JP2001521374A - Ｔ細胞活性化および増殖を阻害するＬＯ―ＣＤ２ａ抗体およびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 この発明はＬＯ−ＣＤ２ａ抗体に関し、またヒト患者にある免疫応答、とりわけ免疫応答がＴ細胞あるいはナチュラルキラー細胞の活性化および増殖により仲介される免疫応答を予防しかつ阻害する同じエピトープ（あるいはその部分）に結合するそのような抗体あるいは分子を使用する方法に関する。ＬＯ−ＣＤ２ａ抗体の有効量のヒト患者への投与は移植片拒絶、対宿主性移植片病あるいは自己免疫疾患を予防しあるいは阻害するであろう。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｔ細胞活性化および増殖を阻害するＬＯ−ＣＤ２ａ抗体およびその用途 この出願は１９９５年３月２９日受理された合衆国特許出願連続番号０８／４ ０７，００９号の継続出願であり、それは放棄されている１９９３年９月９日受 理された合衆国特許出願連続番号０８／１１９，０３２号の継続出願であり、そ れは現在放棄されている１９９３年３月５日受理された合衆国特許出願連続番号 ０８／０２７，００８号の継続出願である。 この発明は抗体（あるいは断片もしくはその誘導体）に関し、望ましくはヒト リンパ球に結合する抗体（あるいは断片もしくはその誘導体）に関する。より詳 細には、この発明はそのような抗体（あるいは断片もしくはその誘導体）の患者 への投与を通じて患者における進行中の免疫応答を予防しおよびもしくは阻害す ることに関する。望ましくは、この発明はそのような抗体あるいは断片もしくは その誘導体の患者への投与を通じてＴ細胞の活性化および増殖を予防しあるいは 阻害することに関する。 従来の技術は移植片拒絶を阻害するＣＤ２抗原に対する抗体の使用の可能性を 開示した。一般に従来の技術は移植片拒絶を阻害するのに多分有用であるものと してＣＤ２抗原に結合する抗体の使用を開示する。オルト・ファーマシューティ カル・ コーポレイション、合衆国特許番号４，３６４，９７３号、４，６１４，７２０ 号、４，５１５，８９３号、４，７４３，６８１号、および４，７９８，８０６ 号を参照されたい。 そのような抗体はヒト患者あるいは非ヒト霊長類における移植片拒絶を阻害す るのに有用であることは知られていなかった。下記の引用例、Ｊ．Ｖ．ギオルギ 、他、サル同種異系移植片受容体におけるＯＫＴＩＩＡモノクローナル抗体の免 疫抑制作用および免疫原性 、移植紀要、１５巻、１号、１９８３年３月、および Ｐ．サーロー、他、モノクローナル抗チンパンジーＴ細胞抗体、移植、３６巻、 ３号、２９３−２９８ページに例示されている通りである。図面の詳細な説明 図１ ビオチン化ＬＯ−ＣＤ２ａおよびＬｅｕ−５ｂＰＥを用いる末梢血単核細胞（ ＰＢＭＣ）の２色染色 この染色のために下記のパラメータが続いた。 図２ ヒトＰＢＭＣがＬＯ−ＣＤ２ａ−ＦＩＴＣで染色され、次い でａ）フィコエリスリン（ＰＥ）に接合されたＴ１１−ＰＥ（ＣＤ２に対するコ ールタ一抗体）、あるいはｂ）フィコエリスリン（ＰＥ）に接合されたＬｅｕ− ５Ｂ−ＰＥ（ＣＤ２に対するベクトン・ディキンソン抗体）で染色された。いず れの場合もＬＯ−ＣＤ２ａでの前処理により変更された二次抗体による染色はな かった。 図３ａおよび３ｂ 膜マーカーに対するＬＯ−ＣＤ２ａの作用。２×１０⁶細胞／ｍｌでのＰＢＭ ＣがＬＯ−ＣＤ２ａ（２００ｎｇ／ｍｌ）の不在下（実線）あるいは存在下（破 線）で培養された。図面で示された時間で、細胞は採取されサイトフルオロメー ター分析のために処理された。ａ）およびｂ）：ＰＢＭＣは抗ＣＤ３（Ｌｅｕ− ４ａ−ＦＩＴＣ）、抗ＣＤ４（Ｔ４＝ＲＤ）ｍＡｂｓ、抗クラスII抗原（ＬＯ− ＤＲａ−ＦＩＴＣ）あるいは抗ＣＤ８（Ｔ８−ＲＤ）モノクローナル抗体（ｍＡ ｂｓ）で標識された。商業用マウスｍＡｂｓの負の対照はＦＩＴＣあるいはロー ダミン標識マウスＩｇＧｓで染色された同一細胞のアリコートであった。ラット ｍＡｂｓの負の対照は標準ラット血清、続いてＦＩＴＣ標識マウス抗ラットｍＡ ｂ（ＭＡＲＫ−ＦＩＴＣ）により保温された細胞であった。結果は正の細胞の割 合として示される。 図４ ＬＯ−ＣＤ２ａの追加ありおよび追加なしでのＬＯ−ＣＤ２ａの膜マーカーお よびヒト血液リンパ球培養に対する作用。１×１０⁶細胞／ｍｌでのリンパ球培 養が、ａ）抗ＣＤ２（Ｌｅ ｕ−５ｂ−ＦＩＴＣ）、抗ＣＤ４（Ｔ₄−ＲＤＩ）ｍＡｂ、あるいは抗ＣＤ８（ Ｔ８−ＲＤ）ｍＡｂで指示された時点で標識された。商業用マウスｍＡｂの負の 対照はＦＩＴＣあるいはローダミン標識マウスＩｇＧｓで染色された同一細胞の アリコートであった。ラットｍＡｂｓの負の対照は標準ラット血清で、次いでＦ ＩＴＣ標識マウス抗ラットｍＡｂ（ＭＡＲＫ−ＦＩＴＣ）で保温された細胞であ った。結果は正細胞の割合として示される。 図５ａおよび５ｂ ＣＤ２発現に対するＬＯ−ＣＤ２ａおよびＬｅｕ−５ｂの作用。ヒトＰＢＭＣ が、ａ）ＬＯ−ＣＤ２ａ（２００ｎｇ／ｍｌ）あるいはｂ）Ｌｅｕ−５ｂ（ＰＢ Ｓに対して透析され、１：２に希釈されたもの）で指示された時点で保温され、 ａ）ＣＤ２（Ｌｅｕ−５ｂ−ＦＩＴＣおよびＴ１１−ＲＤ１）の発現、およびＬ Ｏ−ＣＤ２ａ（Ｍａｒｋ−３−ＦＩＴＣ）の結合、あるいはｂ）ＣＤ２（ＬＯ− ＣＤ２ａ−ＦＩＴＣ、Ｔ１１−ＲＤ１）およびＬｅｕ−５ｂヤギ抗マウス（ＧＡ Ｍ−ＦＩＴＣ）の発現のために染色された。 図６ ＭＬＲに対するＬＯ−ＣＤ２ａの作用。ａ）０地点で付加されたＬＯ−ＣＤ２ ａの増加する濃度の存在下で６日保温された混合リンパ球培養におけるＭＬＲの 阻害。培養は６日で採取された。ｂ）０時点で付加されたＬＯ−ＣＤ２ａの異な った濃度で保温された混合リンパ球培養におけるＭＬＲの阻害。培養は２４時間 間隔で採取された。ｃ）ＬＯ−ＣＤ２ａ（２００ｎｇ ／ｍｌ）の不在下（実線）あるいは存在下（破線）で混合リンパ球培養による³ Ｈ−チミジン（Ｈ−Ｔ）取り込み（ｃｐｍ）。ｄ）保温開始後異なった時点で付 加されたＬＯ−ＣＤ２ａ（２００ｎｇ／ｍｌ）によるＭＬＲの阻害。培養は６日 に採取された。すべての培養は最終量２００μｇ／ウエルで三つ組み（各供与体 ／ｍｌの１×１０⁶細胞）が作られた。培養採取の８時間前に³Ｈ−チミジンが加 えられた。ｃ）の結果は指示された時点で採取されたウエル当り取り込まれたｃ ｐｍＸ１０³として示される。ａ），ｂ）およびｄ）の結果は対照培養（ＬＯ− ＣＤ２ａなしのもの）と比較した三つ組み培養（平均値±標準偏差）のＭＬＲの 阻害割合として示される。 図７ ＭＬＣの間の芽細胞に対するＬＯ−ＣＤ２ａの作用。末梢血単核細胞がＬＯ− ＣＤ２ａの２００ｎｇ／ｍｌの付加もしくは付加なしでの混合リンパ球培養で培 養された。指示された時点で細胞は除去され、ＣＤ２（Ｌｅｕ５ｂ−ＦＩＴＣ） に対する抗体で染色された後フロー・サイトメトリーにより分析された。芽細胞 は前方および側面散乱でゲート化され、指示マーカーの発現は芽細胞で計量され た。 図８ａおよび８ｂ ＭＬＣの間の静止細胞に対するＬＯ−ＣＤ２ａの作用。ヒトリンパ球がＬＯ− ＣＤ２ａ（２００ｎｇ／ｍｌ）の付加ありあるいは付加なしで培養された。指示 された時点で細胞は除去され、ＣＤ３（Ｌｅｕ４ａ−ＦＩＴＣ）、ＣＤ４（Ｔ４ −ＲＤ１）、ＣＤ８（Ｔ８−ＲＤ１）あるいはＣＤ２５（ＬＯ−ＴＡ ＣＴ−１−ＦＩＴＣ）で染色された。静止リンパ球はサイズおよび粒度に対する 差動ゲート化により確認され、結果は指示された抗体での全静止リンパ球染色の 割合で示される（図８ａ）。ＬＯ−ＣＤ２ａありもしくは無しの培養でＬｅｕ− ５ｂにより正に染色された静止細胞の割合は図８ｂで示される。 図９ ミトゲン刺激リンパ球に対するＬＯ−ＣＤ２ａの作用。ＰＢＭＣがＯＫＴ３（ １００ｎｇ／ｍｌ）、Ｃｏｎ−Ａ（１０μｇ／ｍｌ）およびＰＨＡ（１μｇ／ｍ ｌ）の不在下あるいは存在下で９６時間培養された。対比培養において、ＬＯ− ＣＤ２ａ（２００ｎｇ／ｍｌ）がミトゲンの１時間後（グレー棒）あるいはミト ゲンの１時間前（白地棒）に加えられた。市松模様棒はＬＯ−ＣＤ２ａのみの存 在下で行われた培養を表す。（三つ組みの）培養は保温の終りの８時間に³Ｈチ ミジンでパルス標識された。 図１０ ＰＭＢＣのミトゲン駆動活性化に対するＬＯ−ＣＤ２ａの作用。２個の供与体 からのＰＭＢＣ_sがＯＫＴ３（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＣＯＮ−Ａ（１０μｇ／ｍ ｌ）およびＰＨＡ（１μｇ／ｍｌ）の存在下で９６時間培養された。対比培養に おいて、ＬＯ−ＣＤ２ａ（２００ｎｇ／ｍｌ）が培養開始０日（０時間）、１日 （２４時間）、あるいは２日（４８時間）で付加された。グラフは各供与体にお けるミトゲン誘導増殖のＬＯ−ＣＤ２ａによる阻害の割合を示す。 図１１ａおよび１１ｂ ＬＯ−ＣＤ２ａの存在下でエフェクターおよび標的細胞（⁵¹ＣＲ標識Ｋ５６２ 細胞）の保温によるＮＫ活性の阻害。ＬＯ−ＣＤ２ａの３種の濃度：５μｇ／ｍ ｌ，１μｇ／ｍｌ，０．５μｇ／ｍｌが試験された。ＮＫ活性の末梢血リンパ球 であったエフェクター細胞は標識標的細胞の溶菌パーセントで示される。２個の 標準被験材料が３種のＥ／Ｔ比率：２００／１，１００／１，５０／１で試験さ れた。 図１２ １０日間（０日−９日）にわたりＬＯ−ＣＤ２ａを２０ｍｇ／日受けたシノモ ルグスサル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）の末梢血のμｌ当り全リン パ球。 図１３ １０日間（０日−９日）にわたり２０ｍｇ／日でＬＯ−ＣＤ２ａを受けたシノ モルグスサルのＰＢＭＣがＣＤ２（Ｌｅｕ−５ｂ）、ＣＤ４（Ｌｅｕ３ａ）、Ｃ Ｄ８（Ｌｅｕ２ａ）、ナチュラルキラー細胞（ＣＤ８およびＣＤ１１ｂ）、およ びＢ細胞（抗−ＩｇＭ）に対するモノクローナル抗体で指示された日に染色され 、フローサイトメトリーにより分析された。結果は血液のマイクロリットル当り 染色細胞全数の割合で示される。 図１４ １０日間（０日−９日）にわたり２０ｍｇ／日でＬＯ−ＣＤ２ａを受けたシノ モルグスサルのＮＫ活性。ＮＫ活性は１１日および２２日で検定され、２５／１ 、５０／１および１００／１のＥ／Ｔでの溶菌％で示された。 図１５ １０日間（０日−９日）にわたり２０ｍｇ／日で抗体を受けたシノモルグスサ ルのＬＯ−ＣＤ２ａの血清濃度。モノクローナル抗体が本文に記載された通りエ リザにより測定されまたμｇ／ｍｌで表現された。 図１６ １０日間（０日−９日）にわたりＬＯ−ＣＤ２ａを２０ｍｇ／日受けたシノモ ルグスサルにおけるＬＯ−ＣＤ２ａに対するＩｇＧ抗体の推移。モノクローナル 抗体に対する抗体が本文に記載されたサンドイッチエリザにより指定された日に 引き出された血清の連続希釈で測定され、４９２ｎｍの光学濃度（不透明度）で 示される。 図１７ａおよび１７ｂ ヒヒリンパ球に対するＬＯ−ＣＤ２ａの作用。 ａ）指示された日に血液がヒヒから得られ、結合ＬＯ−ＣＤ２ａを検出するた めに、細胞が抗ＣＤ２抗体Ｔ１１−ＲＤ１およびＬｅｕ−５ｂ−ＦＩＴＣ、ＬＯ −ＣＤ２ａおよびＭＡＲＫ３−ＦＩＴＣ、ＦＩＴＣに結合されたマウス抗ラット カッパ１ｂ抗体で染色された。 ｂ）指示された日に採取された血清サンプルがエリザによりＬＯ−ＣＤ２ａの レベルを評価された。 図１８ａおよび１８ｂ ヒヒリンパ球に対するＬＯ−ＣＤ２ａの作用。 指示された日に血液が採取され、結合ＬＯ−ＣＤ２ａを検出するために細胞が ＭＡＲＫ３−ＦＩＴＣおよびＭＡＲＫ２ｂ− ８−ビオチン（ＰＥ−結合ストレプトアビジンで検出されるビオチンに接合され たマウスモノクローナル抗ラットＩｇＧ２ｂ抗体）で染色された。 ａ）細胞の前処理なし。 ｂ）循環抗体で占有されていないいずれかの部位を検出するために染色に先立 つＬＯ−ＣＤ２ａ、２．５μｇ／ｍｌでの保温。 図１９ ヒヒリンパ球に対するＬＯ−ＣＤ２ａの作用。 指示された日に血液サンプルが採取されＴ４−ＲＤ１（ＣＤ４）、Ｔ８−ＲＤ １（ＣＤ８）あるいはＭＡＲＫ３−ＦＩＴＣ（ＬＯ−ＣＤ２ａに結合）で染色さ れた。 図２０ 同種異系拒絶のためＡＴＧ次いでＬＯ−ＣＤ２ａで処置された患者＃１の白血 球、リンパ球およびクレアチニン。 図２１ 患者＃１における処置中および処置後のＬＯ−ＣＤ２ａの血清レベル。 図２２ ＬＯ−ＣＤ２ａの処置前、処置中および処置後の患者＃２におけるクレアチニ ン。 図２３ ＬＯ−ＣＤ２ａの処置前、処置中および処置後の患者＃２における白血球数お よびリンパ球数。 図２４ 各注射の直前および２．５時間後に取り出された患者＃２におけるＬＯ−ＣＤ ２ａの血清レベル。 図２５ 腎同種異系移植片拒絶に関しＬＯ−ＣＤ２ａを受けた患者＃３における白血球 数、リンパ球数および血清クレアチニンレベル。 図２６ ＬＯ−ＣＤ２ａおよび（２）Ｌｅｕ５ｂ、（３）Ｌｅｕ４（ＣＤ３）、（４） Ｌｅｕ３ａ（ＣＤ４）、（５）Ｌｅｕ２ｂ（ＣＤ８）および（６）Ｌｅｕ１１（ 抗ＣＤ１６）ＮＫ細胞のマーカーでの二重色染色。ＬＯ−ＣＤ２ａ結合はヤギ抗 ラットＩＧ−ＦＩＴＣで検出された。２色ヒストグラムの上部セット（１−６） は二重染色を示す。下部セット（７−１２）は各抗体での単一染色を示す。 図２７ ＬＯ−ＣＤ２ａに対するラットアイソタイプ対照（ファーミンゲン、精製ラッ トＩｇＧ２ｂ、カッパ）あるいはＣＤ４（ｃ，ｄ）、ＣＤ８（ｅ，ｆ）、ＣＤ１ ６（ｇ，ｈ）、ＣＤ１９（ｉ，ｊ）およびＣＤ２（ｋ，ｌ）に対するＬＯ−ＣＤ ２ａおよびフィコエリスリン接合抗体でのヒトＰＢＬの２色染色。ＬＯ−ＣＤ２ ａおよびアイソタイプ対照はＦＩＴＣ接合アフィニティー精製Ｆ（ａｂ’）２抗 ラット免疫グロブリン（サザン・バイオテクノロジー）で検出された。ＣＤ抗原 に対する抗体はすべてベクトン・ディキンソンから得たフィコエリスリン接合抗 体であった［ＣＤ４（Ｌｅｕ３ａ）、ＣＤ８（Ｌｅｕ２ ａ）、ＣＤ１６（Ｌｅｕ−１１ｂ）、ＣＤ１９（Ｌｅｕ１２）およびＣＤ２（Ｌ ｅｕＳｂ）］。それぞれの場合アイソタイプ対照での染色は第一ヒストグラムで またＬＯ−ＣＤ２ａは第二ヒストグラムで示される。ヒストグラムａはアイソタ イプ対照でのパターンをまたｂはＬＯ−ＣＤ２ａでのパターンを示す。 図２８ 野生型ＣＤ２で形質移入されたＣＯＳ細胞の染色の細胞蛍光間接撮影分析。左 側パネルはＣＤ２を含まない対照ベクターで形質移入されたＣＯＳ細胞の染色の ヒストグラム、右側のセットのパネルは完全ＣＤ２分子を含むベクターで一過性 形質移入されたＣＯＳ細胞のヒストグラムを示す。各セットにおいて、上部ヒス トグラムはネズミＷ６３２（ＣＯＳ細胞により発現されるものとして知られるク ラスＩに対する抗体）、および７６−２−１１（ネズミＷ６３２のためのアイソ タイプ対照）での染色を示す。中位パネルはＬｅｕ５ｂ（ベクトン・ディキンソ ンからの抗ＣＤ２）および７６−２−１１、Ｌｅｕ５ｂ染色のためのアイソタイ プ付合対照での染色を示し、下部パネルはＬＯ−ＣＤ２ａおよびＬＯ−ＣＤ２ａ のためのラットアイソタイプ付合対照での染色を示す。 図２９ キメラＬＯ−ＣＤ２ａＶ_L鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。 図３０ キメラＬＯ−ＣＤ２ａＶ_H鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸 配列。 図３１ ラットＬＯ−ＣＤ２ａ、ヒトＨＵＭ５４００およびヒト化ＬＯ−ＣＤ２ａの軽 鎖可変領域のアミノ酸配列。 図３２ ヒト化ＬＯ−ＣＤ２ａ可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。 図３３ ラットＬＯ−ＣＤ２ａ、ヒトＡｍｕ５−３、およびヒト化ＬＯ−ＣＤ２ａの重 鎖可変領域のアミノ酸配列。 図３４ ヒト化ＬＯ−ＣＤ２ａの重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。 図３５ ラットＬＯ−ＣＤ２ａ、ヒト化ＬＯ−ＣＤ２ａのジャーカット細胞への結合。 図３６ ラットＬＯ−ＣＤ２ａ、ヒト化ＬＯ−ＣＤ２ａ、および対照ラットならびにヒ ト免疫グロブリンによる試験管内低応答性の誘導。 図３７Ａ、３７Ｂ、および３７Ｃ ＬＯ−ＣＤ２ａによる一次ＭＬＲの阻害および一次ＭＬＲ内でのＬＯ−ＣＤ２ ａで培養されたＴ細胞の二次ＭＬＲ内での抗原あるいはＭＬＲ内での第三者刺激 体に対する応答。 