JP2001340078A - ポリエステルの製造方法 - Google Patents
ポリエステルの製造方法Info
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- JP2001340078A JP2001340078A JP2000164584A JP2000164584A JP2001340078A JP 2001340078 A JP2001340078 A JP 2001340078A JP 2000164584 A JP2000164584 A JP 2000164584A JP 2000164584 A JP2000164584 A JP 2000164584A JP 2001340078 A JP2001340078 A JP 2001340078A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ３ＨＨモル分率を制御し、様々な３ＨＨモル
分率を有するＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を高い生産性
でかつ安定して製造するポリエステルの製造方法を提供
する。 【解決手段】 微生物を用いて、下記式（１）で示され
る３−ヒドロキシ酪酸と下記式（２）で示される３−ヒ
ドロキシヘキサン酸とを共重合してなる共重合体ポリエ
ステルＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を生産する方法であ
って、少なくとも２種の炭素源として、炭素数の異なる
油脂の組み合わせ、炭素数の異なる脂肪酸の組み合わ
せ、又は、炭素数の異なる油脂と脂肪酸との組み合わせ
のいずれかを用いることによって、３ＨＨモル分率の異
なるポリエステルを採取するポリエステルの製造方法。 【化１】 【化２】
分率を有するＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を高い生産性
でかつ安定して製造するポリエステルの製造方法を提供
する。 【解決手段】 微生物を用いて、下記式（１）で示され
る３−ヒドロキシ酪酸と下記式（２）で示される３−ヒ
ドロキシヘキサン酸とを共重合してなる共重合体ポリエ
ステルＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を生産する方法であ
って、少なくとも２種の炭素源として、炭素数の異なる
油脂の組み合わせ、炭素数の異なる脂肪酸の組み合わ
せ、又は、炭素数の異なる油脂と脂肪酸との組み合わせ
のいずれかを用いることによって、３ＨＨモル分率の異
なるポリエステルを採取するポリエステルの製造方法。 【化１】 【化２】
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は共重合ポリエステル
の発酵生産による製造方法に関する。詳しくは、自然環
境（土中、河川、海中）の下で、微生物の作用を受けて
分解するプラスチック様高分子の製造方法に関するもの
である。
の発酵生産による製造方法に関する。詳しくは、自然環
境（土中、河川、海中）の下で、微生物の作用を受けて
分解するプラスチック様高分子の製造方法に関するもの
である。
【０００２】
【従来の技術】現在までに数多くの微生物において、エ
ネルギー貯蔵物質としてポリエステルを菌体内に蓄積す
ることが知られている。その代表例がポリ−３−ヒドロ
キシ酪酸（以下、Ｐ（３ＨＢ）と略す）である。Ｐ（３
ＨＢ）は熱可塑性高分子であり、自然環境中で生物的に
分解されることから、環境にやさしいグリーンプラスチ
ックとして注目されている。しかし、Ｐ（３ＨＢ）は結
晶性が高いため、硬くて脆い性質を持っていることから
実用的には応用範囲が限られる。この為、この性質の改
良を目的とした研究がなされてきた。
ネルギー貯蔵物質としてポリエステルを菌体内に蓄積す
ることが知られている。その代表例がポリ−３−ヒドロ
キシ酪酸（以下、Ｐ（３ＨＢ）と略す）である。Ｐ（３
ＨＢ）は熱可塑性高分子であり、自然環境中で生物的に
分解されることから、環境にやさしいグリーンプラスチ
ックとして注目されている。しかし、Ｐ（３ＨＢ）は結
晶性が高いため、硬くて脆い性質を持っていることから
実用的には応用範囲が限られる。この為、この性質の改
良を目的とした研究がなされてきた。
【０００３】その中で、特開昭５７−１５０３９３号公
報および特開昭５９−２２０１９２号公報などに３−ヒ
ドロキシ酪酸（３ＨＢ）と３−ヒドロキシ吉草酸（３Ｈ
Ｖ）とからなる共重合体Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）の
製造方法が開示されている。このＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３
ＨＶ）はＰ（３ＨＢ）に比べると柔軟性に富むため、幅
広い用途に応用できると考えられた。これらの公報にお
ける共重合体の製造方法は、Ｐ（３ＨＢ）の製造方法と
同様に、前段で菌体を増殖させ、後段で窒素またはリン
を制限して微生物を培養し、共重合体を製造するもので
あった。
報および特開昭５９−２２０１９２号公報などに３−ヒ
ドロキシ酪酸（３ＨＢ）と３−ヒドロキシ吉草酸（３Ｈ
Ｖ）とからなる共重合体Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）の
製造方法が開示されている。このＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３
ＨＶ）はＰ（３ＨＢ）に比べると柔軟性に富むため、幅
広い用途に応用できると考えられた。これらの公報にお
ける共重合体の製造方法は、Ｐ（３ＨＢ）の製造方法と
同様に、前段で菌体を増殖させ、後段で窒素またはリン
を制限して微生物を培養し、共重合体を製造するもので
あった。
【０００４】またＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）について
は、３ＨＶのモル分率が増えるにつれて柔軟性が変化す
ることから、３ＨＶのモル分率を制御する研究もなされ
てきた。例えば、特開昭５７−１５０３９３号公報、特
開昭６３−２６９９８９号公報ではプロピオン酸を使用
し、また特公平７−７９７０５号公報ではプロパン−１
−オールを使用し、それらの培地中への添加量を変える
ことにより３ＨＶのモル分率を制御しており、３ＨＶモ
ル分率が１０〜９０ｍｏｌ％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３Ｈ
Ｖ）が製造されている。しかしながら、実際のところＰ
（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）は３ＨＶモル分率を増加させ
ても、それに伴う物性の変化が乏しく、特にフィルムな
どに使用するのに要求される柔軟性が向上しないため、
シャンプーボトルや使い捨て剃刀の取っ手など硬質成形
体の分野にしか利用されなかった。
は、３ＨＶのモル分率が増えるにつれて柔軟性が変化す
ることから、３ＨＶのモル分率を制御する研究もなされ
てきた。例えば、特開昭５７−１５０３９３号公報、特
開昭６３−２６９９８９号公報ではプロピオン酸を使用
し、また特公平７−７９７０５号公報ではプロパン−１
−オールを使用し、それらの培地中への添加量を変える
ことにより３ＨＶのモル分率を制御しており、３ＨＶモ
ル分率が１０〜９０ｍｏｌ％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３Ｈ
Ｖ）が製造されている。しかしながら、実際のところＰ
（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）は３ＨＶモル分率を増加させ
ても、それに伴う物性の変化が乏しく、特にフィルムな
どに使用するのに要求される柔軟性が向上しないため、
シャンプーボトルや使い捨て剃刀の取っ手など硬質成形
体の分野にしか利用されなかった。
【０００５】近年、３ＨＢと３−ヒドロキシヘキサン酸
（以下、３ＨＨと略す）との２成分共重合ポリエステル
Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）およびその製造方法につい
て研究がなされた。たとえば、特開平５−９３０４９号
公報および特開平７−２６５０６５号公報にそれぞれ記
載されている。これらの公報のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３Ｈ
