JP2001500005A

JP2001500005A - Ｈｐｐｄ遺伝子及び阻害剤

Info

Publication number: JP2001500005A
Application number: JP10509179A
Authority: JP
Inventors: スターナー，スティーブン; ミヨヒラヤマ，リンヌ; シン，ビジェイ; バスコンブ，ニューエル
Original assignee: アメリカンシアナミドコンパニー
Priority date: 1996-07-25
Filing date: 1997-07-25
Publication date: 2001-01-09
Also published as: HUP0000053A3; HUP0000053A2; TR199900200T2; AU748196B2; PL331346A1; NO990296L; AU4231197A; BR9710751A; EA199900150A1; NZ334067A; WO1998004685A1; IL128226A0; SK10199A3; US6118050A; NO990296D0; CA2262002A1; MX9900939A; CN1238008A; IL128226A; BG103206A

Abstract

(57)【要約】シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)からの４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）をコードしている核酸配列を開示する。また、ＨＰＰＤをコードしているＤＮＡを含んでいるべクター、および形質転換された細胞を開示する。さらに、この記述は除草剤抵抗性のＨＰＰＤ、およびＨＰＰＤの阻害剤である除草剤を同定する方法、ならびに植物に除草剤抵抗性を与える方法を教示する。さらに、この記述は雑草防除の方法を教示する。

Description

【発明の詳細な説明】ＨＰＰＤ遺伝子及び阻害剤技術分野本発明は４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）をコードしているＤＮＡ、ＨＰＰＤ阻害性除草剤、およびＨＰＰＤ阻害性除草剤を同定するための化合物をスクリーニングする方法に関する。本発明はまた、除草剤の阻害活性に抵抗性のあるＨＰＰＤ変異体、ＨＰＰＤ変異体をスクリーニングする方法、および除草剤抵抗性ＨＰＰＤを含んでいる植物にも関する。背景技術植物では、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ、ＥＣ１．１３．１１．２７）は、プラストキノンおよびトコフェロールの生合成における鍵酵素である。４−ヒドロキシフェニルピルビン酸（コリスミン酸からシキミ酸経路を経て誘導される）は、ＨＰＰＤにより酸化および脱炭酸され、ホモゲンチジン酸を生じる(FiedlerおよびSchultz、Dev．Plant Biol．8：537、19 82；Fiedler等、Planta 155:511，1982)。続いて起こるホモゲンチジン酸のポリプレニル化および脱炭酸の結果、多数のプラストキノン類およびトコフェロール類を生じる。動物では、ＨＰＰＤはチロシンの異化作用に関係する。ヒトおよびマウスでは、この経路の遺伝的欠損は、遺伝性のＩ型チロシン血症を導く。この病気はＨＰＰＤの阻害剤であるＮＴＢＣ（２−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルベンゾイル）−１，３−シクロヘキサンジオン）により治療できるが、これは肝毒性であるチロシン異化作用の中間産物の蓄積を妨げる(Ellis等、Tox．and Appl．P harm．133:12，1995)。プラストキノンおよびトコフェロールは植物にとって必須な化合物であるため、この酵素の阻害剤は、除草剤としての可能性がある。ＨＰＰＤ阻害剤の一つの部類であるトリケトンは、最近、除草剤としての活性を有することが示されている(Prisbylia等、Brighton Crop Protection Conference：Weeds，British Crop Protection Council，サリー州、英国、731-738頁、1993；Schulz等、FEBS Let ts．318：162，1993)。トウモロコシに選択的な除草剤であるサルコトリオン（s ulcotrione）(２−（２−クロロ−４−メタンスルホニルベンゾイル）−１，３ −シクロヘキサンジオン)は、感受性の植物に、カロチノイドおよびクロロフィルの喪失とフィトエンおよびチロシンの増加を伴う強い漂白作用を引き起こす(Barta等、Pest．Sci．45：286，1995；Soeda等、Pes tic．Biochem．Physiol．29：35，1987；Mayonado等、Pestic．Biochem．Physio l 35:138，1989)。アオウキクサ属(Lemna)のサルコトリオンによる処理は著しく成長を阻害し、その除草剤としての効果は、ホモゲンチジン酸を用いて消失させることができた。トウモロコシから抽出した部分精製された酵素は、サルコトリオンにより著しく阻害されることが示され、算定されたＩＣ₅₀は４５ｎＭであった（Schulz等、1993、前記）。イヌビエ(Echinochloa crus-galli L．)から部分精製されたＨＰＰＤの分析は、サルコトリオンがＫ_i９．８ｎＭの強い競争阻害剤であることを示した(Secor，Plant Physiol．106：1429，1994)。カナダ特許出願第２、１１６、４２１号は、２−ベンゾイルシクロヘキサミン−１，３−ジオンから誘導されたＨＰＰＤ阻害剤の同定を記載している。Ｔ−ＤＮＡで標識したシロイヌナズナ属の個体群から分離した白変種（ｐｓｄｌ）は、最初は著しい色素の欠損に基づいて選択され、カロチノイド生合成のための遺伝子における欠損のせいであると考えられた(Norris等、Plant Cell 7：2 139，1995)。白変種ｐｓｄｌを、ＭＳ２培地上で発芽させ、続いて４−ヒドロキシフェニルピルビン酸塩（ＯＨＰＰ）またはホモゲンチジン酸（ＨＧＡ）のいずれかを添加したＭＳ２培地に移すと、この植物はＨＧＡ上では緑色になったがＯＨＰＰ上ではならなかった。この変異体のさらなる分析は、白変種の表現型を引き起こす欠損が、カロチノイド生合成酵素における突然変異に直接的に起因するものではなく、むしろＨＰＰＤにおける突然変異の結果であって、そのことがカロチノイド生合成に必須なプラストキノンの生合成を妨げることを示している。植物におけるこの経路の重要性にもかかわらず、プラストキノンおよびトコフェロールの生合成のための植物酵素をコードしている遺伝子は、従来、単離されていなかった。従ってこの分野では、ＨＰＰＤ遺伝子、除草剤として有用なＨＰＰＤ阻害剤、および除草剤抵抗性のＨＰＰＤ変異体を提供する方法ならびに組成物が必要である。本発明者等は、植物のＨＰＰＤをコードしている遺伝子を分離し、それを大腸菌において発現させ、さらに細菌で発現された植物ＨＰＰＤに酵素活性があること、およびその酵素活性がトリケトン除草剤により阻害されることを示した。図面の簡単な説明図１は、シロイヌナズナ（ＡｔＨＰＰＤ）からの４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）のアミノ酸配列を示し、この配列をマウス、ヒト、ブタ、およびストレプトミセス・アベルミティリス(Streptomyces aver mitilis（S．Avel.）)からの関連した配列と並列させて示したものである。図２は、シロイヌナズナ属ＨＰＰＤ遺伝子で形質転換された大腸菌による褐色色素の産生（“シロイヌナズナ属”）を、対照ベクターで形質転換した大腸菌（ “プラスミド”）と比較した図である。培地に添加したチロシン濃度の増加が色素形成に及ぼす影響を示す。図3Aは、対照ベクターで形質転換した大腸菌からの培地のＨＰＬＣ溶出曲線である。図3Bは、シロイヌナズナ属ＨＰＰＤ遺伝子で形質転換した大腸菌からの培地のＨＰＬＣ溶出曲線である。基準となるホモゲンチジン酸の標準試料の溶出位置を矢印で示す。図3Bの挿入図は、ホモゲンチジン酸のピークの吸収スペクトルである。図4は、シロイヌナズナＨＰＰＤ遺伝子で形質転換した大腸菌からの細胞抽出物のＨＰＰＤ酵素活性に及ぼすサルコトリオンの濃度増加の影響を示す図である。