図３８Ａおよび３８Ｂ 一次ＭＬＲ内でＬＯ−ＣＤ２ａで培養されたＴ細胞の二次ＭＬＲ内での抗原あ るいは二次培養内での破傷風トキソイドに対する応答。 図３９ ＭＬＲに対するＬＯ−ＣＤ２ａのＦ（ａｂ’）₂断片の作用。 図４０ 無傷ＬＯ−ＣＤ２ａ抗体とＬＯ−ＣＤ２ａのＦ（ａｂ’）₂断片の可溶ＯＫＴ ３によるＰＢＭＣの増殖に対する阻害性の比較。 図４１ ＬＯ−ＣＤ２ａの阻害性についてのＡＰＣ_sの平板結合ＯＫＴ３により誘導さ れる増殖に対する作用。詳細な説明 この発明の一つの見地に従って、ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１１４２３として寄託 された細胞系により生産されたモノクローナル抗体と同じのヒトリンパ球のエピ トープ（あるいはその部分）に結合する分子（望ましくはモノクローナル抗体あ るいはその断片）が提供される。その寄託細胞系で生産される抗体は以下時々Ｌ Ｏ−ＣＤ２ａとして引用される。「分子」あるいは「ＬＯ−ＣＤ２ａとして同じ エピトープに結合する抗体」という用語はＬＯ−ＣＤ２ａを含む。「ＬＯ−ＣＤ ２ａ」という用語は寄託細胞系ＡＴＣＣ ＨＢ１１４２３により生産される抗体 および例えば組換え技術により生産されるそれと同一のものを含む。 この発明の分子あるいは抗体はヒトＴ細胞の活性化および増殖を阻害し、また 出願人はＴ細胞の活性化を刺激する作用薬の前あるいは後のいずれかで分子ある いは抗体を加えた時にそのような阻害を達成できることを発見した。 この発明の分子あるいは抗体はＣＤ２抗原（ＣＤ２正ヒトＴ細胞）のエピトー プに結合する特徴を持つが、しかしＴ細胞の活性化あるいは増殖を阻害するため のそのような分子あるいは抗体の能力はＣＤ２正細胞への結合を通じてもたらさ れあるいはそうでない場合もあり、作用の機構がＣＤ２正細胞への分子あるいは 抗体の結合を伴うものと出願人は現在信じている。 この発明のも一つの見地に従って、以下でＬＯ−ＣＤ２ａ（あるいは断片もし くはその誘導体）として引用する抗体あるいはそのような抗体あるいは誘導体も しくはその断片を模倣するいずれかの分子をヒト患者に投与することを通じて、 ヒト患者における進行中の免疫応答を予防しおよびもしくは阻害する一つの方法 が提供される。 ＬＯ−ＣＤ２ａを生産する細胞系は１９９３年７月２８日、２０８５２メリー ランド、ロックビル、パークローン ドライブ１２３０１にあるアメリカン・タ イプ・カルチャー・コレクションに寄託され、ＡＴＣＣアクセス番号ＡＴＣＣ ＨＢ１１４２３が与えられた。この抗体はラットモノクローナル抗体である。 出願人はこの発明をいずれかの理論的類推に限定しようとするものではないが 、この発明のモノクローナル抗体をして免疫応答の発病度を予防しあるいは減少 させ、またＴ細胞の活性 化および増殖を阻害することを可能にする機構（メカニズム）は、ＬＯ−ＣＤ２ ａ抗体がＴ細胞表面で発現されるＣＤ２の密度を減少させ従ってＣＤ２−Ｔリン パ球の数を減少させ、およびもしくは顕著な形質導入に作用する事実であると考 えられる。これらの作用機構は免疫応答の予防だけでなく、進行中の免疫応答の 減少にも原因となるものと考えられる。加えて、ＬＯ−ＣＤ２ａ抗体はここで例 示されるように、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞試験管内活性を阻害する。これ はこの発明にとって適切である。というのはＮＫ細胞活性などのような非ＭＨＣ 制約細胞毒機構が対宿主性移植片病に影響してきたものと考えられるからである 。 この発明の一見地に従って、ＬＯ−ＣＤ２ａ抗体と同じヒトリンパ球に対する エピトープ（あるいはそのいずれかの部分）に結合する分子（望ましくは抗体） の有効量をヒト患者に投与することにより、患者にあるＴ細胞の当初あるいは更 なる活性化および増殖を阻害する一つの方法が提供される。望ましいＬＯ−ＣＤ ２ａの分子はキメラおよびもしくはそのヒト化形態のものである。このような分 子は、例えばＬＯ−ＣＤ２ａ抗体と同じ相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むであろ う。 この出願を通じてここで使用される「阻害する」という用語は、移植片拒絶の 発病度の予防、あるいは阻害、もしくは減少、あるいは耐性の誘導、もしくは逆 転を意味することを意図している。この出願の目的でここで使用される「移植」 という用語は必ずしもそれに限定されないが、同種異系移植および異種移植を含 むいずれかまたはすべての移植を意味するものとな る。このような移植は実施例によって必ずしもそれに限定されないが、細胞、骨 、骨髄、組織、固体器官、骨、等の移植を含む。 ここで使用される「免疫応答」という用語は、細胞作用およびＴ細胞依存型抗 体の両方を含むＴ細胞の活性化および増殖に依存する免疫応答を意味することを 意図するものであり、それは実施例で制限とするものではなくて（ｉ）移植片、 （ii）対宿主性移植片病、および（iii）実施例によって必ずしもそれに限定さ れないが、慢性関節リウマチ、全身性狼瘡、多発性硬化症、真性糖尿病、等の自 己免疫疾病に帰着する自己抗原への応答で引き出されるものである。 この発明で使用される分子は、ＬＯ−ＣＤ２ａモノクローナル抗体と同じエピ トープ（あるいはこのエピトープの一部）と結合するものである。「ＬＯ−ＣＤ ２ａモノクローナル抗体と同じエピトープと結合する」という用語は、ＬＯ−Ｃ Ｄ２ａモノクローナル抗体を説明するだけでなく、またＬＯ−ＣＤ２ａモノクロ ーナル抗体と同じそのようなエピトープと結合する他の抗体、断片あるいはその 誘導体もしくは分子を説明することを意図するものである。 そのような他の抗体は、実施例によってまたそれに限定されないがラット、ネ ズミ、ブタ、ウシ、ヒト、キメラ、ヒト化抗体、あるいは断片もしくはその誘導 体を含む。 ここで使用される「誘導体」という用語はキメラあるいはヒト化抗体、一本鎖 抗体、重特異的抗体あるいはＬＯ−ＣＤ２ａモノクローナル抗体により認識され るのと同じエピトープ（あ るいはその部分）と結合するような抗体を意味する。 ここで使用される「断片」という用語は抗体の部分を意味し、実施例により抗 体のそのような部分は必ずしもそれに限定されないが、ＣＤＲ、Ｆａｂ、あるい はＬＯ−ＣＤ２ａにより認識されるのと同じエピトープあるいはそのいずれかの 部分と結合するそのような他の部分を含む。 ここで使用される「抗体」という用語はポリクローナル、モノクローナル抗体 、同じく抗体断片、誘導体同じくキメラあるいはヒト化抗体など組換え技術によ り調製される抗体、モノクローナル抗体ＬＯ−ＣＤ２ａにより認識されるのと同 じエピトープあるいはその部分と結合する単鎖もしくは重特異的抗体を含む。「 分子」という用語は実施例により必ずしも限定されないが、ペプチド、オリゴヌ クレオチド、もしくは抗体を模倣しあるいは抗体断片もしくはその誘導体と同じ エピトープあるいはその部分と結合するいずれかの源から誘導される他のそのよ うな化合物を含む。 この発明のも一つの実施例は、ＬＯ−ＣＤ２ａ抗体、あるいは抗体もしくは誘 導体、あるいはその断片もしくはＬＯ−ＣＤ２ａ抗体と同じエピトープ（もしく はその部分）と結合する分子よりなるグループから選択される少くとも１個の部 材の有効量で移植片移植を受けるべきもしくは受けた患者を処置する一つの方法 を提供する。この処置は望ましくは全あるいは無傷ＬＯ−ＣＤ２ａ抗体で実行さ れる。 前に記載の通りこの発明のモノクローナル抗体は、ここで開示された技術と同 様にケーラーおよびミルシュタイン（ネイ チャー２５６巻、４９５−４９７ページ、１９７５年）に記載されたような従来 公知の技術により生産することができる。モノクローナルＬＯ−ＣＤ２ａ抗体の 調製はこの出願の実施例１により詳細に記載される。前に示されたように、ＬＯ −ＣＤ２ａ抗体はまた従来公知の手順を用いて組換え技術により生産することも できる。組換え抗体は更にキメラ抗体の形をとることもあり、ここでＬＯ−ＣＤ ２ａラット抗体の可変領域はも一つの種の抗体の定常部と組み合される。かくし て例えば、モノクローナル抗体は、ラットＬＯ−ＣＤ２ａモノクローナル抗体の ＣＤＲ領域をヒト抗体のＶ領域、フレームワーク領域および定常部と組合せてキ メラヒト−ラットモノクローナル抗体を提供することによりヒト化される。 一つの実施例において、抗体はヒト抗体の定常部、および軽鎖ならびに重鎖可 変領域のフレームワーク領域およびＣＤＲ領域から構築されるＬＯ−ＣＤ２ａ抗 体のヒト化形態であり、ここで軽鎖および重鎖可変領域のフレームワーク領域は ヒト抗体の軽鎖および重鎖可変領域のフレームワーク領域から誘導され、またＣ ＤＲ’ｓはラットＬＯ−ＣＤ２ａ．ＣＤＲ’ｓである。一つの実施例において、 軽鎖および重鎖可変領域のフレームワーク領域の１個もしくはそれ以上のアミノ 酸残基は、ラットＬＯ−ＣＤ２ａフレームワーク領域からのアミノ酸残基である 。このようなラットフレームワーク領域からの残基はヒト化抗体内に保持され、 何故ならこのような残基はＬＯ−ＣＤ２ａの結合特異性を維持するからである。 かくしてヒト化抗体を生産する際に、この発明の望ましい見地に従って、ヒト抗 体のＣ ＤＲ’ｓは、とりわけＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３からのＬＯ−ＣＤ２ａの軽鎖 可変部分のある種のアミノ酸およびとりわけＦＲ−２およびＦＲ−３からのＬＯ −ＣＤ２ａの重鎖可変部分のある種のアミノ酸がヒト化抗体を構築する際に保持 される付加因子を持つＬＯ−ＣＤ２ａのＣＤＲ’ｓで置換される。すなわちヒト フレームワークの対応するアミノ酸はラットＬＯ−ＣＤ２ａフレームワークから の際立ったアミノ酸で置換される。図３１に関連して注目されるように、ラット ＬＯ−ＣＤ２ａの軽鎖可変領域のフレームワークにあるアミノ酸９、１２、４１ 、４２、５０、５１および８２は保持され、また図３３で注目されるように、ラ ットＬＯ−ＣＤ２ａの重鎖可変領域のフレームワークにあるアミノ酸４７、６７ 、７０、７２、７６、８５および８７はヒト化抗体に保持される。このようなヒ ト化抗体の構築の特異的な実施例が下記の実施例７で与えられる。 も一つの実施例において、この発明はヒト定常部およびラットＬＯ−ＣＤ２ａ からの可変領域よりなるキメラ抗体に関し、またその用途に関する。 この発明の抗体あるいは分子は、望ましくは（ｉ）フローサイトメトリーで分 析されるリンパ球の２色染色により示されるように、すべてのＴリンパ球ならび にヌル細胞とは結合するがＢリンパ球とは結合しない（図２６および２７）；（ ii）（抗ＣＤ３抗体Ｌｅｕ４での染色で決定されるように）すべてのＴ細胞、Ｌ ｅｕ３ａおよびＬｅｕ２ｂ抗体それぞれで定義されるようにすべてのＣＤ４およ びＣＤ８正細胞、ならびにＣＤ₃負 （ヌル細胞）であるいくつかのリンパ球と結合する；（iv）ＮＫ細胞のマーカー であるＬｅｕ１１で検出されるＣＤ１６正細胞の染色により確証されるように、 ヌル細胞と結合する。（図２６）；抗ＣＤ１９結合により定義されるように、Ｂ 細胞の染色はＬＯ−ＣＤ２ａと一緒には見られなかった。（図２７）。ＬＯ−Ｃ Ｄ２ａ抗体は、また望ましくはその抗体がヒトヌル細胞と結合する特性を持ち、 更に二重染色によりＣＤ２＋およびＣＤ１６＋両方であるヒト細胞への染色より もＣＤ２＋およびＣＤ４＋両方であるヒト細胞への染色のより高い強度を持ち、 またＣＤ２＋およびＣＤ１６＋両方であるヒト細胞に対するよりもＣＤ２＋およ びＣＤ８＋であるヒト細胞の染色のより高い強度を持つ。 ＣＤ２と結合するＬＯ−ＣＤ２ａはＣＯＳ細胞でのＣＤ２を一過的に発現する ことにより確証された。 ＣＯＳ細胞はピーターソンＡ．およびシードＢ．、ネイチャー３２９巻、１９ ８７年１０月２９日、８４２−８４６ページで記載されるように、全ＣＤ２分子 をコード化する遺伝子を含むπＨ３ＭＣＤ２プラスミドで一過的に形質移入され た。 形質移入はＤＥＡＥ−デキストラン法で達成された。細胞は採取され、染色の 正の対照としてＭＨＣクラスＩへの抗体であるネズミＷ６３２および対応するア イソタイプ付合対照と共に、抗ＣＤ２モノクローナル抗体Ｌｅｕ５ｂ（ベクトン −ディキンソン）およびＬＯ−ＣＤ２ａで染色された。反応性の特異性は関係の ないプラスミドで形質移入されたＣＯＳ細胞に対す るモノクローナル抗体の同一パネルの結合を評価することで立証された。 一過的に発現された天然ＣＤ２に対するこれらモノクローナル抗体の染色パタ ーン（図２８）は、ＣＤ２での形質移入が両抗体の結合に導き、ＬＯ−ＣＤ２ａ がＣＤ２と結合する能力を支持したことを示している。 この発明の目的のために適切なＬＯ−ＣＤ２ａモノクローナル抗体の調製はこ こでの教示から従来の技術に熟練した人にとっては明らかであるに違いない。 前に記載した型の抗体あるいは断片もしくはその誘導体あるいは分子は、この 発明に従ってＴ細胞の活性化および増殖を阻害し、また細胞表面でのＣＤ２発現 の密度を減少させ、それによりＣＤ２−Ｔリンパ球の数を減少させるために生体 内で 投与することができる。 かくして例えば、生体内手順で、このようなＬＯ−ＣＤ２ａ抗体は免疫応答を 予防しおよびもしくは阻害し、これによりＴ細胞の活性化および増殖を阻害する ために投与される。 前に記載した型の抗体あるいは断片もしくはその誘導体あるいは分子は、この 発明に従って細胞表面でのＣＤ２^-発現の密度を減少させかくして供与体細胞の ＣＤ２^-細胞の数を減少させるために生体外で投与することができる。実施例に よりかつ制限することなしに、生体外手順において、このような抗体あるいは断 片もしくはその誘導体あるいは分子は、移植に際して対宿主性移植片病の発症を 予防するために、移植に先立ち供与体骨髄に注入されるであろう。 このような生体内あるいは生体外技術において、抗体あるいは断片もしくはそ の誘導体あるいは分子は薬理許容担体に投与されるであろう。このような担体の 代表的な例として標準食塩水、緩衝液等が言及される。このような薬理許容担体 は従来の技術で公知であり、また適切な担体の選択はここに含まれる教訓から従 来の技術に習熟した人の範囲内にあるものと見做される。 この発明のＬＯ−ＣＤ２ａ抗体あるいは他の分子は生体内静脈内あるいは筋肉 内投与により投与される。 前に示されたように、この発明のＬＯ−ＣＤ２ａ抗体あるいは他の分子は移植 片拒絶を阻害するのに有効な量で生体内投与される。この出願の目的のための「 有効な量」という用語は、望ましい効果、すなわち移植片拒絶の阻害あるいはＴ 細胞の活性化の阻害を生産することのできるモノクローナル抗体の量を意味する ものとする。一般に、このような抗休は少くとも１ｍｇの量で投与される。加え て最初の処置後に、前に記載された量は、もし存在するとすれば続く処置の間に 減少される。かくしてこの発明の範囲はそのような量では限定されない。 この実施例に従って、このような抗体はＴ細胞の活性化および移植片拒絶の阻 害を維持するために投与される。かくして実施例によりまたそれにより限定され ずに、抗体は１−２時間にわたり生理許容担体懸濁液で約１ｍｇ／用量から約５ ０ｍｇ／用量の量で１日１回乃至２回、必要とあれば約８日もしくはそれ以上の 期間にわたり静脈内注入により投与される。移植片拒絶のためのこのような処置 は、望ましくは移植開始時、あるい は移植直前、もしくは移植直後、あるいは移植片拒絶が起こる時である。処置は 移植片に選択的に低応答状態を導入するために、移植の時点で開始された時１日 あるいは２日ほどの少ない期間に、１日１回乃至２回与えることができた。この 発明に従って、抗体あるいは断片もしくはその誘導体あるいは分子の投与と関連 する自己免疫疾病に対するこのような処置は、手当てをする医師が病理免疫応答 を阻害することが望ましいと決定した時に開始される。 かくしてこの発明の一つの見地に従って、移植の時点および殆どの場合その後 の短い期間この発明に基づく抗体を投与することにより、移植組織あるいは器官 に低応答性を導入することができ、これにより更なる拒絶の繰返される症状の出 現を予防しあるいは阻害する。 Ｔ細胞の活性化を阻害するためのこの発明の技術は、単独で、あるいはＴ細胞 の活性化を阻害しもしくは移植片拒絶あるいは対宿主性移植片病を阻害するため の他の技術、薬剤あるいは化合物と併用して用いることができる。 この発明は下記の実施例と関連して更に記述されるが、それらは実証的ではあ るがこの発明の範囲を限定することを意図するものではない。 