JP2001512308A

JP2001512308A - 合成ｈｉｖｇａｇ遺伝子

Info

Publication number: JP2001512308A
Application number: JP53490598A
Authority: JP
Inventors: シヤイバー，ジヨン・ダブリユ，ジユニア; デイビス，メアリー−エレン・エム; フリード，ダニエル・シー; リウ，マーガレツト・エイ; ペリー，ヘレン・シー
Original assignee: メルクエンドカンパニーインコーポレーテッド
Priority date: 1997-02-07
Filing date: 1998-02-03
Publication date: 2001-08-21
Also published as: WO1998034640A3; ATE342916T1; WO1998034640A2; DE69836206D1; CN1252075A; NO993810D0; DK0969862T3; ES2274566T3; AU743616B2; PL335050A1; SK106699A3; DE69836206T2; EP0969862B1; CA2280195A1; KR20000070865A; AU6271198A; EP0969862A2; EE9900343A; IL131131A0; NO993810L

Abstract

(57)【要約】 HIV gagおよびHIV gag修飾体をコードする合成DNA分子を提供する。該合成分子のコドンは、意図される宿主細胞にとって好ましいコドンである。該合成分子は、中和抗体および細胞性免疫の刺激を介してHIV感染に対する有効な免疫予防をもたらすポリヌクレオチドワクチンとして使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】合成ＨＩＶＧＡＧ遺伝子発明の背景ヒト免疫不全ウイルス１(HIV-1)は、後天性ヒト免疫不全症候群（エイズ）および関連障害の病原体である。HIV-1は、レトロウイルス科のRNAウイルスであり、全レトロウイルスの5'LTR-gag-pol-env-LTR3'体制を示す。また、HIV-1は、調節機能または未知の機能を有する少数の遺伝子（tatおよびrev遺伝子など）を含む。env遺伝子は、ウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードしており、該糖タンパク質は、160キロダルトン（kDa）の前駆体（gp160）として翻訳され、ついで細胞プロテアーゼにより切断されて、細胞膜外120kDaエンベロープ糖タンパク質（gp120）および膜貫通41kDaエンベロープ糖タンパク質（gp41）を与える。 Gp120およびgp41は会合したままであり、ウイルス粒子およびHIV感染細胞表面上に提示される。Gp120は、ヘルパーTリンパ球、マクロファージおよび他の標的細胞の表面上に存在するCD4受容体に結合する。gp120がCD4に結合した後、gp41が、ウイルスの侵入を引き起こす融合事象を媒介する。感染は、ウイルス粒子上のgp120がT4リンパ球または他の標的細胞の表面上のC D4受容体に結合した際に開始する。結合したウイルスが、標的細胞と合体し、そのRNAゲノムを該細胞の二本鎖DNA中に逆転写する。該ウイルスDNAは、該細胞の核の遺伝物質中に取込まれ、該核中で、該ウイルスDNAは新たなウイルスRNA、ウイルスタンパク質および新たなウイルス粒子の産生を指令する。その新たな粒子は、標的細胞膜から出芽し、他の細胞に感染する。 T4リンパ球（これは、免疫防御に決定的に重要である）の破壊が、HIV感染の特徴である進行性免疫不全の主要原因である。標的細胞の喪失は、ほとんどの侵入体と戦う身体の能力を著しく損なうが、特に、それはウイルス、真菌、寄生体および或る種の細菌（マイコバクテリアなど）に対する防御に重大な影響を及ぼす。 HIV-1は、それが感染した細胞を、複製、細胞からの出芽および細胞膜の損傷により殺す。HIV-1は、感染細胞の表面上に提示されるウイルスgp120を用いて標的細胞を間接的に殺すことがある。T細胞上のCD4受容体はgp120に対して高い親和性を有するため、CD4受容体を発現する健常な細胞は、gp120に結合し、感染細胞と融合して、シンシチウムを形成しうる。また、HIV-1は、感染細胞に対する正常な細胞性免疫防御を惹起しうる。抗体の補助により又は補助なしで、細胞傷害性防御細胞は、ウイルスタンパク質を表面上に提示する感染細胞を破壊することが可能である。最終的に、遊離gagおよびgp120タンパク質が、HIV-1に感染した個体の血液中を循環しうる。該遊離gp12 0タンパク質は、未感染細胞のCD4受容体に結合し、それを感染したかのようにし、免疫応答を惹起しうる。 HIV-1の感染は、ほとんど常に致命的であり、現在のところ、HIV-1感染に対する治療法は存在しない。HIV-1感染の予防のための有効なワクチンは、いまだに入手不可能である。復帰突然変異または感染の危険性のため、生弱毒化ウイルスをワクチンとして使用することは多分不可能であろう。ほとんどのサブユニットワクチンアプローチは、HIV感染の予防に成功していない。HIV-1感染の治療は、感染者の寿命を延ばすことがあるものの、重篤な副作用を有する。したがって、この致命的感染と闘うための有効な治療およびワクチンが大いに必要とされている。ワクチン接種は、疾患の予防のための有効な形態であり、いくつかの型のウイルス感染に対しては成功することが判明している。防御的な体液性および細胞性免疫を惹起するためにヒトの免疫系にHIV-1抗原を提示させる方法を決定することは、困難な仕事である。現在のところ、有効なHIVワクチンを得るための試みは成功していない。エイズ患者においては、遊離ウイルスは低レベルでしか存在しない。HIV-1の伝播は、融合およびシンシチア（syncytia）形成を介した細胞対細胞相互作用により増強される。したがって、遊離ウイルスまたはウイルスサブユニットに対して産生した抗体は、一般には、ウイルス感染細胞の排除には無効である。ワクチンは、身体が抗原を「記憶」する能力を利用する。一定の抗原との最初の遭遇の後、免疫系は、個体の寿命にわたり該抗原の免疫記憶を保有する細胞を生成する。該抗原に対するその後の曝露は、免疫応答を刺激し、病原体の排除または不活性化を引き起こす。免疫系は、体液性応答および細胞性応答の２通りの方法で病原体に対処する。体液性応答では、リンパ球が、抗原に結合して病原体を不活性化する特異的抗体を生成する。細胞性応答には、感染細胞を特異的に攻撃し破壊する細胞傷害性およびヘルパーTリンパ球が関与する。 HIV-1ウイルスによるワクチン開発では、いくつかの問題が生じる。なぜなら、免疫系において該ワクチンが活性化する必要がある細胞と同じ細胞（すなわち、T4リンパ球）のいくつかに、HIV-1が感染するからである。免疫系が損なわれる前にHIVを不活性化するワクチンを開発することができれば好都合であろう。特に適当なタイプのHIVワクチンであれば、HIV変異体を認識し感染初期のHIV陽性個体内で働く抗HIV免疫応答を生成するであろう。中和および防御免疫応答の惹起が望まれるウイルス（特に、高い突然変異率を有するウイルス、例えば、ヒト免疫不全ウイルス）に対するワクチンの開発の際の主な問題点は、種々のウイルス分離体または株におけるウイルスエンベロープタンパク質の多様性である。マウスおよびヒトにおける細胞傷害性Tリンパ球（C TL）は共に、保存された内部ウイルスタンパク質に由来するエピトープを認識する能力を有し、ウイルスに対する免疫応答において重要であると考えられているため、種々のウイルス株に対する異種防御を付与しうるCTLワクチンの開発に努力が向けられている。 MHCクラスＩ分子と会合したウイルスペプチドをCD8⁺CTLのT細胞受容体が認識すると、CD8⁺CTLはウイルス感染細胞を殺すことが知られている。該ウイルス内のタンパク質の局在または機能に無関係に、該ウイルスペプチドは、内因的に合成されたウイルスタンパク質に由来する。したがって、保存されたウイルスタンパク質に由来するエピトープの認識により、CTLは交差株防御を付与することが可能である。CTL認識のためにMHCクラスＩと会合しうるペプチドは、細胞質または小胞体内に存在するか又はそれらを通過するタンパク質に由来する。一般に、エンドソームプロセシング経路（MHCクラスII分子により提示される抗原の場合）に入る外因性タンパク質は、CD8⁺CTL応答の生成に有効でない。 CTL応答を生成させるためのこれまでのほとんどの努力は、該細胞内にタンパク質抗原を産生させるために複製ベクターを使用するものであったり、あるいはサイトゾル内へのペプチドの導入に焦点があてられていた。これらのアプローチは、ワクチンとしてのそれらの有用性を減少させうる制限を有する。レトロウイルスベクターは、組換えウイルスの複製能を維持しながら融合タンパク質として発現されうるポリペプチドのサイズおよび構造に対する制限を有し、後続の免疫化のためのワクチンなどのベクターの有効性が、該ベクター自体に対する免疫応答により損なわれる可能性がある。また、ウイルスベクターおよび修飾病原体は、ヒトにおけるそれらの使用を妨げる固有のリスクを有する。さらに、提示されるペプチドエピトープの選択は個々のMHC抗原の構造に左右され、したがってペプチドワクチンは、非近交系集団におけるMHCハロタイプの多様性のため、限られた有効性しか有さない可能性がある。 Benvenisty，N.およびReshef，L．[PNAS 83，9551-9555，(1986)]は、マウスの腹腔内（i.p.）、静脈内（i.v.）または筋肉内（i.m.）に導入したCaCl₂沈殿D NAが発現されうることを示している。CaCl₂処理をしないでDNA発現ベクターをi. m.注射した場合には、筋細胞によるDNAの取込み、および該DNAにコードされるタンパク質の発現が生じた。該プラスミドは、エピソーム的に維持され、複製されなかった。ついで、ラット、魚類および霊長類の骨格筋内およびラットの心筋内へのi.m.注射の後に持続性発現が認められている。核酸を治療剤として使用する技術は、WO90/11092（1990年10月４日）において報告されており、この報告では、脊椎動物にワクチン接種するために裸のポリヌクレオチドが使用されている。