発明の概要本発明は、植物の４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）をコードしている分離精製された核酸を提供し、特にシロイヌナズナ由来のＨＰＰＤと、その配列保存変異体ならびに機能保存変異体；転写調節要素に作動的に連結されたＨＰＰＤをコードしている核酸を含んでいるＤＮＡベクター；および細菌、菌類、植物、昆虫、および哺乳類の細胞を含むがこれらに制限されることなく含んでいるＨＰＰＤベクターを含む細胞を提供する。一つの態様では、高いレベルの植物ＨＰＰＤを発現している細菌細胞を提供する。また、ＨＰＰＤボリペブチドオおよびそれらから誘導される、酵素活性のあるフラグメントも含まれる。他の側面では、本発明は、除草剤／ＨＰＰＤ阻害剤を同定する方法を提供し、それらは：（ａ）植物のＨＰＰＤを発現している微生物細胞を提供すること；（ｂ）その細胞を、試験培養物を作成するために試験化合物の存在下に、また対照培養物を作成するために試験化合物の非存在下に培養すること；（ｃ）試験培養物および対照培養物における、ホモゲンチジン酸またはその酸化物のレベルを観察すること；および（ｄ）試験培養物において、対照培養物と比較して、ホモゲンチジン酸またはその酸化物のレベルを減少させるいかなる化合物をもＨＰＰＤを阻害する化合物として同定すること、を含む。上記の方法では、観察の段階は、例えば、前記培養物の４５０ｎＭの吸光度を測定することによるか、または褐色色素の形成を視覚的に検出することにより行なってもよい。別法として、阻害剤は試験培養物の成長を阻害する化合物であって、その培養物へのホモゲンチジン酸の添加により、その阻害を消失させることができる化合物として同定される。さらなる側面では、本発明は、除草剤に抵抗性のあるＨＰＰＤ変異体を同定するための方法であって、（ａ）植物のＨＰＰＤを発現している細胞集団を提供すること；（ｂ）前記の細胞集団を突然変異させること；（ｃ）前記突然変異させた細胞集団に、非突然変異細胞の成長を阻害する条件下で、除草剤を接触させること；（ｄ）成長および／または色素産生についての除草剤の阻害作用に抵抗性のある細胞を回収すること；および（ｅ）回収された細胞からの、ＨＰＰＤをコードしている核酸の塩基配列を決定すること、により行なわれる。別法としては、ＨＰＰＤをコードしているＤＮＡにインビトロで無作為または部位特異的突然変異誘発を行ない、続いて異種細胞において発現させ、除草剤抵抗性を示す細胞を選択する。さらに他の側面では、本発明は除草剤抵抗性の変異ＨＰＰＤタンパク質を含む。好ましくは、生存にＨＰＰＤ活性を必要とする細胞において発現する場合には、除草剤抵抗性のＨＰＰＤ変異タンパク質は、（ｉ）それが発現した細胞の生存を単独で維持するに十分な触媒活性か；または、これもまたその細胞に発現された、第一のＨＰＰＤ変異タンパク質と同じかまたは異なってもよい、除草剤に抵抗性のＨＰＰＤ変異タンパク質との組み合わせにおける触媒活性であって、それが発現した細胞の生存を維持するに十分な触媒活性；および（ｉｉ）除草剤に対し、野性型のＨＰＰＤよりも抵抗性のある触媒活性、を示す。また、除草剤抵抗性のＨＰＰＤ変異体をコードしている核酸、この核酸を含んでいるＤＮＡベクター、および変異ＨＰＰＤをコードしているベクターを含んでいる細胞を提供する。除草剤抵抗性のＨＰＰＤ変異体をコードしている遺伝子は、例えば、他の所望の遺伝子の導入および選択のためのプラスミドおよび方法における、遺伝子標識として用いることができる。他の側面では、本発明は、細胞または複数の細胞、および特に、例えば種子のような植物の細胞または複数の細胞に、除草剤抵抗性を与える方法を提供する。ＨＰＰＤ遺伝子、好ましくはシロイヌナズナのＨＰＰＤ遺伝子には、そのＨＰＰＤの酵素活性を阻害する除草剤の能力を変えるために、突然変異が起こされる。突然変異体遺伝子を、適合する発現ベクターにクローン化し、この遺伝子を除草剤感受性の細胞に、この細胞に除草剤抵抗性を与えるに十分なレベルで発現される条件下で形質転換する。また、本発明の除草剤抵抗性のＨＰＰＤ遺伝子を含んでいる作物を栽培し、雑草の防除に効果的な量の除草剤で処理する、雑草防除の方法も意図している。発明の詳細な説明本発明は、植物の４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）をコードしている分離精製された核酸、酵素活性のあるＨＰＰＤが産生される発現系、およびＨＰＰＤ阻害剤を同定するためのスクリーニング法を含む。本発明はまた、除草剤の阻害作用に抵抗性の植物ＨＰＰＤ変異体、これらの変異体をコードするＤＮＡ、これらのＤＮＡを含むベクター、ＨＰＰＤ変異タンパク質、およびこれらの変異体を発現する細胞をスクリーニングおよび産生する方法を含む。さらに、これらの変異体を発現することにより植物に除草剤抵抗性を産生する方法と、雑草防除の方法とを提供する。シロイヌナズナ属のＨＰＰＤをコードしている遺伝子の単離および特徴づけ本発明者等は、シロイヌナズナのＨＰＰＤをコードしている遺伝子を、以下に概説する方法を用いて単離し、配列を決定した。手短にいえば、シロイヌナズナのλＹｅｓｃＤＮＡライブラリー(E1ledge等、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 8 8 ：1731，1991)を、ＰＣＲに基づく方法(Amaravadi等、BioTechniques 16：98， 1994)を用いてスクリーニングした。プライマー：ＡＴＨＰＰＤＩＦ(5’‐CGTGCTCAGCGATGATCAGA‐3’)と名付けた前向きのプライマーと、ＡＴＨＰＰＤＩＲ(5’-CGGCCTGTCACCTAGTGGTT‐3’) と名付けた逆向きのプライマーとを、哺乳類のＨＰＰＤ配列に相同性を示すシロイヌナズナのＥＳＴ配列(GenBank ID No: T20952)に基づいて合成した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において、プライマーは、ｃＤＮＡファージライブラリーの１μｌのアリコート（３ｘ１０⁶ｐｆｕ／ｍｌを含んでいる）を鋳型ＤＮＡとして用いて評価した。ＰＣＲ用には、５０μｌの反応は１ＸのＰＣＲ緩衝液、２００ｍＭの各デオキシヌクレオチド三リン酸、１．２５単位のＡｍｐｌｉｔａqＤＮＡポリメラーゼ（全てパーキンエルマー(Perkin Elmer)より）、および７．５ｐｍｏｌｅの各プライマーを含んでいた。この反応混合物を９５ ℃で２分間加熱し、３５サイクル（９５℃１分間、４８℃２分間、７２℃１分３０秒間）を用いて増幅した。続いて７２℃にて７分間インキュベートした。予想サイズ１１２ｂｐのフラグメントが産生された。このフラグメントをｐＣＲIIベクター（TAクローニングキット(Cloning Kit)、インビトロジェン(Invitrogen) ）にクローン化して配列決定し、シロイヌナズナのＥＳＴ配列（報告されているＥＳＴ配列においてまだ決定されていなかった３残基を加えて）と同等であることが判明した。ライブラリーのスクリ-ニング：ｃＤＮＡライブラリーを、ＮＺＣＹＭ寒天を含んでいる１３のプレート上に、40,000pfu／プレートの密度で播種した。各プレートからのファージをＳＭに溶出し、１３のファージの個別のプールからのアリコートを、ＡＴＨＰＰＤ１ＦおよびＡＴＨＰＰＤ１ＲプライマーペアとともにＰＣＲの鋳型として用いた。ＰＣＲの条件は上記のとおりであった（一回目は、溶出されたファージプールの各々から１μｌを鋳型として使用し、以後の回では５μｌを使用した）。一回目には、１３のファージプールのうち１０個がPCRにより陽性であった。陽性のプールの一つを、さらなるスクリーニングに使用した。二回目には、１０個の5,000pfu／プレートからの溶出物のうち、１個が陽性のプールを生じた。三回目には、１０個の２０pfu／プレートのうち、２個が陽性のプールを生じた。三回目の陽性のプールを播種し、３６個の別個のプラークを選んでスクリーニングし、一つのＨＰＰＤ陽性プラークを見つけた。挿入配列をもつプラスミドは、このベクターの自動的なサブクローニング特性により、このファージから切除された。制限分析は、このプラスミドが１．５ｋｂの挿入配列を含んでいることを示していた。配列分析：配列決定のための鋳型ＤＮＡは、ウィザードＤＮＡピューリフィケーションシステム（Wizard DNA Purification System）(プロメガ(Promega))を用いて調製した。配列決定反応は、ｆｍｏ１ＤＮＡシーケンシングシステム(fmol DNA Sequencing System)（プロメガ）を用いて行ない、シーケンスゲルをハイドロリンクロングランガー(Hydrolink Long Ranger)（ＡＴバイオケム(AT Biochem)ゲル上に流した。