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JP2001029098A - タンパク質溶液からｖｉｉ因子を活性化するプロテアーゼの活性を測定する方法 - Google Patents

タンパク質溶液からｖｉｉ因子を活性化するプロテアーゼの活性を測定する方法

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JP2001029098A
JP2001029098A JP2000174893A JP2000174893A JP2001029098A JP 2001029098 A JP2001029098 A JP 2001029098A JP 2000174893 A JP2000174893 A JP 2000174893A JP 2000174893 A JP2000174893 A JP 2000174893A JP 2001029098 A JP2001029098 A JP 2001029098A
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アネッテ・フォイスナー
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ハンス−アルノルト・シュテール
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 タンパク質溶液から血液凝固VII因子を活性
化させるプロテアーゼ活性の測定方法を提供する。 【解決手段】 この方法において、プロテアーゼおよび
／またはそのプロ酵素を含むタンパク質溶液をプロテア
ーゼに対する抗体を予め結合させた固相とインキュベー
トし、そして固相を洗浄した後それに固定されたプロテ
アーゼおよび／またはそのプロ酵素をそれらの活性の測
定を可能とする試薬とインキュベートする。 【効果】 血液凝固VII因子活性化プロテアーゼを簡便
かつ特異的に測定して疾患の早期検出に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、例えば血漿のよう
な複雑なタンパク質溶液中でVII因子を活性化するプロ
テアーゼを定性および定量測定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ドイツ特許出願199 03 693.4には、すで
に血液凝固VII因子を活性化するプロテアーゼの定性的
および定量的検出をするための試験システムおよび方法
が開示されている。これらは、標識された低分子量ペプ
チド基質の開裂およびこの場合に生じる吸光の光度計に
よる測定を基にする色素産生試験方法および開示されて
いるプロテアーゼの生物学的特性を利用する試験方法を
包含している。これらの方法では、プロテアーゼまたそ
のプロ酵素が、 ａ) 血液凝固VIII／VIIIａまたはＶ／Ｖａ因子を不活
性化する作用または ｂ) 全凝固試験で血液凝固時間を低減する作用または ｃ) プラスミノーゲン活性化因子（activator）を活性
化する作用または ｄ) VII因子を活性化する作用を有している点からみ
て、このものを検出することができる。
【０００３】しかしながら、従前から使用されている測
定方法では、VII因子活性化因子もしもプロテアーゼが
精製または濃縮された状態で存在して場合において、VI
I因子活性化因子の活性の測定に、信頼し得る結果が得
られ、また不純分の阻害効果が測定結果をゆがめること
がない。しかしながら、殊に血漿または組織液のような
極めて複雑なタンパク質混合物は、VII因子活性化因子
の特異的な測定を阻害するか、または少なくとも妨害し
得る多数のタンパク質を含有している。さらには、現在
の知識レベルによると、プロテアーゼは血漿中では特に
プロ酵素として存在し、そのためにその後の活性測定の
ためには活性プロテアーゼを生じる活性化が必要とな
る。
【０００４】VII因子活性化プロテアーゼは、殊に凝固
および繊維素溶解プロセスでの協同作用により、うっ血
の調整に関係する血漿タンパク質である。従って、プロ
テアーゼの機能および生物活性の研究は非常に関心の高
いものである。例えば、遺伝子変異による抗原含量の低
