばれる。
【００３４】 「ベクター」という用語は、核酸（または複数の核酸）を宿主細胞に伝達する
ための作用物質を指す。ベクターは、伝達される核酸断片を含む核酸を包含し、
そして任意にウイルスキャプシド、または宿主細胞中への核酸の侵入および／ま
たは宿主細胞中でのベクターの複製を促すためのその他の物質（例えば、キャプ
シド内に、またはキャプシドの一部としてパッケージされる逆転写酵素またはそ
の他の酵素）を包含する。
【００３５】 「ウイルスベクター」という用語は、ウイルス核酸を包含し、ウイルスキャプ
シドおよび／または複製機能も含み得るベクターを指す。 好ましい実施態様の説明 本発明は、標的遺伝子座の特殊修飾を有する脊椎動物細胞の産生方法を提供す
る。これらの方法を用いて産生される遺伝子修飾化細胞および動物も提供される
。本方法は、相同対合により特定の標的遺伝子座に遺伝子修飾をターゲッティン
グし得る組換えパルボウイルスベクターを細胞中に導入することを包含する。本
方法に用いられるパルボウイルスベクターの組換えウイルスゲノムは、修飾が導
入されている以外は標的遺伝子座と実質的に同一であるＤＮＡ配列を含むターゲ
ッティング構築物を包含する。細胞への組換えウイルスゲノムの導入時に、相同
対合がターゲッティング構築物と標的遺伝子座との間に起こり、標的遺伝子座へ
の特殊遺伝子修飾の導入を生じる。
【００３６】 本発明の方法は、細胞のゲノムの的確な修飾を可能にする。これは、ゲノムを
修飾する他の方法が用いられる場合に起こり得る外因性遺伝子の挿入による望ま
しい遺伝子の破壊のような望ましくない作用を回避させる。さらに、例えばゲノ
ムの他の場所に遺伝子の矯正コピーを挿入することなく、内因性遺伝子の矯正を
可能にする遺伝子または制御領域の的確な変更を達成し得る。外因性遺伝子の発
現レベルが外因性遺伝子が組み込まれるようになる細胞のゲノムＤＮＡ中の位置
に大いに拠っているしばしば観察される「位置効果」を、本方法は回避する。本
方法は、大きすぎて他の方法によっては細胞中に導入され得ない遺伝子の修飾を
可能にする。所望の修飾を含む遺伝子の全コピーを導入するというよりむしろ、
遺伝子の所望の部分のみを修飾するために、本発明の方法が用いられ得る。 本発明の方法は、所望の遺伝子修飾を含むＤＮＡを修飾される脊椎細胞中に挿入
するために組換えパルボウイルスベクターを用いる。ヒトパルボウイルスへの一
般的紹介は、例えばPattison（1994）Principles and Practice of Clinical Vi
rology（Chapter 23）Zuckerman et al. eds, John Wiley & Sons Ltd.に、およ
びBerns（1991）"Parvoviridae and their Replication," In Fundamental Viro
logy, Fields, Ed., Raven Press, New York, pp.817-837に、ならびに各々に引
用された参考文献に見出される。最良に特性化されたヒトパルボウイルスはＢ１
９およびＡＡＶであって、これらはともに、例えば遺伝子療法のための形質導入
ベクターのための基礎として用いられる。用いられ得るその他のパルボウイルス
ベクター としては、パルボウイルスベクターＬｕＩＩＩ（Maxwell et al.（199
3）Human Gene Ther. 4:441-450）およびマウスの微小ウイルス（ｍｖｍ）（Rus
sel et al.（1992）J. Virol.66:2821-2828）が挙げられるが、これらに限定さ
れない。
【００３７】 好ましい実施態様では、本方法は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来のウイ
ルスベクターを用いる。ＡＡＶは、4.7 Kbゲノムを有する一本鎖複製欠陥ＤＮＡ
ウイルスである。アデノ炊飯ウイルスは容易に得られ、遺伝子送達のためのベク
ターとしてのそれらの使用は、例えば、Muzyczka（1992）Curr. Top. Microbiol
. Immunol. 158:97-129、米国特許第4,797,368号およびＰＣＴ出願WO91/18088に
記載されている。Samulski（1993）Current Opinion in Genetic and Developme
nts 3:74-80およびそこに引用された参考文献はＡＡＶ生活環の概説を提供する
。ＡＡＶの、そしてアデノウイルスまたはヘルペス経る／機能の一般的概説に関
しては、Bern and Bohensky（1987）Advances in Virus Research, Academic Pr
ess., 32:243-306を参照されたい。ＡＡＶのゲノムは、Srivastava et al.（198
3）J. Virol.. 45:555-564に記載されている。Carter等（米国特許第4,797,368
号）は、組換えＡＡＶベクターを構築するための多数の関連計画考察を記載する
（Carter, WO93/24641も参照）。ＡＡＶベクターを記載するさらに別の参考文献
としては、例えば、West et al.（1987）Virology 160:38-47; Kotin（1994）Hu
man Gene Therapy 5:793-801;およびMuzyczka（1994）J. Clin. Invest. 94:135
1が挙げられる。組換えＡＡＶベクターの構築も、多数のさらに別の出版物、例
えば、Lebkowski（米国特許第5,173,414号）; Lebkowski et al.（1988）Mol. C
ell. Biol. 8:3988-3996; Tratschin et al.（1985）Mol. Cell. Biol.5（11）:
3251-3260; Traschin et al.（1984） Mol. Cell. Biol.4:2072-2081;Hermonat
and Muzyczka（1984）Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6466-6470; McLaughlin
et al.（1988）およびSamulski et al.（1989）J. Virol. 63:03822-3828に記
載されている。ＡＡＶは欠陥ヒトパルボウイルスであり、これは、ヘルパーウイ
ルスにも感染される細胞中でのみ、ウイルスがウイルス粒子を複製および生成し
得ることを意味する。哺乳類細胞中へのＡＡＶゲノムの組込みを得るためには、
細胞を、ヘルパーウイルスの非存在下でＡＡＶに感染させる。
【００３８】 パルボウイルスゲノムは、各末端に逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を有する。
本発明の方法に用いるためには、組換えパルボウイルスベクターゲノムは、典型
的には、少なくとも１つのＩＴＲの全部または一部、あるいは機能的等価物を有
するが、これは一般に、複製するためにパルボウイルスベクターに必要とされ、
パルボウイルス粒子中にパッケージされる。ＩＴＲの機能的等価物は、典型的に
は逆反復であり、これはヘアピン構造を形成し得る。両ＩＴＲは、しばしば、本
方法に用いられる組換えパルボウイルスベクターＤＮＡ中に存在する。ウイルス
ゲノムは、一本鎖または二本鎖形態で用いられ得る。
【００３９】 脊椎動物細胞を遺伝子修飾するための方法で用いられるパルボウイルスベクタ
ーの組換えウイルスゲノムは、所望の修飾以外は、遺伝子修飾が望まれる標的遺
伝子座と同一であるかまたは実質的に同一であるターゲッティング構築物を含む
。ターゲッティング構築物は、一般に、標的遺伝子座の対応する領域のヌクレオ
チド配列と同一であるかまたは実質的に同一である、少なくとも約20ヌクレオチ
ド、好ましくは少なくとも約100、さらに好ましくは約1000〜5000ヌクレオチド
またはそれ以上を含む。「実質的に同一の」とは、ターゲッティング構築物のこ
の部分が、標的遺伝子座の対応する領域と少なくとも約80％、さらに好ましくは
少なくとも約90％、最も好ましくは少なくとも約99％同一であることを意味する
。
【００４０】 ターゲッティング構築物は、標的遺伝子座中に導入される単数または複数の遺
伝子修飾も包含する。修飾は、標的遺伝子座のＤＮＡ配列と比較して、１つ又は
それ以上の挿入、欠失または点突然変異、あるいはそれらの組合せを含み得る。
例えば、点突然変異の導入により標的遺伝子座を修飾するためには、ターゲッテ
ィング構築物は、導入される特異的点突然変異以外は標的遺伝子座と少なくとも
実質的に同一であるＤＮＡ配列を含む。細胞への組換えウイルスゲノムの導入時
に、標的遺伝子座の対応する領域と実質的に同一であるターゲッティング構築物
の部分間で相同対合が起こり、その後、ターゲッティング構築物中に存在する導
入される突然変異のＤＮＡ配列が標的遺伝子座の配列と置き換わる。
【００４１】 ターゲッティング構築物は、標的遺伝子座と同一であるかまたは実質的に同一
であるターゲッティング構築物の領域の末端または領域内に遺伝子修飾を有し得
る。標的遺伝子座の一部を欠失するためには、例えば遺伝子修飾は一般に、ター
ゲッティング構築物内に存在し、標的遺伝子座と実質的に同一の２つの領域に側
面を接する。実質的同一の２つの領域と標的遺伝子座のそれらに対応する領域と
の間の相同対合は、欠失を含むターゲッティング構築物の配列の一部を生じ、標
的遺伝子座に組み込まれるようになる。欠失は、この方法により所望の位置に的
確に標的化され得る。同様に、標的遺伝子座へのＤＮＡ配列の部位特異的挿入を
包含する遺伝子修飾は、標的遺伝子座と実質的に同一の領域に側面を接するかま
たは隣接する、そのされるＤＮＡ配列を有するターゲッティング構築物の使用に
より成され得る。ターゲッティング構築物と標的遺伝子座の対応する領域との間
の相同対合の後には、標的遺伝子座への挿入配列の組込が生じる。
【００４２】 本発明の方法は、１つより多い標的遺伝子座に修飾を導入するために用いられ
得る。例えば、細胞ゲノムの二次標的遺伝子座に１つ又はそれ以上の修飾を導入
するためには、細胞は、所望の単数または複数の修飾以外は二次標的遺伝子座と
少なくとも実質的に同一であるターゲッティング構築物を有する組換えウイルス
ゲノムを有するパルボウイルスベクターと接触させられ得る。二次標的遺伝子座
のためのターゲッティング構築物は、一次標的遺伝子座のためのターゲッティン
グ構築物と同一パルボウイルスベクター中に存在し得る化、または二次パルボウ
イルスベクター中に存在し得る。一次および二次ターゲッティング構築物が異な
るパルボウイルスベクター中に存在する場合、細胞は、逐次的に、または同時に
、ベクターを用いて形質導入され得る。２つより多い標的遺伝子座に修飾を得る
ためには、所望によりこの方法を単に反復する。
【００４３】 脊椎動物細胞のゲノムまたはその他のＤＮＡ内の構造遺伝子、調節領域および
その他の配列は、本発明の方法を用いた修飾を受けやすい。「構造遺伝子」とは
、特定細胞内で遺伝子が転写されるか否かにかかわらず、遺伝子の転写領域を指
す。例えば、遺伝子の遺伝子生成物を変え得る、また遺伝子生成物が発現される
のを妨げ得る構造遺伝子内の特殊変化を導入し得る。この実施態様では、組換え
ウイルスゲノムは、導入される特殊ヌクレオチド変化以外は、標的遺伝子座と同
一であるかまたは実質的に同一であるターゲッティング構築物を含み得る。細胞
ＤＮＡ中のターゲッティング構築物と標的遺伝子座との間の相同対合は、標的遺
伝子座中に組み込まれるようになるターゲッティング構築物中に存在する修飾を
生じる。例えば遺伝子生成物がポリペプチドである場合、ネイティブ遺伝子によ
りコードされるポリペプチドと比較して、１つ又はそれ以上の特殊麻置換、挿入
または欠失を有するポリペプチドをコードする遺伝子を得るために、本発明の方
法が用いられ得る。本方法は、存在する場合に、不活性であるかまたは望ましい
ものより低い活性を有するポリペプチドを生じるアミノ酸を特定するコドンを、
ポリペプチドに対する正常の活性を回復するアミノ酸を特定するコドンで置換し
得る。アミノ酸変化を生じる１つ又はそれ以上の突然変異により特性化される多
数の遺伝子疾患は、本発明の方法を用いて矯正可能である。別の例としては、標
的領域は、グリコシル化部位の一部でないアミノ酸をコードするコドンの代わり
に、グリコシル化部位を特定するコドンを置換することにより、修飾され得るし
、その逆もある。さらに別の例としては、プロテアーゼ開裂部位が作製または破
壊され得る。標的遺伝子座中に存在するナンセンスコドンがセンスコドンに変え
られ得るし、あるいは、ポリペプチドの破壊が望ましい場合には、標的遺伝子座
にナンセンス突然変異を導入することができる。内因性タンパク質と連結され得
る融合タンパク質の一部をコードする外因性ＤＮＡをターゲッティング構築物中
に組み入れることにより、融合タンパク質が得られる。外因性ＤＮＡは、標的遺
伝子座の細胞ゲノム中へのターゲッティング構築物のＤＮＡ配列の組入れ時に、
融合タンパク質の翻訳のための適正読取枠内に存在する。
【００４４】 同様に、遺伝子生成物が核酸である場合、本方法は、遺伝子生成物の修飾のた
めに用いられ得る。本発明の方法を用いて修飾され得るＲＮＡ遺伝子は、それか
ら発現されるもの、ｔＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、テロメラーゼサ
ブユニット等を含む。あるいは、本方法は、遺伝子生成物が、外因性核酸に連結
される内因性核酸から成る遺伝子を構築するために用いられ得る。例えば、転写
されると触媒性ＲＮＡを産生する外因性ＤＮＡは、内因性遺伝子と連結され得る
。この融合遺伝子から転写されるＲＮＡは、融合遺伝子の内因性部分と実質的に
相補的である内因性核酸とハイブリダイズし、その後、外因性ＤＮＡから発現さ
れるハイブリッドリボザイムの一部がその通常の反応を触媒し得る。したがって
、本発明の方法を用いて得られる融合遺伝子は、リボザイムをターゲッティング
するための手段を提供する。
【００４５】 本発明の方法は、当該遺伝子の発現に関与する調節領域を作製するヌクレオチ
ドを置換、欠失または挿入するためにも有用である。変更調節領域は、例えば、
非修飾化細胞における等価条件下での発現レベルと比較して、遺伝子の発現レベ
ルを増大または低減することにより、遺伝子の発現を変え得る。修飾は、例えば
遺伝子が典型的には発現されない条件下での遺伝子の発現を生じさせ得るか、あ
るいは特定の環境下で通常は発現される遺伝子の発現を妨げ得る。遺伝子の発現
に影響を及ぼすために適切である当該遺伝子と比較して、ある位置に、異種転写
制御素子を挿入し、または内因性制御素子、例えばプロモーター、エンハンサー
、転写終結シグナルを修飾しするために、本発明の方法は用いられ得る。構成性
プロモーターを誘導可能プロモーターで置き換えることにより、遺伝子の発現を
特定の環境または発生刺激物質の存在または非存在と関連づけ得る。同様に、Ｒ
ＮＡスプライシング、ポリアデニル化、翻訳のような転写後修飾に関与する領域
、ならびに翻訳後修飾に関与するアミノ酸配列をコードする領域が、挿入され、
欠失され、または修飾され得る。本発明の方法を用いて修飾または置換され得る
遺伝子発現制御素子の例としては、応答素子、プロモーター、エンハンサー、遺
伝子座制御領域、転写因子およびその他のタンパク質のための結合部位、その他
の転写開始シグナル、転写延長シグナル、イントロン、ＲＮＡ安定性配列、転写
終結シグナル、ポリアデニル化部位およびスプライス部位が挙げられるが、これ
らに限定されない。遺伝子の発現は、ＤＮＡメチル化部位を導入または破壊する
ために本発明の方法を用いることにより、調節され得る。
【００４６】 一実施態様では、本発明の方法は、細胞中の核酸の選別的発現を得るために用
いられる。核酸の選別的発現とは、所望の細胞型中で、および／または所望の条
件下（例えば誘導時）で発現されるが、しかし望ましくない細胞型中および／ま
たは望ましくない条件下では実質的に発現されない核酸の能力を指す。したがっ
て、特定の核酸配列の発現の部位および程度は、所望の方式で調節され得る。こ
れは、例えば部位特異的ヌクレオチド置換、欠失または挿入を導入して、所望の
細胞型中でおよび／または望ましい条件下で選別的に発現される制御素子を包含
するヌクレオチドを作製することにより達成される。これは、標的遺伝子座中に
すでに存在するヌクレオチドを変更することにより、または制御素子の全部また
は一部として機能する配列を含む外因性ＤＮＡを標的遺伝子座に組み入れること
により、あるいはこれらの修飾の組み合わせにより成し遂げられ得る。
【００４７】 例えば、本発明の方法は、それぞれ転写を刺激し、または抑制するためにトラ
ンス活性化またはトランス抑制化化合物（通常は、タンパク質別の物質と複合化
するタンパク質）と相互作用するシス−作用核酸配列である応答素子を導入また
は破壊するために用いられ得る。本発明の方法を用いて導入または排除され得る
応答素子としては、細胞選別的応答素子、ホルモン受容体応答素子、炭水化物応
答素子、抗生物質応答素子等が挙げられる。細胞選別的応答素子は、当該細胞型
（単数または複数）中で選別的に産生されるトランス活性化調節素子により活性
化され得る。本方法に用いられる細胞選別的応答素子の選別は、発現の誘導が望
ましい細胞が応答素子に作用を及ぼすトランスアクチベーターを産生するか、発
現の抑制が望ましい細胞がそうするかによっている。例えば、膵臓腺房細胞、水
晶体組織、Ｂ細胞、肝細胞およびＨＩＶ感染細胞における遺伝子の選別的発現は
、本発明の方法を用いて、エラスターゼＩエンハンサー、γ−クリスタリン遺伝
子応答素子、免疫グロブリン重および／または軽鎖エンハンサー、肝臓エンハン
サー、例えばα−１抗トリプシンまたは血清アルブミンエンハンサー、絨毛性ゴ
ナドトロピンα−鎖またはβ−鎖エンハンサー、インターロイキン−２（ＩＬ−
２）エンハンサー、ＩＬ−２受容体エンハンサー、またはヒト免疫不全ウイルス
（ＨＩＶ）応答素子、例えばＴＡＲ部位をそれぞれ導入することにより成し遂げ
られ得る。
【００４８】 ホルモンまたはその機能的等価物が、そのホルモンに対する細胞受容体と相互
作用する場合に活性化または抑制され得るホルモン受容体応答素子は、本発明の
方法を用いて所望の位置に導入され得る。ホルモン−受容体複合体は、細胞にイ
ンターナライズされるが、この場合、それは適切なホルモン受容体応答素子と選
別的に相互作用し（直接または間接的に）、それによりその素子に操作可能的に
連結された遺伝子の発現を活性化または抑制する。発現のホルモン応答性誘導ま
たは抑制を得るために、本発明を用いて、調節される遺伝子の上流にホルモン応
答素子を作製する。遺伝子の発現は、所定のホルモンに対する受容体を発現する
細胞中のホルモンにより調製される。
【００４９】 抗生物質応答素子は、抗生物質の存在または非存在により調節される。例えば
、テトラサイクリン応答素子は、テトラサイクリンに応答性である。同様に、炭
水化物応答素子は、ある種の炭水化物またはその類似体の存在または非存在によ
り調節される。その他の応答素子、ならびにプロモーター、エンハンサーおよび
その他の調節領域は、当業者に周知である。これらも、本発明の方法により作製
され、破壊され得る。
【００５０】 本発明の方法は、ＤＮＡ複製（例えば、Kornberg and Baker, DNA Replicatio
n, 2nd Ed., WH Freeman & Co., 1991参照）、ならびにマトリックス結合領域（
例えば、Bode et al.（1996）Crit. Rev. Eukaryot. Gene. Expr. 6:115-38; Bo
ulikas（1993）J. Cell. Biochem. 52:14-22参照）、クロマチン組換えホットス
ポット（例えば、Smith（1994）Exerientia 50:234-41参照）等のようなその他
の細胞工程に関連する核酸配列を修飾するためにも用いられ得る。
【００５１】 本発明は、細胞中に組換えシグナルを導入する方法も提供する。好ましい実施
態様では、組換えシグナルでの組換えを触媒し得る特殊組換え酵素が利用可能で
ある。組換えシグナルを細胞ゲノム中に導入するために、１つ又はそれ以上の組
換えシグナルがターゲッティング構築物中に含入され、これは、標的遺伝子座と
少なくとも実質的に同一である配列も含有する。相同対合とその後の遺伝子修復
は、標的遺伝子座への組換えシグナル（単数または複数）の組み入れを生じる。
【００５２】 適切な一組換え系は、Cre-lox系である。Cre-lox系では、組換え部位は、「lo
x部位」と呼ばれ、組換え酵素は「Cre」と呼ばれる。lox部位が平行配向（即ち
同一方向）である場合には、Creはlox部位間のポリヌクレオチド配列の欠失を触
媒する。lox部位が反対配向である場合には、Cre組換え酵素は介在ポリヌクレオ
チド配列の逆位を触媒する。したがって、例えば、反対方向に配向されて標的遺
伝子座中に２つのlox部位を導入し、そしてlox部位をCreポリペプチドと接触さ
せることによりlox部位間の領域の逆位を得るために、本発明の方法が用いられ
得る。例えば２つのlox部位がプロモーターと側面を接する場合には、Creポリペ
プチドの存在または非存在を単に制御することにより、遺伝子の発現を点滅し得
る。このような部位は、標的遺伝子座の組換えシグナルの位置に組換えシグナル
も含むＤＮＡを導入するためにも有用である。いくつかの実施態様では、Creポ
リペプチドをコードする遺伝子は、構成性または誘導可能プロモーターの制御下
で存在する。
【００５３】 lox511（Hoess R. et al., Nucleic Acids Res. 14:2287-2300（1986））、lo
x66、lox71、lox76、lox75、lox43、lox44（Albert H. et al., Plant J.7（4）
;649-659（1995））を含めたいくつかの異なるlox部位が知られている。この系
は、種々の宿主細胞、例えば哺乳類細胞（米国特許第4,959,317号、Sauer, B. e
t al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5166-5170（1988）; Sauer, B. et al.
