JP2001058969A - 一酸化窒素産生抑制剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 人体及び動物に対し有害な作用を示さず、き
わめて安全性が高い一酸化窒素産生抑制剤を提供するこ
とを目的とする。 【解決手段】 インドネシアで伝承生薬として用いられ
てきた学名：Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ ｐａｎｉｃｕ
ｌａｔａ または、学名：Ｃａｅｓａｌｐｉｎｉ ａ ｓ
ａｐｐａｎ の植物体からの溶媒抽出液から、優れた一
酸化窒素産生抑制を有する化合物が単離された下記化合
物。 【効果】かかる化合物を有効成分とする薬剤は、きわめ
て安全性が高く、ショック、低血圧、慢性関節リウマ
チ、潰瘍性大腸炎、虚血性脳障害、腫瘍、インスリン依
存性糖尿病等の治療および／又は予防に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は一酸化窒素産生阻害剤に
関する。さらに詳しくは一酸化窒素合成酵素（Ｎｉｔｒ
ｉｃ Ｏｘｉｄｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ、以下ＮＯＳと略
す）阻害作用を有し、一酸化窒素（Ｎｉｔｒｉｃ Ｏｘ
ｉｄｅ）生成を抑制することにより、一酸化窒素或いは
一酸化窒素の代謝産物の関与が考えられている脳血管障
害、特に、閉塞性脳血管障害の急性期の病態ならびに敗
血症における低血圧に対して有用な化合物を有効成分と
して含有する一酸化窒素産生抑制剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】免疫担当細胞の一つであるマクロファー
ジが多量の硝酸塩を産生するという発見から、一酸化窒
素が生体内で生成されるということが発見された［Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，７
７３８−７７４２ （１９８５）； Ｊ． Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．，１３８，５５０−５６５ （１９８７）］。ま
た、循環器系分野では血管内皮細胞から放出される弛緩
作用を有する物質が発見され、血管内皮由来弛緩因子
（ＥＤＲＦ）と名付けられた。さらに、このＥＤＲＦの
本体が一酸化窒素であることがわかった［Ｎａｔｕｒ
ｅ，３２７，５２４−５２６ （１９８７）］。

【０００３】それ以来、循環器系以外においても、神経
系さらに免疫系など生体内の多くの生理機能における情
報伝達物質としての一酸化窒素の役割が次々に明かにさ
れている。すなわち、神経系では、神経伝達物質として
働き、シナプス可塑性（小脳長期抑圧現象や海馬長期増
強現象）の成立に関与しており[渋木克栄：ＮＯと神経
系の可塑性−小脳長期抑圧の調節．実験医学１１，２４
５１−２４５６，１９９３．]、さらに、免疫系では腫
瘍細胞や病原体に対する生体防御機構において、エフェ
クター細胞として働いているマクロファージから産生さ
れる一酸化窒素の重要性が指摘されている[滝龍雄、中
野昌康：マクロファージにおけるアルギニンおよびその
代謝産物による抗菌抗腫瘍作用．医学のあゆみ１５６，
１９４−１９７，１９９１．]。血管拡張作用に限って
も、ＥＤＲＦとして血管内膜側から作用するだけでな
く、非アドレナリン・非コリン作動性の血管拡張神経の
伝達物質として外膜側からも作用することが証明されて
おり、一酸化窒素が複雑なメカニズムにより種々の生理
機能の調節を行っていることが指摘されている。

【０００４】そして、現在では、循環、免疫、神経系等
広い分野で、一酸化窒素の生理機能や病態との関連が明
らかにされている。そのうち、例えば、体内で常時産生
されている一酸化窒素は、循環動態の恒常性を維持する
重要な役割を担っていることが解明されている。また一
方、敗血症においては、エンドトキシンにより活性化さ
れたサイトカインの働きにより、大量の一酸化窒素が産
生され、これが内皮細胞障害、心筋収縮力低下等のエン
ドトキシンショック状態を引き起こすといわれている。

【０００５】このように生体内で産生されることが明ら
かになった一酸化窒素は、Ｌ−アルギニンを基質として
一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）により生成される。ＮＯ
Ｓには少なくとも非誘導型（血管内皮型および神経型）
および誘導型のアイソザイムが存在する。血管内皮型Ｎ
ＯＳは、主に血管内皮細胞に存在し、細胞内カルシウム
濃度により活性が制御されている。神経型ＮＯＳは、中
枢神経細胞、末梢神経細胞、または膵島β細胞、消化管
神経、副腎髄質、腎臓緻密斑等に存在し、血管内皮型Ｎ
ＯＳと同様に細胞内カルシウム濃度により活性が制御さ
れている。