ｃＤＮＡライブラリーから単離されたＨＰＰＤを含んでいるプラスミドの挿入配列は、λＹｅｓベクターのＸｈｏＩ部位の両側にハイブリダイズする二つのプライマーを、一連の内部プライマーに加えて用いて配列決定した：すなわち、ＡＴＨＰＰＤＩＦＡＴＨＰＰＤＩＲ（上記）；とである。全ての配列情報は、両鎖の配列を決定することにより確かめた。ＨＰＰＤヌクレオチド配列の翻訳、配列の比較、および多重配列は、ザウィスコンシンパッケージ(The Wisconsin Package)、バージョン８．０（ジェネティッスコンピューターグループ（Genetics Computer Group）、マジソン、ウイスコンシン州）のソフトフェアを用いて行なった。その結果、１．５ｋｂの挿入配列が４４５アミノ酸のオープンリーディングフレーム（図１）を含んでいることを示した。ＧｅｎＥＭＢＬデータベースのＴＦＡＳＴＡ検索は、部分的な相同性を有するものとして五つの既知の配列を同定した：ストレプトミヤス属のＨＰＰＤ（Ｕ１１８６４）；ラットＦアロ抗原（Ｍ１８４０５）：マウスＨＰＰＤ（Ｄ２９９８７）；ブタＨＰＰＤ（Ｄ１３３９０）；およびヒトＨＰＰＤ（Ｘ７２３８９）。シロイヌナズナ属の配列と上記の配列との一対ごとの比較は、５６％の平均類似度および３７％の平均同一性を示した。さらに、保存されたいくつかのチロシンおよびヒスチジン残基がシロイヌナズナ属の配列にも観察されたが、それらは哺乳類のＨＰＰＤにおける金属結合部位として示唆されている(Ruetschi等、Eur．J．Biochem.205：459，1992；Denoya 等、J．Bacteriol．176：5312，1994)。シロイヌナズナ属におけるＨＰＰＤ遺伝子のゲノム構成：シロイヌナズナ属の種子から調製したゲノムＤＮＡを用いて、Dellaportaの方法(Dellaporta等、P1a nt Mol．Biol．Rep．１；19，1983)に従って、サザンブロット分析をおこなった。１０μｇのＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、およびＨｉｎｄIIIで消化した後、消化産物を０．９％のアガロースゲルで分離し、VacuGen eXIバキュームブロッティングシステム（Vacuum blotting System）(ファルマシア(Pharmacia))を用いて、デュラロンＵＶメンブレン（Duralon UV Membrane）( ストラタジーン(Stratagene))に移し、ストラタリンカーＵＶクロスリンカー(St ratalinker UV Crosslinker)（ストラタジーン）を用いて架橋させた。ＨＰＰＤプローブは：（i）ＨＰＰＤ／λＹｅｓプラスミドＤＮＡの消化物からのＸｈｏｌ／Ｓｓｔｌフラグメントをゲル精製（Gene Clean Kit，Bio 101，Inc.を使用）すること。このフラグメントはＡＴＧ開始コドンの上流５０塩基の配列を含み、さらにＴＧＡ停止コドンの上流５５塩基の位置まで伸びている；および（ii）このフラグメントをプライムイットフルオルフルオレッセンスラベリングキット（Prime-It Fluor Fluorescence Labeling kit）（ストラタジーン）を用いて標識すること、により調製した。標識したプローブは、クイックハイブラピッドハイブリダイゼイションソリューション(QuikHyb Rapid Hybridization Solution) (ストラタジーン)を用い、６８℃において２時間で膜にハイブリダイズさせた。この膜を、０．１ＸのＳＳＣ／０．１％ＳＤＳを用いて室温で１回、さらに６０ ℃にて２回洗浄し、その後、イルミネーターノンラジオアクティブディテクションシステム(Illuminator Nonradioactive Detection System)(ストラタジーン) を用いてハイブリッド形成を視覚化した。このプローブに対し、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIII消化物のいずれにおいても、単一のバンドのみが緊縮性の高い条件下でハイブリッド形成した。ＥｃｏＲＩ消化物では二つのバンドが見られ、ＨＰＰＤ配列の内部にＥｃｏＲＩ部位が存在することを反映している。これらの結果は、ＨＰＰＤがシロイヌナズナ属において一コピー遺伝子にコードされていることを示唆している。次に、ＨＰＰＤをコードしている配列全体を、シロイヌナズナ属のゲノムＤＮＡから、プライマーＡＴＨＰＰＤ５Ｆ(5’‐CCATGGGCCACCAAAACG‐3’)およびＡＴＨＰＰＤ５Ｒ(5’‐CTGCAGTCATCCCACTAACTGTTTG‐3’)を用いて増幅した。結果として得られたゲノムＨＰＰＤフラグメントは、対応するｃＤＮＡフラグメントよりもわずかに大きく、ｐＣＲIIベクター（TAクローニングキット、インビトロゲン）にクローン化し、配列を決定した。１０７ｂｐの単一のイントロンが検出され、ｃＤＮＡ配列の１１６３ないし１１６４の位置に局在していた。核酸、ベクター、発現系、およびポリペプチド本発明の実施には、例えば、Sambrook等、1989，Molecular Cloning：A Labor atory Manual、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州；DNA Cloning：A practical Approac h、第IおよびII巻、1985（D．N．Glover編）；Oligonucleotide Synthesis，198 4，（M．L．Gait編）；Transcription and Translation，1984（HamesおよびHig gins編）；A Practical Guideto Molecular Cloning；シリーズ，Methods in En zymology (Academic Press，Inc.)；およびProtein Purifucation：Principles and Practice、第２版（Springer‐Verlag，ニューヨーク州.)に完全に説明されているような、分子生物学、微生物学、組み換えＤＮＡ、およびタンパク質生化学における多くの技術が使われている。本発明は、植物のＨＰＰＤをコードしている核酸配列、それらから誘導される酵素活性のあるフラグメント、および他の植物種からの関連したＨＰＰＤから誘導される配列を含む。本文中において用いたように、あるＨＰＰＤ配列から“誘導された”核酸とは、当該配列の領域に相当する核酸の配列、当該配列と同一または相補的な配列、および「配列保存変異体」ならびに「機能保存変異体」に相当する。配列保存変異体は、所与のコドン位置における一以上のヌクレオチドの変化の結果、その位置にコードされているアミノ酸には何ら変化がないものである。機能保存変異体は、ＨＰＰＤにおける所与のアミノ酸が、ＨＰＰＤポリペプチドの全体的な構造および機能を変化させずに変えるものであって、アミノ酸を同様の物理化学的特性（例えば、酸性、塩基性、疎水性等）を有するもので置換することを含むが、これに制限されない。酵素活性を保持しているＨＰＰＤフラグメントは、本文中に述べた方法、例えば、大腸菌での発現とそれに続く細胞抽出物の酵素活性分析により、同定することができる。シロイヌナズナ以外の植物に由来するＨＰＰＤ配列は、本文中に提供した方法ならびに組成物を用いた従来の実験法により単離することができる。例えば、シロイヌナズナ属のＨＰＰＤ配列の全てまたは一部を含んでいる核酸の、中程度のストリンジェント（例えば、６５℃において２ＸＳＳＣの水溶液）な条件下での、他の植物種に由来するｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡとのハイブリッド形成を、ＨＰＰＤの相同物の同定に用いることができる。異なる植物種に由来するｃＤＮＡライブラリーは市販されている（クロンテク(Clontech)、パロウアルトウ(P alo Alto)、カリフォルニア州；ストラタジーン、ラジョーラ(La Jolla)、カリフォルニア州）。あるいはまた、ＰＣＲに基づく方法を、他の植物に由来するｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡからＨＰＰＤに関連した配列を増幅させるために用いることができる。次いで、同定された配列の、以下にさらに詳しく述べる方法を用いての、例えば大腸菌における発現を実行して、ＨＰＰＤの配列に相当する配列によってコードされているポリペプチドの酵素活性が確認される。