実施例で用いられる細胞、培養、ｍＡｂｓおよびミトゲンは従来の普通の技術 を持つ者に公知でありかつ実施される方法および手順により調製され使用される 。下記のものはそれに続く実施例で使用される細胞、培養、ｍＡｂｓおよびミト ゲンの調製および用途で使用される。細胞および培養 ＰＢＭＣが地方の血液供与センターから得られたヘパリン化血液のフィコール −ハイパーク（スエーデン、ファルマチア）沈降法により得られた。分離された ＰＢＭＣは富化培地：ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μ ｇ／ｍｌ、Ｌ−グルタミン２０ｍＭ、および２０％貯留ヒトＡＢ血清あるいは１ ５％熱不活性化胎仔ウシ血清で補充されたＲＰＭ１１６４０培地（ベルギー、ジ ブコ）で再懸濁された。ＰＢＭＣは最終量２００μｌの培養培地／ウエルになる ように９６Ｕ−ウエル・マイクロ平板（ファルコン）で１×１０⁵細胞／ウエル で培養された。二方向ＭＬＣが前に記した通り培養培地の同一量で各供与体／ウ エルで１×１０⁵細胞を用いて達成された。すべての培養は三つ組みで作られた 。結果で示された時点の８時間前に培養は３_H−Ｔ（ベルギー、エイマシャム； ２４７．９ ＧＢｑ／ｍｍｏｌ；６．７Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の２．０μＣｉ／ウエ ルでパルス標識され、培養に組み込まれた放射性同位元素がベータカウンター（ ベックマンＬ５ ６０００ＳＥ）の液体シンチレーションにより計量された。阻 害の割合は以下のように計算された：阻害％＝［１−（試験培養の平均ｃｐｍ／ 対照培養の平均ｃｐｍ）］×１００。すべての結果は３個の個別培養の平均値で 表される。標準偏差はそれらの値がグラフで示されたものを除き常に平均値の１ ５％以下であった。 サイトフルオロメトリー分析がコンソート３０プログラムを備えたヒューレッ ト・パッカードハードウェアでファクスキャ ン・サイトフルオログラフ（ベクトン・ディキンソン）を用いて行われた。リン パ球および芽細胞の染色についての個別の分析は、サイズおよび粒度で定義され る差動ゲーティングを使用して可能となった。２５，０００事象が各サンプルで 分析された。これらの実験において、ＬＯ−ＣＤ２ａ最終濃度は指示された場合 を除き２００ｎｇ／ｍｌであった。Ｍａｂｓおよびミトゲン ＬＯ−ＤＲＡおよびＬＯ−Ｔａｃｔ−１（いずれもＦＩＴＣ標識されたもの） は我々の研究室で生産されたラットｍＡｂｓである（公開引用例、Ｈ．バザン（ 編集）１９９０年、２８７ページ）。ＬＯ−Ｔａｃｔ−１はＩＬ−２受容体のｐ ５５鎖に対し指向される（公開引用例、Ｈ．バザン、免疫学、１９８４年、およ びジャンセン、Ｍ．、バック、Ｄ．およびメイノー、Ｖ．Ｃ．、白血球型別IV、 白血球分化抗原、Ｗ．ナップ（編）、オクスフォード・ユニバーシティ・プレス 、１９８９年、４０３ページ）。マウス抗ヒト−ＣＤ２および抗ＣＤ３ｍＡｂｓ （Ｌｅｕ−５ｂおよびＬｅｕ−４ａ−ＦＩＴＣ標識）はベクトン・ディキンソン （ベルギー）から得られた。マウス抗ヒトＣＤ４あるいは抗ヒトＣＤ８ｍＡｂｓ （フィコエリスリン標識）およびマウスＩｇＧ ＦＩＴＣ−あるいはフィコエリ スリン標識（負の対照）はコールターから得られた。ＯＫＴ３（オルト−シラー グ、ベルギー）が最終濃度１００ｎｇ／ｍｌで使用された。フィトヘムアグルチ ニンＡ（植物性赤血球凝集素）（ＰＨＡ：ウエルカム・ラブス、英国）およびコ ンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ；カルバイオケム・カンパニー、アメリカ合 衆国）はそれぞれ最終濃度１および１０μｇ／ｍｌで使用された。 ＬＯ−ＣＤ２ａのビオチン化。精製ＬＯ−ＣＤ２ａの濃度は０．１Ｍの重炭酸 ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．４で１ｍｇ／ｍｌに調節された。ＮＨＳ−ビオチン （ベーリンガー・マンハイム１００８ ９６０）が１．５ｍｇ／ｍｌの濃度でＤ ＭＳＯに溶解された。各ＭＡＢに対し、０．１ｍｌのＮＨＳビオチン溶液が付加 された。混合物は２時間周囲温度で回転された。反応は抗体各ｍｌに対して２Ｍ トリスー塩酸、ｐＨ８．０の０．１ｍｌを加え（周囲温度で１０分）、次いで抗 体各ｍｌに対し食塩加リン酸緩衝液（ＰＢＳ）内でのＢＳＡＩ％の１ｍｌを加え ることで完成された。遊離ビオチンを除去するために、この溶液は一晩４℃で１ ０００容積のＰＢＳで透析された。ビオチン化反応および接合ｍＡｂの両方はア ルミホイルで包んで光から隠された。 赤血球（ＲＢＣ）の溶解。ＲＢＣは塩化アンモニウムを用いる溶解で全血液か ら除去された。１０Ｘの株溶液がＮＨ₄Ｃ１、９０ｇ、ＫＨＣＯ₃、１０ｇ、ＥＤ ＴＡ３７０ｍｇ、および１００ｍｌｓの量になる水よりなるよう調製された。１ Ｘ塩化アンモニウム４０ｍｌｓが血液各１０ｍｌｓに付加され、１０分室温で保 温された。混合物は次いで１２００ｒｐｍで１０分遠心分離され、またペレット はアジ化物０．１％で１０ｍｌのＰＢＳに再懸濁された。末梢血の染色 染色は底部の丸い９６ウエル・クラスター平板（コスター＃ ３７９０）で４℃で行われた。単一色染色のために、１０μｌのｍＡｂが０．２ ｍｇのヒト免疫グロブリンを含むＰＢＳに適切に希釈され、各ウエルに付加され た。赤血球除去血液はウエル当り９０μｌの量で平板に分配された。細胞および ｍＡｂはゆるやかなたたきで混合され３０分保温された。５０μｌの冷却ＰＢＳ が各ウエルに加えられ、平板は１９００ｒｐｍで２分遠心分離された。上澄みは 転置および平板のゆるやかなたたきにより除去された。細胞は平板をカウンター でたたくことで分散された。洗浄手順は冷却ＰＢＳ２００μｌの付加により２回 繰返された。ヤギＦ（ａｂ’）₂抗ラット１ｇ−ＦＩＴＣの１／２０希釈物１０ μｌが各ウエルの分散細胞に加えられ、暗がりで３０分保温された。細胞は冷却 ＰＢＳ１８０μｌの各ウエルへの付加で洗浄され、次いで１９００ｒｐｍで２分 遠心分離された。上澄みは除去され、細胞は分散され、また２００μｌの冷却パ ラホルムアルデヒドが各ウエルに加えられた。細胞は管（ファルコン＃２０５４ ）に移され、０．５％パラホルムアルデヒドで約０．５ｍｌｓに希釈された。サ ンプルはリシスIIソフトウエアを用いてベクトン−ディキンソン・ファクスキャ ン機で評価された。 二重色染色が類似の実験記録により行われた。細胞は一次ｍＡｂおよびＦＩＴ Ｃ−接合抗ラット試薬で保温され、１／５希釈の標準マウス血清が抗ラット試薬 のいずれかの残存部位を遮断するために加えられた。１５分の保温（洗浄なし） に続き、既知のＣＤ決定因子に特異的な２０μｌのＰＥ−標識ｍＡｂが加えられ 、３０分保温された。細胞は洗浄され単一染色で記載 されたように固定された。 実施例１ ＬＯ−ＣＤ２ａは文献のいずれかで示された通り、我々の研究室で生産され特 徴付けられたラット（ＩｇＧ２ｂ−カッパ）抗ＣＤ２モノクローナル抗体である （下記の引用例を参照されたい：シーア、Ｈ．、ラベット、Ａ．Ｍ．、ラタンヌ 、Ｄ．、ニナンヌ、Ｊ．、ド・ブリュイエール、Ｍ．、ソ一カル、Ｇ．およびバ ザン、Ｈ．、−Ｈ．バザン（編）、ラット・ハイブリドーマおよびラットモノク ローナル抗体 、ＣＲＣプレス、，インコーポレイテッド、ボカ・レイトン、フロ リダ、１９９０年、３０９ページ、およびラベット、Ａ．Ｍ．、ラタンヌ、Ｄ． 、セガーズ、Ｊ．、マヌーブリーズ、Ｐ．、ニナンヌ、Ｊ．、ド・ブリュイエー ル、Ｍ．、バザン、Ｈ．、およびソーカル、Ｇ．、−Ｈ．バザン（編）、ラット ・ハイブリドーマおよびラットモノクローナル抗体 、ＣＲＣプレス，インコーポ レイテッド、ボカ・レイトン、フロリダ、１９９０年、２８７ページ）。ＬＯ− ＣＤ２ａは生産されるハイブリドーマを受け入れるラットの免疫グロブリンと、 後者により分泌されるｍＡｂとの間に存在するアロタイプ差異の利点を利用する 免疫アフィニティークロマトグラフィーにより腹水から精製された（バザン、Ｈ ．、コーモント、Ｆ．およびデクラーク、Ｌ．、免疫学方法諭ジャーナル、１９ ８４年、７１巻：９ページ）。これはマウスｍＡｂ Ｌｅｕ−５ｂ（ＦＩＴＣ標 識）により染色された全集団、図１およびマウスＴ１１（ローダミン標識） ｍＡｂにより標識された集団の約９０％を標識する（データは示されていない） 。ＣＤ２分子上のＬＯ−ＣＤ２ａにより認識されたエピトープは抗ＣＤ２マウス ｍＡｂｓ Ｌｅｕ−５ｂおよびＴ１１で認識されたエピトープとは異なる（図２ ）。 実施例２ ＬＯ−ＣＤ２ａはＰＢＭＣに対し調節作用は示すがミトゲン作用は示さない 休止リンパ球に対するラットｍＡｂ ＬＯ−ＣＤ２ａの作用を決定するために 、ＰＢＭＣがこのｍＡｂの増加する濃度での存在下で保温された。付表１で見ら れるように、ＬＯ−ＣＤ２ａの存在下で６日間保温されたＰＢＭＣは、対照培養 に比べて³Ｈ−Ｔとり込みの割合に著しい変化を示していない。この期間の終り での細胞の生存度は変化したが、トリパンブル−除外により評価されるように平 均約８０％であった。休止ＰＢＭＣがＬＯ−ＣＤ２ａの存在下で保温された時、 フローサイトメトリーで評価されるように、いくつかの膜マーカーの表現型発現 には著しい変化がなかった。休止成熟Ｔ細胞の細胞マーカー（例えばＣＤ３、Ｃ Ｄ４およびＣＤ８など）は６日間の培養でＬＯ−ＣＤ２ａの存在下あるいは不在 下で同一の変化のパターンを示し、またＣＤ２５（ＩＬ−２Ｒ／ｐ５５）などの 活性化分子はこれらの実験条件では発現されず、あるいはＤＲ抗原決定因子の場 合にあるようにＬＯ−ＣＤ２ａにより修飾されない（図３）。 ＰＢＭＣが６日間ＬＯ−ＣＤ２ａの存在下で保温された時、 Ｌｅｕ−５ｂ＋ゲート化リンパ球の割合の著しい減少が観察された（図４）。Ｃ Ｄ４−およびＣＤ８−リンパ球の割合は培養６日間にＬＯ−ＣＤ２ａの存在によ り影響されず、それはＣＤ２保持リンパ球の観察された減少がこれら細胞の排除 に帰因することはできず、かえってＣＤ２分子の消失あるいはＬＯ−ＣＤ２ａの 結合により生産されたこの糖タンパク質における立体配座変化によるものである ことを示している。 Ｌｅｕ−５ｂ−リンパ球での観察された減少が、ＬＯ−ＣＤ２ａの結合後のＣ Ｄ２の立体配座変化あるいはこの分子の消失（内在化あるいは放出）によるもの であったかどうかを確証するために、ＰＢＭＣがＬＯ−ＣＤ２ａの５００ｎｇ／ ｍｌの存在下で培養され、Ｌｅｕ−５ｂ（ＦＩＴＣ標識）、Ｔ１１−ＲＤ１（ロ ーダミン標識）およびＭＡＲＫ−３（ＦＩＴＣ標識）を用いて６日間にわたりフ ローサイトメトリーで分析された。図５ａで示されるように、Ｌｅｕ−５ｂある いはＴ１１ｍＡｂｓはＬＯ−ＣＤ２ａの存在下で２乃至４日の培養後ＰＢＭＣに 結合できない。これらの条件の下で、マウス抗ラットカッパ鎖ｍＡｂ ＭＡＲＫ −３は培養の６日目に細胞の５０％を標識し、それはもとのＣＤ２保持細胞の僅 か３５％がその表面にＬＯ−ＣＤ２ａを全然示さず、しかしＬｅｕ−５ｂ−ＦＩ ＴＣおよびＴ１１−ＲＤ１染色が２日目に著しく減少したことを指示している。 これは結合に利用できないＬｅｕ５ＢおよびＴ１１のエピトープを供給するＣＤ ２の立体配座変化がＬＯ−ＣＤ２ａに応答して起こることを示唆する。 ＣＤ２＋細胞の平均蛍光の分析は、このマーカーの発現密度 がＬＯ−ＣＤ２ａの存在下で時間と共に減少したことを示した。同じような現象 が、Ｌｅｕ−５ｂ ＦＩＴＣ標識あるいは（ＭＡＲＫ−１ ＦＩＴＣ標識で明ら かにされた）ＬＯ−ＣＤ２ａのいずれかがＣＤ２＋リンパ球を検出するため使用 されたかどうかを観察された。同−ＰＢＭＣのアリコートがＬｅｕ−５ｂ（培養 培地で最終濃度１：２でＰＢＳに対し透析された商業的に利用できるｍＡｂ）の 存在下で培養された。図５ｂで示されるように、これらの実験条件下で、すべて のＣＤ２の保持細胞は（ヤギ抗マウス−ＦＩＴＣで明らかにされるように）Ｌｅ ｕ−５ｂ ｍＡｂにより被覆される。Ｔ１１−ＲＤ１による染色は著しく減少し 、一方より小さくよりゆっくりとした減少がＬＯ−ＣＤ２ａ−ＦＩＴＣ ｍＡｂ により認識されたエピトープを提出する細胞の割合で観察された。これらの結果 をまとめると、ＣＤ２分子はＬＯ−ＣＤ２ａに応答してその立体配座を部分的に 変化させ、またＣＤ２／ＬＯ−ＣＤ２ａのゆるやかな調節が起こるということを 示している。ＬＯ−ＣＤ２ａはＭＬＲを阻害する ラットｍＡｂの増加する濃度の存在下で、ＭＬＣが（６日以上の期間）行われ た時（３Ｈ−チミジン（³Ｈ−Ｔ）とり込みにより測定されるように）、ＭＬＲ の著しい阻害が１２５ｎｇ／ｍｌほどの低いｍＡｂの濃度で観察された。図６ａ において、我々はＬＯ−ＣＤ２ａによるＭＬＲ阻害の用量−応答曲線の典型的な 例を示す。この図６ａで見ることができるように、ＬＯ−ＣＤ２ａは２５０ｎｇ ／ｍｌで（培養６日の）ＭＬＲの８０％の阻害を誘導し、この阻害の割合は広い 範囲の濃度 （０．２５乃至５．０μｇ／ｍｌのｍＡｂ）にわたり殆ど一定もしくは８０％以 上に留まる。図６ｂは培養０日から６日までのＭＬＲに対するＬＯ−ＣＤ２ａの 異なった濃度の阻害作用の時間経過を示す。（ＬＯ−ＣＤ２ａの存在下あるいは 不在下で）、ＭＬＣに対する³Ｈ−Ｔとり込みの典型的な例が図６ｃで示され、 ここでＬＯ−ＣＤ２ａは２００ｎｇ／ｍｌの最終濃度で加えられた。 図６ｄでは、（２００ｎｇ／ｍｌでの）このｍＡｂがＭＬＣの開始後異なった 時間で加えられる時のＭＬＲに対するＬＯ−ＣＤ２ａの作用が示される。（³Ｈ −Ｔとり込みで測定されるように）、ＭＬＲの９０％以上の阻害が、このｍＡｂ が０日で加えられた時に得られ、またこの阻害作用は、ＭＬＣの開始４日後にＬ Ｏ−ＣＤ２ａが加えられる時に（この実施例では４５％の）阻害作用がまだ存在 する。（示されてはいないが）同様の結果がＬＯ−ＣＤ２ａの（０．２０乃至５ ．０μｇ／ｍｌの）より高い濃度で得られた。 ＬＯ−ＣＤ２ａはＩＬ−２Ｒ発現の経路を遮断する 細胞蛍光写真撮影分析がＭＬＣのリンパ芽球サブセットについて行われた時（ 図７ａおよび７ｂ）、下記の観察が行われた：ａ）ＭＬＣの開始時に既に存在し た芽細胞の数（分析された２５，０００事象の約３００−５００芽細胞）が対照 培養内で４日から６日までに急激に上昇した（分析された２５，０００事象から １２００芽細胞以上）；ｂ）ＬＯ−ＣＤ２ａの存在下で行われたＭＬＣで、培養 全期間中芽細胞の数に著しい変化はなく、また６日目では芽細胞数は０日での最 初の芽細胞数より 絶えず低いかあるいは殆ど同じ位である（図７ａ）；ｃ）ＣＤ２５芽細胞の割合 はＬＯ−ＣＤ２ａなしで保温された細胞の中で急激に上昇した（図７ｂ）；ｄ） この割合はｍＡｂの存在下で保温されたＭＬＣからの小数の芽細胞の中で２０％ 以下に留まり（図７ｂ）、また平均蛍光（ＣＤ２５発現の尺度としてのもの）は 対照培養で存在する芽細胞と比較して７５％減少した（結果は示されていない） ；ｅ）ｍＡｂの不在下では、ＣＤ３−芽細胞の割合は培養の最初の４日間は一定 に留まり（図７ｂ）、また６日目にはＣＤ３細胞の割合は９０％に増加し、一方 ＬＯ−ＣＤ２ａの存在下ではＣ３−の割合はゆっくりと上昇し６日目でようやく 約４５％に達した。これらの結果は、ＬＯ−ＣＤ２ａの存在がＩＬ−２受容体（ ＣＤ２５）の発現により特徴付けられる活性化の経路でこれらの細胞の入場を阻 害することを示している。ＣＤ２＋芽細胞の数はＬＯ−ＣＤ２ａの存在下では一 定に留まるかもしくは減少し、またこの膜マーカーの発現密度はこれらの条件の 下では強く減少する（データは示されていない）。 表現型分析がＭＬＣの休止（非芽細胞）リンパ球サブセットに関し６日を通じ て行われた時、図３で示されたものに類似の結果が得られた：ＬＯ−ＣＤ２ａの 存在下では、対照培養と比較してＣＤ３＋、ＣＤ４＋あるいはＣＤ８＋リンパ球 の割合には何ら著しい変化が検出できなかった；培養の６日間でＬＯ−ＣＤ２ａ の存在下あるいは不在下に拘らずＣＤ２５発現（活性化マーカー）は検出できな かった（図８ａ）。これらの結果は、ＬＯ−ＣＤ２ａがもしあるとしてもＭＬＣ でＴリンパ球の 休止サブセットに非常に弱い作用しか持たないことを示唆している；すなわちＴ 細胞が活性化の過程で拘束されない。同時に、図８ｂで示されるように、ＬＯ− ＣＤ２ａはＭＬＣの間ＣＤ２＋リンパ球の割合の著しい減少を誘導する。これら の結果は、非刺激培養（図５）およびＭＬＣの両方において、ＬＯ−ＣＤ２ａの 作用はＣＤ２の発現を減少させ、およびもしくはその構造に立体配座変化を誘導 することである。 