Ｈ）共重合体の製造方法は、土壌より単離されたアエロ
モナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａ
ｅ）を用いてオレイン酸等の脂肪酸やオリーブオイル等
の油脂から発酵生産するものであった。
（以下、３ＨＨと略す）との２成分共重合ポリエステル
Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）およびその製造方法につい
て研究がなされた。たとえば、特開平５−９３０４９号
公報および特開平７−２６５０６５号公報にそれぞれ記
載されている。これらの公報のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３Ｈ
Ｈ）共重合体の製造方法は、土壌より単離されたアエロ
モナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａ
ｅ）を用いてオレイン酸等の脂肪酸やオリーブオイル等
の油脂から発酵生産するものであった。
【０００６】また、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の性質
に関する研究もなされている（Ｙ．Ｄｏｉ，Ｓ．Ｋｉｔ
ａｍｕｒａ，Ｈ．Ａｂｅ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ
ｓ ２８，４８２２−４８２３（１９９５））。この報
告では炭素数が１２個以上の脂肪酸のうちの単一種の脂
肪酸を唯一の炭素源としてＡ．ｃａｖｉａｅを培養し、
３ＨＨが１１〜１９ｍｏｌ％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３Ｈ
Ｈ）を発酵生産している。このＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３Ｈ
Ｈ）は３ＨＨモル分率の増加にしたがって、Ｐ（３Ｈ
Ｂ）の硬くて脆い性質から次第に柔軟な性質を示すよう
になり、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）を上回る柔軟性を
示すことが明らかにされた。
に関する研究もなされている（Ｙ．Ｄｏｉ，Ｓ．Ｋｉｔ
ａｍｕｒａ，Ｈ．Ａｂｅ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ
ｓ ２８，４８２２−４８２３（１９９５））。この報
告では炭素数が１２個以上の脂肪酸のうちの単一種の脂
肪酸を唯一の炭素源としてＡ．ｃａｖｉａｅを培養し、
３ＨＨが１１〜１９ｍｏｌ％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３Ｈ
Ｈ）を発酵生産している。このＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３Ｈ
Ｈ）は３ＨＨモル分率の増加にしたがって、Ｐ（３Ｈ
Ｂ）の硬くて脆い性質から次第に柔軟な性質を示すよう
になり、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）を上回る柔軟性を
示すことが明らかにされた。
【０００７】また、Ａ．ｃａｖｉａｅのＰＨＡシンター
ゼ遺伝子をクローニングし、この遺伝子をＰ（３ＨＢ）
を９０％以上蓄積するＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔ
ｒｏｐｈｕｓに導入した組換え株を用いて、脂肪酸を炭
素源としてＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を生産する報告
がなされた。（Ｔ．Ｆｕｋｕｉ，Ｙ．ｄｏｉ，Ｊ．Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ．ｖｏｌ．１７９，Ｎｏ．１５，４８２
１−４８３０、特開平１０−１０８６８２号公報）この
なかで、オクタン酸ナトリウムを炭素源とすることで、
３ＨＨモル分率が１０〜２０ｍｏｌ％のＰ（３ＨＢ−ｃ
ｏ−３ＨＨ）が生産できると報告している。
ゼ遺伝子をクローニングし、この遺伝子をＰ（３ＨＢ）
を９０％以上蓄積するＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔ
ｒｏｐｈｕｓに導入した組換え株を用いて、脂肪酸を炭
素源としてＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を生産する報告
がなされた。（Ｔ．Ｆｕｋｕｉ，Ｙ．ｄｏｉ，Ｊ．Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ．ｖｏｌ．１７９，Ｎｏ．１５，４８２
１−４８３０、特開平１０−１０８６８２号公報）この
なかで、オクタン酸ナトリウムを炭素源とすることで、
３ＨＨモル分率が１０〜２０ｍｏｌ％のＰ（３ＨＢ−ｃ
ｏ−３ＨＨ）が生産できると報告している。
【０００８】このように、本ポリマーを３ＨＨモル分率
を広い範囲でコントロールして共重合体を製造すること
ができれば、硬い共重合体から柔らかい共重合体まで発
酵生産可能となり、テレビの筐体などのように硬さを要
求されるものから糸やフィルムなどのような柔軟性を要
求されるものまで、幅広い分野への応用が期待できる。
しかしながら、これらの方法では菌体の生産性が低く、
本ポリマーの実用化に向けた生産方法としては適用でき
ない。上述したように、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の
３ＨＨモル分率をコントロールして生産することは、幅
広い分野へ応用するために必要不可欠である。そこで高
い菌体生産性とポリマー含量とを保持し、かつ３ＨＨモ
ル分率をコントロールできる生産方法が求められてい
た。
を広い範囲でコントロールして共重合体を製造すること
ができれば、硬い共重合体から柔らかい共重合体まで発
酵生産可能となり、テレビの筐体などのように硬さを要
求されるものから糸やフィルムなどのような柔軟性を要
求されるものまで、幅広い分野への応用が期待できる。
しかしながら、これらの方法では菌体の生産性が低く、
本ポリマーの実用化に向けた生産方法としては適用でき
ない。上述したように、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の
３ＨＨモル分率をコントロールして生産することは、幅
広い分野へ応用するために必要不可欠である。そこで高
い菌体生産性とポリマー含量とを保持し、かつ３ＨＨモ
ル分率をコントロールできる生産方法が求められてい
た。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記現状に
鑑み、３ＨＨモル分率を制御し、様々な３ＨＨモル分率
を有するＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を高い生産性でか
つ安定して製造するポリエステルの製造方法を提供する
ことを目的とするものである。
鑑み、３ＨＨモル分率を制御し、様々な３ＨＨモル分率
を有するＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を高い生産性でか
つ安定して製造するポリエステルの製造方法を提供する
ことを目的とするものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明者らは様々な検討
を行った結果、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）共重合体を
蓄積する微生物を、油脂および／または脂肪酸を炭素源
とする培地を使用して培養し、高い生産性を保持し、か
つ安定して３ＨＨモル分率が異なる共重合体を製造する
ことに成功した。
を行った結果、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）共重合体を
蓄積する微生物を、油脂および／または脂肪酸を炭素源
とする培地を使用して培養し、高い生産性を保持し、か
つ安定して３ＨＨモル分率が異なる共重合体を製造する
ことに成功した。
【００１１】即ち、本発明は、微生物を用いて、下記式
（１）で示される３−ヒドロキシ酪酸と下記式（２）で
示される３−ヒドロキシヘキサン酸とを共重合してなる
