DE102004037611B4

DE102004037611B4 - Induzierbare Genexpression

Info

Publication number: DE102004037611B4
Application number: DE102004037611A
Authority: DE
Inventors: Dr. Notka Frank; Diana Hammer; Prof. Dr. Wagner Ralf
Original assignee: Geneart AG
Current assignee: Thermo Fisher Scientific Geneart GmbH
Priority date: 2004-08-03
Filing date: 2004-08-03
Publication date: 2013-10-02
Anticipated expiration: 2024-08-04
Also published as: CN101035899B; CA2575480A1; EP1774008A2; US20110033429A1; CN101035899A; DE102004037611A1; WO2006013103A3; US8691533B2; JP2008507290A; WO2006013103A2

Abstract

Verfahren zur verbesserten induzierbaren Genexpression, umfassend (i) Bereitstellen einer zu exprimierenden Zielnukleinsäuresequenz, die für ein therapeutisches und/oder diagnostisches Protein oder ein virales oder retrovirales TDN-Protein kodiert, (ii) Modifizieren der zu exprimierenden Zielnukleinsäuresequenz so dass eine Steigerung der Expression erreicht wird, wobei die Zielnukleinsäuresequenz durch Anpassen des Kodongebrauchs oder des GC-Gehalts der zu exprimierenden Zielnukleinsäuresequenz oder durch Eliminieren von die Transkription negativ beeinflussenden Motiven an das Expressionssystem angepasst wird, (iii) operatives Verknüpfen der modifizierten Zielnukleinsäuresequenz mit einer induzierbaren Transkriptionskontrollsequenz, wobei für die induzierbare Transkriptionskontrollsequenz ein induzierbarer natürlicher viraler oder Virus abgeleiteter Promotor oder ein induzierbarer artifizieller Promotor verwendet wird, (iv) Exprimieren der modifizierten Zielnukleinsäuresequenz in einem geeigneten Expressionssystem durch einen transaktiven Faktor.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren für die induzierbare Genexpression, wobei eine zu exprimierende Zielnukleinsäuresequenz auf Nukleinsäureebene so modifiziert wird, dass eine Steigerung der Expression erreicht wird, und die so modifizierte Nukleinsäuresequenz unter der Kontrolle einer induzierbaren Transkriptionskontrollsequenz exprimiert wird.
Verschiedenste Viren sind auf einen aktiven Export ihrer unvollständig gespleißten Transkripte aus dem Zellkern der infizierten Wirtszelle angewiesen. Dies kann entweder über die Verwendung eines cis-ständigen RNA-Signals innerhalb der viralen Transkripte (konstitutive Transportelemente) erfolgen oder geschieht mit Hilfe viraler Proteine.
Cis-aktive Transportelemente werden beispielsweise von MPMV-CTE (Mason-Pfizer Monkey Virus constitutive transport element), SRV-CTE (Simian Retrovirus constitutive transport element), Hepatitis B-Virus PRE (posttranscriptional regulatory element) und HSV (Herpes Simplex Virus) (innerhalb des TK(Thymidinkinase)-Gens) verwendet. Diese RNA-Elemente rekrutieren zelluläre Faktoren und Exportwege, um den Kernexport der viralen Transkripte zu ermöglichen.
Alternativ dazu kann der Kernexport auch über einen Exportfaktor vermittelt werden, der spezifisch an eine Zielsequenz innerhalb der viralen Transkripte bindet und diese im Zusammenspiel mit zellulären Faktoren in das Zytoplasma transportiert. So werden beispielsweise Ad-5(Adenovirus 5)-Transkripte mit Hilfe der 34K- und E4orf6-Proteine, EBV(Epstein-Barr Virus)-Transkripte mit Hilfe des EB2-Proteins, Herpesvirus Saimiri-Transkripte mit Hilfe des ORF 57-Genproduktes, HSV-Transkripte mit Hilfe des ICP 27-Proteins, HTLV-I und II(human T-cell Leukemia Virus I und II)-Transkripte mit Hilfe der Rex-Proteine, EIAV(Equine Infectious Anaemia Virus)-, SIV(Simian Immunodeficiency Virus)-, und HIV-1 und HIV-2(human Immunodeficiency Virus 1 und 2)-Transkripte mit Hilfe der Rev-Proteine exportiert.
Am besten untersucht ist der HIV-1 Rev vermittelte Kernexport später HIV-1-Transkripte. Wie alle Lentiviren ist HIV-1 darauf angewiesen, aus nur einer proviralen Matrize mehrere Gene zu aktivieren und in einer zeitlich festgelegten Abfolge zu exprimieren. Durch alternative Spleißereignisse sowie weiteren, auf RNA-Ebene stattfindenden Regulationsmechanismen werden unterschiedliche Gene aus nur einem ~9 kb großen Primärtranskript generiert. Diese viralen Transkripte können aufgrund ihrer Größe in 3 Klassen aufgeteilt werden: ~9 kb ungespleißte (gag, pol, ~4 kb einfach gespleißte (env, vif, vpr, vpu) und ~2 kb mehrfach gespleißte (rev, tat, nef) RNAs.
Neben dem Auftreten von unvollständig bis mehrfach gespleißten Transkripten kann zudem eine zeitliche Abfolge in der Expression dieser unterschiedlichen RNA-Spezies beobachtet werden. So sind in der frühen Phase der Replikation im Zytoplasma der infizierten Zellen nur die mehrfach gespleißten ~2 kb RNAs, und ihre Genprodukte Rev, Tat und Nef nachweisbar. Erst zeitlich verzögert treten dort dann auch die un- (~9 kb) und einfach (~4 kb) gespleißten Transkripte und ihre Genprodukte Gag, Pol und Env in Erscheinung.
In Zellen, die mit Virus-Mutanten, denen ein aktives Rev-Protein fehlt, infiziert wurden, können die einfach- und nichtgespleißten Transkripte jedoch nie im Zytoplasma nachgewiesen werden. Die un- und einfach gespleißten Transkripte akkumulieren dann im Kern und die von ihnen translatierten späten Strukturproteine (Gag, Env) und Enzyme (Pol) können nicht gebildet werden. Das virale Rev-Protein ist also in essentieller Weise an der zeitlich regulierten Expression der viralen Gene beteiligt.
HIV-1 Rev, ebenso wie die oben aufgeführten RNA-Transportmoleküle, sind Shuttle-Proteine, die virale RNAs über die Wechselwirkung mit einer innerhalb viraler Transkripte gelegenen RNA-Zielsequenz diese aus dem Kern in das Zytoplasma transportieren. So bindet HIV-1 Rev im Kern spezifisch an seine RNA-Zielstruktur RRE, das ”Rev-responsive-element”. Diese 351 Nukleotide (nt) lange Region ist innerhalb des Env-Leserahmens lokalisiert und damit Bestandteil aller un- und einfach gespleißten Transkripte. Anschließend wird dieser Ribonukleoprotein(RNP)-Komplex über die Interaktion mit zellulären Faktoren aus dem Zellkern exportiert. Dazu ist eine C-terminal gelegene Leucin-reiche Sequenz notwendig, die als Kernexportsequenz NES (”nuclear export sequence”) die nukleäre Translokation des Rev-Proteins unter Verwendung zellulärer Mechanismen vermittelt (Pollard et al., 1998).
Immer noch umstritten ist der Grund, warum die späten Transkripte in Abwesenheit von Rev im Kern zurückbleiben, was eine notwendige Voraussetzung für die Rev-Abhängigkeit und damit die zeitlich regulierte Expression von gag, pol und env ist. Im Prinzip dominieren zwei alternative Vorstellungen zur Kernretention später Transkripte.
Es wird angenommen, dass ein zelluläres Transkript den Zellkern erst dann verlassen kann, wenn der Spleißprozess vollständig abgeschlossen ist, respektive alle aktiven Spleißstellen aus dem Primärtranskript entfernt worden sind. Bei den späten viralen Transkripten handelt es sich um Intron-haltige, nur unvollständig gespleißte pre-mRNAs, die mit Hilfe von Rev und RRE ins Zytoplasma transportiert werden. Deshalb wurde schon frühzeitig der Einfluss der zellulären Spleißmaschinerie auf die Kernretention der späten Transkripte untersucht (Mikaelian et al., 1996) (Kjems et al., 1991; Kjems et al., 1993; Chang et al., 1989; Powell et al., 1997; Lu et al., 1990; O'Reilly et al., 1995). Durch das Vorhandensein unterschiedlich aktiver Spleißstellen scheint der Spleißprozess bei HIV-1-Transkripten nur suboptimal zu erfolgen. Deshalb wurde von mehreren Gruppen die Hypothese aufgestellt, dass Rev den Export von Transkripten ermöglicht, die innerhalb der Spleißmaschinerie durch Ausbildung ineffizienter Spleißkomplexe festgehalten werden.
Konträr dazu konnte aber gezeigt werden, dass die späten HIV-1-Gene, wie beispielsweise env, auch in Abwesenheit von aktiven Spleißstellen in ihrer Expression reprimiert bleiben und damit der Einfluss der Spleißmaschinerie mehr indirekt zu sein scheint (Nasioulas et al., 1994). Daher wurden so genannte inhibitorische Sequenzen (INS) oder cis-aktive Repressor-Elemente (CRS) innerhalb der Leserahmen postuliert, welche die Expression negativ beeinflussen (Nasioulas et al., 1994; Olsen et al., 1992; Schwartz et al., 1992b; Maldarelli et al., 1991). Diese innerhalb der kodierenden mRNA gelegenen Repressor-Sequenzen besitzen jedoch kein gemeinsames Sequenzmotiv wie etwa das AUUUA-Instabilitätsmotiv innerhalb des 3'-UTR der instabilen GM-CSF mRNA (Chen et al., 1995), sondern fallen nur durch ihren durchweg hohen A/U Gehalt auf. So resultierte die Fusion der postulierten INS-haltigen Fragmente aus Leserahmen später Gene (wie gag und env) an ein CAT-Reportersystem in einer reduzierten Reporteraktivität (Cochrane et al., 1991; Rosen et al., 1988). Diese Reduktion der Expression von gag und pol konnte durch mehrfache stille Punktmutationen innerhalb der ”wobble”-Positionen teilweise wieder aufgehoben werden (Schwartz et al., 1992a; Schneider et al., 1997). Die un- und einfach gespleißten HIV-1 mRNAs scheinen also cis-aktive Repressor-Elemente zu besitzen, die entweder durch multiples Spleißen entfernt oder durch einen Rev/RRE vermittelten Kernexport überwunden werden.