ＬＯ−ＣＤ２ａは、ＴｃＲ／ＣＤ３複合体あるいはミトゲン受容体に依存する Ｔ細胞活性化の経路を遮断することができる。 ＬＯ−ＣＤ２ａがミトゲン活性化ＰＢＭＣに付加された時、³Ｈ−Ｔとり込み の著しい阻害が観察された。培養の開始０時間あるいは１時間後のいずれかで加 えられるＬＯ−ＣＤ２ａの存在下あるいは不在下で、ミトゲン（ＯＫＴ３、Ｃｏ ｎＡおよびＰＨＡ）で保温されたＰＢＭＣの３個の実験の一つであった。第一の 場合、ミトゲンは１時間後に加えられた。ＬＯ−ＣＤ２ａが培養の開始１時間後 に加えられた時、ミトゲンは０時間で加えられた。これはミトゲンあるいはＬＯ −ＣＤ２ａでのＰＢＭＣの前保温が、二次試薬の追加で影響され得る事象を誘発 できたかどうかを知るために行われた。培養は³Ｈ−Ｔでパルス標識（６時間） の後、９６時間で収集された。³Ｈ−Ｔとり込みの５０％以上の阻害がそれが第 一にあるいはミトゲンの後で加えられるかどうか、ＬＯ−ＣＤ２ａの存在下で観 察された（図９）。細胞がＭＬＣの開始４日後に収集されミトゲンに露出された 時同じ作用が観察された（データは示されていな い）。ミトゲンのみを受け入れる同じ培養と比較して、ミトゲンおよびＬＯ−Ｃ Ｄ２ａ両方を受け入れた培養において、³Ｈ−Ｔとり込みの劇的な減少がＭＬＣ の開始２日後に観察された（結果は示されていない）。ミトゲン追加前のＬＯ− ＣＤ２ａでのＭＬＣの前保温は、ＯＫＴ３なしでのＭＬＣでの比較できる値に³ Ｈ−Ｔ−とり込みを下げた。 ＬＯ−ＣＤ２ａはまた、ミトゲン誘導増殖の開始１日後に加えられたならば、 ミトゲン誘導増殖を阻害することができた。２個の供与体で行われた実験の結果 が図１０で示される。ＰＢＭＣはミトゲン（ＯＫＴ３、ＣｏｎＡおよびＰＨＡ） と共に保温された。これらの実験で、ＬＯ−ＣＤ２ａは培養開始前時間０（０日 ）、２４時間（１日）あるいは４８時間（２日）の時点で加えられた。ＬＯ−Ｃ Ｄ２ａによるＯＫＴ３およびＣｏｎＡに応答する増殖の阻害は、０時点でミトゲ ンの追加２４時間後に加えられたならば著しいものがあった。 実施例３ ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）活性の阻害 ＰＢＭＣはフィコール・ハイパーク沈降法によりヘパリン化血液から分離され た。洗浄の後、富化培地に懸濁されたエフェクター細胞は（付着により）単核細 胞を除去するために、ファルコン平板に１×１０⁶／ｍｌの濃度で一晩保温され た。 標的細胞（Ｋ５６２細胞系）は⁵¹クロム⁵¹Ｃｒ（３×１０⁶／ｍｌでの細胞懸 濁液の０．９ｍｌ＋５ｍＣｉ／ｍｌ⁵¹Ｃｒの溶液からの０．０２ｍｌ、エイマシ ャム）で一晩保温すること により標識された。 １６時間保温の後、エフェクター細胞および標的細胞は４回洗浄され、計数さ れ、異なったＥ／Ｔ比（エフェクター細胞／標的細胞比）：２００／１（４×１ ０⁶／ｍｌエフェクター細胞の懸濁液１００ｕｌに２×１０⁴／ｍｌ標的細胞１０ ０ｕｌ）、１００／１、５０／１および２５／１で９６Ｖ底マイクロ平板で保温 された。 ４時間保温の後、⁵¹Ｃｒの放出はガンマカウンターで各ウエルからの上澄み１ ００μｌを計数することで測定された。 最大（標的細胞＋ＨＣＬＩＮ）および自発放出（標的細胞＋富化培地）が比溶 菌を計算するために使用された： ２個の標準供与体でのＮＫ検定での５ｕｇ／ｍｌ、１ｕｇ／ｍｌ、および０． ５ｕｇ／ｍｌでのＬＯ−ＣＤ２ａの細胞含有物（図１０ａおよび１０ｂ）が抗体 のすべての試験された濃度およびすべての試験されたＥ／Ｔ比率にわたり約５０ ％の細胞毒性の阻害に導いた。これは用量であるいは０．２５ｕｇ／ｍｌ以上で のＭＬＲでの増殖の基本的に完全な阻害と比較したものである。 実施例４ 非ヒト霊長類での生体内研究材料と方法 モノクローナル抗体 ＭＡＲＫ３−ＦＩＴＣはＦＩＴＣで接合されたラットＩカッパ１ｂアロタイプ に対して指向されたマウスｍＡｂである。ＭＡＲＧ２ｂ＝ビオチンはビオチンで 接合されたマウス抗ラットＩｇＧ２ｂ免疫グロブリンｍＡｂである。これら２個 のｍＡｂｓが我々の研究室で生産され標識された。免疫蛍光試験のために、これ らのｍＡｂｓは２．５μｇ／ｍｌの最終濃度で使用された。Ｌｅｕ−５ｂ−ＦＩ ＴＣ（ベクトン−ディキンソン）およびＴ１１ローダミン（コールター）は２個 のマウス抗ヒトＣＤ２ｍＡｂｓである。Ｔ４−およびＴ８−ローダミン標識（コ ールター）はそれぞれマウス抗ヒトＣＤ４およびＣＤ８ｍＡｂｓである。 表現型分析 抗ヒトＴ細胞ｍＡｂｓ（抗−ＣＤ２、−ＣＤ４、−ＣＤ８、前記参照）が全血 の１００μｌサンプルに加えられ、４℃で４５分保温された。赤血球はトリス緩 衝塩化アンモニウム溶解緩衝液（塩化アンモニウム１４４ｍＭ／トリス１７ｍＭ 、ｐＨ７．２）で溶解され、リンパ球はＰＢＳ／ＦＣＳ２％／ＮａＮ３、０．２ ％で洗浄された。非標識ｍＡｂｓの検出のために、第二ｍＡｂ（ＦＩＴＣ−ある いはビオチン−接合体）が２．５μｇ／ｍｌの最終濃度に加えられた。４℃で４ ５分保温の後、細胞はＰＢＳ／ＦＣＳ／ＮａＮ３で洗浄された。ビオチン化ｍＡ ｂｓのために、ストレプトアビジン−フィコエリスリン接合体での保温（１５分 ）が行われた。標識ヒトあるいはサルリンパ球が２％ホルマリン溶液に再懸濁さ れ、サイズ対粒度の関数としてリンパ球をゲート化するための溶解IIプログラム を備え たファクソン・サイトフルオロメーター（ベクトン・ディキンソン）で分析され た。非特異的染色のための対照として、細胞のアリコートがＦＩＴＣ−あるいは フィコエリスリン接合マウスＩｇｓ（コールター）で保温された。 循環Ａｂｓのレベル 血清のＬＯ−ＣＤ２ａが、マウス抗ラット１ｇＧ２ｂ ｍＡｂ（我々の研究所 で生産されたＭＡＲＧ２ｂ−８）を第一層（被覆物）としまた検出のためにホー スラディッシュペルオキシダーゼに結合されたマウス抗ラットカッパ鎖（ＭＡＲ Ｋ−３）ｍＡｂを用いてエリザで定量された。要約すると、マイクロタイタ平板 （ファルコン）がＭＡＲＧ２ｂ−８（５μｇ／ｍｌ）の１００μＬ／ウエルで一 晩保温され、プラスチックの未占有部位が粉ミルク（ウシ）５％を含むＰＢＳで 飽和された。室温で１時間保温の後、平板はトウィーン−２０、０．１％を持つ ＰＢＳで洗浄され、また希釈サルあるいはヒト血清の１００μｌ／ウエルで保温 された。未結合材料を洗い出した後、平板は１時間１００μｌ／ウエルのＭＡＲ Ｋ３−ペルオキシダーゼ（ＰＢＳ内で２μｇ／ｍｌ）で保温された。再度洗浄の 後、平板は過酸化水素０．０３％を含むクエン酸塩−リン酸塩緩衝液でＯＰＤ（ Ｏ−フェニレンジアミン−ジヒドロクロライド、０．４ｍｇ／ｍｌ、シグマ・ケ ミカルズ）で保温された。染色反応産物は４９２ｎｍで検出された。標準曲線は 対照サルあるいはヒト血清のプールで連続希釈された精製ＬＯ−ＣＤ２ａの既知 の濃度と対比して作られた。 サルあるいはヒト抗ＬＯ−ＣＤ２ａ抗体の検出は、ＬＯ−Ｃ Ｄ２ａ（５μｇ／ｍｌ）で被覆された９６ウエルマイクロタイタ平板を用いるエ リザにより実行された。平板に結合する抗ＬＯ−ＣＤ２ａヒトあるいはサル抗体 は、ラット抗ヒトＩｇＭ（ＬＯ−ＨＭ−７）あるいはＩｇＧ（ＬＯ−ＨＧ−２２ ）ｍＡｂｓで標識されたホースラディッシュペルオキシダーゼにより明らかにさ れた。 Ａ．シノモルグスサル 一匹のシノモルグスサルが３連続日にわたりＬＯ−ＣＤ２ａを１０ｍｇ／日受 けた。モノクローナル抗体は充分に耐性であった。 リンパ球喪失が最初の注射後に観察されたが、２回および３回目の注射後には 非常に僅かの追加喪失があったに過ぎなかった。 第二のサルは１０日にわたり２０ｍｇ／日を受けた。ｍＡｂは同じく充分に耐 性であった。用量投与後副作用は観察されず、そこで動物は活性があり、用心深 く、よく餌を食べ同時に嘔気あるいは胃腸障害の証拠はなかった。 第二のサルのリンパ球の総数および細胞集団は図１２および１３で要約される 。ＮＫ活性は１０回注射後に僅かではあるが減少した（図１４）。ＭＡｂの循環 レベルは非常に高く（図１５）、また免疫化は処置の終りに生じた（図１６）。 Ｂ．ヒヒ ＬＯ−ＣＤ２ａに対するヒヒの耐性を決定し、またこのｍＡｂのヒヒリンパ球 の膜マーカーのいくつかに対する作用を分析しかつ血清におけるＬＯ−ＣＤ２ａ の半減期を決定するために ここで記載された実験が始められた。 ＬＯ−ＣＤ２ａでのヒヒ細胞の染色は染色ヒト細胞のそれよりも著しく低い平 均蛍光強度で正の細胞が２０％以下に帰着する。この染色パターンはヒヒ細胞と のＦｃ相互作用を経由する弱い交差感受性あるいは結合を反映する。 この研究は８．８Ｋｇの体重の雄ヒヒ（パピオ・モルモン）について行われた 。ＬＯ−ＣＤ２ａの各注射の前に、サルは麻酔された。麻酔は第１回目はケテー ラー（２ｍｌ）およびプラジン（０．５ｍｌ）、第２回目はケテーラーのみで続 く回にはケテーラーおよびプラジン（０．３ｍｌ）であった。ＬＯ−ＣＤ２ａは 生理食塩水１００ｍｌで希釈されて、静脈内（ｉ．ｖ．１０分）で注射された。 リンパ球の表現型分析および循環抗体（注射されたＬＯ−ＣＤ２ａ、新しく形成 された抗ＬＯ−ＣＤ２ａ抗体、および前から存在していた交差反応性ヒヒ抗ＬＯ −ＣＤ２ａ抗体）の測定のために、血液サンプル（１０ｍｌ）が、２個の管に取 られた。リンパ球型別のための管はＥＤＴＡを含んでいた。サンプルは基準線レ ベルを決定するために最初の処置の前に採取された。 ＬＯ−ＣＤ２ａの最初の用量（１０ｍｇ）が研究の０日に投与された。続く４ 個の用量（１０ｍｇ／用量）は７、８、９、および１０の日に投与された。血液 サンプルは各ＬＯ−ＣＤ２ａ用量後２−３分で採取された。７日および９日に（ ＥＤＴＡ含有管で）補足血液サンプルが同じくＬＯ−ＣＤ２ａ注射の前に採取さ れた。血液サンプルは１、２、１１、１２、１３、１６および２４日に採取され た。 ＬＯ−ＣＤ２ａ注射の期間あるいはこの研究の期間を通じて異常な活性の反応 あるいは食餌習慣は観察されなかった。動物の体重は０日に測定された約８．８ Ｋｇに留まった（下記の表を参照されたい）。 表現型および循環ｍＡｂの分析 このヒヒの末梢血リンパ球の蛍光染色はいくつかの興味深い特性を明らかにし た： ａ）ＬＯ−ＣＤ２ａの作用の下で、リンパ球のＣＤ２−正サブセットは、ＬＯ −ＣＤ２ａの第５回投与の終結の際に、つまり血液中でｍＡｂの最大の累積の時 点で（２個の異なった抗ＣＤ２ｍＡｂｓにより明らかにされたように）著しく減 少した（図１７ａおよび１７ｂを参照されたい）。リンパ球のＣＤ４＋およびＣ Ｄ８−サブセットがこの期間に減少しないという仮定で（図１９）、またＣＤ４ ＋およびＣＤ８＋細胞が大抵のＣＤ２保持リンパ球を含むために、ＣＤ２^-細胞 における減少は立体配座において減少しているかあるいは変化するものはリンパ 球よりも膜マーカー発現であることを示している。 （図１７ａ）で見ることができるように、ＬＯ−ＣＤ２ａの最初の用量後にＣ Ｄ２＋（Ｌｅｕ−５ｂ^-あるいはＴ１１^-）正リンパ球の僅かな減少が観察される 。この最初の用量の２日後に、ＣＤ２正細胞（Ｔ１１^-のＬｅｕ５ｂ^-）のレベル は出 発時の値に上昇した。 ＬＯ−ＣＤ２ａの４回２４時間間隔をあけた用量の終結時点（７日−１０日） で、ＣＤ２正細胞（Ｌｅｕ５ｂ^-あるいはＴ１１^-）の割合は急激に減少し、また ＬＯ−ＣＤ２ａ投与の終結３日後にゆっくり上昇を開始した。 ｂ）同時に、ＬＯ−ＣＤ２ａ正細胞の割合、すなわち、循環ｍＡｂにより結合 された細胞の割合はＬＯ−ＣＤ２ａの第２回用量（７日）の後２２％に上昇し、 次いで、抗ＣＤ２ｍＡｂｓ Ｌｅｕ５ｂおよびＴ１１により明らかにされたＣＤ ２^-細胞がそうであったように減少した（図１７）。ＬＯ−ＣＤ２ａ＋細胞の減 少はＭＡＲＫ−３ＦＩＴＣ ｍＡｂにより明らかにされた（図１８）。 ＬＯ−ＣＤ２ａ＋細胞の減少は、ＭＡＲＫ３−ＦＩＴＣにより、あるいはＭＡ ＲＧ２ｂ−８−ビオチン接合ｍＡｂｓにより検出された細胞に存在するＬＯ−Ｃ Ｄ２ａの検出により決定された（図１８ａ）。同じ現象は、もしも細胞が循環ｍ Ａｂにより占められていないすべての部位を飽和するために２．５μｇ／ｍｌで ＬＯ−ＣＤ２ａでまず保温されたかどうかが観察された。ＬＯ−ＣＤ２ａはＭＡ ＲＫ−３−ＦＩＴＣあるいはＭＡＲＧ２ｂ−８−ビオチンにより検出された（図 １８）。 ｃ）（図１９）で見ることができるように、ヒヒリンパ球のＴ４正サブセット は９日から１２日までの間に適度の上昇を示し、その後Ｔ４^-リンパ球の割合は 当初の値に戻った。Ｔ４^-細胞の上昇に附随して、Ｔ８正リンパ球の割合は９日 から１１日までに上昇した。その日以後、この割合は当初の値に戻っ た。 ｄ）循環ｍＡｂ ＬＯ−ＣＤ２ａのレベルは最初の注射３日後に目立たない値 にまで減少した（図１７ｂ）。ＬＯ−ＣＤ２ａが４回の短時間間隔の用量を適用 される時、血清ＬＯ−ＣＤ２ａのレベル（約３．７ｍｇ／ｍｌ、この期間での最 大値）は最後の用量（１０日から１６日）後にゆっくり減少し、これはこの動物 モデルでｍＡｂの半減期が相対的に長いことを示している。１１日，１２日，１ ３日，１６日および２４日に採取された血液サンプルではヒヒ抗ＬＯ−ＣＤ２ａ 抗体は検出されなかった。 結論 ＬＯ−ＣＤ２ａはシノモルグスサルヒヒで明らかな反応の不在により示される ように、非ヒト霊長類により十分寛容であるように見える。ＬＯ−ＣＤ２ａはヒ ヒにおいて相対的に長い半減期を持つように見える。ＬＯ−ＣＤ２ａの最初の用 量の２４時間後（図２４ｂの１日目）、ＭＡｂの最大検出レベルの５０％がまだ 血清に存在していた。ＬＯ−ＣＤ２ａの最後の用量の３日後（図２４ｂの１３日 目）、ｍＡｂの最大検出レベルの５０％がまだ血清に存在していた。 非ヒト霊長類での染色パターンがヒト細胞に対するＣＤ２で観察されたものと 一致しないけれども、ＣＤ２正リンパ球の割合の減少に続き細胞のこの割合のゆ るやかな上昇は、ＬＯ−ＣＤ２ａの存在下で培養されたヒトＰＢＭＣ単核細胞で 観察されたものと類似している。 実施例５ ＬＯ−ＣＤ２ａで処置された患者 思いやりのある基礎に基づくＬＯ−ＣＤ２ａで処置された患者 患者＃1（Ｍｂ．Ｅ．） これは末期腎不全のために腎同種異系移植を処置された慢性腎孟腎炎を持つ女 性の患者であった。拒絶発症が起こり、１０日間ＯＫＴ３で処置された。クレア チニンレベルは２乃至１．４ｍｇ／ｄｌまで低下した。約４ケ月後、拒絶発症は ２ｍｇ／ｄｌのクレアチニンレベルおよび適度の拒絶を示す生検により診断され た。患者はソルメドロール１．５ｇおよび続く８日間ＡＴＧのコースで処置され 、その時点でクレアチニンレベルは１．６５ｍｇ／ｄｌであった。処置７日後、 生検が行われ、それは細胞拒絶および適度な血管拒絶を示した。生検（０日）の ２日後、患者は２．４ｍｇ／ｄｌのクレアチニンレベルで無尿症となった。同日 患者はＬＯ−ＣＤ２ａ、１０ｍｇ、コルチコステロイド・ソルメドロール１．５ ｇ、プラス、ポラリミン１ｇ（抗ヒスタミン）およびダファルガン１ｇ（アセト アミノフェン）を受けた。コルチコステロイド、デキスクロロフェニルアミンお よびアセトアミノフェンでの処置は移植群集により「被度」として引用される。 副作用は認められなかった。２３時間の終りまでに、患者は７００ｍｌの尿を出 し、クレアチンは２．７２ｍｇ／ｄｌであった。次の９日間に、彼女はＬＯ−Ｃ Ｄ２ａを１０ｍｇ／日受けた。患者は１１日の時点で追跡生検を受けることなく 病院を離れた。 ＡＴＧ処置の間および続くＬＯ−ＣＤ２ａ処置の間での血清クレアチニンレベ ルの測定は、クレアチニンレベルがＡＴＧ処置にも拘らず上昇し、次いで下降し てＬＯ−ＣＤ２ａで安定化されたことを示した（図２７）。 白血球総数はＬＯ−ＣＤ２ａでの処置の期間に、１０，０００個の最高水準か ら２０００個まで低下し２１日目の最終の測定まで低下を続けた（図２０）。リ ンパ球総数は低く観察の期間中に変化していた。 ＬＯ−ＣＤ２ａの血清レベルは各処置に続き直ちに２．０−３．０μｇ／ｍｌ の最大値に上昇し、各処置の間で約１．０μｇ／ｍｌの最低値に低下した（図２ １）。９日目の最後の処置で、このレベルは２４時間に５０％低下し、１４日目 には０になった。 患者のクレアチニンレベルは４０日で２．２７、５０日で２．４８であり、６ ６日では３．１まで上昇し、この時点で生検が激しい細胞拒絶および間隙出血と 一致する最初の報告と共に得られた（以下を参照のこと）。患者は腎に１５０Ｒ の照射、３×１２５ｍｇのソルメドロールで処置され、一方シクロスポリンプラ ス１２．５ｍｇ／日のステロイドでの維持が続けられた。