JP2001169778A - 迅速細菌遺伝子検査法及びキット - Google Patents
迅速細菌遺伝子検査法及びキットInfo
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Landscapes
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Abstract
(57)【要約】
【課題】ＤＮＡ検出を利用した細菌同定を、ＰＣＲ法を
応用して迅速に行える細菌遺伝子検査法及びキットを提
供する。 【解決手段】高感度、高速ＰＣＲを行えるＤＮＡポリメ
ラーゼ、細菌からＤＮＡを抽出することなくＰＣＲを行
えるＰＣＲ用緩衝液及び細菌遺伝子検出用、薬剤耐性遺
伝子検出用、あるいは毒素産生遺伝子検出用プライマー
を必須成分とする検査液を用いてＰＣＲ法を応用し、採
取した検体から細菌の培養、ＤＮＡの抽出・定量を行う
ことなく、細菌同定、薬剤耐性菌同定、及び毒素産生菌
同定を迅速に行える迅速細菌遺伝子検査法及びキット。
応用して迅速に行える細菌遺伝子検査法及びキットを提
供する。 【解決手段】高感度、高速ＰＣＲを行えるＤＮＡポリメ
ラーゼ、細菌からＤＮＡを抽出することなくＰＣＲを行
えるＰＣＲ用緩衝液及び細菌遺伝子検出用、薬剤耐性遺
伝子検出用、あるいは毒素産生遺伝子検出用プライマー
を必須成分とする検査液を用いてＰＣＲ法を応用し、採
取した検体から細菌の培養、ＤＮＡの抽出・定量を行う
ことなく、細菌同定、薬剤耐性菌同定、及び毒素産生菌
同定を迅速に行える迅速細菌遺伝子検査法及びキット。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ＰＣＲ法を応用し
て迅速に細菌遺伝子を検査する方法及びキットに関する
ものである。更に詳しくは、細菌遺伝子、薬剤耐性菌及
び毒素産生菌遺伝子などの細菌同定を、細菌・細胞培養
を行うことなく、ＤＮＡ検出を利用して迅速に行う検査
方法およびキットに関する。
て迅速に細菌遺伝子を検査する方法及びキットに関する
ものである。更に詳しくは、細菌遺伝子、薬剤耐性菌及
び毒素産生菌遺伝子などの細菌同定を、細菌・細胞培養
を行うことなく、ＤＮＡ検出を利用して迅速に行う検査
方法およびキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】細菌同定や薬剤耐性菌同定及び毒素産生
菌同定の方法として、細菌遺伝子を検査する場合には採
取した検体の細菌・細胞培養を行った後、細菌を検出
し、該細菌からＤＮＡの抽出と定量工程を経てＰＣＲを
実施した後、電気泳動を行い、得られたゲルを試薬にて
染色して遺伝子のバンドを観察すると言う方法が採られ
ており、通常、検査には１乃至２週間の時間と労力を要
し、また、熟練した高度専門技術を要するものであっ
た。
菌同定の方法として、細菌遺伝子を検査する場合には採
取した検体の細菌・細胞培養を行った後、細菌を検出
し、該細菌からＤＮＡの抽出と定量工程を経てＰＣＲを
実施した後、電気泳動を行い、得られたゲルを試薬にて
染色して遺伝子のバンドを観察すると言う方法が採られ
ており、通常、検査には１乃至２週間の時間と労力を要
し、また、熟練した高度専門技術を要するものであっ
た。
【０００３】細菌同定の手段として、細菌遺伝子の検査
を迅速に、かつ、簡易に行う検査方法やキットが種々検
討されて、種々開示されている。
を迅速に、かつ、簡易に行う検査方法やキットが種々検
討されて、種々開示されている。
【０００４】細菌同定を迅速に行う方法として、特開平
９−９４１００には細菌の１６ＳリボゾームＲＮＡ遺伝
子に存在する特異な塩基配列を有するＤＮＡをプライマ
ーとして被同定細菌から得た染色体ＤＮＡを鋳型とした
ＰＣＲ法を適用し、用いたプライマーの塩基配列を含む
特定のＤＮＡを増幅するか否かで細菌属又はグループの
決定を行う方法が開示されている。
９−９４１００には細菌の１６ＳリボゾームＲＮＡ遺伝