下および／または生物活性の崩壊は血栓症の危険性の増
大を示唆するものである。従って、VII因子活性化プロ
テアーゼの生物活性の一種または二種以上をできるだけ
簡便かつ特異的な方式での測定を可能とする方法を開発
することが目的である。このプロテアーゼの生理学的役
割は未だ明らかになっていないので、この方法は原則と
して多数の活性の測定をなし得るものである。
【０００５】
【課題解決のための手段】これらの必要性が、タンパク
質溶液中血液凝固VII因子を活性化するプロテアーゼの
活性を測定する方法によって満たされることが見い出さ
れた。この方法では、 ・ プロテアーゼおよび／またはそのプロ酵素を含むタ
ンパク質溶液を、プロテアーゼに対する抗体が予め結合
されている固相と共にインキュベートし、そして ・ 固相を洗った後、それに固定されたプロテアーゼお
よび／またはそのプロ酵素をそれらの活性の測定を可能
とする試薬と共にインキュベートする。
【０００６】意外にも、この測定方法はその活性化され
た形態のプロテアーゼに限らず使用し得るものである。
以前の研究結果からプロテアーゼは主にプロ酵素として
血漿中を循環していて、それ故にその生物活性を発現し
得るためには上述した固相に結合した後に初めて活性化
されなければならないと予想されるが、意外なことに
は、このような活性化は必要がないことが見い出され、
ただし血漿から固相に結合されたプロ酵素は活性酵素と
同様に固定化された形態でその生物活性を示すことも見
い出された。これにより、別個の活性化工程は不要であ
り、さらに迅速で、干渉のない測定が可能となる。もっ
とも、結合されたプロ酵素が完全に活性化されたことを
確実にするために、プロ酵素の特異的な活性化を、なお
明らかに追加し得るであろう。
【０００７】適当な固相は当業者に既知のマトリック
ス、例えば活性化Sepharose（登録商標）またはFraktog
el（登録商標）である。マイクロタイタープレートは、
好ましくは、ポリクローナルまたはモノクローナル由来
のプロテアーゼに対する抗体でコーティングされてい
る。抗体断片例えばＦ(ａｂ)またはＦ(ａｂ)2も使用し
得る。検出、次いで定量化のために標識第二抗体を使用
する抗原試験とは異なって、本発明によれば、プロテア
ーゼの活性の測定を可能とする色素産生基質を添加す
る。特に好ましい色素産生基質はChromogenix ABからの
Ｓ２２８８（Ｈ−Ｄ−イソロイシル−Ｌ−プロリル−Ｌ
−アルギニン−ｐＮＡ×２ＨＣｌ）であり、このものは
類似化合物と全く同様に基質のアミド分解に因り吸収に
顕著な濃度−および時間−依存性増大を示す。意外なこ
とには、プロテアーゼは抗体に結合された後でもその生
物活性および特性、すなわち、ＦVIIおよびプラスミノ
ーゲン活性化因子を活性化する能力を保持している。複
雑なタンパク質溶液からプロテアーゼの官能性の特異的
測定がこれにより可能である。
【０００８】色素産生基質に加えて、ドイツ特許出願19
9 03 693.4に記述されているその他の基質も活性測定に
供することができる。すなわち、血液凝固VIII／VIIIａ
またはＶ／Ｖａの不活性化およびＦVIIおよびプラスミ
ノーゲン活性化因子の活性化である。この測定では、例
えば、このようにして活性化されるVII因子の比率がＦV
IIに特異的である色素産生基質の直接アミド分解によ
り、または結合反応例えば所謂ＦVIIa-rＴＦ試験によ
り、測定することができる。単鎖プラスミノーゲン活性
化因子（ｓｃｕＰＡ、単鎖ウロキナーゼプラスミノーゲ
ン活性化因子、またはｓｃｔＰＡ、単鎖組織プラスミノ
ーゲン活性化因子）の活性化は例えばＳ２４４４（pyro
Glu-Gly-Arg-pNA×HCl）の基質反応により簡単にモニタ
ーできる。ドイツ特許出願199 03 693.4に記載の如く、
プロテアーゼの活性を刺激する物質例えば可溶性カルシ
ウム塩および／またはヘパリンまたはヘパリン関連物質
例えば硫酸デキストランを検出のために加えることもで
きる。
【０００９】記載の方法の助けによって溶液、体液およ
び細胞または組織抽出液をさらに検査することにより、
ＦVII活性化プロテアーゼの検出または定量化に対する
適合性が示された。これらのものには、このプロテアー
ゼを含有する溶液例えばプロテアーゼの生産中間体およ