, Nucleic Acids Res. 17:147-161（1989））、ビール酵母菌（Sauer, B., Mol
Cell Biol. 7:2087-2096（1987））、ならびに植物、例えばタバコ（Dale, E. e
t al., Gene 91:79-85（1990））およびシロイヌナズナ（Osborne, B. et al.,
Plant J. 7（4）:687-701（1995））で働く。植物におけるCre-lox系の使用は、
米国特許第5,527695号およびＰＣＴ出願WO93/0128にも記載されている。
【００５４】 いくつかのその他の組換え系も、本発明で用いるのに適している。これらの例
としては、例えば酵母菌のFLP/FRT系（Lyznik, L.A. et al., Nucleic Acids Re
s. 24（19）:3784-9（1996））、ファージＭｕのGin組換え酵素（Crisona, N.J.
et al., J. Mol. Biol. 243（3）:437-57（1994））、大腸菌のPin組換え酵素（
例えば、Kutsukake K. et al., Gene 34（2-3）:343-50（1985）参照）、赤痢菌
からのPinB、PinDおよびPinF（Tominaga A et al., J. Bacteriol. 173（13）:4
079-87（1991））、ならびにｐＳＲ１プラスミドのR/RS系（Araki, H. et al.,
J. Mol. Biol. 225（1）:25-37（1992））が挙げられる。したがって、組換え酵
素系は、厖大なそして今なお増加中の供給源から得られる。
【００５５】 細胞に組換えウイルスゲノムを送達するためのパルボウイルスベクターのそれ
らの使用により、本発明の方法は、脊椎動物細胞におけるＤＮＡの部位特異的修
飾のその他の方法により従来可能であったよりはるかに高頻度で起こる所望の特
定遺伝子修飾を生じる。本方法を用いて、典型的には0.01％またはそれ以上の所
望の修飾頻度が得られる。実際、0.1％より大きい、さらに１％より大きくさえ
ある効率が、本方法を用いて得られる。遺伝子修飾の効率は、一部は、形質導入
に用いられる感染多重度（ＭＯＩ：本明細書中では、細胞当たりのベクター粒子
の単位で定義される）、ならびに形質導入される細胞の種類によっている。典型
的実施態様では、連続細胞株から得られる細胞を形質導入するためには、約1〜1
012ＭＯＩが用いられる。さらに好ましくは、ＭＯＩは、少なくとも約104であり
、最も好ましくは、本発明の方法に用いられるＭＯＩは少なくとも約106ベクタ
ー粒子／細胞である。
【００５６】 本発明は、組換えパルボウイルスベクターによる形質導入を受けやすいあらゆ
る細胞中に遺伝子修飾を導入するのに有用である。このような細胞は、多数の脊
椎動物種、例えば哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類等から得られる。例えば
、哺乳類、例えばヒト、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、齧歯類などからの細胞は、
これらの方法を用いて修飾され得る。本発明の方法を用いて修飾され得る細胞と
しては、脳、筋肉、肝臓、肺、骨髄、心臓、神経、胃腸、腎臓、脾臓などが挙げ
られる。生殖細胞、例えば卵、精子、受精卵細胞、胚性幹細胞、ならびに生物体
または生物体の一部、例えば器官に発生し得るその他の細胞も、本発明を用いた
遺伝子修飾を受け得る。例えば、核移植における核供与体である細胞を修飾する
ために、本発明は用いられ得る。
【００５７】 一次細胞（本明細書中では「正常細胞」とも呼ばれる）および細胞株から得ら
れる細胞はともに、本発明の方法を用いた修飾を受けやすい。一次細胞は、生物
体から直接得られる、または生物体内に存在する細胞であり、そしてこれらの供
給源から得られ、培養中で増殖されるが、しかし培養中では連続（例えば多数世
代）増殖は可能でない細胞である。例えば、一次繊維芽細胞は、一次細胞である
と考えられる。本方法は、連続または不死か細胞株、例えば腫瘍細胞等から得ら
れる細胞、ならびに生物体から得られる腫瘍細胞のゲノムを修飾するためにも有
用である。細胞は、本発明の方法およびベクターを用いて、in vitro、ex vivo
またはin vivoで修飾され得る。
【００５８】 本方法は、脊椎動物細胞小器官のゲノム、ならびに核ゲノムを修飾するのに有
用である。例えば、所望の単数または複数の修飾を除いて、ミトコンドリアゲノ
ム中の標的遺伝子座と少なくとも実質的に同一であるターゲッティング構築物を
組換えウイルスゲノムに含入することにより細胞のミトコンドリアゲノム中の標
的遺伝子座を修飾するために、本発明の方法が用いられ得る。
【００５９】 Ａ．ベクターの調製 本発明の実施は、組換えパルボウイルスベクターゲノムの構築、そして任意に
これらのウイルスゲノムのウイルス粒子中へのパッケージングを包含する。これ
らの目的を達成するための方法は、当業界で既知である。組換えウイルスゲノム
の構築に適した広範な種々のクローニングおよびin vitro増幅法は、当業者には
周知である。多数のクローニング実践により技術者を指導するのに十分なこれら
の技術および使用説明の例は、Berger and Kimmel, Guide to Molecular Clonin
g Techniques, Methods in Enzymology 152 Academic Press, Inc., San Diego,
CA（Berger）; Sambrook et al.（1989） Molecular Cloning- A Laboratory M
anual（2nd ed.）Vol.1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harb
or Press, NY,（Sambrook）; Current Protocols in Molecular Biology, F.M.
Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene
Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc.,（1994 Suplement
）（Ausbel）; 米国特許第5,017,478号（Cashion等）および欧州特許第0,246,86
4号（Carr）に見出される。
【００６０】 in vitro増幅法により技術者を指導するのに十分な技術の例は、Berger、Samb
rookおよびAusubelならびにMullis等（米国特許第4,683,202号、1987）；ＰＣＲ
プロトコールA Guide to Methods and Applications（Innis et al. eds, Acade
mic Press Inc. San Deigo, CA（1990））（Innis）；Amheim & Levinson（1990
年10月1日）（C & EN 36-47）；The Journal Of NIH Research（1991）3:81-94
；Kwoh et al.（1989）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173; Guatelli et al.
（1990）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874; Lomell et al.（1989）J. Clin
. Chem. 35:1826; Landegren et al.（1988）Science 241:1077-1080; Van Brun
t（1990）Biotechnology 8:291-294; Wu and Wallace（1989）Gene 4, 560;およ
びBarringer et al.（1990）Gene 89:117に見出される。核酸をクローニングま
たは増幅するのに有用なオリゴヌクレオチド合成は、典型的には、市販固相オリ
ゴヌクレオチド合成機で実行される（Needham-VanDevanter et al.（1984）Nucl
eic Acids Res. 12:6159-6168）化、またはBeaucage等（1981, Tetrahedron Let
ts. 22（20）;1859-1862）により記載された固相ホスホラミダイトトリエステル
法を用いて化学的に合成される。
【００６１】 典型的には、ウイルスゲノムは、最初に、標準クローニング法を用いてプラス
ミドとして構築される。２つの逆方向末端反復配列のうちの少なくとも１つまた
はそれらの等価物を含むターゲッティング構築物がウイルスベクター中に挿入さ
れる。いくつかの実施態様では、ウイルスベクターＤＮＡは、標的細胞を感染さ
せるために用いるためのビリオン中にパッケージングされる。パッケージングさ
れるウイルスベクターは、複製およびビリオン中への組換えウイルスゲノムのパ
ッケージングに必要なウイルスゲノムＤＮＡ配列を含み得る。しかしながら、ほ
とんどの実施態様では、プロデューサー細胞株および／またはヘルパーウイルス
（例えばアデノウイルスまたはヘルペスウイルス）により、１つ又はそれ以上の
複製および／またはパッケージングポリペプチドが提供される。これらのヘルパ
ー機能は、例えば、ＡＡＶゲノムを複製するのに必要とされるRep発現生成物を
含む（例えば、Muzycska, N.（1992）Current Topics in Microbiol. and Immun
ol. 158:97-129およびKotin, R.M.（1994）Human Gene Therapy 5:793-801参照
）。ヒト経るペルウイルス６（ＨＨＶ−６）rep遺伝子は、ＡＡＶrep遺伝子の代
替物として役立ち得る（Thomson et al.（1994）Virology 204:304-311）。キャ
プシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３をコードするcap領域、またはそ
の機能的相同体も典型的には、ヘルパーウイルスまたはプロデューサー細胞株に
より提供される（同上）。
【００６２】 組換えウイルスゲノムは、プラスミドとして増殖され、標準方法によりビリオ
ン中にパッケージングされる（例えば、Muzyczka、上記；Russell et al.（1994
）Proc. Natl. Acad. Sci. USA91:8915-8919; Alexander et al.（1996）Human
Gene Ther. 7:841-850; Koeberl et al.（1997）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 9
4:1426-1431; Samulski et al.（1989）J. Virol. 63:3822-3828; Tratschin et
al.（1985） Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260;およびHermonat and Muzyczka（1
984）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6466-6470参照）。
【００６３】 組換えウイルスゲノムは、任意のいくつかの方法により標的細胞中に導入され
得る。例えば、前記のように、ウイルスゲノムをパルボウイルスビリオン中にパ
ッケージングし、次にこれを用いて、標的細胞を感染させ得る。あるいは、組換
えウイルスゲノムは、非パッケージング形態で細胞中に導入され得る。例えば、
細胞中にＤＮＡを導入するための標準方法は、例えばマイクロインジェクション
、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション、脂質封
入、バイオリスティック等により、ウイルスゲノムを導入するために用いられ得
る。組換えウイルスゲノムは、パルボウイルス以外のウイルス（例えば、不活性
化アデノウイルス）中に組み入れられるか、または標的細胞が受容体および／ま
たは細胞取込みのための機構を有するその他の部分に接合され得る（例えば、Ga
o et al.（1993）Hum. Gene Ther. 4:17-24参照）。組換えウイルスゲノムは、
標的細胞の核または細胞質中に導入され得る。
【００６４】 脊椎動物細胞中で遺伝子をトランスフェクトし、発現する方法は、当業界で既
知である。ウイルスベクターによる細胞の形質導入は、例えば形質導入を引き起
こすのに必要な条件および濃度下でウイルス宿主範囲内の細胞を用いてベクター
をインキュベートすることを包含し得る（例えば、Methods in Enzymology, vol
.185, Academic Press, Inc., San Diego, CA（D.V. Goeddel, ed.）（1990）ま
たはM. Krieger, Gene Transfer and ExpressionA Laboratory Manual, Stockto
n Press, New York, NYおよびMuzyczka（1992）Curr. Top. Microbiol. Immunol
. 158:97-129、ならびに各々で引用された参考文献参照）。細胞株および組織試
料からの培養細胞を含めた細胞の培養は、当業界で周知である。Freshney（Cult
ure of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, Third edition Wiley-Li
ss, New York（1994））は、細胞の培養の一般的指針を提供する。
【００６５】 組換えウイルスゲノムおよび／または組換えウイルスベクターのその他の構成
成分は、ターゲッティング効率を改良するために操作され得る。これらのターゲ
ッティングエンハンサーは、例えば付加生成物、ピリミジンダイマーおよび／ま
たは細胞ＤＮＡ合成、修復および／または組換え系を含み、そしてウイルスゲノ
ム中に導入され得るその他のＤＮＡ改変を含み得る。このような改変は、ウイル
スＤＮＡにおけるヌクレオチドの修飾、例えば１つ又はそれ以上の糖、塩基等の
排除を含み得る。例えば、パルボウイルスベクターは、ＤＮＡ損傷作因、例えば
ＵＶ光、ガンマ線照射、およびアルキル化剤で処理され得る。修飾は、ウイルス
ＤＮＡでin vitroに、あるいはビリオン中へのウイルスＤＮＡのパッケージング
中またはその後に実施され得る。
【００６６】 含まれ得るその他のターゲッティングエンハンサーは、組換え原性タンパク質
である（例えば、Pati et al.（1996）Molecular Biol. of Cancer 1:1; Sena a
nd Zarling（1996）Nature Genet. 3:365; Revet et al.（1993）J. Mol. Biol.
232:779-791; Kowalczkowski & Zarling in Gene Targeting（CRC 1995, Ch.7
）参照）。パルボウイルスベクター核酸は、細胞に導入される前に組換え原性タ
ンパク質と会合され得るか、あるいは組換え原性タンパク質は、パルボウイルス
ベクターと別々に、細胞中に導入され得る。本発明の好ましい一実施態様では、
パルボウイルスベクターは、組換え原性タンパク質の存在下でパッケージングさ
れて、ウ組換え原性タンパク質をウイルス粒子中にパッケージングされるように
する。最良特性化組換え原性タンパク質は大腸菌からのrecAであり、Pharmacia
（Piscataway, NJ）から入手可能である。野生型タンパク質の他に、多数の突然
変異体recA様タンパク質が同定されている（例えば、recA803）。さらに、多数
の生物がrecA様組換え酵素を有する（例えば、Ogawa et al.（1993）Cold Sprin
g Harbor Symp. Quant. Biol. 18:567-576; Johnson and Symington（1995）Mol
. Cell. Biol. 15:4843-4850; Fugisawa et al.（1985）Nucl. Acids Res. 13:7
473; Hsieh et al.（1986）Cell 44:885; Hsieh et al.（1989）J. Biol. Chem.
264:5089; Fishel et al.（1988）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3638; Cass
uto et al.（1987）Mol. Gen. Genet. 208:10; Ganea et al.（1987）Mol. Cell
. Biol. 7:3124; Moore et al.（1990）J. Biol. Chem. 19:11108; Keene et al
.（1984）Nucl. Acids Res. 12:3057; Kimiec（1984） Cold Spring Harbor Sym
p. Quant. Biol. 48:675; Kimeic（1986）Cell 44:545; Kolodner et al.（1987
）Proc. Natl. Acad.Sci. USA 84:5560; Sugino et al.（1985） Proc. Natl. A
cad.Sci. USA 85:3683; Halbrook et al.（1989）J. Biol. Chem. 264:21403; E
isen et al.（1988） Proc. Natl. Acad.Sci. USA 85:7481; McCrthy et al.（1
988） Proc. Natl. Acad.Sci. USA 85:5854; Lowenhaupt et al.（1989）J. Bio
l. Chem. 264:20568）。このような組換え酵素タンパク質の例としては、例えば
recA、recA803、uvsX（Roca（1990）Crit. Rev. Biochem. Molec. Biol. 25:415
）、sep1（Kolodner et al.（1987） Proc. Natl. Acad.Sci. USA 84:5560; Tis
hkoff et al., Mol. Cell. Biol. 11:2953）、RuvC（Dunderdale et al.（1991
）Nature 354:506）、DST2，KEM1、XRN1（Dykstra et al.（1991）Mol. Cell. B
iol. 11:2583）、STPα/DST1（Clark et al.（1991）Mol. Cell. Biol. 11:2576
）、HPP-1（Moore et al.（1991） Proc. Natl. Acad.Sci. USA 88:9067）およ
びその他の真核生物組換え酵素（Bishop et al.（1992）Cell 69:439; Shinohar
a et al., Cell 69:457）が挙げられる（ＰＣＴ特許出願PCT/US98/000852（WO98
/31837）も参照）。
【００６７】 遺伝子ターゲッティングの効率は、組換えウイルスゲノムの導入とともに、宿
主細胞の処理によっても改良され得る。例えば、細胞周期に影響を及ぼす作因を
標的細胞に投与し得る。これらの作因としては、例えばＤＮＡ合成阻害剤（例え
ば、ヒドロキシ尿素、アフィジコリン）、微小管阻害剤（例えばビンクリスチン
）および遺伝子傷害剤（例えば放射線、アルキル化剤）が挙げられる。遺伝子タ
ーゲッティングの効率を改良し得るその他の作因としては、ＤＮＡ修復、ＤＮＡ
組換え、ＤＮＡ合成、タンパク質合成に影響を及ぼすもの、ならびにＡＡＶのた
めの受容体のレベルが挙げられる。低縮合化ＤＮＡは遺伝子ターゲッティングを
より受容可能であると思われるので、クロマチンパッケージング、遺伝子無症候
化、ＤＮＡメチル化等に影響を及ぼす作因も興味深い。これらの作因としては、
例えばトポイソメラーゼ阻害剤、例えばエトポシドおよびカンプトテシン、なら
びにヒストンデアセチチラーゼ阻害剤、例えばラク酸ナトリウムおよびトリコス
タチンが挙げられる。アポトーシスを阻害する作因も、アポトーシスを誘導する
高濃度のＡＡＶの傾向を低減するそれらの能力により、遺伝子ターゲッティング
も増大し得る。これらの用途に適した作因は、例えば米国特許第5,604,090号、R
ussell et al.（1995） Proc. Natl. Acad.Sci. USA92:5719; Chen et al.（199
7） Proc. Natl. Acad.Sci. USA94:5798; Alexander et al.（1994）J. Virol.
