JP2001500383A

JP2001500383A - Compounds and methods for diagnosing tuberculosis

Info

Publication number: JP2001500383A
Application number: JP10518432A
Authority: JP
Inventors: リード，スティーヴン，ジー．; スケイキー，ヤシール，エー．ダブリュ．; ディロン，ダヴィン，シー．; カンポス―ネト，アントニオ; ホウトン，レイモンド; ヴェドヴィック，トーマス，エス．; トワードジック，ダニエル，アール．; ロッジス，マイケル，ジェイ．
Original assignee: コリックサコーポレーション
Priority date: 1996-10-11
Filing date: 1997-10-07
Publication date: 2001-01-16
Also published as: CA2268036A1; IL121936A0; WO1998016645A2; NO991693L; IL129389A0; WO1998016645A3; BR9712298A; TR199901569T2; PL333304A1; NO991693D0; AU4750597A; CZ126699A3; EP0934415A2

Abstract

(57)【要約】結核を診断するための化合物および方法を開示する。提供される化合物は、１種以上の結核菌（M.tuberculosis）タンパク質の少なくとも１つの抗原性部分を含有するポリペプチド、およびこうしたポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む。前記ポリペプチドまたはＤＮＡ配列、および好適な検出試薬を含有する診断キットは、患者および生物学的試料中の結核菌感染の検出に使用できる。こうしたポリペプチドに対する抗体も提供する。 (57) SUMMARY Disclosed are compounds and methods for diagnosing tuberculosis. Provided compounds include polypeptides containing at least one antigenic portion of one or more M. tuberculosis proteins, and DNA sequences encoding such polypeptides. Diagnostic kits containing the polypeptide or DNA sequence and suitable detection reagents can be used to detect Mycobacterium tuberculosis infection in patients and biological samples. Antibodies to such polypeptides are also provided.

Description

【発明の詳細な説明】結核診断用の化合物および方法技術分野本発明は、一般的に、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)感染の検出に関する。本発明は、より詳しくは、結核菌抗原、またはその一部もしくはその他の変異体を含むポリペプチド、ならびに結核菌感染の血清診断のための前記ポリペプチドの使用に関する。発明の背景結核は、慢性の感染症であり、一般的に結核菌の感染によって引き起こされる。結核は、１年に約８百万の新たな発症例があり、３百万人死亡しているために、開発途上国においては主要な病気であり、先進国においては問題が増えつつある。その感染は相当の期間無症候性であり得るが、この病気は最も一般的には肺の急性炎症として現れ、熱および痰を伴わない咳が生じる。治療しないまま放置すると、典型的には重篤な合併症および死に至る。結核は、一般的に長期にわたる抗生物質療法を用いて管理され得るが、そのような治療はこの病気の蔓延を予防するには十分ではない。感染者は、しばらくの間は無症候性であり得るが、保菌者であり得る。さらに、治療レジメに従うことが絶対に重要であるが、患者の行動を監視することは困難である。何人かの患者は治療の過程を終了せず、治療を効果の無いものにし、薬剤耐性を発生させ得る。結核の蔓延を抑制するには、有効なワクチン接種と病気の正確な早期診断が必要である。現在、生菌のワクチン接種が防護免疫を誘導するための最も効率的な方法である。この目的に用いられる最も一般的なミコバクテリアは、ウシ型結核菌(Mycobacterium bovis)の無毒性株のカルメット−ゲラン杆菌（ＢＣＧ）である。しかしながら、ＢＣＧの安全性および有効性は論争の源であり、合衆国などのいくつかの国は一般大衆にワクチン接種していない。診断は、通常、皮膚検査を用いて行われ、ツベルクリンＰＰＤ（タンパク質精製誘導体）への皮内曝露を含むものである。抗原特異的Ｔ細胞応答の結果、注射後48〜72時間のうちに注射部位に測定可能な硬変が生じ、これはミコバクテリア抗原への曝露を示すものである。しかしながら、感度および特異性がこの検査についての問題であり、ＢＣＧを接種された個人は、感染した個人と区別することができない。マクロファージは結核菌免疫の主要なエフェクターとして作用することが分かっており、Ｔ細胞はかかる免疫の有力なインデューサーである。結核菌感染の防御におけるＴ細胞の必須の役割は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染に関連したＣＤ４Ｔ細胞の枯渇による、ＡＩＤＳ患者における結核菌の頻発によって説明される。ミコバクテリア反応性ＣＤ４Ｔ細胞はγ-インターフェロン（ＩＦＮ-γ）の有力な産生細胞であることが分かっており、そしてマウスのマクロファージの抗ミコバクテリア効果を引き出すことが分かっている。ヒトにおけるＩＦＮ-γの役割はあまり明確ではないが、研究によって1,25-ジヒドロキシ−ビタミンＤ３が、単独で、またはＩＦＮ-γもしくは腫瘍壊死因子αとの組み合わせで、ヒトマクロファージを活性化して結核菌感染を阻止するということがわかった。さらに、ＩＦＮ-γはヒトマクロファージを刺激して1,25-ジヒドロキシ− ビタミンＤ３を産生させることが知られている。同様に、ＩＬ-１２は結核菌感染に対する抵抗性を刺激するうえである役割を果たすことが分かっている。結核菌感染の免疫学の概説については、ChanおよびKaufmann，Tuberculosis:Pathoge nesis，Protection and Control，Bloom（編），ASM Press，Washington，DC，1 994を参照されたい。したがって、当技術分野においては、結核を検出するための改良された診断方法が必要とされている。本発明は、この要求を実現するものであり、さらに、その他の関連した利点を提供するものである。発明の概要簡単に述べると、本発明は、結核を診断するための組成物および方法を提供する。一つの面においては、可溶性結核菌抗原の抗原性部分、または保存的置換および／または修飾においてのみ異なる前記抗原の変異体の抗原性部分を含むポリペプチドが提供される。この面の一つの実施形態においては、可溶性抗原は、下記のＮ末端配列：（ここで、Xaaは任意のアミノ酸であり得る）の一つを有する。関連した面においては、結核菌抗原の免疫原性部分、または保存的置換および／または修飾においてのみ異なる前記抗原の変異体の免疫原性部分を含むポリペプチドであって、抗原が下記のＮ末端配列：（ここで、Xaaは任意のアミノ酸であり得る）の一つを有するものが提供される。別の実施形態においては、可溶性結核菌抗原は、配列番号１、２、４〜１０、１３〜２５、５２、９４および９６に記載された配列、前記配列の相補的配列、ならびに配列番号１、２、４〜１０、１３〜２５、５２、９４および９６に記載された配列またはその相補的配列に中程度のストリンジエント条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列からなる群から選択されるＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。関連した面においては、ポリペプチドは、結核菌抗原の抗原性部分、または保存的置換および／または修飾においてのみ異なる前記抗原の変異体の抗原性部分を含み、ここで、抗原は、配列番号２６〜５１、１３３、１３４、１５８〜１７８および１９６に記載された配列、前記配列の相補的配列、ならびに配列番号２６〜５１、１３３、１３４、１５８〜１７８および１９６に記載された配列またはその相補的配列に中程度のストリンジェント条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列からなる群から選択されるＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。関連した面においては、上記ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、これらのＤＮＡ配列を含む組換え発現ベクターおよび前記発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞も提供される。別の面においては、本発明は、第１および第２の本発明のポリペプチド、または本発明ポリペプチドと既知の結核菌抗原を含む融合タンパク質を提供する。本発明のさらなる面においては、患者の結核を検出するための方法および診断キットが提供される。この方法は、（ａ）生物学的試料に１種以上の前記ポリペプチドを接触させ、（ｂ）少なくとも１種のポリペプチドに結合する抗体の存在を試料中で検出し、それによって生物学的試料における結核菌感染を検出する、ことを含む。適当な生物学的試料としては全血、痰、血清、血漿、唾液、脳脊髄液および尿が含まれる。診断キットは、１種以上の前記ポリペプチドと検出試薬との組み合わせを含む。本発明はまた、結核菌感染を検出するための方法を提供し、この方法は、（ａ）患者から生物学的試料を採取し、（ｂ）該試料をポリメラーゼ連鎖反応において少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーと接触させ、該オリゴヌクレオチドプライマーは上記ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に特異的であり、そして（ｃ）第一および第二オリゴヌクレオチドプライマーの存在下で増幅するＤＮＡ配列を試料中で検出することを含む。一実施形態において、オリゴヌクレオチドプライマーは前記ＤＮＡ配列の少なくとも約１０個の連続ヌクレオチドを含む。さらなる面において、本発明は患者の結核菌感染を検出するための方法を提供し、この方法は、（ａ）患者から生物学的試料を採取し、（ｂ）該試料を前記ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブと接触させ、そして（ｃ）該オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズするＤＮＡ配列を試料中で検出することを含む。一実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブは前記ＤＮＡ配列の少なくとも約１５個の連続ヌクレオチドを含む。さらに別の面において、本発明は前記ポリペプチドに結合するポリクローナルおよびモノクローナルの両方の抗体、ならびに結核菌感染の検出におけるそれらの使用法を提供する。本発明のこれらの面およびその他の面は、下記の詳細な説明および添付の図面を参照することによって明らかになるであろう。本明細書中に開示した参考文献はすべて、それぞれを個々に組み入れるかのように、参考としてその全体を本明細書に組み入れることにする。図面の簡単な説明および配列識別名図１ＡおよびＢは、第１および第２の結核菌−免疫ドナーから誘導されたＴ細胞の増殖およびインターフェロン-γ産生の、それぞれ、実施例１に記載した14K d、20Kdおよび26Kd抗原による刺激を示す。図２Ａ〜Ｄは、分泌結核菌タンパク質、既知の結核菌抗原８５ｂならびに本発明の抗原Ｔｂ３８−１およびＴｂＨ−９に対する抗血清の、それぞれ、結核菌溶解物（レーン２）、結核菌分泌タンパク質（レーン３）、組換えＴｂ３８−１（レーン４）、組換えＴｂＨ−９（レーン５）および組換え８５ｂ（レーン５）との反応性を示す。図３Ａは、ＴｂＨ−９特異的Ｔ細胞クローンの増殖の、分泌結核菌タンパク質、組換えＴｂＨ−９および対照抗原ＴｂＲａ１１による刺激を示す。図３Ｂは、ＴｂＨ−９特異的Ｔ細胞クローンのインターフェロン-γ産生の、分泌結核菌タンパク質、ＰＰＤおよび組換えＴｂＨ−９による刺激を示す。図４は、２種の代表的ポリペプチドと、結核菌感染個体および未感染個体由来の血清との反応性を、細菌溶解物の反応性と比較して示す。図５は、４種の代表的ポリペプチドと、結核菌感染個体および未感染個体由来の血清との反応性を、３８ｋＤ抗原の反応性と比較して示す。図６は、組換え３８ｋＤおよびＴｂＲａ１１抗原と、結核菌患者、ＰＰＤ陽性ドナーおよび正常ドナー由来の血清との反応性を示す。図７は、抗原ＴｂＲａ２Ａと３８ｋＤ陰性血清との反応性を示す。図８は、配列番号６０の抗原と、結核菌患者および正常ドナー由来の血清との反応性を示す。図９は、組換え抗原ＴｂＨ−２９（配列番号１３７）と、結核菌患者、ＰＰＤ陽性ドナーおよび正常ドナー由来の血清との、間接ＥＬＩＳＡで測定した反応性を示す。図１０は、組換え抗原ＴｂＨ−３３（配列番号１４０）と、結核菌患者由来および正常ドナー由来の血清との、および結核菌患者由来の血清のプールとの、直接および間接ＥＬＩＳＡで測定した反応性を示す。図１１は、組換え抗原ＴｂＨ−３３（配列番号１４０）と、結核菌患者由来および正常ドナー由来の血清との、ＥＬＩＳＡで測定した反応性を示す。配列番号１は、ＴｂＲａ１のＤＮＡ配列である。配列番号２は、ＴｂＲａ１１のＤＮＡ配列である。配列番号３は、ＴｂＲａ１１のＤＮＡ配列である。配列番号４は、ＴｂＲａ１２のＤＮＡ配列である。配列番号５は、ＴｂＲａ１３のＤＮＡ配列である。配列番号６は、ＴｂＲａ１６のＤＮＡ配列である。配列番号７は、ＴｂＲａ１７のＤＮＡ配列である。配列番号８は、ＴｂＲａ１８のＤＮＡ配列である。配列番号９は、ＴｂＲａ１９のＤＮＡ配列である。配列番号１０は、ＴｂＲａ２４のＤＮＡ配列である。配列番号１１は、ＴｂＲａ２６のＤＮＡ配列である。配列番号１２は、ＴｂＲａ２８のＤＮＡ配列である。配列番号１３は、ＴｂＲａ２９のＤＮＡ配列である。配列番号１４は、ＴｂＲａ２ＡのＤＮＡ配列である。配列番号１５は、ＴｂＲａ３のＤＮＡ配列である。配列番号１６は、ＴｂＲａ３２のＤＮＡ配列である。配列番号１７は、ＴｂＲａ３５のＤＮＡ配列である。配列番号１８は、ＴｂＲａ３６のＤＮＡ配列である。配列番号１９は、ＴｂＲａ４のＤＮＡ配列である。配列番号２０は、ＴｂＲａ９のＤＮＡ配列である。配列番号２１は、ＴｂＲａＢのＤＮＡ配列である。配列番号２２は、ＴｂＲａＣのＤＮＡ配列である。配列番号２３は、ＴｂＲａＤのＤＮＡ配列である。配列番号２４は、ＹＹＷＣＰＧのＤＮＡ配列である。配列番号２５は、ＡＡＭＫのＤＮＡ配列である。配列番号２６は、ＴｂＬ−２３のＤＮＡ配列である。配列番号２７は、ＴｂＬ−２４のＤＮＡ配列である。配列番号２８は、ＴｂＬ−２５のＤＮＡ配列である。配列番号２９は、ＴｂＬ−２８のＤＮＡ配列である。配列番号３０は、ＴｂＬ−２９のＤＮＡ配列である。配列番号３１は、ＴｂＨ−５のＤＮＡ配列である。配列番号３２は、ＴｂＨ−８のＤＮＡ配列である。配列番号３３は、ＴｂＨ−９のＤＮＡ配列である。配列番号３４は、ＴｂＭ−１のＤＮＡ配列である。配列番号３５は、ＴｂＭ−３のＤＮＡ配列である。配列番号３６は、ＴｂＭ−６のＤＮＡ配列である。配列番号３７は、ＴｂＭ−７のＤＮＡ配列である。配列番号３８は、ＴｂＭ−９のＤＮＡ配列である。配列番号３９は、ＴｂＭ−１２のＤＮＡ配列である。配列番号４０は、ＴｂＭ−１３のＤＮＡ配列である。配列番号４１は、ＴｂＭ−１４のＤＮＡ配列である。配列番号４２は、ＴｂＭ−１５のＤＮＡ配列である。配列番号４３は、ＴｂＨ−４のＤＮＡ配列である。配列番号４４は、ＴｂＨ−４−ＦＷＤのＤＮＡ配列である。配列番号４５は、ＴｂＨ−１２のＤＮＡ配列である。配列番号４６は、Ｔｂ３８−１のＤＮＡ配列である。配列番号４７は、Ｔｂ３８−４のＤＮＡ配列である。配列番号４８は、ＴｂＬ−１７のＤＮＡ配列である。配列番号４９は、ＴｂＬ−２０のＤＮＡ配列である。配列番号５０は、ＴｂＬ−２１のＤＮＡ配列である。配列番号５１は、ＴｂＨ−１６のＤＮＡ配列である。配列番号５２は、ＤＰＥＰのＤＮＡ配列である。配列番号５３は、ＤＰＥＰの推定アミノ酸配列である。配列番号５４は、ＤＰＶＮ末端抗原のタンパク質配列である。配列番号５５は、ＡＶＧＳＮ末端抗原のタンパク質配列である。配列番号５６は、ＡＡＭＫＮ末端抗原のタンパク質配列である。配列番号５７は、ＹＹＷＣＮ末端抗原のタンパク質配列である。配列番号５８は、ＤＩＧＳＮ末端抗原のタンパク質配列である。配列番号５９は、ＡＥＥＳＮ末端抗原のタンパク質配列である。配列番号６０は、ＤＰＥＰＮ末端抗原のタンパク質配列である。配列番号６１は、ＡＰＫＴＮ末端抗原のタンパク質配列である。配列番号６２は、ＤＰＡＳＮ末端抗原のタンパク質配列である。配列番号６３は、ＴｂＭ−１ペプチドの推定アミノ酸配列である。配列番号６４は、ＴｂＲａ１の推定アミノ酸配列である。配列番号６５は、ＴｂＲａ１０の推定アミノ酸配列である。配列番号６６は、ＴｂＲａ１１の推定アミノ酸配列である。配列番号６７は、ＴｂＲａ１２の推定アミノ酸配列である。配列番号６８は、ＴｂＲａ１３の推定アミノ酸配列である。配列番号６９は、ＴｂＲａ１６の推定アミノ酸配列である。配列番号７０は、ＴｂＲａ１７の推定アミノ酸配列である。配列番号７１は、ＴｂＲａ１８の推定アミノ酸配列である。配列番号７２は、ＴｂＲａ１９の推定アミノ酸配列である。配列番号７３は、ＴｂＲａ２４の推定アミノ酸配列である。配列番号７４は、ＴｂＲａ２６の推定アミノ酸配列である。配列番号７５は、ＴｂＲａ２８の推定アミノ酸配列である。配列番号７６は、ＴｂＲａ２９の推定アミノ酸配列である。配列番号７７は、ＴｂＲａ２Ａの推定アミノ酸配列である。配列番号７８は、ＴｂＲａ３の推定アミノ酸配列である。配列番号７９は、ＴｂＲａ３２の推定アミノ酸配列である。配列番号８０は、ＴｂＲａ３５の推定アミノ酸配列である。配列番号８１は、ＴｂＲａ３６の推定アミノ酸配列である。配列番号８２は、ＴｂＲａ４の推定アミノ酸配列である。配列番号８３は、ＴｂＲａ９の推定アミノ酸配列である。配列番号８４は、ＴｂＲａＢの推定アミノ酸配列である。配列番号８５は、ＴｂＲａＣの推定アミノ酸配列である。配列番号８６は、ＴｂＲａＤの推定アミノ酸配列である。配列番号８７は、ＹＹＷＣＰＧの推定アミノ酸配列である。配列番号８８は、ＴｂＡＡＭＫの推定アミノ酸配列である。配列番号８９は、Ｔｂ３８−１の推定アミノ酸配列である。配列番号９０は、ＴｂＨ−４の推定アミノ酸配列である。配列番号９１は、ＴｂＨ−８の推定アミノ酸配列である。配列番号９２は、ＴｂＨ−９の推定アミノ酸配列である。配列番号９３は、ＴｂＨ−１２の推定アミノ酸配列である。配列番号９４は、ＤＰＡＳのＤＮＡ配列である。配列番号９５は、ＤＰＡＳの推定アミノ酸配列である。配列番号９６は、ＤＰＶのＤＮＡ配列である。配列番号９７は、ＤＰＶの推定アミノ酸配列である。配列番号９８は、ＥＳＡＴ−６のＤＮＡ配列である。配列番号９９は、ＥＳＡＴ−６の推定アミノ酸配列である。配列番号１００は、ＴｂＨ−８−２のＤＮＡ配列である。配列番号１０１は、ＴｂＨ−９ＦＬのＤＮＡ配列である。配列番号１０２は、ＴｂＨ−９ＦＬの推定アミノ酸配列である。配列番号１０３は、ＴｂＨ−９−１のＤＮＡ配列である。配列番号１０４は、ＴｂＨ−９−１の推定アミノ酸配列である。配列番号１０５は、ＴｂＨ−９−４のＤＮＡ配列である。配列番号１０６は、ＴｂＨ−９−４の推定アミノ酸配列である。配列番号１０７は、Ｔｂ３８−ＩＦ２ＩＮのＤＮＡ配列である。配列番号１０８は、Ｔｂ３８−２Ｆ２ＲＰのＤＮＡ配列である。配列番号１０９は、Ｔｂ３７−ＦＬの推定アミノ酸配列である。配列番号１１０は、Ｔｂ３８−ＩＮの推定アミノ酸配列である。配列番号１１１は、Ｔｂ３８−ＩＦ３のＤＮＡ配列である。配列番号１１２は、Ｔｂ３８−ＩＦ３の推定アミノ酸配列である。配列番号１１３は、Ｔｂ３８−ＩＦ５のＤＮＡ配列である。配列番号１１４は、Ｔｂ３８−ＩＦ６のＤＮＡ配列である。配列番号１１５は、ＤＰＶの推定Ｎ末端アミノ酸配列である。配列番号１１６は、ＡＶＧＳの推定Ｎ末端アミノ酸配列である。配列番号１１７は、ＡＡＭＫの推定Ｎ末端アミノ酸配列である。配列番号１１８は、ＹＹＷＣの推定Ｎ末端アミノ酸配列である。配列番号１１９は、ＤＩＧＳの推定Ｎ末端アミノ酸配列である。配列番号１２０は、ＡＥＥＳの推定Ｎ末端アミノ酸配列である。配列番号１２１は、ＤＰＥＰの推定Ｎ末端アミノ酸配列である。配列番号１２２は、ＡＰＫＴの推定Ｎ末端アミノ酸配列である。配列番号１２３は、ＤＰＡＳの推定アミノ酸配列である。配列番号１２４は、ＤＰＰＤＮ末端抗原のタンパク質配列である。配列番号１２５〜１２８は、４つのＤＰＰＤ臭化シアン断片のタンパク質配列である。配列番号１２９は、ＸＤＳ抗原のＮ末端タンパク質配列である。配列番号１３０は、ＡＧＤ抗原のＮ末端タンパク質配列である。配列番号１３１は、ＡＰＥ抗原のＮ末端タンパク質配列である。配列番号１３２は、ＸＹＩ抗原のＮ末端タンパク質配列である。配列番号１３３は、ＴｂＨ−２９のＤＮＡ配列である。配列番号１３４は、ＴｂＨ−３０のＤＮＡ配列である。配列番号１３５は、ＴｂＨ−３２のＤＮＡ配列である。配列番号１３６は、ＴｂＨ−３３のＤＮＡ配列である。配列番号１３７は、ＴｂＨ−２９の予測アミノ酸配列である。配列番号１３８は、ＴｂＨ−３０の予測アミノ酸配列である。配列番号１３９は、ＴｂＨ−３２の予測アミノ酸配列である。配列番号１４０は、ＴｂＨ−３３の予測アミノ酸配列である。配列番号１４１〜１４６は、ＴｂＲａ３、３８ｋＤおよびＴｂ３８−１を含む融合タンパク質の調製に使用したＰＣＲプライマーである。配列番号１４７は、ＴｂＲａ３、３８ｋＤおよびＴｂ３８−１を含む融合タンパク質のＤＮＡ配列である。配列番号１４８は、ＴｂＲａ３、３８ｋＤおよびＴｂ３８−１を含む融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号１４９は、結核菌抗原３８ｋＤのＤＮＡ配列である。配列番号１５０は、結核菌抗原３８ｋＤのアミノ酸配列である。配列番号１５１は、ＸＰ１４のＤＮＡ配列である。配列番号１５２は、ＸＰ２４のＤＮＡ配列である。配列番号１５３は、ＸＰ３１のＤＮＡ配列である。配列番号１５４は、ＸＰ３２の5'ＤＮＡ配列である。配列番号１５５は、ＸＰ３２の3'ＤＮＡ配列である。配列番号１５６は、ＸＰ１４の予測アミノ酸配列である。配列番号１５７は、ＸＰ１４の逆相補的配列によってコードされる予測アミノ酸配列である。配列番号１５８は、ＸＰ２７のＤＮＡ配列である。配列番号１５９は、ＸＰ３６のＤＮＡ配列である。配列番号１６０は、ＸＰ４の5'ＤＮＡ配列である。配列番号１６１は、ＸＰ５の5'ＤＮＡ配列である。配列番号１６２は、ＸＰ１７の5'ＤＮＡ配列である。配列番号１６３は、ＸＰ３０の5'ＤＮＡ配列である。配列番号１６４は、ＸＰ２の5'ＤＮＡ配列である。配列番号１６５は、ＸＰ２の3'ＤＮＡ配列である。配列番号１６６は、ＸＰ３の5'ＤＮＡ配列である。配列番号１６７は、ＸＰ３の3'ＤＮＡ配列である。配列番号１６８は、ＸＰ６の5'ＤＮＡ配列である。配列番号１６９は、ＸＰ６の3'ＤＮＡ配列である。配列番号１７０は、ＸＰ１８の5'ＤＮＡ配列である。配列番号１７１は、ＸＰ１８の3'ＤＮＡ配列である。配列番号１７２は、ＸＰ１９の5'ＤＮＡ配列である。配列番号１７３は、ＸＰ１９の3'ＤＮＡ配列である。配列番号１７４は、ＸＰ２２の5'ＤＮＡ配列である。配列番号１７５は、ＸＰ２２の3'ＤＮＡ配列である。配列番号１７６は、ＸＰ２５の5'ＤＮＡ配列である。配列番号１７７は、ＸＰ２５の3'ＤＮＡ配列である。配列番号１７８は、ＴｂＨ４−ＸＰ１の全長ＤＮＡ配列である。配列番号１７９は、ＴｂＨ４−ＸＰ１の予測アミノ酸配列である。配列番号１８０は、ＴｂＨ４−ＸＰ１の逆相補的配列によってコードされる予測アミノ酸配列である。配列番号１８１は、ＸＰ３６によってコードされる第１の予測アミノ酸配列である。配列番号１８２は、ＸＰ３６によってコードされる第２の予測アミノ酸配列である。配列番号１８３は、ＸＰ３６の逆相補的配列によってコードされる予測アミノ酸配列である。配列番号１８４は、ＲＤＩＦ２のＤＮＡ配列である。配列番号１８５は、ＲＤＩＦ５のＤＮＡ配列である。配列番号１８６は、ＲＤＩＦ８のＤＮＡ配列である。配列番号１８７は、ＲＤＩＦ１０のＤＮＡ配列である。配列番号１８８は、ＲＤＩＦ１１のＤＮＡ配列である。配列番号１８９は、ＲＤＩＦ２の予測アミノ酸配列である。配列番号１９０は、ＲＤＩＦ５の予測アミノ酸配列である。配列番号１９１は、ＲＤＩＦ８の予測アミノ酸配列である。配列番号１９２は、ＲＤＩＦ１０の予測アミノ酸配列である。配列番号１９３は、ＲＤＩＦ１１の予測アミノ酸配列である。配列番号１９４は、ＲＤＩＦ１２の5'ＤＮＡ配列である。配列番号１９５は、ＲＤＩＦ１２の3'ＤＮＡ配列である。配列番号１９６は、ＲＤＩＦ７のＤＮＡ配列である。配列番号１９７は、ＲＤＩＦ７の予測アミノ酸配列である。配列番号１９８は、ＤＩＦ２−１のＤＮＡ配列である。配列番号１９９は、ＤＩＦ２−１の予測アミノ酸配列である。配列番号２００〜２０７は、ＴｂＲａ３、３８ｋＤ、Ｔｂ３８−１およびＤＰＥＰを含む融合タンパク質（以下、ＴｂＦ−２という）の調製に使用したＰＣＲプライマーである。配列番号２０８は、融合タンパク質ＴｂＦ−２のＤＮＡ配列である。配列番号２０９は、融合タンパク質ＴｂＦ−２のアミノ酸配列である。発明の詳細な説明上述のように、本発明は、一般には、結核を診断するための組成物及び方法に関する。本発明の組成物は、結核菌（M.tuberculosis）抗原の少なくとも１つの抗原性部分、又は保存的置換及び／又は修飾（modifications）においてのみ異なるような抗原の変異体を含むポリペプチドを含有する。本発明の範囲内にあるポリペプチドには可溶性結核菌抗原が含まれるが、これに限定されるものではない。“可溶性結核菌”は、結核菌の培養物濾液中に存在する結核菌起源のタンパク質である。本明細書中で用いられる“ポリペプチド”という用語は完全長のタンパク質（すなわち、抗原）を含むあらゆる長さのアミノ酸鎖を包含し、これらのアミノ酸残基は共有ペプチド結合により結合する。したがって、上述の抗原のうちの１つの抗原性部分を含むポリペプチドは、完全に抗原性部分からなるものであっても、さらなる配列を有するものであってもよい。このさらなる配列は本来の結核菌抗原に由来するものであっても、異種のものであってもよく、（その必要はないが）そのような配列が抗原性であってもよい。抗原（可溶性であってもなくてもよい）の“抗原性部分”は、結核菌感染個体から得られた血清と反応することが可能である（すなわち、本明細書に記載される代表的なELISA検定において、非感染個体からの血清を用いて得られた吸光度を超える少なくとも３つの標準偏差である感染個体からの血清を用いて読み取る吸光度を発生する）部分である。“結核菌感染個体”とは、結核菌に感染された（たとえば、少なくとも0.5cmの直径のPPDに対する内皮皮膚試験応答を有する）ヒトである。感染個体は、結核の症状を示していてもよいし、病気の症状がなくてもよい。本明細書に記載される１以上の結核菌抗原の少なくとも１つの抗原性部分を含むポリペプチドは、一般に、単独でまたは組み合わせて用いて患者の結核を検出することができる。また、本発明の組成物及び方法は上記ポリペプチドの変異体をも包含する。本明細書で用いられる“変異体”は、上記ポリペプチドの抗原性が保持されるように、保存的置換及び／又は修飾においてのみ本来の抗原と異なるポリペプチドである。このような変異体は、一般に、上記ポリペプチド配列のうちの１つを修飾し、例えば本明細書に記載される代表的な手順を用いて、その修飾ポリペプチドの抗原性を評価することにより同定することができる。 “保存的置換”は、ペプチド化学の当業者が実質的に変化しないポリペプチドの二次構造及びヒドロパシー性を予想するように、アミノ酸が同様の特性を有する他のアミノ酸で置換されていることである。一般には、以下のアミノ酸群が保存的変化を表す：(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr；(2)cys、 ser、tyr、thr；(3)val、ile、leu、met、ala、phe；(4)lys、arg、his；及び(5 )phe、tyr、trp、his。同様に（もしくは、その代わりに）、例えば、ポリペプチドの抗原性、二次構造及びヒドロパシー性に与える影響が最小であるアミノ酸を欠失又は付加することにより変異体を修飾することもできる。例えば、ポリペプチドを、そのタンパク質のＮ末端で、翻訳と同時に、もしくは翻訳後にそのタンパク質を移動させるシグナル（すなわちリーダー）配列と結合させることができる。また、ポリペプチドをリンカー、あるいはそのポリペプチドの合成、精製もしくは同定を容易にし又はそのポリペプチドの固体支持体への結合を強化するための他の配列(例えば、ポリHis)に結合させることができる。例えば、ポリペプチドを免疫グロブリンFc領域に結合させることができる。関連する態様において、組み合わせポリペプチドが開示されている。“組み合わせポリペプチド”は、少なくとも１つの上記抗原性部分及び１つ以上のさらなる抗原性結核菌配列を含み、それらがペプチド結合により結合して単一のアミノ酸鎖を形成するポリペプチドである。これらの配列は直接結合しても(すなわち、介在アミノ酸を含まない)、その成分ポリペプチドの抗原性を大きく低下させることのないリンカー配列（例えば、Gly−Cys−Gly）によって結合していてもよい。一般には、結核菌抗原、及びそのような抗原をコードするＤＮＡ配列は様々な手順のいずれを用いても調製することができる。例えば、アニオン交換及び逆相クロマトグラフィーを含む当業者に公知の手順により、可溶性抗原を結核菌培養物濾液から単離することができる。次に、精製した抗原を、所望の特性、例えば結核菌感染個体から得られた血清と反応する能力について評価することができる。そのようなスクリーニングは本明細書に記載される代表的方法を用いて行うことができる。その後、例えば伝統的なエドマン化学のような技術を用いて、抗原を部分的に配列決定することができる。Edman及びBerg,Eur.J.Biochem.80:116-132 ，1967を参照のこと。また、抗原は、その抗原をコードし、発現ベクターに挿入されていて適切な宿主において発現するＤＮＡ配列を用いて、組換えにより産生させることもできる。可溶性抗原をコードするＤＮＡ分子は、可溶性結核菌抗原に対して特異的に生じた抗血清（例えば、ウサギ）を用いて適切な結核菌発現ライブラリーをスクリーニングすることにより単離することができる。可溶性であろうとなかろうと、抗原をコードするＤＮＡ配列は適切な結核菌ゲノムもしくはｃＤＮＡ発現ライブラリーを結核菌に感染した患者から得られた血清でスクリーニングすることによリ同定することができる。このようなスクリーニングは、一般には、当業者に周知の技術、例えば、Sambrookら，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratories,Cold Spring Harbor,NY,1989に記載されるものを用いて行うことができる。また、可溶性抗原をコードするＤＮＡ配列は、適切な結核菌ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡライブラリーを、単離された可溶性抗原の部分的アミノ酸配列に基いて誘導される縮重オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするＤＮＡ配列についてスクリーニングすることにより得ることもできる。このようなスクリーニングにおいて用いられる縮重オリゴヌクレオチド配列は、（例えば）Sambrookら，Mo lecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratories,Cold Spring Harbor,NY（及びそこに引用される参考文献）に記載されるように設計し、かつ合成することができ、スクリーニングもそこに記載される通りに行うことができる。また、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を当該技術分野で公知の方法において上記オリゴヌクレオチドを用いて行い、ｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーから核酸プローブを単離することもできる。次に、この単離されたプローブを用いてライブラリーのスクリーニングを行うことができる。調製方法に拘らず、本明細書に記載される抗原は“抗原性”である。より具体的には、これらの抗原は、結核菌感染個体から得られる血清と反応する能力を有する。反応性は、例えば本明細書に記載される代表的ELISA検定を用いて評価することができ、この場合、非感染個体からの血清を用いて得られた吸光度を超える少なくとも３つの標準偏差である感染個体からの血清を用いて読み取った吸光度が、陽性であると考えられる。結核菌抗原の抗原性部分は、周知の技術、例えば例えば、Paul,FundamentalIm munology,3d ed.,Raven Press,1993,pp.243-247及びそこで引用される参考文献に要約されるものを用いて調製及び同定することができる。このような技術には、本来の抗原のポリペプチド部分を抗原性についてスクリーニングすることが含まれる。本明細書に記載される代表的ELISAが一般にこれらのスクリーニングで使用することができる。ポリペプチドの抗原性部分とは、そのような代表的検定において、完全長の抗原によって生じるものと実質的に同様のシグナルをこのような検定で生じさせる部分をいう。換言すると、結核菌抗原の抗原性部分は、本明細書に記載されるモデルELISAにおいて完全長抗原によって誘導されるシグナルの少なくとも約20％、好ましくは約100％を生じさせる。結核菌抗原の一部及び他の変異体は合成又は組換え手段により産生させることができる。約100個未満のアミノ酸、一般には約50個未満のアミノ酸を有する合成ポリペプチドは、当業者に周知の技術を用いて産生させることができる。例えば、そのようなポリペプチドは、成長するアミノ酸鎖にアミノ酸を連続的に付加する市販の固相技術のいずれか、例えば、メリフィールド固相合成法を用いて合成することができる。Merrifield,J.Am.Chem.Soc.85:2149-2146，1963を参照のこと。ポリペプチドの自動合成のための機器はアプライド・バイオシステムズ社 (Applied BioSystems,Inc.)、フォスターシティー、ＣＡのような供給者から市販されており、製造者の指示に従って稼働させることができる。本来の抗原の変異体は、一般に、標準的な突然変異誘発技術、例えば、オリゴヌクレオチド指向性部位特異的突然変異誘発を用いて調製することができる。また、ＤＮＡ配列の区画を標準技術を用いて除去して切り詰められたポリペプチドを調製することもできる。本来の抗原の一部及び／又は変異体を含む組換えポリペプチドは、当業者に公知の様々な技術を用いて、そのポリペプチドをコードするＤＮＡ配列から容易に調製することができる。例えば、培養培地に組換えタンパク質を分泌する適切な宿主／ベクター系に由来する上清を、まず、市販のフィルターを用いて濃縮することができる。濃縮後、その濃縮物を適切な精製マトリックス、例えば、アフィニティマトリックス又はイオン交換樹脂に適用することができる。最後に、１回以上の逆相ＨＰＬＣ工程を用いて組換えタンパク質をさらに精製することができる。当業者に公知の様々な発現ベクターのうちのいずれをも本明細書に記載の組換えポリペプチドの発現に用いることができる。発現は、組換えポリペプチドをコードするＤＮＡ分子を含む発現ベクターで形質転換又はトランスフェクトした適切な宿主細胞において達成することができる。適切な宿主細胞には原核生物、酵母及び高等真核細胞が含まれる。好ましくは、用いられる宿主細胞は大腸菌、酵母又は哺乳動物細胞系、例えば、ＣＯＳもしくはＣＨＯである。この方法で発現するＤＮＡ配列は天然の抗原、天然の抗原の一部、又はそれらの他の変異体をコードし得る。一般に、調製方法に関係なく、本明細書に開示されるポリペプチドは実質的に純粋な形態で調製される。好ましくは、これらのポリペプチドは少なくとも約80 ％の純度であり、好ましくは少なくとも約90％の純度であり、最も好ましくは少なくとも約99％の純度である。しかしながら、本明細書に記載される方法で使用するときには、そのような実質的に純粋なポリペプチド類を組み合わせて使用してもよい。特定の実施態様において、本発明は、下記Ｎ末端配列のうちの１つを有する可溶性結核菌抗原の少なくとも１つの抗原性部分（またはそのような抗原の変異体）を含むポリペプチドを開示する： (ここで、Xaaはいかなるアミノ酸であってもよく、好ましくはシステイン残基である。) 上記（g）として同定される抗原をコードするＤＮＡ配列は配列番号52に示されており、その推定アミノ酸配列は配列番号53に示されている。上記（a）として確定される抗原をコードするＤＮＡ配列は配列番号96に示されている；その推定アミノ酸配列は配列番号97に示されている。上記抗原（d）に対応するＤＮＡ配列は配列番号24に示され、抗原（c）に対応するＤＮＡ配列は配列番号25に示され、かつ抗原（i）に対応するＤＮＡ配列は配列番号94に記載されており、その推定アミノ酸配列は配列番号95に示されている。さらなる特定の実施態様において、本発明は、下記Ｎ末端配列のうちの１つを有する結核菌抗原の少なくとも１つの免疫原性部分、又は保存的置換及び／又は修飾においてのみ異なるそれらの変異体を含むポリペプチドを開示する： (ここで、Xaaはいかなるアミノ酸であってもよく、好ましくはシステイン残基である。) 別の特定の実施態様において、本発明は、（a）配列番号1、2、4〜10、13〜25 、52、94および96のＤＮＡ配列、（b）そのようなＤＮＡ配列の相補的配列、又は（c）（a）もしくは（b）の配列と実質的に相同であるＤＮＡ配列、によってコードされる１つ以上のアミノ酸配列を含む可溶性結核菌抗原（又はそのような抗原の変異体）の少なくとも１つの抗原性部分を含むポリペプチドを開示する。さらなる特定の実施態様において、本発明は、(a)配列番号26〜51、133、134 、158〜178及び196のＤＮＡ配列、(b)そのようなＤＮＡ配列の相補的配列、又は（c）（a）もしくは（b）の配列と実質的に相同であるＤＮＡ配列、によってコードされる１つ以上のアミノ酸配列を含む、可溶性であってもなくてもよい結核菌抗原（又はそのような抗原の変異体）の少なくとも１つの抗原性部分を含むポリペプチドを開示する。上で論じられる特定の実施態様において、結核菌抗原には、本明細書で具体的に説明される１つ以上のＤＮＡ配列と実質的に相同であるＤＮＡ配列によってコードされる変異体が含まれる。本明細書で用いられる“実質的に相同”とは、中等度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能なＤＮＡ配列を指す。適切な中等度にストリンジエントな条件は、5×ＳＳＣ、0.5％ＳＤＳ、 1.0ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ8.0）の溶液で予備洗浄し；50℃−65℃、5×ＳＳＣで一晩、又は、交雑種（cross-species）相同性の事象においては45℃、0.5×ＳＳＣでハイブリダイズさせ：次いで、65℃で20分間、0.1％ＳＤＳを含む2×、0.5 ×及び0.2×ＳＳＣの各々で２回洗浄することを含む。このようなハイブリダイズするＤＮＡ配列も、これらが、コード縮重のために、ハイブリダイズするＤＮＡ配列によってコードされる免疫原性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であることから、本発明の範囲内にある。関連する態様において、本発明は、第１及び第２発明のポリペプチドあるいは本発明のポリペプチド及び既知結核菌抗原、例えば上記の38kD抗原またはESAT-6 （配列番号98および99）、を含む融合タンパク質を、そのような融合タンパク質の変異体と共に提供する。本発明の融合タンパク質は、これらの第１及び第２ポリペプチドの間にリンカーペプチドを含んでいてもよい。本発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、公知の組換えＤＮＡ技術を用いて第１及び第２ポリペプチドをコードする別々のＤＮＡ配列を適切な発現ベクターに組み立てるように構築する。第１ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の3'末端を、ペプチドリンカーを用いて、もしくは用いることなく、第２ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の5'末端に連結し、それによりこれらの配列の読取り枠が同位相内（in phase）にあって、第１及び第２ポリペプチドの両者の生物学的活性を保持する単一の融合タンパク質へのこれら２つのＤＮＡ配列のｍＲＮＡ翻訳が可能となるようにする。各ポリペプチドがその二次及び三次構造へ確実に折り畳むのに十分な距離だけ第一と第二のポリペプチドを隔離するため、ペプチドリンカー配列を用いることができる。かかるペプチドリンカー配列は、当業界で周知の標準的な技術を使って融合タンパタ質に結合されている。適切なペプチドリンカー配列は、次の因子に基づいて選択することができる：（１）フレキシブルな伸展コンホメーションをとることができること；（２）第一及び第二ポリペプチドの機能的エピトープと相互作用可能な二次構造をとることができないこと；及び（３）ポリペプチドの機能的エピトープと反応し得る疎水性残基または荷電残基が存在しないこと。好ましいペプチドリンカー配列は、Gly、Asn及びSer残基を有する。Thr及びAla 等の他の中性に近いアミノ酸もリンカー配列に用いることができる。リンカーとして有利に用いることができるアミノ酸配列としては、Marateaら，Gene 40:39- 46，1985;Murphyら，Proc.Natl.Acad.Sci．USA 83:8258-8262,1986;米国特許第4 ,935,233号及び米国特許第4,751,180号に開示されたものが挙げられる。リンカー配列は長さで1〜約50アミノ酸であってよい。第一及び第二ポリペプチドが、機能的ドメインを分離し立体妨害を避けるために使用し得る非必須Ｎ末端アミノ酸領域を有する場合は、ペプチドリンカー配列は必要でない。また別の態様においては、本発明は上述のポリペプチドを結核の診断に用いる方法を提供する。この態様においては、上記のポリペプチドの内の１種あるいはそれ以上を、単独であるいは組み合わせて用いて、生物サンプル中の結核菌感染を検出する方法を提供する。複数のポリペプチドを用いる実施態様においては、本明細書に特に記載した以外のポリペプチド、例えばAndersenとHansen，Infect ．Immun．57:2481-2488，1989に記載されている38kD抗原などを含めてもよい。ここで用いている「生物サンプル」とは、患者から得られる、抗体を含有するいかなるサンプルをも意味する。好ましくは、サンプルは全血、喀痰、血清、血漿、唾液、脳脊髄液あるいは尿である。より好ましくは、サンプルは患者あるいは輸血用血液より得た血液、血清、あるいは血漿サンプルである。それらのポリペプチドは、下記に示すとおり、サンプル中にそれらのポリペプチドに対する抗体が存在するか否かを、所定のカットオフ値と比較して決めるためのアッセイに用いられる。そのような抗体が存在することは、それ以前に結核の指標であるマイコバクテリア抗原に対する感作があったことを示している。２以上のポリペプチドが用いられる実施態様においては、用いられるポリペプチドは相補的(すなわちアッセイ法を構成するポリペプチドの一つが、他のポリペプチドでは検出されないと考えられるサンプル中の感染を検出する傾向のあるもの)であることが好ましい。相補的ポリペプチドは、通常は、結核菌に感染していることが知られている一連の患者から得た血清サンプルを各ポリペプチドを個々に用いて評価することにより特定される。各ポリペプチドでどのサンプルが陽性であるか(下記に示すとおりに)を決めた後、供試サンプルの大多数あるいは全ての感染を検出する能力のある２種あるいはそれ以上のポリペプチドの組み合わせを配合することができる。例えば、結核に感染した個体から得た血清の約25 -30%は、単一のタンパク質、例えば上記の38kD抗原に対する抗体に対しては陰性を示す。それ故、相補的ポリペプチドは38kD抗原と組み合わせて診断テストの感度を改善するために用いうる。サンプル中の抗体を検出するために１種又はそれ以上のポリペプチドを用いる様々なアッセイフォーマットが当業者に知られている。例えばHarlowとLane，An tibodies:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988を参照すればよいが、これは参考として本明細書に組み込まれている。好ましい実施態様においては、アッセイ法はサンプルに含まれる抗体を結合及び放出しうるように固相支持体上に固定化したポリペプチドを用いることを含む。結合した抗体はリポーター基を含む検出試薬を用いて検出しうる。それに適した検出試薬としては、抗体/ポリペプチド複合体に結合する抗体、及びリポーター基で標識したフリーのポリペプチド(例えば半競合的アッセイにおいて)を含む。また別のやリ方として、競合的アッセイも用いることができ、そのアッセイでは、ポリペプチドに結合する抗体をリポーター基で標識し、固定化した抗原とサンプルをインキュベートした後にその抗原に結合しうるようにする。標識した抗体のポリペプチドへの結合をサンプル中の成分が阻害する程度が、サンプルの固定化ポリペプチドに対する反応性を示すこととなる。固相支持体としては、抗原を付着させうるものとして当業者に知られているいかなる固体材料をも用いうる。例えば、固相支持体としては、マイクロタイタープレートの試験用ウエルまたはニトロセルロースもしくはその他の適当な膜を用いることができる。また別のものとして、該支持体は、例えば、ガラス、繊維ガラス、ラテックスあるいはポリスチレンやポリ塩化ビニルなどのプラスチック物質のビーズまたはディスクであってもよい。また、支持体として、例えば米国特許No.5,359,681で開示されているものなどの磁性粒子あるいは光ファイバーセンサーなどを用いてもよい。ポリペプチドを固相支持体に結合させるには、当業者であれば既知の各種の手法を用いることができ、それらは特許や科学文献中に多数述べられている。本発明の文脈において、「結合」という用語は、例えば吸着などの非共有結合及び共有結合(それは抗原と支持体上の官能基との直接的なつながり又は架橋剤を介してのつながりがあり得る)の双方を示す。マイクロタイタープレートのウエルあるいは膜との吸着による結合が好ましい。そのような場合には、適当な緩衝液中でポリペプチドを固相支持体と適当な時間接触させることによって吸着を行いうる。接触時間は温度によって異なるが、典型的には1時間から1日の間である。通常は、プラスチックマイクロタイタープレート（例えば、ポリスチレンまたはポリ塩化ビニル）のウエルと、約10ngから約1μｇの、好ましくは約100ngのポリペプチドを接触させることで、適量の抗原を結合させるには十分である。ポリペプチドを固相支持体と共有結合させるためには、通常は、まず、ポリペプチド上の例えばヒドロキシル基又はアミノ基などの官能基および該支持体の両者と反応する二価性試薬と該支持体とを反応させることによって行いうる。例えば、ポリペプチドはポリマーコーティングを施した支持体と、ベンゾキノンで、あるいは支持体上のアルデヒド基をアミン及びポリペプチド上の活性水素で縮合することによって結合させうる(例えば、Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook，1991のA12-A13を参照せよ)。