従って、双子葉および単子葉植物に由来するＨＰＰＤ配列は、本発明の範囲内にある。本発明の核酸は、ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドのいずれかまたは混合ポリリボーポリデオキシリボ核酸の、いかなる長さのプリン−およびピリミジン−含有ポリマーをも含む。これには、一本および二本鎖分子、すなわちＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドや、アミノ酸骨格に塩基を共役させることによって形成される“タンパク質核酸”（ＰＮＡ）が含まれる。核酸は細胞から直接単離してもよい。別法として、化学的に合成された鎖またはゲノム物質を鋳型として用い、ＰＣＲ法を用いて本発明の核酸を産生することができる。ＰＣＲ法に用いるプライマーは、本文中に提供した配列情報を用いて合成することができ、さらに、望ましい場合には、適当な新たな制限部位を導入するよう設計して、所与のベクターへの組換え体の発現のための取り込みを容易にすることができる。本発明の核酸は、両端に天然のシロイヌナズナの調節配列を並べてもよく、あるいは、プロモーター、エンハンサー、反応要素、シグナル配列、ポリアデニル化配列、イントロン、5-および3-非コード領域等を含む異種の配列を結合させてもよい。核酸はまた、技術上周知の多くの方法により修飾してもよい。かかる修正の、制限しない例は、メチル化、“キャップ”、類似体による一以上の天然ヌクレオチドの置換、および、例えば非荷電結合によるもの（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、カルバメート、その他）、および荷電結合によるもの（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチエート、その他）のような、ヌクレオチド間の修飾を含む。核酸は、例えば、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリＬリジン、その他）、挿入色素（例えば、アクリジン、ソラレン、その他）、キレート化剤（例えば、金属、放射性金属、鉄、酸化金属、その他）、およびアルキル化剤(A lkylator)のような、付加的な一以上の共役的に結合している成分を含んでもよい。核酸は、メチルまたはエチルホスホトリエステルの形成、またはアルキルホスホロアミデート結合により誘導体化されてもよい。さらに、本発明の核酸配列を、直接的あるいは間接的に検出可能なシグナルを提供することができる標識で修飾してもよい。代表的な標識は、放射性同位体、蛍光分子、ビオチン等を含む。本発明はまた、開示されたＨＰＰＤ配列またはその誘導体またはそのフラグメントを含んでいる核酸ベクターを提供する。プラスミドおよび菌類のベクターを含む多数のベクターが、種々の真核生物および原核生物の宿主における複製および／または発現について述べられている。制限されない例としては、ｐＫＫプラスミド（クロンテク）、ｐＵＣプラスミド、ｐＥＴプラスミド（ノバゲン社(Nov agen，Inc.)、マジソン、ウィスコンシン州）、または、ｐＲＳＥＴまたはｐＲＥＰ（インビトロゲン(Invitrogenn)、サンジエゴ、カリフォルニア州）、および、本文中に開示または引用したか、さもなければ当業者に周知の方法を用いる多くの適切な宿主細胞を含む。組換えクローニングベクターはしばしば、クローニングまたは発現のための１又は２以上の複製系、宿主における選択のための１又は２以上のマーカー、例えば抗生物質抵抗性、および１又は２以上の発現カセットを含むであろう。適切な宿主細胞は、電気穿孔法、ＣａＣｌ₂を介するＤＮＡの取り込み、菌類の感染、マイクロインジェクション、顕微発射（microproje ctile）または他の確立された方法を含む適切な方法により、適切に形質転換させ／トランスフェクトさせ／感染させてよい。適切な宿主細胞は、細菌、古細菌、菌類、特に酵母、および植物ならびに動物細胞、とくに哺乳類の細胞を含む。最も興味がもたれるものは、大腸菌、枯草菌、サッカロミケス・ケレウィシアエ（Saccaromyces cerevisiae）、サッカロミケス・カルスベルゲンシス（Saccaromyces carlsbergensis）、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombi)、ＳＦ９細胞、Ｃ１２９細胞、２９３細胞、アカパンカビ属、及びＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、および不死化された哺乳類の骨髄性およびリンパ球系の細胞株である。好ましい複製系は、Ｍ１３、ＣｏｌＥ１、ＳＶ４０、バキュロウイルス、ラムダ、アデノウイルス等を含む。多数の転写開始および終結調節領域が単離され、種々の宿主における異種タンパク質の転写および翻訳に効果的であることが示されている。これらの領域の例としては、単離法、操作法、その他は、技術上周知である。適切な発現条件下では、宿主細胞は、組換えにより産生されたＨＰＰＤ由来のペプチドまたはポリペプチド源として用いることができる。都合のよいことに、ベクターは、ＨＰＰＤ部分に操作によって連結された転写調節要素（すなわちプロモーター）を含んでいてもよい。プロモーターは任意にオペレーター部分および／またはリボソーム結合部位を含んでいてもよい。大腸菌に適合する制限されない細菌プロモーターの例としては：ｔｒｃプロモーター；β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）プロモーター；ラクトースプロモーター；トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター；アラビノースＢＡＤオペロンプロモーター；ラムダ由来のＰＩプロモーターとＮ遺伝子リボソーム結合部位；および，ｔｒｐならびにｌａｃＵＶ５プロモーターの配列由来のハイブリッドｔａｃプロモーターを含む。制限されない酵母のプロモーターの例としては、３ −ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーター、ガラクトキナーゼ（ＧＡＬＩ）ブロモーター、ガラクトエピメラーゼプロモーター、およびアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）プロモーターを含む。哺乳類細胞に適切なプロモーターは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、アデノウイルス（ＡＤＶ）、およびウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）からのプロモーターのようなウイルスプロモーターを含むがこれに制限されない。補乳類細胞はまたターミネーター配列およびポリＡ付加配列、および発現を増加させるエンハンサー配列が含まれていてもよい。遺伝子の増幅を引き起こす配列もまた望ましいといってよい。さらに、分泌シグナル配列および／またはプロホルモンのｐｒｏ領域の配列のような、細菌、酵母、および動物細胞を含むがこれに制限されない細胞からの組換え産物の選別を容易にする配列も含まれていてもよい。野性型または変異ＨＰＰＤポリペプチドをコードしている核酸が、組換えにより細胞に導入されもよい。例えば、かかる配列を細胞に導入し、それによって内在性遺伝子またはその遺伝子と実質的に同等な配列の部位における相同遺伝子組換えを成し遂げることができる。非相同遺伝子組換えまたは相同遺伝子組換えによる内在性遺伝子の欠失のような、他の組換えに基づく方法も用いられてよい。本発明のＨＰＰＤ由来のポリペプチドは、ＨＰＰＤの機能保存変異体を含めて、野性型または突然変異したシロイヌナズナ属の細胞か、またはＨＰＰＤ由来のタンパク質をコードしている配列が導入されかつ発現されている、異種の個体または細胞（細菌、菌類、昆虫、植物、および哺乳類の細胞を含むが、これに制限されない）から単離されていてもよい。さらに、このポリペプチドは組換え融合タンパク質の一部であってもよい。あるいはまたポリペプチドは、全面的な固相合成法、部分固相合成法、フラグメント濃縮法、または古典的な液相法を含むがこれに制限されない、市販の自動化された手技により、化学的に合成されていてもよい。ＨＰＰＤポリペプチドの“精製”とは、その酵素活性が、このポリペプチドが発現された細胞の、他の成分に妨げられることなく測定される形でＨＰＰＤポリペプチドを単離することを示す。