び組み換え発現に適した細胞の醗酵でも得られる細胞培
養上澄液があることを理解すべきである。これらのもの
の中には、プロテアーゼまたはプロ酵素の形質転換生産
で得られる溶液例えば乳があることを理解すべきであ
る。さらに、この方法は、組織または細胞の抽出液中の
ＦVII活性化プロテアーゼの活性を測定するのにも適当
であり、このタンパク質の過剰−または過少発現の場
合、プロテアーゼ活性の存在または潜在的な病態に効果
を生じる。
【００１０】特に関心があるのは、体液例えば血液およ
び血漿、精漿、尿、髄液、気管肺泡洗浄液、羊膜液、唾
液または涙液でのプロテアーゼ活性の検出に対する適用
である。ここでの活性試験に対する有用な補助手段はド
イツ特許出願199 03 693.4に開示されている抗原測定シ
ステム（例えばＥＬＩＳＡ）であり、両方のパラメータ
ーの助けで例えば障害の場合より総合的な状態を得るこ
とができる。
【００１１】健康な血液ドナーの検査において、検査し
た血漿の約５〜１０％は、実施例１にさらに詳述するよ
うに、標準品（プール血漿）と比較して著しく低いプロ
テアーゼ活性（「平均値」の約３０〜５０％）を有して
いたことが目立っていた。この情報は、これらのドナー
全員のうちの大部分の者が正常な範囲の抗原含量を有し
ていた事実によって補足された。このことは、例えば、
血漿試料の抗原含量ではなくて活性に相応して影響する
ヘテロ接合体変異を指示していた。結果として、これら
のドナーはある種の疾患の危険グループであり、必要な
らば、早期に予防措置をとることができる。このことは
活性レベルが増大または低下した人にも適用される。本
発明者らは健康なドナーグループと比較して心筋梗塞に
罹っている患者（実施例２も参照）および安定および不
安定な狭心症に罹っている患者の血漿中のこのプロテア
ーゼ活性が著しく増大（場合によっては正常または若干
増大した抗原含量を有する）したことを見い出した。こ
れまでのところ、プロテアーゼ活性の増大がこの状態の
一因と評価できるかどうか、またはこれがさらには血栓
崩壊の増大の意味で生体の逆反応に対応するかも知れな
いものかどうかはなお判然としていない。
【００１２】プロテアーゼ活性の増大の生理学な関連性
とは別に、このパラメーターは早期検出にむすびつくも
のであり、徴候の変化の判定基準として用いることがで
きる。これにはそれ以上の心臓血管関連の合併症の診断
が含まれる。これらの指摘以外に、記載した試験システ
ム（抗原測定とも組み合わせて）悪性疾患、炎症、自己
免疫疾患、脈管炎、呼吸障害の症例での診断および治療
モニターリング、またはうっ血（凝固および繊維素溶
解）の診断、また敗血症および関連反応例えば播種性血
管内凝固症候群の症例での診断および治療モニターリン
グにも使用することができる。さらにこれ以上の適用領
域には、臓器障害、例えば脳、呼吸器および腎臓の疾患
の診断が包含される。肝硬変に罹っている患者では、本
発明者らは、プロテアーゼの活性が著しく低減している
ことを見い出し、これはほとんどの場合抗原レベルの低
減を伴っていた。
【００１３】それ以上の検査で、健康な妊婦の血漿中で
抗原レベルが適度に増大することに加えて、妊娠の過程
でプロテアーゼ活性の著しい増大が認められ、また第三
のトリメスターで最高値を有することがわかった。この
ようなプロテアーゼの増加がないことは、妊娠中の母体
および胎児にとって例えば早産および流産または胎児の
奇形に至るまで、またこれらを包含する血栓塞栓性合併
症の危険に関連するものである。
【００１４】本発明を以下の実施例によって例示する。 実施例１ マイクロタイタープレート（９６ウエル）をＦVII活性
化因子に対するモノクローナル抗体で各孔に１０μg／m
lからなる溶液１５０μlをピペットで注入することによ
ってコーティングした。室温で１６時間インキュベート
した後、プレートを数回洗った。増加濃度の精製プロテ
アーゼ１００μlまたは種々の希釈度の標準ヒト血漿
（ＳＨＰＬ）を各々の場合孔にピペットで注入した。３
７℃でインキュベートした後、溶液を数回洗って除き、
活性を測定した。プロウロキナーゼ溶液（１０μg／m
l、American Diagnostica, US）５０μlを各孔にピペッ