いくつかの実施態様においては、アッセイは固相酵素免疫検定法（ELISA）である。このアッセイでは、まず固相支持体上(通常はマイクロタイタープレートのウエル)に固定化されたポリペプチド抗原をサンプルと接触させることによって、サンプル中に存在するポリペプチドに対する抗体が固定化ポリペプチドと結合しうるようにして行いうる。結合しなかったサンプルは固定化ポリペプチドから除去され、固定化された抗体-ポリペプチド複合体に結合することのできる検出試薬が添加される。次いで、固相支持体に結合したまま残った検出試薬の量は、その検出試薬に特異的な適当な方法を用いて測定する。より特定して述べれば、上述のように一旦ポリペプチドが支持体上に固定化されれば、該支持体上の残りのタンパク質結合部位は通常はブロックされる。当業者に公知の、例えばウシ血清アルブミンやTween 20^TM(Sigma Chemical Co.，St. Louis，米国ミズーリ州)などの適当なブロッキング剤はいかなるものも用いうる。次いで、固定化ポリペプチドをサンプルとインキキュベートして、抗体を抗原と結合させる。サンプルは、例えばリン酸緩衝化食塩水(PBS)などの適当な希釈剤でインキュベーション前に希釈することができる。通常、適当な接触時間(すなわちインキュベーション時間)は、結核菌に感染したサンプル中の抗体の存在を検出するのに十分な長さの時間である。好ましくは、接触時間は、結合した抗体と未結合の抗体が平衡に達したときにできる結合の少なくとも95％の結合が出来上がるのに十分な時間である。当業者であれば、平衡に達するために必要な時間は、時間が経過するにつれて生ずる結合レベルをアッセイすることによって容易に求められることを理解するであろう。室温では約30分間のインキュベーション時間で通常は十分である。未結合サンプルは、固相支持体を、例えば0.1%Tween 20^TM含有のPBSなどの適当な緩衝液で洗うことにより除去しうる。次いで検出試薬を固相支持体に添加しうる。適当な検出試薬としては、固定化抗体-ポリペプチド複合体と結合し、当業者に公知の各種の方法で検出しうるいかなる化合物であっても良い。好ましくは、検出試薬はリポーター基にコンジュゲートされた結合剤(例えばプロテインＡ、プロテインＧ、免疫グロブリン、レクチンあるいはフリーの抗原など)を含有する。好ましいリポーター基としては、酵素(西洋ワサビペルオキシダーゼなど)、基質、補因子、阻害剤、染料、放射性核種、蛍光基、発光基及びビオチンなどがある。結合剤のリポーター基へのコンジュゲーションは、当業者に公知の標準的な方法で行いうる。一般的な結合剤は多種類の官能基と結合させた形で、多数の会社から市販されている(例えばZymed Laboratories，San Francisco，米国カリフォルニア州、及びPierce，Rockford，米国イリノイ州)。次いで、検出試薬を固定化された抗体-ポリペプチド複合体と、結合した抗体を検出するのに十分な時間インキュベートする。どのくらいの長さの時間が適当であるかは、通常は製造者の使用説明書から、あるいは一定時間内に起こる結合のレベルをアッセイすることによって定めうる。未結合の検出試薬を除去し、結合した検出試薬をリポーター基を用いて検出する。リポーター基を検出するために用いる方法はそのリポーター基の性質によって異なる。放射性基についてはシンチレーションカウンターを用いるかあるいはオートラジオグラフ法が通常は適当である。分光学的方法は、染料、発光基、及び蛍光基の検出に用いうる。ビオチンは別のリポーター基(一般的には放射性基または蛍光基、あるいは酵素)を結合させたアビジンを用いて検出しうる。酵素をリポーター基として用いるときは、通常は、基質を添加し(通常はある特定の時間)、その反応産物を分光学的あるいはその他の分析法によって検出しうる。サンプル中に抗結核菌抗体が存在しているか否かは、固相支持体に結合したまま残ったリポーター基から検出されるシグナルを、通常は所定のカットオフ値に対応するシグナルと比較することによって決定する。好ましい実施態様においては、カットオフ値は、固定化抗原を非感染患者からのサンプルとインキュベートして得たシグナルの平均値とする。通常は、所定のカットオフ値より標準偏差の３倍高い値のシグナルを発生するサンプルを結核陽性とする。また別の好ましい実施態様においては、カットオフ値はROC曲線(Receiver Operator Curve)を用いて定められるが、それはSackettら，CliniCal Epidemiology;A Basic Science f or Clinical Medicine，Little Brown and Co.，1985，pp.106-107の方法に従って行う。簡単に記せば、この実施態様においては、カットオフ値は、診断テスト結果に対するそれぞれのとりうるカットオフ値に対応する真の陽性率(すなわち感度)と偽陽性率(100%−特異度)とのペアをプロットして求めうる。上部左側の角に最も近いプロット上のカットオフ値(すなわち最も大きな領域を包含しうる値)が最も正確なカットオフ値であり、この方法で求めたカットオフ値より高い値を示したシグナルを発生させたサンプルを陽性とすることができる。また別のやり方として、偽陽性率を低下させるためにカットオフ値をそのプロットに沿って左側に移動させることができ、また、偽陰性率を低下させるために右に移動させることができる。通常は、この方法で求めたカットオフ値より高いシグナルを生じたサンプルを結核陽性とする。一つの関連実施態様においては、アッセイはラピッドフロースルー法(rapid f low-through)又はストリップテストフォーマット(strip test format)で行われ、その場合は抗原はニトロセルロースなどの膜の上に固定化される。フロースルー法においては、サンプル中に含まれる抗体は、サンプルが膜を通過するにつれて固定化されたポリペプチドと結合する。次いで、検出試薬を含有する溶液が膜を通過するにつれて検出試薬(例えばプロテインＡ-金コロイド)が抗体-ポリペプチド複合体と結合する。結合した検出試薬の検出は上記に示すとおり行いうる。ストリップテストフォーマットにおいては、ポリペプチドを結合させた膜の一端を、サンプルを含有している溶液に浸漬する。サンプルは膜に沿って検出試薬を含有する部分を通って固定化ポリペプチドのエリアまで移動する。ポリペプチドの位置での検出試薬の濃度がサンプル中の抗結核菌抗体の存在を示す。典型的には、その位置での検出試薬の濃度は、あるパターン、例えば線状のパターンを生じ、肉眼で見ることができる。そのようなパターンが認められなければ、それは陰性の結果であることを示す。通常、膜上に固定化されるポリペプチドの量は、生物サンプルが上記に示すようなELISAで陽性シグナルを生じるのに十分と思われるレベルの抗体を含んでいるときには、肉眼で識別しうるパターンを生じるように選択する。好ましくは、膜上に固定化するポリペプチドの量は約25ng〜約1 μｇであり、より好ましくは約50ng〜約500ngである。このような試験は典型的には非常に少量(例えば１滴)の患者血清又は血液で行うことができる。当然ながら、本発明のポリペプチドを用いるのに適したその他の多数のアッセイプロトコールもある。上述の説明は好例のみを示すことを意図している。別の態様においては、本発明は本発明のポリペプチドに対する抗体を提供する。抗体は当業者に公知の多様な技法のいかなるものを用いて調製してもよい。例えば、HarlowとLane，Antibodies:A laboratory Manual，Cold Spring Harbor L aboratory，1988を参照せよ。そのような技法の一つにおいては、抗原ポリペプチドを含む免疫原を多種類の哺乳動物のいずれか(例えばマウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、及びヤギ)に注射する。この工程では、本発明のポリペプチドは修飾を加えることなく免疫原として用いうる。また別のやり方として、特に比較的短いポリペプチドの場合、ポリペプチドを例えばウシ血清アルブミン又はkeyhol e limpet(笠形貝類の一種)のヘモシアニンなどのキャリアータンパク質と結合させればより良い免疫応答を引き出しうる。免疫原を宿主動物に、好ましくは1回ないしそれ以上のブースター免疫感作を含む所定のスケジュールに従って注射し、その動物から定期的に採血する。そのポリペプチドに特異的なポリクローナル抗体を、例えば適当な固相支持体に結合させたポリペプチドを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって、抗血清から精製しうる。目的の抗原ポリペプチドに対して特異的なモノクローナル抗体は、例えば、Ko hlerとMilstein，Eur．J．Immunol．6:511-519，1976に記載の技法及びそれを改善した技法を用いて調製しうる。簡単に記せば、これらの方法は、望ましい特異性(すなわち目的のポリペプチドとの反応性)を有する抗体を産生することができる不死化した細胞系統の調製を含む。そのような細胞系統は、例えば、上記に示す方法で免疫した動物から得た脾細胞から調製しうる。脾細胞は例えば骨髄腫細胞の融合パートナー、好ましくは免疫した動物と同系であるようなものと融合させることにより不死化される。各種の融合技法を用いうる。例えば、脾細胞と骨髄腫細胞を組み合わせて非イオン性界面活性剤で2-3分間処理し、次いでハイブリッド細胞は増殖させるが、骨髄腫細胞は増殖させない選択的培地上に低密度でプレーティングする。好ましい選択技法としてはHAT(ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン)選択法がある。十分な時間、通常は1週間から2週間置いた後、ハイブリッド体のコロニーを観察する。単一のコロニーを選び、ポリペプチドに対する結合活性を調べる。高い反応性と特異性を有するハイブリドーマが好ましい。モノクローナル抗体はハイブリドーマコロニー増殖の上清から単離しうる。さらに、収率を向上させるために、ハイブリドーマ細胞系統を適当なマウスなどの脊椎動物の腹腔に注入するなどの各種の技法を行いうる。モノクローナル抗体はその腹水あるいは血液から採取しうる。夾雑物はクロマトグラフィー、ゲルろ過、沈殿、及び抽出などの従来法で抗体から除去しうる。本発明のポリペプチドは、例えばアフィニティークロマトグラフィーにおける精製工程に用いうる。抗体は、上記に詳述したものと同様なアッセイ法及びその他の当業者にはよく知られた技法を用いて結核菌抗原の存在を検出するための診断試験に用いることができ、それによって患者の結核菌感染を検出する方法を提供する。また、本発明の診断用試薬は、上記のポリペプチドの1種あるいはそれ以上をコードするＤＮＡ配列、あるいはその1つ又はそれ以上の部分を含みうる。例えば、生物サンプルから得た結核菌特異的ｃＤＮＡを増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)をベースとしたアッセイ法では、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプライマーが本発明のポリペプチドの一つをコードするＤＮＡ分子に対して特異的であるような少なくとも2つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いうる。増幅されたｃＤＮＡの存在は当業界でよく知られた技法、例えばゲル電気泳動などを用いて検出される。同様にして、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ分子に対して特異的なオリゴヌクレオチドプローブも、生物サンプル中の本発明のポリペプチドの存在を検出するためのハイブリダイゼーシションアッセイで用いうる。ここで用いられている「あるＤＮＡ分子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマー/プローブ」とは、対象のＤＮＡ分子と少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%の同一性を有するオリゴヌクレオチド配列を意味する。本発明の診断法で用いるのに有用なものとなりうるオリゴヌクレオチドプライマー及び/又はプローブは、少なくともヌクレオチド約10-40個であることが好ましい。好ましい実施態様においては、オリゴヌクレオチドプライマーは、ここで開示したポリペプチドの内の一つをコードするＤＮＡ分子の連続する少なくとも10個のヌクレオチドからなるものである。好ましくは、本発明の診断法に用いるためのオリゴヌクレオチドプローブは、ここで開示したポリペプチドの内の一つをコードするＤＮＡ分子の連続する少なくとも15個のオリゴヌクレオチドからなる。ＰＣＲベースのアッセイ法及びハイブリダイゼーションアッセイ法は当業界ではよく知られたものである(例えばMullisら，Ibid; Ehrlich，Ibid を参照せよ)。プライマーあるいはプローブはこのように生物サンプル中の結核菌特異的な配列を検出するために用いうる。上述のオリゴヌクレオチド配列を含むＤＮＡプローブあるいはプライマーは、単独で、あるいはそれぞれを組み合わせて、あるいは上述の38kD抗原などのあらかじめ同定されている配列と共に用いうる。次の実施例は説明を行うためのものであり、限定を意図するものではない。実施例実施例１結核菌培養濾液由来のポリペプチドの精製および特性決定本実施例は培養濾液からの結核菌可溶性ポリペプチドの調製を例示する。特に記載しない限り、以下の実施例のパーセンテージは全て重量／容積である。結核菌（H37Ra、ATCC No.25177、またはH37Rv、ATCC No.25618のいずれか）を滅菌GAS培地にて37℃で14日間培養した。その後、該培地を0.45μフィルターを通して滅菌2.5Ｌボトル中に真空濾過した（細胞のバルクは残す）。該培地は次に0.2μフィルターを通して滅菌4Lボトル中に濾過し、NaN₃を培養濾液に添加して濃度0.04％にした。その後、ボトルを4℃冷所においた。培養濾液を濃縮し、該濾液をオートクレーブ処理した12Ｌ受容器に移し、該濾液を、エタノールでリンス洗いし10,000kDa ＭＷＣＯ膜を含む400mlアミコン（A micon）攪拌式セルに供給した。圧力は窒素ガスを使い60psiに維持した。この方法により12Ｌの容積はほぼ50mlに減少した。培養濾液を、8,000kDa ＭＷＣＯセルロースエステル膜を使い0.1％重炭酸アンモニウム中に透析し、重炭酸アンモニウム溶液を２回交換した。タンパク質濃度をその後、市販のBCAアッセイ（Pierce,Rockford,IL）で定量した。透析した培養濾液をその後、凍結乾燥し、ポリペプチドを蒸留水中に再懸濁した。該ポリペプチドを再び0.01ｍＭの１，３ビス［トリス（ヒドロキシメチル） −メチルアミノ］プロパン、ｐＨ7.5（ビス−トリスプロパン緩衝液）（これはアニオン交換クロマトグラフィー用初期条件である）に対して透析した。0.01mM のビス−トリスプロパン緩衝液pH7.5に平衡させたPOROS 146 II Q/Mアニオン交換カラム4.6ｍｍｘ 100ｍｍ(Perceptive BioSystems,Framingham,MA) 上のゲル大量使用（profusion）クロマトグラフィーを使って、分画を実施した。ポリペプチドを、上記緩衝液系中で直線的な0〜0.5M NaCl勾配で溶出した。カラム溶出物は220nmの波長で監視した。イオン交換カラムから溶出するポリペプチドのプールを蒸留水に対して透析し、凍結乾燥した。得た物質をpH1.9の水中0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）に溶解し、該ポリペプチドを、Delta-Pak C18カラム（Waters,Milford,MA）300オングストローム孔径、５ミクロン粒子径（3.9 ｘ 150ｍｍ）上で精製した。該ポリペプチドを、直線勾配0〜60％の希釈緩衝液（アセトニトリル中0.1％TFA）でカラムから溶出させた。流速は0.75ml／分であり、HPLC溶出液を214nmで監視した。個々のサンプルの純度を最大化するように溶出ポリペプチドを含有する画分を回収した。おおよそ200の精製ポリペプチドを得た。その後、精製ポリペプチドを、PBMC調製物中でＴ細胞増殖を誘導する能力についてスクリーニングした。PPD皮膚試験で陽性であることが知られておりそのＴ細胞がPPDおよびMTB由来の粗可溶性タンパク質に応答して増殖することが示されている供与者からのPBMCを、10％のプールしたヒト血清および50μｇ/mlゲンタマイシンを補ったRPMI 1640を含む培地中で培養した。精製ポリペプチドを0.5〜 10μｇ/ｍＬの濃度で二つに分けて添加した。200μｌの容積の96ウェル丸底プレート中で６日間培養した後、50μｌの培地を各ウェルから取出して、下記のようにIFN-γレベルを定量した。その後、該プレートを1μCi／ウェルのトリチウム化チミジンで更に18時間パルスをかけ、収穫し、トリチウム摂取をガスシンチレーションカウンタを使って測定した。培地のみで培養した細胞中に観察された増殖より３倍以上の増殖を両方の複製において生じた画分を陽性と考えた。 IFN-γを酵素結合イムノソルベントアッセイ（ELISA）を使い測定した。ELISA プレートを、ヒトIFN-γを指向するマウスモノクローナル抗体（Chemicon）を含むPBSで4時間室温でコーティングした。その後、ウェルを5％（W/V）無脂肪ドライミルクを含有するPBSで1時間室温でブロックした。その後、プレートを６回、 PBS/0.2％TWEEN-20中で洗浄し、そして、ELISAプレート中の培養培地に１:２で希釈したサンプルを一夜室温でインキュベーションした。プレートを再び洗浄し、PBS/10％正常ヤギ血清中に１：3000で希釈したポリクローナルウサギ抗ヒトIFN-γ血清を各ウェルに添加した。その後、プレートを２時間室温でインキュベーションし、洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼを結合した抗ウサギIgG（Jackson Labs.）をPBS15％無脂肪ドライミルク中に１：2000で希釈し添加した。更に2時間の室温インキュベーション後、プレートを洗浄しTMB基質を添加した。反応は20分後に1N硫酸で停止した。光学濃度を570nmを参照波長として、450nmで測定した。培地のみで培養した細胞の平均ODおよび３つの標準偏差より2倍も大きいODを与える両方の複製において生じた画分を陽性と考えた。配列決定のため、ポリペプチドを個々にBiobrene^TM（Perkin Elmer/Applied B ioSystems Division，Foster City，CA）処理ガラス繊維フィルター上で乾燥した。ポリペプチドを伴なうフイルターをPerkin Elmer/Applied BioSystems Divi sion Precise 492タンパク質シーケンサー上にかけた。ポリペプチドは、アミノ酸末端から、伝統的なEdman化学を使って配列決定された。アミノ酸配列は、適切なPTH誘導体標準とPTHアミノ酸誘導体の保持時間を比較して、各ポリペプチドについて決定した。上記の方法を使い、以下のＮ末端配列を有する抗原を単離した：（配列中、Xaaはいずれのアミノ酸であってもよい）。上記の方法に加えて、追加の抗原をミクロボアHPLC精製工程を用いて単離した。詳細には、上記のクロマトグラフィー精製工程からの抗原混合物を含む画分の 20μｌを、孔径７ミクロン、カラムサイズ1ｍｍｘ 100ｍｍ、のアクアポア（Aq uapore）C18カラム（Perkin Elmer/Applied BioSystems Division,Foster City, CA）上で、Perkin Elmer/Applied BioSystems Division Model 172 HPLCを使って精製した。画分を、水（0.05％TFAを含有）中の直線勾配1％/分のアセトニトリル（0.05％TFAを含有）により、流速80μｌ／分でカラムから溶出させた。溶出液は250nmで監視した。元の画分を４つの主なピークおよび他の小成分に分離し、分子量12.054Ｋｄ（質量分析計による）で以下のＮ末端配列を有するポリペプチドを得た；このポリペプチドは、上記のアッセイを使いPBMC調製物中の増殖とIFN-γ産生を誘導することを示した。追加の可溶性抗原を結核菌培養濾液から次の通り単離した。結核菌培養濾液を上記のごとく調製した。ビス−トリスプロパン緩衝液ｐＨ5.5に対して透析した後、ビス−トリスプロパン緩衝液ｐＨ5.5で平衡したPoros QEカラム4.6 ｘ 100 ｍｍ（Perspective Biosystems）上でアニオン交換クロマトグラフィーを使って分画を実施した。ポリペプチドを上記緩衝液系中の直線で0〜1.5M NaCl勾配により、10ml／分の流速で溶出させた。カラム溶出物は214nmの波長で監視した。イオン交換カラムから溶出する画分をプールし、Poros R2カラム4.6 ｘ 100ｍｍ（Perspective Biosystems）を使って逆相クロマトグラフイーにかけた。ポリペプチドを、直線勾配0〜100％のアセトニトリル（0.1％TFA）により、流速5ml ／分で、カラムから溶出させた。溶出物を214nmで監視した。溶出したポリペプチドを含有する画分を凍結乾燥し、80μｌの0.1％TFA水溶液に再懸濁し、更に、Vydac C4カラム4.6 ｘ 150ｍｍ（Western Analytical,Temec ula,CA）上で、直線勾配0〜100％のアセトニトリル（0.1％TFA）により、流速2m l／分で、逆相クロマトグラフィーにかけた。溶出物を214nmで監視した。生物活性を持つ画分を主なピークおよび他の小成分に分離した。PVDF膜へのこのピークのウエスタンブロットは、３つの主な分子量バンド、14Ｋｄ、20Ｋｄおよび26Ｋｄを示した。これらのポリペプチドはそれぞれ以下のＮ末端配列を有すると決定した。（配列中、Xaaはいずれのアミノ酸であってもよい）。上記のアッセイを使い、これらのポリペプチドはPBMC調製物中の増殖とIFN-γ産生を誘導することを示した。図1AおよびＢは、それぞれ第一および第二の供与者由来のPBMC調製物を使ったこのアッセイの結果を示す。上記（a）、（c）、（d）および（g）に記述した抗原をコードするＤＮＡ配列を、該Ｎ末端配列に対応し結核菌コドンバイアスを有する³²Ｐ末端標識をした変性オリゴヌクレオチドを使い、結核菌ゲノムライブラリーをスクリーニングして取得した。上記抗原（a）に対応するプローブを使って実施したスクリーニングは、配列番号96に示す配列を有するクローンを同定した。配列番号96によりコードされたポリペプチドは配列番号97に示す。上記抗原（g）に対応するプローブを使って実施したスクリーニングは、配列番号52に示す配列を有するクローンを同定した。配列番号52によりコードされたポリペプチドは配列番号53に示す。上記抗原（d）に対応するプローブを使って実施したスクリーニングは、配列番号2 4に示す配列を有するクローンを同定し、上記抗原（c）に対応するプローブで実施したスクリーニングは、配列番号25に示す配列を有するクローンを同定した。上記アミノ酸配列を、DNA STARシステムを使ってジーンバンク（gene bank）の公知アミノ酸配列と比較した。サーチしたデータベースはほぼ173,000タンパク質を含有し、スイス、PIRデータベースと翻訳されたタンパク質配列（バージョン87）との組み合わせである。抗原（a）〜（h）および（l）のアミノ酸配列に有意な相同性は検出されなかった。抗原（i）に対するアミノ酸配列はライ菌（M．leprae）由来の配列と相同であることを見出した。全長ライ菌（M．leprae）配列を、GENBANKから取得した配列を使ってゲノムＤＮＡから増幅した。その後、この配列を使って結核菌ライブラリーをスクリーニングし、結核菌相同体の全長コピーを取得した（配列番号94）。抗原（j）に対するアミノ酸配列は、ＤＮＡ配列から翻訳した公知の結核菌タンパク質と相同であることを見出した。本発明者の知る限りでは、このタンパク質は未だかってＴ細胞剌激活性を所持することが示されてない。抗原（k）のアミノ酸配列はライ菌（M．leprae）由来の配列に関係していることを見出した。 PPD陽性の3供与者を使った上記の増殖とIFN-γアッセイにおいて、上に得られた代表的な抗原に対する結果を表1に示す：表1 PBMC 増殖とIFN-γアッセイの結果表1において、2〜4の刺激指数（SI）（培地のみで培養した細胞と比較して）を与える応答を＋と採点し、4〜8または1μｇ以下の濃度で2〜4のSIを++と採点し、8以上のSIを+++と採点した。配列（i）の抗原は、増殖およびIFN-γアッセイの両方において、1供与者に高いSI（+++）を、他の2供与者にそれより低い（++および+）SIを有することを見出した。これらの結果は、これらの抗原は増殖および／またはインターフェロン−γ産生を誘導する能力のあることを示す。実施例２結核菌抗原を単離するための患者血清の使用本実施例では、結核菌感染者由来の血清を用いたスクリーニングによる結核菌溶解物からの抗原の単離を説明する。乾燥した結核菌H37Ra（Difco Laboratories）を2％NP40溶液に添加し、交互にホモジナイズと超音波処理を3回行った。生成した懸濁液をマイクロ遠心チューブに入れて13,000rpmで遠心分離し、上清を0.2ミクロンのシリンジフィルターに通した。濾液をMacro Prep DEAEビーズ（BioRad,Hercules,CA）に結合させた。ビーズを20mM Tris ｐＨ7.5で洗浄し、結合したタンパク質を1M NaClで溶出した。1M NaCl溶出液を、一晩、10mM Tris pH7.5に対して透析した。透析した溶液を DNase及びRNaseにより0.05mg/mlで30分間室温で、その後、α−Ｄ−マンノシダーゼにより0.5U/mg、ｐＨ4.5で3〜4時間室温で処理した。ｐＨ7.5に戻した後、該物質をBio Scale-Q-20カラム（BioRad）でFPLCによって分画した。画分を9プールに組み合わせ、Centriprep 10Amicon,Beverley,MA)内で濃縮し、その後、ウエスタンブロットにより、本発明の他の抗原に対して免疫反応性の無い結核菌感染患者由来の血清プールを使って血清学的活性をスクリーニングした。最も反応性の高い画分をSDS-PAGEにかけ、PVDFに移した。およそ85Ｋｄのバンドを切り出し次の配列を得た：この配列を上記のジーンバンクの配列と比較したところ、公知配列への有意な相同性はみられなかった。上記（ｍ）に記述された抗原をコードするＤＮＡ配列は、配列番号137のＮ末端配列に対応する標識縮重オリゴヌクレオチドを用いてゲノム結核菌Erdman株ライブラリーをスクリーニングニングして得られた。配列番号198に与えられるＤＮＡ配列を有するクローンを同定した。この配列は配列番号199に与えられるアミノ酸をコードすることを見出した。これら配列をジーンバンクの配列と比較すると、先に結核菌及びウシ型結核菌（M.bovis）で同定された配列といくつかの類似性が示された。実施例３結核菌抗原をコードするDNA配列の調製本実施例は、結核菌感染患者の血清または可溶性結核菌抗原に対する抗血清で結核菌発現ライブラリーをスクリーニングすることによって結核菌抗原をコードするDNA配列を調製する手順を示すものである。A ．結核菌上清に対するウサギ抗血清を用いる結核菌可溶性抗原の調製結核菌H37Ra株からゲノムDNAを単離した。このDNAをランダムにせん断し、λZ AP発現系（Stratagcnc,LaJolla,CA）を用いて発現ライブラリーを構築するために使用した。ウサギを結核菌培養液の濃縮上清で免疫することにより、結核菌H3 7Ra、H37RvおよびErdman株の分泌タンパク質に対するウサギ抗血清を作った。具体的には、まずムラミルジペプチド（Calbiochem,LaJolla,CA）100μｇと不完全フロイントアジュバント１mlを含有する総量2ml中タンパク質抗原200μｇを皮下注してウサギを免疫した。4週間後さらに不完全フロイントアジュバント中の抗原100μｇをウサギに皮下注して再免疫を行った（boosted）。最後に、4週間後タンパク質抗原50μｇをウサギに静注して免疫した。Sambrookら、Molecular Cl oning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratorics,Cold Spring Ha rbor,NY,1989の記載に従い、抗血清を用いて発現ライブラリーのスクリーニングを行った。免疫反応性抗原を発現するバクテリオファージ・プラークを精製した。プラークからpファージミドを得て結核菌クローンのヌクレオチド配列を推定した。 32個のクローンを精製した。そのうち25個はこれまで結核菌で同定されたことのない配列である。Skcikyら、J.Exp.Mcd.181:1527-1537,1995記載のように、 IPTGによりタンパク質を誘導しゲル溶出によって精製した。このスクリーニングで同定されたDNA分子の代表的な配列を配列番号1-25に示す。対応する推定アミノ酸配列を配列番号64-88に示す。上記データベースを用い、これらの配列を遺伝子バンク中の公知の配列と比較したところ、以下TbRA2A、TbRA16、TbRA18およびTbRA29（配列番号77,69,71,76 ）と称するクローンは、らい菌で先に同定された配列とはある程度の相同性を示すが結核菌で同定された配列との相同性は示さないことがわかった。TbRA11、Tb RA26、TbRA28およびTbDPEP（配列番号66,74,75,53）は結核菌では既に同定されている。TbRA1、TbRA3、TbRA4、TbRA9、TbRA10、TbRA13、TbRA17、TbRa19、TbRA 29、TbRA32、TbRA36および重複クローンTbRA35、TbRA12（配列番号64,78,82,83, 65,68,76,72,76,79,81,80,67）に対する有意な相同性は見出されなかった。クローンTbRa24はクローンTbRa29と重複している。B ．結核菌抗原をコードするDNA配列を同定するための肺結核患者またはらい患者血清の使用発症している結核患者から得られた血清プールを用いて、上記のゲノムDNAライブラリー、さらにH37Rvライブラリーのスクリーニングを行った。H37Rvライブラリーを作るために、結核菌H37Rv株のゲノムDNAを単離し、部分的Sau3A分解にかけ、λZap発現系（Stratagene,La Jolla,Ca）を用いて発現ライブラリーを構築するのに使用した。三つの異なる血清プールはそれぞれ発症している肺結核またはらい患者3名から得られた血清を含有するもので、これらを発現スクリーニングに使用した。プールは、ELISAおよびイムノブロット法両方におけるH37Ra溶解物との相対的反応性を参照して、それぞれTbL、TbM、TbHとした（すなわち、T bL＝低反応性、TbM＝中程度の反応性、TbH＝高反応性）。発症している肺結核患者7名から得られた４番目の血清プールも使用した。これら血清には全部、組換え38kD結核菌H37Raリン酸結合タンパク質との増大した反応性がなかった。全プールを予め大腸菌溶解物（lysate）に吸着させて、H37RaおよびH37Rv発現ライブラリーのスクリーニングに使用した。手順はSambrookら、Molecular Clon ing:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratories,Cold Spring Harb or, NY,1989の記載に従った。免疫反応性抗原を発現するバクテリオファージプラークを精製した。プラークから得られたファージミドを回収し、結核菌クローンのヌクレオチド配列を推定した。 32個のクローンを精製した。そのうち31個はこれまでヒト結核菌で同定されたことのない配列であった。同定されたDNA分子の代表的な配列を配列番号26-51および100に示す。このうちTbH-8-2（配列番号100）はTbH-8の部分的クローンであり、TbH-4（配列番号43）とTbH-4-FWD（配列番号44）は同クローンの非連続配列である。以下にTb38-1、TbH-4、TbH-8、TbH-9、TbH-12と称する抗原のアミノ酸配列を配列番号89-93に示す。上記の同定されたデータベースを用い、これらの配列を遺伝子バンクで公知の配列と比較したところ、TbH-4、TbH-8、TbH-9およびTbM-3に対しては有意な相同性が見られなかったが、TbH-9には弱い相同性のものが見出された。TbH-12は先にM.paratuberculosis（Acc.No.S28515）において同定された34kDの抗原タンパク質と相同であることが見出された。Tb38-1は先に M.bovis(Acc.No.U34848)およびM.tuberculosis(Sorensenら,Infec.Immun.63:171 0-1717,1995)において同定された抗原ESAT-6のオープンリーディングフレームの上流の34塩基対に位置することがわかった。 Tb38-1とTbH-9は両方ともH37Raライブラリーから単離されたものであるが、これらから誘導されたプローブを用いてH37Rvライブラリーのクローンを同定した。Tb38-1はTb38-1F2、Tb38-1F3、Tb38-1F5およびTb38-1F6（配列番号107,108,11 1,113,114）にハイブリダイズした（配列番号107と108はクローンTb38-1F2の非連続配列である）。Tb38-1F2において二つのオープンリーディングフレームを推定した。一つはTb37FL（配列番号109）に対応し、第二の部分配列はTb38-1の相同体であり、Tb38-IN（配列番号110）とよぶ。推定したTb38-1F3のアミノ酸配列を配列番号112に示す。TbH-9プローブによって、H37Rvライブラリーで3個のクローン、TbH-9(H37Ra)の相同体であるTbH-9-FL（配列番号101）、TbH-9-1（配列番号103）、およびTbH-8-2（配列番号105）（TbH-8の部分的クローンである）が同定された。これら3種のクローンの推定アミノ酸配列を配列番号102、104、106に示す。上記の手順により、さらに結核菌ゲノムDNAライブラリーのスクリーニングを行って、7個の相異なる遺伝子を示すさらに10個の反応性クローンを回収した。これら遺伝子のうちの一つは、上記の38kD抗原として同定されたものであり、一つは結核菌に存在することが先に示された14Kdのαクリスタリン熱ショックタンパク質と同一であることが決定され、また第三のものは上記抗原TbH-8と同一であることが決定された。残り5個のクローン（以下TbH-29、TbH-30、TbH-32およびTbH-33という）について決定したDNA配列をそれぞれ、配列番号133-136に示し、同時に対応する推定アミノ酸配列をそれぞれ配列番号137-140に示す。これらの抗原のDNA配列およびアミノ酸配列を上記遺伝子バンクの配列と比較した。（反応性オープンリーディングフレームを含む）TbH-29の5'末端に対する相同は見られなかったが、TbH-29の3'末端は結核菌のコスミドY227と同一であることが分かった。TbH-32とTbH-33はそれぞれ、先に同定された結核菌挿入エレメントIS61 10、結核菌コスミドY50と同一であることが判明した。TbH-30に対する有意な相同はなかった。この更なるスクリーニングで得られた陽性ファージミドを用いて、上記Sambro okらに記載の通り、大腸菌XL-1 Blue MRF'に感染させた。組換えタンパク質の誘導はIPTGを添加することによって行った。誘導された溶解物と誘導されない溶解物を二重に（in duplicate）SDS-PAGEにかけ、ニトロセルロースフィルターに移した。フィルターをTbH反応性のヒト結核菌血清（1:200希釈）およびlacZのＮ末端4Kd部分と反応性のウサギ血清（1:200または1:250希釈）と反応させた。室温で2時間血清のインキュベーションを行った。¹²⁵Ｉ標識プロテインＡを添加した後、フィルムに16時間から11日間の間の様々な時間暴露して、結合した抗体を検出した。イムノブロットの結果を表2に示す。表2 ヒト結核菌血清および抗lacZ血清両方に対する組換えヒト結核菌抗原の陽性反応は、ヒト結核菌血清の反応性が融合タンパク質に対するものであるこを示している。抗lacZ血清には反応性であるがヒト結核菌血清には反応しない抗原はコンホメーションエピトープを認識するヒト結核菌血清の結果であろう。あるいは、その抗原−抗体結合速度論はイムノブロットにおける2時間の血清暴露が不十分なせいかもしれない。抗原TbH-9とTb38-1が細胞タンパク質を提示するのか、あるいは結核菌培地中に分泌されるのかを決定する実験を行った。第一の実験では、実質的に実施例3A に記載された方法を使用して、Ａ)結核菌の分泌タンパク質、Ｂ)公知の分泌組換え結核菌抗原85b、Ｃ)組換えTb38-1およびＤ)組換えTbH-9に対してウサギ血清を作った。総結核菌溶解物、結核菌培養液の濃縮上清、組換え抗原85b、TbH-9およびTb38-1を変性ゲル上で分解（resolve）してニトロセルロース膜上に固定化した後、上記のウサギ血清を用いて重複ブロットを探した。対照血清（パネルI）と分泌タンパク質、組換え85b、組換えTb38-1および組換えTbH-9に対する抗血清（パネルII）を用いるこの分析の結果をそれぞれ図2A〜3 Dに示す。図中のレーンは以下の通りである。1)分子量タンパク質標準、2)結核菌溶解物5μｇ、3)分泌タンパク質5μｇ、4)組換えTb38-1 50ng、5)組換えTbH-9 50ng、6)組換え85b 50ng。これら組換え抗原を、6個の末端ヒスチジン残基で処理し（engineered）、従って天然のタンパク質よりも約１kD大きい移動度で移動すると予想される。図2Ｄにおいて、組換えTbH-9は全長42kDの抗原のうち約10kDがなく、従って溶解物レーン（矢印で示す）における免疫反応性天然TbH-9抗原のサイズと顕著な差がある。これらの結果は、Tb38-1とTbH-9が細胞内抗原であり、結核菌により活発に分泌されるものではないことを示している。 TbH-9が細胞内抗原であるとの知見は、組換えTbH-9、分泌性結核菌タンパク質およびPPDに対するTbH-9特異的ヒトＴ細胞クローンの反応性を測定することによって確認された。TbH-9特異的Ｔ細胞クローン（131TbH-9とよぶ）は健康なPPD陽性ドナーのPBMCから得られた。分泌タンパク質、組換えTbH-9および対照の結核菌抗原TbRallに対する131TbH-9の増殖応答は、実施例1に記載のように、トリチウム標識チミジンの取り込みを測定することによって決定した。図3Ａに示すように、クローン131TbH-9はTbH-9に特異的に応答し、このことはTbH-9が結核菌分泌タンパク質の重要な成分ではないことを示す。図3Ｂは、第二のTbH-9T特異的細胞クローン（PPD 800-10と称する）を健康なPPD陽性ドナーのPBMCから調製し、次いでＴ細胞クローンを分泌タンパク質、PPDまたは組換えTbH-9で刺激することによりIFN-γを作ることを示す。これらの結果もまた、TbH-9は結核菌によって分泌されないことを証明するものである。C ．結亥菌抗原をコードするDNA配列を同定するための肺結核以外の結核患者血清の使用結核菌Erdman株からゲノムDNAを単離してランダムにせん断し、λZAP発現系（ Stratagene,La Jolla,CA）を用いて発現ライブラリーを構築するために使用した。得られたライブラリーを、上記実施例3Bの記載通り、肺結核以外の結核患者から得られた血清プールを用いてスクリーニングした。二次抗体はアルカリ性ホスフアターゼ結合ヤギ抗ヒトIgG+A+M(H+L)である。 18個のクローンを精製した。そのうち4個のクローン（以下XP14,XP24,XP31,XP 32とよぶ）は公知の配列とある程度の類似性があることが分かった。XP14,XP24 およびXP31について決定したDNA配列をそれぞれ、配列番号151-153に示し、XP32 の5'および3'末端のDNA配列をそれぞれ配列番号154および155に示す。XP14の推定アミノ酸配列は配列番号156に示す。XP14の逆相補配列は配列番号157のアミノ酸配列をコードすることが判明した。残り14個のクローン（以下XP1-XP6,XP17-XP19,XP22,XP25,XP27,XP30およびXP3 6という）の配列を上記の遺伝子バンクの配列と比較したところ、XP2とXP6の3' 末端を除いて相同性はないことがわかった。XP2とXP6の3'末端は公知の結核菌コスミドとある程度の相同性をもつことが分かった。XP27とXP36のDNA配列をそれぞれ配列番号158と159に示す。XP4,XP5,XP17およびXP30の5'末端の配列はそれぞれ配列番号160-163に、XP2,XP3,XP6,XP18,XP19,XP22およびXP25の5'末端および3 '末端の配列はそれぞれ、配列番号164と165；166と167；168と169；170と171；1 72と173；174と175；そして176と177に示す。XP1は上記に開示したTbH4のDNA配列と重複することが判明した。TbH4-XP1の全長DNA配列を配列番号178に示す。このDNA配列は、配列番号179に示すアミノ酸配列をコードするオープンリーディングフレームを含んでいることが分かった。TbH4-XP1の逆相補配列は配列番号180 に示すアミノ酸配列をコードするオープンリーディングフレームを含んでいることが分かった。XP36のDNA配列は、配列番号181と182に示すアミノ酸配列をコードする２個のオープンリーディングフレームを含み、その逆相補配列は配列番号 183に示すアミノ酸配列をコードするオープンリーディングフレームを含んでいることが分かった。組換えXP1タンパク質を上記実施例3B記載の通りに調製した。精製には金属イオンアフィニティクロマトグラフィカラムを使用した。組換えXP1は結核菌免疫ドナーから単離したＴ細胞における細胞増殖とIFN-γ産生を刺激することが明らかになった。D ．結核菌分画タンパク質に対するウサギ抗血清を用いる結核菌可溶性抗原の調製上記実施例2に記載のごとく結核菌溶解物を調製した。得られた物質をHPLCにより分画し、各画分に対し、本発明の他の抗原とは殆どあるいはまったく免疫反応性を示さない結核菌感染患者の血清プールを用いて、血清学的活性についてウエスタンブロットによりスクリーニングした。上記実施例3Aに記載の方法を用いて、最も反応性の高い画分に対するウサギ抗血清を作成した。この抗血清を使い、上記のように調製した結核菌Erdman株ゲノムDNA発現ライブラリーのスクリーニングを行った。免疫反応性抗原を発現するバクテリオファージプラークを精製した。これらのプラークから得られたファージミドを回収し、結核菌クローンのヌクレオチド配列を決定した。 10個の異なるクローンを精製した。これらクローンのうちの一つは、上記のTb Ra35であることが判明し、一つは先に同定された結核菌抗原HSP60であることが分かった。残り8個のクローンのうち6個（以下RDIF2,RDIF5,RDIF8,RDIF10,RDIF1 1,RDIF12という）は先に同定された結核菌配列とある程度類似性をもつことが分かった。RDIF2,RDIF5,RDIF8,RDIF10およびRDIF11について決定されたDNA配列はそれぞれ配列番号184-188に示す。対応する推定アミノ酸配列はそれぞれ配列番号189-193に示す。RDIF12の5'および3'DNA配列は、それぞれ配列番号194と195に示す。抗原RDIF-7に対する有意な相同性は見出されなかった。RDIF7について決定したDNA配列と推定アミノ酸配列はそれぞれ配列番号196と197に示す。RDIF6と称するクローンがさらに1個単離されたが、これはRDIF5と同一であることが分かった。上記に従って組換えRDIF6,RDIF8,RDIF10およびRDIF11を調製した。これらの抗原は結核菌免疫ドナーから単離されたＴ細胞における細胞増殖およびIFN-γ産生を刺激することが判明した。実施例４ツベルクリン精製タンパク質誘導体由来のポリペプチドの精製および特性決定結核菌（M．tuberculosis）ポリペプチドはツベルクリン精製タンパク質誘導体(PPD)から次のようにして単離した。 PPDは公表されているもの（Seibert，F．ら、Tuberculin purified protein d erivative．Preparation and analyses of a large quantity for standard．Th e American Review of Tuberculosis 44:9-25，1941）に若干の改変を加えて調製した。結核菌Rv株をローラービン中で合成培地中37℃で６週間増殖させた。細菌増殖物を含有するビンを次に水蒸気中100℃に３時間加熱した。培養物を0.22 μのフィルターを用いて滅菌濾過し液相を３kDカットオフメンブランを用いて20 倍濃縮した。タンパク質を50％硫酸アンモニウム溶液を用いて１回そして25％硫酸アンモニウム溶液を用いて８回沈殿させた。得られたタンパク質(PPD)をBioca d HPLCシステム（Perseptive Biosystems，Framingham，MA）中でC18カラム（7. 8×300mM;Waters，Milford，MA）を用い逆相液体クロマトグラフィー（RP-HPLC ）により分別した。フラクションを0-100%バッファー（アセトニトリル中0.1%TF A）の直線勾配を用いてカラムから溶離した。流速は毎分10mlであり、溶離液を2 14nmおよび280nmで監視した。６つのフラクションを集め、乾燥し、PBS中に懸濁し、そして遅延型過敏症(DT H)反応の誘導に関して結核菌感染モルモットでそれぞれに検査した。１つのフラクションが強いDTH反応を誘導することが判明し、これを次にPerkin Elmer/Appl ied Biosystems Division Model 172 HPLC中ミクロボア(Microbore)Vydac C18カラム(カタログNo．218TP5115)上のRP-HPLCによりさらに分別した。フラクションを毎分80μｌの流速で5-100%バッファー（アセトニトリル中0.05%TFA）の直線勾配で溶離した。溶離液を215nmでモニターした。８つのフラクションを集めて結核菌感染モルモットにおけるDTHの誘導に関して検査した。１つのフラクションが約16mmの硬結の強いDTHを誘導することが判明した。他のフラクションは検出可能なDTHを誘導しなかった。陽性フラクションをSDS-PAGEゲル電気泳動にかけて、およそ12kD分子量の単一のタンパク質バンドを含有することが判明した。以後DPPDと呼ばれるこのポリペプチドを前記したPerkin Elmer/Applied Biosy stems Division Procise 492タンパク質シークエンサーを用いてアミノ末端から配列決定して配列番号124に示されるN-末端配列を有することが判明した。この配列を前記した遺伝子バンクの既知配列と比較したが既知相同物はなかった。DP PDの４つのシアノーゲンブロマイド断片を単離し、配列番号125-128に示す配列を有することが判った。実施例５合成ポリペプチドの合成ポリペプチドはHPTU(O−ベンゾトリアゾール-N,N,N',N'−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート)活性化を用いるFMOC化学によりMillipore9050 ペプチドシンセサイザー上で合成できる。Gly-Cys-G1y配列をペプチドのアミノ末端に結合してペプチドの結合法または標識法を提供できる。固形支持体からのペプチドの切断は下記切断混合物：トリフルオロ酢酸：エタンジチオール：チオアニソール：水：フェノール（40:1:2:2:3）を用いて実施できる。２時間切断した後、ペプチドを冷メチル−t-ブチル−エーテル中に沈殿させることができる。ペプチドペレットを次に0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)を含有する水中に溶解させ、凍結乾燥し、次にCl8逆相HPLCにより精製できる。ペプチドの溶離には水（0.1 %TFA含有）中の0%-60%アセトニトリル（0.1%TFA含有）の勾配を用いることができる。