該方法の成功のためには、免疫化を筋肉内に行なうことは必ずしも必要ではない。ヒト成長ホルモン（HGH）をコードするDNAでコーティングされた金微粒子をマウスの皮膚に導入すると、該マウス内に抗HGH抗体が産生した。生きた動物の皮膚、筋肉、脂肪および乳房組識にトランスフェクトするために、ジェットインジェクターが使用されている。核酸を導入するための種々の方法が検討されている。マウスにおけるDNA：カチオニックリポソーム複合体の静脈内注射がクローン化トランスジーンの全身的発現を引き起こすことが、Zhuら[Sciencs 261:209- 211(1993年７月９日)]により示されている。Ulmerら[Science 259:1745-1749，( 1993)]は、インフルエンザウイルスタンパク質をコードするDNAの筋肉内注射による、インフルエンザウイルス感染に対する異種防御を報告している。病原体および腫瘍抗原に対する所望の免疫応答を惹起しうる特定の治療剤および予防剤に対する要求が、本発明により満たされる。この治療アプローチにおいて特に重要なのは、該抗原遺伝子の入手起源株に対して異種であるウイルス株によって引き起こされる感染または疾患でさえも予防しうるT細胞免疫応答を誘導する能力である。これは、HIVを取り扱う場合には特に重要である。なぜなら、このウイルスは、迅速に突然変異することが認められており、多数のビルレント分離株が同定されているからである[例えば、245個の異なるHIV分離株を同定しているLaR osaら，Science 249:932-935(1990)を参照されたい]。認められているこの多様性に対して、研究者らは、ペプチド免疫化に基づいてCTLを生成させることを試みている。例えば、Takahashiら[Science 255:333-336(1992)]は、HIVエンベロープ（gp160）決定基を認識する広域的交差反応性の細胞傷害性T細胞の誘導に関して報告している。しかしながら、それらの研究者らは、真に交差反応性のCTL 応答を得ることが困難であることを認めており、非常に厳密（stringent）なT細胞の初回抗原刺激または再刺激と、既に刺激されたCTLからのエフェクター機能（細胞傷害性を含む）の惹起とは二分されていると示唆している。 Wangらは、クローン化されたゲノム（未スプライス）HIV遺伝子の筋肉内接種による、HIVに対するマウスでの免疫応答の惹起に関して報告している。しかしながら、これらの研究で得られた免疫応答のレベルは非常に低かった。また、WangらのDNA構築物では、連続的なTat/rev-gp160-Tat/revコード配列をコードするHIVの実質的にゲノム片が使用されている。後記で詳しく説明するとおり、これは、gp160の高レベルの発現を得るための次善の系である。また、Tatの発現はカポジー肉腫の進行に寄与するため、それは潜在的に危険である。 WO93/17706は、ウイルスに対するワクチンを動物に接種するための方法を記載しており、この場合、担体粒子が遺伝子構築物でコートされており、該コート化粒子が動物の細胞内に導入されるのを促進する。HIVに関しては、実質的に全ゲノム（長末端反復を除く）を使用することが提案されている。その方法は、レシピエント（被投与者）に対して相当なリスクを示す。ワクチンの安全性を保証するためには、HIVの構築物はHIVゲノムの約50％未満を含有すべきであると一般に考えられている。これは、未知の又はほとんど理解されていない機能を有するものが大多数である酵素部分およびウイルス調節タンパク質が排除されることを保証する。このように、有用なヒトHIVワクチンを遺伝子運搬技術から得ようとすると、多く問題が残ってしまう。本発明は、タンパク質の発現を誘導するためにポリヌクレオチドを生きた組識内に導入するための任意の公知方法を熟慮する。しかしながら、本発明は、HIV および他のタンパク質を抗原プロセシング経路に導入してHIV特異的CTLおよび抗体を効率的に産生させるための新規免疫原を提供する。該医薬は、細胞性および体液性の両方の抗HIVおよびHIV中和免疫応答を誘導するためのワクチンとして有効である。本発明においては、それらの方法に関連したリスクを伴うことなく、動物内に導入されるとHIVタンパク質およびエピトープの効率的な発現を指令するポリヌクレオチド免疫原を提供することにより、前記の問題に対処し、それを解決する。このようにして生成した免疫応答は、HIVの認識、HIVの複製の阻害、 HIVに感染した細胞の同定および殺傷に有効であり、多数のHIV株に対して交差反応性である。生物のコドン対は、高度に非ランダムであり、生物によって様々多様である。所望のレベルの翻訳効率を有する改変または合成遺伝子を構築し発現させたり、どのゲノム内領域がタンパク質コード領域であるかを判定したり、異種遺伝子内に翻訳休止（translational pause）部位を導入したり、ヌクレオチド配列の関係または祖先起源を確認するために、この情報を用いる。形質転換生物内での外来異種遺伝子の発現は、現在では一般的である。例えばマウスおよびヒト遺伝子を含む多数の哺乳類遺伝子が、単細胞生物内に成功裡に挿入されている。これに関する標準的な技術には、発現させる外来遺伝子をプラスミド、ファージなどのベクター内へ導入したり、そのベクターを利用して該遺伝子を生物内に挿入することが含まれる。そのような遺伝子用の天然プロモーターは、一般には、該遺伝子を挿入する宿主に適合した強力なプロモーターで置換される。タンパク質配列決定装置は、天然タンパク質のアミノ酸配列の解明を、該タンパク質が少量であっても可能にする。これらのアミノ酸配列から、それらのタンパク質をコードするDNA配列を推定することができる。また、DNA合成は、急速に進歩しつつある技術であり、それらの推定DNA配列に対応する合成遺伝子を容易に構築することが可能である。発現系および組換えDNAに関する知見の急速な拡大にもかかわらず、外来または合成遺伝子を生物内で発現させることを試みる際には、重大な障害が依然として存在する。例えば、多数の天然の活性タンパク質は、それらが外来宿主内で発現される場合とは異なる様態でグリコシル化される。この理由により、多数の哺乳類遺伝子を発現させるためには、酵母などの真核性宿主の方が細菌性宿主より好ましいかもしれない。グリコシル化の問題は、研究継続中の課題である。もう１つの問題は、より不十分にしか理解されていない。合成遺伝子の翻訳は、強力なプロモーターと結びついた場合には、予想されるよりはるかに低い効率で進行することが多い。発現生物に対して異質の外因性遺伝子にも、しばしば同じことが当てはまる。該遺伝子が、回収可能な量の翻訳産物が産生される程度に十分に効率的に転写された場合であっても、該タンパク質が不活性であったり、あるいは天然タンパク質とは特性において異なることが多い。後者の問題は、一般には、種々の生物間におけるタンパク質のフォールディングの相違によるものであると認識されている。この問題の解決は依然として、とらえ所がなく、タンパク質のフォールディングを制御するメカニズムは十分には理解されていない。翻訳効率に関連した問題は、コドンコンテクスト効果（codon context effect s）に関連していると考えられている。すべての生物における遺伝子のタンパク質コード領域は多種多様な機能的制約にさらされ、それらのいくつかは、適切に機能するタンパク質ならびに適当な翻訳開始および終結シグナルをコードするための要件に依存する。しかしながら、これらの制約に関して容易には理解されない、タンパク質コード領域のいくつかの特徴が認識されている。そのような特徴の重要な２つのタイプとして、コドン使用頻度およびコドンコンテクストに関連したものが挙げられる。コドンの使用は非常に偏っており、異なる生物間でかなり差があることが知られている。コドン使用頻度パターンは、tRNAアイソアクセプターの相対存在量に関連していることが示されている。高い及び低い存在量のタンパク質をコードする遺伝子は、それらのコドン優先性（codon preferences）における相違を示す。コドン使用頻度の偏りがペプチドの伸長速度を変化させる可能性が、広く検討されている。コドン使用頻度の相違は翻訳速度の相違に関連しているが、翻訳に対するコドン選択の直接的な効果を証明することは現在のところ困難である。コドン使用頻度パターンに対する提案されている他の制約には、翻訳の忠実度の最大化、およびタンパク質合成の速度論的効率の最適化が含まれる。非ランダムなコドン使用とは別に、コドン／アンチコドン認識が該コドン自体以外の配列により影響される（「コドンコンテクスト（codon context）」と称される現象である）ことを示すかなりの証拠が蓄積されている。ナンセンスコドンおよびミスセンスコドンのサプレッションの効率に対する近傍ヌクレオチドの強い影響が存在する。明らかに、天然細菌集団におけるサプレッサー活性の豊富さ、およびセレノシステインおよびホスホセリンをコードするための「終結」コドンの使用のためには、終結がコンテクスト依存性であることを必要とする。同様のコンテクスト効果が、翻訳の忠実度および翻訳開始の効率に影響を及ぼすことが示されている。大腸菌(E．coli)のタンパク質コード領域の統計分析は、「コドンコンテクスト」のもう１つの現れ方を示している。ある１つの位置の或る特定のコドンの存在は、隣接コドン中の或るヌクレオチドの出現頻度に強い影響を及ぼし、これらのコンテクストの制約は、高い及び低いレベルで発現される遺伝子間で著しく異なる。該コンテクスト効果は認められているものの、コドンに隣接した好ましいヌクレオチドに関する統計規則の予測値は比較的低い。これは、所望のレベルの翻訳効率を達成するコドンを選択するためにそのようなヌクレオチド優先性データを利用することを制限している。自動ヌクレオチド配列決定装置の出現は、多種多様の生物に関する多量の配列データを入手することを可能にした。そのようなデータを理解することは、かなり困難である。例えば、遺伝子配列データをタンパク質配列と関連づけるためには、ゲノムのコード領域を同定することが重要である。また、ある生物のゲノムの祖先に、相当な関心が持たれる。いくつかの生物のゲノムは、種々雑多な祖先のものであることが公知である。