Eine elegante Methode, um die Rev-Abhängigkeit von HIV-Transkripten zu umgehen, wurde von Schwartz und Schneider, wie bereits erwähnt, in Form einer partiellen Änderung des Leserahmens von HIV-Genen entwickelt. Eine konsequente Weiterführung dieses Konzeptes führte zur Synthese eines kodonoptimierten HIV-gag-pol-Gens unter Verwendung synthetischer Oligonukleotide (Wagner et al., 2000; Graf et al., 2000). Diese Form der Anpassung des G/C-Gehalts und des Kodongebrauchs an den von Säugerzellen ermöglichte eine konstitutive Synthese des Gag-Pol-Polyproteins in Säugerzellen in großen Mengen. Der zugrunde liegende Mechanismus dieser Abkopplung der Proteinsynthese von der Rev-Abhängigkeit ist ein veränderter Kernexport der mRNA. Während die HIV-Wildtyp-RNA auf einen alternativen, durch das Crm1-Protein charakterisierten Exportweg, in Abhängigkeit des HIV Shuttle-Proteins Rev, angewiesen ist, wird die synthetische mRNA auf dem regulären Kernexportweg für zelluläre mRNAs konstitutiv in das Zytoplasma transportiert. Diese konstitutive Expression von HIV-Proteinen eröffnet neue Wege für eine HIV-Therapieform auf genetischer Ebene.
Die Expression von anti-HIV-Genen in Zellen kann effizient für eine intrazelluläre Hemmung der HIV-Replikation genutzt werden (Bunnell et al., 1998). Inzwischen wurde eine ganze Reihe von HIV-Gentherapie-Strategien entwickelt, die von Antisenskonstrukten und RNA-Decoys über spezifische RNA-abbauenden Ribozyme und RNA interference bis zu transdominant-negativen, von HIV abgeleiteten Proteinen reichen. Neben diesen intrazellulären Hemmstoffen, die gezielt Schritte der HIV-Replikation stören, kann im Rahmen einer Gentherapie auch die Neuinfektion von Zellen oder die Verbreitung von Nachkommenviren verhindert werden. Verschiedene Ansätze befassen sich mit der Expression von sezernierbaren anti-HIV-Proteinen, immunstimulierenden oder unspezifische antiviralen Faktoren und nicht zuletzt mit der Expression von zelltoxischen Faktoren nach erfolgter Infektion (Übersicht siehe Mautino et al., 2002).
Neben diesen eher unspezifischen Hemmstrategien kann die Virusvermehrung durch eine Verhinderung der Virusfreisetzung auf sehr spezifische Weise, unter Verwendung HIV-eigener Proteinderivate erfolgen. Deletionen im Gag vermitteln einen transdominant-negativen (TDN) Effekt auf die Neubildung und Freisetzung von Nachkommenviren (von Poblotzki et al., 1993; Trono et al., 1989; Smythe et al., 1994; Furuta et al., 1997). Diese Deletionen liegen im p17MA, im Übergangsbereich von p17MA/p24CA und in der C-terminalen Domäne des p24CA. Der genaue Wirkmechanismus des transdominant-negativen Effektes ist nicht aufgeklärt. Einige Anhaltspunkte deuten jedoch auf einen Einfluss der reduzierten Cyclophilin A-Bindekapazität des mutierten p24CA (Chiu et al., 2002) und auf ein verändertes Membran Targeting, von der Plasmamembran zur ER Membran, bei Deletionen im p17MA (Facke et al., 1993; Gallina et al., 1994; Ono et al., 2004) hin. Da Gag ein sehr stark multimerisierendes Polyprotein ist und eine exakte Zusammenlagerung für die korrekte Ausbildung von HIV-Partikeln notwendig ist (Wilk et al., 2001), ist es naheliegend, dass TDN Gag-Deletionsderivate mit funktioneller Assembly Domäne (C-terminale Domäne des p24CA) durch eine Bindung an Wildtyp Gag-Proteine den Zusammenbau von HIV-Capsiden direkt beeinträchtigen und so nachweislich zu einer Hemmung der HIV-Replikation führen.
Gerade die letzte Strategie weist jedoch bei einer konstitutiven Protein-Expression einige Probleme auf. So kann die Expression des Fremdgens zu Zelltoxizität, einer Fehlregulation der zellulären Funktionen, einer Herabregulierung der Transkription und, gerade Im Fall eines von HIV abgeleiteten Proteins, zu einer unerwünschten Immunantwort führen (Smythe et al., 1994). Um diese Problematik zu umgehen, werden unterschiedliche Strategien verfolgt, die Expression des Transgens von einer HIV-Infektion abhängig zu machen.
In verschiedenen Ansätzen wurde eine Tat-, eine Rev- und eine Tat/Rev-abhängige Expression untersucht und teilweise die Hemmung der HIV-Vermehrung in vitro beschrieben (Caruso et al., 1992; Harrison et al., 1992; Liu et al., 1994). Übereinstimmend konnte die Expression von Thymidinkinase (Marcello et al., 1998) bzw. Interferon α2 (Ragheb et al., 1999) durch Tat um den Faktor 5 bzw. 4 und durch Rev um den Faktor 3,3 bzw. < 2 gesteigert werden. Die kombinierte Zugabe von Tat und Rev führte dagegen zu sehr unterschiedlichen Ergebnissen: Die Expression der Thymidinkinase war um den Faktor 7 erhöht, während für Interferon α2 eine Steigerung der Expression um den Faktor > 300 angegeben wurde. Für HIV-1 TDN Gag-Derivate konnte eine deutliche Rev-vermittelte Induktion der Proteinsynthese (bei geringer Basalaktivität) gezeigt werden, die mit einer weitgehenden Hemmung der HIV-Replikation (bis 94%) verbunden war (Smythe et al., 1994; Furuta et al., 1997). Für die Kombination von Tat- und Rev-abhängiger Expression von TDN Gag konnte ebenfalls eine deutlich erhöhte Proteinsynthese durch Kotransfektion von tat- und rev-Expressionsplasmiden erzielt werden (Ding et al., 2002; Cara et al., 1998). Hier zeigte sich jedoch, dass die Hemmung der HIV-Replikation nur partiell erfolgte (Cara et al., 1998) und nur durch Kombination mit verschiedenen Hemmstrategien auf ein hohes Niveau anstieg (Ding et al., 2002; Cara et al., 1998). Im Gegensatz dazu führte die LTR/Tat-induzierbare Expression von Suizidgenen, wie TK, mehrfach zu einer Hemmung der Virusreplikation (Marcello et al., 1998; Miyake et al., 2001; Ragheb et al., 1999).
Die Basalaktivität betreffend, ist übereinstimmend gezeigt worden, dass eine Abhängigkeit von Rev nicht zu einer absoluten Verhinderung der Proteinsynthese führt. Rev beeinflusst den Export der RNA aus dem Zellkern und ist nur in Verbindung mit entsprechenden cis-aktiven Rückhaltesequenzen (INS, siehe oben) und einer cis-ständigen Erkennungssequenz (RRE) funktionell. Isolierte und in ihrer Größe (und damit auch in der Größe der INS) reduzierte gag-Gene werden unter einem entsprechend aktiven Promotor (z. B. CMV) effizient transkribiert und es liegt nahe, dass ein gewisser Teil der RNA ohne die Unterstützung des Rev ins Zytoplasma gelangt und translatiert wird.
Für die Regulation durch LTR/Tat gibt es keine einheitlichen Daten. In den meisten Berichten wurde eine Basalaktivität der Gene unter LTR-Kontrolle beschrieben (Caruso et al., 1992; Ding et al., 2002; Muratori et al., 2002; Cara et al., 1998). Mögliche Erklärungen dieser Expression in Abwesenheit von Tat sind eine Aktivierung des LTR-Promotors durch TNFα, das aus den entsprechenden transduzierten Zellen sezerniert wurde (Muratori et al., 2002) oder Elemente des Vektorkonstrukts, die von HIV abgeleitet sind (Miyake et al., 2001).
Auch die Länge des verwendeten LTR kann einen Einfluss auf die Regulation haben. So wurde mit einem minimalen LTR eine komplette Abschaltung der Transkription in Abwesenheit von Tat nachgewiesen (Miyake et al., 2001), also ein ”dichter” induzierbarer Promotor beschrieben.
Für eine HIV-abhängige Transgen-Expression scheint daher das LTR/Tat-System das konsequentere Schaltermodul zu sein. Auch deswegen, weil eine Induktion durch Rev der durch Tat nachgeschaltet ist, was zu einer initialen Virusvermehrung führen kann, und zwar kurz bevor die Hemmung durch das Transgen greifen kann. So wird unter anderem die beobachtete unvollständige Hemmung der Replikation nach Rev-Induktion erklärt (Smythe et al., 1994).
Allerdings konnte für eine Tat-induzierbare Expression von transdominant-negativen (TDN) Gag-Derivaten, im Gegensatz zu Suizidgenen, bisher noch keine hinreichende Hemmung der HIV-Replikation nachgewiesen werden (siehe oben). Für diesen Mangel gibt es mehrere Erklärungsmöglichkeiten:

i) Die TDN-Wirkung korreliert mit der Menge des TDN-Proteins, d. h. es muss ein gewisses Limit überschritten werden, um eine wirkungsvolle Intervention zu erreichen. Die Proteinmenge ist aber in großem Maß abhängig von der Promotoraktivität. Diese ist im Vergleich zu hoch aktiven viralen Promotoren (z. B. CMV, SV40) im HIV-1 LTR relativ gering, also möglicherweise nicht ausreichend.
ii) Die bisher verwendeten TDN-Derivate sind vom HIV-1 Wildtyp-Genom abgeleitet, enthalten folglich INS-Motive und sind daher von einem Rev-vermittelten Kernexport abhängig. Wie oben beschrieben, setzt daher die eigentliche Hemmwirkung erst mit der Anwesenheit des REV im Zellkern ein, wodurch die ersten HIV-Transkripte ungehindert in das Zytoplasma gelangen und die Replikation vollenden können. Daher ist es nicht verwunderlich, dass eine Kombination aus beiden Regulationssystemen zu einer sehr ineffizienten Hemmung der HIV-Replikation führt (Cara et al., 1998).

Außer dem LTR-tat-System sind viele andere induzierbare virale Promotoren bekannt. Auch andere induzierbare Expressionssysteme sind im Stand der Technik bekannt. Oftmals kann jedoch mit einem induzierbaren System nicht der gewünschte Grad der Genexpression erreicht werden. Daher war es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes Verfahren zur induzierbaren Genexpression bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur induzierbaren Genexpression, umfassend

(i) Bereitstellen einer zu exprimierenden Zielnukleinsäuresequenz, die für ein therapeutisches und/oder diagnostisches Protein oder ein virales oder retrovirales TDN-Protein kodiert
(ii) Modifizieren der zu exprimierenden Zielnukleinsäuresequenz, so dass eine Steigerung der Expression erreicht wird, wobei die Zielnukleinsäuresequenz durch Anpassen des Kodongebrauchs oder des GC-Gehalts der zu exprimierenden Zielnukleinsäuresequenz oder durch Eliminieren von die Transkription negativ beeinflussenden Motiven an das Expressionssystem angepasst wird
(iii) operatives Verknüpfen der modifizierten Zielnukleinsäuresequenz mit einer induzierbaren Transkriptionskontrollsequenz, wobei für die induzierbare Transkriptionskontrollsequenz ein induzierbarer natürlicher viraler oder Virus abgeleiteter Promotor oder ein induzierbarer artifizieller Promotor verwendet wird,
(iv) Exprimieren der modifizierten Zielnukleinsäuresequenz in einem geeigneten Expressionssystem durch einen transaktiven Faktor.

Überraschenderweise hat sich gezeigt, dass die induzierbare Expression eines in einer zu exprimierenden Zielnukleinsäure kodierten Gens (nachfolgend auch Transgen) deutlich verbessert werden kann, wenn zum einen seine Sequenz auf Nukleinsäureebene zu einer Steigerung der Genexpression modifiziert wird und andererseits die Zielnukleinsäure unter der Kontrolle einer durch einen transaktiven Faktor induzierbaren Transkriptionskontrollsequenz exprimiert wird.
Eine induzierbare Genexpression ist z. B. bei der Verwendung von toxischen Genprodukten essentiell und hat bei anderen, therapeutisch einsetzbaren Genen gegenüber einer konstitutiven Expression entscheidende Vorteile:

– Eine nicht infizierte Zelle wird in ihrer physiologischen Leistung nicht durch eine hohe Expression zusätzlicher Faktoren unter Stress gesetzt.
– Unspezifische oder nicht absehbare Wechselwirkungen der Genprodukte könnten zu physiologischen Modifikationen, wie Aktivierung, Proliferation oder ähnlichem, auch bei benachbarten Zellen, in Geweben oder im gesamten Organismus führen.
– Von HIV stammende Proteine werden im Umfeld einer HIV-Infektion von Immunzellen erkannt und die entsprechenden Protein-exprimierenden Zellen eliminiert.
– Im Fall von toxischen Faktoren muss eine konstitutive Produktion vermieden werden.