68:8282:およびFerrari et al.（1995）J. Neurosci. 15:2857-66、（1998）Mol
. Cell. Biol. 18:6482-92、（1994）EMBO J. 13:5922-8（70:3227）に記載され
ている。
【００６８】 パルボウイルスベクターは、ビリオンの使用により特定の細胞または組織型に
対して標的化され得るし、あるいは所望の標的細胞に特異的である部分と結合す
る分子を表示するビヒクルを送達し得る。例えば、癌細胞に関して見出されるポ
リペプチドと結合する抗体は、デリバリー・ビヒクル上に表示され得る。いくつ
かの実施態様では、標的細胞と特異的に結合し得るポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチドは、パルボウイルスキャプシドタンパク質をコードする遺伝子中
に組み容れられる。パルボウイルスベクターゲノムのパッケージング時に、修飾
化キャプシドはビリオンの表面に表示され、したがってビリオンに核酸を所望の
標的細胞に優先的に送達させる。その他の目的のためのパルボウイルスキャプシ
ドタンパク質の修飾、ならびに修飾化タンパク質をコードする遺伝子を発現する
のに有用な細胞および修飾化キャプシドタンパク質を用いたin vitroパッケージ
ング法は、米国特許第5,863,541号（1999年1月26日発行）に記載されている。
【００６９】 組換えウイルスゲノムの＋または−のいずれかの一本鎖のみを用いることによ
っても、遺伝子ターゲッティングを改良し得る。例えば、各々＋鎖を保有する、
あるいは各々−鎖を保有するパルボウイルスベクターの集団の使用は、遺伝子タ
ーゲッティングの効率を増大し得る。あるいは、異なるベクターにより各々送達
される、＋および−鎖の組合せも用いられ得る。
【００７０】 Ｂ．遺伝子修飾を有する細胞の同定 特異的遺伝子修飾が本発明の方法を用いて起こるのが高頻度であるため、所望
の修飾を含む個々の細胞に関する選別またはスクリーニングは、多くの用途には
必要でない。所望の遺伝子修飾を組み入れた細胞を同定するのが望ましい場合に
は、当業者に周知の技術が用いられ得る。例えばＰＣＲおよび関連方法（例えば
リガーゼ連鎖反応）は、核酸における特異的変化を検出するためにルーチンに用
いられる（ＰＣＲ法の一般的説明に関しては、Innis（上記）参照）。適切な緊
縮の条件下でのハイブリダイゼーション分析も、特異的遺伝子修飾を検出するの
に適している。多数の検定フォーマットが適しており、その例としては、例えば
、Tijssen（1993）Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Bio
logyHybridization with Nucleic Acid Probes, Parts I and II, Elsevier, Ne
w York;およびChoo（ed）（1994）Methods In Molecular Biology Volume 33-In
Situ Hybridization Protocols, Human Press Inc., New Jerseyで検討されて
いるものが挙げられる（Methods in Molecular Biologyシリーズ中のその他の本
も参照）。種々の自動固相検出技法も適している。例えば、非常に大規模な固定
化ポリマーアレイ（ＶＳＳＩＰＳ）が、核酸中の特定の突然変異の検出のために
用いられる（Tijssen（上記）、Fodor et al.（1991）Science, 251:767-777お
よびSheldon et al.（1993）Clinical Chemistry 39（4）:718-719参照）。
【００７１】 これらの方法は、特異的遺伝子修飾それ自体を検出するために用いられ得るし
、あるいは修飾に起因する変化を検出するために用いられ得る。例えば、プロモ
ーター領域に修飾を有する細胞中のｍＲＮＡの存在または非存在を検出するため
に、ハイブリダイゼーションまたはその他の方法が用いられ得る。 他の方法により、細胞の表現型の変化も検出され得る。例えば、非修飾化細胞
がポリペプチドを発現しない条件下で修飾化細胞中に発現される、またはその逆
の場合の、ポリペプチドを遺伝子修飾が生じる場合、ポリペプチドに対する抗体
が、発現を検出するために用いられ得る。修飾化細胞が脊椎動物中にある場合、
抗体は、例えば血流中のまたはその他の組織中のタンパク質の存在または非存在
を検出するために用いられ得る。遺伝子修飾がポリペプチドの構造を変える場合
には、非修飾化ポリペプチドを認識するが、修飾化ポリペプチドを認識しない、
あるいはその逆の、抗体が得られる。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体
の産生方法は、当業者には既知であり、多数の抗体が入手可能である（例えば、
Coligan（1991）Current Protocols in Immunology Wiley/Greene, NY; およびH
arlow and Lane（1989）Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbo
r Press, NY; Stites et al.（eds.）Basic and Clinical Immunology（4th ed.
）Lange Medical Publications, Los Altos, CA、およびそこに引用された参考
文献; Goding（1986）Monoclonal Antibodies: Principles and Practice（2d e
d.）Academic Press, New York, NY; ならびにKohler and Milstein（1975）Nat
ure 256:495-497参照）。抗体調製のためのその他の適切な技法としては、ファ
ージまたは同様のベクター中の組換え抗体のライブラリーの選別が挙げられる（
Huse et al.（1989）Science 246:1275-1281およびWard et al.（1989）Nature
341:544-546参照）。Vaughan et al.（1996）Nature Biotechnology, 14:309-31
4は、大型非免疫感作ファージ表示ライブラリーから単離されたサブナノモル親
和性を有するヒト抗体を記載する。Chhabinath等は、抗体構造モデリングのため
の知識に基づいた自動アプローチを記載する（1996, Nature Biotechnology 14:
323-328）。特異的モノクローナルおよびポリクローナル抗体、ならびに抗血清
は、通常は、少なくとも約0.1 mM、さらに通常では少なくとも約１μM、好まし
くは少なくとも約0.1μMまたはそれより良好なＫDを有するそれらの対応する抗
体と結合する。修飾化酵素の酵素活性（またはその損失）も検出し得る。
【００７２】 一般的に、修飾化細胞は、細胞ゲノム中に組み入れられる選択可能またはスク
リーニング可能マーカーの使用によっても、同定され得る。選択可能マーカーは
、細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードする遺伝子であり、そこで
、マーカーを含有する宿主細胞だけが選別条件下で増殖し得る。例えば、誘導可
能プロモーターの制御下で細胞増殖に必要な遺伝子を配置する遺伝子修飾を導入
するために本発明の方法が用いられる場合、遺伝子の発現も誘導する選別条件下
で細胞を増殖させることにより、所望の修飾を組み入れた細胞が選別され得る。
典型的選別遺伝子は、（ａ）抗生物質またはその他の毒性物質、例えばガンシク
ロビル、ネオマイシン、ヒグロマイシン、Ｇ４１８、メトトレキセート等に対す
る耐性を付与し、（ｂ）栄養要求性欠陥を補足し、または（ｃ）複合培地からは
利用できない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。適切な選択可能
マーカーの選定は宿主細胞によっており、異なる宿主のための適切なマーカーは
、当業界で周知である。スクリーニング可能マーカーは、その活性が容易に検出
され、このようなマーカーを発現する細胞を容易に同定させるタンパク質をコー
ドする遺伝子である。このようなマーカーとしては、例えばβ−ガラクトシダー
ゼ、β−グルクロニダーゼおよびルシフェラーゼが挙げられる。その他のマーカ
ーとしては、蛍光活性化細胞分取により同定されるものが挙げられる。例えば、
蛍光タンパク質、例えばグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は、蛍光活性化セル
ソーター（ＦＡＣＳ）を用いて、またはＨＯＯＫ選別（Clontechから入手可能）
を用いて、タンパク質を発現する細胞の分離を可能にする。あるいは、マーカー
は、細胞表面に表示され、蛍光標識抗体により検出可能なポリペプチドをコード
し得る。
【００７３】 Ｃ．in vitro使用 本発明の方法は、多数の目的に有用な細胞および細胞株を構築するために有用
である。遺伝子修飾化細胞は、別の方法で細胞が産生するよりも高いレベルで所
望の遺伝子生成物を産生するために用いられ得るし、あるいは、遺伝子生成物は
、別の方法で産生されたものから修飾される。例えば、コード化タンパク質のア
ミノ酸配列がヒト形態のタンパク質の配列に対応するように、所望のタンパク質
をコードする非ヒト細胞遺伝子を修飾し得る。またはアミノ酸配列は、タンパク
質をより活性に、より安定にさせ、より長い治療半減期を有し、異なるグリコシ
ル化パターンを有するように等、変更され得る。本方法は、タンパク質のアミノ
末端にシグナル配列を導入するために用いられ得るが、これは普通では分泌され
ないタンパク質を細胞に分泌させることにより、タンパク質の精製を促し得る。
【００７４】 別の例としては、例えば毒性化合物の分解に関与するポリペプチドを発現させ
るように細胞を修飾するために、本発明の方法が用いられ得る。所望により、発
現は、毒性化合物の存在により誘導可能にさせ得る。このような細胞は、毒性廃
液の生改善のために、ならびに汚染部位の浄化のために用いられ得る。 本発明の方法を用いて修飾された細胞は、特定の突然変異の作用を研究するの
にも有用である。例えば、特定の遺伝子の発現を崩壊し、細胞の増殖および／ま
たは発生ならびにその細胞のその他の細胞との相互作用に及ぼす突然変異の影響
を確定し得る。疾患、例えば腫瘍形成（例えば新脈管形成の刺激剤）およびその
他の疾患への関与が疑われる遺伝子は、疾患発症に及ぼす作用を確定するために
崩壊され得る。あるいは、疾患関連遺伝子の発現が作動され、増大されて、作用
が評価され得る。
【００７５】 所定条件下で特定の遺伝子を発現するために修飾される細胞は、遺伝子の発現
を阻害し得る化合物に関してスクリーニングするために用いられ得る。例えば、
細胞は、誘導可能プロモーターの制御下での細胞増殖に必要な遺伝子を配置する
ために修飾され得る。被験化合物が、遺伝子の発現を誘導する部分とともに増殖
培地に付加される。誘導部分および誘導可能プロモーター間の相互作用を阻害す
る被験化合物の存在下での細胞は、増殖しない。したがって、これらの細胞は、
遺伝子発現を調節する化合物に関する簡単なスクリーニング系を提供する。
【００７６】 本発明は、標的化組込み物のライブラリーも提供する。これらのライブラリー
は、前記のスクリーニング検定における使用に、ならびに遺伝子分析に特に適し
ている。遺伝子突然変異を導入するための本発明の方法に関する多数のその他の
用途は、当業者には明らかである。 Ｄ．トランスジェニックおよびキメラ動物の構築 本発明は、トランスジェニックおよびキメラ動物の産生方法、ならびにこれら
の方法を用いて産生されるトランスジェニックおよびキメラ動物も提供する。「
キメラ動物」は、本方法を用いて導入された１つ又はそれ以上の遺伝子修飾を含
有するいくつかの細胞、ならびに修飾を含有しないその他の細胞を包含する。「
トランスジェニック動物」は、それと対照して、単数または複数の特異的修飾を
すべて組み入れた細胞で構成される。トランスジェニック動物は修飾化標的遺伝
子座をその子孫に伝達し得るが、しかし修飾を伝達するキメラ動物の能力は、修
飾化標的遺伝子座が動物の生殖細胞中に存在するか否かによっている。修飾とし
ては、例えば１つ又はそれ以上のヌクレオチドの挿入、欠失または置換が挙げら
れ得る。
【００７７】 本発明の方法は、ほとんどの脊椎動物種のトランスジェニックおよびキメラ動
物を産生するのに有用である。このような種としては、非ヒト哺乳類、例えばマ
ウスおよびラットのような齧歯類、ウサギ、ヒツジ類、例えばヒツジおよびヤギ
、ブタ類例えばブタ、ならびにウシ類、例えば畜牛および野牛が挙げられるが、
これらに限定されない。トランスジェニック動物の獲得方法は、例えば、Puhler
, A., Ed., Genetic Engineering of Animals, VCH Publ.,1993; Murphy and Ca
rter, Eds., Transgenesis Techniques:Principles and Protocols（Methods in
Molecular Biology, Vol.18）, 1993;およびPinkert, CA, Ed., Transgenic An
imal Technology: A Laboratory Handbook, Academic Press, 1994に記載されて
いる。特異的遺伝子修飾を有するトランスジェニック魚も、本発明の方法を用い
て作製され得る（例えば、トランスジェニック魚の一般的作製方法に関しては、
Iyengar et al.（1996）Transgenic Res. 5:147-166参照）。
【００７８】 そのゲノム中に特異的修飾を有するトランスジェニックまたはキメラ動物の一
獲得方法は、所望の修飾を有するターゲッティング構築物を含むパルボウイルス
ベクターと受精卵細胞を接触させることである。いくつかの動物、例えばマウス
に関しては、受精はin vivoで実施され、受精卵は外科的に取り出される。他の
動物、特にウシにおいては、生きた動物または屠殺動物から卵を取り出して、in
vitroで卵を受精させるのが好ましい（DeBoer等、WO91/08216参照）。in vitro
受精は、修飾を実質的同期細胞中に導入させ得る。次に受精卵は、約16〜150細
胞を含有する前移植胚が得られるまでin vitroで培養される。16〜32細胞期の胚
は、桑実胚と記載される。32より多い細胞を含有する前移植胚は、胞胚と呼ばれ
る。これらの胚は、典型的には64細胞期での胞胚腔の発生を示す。１つより多い
細胞の胚も、本発明の組換えパルボウイルスゲノムを導入することにより修飾さ
れ得る。所望により、胚細胞中の望ましい修飾の存在は、当業者に既知の方法に
より検出され得る。受精卵の前移植段階への培養方法は、Gordon et al.（1984
）Methods Enzymol.101:414; Hogan et al. Manipulation of the Mouse Embryo
:A Laboratory Manual, C.S.H.L. N.Y.（1986）（マウス胚）；Hammer et al.（
1985）Nature 315:680（ウサギおよびブタ胚）；Gandolfi et al.（1987）J. Re
prod. Fert.81:23-28; Rexroad et al.（1988）J. Anim. Sci. 66:947-953（ヒ
ツジ胚）およびEyestone et al.（1989）J. Reprod. Fert. 85:715-720; Camous
et al.（1984）J. Reprod. Fert. 72:779-785；およびHeyman et al.（1987）T
heriogenology 27:5968（ウシ胚）に記載されている。時として、前移植胚は、
移植までの期間、凍結保存される。前移植胚は、適切な雌に移されて、導入遺伝
子が組み込まれる時の発生段階によって、トランスジェニックまたはキメラ動物
を誕生させる。キメラ哺乳類は、繁殖されて、真の生殖細胞系列トランスジェニ
ック動物を生成する。
【００７９】 あるいは、パルボウイルスは、胚性幹細胞（ＥＳ）中に特異的遺伝子修飾を導
入するために用いられ得る。これらの細胞は、in vitro培養された前移植胚から
得られる（例えば、Hooper, ML, Embryonal Stem Cells:Introducing Planned C
hanges into the Animal Germline（Modern Genetics, v.1）, Int'l. Pub. Dis
trib. Inc., 1993; Bradley et al.（1984）Nature 309:255-258参照）。形質転
換化ＥＳ細胞は、非ヒト動物からの胞胚と組合される。ＥＳ細胞は胚をコロニー
化し、ある胚では、結果的に生じるキメラ動物の生殖細胞系列を生成する（Jaen
isch, Science, 240:1468-1474（1988）参照）。あるいは、生物体を再構成し得
るＥＳ細胞または体細胞（「体細胞再集団形成細胞」）は、トランスジェニック
動物を生じる細胞核摘出受精卵への移植のための核の供給源として用いられ得る
（例えば、Wilmut et al.（1997）Nature 385:810-813参照）。
【００８０】 ２つまたはそれ以上の修飾化標的遺伝子座を含有するトランスジェニック動物
の産生のために、２つのターゲッティング構築物を含有するパルボウイルスベク
ターが用いられ得るし、あるいはさらに好ましくは、各々異なるターゲッティン
グ構築物を含有する２つの異なるパルボウイルスベクターが、単一標的遺伝子座
を修飾するための場合と同様の手法を用いて、同時に導入される。あるいは、各
修飾は、最初に別個の動物に導入され、次に、動物を繁殖させることにより、同
一ゲノム中に併合される。または、所望の修飾のうちの１つの包含する最初のト
ランスジェニック動物が産生され、その後、その動物からの受精卵または胚性幹
細胞中に第二修飾が導入される。
【００８１】 Ｅ．ex vivo用途 本発明の方法は、ex vivo用途に有用であり、この場合、細胞は生物体から取
り出され、本方法を用いて遺伝子修飾され、そして生物体中に再導入される。い
くつかの用途においては、遺伝子修飾化培養細胞株が生物体に導入される。遺伝
子修飾化細胞は、細胞が元々得られた同一細胞中に導入され得る化、または同一
または異なる種の異なる生物体中に導入され得る。ex vivo両方は、例えば遺伝
子疾患、例えば血友病およびある種のサラセミア、ならびに本発明の方法を用い
て動物から取り出され、本発明の方法を用いて修飾され、そして生物体中に再導
入され得る細胞における欠損により特性化されるその他の疾患を治療するのに有
用である。細胞は、例えば、骨髄または胎児胎盤血から得られる造血性幹細胞、
Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、肝細胞、筋細胞、繊維芽細胞、間質細胞、皮膚
細胞または幹細胞であり得る。細胞は患者から培養され得る化、または細胞バン
ク（例えば血液バンク）に保存されたものであり得る。これらの方法は、ヒトの
治療に、そして獣医学的目的にも有用である。