ポリペプチドの精製法は技術上周知であり、分離用ディスクゲル電気泳動、等電点電気泳動、ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、ゲルろ過、イオン交換および分配クロマトグラフィー、および向流分配を含むがこれに制限されない。ある目的のためには、ＨＰＰＤタンパク質が、ポリヒスチジン配列（これに制限されない）のような、精製を容易にする付加的な配列であるタグを含む組換え系においてこのポリペプチドを産生することが好ましい。このポリペプチドは、次いで、宿主細胞の粗溶解物から、適当な固相マトリックス上でのクロマトグラフィーにより精製することができる。別法としては、ＨＰＰＤに対し、またはそれに由来するペプチドに対して産生された抗体を、精製用の試薬として用いることもできる。他の精製法も可能である。本発明はまた、ＨＰＰＤポリペプチドの誘導体および同族体も含む。ある目的のためには、このペプチドをコードしている核酸配列を、機能的に同等な分子、すなわち機能保存変異体を供する置換、付加、または欠失によって変えてもよい。例えば、その配列内の１又は２以上のアミノ酸を、例えば正に帯電したアミノ酸（アルギニン、リジン、およびヒスチジン）；負に帯電したアミノ酸（アスパラギン酸塩およびグルタミン酸塩）；極性中性アミノ酸；および非極性アミノ酸、のような同じ性質をもつ別のアミノ酸で置換することができる。単離されたポリペプチドは、例えばリン酸化、硫酸化、アシル化、または他のタンパク質修飾により修飾されていてもよい。それらはまた、放射性同位体および蛍光化合物を含むがこれに制限されない、直接的または間接的に検出される、検出可能なシグナルを提供することができる標識で、修飾されていてもよい。ＨＰＰＤ阻害剤／除草剤を同定するためのスクリーニング法本発明の方法ならびに組成物は、ＨＰＰＤの機能を阻害しそれゆえ除草剤として、あるいは有用な除草剤の開発のための手がかりとなる化合物として有用な、化合物の同定のために用いることができる。このことは、ＨＰＰＤを発現する細胞を提供し、それによって４−ヒドロキシフェニルピルビン酸塩（ＯＨＰＰ）からホモゲンチジン酸を産生することにより成就される。ＨＰＰＤを発現している細胞培養物を、試験培養物を作成するために、試験化合物の存在下で、また対照培養物を作成するためには試験化合物の非存在下で培養する。培養は、十分な時間をかけかつ適切な条件下において進行させ、ＨＰＰＤの機能を妨げるようにする。試験化合物と共に培養を開始した後、あらかじめ決められた時間に、ＨＰＰＤの酵素活性の観察をおこなった。好ましい態様では、ＨＰＰＤ活性は、ホモゲンチジン酸の酸化および／または重合により産生される赤褐色の色素の出現により、視覚的に観察される（La Du等著、Ochronosis，Pigments in Pat hology，M．Wolman編、アカデミックプレス、ニューヨーク、1969）。別法として、以下の実施例１に述べたような通常の分析法を用いて、細胞抽出物におけるＨＰＰＤ酵素活性を観察してもよい。例えば、ＨＰＰＤを発現していない宿主細胞（例えば、ＨＰＰＤ遺伝子を逆向きに含んでいるか、または何も挿入されていないプラスミドで形質転換した宿主細胞）のような、培養試料および分析試料の両者に関し、付加的な対照も培養する。ＨＰＰＤ阻害性化合物は、試験培養物において、対照培養物と比較して、ＨＰＰＤ活性を減少させるものとして同定される。本発明の実施に用いてよい宿主細胞は、細菌、菌類、昆虫、哺乳類、および植物の細胞を含むが、これに制限されない。好ましくは、細菌細胞が使用される。最も好ましくは、細菌細胞は、野性型の宿主細胞に比べて試験化合物に対する増加した膜透過性を示す変異体（例えば、大腸菌のｉｍｐ突然変異体のような）である。好ましくは、本発明の方法は、ハイスループット(high-throughput)スクリーンに適合しており、化合物の多様性が単回の分析で検査されるようになっている。かかる阻害化合物は、例えば、天然産物ライブラリー、発酵ライブラリー（植物および微生物を含む）、組み合わせライブラリー、化合物ライブラリー、および合成化合物ライブラリーの中に発見してもよい。例えば、合成化合物ライブラリーは、メイブリッジケミカル社（Maybridge Chemical Co．）(トレヴィレット (Trevillet)、コーンウォール州、英国)、コムジェネックス（Comgenex)（プリンストン、ニュージャージー州)、ブランドンアソシエイツ（Brandon Associate ）(メリマック、ニューハンプシャー州)、およびマイクロソース（Microsource ）(ニューミルフォード、コネクチカット州)から市販されている。希化学物質ライブラリーは、オールドリッチケミカル社（Aldrich Chemical Company，Inc）（ミルウォーキー、ウィスコンシン州）から入手できる。あるいはまた、細菌、菌類、植物、および動物の抽出物の形態の天然化合物のライブラリーは、例えば、パンラボラトリーズ（Pan Laboratories）（ボスウェル、ワシントン州）または、マイコサーチ（MycoSearch）(ノースカロライナ州)から入手できるか、または容易に製造される。さらに、天然および合成により製造されたライブラリーおよび化合物は、通常の化学的、物理学的、および生化学的方法を介して容易に修飾される(Blondelle等、TibTech 14：60，19 96)。本発明のＨＰＰＤ阻害剤分析は、多くの異なるタイプの溶媒に適応する利点があり、従って、多くの源からの化合物の検査を可能にする。本発明の方法により、一度ＨＰＰＤ阻害剤として同定されれば、インビボおよびインビトロの検査を行なって、ＨＰＰＤ阻害活性の性質および機構をさらに特徴づけてもよい。例えば、ある同定された化合物の、精製または部分精製されたＨＰＰＤのインビトロにおける酵素活性に及ぼす影響は、以下の実施例１のように測定してもよい。古典的な酵素カイネチックプロット法(kineticplot)を用いて、例えば競争および非競争阻害剤を識別してもよい。本発明の方法を用いてＨＰＰＤ阻害剤と同定された化合物は、有効性、効率、吸収量、安定性、および市販の除草剤への適用に用いるための適性を修飾されていてもよい。これらの修飾は、技術上周知の方法を用いて行なわれかつ検査される。除草剤抵抗性ＨＰＰＤ変異体の単離本発明は、ＨＰＰＤ阻害剤／除草剤の作用に対し抵抗性のあるＨＰＰＤ変異体の単離を含む。ＨＰＰＤ変異体は、天然に生じるか、または、任意のあるいは部位特異的突然変異誘発により得てもよい。一つの態様では、ＨＰＰＤを発現している細胞または個体の集団を、当該技術に周知の手技を用いて突然変異を誘発し、その後、その細胞または個体にスクリーニングまたは選別の手技を処し、ＨＰＰＤ阻害剤の毒性作用に抵抗性のあるものを同定する。次いで、変異ＨＰＰＤ遺伝子を、例えばＰＣＲ法を用いて抵抗性の細胞または個体から単離する。他の態様では、単離されたＨＰＰＤ遺伝子に、インビトロで任意のまたは指定部位突然変異誘発を処し、その後、この遺伝子の突然変異誘発された変異種を、例えば大腸菌のような適当な細胞に導入し、その細胞に上記の選択またはスクリーニングの手技を行なう。変異ＨＰＰＤ遺伝子は、適切な宿主細胞において発現され、変異ＨＰＰＤポリペプチドの酵素特性を、野性型のＨＰＰＤと比較する。好ましくは、所与の突然変異の結果、インビトロにおける４−ヒドロキシフェニルピルビン酸（ＯＨＰＰ）に対する酵素活性、すなわちＯＨＰＰのホモゲンチジン酸への変換は保持している（従ってインビボで生物学的に活性があることが期待される）が、一方選択した除草剤に対し、野性型のＨＰＰＤよりも相対的に抵抗性のより高い触媒活性を示すＨＰＰＤ変異ポリペプチドを生じる。好ましくは、生存にＨＰＰＤ活性を必要とする細胞で発現すると、変異ＨＰＰＤは、（i）それが発現した細胞の生存を単独で維持するに十分な触媒活性か；または、これもまたその細胞に発現した、第一のＨＰＰＤ変異タンパク質と同じかまたは異なってもよい、除草剤に抵抗性のＨＰＰＤ変異タンパク質との組み合わせにおける触媒活性であって、それが発現した細胞の生存を維持するに十分な触媒活性；および（ii）除草剤に対し、野性型のＨＰＰＤよりも抵抗性のある触媒活性、を示す。従って、特定の一つのＨＰＰＤ変異タンパク質が細胞の生存の維持に必要な全触媒活性を有する必要はないが、単独または同一のＨＰＰＤ変異体の付加的なコピーの触媒活性および／または他のＨＰＰＤ変異タンパク質の触媒活性との組み合わせにおいて、生存にＨＰＰＤ活性を必要とする細胞の生存を維持するに十分な量の触媒活性を有する必要がある。