Eine Transkriptionskontrollsequenz ist eine Nukleinsäuresequenz, welche die Expression einer damit operativ assoziierten Nukleinsäuresequenz, insbesondere eines Gen, ermöglicht. Es kann sich hierbei um einen Promotor handeln, zusätzlich kann die Transkriptionskontrollsequenz auch weitere Elemente umfassen, wie etwa Enhancer und dergleichen. Vorzugsweise handelt es sich bei der induzierbaren Transkriptionskontrollsequenz um einen induzierbaren Promotor. Hierbei ist grundsätzlich jedes induzierbare Promotorsystem geeignet, das im Stand der Technik bekannt ist. Es kann beispielsweise ein natürlicher oder artifizeller induzierbarer Promotor verwendet werden, beispielsweise ein durch Tetracyclin induzierbarer Promotor (Tet on/Tet off-System). Des Weiteren kann aber auch ein induzierbarer viraler Promotor verwendet werden.
Vorzugsweise ist die induzierbare Transkriptionskontrollsequenz durch einen viralen transaktiven Faktor induzierbar. Eine virale induzierbare Transkriptionskontrollsequenz, die durch einen viralen transaktiven Faktor induzierbar ist, kann von einem beliebigen Virus abgeleitet sein. Vorzugsweise werden hierfür Sequenzen von Retroviren, HCV (Hepatitis C-Virus), HBV (Hepatitis B-Virus), HSV (Herpes simlex-Virus), EBV (Epstein-Barr-Virus), SV40 (Simian-Virus 40), AAV (Adeno-assoziierter Virus), Adenovirus, Papillomviren oder Ebolavirus verwendet. Die hierbei verwendeten transaktiven Faktoren sind demgemäß z. B. ausgewählt aus den folgenden viralen Faktoren, jedoch nicht beschränkt auf diese: NS5A (HCV), HB X (HBV), VP16/ICP4 (EBV), EBNA1/Rta (EBV), ART (HHV8), Large T-Antigen (SV40), Rep78/68 (AAV), E1A (Adenovirus), E2 (Papillomvirus) und VP30 (Ebolavirus).
Als induzierbare Transkriptionskontrollsequenz, die durch einen viralen transaktiven Faktor induzierbar ist, wird vorzugsweise ein retroviraler LTR-Promotor oder eine funktionelle Teilsequenz davon verwendet. Vorzugsweise ist daher der transaktive Faktor ein retrovirales Tat oder Tax Protein. Der LTR-Promotor kann ausgewählt sein aus den LTRs von HIV-1, HIV-2, SIV, HTLV und anderen verwandten Retroviren, die LTR-Promotoren aufweisen. Insbesondere sind lentivirale Promotoren bevorzugt, insbesondere die von HIV.
Zur Verbesserung der Genexpression wird die zu exprimierende Zielnukleinsäuresequenz modifiziert. Dies geschieht auf Nukleinsäureebene und bevorzugt so, dass die entsprechende Aminosäuresequenz nicht oder im wesentlichen nicht verändert wird. Wird die Aminosäuresequenz bei der Modifikation der Nukleinsäuresequenz zur Erhöhung der Genexpression verändert, so sollte dies keinen Einfluss auf die Funktion des resultierenden Proteins haben.
Die Modifikation der Zielnukleinsäuresequenz zur Erhöhung der Genexpression kann auf mehrere Arten durchgeführt werden.
Zum einen ist es möglich, den Kodongebrauch des Transgens an das verwendete Expressionssystem anzupassen. Ein eukaryontisches Expressionssystem, insbesondere eines auf Säugerbasis ist bevorzugt, insbesondere handelt es sich hierbei um Säugerzellen, vorzugsweise humane Zellen. Daher wird der Kodongebrauch des Transgens vorzugsweise an den Kodongebrauch von Säugerzellen, stärker bevorzugt den von humanen Zellen, angepasst.
Erfindungsgemäße und vorzugsweise für die Gentherapie geeignete modifizierte Zielnukleinsäuresequenzen lassen sich beispielsweise erzeugen, indem man die Kodonverteilung so wählt, wie sie in exportierter zellulärer mRNA auftritt. Bevorzugt soll hierbei eine Kodonwahl verwendet werden, wie in sie Säugerzellen am häufigsten oder am zweithäufigsten verwendet wird (Ausubel et al., 1994), noch mehr bevorzugt wird die Kodonwahl an die von aktiv exprimierten Säugergenen angepasst. Vorzugsweise wird die Nukleinsäuresequenz unter Verwendung der Gene Optimizer-Technologie (deutsche Patentanmeldung DE 102 60 805.9 , PCT/EP03/14850 ) für eine optimale Expression in Säugetieren modifiziert.
Anstelle der oder auch zusätzlich zur Anpassung der Kodonwahl, ist es aber auch möglich, den GC-Gehalt zu optimieren. Vorzugsweise wird dies erreicht, indem der GC-Gehalt des Transgens so genau wie möglich an den GC-Gehalt des verwendeten Expressionssystems angepasst wird. Dabei wird vorzugsweise die Degeneration des genetischen Codes ausgenutzt, sodass die Änderung der Nukleinsäuresequenz zwecks Erhöhung des GC-Gehalts nicht zu einer Änderung der Aminosäuresequenz führt. Der optimale Prozentsatz an G und C Nukleotiden in einer zu exprimierenden Sequenz hängt, wie bereits erwähnt, von dem jeweiligen Organismus, bzw. den jeweiligen Zellen ab, in denen die Sequenz exprimiert werden soll. Beispielsweise liegt der optimale GC-Gehalt bei Nukleinsäuren in Säugerzellen bei etwa 50%. Es gibt bereits Referenzdokumente, in denen der Fachmann den optimalen GC-Gehalt für verschiedene Organismen bzw. Zellen nachschlagen kann Es existiert die regelmäßig aktualisierte Codon Usage Database unter www.Kazusa.or.jp/codon/ von Y. Nakamura am Kazusa DNA Research Institute, siehe auch Nakamura, Y. et al. (2000) Nucl. Acids Res. 28, 292. Es ist dann für den Fachmann kein Problem, die Nukleinsäuresequenz der zu exprimierenden Zielnukleinsäure bezüglich des GC-Gehalts zu optimieren.
Die Optimierung des GC-Gehalts oder die Anpassung des Kodongebrauchs erfolgt vorzugsweise durch stumme Mutationen oder durch Mutationen, die die Aktivität des vom Transgen kodierten Proteins nicht beeinflussen. Der Kodongebrauch muss nicht unbedingt angepasst werden, wenn der GC-Gehalt des besagten Gens bereits über 50% beträgt. Gene mit vom Wildtyp abweichenden Kodongebrauch können, wie im Beispiel angegeben, aus langen Oligonukleotiden mit einer schrittweisen PCR hergestellt werden.
Eine weitere Möglichkeit, die zu exprimierende Zielnukleinsäuresequenz zwecks Verbesserung der Expression zu modifizieren, besteht darin, entweder anstelle der obigen Möglichkeiten oder zusätzlich dazu, Motive gezielt zu eliminieren, welche die Transkription negativ beeinflussen. Dies umfasst z. B. die Deletion von Nukleinsäuremotiven wie etwa poly-A Sequenzen und dergleichen, die dem Fachmann bereits bekannt sein dürften.
Die zu exprimierende Zielnukleinsäuresequenz kodiert vorzugsweise für ein therapeutisches und/oder diagnostisches Protein. Ein solches Protein kann z. B. ausgewählt sein aus toxischen Genprodukten, Suizidfaktoren, Apoptose induzierenden Proteinen, Botenstoffen, transaktiven Faktoren, Regulatorproteinen, transdominant-negativen Proteinen, Cytokinen, Chemokinen etc. Spezifische Beispiele sind Interferon α, SDF-I RANTES, MIP1α, TNF und Interleukine, insbesondere die Interleukine 2, 6, 10, 12, 15 und 28. Vorzugsweise kodiert die zu exprimierende Zielnukleinsäuresequenz für ein Gen, das bei Verwendung des LTR/Tat-Systems, z. B. nach Aktivierung durch HIV-Infektion Proteine produziert, die geeignet sind, die natürlichen Abwehrmechanismen benachbarter Zellen zu induzieren oder durch Bindung an die entsprechenden Rezeptoren eine Infektion mit HIV zu verhindern. Bei HIV sind dies insbesondere die Rezeptoren CD4, CCR5 oder CXCR4.
Weitere Beispiele sind Enzyme, wie z. B. Thymidinkinase, Cytosindeaminase, Purin Nukleosid Phosphorylase, Carboxypeptidase, Carboxylesterase, Nitroreductase, Peroxidase, Xanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase, Glykosidase, Thymidinphosphorylase und dergleichen.
Besonders geeignet ist das Verfahren für die Expression von toxischen Genprodukten, z. B. Thymidinkinase aus Herpesviren, Nukleasen oder Apoptose-induzierende Proteine (z. B. FAS/FAS-Ligand, Kaspasen etc.). Neben den Kaspasen sind auch TNF-related Apoptosis-Inducing Ligand (TRAIL), Proteinkinase C (PKC), Tumornekrosefaktor (TNF), Apoptosis-Inducing Factor (AIF) und dergleichen geeignet. Nach Infektion mit HIV würde in diesem Fall die Expression von Genen induziert, die Zellen schädigen und somit die neue Produktion und Verbreitung von Nachkommenviren verhindern.
Weiterhin kann es sich bei dem Transgen um ein Regulatorgen handeln, das nach seiner induzierten Expression in einer Zelle als molekulares Schaltermolekül die Expression anderer Gene an- oder abschaltet. Als solches Regulatorgen kann beispielsweise ein Gen verwendet werden, das für einen Transkriptionsfaktor kodiert. Natürlich sind diese Anwendungsmöglichkeiten nicht auf die Infektion mit HIV beschränkt, der Fachmann ist in der Lage, entsprechende Systeme auch für andere Infektionen zu verwenden.
Weiterhin kann es sich bei der zu exprimierenden Zielnukleinsäuresequenz auch um ein Gen für ein transdominant-negatives (TDN) Protein handeln. Vorzugsweise handelt es sich dabei um ein virales TDN Protein, vorzugsweise ein retrovirales, am meisten bevorzugt ein lentivirales.
Insbesondere sind hierbei lentivirale TDN Proteine geeignet, z. B. Derivate von Pr55^gag, Gp41, Gp120, Rev, Protease, Integrase, Reverse Transkriptase, Nef, Vpr, Vpv oder jedes andere Lentivirus-Protein, das dazu geeignet ist, den Replikationszyklus von Lentiviren, insbesondere HIV zu unterbrechen oder die Freisetzung/Ablösung von Viruspartikeln zu verhindern.
Vorzugsweise wird HIV-1 gag (gruppenspezifisches Antigen) als Transgen verwendet, wobei dessen Kodonwahl an die Kodonwahl, wie sie in humanen Genen vorzufinden ist, angepasst wird.
Besonders bevorzugt wird ein gag-Gen verwendet, das weitere Deletionen enthält. Dies kann die TDN Wirkung noch verstärken. Vorzugsweise handelt es sich dabei um weitere Deletionen im p24-Bereich oder einzelne oder mehrere Assembly-Domänen.
Beispielsweise wurde die Aminosäuresequenz des gag-Genprodukts in einen synthetischen Gag-kodierenden Leserahmen, unter Verwendung der Kodonwahl von humanen Genen, rückübersetzt. Dieser „syngag” benannte Leserahmen wurde dann unter Verwendung von langen Oligonukleotiden und einer schrittweisen PCR als vollsynthetischer Leserahmen aufgebaut. Anschließend wurde der syngag-Leserahmen in einen Expressionsvektor einkloniert. Der hergestellte syngag-Vektor erwies sich in der Expression des HIV-Gag als vollständig unabhängig von der Präsenz des Rev-Proteins, einer RRE-Sequenz, einer 5' untranslatierten Region (UTR) oder Spleißstellen. Das Ausgangs-gag-Gen, welches in seiner Kodonwahl dem HIV-1 Wildtyp-Gen entspricht (wtgag), erwies sich in seiner Expression dagegen als abhängig von Rev, RRE und dem 5'-UTR inklusive Spleißdonor (Graf et al., 2000).
Des Weiteren betrifft die Erfindung daher vorzugsweise ein Verfahren zur Expression von transdominant-negativen (TDN) Lentivirus-Proteinen in eukaryontischen Zellen, umfassend:

(a) Einbringen eines Vektors, umfassend eine zu exprimierende Zielnukleinsäuresequenz, die für ein TDN Lentivirus-Protein kodiert und deren Kodongebrauch an den von Säugern angepasst ist, und eine durch Lentivirus Tat-Protein induzierbare Promotorsequenz in operativer Verknüpfung mit der Zielnukleinsäuresequenz, in eine eukaryontische Zelle, (b) Bereitstellen des Tat-Proteins so dass eine Expression der Zielnukleinsäuresequenz induziert wird.