【００８２】 修飾化細胞は、修飾化細胞型のＬＤ50により、ならびに大部分のおよび全体的
健康な患者に適用される場合の種々の濃度での細胞型の副作用により確定された
割合で、動物または患者に投与される。投与は、１回または何回かに分けて成さ
れ得る。 ex vivo遺伝子療法のための動物モデルおよび臨床プロトコールは、造血細胞
（Blaese et al.（1995）Science 270:475-480; Kohn et al.（1995）Nature Me
d. 1:1017-1023）、肝細胞（Grossman et al.（1994）Nature Genet. 6:335-341
）、筋細胞（Bonham et al.（1996）Human Gene Ther. 7:1423-1429）、皮膚細
胞（Choate et al.（1996）Nature Med. 2:1263-1267）および繊維芽細胞（Palm
er et al.（1989）Blood 73:438-445）に関して確立されている。
【００８３】 Ｆ．in vivo療法 本発明の方法は、遺伝子欠陥をin vivoで矯正するために有用である。筋ジス
トロフィーは、まさに、しばしばその機能を適正に実行できない異常ポリペプチ
ドを発現させる１つまたは２〜３個の突然変異の結果である遺伝子疾患の一例で
ある。これらのおよびその他の遺伝子疾患の多数の変異体に関する的確な突然変
異は、望ましくない遺伝子突然変異を同定するための方法の場合と同様に、当業
者には既知である。例としては、シャルコー・マリー・ツース病、コフィン・ロ
ーリー症候群、嚢胞性繊維症、脆弱Ｘ症候群、血友病、遺伝性血栓素因（Ｖ因子
突然変異）ハンティングトン病、中鎖アシル補酵素デヒドロゲナーゼ欠損（ｍｃ
ａｄ）、筋緊張性ジストロフィー、神経繊維腫症（ｎｆ１）、鎌状赤血球症およ
びグロビン鎖変異、脊椎筋萎縮、脊髄小脳性運動失調、αおよびβサラセミア、
フォン・ヒッペル−リンダウ病等が挙げられるが、これらに限定されない。遺伝
子疾患は、例えば、Shaw, DJ（Ed.）, Molecular Genetics of Human Inherited
Disease, John Wiley & Sons, 1995; Davies and Read, Molecular Basis of I
nherited Disease, 2nd Edition, IRL Press, 1992で検討されている。ヒト遺伝
子疾患は、他の脊椎動物の場合と同様に、本発明の方法を用いて治療可能である
。非遺伝子疾患も、遺伝子を操作することにより治療され得る。例えば、受容体
がもはやＨＩＶ粒子と結合し得ないように、ＨＩＶに対する補助受容体を修飾し
得る。
【００８４】 組換えパルボウイルスゲノムを含有するパルボウイルスベクターは、in vivo
での細胞の修飾のために生物体に直接投与され得る。投与は、血液または組織細
胞との最終接触物中へにウイルスベクターを導入するために通常用いられる経路
のいずれかにより成され得る。本発明の方法に用いられるウイルスベクターは、
好ましくは製薬上許容可能な担体とともに、あらゆる適切な方法で投与される。
本発明の情況でのこのようなウイルスベクターの患者への投与のための適切な方
法は利用可能であり、そして１つより多い経路が特定のウイルスベクターを投与
するために用いられ得るが、しかしある特定経路はしばしば、別の経路より直接
的且つより有効な反応を提供する。
【００８５】 製薬上許容可能な担体は一部は、投与される特定のウイルスベクターにより、
ならびに組成物を投与するために用いられる特定の方法により、確定される。し
たがって、本発明の製剤組成物の種々の広範な適切な処方物が存在する。 経口投与に適した処方物は、（ａ）液体溶液、例えば水、食塩水またはＰＥＧ
４００のような稀釈剤中に溶解される有効量のベクター、（ｂ）各々予定量の活
性成分を、液体、固体、顆粒またはゼラチンとして含有するカプセル、サッシェ
または錠剤、（ｃ）適切な液体中の懸濁液、および（ｄ）適切なエマルションか
ら成る。錠剤形態は、１つ又はそれ以上のラクトース、スクロース、マンニトー
ル、ソルビトール、リン酸カルシウム、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、
トラガカントゴム、微晶質セルロース、アラビアゴム、ゼラチン、コロイド二酸
化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム
、ステアリン酸およびその他の賦形剤、着色剤、充填剤、結合剤、稀釈剤、緩衝
剤、加湿剤、防腐剤、風味剤、染料、崩壊剤、ならびに製薬上許容可能な担体を
包含し得る。ロゼンジ形態は、風味剤、通常はスクロースおよびアラビアゴムま
たはトラガカントゴム中に活性成分を包含し得るし、香錠は、ウイルスベクター
の他に、当業界で既知の担体を含有する不活性基剤、例えばゼラチンおよびグリ
セリンまたはスクロースおよびアラビアゴムエマルション、ゲル等の中に活性成
分を包含する。
【００８６】 ウイルスベクターは、単独で、またはその他の適切な構成成分と組合せて、吸
入により投与され得るエーロゾル処方物に作製され得る。気管支通路がある種の
ウイルスに関して選別される通常経路であるために、対応するベクターは、この
方法により適切に投与される。エーロゾル処方物は、加圧許容可能噴射剤、例え
ばジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等の中に投入される。
【００８７】 直腸投与のための適切な処方物としては、例えば、座薬基剤を伴う活性ウイル
スベクターから成る座薬が挙げられる。適切な座薬基剤としては、天然または合
成トリグリセリドまたはパラフィン系炭化水素が挙げられる。さらに、ウイルス
ベクターと基剤、例えば液体トリグリセリド、ポリエチレングリコールおよびパ
ラフィン系炭化水素の組合せから成るゼラチン直腸カプセルを用いることもでき
る。
【００８８】 例えば関節内（関節中）、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、鞘内（脳脊髄液中
）および皮下経路による非経口投与に適した処方物としては、酸化防止剤、緩衝
剤、静細菌剤、および処方物を意図される受容者の血液と等張にさせる溶質を含
有し得る水性および非水性、等張滅菌注射液、ならびに沈澱防止剤、可溶化剤、
増粘剤、安定剤および防腐剤を含み得る水性および非水性滅菌懸濁液が挙げられ
る。処方物は、単位用量または多数回用量密封容器、例えばアンプルおよびバイ
アル中に存在し、そしていくつかの実施態様では、使用直前に注射用の滅菌液体
担体、例えば水の付加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）条件下で保
存され得る。処方箋に応じて処方される注射溶液および懸濁液は、前記の種類の
滅菌粉末、顆粒および錠剤から調製され得る。
【００８９】 患者への用量投与は、本発明の情況では、長時間の患者における有益な治療応
答を実行するのに十分であるべきである。用量は、用いられる特定のウイルスベ
クターの効力、および患者または動物の症状、ならびに治療される患者の体重ま
たは表面積により確定され流。用量サイズは、特定の患者または動物における特
定のベクターまたは修飾化細胞型の投与に伴う任意の副作用の存在、性質および
程度により確定される。
【００９０】 特定の疾患の治療または予防に投与されるウイルスベクターの有効量の確定に
際しては、医者または獣医は、循環血漿レベル、ベクター毒性および疾患の進行
を評価する必要がある。 本発明の実施に際しては、パルボウイルスベクターは、例えばエーロゾル化お
よび吸入、静脈内注入により、経口的、局所的、筋内的、腹腔内的、嚢内または
鞘内的に投与され得る。好ましい投与方法は、しばしば、静脈内または吸入によ
るが、しかしパルボウイルスベクターは、ウイルス媒介性症状の局部的および局
所的治療のために適切なビヒクル中に適用され得る。
【００９１】 投与のために、本発明のパルボウイルスベクターおよび遺伝子修飾化細胞型は
、パルボウイルスベクターのＬＤ50により、ならびに大部分のおよび全体的健康
な患者に適用される場合の種々の濃度でのパルボウイルスベクターまたは細胞型
の副作用により確定された割合で、動物または患者に投与される。投与は、１回
または何回かに分けて成され得る。
【００９２】 アデノ随伴ウイルスベクターを用いるin vivo遺伝子療法のためのプロトコー
ルは、脳（Alexander et al.（1996）Human Gene Ther. 7:841-850）、肝臓（Ko
eberl et al.（1997）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:1426-1431）、胚（Flott
e et al.（1993） Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10613-10617）および筋肉（
Xiao et al.（1996）J. Virol. 70:8098-8108）に関して記載されている。これ
らの方法は、当業者により、他の標的器官に適合され得る。
【００９３】 Ｇ．遺伝子ターゲッティング効率の検定系 本発明は、パルボウイルス媒介性遺伝子ターゲッティングの効率の確定方法も
提供する。本発明は、遺伝子ターゲッティングによりその後矯正される突然変異
レポーター遺伝子を標的細胞中に導入するためにレトロウイルスベクターを用い
ることを包含する。矯正される遺伝子を導入するためのレトロウイルスベクター
の使用亜Ｈ、従来用いられている検定系を上回る有意の利点を有する。標的細胞
ゲノム中に組み込まれるようになるレトロウイルスベクター内に突然変異体レポ
ーター遺伝子を投入することにより、レポーター遺伝子は十分特性化された染色
体領域内の細胞ゲノム中に組み込まれるようになる（組込み化プロウイルス）。
レポーター遺伝子を取り囲む領域のこの均一性のために、一次細胞を含めた広範
な種々の細胞型の間の遺伝子ターゲッティング効率を比較し得る。さらに、レト
ロウイルスベクタープロウイルスは、低感染多重度で細胞を感染させることによ
り、単一コピー標的として細胞中に導入され得る。さらに別の利点は、数千の異
なるレトロウイルスベクター組込み部位に標的遺伝子座を含有する細胞のポリク
ローナル集団を検定に用い、したがって位置効果による遺伝子ターゲッティング
速度の変動を考慮し得る。
【００９４】 レトロウイルスベクターを用いて標的細胞中に導入されるレポーター遺伝子は
、レポーター遺伝子の検出可能および／または選択可能遺伝子生成物が発現され
ず、遺伝子ターゲッティングによる矯正が認められないという点で欠陥性である
。例えば、レポーター遺伝子は、コード領域における、あるいはプロモーターま
たはレポーター遺伝子の発現を制御するその他の配列における突然変異によって
、欠陥性であり得る。本発明の好ましい実施態様では、レトロウイルスベクター
は、欠陥レポーター遺伝子の他に、選択可能マーカーを包含する。したがって、
組込みレトロウイルスプロウイルスを含有する細胞に関して選別し得る。これら
の細胞は、次に、遺伝子ターゲッティング検定に用いられる。
【００９５】 本発明の検定に用いるのに適したレポーター遺伝子は、当業者に既知である。
典型的には、レポーター遺伝子は、直接検出可能なポリペプチド、例えば蛍光ポ
リペプチドまたは検出作因の使用により容易に検出可能であるポリペプチドをコ
ードする。例えば、レポーター遺伝子は、存在する場合、基質を容易に検出可能
な形態に転換する酵素をコードし得る。あるいは、レポーター遺伝子生成物に結
合する検出可能作因、例えば標識化抗体によりレポーター遺伝子生成物を検出し
得る。適切なレポーター遺伝子としては、大腸菌からのβ−グルクロニダーゼ（
ＧＵＳ、uidA）、β−ガラクトシダーゼ、ホタルからのルシフェラーゼ（ＬＵＣ
）、およびクラゲからのグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（例えば、Chalfie
et al.（1994）Science 263:802-805; Crameri et al.（1996）Nature Biotechn
ol. 14:315-319; Chalfie et al.（1995）Photochem. Photobiol. 62:651-656;
Olson et al.（1995）J. Cell. Biol. 130:639-650参照）、ならびに関連抗原が
挙げられ、これらのうちのいくつかは市販されているが、これらに限定されない
。いくつかの実施態様では、レポーター遺伝子は、細胞の表面で発現されるポリ
ペプチドをコードする。次に、例えばフローサイトメトリーベースの細胞分取に
より首尾よく遺伝子ターゲッティングを受けた細胞に関して同定し、濃縮し得る
。
【００９６】 レポーター遺伝子は、所望の遺伝子ターゲッティング事象を受けた修飾化細胞
の選別を可能にする選別可能マーカーでもあり得る。これらの遺伝子は、選別培
地中で増殖された形質転換化宿主細胞の生存または増殖に必要な遺伝子生成物、
例えばタンパク質をコードし得る。選別遺伝子の遺伝子生成物を発現しない宿主
細胞は、培地中で生存しない。典型的選別遺伝子は、抗生物質またはその他の毒
素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、カナマイシン、クロラムフェニコール
またはテトラサイクリンに対する耐性を付与するタンパク質をコードする。選別
可能マーカーに関する適切なコード配列の例を以下に挙げる：抗生物質カナマイ
シン、ネオマイシンおよびＧ４１８に対する耐性を付与する酵素ネオマイシンホ
スホトランスフェラーゼをコードするneo遺伝子（Beck et al.（1982）Gene 19:
327）；酵素ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼをコードし、抗生物質ヒ
グロマイシンに対する耐性を付与するhyg遺伝子（Gritz and Davies（1983）Gen
e 25:179）。あるいは、選別可能マーカーは、栄養要求性欠陥を補足し、または
複合培地からは利用できない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードし得る
。多数の選別可能マーカーが当業者には既知であり、例えばSambrook等（上記）
に記載されている。
【００９７】 検定は、組込みレトロウイルスプロウイルスおよび関連欠陥レポーター遺伝子
を含有する細胞中に、レトロウイルスプロウイルスの場合とは異なる突然変異に
より欠陥性であるレポーター遺伝子を含む組換えパルボウイルスベクターを導入
することにより実行される。パルボウイルスベクター中に存在する欠陥レポータ
ー遺伝子は、例えば、活性レポーター遺伝子生成物の発現を妨げる突然変異（例
えば、プロモーター、コード領域または遺伝子発現に影響を及ぼすその他の領域
の突然変異）を含む全長レポーター遺伝子であり得る。あるいは、パルボウイル
スベクターは、レトロウイルスプロウイルス中に存在するレポーター遺伝子の亜
配列のみを含み得る。いずれかの場合、パルボウイルスベクター中に存在するレ
ポーター遺伝子は、レトロウイルスプロウイルス中の欠陥レポーター遺伝子の突
然変異化領域を重複する。パルボウイルスベクターレポーター遺伝子は、プロウ
イルスレポーター遺伝子とは異なる位置で突然変異化され、したがってレポータ
ー遺伝子生成物は相同対合および遺伝子修復が２つの欠陥レポーター遺伝子間で
起こった細胞によってのみ産生される。
【００９８】 次に、遺伝子ターゲッティングの効率は、レポーター遺伝子生成物を発現する
細胞のパーセンテージを確定することにより確証される。 さらに別の実施態様では、本発明は、遺伝子ターゲッティングが起きた細胞に
関して濃縮するための方法を提供する。これらの方法は、ある遺伝子座で遺伝子
ターゲッティングを受ける細胞が第二の遺伝子座でのターゲッティングを受けや
すいという知見に基づいている。したがって、２つのターゲッティング構築物が
細胞に°にされる。一方のターゲッティング構築物は、矯正時に、容易に検出可
能なレポーター遺伝子生成物を産生する欠陥レポーター遺伝子を矯正し得る。他
方のターゲッティング構築物は、当該遺伝子に向けられる。２つのターゲッティ
ング構築物は同一パルボウイルスベクター上に存在し得るが、しかしより一般的
には、各々は別個のパルボウイルスベクターに含入される。細胞中へのターゲッ
ティング構築物の導入後、細胞は、先ずスクリーニングまたは選別されて、レポ
ーター遺伝子生成物を発現するものを同定する。その結果生じる濃縮細胞集団は
次に、スクリーニングされて、当該遺伝子が首尾よく遺伝子ターゲッティングを
受けた細胞を同定する。
【００９９】 標的細胞に関する濃縮の方法は、多数の用途に有用である。例えば、生殖細胞
、卵、またはトランスジェニック生物体が再構築され得るその他の細胞は、遺伝
子ターゲッティングを受けた細胞に関して濃縮され得る。これらの細胞発議に、
スクリーニングされて、当該標的遺伝子座に所望の変更を含有するものを同定す
る。所望の遺伝子ターゲッティング事象を受けた細胞は、次に、トランスジェニ
ックおよび／またはキメラ動物を産生するために用いられる。
【０１００】 実施例 以下の実施例は、本発明を説明するために提示されるが、本発明はこれらに限
定されない。 実験手法 Ａ．細胞培養 ＨｅＬａ（Scherer et al.（1953）J. Exp. Med. 97:695-709）、ＨＴ−１０
８０（Rasheed et al.（1974）Cancer 33:1027-33）および２９３（Graham et a
l.（1977）J. Gen. Virol. 36:59-74）細胞を、10％加熱不活性化（56℃で30分
）ウシ胎仔血清（HyClone, Logan, UT）、1.25μg/mlアンフォテリシン、100 U/
mlのペニシリンおよび100μg/mlのストレプトマイシンを含有するダルベッコの
変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、37℃で10％ＣＯ2大気中で培養した。ＨＴ
−１０８０細胞を、形質導入実験にそれらを使用する前に、ＨＡＴ培地（13.61
μg/mlのヒポキサンチン、0.176μg/mlのアミノプテリンおよび3.875μg/mlのチ
ミジンを含有するＤＭＥＭ）中に保持して、集団中のＨＰＲＴ-細胞の数を最小
限にした。
【０１０１】 ＳＶ４０複製起点およびプロモーター、突然変異体neo遺伝子およびｐ１５Ａ
起点を含有するBamHI断片（ｐＡＳＮＯ３９中に存在する同一断片、図１Ａおよ
び以下参照）、およびモロニーネズミ白血病ウイルス長末端反復プロモーターお
よびヒグロマイシン耐性遺伝子を含有するｐＬＨＬのBstYI断片を用いたＨｅＬ
ａ細胞の同時トランスフェクションにより、ＨＳＮＯ３９細胞を作製した。0.2
mg/mlヒグロマイシン（Calbiochem, San Diego, CA）中で増殖させて、トランス
フェクト化細胞を選別した。単一ヒグロマイシン耐性コロニーからＨＳＮＯ３９
細胞を得て、サザン分析により、neo遺伝子／細胞の３つのコピーを含有するこ
とを示した。形質導入実験に用いる前に、0.2 mg/mlヒグロマイシンを含有する
培地中でＨＳＮＯ３９細胞を培養した。