純粋なフラクションの凍結乾燥に続き、エレクトロスプレー質量分光測定を用いそしてアミノ酸分析によりペプチドを特性決定できる。この手法を用いて、TbM-1配列の１．５倍の反復配列を含むTbM-1ペプチドを合成した。TbM-1ペプチドは配列：GCGDRSGGNLDQIRLRRDRSGGNL（配列番号63）を有する。実施例６結核の血清診断のための代表的な抗原の使用本実施例はいくつかの代表的な抗原の診断用としての特性を説明するものである。 200ngの抗原を炭酸コーティング緩衝液，pH9.6で希釈して50μｌとした液でコートした96ウエルのプレートでアッセイを行った。ウエルを4℃で一晩(あるいは 37℃で2時間)コートした。次いでプレートの内容物を除去しウエルを200μｌのP BS/1%BSAで2時間ブロックした。ブロッキングステップの後、ウエルをPBS/0.1%T ween 20^TMで５回洗った。PBS/0.1%Tween 20^TM/0.1%BSAで1:100に希釈して50μｌとした血清を各ウエルに添加し、室温で30分間インキュベートした。その後プレートを再度、PBS/0.1%Tween 20^TMで５回洗った。次いで、酵素コンジュゲート(西洋ワサビペルオキシダーゼープロテインA，Zy med，San Francisco，米国カリフォルニア州)をPBS/0.1%Tween 20^TM/0.1%BSAで1 :10000に希釈し、希釈したコンジュゲートの50μｌを各ウエルに添加し、室温で 30分間インキュベートした。インキュベート後、ウエルをPBS/0.1%Tween 20^TMで５回洗った。100μｌのテトラメチルベンジジンペルオキシダーゼ(TMB)基質(Kir kegaard and Perry Laboratories,Gaithersburg，米国メリーランド州)を添加し、希釈せず、約15分間インキュベートした。100μｌの1Ｎ硫酸を各ウエルに添加することにより反応を停止させ、プレートを450nmで読み取った。図４は、結核菌陽性及び陰性の患者から得た血清と、実施例３のＡ法を用いて単離した2つの組換え抗原(TbRa3及びTbRa9)とのELISAの反応性を示す。これらの抗原の反応性を、結核菌H37Ra株(Difco，Detroit，米国ミネソタ州)から単離した細菌溶解物の反応性と比較した。どちらの場合も、組換え抗原は陽性と陰性の血清を区別し得た。ROC曲線(receiver-operator curve)から得られたカットオフ値に基づくと、TbRa3は87検体の陽性血清の内の56検体を検出し、TbRa9は165検体の陽性血清の内の111検体を検出した。図５は実施例３のＢ法を用いて単離された代表的な抗原のELISA反応性を示す。組換え抗原TbH4，TbH12，Tb38-1及びペプチドTbM-1(実施例４に記載)の反応性を、AndersenとHansen，Infect．Immun．57:2481-2488，1989に記載の38kD抗原の反応性と比較した。ここでも、試験したポリペプチドは全て陽性と陰性の血清を区別し得た。ROC曲線から得られたカットオフ値に基づくと、TbH4は126検体の陽性血清の内の67検体を検出し、TbH12は125検体の陽性血清の内の50検体を検出し、38-1は101検体の陽性血清の内の61検体を検出し、TbM-1ペプチドは30検体の陽性血清の内の25検体を検出した。 4種の抗原(TbRa3，TbRa9，TbH4及びTbH12)と、喀痰の抗酸菌染色(Smithwickと David，Tubercle 52:226 1971)では異なる反応性を示す結核菌感染患者の一群から得た血清との反応性も調べ、結核菌溶解物及び38kD抗原の反応性と比較した。結果を下記の表３に示す。表３結核菌患者から得た血清と抗原との反応性 ROC曲線から得られたカットオフ値に基づくと、TbRa3は27検体の陽性血清の内の23検体、TbRa9は27検体の陽性血清の内の22検体、TbH4は27検体の陽性血清の内の18検体、TbH12は27検体の陽性血清の内の15検体を検出した。組み合わせて用いれば、これらの4種の抗原は理論的には27陽性検体中27検体を検出する感度を持つであろうが、このことはこれらの抗原が結核菌感染の血清学的検出に際してそれぞれが補完的な働きをするはずであることを示している。さらに、組換え抗原のいくつかは38kD抗原では検出し得ない陽性血清を検出したが、このことはこれらの抗原が38kD抗原に対して補完的な働きをしうることを示している。 38kD抗原で陰性を示した結核菌患者から得た血清、及びPPD陽性ドナー及び正常のドナーから得た血清と、組換え抗原TbRallとの反応性を上述のELISAで測定した。結果を図６に示すが、その図は、TbRallはPPD陽性ドナー及び正常なドナーから得た血清では陰性であったが、38kD抗原で陰性であった血清を検出しうることを示している。試験した13検体の38kD陰性の血清の内、9検体がTbRallで陽性であったが、これはこの抗原が38kD抗原陰性血清のサブグループと反応しうることを示している。これに対して、TbRallに反応性の38kD陽性血清群においては、TbRallの平均OD 450は38kD抗原のそれよりも低かった。このデータは、TbRall 活性の存在と38kD陽性度との間には反比例の関係があることを示している。 1:100に希釈した血清50μｌを室温で30分間置いた後、PBS/Tweenで洗い、1:10 ,000希釈したビオチン化プロテインＡ(Zymed，San Francisco，米国カリフォルニア州)と30分間インキュベートしたものを用いて、抗原TbRa2Aを間接ELISAで試験した。洗った後、50μｌのストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼ( Zymed)の1:10,000希釈を添加し、混合物を30分間インキュベートした。洗った後、上述のTMB基質でアッセイを発色させた。TbRa2Aの結核菌患者及び正常なドナーから得た血清との反応性を表４に示す。結核菌患者から得た血清とTbRa2Aとの反応性の平均値は0.444で標準偏差は0.309であった。正常なドナーから得た血清との反応性の平均値は0.109で標準偏差は0.029であった。また、38kD陰性血清の試験(図７)でもTbRa2A抗原がこのカテゴリーの血清を検出しうることが示された。表４結核菌患者及び正常なドナーから得た血清とTbRa2Aとの反応性組換え抗原(ｇ)(配列番号６０)と、結核菌患者及び正常なドナーから得た血清との反応性を上述のやり方に従ってELISAで求めた。図８は抗原(ｇ)と、38kD抗原と全て反応した結核菌陽性血清4検体、及び正常ドナー血清4検体とのタイトレーション結果を示す。陽性血清4検体はいずれも抗原(ｇ)と反応した。組換え抗原TbH-29(配列番号１３７)と結核菌患者、PPD陽性ドナー及び正常ドナーから得た血清との反応性を上述の間接ELISA法で求めた。結果は図９に示す。TbH-29は結核菌陽性血清60検体中30検体、PPD陽性血清8検体中2検体、正常血清27検体中2検体を検出した。図１０は、抗原TbH-33（配列番号１４０）と、結核菌患者から得た血清、正常ドナーから得た血清、及び結核菌患者から得た血清をプールしたものとのELISA 試験(直接及び間接の双方)の結果を示す。結核菌患者から得た血清ではOD 450の平均値が正常ドナーのものより高く、間接ELISAでのOD 450の平均値は直接ELISA の値より有意に高かった。図１１は組換えTbH-33と結核菌患者及び正常ドナーから得た血清との反応性のタイトレーション曲線で、これは抗原濃度の増加につれてOD 450の増加が起こることを示している。組換え抗原RDIF6，RDIF8及びRDIF10(それぞれ配列番号184-187)と結核菌患者及び正常ドナーから得た血清との反応性を上述のELISA法で求めた。RDIF6は結核菌血清32検体中6検体、正常血清15検体中0検体を検出し、RDIF8は結核菌血清32 検体中14検体、正常血清15検体中0検体を検出し、RDIF10は結核菌血清27検体中4 検体、正常血清15検体中1検体を検出した。さらにRDIF10はPPD陽性ドナーから得た5検体の血清では全検体とも検出しなかった。実施例７結核菌融合タンパク質の調製および特性決定 TbRa3，38kD抗原およびTb38-1を含有する融合タンパク質は次のようにして調製した。ＤＮＡ構築物TbRa3、38kDおよびTb38-1のそれぞれを、それらの融合および続く融合タンパク質TbRa3-38kD-Tb38-1の発現を容易にするためにPCRにより修飾した。プライマーPDM-64およびPDM-65(配列番号141および142)、PDM-57およびPD M-58(配列番号143および144)、およびPDM-69およびPDM-60(配列番号145および14 6)をそれぞれ使用し、TbRa3、38kDおよびTb38-1ＤＮＡを用いてPCRを実施した。それぞれの場合に、10μｌの10X Pfuバッファー、２μｌの10mM dNTP、それぞれ２μｌの10μＭ濃度のPCRプライマー、81.5μｌの水、1.5μｌのPfuＤＮＡポリメラーゼ(Stratagene，La Jolla，CA)および、70ng/μｌ（TbRa3の場合）または 50ng/μｌ（38kDおよびTb38-1の場合）の濃度の１μｌＤＮＡを用いてＤＮＡ増幅を行った。TbRa3に関しては、94℃で２分間変性を行い、続いて96℃で15秒間および72℃で１分間の40サイクルを行い、最後に72℃で４分間行った。38kDに関しては、96℃で２分間変性を行い、続いて96℃で30秒間、68℃で15秒間および72 ℃で３分間の40サイクルを行い、最後に72℃で４分間行った。Tb38-1に関しては、94℃で２分間変性し、続いて96℃で15秒間、68℃で15秒間および72℃で1.5分間の10サイクル、96℃で15秒間、64℃で15秒間および72℃で1.5の30サイクル、そして最後に72℃で４分間行った。 TbRa3 PCR断片をNdeIおよびEcoRIで消化し、そしてNdeIおよびEcoRI部位を用いてpT7 L2 IL １ベクター中に直接クローン化した。38k DPCR断片はSse8387Iで消化し、T4ＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑末端となし、そして次に、StuIおよびEcoRIで消化しておいたpT7 L2Ra3-1ベクター中に直接クローン化するためにEcoRIで消化した。Tb38-IPCR断片はEco47IIIおよびEcoRIで消化し、そして同じ酵素で消化しておいたpT7 L2Ra3/38kD-17中に直接サブクローン化した。全融合物を次にNdeIおよびEcoRI部位を用いてpET28bに移入した。この融合構築物をＤＮＡシークエンシングにより確認した。この発現構築物をBLR pLys S E.coli(Novagen，Madison，WI)中に形質転換し、カナマイシン（30μｇ/ml）およびクロラムフェニコール（34μｇ/ml）を含有するLBブロス中で一夜増殖させた。この培養物(12ml)を用いて同じ抗生物質を含有する500mlの2XYTを接種し、そして培養物をOD560 0.44でIPTGを用いて最終濃度1.2mMとなるまで誘導した。誘導４時間後、細菌を収穫し、そして20mMトリス( 8.0)，100mM NaCl，0.1% DOC，20μｇ/ml Leupeptin，20mM PMSF中で音波処理し続いて26,000Xgで遠心した。生成したペレットを8M尿素，20mMトリス(8.0)，100 mM NaCl中に再懸濁し、そしてPro-bondニッケル樹脂(Invitrogen,Carlsbad，CA ）に結合させた。カラムを前記バッファーで数回洗浄し次にイミダゾール勾配(8 M尿素，20mMトリス(8.0)，100mM NaCl中に50mM，100mM，500mMイミダゾールを添加)で溶離した。当該タンパク質を含有する溶出液を10mMトリス(8.0)で透析した。得られた融合タンパク質（以下、TbRa3-38kD-Tb38-1と呼ぶ）のＤＮＡおよびアミノ酸配列を配列番号147および148にそれぞれ示す。ヒンジ配列を有しない２つの抗原TbH-9およびTb38-1を含有する融合タンパク質（以下TbH-9-Tb38-1と呼ぶ）を前記したと同様の操作で調製した。TbH-9-Tb38 -1融合タンパク質のＤＮＡ配列を配列番号151に示す。 TbRa3,抗原38kD,Tb38-1およびDPEPを含有する融合タンパク質を次のようにして調製した。ＤＮＡ構築物TbRa3，38kDおよびTb38-1のそれぞれを実質的に前記したようにしてPCRにより修飾し、ベクター中にクローン化した。Tb38-1A断片の増幅にはプライマーPDM-69(配列番号145)およびPDM-83(配列番号200)を使用した。Tb38-1A は最終的なアミノ酸を完全無欠に保持する一方で読み取り枠中にある平滑制限部位を創成しているコード領域の3'末端にあるDraI部位がTb38-1とは異なる。TbRa 3/38kD/Tb38-1A融合物を次にNdeIおよびEcoRI部位を用いてpET28b中に移入した。プライマーPDM-84およびPDM-85(配列番号それぞれ201および202)および50ng/ μｌのＤＮＡ１μｌを用い、DPEPＤＮＡを用いてPCRを実施した。94℃での変性２分間、続いて96℃で15秒間、68℃で15秒間そして72℃で1.5分間の10サイクル、96℃で15秒間、64℃で15秒間そして72℃で1.5分間の30サイクルを行い、最後に72℃で４分間行った。DPEP PCR断片をEcoRIおよびEco72Iで消化し、DraIおよびEcoRIで消化したpET28Ra3/38kD/38-1A構築物中に直接クローン化した。融合タンパク質はＤＮＡ配列決定により正確であると確認された。組換えタンパク質は前記したようにして調製した。得られた融合タンパク質（以下TbF-2と呼ぶ）のＤＮＡおよびアミノ酸配列を配列番号203および204にそれぞれ示す。実施例８結核の血清診断への結核菌融合タンパク質の使用上述の方法で調製した融合タンパク質TbRa3-38kD-Tb38-1の結核感染の血清診断における有効性をELISAで調べた。 ELISAのプロトコールは上述の実施例６に記載のとおり行い、融合タンパク質は200ng/ウエルをコートした。ELISAあるいはウエスタンブロット分析で3種の抗原のそれぞれと単独であるいはそれらを組み合わせたものと反応することが前もって示されている結核患者の一群から血清のパネルを選んだ。そのようなパネルの使用によって、3種のエピトープが全てその融合タンパク質中で機能するかどうかを調べるために融合タンパク質の血清学的反応性を詳細に分析することが可能となった。図５に示すとおり、TbRa3のみと反応した4検体の血清は全て融合タンパク質で検出可能であった。Tb38-1のみと反応した3検体の血清も融合タンパク質で検出可能であり、38kDのみと反応した2検体の血清も同様であった。残りの15検体の血清は、陰性の平均値プラス標準偏差の3倍をこのアッセイでのカットオフ値としたとき、融合タンパク質で全て陽性であった。このデータは融合タンパク質中での3種のエピトープ全てが機能し活性を有することを示している。表５結核菌患者から得た血清とのトリペプチド融合タンパク質の反応性結核菌感染患者からの血清とこの融合タンパク質TbF-2との反応性を前記したプロトコルを用いてELISAにより検査した。これらの研究の結果（表６）は、４つの抗原すべてが融合タンパク質中で独立して機能することを示している。表６ＴＢおよび正常血清とのTbF-2融合タンパク質の反応性当業者であれば、エピトープのそれぞれがなお機能的に利用可能であるならば融合タンパク質内の個々の抗原の順序を変更できること、および同等の活性が予想されようことが理解されよう。さらに、活性エピトープを含有するこのタンパク質の末端切断型も融合タンパク質の構築に使用できる。上記に記載したように、本発明の具体的な態様が説明の目的で本明細書中に記載されているが、本発明の精神および範囲を逸脱することなく種々の改変をなすことができることが理解されよう。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Compounds and methods for diagnosing tuberculosis Technical field The present invention relates generally to the detection of Mycobacterium tuberculosis infection. You. The invention more particularly relates to M. tuberculosis antigens, or parts or other variants thereof. Polypeptide comprising a variant, and said polypeptide for serodiagnosis of M. tuberculosis infection Concerning the use of tide. Background of the Invention Tuberculosis is a chronic infection, commonly caused by infection with Mycobacterium tuberculosis . Tuberculosis has about 8 million new cases each year and 3 million deaths. It is a major illness in developing countries and is increasing in developed countries. You. The infection can be asymptomatic for a considerable period of time, but the disease is most commonly Manifests as acute inflammation of the skin, resulting in fever and cough without sputum. Left untreated This typically results in severe complications and death. Tuberculosis can generally be managed with long-term antibiotic therapy, but Ung treatment is not enough to prevent the spread of the disease. Infected people The interval can be asymptomatic, but can be a carrier. In addition, following a treatment regime Is absolutely important, but it is difficult to monitor patient behavior. Some patients Does not end the course of treatment, renders treatment ineffective and can develop drug resistance . Controlling the spread of TB requires effective vaccination and accurate early diagnosis of the disease. It is important. Currently, live bacterial vaccination is the most efficient way to induce protective immunity Is the way. The most common mycobacteria used for this purpose are bovine tuberculosis Bacillus Calmette-Guerin (BCG), a non-toxic strain of Mycobacterium bovis You. However, the safety and effectiveness of BCG is a source of controversy, including in the United States Some countries have not vaccinated the general public. Diagnosis is usually skin examination Intradermal exposure to tuberculin PPD (purified protein derivative) Including. Injection within 48-72 hours after injection as a result of antigen-specific T cell response There is a measurable cirrhosis at the site, indicating exposure to mycobacterial antigens is there. However, sensitivity and specificity are issues with this test, and BC Individuals vaccinated with G cannot be distinguished from infected individuals. Can macrophages act as major effectors of M. tuberculosis immunity? Thus, T cells are potent inducers of such immunity. Preventing Mycobacterium tuberculosis infection T cell plays an essential role in human immunodeficiency virus (HIV) infection Of depleted CD4 T cells, resulting in frequent occurrence of M. tuberculosis in AIDS patients Explained. Mycobacteria-reactive CD4 T cells are γ-interferon (I FN-γ) has been shown to be a potent producer of It has been shown to elicit the antimycobacterial effect of phage. In humans Although the role of IFN-γ is less clear, studies have shown that 1,25-dihydroxy-bi Tamine D3 alone or in combination with IFN-γ or tumor necrosis factor α To activate human macrophages to prevent M. tuberculosis infection Was. In addition, IFN-γ stimulates human macrophages to 1,25-dihydroxy- It is known to produce vitamin D3. Similarly, IL-12 is resistant to M. tuberculosis It has been found to play a role in stimulating resistance to dyeing. tuberculosis For an overview of the immunology of bacterial infection, see Chan and Kaufmann, Tuberculosis: Pathoge. nesis, Protection and Control, Bloom (ed.), ASM Press, Washington, DC, 1 See 994. Accordingly, there is a need in the art for an improved diagnostic method for detecting tuberculosis. A law is needed. The present invention fulfills this need, and furthermore, Provide other related advantages. Summary of the Invention Briefly, the present invention provides compositions and methods for diagnosing tuberculosis. You. In one aspect, the antigenic portion of a soluble Mycobacterium tuberculosis antigen, or a conservative substitution or And / or comprising an antigenic portion of a variant of said antigen which differs only in modification A peptide is provided. In one embodiment of this aspect, the soluble antigen is N-terminal sequence:(Where Xaa can be any amino acid) Having one of In a related aspect, the immunogenic portion of a M. tuberculosis antigen, or a conservative substitution and And / or a polypeptide comprising an immunogenic portion of a variant of said antigen which differs only in modification A peptide wherein the antigen is the following N-terminal sequence: (Where Xaa can be any amino acid) Is provided. In another embodiment, the soluble Mycobacterium tuberculosis antigen is SEQ ID NOs: 1, 2, 4-10, 13-25, 52, 94 and 96, the complementary sequence of said sequence, And SEQ ID NOs: 1, 2, 4 to 10, 13 to 25, 52, 94 and 96 Sequence or its complementary sequence under moderate stringency conditions. Encoded by a DNA sequence selected from the group consisting of a soybean DNA sequence Amino acid sequence. In a related aspect, the polypeptide is an antigenic portion of a M. tuberculosis antigen, or a polypeptide. Antigenic portions of variants of said antigen differing only in conservative substitutions and / or modifications Wherein the antigen is SEQ ID NO: 26-51, 133, 134, 158-17 8 and 196, the complement of said sequence, and SEQ ID NO: 2 6-51, 133, 134, 158-178 and 196; Is a DN that hybridizes to its complementary sequence under moderately stringent conditions. Amino acid sequence encoded by a DNA sequence selected from the group consisting of A sequences including. In a related aspect, the DNA sequences encoding the polypeptides, A recombinant expression vector comprising the DNA sequence and transformation with said expression vector or Also provided is a transfected host cell. In another aspect, the present invention provides first and second polypeptides of the invention, and Provides a fusion protein comprising a polypeptide of the invention and a known Mycobacterium tuberculosis antigen. In a further aspect of the present invention, methods and diagnostics for detecting tuberculosis in a patient A kit is provided. The method comprises the steps of (a) adding one or more of the polypeptides to a biological sample. Contacting the peptide and (b) the presence of an antibody that binds to at least one polypeptide In a sample, thereby detecting a M. tuberculosis infection in a biological sample, Including. Suitable biological samples include whole blood, sputum, serum, plasma, saliva, cerebrospinal cord Includes fluid and urine. The diagnostic kit comprises one or more of the polypeptides and a detection reagent. Including combinations with The present invention also provides a method for detecting a Mycobacterium tuberculosis infection, the method comprising: (a) A) taking a biological sample from the patient, and (b) subjecting the sample to polymerase chain reaction. Contacting at least one oligonucleotide primer with the oligonucleotide Otide primers are specific for a DNA sequence encoding the polypeptide, And (c) amplifying in the presence of the first and second oligonucleotide primers Detecting the DNA sequence in the sample. In one embodiment, the oligonucleotide Otide primers comprise at least about 10 contiguous nucleotides of the DNA sequence. Including. In a further aspect, the invention provides a method for detecting a Mycobacterium tuberculosis infection in a patient. The method comprises the steps of (a) obtaining a biological sample from a patient, and (b) Contact with oligonucleotide probes specific for the DNA sequence encoding the repeptide Touching and (c) a DN that hybridizes to the oligonucleotide probe Detecting the A sequence in the sample. In one embodiment, the oligonucleotide The probe comprises at least about 15 contiguous nucleotides of the DNA sequence. In yet another aspect, the invention relates to polyclonal binding to the polypeptide. Antibodies, both monoclonal and monoclonal, and those in the detection of M. tuberculosis infection Provides usage of These and other aspects of the present invention are described in the following detailed description and accompanying drawings. Will become apparent by reference to References disclosed herein Are all in their entirety for reference, as if each were individually incorporated. I will include it in the detailed book. Brief description of the drawing and sequence identifier FIGS. 1A and B show T-cells derived from first and second M. tuberculosis-immune donors. 14K of vesicle growth and interferon-γ production, respectively, as described in Example 1. Shows stimulation by d, 20Kd and 26Kd antigens. 2A-D show secreted Mycobacterium tuberculosis protein, a known Mycobacterium tuberculosis antigen 85b and the present invention. Of antisera against the clear antigens Tb38-1 and TbH-9, respectively, Digest (lane 2), M. tuberculosis secreted protein (lane 3), recombinant Tb38-1 (lane 2) Lane 4), recombinant TbH-9 (lane 5) and recombinant 85b (lane 5) Shows the reactivity of FIG. 3A shows the secreted M. tuberculosis protein of the expansion of TbH-9 specific T cell clones. , Shows stimulation with recombinant TbH-9 and control antigen TbRa11. FIG. 3B shows the interferon-γ production of TbH-9 specific T cell clones. FIG. 9 shows stimulation by secreted M. tuberculosis proteins, PPD and recombinant TbH-9. FIG. 4 shows two representative polypeptides from M. tuberculosis infected and uninfected individuals. Is shown relative to the reactivity of the bacterial lysate. FIG. 5 shows four representative polypeptides and those from infected and uninfected individuals of M. tuberculosis. Is shown in comparison with the reactivity of the 38 kD antigen. FIG. 6 shows recombinant 38 kD and TbRa11 antigens, M. tuberculosis patients, PPD positive Figure 3 shows reactivity with sera from donors and normal donors. FIG. 7 shows the reactivity of the antigen TbRa2A with a 38 kD negative serum. FIG. 8 shows that the antigen of SEQ ID NO: 60 was combined with serum from M. tuberculosis patients and normal donors. Shows reactivity. FIG. 9 shows that recombinant antigen TbH-29 (SEQ ID NO: 137) and M. tuberculosis patient, PPD Reactivity as measured by indirect ELISA with sera from positive and normal donors Is shown. FIG. 10 shows recombinant antigen TbH-33 (SEQ ID NO: 140) and M. tuberculosis patient-derived Directly with sera from normal and normal donors and with a pool of sera from M. tuberculosis patients. The reactivity measured by direct and indirect ELISA is shown. FIG. 11 shows the recombinant antigen TbH-33 (SEQ ID NO: 140) and M. tuberculosis patients. 2 shows the reactivity of sera from normal and normal donors as measured by ELISA. SEQ ID NO: 1 is the DNA sequence of TbRa1. SEQ ID NO: 2 is the DNA sequence of TbRa11. SEQ ID NO: 3 is the DNA sequence of TbRa11. SEQ ID NO: 4 is the DNA sequence of TbRa12. SEQ ID NO: 5 is the DNA sequence of TbRa13. SEQ ID NO: 6 is the DNA sequence of TbRa16. SEQ ID NO: 7 is the DNA sequence of TbRa17. SEQ ID NO: 8 is the DNA sequence of TbRa18. SEQ ID NO: 9 is the DNA sequence of TbRa19. SEQ ID NO: 10 is the DNA sequence of TbRa24. SEQ ID NO: 11 is the DNA sequence of TbRa26. SEQ ID NO: 12 is the DNA sequence of TbRa28. SEQ ID NO: 13 is the DNA sequence of TbRa29. SEQ ID NO: 14 is the DNA sequence of TbRa2A. SEQ ID NO: 15 is the DNA sequence of TbRa3. SEQ ID NO: 16 is the DNA sequence of TbRa32. SEQ ID NO: 17 is the DNA sequence of TbRa35. SEQ ID NO: 18 is the DNA sequence of TbRa36. SEQ ID NO: 19 is the DNA sequence of TbRa4. SEQ ID NO: 20 is the DNA sequence of TbRa9. SEQ ID NO: 21 is the DNA sequence of TbRaB. SEQ ID NO: 22 is the DNA sequence of TbRaC. SEQ ID NO: 23 is the DNA sequence of TbRaD. SEQ ID NO: 24 is the DNA sequence of YYWCPG. SEQ ID NO: 25 is the DNA sequence of AAMK. SEQ ID NO: 26 is the DNA sequence of TbL-23. SEQ ID NO: 27 is the DNA sequence of TbL-24. SEQ ID NO: 28 is the DNA sequence of TbL-25. SEQ ID NO: 29 is the DNA sequence of TbL-28. SEQ ID NO: 30 is the DNA sequence of TbL-29. SEQ ID NO: 31 is the DNA sequence of TbH-5. SEQ ID NO: 32 is the DNA sequence of TbH-8. SEQ ID NO: 33 is the DNA sequence of TbH-9. SEQ ID NO: 34 is the DNA sequence of TbM-1. SEQ ID NO: 35 is the DNA sequence of TbM-3. SEQ ID NO: 36 is the DNA sequence of TbM-6. SEQ ID NO: 37 is the DNA sequence of TbM-7. SEQ ID NO: 38 is the DNA sequence of TbM-9. SEQ ID NO: 39 is the DNA sequence of TbM-12. SEQ ID NO: 40 is the DNA sequence of TbM-13. SEQ ID NO: 41 is the DNA sequence of TbM-14. SEQ ID NO: 42 is the DNA sequence of TbM-15. SEQ ID NO: 43 is the DNA sequence of TbH-4. SEQ ID NO: 44 is the DNA sequence of TbH-4-FWD. SEQ ID NO: 45 is the DNA sequence of TbH-12. SEQ ID NO: 46 is the DNA sequence of Tb38-1. SEQ ID NO: 47 is the DNA sequence of Tb38-4. SEQ ID NO: 48 is the DNA sequence of TbL-17. SEQ ID NO: 49 is the DNA sequence of TbL-20. SEQ ID NO: 50 is the DNA sequence of TbL-21. SEQ ID NO: 51 is the DNA sequence of TbH-16. SEQ ID NO: 52 is the DNA sequence of DPEP. SEQ ID NO: 53 is the predicted amino acid sequence of DPEP. SEQ ID NO: 54 is the protein sequence of the DPV N-terminal antigen. SEQ ID NO: 55 is the protein sequence of the AVGS N-terminal antigen. SEQ ID NO: 56 is the protein sequence of AAMK N-terminal antigen. SEQ ID NO: 57 is the protein sequence of the YYWC N-terminal antigen. SEQ ID NO: 58 is the protein sequence of the DIGS N-terminal antigen. SEQ ID NO: 59 is the protein sequence of the AEES N-terminal antigen. SEQ ID NO: 60 is the protein sequence of the DPEP N-terminal antigen. SEQ ID NO: 61 is the protein sequence of the APKT N-terminal antigen. SEQ ID NO: 62 is the protein sequence of the DPAS N-terminal antigen. SEQ ID NO: 63 is the predicted amino acid sequence of the TbM-1 peptide. SEQ ID NO: 64 is the deduced amino acid sequence of TbRa1. SEQ ID NO: 65 is the predicted amino acid sequence of TbRa10. SEQ ID NO: 66 is the deduced amino acid sequence of TbRa11. SEQ ID NO: 67 is the predicted amino acid sequence of TbRa12. SEQ ID NO: 68 is the deduced amino acid sequence of TbRa13. SEQ ID NO: 69 is the deduced amino acid sequence of TbRa16. SEQ ID NO: 70 is the predicted amino