例えば、変異体をコードしている遺伝子の複数のコピーを細胞に導入することによるか、または変異体の産生を高める比較的強力なプロモーターをさらに含んでいる遺伝子を導入することにより、触媒活性を最低限許容されるレベルまで増加させてもよい。抵抗性がより高いということは、変異体の触媒活性が除草剤によって、野性型のＨＰＰＤの触媒活性が除草剤によって減少するよりも、少しでもより少ない程度に減少することを意味する。好ましい、抵抗性のより高い変異ＨＰＰＤは、野性型のＨＰＰＤが、細胞、植物、または個体の生存を維持するに十分な触媒活性を保持しない場合と同一種の除草剤の同一の濃度において、細胞、植物、または個体の生存を維持するに十分な触媒活性を保持している。好ましくは、除草剤がない場合の触媒活性は、除草剤がない場合の野性型ＨＰＰＤの触媒活性の少なくとも約５％、最も好ましくは、約２０％より高い。トリケトン抵抗性の変異ＨＰＰＤの場合には、ＨＰＰＤ変異タンパク質は、（i）前記除草剤がない場合には、前記野性型ＨＰＰＤの触媒活性の約２０％より高い触媒活性；および（ii）野性型ＨＰＰＤに比較して、トリケトン除草剤の存在に対し、相対的により抵抗性の高い触媒活性、とを有する。除草剤抵抗性のＨＰＰＤ変異体は、正常には成長および／または色素形成について除草剤の阻害作用に感受性があるいかなる細胞においても、遺伝的指標として用いることができる。一つの態様においては、除草剤抵抗性のＨＰＰＤ変異体をコードしているＤＮＡは、適当なプロモーターの調節の下に、プラスミドに取り込まれる。従って、いかなる所望の遺伝子もプラスミドに取り込ませることができ、最終的な組換えプラスミドが除草剤感受性の細胞に取り込まれる。このプラスミドで形質転換した細胞は、次に、成長および／または色素形成を阻害するに十分な濃度の除草剤の存在下に培養することにより、選択またはスクリーニングされる。化学物質抵抗性植物および変異ＨＰＰＤ遺伝子を含んでいる植物本発明は、除草剤抵抗性のＨＰＰＤ変異体が導入された種子、個体、および植物を含むがこれに制限されない、遺伝子導入細胞を含む。適切な受容植物の例を以下の表１に一覧表に示すが、これに制限されない：表１受容植物遺伝子導入植物における変異ＨＰＰＤポリペプチドの発現は、例えばサルコトリオン(Sulcotrione)のようなトリケトン除草剤を含むがこれに制限されない除草剤に対する高レベルの抵抗性を与え、遺伝子導入植物の栽培を通してこれらの除草剤を使用できるようにする。外来性遺伝子を植物に導入する方法は、当該技術に周知である。かかる方法の例は、アグロバクテリウム属の感染、粒子爆撃(particle bombardment)、プロトプラストのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）処理、プロトプラストの電気穿孔、マイクロインジェクション、マクロインジェクション、ティラー(tiller)インジェクション、花粉管経路、乾燥種子吸収、レーザー穿孔、および電気泳動法を含むがこれに制限されない。これらの方法は、例えば、B．Jenes等、およびS．W ．Ritche等、Transgenic Plants、第１巻、Engineering and Utilization、S．D ．Kung，R．Wu編、アカデミックプレス、Harcourt Brace Jovanovich 1993；およびL．Mannonen等、Critical Reviews in Biotechnology，14：287‐310，1994 に記述されている。好適な態様では、変異ＨＰＰＤをコードしているＤＮＡを、抗生物質耐性マーカー遺伝子を含んでいるＤＮＡベクターにクローン化し、組換えＨＰＰＤのＤＮＡを含んでいるプラスミドを、Ｔｉプラスミドを含んでいるアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)に導入する。この“バイナリーベクター（二ベクター）システム”は、例えば、米国特許第4,490,838号、およびAn等、Plant Mol．Biol．Manual A3：１‐19(1988)に記述されている。形質転換されたアグロバクテリウム属は、次いで、受容植物からのリーフディスク(l eaf disk)と共に培養し、植物細胞に感染および形質転換させる。形質転換された植物は、次に再生培地で培養するが、これは、まず形質転換した細胞の選択に適した抗生物質の存在下で、次に除草剤の存在下で、シュートの形成を促進する。除草剤抵抗性ＨＰＰＤをコードしているＤＮＡでうまく形質転換された植物細胞では、非形質転換細胞からのシュート形成を阻害するレベルの除草剤の存在下においても、シュート形成が起こる。例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析法を使用して変異ＨＰＰＤＤＮＡの存在を確認した後、形質転換した植物を、除草剤の噴霧に抵抗するそれらの能力と、除草剤の存在下における種子の発芽および根の発生と増殖についてのそれらの能力とについて調べた。本発明の方法ならびに組成物は、除草剤抵抗性ＨＰＰＤ変異体であって、植物に取り込まれ、その植物に選択的な除草剤抵抗性を与える変異体の産生に使用することができる。ＨＰＰＤの中程度の変異体（例えば、最適値より低い比活性を示すが、高い除草剤抵抗性を示すか、またはその逆）は、適度の比活性と高い抵抗性とを保持する第二世代のＨＰＰＤ変異体の、設計用の鋳型として有用である。除草剤抵抗性ＨＰＰＤ遺伝子は、単一または多数のコピーとして作物種に形質転換され、除草剤抵抗性を与えることができる。除草剤に対する感受性を減少させることを以ってなされる作物種の遺伝子工学は：（１）特効性で環境に優しい除草剤の適用の範囲および適応性を増し；（２）これらの除草剤の商業的価値を増し；（３）除草剤抵抗性の作物種に除草剤を効果的に用いることにより雑草からの圧迫を減少させ、それに対応して収穫量を増加させ；（４）除草剤抵抗性の植物の種子の需要を増し；（５）従来の栽培で適用されていた除草剤の残予による作物の損傷に対する抵抗性を増し；（６）不順な天候条件による除草剤の性質の変化に対する感受性を減少させ；さらに（７）不均一に、あるいは誤って適応された除草剤に対する耐性を増加させる、ことができる。たとえば、組換えＨＰＰＤ変異タンパク質を含む植物を栽培することができる。作物は、ＨＰＰＤ変異組換え植物が抵抗性であり、結果として栽培された作物に決定的な影響を与えることなく、雑草を抑制する効果的な量の除草剤で処理することができる。好適な態様の説明以下の実施例は本発明の説明を意図したものであって、これに制限されない。実施例１：大腸菌におけるシロイヌナズナ属のＨＰＰＤの発現以下の実験は、酵素活性のあるシロイヌナズナ属のＨＰＰＤの、大腸菌における高レベルの産生を説明するために行なわれた。Ａ．クローニングおよび細菌の形質転換ＨＰＰＤをコードしている配列を、ＰＣＲに基づく方法を用いて、ＨＰＰＤのＡＴＧ開始コドンがｔｒｃプロモーターと共にインフレーム(in-frame)されるよう、ｐＫＫ２３３−２発現ベクター（クロンテク）にクローン化した。ＨＰＰＤの開始コドン（太字）の領域にハイブリダイズする、ＡＴＨＰＰＤ６Ｆと名付けたプライマー（5’‐GAAATCCATGGCACCAAAACG‐3’）は、一塩基の変異（ＡからＣへ、イタリック体で）を含み、ＮｃｏＩ部位（下線）を生じる。ＨＰＰＤの停止コドン（太字）の領域にハイブリダイズするプライマー、ＡＴＨＰＰＤ６Ｒ（5’‐CTTCTCCATGGTCATCCCACTAACTGT‐3’）は、コード領域の外側にＮｃｏＩ部位（下線）を含む。ＰＣＲ反応は、上記のプライマーと、鋳型ＤＮＡとして上記のｃＤＮＡライブラリースクリーンから単離されたＨＰＰＤとを用いて行なった。反応混合物（10 0μｌ）には、以下の成分が含まれていた：２ｎｇのプラスミドＤＮＡ；１ＸのP CR緩衝液；２００ｍＭの各デオキシヌクレオチド三リン酸；２．５単位のＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ(パーキンエルマー(Perkin Elmer))；１３ｐｍｏｌのＡＴＨＰＰＤ６Ｆプライマー；および１１ｐｍｏｌのＡＴＨＰＰＤ６Ｆプライマー。反応混合物を９５℃にて２分間加熱し、次いで；９５℃で１分、５５℃ で２分、７２℃で１．５分；の３０サイクルを用いて増幅させた。この後、７２ ℃にて７分間インキュベートした。１．３ｋｂのＰＣＲ産物が増幅された。このフラグメントを１．２％のＮｕＳｉｅｖｅＧＴＧゲル（ＦＭＣ）に溶解し、精製した(ジーンクリーン(GeneClea n)、Bio 101)。