DE10036641A1 - Monoklonale Antikörper für die den Blutgerinnungsfaktor VII aktivierende Protease (FSAP)und ihre Verwendung - Google Patents
Monoklonale Antikörper für die den Blutgerinnungsfaktor VII aktivierende Protease (FSAP)und ihre VerwendungInfo
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Abstract
Es werden monoklonale Antikörper gegen die den Blutgerinnungsfaktor VII aktivierende Protease beschrieben, die von der Hybridoma-Zelllinie DSM ACC2453 oder der Hybridoma-Zelllinie DSM ACC2454 gebildet werden. Sie können zur Reindarstellung, zum Nachweis und zur Aktivitätsbestimmung der den Blutgerinnungsfaktor VII aktivierenden Protease oder ihres Proenzyms eingesetzt werden.
Description
Gegenstand der Erfindung sind monoklonale Antikörper gegen die den Blutgerin
nungsfaktor VII aktivierende Protease und ihre Verwendung als Immunabsorbens
zur Reinigung, zum Nachweis und zur Bestimmung der Aktivität der genannten
Protease (FSAP).
Seit 1996 ist eine im Plasma vorkommende Protease bekannt, die aufgrund ihre
Eigenschaft, an Hyaluronsäure zu binden, als Plasma Hyaluronean Binding Protein
(= PHBP), bezeichnet wurde (Choi-Miura et al., J. Biochem. 1996; 119: 1157-65).
Diese Protease wurde kurz danach auch in Prothrombin-Konzentraten nachgewie
sen und daraus isoliert (Hunfeld et al., Ann. Hematol. 1998; 76: A101; Hunfeld et
al., FEBS Letters, 1999; 456: 290-94). Eine mögliche biologische Funktion konnte
bis dahin allerdings nicht beschrieben werden. Diese wurde erstmals 1999 mitge
teilt (Römisch et al., Ann. Hematol. 1999; 78: A101; Römisch et al., Ann. Hematol.
1999; 78: A24; Römisch et al. Blood Coagul Fibrinol., 1999; 10: 471-79; Römisch et
al.; Haemostasis 1999; 29: 292-99). In in vitro Untersuchungen wurde gezeigt, dass
die Protease den Gerinnungsfaktor VII und die Einketten-Plasminogenaktivatoren
aktivieren kann. Dagegen werden die Blutgerinnungsfaktoren V und VIII proteoly
tisch degradiert (Deutsche Patentanmeldung 199 03 693.4). Entsprechend dem
Erstbefund wurde die Protease Faktor Sieben Aktivierende Protease oder FSAP
genannt.
Neuere Ergebnisse haben bestätigt, dass FSAP tatsächlich ein Plasmaprotein ist.
Als potentiell in die Regulation der Hämostase, vor allem in Gerinnungs- und Fibri
nolysereaktionen eingreifendes Enzym, ist nicht nur dessen Herstellung und Cha
rakterisierung von Interesse, sondern auch die Quantifizierung von Blutplasma-
Konzentrationen in gesunden Personen und Patienten. Außerdem könnten FSAP-
Konzentrationen in anderen Körperflüssigkeiten oder Zellextrakten Informationen
über potentielle Krankheitszustände geben. Entsprechende Testsysteme, die die
Quantifizierung sowohl des FSAP-Antigengehaltes als auch die Bestimmung seiner
Aktivität ermöglichen, wie Western Blots oder ein Enzym-Immunoassay (ELISA),
wurden bereits beschrieben (Deutsche Patentanmeldungen 199 03 693.4 und 199 26 531.3).
Diese Testsysteme basieren darauf, dass FSAP durch spezifische monoklonale
Antikörper gebunden und/oder detektiert wird. Obwohl bei der Immunisierung
bspw. von Mäusen häufig viele positive Klone bezüglich der Expression eines spe
zifischen monoklonalen Antikörpers identifiziert werden, sind doch nicht selten nur
wenige davon für die vorstehend genannten Fragestellungen geeignet. Es stellte
sich deshalb die Aufgabe, spezifische monoklonale Antikörper gegen die den Blut
gerinnungsfaktor VII aktivierende Protease aufzufinden, die sowohl für ihre Rein
darstellung, als auch für ihren qualitativen und quantitativen Nachweis als auch für
ihre Aktivitätsbestimmung effektiv einsetzbar sind.
Es wurde nun gefunden, dass diesen Anforderungen in hohem Maße monoklonale
Antikörper gegen die den Blutgerinnungsfaktor VII aktivierende Protease gerecht
werden, die von der Hybridomazelllinie DSM ACC2453 und der Hybridomazelllinie
DSM ACC2454 gebildet werden.