ウイルス由来のいくつかの配列は、現在では、真核生物のゲノム内に安定に取込まれている。ウイルスの配列自体は、別の実質的に無関係な種に由来するものであった可能性がある。ある遺伝子の祖先の理解は、他の生物内の関連遺伝子とそれらの翻訳産物との間の適切な類似性を引き出す際に重要となることがある。翻訳に対するコドンコンテクスト効果の更に深い理解が必要とされており、また、望ましい任意の翻訳効果のための適当なコドンを決定するための方法が必要とされている。また、ヌクレオチド配列データからゲノムのコード領域を同定するための方法が必要とされている。また、タンパク質のフォールディングを制御するための方法、および外来遺伝子が宿主内で発現されると該外来遺伝子が適当にフォールディングすることを保証するための方法が必要とされている。所望の翻訳効率に従い改変または構築される遺伝子は、かなりの価値があるであろう。産業的および医薬的に関心が持たれるタンパク質の微生物による発現のための組換えDNA技術の実施のもう１つの態様は、「コドン優先性（codon preference ）」の現象である。遺伝的に形質転換された宿主細胞内での遺伝子発現のための既存の機構が、所望の一定の産物を構築するように「作動」することは、以前から認められていたが、挿入された外来遺伝子中に存在するアミノ酸を特定する遺伝暗号の特定の択一的（alternative）形態に応じて、微生物内で得られる発現のレベルが多様な変異を受ける可能性がある。４個の可能なヌクレオチド塩基の「トリプレット」コドンは、64個の異なる形態で存在することが可能である。これらの形態が、わずか20個の異なるアミノ酸（ならびに転写開始および終結）に関するメッセージだけしか与えないことは、いくつかのアミノ酸が２以上のコドンによりコードされている可能性があることを意味する。実際のところ、６個もの「縮重」した異なるコドンを有するアミノ酸もあれば、要求される単一のコドンしか有さないアミノ酸もある。完全には理解されていない理由により、択一的コドンは、種々の型の細胞の内因性DNA中に均一には存在せず、ある型の細胞における或るコドンに関して、可変性の自然階層（natural hierarchy）または「優先性（preference）」が存在するらしい。一例として、アミノ酸ロイシンは、CTA、CTC、CTG、CTT、TTAおよびTTG（それらは、それぞれ、mRNAコドンCUA、CUC、CUG、CUU、UUAおよびUUGに対応する）を含む６個のDNAコドンのいずれかにより特定される。微生物に関するゲノムのコドン出現頻度の徹底的な分析は、大腸菌（E．coli）の内因性DNAが、ロイシンを特定するコドンCTGを最も一般的に含有し、酵母および変形菌類のDNAが、ロイシンを特定するコドンTTAを最も一般的に含むことを示している。この階層を考慮すると、一般には、ロイシンに富むポリペプチドの大腸菌（E．coli）宿主による高レベル発現を得る可能性は、ある程度はコドン使用の頻度に左右されると考えられる。例えば、TTAコドンに富む遺伝子は、おそらく、大腸菌（E．coli）内では不十分にしか発現されず、一方、CTGに富む遺伝子は、多分、該ポリペプチドを高度に発現するであろう。同様に、酵母細胞が、ロイシンに富むポリペプチドの発現のための意図される形質転換宿主細胞である場合には、挿入するDNAにおいて使用するための好ましいコドンはTTAとなろう。組換えDNA技術にコドン優先性現象が関連していることは明らかであり、該現象は、成功裡に形質転換された宿主生物内で外因性遺伝子の高い発現レベルを達成することについてのこれまでの多数の失敗を説明するのに役立つ可能性があり、それほど「優先」しない（好ましくない）コドンは、挿入遺伝子内に繰返し存在している可能性があり、発現用の宿主細胞機構は、それほど効率的に機能しない可能性がある。この現象は、意図される宿主細胞に好ましいコドンを含むように設計された合成遺伝子が、組換えDNA技術の実施のための外来遺伝物質の好ましい形態を与えることを示唆している。真核細胞を典型づける機能の多様性は、それらの膜境界の構造的差異に依存する。これらの構造を生成し維持するためには、タンパク質が、小胞体内のその合成部位から、予め決められた目的地へ、細胞全体にわたり輸送されなければならない。このためには、輸送タンパク質が、主要輸送経路への進入点に位置する経路選択を行なう分子機構により認識されるソーティングシグナルを提示する必要がある。ほとんどのタンパク質に関するソーティングの決定は、それらがそれらの生合成経路を横断する際に１回だけ行われる必要がある。なぜなら、それらがそれらの機能を遂行する細胞位置であるそれらの最終目的地が、それらの永久的な存在位置となるからである。細胞内の完全性の維持は、１つには、正しい目的地へのタンパク質の選択的ソーティングおよび正確な輸送に依存する。過去数年にわたり、タンパク質のターゲッティングおよび局在化のための分子機構の分析が精力的に研究されている。「宛名標識（address label）」として作用しうるタンパク質上の一定の配列モチーフが同定されている。組識特異的プラスミノーゲンアクチベータータンパク質tPAなどのリーダーまたはシグナルペプチドは、小胞体およびゴルジ装置を介して細胞分泌経路内にタンパク質を輸送するように機能する。多数のソーティングシグナルは、リソソーム区画にタンパク質を導きうるジロイシンアミノ酸モチーフまたはチロシンに基づく配列などの膜タンパク質の細胞質ドメインと会合していることが判明している。HIVでは、ウイルス粒子の、細胞からの輸送および排出は、gag のアミノ末端の第２グリシン残基のミリストイル化に依存している。発明の概要 HIV gagおよびHIV gag修飾体をコードする合成DNA分子を提供する。該合成分子のコドンは、意図される宿主細胞にとって好ましいコドンを含む。該合成分子は、好ましい形態の外来遺伝物質を与える。該合成分子は、中和抗体および細胞性免疫を介してHIV感染に対する有効な免疫予防をもたらすポリヌクレオチドワクチンとして使用することができる。本発明は、霊長類、ヒトなどの哺乳類を含む脊椎動物内にインビボで直接導入されると該動物内でコード化タンパク質の発現を誘導するポリヌクレオチドを提供する。図面の簡単な説明図１は、HIV gag DNAでトランスフェクトされた後の293細胞系トランスフェクト体におけるgagおよびtPA gagの相対的発現を示す。図２は、マウスにおける、最適化されたHIV gagおよびtPA-gag DNAワクチン媒介性血清抗gag応答を示す。図３は、最適化されたHIV gagまたはtPA-gag DNAでワクチン接種した後にマウスから得た脾細胞の抗gag CTL応答を示す。図４は、最適化されたHIV gagまたはtPA-gag DNAでワクチン接種した後にマウスから得た脾細胞のgag抗原特異的サイトカイン分泌を示す。図５は、HIV p55 gag DNAでワクチン接種したマウスからの抗HIV gag CTLを示す。発明の詳細な説明 HIV gagをコードする合成DNA分子およびHIV gagの修飾体をコードする合成DNA 分子を提供する。該合成分子のコドンは、意図される宿主細胞にとって好ましいコドンを使用するように設計されている。該合成分子は、中和抗体および細胞性免疫を介してHIV感染に対する有効な免疫予防をもたらすポリヌクレオチドワクチンとして使用することができる。該合成分子は、免疫原性組成物として使用することが可能である。本発明は、霊長類、ヒトなどの哺乳類を含む脊椎動物内にインビボで直接導入されると該動物内でコード化タンパク質の発現を誘導するポリヌクレオチドを提供する。本発明で用いるポリヌクレオチドは、生きた脊椎動物細胞内に導入されると、該ポリヌクレオチドを含む遺伝子にコードされる翻訳産物を産生するよう細胞機構に指令しうる必須の調節要素を含有する核酸である。本発明の１つの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、転写プロモーターに作動的に連結された少なくとも１つのHIV遺伝子を含むポリデオキシリボ核酸である。本発明のもう１つの実施形態では、該ポリヌクレオチドワクチン（ PNV）は、真核細胞機構（リボソーム、tRNAおよび他の翻訳因子）による翻訳を受けやすい少なくとも１つのHIV遺伝子をコードするポリリボ核酸を含む。該ポリヌクレオチドにコードされるタンパク質が、病的状態以外ではその動物内に通常は存在しないもの（すなわち、異種タンパク質）、例えば、後天性免疫不全症候群（エイズ）の病原体であるヒト免疫不全ウイルス（HIV）に関連したタンパク質である場合には、該動物の免疫系は、防御免疫応答を引き起こすよう活性化される。これらの外因性タンパク質は該動物の組識により産生されるため、発現されたタンパク質は、関連生物（HIV）による実際の感染が生じるのと同様に主要組織適合系MHCによりプロセシングされる。その結果は、本開示において示すとおり、コグネイト（対応）病原体に対する免疫応答の誘導である。したがって、本発明者らは、生物学的系内に導入されるとHIV タンパク質およびエピトープの発現を誘導する核酸を製造した。誘導される抗体応答は、発現されるHIVタンパク質に特異的であり、かつ、HIVを中和する。また、HIV感染細胞を特異的に認識し破壊する細胞傷害性Tリンパ球が誘導される。本発明は、哺乳類組識内に導入されると、分離した遺伝子産物のインビボにおける単一細胞内での発現を誘導するポリヌクレオチドを使用する方法を提供する。本発明は、rev非依存性遺伝子を得るためにrev依存性HIV遺伝子の複数の操作を必要としない異なる解決手段を提供する。本明細書に記載のrev非依存性発現系は、それ単独で有用であり、単一の所望の遺伝子産物のインビボにおける単一細胞内での発現を示すための系である。本発明の適用の多くは抗ウイルスワクチン接種に応用されるため、該ポリヌクレオチドは、しばしば、ポリヌクレオチドワクチンまたはPNVと称される。これは、免疫刺激および抗腫瘍治療におけるこれらのポリヌクレオチドの追加的な有用性が本発明の範囲外とみなされることを意味するものではない。本発明の１つの実施形態では、HIV遺伝子産物をコードする遺伝子を発現ベクター内に取込ませる。