精製されたフラグメントをＮｃｏＩで消化し、ＮｃｏＩで消化しかつアルカリ性ホスファターゼ処理をしたｐＫＫ２３３−２ベクター（クロンテク）に連結した。連結混合物をＤＨ５αライブラリーエフィッシエンシーコンピテントセルズ(Library Efficiency Competent Cells)(ギブコ（Gibco）BRL)に形質転換した。ＨＰＰＤを発現している形質転換細胞は、アンピシリンと共にＬＢにて一晩培養した時に産生される赤褐色によっで同定した。形質転換細胞はまた、ＤＨ５α細胞を、空のｐＫＫ２３３−２ベクターを用いて形質転換することにより調製し、酵素活性分析における対照として用いた。Ｂ．大腸菌における褐色色素およびホモゲンチジン酸の産生褐色色素の形成は、シロイヌナズナ属のＨＰＰＤ遺伝子で形質転換された大腸菌の、固形培地に生育したコロニーおよび液体培養物中に観察された。形質転換されていない大腸菌または対照ベクターを用いて形質転換した大腸菌には、何ら同様の褐色色素の形成がなかった。褐色色素の形成（４５０ｎｍの特有の吸収を示す）は、培地にチロシンを加えることにより増加した（図２）。ホモゲンチジン酸は、静置した時、またはアルカリ性にして酸素にさらした時、オクロノーシスの色素の形成により、褐色に変化する(La Du等、Ochronosis． Pigments in Pathology，M．Wolman編、アカデミックプレス、ニューヨーク、19 69)。同様の色素は、ある種の細菌では、天然に起こるホモゲンチジン酸の分泌および酸化から形成される(Trias等、Can．J．Microbiol．35：1037，1989；Goo dwin等、Can．J．Microbiol．40：28，1995)。従って、褐色色素の発生は、シロイヌナズナ属ＨＰＰＤ遺伝子を用いて上記のように形質転換された大腸菌が、大量のホモゲンチジン酸を産生することを示唆した。さらに、チロシンは、ヒドロキシフェニルピルビン酸に代謝されるため（従ってＨＰＰＤの追加的な基質を提供しており）、増加させたチロシンの存在下における発色の増加は、褐色色素がＨＰＰＤ活性の結果であることを示唆する。このことは、ホモゲンチジン酸を、ＨＰＬＣに基づく方法を用いた直接的な測定によって確認された。ホモゲンチジン酸の測定のためのＨＰＬＣの条件は、De noya等(J．Bacteriol．176：5312，1994)に述べられているものと同じであった。HPLCシステムは、Waters 510デリバリモジュール（delivery module）(Waters Assoc.、ミルフォード、マサチューセッツ州)、Waters 996フォトダイオード検出器、WTSP 710B自動サンプラー、およびWaters 840データ積分システムからなる。Phenomenex Spherisorb 5 ODS（1）C18逆相カラム(粒子サイズ、５mm；内径、250ｘ4.6mm)を用い、これをＣ１８樹脂を充填したステンレス鋼のガードカラムに連結した。移動相（10mM酢酸：メタノール：85：15V／V）は、流速１ml／分で流した。波長は２９２nMに設定した。液体培地の試料(１ml)を１００mlの氷酢酸と混合して酸性化し、遠心分離により不純物を除去した。この混合物５０mlをカラムに注入した。ホモゲンチジン酸に相当するピークを、同定および定量のための標準のホモゲンチジン酸と比較した。対照となる大腸菌細胞を一晩培養した培地は、微量のホモゲンチジン酸の痕跡も示さなかった（図3A）。対照的に、ＨＰＰＤで形質転換した大腸菌は高レベルのホモゲンチジン酸を産生した（図3B）。８分後に溶出されるピークは、真正のホモゲンチジン酸と等しい吸収スペクトルを有していた（挿入図）。Ｃ．ＨＰＰＤ活性の分析大腸菌の形質転換細胞を、５０mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.3)における0.1mg／mlのリゾチームを用いて、３０℃にて１０分間処理した。細胞を超音波処理し（VibraCellソニケーター（Sonics and Material，Inc.ダンビュリー、コネチカット州）を用いて、５秒間ずつ３回）、抽出物を遠心分離した。上清を、あらかじめ５０mMのリン酸緩衝液（pH7.3）で平衡化しておいたEcono‐Pac 10 ＤＧカラム（バイオラッド(Bio-Rad)、リッチモンド、カリフォルニア州）で脱塩した。ＨＰＰＤを含んでいる脱塩された抽出物をＨＰＰＤ分析に用いた。ＨＰＰＤの酵素活性は、¹⁴Ｃ−ヒドロキシフェルピルビン酸塩から放出された¹⁴ ＣＯ₂の捕獲によって測定した(Schulz等、FEBS Letters．318：162，1993；Se cor，Plant Physiol．106：1429，1994)。反応は２０mlのシンチレーションバイアル中で行ない、それぞれにシーラムストッパー(serum stopper)でキャップをし、これを通して５０μｌの水酸化ベンゼトニウムを含んでいるポリプロピレンウェルを吊す。各４５０μｌの反応混合物は：５０mMリン酸緩衝液（pH7.3）；５０μｌの新たに調製した、１５０mMの還元グルタチオンと３mMジクロロフェノールインドフェノールの１：１（V／V）混合物；２５００単位のカタラーゼ；および細菌抽出物（ＨＰＰＤの源）を含んでいた。酵素阻害剤は、指示どおりに添加した。Secor（1994，上記）の方法によって調製した¹⁴Ｃ−ヒドロキシフェルピルビン酸塩（２mMの溶液を５０μｌ）を添加して反応を開始し、３０℃にて３０分間進行させた。１００μｌの４N硫酸を加えて反応を停止し、混合物をさらに３０分間インキュベートした。水酸化ベンゼトニウムに捕獲された放射能を、シンチレーションカウンターで測定した。その結果は、シロイヌナズナ属のＨＰＰＤ遺伝子で形質転換された大腸菌細胞が、非常に高レベルのＨＰＰＤ活性（すなわち、２．７μｍｏｌ／mgタンパク質／時間）を発現したことを示した。対照的に、形質転換されていない細胞または対照の大腸菌では、ＨＰＰＤ活性は検出不能であった。さらに、ＨＰＰＤ活性はサルコトリオンによる阻害に感受性であった（図4）。１μＭより高いサルコトリオンでは、ほぼ完全な活性の阻害が観察された。５０％の活性阻害を引き起こすために必要なサルコトリオンの濃度は、１００nMであった。実施例２：ＨＰＰＤ阻害剤を同定するための試験化合物のハイスループットスクリーニング以下の方法は、ＨＰＰＤ阻害剤を同定するためのハイスループット法に用いられる。上記の実施例１に述べたように、シロイヌナズナ属のＨＰＰＤ遺伝子で形質転換した大腸菌を、１００μｇ／mlのアンピシリンと共に、ルリアブロス(Luria B roth)中で３７℃で一晩培養する。１００μｇ／mlのアンピシリンおよび１mMのチロシンを含んでいる、溶解した１リットルのＬＢ寒天を、５０℃に冷ます。次に、大腸菌の一夜培養物０．１ml を加え、この混合物１５０mlを各々９x９の滅菌したサミロンバイオトレー(Sumi lon biotray)（ヴァンガード(Vangard)インターナショナル、ネプチューン、ニュージャージー州）に注ぐ。プレートを凝固させ、３０分間乾燥させる。試験化合物（２５μｌまで）を試験プレートのサンプルウェル（１４４ウェル／プレート、直径５cm中に１２x１２列）またはスポット（６x９６化合物／プレート）につける。プレートを、３７℃で一晩培養する。プレートは、（i）大腸菌の成長および（ii）褐色色素の強さを観察することによって評価する。細菌細胞は生きているが色素が減少している区域を、ＨＰＰＤ阻害剤について陽性であるものとして評価する。上記のすべての特許、出願、論文、出版物、ならびに検査方法は、本文中に引例として取り込まれている。上記の詳細な記述によって、本発明の多くの改変がこの技術の当業者に提案されるであろう。かかる明らかな改変は、添付した請求項の意図する全範囲内にある。