トで注入し、その時に３０mM ＣａＣｌ2および１００IU
／mlのヘパリンを含む緩衝剤５０μlを入れた。２分後
に、緩衝剤をさらに１００μlおよび基質Ｓ２４４４
（３mM）２５μlを加えた。４０５nmでの毎分の吸収増
大を測定した。
【００１５】
【表１】
【００１６】実施例２ 試料溶液を用いたマイクロタイタープレートのコーティ
ングおよびインキュベーションを実施例１に記載の如く
行った。プロウロキナーゼの活性化に代わって、VII因
子の活性化を測定した。このために、各々の例では、３
０mM ＣａＣl2および１００IU／mlヘパリンを含む緩衝
剤５０μlを室温で２分間プレートの孔に加えた。緩衝
剤をさらに１００μlおよびSpectrozym（登録商標）VII
ａ（３mM，American Diagnostica／US）を加えた後、△
ｍＯＤ／分を測定した。
【００１７】
【表２】
【００１８】これらの希釈系の助けにより、個々の血漿
の比較およびプロテアーゼの官能度を測定することが可
能となる。いくつもの個々の血漿のプールを表している
標準ヒト血漿との比較により、標準からの有意の偏差を
検知することができる。このようにしてわかった活性は
理想的には例えばＥＬＩＳＡによって測定し得る抗原含
量に対する比で設定すべきものである。プロテアーゼ量
が既知であると、プロテアーゼの比活性およびタンパク
質溶液中に含まれるそのプロ酵素を測定することができ
る。
【００１９】実施例３ １９０人の健康ドナーの血漿のプロテアーゼ測定 １４０人が男性で、５０人が女性である１９０人の健康
人のクエン酸塩加血漿について、ここに記載の活性度試
験の助けで検査した。活性がプロテアーゼ抗原レベルの
相当する変化を伴っている全ての検査血漿の平均値とは
潜在的に相異しているか否かを測定するために、ドイツ
特許出願199 03 693.4に記載の如くＥＬＩＳＡを用い
た。抗原としてのプロテアーゼの検出のためのこのＥＬ
ＩＳＡはこのプロテアーゼに対するモノクローナルまた
はポリクローナル特異抗体の助けによって実施し得る。
図(１)は検査健康男性(Ａ)および女性(Ｂ)のプロテアー
ゼ活性を示す。男女共に、５〜１０％が平均値に比べて
顕著に低下した活性を示していることが明らかである。
【００２０】プロテアーゼ活性（ｙ軸）およびこれに属
している対応する人の抗原レベル（ｘ軸）を図示する。
抗原および活性レベルの任意の「正常域」は各例でパラ
メーターの上部および下部限界として水平および垂直の
線で示している。従って、これから生じる長方形は健康
なドナーの「正常域」を表している。活性が低下した試
料の大多数が抗原レベルの対応する低減を伴っていない
ことも特にここでは明瞭である。このことはヘテロ接合
性変異（または数種の）を示し、すなわち、プロテアー
ゼ分子の例えば約５０％が一種または二種以上の変異に
よって修飾され、その結果生物学的基質との反応がそれ
以上保証されなくなる。プロテアーゼの繊維素溶解性の
重要さでは、これは現在のところなお「健康な」集団の
血栓症（またはその他の疾患等）の危険性と関連してい
るが、検査した試料の少数例では、抗原含量の低減と極
めてよく同調している低減プロテアーゼ活性の数値をま
さしく興味あるものとして評価すべきであり、これはプ
ロテアーゼの血漿利用性の不調が存在していることが明
白であることにより、そして記載した如く相当な危険性
と関連し得るものである。従って、抗原測定とも関連し
てプロテアーゼの活性の検出で早期の認識および予防／
治療コントロールのためのパラメーターを知ることがで
きる。
【００２１】実施例４ 妊娠女性の血漿中のプロテアーゼ活性の測定 妊娠女性のクエン酸塩加血漿を実施例３に記載の如く試
験した。試料は妊娠期間中の様々な時点で入手し、次い
で検査した。二通りの問題のない妊娠経過を表１に示
す。妊娠期間と共にプロテアーゼ活性が明らかに増大し
たことが検知され、これと比較して、プロテアーゼの抗
原含量は全く増大しない乃至中程度の増大を示す。この
増大した活性が存在していないことは、母体および胎児
にとっての問題と関連させることができる。一方、健康
な（妊娠していない）女性は相当する観察期間中（示し
ていない）の連続したプロテアーゼ活性の過程（試験の
変動に関して増大も低減もしていない）を示している。
【００２２】