クレアチニンレベルは 続く期間中は上昇を続けた。７０日にクレアチニンレベルは３．３、８０日に５ ．６３、８４日には８．３５であった。８６日にはクレアチニンレベルは１０． ８となり、移植腎摘出が８８日に行われた。この患者の１０日の排泄と６６日生 検の間の期間の維持免疫抑制を伴う患者のコンプライアンスは疑問であり、また 明らかに成功した救助 であるにも拘らず腎の喪失が不確かなコンプライアンスの要因となるに違いない 。 （ii）患者＃２ この患者はＣ型肝炎を患った３８歳の男性であった。彼は慢性間隙性腎症（ネ フロパシー）に帰因する末期腎不全の処置のために腎同種異系移植を受けた。１ 年３ケ月後、彼は一連のＯＫＴ３に耐性の急性細胞および血管拒絶のため移植腎 摘出を受けた。 移植腎摘出から１年１０ケ月に、彼は２回目の腎同種異系移植を受けた。３日 後、彼のクレアチニンレベルは１．４ｍｇ／ｄｌであった。３日後彼はソルメド ロール５００ｍｇを受けた。その日の後患者のクレアチニンは１．８ｍｇ／ｄｌ であった。次の日彼はソルメドロールの５００ｍｇを受けた。クレアチニンは３ ．２５ｍｇ／ｄｌであった。次の日彼はソルメドロール５００ｍｇを受けた。彼 のクレアチニンは２．９５ｍｇ／ｄｌであった。３日後彼のクレアチニンレベル は２．３ｍｇ／ｄｌであり、彼は生検を受けそれは３プラスの細胞性拒絶を示し た。３日後彼はＬＯ−ＣＤ２ａ、１０ｍｇ、プラスソルメドロール２００ｍｇポ ララミンおよびダルファガンを受けた。観察された副作用は眠気さに限定された 。高熱あるいは高血圧は認められなかった。次の９日間彼は毎日ＬＯ−ＣＤ２ａ 、１０ｍｇの処置を受けた。このような処置の終りの次の日生検は拒絶反応を示 さなかった。 患者はＬＯ−ＣＤ２ａのコースで十分な耐性を示し、どのような用量でも熱あ るいは高血圧もなく臨床副作用の何らの徴候 も示さなかった。処置のコースの間に得られたいつもの血液学および臨床化学実 験室検査（ＬＦＴｓを含む）は、リンパ球総数が２９０／立方mmから１００／立 方mmの最低値に減少し、また拒絶発症の消炎と関連するクレアチニンレベルの減 少（ＬＯ−ＣＤ２ａの処置の開始で２．７ｍｇ／ｄｌからコース終期での１．１ ０への減少）したことを除き、抗体の投与に帰属する何らの変化も示さなかった 。 図２２はＬＯ−ＣＤ２ａの処置に続く日々に２．５から約１．０低下したこの 患者の血清クレアチニンレベルを示す。患者は処置の前および処置の間リンパ球 減少症であり、白血球数は処置によって何ら劇的な変化を示さなかった（図２３ ）。この患者では、ＬＯ−ＣＤ２ａの血清レベルは各処置後２．０μｇ／ｍｌ以 上に上昇せずまた１．０から０．２５μｇ／ｍｌの最低値に低下した（図２４） 。ＬＯ−ＣＤ２ａでの処置の８ケ月後、患者は正常な腎機能をで身体が丈夫であ り、再発性拒絶の徴候はなかった。 患者２−生検＃１−診断：不確定 生検は目立たない約２０個の糸球を含んでいた。散在する単核性浸潤および少 ない度合いの間隙性水腫があった。少ない度合いの管状浸入のみが見出されたが 血管外傷はなかった。これらの発見は急性細胞性拒絶の診断には不十分である。 小動脈にはまれに単核細胞が存在したがこれは疑わしく、しかし拒絶の診断の判 定基準には合致しなかった。 患者２−生検＃２、最初の生検の約２週間後のもの−診断上異常は認められなか った。 この生検は前の生検に類似しているように見え、約１０個の糸球を含んでいた。 浸潤は非常にまばらであり血管外傷は確認されなかった。 （iii）患者＃３ この患者はフォン・ヴィレブランド病にかかった１９歳の人であり、慢性腎孟 腎炎に起因する末期腎不全の処置のため腎同種異系移植を受けた。６日コースの ＯＫＴ３が失敗した後で二次高血圧での急性血管拒絶のため移植片は１７日後に 除去された。 ５ケ月半後に彼は第二回目の腎同種異系移植を受けた。１０日後彼のクレアチ ニンレベルは６ｍｇ／ｄｌであった。その翌日クレアチニンレベルは７ｍｇ／ｄ ｌであり生検は３プラス細胞性拒絶および血管拒絶（壊死あるいは血栓症のない 増殖性動脈内膜炎）を示した。その同日、彼はＬＯ−ＣＤ２ａ、１０ｍｇ、ソル メドロール４０ｍｇおよびポララミンならびにダファルガンを受けた。副作用は 観察されなかった。次の９日間、彼は毎日、他の薬剤あるいは副作用なしでＬＯ −ＣＤ２ａ、１０ｍｇの処置を受けた。処置の完了の２日後、彼のクレアチニン レベルは１．７５ｍｇ／ｄｌであり、生検は間隙性壊死および１個所慢性拒絶の 焦点はあったが、急性拒絶の徴候は示さなかった。 臨床的副作用（ＢＰあるいは温度の変化）は観察されなかった。日常の血液学 および臨床化学実験室試験（ＬＦＴｓを含む）は、拒絶発症の消炎に伴うクレア チニンレベルの減少（ＬＯ−ＣＤ２ａの処置開始時の７．１０ｍｇ／ｄｌから１ ０日間 コースの終期での１．７５ｍｇ／ｄｌ）を除き、抗体の投与に帰属する変化を示 さなかった。リンパ球数は処置前３４０／立方mmであり、処置中に２２０／立方 mmの最低値に低下し、ＬＯ−ＣＤ２ａでの処置の中止９日後に６９０／立方mmに 上昇しまた処置終期の２３日後に１０００／立方mmにまで上昇した。 この患者の白血球数は処置により著しく変化しなかった（図２５）。血清クレ アチニンレベルは処置で劇的に低下した（図２５）。ＬＯ−ＣＤ２ａでの最初の 処置７ケ月後に、患者は正常な腎機能で身体は丈夫になり、再発性拒絶の徴候は 存在しなかった。 患者３−生検＃１−診断：小動脈およびそれより低い度合いで間隙ならびに糸球 に影響する危険な細胞拒絶 弓状型動脈は弾性線維の破壊を伴う内膜への著しい単核浸潤を示した。時々細 管に侵入した間隙にまばらな浸潤巣が存在した。間隙は拡散した軽い間隙水腫を 示した。約７個の糸球が存在した。これらは単核細胞での細胞過剰症および内皮 腫脹を示した。全体に、このパターンは重い急性細胞拒絶の症状を示した。 患者３−生検＃２、最初の生検約２週後−診断：処置された拒絶と一致 生検は時々ムコイド物質を持ちしかしごく少量の細胞浸潤巣を持つ内膜線維症 を示す２、３の小動脈を示した。間隙は微細な拡散線維症および最少の単核浸潤 巣を示した。細管は局部的に萎縮性であったがそれ以外は目立たなかった。活性 細胞拒絶の徴候は存在しなかった。 患者の免疫抑制療法でコンプライアンスに留まった第２および第３の患者の追 跡治療での２８ケ月間にはその後拒絶症状の出現は報告されなかった。 （iv）患者＃４ 同種異系骨髄移植の後、重い対宿主性移植片病（高用量のプレドニゾン投与に 対し耐性である重い皮膚、消化管、腎および中枢神経系毒性）を患う患者が１２ 日間ＬＯ−ＣＤ２ａを１０ｍｇ／日を受けた。彼の症状は改善した。腎機能は正 常に戻り、下痢は止まり、皮膚は改善されまた錯乱状態は消散した。４日後抗体 は停止され、症状は再発し、患者は抗体の第２回コースの開始にも拘らず死亡し た。 ＬＯ−ＣＤ２ａは、かくして外部組織（同種異系および異種、というのはそれ が同種異系ＭＬＲと同じように異種ＭＬＲを阻害するためである）に対する進行 中の免疫応答を逆転するために使用することができた。抗体は１０日から１４日 にわたり、１日１回乃至２回静脈内注入により与えられるであろう。それはまた 器官移植に続いて直ちに誘導実験記録の一部としてＴ細胞の活性化を阻害するた めに予防的に使用することができるかもしれない。 ２回目の実験、フェーズＩ安全性、において、薬物動態および用量決定臨床試 験が、急性拒絶症状の出現を証明された最初の生検を受けた腎同種異系移植片受 容体で開始された。この試験で使用された抗体調製物は細胞培養で生産されたＬ Ｏ−ＣＤ２ａである。 抗体の思いやりのある使用は副作用を示さず、また１０日間 １０ｍｇ／日の用量で急性移植片拒絶を逆転するのに有効であることを示唆した 。チンパンジーを用いる予備臨床研究は、類似の生体内効果が明らかな副作用な しで０．１−１００ｍｇ／日にわたるヒト用量に等しい用量で観察されたことを 示唆した。従ってこのフェーズＩ試験の、目的は最小有効量の目安を得るために 、１０日間（選択肢の延長として追加の５日間）１０ｍｇ／日で開始するＬＯ− ＣＤ２ａの用量レベルを減少することを調査することであった。前に記載した思 いやり使用患者において副作用がステロイドの「適用範囲」で観察されなかった ため、ステロイドの適用範囲なしで鎮痛薬および抗ヒスタミン薬の最小予備処置 のみの投与が決定された。これはＬＯ−ＣＤ２ａにより誘導される副作用を予言 的に特徴付けるために行われた。 １１名の患者がこれまでのこのプロトコルの下で登録された。４名の患者は１ ０ｍｇ／日で処置され、５名の患者は５ｍｇ／日で処置され、また２名の患者は ２．５ｍｇ／日で処置された。 登録された１１名の患者の間で、９名の患者は生検で確認された急性拒絶の逆 転あるいは部分的逆転を経験した。その９名は、１０ｍｇ／日でＬＯ−ＣＤ２ａ で処置された４名すべての患者、５ｍｇ／日で処置された３名の患者、および２ ．５ｍｇ／日で処置された２名の患者であった。５ｍｇ／日で処置された患者の １人（下記参照、患者８）は最初の処置の後自発的に研究から退き、また第２の 患者（患者９）は劣った応答を示した。 表１はこのプロトコルの下でＬＯ−ＣＤ２ａで処置された腎拒絶患者で得られ た結果を要約したものである。 ¹患者の要請で取り消した 多分サイトカインの一過性放出の結果として、悪心、嘔吐、発熱、悪寒、およ び高血圧を含むステロイドの適用範囲なしでのＬＯ−ＣＤ２ａで処置の間副作用 が観察された。これらの事象の大多数（７０％以上）は最初の用量の投与の間に 観察され、それの事象は制限された範囲および継続期間のものであった。例えば 、４０℃以上の発熱は観察されず、事象の殆どは発症の時間内に消散した。高血 圧あるいは重い下痢症状は観察されなかった。これらの事象の強さおよび出現率 ならびに抗体用量との間には明らかな関係がなかった。これらの症状が明らかに 不快であったにも拘らず緊急蘇生手段を必要とする事象は存在しなかった。 第３の実験において、急性腎同種異系移植拒絶の１０名の患者は以下の通りＬ Ｏ−ＣＤ２ａでのステロイドの適用範囲なしで思いやりのある基礎に基づいて処 置された。 ２名は１０ｍｇ／日、４名は５ｍｇ／日、また４名は２．５ｍｇ／日で処置さ れた。すべての思いやり使用患者は１０ｍｇ／日および５ｍｇ／日で処置され、 １人を除いて２．５ｍｇ／日で処置された患者すべては生検および他の臨床徴候 により完全なあるいは部分的拒絶消散の証拠を示した。これらの思いやり使用患 者の有害事象プロフィールは、制限された持続時間および範囲の第１用量症状で ここで支配的に見られるものと類似していた。 第４の実験において、ステロイド耐性対宿主性移植片病を持つ６名の患者およ び１名の肝移植受容者が思いやりのある基礎に基づいてＬＯ−ＣＤ２ａを受けた 。これらの患者に対して副 作用は報告されなかった。これらの患者に関する短い物語は以下の通りである。 ＧｖＨＤ（対宿主性移植片病）患者６名のすべてが、１０日連続でＬＯ−ＣＤ ２ａ、１０ｍｇの用量を毎日処置され、１時間にわたり静脈内投与された。これ に付随して、シクロスポリンおよびステロイドの投与が続けられた。１人を除き すべての人がＧｖＨＤ症状の改善を示した。ＧｖＨＤ症状の消散はｍＡｂ療法の 開始３−６日後に始まった。ｍＡｂ療法の下で肝臓ＧｖＨＤの徴候の向上が２名 の患者で観察された。ＧｖＨＤの徴候の再発は評価される３名の患者の内２名で 見られた。 ７番目の患者は供与体の肝臓を受け入れたが、不幸にもシクロスポリン毒性の ため腎不全に伴う手術合併症の結果として敗血症を起こし、骨髄機能を著しく低 下させた。彼女の疾患状態のため、外科医は誘導のための現在利用できる免疫抑 制剤（０ＫＴ３、モフェティル、ＦＫ５０６、シクロスポリンおよびＡＴＧ）を 用いることにより、割当てられた第２の肝臓で患者にリスクをとらせることを望 まなかった。患者は肝移植を受け、移植器官の鉗子利用に先立ち手術開始の間注 入される最初の用量として５ｍｇ／日で７日間ＬＯ−ＣＤ２ａの処置を受けた。 これに続く用量は低用量のステロイドが与えられた。処置期間の間患者の腎機能 は開始されるべき従来の免疫抑制処方に対し十分な改善をみた。患者は移植８週 後に何らの拒絶徴候も見せなかった。 この発明は望ましい実施例において移植片拒絶の阻害に向けられるけれども、 この発明の範囲はそれに限定されるべきでな く、また目的の何れかおよびすべてでＴ細胞活性化の阻害に一般に有用であるこ とは理解されるべきである。 実施例６ キメラ抗体の構築および発現 Ａ．ＬＯ−ＣＤ２ａのＶ_HおよびＶ_Lのクローニングおよび配列化 全ＲＮＡがチャーグウィンの方法（バイオケミストリー、１８巻、５２９４ペ ージ、１９７９年）に従って細胞系ＬＯ−ＣＤ２ａ（ＡＴＣＣ ＨＢ１１４２３ ）から分離された。ｍＲＮＡが次いでオリゴテックス−ｄＴ ｍＲＮＡキット（ カリフォルニア、チャッツワース、キアジェン）を用いて調製された。約２００ −３００ｎｇのｍＲＮＡがパーキン−エルマー・シータス（コネチカット、ノー フォーク）のＲＮＡ−ＰＣＲキットを用いて逆転写された。反応は４２℃で１時 間行われた。Ｖ_HおよびＶ_L遺伝子の増幅に必要なオリゴヌクレオチド・プライマ ーは下記の引用例を用いて選択された：１）免疫関連タンパク質の配列、キャバ ット、他、第５版、１９９１年、２）オーランディ、他、全米科学アカデミー紀 要（アメリカ合衆国） 、８６巻：３８３３−３８３７（１９８９年）。 番号はキャバット、他、１９９１年で示されたアミノ酸残基を引用する。 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が下記の条件を用いてパーキン−エルマーＤ ＮＡサーマル・サイクラー４８０で行われた：９４℃で５分。９４℃で１分、６ ０℃で２分、および７２℃で２分よりなる３０サイクル、これに７２℃で５分が 続いた。ＤＮＡ断片はキエックス・ゲル抽出キット（カリフォルニア、チャッツ ワース、キアーゲン）を用いてアガロース１％からゲル精製された。断片は次い でカナンゴおよびパンディ、バイオテクニクス、１４巻：９１２−９１３ページ （１９９３年）の方法に従って平滑末端化され、ブルースクリプトＫＳＩＩ^-（ カリフォルニア、ラホーラ、ストラータジーン）のＳｍａＩ部位に連結された。 多重クローンはシーケナーゼ^TMＴ７ポリメラーゼ・キット（オハイオ、クリーブ ランド、ユー・エス・バイオケミカル）を用いるジデオキシ鎖終結法により配列 された。 ＰＣＲに固有の潜在的誤り率の故で、少くとも３回異なった反応が行われた。 ＬＯ−ＣＤ２ａ Ｖ_LおよびＶ_H遺伝子でもっとも普通に観察される配列は図２９ および図３０で示され、ここで図２９は天然リーダー配列を含むＬＯ−ＣＤ２ａ Ｖ_L鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示している。図３０は天然リーダー 配列を含むＬＯ−ＣＤ２ａ Ｖ_H鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。 図２９で示されるように、リーダー配列はアミノ酸残基−２０乃至−１である 。フレームワーク１はアミノ酸残基１乃至２３である。ＣＤＲ１はアミノ酸残基 ２４乃至３９である。フレームワーク２はアミノ酸残基４０乃至５４である。Ｃ ＤＲ２はアミノ酸残基５５乃至６１である。フレームワーク３はアミノ酸残基は ６２乃至９３である。ＣＤＲ３はアミノ酸残基９４乃至１０２である。フレーム ワーク４はアミノ酸残基１０３乃至１１２である。 図３０で示されるように、リーダー配列はアミノ酸残基−１９乃至−１である 。フレームワーク１はアミノ酸残基１乃至３０である。ＣＤＲ１はアミノ酸残基 ３１乃至３５である。フレームワーク２はアミノ酸残基３６乃至４９である。Ｃ ＤＲ２はアミノ酸残基５０乃至６６である。フレームワーク３はアミノ酸残基６ ７乃至９８である。ＣＤＲ３はアミノ酸残基９９乃至１０７である。フレームワ ーク４はアミノ酸残基１０８乃至１１８である。 Ｂ．一過性発現のためのベクターへの挿入 ２個のベクターがＬＯ−ＣＤ２ａのキメラ軽鎖および重鎖それぞれの発現のた め、ロンドンのメディカル・リサーチ・カウンシル（ＭＲＣ）からライセンスさ れた。９．２キロベース軽鎖ベクター（ｈｃｍｖ−ｖｌｌｙｓ−ｋｒ−ｎｅｏ） はＨｉｎｄＩＩＩ−Ｂａｍ ＨＩ断片としてヒトカッパ定常部および抗 リゾチームのヒト化Ｖ_L領域のゲノムクローンを含む。８．