【０００６】血管内皮型ＮＯＳおよび神経型ＮＯＳ（ｃ
ｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ＮＯＳ、ｃＮＯＳと省略され
る）は細胞内に恒常的に存在し、生理的変化による酵素
量の変化はほとんど見られない。誘導型ＮＯＳ（ｉｎｄ
ｕｃｉｂｌｅ ＮＯＳ、ｉＮＯＳと省略される）は、肝
実質細胞、好中球、マクロファージ、平滑筋、繊維芽細
胞、腎メサンギウム細胞、消化管上皮、膵島β細胞、血
管平滑筋細胞またはグリア細胞等に存在する。これは通
常細胞内で認められず、エンドトキシンや各種サイトカ
イン等による刺激により誘導される。

【０００７】ＮＯＳにより生成される一酸化窒素の作用
は多彩であり、例えば、血管弛緩作用、血小板凝集抑制
作用、粘着抑制、白血球粘着・遊走抑制、交感神経活動
抑制、エンドトキシンショック、エンドトキシン又はサ
イトカインによる低血圧障害、神経細胞間の情報伝達物
質としての作用、虚血性脳細胞障害、抗腫瘍、殺菌作
用、自己免疫疾患、インスリン依存性糖尿病、関節炎、
移植後組織障害、拒絶反応等が挙げられる。

【０００８】生体内での一酸化窒素の生理活性を解析す
る上で、ＮＯＳ阻害剤は有用であり、またショックや虚
血性疾患等の治療薬として用いられる可能性があること
により、近年種々のＮＯＳ阻害剤の開発が現在進められ
ている。例えば、基質競合剤としてアルギニン類似体が
あり、Ｎω−モノメチル−Ｌ−アルギニン（Ｌ−ＮＭＭ
Ａ）、Ｎω−ニトロ−Ｌ−アルギニン（Ｌ−ＮＮＡ）、
Ｎω−アミノ−Ｌ−アルギニン（Ｌ−ＮＡＡ）、Ｎω−
イミノエチル−オルニチン（Ｌ−ＮＩＯ）等がそれに当
たる。また、コファクター（Ｃｏｆａｃｔｏｒ）競合阻
害剤としてジフェニレンヨードニウム（ＤＰＩ）、ジ−
２−チエニルヨードニウム（ＤＴＩ）、カルシニューリ
ン等がある。また、遺伝子転写誘導阻害するものとして
は、コルチコステロイド、ＴＧＦβ、ＩＬ−４、ＩＬ−
１０等が挙げられる。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記代
表例を含む従来公知のＮＯＳ阻害剤は、ｉＮＯＳだけで
なく、ｃＮＯＳをも阻害してしまうものが殆どであり、
これらの治療薬としての利用によれば、恒常的な循環動
態の調節までもが抑制されてしまい、血圧上昇、臓器血
流減少等の副作用を回避することはできない。更に、こ
れらの利用時には、中枢神経系への影響やインポテンツ
等の問題も懸念される。以上のように、従来知られてい
るＮＯＳ阻害剤は、医薬品として評価できるものではな
く、これらに代わって、ｉＮＯＳを選択的に阻害するこ
とのできる一酸化窒素産生抑制作用を有する薬剤の開発
が求められていた。ｉＮＯＳを選択的に阻害する薬剤と
してはデキサメタゾン等の副腎皮質ホルモンが使用され
ているが、これとて重篤な副作用がしばしば患者を悩ま
せ汎用すべき薬物ではありえなかった。副腎皮質ホルモ
ンでなく、副作用の少ない一酸化窒素産生抑制作用を有
する薬剤の開発が求められている。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ｉＮＯＳ
を選択的に阻害することのできる一酸化窒素産生抑制作
用を有する薬剤を見出すべく鋭意検討を行った結果、イ
ンドネシアで伝承生薬として用いられてきた植物の抽出
物から安全性が高くかつ、一酸化窒素産生抑制作用の高
い化合物を見出し本発明を完成した。従って本発明は、
安全性が高く、副作用が少ない新規な一酸化窒素抑制剤
に関する。

【００１１】即ち、本発明は、下記の一般式ＩまたはＩ
Ｉに示される化合物、それらの塩またはそれらの水和物
を有効成分として含有することを特徴とする一酸化窒素
産生抑制剤に関する。