【０１０２】 Ｂ．プラスミド プラスミドｐＡＡＡ／Ａｄ（Samulski et al.（1989）J. Virol. 63:3822-8）
、ｐＡＣＹＣ１８４（Chang et al.（1978）J. Bacteriol. 134:1141-56）、ｐ
Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Stratagene, La Jolla, CA），ｐｓｕｂ２０１（Samuls
ki et al.（1987）J. Virol. 61:3096-101）、ｐＳＶ２neo（Southern and Berg
（1982）J. Mol. Appl. Genet. 1:327-41）およびｐＴＲ（Ryan et al.（1996）
J. Virol. 70:1542-53）が記載されている。ｐＬＨＬは、A.D. Miller（Fred Hu
tchinson Cancer Research Center, Seatle, WA）からの寄贈であった。ｐＲｅ
ｐＣａｐ２は、 ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのXbaI部位にＡＡＶ２repおよびcap遺
伝子を含有するｐｓｕｂ２０１のXbaI断片を含有する。 neo遺伝子の下流のBstB
I部位（ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片で末端充填化）中のｐＡＣＹＣ１
８４からのEspI-BstI 1071起点断片を含有するｐＳＶ２neoのBamHI-Esp31 neo断
片を、BamHIリンカーをｐＳＶ２neo Esp31部位に結合後に、ｐＴＲのＡＡＶベク
ター主鎖のBg/II部位に挿入することにより、ｐＡＳＮori２を構築した。この同
一neo断片を用いて、ＨＳＮＯ３９細胞株を構築した。ｐＡＳＮＯ３９は、末端
充填化EagI部位中のSalIリンカー（5-CGGTCGACCG）以外はｐＡＳＮori２と同一
である。ｐＡＳＮＯ６４８は、末端充填化および再結紮化CspI部位以外はｐＡＳ
Ｎori２部位と同一である。ｐＡＨＰｅ２／３は、ＤＮＡシーケンシングにより
確定されるように、ｐＴＲのBglII部位にbp14,057〜17,809のヒトＨＰＲＴ遺伝
子座（GenBank HUMHPRTB）を含有する。ｐＡＨＰｅ２／３Ｘは、末端充填化およ
び再結紮化XhoI部位以外はｐＡＨＰｅ２／３と同一である。ｐＴＲ主鎖に関する
両配向のＨＰＲＴ配列が得られ、対応するベクターの遺伝子矯正率に差は認めら
れなかった。ヒトＨＰＲＴ配列は、前記のＨｕλ３ラムダファージからであった
（Patel et al.（1986）Mol. Cell. Biol. 6:393-403）。
【０１０３】 Ｃ．ベクター産生 ＡＡＶベクターストックを以下のように調製した。２９３細胞を、4 x 106細
胞／皿の密度で、２４皿（10 cm）中でプレート化した。翌日、各皿を5.6 x 107 プラーク形成単位の５型アデノウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−５）で感染させて、
２時間後に、リン酸カルシウム法（Sambrook、上記）により、4μgのベクタープ
ラスミドおよび16μgのヘルパープラスミドで同時トランスフェクトさせた。３
日後、細胞および培地を採取して、３回凍結−解氷し、Sorvall HS4ローター中
で4℃で30分間、5800xg（5500 rpm）での遠心分離により清澄化し、68単位／ml
のミクロコッカスヌクレアーゼ（Pharmacia, Piscataway, NJ）を用いて37℃で
１時間消化し、50 ng/mlのトリプシンで37℃で30分間処理し、Beckman SW28ロー
ター中で27,000 rpmで4℃で16時間、リン酸塩緩衝化食塩水中の40％スクロース
に通して遠心分離した。ペレットをＣｓＣｌの0.51 g/ml溶液 8 ml中に再懸濁
し、Beckman SW41ローター中で35,000 rpmで4℃で20時間遠心分離した。ＡＡＶ
ビリオンを含有する勾配の領域を収集し、50,000分子量カットオフ膜（Spectrum
, Houston, TX）を通してＤＭＥｅｕに対して透析し、Centricon 100フィルター
（Amicon, Inc., Beverly, MA）中での遠心分離により濃縮した。使用したベク
タープラスミドは、ＡＡＶ−ＳＮoriにはｐＡＳＮori２、ＡＡＶ−ＳＮＯ６４８
にはｐＡＳＮＯ６４８、ＡＡＶ−ＳＮＯ３９にはｐＡＳＮＯ３９、ＡＡＶ−ＨＰ
ｅ２／３にはｐＡＨＰｅ２／３およびＡＡＶ−ＨＰｅ２／３ＸにはｐＡＨＰｅ２
／３Ｘであった。使用したヘルパープラスミドは、ｐＡＡＶ／Ａｄ（Samulski e
t al.（1989）上記）またはｐＲｅｐＣａｐ２であって、これらは等価ストック
力価を生じた。
【０１０４】 アルカリゲルのサザンブロットにより、各ストックベクターの力価を以下のよ
うに確定した。10μlのストック稀釈液を2μlの10％ＳＤＳと混合し、100℃で10
分間加熱し、1.2％アルカリアガロースゲルを通して電気泳動処理し（Sambrook
、上記）、Hybon-N膜（Amersham, Buckinghamshire, England）上にブロットし
て、ベクター配列に関してプローブした。Molecular Dynamics PhosphorImager
400S（Sunnyvale, CA）を用いて同一ゲル上に存在する標準と比較することによ
り、各試料中に存在する全長線状ベクターＤＮＡの量を確定し、この測定から、
ストック１ml当たりのベクターゲノム数を算出した。同一検定を用いて、10μl
の各勾配分画を電気泳動処理することにより、ＣｓＣｌ上のベクター粒子を位置
決定した。ストック1 ml当たりの無傷ベクターゲノム数は、ベクター粒子数に関
して用いられた値であり、これは典型的には＞1011/mlであった。
【０１０５】 Ｄ．ＤＮＡ技法 New England BioLabs（Bevely, MA）、Boehringer Mannheim（Indianapolis,
IN）またはStratagene（La Jolla, CA）から酵素を入手し、メーカー推奨条件を
用いて、反応を実施した。プラスミド構築、ＤＮＡ精製、サザンブロット分析お
よび細菌培養を、標準手法（Sambrook等、上記）により実施した。Qiagenカラム
（Chatsworth, CA）を用いてプラスミドを調製した。ABI PRISMシーケンシング
キット（Perkin Elmer, Foster City, CA）を用いてダイ−ターミネーターサイ
クルシーケンシングを実行し、Applied Biosystems Inc.シーケンサー（Foster
City, CA）で分析した。オリゴヌクレオチドは、Cruachem, Inc.（Dulles, VA）
からであった。
【０１０６】 試料中の遊離端の結紮を防止するために高分子量ゲノムＤＮＡを仔ウシ小腸ホ
スファターゼで消化することにより、組込みneo遺伝子を形質導入化ＨＳＮＯ３
９細胞から取り出し、加熱不活性化して、フェノールおよびクロロホルムで抽出
し、エタノールで沈澱させた。再懸濁化ＤＮＡをBamHIで消化し、フェノールお
よびクロロホルムで抽出して、エタノールで沈澱させた。その結果生じたＤＮＡ
断片を再懸濁し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて14℃で一夜環化させて、エレクト
ロポレーションまたは高効率化学形質転換により大腸菌に移した。カナマイシン
プレート上での増殖により、細菌コロニーを選別した。
【０１０７】 細菌プラスミドとして回収された矯正化neo遺伝子のbp39およびbp648突然変異
のシーケンシングを、それぞれプライマー９６０６Ｄ（dATGGCTTTCTTGCCGCCA）
（配列番号１）および９６０７Ａ（dATACGCTTGATCCGGCTAC）（配列番号２）を用
いて実施した。従来発表済の手法（Rossiter et al.（1991）“Detection of de
letions and point mutations.”In PCR. A practical approach, M.J.McPherso
n et al., eds.（Oxford, England:IRL Press）, pp.67-83）の変法を用いて、
高分子量ゲノムＤＮＡから、ＨＰＲＴエキソン３配列を、以下のように増幅した
。2.1ピコモルの５プライマー（dCCTTATGAAACATGAGGGCAAAGG）（配列番号３）お
よび３プライマー（TGTGACACAGGCAGACTGTGGATC）（配列番号４）、6 mMＭｇＳＯ 4 、1.25 mMの各デオキシヌクレオシドトリホスフェートおよび0.4単位のVentＤ
ＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs, Beverly, MA）を含有する20μlの反
応容量中の100 ngのゲノムＤＮＡＰＣＲを実施した。ＰＴＣ−200サーモサイク
ラー（MJ Research, Watertown, MA）中で反応を実行し、変性を94℃で4.5分間
、その後94℃で30秒、61℃で50秒および72℃で2分間を30回実施し、次に72℃で5
分間最終重合させた。6μlの生成物をさらに、同一条件下で20回、100μl容量中
で増幅させ、メーカーのプロトコールにしたがってQIAquickキット（Qiagen, Ch
atsworth, CA）を用いてＰＣＲ生成物を精製し、75 ngの精製生成物を、プライ
マーdACCTACTGTTGCCACTA（配列番号５）とともにＤＮＡシーケンシングに用いた
。
【０１０８】 Ｅ．遺伝子ターゲッティング検定 １日目に、96（Nunc, Naperville, IL）または48（Costar, Cambridge, MA）
ウエルプレート中でそれぞれ5 x 103または1 x 104ＨＳＮＯ３９細胞／ウエルを
、あるいは48ウエルプレート中で2 x 104ＨＴ−１０８０細胞をプレート化する
ことにより、標準形質導入実験を実施した。２日目に、培地を取り換え、ベクタ
ーストック（ＤＭＥＭ中に調製）をウエルに付加した。ＭＯＩを算出して、オリ
ジナルプレート化以後の一細胞倍化を想定した。３日目に、各ウエルをトリプシ
ンで処理し、細胞を10 cm皿中でプレート化した。４日目、検定は各細胞株に関
して異なった。
【０１０９】 neo遺伝子矯正実験のために、各ウエルからの90％、9.5％および0.5％の細胞
を異なる皿中でプレート化した。４日目に、Ｇ４１８（1 mg/ml活性化合物）を9
0％および9.5％さらに付加し、３〜４日毎に培地を取り換えながら、10〜12日間
、選別を継続した。Ｇ４１８は0.5％皿には付加せず、これは、各オリジナルウ
エルからのコロニー形成単位（ＣＦＵ）の総数に関する対照として役立てた。各
皿中に存在するコロニーを、クーマシーブリリアントブルーＧで染色後に計数し
た。neo遺伝子矯正率を、Ｇ４１８耐性ＣＦＵ／各オリジナルウエルに関する全
ＣＦＵの数値として算出した。
【０１１０】 ＨＰＲＴ実験のために、各ウエルからの細胞すべてを、３日目に10cm皿中にプ
レート化された後、10〜14日間選別なしで培養し、ＨＰＲＴ細胞中の既存ＨＰＲ
Ｔタンパク質を排除させた。10〜14日培養後、ＨＰＲＴ突然変異率に有意差は認
められなかった。培地を３〜４日毎に取り換え、皿が高密度になりすぎたら、ト
リプシンで細胞を処理し、稀釈液を新しい皿中に入れた。この表現型発現期間後
、各培養の105、104および102細胞を新しい10 cm皿中でプレート化して、翌日、
６ＴＧ（5μg/ml）を105および104細胞皿に付加した。プレート化効率を算出す
るために用いたため、６ＴＧ選別は102細胞皿には適用しなかった。細胞をさら
に10日間培養し、クーマシーブリリアントブルーＧで染色し、生存コロニーを計
数した。プレート化効率に関する矯正後、６ＴＧ耐性ＣＦＵのパーセントを確定
した。
【０１１１】 実施例１ アデノ随伴ウイルスベクターを用いた突然変異体neo遺伝子の矯正 本実施例は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を基礎にしたベクターがヒト細胞
中の特異的染色体標的配列を効率的に修飾し得ることを立証する。 形質導入による遺伝子矯正を試験するためのマーカーとして、選別可能ネオマ
イシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（neo）を用いた。これらの実験のため
に構築されたベクターは、ＡＡＶシャトルベクターＡＡＶ−ＳＮori（図１Ａ）
を基礎にしており、これは、細菌Ｔｎ５プロモーターおよびＳＶ４０初期プロモ
ーターの両方の制御下のneo遺伝子、ならびに大腸菌の安定複製を支持するｐ１
５Ａプラスミド複製起点を含有する（Cozzarelli et al.（1968）Proc. Natl. A
cad. Sci. USA 60:992-999）。ＡＡＶ２末端反復配列はこれらの内部配列と側面
を接し、ベクターゲノムの複製およびパッケージングに必要なシス−作用配列を
含有する（McLaughlin et al.（1988）J. Virol. 62:1963-1973; Samulski et a
l.上記）。ＡＡＶ−ＳＮoriにより形質導入される哺乳類細胞はＧ４１５に耐性
であり、取込みプロウイルスは、カナマイシン耐性を発現する細菌プラスミドと
して回収され得る。neo遺伝子のbp39（14ヌクレオチド挿入）およびbp648（3ヌ
クレオチド挿入）（bp1は翻訳開始コドンである）でＡＶＶ−ＳＮoriベクター中
に突然変異を導入して、ベクターＡＡＶ−ＳＮＯ３９およびＡＡＶ−ＳＮＯ６４
８を生成した。両突然変異は、neo遺伝子機能を崩壊するが、しかし２つの突然
変異体遺伝子間の遺伝子矯正は機能性遺伝子を再生し、Ｇ４１８耐性を付与し得
る。
【０１１２】 モデルヒト系としてＨｅＬａ細胞を用いて、ＡＡＶベクターによる遺伝子矯正
を試験した。ヒグロマイシン選別可能マーカーによるこの断片の同時トランスフ
ェクションにより、ＡＡＶ−ＳＮＯ３９ゲノム（末端反復配列を欠く）の内部部
分の取込みコピーを含有するＨｅＬａ細胞株を作製した（実験手法参照）。いく
つかのヒグロマイシン耐性クローンを単離し、サザン分析により突然変異体neo
遺伝子カセットの存在に関してスクリーニングした。ＨＳＮＯ３９と呼ばれる一
細胞株は、異なる位置に組み込まれたneoカセットの３無傷コピー／細胞を含有
すると考えられ、さらなる実験のために選別した。
【０１１３】 Ａ．neo遺伝子矯正頻度 ＨＳＮＯ３９細胞をＡＡＶ−ＳＮＯ６４８ベクターストックに感染させて、ト
リプシンで処理し、翌日、異なる稀釈液でプレート化した後、感染後２日目に、
Ｇ４１８中で選別した。試料中のコロニー形成単位の総数を確定するために、選
別せずに、稀釈液を増殖させた。ベクターゲノムを取り込むことによる突然変異
体染色体neo遺伝子の矯正を、Ｇ４１８に対して耐性のコロニーの分数として測
定した。表１に示すように、ＡＡＶ−ＳＮＯ６４８による感染後、約0.1％のＨ
ＳＮＯ３９細胞がＧ４１８に耐性であった。これは、いくつかの細胞が不適正発
現レベルで無症候化遺伝子を含有し得るので、最小neo遺伝子矯正率を表す。Ａ
ＡＶ−ＳＮＯ６４８によるＨｅＬａ細胞の感染はＧ４１８耐性コロニーにを産生
せず、これはベクター中のbp648突然変異の復帰が検出可能率で起きなかったこ
とを立証する。同様に、Ｇ４１８耐性コロニーは非感染ＨＳＮＯ３９細胞または
ＡＡＶ−ＳＮＯ３９感染ＨＳＮＯ３９細胞では検出されず、これは、染色体bp39
突然変異の復帰が起きなかったことを示す。機能性neo遺伝子を含有し、非相同
組換えにより無作為染色体位置に組込み得るＡＡＶ−ＳＮoriベクターによる形
質導入後、約0.6％のＨｅＬａ細胞がＧ４１８に耐性であった。したがって、neo
遺伝子矯正率は、同様のベクターの無作為ベクター取込み率の約５分の１であっ
た。
【０１１４】
【表１】
【０１１５】 Ｂ．染色体neo遺伝子の構造 ＡＡＶ−ＳＮＯ６４８でＨＳＮＯ３９細胞を感染させることにより得られたい
くつかのＧ４１８耐性コロニーを単離し、約2 x 107細胞に展開させて、サザン
ブロットにより分析した。BamHIで消化後、親ＨＳＮＯ３９細胞からのゲノムＤ
ＮＡは、2.7、5.0および＞20 kbの３つの主要neo−ハイブリダイズ化帯域を含有
したが、これはneo遺伝子カセットの３つの組込みコピーを表す（図１Ｂ）。2.7
kbのBamHI neo断片を用いて、同時トランスフェクションによりＨＳＮＯ３９株
を生成した。不鮮明な8.0 kb帯域も１未満／細胞で観察されたが、これは、ＨＳ
柄縫うＯ３９細胞のサブセット中のBamHI部位の１つでのメチルかまたは突然変
異によるものと思われる。11のＨＳＮＯ３９／ＡＡＶ−ＳＮＯ６４８ Ｇ４１８
耐性クローンのうちの４つ（１、２、９および１０）は、親株と同一の３つの主
帯域を含有したが、付加断片は伴わなかった。クローン４および５の8.0 kb帯域
は、親株における同一サイズの不鮮明な帯域を表す。クローンのうちの４つに、
新規の帯域が観察されたが、これは、無作為ベクター取込みがベクターに曝露さ
れた細胞のサブセットにも起きたことを示唆する。３つのクローンは、親株に存
在する帯域を有さず（３、４および７）、これは、これらのクローン中に新規の
帯域が観察されなかったので、再配列というよりむしろBamHI部位の修飾により
説明され得る。ベクターと染色体neoカセット間の相同は、BamHI部位にまで及び
、ベクターＤＮＡによるこの部位での染色体配列のそのような修飾は、その部位
を破壊しなかった。これらの結果は、単離されたＧ４１８耐性クローンの大多数
が、ベクター取込みによる付加的再配列を伴わずに、少なくとも１つの矯正化ne
o遺伝子を含有したことを実証する。
【０１１６】 Ｃ．矯正化neo遺伝子の配列 遺伝子矯正工程の忠実度を査定するために、細菌プラスミド中のいくつかの矯
正化neo遺伝子を回収し、関連領域をシーケンシングした。ＨＳＮＯ３９細胞中
に存在するneo遺伝子カセットおよびＡＡＶ−ＳＮＯ６４８ベクターは、大腸菌
中でカナマイシン耐性を複製し、付与し得る（図１Ａ）が、これにより細菌プラ
スミドとして矯正化neo遺伝子を回収し得る。図１Ｂに示したＧ４１８耐性ＨＳ
ＮＯ３９／ＡＡＶ−ＳＮＯ６４８クローンからの染色体ＤＮＡをBamHIで消化し
、ＤＮＡリガーゼで環化して、細菌中に移し、これを次に、カナマイシン耐性に
関して選別した。表２に示したように、矯正化neo遺伝子を７／１１クローンか
ら細菌プラスミドとして回収した。残りの４クローンからプラスミドを回収する
さらに持続的な試みもうまくいった。これらの細菌から単離したプラスミドをBa
mHIで消化して、ユニークな部位を有するものだけが正しいとみなした。2.7 kb
プラスミドを７つのクローンの各々から回収し、制限消化により、環化BamHI断
片は、bp39突然変異の非存在以外は、ＨＳＮＯ３９を産生するために用いたもの
と同一であると考えた。二次20 kbプラスミドもクローン１１から回収したが、
これは、サザンブロットで観察された高分子量帯域に対応すると思われた。明ら
かに、この細胞株中に存在する少なくとも２つのneo遺伝子は矯正されていた。