共重合ポリエステルＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を生産
する方法であって、少なくとも２種の炭素源として、炭
素数の異なる油脂の組み合わせ、炭素数の異なる脂肪酸
の組み合わせ、又は、炭素数の異なる油脂と脂肪酸との
組み合わせのいずれかを用いることによって、３ＨＨモ
ル分率の異なるポリエステルを採取するポリエステルの
製造方法である。
（１）で示される３−ヒドロキシ酪酸と下記式（２）で
示される３−ヒドロキシヘキサン酸とを共重合してなる
共重合ポリエステルＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を生産
する方法であって、少なくとも２種の炭素源として、炭
素数の異なる油脂の組み合わせ、炭素数の異なる脂肪酸
の組み合わせ、又は、炭素数の異なる油脂と脂肪酸との
組み合わせのいずれかを用いることによって、３ＨＨモ
ル分率の異なるポリエステルを採取するポリエステルの
製造方法である。
【００１２】
【化３】
【００１３】
【化４】
【００１４】また、本発明の要旨は、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ
−３ＨＨ）共重合体を蓄積する微生物を、少なくとも２
種の炭素源として、炭素数の異なる油脂の組み合わせ、
炭素数の異なる脂肪酸の組み合わせ、又は、炭素数の異
なる油脂と脂肪酸との組み合わせのいずれかを添加した
培地で培養することで、３ＨＨモル分率が１〜４０ｍｏ
ｌ％の範囲のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）共重合体を菌
体内に蓄積させ、その培養物からポリマーを採取するこ
とを特徴とする共重合体ポリエステルの製造方法に関す
る。以下に、本発明の詳細を説明する。
−３ＨＨ）共重合体を蓄積する微生物を、少なくとも２
種の炭素源として、炭素数の異なる油脂の組み合わせ、
炭素数の異なる脂肪酸の組み合わせ、又は、炭素数の異
なる油脂と脂肪酸との組み合わせのいずれかを添加した
培地で培養することで、３ＨＨモル分率が１〜４０ｍｏ
ｌ％の範囲のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）共重合体を菌
体内に蓄積させ、その培養物からポリマーを採取するこ
とを特徴とする共重合体ポリエステルの製造方法に関す
る。以下に、本発明の詳細を説明する。
【００１５】
【発明の実施の形態】本発明のポリエステルの製造方法
は、微生物を用いて、上記式（１）で示される３−ヒド
ロキシ酪酸と上記式（２）で示される３−ヒドロキシヘ
キサン酸とを共重合してなる共重合ポリエステルＰ（３
ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を生産する際に適用される。上記
式（１）で示される３−ヒドロキシ酪酸と上記式（２）
で示される３−ヒドロキシヘキサン酸とを共重合してな
る共重合ポリエステルＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）は、
例えば、下記一般式（３）に示される。
は、微生物を用いて、上記式（１）で示される３−ヒド
ロキシ酪酸と上記式（２）で示される３−ヒドロキシヘ
キサン酸とを共重合してなる共重合ポリエステルＰ（３
ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を生産する際に適用される。上記
式（１）で示される３−ヒドロキシ酪酸と上記式（２）
で示される３−ヒドロキシヘキサン酸とを共重合してな
る共重合ポリエステルＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）は、
例えば、下記一般式（３）に示される。
【００１６】
【化５】
【００１７】式中、ｍ及びｎは、同じか又は異なって、
１以上の整数を表す。本発明のポリエステルの製造方法
において、使用する微生物には特に制限なく、菌株の寄
託機関（例えばＩＦＯ、ＡＴＣＣ等）に寄託されている
Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属やＡ
ｅｒｏｍｏｎａｓ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属などの
細菌類を使用することが出来るが、Ａｌｃａｌｉｇｅｎ
ｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕ
ｔｒｏｐｈａ）を使用することが好ましい。
１以上の整数を表す。本発明のポリエステルの製造方法
において、使用する微生物には特に制限なく、菌株の寄
託機関（例えばＩＦＯ、ＡＴＣＣ等）に寄託されている
Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属やＡ
ｅｒｏｍｏｎａｓ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属などの
細菌類を使用することが出来るが、Ａｌｃａｌｉｇｅｎ
ｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕ
ｔｒｏｐｈａ）を使用することが好ましい。
【００１８】また、本発明のポリエステルの製造方法に
用いられる微生物は、ポリエステル重合酵素遺伝子を含
む組換えベクターにより、形質転換された微生物である
ことが好ましい。形質転換体を作製する場合はベクター
には、その菌内で自立的に増殖しうるプラスミドベクタ
ーを用いることができるが、染色体に組み込まれていて
も良い。ポリエステル重合遺伝子は構造遺伝子のほか
に、プロモーター、ターミネーターなど宿主菌で機能す
る発現ユニットを有していればよい。本発明のポリエス
テルの製造方法において用いられるポリエステル重合遺
伝子は、アエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ
ｃａｖｉａｅ）より単離された遺伝子が好ましく、例
えば特開平１０−１０８６８２号公報に記載されている
遺伝子断片を用いることができる。
用いられる微生物は、ポリエステル重合酵素遺伝子を含
む組換えベクターにより、形質転換された微生物である
ことが好ましい。形質転換体を作製する場合はベクター
には、その菌内で自立的に増殖しうるプラスミドベクタ
ーを用いることができるが、染色体に組み込まれていて
も良い。ポリエステル重合遺伝子は構造遺伝子のほか
に、プロモーター、ターミネーターなど宿主菌で機能す
る発現ユニットを有していればよい。本発明のポリエス
テルの製造方法において用いられるポリエステル重合遺
伝子は、アエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ
ｃａｖｉａｅ）より単離された遺伝子が好ましく、例
えば特開平１０−１０８６８２号公報に記載されている
遺伝子断片を用いることができる。
【００１９】微生物に組換えベクターを導入するには、
公知の方法により行うことができる。例えば、カルシウ
ム法（Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ．Ｅ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，
Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１１９．１０７２（１９７
４））やエレクトロポレーション法（Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ、１巻、１．８．４頁、１９９４年）等を用
いることができる。
公知の方法により行うことができる。例えば、カルシウ
ム法（Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ．Ｅ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，
Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１１９．１０７２（１９７
４））やエレクトロポレーション法（Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ、１巻、１．８．４頁、１９９４年）等を用
いることができる。
【００２０】（ポリエステルの製造方法）本発明のポリ