acid sequence of TbRa17. SEQ ID NO: 71 is the predicted amino acid sequence of TbRa18. SEQ ID NO: 72 is the deduced amino acid sequence of TbRa19. SEQ ID NO: 73 is the predicted amino acid sequence of TbRa24. SEQ ID NO: 74 is the predicted amino acid sequence of TbRa26. SEQ ID NO: 75 is the deduced amino acid sequence of TbRa28. SEQ ID NO: 76 is the predicted amino acid sequence of TbRa29. SEQ ID NO: 77 is the deduced amino acid sequence of TbRa2A. SEQ ID NO: 78 is the deduced amino acid sequence of TbRa3. SEQ ID NO: 79 is the predicted amino acid sequence of TbRa32. SEQ ID NO: 80 is the predicted amino acid sequence of TbRa35. SEQ ID NO: 81 is the predicted amino acid sequence of TbRa36. SEQ ID NO: 82 is the deduced amino acid sequence of TbRa4. SEQ ID NO: 83 is the deduced amino acid sequence of TbRa9. SEQ ID NO: 84 is the predicted amino acid sequence of TbRaB. SEQ ID NO: 85 is the predicted amino acid sequence of TbRaC. SEQ ID NO: 86 is the predicted amino acid sequence of TbRaD. SEQ ID NO: 87 is the predicted amino acid sequence of YYWCPG. SEQ ID NO: 88 is the deduced amino acid sequence of TbAAMK. SEQ ID NO: 89 is the predicted amino acid sequence of Tb38-1. SEQ ID NO: 90 is the predicted amino acid sequence of TbH-4. SEQ ID NO: 91 is the predicted amino acid sequence of TbH-8. SEQ ID NO: 92 is the predicted amino acid sequence of TbH-9. SEQ ID NO: 93 is the predicted amino acid sequence of TbH-12. SEQ ID NO: 94 is the DNA sequence of DPAS. SEQ ID NO: 95 is the predicted amino acid sequence of DPAS. SEQ ID NO: 96 is the DNA sequence of DPV. SEQ ID NO: 97 is the predicted amino acid sequence of DPV. SEQ ID NO: 98 is the DNA sequence of ESAT-6. SEQ ID NO: 99 is the deduced amino acid sequence of ESAT-6. SEQ ID NO: 100 is the DNA sequence of TbH-8-2. SEQ ID NO: 101 is the DNA sequence of TbH-9FL. SEQ ID NO: 102 is the predicted amino acid sequence of TbH-9FL. SEQ ID NO: 103 is the DNA sequence of TbH-9-1. SEQ ID NO: 104 is the predicted amino acid sequence of TbH-9-1. SEQ ID NO: 105 is the DNA sequence of TbH-9-4. SEQ ID NO: 106 is the predicted amino acid sequence of TbH-9-4. SEQ ID NO: 107 is the DNA sequence of Tb38-IF2IN. SEQ ID NO: 108 is the DNA sequence of Tb38-2F2RP. SEQ ID NO: 109 is the predicted amino acid sequence of Tb37-FL. SEQ ID NO: 110 is the predicted amino acid sequence of Tb38-IN. SEQ ID NO: 111 is the DNA sequence of Tb38-IF3. SEQ ID NO: 112 is the predicted amino acid sequence of Tb38-IF3. SEQ ID NO: 113 is the DNA sequence of Tb38-IF5. SEQ ID NO: 114 is the DNA sequence of Tb38-IF6. SEQ ID NO: 115 is the predicted N-terminal amino acid sequence of DPV. SEQ ID NO: 116 is the predicted N-terminal amino acid sequence of AVGS. SEQ ID NO: 117 is the predicted N-terminal amino acid sequence of AAMK. SEQ ID NO: 118 is the predicted N-terminal amino acid sequence of YYWC. SEQ ID NO: 119 is the predicted N-terminal amino acid sequence of DIGS. SEQ ID NO: 120 is the predicted N-terminal amino acid sequence of AEES. SEQ ID NO: 121 is the predicted N-terminal amino acid sequence of DPEP. SEQ ID NO: 122 is the predicted N-terminal amino acid sequence of APKT. SEQ ID NO: 123 is the predicted amino acid sequence of DPAS. SEQ ID NO: 124 is the protein sequence of the DPPDN terminal antigen. SEQ ID NOs: 125-128 are the protein sequences of the four DPPD cyanogen bromide fragments It is. SEQ ID NO: 129 is the N-terminal protein sequence of the XDS antigen. SEQ ID NO: 130 is the N-terminal protein sequence of the AGD antigen. SEQ ID NO: 131 is the N-terminal protein sequence of the APE antigen. SEQ ID NO: 132 is the N-terminal protein sequence of the XYI antigen. SEQ ID NO: 133 is the DNA sequence of TbH-29. SEQ ID NO: 134 is the DNA sequence of TbH-30. SEQ ID NO: 135 is the DNA sequence of TbH-32. SEQ ID NO: 136 is the DNA sequence of TbH-33. SEQ ID NO: 137 is the predicted amino acid sequence of TbH-29. SEQ ID NO: 138 is the predicted amino acid sequence of TbH-30. SEQ ID NO: 139 is the predicted amino acid sequence of TbH-32. SEQ ID NO: 140 is the predicted amino acid sequence of TbH-33. SEQ ID NOs: 141-146 include TbRa3, 38 kD, and Tb38-1 PCR primers used for the preparation of the fusion protein. SEQ ID NO: 147 is a fusion protein comprising TbRa3, 38 kD and Tb38-1 This is the DNA sequence of the protein. SEQ ID NO: 148 is a fusion protein comprising TbRa3, 38 kD and Tb38-1 This is the amino acid sequence of the protein. SEQ ID NO: 149 is the DNA sequence of Mycobacterium tuberculosis antigen 38 kD. SEQ ID NO: 150 is the amino acid sequence of Mycobacterium tuberculosis antigen, 38 kD. SEQ ID NO: 151 is the DNA sequence of XP14. SEQ ID NO: 152 is the DNA sequence of XP24. SEQ ID NO: 153 is the DNA sequence of XP31. SEQ ID NO: 154 is the 5 'DNA sequence of XP32. SEQ ID NO: 155 is the 3 'DNA sequence of XP32. SEQ ID NO: 156 is the predicted amino acid sequence of XP14. SEQ ID NO: 157 is the predicted amino acid encoded by the reverse complement of XP14 It is an acid sequence. SEQ ID NO: 158 is the DNA sequence of XP27. SEQ ID NO: 159 is the DNA sequence of XP36. SEQ ID NO: 160 is the 5 'DNA sequence of XP4. SEQ ID NO: 161 is the 5 'DNA sequence of XP5. SEQ ID NO: 162 is the 5 'DNA sequence of XP17. SEQ ID NO: 163 is the 5 'DNA sequence of XP30. SEQ ID NO: 164 is the 5 'DNA sequence of XP2. SEQ ID NO: 165 is the 3 'DNA sequence of XP2. SEQ ID NO: 166 is the 5 'DNA sequence of XP3. SEQ ID NO: 167 is the 3 ′ DNA sequence of XP3. SEQ ID NO: 168 is the 5 'DNA sequence of XP6. SEQ ID NO: 169 is the 3 'DNA sequence of XP6. SEQ ID NO: 170 is the 5 'DNA sequence of XP18. SEQ ID NO: 171 is the 3 'DNA sequence of XP18. SEQ ID NO: 172 is the 5 'DNA sequence of XP19. SEQ ID NO: 173 is the 3 'DNA sequence of XP19. SEQ ID NO: 174 is the 5 'DNA sequence of XP22. SEQ ID NO: 175 is the 3 'DNA sequence of XP22. SEQ ID NO: 176 is the 5 'DNA sequence of XP25. SEQ ID NO: 177 is the 3 'DNA sequence of XP25. SEQ ID NO: 178 is the full-length DNA sequence of TbH4-XP1. SEQ ID NO: 179 is the predicted amino acid sequence of TbH4-XP1. SEQ ID NO: 180 is a sequence encoded by the reverse complementary sequence of TbH4-XP1. It is a measured amino acid sequence. SEQ ID NO: 181 is the first predicted amino acid sequence encoded by XP36 is there. SEQ ID NO: 182 is the second predicted amino acid sequence encoded by XP36 is there. SEQ ID NO: 183 is the predicted amino acid encoded by the reverse complement of XP36 It is an acid sequence. SEQ ID NO: 184 is the DNA sequence of RDIF2. SEQ ID NO: 185 is the DNA sequence of RDIF5. SEQ ID NO: 186 is the DNA sequence of RDIF8. SEQ ID NO: 187 is the DNA sequence of RDIF10. SEQ ID NO: 188 is the DNA sequence of RDIF11. SEQ ID NO: 189 is the predicted amino acid sequence of RDIF2. SEQ ID NO: 190 is the predicted amino acid sequence of RDIF5. SEQ ID NO: 191 is the predicted amino acid sequence of RDIF8. SEQ ID NO: 192 is the predicted amino acid sequence of RDIF10. SEQ ID NO: 193 is the predicted amino acid sequence of RDIF11. SEQ ID NO: 194 is the 5 'DNA sequence of RDIF12. SEQ ID NO: 195 is the 3 'DNA sequence of RDIF12. SEQ ID NO: 196 is the DNA sequence of RDIF7. SEQ ID NO: 197 is the predicted amino acid sequence of RDIF7. SEQ ID NO: 198 is the DNA sequence of DIF2-1. SEQ ID NO: 199 is the predicted amino acid sequence of DIF2-1. SEQ ID NOs: 200-207 are TbRa3, 38 kD, Tb38-1 and DP PCR used for preparation of fusion protein containing EP (hereinafter referred to as TbF-2) It is a primer. SEQ ID NO: 208 is the DNA sequence of fusion protein TbF-2. SEQ ID NO: 209 is the amino acid sequence of fusion protein TbF-2. Detailed description of the invention As described above, the present invention generally relates to compositions and methods for diagnosing tuberculosis. Related. The composition of the present invention comprises M. tuberculosis (M. tuberculosis) at least one of the antigens Differ only in antigenic portions, or conservative substitutions and / or modifications. Polypeptides comprising variants of such antigens. Within the scope of the present invention Polypeptides include, but are not limited to, soluble Mycobacterium tuberculosis antigens. No. "Soluble M. tuberculosis" refers to the protein originating from M. tuberculosis that is Quality. As used herein, the term "polypeptide" refers to a full-length Encompasses amino acid chains of any length, including proteins (ie, antigens) Are linked by a covalent peptide bond. Therefore, of the above antigens A polypeptide comprising one of the antigenic portions is composed entirely of the antigenic portion Or may have additional sequences. This further sequence is It may be derived from a conventional Mycobacterium tuberculosis antigen or may be heterologous, Such sequences may (but need not) be antigenic. The "antigenic part" of an antigen (which may or may not be soluble) is the M. tuberculosis infected individual (Ie, as described herein). Absorbance obtained using serum from uninfected individuals in a typical ELISA assay Read using serum from infected individuals that is at least 3 standard deviations above (Which generates absorbance). “M. tuberculosis infected individuals” are those infected with M. tuberculosis (For example, at least 0. With endothelial skin test response to 5cm diameter PPD) Human. Infected individuals may show symptoms of tuberculosis or have no symptoms of the disease You may. At least one antigenicity of one or more M. tuberculosis antigens described herein Polypeptides containing moieties are generally used alone or in combination to bind a patient. The nucleus can be detected. The compositions and methods of the present invention also include variants of the above polypeptides. Book As used herein, a “variant” refers to one that retains the antigenicity of the polypeptide. A polypeptide that differs from the original antigen only in conservative substitutions and / or modifications. is there. Such variants generally modify one of the above polypeptide sequences. And modifying the modified polypeptide using, for example, the representative procedures described herein. Can be identified by evaluating antigenicity. “Conservative substitutions” are polypeptides that are not substantially altered by those skilled in peptide chemistry. Amino acids have similar properties, as expected for the secondary structure and hydropathic properties of Is substituted with another amino acid. In general, the following amino acid groups are conserved: Represents alterative changes: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; and (5) ) phe, tyr, trp, his. Similarly (or alternatively), for example, the antigenicity, secondary structure of a polypeptide Deletion or addition of amino acids that have minimal effect on structural and hydropathic properties And can also modify the mutant. For example, a polypeptide can be Move the protein at the N-terminus of the protein, either simultaneously or post-translationally It can be linked to a signal (ie, leader) sequence. Also, polypep Facilitates the synthesis, purification or identification of tides as linkers or polypeptides Or other sequence to enhance binding of the polypeptide to the solid support (e.g., For example, it can be bound to poly-His). For example, immunoglobulin Can be bound to the Fc region. In a related aspect, a combination polypeptide is disclosed. “Combination "Polypeptide" comprises at least one of the above antigenic portions and one or more additional Antigenic Mycobacterium tuberculosis sequences, which are linked by peptide bonds to form a single amino acid It is a polypeptide that forms an acid chain. These sequences can be directly linked (ie, No intervening amino acids), greatly reducing the antigenicity of its component polypeptides Even if linked by a linker sequence (for example, Gly-Cys-Gly) Good. Generally, M. tuberculosis antigens, and the DNA sequences encoding such antigens can vary widely. It can be prepared using any of the procedures. For example, anion exchange and reverse phase Soluble antigens can be cultured for M. tuberculosis by procedures known to those of skill in the art, including chromatography. Can be isolated from the filtrate. Next, the purified antigen is combined with desired properties, for example, Can be evaluated for its ability to react with serum obtained from M. tuberculosis infected individuals . Such screening may be performed using the representative methods described herein. Can be. Then, using techniques such as traditional Edman chemistry, the antigen To It can be partially sequenced. Edman and Berg, Eur. J. Biochem. 80: 116-132 , 1967. In addition, the antigen encodes the antigen, and is inserted into an expression vector so as to have an appropriate host. It can also be produced recombinantly using a DNA sequence that is mainly expressed . DNA molecules encoding soluble antigens are specifically produced for soluble M. tuberculosis antigens. A suitable M. tuberculosis expression library using the same antiserum (eg, rabbit) Can be isolated. Whether soluble or not, The DNA sequence encoding the antigen is a suitable M. tuberculosis genomic or cDNA expression library. Screening rallies with sera from patients infected with M. tuberculosis Can be re-identified. Such screening is generally routine to one of ordinary skill in the art. Known techniques, for example, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989 It can be performed using: In addition, the DNA sequence encoding the soluble antigen may be an appropriate Mycobacterium tuberculosis cDNA or A genomic DNA library was prepared based on the partial amino acid sequence of the isolated soluble antigen. DNA sequences that hybridize to the degenerate oligonucleotides And can be obtained by screening. Such screening The degenerate oligonucleotide sequences used in are described in (for example) Sambrook et al., Mo. lecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Designed as described in Spring Harbor, NY (and references cited therein) And can be synthesized and screened as described there. Can be. In addition, the polymerase chain reaction (PCR) is performed by a method known in the art. The method is performed using the above oligonucleotide in the cDNA or genomic library. The nucleic acid probe can also be isolated from the nucleic acid. Next, this isolated probe Can be used to screen a library. Regardless of the method of preparation, the antigens described herein are "antigenic". More specific Typically, these antigens have the ability to react with serum from M. tuberculosis infected individuals. I do. Reactivity is assessed, for example, using a representative ELISA assay described herein. In this case, the absorbance obtained using serum from an uninfected individual can be exceeded. Absorbance read using serum from infected individuals with at least three standard deviations Light intensity is considered positive. Antigenic portions of Mycobacterium tuberculosis antigens can be prepared by well-known techniques, for example, Paul, FundamentalIm. munology, 3d ed. , Raven Press, 1993, pp. 243-247 and references cited therein Can be prepared and identified using those summarized in Such technologies include Involves screening the polypeptide portion of the original antigen for antigenicity. I will. Representative ELISAs described herein are generally used in these screens. Can be used. The antigenic portion of a polypeptide is such a representative assay Produce a signal substantially similar to that produced by the full-length antigen. This refers to the part generated by such a test. In other words, the antigenic portion of the M. tuberculosis antigen Signa induced by full-length antigen in a model ELISA described herein At least about 20%, preferably about 100% of the Some M. tuberculosis antigens and other mutants may be produced by synthetic or recombinant means Can be. A combination having less than about 100 amino acids, generally less than about 50 amino acids. Synthetic polypeptides can be produced using techniques well known to those skilled in the art. example Such polypeptides, for example, have a continuous addition of amino acids to a growing chain of amino acids. Synthesis using any of the commercially available solid phase techniques, e.g., the Merrifield solid phase synthesis method. Can be achieved. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2146, see 1963 thing. Applied Biosystems for automated polypeptide synthesis (Applied BioSystems, Inc. ), A city from a supplier like Foster City, CA It is sold and can be operated according to manufacturer's instructions. Changes in the original antigen Variants are generally engineered using standard mutagenesis techniques, such as oligonucleotide-directed It can be prepared using sex site-directed mutagenesis. In addition, the DNA sequence The compartments can also be removed using standard techniques to prepare truncated polypeptides. it can. Recombinant polypeptides containing portions and / or variants of the original antigen will be publicly available to those of skill in the art. The DNA sequence encoding the polypeptide can be easily converted using various techniques known in the art. Can be prepared. For example, a suitable medium that secretes the recombinant protein into the culture medium The supernatant from the host / vector system is first concentrated using a commercially available filter be able to. After concentration, the concentrate is applied to a suitable purification matrix, e.g. It can be applied to a matrix or an ion exchange resin. Finally, once The above reverse phase HPLC step can be used to further purify the recombinant protein. You. Any of a variety of expression vectors known to those of skill in the art can be engineered as described herein. Can be used for the expression of polypeptides. Expression involves recombinant polypeptides. Transfected or transfected with an expression vector containing the DNA molecule to be loaded. It can be achieved in a host cell that is too sensitive. Suitable host cells include prokaryotes, yeast Includes mother and higher eukaryotic cells. Preferably, the host cell used is E. coli, A mother or mammalian cell line, such as COS or CHO. Expressed in this way The resulting DNA sequence encodes a naturally occurring antigen, a portion of a naturally occurring antigen, or other variant thereof. Can be loaded. In general, regardless of the method of preparation, the polypeptides disclosed herein will be substantially Prepared in pure form. Preferably, these polypeptides have at least about 80 % Purity, preferably at least about 90% pure, and most preferably At least about 99% pure. However, use in the methods described herein Use a combination of such substantially pure polypeptides. You may. In certain embodiments, the present invention relates to a kit comprising one of the following N-terminal sequences: At least one antigenic portion of a lytic tuberculosis antigen (or a variant of such an antigen) Disclosed are polypeptides comprising: (Where Xaa may be any amino acid, preferably a cysteine residue is there. ) The DNA sequence encoding the antigen identified as (g) above is set forth in SEQ ID NO: 52. And its deduced amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 53. As (a) above The DNA sequence encoding the identified antigen is set forth in SEQ ID NO: 96; The amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 97. DNA sequence corresponding to the antigen (d) The sequence is shown in SEQ ID NO: 24 and the DNA sequence corresponding to antigen (c) is shown in SEQ ID NO: 25 And the DNA sequence corresponding to antigen (i) is set forth in SEQ ID NO: 94, The deduced amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 95. In a further specific embodiment, the present invention provides one of the following N-terminal sequences: At least one immunogenic portion of a M. tuberculosis antigen, or conservative substitutions and / or Disclose polypeptides that include those variants that differ only in modification: (Where Xaa may be any amino acid, preferably a cysteine residue is there. ) In another specific embodiment, the invention relates to (a) SEQ ID NOs: 1, 2, 4-10, 13-25 , 52, 94 and 96; (b) the complementary sequence of such a DNA sequence; Is (c) a DNA sequence substantially homologous to the sequence of (a) or (b), A soluble Mycobacterium tuberculosis antigen comprising one or more encoded amino acid sequences (or such Polypeptides comprising at least one antigenic portion of an antigen variant) are disclosed. In a further specific embodiment, the invention relates to (a) SEQ ID NOs: 26-51, 133, 134 158-178 and 196, (b) the complementary sequence of such a DNA sequence, or (C) a DNA sequence substantially homologous to the sequence of (a) or (b); Tuberculosis, which may or may not be soluble, containing one or more amino acid sequences to be loaded Possibly comprising at least one antigenic portion of a bacterial antigen (or a variant of such an antigen) A polypeptide is disclosed. In certain embodiments discussed above, Mycobacterium tuberculosis antigens include those specifically described herein. A DNA sequence that is substantially homologous to one or more of the DNA sequences described in Variants to be loaded. As used herein, "substantially homologous" DNA sequence capable of