回収プラスミドは、BsiEIによる消化に基づいて、野生型neo遺伝子を含有したが
、これは、bp39及びbp648突然変異を同定し得る（図１Ａ参照）。
【０１１７】
【表２】
【０１１８】 各回収プラスミドのbp39およびbp648突然変異周囲の領域をシーケンシングし
た。各領域から200 bpより大きい配列を得たが、すべての場合に、その配列は野
生型neo遺伝子の配列と正確に対応した。したがって、遺伝子矯正工程は、染色
体bp39突然変異に存在する１４のヌクレオチド挿入の精密な欠失をもたらし、付
加的遺伝子変化を伴わず、そしてベクター中に存在するbp648突然変異の挿入を
伴わなかった。しかしながら、我々の検定は機能性neo遺伝子の存在を要したた
めに、neo遺伝子機能を崩壊したターゲッティング事象中に作製された付加的突
然変異はすべて、我々の分析からは排除した。
【０１１９】 実施例２ ＡＡＶベクターによるヒトＨＰＲＴ遺伝子の修飾 ヒトヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子座（ＨＰＲＴ）
でのＡＡＶベクターによる遺伝子矯正も調べた。ＨＰＲＴ遺伝子は、ＨＰＲＴ-
細胞が６−チオグアニン（６ＴＧ）の存在下での増殖により選別され得るため、
しばしば、突然変異を調べるために用いられるが、単一コピーＸ−連鎖遺伝子座
でのそのような突然変異誘発は、二倍体雄細胞で測定し得る。この細胞株は偽二
倍体雄核型を有する（Rasheed et al.（1974）Cancer 33:1027-1033）ため、そ
してＨＰＲＴ遺伝子ターゲッティング実験に従来用いられている（Pikaart et a
l.（1992）Mol. Cell. Biol. 12:5785-92; Zheng et al.（1991）Proc. Natl. A
cad. Sci. USZ 88:8067-71）ために、ＨＴ−１０８０ヒト繊維肉腫細胞を用いて
、ＨＰＲＴ遺伝子での遺伝子ターゲッティングを調べた。
【０１２０】 エキソン２および３を包含するヒトＨＰＲＴ遺伝子座の領域を含有するＡＡＶ
ベクターを用いて、特異的突然変異をＨＴ−１０８０細胞のＨＰＲＴ遺伝子中に
導入した（図２Ａ）。ＡＡＶ−ＨＰｅ２／３ベクターは野生型ゲノム配列を含有
し、一方、ＡＡＶ−ＨＰｅ２／３Ｘベクターはエキソン３中に４つのヌクレオチ
ド挿入を含有し、これがＨＰＲＴコード配列中に読取枠を生じる。ＨＴ−１０８
０細胞を両ベクターで感染させて、既存のＨＰＲＴタンパク質の排除を可能にす
るために選別せずに一定期間細胞を培養後（実験手法の項参照）、６ＴＧ耐性に
関して選別した。図３に示したように、突然変異体ＡＡＶ−ＨＰｅ２／３Ｘベク
ターに感染した約1/2000のＨＴ−１０８０細胞が６ＴＧ耐性であった。これは、
ＨＴ−１０８０細胞が均一に二倍体でなく、付加的Ｘ染色体を含有し得ない（Ra
sheed等、上記）ので、最小ＨＰＲＴ遺伝子修飾頻度を表す。ＡＡＶ−ＨＰｅ２
／３Ｘベクターターゲッティング頻度は、バックグラウンド突然変異率の約30倍
であった。野生型ベクターによる感染は、バックグラウンドより高いＨＰＲＴ突
然変異率を生じなかった。
【０１２１】 ＡＡＶ−ＨＰｅ２／３Ｘによる感染後に単離されたいくつかの６ＴＧ耐性クロ
ーンのサザン分析は、ベクター突然変異が染色体ＨＥＲＴ遺伝子座に導入された
ことを確証した。図２Ｂは、HindIIIによる消化の結果を示すが、これは、ベク
ター配列の外側を切断し、ＨＴ−１０８０中細胞にエキソン２および３を含有す
る6.8 kb染色体断片を生成する。この帯域は、分析したクローンのすべてに置い
て未変更で、これは、この領域における大きい再配列の非存在を実証する。５つ
の株が付加的帯域を含有したが、これは無作為ベクター取込みによるものと思わ
れる。PvuIによるさらなる消化は、10/13のクローンが、染色体へのベクターPvu
I部位挿入突然変異の移動から予測される2.2 kb帯域を含有した（図２Ｃ）。今
日まで、ＡＡＶ−ＨＰｅ２／３Ｘに感染した24の個々の６ＴＧ耐性ＨＴ−１０８
０クローンを分析したが、このうち18個が、サザン分析で測定した場合に、予測
されるPvuI部位挿入を有した。これらのクローンのうちの６つのゲノムＤＮＡか
らのエキソン３を増幅するためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用い、そし
てＰＣＲ生成物をシーケンシングした（実験手法の項参照）。少なくとも330 bp
の疑わしい配列が各クローンから得られ、エキソン３のすべてを包含していた。
すべての場合に、エキソン３中の予測された４つのヌクレオチド挿入以外は、全
配列が発表されたＨＰＲＴ配列と同一であった。付加的ベクター組込み事象を伴
わないクローンをシーケンシングして、非連鎖ベクターの増幅を回避した。親Ｈ
Ｔ−１０８０細胞株からの配列は、この挿入突然変異を含有しなかった。
【０１２２】 実施例３ 遺伝子矯正に及ぼすベクター投与の影響 ＨＳＮＯ３９細胞中の突然変異体neo遺伝子を、一連の感染他重度を用いて、
ＡＡＶ−ＳＮＯ６４８ベクターで矯正した。図４は、感染ベクターゲノム／細胞
対矯正化neo遺伝子を有する細胞のパーセントとしてプロットしたいくつかの実
験結果を示す。遺伝子矯正率は、40〜2 x 106ベクター粒子／細胞のベクター用
量の増大に伴って、約0.001から0.1％より高い値に増大した。これらの結果は、
遺伝子矯正反応が、細胞に侵入するベクター分子の数により限定されることを示
唆する。
【０１２３】 実施例４ 形質導入およびトランスフェクション遺伝子矯正率の比較 ＡＡＶ−ＳＮＯ６４８ベクターストックを形質導入させたＨＳＮＯ３９細胞、
または全ＡＡＶ−ＳＮＯ６４８ゲノムを含有するプラスミドｐＡＳＮＯ６４８で
トランスフェクトしたＨＳＮＯ３９細胞におけるneo遺伝子矯正率を比較した（
図５）。形質導入率は、トランスフェクションにより得られた場合の少なくとも
400倍であった。ＨＳＮＯ３９細胞株と同一突然変異を含有するｐＡＳＮＯ３９
プラスミドを用いたさらなるトランスフェクション実験はｐＡＳＮＯ６４８と同
様の結果を示したが、これはｐＡＳＮＯ６４８の遺伝子矯正率が相同対合という
よりむしろ、実際には変異復帰によるものであったことを示唆する。したがって
、形質導入による相同対合率は、トランスフェクションにより得られる場合の40
0倍よりはるかに大きかった。この差異に関して考え得る一つの説明は、プラス
ミド取込みがトランスフェクト化細胞の小部分でのみ起きるが、一方、ベクター
ゲノムはすべての細胞に侵入すると思われるというものである。ＨＳＮＯ３９細
胞の安定トランスフェクション効率は、ｐＡＳＮori２によるトランスフェクシ
ョンで確定した場合、約7％であったが、これは、それが機能性neo遺伝子を含有
する以外は、ｐＡＳＮＯ６４８と同一である。おそらく、さらに高いパーセンテ
ージの細胞でさえ、一時的にトランスフェクトされた。７％のトランスフェクト
化細胞が機能性プラスミド分子を含有したという、そしてすｐＡＳＮＯ６４８を
トランスフェクトすることにより得られたＧ４１８耐性コロニーのすべてが相同
対合によるものであったという保存的仮定が成された後でも、遺伝子矯正率は、
形質導入化細胞では、プラスミドＤＮＡを組み入れた細胞の亜集団で観察された
ものの30倍以上である（1.7 x 10-3対5.7 x 10-5）。
【０１２４】 実施例５ 正常ヒト繊維芽細胞におけるＨＰＲＴ遺伝子の修飾 5 x 104の正常ヒト繊維芽細胞／ウエルを24ウエルプレート中でプレート化す
ることにより、標準形質導入実験を実施した。２日目に、培地を取り換え、ベク
ターストック（ＡＡＶ−ＨＰｅ２／３またはＡＡＶ−ＨＰｅ２／３Ｘ、ＤＭＥＭ
中に調製）をウエルに付加した。３日目に、各ウエルをトリプシンで処理し、細
胞を10 cm皿中でプレート化した。４日目、各ウエルからの細胞すべてを培養し
たが、ＨＰＲＴ細胞中の既存のＨＰＲＴタンパク質を除去させるために12〜14日
間選別をしなかった。３〜４日毎に培地を取り換え、細胞の密度が高すぎるよう
になったら、トリプシンで細胞を処理し、稀釈液を新しい皿中に入れた。この表
現型発現期間後、各培養の105、104および102細胞を新しい10 cm皿中でプレート
化して、翌日、６ＴＧ（10Tg/ml）を105および104細胞皿に付加した。プレート
化効率を算出するために用いたため、６ＴＧ選別は102細胞皿には適用しなかっ
た。細胞をさらに10日間培養し、クーマシーブリリアントブルーＧで染色し、生
存コロニーを計数した。プレート化効率に関する矯正後、６ＴＧ耐性ＣＦＵのパ
ーセントを確定した。４つの異なる正常繊維芽細胞株を調べた。ＭＨＦ１、ＭＨ
Ｆ２およびＭＨＦ３は正常雄からであり、ＦＨＦ１は正常雌からであった。
【０１２５】 図６に示したように、ＨＰＲＴ遺伝子の修飾は、感染ウイルスゲノム数／細胞
に比例した。修飾は、４つの繊維芽細胞株すべてのＨＰＲＴ遺伝子中に導入され
た（図７）。 実施例１〜５の要約 これらの実施例は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を基礎にしたベクターが効
率的且つ特異的に脊椎動物染色体標的配列を修飾することを実証する。組み込ま
れたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子および正常Ｘ連鎖ヒポキサン
チンホス堀越し流トランスフェラーゼ遺伝子はともに、ＡＡＶベクターにより標
的化された。部位特異的遺伝子修飾は、全細胞集団の＞0.1％に導入され、トラ
ンスフェクションにより達成されるよりも有意に高い比率であって、修飾は、正
常一次細胞中に導入され得る。大多数の修飾化細胞がその他の検出可能遺伝子変
化を含有せず、ＤＮＡシーケンシングは、工程の高忠実度を実証した。これらの
結果は、パルボウイルスベクターが、広範囲の種々の脊椎動物細胞のゲノムＤＮ
Ａ中に特異的遺伝子変化を導入するのに有用であることを示唆する。
【０１２６】 実施例６ 遺伝子ターゲッティング効率を確定するための検定系 本実施例は、遺伝子ターゲッティング効率の確定系を記載する。本系は、細胞
中に標的遺伝子座を導入するための二シストロン性レトロウイルスベクターを使
用する。用いられる戦略は、図８に説明されている。
【０１２７】 Ａ．アルカリ性ホスファターゼ遺伝子の矯正 本実験では、ヒト胎盤アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）レポーター遺伝子を
用いた。ＬＡＰＳＮレトロウイルスベクターは、ネズミ白血病ウイルス（ＭＬＶ
）ＬＴＲの制御下のＡＰ遺伝子、および内部ＳＶ４０初期プロモーターの制御下
のネオマイシン耐性遺伝子（neo）を含有した（Miller et al.（1994）Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 91:78-82）。このベクターを、ＡＰ読取枠のヌクレオチド3
75に4 bp欠失を有するよう工学処理して、ベクターＬＡＰ３７５（△４）ＳＮを
作製するか、またはヌクレオチド961に2 bp欠失を有するよう工学処理して、ベ
クターＬＡＰ９６１（△２）ＳＮを作製した（図８）。テナガザル白血病ウイル
ス（ＧＡＬＶ）エンベロープ中の偽型ベクター粒子を用いて、ＰＧ１３細胞の一
過性トランスフェクションにより、レトロウイルスベクターストックを調製した
（Miller et al.（1991）J. Virol. 65:2220-2224）この偽型はヒト細胞の効率
的感染を可能にする。正常一次ヒト繊維芽細胞を、ＬＡＰ３７５（△４）ＳＮ／
ＰＧ１３を用いて形質導入し、Ｇ４１８中で選別した。5,000より多い個々の形
質導入化細胞由来のポリクローナル集団を得たが、この各々は、おそらく、レト
ロウイルス標的遺伝子座の異なる単一コピー組込み部位を含有した。
【０１２８】 ＡＰ遺伝子の５’部分を含有するＡＡＶベクターＡＡＶ−５’ＡＰＢｓｓを調
製した（ｐＬＡＰＳＮからの2486 bp BssHII制限断片；図９参照）。ＬＡＰ３７
５（△４）ＳＮを含有する繊維芽細胞集団を、1,200ベクター粒子／細胞のＭＯ
ＩでＡＡＶ−５’ＡＰＢｓｓベクターに感染させ、細胞を培養して、感染後の異
なる時期にＡＰ発現に関して染色した。
【０１２９】 図１０に示したように、ＡＰ+細胞病巣の数は培養期間中に増大し、大型ＡＰ+ 病巣のみが予測より遅れて出現した。１〜２ＡＰ+（おそらくは最新遺伝子ター
ゲッティング事象を反映）小病巣の数も、時間とともに増大し、このことは、遺
伝子矯正が全培養期間中起こり続けることを示唆する。これは、ＡＡＶベクター
ゲノムはヒト繊維芽細胞中でエピソーム分子として数日間存続するので、意外で
はない（Russell et al.（1994）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:8915-8919）
。ＡＰ+細胞は、レトロウイルス標的を含有しない細胞中でも、ＡＡＶベクター
を受容しない細胞でも観察されなかった。これらの制御は、ＡＰ陽性の供給源と
しての復帰突然変異を妨げる。遺伝子ターゲッティング事象の絶対数は、等価Ｍ
ＯＩで、正常ヒト繊維芽細胞を用いたＨＰＲＴターゲッティング実験で得られる
ものと同様で（Russell and Hirata（1998）Nat. Genet. 18:325-330）、これは
本実験においては相対的に低かった。したがって、これらの結果は、ＡＡＶベク
ターにより遺伝子矯正を測定するための便利な検定として正常ヒト細胞で用いら
れ得る。
【０１３０】 Ｂ．neo遺伝子の矯正および取り出し 本実験では、正常ヒト細胞中の突然変異体neo遺伝子での遺伝子矯正を試験し
た。レトロウイルスベクターＭＬＶ−ＬＨＳＮＯ３９を用いて、突然変異体neo
遺伝子を正常ヒト繊維芽細胞中に導入した。ＭＬＶ−ＬＨＳＮＯ３９は、機能性
ヒグロマイシン耐性遺伝子およびコード配列のbp39に挿入突然変異を有するneo
遺伝子を含有した。ベクターは、ｐ１５Ａ細菌プラスミド複製起点およびneo遺
伝子を制御する原核生物プロモーターも含有し、これにより、カナマイシンまた
はネオマイシンに対する耐性を付与する細菌プラスミドとして矯正化プロウイル
スを回収し得た。
【０１３１】 ＭＬＶ−ＬＨＳＮＯ３９を用いて、正常ヒト繊維芽細胞を形質導入し、ヒグロ
マイシン耐性細胞を選別した。次にこれらの細胞を、neo遺伝子がコード配列のb
p648で突然変異化され、bp39には突然変異は認められない意外は、ＭＬＶ−ＬＨ
ＳＮＯ３９ベクターと約2.7 kbの配列同一性を有するＡＡＶベクターＡＡＶ−Ｓ
ＮＯ６４８を用いて形質導入した（図１１）。neo突然変異はともに、neo機能を
崩壊し、そこでＧ４１８耐性細胞は遺伝子ターゲッティング事象を受けねばなら
なかった。
【０１３２】 ＡＡＶ−ＳＮＯ６４８ベクターによる感染後、ＬＨＳＮＯ３９標的プロウイル
スを含有する1000個の正常ヒト繊維芽細胞のうち約１個がＧ４１８耐性になった
。この遺伝子矯正率は、前記の実施例１における同一neo突然変異を含有するＨ
ｅＬａ細胞で観察されたものと同様である。 いくつかのＧ４１８耐性コロニーが単離され、ＤＮＡ分析のために約106〜107 細胞に展開された（表３）。各クローンからのゲノムＤＮＡをEcoRIで消化した
が、これはＡＡＶ−ＳＮＯ６４８ベクターと相同の領域の外側のヒグロマイシン
耐性遺伝子中で、ＬＨＳＮＯ３９標的を一旦消化する（図１１）。矯正化neoを
含有するゲノムＤＮＡ断片は、フランキング染色体ＤＮＡ中にある次のEcoRIの
下流に伸び、したがって、それらはＡＡＶ−ＳＮＯ６４８ベクターと相同の全領
域、およびＡＡＶ−ＳＮＯ６４８と相同の領域の直g外側の領域、ならびにレト
ロウイルスプロウイルスと染色体ＤＮＡとの間の接合部を包含する。これらの断
片をＤＮＡリガーゼで環化し、カナマイシンまたはネオマイシン耐性を付与する
プラスミドとして細菌中で回収した。表３は、これらの回収プラスミドに付いて
の今日までの制限消化および配列分析を要約する。
【０１３３】
【表３】
【０１３４】 １２の個々のＧ４１８耐性繊維芽細胞クローンのうち、１０個が矯正化neo標
的を含有したが、これは細菌プラスミドとして容易に回収し得た。プラスミド取
り出しの効率には多少の変動性が認められたが、これはおそらくはフランキング
染色体ＤＮＡの差に関連すると思われる。各々の場合、異なるプラスミドが回収
されたが、これは、レトロウイルスベクタープロウイルスが予測とは異なる染色
体位置に組み込まれたことを確証する。これらの取り出されたプラスミドを、タ
ーゲッティング工程中にいかなる大きな再配列が起きているのかを確定するよう
意図された酵素パネルで消化したが、特に、左右の相同端では、ＡＡＶターゲッ
ティングベクターの配列がレトロウイルス標的の配列から分岐する。制限分析に
基づいて、10個の回収標的のうちの１つは、左相同で再配列を有し、10すべての
の右相同端は無傷であると考えられた。シーケンシングは、取り出されたプラス
ミド10個のうちの9個が左相同端に修飾を有さないことを確証した。クローン＃
１からのプラスミドのシーケンシングは、再配列が起きており、これは一部はＡ
ＡＶベクターからの14の付加的非相同ヌクレオチドの挿入によるものであること
を実証した。
【０１３５】 ＨＰＲＴ遺伝子ターゲッティングのこれらの取り出し実験および配列分析（実
施例２）は、ＡＡＶ媒介性遺伝子矯正が通常は、意図された修飾部位での配列の
精密な置換からなる高忠実度工程であることを実証する。さらに、本工程は、相
同端であっても、通常は二次突然変異または再配列を導入しない。エレクトロポ
レーションを基礎にした慣用的遺伝子ターゲッティング実験の場合、いくつかの
試験（しかし、Thomas et al.（1992）Mol.Cell.Biol. 12:2919-2923; Zheng et
al.（1991）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8067-8071以外ではない）は、二
次突然変異が標的化遺伝子座で起こり得る（Brinster et al.（1989） Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 86:7087-7091; Thomas and Capecchi（1986）Nature 324:3
4-38）ことを、特に相同端での再配列（Doetschman et al.（1988） Proc. Natl
. Acad. Sci. USA 85:8583-8587; Hasty et al.（1991）Mol. Cell. Biol. 11:4
509-4517）が起こりうることを示唆しており、したがって、ＡＡＶ媒介性反応の
忠実度を確定することは重要であった。挿入ベクターを用いる慣用的遺伝子ター
ゲッティング法によりしばしば生じる、ＡＡＶ標的化遺伝子座での倍加を我々は
観察されたことがないことに留意すべきである。
【０１３６】 これらのneo取り出し実験は、いくつかの重油な点を実証する。試験された繊
維芽細胞集団は無作為染色体位置に多数の個々の標的遺伝子座を含有するため、
ＡＡＶ媒介性遺伝子矯正は特定の遺伝子座に限定されないと考えられる（但し、
レトロウイルス組込みに関する潜在的優先部位は除く）。本方法が高忠実度遺伝
子矯正事象であるという事実は、治療目的のために本方法を用いるためには極め
て重要である。さらに、neo標的を用いたこの実証により、配列分析がより難し