子に存在する特異な塩基配列を有するＤＮＡをプライマ
ーとして被同定細菌から得た染色体ＤＮＡを鋳型とした
ＰＣＲ法を適用し、用いたプライマーの塩基配列を含む
特定のＤＮＡを増幅するか否かで細菌属又はグループの
決定を行う方法が開示されている。
【０００５】細菌の簡易同定方法及び同定キットとし
て、特開平６−１１３８９９には酪酸菌から染色体ＤＮ
Ａを抽出し、次いでｒＲＮＡ遺伝子を特異なプライマー
を用いるＰＣＲ法により増幅させ、増幅したｒＤＮＡ断
片の長さを電気泳動により解析、比較することからなる
酪酸菌の簡易同定方法を開示している。
て、特開平６−１１３８９９には酪酸菌から染色体ＤＮ
Ａを抽出し、次いでｒＲＮＡ遺伝子を特異なプライマー
を用いるＰＣＲ法により増幅させ、増幅したｒＤＮＡ断
片の長さを電気泳動により解析、比較することからなる
酪酸菌の簡易同定方法を開示している。
【０００６】また、極めて少数の細胞でのｍＲＮＡの定
量を行う方法として、特開平７−２３１９７には遺伝子
のイントロンを含まない部分由来の検出対象のｍＲＮＡ
から合成されたｃＤＮＡを、該ｃＤＮＡに対応する部分
の染色体ＤＮＡと共に増幅させる方法が開示されてい
る。
量を行う方法として、特開平７−２３１９７には遺伝子
のイントロンを含まない部分由来の検出対象のｍＲＮＡ
から合成されたｃＤＮＡを、該ｃＤＮＡに対応する部分
の染色体ＤＮＡと共に増幅させる方法が開示されてい
る。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、特開平
９−９４１００に開示された方法はすべての細菌を検出
できるプライマーを設計したことに特徴があり、ＰＣＲ
法を用いれば迅速に細菌の同定が可能で、取り立てて迅
速検査方法とは言えない。
９−９４１００に開示された方法はすべての細菌を検出
できるプライマーを設計したことに特徴があり、ＰＣＲ
法を用いれば迅速に細菌の同定が可能で、取り立てて迅
速検査方法とは言えない。
【０００８】特開平６−１１３８９９や特開平７−２３
１９７には高度の熟練技術を必要とせず、また、少数の
試料から同定する方法が開示されているが、それらは特
定の菌に関するものであり、種々の検体からＤＮＡ検出
を利用して細菌同定や薬剤耐性菌同定を極めて短時間に
行う方法を示したものではない。
１９７には高度の熟練技術を必要とせず、また、少数の
試料から同定する方法が開示されているが、それらは特
定の菌に関するものであり、種々の検体からＤＮＡ検出
を利用して細菌同定や薬剤耐性菌同定を極めて短時間に
行う方法を示したものではない。
【０００９】ＤＮＡ検出を利用して病院の外来などで種
々の細菌の同定や結核菌などの薬剤耐性菌同定を極めて
短時間に、高度の熟練技術を必要とせず、しかも感度良
く検査する方法は感染症診断の一助となるものであり、
その技術開発は各方面から待たれている。
々の細菌の同定や結核菌などの薬剤耐性菌同定を極めて
短時間に、高度の熟練技術を必要とせず、しかも感度良
く検査する方法は感染症診断の一助となるものであり、
その技術開発は各方面から待たれている。
【００１０】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に発明者らは鋭意研究の結果、微量な細菌遺伝子を、Ｐ
ＣＲ法を応用して迅速に検出し、感染症診断の一助とす
る画期的な検査方法及びキットを開発するに至った。
に発明者らは鋭意研究の結果、微量な細菌遺伝子を、Ｐ
ＣＲ法を応用して迅速に検出し、感染症診断の一助とす
る画期的な検査方法及びキットを開発するに至った。
【００１１】本発明は、高感度で高速反応性のあるＤＮ
Ａポリメラーゼ、細菌遺伝子検出用、薬剤耐性遺伝子検
出用、あるいは毒素産生遺伝子検出用プライマー及び細
菌のＤＮＡを抽出することなくＰＣＲを可能としたＰＣ
Ｒ緩衝液を必須成分とし、８−Ｍｅｔｈｏｘｙｐｓｏｒ
ａｌｅｎを添加して検査液となし、紫外線処理を行った