６キロベース重鎖ベ クター（ｈｃｍｖ−ＶｈＬｙｓ−ｇａｍｍａｌ−ｎｅｏ）はＨｉｎｄ ＩＩＩ− Ｂａｍ ＨＩ断片としてヒトγ１定常部および抗リゾチームのヒト化Ｖ_H領域の ゲノムクローンを含む。これらのベクターは前田、他、ヒト抗体ハイブリドーマ 、２巻：１２４−１３４ページ（１９９１年）により詳細に記述されている。 天然シグナルペプチドを含むＤＮＡ断片は利用不可能であるため、ＬＯ−ＣＤ ２ａのＶ領域はＭＲＣベクターに既に存在するシグナルの背後にクローンされた 。シグナル断片を持つ軽鎖Ｖ領域は下記の通り個別のＰＣＲ反応からそれぞれ誘 導された２個の断片から構築された：反応１ ：ＤＮＡ鋳型はＭＲＣ軽鎖ベクターであった。増幅された断片はシグナル ペプチドに加えてフレームワーク（ＦＲ）１の一部を含んでいた。使用された２ 個のペプチドは以下の通りであった。 アンチセンスプライマーは抗リゾチームのＭＲＣベクターでは見出されなかっ たＬＯ−ＣＤ２ａのＦＲ１配列を含んでいた。ＰＣＲ反応は０．１５キロベース のＨｉｎｄ ＩＩＩ−Ｔｔｈ ＩＩＩ断片を生産した。反応２ ：ＤＮＡ鋳型はブルースクリプト内のＬＯ−ＣＤ２ａＶ_Lクローンであっ た。増幅された断片は（Ｔｔｈ ＩＩＩ部 位から）ＦＲ４の末端までにＬＯ−ＣＤ２ａ ＦＲ１を含んでいた。ＭＲＣ軽鎖 ベクターで見出される３’未翻訳領域はアンチセンス・オリゴヌクレオチドを用 いてＬＯ−ＣＤ２ａの３’末端に付加された。使用された２個のオリゴヌクレオ チドは以下のものであった。 この反応は０．３５キロベースのＴｔｈＩＩＩ−Ｂａｍ ＨＩ断片を産出した 。双方のＰＣＲ産物はキアックスを用いてゲル精製され、適切な酵素を用いて制 限された。ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｔｔｈ ＩＩＩ断片プラスＴｔｈＩＩＩ−Ｂａｍ ＨＩ断片は次いで３方向連結でブルースクリプトのＨｉｎｄ ＩＩＩおよびＢａ ｍ ＨＩ部位の間で連結された。ＬＯ−ＣＤ２ａの全Ｖ_L領域プラスＭＲＣシグ ナルペプチドを含むこの構築物は次いで配列された。 重鎖ＬＯ−ＣＤ２ａ Ｖ領域構築物はその５’末端でＭＲＣシグナル配列、お よび同じくＭＲＣ重鎖ベクターから誘導された長３’未翻訳領域を含んでいる。 最終構築物は以下に述べる３種の異なったＰＣＲ反応から作られた：反応１ ：ＤＮＡ鋳型はＭＲＣ重鎖ベクターであった。抗リゾチームのＶ_Lおよび Ｖ_H遺伝子が同じシグナルを使うために、 センスプライマーはＬＯ−ＣＤ２ａ Ｖ_L構築物に使用されたもの、すなわち５ ’Ｖ_Lｌｙｓｓｉｇ と同じであった。アンチセンスプライマーは３’Ｖ_Hｌｙｓｓ ｉｇ ：以下のものであった。 この反応はＭＲＣシグナルに加えＬＯ−ＣＤ２ａのＦＲ１の一部を含む０．１６ キロベースのＨｉｎｄ ＩＩＩ−Ｐｓｔ Ｉ断片を生産した。断片はゲル精製さ れ、制限され、配列化のためＨｉｎｄ ＩＩＩ−Ｐｓｔ Ｉ切断ブルースクリプ トに連結された。反応２ ：ＤＮＡ鋳型はブルースクリプトのＬＯ−ＣＤ２ａＶ_H領域であった。こ の反応はＶ_H領域の殆どを含む０．３キロベースのＰｓｔ Ｉ−Ｓｔｙ Ｉ断片 を産出した。ＬＯ−ＣＤ２ａのＦＲ３に内部Ｐｓｔ Ｉ部位があったために、Ｐ ｓｔ Ｉ−Ｓｙｔ Ｉ断片は以下に示す２種のＰＣＲ反応から構築されねばなら なかった。 上で示された鋳型ＤＮＡはブルースクリプト内のＬＯ−ＣＤ２ａ Ｖ_H、クロー ン８２−８である。反応Ａ ：プライマーとしてオリゴ１および２として引用される オリゴヌクレオチドを用いて、０．２キロベース断片を産出する。 反応Ｂ：プライマーとしてオリゴ３およびオリゴ４を用いて０．１キロベースの 断片を産出する。 前記のオリゴ２および３はＬＯ−ＣＤ２ａのアミノ酸配列を変化させることな く、内部Ｐｓｔ Ｉを除去するヌクレオチド配列での変化を含む。前記の反応Ａ およびＢのオーバーラップ産物のアリコート（２−５μｌ）は組合され、第３Ｐ ＣＲ反応のための鋳型として役立った。この反応のためのオリゴヌクレオチドプ ライマーは前記ダイアグラムの番号１および４であった。０．３キロベースの産 物はキアックスによりゲル精製され、Ｐｓｔ ＩおよびＳｔｙ Ｉで制限された 。断片は無傷のままに留まったため、内部Ｐｓｔ Ｉ部位は成功裡に突然変異さ れた。反応３ ：最終Ｖ_H断片はＭＲＣ重鎖ベクターを鋳型として用いて生産された。こ の０．２３キロベースＳｔｙ Ｉ−ＢａｍＨＩ断片はＬＯ−ＣＤ２ａのＦＲ４の 一部、およびＭＲＣベク ターからの全３’未翻訳領域を含んでいた。使用されたプライマーは以下のもの である：生成断片はゲル精製され、Ｓｔｙ ＩおよびＢａｍ ＨＩで制限された。Ｐｓｔ Ｉ−Ｓｔｙ ＩおよびＳｔｙ Ｉ−Ｂａｍ ＨＩ断片は次いで配列化のために Ｐｓｔ Ｉ−Ｂａｍ ＨＩ切断ブルースクリプトに連結された。 すべてのオリゴヌクレオチドはアプライド・バイオシステムズ合成機で合成さ れた。すべての配列反応はシーケナーゼ^TMＴ７ポリメラーゼキット（オハイオ、 クリーブランド、ユー・エス・バイオケミカル）を用いて実行された。すべての ＰＣＲ_sは下記のプロトコルを使用して実行された：９５℃で５分。９４℃で１ 分、５０℃で１分、７２℃で２分よりなる３５サイクル、７２℃で５分の最終延 長。 正しい配列を含むＬＯ−ＣＤ２ａＶ_LおよびＶ_H断片はブルースクリプトから除 去され、ＭＲＣ軽鎖および重鎖ベクターそれぞれのＨｉｎｄ ＩＩＩおよびＢａ ｍ ＨＩ部位の間にクローンされた。重鎖に対しては、５’Ｈｉｎｄ ＩＩＩ− Ｐｓｔ Ｉ断片はまずブルースクリプト内での構築物（Ｐｓｔ Ｉ−Ｂａｍ Ｈ Ｉ）の残部に結合された。全Ｈｉｎｄ ＩＩＩ−Ｂａｍ ＨＩ断片は次いでＭＲ Ｃベクターにクローンされた。 Ｃ．Ｖ_HおよびＶ_LのＮ−末端アミノ酸配列化 Ｎ末端アミノ酸配列分析は、ＲＮＡ−ＰＣＲを用いて得られた配列を確認する ために、ＬＯ−ＣＤ２ａ重鎖および軽鎖のサンプルについて、マサチューセッツ 、ケンブリッジにあるハーバード・マイクロケミストリー・ラボラトリーにより 実行された。サンプルは以下のように調製された： ＬＯ−ＣＤ２ａの２００μｇがＢ−メルカプトエタノールの存在下で１２％ＳＤ Ｓポリアクリルアミドゲル走行全体にわたり適用された。電気泳動に続き、タン パク質はウエスタン移転機器を用いてＰＶＤＦ膜に移された。膜は短時間でポン ソーＳで染色され、１％酢酸内で脱色され、また軽鎖および重鎖帯は真空下で乾 燥されアミノ酸分析およびＮ末端配列化に送られた。 ＬＯ−ＣＤ２ａ Ｖ_Hの最初の２０残基のアミノ酸配列はクローン配列と完全 に一致した。しかしＦＲ１の２、３、７残基が、クローン遺伝子によりコード化 されたものと異なっていることをＶ_Lの配列が示した。これらの差異すべては、 これまでに引用した文献から得られた最良の推定配列にもとづき、クローニング 目的のために使用されるＰＣＲプライマーに存在する。 Ｄ．Ｎ末端アミノ酸配列のＤＮＡ配列確認およびその補正 この配列を補正しまた同時にＬＯ−ＣＤ２ａのＶ_LおよびＶ_H双方の天然シグナ ルペプチドをクローンするために、ＲＡＣＥ−ＰＣＲ（ｃＤＮＡ、Ｈｎｄｓ末端 のＲａｐｉｄ急速Ａｎｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ増幅−ＰＣＲ）が採用された。Ｌ Ｏ− ＣＤ２ａ細胞からのｍＲＮＡは逆転写され、生成ｃＤＮＡはｄＧＴＰの存在下で ターミナルトランスフェラーゼを用いてその３’末端でＧ尾部につなげられた。 ｃＤＮＡは次いでＧ尾部に相補的な特異的３’オリゴヌクレオチドおよび５’オ リゴヌクレオチドを用いて増幅された。サブクローニングを単純化するために、 適切な制限部位が各オリゴヌクレオチドの５’末端に加えられた。 ｃＤＮＡの調製のために使用されたオリゴヌクレオチドは下記のものであった 。 ＲＡＣＥ−ＰＣＲのオリゴヌクレオチドは下記の通りであった： ＲＡＣＥ−ＰＣＲ反応は下記のプロトコルを用いて行われた：９４℃で５分。 ９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、および７２℃で５０秒の４０サイクル、続い て７２℃で５分の延長。 ＬＯ−ＣＤ２ａ、Ｖ_LおよびＶ_Hで得られたＰＣＲ産物はキアックスを用いてゲ ル抽出された。Ｖ_H断片はＸｈｏ Ｉおよ びＳｕｔ Ｉで制限され、Ｘｈｏ Ｉ−Ｓｍａ Ｉ切断ブルースクリプトに連結 された。Ｖ_L断片は平滑末端化されＳｍａ Ｉ切断ブルースクリプトに連結され た。数多くのクローンが軽鎖および重鎖Ｖ領域に配列され、シグナル配列が確認 された。 免疫グロブリン遺伝子で見出されるシグナル配列が一般にイントロンを持って いるために、これらは発現に重要となるであろう。Ｖ_LおよびＶ_Hリーダー配列を 含むゲノムクローンは同様に確認された。ゲノムクローンは以下の通り調製され た：４×１０⁷ＬＯ−ＣＤ２ａ細胞が回転され、冷却ＰＢＳで洗浄され、回転さ れ、ＰＢＳで再度洗浄された。細胞は（新鮮追加プロテイナーゼＫを持つ）消化 緩衝液０．４ｍｌに再懸濁された。この混合物は振動させながら５０℃で１２− １５時間保温され、等量のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで 抽出され、１７００ｘｇで回転された。水相は清浄な管に移され、１／２量の酢 酸アンモニウム７．５Ｍおよび２量の９５％エタノールが加えられた。ＤＮＡは ２分間、１７００ｘｇの回転でペレット化された。ペレットは７０％エタノール で洗浄され、空気乾燥された。ペレットは８０ｍｌのＴＥ、ｐＨ８．０に再懸濁 された。 鋳型として細胞系ＬＯ−ＣＤ２ａから得られたゲノムＤＮＡを用いて、下記の オリゴヌクレオチドがＶ_LおよびＶ_H両方のゲノムリーダー配列、同じくユニーク 制限部位（Ｖ_LではＳｐｈ ｌ、Ｖ_HではＰｓｔ Ｉ）で終結するフレーワーク領 域の部分を増幅するために指定された。 ＰＣＲ反応は以下の通り行われた：ＬＯ−ＣＤ２ａ細胞からのゲノムＤＮＡ１ ００ｎｇ、オリゴＬＶＬおよびＢＫＡ（Ｖ_L断片用）それぞれ２００ｐｍｏｌあ るいはＬＶＨおよびＰＶＨＡ（Ｖ_H断片用）それぞれ２００ｐｍｏｌ、１ｍｍ、 ｄＮＴＰｓ１０μｌ、１０ＸＰｆｕ緩衝液１０μｌ。Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラー ゼ（カリフォルニア、ラホーラ、ストラータジーン）１μｌ（２．５単位）、１ ００μｌまでの脱イオン水。Ｐｆｕが使用された理由は、それがＴａｑポリメラ ーゼよりも精度が高いためであった。 反応条件は以下の通りであった：９４℃５分、５０℃５分。９４℃１分、５０ ℃で１分、７２℃１分の３５サイクル、次いで７２℃で５分。ＰＣＲ産物はゲル 精製され、制限され、配列化のためブルースクリプトに連結された。正しい配列 を含むクローンが一度確認されると、これらのクローンを含むブルースクリプト ベクターはＨｉｎｄ ＩＩＩおよびＳｐｈ Ｉ（Ｖ_L）あるいはＨｉｎｄ ＩＩ Ｉおよびｐｓｔ Ｉ（Ｖ_H）で切断され、断片はゲル分離された。０．７５キロ ベースのＨｉｎｄ ＩＩＩ−Ｓｐｈ Ｉ断片は次いでもとのＬＯ−ＣＤ２ａ Ｖ_L 構築物を含むブルースクリプトに連結され、それから Ｈｉｎｄ ＩＩＩ−Ｓｐｈ Ｉ断片が除去された。新しい構築物は天然ＬＯ−Ｃ Ｄ２ａシグナルプラスイントロンおよび補正ＦＲ１配列（Ｎ末端配列と合致する もの）を含んでいた。０．１６キロベースＨｉｎｄ ＩＩＩ−Ｐｓｔ Ｉ断片は もとのＬＯ−ＣＤ２ａ Ｖ_H構築物を含むブルースクリプトに連結され、それか らＨｉｎｄ ＩＩＩ−Ｐｓｔ Ｉ断片が除去された。新しい構築物は天然シグナ ル＋イントロンを含んでいた。新しく構築されたＶ_LおよびＶ_H断片は次いでＨｉ ｎｄ ＩＩＩおよびＢａｍ ＨＩでの消化によりブルースクリプトから除去され 、ＣＯＳ細胞での発現のためにＭＲＣ軽鎖および重鎖ベクターそれぞれにクロー ンされた。 Ｅ．ＣＯＳ細胞での一過性発現 ＣＯＳ７細胞はＡＴＣＣ（アクセス番号ＣＲＬ−１６５１）から得られ、ウシ 胎仔血清（ＦＢＳ）１０％を持つダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥＭ）で生成し た。最適形質移入は付着細胞の約５０％密集で達成された。形質移入の調製にお いて、プラスミドＤＮＡがニューセラムおよびＤＥＡＥ−デキストラン／二リン 酸クロロキンを含むＤＭＥＭに加えられた。ＣＯＳ細胞培地は除去され、ＤＮＡ 混合物が加えられ、細胞は３時間３７℃で保温された。この培地が次いで除去さ れ、ＰＢＳ内１０％のＤＭＳＯが細胞に２分間加えられ次いで除去された。ＦＢ Ｓ１０％を持つＤＭＥＭが細胞に加えられた。一晩保温の後、培地は取り替えら れ細胞は２日間３７℃で保温された。上澄みがキメラ抗体の分泌のためのエリザ による検定のために採取された。 Ｆ．エリザによる分泌キメラ抗体の検出 キメラ抗体の分泌は、ヒト抗体（あるいはその部分）の存在を検出するために 設計されたエリザでの形質移入ＣＯＳ細胞からの上澄みの検定により確認された 。ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）は食塩加リン酸緩衝液（ＰＢＳ）に５μｇ／ｍｌ の濃度で希釈され、エリザマイクロタイタ平板のウエルに１晩４℃での保温で付 着された。平板は３回エリザ平板洗浄器を用いて洗浄された。 残った遊離部位はウシ胎仔血清アルブミン１％を含むＰＢＳ２００μｌ（ＰＢ Ｓ−ＢＳＡ）を１／２時間室温で加えることにより遮断された。上澄みおよび正 の対照引用標準（精製ヒトＩｇＧ１Ｋ）のＰＢＳ−ＢＳＡでの２倍希釈液が用意 された。培地のみおよびもしくはＰＢＳ−ＢＳＡのみが負の対照を構成した。抗 体希釈液および対照はウエルに加えられ、室温で１．５時間保温された。平板は 次いでトウィーン２０の０．０５％を含むＰＢＳ内で平板洗浄器で３回洗浄され た。ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ガンマ鎖特異的）−ホースラディッシュペルオキシダー ゼ（ＨＲＰ）接合抗体あるいはヤギ抗ヒトカッパ軽鎖−ＨＲＰ接合抗体の適切な 希釈液が各ウエルに加えられ室温で１時間保温された。平板は前に記載の通りＰ ＢＳ−トウィーン２０で洗浄され、その後過酸化水素を含む成長基質（ＡＢＴＳ ）が加えられた。結合抗体は４０５ｎｍの波長での吸光度を読み取ることで検出 された。 Ｇ．分泌キメラ抗体の結合特異性 キメラ抗体の結合特異性がＣＤ２発現突然変異体ジャーカッ ト細胞系ＪＲＴ３−Ｔ３−５に結合する抗体のフロー・サイトメトリー分析によ り評価された。キメラ抗体（ヒトＩｇＧ１）の結合プロフィルは天然ラット抗体 （ＩｇＧ２ｂ）および無関係の（非−ＣＤ−２）結合特異性を示すアイソタイプ 付合対照ＭＡＢ_s（ヒトＩｇＧ１およびラットＩｇＧ２ｂ）の結合プロフィルと 比較された。 ＪＲＴ３−Ｔ３−５（ジャーカット）細胞系の調製 ジャーカット細胞系はＡＴＣＣ（アクセス番号ＴＩＢ−１５３）から得られ、 ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）１０％、アミノ酸補足物（ＮＣＴＣ）１０％、およびＬ −グルタミン６ｍＭを含むＤ−ＭＥＭ（完全培地）で増殖された。細胞は３７℃ 、炭酸ガス１０％で維持され、１：４の比率（継代での細胞濃度が約３×１０⁶ ／ｍｌになるように）で週当り３回継代された。ジャーカット細胞は収穫され、 消費培地を除去するために遠心分離され、ＤＭＥＭで洗浄された。細胞は次いで アジドナトリウム（ＮａＡｚ）０．１％を持つ食塩加リン酸緩衝液（ＰＢＳ）に 再懸濁され、細胞計量のためにアリコートが取りわけられた。生菌数はトリパン ブルー排除により決定された。 ジャーカット細胞の間接染色 細胞面染色が９６ウエルＵ型底部マイクロタイタ平板で行われた。９０μｌの 量の約６×１０⁵細胞がマイクロタイタ平板の各ウエルに分配された。試験され る抗体の希釈液はＮａＡｚ、０．１％を持つＰＢＳで調製され、１０μｌの量で 適切なウエルに分配された。細胞は抗体と共に１５分室温で保温され、その後細 胞はＮａＡｚ、０．１％を持つＰＢＳを各ウエル に加え２分間１９００ｒｐｍ（ソーバルＲＴ６０００Ｄ）で遠心分離して３回洗 浄された。細胞の再懸濁は平板を緩やかにたたいて達成された。適切なフルオレ セインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）接合二次抗体（抗ヒトＩｇあるいは抗ラ ットＩｇ）のアリコートｌ０ｕｌが適切なウエルに加えられ、室温で暗闇で１５ 分保温された。