いＡＰ遺伝子（前記）のような他のレトロウイルス標的を用いたデータを確信を
持って解明し得る。これらの研究は、特に標的化遺伝子座が正常ヒト細胞からル
ーチンに回収され、細菌プラスミドとして分析され得るレトロウイルス標的矯正
系の実験的可能性も実証する。したがって、これらの実験は、忠実度を実証する
だけでなく、突然変異が遺伝子矯正中に導入されたことをかくていするためにも
標的化遺伝子座の配列分析を要する広範な種々の細胞型および培養条件に容易に
適合可能である。
【０１３７】 Ｃ．本明細書中に記載したレトロウイルス標的遺伝子矯正系の重要な特徴は、
異なる細胞型に用いられるその能力である。これにより、遺伝子ターゲッティン
グにとって重要であり得る遺伝子中の種々の突然変異と細胞株中の同一ベクター
による同一遺伝子座での遺伝子ターゲッティング率を比較することができる。標
的およびＡＡＶターゲッティングベクターを導入するために用いられるレトロウ
イルスベクターはともに広範な宿主範囲を有するので、多数の突然変異体細胞株
を試験し得る。特に、関連する組の細胞は、ＤＮＡ修復および／または組換えに
関与する遺伝子に突然変異を有する一次ヒト繊維芽細胞であるが、これらの同一
遺伝子が遺伝子ターゲッティングで重要な役割を演じるためである。多数の種類
のこれらの細胞は、Coriell Institute for Medical Research（Camden NJ）か
ら入手可能である。
【０１３８】 本実施例では、４つの異なる一次ヒト繊維芽細胞培養を用いた。これらの繊維
芽細胞は、正常男性（ＭＨＦ２）、あるいは色素性乾皮症（ＸＰ）相補的群Ａ（
ＸＰＡ１）またはＣ（ＸＰＣ１）およびブルーム症候群（ＢＳ１）を有する患者
から単離した。いずれの疾患も、ＤＮＡ修復の欠損に関連しており、ＸＰ患者は
紫外線に対する感受性の増大を示し、ブルーム症候群患者は過変異症を有する。
【０１３９】 遺伝子矯正率を測定するために、図９に示したアルカリ性ホスファターゼ（Ａ
Ｐ）遺伝子ターゲッティング系を用いた。４つの繊維芽細胞型すべてを、先ず、
突然変異体ＡＰ遺伝子を含有するレトロウイルスベクターＬＡＰ３７５（△４）
ＳＮを用いて形質導入し、ポリクローナルＧ４１８耐性集団を選別したが、これ
は5,000より多い個々のプロウイルス組込み事象で構成されていた。次にこれら
の形質導入化繊維芽細胞をＡＡＶ−５‘ＡＰＢｓｓターゲッティングベクターで
感染させて、8日間培養し、ＡＰ発現に関して染色した。遺伝子矯正率をＡＰ+病
巣数／105感染細胞として算出した。ＡＰ+病巣はベクターを受容しない培養でも
、レトロウイルスベクター標的を含有しない培養中でも観察されなかったが、こ
れは、ＡＰ発現がＡＡＶ媒介性遺伝子矯正によるものであることを確証する。図
１２に示すように、正常ヒト繊維芽細胞ＭＨＦ２と比較して、ＸＰ繊維芽細胞Ｘ
ＰＡ１とＸＰＣ１との間には、遺伝子ターゲッティング率にほとんど差は認めら
れなかった。しかしながら、ブルーム症候群繊維芽細胞ＢＳ１は、両レトロウイ
ルス標的に関して、約５倍の遺伝子矯正率を有する。ブルーム症候群患者からの
細胞は娘染色糸交換率の増大を示すことが知られている（Chaganti et al.（197
4）Proc.Natl. Acad.Sci. USA 71:4508-4512）ため、これは、遺伝子ターゲッテ
ィングおよび娘染色糸交換が同様のメカニズムを包含することを示唆する。
【０１４０】 これらの実験は、レトロウイルス標的矯正検定が一次繊維芽細胞培養を含めた
異なる細胞株に用いられ得ることを実証する。ＨＴ−１０８０ヒト繊維肉腫細胞
およびＨｅＬａ細胞に関する系も用いたが、これは、本方法が広範な種々の細胞
型に適用可能であることを示す。 実施例７ 染色体遺伝子のin vivo矯正 本実施例は、本発明の遺伝子ターゲッティング法を用いたin vivo遺伝子矯正
の実施方法を記載する。一方は内因性β−グルクロニダーゼ遺伝子（β−gus）
の突然変異を有し、そして他方はβ−ガラクトシダーゼ（β−gal）導入遺伝子
に工学処理突然変異を有する２つのネズミモデルを用いた。
【０１４１】 Ａ．β−gus遺伝子in vivo矯正 ムコ多糖症ＶＩＩ型（ＭＰＳＶＩＩ）のネズミモデルを、β−gus遺伝子にお
ける単一塩基対欠失により生じさせた（Sands and Birkenmeier（1993）Proc. N
atl. Acad. Sci. USA90:6567-6571）。ＭＰＳ ＶＩＩ突然変異gusmpsに関する
マウスホモ接合体は、ヒトＭＰＳ ＶＩＩまたはＳｌｙ症候群と同様の特徴、例
えば寿命短縮、骨格異常および種々の組織におけるグリコサミノグリカンの蓄積
を有するリソソーム貯蔵疾患を発症する。これらのマウスは、以下の理由から、
in vivo遺伝子ターゲッティングを研究するための理想的モデルである。第一に
、野生型および突然変異体ゲノム遺伝子座はともに、クローン化され、シーケン
シングされている（Gallagher et al.（1987）Genomics1:145-152; Sands and B
urkenmeier、上記）。第二に、組織化学染色（β−galに対する染色と同様）を
用いて、組織培養およびいくつかの器官からの組織切片中のgus+細胞をgusmpsと
容易に識別し得ることである。第三に、β−グルクロニダーゼに関する生化学的
検定が利用可能である（Gallagher（1992））。突然変異体と野生型対立遺伝子
とを識別するＰＣＲ検定が開発されている（Wolfe and Sands（1996）Murine mu
copolysaccharidosis type VII: a model system for somatic gene therapy of
the central mervous system. In Protocols for gene transfer in neuroscie
nce:towards gene therapy of neurological disorders, P.R.Lowenstein and W
. Enquist, eds.,; John Wiley and Sons, Ltd.）。gusmpsヘテロ接合体および
ホモ接合体からの形質転換化繊維芽細胞株は、in vitro試験用に用い得る。さら
に、突然変異は、ＡＡＶベクターによる矯正を容易に施し得る小（1 bp）欠失で
ある。
【０１４２】 本実験に用いるのに適したマウスβ−gusゲノム遺伝子座およびＡＡＶベクタ
ーの構造を、図１３に示す。ＡＡＶベクターは、エキソン１０を含めた約4 kbの
ゲノムＤＮＡを含有する。ＡＡＶ−Ｇｕｓ１０ｗ５ベクターは、野生型ＤＮＡか
ら作製され、一方対照ベクターＡＡＶ−Ｇｕｓ１０ｍｐｓは、ＭＰＳ ＶＩＩに
関与するエキソン１０における1 bp欠失を含有する。
【０１４３】 初期実験では、ＡＡＶ− Ｇｕｓ１０ｗｔベクターで感染させることによりＭ
ＰＳＶＩＩマウスからの形質転換化繊維芽細胞においてgusmps突然変異を矯正し
、次に、β−gus発現に関して染色する。 ＡＡＶ−Ｇｕｓ１０ｍｐｓベクターに
感染させた細胞は、対照として供する。遺伝子矯正が起きた場合、β−gus発現
は野生型ベクターに感染した細胞中でのみ観察される。培養マウス細胞は一般に
、in vivoマウス細胞よりＡＡＶベクターで形質導入するのが難しいので、本実
験は、部ｋたがin vivo実験においても機能するとの合理的予測を提供すると期
待される。
【０１４４】 次に、ヘテロ接合体を繁殖させ、gusmps対立遺伝子に関するＰＣＲにより同定
して得られたホモ接合体gusmpsマウスに関して（Wolfe and Sands、上記）in vi
vo実験を実施した。β−gusが高レベルで発現されるために、肝臓を標的組織と
して用いた。（Koeberl et al.（1997）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:1426-1
431; Snyder et al.（1997）Nat. Genet. 16:270-276）。静脈内または肝臓内注
射により、8〜10週齢マウスに1010〜1011ベクター粒子を摂取させた。従来の遺
伝子付加試験は、両型の注射が、肝臓にベクター粒子を効率的に送達することを
示している（Koeberl et al.上記）。
【０１４５】 感染後の異なる時点（約２週間、２ヶ月および／または死亡時）で、β−gus
遺伝子矯正に関してマウスを分析した。ＡＡＶベクターによるＡＰ遺伝子ターゲ
ッティング（図１０）と、マウス乾燥に遺伝子を送達するためにＡＡＶベクター
を用いた従来の遺伝子付加実験（Snyder et al.上記）の時間経過に基づけば、
最大遺伝子矯正レベルに達するには数日または数週間を要する。後者の時点は、
矯正化対立遺伝子からの遺伝子発現の持続性を査定する。
【０１４６】 注射マウスの分析は、β−gus発現に関して組織切片を染色し、組織ホモジネ
ート中のβ−グルクロニダーゼ活性を測定し、そしてサザン分析およびＰＣＲの
ために組織試料からＤＮＡを単離する工程からなる。検査される組織としては、
肝臓、脾臓、腎臓、肺および脳が挙げられる。個々のgus+細胞は染色切片中に明
らかに目に見えるべきであり、それにより切片または可視化視野中の全細胞数の
概算を基礎にして遺伝子矯正率が得られる。染色切片の密着検査も、どの型の細
胞がβ−gusを発現しているかの同定を可能にし得る。この組織化学的分析は、
遺伝子矯正に関して最も高感度の検定であると予測され、遺伝子矯正率を検出す
る能力は1％をはるかに下回る。in vitro遺伝子ターゲッティング率を基礎にし
て、in vivo遺伝子ターゲッティング率は、0.1〜1.0％と予測される。ＡＡＶ−
Ｇｕｓ１０ｗｔおよび対照ベクターＡＡＶ−Ｇｕｓ１０ｍｐｓを注射したマウス
からの切片の比較は、観察されたβ−gus発現がgusmps１bp欠失突然変異の特異
的矯正によるものであることを実証する。組織ホモジネート中のβ−グルクロニ
ダーゼレベルの測定も、遺伝子矯正率の確定を補助するために実施する。
【０１４７】 遺伝子矯正率が10％に近い場合、野生型対立遺伝子はNlaIVにより消化される
が、突然変異対立遺伝子は消化されないため、サザンブロットで直接、矯正化染
色体遺伝子を同定し得ると考えられる。遺伝子矯正率がそれより低い場合には、
標的化遺伝子座の他に存在し得る無作為組込みベクタープロウイルスを同定する
ために、ゲノムＤＮＡ試料のサザン分析を実施し得る（制限酵素および／または
ＡＡＶ末端反復配列からのプローブを使用）。
【０１４８】 矯正化対立遺伝子を同定するためには、ＰＣＲ分析も用い得る。例えば、図１
３に示すような位置にプライマーを用いて、エキソン１０を増幅し得る。これら
のＰＣＲ生成物は、ゲノムβ−gus遺伝子座からのみ産生され、無作為組込みベ
クターからは産生されるべきでない。NlaIVで生成物を消化し、次に突然変異対
立遺伝子と矯正化遺伝子を識別して、相対的に小分画の野生型、矯正化対立遺伝
子も検出し得るべきである。
【０１４９】 同様の遺伝子矯正実験を、ベクターを浅側頭静脈に注射することにより、新生
児動物に関しても実施する（Sands et al.（1993）Lab. Invest.68:676-686）。
このアプローチは、ＡＡＶベクターを用いた遺伝子付加実験において非常にうま
く立証し、より多くの細胞増殖が起こる時点でのベクター送達を可能にする。さ
らに、遺伝子矯正によるものと思われるあらゆる治療的効果が、高齢動物に恒久
的損傷が起こる前に現れなければならない。非矯正化gusmps同腹子と比較して、
動物の発生を追跡検査し、膨張化リソソーム中での低減が起きたことを顕微鏡技
術により確定し得る（Wolfe and Sands、上記）。
【０１５０】 Ｂ．β−Ｇａｌ形質導入遺伝子in vivo矯正 in vivo遺伝子矯正実験のために、トランスジェニックマウスモデルも開発す
る。このモデルは、ラクトース含有培地中でlac-細菌を増殖させ得る細菌プラス
ミドとして哺乳類細胞から取り出し得るβ−galシャトル形質導入遺伝子を基礎
にする。突然変異化バージョンのβ−galシャトル形質導入遺伝子を含有するト
ランスジェニックマウスを、β−gal突然変異を矯正し得るＡＡＶターゲッティ
ングベクターで感染させて、矯正化形質導入遺伝子を有する細胞を、β−gus遺
伝子矯正に関して前記した実験と同様に、組織切片の組織化学的染色により検出
する。β−gal系の主な利点は、矯正化遺伝子が細菌中に取り出されて、矯正率
の個々の概算を提供し、標的化遺伝子の配列分析を可能にする点である。さらに
、所望の導入遺伝子発現プロフィールを有するマウスを選別することにより、種
々の異なる器官で遺伝子矯正実験を実行し得る。そのアプローチは、この場合は
遺伝子矯正に関する検定であること以外は、β−gal導入遺伝子での突然変異誘
発に関してスクリーニングする他のトランスジェニック動物モデルと同様である
（Gossen et al.（1994）Mutat. Res. 307:451-459）。
【０１５１】 図１４は、これらの実験に用いられ得る構築物を示す（線状形態で）。ｐＣｎ
ＺＳＮＯは、強力なサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下の核
局在化β−gal遺伝子、ＳＶ４０初期プロモーターの制御下のneo遺伝子およびｐ
１５Ａプラスミド起点を含有する。プラスミドのＳＶ−neo−ｐ１５Ａ部分は、
実施例６に用いた同一シャトルベクターカセットであり、これは、大腸菌中で複
製し、カナマイシン耐性を付与する。β−gal遺伝子は、細菌lacオペレーターお
よびプロモーターも含有する（図１４の「lac」）が、これは大腸菌中での転写
を制御し、矯正化対立遺伝子に関する青／白スクリーニングを可能にし、lac-細
菌にラクトース依存性増殖性を付与する別の原核生物選択可能マーカーを提供す
る。ｐＣｎＺＳＮＯでトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞は、β−gal発現に
関して染色された場合、青色核を有するＧ４１８耐性コロニーを形成する。細菌
コロニーはカナマイシンまたは単独糖源としてのラクトースを含有する培地中で
増殖することにより、ｐＣｎＺＳＮＯに関して選別され得る。
【０１５２】 プラスミドｐＣｎＺＳＮＯは、β−gal導入遺伝子を発現するトランスフェク
ト化細胞を同定するのに役立つ付加的マーカー遺伝子を含有するようさらに修飾
し得る。遺伝子矯正実験のために突然変異がβ−gal中に導入されるため、同定
のためのさらに別のマーカーが必要である。例えば、β−galと同一プロモータ
ーにより制御されるが、しかし脳心筋炎ウイルス由来の内部リボソーム侵入Ｖ（
ＩＲＥＳ）から翻訳を開始するレポーター遺伝子を下流に挿入し得る。グリーン
蛍光タンパク質（ＧＦＰ）および／またはアルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）を
有するプラスミドを、例えば図１４に示されているように構築し得る。
【０１５３】 ｐＣｎＺＧＳＮＯおよびｐＣｎＺＡＰＳＮＯプラスミドを先ず、培養細胞中で
検査する。タンパク質機能を崩壊する突然変異をプラスミドβ−gal遺伝子中で
工学処理する。ＨｅＬａ細胞をこれらの突然変異化プラスミドでトランスフェク
ト化して、安定組込み物をＧ４１８中で選別する。個々のＧ４１８耐性コロニー
を選別し、蛍光または組織化学的染色下での可視化により、ＧＦＰまたはＡＰ発
現に関して検査する。次にＧＦＰまたはＡＰを発現するコロニーを、β−galの
野生型部分を含有するＡＡＶベクターを用いて遺伝子同時反応性に関してスクリ
ーニングする（図１４）。ベクター中に含入されるβ−galの一部は、機能性β
−galタンパク質をコードしない。β−gal発現に関してＨｅＬａ細胞を染色する
ことにより（前記のＡＰ遺伝子矯正検定と同様である）、ならびにプラスミドを
取り出して、β−gal発現に関して細菌コロニーをスクリーニングすることによ
り、矯正化遺伝子を同定する。
【０１５４】 プラスミド取り出し実験は前記と同様であり、必要な遺伝子素子の外側の組込
み導入遺伝子を制限酵素で消化し、細菌をエレクトロポレーション処理し、次に
カナマイシン耐性に関して選択する（neo取り出し）か、ラクトース含有培地で
増殖させる（β−gal取り出し）工程からなる。neo取り出し実験の場合、Ｘｐ−
galプレート上でコロニーを増殖させて、青／白コロニースクリーニングにより
矯正化導入遺伝子を有する回収プラスミドのパーセンテージを測定し得る。これ
らのin vitro実験は、遺伝子矯正に筆よな構築物はすべて、適正に働いているこ
とを実証する。
【０１５５】 次に、適切なｐＣｎＺＧＳＮＯまたはｐＣｎＺＡＰＳＮＯ構築物の原核注入に
より、トランスジェニック動物を作製する。蛍光下でのＧＦＰ発現または尾また
は足指切片の組織化学的染色によるＡＰ発現に関して検定することにより、導入
遺伝子の存在に関してＰｕｐをスクリーニングする。導入遺伝子を発現するＰｕ
ｐは、サザンブロットにより分析して、導入遺伝子の構造を確定し得る。これら
の始祖は繁殖され、それらの子孫はスクリーニングされて、どの器官および組織
がＧＦＰまたはＡＰレポーター遺伝子を発現するかを確定される。おそらくは、
突然変異体β−gal 転写体は、それが同一プロモーターにより制御されるため、
これらの同一組織中でも高度に発現されると思われる。目標は、広範な種々の組
織中で高レベルのＧＦＰまたはＡＰを発現する動物を同定することである。この
ような動物は、in vivo遺伝子矯正を研究するための多目的モデルである。
【０１５６】 適切なトランスジェニックマウスが同定されれば、それらはin vivo遺伝子矯
正実験に用いられる。用いられるＡＡＶベクターは、野生型β−gal配列または
トランスジェニック動物中に存在するのと同一の突然変異を有するβ−galの一
バージョンを含有する。野生型ベクターのみが遺伝子矯正を生じるべきである。
前記の実験と同様に、静脈内または肝臓内注射により、8〜10週齢マウスに1010
〜1011ＡＡＶベクター粒子を接種した。これらの注射は、主に肝臓にベクターを
送達すると予測される（Koeberl et al.上記）。ＡＡＶベクターは、遺伝子付加
実験において骨格筋を効率的に形質導入させることが見出されている（Fisher e
t al.（1997）Nat. Med. 3:306-312; Xiao et al.（1996）J. Virol. 70:8098-8
108）ため、そしてこの手法は簡単に実施し得るため、筋肉内注射も、これらの
トランスジェニック動物では好ましい。さらに、静脈内注射は、前記のように新
生児動物で実施し得る。
【０１５７】 注射後の異なる時点（約２週間、２ヶ月および12ヶ月または他の原因による死
亡時）で動物を屠殺し、いくつかの方法により分析する。第一に、核β−gus発
現に関して組織切片を組織化学的に染色して、関連器官中の遺伝子矯正率を確定
する。第二に、サザンブロットおよび細菌中でのプラスミド取り出しを含めたＤ
ＮＡ分析を実施する。サザン分析は、標的遺伝子座の全体的構造を確定し、起き
例えば思われる無作為組込み事象を同定するのに有用である。プラスミド取り出
しは、neoまたはβ−gal遺伝子に関して選別することにより実施し、回収プラス
ミドをシーケンシングして、予測通りに遺伝子矯正が起きたことを確定し、反応