後、該検査液に採取した検体を添加してＰＣＲを行って
細菌遺伝子を検出するもので、細菌の培養、菌体からの
ＤＮＡの抽出、定量作業を省略することにより、遺伝子
の人為的な喪失がなく、また、作業者の習熟度による結
果変動がない、高感度で迅速な細菌遺伝子の検査法及び
キットに関するものである。
Ａポリメラーゼ、細菌遺伝子検出用、薬剤耐性遺伝子検
出用、あるいは毒素産生遺伝子検出用プライマー及び細
菌のＤＮＡを抽出することなくＰＣＲを可能としたＰＣ
Ｒ緩衝液を必須成分とし、８−Ｍｅｔｈｏｘｙｐｓｏｒ
ａｌｅｎを添加して検査液となし、紫外線処理を行った
後、該検査液に採取した検体を添加してＰＣＲを行って
細菌遺伝子を検出するもので、細菌の培養、菌体からの
ＤＮＡの抽出、定量作業を省略することにより、遺伝子
の人為的な喪失がなく、また、作業者の習熟度による結
果変動がない、高感度で迅速な細菌遺伝子の検査法及び
キットに関するものである。
【００１２】本発明では検体から細菌の検出を行う場合
にはＤＮＡポリメラーゼ内に混入している大腸菌ＤＮＡ
を除去する目的で検査液に８−Ｍｅｔｈｏｘｙｐｓｏｒ
ａｌｅｎを添加して紫外線ランプを用いてソラレン・紫
外線処理を約２分間行い、続いてＰＣＲを行うが、細菌
由来の遺伝子を検出する場合以外にはソラレン・紫外線
処理を行う必要がない。
にはＤＮＡポリメラーゼ内に混入している大腸菌ＤＮＡ
を除去する目的で検査液に８−Ｍｅｔｈｏｘｙｐｓｏｒ
ａｌｅｎを添加して紫外線ランプを用いてソラレン・紫
外線処理を約２分間行い、続いてＰＣＲを行うが、細菌
由来の遺伝子を検出する場合以外にはソラレン・紫外線
処理を行う必要がない。
【００１３】本発明の特徴の一つである、高感度、高速
ＰＣＲを行うためのＤＮＡポリメラーゼとしては宝酒造
（株）製のＴＡＫＡＲＡ ｚ−ＴａｑＤＮＡポリメラー
ゼが有用であり、また、細菌からＤＮＡの抽出作業を行
うことなくＰＣＲを可能としたＰＣＲ緩衝液としては
（株）島津製作所製のＳＨＩＭＡＤＺＵ Ａｍｐｄｉｒ
ｅｃｔが有用であるが、本発明はそれに限定されるもの
ではない。
ＰＣＲを行うためのＤＮＡポリメラーゼとしては宝酒造
（株）製のＴＡＫＡＲＡ ｚ−ＴａｑＤＮＡポリメラー
ゼが有用であり、また、細菌からＤＮＡの抽出作業を行
うことなくＰＣＲを可能としたＰＣＲ緩衝液としては
（株）島津製作所製のＳＨＩＭＡＤＺＵ Ａｍｐｄｉｒ
ｅｃｔが有用であるが、本発明はそれに限定されるもの
ではない。
【００１４】本発明は、薬剤耐性遺伝子プライマーを設
計することにより、最適抗生物質の推定が可能となり、
また、毒素産生遺伝子検出用プライマーを設計すること
により、Ｏ１５７のごとき毒素産生菌についても検出し
た菌を培地で培養することなく、迅速に検出できる。
計することにより、最適抗生物質の推定が可能となり、
また、毒素産生遺伝子検出用プライマーを設計すること
により、Ｏ１５７のごとき毒素産生菌についても検出し
た菌を培地で培養することなく、迅速に検出できる。
【００１５】本発明は目的に応じたプライマーを用いる
ことにより、ペストなど、診察した経験が無く、病院外
来で診断がつかない疾病についても的確に診断が下せ
る。
ことにより、ペストなど、診察した経験が無く、病院外
来で診断がつかない疾病についても的確に診断が下せ
る。
【００１６】本発明を従来から一般的に行われている細
菌遺伝子を応用した検査法と比較すると、従来法では、
検体を採取して細菌・細胞の培養に１乃至３日、ＤＮＡ
抽出に２乃至５時間、ＤＮＡ定量に１０乃至２０分、Ｐ
ＣＲに２乃至３時間、電気泳動に１０乃至１５分を要し
た。
菌遺伝子を応用した検査法と比較すると、従来法では、
検体を採取して細菌・細胞の培養に１乃至３日、ＤＮＡ
抽出に２乃至５時間、ＤＮＡ定量に１０乃至２０分、Ｐ
ＣＲに２乃至３時間、電気泳動に１０乃至１５分を要し
た。
【００１７】これに対して本発明では、ソラレン・紫外
線処理に２分、ＰＣＲに３０乃至４０分、電気泳動に１