Bis vor kurzem wurde FSAP überwiegend in ihrer aktivierten Form gereinigt. Kon
ventionelle Präparationsmethoden, wie säulenchromatografische Techniken, be
günstigten die rasche Aktivierung und anschließende Inaktivierung der Protease.
Erfindungsgemäß ist nun die Reindarstellung der den Blutgerinnungsfaktor VII
aktivierenden Protease und vor allem ihres Proenzyms mit hoher Ausbeute da
durch möglich, dass man einen der vorstehend genannten Antikörper an einen
Träger koppelt, diesen mit einer die Protease oder ihre Proenzym enthaltenden
Flüssigkeit equilibriert, anschließend auswäscht und dann die Protease oder ihr
Proenzym durch Elution gewinnt.
Darüber hinaus eignen sich die genannten Antikörper auch zum Nachweis der den
Blutgerinnungsfaktor VII aktivierenden Protease oder ihres Proenzyms mit einem
Immunoassay, bei dem man
- a) eine Probe, die die Protease oder ihr Proenzym enthalten soll, mit ei nem auf einem festen Träger fixierten ersten erfindungsgemäßen An tikörper inkubiert und auswäscht, dann einen zweiten markierten er findungsgemäßen Antikörper zugibt und abermals auswäscht und das vom zweiten Antikörper oder anderen monklonalen oder polyklonalen Antikörpern hervorgerufene Signal misst; oder
- b) auf einem Träger die in der zu untersuchenden Probe enthaltene Protease oder ihr Proenzym fixiert, beispielsweise durch polyklonale Antikörper gegen die Protease oder ihr Proenzym, und sie mit einem markierten erfindungsgemäßen Antikörper allein oder in Mischung oder mit einem unmarkierten der erfindungsgemäßen Antikörper und anschließendem Nachweis des monoklonalen Antikörpers detektiert oder
- c) einen auf einem Träger fixierten erfindungsgemäßen Antikörper mit einer auf die Protease oder ihr Proenzym zu untersuchenden Probe in Gegenwart einer markierten Protease oder ihres Proenzyms ver setzt und das durch die Markierung hervorgerufene Signal misst.
Eine andere Möglichkeit zum Nachweis der den Blutgerinnungsfaktor VII aktivie
renden Protease oder ihres Proenzyms besteht darin, dass man den Nachweis mit
der Western Blot-Methodik durch eine immunologische Reaktion mit einem mar
kierten erfindungsgemäßen Antikörper allein oder in Mischung oder mit einem un
markierten der erfindungsgemäßen Antikörper und anschließendem Nachweis des
monoklonalen Antikörpers, z. B. durch markiertes Protein A oder G oder einen mar
kierten, gegen den monoklonalen Antikörper gerichteten monoklonalen oder po
lyklonalen Antikörper durchführt.
Schließlich ist es auch möglich, die Aktivität der den Blutgerinnungsfaktor VII akti
vierenden Protease oder ihres Proenzyms in Proteinlösungen dadurch zu bestim
men, dadurch dass man die die Protease und/oder ihr Proenzym enthaltende Pro
teinlösung an einem festen Träger inkubiert, an die zuvor ein gegen die Protease
gerichteter monoklonaler erfindungsgemäßer Antikörper gekoppelt wurde und nach
Auswaschen des festen Trägers die daran fixierte Protease und ihr Proenzym mit
Reagentien inkubiert, die deren Aktivitätsbestimmung erlauben. Die Aktivität der
Protease oder ihres Proenzyms kann dann durch eine photometrische Bestimmung
der bei der Einwirkung auf chromogene Substrate auftretenden Extinktion gemes
sen werden.
Andere Möglichkeiten zur Bestimmung der Aktivität der Protease oder ihres Prote
ins bestehen darin, dass man
- - ihre die Blutgerinnungsfaktoren VIII/VIIIa oder V/Va aktivierende Wir kung oder
- - ihre die Blutgerinnungszeiten verkürzende Wirkung in globalen Ge rinnungstests oder
- - ihre Plasminogenaktivatoren aktivierende Wirkung oder
- - ihre den Blutgerinnungsfaktor VII aktivierende Wirkung misst.