Überraschenderweise kann LTR/Tat-System trotz der genannten Limitation angewendet werden, wenn, wie oben beschrieben, die Expression des TDN-Derivats von Rev/RRE unabhängig ist. In der vorliegenden Erfindung wird dies erreicht durch die Anpassung des Kodongebrauchs an den von Säugerzellen.
In der Kombination von LTR- und synthetischen HIV-Leserahmen verbindet sich eine frühe Expression des TDN-Gens – in einer frühen Phase der HIV-Infektion – mit einem effizienten Kernexport (plus einer RNA-Stabilisierung) und damit einer Proteinbiosynthese, bevor HIV-eigene Struktur- und damit Targetproteine produziert werden. Insgesamt bietet diese Kombination i) eine hohe TDN-Proteinmenge mit ii) einem kinetisch günstigen Expressionsverlauf und iii) einer sehr effizienten Induzierbarkeit.
In Abgrenzung zu den bisher beschrieben Verfahren ist i) die Induzierbarkeit der Expression auf die Anwesenheit von Tat beschränkt, wodurch die Notwendigkeit des HIV RRE/Rev im Transferkonstrukt vermieden wird und ii) die Rev-Unabhängigkeit des Transkripts durch eine geeignete Kodonwahl für das Transferkonstrukt gewährleistet.
Die Transkriptionskontrollsequenz wird zum Transgen bevorzugt analog zum natürlichen Auftreten positioniert.
Die Induzierung des Promotors erfolgt durch ein lentivirales Tat-Protein, vorzugsweise durch das HIV Tat-Protein, das als trans-aktiver Faktor fungiert. Dies ermöglicht es, dass eine Induzierung des Promotors, durch eine Infektion der Zelle, die den Vektor enthält, mit einem Lentivirus, insbesondere HIV, von selbst eintritt. Unter einem solchen in trans aktiven Faktor wird im Sinne dieser Anmeldung sowohl ein einzelnes Protein als auch ein Proteinkomplex verstanden.
Die Stabilisierung der RNA und die Verbesserung der Kernexporteigenschaften sowie die Unabhängigkeit der Proteinproduktion von einer RRE/Rev-Wechselwirkung (im Fall von HIV-abgeleiteten Proteinen) kann beispielsweise erreicht werden durch eine entsprechende Kodonwahl, unter Berücksichtigung RNA-Stabilität-beeinflussender Motive.
Weiterhin betrifft die Erfindung einen Nukleinsäure-Vektor umfassend:

(a) eine zu exprimierende Zielnukleinsäuresequenz, die für ein therapeutisches und/oder diagnostisches Protein und/oder ein TDN Virus Protein kodiert,
(b) eine durch einen transaktiven Faktor induzierbare Transkriptionskontrollsequenz, wobei für die induzierbare Transkriptionskontrollsequenz ein induzierbarer natürlicher viraler oder Virus abgeleiteter Promoter oder ein induzierbarer artifizieller Promoter verwendet wird, in operativer Verknüpfung mit der zu exprimierenden Zielnukleinsäuresequenz,