【表３】
【００２３】実施例５ 心筋梗塞血漿中のプロテアーゼ活性の測定 急性心筋梗塞に罹った５４人の患者の血漿を救急病棟へ
の許可を得て（集中治療前）入手し、そして通常の分析
に使用した。その後、血漿残渣（未解凍アリコート）を
プロテアーゼ活性（および抗原含量）の定量に使用し
た。図(２)に検査の結果を要約する。健康なドナー(Ｂ)
のグループと比較して、急性心筋梗塞に罹っている患者
(Ａ)の血漿では、有意により高いプロテアーゼ活性（そ
してまた抗原含量）を測定することができる。
【００２４】従って、これらのパラメーターを梗塞の早
期検知に、すなわち安定および不安定狭心症の場合で
も、使用することができる。これらの冠状心疾患に罹っ
ている患者では、本発明者らは平均して有意に増大した
活性を見い出した。測定値の高さにより、疾患の重篤度
の評価が可能となり、または梗塞および狭心症予防およ
び治療の過程で患者の症状についての貴重な指示を得る
ことができる。さらには、これらのパラメーターは心臓
血管系に関連するその他の合併症の評価に使用すること
もできる。
【図面の簡単な説明】
【図１】検査した健康な男性(Ａ)および女性(Ｂ)のプロ
テアーゼ活性を示す。
【図２】急性心筋梗塞患者(Ａ)および健康なドナー(Ｂ)
のプロテアーゼ活性を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アネッテ・フォイスナー ドイツ連邦共和国デー−35043マルブルク. ランゲヴィーゼンヴェーク10 (72)発明者 ハンス−アルノルト・シュテール ドイツ連邦共和国デー−35093ヴェター. シュールシュトラーセ66

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 プロテアーゼおよび／またはそのプロ酵
    素を含むタンパク質溶液をプロテアーゼに対する抗体が
    予め結合されている固相と共にインキュベートし、そし
    て固相を洗った後、それに固定されたプロテアーゼおよ
    び／またはそのプロ酵素をそれらの活性の測定を可能と
    する試薬と共にインキュベートする、ことを特徴とする
    タンパク質溶液から血液凝固VII因子を活性化するプロ
    テアーゼの活性を測定する方法。
  2. 【請求項２】 プロテアーゼの活性を、色素産生基質に
    対する作用中に生じる吸光を光度計による測定によって
    測定する請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 プロテアーゼの活性を、 ａ) 血液凝固VIII／VIIIａまたはＶ／Ｖａ因子を不活
    性化するその作用または ｂ) 全凝固試験で血液凝固時間を短縮するその作用ま
    たは ｃ) プラスミノーゲン活性化因子を活性化するその作
    用または ｄ) VII因子を活性化するその作用によって測定する請
    求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】 プロテアーゼに対する抗体がポリクロー
    ナルもしくはモノクローナル抗体またはＦ(ａｂ）もし
    くはＦ(ａｂ)2抗体断片である請求項１〜３記載の方
    法。
  5. 【請求項５】 血液凝固VII因子を活性化するプロテア
    ーゼを測定するためのキット。
  6. 【請求項６】 測定するパラメーターが血液凝固VII因
    子を活性化するプロテアーゼである梗塞、または安定も
    しくは不安定狭心症の早期発見のための方法。
  7. 【請求項７】 測定するパラメーターが血液凝固VII因
    子を活性化するプロテアーゼである梗塞の過程または重
    篤度または狭心症の場合の予防および／または治療の結
    果を診断する方法。
  8. 【請求項８】 測定するパラメーターが血液凝固VII因
    子を活性化するプロテアーゼである妊娠をモニターする
    方法。
  9. 【請求項９】 測定するパラメーターが血液凝固VII因
    子を活性化するプロテアーゼである血栓症の危険を早期
    に発見する方法。
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