Für die Anwendung in den vorstehend genannten Verfahren eignen sich sowohl die
vollständigen monoklonalen Antikörper als auch deren Fragmente wie F(ab)2 oder
F(ab). Die Antikörper oder ihre Fragmente werden nach Markierung mit einer ra
dioaktiven oder fluoreszierenden oder enzymatisch aktiven Substanz als detektie
rende Hilfsmittel in einem Immunoassay oder in einem Western Blot-Nachweis
verfahren eingesetzt. Die unmarkierten monoklonalen Antikörper oder Fragmente
können ebenfalls eingesetzt werden, jedoch wird dann die Detektion oder Immobi
lisierung z. B. durch einen gegen den Maus-Antikörper gerichteten markierten Anti
körper oder sein markiertes Fragment durchgeführt (Sandwich-Verfahren). Die er
findungsgemäßen monoklonalen Antikörper oder ihre Fragmente können allein
oder als Mischung eingesetzt werden. Dies ist besonders empfehlenswert bei
Western Blots, da SDS-Gelelektrophoresen häufig unter reduzierenden Bedingun
gen der Proben durchgeführt werden. Da die beiden Polypeptidketten der FSAP
lediglich über eine Disulfidbrücke miteinander verbunden sind, zerfällt das Molekül
bei der Reduktion in zwei Ketten, nämlich in die schwere und die leichte Kette, wo
bei die erstere vom monoklonalen Antikörper der DSM ACC2454 und die letztere
vom monoklonalen Antikörper der DSM ACC2453 erkannt wird. Zur Detektion bei
der Ketten sind also die beiden erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper oder
ihre Fragmente erforderlich.
Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper wurden wie folgt hergestellt und
charakterisiert:
Drei weibliche Balb/c-Mäuse (ca. 6 Wochen alt) wurden mit FVIII-aktivator immuni
siert. Die erste Injektion bestand aus 0,2 ml des Antigens (10 µg) gemischt mit 0,2 ml
kompl. Freunds Adjuvans. In den drei folgenden Boost-Injektionen (Abstand
jeweils 2 Wochen) wurde das Antigen (20 µg in 0,2 ml) ohne Adjuvans verabreicht
(alle Injektionen i. p.). Die Verdünnung des Immunogens erfolgte in PBS. Nach der
letzten Injektion wurden die Serum-Titer mittels indirektem ELISA bestimmt, indem
eine Mikrotiterplatte mit FVII-Aktivator beschichtet wurde. Für die Fusion wurde die
Maus mit dem höchsten Serum-Titer ausgewählt.
Etwa drei Wochen nach der letzten Applikation wurde das Antigen an drei aufein
anderfolgenden Tagen verabreicht (10 µg in 0,1 ml i. v.). Am nächsten Tag (Tag 4)
wurde die Maus nach einer Blutentnahme getötet, die Milz entnommen und die
Milzzellen isoliert. Die Milzzellen wurden anschließend mit der murinen Myelom-
Zelllinie SP2/0-Ag 14 fusioniert. Als Fusionsreagenz wurde Polyethylenglykol 4000
(Merck) verwendet. Die Fusion wurde mit einer Modifikation der Original Köh
ler/Milstein-Methode durchgeführt. Die Zellen wurden auf 24 Well-Kulturplatten
verteilt. Als Medium wurde Dulbecco mod. Eagle's Medium mit 10% fötalem Käl
berserum und HAT zur Selektion eingesetzt. Nach etwa zwei Wochen wurden die
gewachsenen Zellclone in die Vertiefungen einer 48 Well-Platte transferiert und
kodiert.
Von 1728 gewachsenen Clonen wurde der Kulturüberstand genommen und mittels
Aktivator wurden Maus IgG positive Überstände auf Spezifität geprüft (ELISA). Von
den getesteten Zelllinien wurden 108 Zelllinien als spezifisch für FVII-Aktivator
identifiziert und kryokonserviert.
Die zwei Hybridoma-Zelllinien mit den Bezeichnungen DSM ACC2453 und DSM
ACC2454 wurden für weitere Untersuchungen ausgewählt. Die Spezifität der von
diesen Zelllinien gebildeten Antikörper wurde mit dem BIACORE bestätigt und die
Bindungskinetik untersucht. Die beiden monoklonalen Antikörper sind vom Typ des
IgG1.
Claims (9)
1. Monoklonale Antikörper gegen die den Blutgerinnungsfaktor VII aktivierende
Protease, dadurch gekennzeichnet, dass sie von der Hybridoma-Zelllinie DSM
ACC2453 oder der Hybridoma-Zelllinie DSM ACC2454 gebildet werden.
2. Verfahren zur Reindarstellung der den Blutgerinnungsfaktor VII aktivieren
den Protease oder ihres Proenzyms, dadurch gekennzeichnet, dass man die
monoklonalen Antikörper von Anspruch 1 allein oder in Mischung an einen Träger
koppelt, diesen mit einer die Protease oder ihr Proenzym enthaltenden Flüssigkeit
equilibriert, anschließend auswäscht und dann die Protease oder ihr Proenzym
durch Elution gewinnt.