wobei die Sequenz gemäß (a) auf Nukleinsäureebene durch Anpassung der Zielnukleinsäuresequenz durch Anpassen des Kodongebrauchs oder des GC-Gehalts der zu exprimierenden Zielnukleinsäuresequenz oder durch Eliminieren von die Transkription negativ beeinflussenden Motiven an das verwendete Expressionssystem so modifiziert ist, dass eine Steigerung der Expression erreicht wird.
Unter einem Nukleinsäure-Vektor wird in diesem Zusammenhang ein Nukleinsäure-Konstrukt verstanden, welches zur Expression einer darauf enthaltenen Zielnukleinsäuresequenz in einem geeigneten Expressionssystem, z. B. einer Zelle, einem Organismus oder einem in vitro System, geeignet ist und mindestens eine zu exprimierende Zielnukleinsäuresequenz und eine mit dieser in operativer Verknüpfung stehende induzierbare Transkriptionskontrollsequenz umfasst. Ein solcher Vektor kann weitere kodierende Sequenzen enthalten, wie z. B. Selektionsmarkergene und dergleichen. Der Fachmann ist in der Lage, die zu exprimierende Zielnukleinsäuresequenz in Verknüpfung mit ihrer Transkriptionskontrollsequenz in einen geeigneten kommeriell erhältlichen Plasmid-Vektor oder dergleichen oder auch einen selbst konstruierten einzusetzen.
Die zu exprimierende Zielnukleinsäuresequenz und die induzierbare Transkriptionskontrollsequenz können auch hier wie oben beschrieben ausgewählt werden. Auch die Modifizierung der Sequenz kann wie oben erläutert erfolgen.
Eine bevorzugte Ausführungsform betrifft Vektoren, die in der HIV-Gentherapie eingesetzt werden können und sich dadurch auszeichnen, dass sie für ein therapeutisches Gen kodieren, das erst nach Infektion der Zelle mit HIV exprimiert wird. Die Transkription entsprechender Gene wird dabei von der HIV-eigenen LTR(„long terminal repeat”)-Region kontrolliert und erfolgt erst in Anwesenheit des HIV-Tat-Proteins. Dabei werden vorzugsweise synthetische, an die Expression in humanen Zellen angepasste Leserahmen für die therapeutischen Gene verwendet, zur Steigerung der Genexpression, insbesondere der RNA-Stabilität und des RNA-Kernexportes. Diese Gene können vorzugsweise gegen unterschiedliche Schritte im HIV-Replikationszyklus gerichtet sein und intervenieren mit der Infektion von Zellen, der Replikation von HIV oder der Verbreitung von Nachkommenviren.
Der erfindungsgemäße Vektor kann zusätzlich ein weiteres Transgen enthalten, das vorzugsweise für ein therapeutisches, gentherapeutisches und/oder diagnostisches Protein kodiert. Dieses weitere Transgen kann sich ebenfalls unter der Kontrolle eines LTR-Promotors, z. B. desselben Promotors wie die Sequenz gemäß (a) befinden. Oder aber es kann durch einen separaten Promotor, der konstitutiv oder induzierbar sein kann, gesteuert sein.
Der Vektor kann z. B. viralen (z. B. Adeno-assoziierte Viren, Adenoviren, Retroviren, Herpesviren, Alphaviren etc.) oder bakteriellen Ursprungs oder ein Plasmid sein. Besonders bevorzugt wird die induzierbare Transkriptionskontrollsequenz so ausgewählt, dass die Expression des Fremdgens von der Anwesenheit des HIV-1 Tat-Proteins abhängig ist. Wird die Tat-Transaktivierung erfolgreich rekonstituiert, sollte vorzugsweise eine Steigerung der Expression des Tat-abhängigen Gens um mindestens das 3-fache, bevorzugt das 5-fache, noch mehr bevorzugt das 10-fache oder mehr zu messen sein.
Vorzugsweise umfasst der Vektor eine Sequenz gemäß SEQ ID NO. 1, 16 oder 18.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin modifizierte Zielnukleinsäuresequenzen bereit, welche, wenn sie in operativer Verknüpfung mit einer geeigneten induzierbaren Transkriptionskontrollsequenz stehen, eine gesteigerte Genexpression bewirken. Vorzugsweise sind diese modifizierten Zielnukleinsäuresequenzen ausgewählt aus den in dieser Erfindung in den Beispielen und im Sequenzprotokoll angegebenen Sequenzen. Am meisten bevorzugt sind die modifizierten Zielnukleinsäuresequenzen ausgewählt aus den folgenden Sequenzen: SEQ ID NO. 1, 16 und 18.
Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Zellen, vorzugsweise eukaryontische Zellen, stärker bevorzugt Säugetierzellen, am meisten bevorzugt humane Zellen, die mit einer Nukleinsäure oder einem Vektor, wie oben beschrieben, transformiert sind, wobei die Nukleinsäure in einer transkriptionsfähigen Form vorliegt. Die Nukleinsäure bzw. der Vektor können beispielsweise episomal vorliegen oder stabil ins Chromosom integriert sein. Dabei können in der Zelle ein oder mehrere Kopien vorliegen.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem Arzneimittel auf der Basis der hier offenbarten Vektoren und Zellen. Die erfindungsgemäße Arzneimittel sind geeignet als therapeutische und diagnostische Anwendungen, insbesondere sind sie geeignet zur Diagnose, Prävention oder Therapie von Virus-assoziierten Erkrankungen oder/und Tumorerkrankungen. Für diese Anwendungen kann z. B. die zu exprimierende Zielnukleinsäuresequenz insbesondere ein Suizidgen sein oder dergleichen.
Beispielsweise können die Arzneimittel zur Therapie eingesetzt werden, vorzugsweise zur Therapie von lentiviralen Infektionen, z. B. HIV und SIV, insbesondere HIV-1 und HIV-2. Der Fachmann ist in der Lage, die Promotorsequenz an das System anzupassen, in dem die Expression stattfinden soll. Somit können nun lentivirale Infektionen bekämpft werden, indem infizierte Personen in vitro, ex vivo und natürlich in vivo behandelt werden, z. B. durch Einbringen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder Vektoren in PMLs aus diesen Patienten oder in T-Zellen in unterschiedlichen Differenzierungsstadien oder Stammzellen.
Die Erfindung soll durch die folgenden Figuren und Beispiele näher erläutert werden.
Abbildungen und Sequenzen
stellt alle hergestellten gag-kodierenden Konstrukte schematisch dar.
zeigt die Ergebnisse der Expression verschiedener gag-kodierender Konstrukte in H1299-Zellen.
zeigt einen HIV-1 p24-spezifischen Western Blot von transfizierten Zellen.
zeigt einen p24-ELISA-Test.
zeigt die Ergebnisse der Expression Wildtyp gag-exprimierenden Konstrukten in An- und Abwesenheit von Tat und/oder Rev.
zeigt einen HIV-1 p24-spezifischen Western Blot von transfizierten Zellen.
einen ELISA-Test.
zeigt die Wirkung der transdominanten negativen gag-Proteine auf die Freisetzung von HIV-Partikeln.
zeigt die Hemmung der Freisetzung von Partikeln in Prozent gemäß einem p24 ELISA-Test.
zeigt die Hemmung der Infektiösität der freigesetzten Viruspartikel in Prozent.
zeigt die Hemmung der Freisetzung von Viruspartikeln in Prozent, die in Anwesenheit von transdominant negativen gag-Konstrukten mit weiteren Deletionen im p24 gebildet wurden.
zeigt die Hemmung der Freisetzung in Prozent.
zeigt die Hemmung der Infektiösität in Prozent.
zeigt die Sequenzen von TDsyngag und TDwtgag sowie einen Sequenzvergleich zwischen TDwtgag und TDsyngag.
zeigt die Nukleinsäuresequenzen von TDsyngag delta 2 und TDsyngag delta 2 delta p7.
SEQ ID No. 1 zeigt die Nukleinsäuresequenz von TDsyngag.
SEQ ID No. 2 zeigt die Aminosäuresequenz von TDsyngag.
SEQ ID No. 3 zeigt die Nukleinsäuresequenz von TDwtgag.
SEQ ID No. 4 zeigt die Aminosäuresequenz von TDwtgag.
SEQ ID No. 5 bis 15 zeigen verschiedene Oligonukleotide.
SEQ ID No. 16 zeigt die Nukleinsäuresequenz von TDsyngag delta 2.
SEQ ID No. 17 zeigt die Aminosäuresequenz von TDsyngag delta 2.
SEQ ID No. 18 zeigt die Nukleinsäuresequenz von TDsyngag delta 2 delta p7.
SEQ ID No. 19 zeigt die Aminosäuresequenz von TDsyngag delta 2 delta p7.
Beispiele
Beispiel 1
Herstellung von unabhängigen, Tat-abhängigen, Rev-abhängigen und Tat- und Rev-abhängigen Gag-Genderivaten
HIV-1 transdominant-negative (TDN) Gag-Derivate wurden als konstitutiv, Tat-, Rev- oder Tat/Rev-abhängig exprimierende Genkonstrukte hergestellt. Die Rev-Abhängigkeit wurde durch die Verwendung von HIV Wildtyp(wt)-Gensequenzen, inklusive des 5'-nicht translatierten Bereiches (UTR), in Verbindung mit dem HIV Rev-Responsive-Element (RRE) erreicht. Die Rev-Unabhängigkeit wurde durch synthetische, GC-reiche Gensequenzen ermöglicht, wobei die kodierte Aminosäuresequenz für beide Konstrukte identisch ist. Eine Abhängigkeit von Tat wurde durch die Verwendung des HIV-1 LTR als Transkriptionskontrolle erreicht. Demgegenüber wurde für eine konstitutive Transkription der CMV-Promotor/Enhancer verwendet. Durch entsprechende Kombination der Elemente wurde eine konstitutive Expression (CMV-syngag), eine Tat-abhängige (LTR-syngag) eine Rev-abhängige (CMV-UTR-wtgag-RRE) und eine Tat- und Rev-abhängige (LTR-UTR-wtgag-RRE) Expression von identischen (auf Proteinebene) TDN Gag-Derivaten generiert.
Der Leserahmen des HIV-1 gruppenspezifischen Antigens (gag) (GenBank Accession Nummer: M15654.1 HIVBH102, Nukleotide 112–1650; Referenz: Ratner L, Haseltine W, Patarca R, Livak KJ, Starcich B, Josephs SF, Doran ER, Rafalski JA, Whitehorn EA, Baumeister K, et al. Complete nucleotide seqence of the AIDS virus, HTLV-III. Nature. 1985 Jan 24–30; 313 (6000): 277–84) sollte unter Verwendung einer Kodonwahl, wie sie in humanen Zellen zu finden ist, künstlich aufgebaut werden. Dazu wurde die Aminosäuresequenz des Gag-Proteins (entspricht GenBank Accession Nummer: M15654 JIVBH102, Nukleotide 112–1408) mit einer Deletion von nt 304–489 in eine entsprechende Nukleotidsequenz übersetzt. Für die Kodonoptimierung und Optimierung der RNA-Sequenz wurde ein entsprechendes Software-Paket (GeneOptimizer) verwendet. Zur Subklonierung sowie zum Anfügen weiterer Sequenzelemente innerhalb nicht translatierter Regionen wurden weitere Restriktionsschnittstellen eingefügt. Die Nukleinsäuresequenz, inklusive der Schnittstellen, ist in SEQ ID NO. 1 angegeben.
Diese Sequenz wurde als vollsynthetisches Gen unter Verwendung synthetischer Oligonukleotide nach einer bereits beschriebenen Methode (Zolotukhin et al., 1996) hergestellt.