エステルの製造方法においては、微生物を培養する際
に、上記のように少なくとも２種の炭素源として、炭素
数の異なる油脂の組み合わせ、炭素数の異なる脂肪酸の
組み合わせ、又は、炭素数の異なる油脂と脂肪酸との組
み合わせのいずれかを用い、炭素源以外の栄養源である
窒素源、無機塩類、そのほかの有機栄養源を含む培地が
使用できる。なお、上記炭素数の異なる油脂とは、油脂
を構成する脂肪酸のうち、主要脂肪酸の炭素数が異なる
油脂を意味する。培養温度はその菌の生育可能な温度で
あればよいが、２０℃から４０℃好ましい。培養時間に
は特に制限はないが、１〜７日程度で良い。その後、得
られた該培養菌体又は培養物からポリエステルを回収す
ればよい。また、形質転換体を使用する際は、培養中に
ベクターに存在する耐性遺伝子に対応するカナマイシ
ン、アンピシリン、テトラサイクリン等の抗生物質を添
加しても良い。
エステルの製造方法においては、微生物を培養する際
に、上記のように少なくとも２種の炭素源として、炭素
数の異なる油脂の組み合わせ、炭素数の異なる脂肪酸の
組み合わせ、又は、炭素数の異なる油脂と脂肪酸との組
み合わせのいずれかを用い、炭素源以外の栄養源である
窒素源、無機塩類、そのほかの有機栄養源を含む培地が
使用できる。なお、上記炭素数の異なる油脂とは、油脂
を構成する脂肪酸のうち、主要脂肪酸の炭素数が異なる
油脂を意味する。培養温度はその菌の生育可能な温度で
あればよいが、２０℃から４０℃好ましい。培養時間に
は特に制限はないが、１〜７日程度で良い。その後、得
られた該培養菌体又は培養物からポリエステルを回収す
ればよい。また、形質転換体を使用する際は、培養中に
ベクターに存在する耐性遺伝子に対応するカナマイシ
ン、アンピシリン、テトラサイクリン等の抗生物質を添
加しても良い。
【００２１】本発明のポリエステルの製造方法において
は、少なくとも２種の炭素源として、炭素数の異なる油
脂の組み合わせ、炭素数の異なる脂肪酸の組み合わせ、
又は、炭素数の異なる油脂と脂肪酸との組み合わせのい
ずれかを用いることによって、３ＨＨモル分率の異なる
ポリエステルを採取する。
は、少なくとも２種の炭素源として、炭素数の異なる油
脂の組み合わせ、炭素数の異なる脂肪酸の組み合わせ、
又は、炭素数の異なる油脂と脂肪酸との組み合わせのい
ずれかを用いることによって、３ＨＨモル分率の異なる
ポリエステルを採取する。
【００２２】炭素源として使用する油脂には特に制限は
なく、例えば構成脂肪酸がリノール酸５２％、オレイン
酸２１％、パルミチン酸１２％、リノレン酸１１％、ス
テアリン酸３％である大豆油、構成脂肪酸がオレイン酸
５９％、リノール酸２２％、リノレン酸１１％、パルミ
チン酸４％、ステアリン酸２％であるナタネ油、構成脂
肪酸がリノール酸５１％、オレイン酸３５％、パルミチ
ン酸１１％、ステアリン酸２％であるコーン油、構成脂
肪酸がオレイン酸７５％、リノール酸１０％、パルミチ
ン酸１０％、ステアリン酸３％、リノレン酸１％である
オリーブ油、構成脂肪酸がパルミチン酸４３％、オレイ
ン酸４１％、リノール酸１０％、ステアリン酸５％、ミ
リスチン酸１％であるパーム油、構成脂肪酸がラウリン
酸４７％、ミリスチン酸１８％、パルミチン酸９％、オ
レイン酸７％、ステアリン酸３％、リノール酸２％であ
るヤシ油、構成脂肪酸がラウリン酸４４％、オレイン酸
１７％、ミリスチン酸１４％、パルミチン酸３％、リノ
ール酸３％であるパーム核油などの天然物由来の油脂
や、炭素数が６以上２０以下の脂肪酸、例えば、ヘキサ
ン酸、オクタン酸、デカン酸、ラウリン酸などから１種
以上選択された脂肪酸とグリセロールとから合成したト
リグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリドなどがあ
げられる。天然物由来の油脂では炭素数１２以下の脂肪
酸を構成脂肪酸として４０〜５０％含むヤシ油、パーム
核油が好ましい。合成したトリグリセリド、ジグリセリ
ド、モノグリセリドについては、構成脂肪酸はヘキサン
酸が好ましい。
なく、例えば構成脂肪酸がリノール酸５２％、オレイン
酸２１％、パルミチン酸１２％、リノレン酸１１％、ス
テアリン酸３％である大豆油、構成脂肪酸がオレイン酸
５９％、リノール酸２２％、リノレン酸１１％、パルミ
チン酸４％、ステアリン酸２％であるナタネ油、構成脂
肪酸がリノール酸５１％、オレイン酸３５％、パルミチ
ン酸１１％、ステアリン酸２％であるコーン油、構成脂
肪酸がオレイン酸７５％、リノール酸１０％、パルミチ
ン酸１０％、ステアリン酸３％、リノレン酸１％である
オリーブ油、構成脂肪酸がパルミチン酸４３％、オレイ
ン酸４１％、リノール酸１０％、ステアリン酸５％、ミ
リスチン酸１％であるパーム油、構成脂肪酸がラウリン
酸４７％、ミリスチン酸１８％、パルミチン酸９％、オ
レイン酸７％、ステアリン酸３％、リノール酸２％であ
るヤシ油、構成脂肪酸がラウリン酸４４％、オレイン酸
１７％、ミリスチン酸１４％、パルミチン酸３％、リノ
ール酸３％であるパーム核油などの天然物由来の油脂
や、炭素数が６以上２０以下の脂肪酸、例えば、ヘキサ
ン酸、オクタン酸、デカン酸、ラウリン酸などから１種
以上選択された脂肪酸とグリセロールとから合成したト
リグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリドなどがあ
げられる。天然物由来の油脂では炭素数１２以下の脂肪
酸を構成脂肪酸として４０〜５０％含むヤシ油、パーム
核油が好ましい。合成したトリグリセリド、ジグリセリ
ド、モノグリセリドについては、構成脂肪酸はヘキサン
酸が好ましい。
【００２３】本発明のポリエステルの製造方法において
は、上記油脂として、ヤシ油、パーム油、パーム核油及
びヘキサン酸トリグリセリドからなる群より選択される
油脂を用いることが好ましい。また、上記脂肪酸として
はヘキサン酸、オクタン酸、デカン酸、ラウリン酸、オ
レイン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸、ミ
リスチン酸などの飽和または不飽和脂肪酸、これら脂肪
酸のエステルや脂肪酸塩など脂肪酸誘導体が挙げられ
る。なかでも、炭素数が６〜１０である飽和または不飽
和脂肪酸、その脂肪酸エステル及び脂肪酸塩からなる群
より選択される脂肪酸が好ましい。
は、上記油脂として、ヤシ油、パーム油、パーム核油及
びヘキサン酸トリグリセリドからなる群より選択される
油脂を用いることが好ましい。また、上記脂肪酸として
はヘキサン酸、オクタン酸、デカン酸、ラウリン酸、オ
レイン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸、ミ
リスチン酸などの飽和または不飽和脂肪酸、これら脂肪
酸のエステルや脂肪酸塩など脂肪酸誘導体が挙げられ
る。なかでも、炭素数が６〜１０である飽和または不飽
和脂肪酸、その脂肪酸エステル及び脂肪酸塩からなる群
より選択される脂肪酸が好ましい。
【００２４】３ＨＨモル分率の高いポリエステルを得る
ためには、できるだけ炭素数の少ない脂肪酸を含む油
脂、脂肪酸を用いることが好ましい。油脂では炭素数が
１２以下の脂肪酸を比較的多く含むヤシ油、パーム核
油、ヘキサン酸トリグリセリドなどが好ましく、また脂
肪酸では、炭素数が６〜１０である飽和または不飽和脂
肪酸、その脂肪酸エステル、脂肪酸塩が好ましい。炭素
数が６〜１０である飽和または不飽和脂肪酸、その脂肪
酸エステル、脂肪酸塩のなかでも、偶数個の炭素数のも
のがより好ましく、炭素数６のヘキサン酸が特に好まし
い。
ためには、できるだけ炭素数の少ない脂肪酸を含む油
脂、脂肪酸を用いることが好ましい。油脂では炭素数が
１２以下の脂肪酸を比較的多く含むヤシ油、パーム核
油、ヘキサン酸トリグリセリドなどが好ましく、また脂
肪酸では、炭素数が６〜１０である飽和または不飽和脂
肪酸、その脂肪酸エステル、脂肪酸塩が好ましい。炭素
数が６〜１０である飽和または不飽和脂肪酸、その脂肪
酸エステル、脂肪酸塩のなかでも、偶数個の炭素数のも
のがより好ましく、炭素数６のヘキサン酸が特に好まし
い。
【００２５】また、本発明のポリエステルの製造方法に
おいては、炭素源として用いる油脂または脂肪酸の添加
量を変えることによって、３ＨＨモル分率を制御するこ
とが好ましい。天然由来の油脂を炭素源とすると、３Ｈ
Ｈモル分率が１０ｍｏｌ％よりも小さいＰ（３ＨＢ−ｃ
ｏ−３ＨＨ）が生産できる。３ＨＨモル分率が１０ｍｏ
ｌ％より大きいＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を生産する