【化５】 [式中、Ｒ₁およびＲ₂は、水素または直鎖状もしくは分
岐鎖状の炭素数１〜６の低級アルキルを表わす。]

【化６】 [式中、Ｒ₃は、水素または単糖類の残基を表わす。] 更に、本発明は、下記の一般式Ｉ’またはＩＩ’に示さ
れる化合物、それらの塩またはそれらの水和物に関す
る。

【化７】 [式中、Ｒ’₁およびＲ’₂は、直鎖状もしくは分岐鎖状
の炭素数１〜６の低級アルキルを表わす。]

【化８】 [式中、Ｒ’₃は、水素を表わす。]

【００１２】

【発明の実施の形態】本発明の一酸化窒素産生抑制剤の
有効成分として用いる一般式Ｉの化合物において、Ｒ₁
およびＲ₂は、水素または直鎖状もしくは分岐鎖状の炭
素数１〜６の低級アルキルを表わす。ここで、直鎖状も
しくは分岐鎖状の炭素数１〜６の低級アルキルとして
は、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピ
ル、ブチル、イソブチル、ペンチル、ヘキシル等を挙げ
ることができる。一般式ＩにおいてＲ ₁およびＲ₂がとも
に水素である化合物は、Buteinと言われる公知化合物で
ある。一般式ＩにおいてＲ₁およびＲ₂がともに直鎖状も
しくは分岐鎖状の炭素数１〜６の低級アルキルである化
合物、即ち一般式Ｉ’で表される化合物は、新規化合物
である。本発明の一酸化窒素産生抑制剤の有効成分とし
て用いる一般式ＩＩの化合物において、Ｒ₃は、水素ま
たは単糖類の残基を表わす。ここで、単糖類の残基とし
ては、例えば、グルコース残基、キシロース残基、ガラ
クトース残基などが挙げられる。一般式ＩＩにおいて、
Ｒ₃がグルコース残基である化合物は、neoandrographol
ideと言われる公知化合物である。一般式ＩＩにおいて
Ｒ₃が水素である化合物、即ち一般式ＩＩ’で表される
化合物は、新規化合物である。本発明では、これらの化
合物は、塩またはそれらの水和物であってもよい。塩と
しては、一般式Ｉの化合物のナトリウム塩、カリウム塩
などが挙げられ、水和物としては、これら塩の水和物が
挙げられる。

【００１３】一般式Ｉで表される化合物は、下記反応ス
キームに示すように、一般式ＩＩＩで表されるアセトフ
ェノン誘導体と、一般式ＩＶで表されるベンズアルデヒ
ド誘導体とを原料とし、これらの化合物をアルカリで縮
合させることにより得ることができる。この反応は公知
の反応であり、詳細な反応条件等は当業者にとって容易
に決定可能なものである。反応スキーム

【化９】 また、一般式ＩにおいてＲ₁およびＲ₂がともにメチル基
である新規化合物（以後Ｃｓ−１と言うこともある）
は、学名：Ｃａｅｓａｌｐｉｎｉａ ｓａｐｐａｎ、イ
ンドネシア名（Ｋａｙａ ｓｅｃａｎｇ）の植物体から
の溶媒抽出法あるいは炭酸ガスを使用する超臨界抽出法
により単離抽出することができる。同様に、一般式ＩＩ
において、Ｒ₃がグルコース残基である化合物（neoandr
ographolide）は、学名：Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ
ｐａｎｉｃｕｌａｔａ インドネシア名（Ｓａｍｂｉ
ｂｏｔｏ））の植物体からの溶媒抽出法あるいは炭酸ガ
スを使用する超臨界抽出法により単離抽出することがで
きる。

【００１４】植物体からの溶媒抽出の場合は、植物をそ
のまま切裁せずに用いても良いが、抽出操作の前に切裁
した植物を用いたほうが抽出時間を短縮できる点でより
好ましい。抽出方法としてはそれ公知の方法が採用でき
る。溶媒による抽出法としては、例えば、原材料に溶媒
を添加して溶媒の還流温度下で加熱処理する方法が挙げ
られる。この加熱処理は一般に８０℃以下の温度で実施
することが好ましく、公知の抽出装置を用いて還流下１
〜６時間加熱処理することによって抽出液を得ることが
できる。また、溶媒中に前記原材料の乾燥粉末を温浸す
ることによって抽出液を得ることもできる。溶媒による
抽出操作は、１回目の抽出操作を終えた原料残留物で繰
り返して実施することができる。抽出に使用する溶媒の
量は、原材料１００重量部当たり１００〜１０，０００
重量部が適当であり、さらに好ましくは３００〜５，０
００重量部である。