【手続補正書】【提出日】平成１１年１０月２２日（１９９９．１０．２２）【補正内容】請求の範囲１．植物のＨＰＰＤをコードしている分離精製された核酸。２．シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）に由来する、請求項１に記載の核酸。３．核酸が、図１Ａ／１Ｂに記載された以下のＡｔＨＰＰＤアミノ酸配列に相当するポリペプチドをコードする核酸；その配列保存変異体、及びその機能保存変異体から選択される、請求項２に記載の核酸配列。４．転写調節要素に作動的に連結された、請求項３に記載の核酸の配列を含むＤＮＡベクター。５．細胞が細菌、菌類、植物、昆虫、および哺乳類の細胞からなる群より選択されることを特徴とする、請求項４に記載のＤＮＡベクターを含む細胞。６．細胞が細菌細胞であることを特徴とする、請求項５に記載の細胞。７．細胞が植物細胞であることを特徴とする、請求項５に記載の細胞。８．請求項７に記載の細胞を含む種子。９．請求項２に記載のＤＮＡにコードされているタンパク質を含むＨＰＰＤタンパク質。１０．除草剤／ＨＰＰＤ阻害剤を同定する方法であって、該方法が、（ａ）植物のＨＰＰＤを発現する微生物細胞を提供すること；（ｂ）該細胞を、試験培養物を作成するために試験化合物の存在下に、また対照培養物を作成するために試験化合物の非存在下に培養すること；（ｃ）該試験および対照培養物における、ホモゲンチジン酸またはその酸化物のレベルを観察すること；および（ｄ）試験培養物において、対照培養物と比較して、ホモゲンチジン酸またはその酸化物のレベルを減少させるいかなる化合物も、ＨＰＰＤを阻害する化合物として同定すること、を含む、前記方法。１１．微生物細胞が大腸菌であることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。１２．観察することとして、培養物の吸光度を４５０nmにおいて測定することを含むことを特徴とする、請求項１０に記載の方法。１３．観察することとして、褐色色素の形成を検出することを含むことを特徴とする、請求項１０に記載の方法。１４．除草剤に抵抗性のあるＨＰＰＤ変異体を同定する方法であって、該方法が、（ａ）植物ＨＰＰＤを発現する細胞集団を提供すること；（ｂ）細胞集団に突然変異を誘発すること；（ｃ）突然変異を誘発した細胞集団を、突然変異を誘発しなかった細胞の成長または色素産生を阻害する条件下で除草剤と接触させること；（ｄ）成長および／または色素産生に対する該除草剤の阻害作用に抵抗性のある細胞を回収すること；および（ｅ）該回収された細胞からのＨＰＰＤをコードしている核酸の塩基配列を決定し、除草剤に抵抗性のあるＨＰＰＤ変異体を同定すること、を含むことを特徴とする、前記方法。１５．除草剤抵抗性である、変異ＨＰＰＤタンパク質。１６．生存のためにＨＰＰＤ活性を必要とする細胞において発現する場合に、ＨＰＰＤタンパク質が、（ｉ）それが発現される細胞の生存を単独で維持するに十分な触媒活性か；または、第一のＨＰＰＤ変異タンパク質と同じかまたは異なってもよい、同じくその細胞に発現される、除草剤に抵抗性のＨＰＰＤ変異タンパク質との組み合わせにおける触媒活性であって、それが発現される細胞の生存を維持するに十分な触媒活性；および（ｉｉ）除草剤に対し、野性型のＨＰＰＤよりも抵抗性のある触媒活性、を示すことを特徴とする、請求項１５に記載の変異ＨＰＰＤタンパク質。１７．タンパク質がシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)に由来することを特徴とする、請求項１５に記載の変異ＨＰＰＤタンパク質。１８．請求項１５に記載の変異ＨＰＰＤタンパク質をコードしている核酸。１９．請求項１８に記載の核酸を含むＤＮＡベクター。２０．細胞が細菌、菌類、植物、昆虫、および哺乳類の細胞からなる群より選択された細胞であることを特徴とする、請求項１９に記載のＤＮＡベクターを含む細胞。２１．細胞が細菌細胞であることを特徴とする、請求項２０に記載の細胞。２２．細胞が植物細胞であることを特徴とする、請求項２０に記載の細胞。２３．請求項２２に記載の細胞を含む種子。２４．植物に除草剤抵抗性を与える方法であって、植物に請求項１６に記載の除草剤抵抗性ＨＰＰＤ変異体をコードする核酸を、該核酸が該植物において発現される条件下に導入することを含むことを特徴とする、前記方法。２５．雑草を防除する方法であって、除草剤抵抗性のＨＰＰＤ遺伝子を含む作物を、雑草の防除に有効な量の除草剤の存在下に栽培することを含む、前記方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者シン，ビジェイアメリカ合衆国ニュージャージー州 08690、ハミルトンスクエア、アベマールロード 12 (72)発明者バスコンブ，ニューエルアメリカ合衆国ニュージャージー州 08648、ローレンスビル、ガロコート９

Claims

【特許請求の範囲】１．植物のＨＰＰＤをコードしている分離精製された核酸。２．シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）に由来する、請求項１に記載の核酸。３．核酸が配列番号：１（SEQ ID NO：1）の核酸、その配列保存変異体、およびその機能保存変異体から選択されることを特徴とする、請求項２に記載の核酸。４．転写調節要素に作動的に連結された、請求項３に記載の核酸の配列を含むＤＮＡベクター。５．細胞が細菌、菌類、植物、昆虫、および哺乳類の細胞からなる群より選択されることを特徴とする、請求項４に記載のＤＮＡベクターを含む細胞。６．細胞が細菌細胞であることを特徴とする、請求項５に記載の細胞。７．細胞が植物細胞であることを特徴とする、請求項５に記載の細胞。８．請求項７に記載の細胞を含む種子。９．請求項２に記載のＤＮＡにコードされているタンパク質を含むＨＰＰＤタンパク質。１０．除草剤／ＨＰＰＤ阻害剤を同定する方法であって、該方法が、（ａ）植物のＨＰＰＤを発現する微生物細胞を提供すること；（ｂ）該細胞を、試験培養物を作成するために試験化合物の存在下に、また対照培養物を作成するために試験化合物の非存在下に培養すること；（ｃ）該試験および対照培養物における、ホモゲンチジン酸またはその酸化物のレベルを観察すること；および（ｄ）試験培養物において、対照培養物と比較して、ホモゲンチジン酸またはその酸化物のレベルを減少させるいかなる化合物も、ＨＰＰＤを阻害する化合物として同定すること、を含む、前記方法。１１．微生物細胞が大腸菌であることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。１２．観察することとして、培養物の吸光度を４５０nmにおいて測定することを含むことを特徴とする、請求項１０に記載の方法。１３．観察することとして、褐色色素の形成を検出することを含むことを特徴とする、請求項１０に記載の方法。１４．除草剤に抵抗性のあるＨＰＰＤ変異体を同定する方法であって、該方法が、（ａ）植物ＨＰＰＤを発現する細胞集団を提供すること；（ｂ）細胞集団に突然変異を誘発すること；（ｃ）突然変異を誘発した細胞集団を、突然変異を誘発しなかった細胞の成長または色素産生を阻害する条件下で除草剤と接触させること；（ｄ）成長および／または色素産生に対する該除草剤の阻害作用に抵抗性のある細胞を回収すること；および（ｅ）該回収された細胞からのＨＰＰＤをコードしている核酸の塩基配列を決定し、除草剤に抵抗性のあるＨＰＰＤ変異体を同定すること、を含むことを特徴とする、前記方法。１５．除草剤抵抗性である、変異ＨＰＰＤタンパク質。１６．生存のためにＨＰＰＤ活性を必要とする細胞において発現する場合に、ＨＰＰＤタンパク質が、（ｉ）それが発現される細胞の生存を単独で維持するに十分な触媒活性か；または、第一のＨＰＰＤ変異タンパク質と同じかまたは異なってもよい、同じくその細胞に発現される、除草剤に抵抗性のＨＰＰＤ変異タンパク質との組み合わせにおける触媒活性であって、それが発現される細胞の生存を維持するに十分な触媒活性；および（ｉｉ）除草剤に対し、野性型のＨＰＰＤよりも抵抗性のある触媒活性、を示すことを特徴とする、請求項１５に記載の変異ＨＰＰＤタンパク質。１７．タンパク質がシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)に由来することを特徴とする、請求項１５に記載の変異ＨＰＰＤタンパク質。１８．請求項１５に記載の変異ＨＰＰＤタンパク質をコードしている核酸。１９．請求項１８に記載の核酸を含むＤＮＡベクター。２０．細胞が細菌、菌類、植物、昆虫、および哺乳類の細胞からなる群より選択された細胞であることを特徴とする、請求項１９に記載のＤＮＡベクターを含む細胞。２１．細胞が細菌細胞であることを特徴とする、請求項２０に記載の細胞。２２．細胞が植物細胞であることを特徴とする、請求項２０に記載の細胞。２３．請求項２２に記載の細胞を含む種子。２４．植物に除草剤抵抗性を与える方法であって、植物に請求項１６に記載の除草剤抵抗性ＨＰＰＤ変異体をコードする核酸を、該核酸が該植物において発現される条件下に導入することを含むことを特徴とする、前記方法。２５．雑草を防除する方法であって、除草剤抵抗性のＨＰＰＤ遺伝子を含む作物を、雑草の防除に有効な量の除草剤の存在下に栽培することを含む、前記方法。