hybridizing under equally stringent conditions Point to. Suitable moderately stringent conditions are 5 × SSC, 0.5% SDS, Pre-wash with a solution of 1.0 mM EDTA (pH 8.0); 50 ° -65 ° C., 5 × SSC 45 ° C., 0.5 × SS overnight or in the event of cross-species homology C .: Then 2 ×, 0.5% with 0.1% SDS at 65 ° C. for 20 minutes. Washing twice with each of × and 0.2 × SSC. Such a hybrid DNA sequences that they hybridize due to code degeneracy. A nucleotide sequence encoding an immunogenic polypeptide encoded by the A sequence Because they are columns, they are within the scope of the present invention. In a related aspect, the invention relates to the polypeptides of the first and second invention or Polypeptides of the invention and known Mycobacterium tuberculosis antigens, such as the 38 kD antigen or ESAT-6 described above (SEQ ID NOs: 98 and 99) comprising the fusion protein Provided with the mutant of The fusion protein of the present invention comprises these first and second A linker peptide may be included between the polypeptides. The DNA sequence encoding the fusion protein of the present invention can be prepared by known recombinant DNA technology. Expression of separate DNA sequences encoding the first and second polypeptides using Build to assemble into a vector. DNA sequence encoding the first polypeptide The 3 ′ end of the row can be modified with or without a peptide linker to the second poly Ligation to the 5 'end of the DNA sequence encoding the peptide, thereby The reading frame is in phase and both the first and second polypeptides M of these two DNA sequences into a single fusion protein that retains biological activity Enables RNA translation. Only enough distance to ensure that each polypeptide folds into its secondary and tertiary structure Using a peptide linker sequence to isolate the first and second polypeptides Can be. Such peptide linker sequences can be prepared using standard techniques well known in the art. And is bound to the fusion protein. A suitable peptide linker sequence depends on the following factors: Can be selected based on: (1) Flexible extension conformation (2) functional epitopes of the first and second polypeptides Inability to assume a secondary structure capable of interacting with the polypeptide; and (3) the polypeptide No hydrophobic or charged residues capable of reacting with the functional epitope of Preferred peptide linker sequences have Gly, Asn and Ser residues. Thr and Ala Other near neutral amino acids can also be used for the linker sequence. With linker An amino acid sequence that can be used advantageously is Maratea et al., Gene 40: 39- 46, 1985; Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8258-8262,1986; U.S. Patent No. 4 , 935,233 and U.S. Patent No. 4,751,180. linker The sequence may be from 1 to about 50 amino acids in length. The first and second polypeptides are Non-essential N-terminal amino that can be used to separate functional domains and avoid steric hindrance If it has an acid region, no peptide linker sequence is required. In yet another aspect, the invention uses a polypeptide as described above for the diagnosis of tuberculosis. Provide a way. In this embodiment, one of the above polypeptides or More than that, alone or in combination, can be used to control M. tuberculosis infection in biological samples. To provide a method for detecting In embodiments using more than one polypeptide, Polypeptides other than those specifically described herein, such as Andersen and Hansen, Infect . Immun. 57: 2481-2488, 1989, and the like. As used herein, a "biological sample" refers to a sample obtained from a patient that contains antibodies. It also means such a sample. Preferably, the sample is whole blood, sputum, serum, plasma , Saliva, cerebrospinal fluid or urine. More preferably, the sample is a patient or It is a blood, serum, or plasma sample obtained from transfusion blood. Those polypees Peptides are present in the sample as antibodies to those polypeptides, as shown below. Is used in assays to determine the presence or absence of Can be. The presence of such antibodies was earlier than my indicators of tuberculosis. Ko This indicates that there was sensitization to a bacterial antigen. In embodiments where more than one polypeptide is used, the polypeptide used The peptide is complementary (i.e., one of the polypeptides that make up the assay is Tends to detect infections in samples that may not be detectable with peptides Is preferable. Complementary polypeptides usually infect M. tuberculosis Serum samples from a series of patients known to be It is specified by evaluating it individually. Which sample is for each polypeptide After determining whether the sample is positive (as shown below), Combination of two or more polypeptides capable of detecting all infections Can be blended. For example, about 25 sera from individuals infected with tuberculosis -30% negative for antibodies against a single protein, e.g., the 38 kD antigen described above Is shown. Therefore, complementary polypeptides can be used in combination with the 38 kD antigen in a diagnostic test. Can be used to improve degree. Using one or more polypeptides to detect antibodies in a sample Various assay formats are known to those skilled in the art. For example, Harlow, Lane, An tibodies: see A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 This may be done, but is incorporated herein by reference. Preferred embodiment In some embodiments, the assay is capable of binding and releasing antibodies contained in the sample. Using a polypeptide immobilized on a solid support. Bound antibody Detection can be performed using a detection reagent containing a reporter group. As a suitable detection reagent Are antibodies that bind to the antibody / polypeptide complex, and a reporter group-labeled antibody. (E.g., in a semi-competitive assay). Another way Alternatively, a competitive assay can be used, in which the polypeptide The antibody that binds to the antibody is labeled with a reporter group, and the immobilized antigen and sample are incubated. After being allowed to bind to the antigen. Labeled antibody polypeptide The extent to which components in the sample inhibit binding to Will be shown. The solid support is known to those skilled in the art as a substance to which an antigen can be attached. Such solid materials can also be used. For example, as a solid support, a microtiter Use plate test wells or nitrocellulose or other suitable membrane Can be. Alternatively, the support may be, for example, glass, fiber Plastics such as lath, latex or polystyrene or polyvinyl chloride It can be a quality bead or disc. As a support, for example, US No. 5,359,681 or magnetic particles or optical fiber sensors. Sir etc. may be used. Various techniques known to those skilled in the art can be used to bind a polypeptide to a solid support. Methods can be used, and they are mentioned numerous in the patent and scientific literature. Departure In the context of clarity, the term “bond” refers to non-covalent and Covalent (that is, via a direct link or cross-linking agent between the antigen and the functional group on the support) All possible connections). Well of microtiter plate Alternatively, bonding by adsorption to a membrane is preferred. In such a case, in an appropriate buffer Performs adsorption by contacting the polypeptide with the solid support for a suitable period of time You. The contact time depends on the temperature, but is typically between 1 hour and 1 day. Through Usually, a plastic microtiter plate (eg, polystyrene or polystyrene) (Polyvinyl chloride) and about 10 ng to about 1 μg, preferably about 100 ng of polypeptide. Contacting the peptide is sufficient to bind the appropriate amount of antigen. In order to covalently attach a polypeptide to a solid support, usually first a polypeptide is used. Both functional groups on the peptide, such as hydroxyl or amino groups, and the support The reaction can be carried out by reacting a bivalent reagent that reacts with the support with the support. example For example, the polypeptide could be a polymer-coated support, benzoquinone, Alternatively, condensation of aldehyde groups on the support with amines and active hydrogens on the polypeptide (E.g., Pierce Immunotechnology Catalog and See Handbook, 1991, A12-A13). In some embodiments, the assay is an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). is there. In this assay, a solid support (typically a microtiter plate) is By contacting the polypeptide antigen immobilized in the Antibody to the polypeptide present in the sample binds to the immobilized polypeptide. It can be done in a way that can be combined. Is the unbound sample an immobilized polypeptide? That can bind to the immobilized antibody-polypeptide complex An exit reagent is added. Then, the amount of the detection reagent remaining remaining bound to the solid support is , Using an appropriate method specific to the detection reagent. More specifically, once the polypeptide is immobilized on the support, as described above. If so, the remaining protein binding sites on the support are usually blocked. Business Such as bovine serum albumin and Tween 20^TM(Sigma Chemical Co., St. Any suitable blocking agent (e.g. Louis, Missouri, USA) can be used. . Next, the immobilized polypeptide is incubated with the sample to incubate the antibody with the antigen. And combined with Samples are diluted appropriately, e.g., in phosphate buffered saline (PBS). Agents can be diluted prior to incubation. Usually, a suitable contact time (I.e. incubation time) depends on the presence of antibodies in the sample infected with M. tuberculosis. Is long enough to detect Preferably, the contact time is At least 95% of the binding that occurs when the body and unbound antibody reach equilibrium. It's enough time to come up. One of ordinary skill in the art, when necessary to reach equilibrium The interval is determined by assaying the level of binding that occurs over time. You will understand that it is easily required. Incubation for about 30 minutes at room temperature Time is usually sufficient. Unbound sample can be loaded onto a solid support, e.g., 0.1% Tween 20^TMSuitable for PBS etc. It can be removed by washing with an appropriate buffer. The detection reagent is then added to the solid support. sell. Suitable detection reagents include those that bind to the immobilized antibody-polypeptide complex and Any compound that can be detected by various methods known to those skilled in the art may be used. Preferably The detection reagent is a binding agent conjugated to a reporter group (e.g., protein A, protein G, immunoglobulins, lectins or free antigens). Have. Preferred reporter groups include enzymes (such as horseradish peroxidase). Etc.), substrates, cofactors, inhibitors, dyes, radionuclides, fluorescent groups, luminescent groups and biotin and so on. Conjugation of the binding agent to the reporter group is known to those skilled in the art. This can be done in a standard way. Common binders are combined with various types of functional groups, It is commercially available from a number of companies (eg, Zymed Laboratories, San Francisco, US (California, and Pierce, Rockford, Illinois, USA). Next, the antibody-polypeptide complex having the detection reagent immobilized thereon and the bound antibody Incubate for a time sufficient to detect. How long is appropriate Is usually determined from the manufacturer's instructions or within a certain period of time. Can be determined by assaying the level of Remove unbound detection reagent and allow The combined detection reagent is detected using a reporter group. To detect reporter groups The method used depends on the nature of the reporter group. For radioactive groups, Using a scintillation counter or an autoradiographic method That's right. Spectroscopic methods can be used to detect dyes, luminescent groups, and fluorescent groups. Bio Tin binds another reporter group (typically a radioactive or fluorescent group, or an enzyme). It can be detected using combined avidin. When using an enzyme as a reporter group Usually, the substrate is added (usually at a certain time) and the reaction product is spectroscopically Or other analytical methods. The presence or absence of anti-M. Tuberculosis antibodies in the sample is determined by keeping the sample attached to the solid support. The signal detected from the remaining reporter group is usually adjusted to a predetermined cutoff value. Determined by comparing to the corresponding signal. In a preferred embodiment Incubate immobilized antigen with sample from uninfected patient And the average of the signals obtained. Normally, the standard deviation is Samples that generate a signal three times higher are considered tuberculosis positive. Another preferred In an embodiment, the cutoff value is determined using a ROC curve (Receiver Operator Curve). Sackett et al., CliniCal Epidemiology; A Basic Science f or Clinical Medicine, Little Brown and Co., 1985, pp. 106-107. Do it. Briefly, in this embodiment, the cutoff value is The true positive rate corresponding to each possible cutoff value for the result (i.e., The sensitivity and the false positive rate (100% -specificity) can be obtained by plotting a pair. Upper left Cutoff value on plot closest to corner (i.e. may encompass largest area) Value) is the most accurate cutoff value and is higher than the cutoff value determined by this method. A sample that generates a signal indicating a value can be regarded as positive. Another As an approach, cut the cutoff value along the plot to reduce the false positive rate. To the left, and to the right to reduce the false negative rate. Can be moved. Usually, a signal higher than the cutoff value determined by this method The sample that produced null is regarded as tuberculosis positive. In one related embodiment, the assay is a rapid flow-through assay (rapid flow-through). low-through) or strip test format. In that case, the antigen is immobilized on a membrane such as nitrocellulose. Flow through In this method, the antibodies contained in the sample are removed as the sample passes through the membrane. To bind to the immobilized polypeptide. The solution containing the detection reagent is then applied to the membrane. Detection reagent (eg, protein A-colloidal gold) as antibody passes through the antibody-polypeptide. Binds to the tide complex. Detection of the bound detection reagent can be performed as described above. In strip test format, one end of the membrane to which the polypeptide is attached Is immersed in the solution containing the sample. The sample is loaded with the detection reagent along the membrane. It travels through the containing part to the area of the immobilized polypeptide. Polypeptide The concentration of the detection reagent at the position indicates the presence of the anti-M. Tuberculosis antibody in the sample. Typically Indicates that the concentration of the detection reagent at that position produces a certain pattern, for example, a linear pattern. And can be seen with the naked eye. If no such pattern is found, it is Indicates a negative result. Usually, the amount of polypeptide immobilized on the membrane is Biological sample appears to be sufficient to produce a positive signal in the ELISA as shown above Contains a certain level of antibody, it can produce a visually discernible pattern. To choose. Preferably, the amount of polypeptide immobilized on the membrane is from about 25 ng to about 1 ng. μg, more preferably about 50 ng to about 500 ng. Such tests are typical Can be performed with very small amounts (eg, one drop) of patient serum or blood. Of course, many other assays suitable for using the polypeptides of the present invention. There is also an protocol. The above description is intended to show only good examples. In another aspect, the invention provides an antibody against a polypeptide of the invention. . Antibodies may be prepared using any of a variety of techniques known to those of skill in the art. An example For example, Harlow and Lane, Antibodies: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor L See aboratory, 1988. In one such technique, antigenic polypeptides The immunogens containing the tides can be transferred to any of a variety of mammals (e.g., mice, rats, Injections into goats, sheep, and goats). In this step, the polypeptide of the present invention is repaired. Can be used as an immunogen without decoration. Another alternative, especially relatively In the case of short polypeptides, the polypeptide can be, for example, bovine serum albumin or keyhol. e limpet (a type of copepod) that binds to carrier proteins such as hemocyanin A better immune response could be elicited. Immunogen to host animal, preferably once Injections according to the prescribed schedule, including booster immunizations Blood is regularly collected from the animal. Polyclonal specific for the polypeptide Affinity using an antibody, for example, using a polypeptide bound to a suitable solid support It can be purified from antiserum by preparative chromatography. Monoclonal antibodies specific for the antigenic polypeptide of interest include, for example, Ko hler and Milstein, Eur. J. Immunol. 6: 511-519, 1976 and modifications thereto. It can be prepared using good techniques. Simply stated, these methods are desirable Antibodies (i.e., reactivity with the polypeptide of interest) can be produced. Preparation of immortalized cell lines. Such cell lines are described, for example, above. Can be prepared from spleen cells obtained from an animal immunized by the method described above. Splenocytes, for example, myeloma Vesicle fusion partner, preferably one that is syngeneic to the immunized animal. Is immortalized. Various fusion techniques may be used. For example, splenocytes and bone Combine myeloma cells and treat with non-ionic detergent for 2-3 minutes, then hybridize Lid cells grow but myeloma cells do not. Plate. A preferred selection technique is HAT (hypoxanthine, aminop Terin, thymidine) selection methods. After a sufficient time, usually one to two weeks Observe the hybrid colonies. Pick a single colony and use the polypeptide The binding activity to is examined. Hybridomas with high reactivity and specificity are preferred New Monoclonal antibodies can be isolated from the supernatant of hybridoma colony growth. Sa In addition, in order to improve the yield, the hybridoma cell line was Various techniques can be performed, such as injection into the abdominal cavity of a vertebrate. Monoclonal antibodies It can be collected from the ascites or blood. Chromatography and gel filtration for impurities Antibodies can be removed from the antibody by conventional methods, such as, precipitation, and extraction. The polypeptide of the present invention For example, in a purification step in affinity chromatography. Antibodies can be used in assays similar to those detailed above, and by others skilled in the art. Use in diagnostic tests to detect the presence of M. tuberculosis antigens using known techniques And thereby provide a method of detecting a Mycobacterium tuberculosis infection in a patient. Further, the diagnostic reagent of the present invention comprises one or more of the above polypeptides. It may include a coding DNA sequence, or one or more portions thereof. example A polymerase for amplifying M. tuberculosis-specific cDNA obtained from biological samples In a chain reaction (PCR) -based assay, at least one oligonucleotide Reotide primers bind to DNA molecules encoding one of the polypeptides of the invention. Using at least two oligonucleotide primers that are specific to sell. The presence of the amplified cDNA can be determined by techniques well known in the art, such as gel electrophoresis. It is detected using electrophoresis or the like. Similarly, encodes a polypeptide of the invention Oligonucleotide probes specific for DNA molecules can also be found in biological samples. Hybridization assay for detecting the presence of a polypeptide of the invention Can be used in i. As used herein, the term “oligonucleotide primer specific to a DNA molecule” is used. A `` mer / probe '' is at least 80%, preferably at least 80%, of the DNA molecule of interest. Oligonucleotide sequences having even 90%, more preferably at least 95% identity Means Oligonucleotides that may be useful in the diagnostic methods of the invention Tide primers and / or probes are at least about 10-40 nucleotides Is preferred. In a preferred embodiment, the oligonucleotide primer Is a sequence of DNA molecules encoding one of the polypeptides disclosed herein. It consists of at least 10 nucleotides. Preferably, the diagnosis of the present invention The oligonucleotide probe for use in the method may be a polypeptide disclosed herein. At least 15 consecutive oligonucleotides of a DNA molecule encoding one of Consists of tide. PCR-based and hybridization assays The methods are well known in the art (eg, Mullis et al., Ibid; Ehrlich, Ibid See). Primers or probes are thus used for tuberculosis in biological samples. It can be used to detect bacterial-specific sequences. Including the above oligonucleotide sequence DNA probes or primers may be used alone or in combination. Or with previously identified sequences such as the 38 kD antigen described above sell. The following examples are illustrative and not intended to be limiting. Example Example 1 Purification and characterization of polypeptides from Mycobacterium tuberculosis culture filtrate This example illustrates the preparation of a M. tuberculosis soluble polypeptide from a culture filtrate. In particular Unless otherwise stated, all percentages in the following examples are weight / volume. Mycobacterium tuberculosis (H37Ra, ATCC No. 25177, or H37Rv, ATCC No. 25618) The cells were cultured in a sterile GAS medium at 37 ° C. for 14 days. Thereafter, the medium was filtered with a 0.45μ filter. Through a vacuum into a sterile 2.5 L bottle (leaving the bulk of the cells). The medium is as follows Filter through a 0.2μ filter into a sterile 4L bottle and add NaN_ThreeTo the culture filtrate To a concentration of 0.04%. Thereafter, the bottle was placed in a 4 ° C. cold place. The culture filtrate was concentrated, and the filtrate was transferred to an autoclaved 12 L receiver. The solution was rinsed with ethanol and washed with 400 ml Amicon (A) containing a 10,000 kDa MWCO membrane. micon). The pressure was maintained at 60 psi using nitrogen gas. This one By the method, the volume of 12 L was reduced to almost 50 ml. The culture filtrate was treated with 0.1% bicarbonate ammonium carbonate using a 8,000 kDa MWCO cellulose ester membrane. It was dialyzed into monium and the ammonium bicarbonate solution was changed twice. Protein concentration Was then quantified with a commercial BCA assay (Pierce, Rockford, IL). The dialyzed culture filtrate is then lyophilized and the polypeptide resuspended in distilled water. Was. The polypeptide was again purified from 0.01 mM 1,3 bis [tris (hydroxymethyl) -Methylamino] propane, pH 7.5 (bis-trispropane buffer) (this is (The initial conditions for anion exchange chromatography). 