3. Verfahren zum Nachweis der den Blutgerinnungsfaktor VII aktivierenden
Protease oder ihres Proenzyms mit einem Immunoassay, dadurch gekennzeich
net, dass man
- a) eine Probe, die die Protease oder ihr Proenzym enthalten soll, mit einem auf einem festen Träger fixierten ersten Antikörper von Anspruch 1 allein oder in Mischung inkubiert und auswäscht, dann einen zweiten, markierten Antikör per zugibt und abermals auswäscht und das vom zweiten Antikörper oder anderen monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern hervorgerufene Signal misst oder
- b) auf einem Träger die in der zu untersuchenden Probe enthaltene Protease oder ihr Proenzym fixiert und sie mit einem markierten Antikörper von An spruch 1 allein oder in Mischung oder mit einem unmarkierten der erfin dungsgemäßen Antikörper und anschließendem Nachweis des monoklona len Antikörpers detektiert oder
- c) einen auf einem Träger fixierten Antikörper von Anspruch 1 allein oder in Mischung mit einer auf die Protease oder ihr Proenzym zu untersuchenden Probe in Gegenwart einer markierten Protease oder ihres Proenzyms ver setzt und das durch die Markierung hervorgerufene Signal misst.
4. Verfahren zum Nachweis der den Blutgerinnungsfaktor VII aktivierenden
Protease oder ihres Proenzyms, dadurch gekennzeichnet, dass man den Nach
weis mit der Western Blot Methodik durch eine immunologische Reaktion mit ei
nem markierten Antikörper von Anspruch 1 allein oder in Mischung oder mit einem
unmarkierten der erfindungsgemäßen Antikörper und anschließendem Nachweis
des monoklonalen Antikörpers durchführt.
5. Verfahren zur Bestimmung der Aktivität der den Blutgerinnungsfaktor VII
aktivierenden Protease oder ihres Proenzyms in Proteinlösungen, dadurch ge
kennzeichnet, dass man
die die Protease und/oder ihr Proenzym enthaltende Proteinlösung an einem festen Träger inkubiert, an die zuvor ein gegen die Protease gerichteter monoklonaler Antikörper von Anspruch 1 allein oder in Mi schung gekoppelt wurde und
nach Auswaschen des festen Trägers die daran fixierte Protease und/oder ihr Proenzym mit Reagentien inkubiert, die deren Aktivi tätsbestimmung erlauben.
die die Protease und/oder ihr Proenzym enthaltende Proteinlösung an einem festen Träger inkubiert, an die zuvor ein gegen die Protease gerichteter monoklonaler Antikörper von Anspruch 1 allein oder in Mi schung gekoppelt wurde und
nach Auswaschen des festen Trägers die daran fixierte Protease und/oder ihr Proenzym mit Reagentien inkubiert, die deren Aktivi tätsbestimmung erlauben.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Aktivität
der Protease oder ihres Proenzyms durch eine photometrische Bestimmung der
Einwirkung auf chromogene Substrate auftretenden Extinktion gemessen wird.
7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Aktivität
der Protease oder ihres Proenzyms gemessen wird durch
ihre die Blutgerinnungsfaktoren VIII/VIIIa oder V/Va inaktivierende Wirkung oder
ihre die Blutgerinnungszeiten verkürzende Wirkung in globalen Ge rinnungstests oder
ihre Plasminogen-Aktivatoren aktivierende Wirkung oder
ihre den FVII aktivierende Wirkung.
ihre die Blutgerinnungsfaktoren VIII/VIIIa oder V/Va inaktivierende Wirkung oder
ihre die Blutgerinnungszeiten verkürzende Wirkung in globalen Ge rinnungstests oder
ihre Plasminogen-Aktivatoren aktivierende Wirkung oder
ihre den FVII aktivierende Wirkung.
8. Verfahren nach den Ansprüchen 5 und 7, dadurch gekennzeichnet, dass
der gegen die Protease oder sein Proenzym gerichtete Antikörper ein F(ab)- oder
ein F(ab)2-Fragment eines Antikörpers von Anspruch 1 ist.
9. Verwendung eines monoklonalen Antikörpers von Anspruch 1 oder seines
F(ab)- oder F(ab)2-Fragments als Immunadsorbens zur Reinigung der den Blutge
rinnungsfaktor VII aktivierenden Protease (= FSAP) oder ihres Proenzyms.
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