ためには、炭素数６〜１０の脂肪酸またはそのトリグリ
セリド、ジグリセリド、モノグリセリドを添加すれば良
い。
おいては、炭素源として用いる油脂または脂肪酸の添加
量を変えることによって、３ＨＨモル分率を制御するこ
とが好ましい。天然由来の油脂を炭素源とすると、３Ｈ
Ｈモル分率が１０ｍｏｌ％よりも小さいＰ（３ＨＢ−ｃ
ｏ−３ＨＨ）が生産できる。３ＨＨモル分率が１０ｍｏ
ｌ％より大きいＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を生産する
ためには、炭素数６〜１０の脂肪酸またはそのトリグリ
セリド、ジグリセリド、モノグリセリドを添加すれば良
い。
【００２６】本発明のポリエステルの製造方法において
は、上記のように少なくとも２種の炭素源として、炭素
数の異なる油脂の組み合わせ、炭素数の異なる脂肪酸の
組み合わせ、又は、炭素数の異なる油脂と脂肪酸との組
み合わせのいずれかを用い、上記油脂または脂肪酸の添
加量を変えることによって、得られるポリエステルの３
ＨＨモル分率を１〜４０ｍｏｌ％の間で制御することが
できる。
は、上記のように少なくとも２種の炭素源として、炭素
数の異なる油脂の組み合わせ、炭素数の異なる脂肪酸の
組み合わせ、又は、炭素数の異なる油脂と脂肪酸との組
み合わせのいずれかを用い、上記油脂または脂肪酸の添
加量を変えることによって、得られるポリエステルの３
ＨＨモル分率を１〜４０ｍｏｌ％の間で制御することが
できる。
【００２７】本発明のポリエステルの製造方法におい
て、炭素源である油脂および／または脂肪酸の添加方法
としては、特に制限はない。しかし、油脂は一度に大量
に添加すると培養液中の溶存酸素濃度を低下させる可能
性がある。また脂肪酸は細胞毒性があるため、生育阻害
を起こす可能性がある。したがって、これらの添加方法
としては、生育阻害を起こさない程度の量を分割して添
加する方法や、ペリスタポンプなどを使用し連続添加
し、生育阻害を起こさない濃度を維持する方法などが好
ましい。分割して添加する場合は、一度に添加する脂肪
酸の濃度は１ｗ／ｖ％以下、油脂では５ｗ／ｖ％以下が
好ましいが、特に制限されるものではない。また、添加
する油脂および脂肪酸の総量は、選択した微生物の生育
に影響を与えない程度であれば良く、２０ｗ／ｖ％以下
が好ましいが、特に制限されるものではない。油脂と脂
肪酸とは別々のラインで添加しても良いが、相溶性があ
る場合は油脂と脂肪酸とを混合して添加した方が、添加
ラインを減らすことができるため好ましい。
て、炭素源である油脂および／または脂肪酸の添加方法
としては、特に制限はない。しかし、油脂は一度に大量
に添加すると培養液中の溶存酸素濃度を低下させる可能
性がある。また脂肪酸は細胞毒性があるため、生育阻害
を起こす可能性がある。したがって、これらの添加方法
としては、生育阻害を起こさない程度の量を分割して添
加する方法や、ペリスタポンプなどを使用し連続添加
し、生育阻害を起こさない濃度を維持する方法などが好
ましい。分割して添加する場合は、一度に添加する脂肪
酸の濃度は１ｗ／ｖ％以下、油脂では５ｗ／ｖ％以下が
好ましいが、特に制限されるものではない。また、添加
する油脂および脂肪酸の総量は、選択した微生物の生育
に影響を与えない程度であれば良く、２０ｗ／ｖ％以下
が好ましいが、特に制限されるものではない。油脂と脂
肪酸とは別々のラインで添加しても良いが、相溶性があ
る場合は油脂と脂肪酸とを混合して添加した方が、添加
ラインを減らすことができるため好ましい。
【００２８】窒素源としては、例えばアンモニア、塩化
アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム
等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エ
キスなどが挙げられる。無機塩類としては、例えばリン
酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシ
ウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウムなどが挙げら
れる。
アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム
等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エ
キスなどが挙げられる。無機塩類としては、例えばリン
酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシ
ウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウムなどが挙げら
れる。
【００２９】そのほかの有機栄養源としては、アミノ
酸、例えばグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、
プロリンなど、ビタミン、例えばビタミンＢ1 、ビタミ
ンＢ12、ビタミンＣ等が挙げられる。
酸、例えばグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、
プロリンなど、ビタミン、例えばビタミンＢ1 、ビタミ
ンＢ12、ビタミンＣ等が挙げられる。
【００３０】本発明において、ポリエステルの菌体から
の回収は例えば、次のような方法が使用できる。培養終
了後、培養液から遠心分離器などを用いて菌体を分離
し、その菌体を蒸留水およびメタノール等により洗浄し
た後、乾燥させる。この乾燥菌体からクロロホルム等の
有機溶剤を用いてポリエステルを抽出する。このポリエ
ステルを含んだ有機溶剤溶液から濾過等によって菌体成
分を除去し、そのろ液にメタノールやヘキサン等の貧溶
媒を加えてポリエステルを沈殿させる。濾過や遠心分離
によって上澄み液を除去し、乾燥させてポリエステルを
回収する。得られたポリエステルの分析は、例えば、ガ
スクロマトグラフ法や核磁気共鳴法などにより行う。
の回収は例えば、次のような方法が使用できる。培養終
了後、培養液から遠心分離器などを用いて菌体を分離
し、その菌体を蒸留水およびメタノール等により洗浄し
た後、乾燥させる。この乾燥菌体からクロロホルム等の
有機溶剤を用いてポリエステルを抽出する。このポリエ
ステルを含んだ有機溶剤溶液から濾過等によって菌体成
分を除去し、そのろ液にメタノールやヘキサン等の貧溶
媒を加えてポリエステルを沈殿させる。濾過や遠心分離
によって上澄み液を除去し、乾燥させてポリエステルを
回収する。得られたポリエステルの分析は、例えば、ガ
スクロマトグラフ法や核磁気共鳴法などにより行う。
【００３１】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。ただし、本発明は、これら実施例にその技術
範囲を限定するものではない。
説明する。ただし、本発明は、これら実施例にその技術
範囲を限定するものではない。
【００３２】（実施例１）Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅ
ｕｔｒｏｐｈｕｓ ＰＨＢ−４／ｐＪＲＤＥＥ３２ｄ１
３株（Ｔ．Ｆｕｋｕｉ．，Ｙ．Ｄｏｉ．，Ａｐｐｌ Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４９，３３
３−３３６，（１９９８），受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１
５７８６）（以下Ａｅｄ１３株と略す。）を次のように
培養した。前培地の組成は１ｗ／ｖ％Ｍｅａｔ−ｅｘｔ
ｒａｃｔ、１ｗ／ｖ％Ｂａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎ、
０．２ｗ／ｖ％Ｙｅａｓｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、０．９ｗ
／ｖ％Ｎａ2 ＨＰＯ4 ・１２Ｈ2 Ｏ、０．１５ｗ／ｖ％
ＫＨ2 ＰＯ4 、（ｐＨ６．７）とした。ポリエステル生
産培地の組成は１．１ｗ／ｖ％Ｎａ2 ＨＰＯ4 ・１２Ｈ
2 Ｏ、０．１９ｗ／ｖ％ＫＨ2 ＰＯ4 、０．６ｗ／ｖ％
（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 、０．１ｗ／ｖ％ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ
2 Ｏ、０．５ｖ／ｖ％微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に
１．６ｗ／ｖ％ＦｅＣｌ3 ・６Ｈ2 Ｏ、１ｗ／ｖ％Ｃａ
Ｃｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％ＣｏＣｌ2 ・６Ｈ
2 Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％ＣｕＳＯ4 ・５Ｈ2 Ｏ、０．
０１２ｗ／ｖ％ＮｉＣｌ3 ・６Ｈ2 Ｏ、０．０１ｗ／ｖ
％ＣｒＣｌ 3 ・６Ｈ2 Ｏを溶かしたもの。）、２ｗ／ｖ
％プロエキスＡＰ−１２（播州調味料）、５×１０-6ｗ
／ｖ％カナマイシンとした。炭素源は油脂のみとし、パ
ーム油、パーム核油又はヤシ油４ｗ／ｖ％を３回に分け
て添加した。
ｕｔｒｏｐｈｕｓ ＰＨＢ−４／ｐＪＲＤＥＥ３２ｄ１
３株（Ｔ．Ｆｕｋｕｉ．，Ｙ．Ｄｏｉ．，Ａｐｐｌ Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４９，３３
３−３３６，（１９９８），受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１
５７８６）（以下Ａｅｄ１３株と略す。）を次のように
培養した。前培地の組成は１ｗ／ｖ％Ｍｅａｔ−ｅｘｔ
ｒａｃｔ、１ｗ／ｖ％Ｂａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎ、
０．２ｗ／ｖ％Ｙｅａｓｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、０．９ｗ
／ｖ％Ｎａ2 ＨＰＯ4 ・１２Ｈ2 Ｏ、０．１５ｗ／ｖ％
ＫＨ2 ＰＯ4 、（ｐＨ６．７）とした。ポリエステル生
産培地の組成は１．１ｗ／ｖ％Ｎａ2 ＨＰＯ4 ・１２Ｈ
2 Ｏ、０．１９ｗ／ｖ％ＫＨ2 ＰＯ4 、０．６ｗ／ｖ％
（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 、０．１ｗ／ｖ％ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ
2 Ｏ、０．５ｖ／ｖ％微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に
１．６ｗ／ｖ％ＦｅＣｌ3 ・６Ｈ2 Ｏ、１ｗ／ｖ％Ｃａ
Ｃｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％ＣｏＣｌ2 ・６Ｈ
2 Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％ＣｕＳＯ4 ・５Ｈ2 Ｏ、０．
０１２ｗ／ｖ％ＮｉＣｌ3 ・６Ｈ2 Ｏ、０．０１ｗ／ｖ
％ＣｒＣｌ 3 ・６Ｈ2 Ｏを溶かしたもの。）、２ｗ／ｖ
％プロエキスＡＰ−１２（播州調味料）、５×１０-6ｗ
／ｖ％カナマイシンとした。炭素源は油脂のみとし、パ
ーム油、パーム核油又はヤシ油４ｗ／ｖ％を３回に分け
て添加した。
【００３３】Ａｅｄ１３株のグリセロールストックを前
培地に接種して２０時間培養し、６Ｌの生産培地を入れ
た１０Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製Ｍ
Ｄ−５００型）に１．５ｖ／ｖ％接種した。運転条件
は、培養温度３０℃、攪拌速度４００ｒｐｍ、通気量
１．８Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．６から６．８の間で
コントロールした。コントロールには５規定の硫酸と水
酸化ナトリウムとを使用した。培養は７２時間まで行っ
た。遠心分離によって菌体を回収し、メタノールで洗浄
後、凍結乾燥し、乾燥菌体重量を測定した。
培地に接種して２０時間培養し、６Ｌの生産培地を入れ
た１０Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製Ｍ
Ｄ−５００型）に１．５ｖ／ｖ％接種した。運転条件
は、培養温度３０℃、攪拌速度４００ｒｐｍ、通気量
１．８Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．６から６．８の間で
コントロールした。コントロールには５規定の硫酸と水
酸化ナトリウムとを使用した。培養は７２時間まで行っ
た。遠心分離によって菌体を回収し、メタノールで洗浄
後、凍結乾燥し、乾燥菌体重量を測定した。
【００３４】得られた乾燥菌体約３０ｍｇに２ｍｌの硫
酸−メタノール混液（１５：８５）と２ｍｌのクロロホ
ルムとを添加して密栓し、１００℃で１４０分間加熱す
ることで菌体内のポリエステル分解物のメチルエステル
を得た。冷却後、これに１ｍｌの蒸留水を添加し、攪拌
機を用いて激しく撹拌した。静置して二層に分離させた
後、下層の有機溶媒層を取り出し、その組成をキャピラ
リーガスクロマトグラフィーにより分析した。ガスクロ
マトグラフは島津製作所ＧＣ−１７Ａ、キャピラリーカ
ラムはＧＬサイエンス社製ＮＥＵＴＲＡ ＢＯＮＤ−１
（カラム長２５ｍ、カラム内径０．２５ｍｍ、液膜厚
０．４μｍ）を用いた。温度条件は、初発温度１００℃
から８℃／分の速度で昇温した。得られた結果を表１に
示す。
酸−メタノール混液（１５：８５）と２ｍｌのクロロホ
ルムとを添加して密栓し、１００℃で１４０分間加熱す
ることで菌体内のポリエステル分解物のメチルエステル
を得た。冷却後、これに１ｍｌの蒸留水を添加し、攪拌
機を用いて激しく撹拌した。静置して二層に分離させた
後、下層の有機溶媒層を取り出し、その組成をキャピラ
リーガスクロマトグラフィーにより分析した。ガスクロ
マトグラフは島津製作所ＧＣ−１７Ａ、キャピラリーカ
ラムはＧＬサイエンス社製ＮＥＵＴＲＡ ＢＯＮＤ−１
（カラム長２５ｍ、カラム内径０．２５ｍｍ、液膜厚
０．４μｍ）を用いた。温度条件は、初発温度１００℃
から８℃／分の速度で昇温した。得られた結果を表１に
示す。
【００３５】
【表１】
【００３６】この結果から、生産性は、ヤシ油を炭素源
とした場合、約２４ｇ／Ｌに向上することがわかった。
また生産性が向上すると、特開平１０−１０８６８２号
公報に記載の結果とは異なり、３ＨＨモル分率が１０ｍ
ｏｌ％よりも小さくなることがわかった。
とした場合、約２４ｇ／Ｌに向上することがわかった。
また生産性が向上すると、特開平１０−１０８６８２号
公報に記載の結果とは異なり、３ＨＨモル分率が１０ｍ
ｏｌ％よりも小さくなることがわかった。
【００３７】（実施例２）炭素源として１）ヤシ油５ｗ
／ｖ％、２）ヤシ油４ｗ／ｖ％とヘキサン酸１ｗ／ｖ
％、３）ヤシ油３ｗ／ｖ％とヘキサン酸２ｗ／ｖ％、
４）ヤシ油２ｗ／ｖ％とヘキサン酸３ｗ／ｖ％、５）ヤ
シ油１ｗ／ｖ％とヘキサン酸４ｗ／ｖ％、６）ヤシ油
０．５ｗ／ｖ％とヘキサン酸５ｗ／ｖ％と様々に割合を
変えて油脂と脂肪酸とを添加した。ヤシ油は接種時にヤ
シ油を０．５ｗ／ｖ添加し、残りのヤシ油とヘキサン酸
とは混合して約１０ｍｌ／ｍｉｎの速度で２４〜６０時
間までの間にペリスタポンプで連続添加した。それ以外
は実施例１と同様の培地・条件で培養を行い、分析を行
った。その結果を表２に示す。
／ｖ％、２）ヤシ油４ｗ／ｖ％とヘキサン酸１ｗ／ｖ
％、３）ヤシ油３ｗ／ｖ％とヘキサン酸２ｗ／ｖ％、
４）ヤシ油２ｗ／ｖ％とヘキサン酸３ｗ／ｖ％、５）ヤ
シ油１ｗ／ｖ％とヘキサン酸４ｗ／ｖ％、６）ヤシ油
０．５ｗ／ｖ％とヘキサン酸５ｗ／ｖ％と様々に割合を
変えて油脂と脂肪酸とを添加した。ヤシ油は接種時にヤ
シ油を０．５ｗ／ｖ添加し、残りのヤシ油とヘキサン酸
とは混合して約１０ｍｌ／ｍｉｎの速度で２４〜６０時
間までの間にペリスタポンプで連続添加した。それ以外
は実施例１と同様の培地・条件で培養を行い、分析を行
った。その結果を表２に示す。
【００３８】
【表２】
【００３９】この結果から、ヘキサン酸の割合が０〜４
ｗ／ｖ％に増加するにしたがって、３ＨＨモル分率が
８．１〜３２ｍｏｌ％に増加することが分かった。
ｗ／ｖ％に増加するにしたがって、３ＨＨモル分率が
８．１〜３２ｍｏｌ％に増加することが分かった。
【００４０】（実施例３）炭素源としてヤシ油４ｗ／ｖ
％とヘキサン酸トリグリセリド（ＨＴＧ）１ｗ／ｖ％と
を用いた。ヤシ油のみの場合は５ｗ／ｖ％添加した。実
施例１と同様の培地を使用し、１．８Ｌの生産培地を入
れた３Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製Ｍ
ＤＬ−３００型）を用い培養を行った。運転条件は培養