該ベクターは、真核性 RNAポリメラーゼに認識される転写プロモーターおよび転写ターミネーター（HIV 遺伝子コード配列の末端に存在する）を含有する。好ましい実施形態では、該プロモーターは、イントロンA配列を有するサイトメガロウイルスプロモーター（C MV-intA）であるが、当業者は、強力な免疫グロブリンまたは他の真核性遺伝子プロモーターなどの他の多数の任意の公知プロモーターを使用することが可能であると認識するであろう。好ましい転写ターミネーターは、ウシ成長ホルモンターミネーターである。CMVintA-BGHターミネーターの組合せが特に好ましい。原核細胞内でのポリヌクレオチドの産生を補助するために、好ましくは、原核性プロモーターの転写制御下に抗生物質耐性マーカーを発現ベクター内に含有させて、該抗生物質の発現が真核細胞内で生じないようにする。アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子および他の医薬上許容される抗生物質耐性マーカーを使用することができる。原核生物内での発酵による該ポリヌクレオチドの高レベルの産生を補助するためには、該ベクターは原核性複製起点を含有し高コピー数のものであることが好都合である。多数の商業的に入手可能な原核性クローニングベクターが、これらの利点を与える。非必須DNA配列を除去することが望ましい。また、該ベクターが真核細胞内で複製能を有さないことが望ましい。これは、ポリヌクレオチドワクチン配列がレシピエントのゲノム内に組込まれる危険性を最小限に抑える。該ポリヌクレオチドの発現を或る特定の組識型に限定するのが望ましい場合には、組識特異的プロモーターまたはエンハンサーを使用することが可能である。１つの実施形態では、ラウス肉腫ウイルス（RSV）の長末端反復（LTR）をプロモーターとして使用する発現ベクターpnRSVを用いる。もう１つの実施形態では、CMVプロモーターおよびBGH転写ターミネーターが内部にクローニングされた突然変異pBR322ベクターであるV1を使用する。もう１つの実施形態では、V1および pUC19の要素を組合せて、V1Jと称される発現ベクターを得た。V1Jまたは別の望ましい発現ベクター内に、gp120、gp41、gp160、gag、pol、envなどのHIV遺伝子または抗HIV免疫応答を誘導しうる他の任意のHIV遺伝子をクローニングする。もう１つの実施形態では、アンピシリン耐性遺伝子をV1Jから除去し、ネオマイシン耐性遺伝子で置換して、V1J-neoを得た（本発明に従い使用するために、種々のHIV遺伝子がクローニングされている）。もう１つの実施形態では、該ベクターは、ユニークSfi1制限部位がV1J-neoの2114位の単一のKpn1部位内に改変処理されていることを除きV1J neoと同一であるV1Jnsである。ヒトゲノムDNA内のSfi1部位の頻度は非常に低い（100,000塩基当たり該部位は約１個）。したがって、このベクターは、抽出されたゲノムDNAの単なるSfi1消化により宿主DNA内への発現ベクターの組込みに関する注意深いモニターを可能にする。さらなる改良形態（refinement）においては、該ベクターはV1Rである。このベクターにおいては、非常に小型のベクターを得るために、可能な限り多くの非必須DNAが該ベクターから「除去」されている。このベクターは、V1Jnsの誘導体である。このベクターは、より大きなインサートの使用を可能にして、望ましくない配列がコードされる懸念を少なくし、細胞による取込みを最適化する。本発明の１つの実施形態では、実験室用に適合させたHIV株（例えば、IIIBまたはCAM-1）由来のHIV gagをコードする遺伝子を取込ませる。HIV-1由来の遺伝子と同様の機能を有するHIV-1またはHIV-2株の他の株に由来する遺伝子の使用は、HIV-1構築物に関して本明細書に記載のものと同様の免疫応答を生成させると予想される、と当業者は認識するであろう。これらの遺伝子を得るためのクローニングおよび操作の方法は、当業者に公知である。現在、多数のHIV株の多数の遺伝子の配列が、GENBANK上で公的に入手可能であり、HIVのそのような初代野外分離株は、これらの株を入手可能にするようQuali ty Biological，Inc.，[7581 Lindbergh Drive，Gaithersburg，Maryland 20879 ]と契約しているNational Institute of Allergy and Infectious Diseases（NI AID）から入手可能である。そのような株は、世界保健機関（WHO）[Network fo r HIV Isolation and Characterization，Vaccine Development Unit， Office of Research，Global Program me on AIDS，CH-1211 Geneva 27 ，Switerland]からも入手可能である。この研究から、当業者は、本発明の有用性の１つが、HIV配列の多様性とHIV中和の血清学との相互関係ならびに他のパラメーターをインビボおよびインビトロで試験し分析するための系を提供することであると認識するであろう。HIV株の初代分離株由来の遺伝子の取込みは、該ウイルスの臨床分離株に対する免疫応答を誘導し該分野で現在満たされていない要求を満たす免疫原を与える。さらに、ビルレント分離株が変化するにつれて、必要に応じて新たな配列を反映するように免疫原を修飾することができる。用語の一貫性が保たれるよう、ポリヌクレオチド免疫原構築物を表すために本明細書では以下の規約に従う：「ベクター名-HIV株-遺伝子-追加的要素」。該構築物に加える追加的要素については、後記で更に詳しく説明する。該ウイルスの病原株が変化するにつれて、該医薬への取込みに最適な厳密な遺伝子を変化させることが可能である。しかしながら、後記で示すとおり、異種株に対して防御しうるCTL応答が誘導されるため、本発明の免疫原およびワクチンにおいては、株変異性は、全ウイルスまたはサブユニットポリペプチドに基づくワクチンと比べて、それほど決定的に重要なものではない。また、該医薬は、新たな遺伝子を挿入するよう容易に操作されるため、分子生物学の標準的な技術により容易にこのような調節が行われる。本発明で用いる「プロモーター」なる語は、RNAポリメラーゼが結合するDNA鎖上の認識部位を意味する。該プロモーターは、RNAポリメラーゼとの開始複合体を形成して、転写活性を開始させ駆動する。該複合体は、「エンハンサー」と称される配列を活性化することにより、あるいは「サイレンサー」と称される配列を抑制することにより修飾することができる。本発明で用いる「リーダー」なる語は、構造遺伝子の5'末端の、該遺伝子と共に転写されるDNA配列を意味する。該リーダーは、通常、プロ配列と称されることがあるN末端ペプチド伸長を有するタンパク質を与える。細胞外媒体または膜へ分泌するように定められたタンパク質においては、一般には疎水性であるこのシグナル配列は、該タンパク質を小胞体内へ導き、それを該小胞体内から適当な目的地へ放出させる。本発明で用いる「イントロン」なる語は、遺伝子産物中のアミノ酸をコードしていない遺伝子の中間に見出されるDNAの区分を意味する。該イントロンの前駆体RNAは切り出されるため、それはmRNAに転写されず、また、タンパク質に翻訳されない。「カセット」なる語は、発現させようとする核酸配列を含有する本発明の配列を意味する。該カセットは、概念としてはカセットテープに類似している。各カセットは、それ自身の配列を有することになる。したがって、該カセットを交換することにより、該ベクターは異なる配列を発現することになる。5'および3'末端が制限部位になっているため、該カセットを容易に挿入したり、除去したり、あるいは別のカセットと置換することが可能である。「3'非翻訳領域」または「3’UTR」なる語は、構造遺伝子の3'末端の、通常は該遺伝子と共に転写される配列を意味する。この3’UTR領域は、通常、ポリA配列を含有する。3’UTRはDNAから転写されるが、それは、タンパク質に翻訳される前に切り出される。「非コード領域」または「NCR」なる語は、構造遺伝子の3'UTR領域に隣接した領域を意味する。NCR領域は、転写終結シグナルを含有する。「制限部位」なる語は、制限エンドヌクレアーゼの配列特異的切断部位を意味する。「ベクター」なる語は、宿主生物または宿主組識内にDNA断片を導入することを可能にする何らかの手段を意味する。プラスミド、バクテリオファージおよびコスミドを含む種々の型のベクターが存在する。「有効（な）量」なる語は、適当なレベルのポリペプチドを産生するのに十分なPNVを注射することを意味する。当業者には、このレベルが様々なものとなることが可能であると認識される。本発明を記載するために、HIVに関する以下の背景事項を説明する。ヒト免疫不全ウイルスは、リボ核酸（RNA）ゲノムを有する。本明細書に教示する方法に従うクローニングおよび操作のためにcDNAコピーを生成させるためには、このRN Aゲノムを当技術分野で公知の方法により逆転写しなければならない。該ゲノムの各末端には、プロモーターとして作用する長末端反復が存在する。これらの末端の間で、該ゲノムは、主要遺伝子産物としてgag-pol-envを種々のリーディングフレーム内にコードする。gagはグループ特異的抗原であり、polは逆転写酵素またはポリメラーゼである。別のリーディングフレーム内でこの領域にコードされているのは、例えばgp160からgp120およびgp41への翻訳後プロセシングを引き起こすウイルスプロテアーゼである。envはエンベロープタンパク質であり、vif はビリオン感染因子であり、revはビリオンタンパク質の発現の調節体であり、n efは負の調節因子であり、vpuはビリオン産生因子「u」であり、tatは転写のトランスアクチベーターであり、vprはウイルスタンパク質ｒである。これらの各要素の機能は、既に記載されている。本発明の１つの実施形態では、HIV gagタンパク質をコードする遺伝子を転写プロモーターに直接連結する。しかしながら、スプライシングされていない遺伝子は核から輸出されないため、gagの発現は、revの不存在下では抑制される。この系を理解するためには、HIVの生活環について更に詳しく説明しなければならない。 