０乃至１５分と非常に時間短縮が可能となる。更に、細
菌の検出を行う場合には高感度、高速ＰＣＲを可能とす
るために使用されるＤＮＡポリメラーゼである、ｚ−Ｔ
ａｑＤＮＡポリメラーゼ内に混入している大腸菌ＤＮＡ
を除去するためにソラレン・紫外線処理が必要である
が、細菌以外の検体の場合には不要なので、一層、迅速
な検査が可能となる。
線処理に２分、ＰＣＲに３０乃至４０分、電気泳動に１
０乃至１５分と非常に時間短縮が可能となる。更に、細
菌の検出を行う場合には高感度、高速ＰＣＲを可能とす
るために使用されるＤＮＡポリメラーゼである、ｚ−Ｔ
ａｑＤＮＡポリメラーゼ内に混入している大腸菌ＤＮＡ
を除去するためにソラレン・紫外線処理が必要である
が、細菌以外の検体の場合には不要なので、一層、迅速
な検査が可能となる。
【００１８】検出された細菌の詳細な種類を正確かつ迅
速に判定する場合には、ＰＣＲで増幅した遺伝子の塩基
配列を、塩基配列決定法あるいはＤＮＡチップを用いて
検査することによって細菌の正確な菌種同定が出来る。
速に判定する場合には、ＰＣＲで増幅した遺伝子の塩基
配列を、塩基配列決定法あるいはＤＮＡチップを用いて
検査することによって細菌の正確な菌種同定が出来る。
【００１９】
【実施例】以下、本発明を実施例にて具体的に説明する
が、本発明は実施例に限定されるものではない。
が、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００２０】
【実施例１】滅菌処理をしたプラスチックチューブに下
記の溶液を作製した。 滅菌蒸留水 ２３μｌ Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ Ａ液 １０μｌ Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ Ｉ液 １０μｌ ＤＮＴＰ（１０ｍＭ） ４μｌ ８−Ｍｅｔｈｏｘｙｐｓｏｒａｌｅｎ液（２．５ｍｇ／ｍｌＤＭＳＯ） ０．５μｌ ｚ−ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ） ０．５μｌ 上記の溶液に３６５ｎｍの紫外線を１ｃｍの距離から２
分間照射する。次に細菌検出用ユニバーサルプライマー
（１０ｐｍｏｌ／μｌ）としてセンスプライマーとアン
チセンスプライマーの各々１μｌを添加して検査液とし
た。
記の溶液を作製した。 滅菌蒸留水 ２３μｌ Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ Ａ液 １０μｌ Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ Ｉ液 １０μｌ ＤＮＴＰ（１０ｍＭ） ４μｌ ８−Ｍｅｔｈｏｘｙｐｓｏｒａｌｅｎ液（２．５ｍｇ／ｍｌＤＭＳＯ） ０．５μｌ ｚ−ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ） ０．５μｌ 上記の溶液に３６５ｎｍの紫外線を１ｃｍの距離から２
分間照射する。次に細菌検出用ユニバーサルプライマー
（１０ｐｍｏｌ／μｌ）としてセンスプライマーとアン
チセンスプライマーの各々１μｌを添加して検査液とし
た。
【００２１】採取した液体検体は直接、それ以外の検体
は蒸留水などに溶解あるいは分散させ、その１μｌを前
記検査液に添加して試験検体を作製した。この場合、採
取した検体の前処理は不要である。試験検体をサーマル
サイクラーに設置し、９８℃／１秒、６８℃／１０秒の
ＰＣＲプロトコールを３０回実行した。
は蒸留水などに溶解あるいは分散させ、その１μｌを前
記検査液に添加して試験検体を作製した。この場合、採
取した検体の前処理は不要である。試験検体をサーマル
サイクラーに設置し、９８℃／１秒、６８℃／１０秒の
ＰＣＲプロトコールを３０回実行した。
【００２２】ＰＣＲした試験検体の８μｌを採取し、エ