温度３０℃、攪拌速度５５０ｒｐｍ、通気量１．８Ｌ／
ｍｉｎとし、ｐＨを６．６から６．８の間で５規定の硫
酸と水酸化ナトリウムとでコントロールした。接種時に
ヤシ油を０．５ｗ／ｖ％添加し、残りのヤシ油とＨＴＧ
とは混合して３等分し、接種後２４、３６、４８時間に
添加した。培養は７２時間まで行った。遠心分離によっ
て菌体を回収し、メタノールで洗浄後、凍結乾燥し、乾
燥菌体重量を測定した。実施例１と同様の分析を行っ
た。その結果を表３に示す。
％とヘキサン酸トリグリセリド（ＨＴＧ）１ｗ／ｖ％と
を用いた。ヤシ油のみの場合は５ｗ／ｖ％添加した。実
施例１と同様の培地を使用し、１．８Ｌの生産培地を入
れた３Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製Ｍ
ＤＬ−３００型）を用い培養を行った。運転条件は培養
温度３０℃、攪拌速度５５０ｒｐｍ、通気量１．８Ｌ／
ｍｉｎとし、ｐＨを６．６から６．８の間で５規定の硫
酸と水酸化ナトリウムとでコントロールした。接種時に
ヤシ油を０．５ｗ／ｖ％添加し、残りのヤシ油とＨＴＧ
とは混合して３等分し、接種後２４、３６、４８時間に
添加した。培養は７２時間まで行った。遠心分離によっ
て菌体を回収し、メタノールで洗浄後、凍結乾燥し、乾
燥菌体重量を測定した。実施例１と同様の分析を行っ
た。その結果を表３に示す。
【００４１】
【表３】
【００４２】この結果から、炭素源の一部をＨＴＧに変
更すると３ＨＨモル分率が向上することが分かった。
更すると３ＨＨモル分率が向上することが分かった。
【００４３】（実施例４）実施例１と同じ培地、ジャー
ファーメンターを使用し、同じ運転条件で培養を行っ
た。炭素源はヤシ油４ｗ／ｖ％にヘキサン酸０．５ｗ／
ｖ％またはオクタン酸０．５ｗ／ｖ％を混ぜて実施例１
と同様に連続添加した。ヤシ油のみの場合は５ｗ／ｖ％
添加した。分析結果を表４に示す。
ファーメンターを使用し、同じ運転条件で培養を行っ
た。炭素源はヤシ油４ｗ／ｖ％にヘキサン酸０．５ｗ／
ｖ％またはオクタン酸０．５ｗ／ｖ％を混ぜて実施例１
と同様に連続添加した。ヤシ油のみの場合は５ｗ／ｖ％
添加した。分析結果を表４に示す。
【００４４】
【表４】
【００４５】この結果から、添加する脂肪酸を変えるこ
とで、３ＨＨモル分率の異なるポリマーが得られた。
とで、３ＨＨモル分率の異なるポリマーが得られた。
【００４６】
【発明の効果】本発明により、生分解性ポリマーである
Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）共重合体を、物性を大きく
変化させる３ＨＨモル分率を１〜４０ｍｏｌ％の範囲で
任意に制御して、高い生産性かつ安定して生産すること
が可能となり、応用範囲の広い本ポリマーを提供できる
ようになる。
Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）共重合体を、物性を大きく
変化させる３ＨＨモル分率を１〜４０ｍｏｌ％の範囲で
任意に制御して、高い生産性かつ安定して生産すること
が可能となり、応用範囲の広い本ポリマーを提供できる
ようになる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｐ 7/62 Ｃ１２Ｒ 1:05） Ｃ１２Ｒ 1:05） Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 小田原 修 兵庫県高砂市西畑１丁目13番１−303 (72)発明者 松本 圭司 兵庫県西宮市大森町11−33 (72)発明者 土肥 義治 埼玉県和光市広沢２番１号 理化学研究所 内 Ｆターム(参考） 4B024 AA03 BA80 CA03 DA05 EA04 GA11 4B064 AD83 CA02 CA19 CB03 CC24 CD07 DA16 4B065 AA10Y AA12X AB01 AC14 BA02 BB08 CA12 CA60
Claims (7)
- 【請求項１】 微生物を用いて、下記式（１）で示され
る３−ヒドロキシ酪酸と下記式（２）で示される３−ヒ
ドロキシヘキサン酸とを共重合してなる共重合ポリエス
テルＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を生産する方法であっ
て、少なくとも２種の炭素源として、炭素数の異なる油
脂の組み合わせ、炭素数の異なる脂肪酸の組み合わせ、
又は、炭素数の異なる油脂と脂肪酸との組み合わせのい
ずれかを用いることによって、３ＨＨモル分率の異なる
ポリエステルを採取することを特徴とするポリエステル
の製造方法。 【化１】 【化２】 - 【請求項２】 炭素源として用いる油脂または脂肪酸の
添加量を変えることによって、３ＨＨモル分率を制御す
る、請求項１記載のポリエステルの製造方法。 - 【請求項３】 前記油脂がヤシ油、パーム油、パーム核
油及びヘキサン酸トリグリセリドからなる群より選択さ
れる油脂である請求項１又は２記載のポリエステルの製
造方法。 - 【請求項４】 前記脂肪酸が炭素数が６〜１０である飽
和または不飽和脂肪酸、その脂肪酸エステル及び脂肪酸
塩からなる群より選択される脂肪酸である請求項１又は
２記載のポリエステルの製造方法。 - 【請求項５】 前記ポリエステルの３ＨＨモル分率が１
〜４０ｍｏｌ％であることを特徴とする請求項１〜４の
いずれか１項に記載のポリエステルの製造方法。 - 【請求項６】 前記微生物がアエロモナス・キャビエ
（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ）より単離された
ポリエステル重合酵素遺伝子を含む組換えベクターによ
り、形質転換された微生物である請求項１〜５のいずれ
か１項に記載のポリエステルの製造方法。 - 【請求項７】 前記微生物がＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ
ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏ
ｐｈａ）であることを特徴とする請求項１〜６のいずれ
か１項に記載のポリエステルの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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Cited By (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004033701A1 (ja) | 2002-10-10 | 2004-04-22 | Kaneka Corporation | 共重合ポリエステルの生産方法 |
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| WO2004041936A1 (ja) | 2002-11-08 | 2004-05-21 | Kaneka Corporation | 生分解性ポリエステル水性分散液およびその製造方法 |
| WO2005049691A1 (ja) | 2003-11-21 | 2005-06-02 | Kaneka Corporation | ポリヒドロキシアルカノエート結晶の製造方法 |
| WO2008010296A1 (en) | 2006-07-21 | 2008-01-24 | Kaneka Corporation | Microorganism with replaced gene and process for producing polyester using the same |
| US7384766B2 (en) | 2006-07-26 | 2008-06-10 | Kaneka Corporation | Gene-substituted microorganisms, and production method of polyesters using the same |
| WO2009145164A1 (ja) | 2008-05-26 | 2009-12-03 | 株式会社カネカ | 改良されたポリヒドロキシアルカノエート生産微生物及びそれを用いたポリヒドロキシアルカノエートの製造方法 |
| WO2010113497A1 (ja) * | 2009-03-31 | 2010-10-07 | 株式会社カネカ | 微生物の培養方法、及び微生物による物質の製造方法 |