HIVの生活環においては、宿主細胞に感染すると、HIVRNAゲノムがプロウイルスDNAに逆転写され、それが単一の転写単位として宿主ゲノム内に組込まれる。L TRは、5'から3'方向へHIV遺伝子（gag、pol、env）を転写して全ゲノムの未スプライス化転写産物を形成するプロモーターを与える。該未スプライス化転写産物はmRNAとして機能し、それよりgagおよびpolが翻訳される。一方、envコード化遺伝子の翻訳のためには、一定のスプライシングが生じなければならない。調節遺伝子産物revが発現されるためには、１回を超えるスプライシング事象が生じなければならない。なぜなら、該ゲノム環境においては、図１に示すとおり、re vおよびenvが重複しているからである。envの転写が生じるためには、revの転写が停止しなければならず、その逆も成り立つ。また、未スプライス化RNAが核から輸出されるためには、revの存在が要求される。しかしながら、revがこのように機能するためには、rev応答要素（RRE）が転写産物上に存在しなければならない[Malimら，Nature 338:254-257(1989)]。本発明のポリヌクレオチドワクチンにおいては、完全にスプライシングされた遺伝子を与えることにより、ある種のHIV遺伝子の強制スプライシングが除かれる（すなわち、リーディングフレームの切替え又は非コード領域の除去を必要とすることなく、所望の遺伝子産物に関する完全なオープンリーディングフレームを与えること；ある特定の遺伝子のスプライシングの際には、生じる厳密な配列における或る程度の許容度が存在するが、機能的コード配列が得られる限り、これは許容される、と当業者は認識するであろう）。したがって、１つの実施形態では、gagの全コード配列がスプライシングされて、各遺伝子産物の断続的発現が全く不要となる。 HIVが集団内および感染個体において突然変異する傾向があると仮定すると、本発明により得られる二重の体液性および細胞性免疫応答はHIV感染の抑制に特に重要である。HIVに対する有効な防御ワクチンを製剤化するためには、例えばH IV上の主要中和標的であるgp160[envは、種々のHIV-1、クレイドB 株(これらは米国のヒト集団において優勢である)の間で約80％保存されている] に対する多価抗体応答、ならびにgp160の保存部分およびgagにコードされる内部ウイルスタンパク質に対して反応性の細胞傷害性T細胞を得るのが望ましい。本発明者らは、一般的な研究用株、感染集団内で見出される優勢な初代ウイルス分離株、交差株中和抗体エピトープを脱マスク化（unmask）するように設計された突然変異gp160、およびHIV分離株間で〜95％保存されている他の代表的なHIV遺伝子（例えば、gagおよびpol遺伝子）から選択されるgp160遺伝子を含むHIVワクチンを製造した。免疫不全状態にまでは進行していない実質的にすべてのHIV血清陽性患者が、抗gag CTLを保持しており、一方、これらの患者の約60％は、交差株gp160特異的 CTLを示す。しかしながら、エイズとして知られる病態にまで進行した感染個体内で見出されるHIV特異的CTLの量は、はるかに少なく、このことは、交差株CTL 応答の誘導が可能であるという本発明者らの知見の重要性を示している。本発明者らのenvおよびgagポリヌクレオチドワクチン構築物により誘導される免疫応答は、マウスおよび霊長類において示される。マウスにおいてenvに対する抗体産生をモニターすることにより、一定の構築物か適切に免疫原性である（すなわち、ワクチン接種された動物の大多数が抗体応答を示す）ことを証明することが可能になる。また、マウスは、本発明者らの構築物によりCTL誘導を試験するのに適した最も簡便な動物モデルとなるため、ある特定の構築物がそのような活性を与えうるか否かを評価するためにはマウスを使用する。サル（アフリカミドリザル、アカゲザル、チンパンジー）は、より大きな非げっ歯類動物における抗体評価のための追加的な種（霊長類を含む）となる。また、マウス血清においてはレトロウイルスに対する高レベルの内因性中和活性が認められるため、これらの種は、抗血清中和アッセイのためには、マウスより好ましい。これらのデータは、この系のための中和抗体の公知防御レベルに基づくチンパンジー／HIV IIIB攻撃モデルでの実験において防御を達成するのに十分な免疫原性が本発明者らのワクチンにより生じることを示している。しかしながら、科学界において現在持ち上がっており次第に受け入れられつつある防御の定義は、HIV感染からの完全な防御を示すいわゆる「根絶免疫（ste rilizing immunity）」から、疾患の予防へと変化しつつある。この目的には多数のものが相互関連しており、それらには、PCR、HIV逆転写酵素活性により、血清のサンプルの感染性により、p24または他のHIV抗原の血中濃度のELISAアッセイにより、CD4⁺T細胞濃度の増加および生存率の増加により測定した血中ウイルス力価の減少が含まれる［抗HIVワクチン効力に関する発展しつつある定義について検討するには、例えば、Cohen，J.，Science 262:1820- 1821，1993を参照されたい］。また、本発明の免疫原は、HIVの感染性（臨床、初代野外）分離株に対する中和免疫応答を生成させる。分泌されたtPA-gagまたは天然gagのどちらを発現する最適化gagワクチンベクターがgag特異的抗体の産生に有効であるかを判定するには、ELISAアッセイを使用する。本発明者らのワクチン接種用ベクターによるgag発現の最初のインビトロでの特徴づけは、最適化gagをトランスフェクトした細胞ライセートの免疫ブロット分析により得られる。これらのデータは、トランスフェクト細胞のgag発現を可視化するために抗HIV抗血清を使用して、gag発現を確認し定量する。ＣＴＬ応答の生成細胞内で合成されるウイルスタンパク質は、MHC I拘束CTL 応答を引き起こす。これらのタンパク質のそれぞれは、血清陽性患者においてCT Lを惹起する。また、本発明者らのワクチンは、マウスおよびアカゲザルにおいてCTLを惹起する能力を有する。マウス株の免疫遺伝学は、インフルエンザNPで示されるとおり、そのような研究に有用である［Ulmerら，Science259:1745-174 9，1993を参照されたい］。Balb/cマウスにおいてHIVタンパク質env、rev、nef およびgagに関していくつかのエピトープが明らかにされており（Frankel，F.R. ら，J．Immunol．155，4775-82(1995)）、したがってインビトロでのCTLの培養および細胞傷害性アッセイが容易になった。あるいは、gp160、gp120、polまたはgagをコードする全遺伝子を使用することが可能であろう。この件に関する追加的な概説としては、例えば、HIV Molecular Immunology Database 1995，Korb erら編，Los Alamos National Laboratory，Los Alamos，NM，USAを参照されたい。本発明で用いるT細胞エフェクター機能は、成熟T細胞の表現型、例えば、細胞傷害性、B細胞の活性化のためのサイトカイン分泌、および／またはマクロファージおよび好中球のリクルートメントまたは刺激に関連している。Ｔ_H活性の測定ワクチン接種した動物に由来する脾臓細胞培養を、組換えタンパク質またはペプチドエピトープの添加による特異的抗原に対する想起（recall）に関して試験する。付随する脾臓抗原提示細胞APCにより提示されるそのような抗原によるT細胞の活性化は、これらの培養の増殖により又はサイトカインの産生によりモニターする。また、サイトカイン産生のパターンは、T_H応答の１型または２型としての分類を可能にする。優勢（ドミナント）なT_Hの応答は、免疫低下血清陽性患者における細胞性免疫の排除と相関しているらしいため、患者において一定のPNV により引き起こされる応答の型を定めることが可能であり、得られた免疫応答を操作することが可能となる。前記の免疫学的研究に基づき、本発明者らのワクチンは、ビルレントHIVによる攻撃に対して脊椎動物において有効であると予想することができる。これらの研究を、HIV IIIB／チンパンジー攻撃モデルにおいて行なう。その前に、PNV構築物で、またはgp160 IIIB、gag IIIB、nef IIIBおよびREV IIIBよりなるPNV構築物のカクテルでこれらの動物に対して十分なワクチン接種を行なう。これに関しては、IIIB株が有用である。なぜなら、この株の致死量のチンパンジー力価が既に確立されているからである。しかしながら、任意のHIV株およびその与えられた株に特異的な又は異種であるエピトープを使用する同じ研究が意図される。チンパンジーの他のもう１つのワクチン接種／攻撃モデルは、scid-hu PBLマウスである。このモデルは、マウス宿主における後続のHIV攻撃による、ヒトリンパ球免疫系および本発明者らのワクチンの試験を可能にする。この系は、任意のHIV株との併用に容易に適合し、H IVの初代野外分離株の複数の株に対する防御の証拠を与えるため、有利である。もう１つの攻撃モデルは、ハイブリッドHIV/SIVウイルス（SHIV）を使用するものであり、該ウイルスのいくつかは、アカゲザルに感染して、死を招く免疫不全症を引き起こすことが示されている[Li，J.ら，J．AIDS 5:639-646，1992]。本発明者らのポリヌクレオチドワクチン構築物でのアカゲザルに対するワクチン接種は、致死量のSHIVでの後続の攻撃に対して防御的である。哺乳類細胞内での発現に関して最適化されたコドンを使用しないウイルス性および細菌由来の多数の遺伝子が存在する。この理由には、これらの微生物が、それら自身のポリメラーゼを与えたり、あるいはそれらの遺伝子産物の転写／翻訳を促進する特異的タンパク質または因子を与えるという事実が含まれる。細菌の場合、特異的tRNAに関する種々の相対的存在量が存在する可能性がある。明らかに、DNA ワクチンの場合におけるそのような遺伝子のインビボでの発現は、実質的に異なる。