0.01mM POROS 146 II Q / M anion exchange equilibrated to pH 7.5 bis-trispropane buffer Exchange column 4.6 mm x 100 mm (Perceptive BioSystems, Framingham, MA) Fractionation was performed using gel profusion chromatography above. . The polypeptide was eluted with a linear 0-0.5M NaCl gradient in the above buffer system. Mosquito Lamb eluate was monitored at a wavelength of 220 nm. The polypeptide pool eluted from the ion exchange column is dialyzed against distilled water. Lyophilized. Dissolve the obtained substance in 0.1% trifluoroacetic acid (TFA) in water at pH 1.9 The polypeptide was then transferred to a Delta-Pak C18 column (Waters, Milford, Mass.) 300 Å Purified on storm pore size, 5 micron particle size (3.9 x 150 mm). The polype The peptide was purified with a linear gradient of 0-60% dilution buffer (0.1% TFA in acetonitrile). Eluted from the system. The flow rate was 0.75 ml / min and the HPLC eluate was monitored at 214 nm. Collect the fractions containing the eluted polypeptide to maximize the purity of each sample. Received. Approximately 200 purified polypeptides were obtained. Thereafter, the purified polypeptide is tested for its ability to induce T cell proliferation in a PBMC preparation. And screened. It is known to be positive in the PPD skin test and its T Cells are shown to grow in response to crude soluble proteins from PPD and MTB 10% pooled human serum and 50 μg / ml gent The cells were cultured in a medium containing RPMI 1640 supplemented with mycin. 0.5 to purified polypeptide It was added in two portions at a concentration of 10 μg / mL. 96-well round bottom press with 200 μl volume After culturing in a plate for 6 days, 50 μl of medium was removed from each well and IFN-γ levels were determined. Thereafter, the plate was diluted with 1 μCi / well Pulse for another 18 hours with thymidine, harvest, and tritium uptake by gas scintillation It was measured using an application counter. The increase observed in cells cultured in medium alone Fractions that produced more than three times the growth in both replicates were considered positive. IFN-γ was measured using an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). ELISA Plates contain a mouse monoclonal antibody (Chemicon) directed against human IFN-γ. For 4 hours at room temperature. Then, the wells are 5% (W / V) Blocked with PBS containing imilk for 1 hour at room temperature. Then, plate 6 times, Wash in PBS / 0.2% TWEEN-20 and add 1: 2 to culture medium in ELISA plate The diluted sample was incubated overnight at room temperature. Pre The plate was washed again and polyclonal diluted 1: 3000 in PBS / 10% normal goat serum. Rabbit anti-human IFN-γ serum was added to each well. Then place the plate in the room for 2 hours Incubated at room temperature, washed, and stained with horseradish peroxidase. Rabbit IgG (Jackson Labs.) Diluted 1: 2000 in PBS 15% non-fat dry milk And added. After an additional 2 hours at room temperature incubation, wash the plate and remove TMB substrate. Was added. The reaction was stopped after 20 minutes with 1N sulfuric acid. Optical density is set to 570nm as reference wavelength And measured at 450 nm. Mean OD of cells cultured in medium alone and three standard deviations Fractions generated in both replicates giving an OD more than twice the difference were considered positive. For sequencing, polypeptides can be individually^TM(Perkin Elmer / Applied B ioSystems Division, Foster City, CA) Dry on treated glass fiber filters Was. Filter with polypeptides from Perkin Elmer / Applied BioSystems Divi sion Precise 492 loaded on a protein sequencer. The polypeptide may be amino From the acid end, it was sequenced using traditional Edman chemistry. Amino acid sequence By comparing the retention times of the PTH derivative standard and the PTH amino acid derivative, Was decided. Using the above method, an antigen having the following N-terminal sequence was isolated: (In the sequence, Xaa may be any amino acid). In addition to the methods described above, additional antigens were isolated using a microbore HPLC purification step . In particular, the fraction containing the antigen mixture from the above chromatographic purification step 20 μl of Aquapore (Aq) with a pore size of 7 microns and a column size of 1 mm x 100 mm uapore) C18 column (Perkin Elmer / Applied BioSystems Division, Foster City, CA) using a Perkin Elmer / Applied BioSystems Division Model 172 HPLC And purified. Fractions were collected on a linear gradient of 1% / min acetonitrile in water (containing 0.05% TFA). The column was eluted with ril (containing 0.05% TFA) at a flow rate of 80 μl / min. Dissolution Effluent was monitored at 250 nm. Separates the original fraction into four major peaks and other minor components A polypeptide having a molecular weight of 12.054 Kd (by mass spectrometry) and having the following N-terminal sequence: Got the peptide; This polypeptide can be used for growth and IFN-γ production in PBMC preparations using the assays described above. Was induced. Additional soluble antigen was isolated from the M. tuberculosis culture filtrate as follows. Mycobacterium tuberculosis culture filtrate Prepared as above. Dialyzed against bis-trispropane buffer pH 5.5 Thereafter, a 4.6 × 100 Poros QE column equilibrated with bis-trispropane buffer pH 5.5. mm (Perspective Biosystems) using anion exchange chromatography Fractionation was performed. The polypeptide was subjected to a linear 0-1.5 M NaCl gradient in the above buffer system. And eluted at a flow rate of 10 ml / min. The column eluate was monitored at a wavelength of 214 nm. The fractions eluted from the ion exchange column are pooled and the Poros R2 column 4.6 x 100m m (Perspective Biosystems) for reverse phase chromatography. Poly The peptide was purified with a linear gradient of 0-100% acetonitrile (0.1% TFA) at a flow rate of 5 ml. / Min. From the column. The eluate was monitored at 214 nm. The fraction containing the eluted polypeptide is lyophilized and 80 μl of 0.1% TFA aqueous solution And resuspended in a Vydac C4 column 4.6 x 150 mm (Western Analytical, Temec ula, CA) with a linear gradient of 0-100% acetonitrile (0.1% TFA) and a flow rate of 2 m At l / min, reverse phase chromatography was applied. The eluate was monitored at 214 nm. The biologically active fraction was separated into the main peak and other minor components. Saw to PVDF membrane Western blot of the peaks of the three major molecular weight bands, 14 Kd, 20 Kd and And 26 Kd. Each of these polypeptides has the following N-terminal sequence: I decided to. (In the sequence, Xaa may be any amino acid). Using the assays described above, these polypeptides can be grown in PBMC preparations and produce IFN-γ. It was shown to induce life. FIGS. 1A and 1B show first and second donors, respectively. Figure 3 shows the results of this assay using PBMC preparations from PBMC. DNA sequences encoding the antigens described in (a), (c), (d) and (g) above Has a M. tuberculosis codon bias corresponding to the N-terminal sequence³²Modified with P-terminal label Screening of Mycobacterium tuberculosis genomic library using I got it. Screening performed using a probe corresponding to the above antigen (a) Identified a clone having the sequence shown in SEQ ID NO: 96. SEQ ID NO: 96 The loaded polypeptide is shown in SEQ ID NO: 97. Probe corresponding to the above antigen (g) Screening performed using a clone having the sequence shown in SEQ ID NO: 52 Identified. The polypeptide encoded by SEQ ID NO: 52 is shown in SEQ ID NO: 53. Up Screening performed using the probe corresponding to the antigen (d) described in SEQ ID NO: 2 A clone having the sequence shown in Fig. 4 was identified, and was cloned with a probe corresponding to the antigen (c). The screen was cloned having the sequence shown in SEQ ID NO: 25 Was identified. Using the DNA STAR system, the above amino acid sequence can be used as a gene bank. Was compared with the known amino acid sequence. Searched database is almost 173,000 tampa Protein sequence containing protein 87). Amino acid sequences of antigens (a)-(h) and (l) No significant homology was detected. The amino acid sequence for antigen (i) is homologous to the sequence from M. leprae. I found that. Full length rye (M. leprae) sequence obtained from GENBANK Was used to amplify from genomic DNA. Then, using this sequence, the M. tuberculosis library And a full-length copy of the M. tuberculosis homolog was obtained (SEQ ID NO: 94). . The amino acid sequence for antigen (j) is a known M. tuberculosis bacterium translated from a DNA sequence. It was found to be homologous to the protein. To the inventor's knowledge, this protein Quality has not yet been shown to possess T cell stimulating activity. Antigen (k) The amino acid sequence was found to be related to sequences from M. leprae. In the above proliferation and IFN-γ assay using three PPD positive donors, The results for representative antigens are shown in Table 1: table 1 PBMC Proliferation and IFN-γ assay results In Table 1, the stimulation index (SI) of 2-4 (compared to cells cultured in medium alone) The response giving a score of + is given, and the SI of 2-4 at a concentration of 4-8 or 1 μg or less is scored as ++. And scored a SI of 8 or more as +++. The antigen of sequence (i) is used for proliferation and IFN-γ assay. High SI (+++) for one donor and lower for two other donors in both cases (++ and +) found to have SI. These results indicate that these antigens are 5 shows the ability to induce reproduction and / or interferon-γ production. Example 2 Use of patient sera to isolate M. tuberculosis antigens In the present example, M. tuberculosis was screened using serum from a M. tuberculosis infected person. 2 illustrates the isolation of antigen from lysates. Add dried Mycobacterium tuberculosis H37Ra (Difco Laboratories) to 2% NP40 solution and alternately Homogenization and sonication were performed three times. Transfer the resulting suspension to a microcentrifuge tube. Centrifuge at 13,000 rpm, and transfer the supernatant to a 0.2 micron syringe filter. I passed. The filtrate was bound to Macro Prep DEAE beads (BioRad, Hercules, CA). Beads were washed with 20 mM Tris pH 7.5 and bound proteins were eluted with 1 M NaCl . The 1 M NaCl eluate was dialyzed overnight against 10 mM Tris pH 7.5. Dialysate solution DNase and RNase at 0.05 mg / ml for 30 minutes at room temperature, followed by α-D-mannosida Treated with 0.5 U / mg, pH 4.5 for 3-4 hours at room temperature. After returning to pH 7.5, The material was fractionated by FPLC on a Bio Scale-Q-20 column (BioRad). 9 fractions And concentrated in Centriprep 10 Amicon, Beverley, Mass. Estimation of mycobacterium tuberculosis without immunoreactivity to other antigens of the present invention Serological activity was screened using serum pools from stained patients. The most reactive fraction was subjected to SDS-PAGE and transferred to PVDF. About 85Kd van To get the following sequence: When this sequence was compared with the sequence of the gene bank described above, a significant No homology was found. The DNA sequence encoding the antigen described in (m) above is the N-terminal of SEQ ID NO: 137. M. tuberculosis Erdman strain La using labeled degenerate oligonucleotides corresponding to the end sequences It was obtained by screening the library. D given in SEQ ID NO: 198 A clone having the NA sequence was identified. This sequence is provided in SEQ ID NO: 199. It was found that it codes for amino acids. Compare these sequences with the gene bank sequences. The sequence previously identified in M. tuberculosis and M. bovis (M. bovis) Similarity was shown. Example 3 Preparation of DNA sequence encoding M. tuberculosis antigen This example is directed to the serum of a patient infected with M. tuberculosis or an antiserum against a soluble M. tuberculosis antigen. Encodes M. tuberculosis antigens by screening M. tuberculosis expression libraries 1 shows a procedure for preparing a DNA sequence to be prepared.A . Preparation of Mycobacterium tuberculosis soluble antigen using rabbit antiserum against Mycobacterium tuberculosis supernatant Genomic DNA was isolated from Mycobacterium tuberculosis H37Ra strain. This DNA is sheared randomly and λZ To construct an expression library using the AP expression system (Stratagcnc, LaJolla, CA) Used for Immunization of rabbits with the concentrated supernatant of Mycobacterium tuberculosis culture resulted in Rabbit antisera were raised against secreted proteins of 7Ra, H37Rv and Erdman strains. Ingredient Physically, first, 100 μg of muramyl dipeptide (Calbiochem, LaJolla, CA) is incomplete. 200 μg of protein antigen in 2 ml total volume containing 1 ml Freund's adjuvant subcutaneously The rabbit was immunized by injection. 4 weeks later Incomplete Freund's adjuvant Rabbits were boosted with 100 μg of the stock injected subcutaneously into rabbits. Finally, after 4 weeks Rabbits were immunized intravenously with 50 μg of protein antigen. Sambrook et al., Molecular Cl oning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratorics, Cold Spring Ha Screening of expression library using antiserum as described in rbor, NY, 1989 Was done. Purified bacteriophage plaques expressing immunoreactive antigens . Derivation of p-phagemid from plaque to deduce nucleotide sequence of M. tuberculosis clone did. 32 clones were purified. 25 of them have been identified in Mycobacterium tuberculosis so far Is an array without. As described by Skciky et al., J. Exp. Mcd. 181: 1527-1537, 1995, The protein was induced by IPTG and purified by gel elution. This screening Representative sequences of the DNA molecules identified in are shown in SEQ ID NOs: 1-25. Corresponding estimated net The amino acid sequences are shown in SEQ ID NOs: 64-88. Using the above database, compare these sequences with known sequences in the gene bank As a result, the following TbRA2A, TbRA16, TbRA18 and TbRA29 (SEQ ID NO: 77, 69, 71, 76 The clone named) shows some homology to the sequence previously identified in Mycobacterium leprae. However, it was found that it did not show any homology with the sequence identified in M. tuberculosis. TbRA11, Tb RA26, TbRA28 and TbDPEP (SEQ ID NOs: 66,74,75,53) have already been identified in M. tuberculosis ing. TbRA1, TbRA3, TbRA4, TbRA9, TbRA10, TbRA13, TbRA17, TbRa19, TbRA 29, TbRA32, TbRA36 and overlapping clones TbRA35, TbRA12 (SEQ ID NOs: 64, 78, 82, 83, 65,68,76,72,76,79,81,80,67). Black Clone TbRa24 overlaps clone TbRa29.B . Patients with pulmonary tuberculosis or leprosy to identify DNA sequences encoding M. tuberculosis antigens Use of serum Using the serum pool obtained from a patient with tuberculosis, The library and the H37Rv library were screened. H37Rv Live Genomic DNA of Mycobacterium tuberculosis H37Rv strain was isolated and partially degraded to create a rally. And construct an expression library using the λZap expression system (Stratagene, La Jolla, Ca). Used to build. The three different serum pools each have It contains sera obtained from three ore patients and expresses them. Used for Pools were H37Ra soluble in both ELISA and immunoblot. TbL, TbM, and TbH were determined with reference to the relative reactivity with the dissociation (that is, TbL, TbM, and TbH). bL = low reactivity, TbM = moderate reactivity, TbH = high reactivity). Pulmonary tuberculosis disease A fourth pool of sera from seven subjects was also used. All of these sera are recombinant There was no increased reactivity with the 38 kD Mycobacterium tuberculosis H37Ra phosphate binding protein. All pools were pre-adsorbed to Escherichia coli lysate (H37Ra and H37Rv expression) Used for library screening. Procedures are described in Sambrook et al., Molecular Clon. ing: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harb or, NY, 1989. Bacteriophage puller expressing immunoreactive antigen Was purified. The phagemids obtained from the plaques were recovered and The nucleotide sequence was deduced. 32 clones were purified. 31 of them have been identified in Mycobacterium tuberculosis so far There was no sequence. Representative sequences of the identified DNA molecules are set forth in SEQ ID NOs: 26-51 and And 100. Of these, TbH-8-2 (SEQ ID NO: 100) is a partial clone of TbH-8. TbH-4 (SEQ ID NO: 43) and TbH-4-FWD (SEQ ID NO: 44) are non-contiguous sequences of the same clone. It is. Amino acids of antigens referred to below as Tb38-1, TbH-4, TbH-8, TbH-9, TbH-12 The sequence is shown in SEQ ID NOs: 89-93. Using these identified databases, these When the sequences were compared to known sequences in the gene bank, TbH-4, TbH-8, TbH-9 and And TbM-3 did not show significant homology, but TbH-9 also showed weak homology. Was found. TbH-12 was first used in M. paratuberculosis (Acc. No. S28515) It was found to be homologous to the identified 34 kD antigen protein. Tb38-1 first M.bovis (Acc.No.U34848) and M.tuberculosis (Sorensen et al., Infec.Immun. 63: 171). 0-1717, 1995) of the open reading frame of the antigen ESAT-6 identified in It was found to be located 34 base pairs upstream. Although Tb38-1 and TbH-9 were both isolated from the H37Ra library, H37Rv library clones were identified using probes derived from them . Tb38-1 includes Tb38-1F2, Tb38-1F3, Tb38-1F5 and Tb38-1F6 (SEQ ID NOs: 107, 108, 11). 1,113,114) (SEQ ID NOS: 107 and 108 are non-clones of clone Tb38-1F2). Continuous array). In Tb38-1F2, two open reading frames were Specified. One corresponds to Tb37FL (SEQ ID NO: 109) and the second subsequence is the phase of Tb38-1. It is homologous and is called Tb38-IN (SEQ ID NO: 110). Deduced amino acid sequence of Tb38-1F3 Is shown in SEQ ID NO: 112. The TbH-9 probe allows three clones in the H37Rv library. TbH-9-FL (SEQ ID NO: 101), TbH-9-1 (SEQ ID NO: 101), which are homologs of TbH-9 (H37Ra) No. 103), and TbH-8-2 (SEQ ID NO: 105), which is a partial clone of TbH-8. Was decided. The deduced amino acid sequences of these three clones are shown in SEQ ID NOs: 102, 104, and 106. Show. By the above procedure, further screening of M. tuberculosis genomic DNA library A further 10 reactive clones representing 7 different genes were recovered. One of these genes was identified as the 38 kD antigen described above, Are 14Kd α-crystallin heat shock tans previously shown to be present in M. tuberculosis And the third one is identical to the antigen TbH-8. It was decided. The remaining 5 clones (hereinafter TbH-29, TbH-30, TbH-32 and And TbH-33) are shown in SEQ ID NOs: 133-136, respectively. And the corresponding deduced amino acid sequences are shown in SEQ ID NOs: 137-140, respectively. these The DNA sequence and amino acid sequence of the antigen were compared with those of the above gene bank. ( No homology to the 5 'end of TbH-29 (including reactive open reading frame) However, the 3 'end of TbH-29 was found to be identical to M. tuberculosis cosmid Y227. won. TbH-32 and TbH-33 are each the previously identified M. tuberculosis insertion element IS61 10. It was found to be the same as Mycobacterium tuberculosis cosmid Y50. Significant phase for TbH-30 It was not. Using the positive phagemid obtained in this further screening, E. coli XL-1 Blue MRF 'was infected as described by ok et al. Attracting recombinant proteins Derivation was performed by adding IPTG. Induced and uninduced lysates Run the product on SDS-PAGE in duplicate and transfer to a nitrocellulose filter. did. Filter with TbH reactive M. tuberculosis serum (1: 200 dilution) and N-terminal of lacZ Reacted with rabbit serum (1: 200 or 1: 250 dilution) reactive with the terminal 4Kd portion. room temperature For 2 hours.