の忠実度を査定する。遺伝子矯正率は、neo遺伝子選別により回収されたプラス
ミド中のβ−gal発現に関するコロニーの青／白染色によっても測定する。
【０１５８】 本明細書中に記載した実施態様は、説明のためだけのものであり、その観点で
の種々の修正および変更が当業者に示唆されており、本出願の精神および範囲内
に、そして添付の特許請求の範囲内に含まれる、と理解される。本明細書中に引
用された出版物、特許および特許出願はすべて、参照により本明細書中に含まれ
る。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】 図１Ａは、実施例１に記載されるアデノ炊飯ウイルスベクターＡＡＶ−ＳＮｏ
ｒｉの図である。このベクターは、２つのＡＡＶ末端反復（ＴＲ）、ＳＶ４０初
期プロモーターの制御下でネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（neo）をコ
ードする細菌遺伝子および細菌Ｔｎ５プロモーター、ｐ１５Ａプラスミド複製起
点および真核生物ポリアデニル化部位を含む。それぞれneo遺伝子のbp39およびb
p648に突然変異を含有するベクターＡＡＶ−ＳＮＯ３９およびＡＡＶ−ＳＮＯ６
４８も示されている。
【図１Ｂ】 図１Ｂは、実施例１に記載されているように修飾されたＧ４１８耐性ＨｅＬａ
細胞クローンからのBamHI−消化ゲノムＤＮＡのサザンブロット分析の結果を示
すオートラジオグラムである。見出し「ＨｅＬａ」のレーンは、非修飾化ＨｅＬ
ａ細胞からのゲノムＤＮＡとのneo遺伝子プローブのハイブリダイゼーションを
示し、見出し「ＨＳＮＯ３９」のレーンは、ＡＡ不−ＳＮＯ３９の内部部分を含
有したプラスミドの３つのコピーを含有するＨＳＮＯ３９からのゲノムＤＮＡと
のプローブのハイブリダイゼーションを示し、レーン１〜１１は、パルボウイル
スベクターＡＡＶ−ＳＮＯ６４８を用いてＨＳＮＯ３９細胞を修飾することによ
り得られる１１の異なるクローンとのプローブのハイブリダイゼーションを示す
。
【図２Ａ】 図２Ａは、ヒトＨＰＲＴ遺伝子座、ならびにヒトＨＰＲＴ遺伝子座を修飾する
ために用いられたＡＡＶベクターＨＰｅ２／３およびＨＰｅ２／３Ｘの図である
。ＨＰＲＴ遺伝子の指示部分の他に、実施例２に記載されるこれらのベクターは
、２つのＡＡＶ末端反復（ＴＲ）、ならびにＯ、Ｐ、ＱおよびＲと呼ばれる４つ
のＡｌｕ反復を含有する。
【図２Ｂ】 図２Ｂおよび２Ｃは、HindIII（図２Ｂ）またはHindIII＋PvuI（図２Ｃ）で消
化されたＨＴ−１０８０一繊維肉腫細胞ゲノムＤＮＡのオートラジオグラムであ
る。見出し「ＨＴ１０８０」のレーンは、非修飾化ＨＴ１０８０細胞からのゲノ
ムＤＮＡとの図２Ａに示したプローブのハイブリダイゼーションを示し、レーン
１〜１３は、ＡＡＶベクターＡＡＶ−ＨＰｅ２／３Ｘを用いて形質導入により６
ＴＧ耐性にされた１３の異なるクローンからのゲノムＤＮＡとのこのプローブの
ハイブリダイゼーションを示す。
【図２Ｃ】 図２Ｂおよび２Ｃは、HindIII（図２Ｂ）またはHindIII＋PvuI（図２Ｃ）で消
化されたＨＴ−１０８０一繊維肉腫細胞ゲノムＤＮＡのオートラジオグラムであ
る。見出し「ＨＴ１０８０」のレーンは、非修飾化ＨＴ１０８０細胞からのゲノ
ムＤＮＡとの図２Ａに示したプローブのハイブリダイゼーションを示し、レーン
１〜１３は、ＡＡＶベクターＡＡＶ−ＨＰｅ２／３Ｘを用いて形質導入により６
ＴＧ耐性にされた１３の異なるクローンからのゲノムＤＮＡとのこのプローブの
ハイブリダイゼーションを示す。
【図３】 図３は、ＡＡＶベクターＡＡＶ−ＨＰｅ２／３およびＡＡＶ−ＨＰｅ２／３Ｘ
がＨＴ−１０８０細胞中のＨＰＲＴ遺伝子座を修飾するために用いられた実施例
２に記載される実験の結果を示す。得られた６ＴＧ−耐性細胞のパーセントが示
されている。
【図４】 図４は、ＨｅＬａ細胞中に存在する欠陥neo遺伝子がＡＡＶベクターＡＡＶ−
ＳＮＯ６４８により矯正される頻度に及ぼす感染多重度の影響の分析結果を示す
。この実験は、実施例３に説明されている。
【図５】 図５は、実施例４で説明されるような形質導入対トランスフェクションを用い
て得られたＨＳＮＯ３９細胞におけるneo遺伝子矯正の頻度の比較を示す。形質
導入は、ＡＡＶベクターＡＡＶ−ＳＮＯ６４８を用いて実行され、一方トランス
フェクションは、プラスミドｐＡＳＮＯ６４８（全ＡＡＶ−ＳＮＯ６４８ゲノム
を含有する）、ｐＡＳＮＯ３９（neo遺伝子の塩基対39に突然変異を含有する）
およびｐＡＳＮｏｒｉ２（neo突然変異を有さない）を用いて実施された。
【図６】 図６は、実施例５に記載されるようなＡＡＶベクターＡＡＶ−ＨＰｅ２／３を
用いた形質導入後の修飾化ＨＰＲＴ遺伝子を有する正常ヒト繊維芽細胞の分画を
示す。ＨＰＲＴ−修飾化細胞の分画は、細胞当たりの感染ＡＡＶゲノム数に対し
てプロットされている。
【図７】 図７は、４つの異なる正常ヒト繊維芽細胞培養がＡＡＶ−ＨＰｅ２／３（野生
型ＨＰＲＴ遺伝子）またはＡＡＶ−ＨＰｅ２／３Ｘ（ＨＰＲＴ遺伝子におけるフ
レームシフト突然変異を導入する）で形質導入された実験の結果を示す。ＨＰＲ
Ｔ遺伝子修飾のパーセントが示されている。
【図８】 図８は、レトロウイルスベクター標的遺伝子座での遺伝子ターゲッティングの
略図である。
【図９】 図９は、アルカリ性ホスファターゼ遺伝子の修復による遺伝子ターゲッティン
グの研究のために用いられたベクターを示す。２つのレトロウイルスベクター（
ＭＬＶ−ＬＡＰＳＮ）が示されている。ベクターＬＡＰ３７５△４は、ＡＰ読取
り枠のヌクレオチド375に４bp欠失を有し、一方ベクターＬＡＰ９６△２は、ヌ
クレオチド961に２つの塩基対欠失を有する。これらのベクターのいずれかが、
遺伝子ターゲッティングのための標的遺伝子座として宿主細胞中に導入される。
遺伝子ターゲッティングのために用いられるＡＡＶベクター（ＡＡＶ−５‘ＡＰ
Ｂｓｓ）は、ＡＰ遺伝子の一部を含む。
【図１０】 図１０は、ＡＰベクター系を用いた遺伝子ターゲッティングの時間経過を示す
。
【図１１】 図１１は、遺伝子ターゲッティングによりneo遺伝子を矯正する能力を試験す
るのに用いるのに適したレトロウイルスベクターおよびＡＡＶベクターを示す。
標的遺伝子座として宿主細胞中に導入されるレトロウイルスベクターＭＬＶ−Ｌ
ＨＳＮＯ３９は、neo遺伝子のbp39に挿入突然変異を含有するネオマイシン耐性
遺伝子を有する。ＡＡＶベクターＡＡＶ−ＳＮＯ６４８は、neo遺伝子のbp648に
挿入突然変異を有するneo遺伝子を含む。
【図１２】 図１２は、正常（ＭＨＦ２）および突然変異体繊維芽細胞（色素性乾皮症相補
性群Ａ（ＸＰＡ１）およびＣ（ＸＰＣ１）ならびにブルーム症候群（ＢＳ１））
における遺伝子ターゲッティングにより突然変異体ＡＰ遺伝子が矯正される実験
の結果を示す。
【図１３】 図１３は、ゲノムβ−グルクロニダーゼ遺伝子座における突然変異を矯正する
ための実験に用いられるマウスβ−グルクロニダーゼゲノム遺伝子座およびＡＡ
Ｖベクターの構造を示す。
【図１４】 図１４は、トランスジェニック動物細胞に導入されるβ−ガラクトシダーゼ導
入遺伝子を示す（ｐＣｎＺＳＮＯ、ｐＣｎＺＧＳＮＯ（グリーン蛍光タンパク質
レポーター遺伝子）およびｐＣｎＺＡＰＳＮＯ（アルカリホスファターゼレポー
ター遺伝子））。β−galコード配列の一部を含有するＡＡＶベクターも示され
ている。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ａ６１Ｋ 35/76 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国 ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ， ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，Ｋ Ｒ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ヒラタ，ロリー ケー． アメリカ合衆国，ワシントン 98102，シ アトル，トゥエルフス アベニュ イース ト 603，アパートメント シー Ｆターム(参考） 4B024 AA10 AA11 AA20 DA02 EA02 FA11 GA11 HA17 4B063 QA01 QA13 QA18 QQ02 QQ42 QQ53 QR08 QR55 QR62 QR80 QS25 QS34 4B065 AA90X AA90Y AA95Y AB01 BA02 CA44 CA46 4C084 AA13 MA13 MA52 MA56 MA66 4C087 AA01 BC83 MA13 MA52 MA56 MA66

Claims (26)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 予備選定標的遺伝子座に修飾を有する脊椎動物細胞の産生方
    法であって、以下の： ａ）修飾が導入されている以外は実質的に標的遺伝子座と同一であるＤＮＡ配
    列を包含するターゲッティング構築物、および ｂ）少なくとも１つのパルボウイルスＩＴＲまたは機能的等価物の全部または
    一部 を包含する組換えパルボウイルスベクターゲノムを脊椎動物細胞に導入すること
    を包含する方法であって、 マイクロインジェクション、トランスフェクション、エレクトロポレーション
    、リポフェクション、脂質封入およびバイオリスティックから成る群から選択さ
    れる方法により、組換えパルボウイルスベクターゲノムが脊椎動物細胞中に導入
    され、そして ターゲッティング構築物と標的遺伝子座との間に相同対合が起きて、標的遺伝
    子座に導入されている修飾を生じる ことを包含する方法。
  2. 【請求項２】 核が脊椎動物細胞から取り出されて、生物体が核の移植時に
    それから再構成され得る細胞中に移植される請求項１の方法。
  3. 【請求項３】 細胞が、胚性幹細胞、精子細胞、卵、受精卵および体細胞性
    再集団形成細胞から成る群から選択される請求項２の方法。
  4. 【請求項４】 標的遺伝子座の修飾を有する細胞を包含する非ヒト動物の作
    製方法であって、以下の： ａ）修飾が導入されている以外は実質的に標的遺伝子座と同一であるＤＮＡ配
    列を包含するターゲッティング構築物、および ｂ）少なくとも１つのパルボウイルスＩＴＲまたは機能的等価物の全部または
    一部 を包含する組換えパルボウイルスベクターゲノムを脊椎動物細胞に導入するが、
    この場合、ターゲッティング構築物と標的遺伝子座との間に相同対合が起きて、
    標的遺伝子座に導入されている修飾を生じ、 細胞からの核を、動物が再構成され得る二次細胞中に導入し、そして 細胞を胚に発生させる 工程を包含する方法。
  5. 【請求項５】 動物がトランスジェニック動物である請求項４の方法。
  6. 【請求項６】 動物がキメラ動物である請求項４の方法。
  7. 【請求項７】 予備選定標的遺伝子座に修飾を有する脊椎動物細胞の産生方
    法であって、以下の： ａ）修飾が導入されている以外は実質的に標的遺伝子座と同一であるＤＮＡ配
    列を包含するターゲッティング構築物、 ｂ）少なくとも１つのパルボウイルスＩＴＲまたは機能的等価物の全部または
    一部、および ｃ）ターゲッティングエンハンサー を包含する組換えパルボウイルスベクターゲノムを脊椎動物細胞に導入するが、
    この場合、ターゲッティング構築物と標的遺伝子座との間に相同対合が起きて、
    標的遺伝子座に導入されている修飾を生じる ことを包含する方法。
  8. 【請求項８】 ターゲッティングエンハンサーが付加生成物、ピリミジンダ
    イマーおよび修飾化ヌクレオチドまたは修飾化ＤＮＡ主鎖から成る群から選択さ
    れる請求項７の方法。
  9. 【請求項９】 組換えパルボウイルスベクターゲノムがＤＮＡ組換えポリペ
    プチドまたはＤＮＡ修復ポリペプチドと会合する請求項７の方法。
  10. 【請求項１０】 組換えポリペプチドがＲｅｃＡ、ＲｅｃＡ相同体およびＲ
    ｅｃＡ関連タンパク質から成る群から選択される請求項９の方法。
  11. 【請求項１１】 予備選定標的遺伝子座に修飾を有する脊椎動物細胞の産生
    方法であって、以下の： ａ）修飾が導入されている以外は実質的に標的遺伝子座と同一であるＤＮＡ配
    列を包含するターゲッティング構築物、および ｂ）少なくとも１つのパルボウイルスＩＴＲまたは機能的等価物の全部または
    一部 を包含する組換えパルボウイルスベクターゲノムを脊椎動物細胞に導入すること
    を包含する方法であって、 細胞に投与される組換えパルボウイルスベクターゲノムの集団の全成員が組換
    えパルボウイルスゲノムの＋系統であるか、または集団の全成員が−系統であり
    、そして ターゲッティング構築物と標的遺伝子座との間に相同対合が起きて、標的遺伝
    子座に導入されている修飾を生じる ことを包含する方法。
  12. 【請求項１２】 予備選定標的遺伝子座に修飾を有する脊椎動物細胞の産生
    方法であって、以下の： ａ）修飾が導入されている以外は実質的に標的遺伝子座と同一であるＤＮＡ配
    列を包含するターゲッティング構築物、および ｂ）少なくとも１つのパルボウイルスＩＴＲまたは機能的等価物の全部または
    一部 を包含する組換えパルボウイルスベクターゲノムを脊椎動物細胞に導入すること
    を包含する方法であって、 細胞がターゲッティング効率を増大する作用物質で処理され、ターゲッティン
    グ構築物と標的遺伝子座との間に相同対合が起きて、標的遺伝子座に導入されて
    いる修飾を生じる ことを包含する方法。
  13. 【請求項１３】 ターゲッティング効率を増大する作用物質が以下の：細胞
    周期モジュレーター、ＤＮＡ修復モジュレーター、ＤＮＡ組換えモジュレーター
    、クロマチンパッケージングのモジュレーター、アポトーシスの阻害剤およびＤ
    ＮＡメチル化阻害剤から成る群から選択される請求項１２の方法。
  14. 【請求項１４】 予備選定標的遺伝子座に組換えシグナルを有する脊椎動物
    細胞の産生方法であって、以下の： ａ）ターゲッティング構築物中の組換えシグナルの存在以外は実質的に標的遺
    伝子座と同一であるＤＮＡ配列を包含するターゲッティング構築物、および ｂ）少なくとも１つのパルボウイルスＩＴＲまたは機能的等価物の全部または
    一部 を包含する組換えパルボウイルスベクターゲノムを脊椎動物細胞に導入すること
    を包含する方法であって、 ターゲッティング構築物と標的遺伝子座との間に相同対合が起きて、標的遺伝
    子座に導入されている組換えシグナルを生じる ことを包含する方法。
  15. 【請求項１５】 組換え部位がlox部位である請求項１４の方法。
  16. 【請求項１６】 パルボウイルスベクター介在性遺伝子ターゲッティングの
    効力の確定方法であって、以下の： 検出可能表現型を有するレポーター遺伝子生成物の発現を妨げる一次突然変異
    を包含するレポーター遺伝子を包含する組込レトロウイルスプロウイルスを有す
    る細胞を提供し、 レポーター遺伝子のポリヌクレオチド亜配列を包含する組換えパルボウイルス
    ベクターゲノムを細胞に導入するが、この場合、ポリヌクレオチド亜配列は一次
    突然変異の位置と重複するが、しかし一次突然変異を含まず、そして検出可能表
    現型を有するレポーター遺伝子生成物の発現を妨げる二次突然変異を包含し、こ
    の場合、ポリヌクレオチド亜配列とレポーター遺伝子との間に相同対合が起きて
    、一次突然変異の矯正およびレポーター遺伝子の発現を生じ、そして レポーター遺伝子生成物の存在または非存在を検出する 工程を包含する方法。
  17. 【請求項１７】 二次突然変異が、欠失、ナンセンス突然変異、ミスセンス
    突然変異および挿入から成る群から選択される１つ又はそれ以上の突然変異であ
    る請求項１６の方法。
  18. 【請求項１８】 レトロウイルスプロウイルスがレポーター遺伝子の他に選
    択可能マーカーを包含する請求項１６の方法。
  19. 【請求項１９】 ベクターゲノムが選択可能マーカーを包含する請求項１８
    の方法であって、細胞を選択可能マーカーの発現に関する選別に付すことをさら
    に包含する方法。
  20. 【請求項２０】 レポーター遺伝子生成物がアルカリ性ホスファターゼ、グ
    リーン蛍光タンパク質およびβ−ガラクトシダーゼから成る群から選択される請
    求項１６の方法。
  21. 【請求項２１】 標的遺伝子座での遺伝子ターゲッティングが起きた細胞に
    対する濃縮方法であって、以下の： １）検出可能表現型を有するレポーター遺伝子生成物の発現を妨げる一次突然
    変異を包含するレポーター遺伝子、および２）修飾が望まれる標的遺伝子座を有
    する細胞を提供し、 以下の： ａ）レポーター遺伝子のポリヌクレオチド亜配列を包含する選択構築物であっ
    て、ここで、ポリヌクレオチド亜配列は一次突然変異の位置と重複するが、しか
    し一次突然変異を含まず、そして検出可能表現型を有するレポーター遺伝子生成
    物の発現を妨げる二次突然変異を包含し、そして ｂ）修飾が導入されている以外は標的遺伝子座と実質的に同一であるＤＮＡ配
    列を包含するターゲッティング構築物 を包含する組換えパルボウイルスベクターゲノムを細胞に導入し、 ポリヌクレオチド亜配列とレポーター遺伝子との間で相同対合が起きて、一次
    突然変異の矯正およびレポーター遺伝子の発現を生じた細胞の集団を得るために
    レポーター遺伝子生成物が発現される細胞を同定し、そして ターゲッティング構築物と標的遺伝子座との間で相同対合が起きて、標的遺伝
    子座に導入されている修飾を生じたものを同定するために細胞の集団をスクリー
    ニングする 工程を包含する方法。
  22. 【請求項２２】 細胞が生物体がそれから再構成され得る細胞である請求項
    ２１の方法。
  23. 【請求項２３】 核が脊椎動物細胞から取り出されて、生物体が核の移植時
    にそれから再構成され得る細胞中に移植される請求項２１の方法。
  24. 【請求項２４】 細胞が、胚性幹細胞、精子細胞、卵、受精卵および体細胞
    性再集団形成細胞から成る群から選択される請求項２３の方法。
  25. 【請求項２５】 選択構築物およびターゲッティング構築物が異なるパルボ
    ウイルスベクターゲノム上に存在する請求項２１の方法。
  26. 【請求項２６】 標的遺伝子座での遺伝子ターゲッティングが起きた細胞に
    対する濃縮方法であって、以下の： 細胞中に、以下の： ａ）修飾が導入されている以外は標的遺伝子座と実質的に同一であるＤＮＡ配
    列、および ｂ）選択可能マーカー を包含するターゲッティング構築物を包含する組換えパルボウイルスベクターゲ
    ノムを導入し、そして ターゲッティング構築物と標的遺伝子座との間で相同対合が起きて、標的遺伝
    子座に導入されている修飾を生じた細胞に関して濃縮するために選別条件下で細
    胞を増殖させる 工程を包含する方法。
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