代表的な構築物成分には、HIV env、HIV gag、HIV pol、HIV rev、HIV vprおよびHIV nef；HIV以外の病原体により発現される抗原（例えば、インフルエンザウイルス核タンパク質、赤血球凝集素、マトリックス、ノイラミニダーゼおよび他の抗原性タンパク質などであるが、これらに限定されるものではない）をコードする遺伝子；単純ヘルペスウイルス遺伝子；ヒトパピローマウイルス遺伝子；結核抗原；A、BまたはC型肝炎ウイルス抗原が含まれるが、これらに限定されるものではない。後続のウイルス攻撃に対するポリヌクレオチドHIV免疫原の防御効力は、本発明の非増殖性プラスミドDNAでの免疫により示される。感染因子が全く関与せず、ウイルス粒子の集合が必要とされず、決定基選択が許容されるため、これは有利である。さらに、gagならびにプロテアーゼおよびその他のいくつかのウイルス遺伝子産物の配列は種々のHIV株間で保存されているため、クローン化遺伝子の入手起源株に対して同種であるビルレントHIV株および該起源株に対して異種である株による後続の攻撃に対する防御が可能となる。本発明は、自己複製因子またはアジュバントを必要とすることなく交差株防御免疫を誘導するための手段を提供する。また、本発明のポリヌクレオチドでの免疫は、多数の他の利点を与える。このワクチン接種アプローチは、腫瘍および感染因子に適用可能なはずである。なぜなら、CD8⁺CTL応答は、両方の病態生理学的過程に重要だからである[K．Tanakaら，Annu．Rev．Immunol．6，359(1988)] 。したがって、形質転換過程に決定的に重要なタンパク質に対する免疫応答の惹起は、癌の予防または免疫療法の有効な手段となる可能性がある。ウイルスタンパク質およびヒト成長ホルモンDNAを注射した後の発現タンパク質に対する高力価抗体の産生は、これが、単独で又は保存された抗原を標的とする細胞傷害性T リンパ球ワクチンと併用して、抗体に基づくワクチンを製造するための、簡便かつ非常に有効な手段であることを示唆する。 DNA構築物の製造および精製の容易さは、伝統的なタンパク質精製方法に比べて有利であり、組合せワクチンの作製を容易にする。したがって、複数の構築物、例えば、gp160、gp120、 gp41、gagまたは他の任意のHIV遺伝子をコードする構築物を製造し、混合し、共投与することができる。タンパク質の発現はDNAの注射後に維持されるため、B細胞およびT細胞の記憶の持続性を増強し、それにより長寿命の体液性および細胞性免疫を生成させることが可能である。 DNA構築物を製造し精製するための分子生物学の標準的な技術は、本発明のDNA 免疫原の製造を可能にする。したがって、分子生物学の標準的な技術は、本発明の生成物の製造に十分であり、一方、本明細書に開示する具体的な構築物は、驚くべきことに交差株および初代HIV分離株の中和を引き起こす新規ポリヌクレオチド免疫原を与え、これは、標準的な不活化全ウイルスまたはサブユニットタンパク質ワクチンで従来達成されなかった成果である。ワクチンレシピエントに導入する発現可能なDNAまたは転写されるRNAの量は、使用する転写および翻訳プロモーターの強度と、発現される遺伝子産物の免疫原性とに左右されるであろう。一般に、免疫学的または予防的に有効な用量である約1ng〜約100mg、好ましくは約10μg〜300μgを、筋組識内に直接投与する。また、皮下注射、皮内導入、皮膚を通過させる圧入（impression）、および腹腔内、静脈内または吸入運搬などの他の投与様式も意図される。また、追加抗原刺激（ブースター）ワクチン接種を行なうことも意図される。HIVポリヌクレオチド免疫原でのワクチン接種の後、gp160、gp120およびgag遺伝子産物などのHIVタンパク質免疫原で追加抗原刺激することも意図される。本発明のPNVの非経口導入と同時またはそれに続くインターロイキン12タンパク質の非経口投与、例えば静脈内、筋肉内、皮下または他の投与手段も有利である。該ポリヌクレオチドは、裸であること、すなわち、レシピエントの免疫系に影響を及ぼすいずれのタンパク質、アジュバントまたは他の物質とも会合していないことが可能である。この場合、該ポリヌクレオチドを生理的に許容される溶液（例えば、無菌溶液または無菌緩衝食塩水などであるが、これらに限定されるものではない）中に存在させることが望ましい。あるいは、該DNAを、DNA−リポソーム混合物として、リポソーム（例えば、レシチンリポソームまたは当技術分野で公知の他のリポソーム）と会合させることが可能である。あるいは、該DNAを、免疫応答を増強する当技術分野で公知のアジュバント（例えば、タンパク質または他の担体）と会合させることが可能である。また、DNAの細胞取込みを補助する物質（例えば、カルシウムイオンなどであるが、これに限定されるものではない）を有利に使用することができる。本明細書中では一般に、これらの物質を、トランスフェクション促進試薬および医薬上許容される担体と称する。ポリヌクレオチドでコーティングされた微小弾丸のコーティング技術は当技術分野で公知であり、それもまた、本発明に関連して有用である。以下の実施例は、例示として記載するものであり、本発明を何ら限定するものではない。実施例１ＨＩＶ後期遺伝子産物の異種発現 envおよびgagなどのHIVの構造遺伝子は、完全長タンパク質を効率的に産生するためにはHIV調節遺伝子revの発現を要する。本発明者らは、gagのrev依存的発現が低レベルのタンパク質を与え、rev自体が細胞に対して毒性となりうることを見出した。本発明者らは、gp160の比較的高レベルのrev依存的発現をインビトロで得ているが、このワクチンは、rev/gp160DNAでのインビボでの免疫後にgp16 0に対して低レベルの抗体を惹起した。これは、revの公知の細胞傷害性効果の結果、また、数百個の核を含有する筋細管内でrev機能を得る困難性の増大の結果（gagまたはenvタンパク質の発現が生じるためには、revタンパク質はrev依存的転写産物と同じ核内に存在する必要がある）である可能性がある。しかしながら、env 遺伝子の選択された修飾を用いてrev依存的発現を得ることが可能となっている。一般に、本発明者らのワクチンは、本発明者らの一般化ワクチン接種ベクター V1Jns[これは、CMV前初期（IE）プロモーター、BGHポリアデニル化部位およびpU Cバックボーンよりなる]内での発現の最適化のために、主にHIV(IIIB、MNまたは CAM-1)envおよびgag遺伝子を用いる。envの天然分泌リーダーペプチドを組識特異的プラスミノーゲンアクチベーター（tpA）遺伝子由来のものと置換し、得られたキメラ遺伝子をCMVIEプロモーター（CMVイントロンAを含有する）の背後で発現させることにより、rev非依存的発現の、使用する遺伝子セグメントの大きさに応じた（例えば、gp120対gp160）種々の効率を、envに関して得ることができる。前記のとおり、本発明者らは、この計画が成功する可能性を最大にするためには以下の目的の達成が不可欠であると考えている：（１）より強力な中和抗体応答を霊長類において生成しうるenvに基づくベクター、（２）霊長類においてCTLおよびヘルパーエフェクター機能により特徴づけられる強力なTリンパ球応答を惹起するgagおよびenvベクター、（３）本発明者らのワクチンにおける、およびそれが惹起する免疫応答（特に、初代分離株の中和）の特徴づけにおける、臨床的に関連したHIV-1株からのenvおよびgag 遺伝子の使用、（４）適当な最適化ワクチンを使用する、チンパンジー/HIV（II B）またはアカゲザル/SHIVなどの動物攻撃モデルにおける防御の証明、および（５）臨床的使用に適した免疫応答の持続時間の測定。これらの目的の最初の３つに関しては、著しい進展が得られており、gp160およびgagに関する本発明者らの最近のワクチン接種構築物がこれらの初期の結果を改善するか否かを判定するための実験が、現在進行中である。実施例２ワクチン製造用ベクターＡ．V1Jneo発現ベクターアンピシリンは大規模発酵には使用できない可能性があるため、V1Jを保持する細菌の抗生物質選択のために使用するamp^r 遺伝子を除去することが必要であった。V1JのPUCバックボーンからのamp^r遺伝子は、SspIおよびEam1105I制限酵素での消化により除去した。残存プラスミドをアガロースゲル電気泳動により精製し、T4 DNAポリメラーゼで平滑末端化し、ついで仔ウシ腸アルカリホスファターゼで処理した。トランスポゾン903に由来しpUC 4Kプラスミド中に含有されている商業的に入手可能なkan^r遺伝子を、PstI制限酵素を使用して切り出し、アガロースゲル電気泳動により精製し、T4 DNAポリメラーゼで平滑末端化した。この断片をV1Jバックボーンに連結し、kan^r遺伝子をいずれかの配向で有するプラスミドを誘導し、それらをV1Jneo#1および３と称することにした。これらのプラスミドのそれぞれを、制限酵素消化分析、結合領域の DNA配列決定により確認し、V1Jと同様の量のプラスミドを与えることが示された。また、これらのV1Jnepベクターでは、異種遺伝子産物の発現はV1Jに匹敵した。本発明者らは、V1J中のamp^r遺伝子と同じ配向でkan^r遺伝子を含有するV1Jneo# 3（以下、V1Jneoと称する）を発現構築物として、任意に選択した。Ｂ．V1Jns発現ベクター組込み研究を容易にするために、V1JneoにSfiI部位を付加した。商業的に入手可能な13塩基対のSfiIリンカー（NewEngland BioLabs）を、該ベクターのBGH配列内のKpnI部位に付加した。V1JneoをKpnIで線状化し、ゲル精製し、T4 DNAポリメラーゼで平滑化し、平滑SfiIリンカーに連結した。クローン単離体を、制限マッピングにより選択し、該リンカーを介した配列決定により確認した。その新規ベクターをV1Jnsと称することにした。V1Jns（SfiIを有する）中の異種遺伝子の発現は、V1Jneo（KpnIを有する）中の同じ遺伝子の発現に匹敵した。Ｃ．V1Jns-tPA 分泌および／または膜タンパク質に異種リーダーペプチド配列を付与するために、ヒト組識特異的プラスミノーゲンアクチベーター（tpA）リーダーを含むようにV1Jnを修飾した。２個の合成相補的オリゴマーをアニールさせ、ついでBglI Iで消化されているV1Jn中に連結した。これらのオリゴマーは、BglIIで切断された配列に対する連結に適合した突出塩基を有する。