¹²⁵I-labeled protein A was added Later, the film was exposed for various times between 16 hours and 11 days to detect bound antibodies. Issued. Table 2 shows the results of the immunoblot. Table 2 Positive response of recombinant M. tuberculosis antigen to both M. tuberculosis serum and anti-lacZ serum Responses show that the reactivity of M. tuberculosis sera is to the fusion protein. I have. Antigens that are reactive with anti-lacZ serum but not with M. tuberculosis serum It may be the result of a M. tuberculosis serum that recognizes a homeotic epitope. Or, Its antigen-antibody binding kinetics is poor with 2 hours of serum exposure in immunoblots It may be because. Whether antigens TbH-9 and Tb38-1 present cellular proteins, or in M. tuberculosis medium An experiment was performed to determine whether it was secreted. In a first experiment, substantially the same as Example 3A A) secreted proteins of M. tuberculosis, B) known secretory recombination, using the methods described in Rabbit serum against M. tuberculosis antigen 85b, C) recombinant Tb38-1 and D) recombinant TbH-9 Had made. Total M. tuberculosis lysate, concentrated supernatant of M. tuberculosis culture, recombinant antigen 85b, TbH-9 and And Tb38-1 are resolved on denaturing gel and immobilized on nitrocellulose membrane After that, duplicate blots were searched using the above rabbit serum. Control serum (panel I) and secreted proteins, recombinant 85b, recombinant Tb38-1 and recombinant The results of this analysis using an antiserum to TbH-9 (panel II) are shown in FIGS. Shown in D. The lanes in the figure are as follows. 1) molecular weight protein standard, 2) tuberculosis 5 μg of bacterial lysate, 3) 5 μg of secreted protein, 4) 50 ng of recombinant Tb38-1, 5) recombinant TbH-9 50ng, 6) 50ng of recombinant 85b. These recombinant antigens were treated with six terminal histidine residues. Engineered and therefore travels about 1 kD more than native protein Then is expected. In FIG. 2D, recombinant TbH-9 lacks about 10 kD of the full-length 42 kD antigen. Therefore, the size of the immunoreactive native TbH-9 antigen in the lysate lane (indicated by the arrow) And there is a significant difference. These results indicate that Tb38-1 and TbH-9 are intracellular antigens, This indicates that it is not actively secreted by the bacterium. The finding that TbH-9 is an intracellular antigen suggests that recombinant TbH-9, a secreted M. tuberculosis protein By measuring the reactivity of TbH-9-specific human T cell clones to PPD and PPD Was confirmed. TbH-9-specific T cell clone (called 131TbH-9) is a healthy PPD Obtained from sex donor PBMC. Secreted protein, recombinant TbH-9 and control tuberculosis The proliferative response of 131TbH-9 to the fungal antigen TbRall, as described in It was determined by measuring the incorporation of um-labeled thymidine. As shown in FIG. 3A Thus, clone 131TbH-9 specifically responds to TbH-9, which means that TbH-9 is Indicates that it is not an important component of the secreted protein. FIG. 3B shows the second TbH-9T specific A cell clone (designated PPD 800-10) was prepared from PBMC of a healthy PPD positive donor. The T cell clone is then stimulated with a secreted protein, PPD or recombinant TbH-9. Indicates that IFN-γ is produced. These results also indicate that TbH-9 is Is not secreted.C . Tuberculosis patient serum other than pulmonary tuberculosis to identify DNA sequences encoding Mycobacterium tuberculosis antigens Use of Isolate genomic DNA from Mycobacterium tuberculosis Erdman strain and randomly shear it into a λZAP expression system ( Stratagene, La Jolla, CA) . The resulting library was used for tuberculosis patients other than pulmonary tuberculosis as described in Example 3B above. Screening was performed using the obtained serum pool. Secondary antibody is alkaline phos Phatase-conjugated goat anti-human IgG + A + M (H + L). 18 clones were purified. 4 clones (XP14, XP24, XP31, XP) 32) was found to have some similarity to known sequences. XP14, XP24 And the DNA sequences determined for XP31 are shown in SEQ ID NOs: 151-153, respectively, and XP32 The DNA sequences at the 5 'and 3' ends of are shown in SEQ ID NOs: 154 and 155, respectively. XP14 The constant amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 156. The reverse complement sequence of XP14 is that of SEQ ID NO: 157. It was found to encode a amino acid sequence. The remaining 14 clones (hereinafter XP1-XP6, XP17-XP19, XP22, XP25, XP27, XP30 and XP3 6) was compared with the sequence of the above gene bank, 3 'of XP2 and XP6 No homology was found except at the ends. The 3 'ends of XP2 and XP6 are It was found to have some homology with Sumid. XP27 and XP36 DNA sequences These are shown in SEQ ID NOs: 158 and 159, respectively. The sequences at the 5 'end of XP4, XP5, XP17 and XP30 SEQ ID NOs: 160-163, the 5 'end of XP2, XP3, XP6, XP18, XP19, XP22 and XP25 and 3 'Terminal sequences are SEQ ID NOs: 164 and 165; 166 and 167; 168 and 169; 170 and 171, respectively. 72 and 173; 174 and 175; and 176 and 177. XP1 is the DNA sequence of TbH4 disclosed above. Turned out to overlap with the column. SEQ ID NO: 178 shows the full-length DNA sequence of TbH4-XP1. This The open reading sequence encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 179 It was found to contain a flaming frame. The reverse complement sequence of TbH4-XP1 is SEQ ID NO: 180 Contains an open reading frame encoding the amino acid sequence shown in I understood. The DNA sequence of XP36 encodes the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 181 and 182. And two reverse open reading frames, the reverse complement of which is Contains the open reading frame encoding the amino acid sequence shown at 183 I found out. Recombinant XP1 protein was prepared as described in Example 3B above. For purification An on-affinity chromatography column was used. Recombinant XP1 is Mycobacterium tuberculosis immunity Stimulate cell proliferation and IFN-γ production in T cells isolated from donor Or it becomes.D . Preparation of Mycobacterium tuberculosis soluble antigen using rabbit antiserum against Mycobacterium tuberculosis fraction protein Made A tuberculosis lysate was prepared as described in Example 2 above. HPLC of the obtained substance Fraction, and each fraction was subjected to little or no immunoreactivity with the other antigens of the present invention. Serological activity was assessed using serum pools from M. tuberculosis-infected patients who did not respond. Screened by easter blot. Using the method described in Example 3A above Thus, a rabbit antiserum against the most reactive fraction was prepared. Using this antiserum , Screening of M. tuberculosis Erdman strain genomic DNA expression library prepared as described above Was performed. Purify bacteriophage plaques expressing immunoreactive antigens Was. The phagemids obtained from these plaques were collected, and the cloned M. tuberculosis clone The nucleotide sequence was determined. Ten different clones were purified. One of these clones is It turned out to be Ra35, one to be the M. tuberculosis antigen HSP60 identified earlier Do you get it. Six of the remaining eight clones (RDIF2, RDIF5, RDIF8, RDIF10, RDIF1 1, RDIF12) has some similarity to the previously identified M. tuberculosis sequence. won. The DNA sequences determined for RDIF2, RDIF5, RDIF8, RDIF10 and RDIF11 are These are shown in SEQ ID NOs: 184-188, respectively. The corresponding deduced amino acid sequence is No. 189-193. The 5 'and 3' DNA sequences of RDIF12 are shown in SEQ ID NOs: 194 and 195, respectively. Show. No significant homology to the antigen RDIF-7 was found. RDIF7 decision The determined DNA sequence and deduced amino acid sequence are shown in SEQ ID NOs: 196 and 197, respectively. RDIF6 and One more clone was isolated, which proved to be identical to RDIF5. Was. Recombinant RDIF6, RDIF8, RDIF10 and RDIF11 were prepared as described above. These anti Cell proliferation and IFN-γ production in T cells isolated from M. tuberculosis immune donors Was found to be irritating.Example 4 Purification and characterization of polypeptides from tuberculin purified protein derivatives M. tuberculosis polypeptide is derived from tuberculin purified protein Isolated from the body (PPD) as follows. PPD is published (Seibert, F. et al., Tuberculin purified protein d erivative. Preparation and analyzes of a large quantity for standard.Th e American Review of Tuberculosis 44:9-25, 1941) with some modifications. Made. The Mycobacterium tuberculosis Rv strain was grown for 6 weeks at 37 ° C. in a synthetic medium in roller bottles. Fine The bottle containing the fungal growth was then heated to 100 ° C. in steam for 3 hours. 0.22 culture The solution was sterile filtered using a μ filter and the liquid phase was filtered using a 3 kD cut-off membrane. It was concentrated twice. The protein is washed once with a 50% ammonium sulfate solution and 25% sulfuric acid. The precipitate was precipitated eight times using an ammonium acid solution. The obtained protein (PPD) is d In a HPLC system (Perseptive Biosystems, Framingham, MA), a C18 column (7. Reversed-phase liquid chromatography (RP-HPLC) using 8 × 300 mM; Waters, Milford, Mass. ). Fractions are 0-100% buffer (0.1% TF in acetonitrile) The column was eluted using the linear gradient of A). The flow rate was 10 ml per minute and the eluent was Monitored at 14 nm and 280 nm. Six fractions were collected, dried, suspended in PBS, and delayed type hypersensitivity (DT H) The induction of the reaction was individually tested in M. tuberculosis infected guinea pigs. One hula Was found to induce a strong DTH response, which was then converted to Perkin Elmer / Appl. ied Biosystems Division Model 172 HPLC Microbore Vydac C18 Further fractionation was performed by RP-HPLC on a ram (Catalog No. 218TP5115). Fraction With a linear gradient of 5-100% buffer (0.05% TFA in acetonitrile) at a flow rate of 80 μl / min. Elution. The eluent was monitored at 215 nm. Collect 8 fractions and conclude The guinea pigs were tested for the induction of DTH in guinea pigs. One fraction Induced DTH with a strong induration of about 16 mm. Other fractions detected Did not induce possible DTH. Run positive fractions on SDS-PAGE gel electrophoresis Was found to contain a single protein band of approximately 12 kD molecular weight. This polypeptide, hereinafter referred to as DPPD, was converted to Perkin Elmer / Applied Biosy as described above. stems Division Procise 492 from the amino terminus using a protein sequencer The sequence was determined to have the N-terminal sequence shown in SEQ ID NO: 124. this The sequence was compared to known sequences in the gene bank described above, but there were no known homologs. DP The four cyanogen bromide fragments of PD were isolated and sequenced as shown in SEQ ID NOs: 125-128. It was found to have Example 5 Synthesis of synthetic polypeptides The polypeptide is HPTU (O-benzotriazole-N, N, N ', N'-tetramethyluroni Millipore 9050 by FMOC chemistry with (Hexahexafluorophosphate) activation It can be synthesized on a peptide synthesizer. Gly-Cys-G1y sequence The ends can be attached to provide a method of coupling or labeling the peptide. From a solid support Cleavage of the peptide is performed by the following cleavage mixture: trifluoroacetic acid: ethanedithiol: thio Can be performed using anisole: water: phenol (40: 1: 2: 2: 3). Cut for 2 hours After that, the peptide can be precipitated in cold methyl-t-butyl-ether. The peptide pellet was then dissolved in water containing 0.1% trifluoroacetic acid (TFA). Can be lyophilized and then purified by Cl8 reverse phase HPLC. Water (0.1 A gradient of 0% -60% acetonitrile (containing 0.1% TFA) in Wear. Lyophilization of pure fractions followed by electrospray mass spectrometry And the peptide can be characterized by amino acid analysis. Using this technique, a TbM-1 peptide containing 1.5 times the repeat sequence of the TbM-1 sequence was synthesized. Done. The TbM-1 peptide has the sequence: GCGDRSGGNLDQIRLRRDRSGGNL (SEQ ID NO: 63) I do. Example 6 Use of representative antigens for serodiagnosis of tuberculosis This example illustrates the diagnostic properties of some representative antigens. You. Dilute 200 ng of antigen with carbonic acid coating buffer, pH 9.6 to make 50 μl. Assays were performed on plated 96-well plates. Wells at 4 ° C overnight (or (At 37 ° C for 2 hours). The contents of the plate were then removed and the wells were Blocked for 2 hours with BS / 1% BSA. After the blocking step, transfer the wells to PBS / 0.1% T ween 20^TMAnd washed 5 times. PBS / 0.1% Tween 20^TM/ 100% diluted 1: 100 with 0.1% BSA Was added to each well and incubated at room temperature for 30 minutes. Then pre Plate again with PBS / 0.1% Tween 20^TMAnd washed 5 times. Then, the enzyme conjugate (horseradish peroxidase protein A, Zy med, San Francisco, California, USA) PBS / 0.1% Tween 20^TM1 at /0.1% BSA : Dilute 10000, add 50 μl of diluted conjugate to each well, Incubated for 30 minutes. After incubation, transfer the wells to PBS / 0.1% Tween 20^TMso Washed 5 times. 100 μl of tetramethylbenzidine peroxidase (TMB) substrate (Kir kegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, Maryland, USA) Incubated for about 15 minutes without dilution. Add 100 μl of 1N sulfuric acid to each well The reaction was stopped by reading the plate at 450 nm. FIG. 4 shows sera obtained from M. tuberculosis positive and negative patients and the method A of Example 3; Figure 4 shows the reactivity of ELISA with two isolated recombinant antigens (TbRa3 and TbRa9). these Antigen reactivity was isolated from Mycobacterium tuberculosis strain H37Ra (Difco, Detroit, Minnesota, USA). The bacterium lysate was compared with the reactivity. In both cases, recombinant antigens are positive and negative The sera could be distinguished. Cutoff obtained from ROC curve (receiver-operator curve) Based on the values, TbRa3 detected 56 of 87 positive sera and TbRa9 detected 165. Of the body's positive sera, 111 were detected. FIG. 5 shows the ELISA reactivity of a representative antigen isolated using Method B of Example 3. . Reactivity of recombinant antigens TbH4, TbH12, Tb38-1 and peptide TbM-1 (described in Example 4) And Andersen and Hansen, Infect. Immun. 57: 2481-2488, 38 kD antigen described in 1989 Was compared with the reactivity. Again, all tested polypeptides were positive and negative sera Could be distinguished. Based on the cut-off value obtained from the ROC curve, TbH4 TbH12 detected 50 of 125 positive sera from 67 positive sera 38-1 detected 61 out of 101 positive sera, and TbM-1 peptide Twenty-five of the positive sera were detected. Four antigens (TbRa3, TbRa9, TbH4 and TbH12) and mycobacterial staining of sputum (Smithwick and David, Tubercle 52: 226 1971) is a group of M. tuberculosis infected patients showing different reactivity? The reactivity with the obtained serum was also examined and compared with the reactivity of the M. tuberculosis lysate and the 38 kD antigen. The results are shown in Table 3 below. Table 3 Reactivity of antigens with serum obtained from M. tuberculosis patients Based on the cut-off value obtained from the ROC curve, TbRa3 was out of 27 positive sera Of 23 positive samples, TbRa9 of 22 positive samples of 27 positive sera, TbH4 of 27 positive sera Among them, 18 samples and TbH12 detected 15 samples out of 27 positive sera. In combination If used, these four antigens would theoretically have the sensitivity to detect 27 of the 27 positive samples Which means that these antigens may be necessary for the serological detection of M. tuberculosis infection. Each of them should be complementary. In addition, recombinant Some of the antigens detected positive sera that could not be detected with the 38 kD antigen, This shows that these antigens can function complementarily to the 38 kD antigen. Serum from a M. tuberculosis patient who was negative for the 38 kD antigen, and a PPD-positive donor and positive Reactivity of serum obtained from normal donors with recombinant antigen TbRall was measured by ELISA as described above. did. The results are shown in FIG. 6, which shows that TbRall was a PPD positive donor and a normal donor. Sera were negative, but sera negative for 38 kD antigen could be detected It is shown that. Nine of the thirteen 38kD negative sera tested were positive on TbRall. But this antigen may react with a subgroup of 38kD antigen-negative sera It is shown that. In contrast, in the 38kD positive serogroup reactive with TbRall The average OD 450 of TbRall was lower than that of the 38 kD antigen. This data is based on TbRall This shows that there is an inverse relationship between the presence of activity and the 38 kD positivity. After 50 μl of the 1: 100 diluted serum was left at room temperature for 30 minutes, washed with PBS / Tween, 1:10 Biotinylated protein A (Zymed, San Francisco, California, USA) (B.N.A.) for 30 minutes and tested for antigen TbRa2A by indirect ELISA. Tested. After washing, 50 μl of streptavidin-horseradish peroxidase ( A 1: 10,000 dilution of Zymed) was added and the mixture was incubated for 30 minutes. After washing The assay was developed with the TMB substrate described above. Mycobacterium tuberculosis patients with TbRa2A and normal donors Table 4 shows the reactivity with the sera obtained from the above. Between serum obtained from M. tuberculosis patients and TbRa2A The average value of the reactivity was 0.444 and the standard deviation was 0.309. Serum from a normal donor The average value of the reactivity with was 0.109 and the standard deviation was 0.029. In addition, 38kD negative serum The test (FIG. 7) also showed that the TbRa2A antigen was able to detect serum in this category .Table 4 Reactivity of serum from M. tuberculosis patients and normal donors with TbRa2A Recombinant antigen (g) (SEQ ID NO: 60) and serum from M. tuberculosis patients and normal donors Was determined by ELISA according to the procedure described above. FIG. 8 shows the antigen (g) and the 38 kD antibody. Titration with 4 M. tuberculosis positive sera and 4 normal donor sera Shows the results of the solution. All four positive serum samples reacted with the antigen (g). Recombinant antigen TbH-29 (SEQ ID NO: 137) and M. tuberculosis patients, PPD positive donors and normal donors The reactivity with the serum obtained from the gel was determined by the indirect ELISA method described above. The results are shown in FIG. . TbH-29: 30 out of 60 M. tuberculosis positive sera, 2 out of 8 PPD positive sera, normal blood Two of 27 samples were detected. FIG. 10 shows the antigen TbH-33 (SEQ ID NO: 140), serum obtained from a M. tuberculosis patient, ELISA with pooled sera from donors and M. tuberculosis patients The results of the test (both direct and indirect) are shown. OD 450 in serum from M. tuberculosis patients Mean is higher than that of normal donors; mean OD450 in indirect ELISA is direct ELISA Was significantly higher than the value of FIG. 11 shows that recombinant TbH-33 and M. tuberculosis patients and normal donors. This is a titration curve of the reactivity with the serum obtained, which increases with increasing antigen concentration. OD 450 increases. Recombinant antigens RDIF6, RDIF8 and RDIF10 (SEQ ID NOS: 184-187, respectively) and M. tuberculosis patients And the reactivity with serum obtained from normal donors was determined by the above-described ELISA method. RDIF6 is tuberculosis 6 out of 32 serum samples and 0 out of 15 normal serum samples were detected. RDIF10 detected 4 out of 27 samples of M. tuberculosis serum in 14 samples and 0 samples in 15 normal sera. One sample was detected from 15 samples and 15 normal serum samples. In addition, RDIF10 was obtained from PPD positive donors. None of the five serum samples were detected. Example 7 Preparation and characterization of Mycobacterium tuberculosis fusion protein The fusion protein containing TbRa3, 38kD antigen and Tb38-1 was prepared as follows. Made. Each of the DNA constructs TbRa3, 38kD and Tb38-1 was fused and Modified by PCR to facilitate expression of the fusion protein TbRa3-38kD-Tb38-1 did. Primers PDM-64 and PDM-65 (SEQ ID NOs: 141 and 142), PDM-57 and PD M-58 (SEQ ID NOs: 143 and 144), and PDM-69 and PDM-60 (SEQ ID NOs: 145 and 14) PCR was performed using TbRa3, 38 kD and Tb38-1 DNA, respectively, using 6). In each case, 10 μl of 10 × Pfu buffer, 2 μl of 10 mM dNTP, each 2 μl of 10 μM PCR primers, 81.5 μl of water, 1.5 μl of Pfu DNA Merase (Stratagene, La Jolla, CA) and 70ng / μl (for TbRa3) or DNA amplification using 1 μl DNA at a concentration of 50 ng / μl (for 38 kD and Tb38-1) The