チジウムブロマイド含有１％アガロースゲルで１００Ｖ
／１５分間の電気泳動を行った。電気泳動終了後のゲル
に紫外線を照射し、エチジウムブロマイドで染色された
遺伝子のバンドを観察し、バンドの出現したものを陽性
と判定した。
チジウムブロマイド含有１％アガロースゲルで１００Ｖ
／１５分間の電気泳動を行った。電気泳動終了後のゲル
に紫外線を照射し、エチジウムブロマイドで染色された
遺伝子のバンドを観察し、バンドの出現したものを陽性
と判定した。
【００２３】
【実施例２】細菌の菌種を同定するために、本発明の方
法で増幅したＰＣＲ産物を直接シークエンス反応に用い
て該細菌の塩基配列を決定した。また、本発明の方法の
ＰＣＲ溶液中にシークエンスプライマーを加え、増幅反
応とシークエンス反応を同時に行い、所要時間の短縮を
可能とした。
法で増幅したＰＣＲ産物を直接シークエンス反応に用い
て該細菌の塩基配列を決定した。また、本発明の方法の
ＰＣＲ溶液中にシークエンスプライマーを加え、増幅反
応とシークエンス反応を同時に行い、所要時間の短縮を
可能とした。
【００２４】
【実施例３】ＤＮＡチップを用いて細菌の菌種を同定す
るために、各菌種に特異的なプローブを必要数だけＤＮ
Ａチップ上に固定し、本発明の方法で増幅したＰＣＲ産
物をＤＮＡチップ上にハイブリダイズ反応させた。ＰＣ
Ｒ産物とハイブリダイズしたプローブが菌種と同定され
た。
るために、各菌種に特異的なプローブを必要数だけＤＮ
Ａチップ上に固定し、本発明の方法で増幅したＰＣＲ産
物をＤＮＡチップ上にハイブリダイズ反応させた。ＰＣ
Ｒ産物とハイブリダイズしたプローブが菌種と同定され
た。
【００２５】
【発明の効果】本発明は、目的に応じたプライマーを用
いることにより、さまざまな細菌遺伝子の迅速な検出へ
の応用が可能である。各種細菌ＤＮＡプライマーを設計
すれば感染症の特定が可能であり、また、薬剤耐性遺伝
子のプライマーを設計すれば最適抗生物質の特定が可能
となる。
いることにより、さまざまな細菌遺伝子の迅速な検出へ
の応用が可能である。各種細菌ＤＮＡプライマーを設計
すれば感染症の特定が可能であり、また、薬剤耐性遺伝
子のプライマーを設計すれば最適抗生物質の特定が可能
となる。
フロントページの続き (72)発明者 大島 譲二 埼玉県熊谷市久保島1785−２ Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 CA09 HA14 4B063 QA01 QA18 QQ06 QQ42 QR08 QR32 QR56 QR62 QR82 QS20 QS25 QS34 QX04
Claims (3)
- 【請求項１】高感度、高速ＰＣＲを可能とするＤＮＡポ
リメラーゼ、細菌遺伝子検出用、薬剤耐性遺伝子検出
用、あるいは毒素産生遺伝子検出用プライマー及びＤＮ
Ａを抽出することなくＰＣＲを可能とするＰＣＲ用緩衝
液を必須成分とし、８−Ｍｅｔｈｏｘｙｐｓｏｒａｌｅ
ｎを添加して検査液となし、紫外線処理を行った後、該
検査液に採取した検体を添加してＰＣＲを行うことを特
徴とするＰＣＲ法を応用した迅速細菌遺伝子検査法。 - 【請求項２】上記ＰＣＲで増幅した遺伝子の塩基配列
を、塩基配列決定法あるいはＤＮＡチップを用いて検査
し、細菌の詳細な種類を迅速に決定することを特徴とす
る請求項１に記載の迅速細菌遺伝子検査法。 - 【請求項３】高感度、高速ＰＣＲを可能とするＤＮＡポ
リメラーゼ、細菌遺伝子検出用、薬剤耐性遺伝子検出
用、あるいは毒素産生遺伝子検出用プライマー及びＤＮ
Ａを抽出することなくＰＣＲを可能とするＰＣＲ用緩衝
液を必須成分とし、８−Ｍｅｔｈｏｘｙｐｓｏｒａｌｅ
ｎを添加後、紫外線処理をした検査液からなることを特