連結後、該土流BglII部位を破壊し、一方、該下流BglIIを後続の連結のために保有させた。該結合部位および全tPAリーダー配列の両方を、DNA配列決定により確認した。また、本発明者らのコンセンサス最適化ベクターV1Jns（＝SfiI部位を有するV1Jneo）に適合させるために、KpnI部位をT4 DNAポリメラーゼで平滑化し、ついでSfiIリンカー（カタログ#1138，NewEngland Biolabs）で連結することにより、SfiI制限部位をV1Jn-tPAのBGHターミネーター領域内のKpnI部位に配置した。この修飾は、制限消化およびアガロースゲル電気泳動により確認した。Ｄ．ベクターV1Rの製造本発明者らの基本的なワクチン接種ベクターの最適化を続けるために、本発明者らは、V1Rと称されるV1Jnsの誘導体を製造した。このベクターの構築の目的は、最小サイズのワクチンベクター（すなわち、これは、不必要なDNA配列を含有せず、V1JおよびV1Jnsが与える全体的な最適化異種遺伝子発現特性および高いプラスミド収量を依然として保有する）を得ることであった。本発明者らは、文献から及び実験により、（１）大腸菌（E．coli）複製起点を含むpUCバックボーン内の領域を、細菌からのプラスミド産生に影響を及ぼすことなく取り出すことが可能であること、（２）カナマイシンオープンリーディングフレームに続くkan^r 遺伝子の3'領域を、その代わりに細菌ターミネーターを挿入した場合には、取り出すことが可能であること、および（３）BGHターミネーターの3'側半分からの〜300bp（BGH要素内の元のKpnI制限酵素部位に続く）を、その調節機能に影響を及ぼすことなく取り出すことが可能であることを確認した。 CMVintAプロモーター／BGHターミネーター、複製起点およびカナマイシン耐性要素にそれぞれ相当するV1Jnsからの３個のDNAセグメントを合成するためにPCR を用いることにより、V1Rを構築した。該PCRオリゴマーを使用して、各セグメントに特有の以下の制限酵素部位を各セグメント末端に付加した：CMVintA/BGHにはSspIおよびXhoI、kan^r遺伝子にはEcoRVおよびBamHI、ならびにori^rにはBclIおよびSalI。これらの酵素部位を選択したのは、それらが、該PCR由来DNAセグメントのそれぞれの一定方向の連結と、それに続く各部位の喪失とを可能にするからである。すなわち、EcoRVおよびSspIは、連結に適合した平滑末端化DNAを残し、一方、BamHIおよびBclIは、SalIおよびXhoIの場合と同様に相補的な突出を残す。これらのセグメントをPCRにより得た後、各セグメントを前記の適当な制限酵素で消化し、ついで全３個のDNAセグメントを含有する単一の反応混合物中で共に連結した。ori^rの5'末端は、この領域内に通常存在するT2rho非依存性ターミネーター配列を含むように設計して、それがカナマイシン耐性遺伝子に終結情報を付与しうるようにした。該連結産物は、制限酵素消化（>8酵素）により及び該連結結合のDNA配列決定により確認した。V1R内のウイルス遺伝子を使用するDNAプラスミド産生および異種発現は、 V1Jnsと同様であるらしい。得られたベクターサイズの正味の減少は、1346bp（V 1Jns=4.86kb;V1R=3.52kb）であった。実施例３増加しgag遺伝子発現のための合成遺伝子セグメントの設計遺伝子セグメントを、同一翻訳配列を有するが択一的コドン使用頻度［J Mole c．Biol．Vol.183，pp.1-12(1985)(題名"Synthetic Oligonucleotide Probes De duced from Amino Acid Sequence Data:Theoretical and Practical Considerat ions")においてR．Latheが定義しているもの］を有する配列に変換した。HIV ga g遺伝子セグメントの発現を増加させるための以下に記載の方法は、哺乳類細胞内におけるこの遺伝子の効率的発現の公知の不可能性が全体的な転写産物の組成の結果であるという本発明者らの仮定に基づく。したがって、同一タンパク質配列をコードする選択的コドンを使用して、gagの発現に対する制限を排除する。用いる特異的コドン置換法は、以下のとおり説明される。 1．適切なオープンリーディングフレームのためのコドンの配置を確認する。 2．ヒト遺伝子による認められる使用頻度に関して野生型コドンを比較する。 3．コドンが最も一般的に用いられない場合には、それをヒト細胞内での高い発現のための最適なコドンで置換する。 4．完全な遺伝子セグメントが置換されるまで、この手順を繰返す。 5．これらのコドン置換により生成した望ましくない配列（例えば、「ATTTA」配列、イントロンスプライス認識部位の故意でない生成、望ましくない制限酵素部位など）に関して、新たな遺伝子配列を調べ、これらの配列を除去するコドンで置換する。 6．合成遺伝子セグメントを合体させ、改善された発現に関して試験する。これらの方法を用いて、HIV gag用の以下の合成遺伝子セグメントを作製して、発現のための最適コドン使用頻度を完全に含む遺伝子を作製する。前記の手法は、DNAワクチン用のコドン最適化遺伝子を設計するための本発明者らの方法の概要を定めるものであり、該方法の若干の変更により又は該配列の若干の変更により同様のワクチン効力または増加した遺伝子発現を達成することが可能であると当業者に理解されるであろう。実施例４Ｉ．HIV gag ワクチン構築物これは、最適なコドンを含む完全なHIV-1（CAM1）gag orfである。実施例５インビトロでのgagワクチンの発現トランスフェクトされたヒト横紋筋肉腫（RD）または293細胞において、これらの構築物に関してインビトロでの発現を試験した。トランスフェクトされた29 3細胞からのgagの定量は、V1Jns-opt-gagおよびV1Jns-tPA-opt gagベクターが分泌gag を産生することを示した。実施例６HIV-gag 細胞傷害性Tリンパ球に関するアッセイこの節に記載の方法は、ワクチン接種されたマウスに使用するアッセイを例示するものである。各動物の標的細胞として使用するための自己由来B細胞系を樹立しなければならないことを除き実質的に同様のアッセイを、霊長類で使用することができる。これは、エプスタイン・バーウイルスを使用してヒトに、また、ヘルペスBウイルスを使用してアカゲザルに行なうことができる。赤血球を白血球から分離するためにFicoll-Hypaque遠心を用いて、新たに採血した血液または脾臓から末梢血単核球分核（PBMC）を誘導する。マウスの場合には、リンパ節を使用することも可能である。IL-2（20U/ml）およびコンカナバリンA（2μg/ml）中で6〜12日間のインビトロ培養により又は照射された等数の抗原提示細胞を用いて特異的抗原を使用することにより、エフェクターCTLをPBMC から調製することができる。特異的抗原は、用いる動物のMHCハロタイプに関するCTL認識のための公知エピトープである合成ペプチド（通常、9〜15アミノ酸）、または適当な抗原を発現するように操作したワクシニアウイルス構築物よりなることが可能である。標的細胞は、CTLのインビトロ刺激に関して記載されているとおり適当な抗原を提示するように処理されている同系の又はMHCハロタイプが一致した細胞系であることが可能である。Balb/cマウスの場合には、照射された同系脾細胞を使用してインビトロでCTLを再刺激するために、Paterson（J ．Immunol.，1995）のgagペプチドを10μMの濃度で使用することが可能であり、また、細胞傷害性アッセイ中に標的細胞を感作するためには、該アッセイの前に約２時間、37℃でインキュベートすることにより、該ペプチドを1〜10μMで使用することが可能である。これらのH-2^dMHCハロタイプマウスの場合には、マウス肥満細胞腫細胞系P815が、優れた標的細胞となる。抗原で感作された標的細胞に Na⁵¹CrO₄をローディングし、標的細胞を37℃で1〜2時間インキュベートし（〜5x 10⁶個の細胞当たり0.2mCi）、ついで該標的細胞を数回洗浄することにより、CTL による殺傷に際して該Na⁵¹CrO₄が標的細胞の内部から放出される。CTL集団を、エフェクター対標的の種々の比（例えば、100：１、50：１、25：１など）で標的細胞と混合し、共にペレット化し、37℃で4〜6時間インキュベートした後、該上清を集め、ついでそれを、ガンマカウンターを使用して放射能の放出に関してアッセイする。細胞傷害性を、標的細胞からの自然放出を差し引いた標的細胞からの全放出可能計数（0.2％ Triton X-100処理を用いて得たもの）の割合（％）として計算する。実施例７HIV gag 特異的抗体に関するアッセイ基質抗原として特異的組換えp24gagタンパク質を使用して、HIVに対して産生させた抗体を検出するように、ELISAを設計した。96ウェルマイクロタイタープレートを、振とうプラットフォーム上で50μl/ウェルを使用するPBS（リン酸緩衝食塩水）溶液中2μg/mlの組換え抗原で4℃で一晩コートした。抗原は、組換え p24 gag（Intracell）よりなるものであった。洗浄バッファー（PBS/0.05% Twee n 20）を使用してプレートを４回リンスし、ついで、振とうしながら室温で１時間、200μl/ウェルのブロッキングバッファー（PBS/0.05％ Tween-20中の1％Ca rnationミルク溶液）を加えた。免疫前血清（pre-sera）および免疫血清を、所望の範囲の希釈度にてブロッキングバッファー中に希釈し、１ウェル当たり100 μｌを加えた。プレートを、振とうしながら室温で１時間インキュベートし、ついで洗浄バッファーで４回洗浄した。ついで、ブロッキングバッファー中で１：2000希釈した、ホースラディッシュペルオキシダーゼとコンジュゲートさせた二次抗体（抗アカゲザルIg，So uthern Biotechnology Associates;抗マウスおよび抗ウサギIgG，Jackson Immun o Research）を、100μl/ウェルで各サンプルに加え、振とうしながら室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄バッファーで４回洗浄し、ついで100m Mクエン酸バッファー（pH4.5）中1mg/mlのo-フェニレンジアミン（o-PD，Calbio chem）溶液を100μl/ウェルで加えることにより展開した。