平板は前に記載の通りＮａＡｚ０．１％を持つＰＢＳで３回洗浄 された。染色細胞はＰＢＳ内でパラホルムアルデヒド０．５％の２００μｌを追 加することで固定され４℃で（１週間まで）貯蔵された。 染色ジャーカット細胞のフロー・サイトメトリー分析 染色細胞はベクトン−ディキンソン・ファクスキャンを用いるデータ取得のた めに１２×１７ｍｍポリスチレン管に移された。データ取得および分析はリシス −ＩＩソフトウエアを用いて行われた。ＣＤ２発現ジャーカット細胞はＬＯ−Ｃ Ｄ２ａ（ラットＩｇＧ２ｂ）ＭＡＢ、ＬＯ−ＣＤ２ａ（ヒトＩｇＧ１）のキメラ 版、および対応するアイソタイプ付合対照と共に保温された。結合抗体は前に記 載したプロトコルに従って適切なＦＩＴＣ接合二次抗体を用いて検出された。分 析は天然ラットＬＯ−ＣＤ２ａおよびキメラヒト−ラットＬＯ−ＣＤ２ａの類似 の結合パターンを示している。 Ｈ．ＮＳＯ細胞における安定発現 安定した形質移入体にキメラ抗体を発現するために、グルタミン合成酵素遺伝 子増幅システムがセルテック・リミテッド（英国、バークシャー）から得られた 。このシステムはベビントン、他、バイオテクノロジー、１０巻、１６９−１７ ５ペー ジ（１９９２年）に記載されている。使用された発現ベクターはｐＥＥ６ｈＣＭ Ｖ−ＢおよびｐＥＥ１２であった。このようなベクターは公開ＰＣＴ出願番号Ｗ Ｏ８６／０５８０７、ＷＯ８７／０４４６２、ＷＯ８９／０１０３６、およびＷ Ｏ８９／１０４０４に記載されている。これらベクターのいずれもがＣカッパあ るいはＣガンマ１を含まないために、これら遺伝子のゲノムクローンはそれぞれ ＭＲＣ軽鎖および重鎖ベクターから得られた。両定常部クローンは制限地図を得 るため配列された。２個の構築物はｐＥＥ１２内で作られた。第１のものは軽鎖 （Ｖ＋Ｃ）５’から重鎖（Ｖ＋Ｃ）までを含んでいた。第２の構築物は重鎖５’ から軽鎖までを含んでいた。 軽鎖を伴う戦略は以下の通りであった。 １．ｐＥＥ６ｈＣＭＶ−ＢおよびｐＥＥ１２それぞれはＸｍａ ＩおよびＥｃ ｏ ＲＩで消化された。 ２．キメラ軽鎖の５’、１．９３キロベース部分はＨｉｎｄ ＩＩＩおよびＥ ｃｏ ＲＩを用いてＭＲＣベクターから除去された。この断片は以下に述べるよ うにＰＣＲ突然変異誘発の鋳型として使用された。 制限部位はアンダーラインされている ＰＣＲは５’制限部位をＨｉｎｄ ＩＩＩからＸｍａ Ｉに変更し、コザック コンセンサス配列を構築物の５’末端に加えるために行われた。これは効果的な 翻訳にとっては必須である（コザック、Ｍ．細胞生物学ジャーナル、１０８巻： ２２９ページ、１９８９年）。３’ＰＣＲオリゴは続くクローニング段階に干渉 する内部Ｂａｍ ＨＩおよびＥｃｏ ＲＩ部位を除去するために使用される。Ｐ ＣＲ突然変異誘発の最終産物は０．８５キロベースＸｍａ Ｉ−Ｍｓｃ Ｉ断片 である。ＰＣＲ_sはＴＡクローニングキット（カリフォルニア、サンジェゴ、イ ンバイトロジェン）で提供された指示に従って行われた。下記の条件がＰＣＲに 使用された：９４℃で２分。続いて９４℃で１分、５５℃で２分、および７２℃ で２分の３０サイクル。これは７２℃で５分の延長に続けられた。連結反応およ び形質転換がキット指示事項に従って行われた。数多くのクローンが前に記載の 通り、ジデオキシ鎖終結法により配列された。補正クローンはＸｍａ Ｉおよび Ｍｓｃ Ｉでの消化によりＴＡクローニングベクターから除去された。この断片 はキアックスを使ってゲル精製された。 ３．２．７キロベースＣカッパ断片がＭｓｃ ＩおよびＥｃｏ ＲＩでの消化 によりＭＲＣベクターから除去された。この断片はキアックスを使ってゲル精製 された。 ２個の異なった３方向連結反応を用いて、完全キメラ軽鎖、すなわち０．８５ キロベースＸｍａ Ｉ/Ｍｓｃ Ｉ断片＋２．７キロベースＭｓｃ Ｉ／Ｅｃｏ ＲＩ断片がｐＥＥ６ｈＣＭＶ−ＢおよびｐＥＥ１２両方に連結され、そのそれ ぞれが Ｘｍａ Ｉ／Ｅｃｏ ＲＩで切断された。 重鎖を伴う戦略は以下の通りであった。 １．ｐＥＥ６ｈＣＭＶ−ＢおよびｐＥＥ１２の両方が大腸菌菌株ＤＭＩに形質 移入された。両ベクターはＥｃｏ ＲＩおよびＢｃ１Ｉで消化された（Ｂｃ１Ｉ はもしもプラスミドがメチラーゼマイナス菌内で増殖するならば切断するだけで あろう）。 ２．キメラ重鎖はＨｉｎｄ ＩＩＩおよびＥｃｏ ＲＩでの消化によりＭＲＣ ベクターから除去された。生成２．７キロベース断片はキアックスを用いてゲル 精製された。この断片はＮｈｅ ＩおよびＢｇｌ ＩＩで消化された。これは０ ．７キロベースＨｉｎｄ ＩＩＩ／Ｎｈｅ Ｉ断片および２キロベースＮｈｅ Ｉ／Ｂｇｌ ＩＩ断片を生産する。両断片はゲル精製された。０．７キロベース 断片は次いでＰＣＲ突然変異誘発の鋳型として使用された。 制限部位はアンダーラインされている。 このＰＣＲは５’制限部位をＨｉｎｄ ＩＩＩからＥｃｏ ＲＩに変更し更に コザックコンセンサス配列を加えるために行われた。３’オリゴは続くクローニ ング段階に干渉すると思われる内部Ｂａｍ ＨＩ部位を除去するために使用され る。ＰＣ Ｒｓ、連結反応および形質転換は前に記載された通りに行われた。 ２個の異なった３方向連結反応を用いて、完全キメラ重鎖、すなわち０．７キ ロベースＥｃｏ ＲＩ／Ｎｈｅ Ｉ断片＋２．０キロベースＮｈｅ Ｉ／Ｂｇ１ ＩＩ断片がｐＥＥ６ｈＣＭＶ−ＢおよびｐＥＥ１２両方に連結され、それぞれ はＥｃｏ ＲＩ／Ｂｃ１ Ｉで切断された。 （Ｂｃ１ ＩおよびＢｇ１ ＩＩは両立できる制限部位である）。 キメラ軽鎖および重鎖両方を含むｐＥＥ１２での最終構築物は下記の通り作ら れた。 軽鎖５’から重鎖まで：キメラ重鎖を運ぶｐＥＥ６ｈＣＭＶ−ＢがＢｇ１ Ｉ Ｉ／Ｂａｍ ＨＩで消化された。重鎖プラスｈＣＭＶプロモーターを含む５．１ キロベース断片はゲル精製され、キメラ軽鎖を含むｐＥＥ１２のＢａｍ ＨＩ部 位に連結された。正しい配向はＳａｌ Ｉ／Ｂａｍ ＨＩでの消化により照合さ れた。０．２８キロベース断片の存在は正しい配向を示している。 重鎖５’から軽鎖まで：キメラ軽鎖を運ぶｐＥＥ６ｈＣＭＶ−ＢがＢｇｌ Ｉ Ｉ／Ｂａｍ ＨＩで消化された。軽鎖プラスｈＣＭＶプロモーターを含む５．９ キロベース断片はゲル精製され、キメラ重鎖を含むｐＥＥ１２のＢａｍ ＨＩ部 位に連結された。配向は前に記載の通りＳａｌ Ｉ／Ｂａｍ ＨＩでの消化によ り照合された。 ＮＳ／Ｏ細胞（ガルファー、他、酵素学での方法論、７３巻 （Ｂ）、３−４６ページ（１９８１年）、ヨーロッパ動物細胞培養収集所に寄託 されたＥＣＡＣＣカタログ番号８５１１０５０３）が電気穿孔法により形質移入 された。形質移入細胞はグルタミン無し培地での成長により選別された。ＣＤ２ −発現ジャーカット細胞に対する抗休生産および結合活性は下記に記載されたよ うに確認された。 ヒト−ラットキメラ抗体の機能分析は、その機能性がラットＬＯ−ＣＤ２ａ抗 体のそれと類似していることを示している。両抗体は抗体の１２０ｎｇ／ｍｌま でのナノグラム量が培養に加えられた時一次混合白血球反応（ＭＬＲ）を阻害す る。更にキメラ抗体の一次ＭＬＲへの追加は、もとの同種異系抗原あるいは第三 者同種異系抗原に攻撃するために応答個体集団に低応答性の状態を誘導する。低 応答性はミトゲンあるいは破傷風トキソイドへの攻撃が増殖応答を誘導すること で同種異系抗原に特異的である。 実施例７ ヒト化抗体の構築および発現 Ａ．ヒト化軽鎖の構築 ＬＯ−ＣＤ２ａと相同性を分ち合いＨＵＭ５４００（ＥＭＢＬアクセスＸ５５ ４００）として名付けられたヒトＶカッパ遺伝子からのフレームワーク領域が軽 鎖Ｖ領域のヒト化のために選ばれた。以下はＬＯ−ＣＤ２ａとＨＵＭ５４００の フレームワークの間の比較である： ラットＬＯ−ＣＤ２ａの軽鎖可変領域、相同性ヒト可変領域、ＨＵＭ５４００ 、およびヒト化ＬＯ−ＣＤ２ａの比較が図３１で示される。完全アミノ酸配列が ＬＯ−ＣＤ２ａ可変領域のために与えられ、残基はラット配列に従って数が付け られている。ヒト化配列とＨＵＭ５４００配列で対応する位置にあるラットのそ れと同一の残基は水平のダッシュ線で示され、一方同一でない残基は文字コード で与えられる。ヒト化ＬＯ−ＣＤ２ａ軽鎖可変領域はＨＵＭ５４００フレームワ ーク領域、ラットＬＯ−ＣＤ２ａ ＣＤＲ’ｓ（アンダーライン付き）、および ７個のラットＬＯ−ＣＤ２ａフレームワーク残基（ラット配列の上に＊で指定さ れたもの）よりなり、これらはそのような残基がＬＯ−ＣＤ２ａの結合特異性を 維持することに関連するため選ばれた。 図３１で示されるように、フレームワーク１はアミノ酸残基１乃至２３までで ある。ＣＤＲ１はアミノ酸残基２４乃至３９ である。フレームワーク２はアミノ酸残基４０乃至５４である。ＣＤＲ２はアミ ノ酸残基５５乃至６１である。フレームワーク３はアミノ酸残基６２乃至９３で ある。ＣＤＲ３はアミノ酸残基９４乃至１０２である。フレームワーク４はアミ ノ酸残基１０３乃至１１２である。リーダー配列はアミノ酸残基−２０乃至−１ である（図３２）。フレームワーク領域内に保持されるラットアミノ酸残基はフ レームワーク１のアミノ酸残基９および１２、フレームワーク２のアミノ酸残基 は４１、４２、５０および５１、またフレームワーク３のアミノ酸残基は８２で ある。 ヒト化軽鎖は、ＬＯ−ＣＤ２ａのＣＤＲｓおよびＨＵＭ５４００の可変領域フ レームワークを含むように構築されたが、ただ７個の異常残基（＊）はＬＯ−Ｃ Ｄ２ａのフレームワークから保持された。５’領域はキメラ軽鎖構築物から得ら れた。この０．４３キロベースＨｉｎｄ ＩＩＩ／Ｈｐｈ Ｉ断片は、天然シグ ナルプラスイントロンおよびラットとヒトフレームワークで同一であるフレーム ワーク１の最初の３個のアミノ酸残基をコード化する配列を含む。可変領域の最 初の３個のアミノ酸を除くすべてのアミノ酸をコード化するヌクレオチドを含む 構築物（０．３７キロベース）の残部（すなわち３’末端）は、６３−８１ヌク レオチドの大きさにわたる７個のオーバーラッピングオリゴヌクレオチドからＰ ＣＲにより合成された。これらの長いオリゴヌクレオチドは、それより短い５’ および３’外部ＰＣＲオリゴヌクレオチド（長さ２１−２６のヌクレオチド）の 鋳型として役立った。すべての場合で、鋳型５ｐｍ ｏｌがそれぞれの外部ＰＣＲオリゴヌクレ才チド１００ｐｍｏｌと共に使用され た。すべてのＰＣＲｓはより大きな適合度を達成するために、Ｐｆｕポリメラー ゼを用いて行われた。その手順は以下の通りであった：９５℃で５分。続いて９ ４℃で２分、５５℃で２分および７２℃で２分を含んだ２５サイクル。これはそ の後７２℃で５分の追加延長が続けられた。すべての合成は４段階で達成された 。第１段階では、最初の長いオリゴヌクレオチドが０．４３キロベースＨｉｎｄ ＩＩＩ−Ｈｐｈ Ｈ断片に加えられた。次の３組のオーバーラッピングオリゴ ヌクレオチドは、次いでＰＣＲを用いて連続的に加えられた。全０．８キロベー ス構築物の合成が完成された後、それはキアックスを用いてゲル精製され、Ｈｉ ｎｄ ＩＩＩ／Ｂａｍ ＨＩ切断ブルースクリプト ＫＳ ＩＩに連結された。 数多くのクローンが正しい版のものが得られるまで配列された。クローンは次い でＨｉｎｄ ＩＩＩおよびＢａｍ ＨＩでの消化によりブルースクリプトから除 去された。生成断片はキアックスでゲル精製され、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ／Ｂａｍ ＨＩで切断されたＭＲＣ軽鎖ベクターに連結された。ヒト化ＬＯ−ＣＤ２ａ軽鎖 Ｖ領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は図３２で示される。 ヒト化軽鎖の合成で使用されたオーバーラッピングオリゴヌクレオチドおよび その用途についての説明は以下の通りである。 オリゴヌクレオチド１、３、５、および７は逆補体配列である。 オリゴヌクレオチド２、４、および６はセンス鎖配列である。 オリゴヌクレオチド＃１はキメラ軽鎖構築物から誘導された０．４３キロベー スＨｉｎｄ ＩＩＩ／Ｈｐｈ Ｉ断片をオーバーラップする。このオリゴヌクレ オチドは、下記のＰＣＲオリゴを用いてＰＣＲにより０．４３キロベース断片に 加えられた。： 同じようなやり方で、オリゴヌクレオチド＃２および＃３が下記のＰＣＲオリ ゴを用いてＰＣＲによりお互いに取り替えられた： ＰＣＲの後、両産物はキアックスを用いてゲル精製され、次いで第３回のＰＣ Ｒを用いて一緒に接合された。第３回のＰＣＲは下記のオリゴを必要とした： （5'）PCR 1A （3'）PCR 2B' 生成断片はキアックスによりゲル精製された。オリゴヌクレオチド＃４および ＃５は次いで下記のオリゴを用いるＰＣＲにより一緒に接合された： 断片はゲル精製され、ＰＣＲオリゴを用いてこれまでの構築物に加えられた： （5'）PCR 1A （3'）PCR3 C’ 最終断片はオリゴヌクレオチド＃６および＃７ならびにＰＣＲオリゴを用いて 構築された： ゲル精製後、この断片はオリゴを用いるＰＣＲによりヒト化軽鎖構築物の残部 に加えられた。 （5'）PCR 1A （3'）PCR 4D’Ｂ．ヒト化重鎖の構築 ヒト抗体クローンＡｍｕ５−３（ジェンバンク・アクセス番号Ｕ００５６２） のフレームワーク領域がヒト化重鎖の生成のために使用された。下記はＬＯ−Ｃ Ｄ２ａのフレームワークおよびＡｍｕ５−３のそれとの比較である： 図３３はラットＬＯ−ＣＤ２ａの重鎖可変領域配列、相同性ヒト可変領域Ａｍ ｕ５−３、およびヒト化ＬＯ−ＣＤ２ａ（ヒト化Ｖｈ）を示す。完全アミノ酸配 列がＬＯ−ＣＤ２ａに与えられ、残基はラット配列に従って番号を付される。ヒ ト化配列 およびＡｍｕ５−３配列内の対応する位置にあるラットのそれと同一の残基は水 平のダッシュ線で示され、一方同一でない残基は文字コードで与えられる。ヒト 化ＬＯ−ＣＤ２ａ ＶｈはＡｍｕ５−３フレームワーク領域、ラットＬＯ−ＣＤ ２ａ ＣＤＲｓ、および７個のラットＬＯ−ＣＤ２ａフレームワーク残基（ラッ ト残基上の＊により指定されたもの）よりなり、それらはＬＯ−ＣＤ２ａの結合 特異性を維持するために関係があるということで選択された。ラットおよびヒト 化配列のＣＤＲ３での垂直線は３個の配列を整列するために必要であった空間を 表しており、何故ならＡｍｕ５−３はラットおよびヒト化領域より長いＣＤＲ３ を有していたからである。 図３３で示されるように、フレームワーク１はアミノ酸残基１乃至３０である 。ＣＤＲ１はアミノ酸残基３１乃至３５である。フレームワーク２はアミノ酸残 基３６乃至４９である。ＣＤＲ２はアミノ酸残基５０乃至６６である。フレーム ワーク３はアミノ酸残基６７乃至９８である。ＣＤＲ３はアミノ酸残基９９乃至 １０７である。フレームワーク４はアミノ酸残基１０８乃至１１８である。リー ダー配列はアミノ酸残基−１９乃至−１である（図３４）。 フレームワーク領域に保持されるラットＬＯ−ＣＤ２ａアミノ酸残基はフレー ムワーク２のアミノ酸残基４７であり、またフレームワーク３のアミノ酸残基６ ７、７０、７２、７６、８５および８７である。 単一のヒト化重鎖構築物が作られた。この構築物は、ＬＯ−ＣＤ２ａから保持 される７個の残基（＊）という例外はある が、ＬＯ−ＣＤ２ａのＣＤＲｓおよびＡｍｕ５−３のフレームワークを含む。こ の構築物はヒト軽鎖のそれと同じやり方で生産された。この場合、６９−８８の ヌクレオチドのサイズにわたる１２個のオーバーラッピング鋳型オリゴヌクレオ チドがあった。１２個の外部ＰＣＲオリゴヌクレオチドは２１−２６のサイズに わたっていた。合成は各段階で１対のオーバーラッピング鋳型オリゴヌクレオチ ドを加えて６段階で達成された。最終構築物（０．７キロベース）は前に記載し た通りキアックスを用いてゲル精製され、Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＢａｍ ＨＩ で消化され、再びゲル精製され、前に記載した通りに配列化のためにブルースク リプトに連結された。正しいクローンが確認されると、それはＨｉｎｄ ＩＩＩ ／Ｂａｍ ＨＩでの制限によりブルースクリプトから除去され、次いで同じ酵素 で消化されたＭＲＣ重鎖ベクターに連結された。ヒト化ＬＯ−ＣＤ２ａ重鎖Ｖ領 域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列が図３４で示される。 ヒト化重鎖の合成に使用されたオーバーラッピングオリゴヌクレオチドおよび その用途の説明が以下に続く。 