In ist ein Vergleich der Nukleinsäuresequenzen von TDsyngag (Kodonwahl abgeleitet von Säugergenen) und TDwtgag (Kodonwahl abgeleitet von HIV-Strukturgenen) gezeigt. Das so hergestellte TDGag kodierende DNA-Fragment (”TDsyngag”) wurde unter Verwendung der Schnittstellen EcoRI und XhoI in den Expressionsvektor pcDNA3.1(+) (Invitrogen) unter die transkriptionelle Kontrolle des Cytomegalo-Virus (CMV) early promotor/enhancer gestellt (”pc-CMV-TDsyngag”).
Zur Herstellung eines analogen, jedoch in seiner Kodonwahl dem HIV-Wildtyp entsprechenden Expressionsplasmids, wurde die kodierende Region des HIV-1 gag, inklusive des 5'-nicht translatierten Bereichs (UTR), subkloniert und, um die Voraussetzungen für einen Rev-vermittelten Kernexport zu erfüllen, dem wtgag-kodierenden Bereich eine RNA-Zielsequenz (RRE) angefügt (Graf et al., 2000). Diese Zielsequenz interagiert auf RNA-Ebene mit einem viralen Kernexportprotein (im Falle von HIV-1 das Rev-Protein) und zellulären Kernexportproteinen.
Um eine Anpassung auf Proteinebene zu gewährleisten, wurde das Wildtyp-Konstrukt durch Einführung von zwei aufeinander folgenden Stop-Kodons im gag Leserahmen C-terminal verkürzt (Kodons für 372F und 373L wurden mutiert). Die Mutationen wurden durch gerichtete Mutagenese (QuickChange site-directed mutagenesis kit, Stratagene) unter Verwendung der Oligonukleotide gag-stop1 und gag-stop2 eingeführt. Das resultierende Konstrukt wurde pc-CMV-UTR-wtgag-RRE bezeichnet. Unter Verwendung der Oligonukleotide Del1 und Del2 wurde in diesem Konstrukt – analog dem TDsyngag – eine Deletion von nt 304 bis nt 489 eingefügt (pc-UTR-TDwtgag-RRE). Die kodierende Sequenz ist in SEQ ID No. 3 angegeben.
Die kodierenden Sequenzen wurden unter die transkriptionelle Kontrolle des HIV-Promotors gestellt, um eine Tat-Abhängigkeit des Gag-Proteinderivats zu erreichen. Der HIV-1 Long Terminal Repeat (LTR) beinhaltet einen solchen Promotor. Diese Region wurde mittels PCR unter Verwendung der Oligonukleotide Itr1 und Itr2 aus proviraler HIV-1 DNA (HX10 siehe (Ratner et al., 1987)) amplifiziert und unter Verwendung der Schnittstellen MluI und EcoRI direkt 5' vor das ATG des gag-kodierenden Leserahmen im pc-CMV-TDsyngag kloniert, wobei der CMV-Promotor durch das LTR ersetzt wurde. Für den Austausch des Promotors im wtgag-Konstrukt wurden Teile des HIV-Genoms unter Verwendung der Oligonukleotide Itr1 und Itr3 in einer PCR-Reaktion amplifiziert und unter Verwendung der Schnittstellen MluI und ClaI der CMV-Promotor im pc-CMV-UTR-TDwtgag-RRE-Konstrukt ausgetauscht. Dabei wurde der natürliche Leserahmen des HIV-Provirus (mit der Reihenfolge LTR, UTR, gag) wieder hergestellt. Die resultierenden Konstrukte wurden im Weiteren als ”pc-LTR-TDsyngag” bzw. ”pc-LTR-UTR-TDwtgag-RRE” bezeichnet.
In sind alle hergestellten Gag-kodierenden Konstrukte schematisch dargestellt.
Beispiel 2
Die Expression der TDgag-Konstrukte kann durch HIV-Regulatorproteine kontrolliert werden
Sämtliche Zellkulturprodukte waren von Life Technologies (Karlsruhe). Alle Säugerzelllinien wurden bei 37°C und 5% CO₂ kultiviert. Die humane Lungenkarzinomzelllinie H1299 wurden in Dulbecco's Modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit L-Glutamin, D-Glucose (4,5 mg/ml), Natriumpyruvat, 10% inaktiviertem fötalem Rinderserum, Penicillin (100 U/ml) und Streptomycin (100 μg/ml) kultiviert. Die Zellen wurden nach Erreichen der Konfluenz im Verhältnis 1:10 subkultiviert.
1 × 10⁶ Zellen wurden in Petrischalen (Durchmesser: 100 mm) ausgesät und 24 h später durch Calciumphosphat Kopräzipitation (Graham et al., 1973) mit 30 μg TDgag-Plasmiden und 15 μg pc-tat (Tat Expressionsplasmid) bzw. pc-rev (Rev-Expressionsplasmid) oder pcDNA3.1 Vektor (Referenzplasmid) transfiziert. Bei Kotransfektionen von gag, tat und rev wurden je 15 μg Plasmid eingesetzt. Zellen und Kulturüberstände wurden 48 h nach der Transfektion geerntet. Die transfizierten Zellen wurden zweimal mit eiskaltem PBS (10 mM Na₂HPO₄, 1,8 mM KH₂PO₄, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl) gewaschen, in eiskaltem PBS abgekratzt, 10 min bei 300 xg abzentrifugiert und in Lyse-Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.5% Triton X-100 (w/v)) 30 min auf Eis lysiert. Unlösliche Bestandteile des Zelllysates wurden 30 min bei 10000 xg und 4°C abzentrifugiert. Die Gesamtproteinmenge des Überstandes wurde mit dem Bio-Rad-Proteinassay (Bio-Rad, München) nach Herstellerangaben bestimmt.
Die Proben wurden mit gleichem Volumen an 2-fach Probenpuffer (Laemmli, 1970) versetzt und 5 min auf 95°C erhitzt. 50 μg Gesamtprotein aus Zelllysaten wurden über ein 12,5%-iges SDS/Polyacrylamidgel aufgetrennt (Laemmli, 1970), auf eine Nitrocellulose-Membran elektrotransferiert und mit dem monoklonalen p²⁴-spezifischen Antikörper 13-5 (Wolf et al., 1990) analysiert und mittels einem sekundären, AP-(Alkalische Phosphatase) gekoppelten Antikörper detektiert und mittels chromogener Färbung nachgewiesen ( ).
Ergänzend dazu wurden die Zelllysate in einem kommerziell erhältlichen p24 ELISA-Test (NEN) quantifiziert. Je 1 μg des Zelllysates wurden nach den Angaben des Herstellers ausgewertet und die Gesamtkonzentration an HIV-1 p24 bestimmt ( ).
H1299 Zellen wurden transient mit den gag-Konstrukten transfiziert. Die erzielte Expression wurde in An- und Abwesenheit von Tat oder Rev analysiert ( ). Für das pc-CMV-TDsyngag wurde eine konstitutive Expression des TDgag unabhängig von Tat oder Rev nachgewiesen ( , Spur 2 und , 2). Die Expression des TDgag konnte für das pc-CMV-UTR-TDwtgag-RRE-Konstrukt durch Rev um den Faktor 7 ( , Spuren 3 und 4 und 3 und 4) und für das pc-LTR-TDsyngag-Konstrukt durch Cotransfektion von pc-tat um den Faktor 2,5 ( , Spuren 5 und 6 und , 5 und 6) gesteigert werden. Die Basalaktivität der TDgag Expression war dabei für das pc-LTR-TDsyngag-Konstrukt im Vergleich zu pc-CMV-UTR-TDwtgag-RRE etwas geringer, für beide Konstrukte aber gegenüber dem pc-CMV-TDsyngag deutlich reduziert und nur geringfügig über der Negativkontrolle (ca. Faktor 2,5 für pc-CMV-UTR-TDwtgag-RRE und 1,5 für pc-LTR-TDsyngag; ). Das Genprodukt von pc-LTR-UTR-TDwtgag-RRE konnte mit diesen Methoden nicht nachgewiesen werden. Die Deletion im Gag führt zu einer verringerten Erkennung durch den monoklonalen Antikörper und in Verbindung mit einer stark eingeschränkten Expression sind die erreichten TDgag Mengen unzureichend für einen Nachweis durch Antikörper. Daher wurde die Tat- und Rev-Abhängigkeit in einem Referenzkonstrukt (komplette wtgag-Sequenz) untersucht. Dieses Konstrukt (pc-LTR-UTR-wtgag-RRE) war sowohl von Tat als auch von Rev abhängig.
Tat allein führte zu einer Expressionszunahme um den Faktor 4, Rev alleine um den Faktor 16 und die Kombination von Tat und Rev um den Faktor 47 ( ).
Beispiel 3
Die TDgag-Konstrukte haben auf die HIV-Partikelfreisetzung einen transdominant negativen Effekt
H1299 Zellen wurden, wie unter Beispiel 1 beschrieben, mit Kombinationen von Plasmiden transient transfiziert. Für eine Transfektion wurden 15 μg HX10 provirale DNA und je 30 μg der TDgag-Konstrukte oder 30 μg pcDNA3.1 als Kontrolle für eine ungehemmte Replikation eingesetzt. Nach 48 h wurden die Zellkulturüberstände geerntet, Zellbestandteile durch Zentrifugation (10 min bei 10000 xg) sedimentiert und die Überstände mit 10% einer Triton × 100 Lösung (5%) zur Lyse der HIV-Partikel im Überstand 15 min bei RT inkubiert. Die behandelten Überstände wurden in entsprechenden Verdünnungen in einen p24 ELISA-Test (NEN) eingesetzt und die p24-Menge quantifiziert. Die Reduktion der p24-Menge korreliert dabei direkt mit einer Hemmung der Partikelfreisetzung nach Transfektion mit einem HIV-Provirus. Die bestimmten p24-Mengen wurden in Relation zu der Kontrolle (Cotransfektion mit pcDNA3.1, ungehemmt) gesetzt und die Hemmung in Prozent berechnet. Für jede Kombination wurden mindestens 6 unabhängige Ansätze getestet.
Wie aus zu ersehen ist, haben alle getesteten TDgag-Konstrukte zu einer erheblichen Hemmung der Partikelfreisetzung geführt. Die TDsyngag(TDsg)-Konstrukte hatten unabhängig vom vorgeschalteten Promoter eine sehr hohe Hemmung bewirkt. Die Hemmwirkung der TDwtgag(TDwtg)-Konstrukte war dagegen von der Promotorregion abhängig. Die Hemmung der Partikelfreisetzung war unter einer CMV-Promotorkontrolle deutlich höher als unter dem HIV LTR-Promotor.
Beispiel 4
Die TDgag-Konstrukte haben auf die HIV-Infektiösität einen transdominant negativen Effekt
H1299 Zellen wurden, wie unter Beispiel 3 beschrieben, mit Plasmidkombinationen transfiziert und die Überstände nach 48 h geerntet und aufgereinigt. Zur Überprüfung des Einflusses der TDgag-Konstrukte auf die Freisetzung infektiöser Nachkommenviren, wurden die konditionierten Zellkulturüberstände in einer entsprechenden Indikatorzelllinie (MAGI) überprüft (Kimpton et al., 1992).
Bei den eukaryontischen MAGI(multinuclear activation of a galactosidase indicator)-Zellen handelt es sich um eine Indikatorzelllinie, die eine Reportergenkassette enthält, welche durch HIV-Infektion induziert werden kann. Die MAGI-Zellen wurden vom UK Medical Research Council (MRC) zur Verfügung gestellt In dieser Kassette ist der virale LTR(long terminal repeat)-Promotor dem E. coli β-Galactosidasegen (IacZ) vorgeschaltet. Die Expression des IacZ ist demnach von der Transkriptionsaktivität des LTR-Promotors durch das virale Tat abhängig.
Für die Infektion wurden am Vortag 3 × 10⁴ Zellen pro 300 μl Medium (in 48-Well-Platten) ausgesät. Nach Ernte der transfizierten H1299-Zellüberstände wurden die Magi-Zellen mit 100 μl Überstand je Ansatz infiziert und 48 h kultiviert.
Zur Auswertung der Infektiösität wurde das Medium abgesaugt und die Wells mit PBS gewaschen. Die Monolayer wurden mit 200 μl Fixierlösung (1% Formaldehyd, 0,2% Glutaraldehyd in PBS) fixiert und nach Inkubation von 5 min bei Raumtemperatur noch mal mit PBS gewaschen. Anschließend wurden 200 μl Färbelösung (16 mg X-Gal in 4 ml DMSO, ad 40 ml PBS; Zugabe von 400 μl K-Ferricyamid (400 mM), 400 μl K-Ferrocyamid (400 mM) und 80 μl MgCl₂ (1 M)) auf die Zellen gegeben. Die Inkubation erfolgte bei 37°C zwischen 15 min und 3 h. Die blauen Zellen wurden im Lichtmikroskop ausgezählt.