プレートを450nmの吸光度で速度論的に（反応の最初の10分）、そして10分および30分の終点で読取った（Thermo-maxマイクロプレートリーダー，Molecular Devices）。実施例８T 細胞増殖アッセイ PBMCを得、該PBMC集団内での増殖により測定される特異的抗原に対する想起応答に関して試験する。収穫前にインキュベーションの最後の18〜24時間にわたり該細胞培養に加える³H-チミジンを使用して、増殖をモニターする。セルハーベスターのフィルター上に遊離形態で保有されない同位体を静止細胞が取込まない間に増殖が生じた場合には、セルハーベスターはフィルター上に同位体含有DNAを保有する。げっ歯類または霊長類の種では、合計200μｌの完全培地（RPMI/10%ウシ胎仔血清）中、96ウェルマイクロタイタープレート中に4×10⁵細胞をプレーティングする。PBMCおよび培地だけを使用して、バックグラウンド増殖応答を測定し、一方、フィトヘマグルチン（PHA）またはコンカナバリンA（ConA）などのレクチンを1〜5μg/mlの濃度で陽性対照として使用することにより非特異的応答を生成させる。特異的抗原は、既知ペプチドエピトープ、精製タンパク質または不活化ウイルスよりなる。抗原濃度は、ペプチドでは1〜10μMであり、タンパク質では1〜10μg/mlである。レクチンで誘導された増殖は細胞培養インキュベーションの3〜5日目に最大になり、一方、抗原特異的応答は5〜7日目に最大になる。特異的増殖は、培地バックグラウンドの少なくとも３倍の放射能カウントが得られた際に生じ、しばしば、バックグラウンドに対する比率または刺激指数（SI）として示される。実施例９本発明者らが用いる方法は、HIVに対する[主として、HIV gag（〜95％保存されている）およびenv（gp160またはgp120；70〜80％保存されている）遺伝子産物に対する]細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答および中和抗体応答の両方を誘導するように設計する。gp160は、HIV粒子上の唯一の公知中和抗体エピトープを含有し、一方、抗envおよび抗gag CTL応答の重要性は、感染後のこれらの細胞性免疫の開始と一次ウイルス血症の排除（これは、中和抗体の出現前に生じる）との公知の関連性(Koupら，J．Virol．68:4650(1994))、および無症候状態の維持におけるCTLの役割により強調される。HIVは、その遺伝的多様性で良く知られているが、本発明者らは、臨床分離株由来のいくつかの代表的なenv遺伝子およびgp41 （〜90％保存されており、より保存された2F5中和エピトープを含有する）の両方を含めることにより、より広域性の中和抗体を得ることを望んでおり、一方、高度に保存されたgag遺伝子は、広域性の交差株CTL応答を生成するはずである。このワクチン方法は、非ヒト霊長類においてはHIVに対する強力な体液性および細胞性の両方の免疫を生成するため、このアプローチは、HIVに対する他の利用可能なワクチン接種法と比べて、特有の利点を与える。Ａ．HIV-1 gagポリヌクレオチドワクチンの開発ヒトでの発現のための最適コドンよりなる遺伝子を使用するHIV env遺伝子発現のための本発明者らの実験に基づき、〜350個（合計1500nt中）のサイレント突然変異を与えるすべての最適コドン使用頻度を含有する合成p55 gag遺伝子（o pt gag）を設計し、合成し、V1R中にクローニングした。また、HIV envに関して前記したものと同様のNH₂末端にtPAシグナルペプチドをコードする配列を含有し、野生型遺伝子中のこの位置に位置する核局在化配列モチーフを除去するもう１つの形態のopt gagベクターを構築した。ER/ゴルジ分泌経路内へのgagの正常な細胞内輸送パターンの改変がgag DNAワクチンの免疫原性を改変しうるか否かを試験することができるように、この修飾を設計した。gagに対するtPAリーダーペプチドの付加は、より高レベルのgagの分泌を引き起こし、該分泌タンパク質は、分子量（w.t.）gagより高い分子量の形態として移動した。これは、翻訳後修飾（おそらくグリコシル化）が、tPAリーダーペプチドでの修飾の結果として生じることを示している。２つの最適化p55 gag構築物（v1R-opt gag±tPAリーダー）またはV1R-gag（野生型）のいずれか１つで免疫したマウスを、１回の注射（ワクチン接種用量＝10、3.3または1μg/マウス）後に抗gagペプチドCTL応答に関して試験した。高レベルの抗gag CTLが、両方のV1R-opt gag DNAにより全ての用量で生成し、V1R-tPA-opt gagが最高特異的殺傷を与えた（〜85％@E/T＝１μｇ用量で3）。各DNA用量における細胞傷害性曲線の比較は、V1R-tPA-opt gagワクチン接種がV1R-gag（野生型）より〜100倍強力なCTL応答を生成することを示した。全体的に見て、それらの３つのワクチン群に関する免疫応答は、CTL、ヘルパーTおよび抗体応答に関して同じ相対効力を示し、最大応答から最低応答の順序に並べるとV1R-tPA-optgag>V1R-opt gag>V1Rgag（野生型）となった。要約すると、CTL、体液性およびヘルパーT細胞応答は、opt gag構築物（特に、tPAリーダーを有するもの）の場合に、はるかに高い。実施例10治療方法ヒト免疫不全ウイルスによる感染に対する治療的または予防的免疫化を要するヒトに、env、gagまたはpol遺伝子の全部もしくは一部またはそれらの組合せをコードするHIV DNAを注射する。該注射は、i.p.、皮下、筋肉内または皮内に行なうことが可能である。該 HIV DNAは、該免疫応答のプライマー（初回刺激抗原）として使用することができ、あるいは該免疫応答の追加刺激抗原として使用することができる。DNAの注射は、不活化HIV、弱毒化HIV、HIV由来タンパク質含有組成物またはそれらの組合せを含む医薬組成物を該ヒトに注射する前、それと同時またはその後に行なうことが可能である。実施例11治療方法ヒト免疫不全ウイルスによる感染に対する治療的治療を要するヒトを、抗HIV 抗ウイルス剤またはその組合せで治療する。治療されるその個体に、本発明のHI V DNA医薬組成物を注射する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 37/04 Ｃ０７Ｋ 14/16 43/00 １１１Ｃ１２Ｎ 7/04 // Ｃ０７Ｋ 14/16 Ｃ１２Ｒ 1:92）Ｃ１２Ｎ 7/04 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＡ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｒ 1:92）Ｃ１２Ｒ 1:92） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者デイビス，メアリー−エレン・エムアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者フリード，ダニエル・シーアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者リウ，マーガレツト・エイアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者ペリー，ヘレン・シーアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126

Claims

【特許請求の範囲】１．非哺乳類タンパク質をコードするDNA配列またはその断片を含んでなる合成ポリヌクレオチドであって、該DNA配列が、哺乳類宿主内での発現のために最適化されたコドンを含むことを特徴とする合成ポリヌクレオチド。２．該タンパク質が、HIVタンパク質、HSVタンパク質、HAVタンパク質、HBVタンパク質、HCVタンパク質、HPVタンパク質、HSVタンパク質、プラスモジウム（P lasmodium）タンパク質、マイコバクテリウム（Mycobacterium）タンパク質、ボレリア（Borrelia）タンパク質およびロタウイルスタンパク質から選ばれる、請求項１に記載のポリヌクレオチド。３．該タンパク質がHIVタンパク質である、請求項２に記載のポリヌクレオチド。４． DNA配列：（配列番号１）を有する、請求項３に記載のポリヌクレオチド。５．該ポリヌクレオチドが、HIVgag、gag-プロテアーゼまたはenv遺伝子産物をコードする遺伝子を含み、ヒト組識を含む脊椎動物組識内にインビボで導入されると抗HIV中和抗体、HIV特異的T細胞免疫応答または防御免疫応答を誘導する、請求項３に記載のポリヌクレオチド。６．脊椎動物において免疫応答を誘導するための方法であって、請求項１に記載のポリヌクレオチド1ng〜100mgを該脊椎動物の組識内に導入することを含んでなる方法。７．弱毒化病原体、不活化病原体、サブユニットワクチン、タンパク質ワクチンおよびそれらの組合せの投与を更に含む、請求項６に記載の方法。８．請求項３に記載のポリヌクレオチドおよび医薬上許容される担体および所望によりアジュバントを含んでなる、HIV感染に対する免疫応答を誘導するための免疫原性組成物。９．霊長類において抗HIV免疫応答を誘導するための方法であって、請求項３に記載のポリヌクレオチドを該霊長類の組識内に導入し、同時にサイトカインを非経口的に投与することを含んでなる方法。 10． HIV抗原に特異的なリンホカイン分泌を含むエフェクター機能として細胞傷害性およびヘルパーT細胞増殖を刺激するよう抗原提示細胞を誘導する方法であって、脊椎動物の細胞を請求項３に記載のポリヌクレオチドにインビボでさらすことを含んでなる方法。 11．請求項３に記載のポリヌクレオチドを抗HIV抗ウイルス剤と共に患者に投与することを含んでなる、治療を要する患者を治療する方法。 12．請求項１に記載のポリヌクレオチドを含んでなる医薬組成物。