オーバーラッピングオリゴヌクレオチド＃１および＃２は下記のＰＣＲオリゴ を用いてＰＣＲにより一緒に接合された： 生成断片はゲル精製された。 オーバーラッピングオリゴヌクレオチド＃３および＃４は下記のＰＣＲオリゴ を用いてＰＣＲにより一緒に接合された： 断片はゲル精製された。 オリゴヌクレオチド＃５および＃６は下記のＰＣＲオリゴを用いてＰＣＲによ り一緒に接合された： ゲル精製後、この断片は下記のオリゴでＰＣＲによりオリゴヌクレオチド＃３ および＃４で生産された断片に接合された： （5'）PCR 1E（センス） （3'）PCR 2F'(アンチセンス)。 生成断片はゲル精製された。 オリゴヌクレオチド＃７および＃８は下記のＰＣＲオリゴを用いてＰＣＲによ り一緒に接合された： 生成断片はゲルに精製され、オリゴヌクレオチド＃３から＃６までを接合して 作られた構築物に加えられた。これはＰＣＲオリゴを用いて実現された。 （5'）PCR 1E（センス） （3'）PCR 3G'(アンチセンス)。 オリゴヌクレオチド＃３から＃８までを接合することにより 作られた生成断片はゲル精製された。構築物（オリゴヌクレオチド＃１＋＃２） の５’末端が次いでＰＣＲオリゴを用いて加えられた。 （5'）PCR 4H（センス） （3'）PCR 3G'。 この断片はゲル精製され、次の断片（３’）がオリゴヌクレオチド＃９および ＃１０を用いて加えられた。 オリゴヌクレオチド＃９および＃１０は下記のＰＣＲオリゴを用いてＰＣＲに より接合された： ゲル精製後、この３’末端はＰＣＲオリゴを用いて構築物の残部に加えられた 。 （5'）PCR 4H（センス） （3'）PCR 51'(アンチセンス)。 生成断片はゲル精製され、構築物の残部に加えられた。 オリゴヌクレオチド＃１１および＃１２は下記のＰＣＲオリゴを用いてＰＣＲ により接合された： ゲル精製後、この最終３’断片はオリゴ（５’）ＰＣＲ４Ｈ（センス）および （３’）ＰＣＲ６Ｊ’（アンチセンス）を用いて構築物の残部に加えられた。生 成０．７キロベース最終構築物は前に指示された通り、ゲル生成され、配列化さ れ、ＭＲＣ重鎖ベクターにクローンされた。 ＣＯＳ細胞の一過性発現および分泌抗体の検出はキメラ抗体に対して前に記載 された通り行われた。ヒト化抗体はアフィニティークロマトグラフィーにより精 製された（タンパク質Ａ）。ジャーカット細胞に関する結合研究はＬＯ−ＣＤ２ ａのヒト化形態とラット形態の間で類似の結合パターンを示している（図３５） 。ＣＤ２を発現するジャーカット細胞系は、ラットＬＯ−ＣＤ２ａ、ヒト化ＬＯ −ＣＤ２ａ（ＬＯ−ＣＤ２ａＨｕ）あるいはラットＩｇＧ２ｂもしくはヒトＩｇ Ｇ対照と共に染色された。抗体濃度は０乃至４μｇ／ｍｌであった。ＬＯ−ＣＤ ２ａのラットおよびヒト化形態はジャーカット細胞と類似の結合パターンで結合 するが、一方ラットおよびヒトアイソタイプ対照抗体はそうではない。結合抗体 はアイソタイプ特異的ＦＩＴＣ接合抗血清で検出された。図３５で示される結果 は、前に述べられた濃度の範囲にわたり抗体で正に染色された細胞の割合として 表現される。ヒト化抗体は更に一次抗体を阻害できることを機能研究が示してい る。ＬＯ−ＣＤ２ａ、ＬＯ−ＣＤ２ａＨｕ、ラットＩｇＧ２ｂ対照、あるいはヒ トＩｇＧ１対照のナノグラム量が、指定された応答体および剌激体（照射細胞） からのヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の等数を含む培養ウエルに加えられた。 対照ウエルは抗体を全然含んでいなかった。培養は５日間保温され、次いで一晩 トリチウム化されたチミジン（³ＨＴ）でパルスされた。増殖は³ＨＴの取り込み で検出される。以下の表２で与えられるように、結果はベータ平板リーダーで記 録された平均ＣＰＭ（１分間当り放射能カウント数）で表現される。 ヒト化抗体はまた、（無関係の特異性を持つ）アイソタイプ対照がヒト抗体と 置換される時ではなく、これらのＴ細胞が同種異系抗原およびヒト化ＬＯ−ＣＤ ２ａの存在下で一次ＭＬＲで培養される時に（平均ＣＰＭで³ＨＴの取り込みで 測定されるように）Ｔ細胞にある同種異系抗原を攻撃するための低応答状態を誘 導する（図３６）。ヒト化抗体の機能特性はラットＬＯ−ＣＤ２ａのそれと類似 する。 実施例８ ＬＯ−ＣＤ２ａは同種異系抗原特異的低応答性を引き出す 一次培養のみへのＬＯ−ＣＤ２ａの追加に続き二次ＭＬＲにおける同種異系抗 原を認識するＴ細胞の能力が試験された。一次ＭＬＲ培養がＬＯ−ＣＤ２ａ、対 照抗体（ＬＯ−ＤＮＰ１１、マサチューセッツ、チャールズタウン、バイオトラ ンスプラント，インコーポレイテッド）の存在下で、あるいは無抗体の下で応答 個体細胞および照射剌激体を含み、７日間保温され た。細胞は次いで洗浄され、追加の３日間培地のみで休止された。休止期間の後 、培養細胞はもとの刺激細胞あるいは異なった供与体から得られた細胞（「第三 者」細胞）で再攻撃された。 これらの研究からの代表的な実験結果が図３７で図示される。パネルＡでは、 応答個体細胞が２００ｎｇ／ｍｌで対照抗体の存在下で培養された時に一次応答 が観察されたが、ＬＯ−ＣＤ２ａが２００ｎｇ／ｍｌでの存在下で培養された場 合には応答は監視されず、これはこれまでに報告されたデータと合致した。応答 の動態は３日、５日、および７日に培養を収穫して測定された。データは個別ウ エルからのｃｐｍが平均値の１０％以内にあった各データ時点で三つ組ウエル運 転の平均値として提供された。 図３７Ｂで描かれているように、ＬＯ−ＣＤ２ａあるいは対照抗体のいずれか で処置された培養からの応答個体細胞は、二次ＭＬＲに何らの抗体も存在せずに １：１の割合で刺激細胞を運ぶ同種異系抗原に再攻撃された。応答の動態は３日 、５日、および７日に培養を収穫して測定された。ＬＯ−ＣＤ２ａあるいは対照 抗体のいずれかで一次ＭＬＲで培養された細胞の応答は対照として含まれる。デ ータは個体ウエルからのｃｐｍが平均値の１０％以内であった各データ時点で三 つ組ウエル運転の平均値として提示される。データは図３７Ａで描かれた同じ実 験からのものである。 図３７Ｃで示されるように、ＬＯ−ＣＤ２ａあるいは対照抗体の存在下で特異 的同種異系抗原で一次ＭＬＲ内で刺激された 細胞は、次いで二次培養に存在する何らの抗体の存在なしで１：１の比率で第三 者供与体からの細胞を運ぶ同種異系抗原で攻撃された。応答の動態は３日、５日 、および７日に培養を収穫して測定された。対照抗体あるいはＬＯ−ＣＤ２ａで 一次ＭＬＲ内で培養された自己由来刺激細胞に対する細胞の応答は対照として含 まれる。データは個々のウエルからのｃｐｍが平均値の１０％以内であった各デ ータ時点で三つ組ウエル運転の平均値として提示される。データは図３７Ａおよ びＢで描かれた同じ実験からのものである。 一次培養で対照抗体の存在下で培養された細胞は、一次培養でのそれと同じ同 種異系剌激細胞による再攻撃に応答性であり（パネルＢ）、また第三者細胞によ る刺激に対しても応答性であった（パネルＣ）。それに反して、一次ＭＬＲの間 でＬＯ−ＣＤ２ａの存在下で培養された細胞は、一次同種異系刺激細胞での再攻 撃（パネルＢ）あるいは第三者細胞による刺激（パネルＣ）のいずれに対しても 応答性でなかった。ＬＯ−ＣＤ２ａを含む培養での細胞は生存でき、同種異系抗 原以外の刺激に応答性であった。例えばＰＨＡあるいは可溶ＯＫＴ３のいずれか による刺激は、ＬＯ−ＣＤ２ａ対照抗体、あるいは新鮮自己由来ＰＢＭＣで培養 された細胞で同等の増殖応答を引き起こした（データは示されていない）。休止 後のこれらの細胞のフロー・サイトメトリー分析は細胞表面でのＬＯ−ＣＤ２の 検出を果せなかった（データは示されていない）。かくしてこれらのデータは、 ＬＯ−ＣＤ２ａおよび同種異系抗原への露出が続く同種異系抗原低応答性、すな わち耐性の状態を誘導することが できることを示している。 同種異系抗原刺激の間に、ＬＯ−ＣＤ２ａにより誘導された低応答性の明らか な同種異系抗原特異性にアドレスするために、同種異系抗原剌激の後に培養から 得られた細胞は、可溶タンパク質抗原、すなわち破傷風トキソイドに応答するた めに攻撃された。可溶抗原応答は７日後に同種異系抗原刺激培養で喪失した生存 可能な抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在を必要とする。従ってこれらの研究では、 ＡＰＣの新鮮源が照射自己由来ＰＢＭＣを二次検定培養に加えることにより培養 細胞に提供された。図３８Ａで描かれるように、ＬＯ−ＣＤ２ａあるいは対照抗 体のいずれかで処置された培養からの応答個体細胞は、二次ＭＬＲに存在するい ずれの抗体の存在もなしで１：１の比率で刺激細胞を運ぶ同種異系抗原で再攻撃 された。応答の動態は３日、５日、および７日での収穫培養で測定された。ＬＯ −ＣＤ２ａあるいは対照抗体のいずれかで一次ＭＬＲで培養された自己由来刺激 細胞に対する細胞の応答はまた対照として含まれる。データは個別のウエルから のｃｐｍが平均値の１０％以内にあった各データの時点で三つ組ウエル運転の平 均値として提示される。 図３８Ｂで描かれるように、ＬＯ−ＣＤ２ａあるいは対照抗体のいずれかで処 置された培養からの応答個体細胞は、二次培養に存在するいずれの抗体もなしで ７．５μｇ／ｍｌの破傷風トキソイドで再攻撃された。応答の動態は３日、５日 、および７日での収穫培養により測定された。抗体および自己由来刺激細胞なし の一次培養で培養された細胞の応答は、破傷風トキソ イドに対する応答の対照として役立った。 図３８ＡおよびＢで示される結果は、一次ＭＬＲ内でＬＯ−ＣＤ２ａプラス同 種異系抗原で培養された細胞が二次ＭＬＲ内での同種異系抗原に対し低応答性で あったけれども、この細胞は新鮮ＡＰＣにより提示された時には破傷風トキソイ ドに対し応答性であったことを示している。 実施例９ ＬＯ−ＣＤ２ａのＦｃ部分の役割にアドレスするために、Ｆ（ａｂ’）₂断片 の機能効果を全抗体と比較する研究が行われた。 図３９で示されるように、ＰＢＭＣが照射エプスタイン−バーウイルス（ＥＢ Ｖ）形質転換Ｂ細胞系と応答個体対刺激細胞２：１の割合でまたＬＯ−ＣＤ２ａ あるいはそのＦ（ａｂ’）₂断片の用量を増加させながら６日間培養された。こ のグラフは４人の異なった供与体の応答に関するＦ（ａｂ’）₂断片の作用を描 き、また各時点は各データ時点での三つ組ウエル運動の平均値である。結果は対 照応答の割合として報告される。グラフを明確にするために、全ＬＯ−ＣＤ２ａ 抗体を追加したものからのデータは示されていない。全ＬＯ−ＣＤ２ａの３０ｎ ｇ／ｍｌの用量で、供与体の応答は：対照に対し供与体１−１８％、供与体２− ６．６％、供与体３−３．７％、および供与体４−１２％であった。試験された 個体からの存在する抗体なしの細胞応答は、平均値が５６，６９０ｃｐｍから４ ０４，８４３ｃｐｍにわたり、また個体ウエルからのｃｐｍは平均値の１０％以 内であった。 Ｆ（ａｂ’）₂断片の潜在阻害性を更に評価するために、Ｆ（ａｂ’）₂断片の 用量滴定が、可溶ＯＫＴ３（ＡＰＣ依存性応答）で刺激された未分画ＰＢＭＣに 加えられた。図４０で示されるように、ＰＢＭＣは可溶ＯＫＴ３（１００ｎｇ／ ｍｌ）で３日間刺激された。ＬＯ−ＣＤ２ａの無傷抗体あるいはＦ（ａｂ’）₂ 断片のいずれかが用量を増加させながら０日に加えられた。結果はアイソタイプ 付合対照モノクローナル抗体の存在下でＯＫＴ３に対する細胞の増殖応答の割合 で表現される。各データ時点は個体ウエルからのｃｐｍが平均値の１０％以内で あった三つ組ウエルの平均値である。抗体なしでの刺激されたＰＢＭＣに対する 平均ｃｐｍは６０，１１７であった。 図４０の結果はＯＫＴ３に対するＴ細胞の増殖が、Ｆ（ａｂ’）₂断片が使用 された時には阻害されなかったことを示している。 実施例１０ ＡＰＣは試験管内培養におけるＬＯ−ＣＤ２ａの阻害性を必要とする ＬＯ−ＣＤ２ａの阻害性でＡＰＣの役割の問題をアドレスするために、ＰＢＭ ＣのＴ細胞集団は免疫磁性選別によりＣＤ１４、ＣＤ５６、ＣＤ１９およびＨＬ Ａ−ＤＲ正細胞を喪失された。精製細胞のフローサイトメトリーによる分析は、 ＡＰＣ集団が９５％以上喪失したことを示した（データは示されていない）。可 溶ＯＫＴ３に対するこれら精製Ｔ細胞の増殖（ＡＰＣ依存性応答）はこの喪失に より未分画ＰＢＭＣの増殖の１％以 下に減少した（データは示されていない）。精製Ｔ細胞あるいは未分画ＰＢＭＣ は、ＬＯ−ＣＤ２ａの存在下あるいは不在下で平板結合ＯＫＴ３（Ｔ細胞刺激の ＡＰＣ非依存性方法）により刺激された。Ｔ細胞活性化を阻害するＬＯ−ＣＤ２ ａの能力はＡＰＣが除去された時に取り除かれた（図４１）。図４１で示される ように、ＰＢＭＣあるいは免疫磁性技術によりＡＰＣを喪失させたＰＢＭＣは、 ＯＫＴ３（１０μｇ／ｍｌ）で被覆された９６ウエル平板で平板培養され、３日 間培養された。ＬＯ−ＣＤ２ａは培養の開始時に加えられた。結果はアイソタイ プ付合対照モノクローナル抗体の存在下でＯＫＴ３に対する細胞の増殖応答の割 合として表現される。プロットされたデータは３種の実験の代表であり、ここで 各データ時点は個別ウエルからのｃｐｍが平均値１０％以内にあった三つ組のウ エルの平均値である。 この発明の数多くの修飾および変更が前記教訓を考慮して可能であり、また従 って、付加された請求の範囲内でこの発明は特に記載されたもの以外にも実施可 能である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ０７Ｋ 19/00 19/00 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 ラタンヌ，ドミニク ベルギー，ブリュッセル ベー―1150，ボ ワート ポスタル 17，アブニュ ジェネ ラル ド ロングビル，16 (72)発明者 キャプラン，ルース アメリカ合衆国，01876 マサチューセッ ツ，チュークスベリ，ダンベガン ロード 10 (72)発明者 キーバー―エモンズ，トーマス アメリカ合衆国，19073 ベンシルバニア, ニュートン スクエア，ソー ミル ロー ド 3231 (72)発明者 ポステマ，クリスティーナ，イー. アメリカ合衆国，02129 マサチューセッ ツ，チャールズタウン，＃２ ラッセル 48 (72)発明者 ホワイト―シャーフ，メアリ，イー. アメリカ合衆国，01890 マサチューセッ ツ，ウィンチェスター，ジョンソン ロー ド 19

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ＬＯ−ＣＤ２ａからのＣＤＲを含む一つのヒト化抗体。 ２．請求の範囲第１項記載のヒト化抗体であって、図３１で示されるように、ヒ ト化抗体の軽鎖可変領域のフレームワークにラットＬＯ−ＣＤ２ａ軽鎖可変領域 のアミノ酸９、１２、４１、４２、５０、５１および８２を更に含むことを特徴 とするヒト化抗体。 ３．請求の範囲第２項記載のヒト化抗体であって、図３３で示されるように、ヒ ト化抗体の軽鎖可変領域のフレームワークにラットＬＯ−ＣＤ２ａ重鎖可変領域 のアミノ酸４７、６７、７０、７２、７６、８５、および８７を更に含むことを 特徴とするヒト化抗体。 ４．請求の範囲第１項記載のヒト化抗体であって、ここでヒト化抗体の軽鎖可変 領域が図３１のアミノ酸配列を持つことを特徴とするヒト化抗体。 ５．請求の範囲第４項記載のヒト化抗体であって、ここでヒト化抗体の重鎖可変 領域が図３３のアミノ酸配列を持つことを特徴とするヒト化抗体。 ６．患者にある免疫応答を阻害する一つの方法であって、 患者を請求の範囲第１項記載の抗体で処置することを含む方法。 ７．患者にある移植片の拒絶を阻害する一つの方法であって、患者を請求の範囲 第１項記載の抗体で処置することを含むことを特徴とする方法。 ８．ＡＴＴＣ ＨＢ １１４２３として寄託された細胞系によ り生産されたモノクローナル抗体と同じヒトリンパ球のエピトープあるいはその 部分と結合する一つのキメラ抗体、前記キメラ抗体はヒト化定常部および図２９ で示されるようなアミノ酸配列を持つＶ_L鎖ならびに図３０で示されるようなア ミノ酸配列を持つＶ_H鎖を持つことを特徴とするキメラ抗体。 ９．患者にある免疫応答を阻害する一つの方法であって、患者を請求の範囲第８ 項記載の抗体で処置することを含む方法。 １０．患者にある移植片の拒絶を阻害する一つの方法であって、患者を請求の範 囲第８項記載の抗体で処置することを含む方法。