Die Hemmung wurde als Reduktion blauer Zellen bestimmt und in Relation zu der Zahl an blauen Zellen in der Positivkontrolle als Prozent-Hemmung der Infektiösität angegeben. Im Wesentlichen korrelieren die Ergebnisse mit den Daten der Hemmung der Partikelfreisetzung (4B). Nahezu vollständige Hemmung wurde für die Konstrukte pc-CMV-TDsyngag, pc-LTR-TDsyngag und pc-CMV-UTR-TDwtgag-RRE nachgewiesen, während das Konstrukt pc-LTR-UTR-TDwtgag-RRE eine etwa 50%ige Hemmung bewirkte (abgebildet sind die Ergebnisse eines exemplarischen Experimentes aus zwei unabhängigen Ansätzen, 4B).
Beispiel 5
Transdominant negativer Effekt von Tat-abhängigen TDgag-Derivaten mit einer weiteren Deletion im p24
Ausgehend von den Konstrukten pc-CMV-TDsyngag, pc-LTR-TDsyngag, pc-CMV-UTR-TDwtgag-RRE und pc-LTR-UTR-TDwtgag-RRE wurde durch die Verwendung der Oligonukleotide Del3 und Del4 (syngag) und Del5 und Del6 (wtgag) eine weitere Deletion in den gag-Leserahmen eingeführt. Diese Deletion betrifft die Aminosäuren 230 bis 300, ein Bereich in dem sehr viele CTL-Epitope identifiziert wurden. Die Expression des entsprechenden TDN Gag-Derivates nach Transfektion von H1299 Zellen mit den neu entstandenen Konstrukten pc-CMV-TDsyngagd2, pc-LTR-TDsyngagd2, pc-CMV-UTR-TDwtgagd2-RRE und pc-LTR-UTR-TDwtgagd2-RRE (schematische Übersicht siehe ) konnte nicht nachgewiesen werden, da die Modifikationen die Affinität der verfügbaren gag-spezifischen Antikörper beeinflussen und weder im Western Blot noch im p24-ELISA spezifische Signale zu detektieren waren.
Wie unter 3. beschrieben, wurden H1299 Zellen zur Überprüfung der TDN-Wirkung mit Kombinationen aus HX10 (15 μg) und TDsyngagd2 bzw. pcDNA3.1 transfiziert (je 30 μg Plasmid DNA) und die Überstände, wie unter 3. beschrieben, im p24-ELISA und, wie unter 4. beschrieben, mittels der MAGI-Zellen ausgewertet. Eine Hemmung der Partikelfreisetzung (Ergebnisse der p24-ELISA-Auswertung, , mindestens 6 unabhängige Ansätze) und der Infektiösität von Nachkommenviren (Ergebnisse der MAGI-Auswertung, , zwei unabhängige Ansätze) wurde für alle eingesetzten Konstrukte gezeigt. Die Reihenfolge der Hemmeffekte (Partikelfreisetzung) ist hier pc-CMV-TDsyngagd2 (98,45%) > pc-LTR-TDsyngagd2 (97,49%) > pc-CMV-UTR-TDwtgagd2-RRE (80,99%) > pc-LTR-UTR-TDwtgagd2-RRE (73,69%) und entspricht damit im Wesentlichen den Ergebnissen der TDgag-Experimente. Die synthetischen Leserahmen zeigen auch hier offensichtlich eine Überlegenheit in der Hemmung in der Partikelfreisetztung. Die Reduktion von infektiösen Nachkommenviren war dagegen in diesem experimentellen Ansatz vergleichbar ( ). Im direkten Vergleich der Rev-Abhängigkeit mit der Tat-Abhängigkeit ergeben sich für die Kombination LTR mit synthetischem Leserahmen klare Vorteile. Tabelle 1: Verwendete Oligonukleotide
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Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Verfahren zur verbesserten induzierbaren Genexpression, umfassend (i) Bereitstellen einer zu exprimierenden Zielnukleinsäuresequenz, die für ein therapeutisches und/oder diagnostisches Protein oder ein virales oder retrovirales TDN-Protein kodiert, (ii) Modifizieren der zu exprimierenden Zielnukleinsäuresequenz so dass eine Steigerung der Expression erreicht wird, wobei die Zielnukleinsäuresequenz durch Anpassen des Kodongebrauchs oder des GC-Gehalts der zu exprimierenden Zielnukleinsäuresequenz oder durch Eliminieren von die Transkription negativ beeinflussenden Motiven an das Expressionssystem angepasst wird, (iii) operatives Verknüpfen der modifizierten Zielnukleinsäuresequenz mit einer induzierbaren Transkriptionskontrollsequenz, wobei für die induzierbare Transkriptionskontrollsequenz ein induzierbarer natürlicher viraler oder Virus abgeleiteter Promotor oder ein induzierbarer artifizieller Promotor verwendet wird, (iv) Exprimieren der modifizierten Zielnukleinsäuresequenz in einem geeigneten Expressionssystem durch einen transaktiven Faktor.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die induzierbare Transkriptionskontrollsequenz ausgewählt wird aus viralen Transkriptionskontrollsequenzen, insbesondere aus den folgenden Viren: Retroviren, HCV, HBV, HSV, EBV, SV40, AAV, Adenovirus, Papillomviren, Ebolavirus.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei eine induzierbare Transkriptionskontrollsequenz verwendet wird, die durch ein retrovirales Tat oder Tax-Protein als transaktiven Faktor induzierbar ist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Kodongebrauch an den von Säugern angepasst wird.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei der Kodongebrauch an den von Menschen angepasst wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der GC-Gehalt der zu exprimierenden Zielnukleinsäuresequenz für den von Säugern optimiert wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Modifikation der zu exprimierenden Zielnukleinsäuresequenz im Wesentlichen ohne Veränderung der entsprechenden Aminosäuresequenz durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das therapeutische und/oder diagnostische Protein ausgewählt ist aus toxischen Genprodukten, Suizidfaktoren, Apoptose induzierenden Proteinen, Botenstoffen, transaktiven Faktoren, Regulatorproteinen, transdominant-negativen Proteinen, Cytokinen, Chemokinen, Interleukinen, Interferon α, RANTES, MIP1α, TNF, Thymidinkinasen, Nukleasen, FAS, FAS-Ligand, Kaspasen und Transkriptionsfaktoren.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei eine zu exprimierende Zielnukleinsäuresequenz verwendet wird, die für ein TDN Lentivirus-Protein, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Gag, Env, Tat, Rev, Nef, Vpr, Vpv, Reverser Transkriptase, Protease und Integrase, kodiert.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Expression von transdominant-negativen (TDN) Lentivirus-Proteinen in eukaryontischen Zellen, umfassend: (a) Einbringen eines Vektors, umfassend eine zu exprimierende Zielnukleinsäuresequenz, die für ein TDN Lentivirus-Protein kodiert und deren Kodongebrauch an den von Säugern angepasst ist, und eine durch ein Lentivirus Tat-Protein induzierbare Promotorsequenz in operativer Verknüpfung mit der Zielnukleinsäuresequenz, in eine eukaryontische Zelle, (b) Bereitstellen des Tat-Proteins so dass eine Expression der Zielnukleinsäuresequenz induziert wird.
Nukleinsäure-Vektor umfassend: (a) eine zu exprimierende Zielnukleinsäuresequenz, die für ein therapeutisches und/oder diagnostisches Protein und/oder ein TDN Virus Protein kodiert, (b) eine durch einen transaktiven Faktor induzierbare Transkriptionskontrollsequenz, wobei für die induzierbare Transkriptionskontrollsequenz ein induzierbarer natürlicher viraler oder Virus abgeleiteter Promoter oder ein induzierbarer artifizieller Promoter verwendet wird, in operativer Verknüpfung mit der zu exprimierenden Zielnukleinsäuresequenz, wobei die Sequenz gemäß (a) auf Nukleinsäureebene durch Anpassung der Zielnukleinsäuresequenz durch Anpassen des Kodongebrauchs oder des GC-Gehalts der zu exprimierenden Zielnukleinsäuresequenz oder durch Eliminieren von die Transkription negativ beeinflussenden Motiven an das verwendete Expressionssystem so modifiziert ist, dass eine Steigerung der Expression erreicht wird.
Vektor nach Anspruch 11, wobei die Sequenz gemäß (a) so modifiziert ist, dass die entsprechende Aminosäuresequenz nicht verändert ist.
Vektor nach Anspruch 11 oder 12, wobei der Kodongebrauch der Sequenz gemäß (a) an den von Säugetieren angepasst ist.
Vektor nach einem der Ansprüche 11 bis 13, wobei die Sequenz gemäß (a) so modifiziert ist, dass der GC-Gehalt für den von Säugern optimiert ist.
Vektor nach Anspruch 14, wobei die Sequenz gemäß (a) so modifiziert ist, dass der GC-Gehalt für den von Menschen optimiert ist.
Vektor nach einem der Ansprüche 11 bis 15, wobei die Sequenz gemäß (a) für ein TDN Lentivirus-Protein, kodiert.
Vektor nach einem der Ansprüche 11 bis 15, wobei das diagnostische und/oder therapeutische Protein ausgewählt ist aus toxischen Genprodukten, Suizidfaktoren, Apoptose induzierenden Proteinen, Botenstoffen, transaktiven Faktoren, Regulatorproteinen, transdominant-negativen MIP1α, TNF, Thymidinkinasen, Nukleasen, FAS, FAS-Ligand, Kaspasen und Transkriptionsfaktoren.
Vektor nach einem der Ansprüche 11 bis 15, wobei das TDN Virus-Protein ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Gag, Env, Tat, Rev, Nef, Vpv, Vpu, Reverser Transkriptase, Protease und Integrase.
Vektor nach Anspruch 16 oder 18, wobei das TDN Lentivirus-Protein das Gag-Protein ist.
Vektor nach Anspruch 18 oder 19, wobei das TDN Lentivirus-Protein ein Gag-Protein mit Deletionen im p24-Bereich ist.
Vektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche 11 bis 20, wobei die Sequenz gemäß (a) die Sequenz der SEQ ID NO: 1, 16 und 18 umfasst.
Vektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche 11 bis 21, wobei die Promotorsequenz eine lentivirale LTR-Sequenz oder eine funktionelle Teilsequenz davon ist.
Zelle, die einen Vektor nach einem der Ansprüche 11 bis 22 enthält, ausgenommen menschliche embryonale Stammzellen.
Arzneimittel, umfassend als Wirkstoff einen Vektor, oder eine Zelle nach einem der Ansprüche 11 bis 23.
Verwendung eines Vektors und/oder einer Zelle nach einem der Ansprüche 11 bis 23 zur Herstellung eines Arzneimittels für die Gentherapie und/oder Diagnostik.
Verwendung nach Anspruch 25 für die Gentherapie und/oder Diagnose bei retroviralen Infektionen.
Verwendung nach Anspruch 25 zur Behandlung und/oder Diagnose von lentiviralen Infektionen.
Verwendung nach Anspruch 25 zur Behandlung und/oder Diagnose einer HIV-Infektion.
Verwendung nach Anspruch 25 zur ex vivo Transduktion von PMLs aus mit HIV infizierten Personen.