徴とする細菌遺伝子を迅速に検出する同定用キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP37668799A JP2001169778A (ja) | 1999-12-17 | 1999-12-17 | 迅速細菌遺伝子検査法及びキット |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP37668799A JP2001169778A (ja) | 1999-12-17 | 1999-12-17 | 迅速細菌遺伝子検査法及びキット |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001169778A true JP2001169778A (ja) | 2001-06-26 |
Family
ID=18507560
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP37668799A Pending JP2001169778A (ja) | 1999-12-17 | 1999-12-17 | 迅速細菌遺伝子検査法及びキット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001169778A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2017518768A (ja) * | 2014-06-13 | 2017-07-13 | キュー−リネア エービー | 微生物の検出及び特徴付け方法 |
| US10995311B2 (en) | 2015-04-24 | 2021-05-04 | Q-Linea Ab | Medical sample transportation container |
| CN113913504A (zh) * | 2021-09-30 | 2022-01-11 | 广西中医药大学 | 一种以三角褐指藻藻细胞为模板无需提取纯化dna的快速pcr检测方法 |
| US11845978B2 (en) | 2016-04-21 | 2023-12-19 | Q-Linea Ab | Detecting and characterizing a microorganism |
-
1999
- 1999-12-17 JP JP37668799A patent/JP2001169778A/ja active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2017518768A (ja) * | 2014-06-13 | 2017-07-13 | キュー−リネア エービー | 微生物の検出及び特徴付け方法 |
| US11505835B2 (en) | 2014-06-13 | 2022-11-22 | Q-Linea Ab | Method for determining the identity and antimicrobial susceptibility of a microorganism |
| US10995311B2 (en) | 2015-04-24 | 2021-05-04 | Q-Linea Ab | Medical sample transportation container |
| US12247192B2 (en) | 2015-04-24 | 2025-03-11 | Q-Linea Ab | Medical sample transportation container |
| US11845978B2 (en) | 2016-04-21 | 2023-12-19 | Q-Linea Ab | Detecting and characterizing a microorganism |
| CN113913504A (zh) * | 2021-09-30 | 2022-01-11 | 广西中医药大学 | 一种以三角褐指藻藻细胞为模板无需提取纯化dna的快速pcr检测方法 |
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