| EP1609868A4 (en) * | 2003-01-20 | 2011-05-25 | Kaneka Corp | PROCESS FOR COLLECTING VERY PURE POLYHYDROXYALCANOATE FROM MICROBIAL CELLS |
| WO2015115619A1 (ja) | 2014-01-31 | 2015-08-06 | 株式会社カネカ | Ｒ体特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の発現が調節された微生物及びそれを用いたポリヒドロキシアルカノエート共重合体の製造方法 |
| WO2019142845A1 (ja) | 2018-01-17 | 2019-07-25 | 株式会社カネカ | 高組成比率の３ｈｈモノマー単位を含む共重合ｐｈａを生産する形質転換微生物およびそれによるｐｈａの製造方法 |
| US10829793B2 (en) | 2016-07-26 | 2020-11-10 | Kaneka Corporation | Transformant that produces copolymerized PHA containing 3HH unit, and method for producing said PHA |
| WO2021153250A1 (ja) | 2020-01-29 | 2021-08-05 | 株式会社カネカ | 生分解性ポリエステル溶液およびその利用 |
| WO2021256381A1 (ja) | 2020-06-16 | 2021-12-23 | 日本製紙株式会社 | 塗工紙 |
| WO2025211413A1 (ja) * | 2024-04-04 | 2025-10-09 | 株式会社クラレ | 樹脂組成物 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0593049A (ja) * | 1991-09-17 | 1993-04-16 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | 共重合体およびその製造方法 |
-
2000
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Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0593049A (ja) * | 1991-09-17 | 1993-04-16 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | 共重合体およびその製造方法 |
Cited By (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004033670A1 (ja) | 2002-10-10 | 2004-04-22 | Kaneka Corporation | 共重合ポリエステルの組成をコントロールする培養方法 |
| US7235621B2 (en) | 2002-10-10 | 2007-06-26 | Kaneka Corporation | Process for producing copolyester |
| EP1557470A4 (en) * | 2002-10-10 | 2010-06-02 | Kaneka Corp | PROCESS FOR PRODUCING COPOLYESTER |
| WO2004033701A1 (ja) | 2002-10-10 | 2004-04-22 | Kaneka Corporation | 共重合ポリエステルの生産方法 |
| WO2004041936A1 (ja) | 2002-11-08 | 2004-05-21 | Kaneka Corporation | 生分解性ポリエステル水性分散液およびその製造方法 |
| EP1609868A4 (en) * | 2003-01-20 | 2011-05-25 | Kaneka Corp | PROCESS FOR COLLECTING VERY PURE POLYHYDROXYALCANOATE FROM MICROBIAL CELLS |
| WO2005049691A1 (ja) | 2003-11-21 | 2005-06-02 | Kaneka Corporation | ポリヒドロキシアルカノエート結晶の製造方法 |
| EP1688450A4 (en) * | 2003-11-21 | 2007-02-28 | Kaneka Corp | PROCESS FOR PREPARING POLYHYDROALKANOATE CRYSTAL |
| WO2008010296A1 (en) | 2006-07-21 | 2008-01-24 | Kaneka Corporation | Microorganism with replaced gene and process for producing polyester using the same |
| US7384766B2 (en) | 2006-07-26 | 2008-06-10 | Kaneka Corporation | Gene-substituted microorganisms, and production method of polyesters using the same |
| WO2009145164A1 (ja) | 2008-05-26 | 2009-12-03 | 株式会社カネカ | 改良されたポリヒドロキシアルカノエート生産微生物及びそれを用いたポリヒドロキシアルカノエートの製造方法 |
| CN102325883A (zh) * | 2009-03-31 | 2012-01-18 | 株式会社钟化 | 微生物的培养方法及利用微生物制造物质的方法 |
| CN102325883B (zh) * | 2009-03-31 | 2014-07-30 | 株式会社钟化 | 微生物的培养方法及利用微生物制造物质的方法 |
| JP5696036B2 (ja) * | 2009-03-31 | 2015-04-08 | 株式会社カネカ | 微生物の培養方法、及び微生物による物質の製造方法 |
| EP2418277B1 (en) * | 2009-03-31 | 2018-06-27 | Kaneka Corporation | METHOD FOR CULTURING MICROORGANISM, AND PROCESS FOR PRODUCING PHAs WITH MICROORGANISM |
| WO2010113497A1 (ja) * | 2009-03-31 | 2010-10-07 | 株式会社カネカ | 微生物の培養方法、及び微生物による物質の製造方法 |
| US10533197B2 (en) | 2009-03-31 | 2020-01-14 | Kaneka Corporation | Method for culturing microorganism, and process for producing substance with microorganism |
| WO2015115619A1 (ja) | 2014-01-31 | 2015-08-06 | 株式会社カネカ | Ｒ体特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の発現が調節された微生物及びそれを用いたポリヒドロキシアルカノエート共重合体の製造方法 |
| US10072255B2 (en) | 2014-01-31 | 2018-09-11 | Kaneka Corporation | Microorganism having regulated expression of (R)-specific enoyl-coa hydratase gene and method for producing polyhydroxyalkanoate copolymer using same |
| US10829793B2 (en) | 2016-07-26 | 2020-11-10 | Kaneka Corporation | Transformant that produces copolymerized PHA containing 3HH unit, and method for producing said PHA |
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