width went. For TbRa3, denature at 94 ° C for 2 minutes, then at 96 ° C for 15 seconds And 40 cycles of 1 minute at 72 ° C. and finally 4 minutes at 72 ° C. 38kD This was followed by denaturation at 96 ° C for 2 minutes, followed by 96 ° C for 30 seconds, 68 ° C for 15 seconds and 72%. Forty cycles of 3 minutes at 40 ° C. and finally 4 minutes at 72 ° C. About Tb38-1 Denature at 94 ° C for 2 minutes, followed by 96 ° C for 15 seconds, 68 ° C for 15 seconds and 72 ° C for 1.5 minutes 30 cycles of 10 cycles between, 15 seconds at 96 ° C, 15 seconds at 64 ° C and 1.5 at 72 ° C, And finally, it was performed at 72 ° C. for 4 minutes. Digest the TbRa3 PCR fragment with NdeI and EcoRI and use the NdeI and EcoRI sites And cloned directly into the pT7 L2 IL1 vector. The 38k DPCR fragment is Sse8387I Digest, treat with T4 DNA polymerase to make blunt ends, and then For direct cloning into pT7 L2Ra3-1 vector digested with Was digested with EcoRI. The Tb38-IPCR fragment was digested with Eco47III and EcoRI and digested with It was subcloned directly into pT7 L2Ra3 / 38kD-17 which had been digested with the same enzymes. Total melting The compound was then transferred to pET28b using NdeI and EcoRI sites. This fusion construct Confirmed by DNA sequencing. This expression construct was transformed into BLR pLys S E. coli (Novagen, Madison, Wis.). Contains kanamycin (30 μg / ml) and chloramphenicol (34 μg / ml) Grown overnight in LB broth. Use this culture (12 ml) to contain the same antibiotics. With 500 ml of 2XYT, and the culture is final concentrated with IPTG at OD560 0.44. Induction was performed until the temperature reached 1.2 mM. Four hours after induction, bacteria were harvested and 20 mM Tris ( 8.0), 100 mM NaCl, 0.1% DOC, 20 μg / ml Leupeptin, sonicated in 20 mM PMSF. Subsequently, it was centrifuged at 26,000Xg. The resulting pellets are 8 M urea, 20 mM Tris (8.0), 100 Resuspend in mM NaCl and Pro-bond nickel resin (Invitrogen, Carlsbad, CA ). The column is washed several times with the buffer and then imidazole gradient (8 M urea, 20 mM Tris (8.0), 100 mM NaCl, 50 mM, 100 mM, 500 mM imidazole ). The eluate containing the protein was dialyzed against 10 mM Tris (8.0) . DNA of the resulting fusion protein (hereinafter referred to as TbRa3-38kD-Tb38-1) and The amino acid sequences are shown in SEQ ID NOs: 147 and 148, respectively. Fusion protein containing two antigens TbH-9 and Tb38-1 without hinge sequence The quality (hereinafter referred to as TbH-9-Tb38-1) was prepared by the same operation as described above. TbH-9-Tb38 The DNA sequence of the -1 fusion protein is shown in SEQ ID NO: 151. A fusion protein containing TbRa3, antigen 38kD, Tb38-1 and DPEP was prepared as follows. Prepared. Each of the DNA constructs TbRa3, 38kD and Tb38-1 was substantially as described above. And modified by PCR and cloned into a vector. For amplification of the Tb38-1A fragment, Primers PDM-69 (SEQ ID NO: 145) and PDM-83 (SEQ ID NO: 200) were used. Tb38-1A Indicates the smooth restriction region in the open reading frame while retaining the final amino acid integrity. The DraI site at the 3 'end of the coding region creating the position differs from Tb38-1. TbRa The 3/38 kD / Tb38-1A fusion was then transferred into pET28b using NdeI and EcoRI sites . Primers PDM-84 and PDM-85 (SEQ ID NOs: 201 and 202, respectively) and 50 ng / PCR was performed with DPEP DNA using 1 μl of DNA. Denaturation at 94 ° C 2 minutes, followed by 10 cycles of 96 ° C for 15 seconds, 68 ° C for 15 seconds and 72 ° C for 1.5 minutes 30 cycles of 96 ° C for 15 seconds, 64 ° C for 15 seconds and 72 ° C for 1.5 minutes For 4 minutes at 72 ° C. Digest the DPEP PCR fragment with EcoRI and Eco72I, And EcoRI digested directly into the pET28Ra3 / 38kD / 38-1A construct. Fusion The protein was confirmed to be accurate by DNA sequencing. The recombinant protein Prepared as described above. Of the obtained fusion protein (hereinafter referred to as TbF-2) The DNA and amino acid sequences are shown in SEQ ID NOs: 203 and 204, respectively.Example 8 Use of Mycobacterium tuberculosis fusion protein for serodiagnosis of tuberculosis Serodiagnosis of tuberculosis infection with the fusion protein TbRa3-38kD-Tb38-1 prepared by the method described above Efficacy in disruption was tested by ELISA. The ELISA protocol was performed as described in Example 6 above, and the fusion protein Coated 200 ng / well. ELISA or Western blot analysis Before reacting with each of the originals alone or with a combination of them A panel of sera was selected from a group of tuberculosis patients indicated as: Such a panel Whether all three epitopes function in the fusion protein Detailed analysis of the serologic reactivity of the fusion protein to determine Noh. As shown in FIG. 5, the sera of the four samples that reacted only with TbRa3 It was detectable in protein. Three sera reacted with Tb38-1 alone were also The same was true for the two sera that were detectable in proteins and reacted only with 38 kD. remaining Of the 15 sera, the mean negative value plus three standard deviations was When the toe-off value was used, all of the fusion proteins were positive. This data is It shows that all three epitopes in the protein are functional and active.Table 5 Reactivity of tripeptide fusion proteins with serum obtained from M. tuberculosis patients The reactivity of this fusion protein, TbF-2, with serum from M. tuberculosis-infected patients was described above. Inspection was performed by ELISA using the protocol. The results of these studies (Table 6) show that This indicates that all three antigens function independently in the fusion protein.Table 6 Reactivity of TbF-2 fusion protein with TB and normal serum One of skill in the art will recognize that if each of the epitopes is still functionally available The ability to change the order of the individual antigens within the fusion protein, and equivalent activity It will be understood that it is imagined. In addition, this protein containing an active epitope Truncated forms of proteins can also be used to construct fusion proteins. As noted above, specific embodiments of the present invention have been described herein for purposes of illustration. Various modifications may be made without departing from the spirit and scope of the invention. It will be appreciated that it is possible.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＤＧ０１Ｎ 33/53 33/569 Ｆ 33/569 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者ディロン，ダヴィン，シー. アメリカ合衆国 98053 ワシントン州, レッドモンド，エヌ．イー．24ティーエイチストリート 21607 (72)発明者カンポス―ネト，アントニオアメリカ合衆国 98021 ワシントン州, バインブリッジアイランド，ミッドシップコートエヌ．イー．9308 (72)発明者ホウトン，レイモンドアメリカ合衆国 98021 ワシントン州, ボスエル，242エヌディープレースエス．イー．2636 (72)発明者ヴェドヴィック，トーマス，エス. アメリカ合衆国 98003 ワシントン州, フェデラルウェイ，サウス 300ティーエイチプレース 124 (72)発明者トワードジック，ダニエル，アール. アメリカ合衆国 98110 ワシントン州, バインブリッジアイランド，サウスビーチドライブ 10195 (72)発明者ロッジス，マイケル，ジェイ. アメリカ合衆国 98126 ワシントン州, シアトル，36ティーエイチアベニューエス．ダブリュ．9223──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) C12N 5/10 C12Q 1/68 A C12Q 1/68 G01N 33/53 D G01N 33/53 33/569 F 33 / 569 C12N 5/00 B (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, KE, LS, MW, SD, SZ, UG, ZW) , EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, Z, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GE, GH, HU, ID, IL, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU , LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, UZ, VN, YU (72) Inventor Dillon, Davin, C. United States 98053 Washington, Redmond, NJ. E. 24 T. H. Street 21607 (72) Inventor Campos-Neto, Antonio United States 98021 Washington, Vinebridge Island, Midship Court N. E. 9308 (72) Inventor Houghton, Raymond United States 98021 Boswell, Washington 242 Nd Place ES. E. 2636 (72) Inventor Vedvic, Thomas, S. United States 98003 Washington, Federal Way, South 300 Tea H Place 124 (72) Inventor Toward Sick, Daniel, Earl. United States 98110 Washington, Vinebridge Island, South Beach Chi Drive 10195 (72) Inventor Lodges, Michael, Jay. 36 T.A.S., Seattle, Washington 98126, USA. W. 9223

Claims

[Claims] 1. A polypeptide comprising an antigenic portion of a soluble M. tuberculosis antigen, or an antigenic portion of a variant of the antigen that differs only in conservative substitutions and / or modifications, wherein the antigen comprises: A polypeptide having an N-terminal sequence selected from the group consisting of: (j). [Wherein Xaa may be any amino acid] A polypeptide comprising an immunogenic portion of a Mycobacterium tuberculosis antigen or an antigenic portion of a variant of the antigen that differs only in conservative substitutions and / or modifications, wherein the antigen comprises the following (a)-(b): A polypeptide having an N-terminal sequence selected from the group consisting of: [Wherein Xaa may be any amino acid] A polypeptide comprising an antigenic portion of a soluble Mycobacterium tuberculosis antigen or an antigenic portion of a variant of the antigen that differs only in conservative substitutions and / or modifications, wherein the antigen has SEQ ID NOs: 1, 2, 4-10 , 13-25, 52, 94 and 96, the complementary sequences of these sequences, and SEQ ID NOs: 1, 2, 4-10, 13 under moderate stringency conditions. A polypeptide having an amino acid sequence encoded by a DNA sequence that hybridizes to a sequence of ２５25, 52, 94, and 96 or a complement thereof. 4. A polypeptide comprising an antigenic portion of a Mycobacterium tuberculosis antigen or an antigenic portion of a variant of the antigen that differs only in conservative substitutions and / or modifications, wherein the antigen has SEQ ID NOs: 26-51, 133, 134; DNA sequences selected from the group consisting of the sequences of 158-178 and 196, the complementary sequences of these sequences, and SEQ ID NOs: 26-51, 133, 134, 158-178 and 196 under moderate stringency conditions. Or a polypeptide having an amino acid sequence encoded by a DNA sequence that hybridizes to the complementary sequence thereof. 5. A DNA molecule comprising a nucleotide sequence encoding the polypeptide according to any one of claims 1 to 4. 6. A recombinant expression vector containing the DNA molecule according to claim 5. 7. A host cell transformed with the expression vector according to claim 6. 8. The host cell according to claim 7, which is selected from the group consisting of Escherichia coli, yeast and mammalian cells. 9. A method for detecting a Mycobacterium tuberculosis infection in a biological sample, comprising the steps of: (A) contacting a biological sample with one or more polypeptides according to any of claims 1 to 4, and (b) detecting the presence of antibodies that bind to at least one polypeptide in the sample. Detecting Mycobacterium tuberculosis infection in a biological sample. 10. A method for detecting a Mycobacterium tuberculosis infection in a biological sample, comprising the steps of: (A) contacting a biological sample with a polypeptide having an N-terminal sequence selected from the group consisting of the sequences given in SEQ ID NOs: 129 and 130; (b) the presence of an antibody that binds at least one polypeptide Is detected in the sample, thereby detecting M. tuberculosis infection in the biological sample. 11. A method for detecting a Mycobacterium tuberculosis infection in a biological sample, comprising the steps of: (A) providing a biological sample with a DNA sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3, 11, 12, 135, 136, 151 to 155, 184 to 188, 194 to 195, and 198; And one or more polypeptides encoded by DNA sequences that hybridize to the sequences of SEQ ID NOs: 3, 11, 12, 135, 136, 151-155, 184-188, 194-195, and 198. (B) detecting in the sample the presence of antibodies that bind to at least one polypeptide, thereby detecting a M. tuberculosis infection in the biological sample. 12. Step (a) further comprises contacting the biological sample with a 38 kD Mycobacterium tuberculosis antigen, and step (b) further comprising detecting the presence of an antibody that binds to the 38 kD Mycobacterium tuberculosis antigen in the sample. The method according to any one of claims 9 to 11, comprising: 13. 12. The method according to any one of claims 9 to 11, wherein the polypeptide is bound to a solid support. 14． 14. The method according to claim 13, wherein the solid support comprises a nitrocellulose, latex or plastic material. 15. 12. The method according to any one of claims 9 to 11, wherein the biological sample is selected from the group consisting of whole blood, serum, plasma, saliva, cerebrospinal fluid and urine. 16. 16. The method according to claim 15, wherein the biological sample is whole blood or serum. 17． A method for detecting a Mycobacterium tuberculosis infection in a biological sample, comprising the steps of: (A) contacting the sample with at least two oligonucleotide primers in a polymerase chain reaction, wherein at least one of the oligonucleotide primers is specific for the DNA molecule of claim 5; A DNA sequence that amplifies in the presence is detected in the sample, thereby detecting a Mycobacterium tuberculosis infection. 18. 18. The method of claim 17, wherein the at least one oligonucleotide primer contains at least about 10 contiguous nucleotides of the DNA molecule of claim 5. 19. A method for detecting a Mycobacterium tuberculosis infection in a biological sample, comprising the steps of: (A) contacting the sample with at least two oligonucleotide primers in a polymerase chain reaction, wherein at least one of the oligonucleotide primers is SEQ ID NO: 3, 11, 12, 135, 136, 151-155, 184-188, 194 (B) detecting in the sample a DNA sequence that amplifies in the presence of the first and second oligonucleotide primers, wherein the DNA sequence is specific for a DNA sequence selected from the group consisting of -195 and 198; Detect bacterial infection. 20. At least about 10 contiguous stretches of DNA sequence wherein the at least one oligonucleotide primer is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3, 11, 12, 135, 136, 151-155, 184-188, 194-195 and 198 20. The method of claim 19, comprising a nucleotide. 21. 20. The method according to claim 17 or 19, wherein the biological sample is selected from the group consisting of whole blood, sputum, serum, plasma, saliva, cerebrospinal fluid and urine. 22. A method for detecting a Mycobacterium tuberculosis infection in a biological sample, comprising the steps of: (A) contacting the sample with one or more oligonucleotide probes specific for the DNA molecule of claim 5, (b) detecting in the sample a DNA sequence that hybridizes to the oligonucleotide probe, Detect Mycobacterium tuberculosis infection. 23. 23. The method of claim 22, wherein the probe contains at least about 15 contiguous nucleotides of the DNA molecule of claim 5. 24. A method for detecting a Mycobacterium tuberculosis infection in a biological sample, comprising the steps of: (A) preparing one or more oligos specific to a DNA sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3, 11, 12, 135, 136, 151 to 155, 184 to 188, 194 to 195 and 198; (B) detecting in the sample a DNA sequence that hybridizes to the oligonucleotide probe, thereby detecting a Mycobacterium tuberculosis infection. 25. The oligonucleotide probe contains at least about 15 contiguous nucleotides of a DNA sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3, 11, 12, 135, 136, 151-155, 184-188, 194-195, and 198. The method of claim 24, wherein 26. 25. The method according to claim 22 or 24, wherein the biological sample is selected from the group consisting of whole blood, sputum, serum, plasma, saliva, cerebrospinal fluid and urine. 27. A method for detecting a Mycobacterium tuberculosis infection in a biological sample, comprising the following steps. (A) contacting a biological sample with a binding agent capable of binding to the polypeptide according to any one of claims 1 to 4, and (b) placing a protein or polypeptide binding to the binding agent in the sample. Detecting, thereby detecting M. tuberculosis infection in the biological sample. 28. A method for detecting a Mycobacterium tuberculosis infection in a biological sample, comprising the steps of: (A) contacting a biological sample with a binding agent capable of binding a polypeptide having an N-terminal sequence selected from the group consisting of the sequences given in SEQ ID NOs: 129 and 130; (b) binding to the binding agent A protein or polypeptide is detected in the sample, thereby detecting a Mycobacterium tuberculosis infection in the biological sample. 29. A method for detecting a Mycobacterium tuberculosis infection in a biological sample, comprising the steps of: (A) providing a biological sample with a DNA sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3, 11, 12, 135, 136, 151 to 155, 184 to 188, 194 to 195 and 198; Contacting a binding agent capable of binding to a polypeptide encoded by a DNA sequence that hybridizes to the sequence of SEQ ID NOs: 3, 11, 12, 135, 136, 151-155, 184-188, 194-195 and 198. (B) detecting in the sample a protein or polypeptide that binds to the binding agent, thereby detecting a M. tuberculosis infection in the biological sample. 30. 30. The method according to any one of claims 27 to 29, wherein the binding agent is a monoclonal antibody. 31. 30. The method according to any one of claims 27 to 29, wherein the binding agent is a polyclonal antibody. 32. A diagnostic kit comprising (a) one or more polypeptides according to any one of claims 1 to 4, and (b) a detection reagent. 33. A diagnostic kit comprising (a) one or more polypeptides having an N-terminal sequence selected from the group consisting of the sequences given in SEQ ID NOs: 129 and 130, and (b) a detection reagent. 34. A DNA sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3, 11, 12, 135, 136, 151-155, 184-188, 194-195 and 198, a complementary sequence to the sequence, SEQ ID NOs: 3, 11, 12 A diagnostic kit comprising one or more polypeptides encoded by a DNA sequence that hybridizes to the sequence of SEQ ID NO: 135, 136, 151-155, 184-188, 194-195 and 198, and (b) a detection reagent. 35. 35. The kit according to any one of claims 32 to 34, wherein the polypeptide is immobilized on a solid support. 36. 36. The kit of claim 35, wherein the solid support is comprised of a nitrocellulose, latex or plastic material. 37. 35. The kit according to any one of claims 32 to 34, wherein the detection reagent contains a reporter group attached to the detection agent. 38. 38. The kit of claim 37, wherein the binding agent is selected from the group consisting of anti-immunoglobulin, protein G, protein A, and lectin. 39. 38. The kit of claim 37, wherein the reporter group is selected from the group consisting of a radioisotope, a fluorescent group, a luminescent group, an enzyme, biotin, and a dye particle. 40. A diagnostic kit comprising at least two oligonucleotide primers, wherein at least one oligonucleotide primer is specific for a DNA molecule according to claim 5. 41. 41. The diagnostic kit of claim 40, wherein the at least one oligonucleotide primer contains at least about 10 contiguous nucleotides of the DNA molecule of claim 5. 42. A diagnostic kit comprising at least two oligonucleotide primers, wherein at least one of said primers comprises SEQ ID NOs: 3, 11, 12, 135, 136, 151-155, 184-188, 194-195 and 198 A diagnostic kit that is specific for a DNA sequence selected from the group consisting of: 43. The at least one oligonucleotide primer has at least about 10 contiguous stretches of a DNA sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3, 11, 12, 135, 136, 151-155, 184-188, 194-195, and 198. 43. The diagnostic kit of claim 42, comprising a nucleotide. 44. A diagnostic kit comprising at least one oligonucleotide probe specific for the DNA molecule according to claim 5. 45. 46. The kit of claim 44, wherein the oligonucleotide probe contains at least about 15 contiguous nucleotides of the DNA molecule of claim 5. 46. Contains at least one oligonucleotide probe that is specific for a DNA sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3, 11, 12, 135, 136, 151-155, 184-188, 194-195, and 198. Diagnostic kit. 47. The oligonucleotide probe contains at least about 15 contiguous nucleotides of a DNA sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3, 11, 12, 135, 136, 151-155, 184-188, 194-195, and 198. 47. The kit of claim 46, wherein 48. A monoclonal antibody that binds to the polypeptide according to any one of claims 1 to 4. 49. A polyclonal antibody that binds to the polypeptide according to any one of claims 1 to 4. 50. A fusion protein comprising two or more polypeptides according to any one of claims 1 to 4. 51. A fusion protein comprising one or more polypeptides of any one of claims 1 to 4 and ESAT-6 (SEQ ID NO: 99). 52. A fusion protein comprising a polypeptide having an N-terminal sequence selected from the group of sequences given in SEQ ID NOs: 129 and 130. 53. A fusion protein comprising one or more polypeptides according to any one of claims 1 to 4 and a Mycobacterium tuberculosis antigen 38 kD (SEQ ID NO: 150). 54. A diagnostic kit comprising (a) one or more fusion proteins according to any one of claims 50 to 53, and (b) a detection reagent.