【００１５】上記の抽出溶媒としては、低級アルコール
であるメタノール、エタノール、プロピルアルコール、
イソプロピルアルコール、ブタノール、イソブタノール
等、あるいはプロピレングリコール、１，３ブチレング
リコール等の多価アルコール、アセトン、ジオキサン、
メチルエチルケトン、アセトニトリル、酢酸エチル、ブ
チルメチルケトン、ジエチルエーテル、ジクロロメタ
ン、キシレン及びトルエン等が挙げられる。特に、酢酸
エチルが好ましい。上記の溶媒を単独で使用しても、２
種以上を混合して使用してもよく、水と有機溶媒を併用
してもよい。このようにして得られた抽出液を減圧濃縮
して、次いでシリカゲルクロマトグラフィー等に付すこ
とにより目的とする化合物を単離することができる。

【００１６】超臨界抽出法は、超臨界流体を用いた方法
であり、超臨界流体の溶解力は圧力，温度により容易に
しかも広範囲に渡って連続的に制御できるため、この性
質を利用した超臨界抽出法は、新たな分離法として期待
されている。超臨界抽出法と上記溶媒による抽出法を組
み合わせて使用してもよい。超臨界抽出法は、食品、化
学、医薬、化粧品工業など幅広い分野で注目を集めてい
る抽出技術である。特に、抽出溶媒として二酸化炭素を
用いた場合は、その臨界点（７５ｋｇ／ｃｍ²、３１
℃）が比較的低く安全性が高いため、熱に対して不安定
な成分や揮発性の高い成分等を効率よく抽出分離するこ
とができる。原料から目的の成分を抽出するためには、
二酸化炭素の圧力・温度を臨界点以上に設定することに
より達せられる。一般的には、同じ温度であれば圧力が
高いほど超臨界二酸化炭素の溶解力は増す。例えば、超
臨界抽出装置を用い、高圧セル部の温度３３〜４０℃、
好ましくは３５℃、圧力７５〜３００ａｔｍ、好ましく
は１５０ａｔｍとし、二酸化炭素の流量０．５〜５．０
ｄｍ³／分、好ましくは４．０ｄｍ³／分の条件下で行う
ことができる。これにより、一酸化窒素産生抑制剤を含
む抽出物が効率よく回収できる。このようにして得られ
る抽出物を必要に応じて、更に、上記したシリカゲルク
ロマトグラフィー等に付すことにより目的とする化合物
を単離することができる。

【００１７】一般式ＩＩにおいてＲ₃が水素である化合
物は、上記した抽出法により得られた一般式ＩＩにおい
てグルコース残基である化合物（neoandrographolide）
から、それ自体公知の加水分解反応等によりグルコース
残基を除去することによってうることができる。また、
一般式ＩＩにおいてＲ₃がグルコース残基以外の単糖類
の残基である化合物は、一般式ＩＩにおいてＲ₃が水素
である化合物に、単糖類のハロゲン化物等を反応させる
ことによって得ることができる。

【００１８】なお、本発明で用いた上記植物は伝承生薬
の構成植物としてすでに長い歴史を有し、安全性が確認
されたものであるので、それから得られる化合物も安心
して使用することができる。例えば、上記植物の粗抽出
液をマウスおよびラットに対し、投与限界である１５ｇ
／ｋｇの経口投与で死亡例も異常所見も認められないこ
とから明らかなように極めて安全性の高いものである。

【００１９】本発明の一酸化窒素産生抑制剤には、有効
成分である上記化合物の他に、該化合物に有害でなく且
つ一酸化窒素産生抑制剤として利用する製品に不適当で
ない限り、適宜添加剤を常法に従って配合することが可
能であり、また、グリチルリチン酸、グリチルリチン酸
ジカリウム、塩化リゾチーム、溶菌酵素、ムタナーゼ、
クロルヘキシジン、ソルビン酸、アレキシジン、ヒノキ
チオール、セチルピリジニウムクロライド、アルキルグ
リシン、アルキルジアミノエチルグリシン塩、アラント
イン、ε−アミノカプロン酸、アズレン、ビタミンＥ及
びその誘導体、モノフルオロリン酸ナトリウム、フッ化
ナトリウム、フッ化第１錫、水溶性第１若しくは第２リ
ン酸塩、第４級アンモニウム化合物、塩化ナトリウム等
の他の有効成分を配合することもできる。

【００２０】本発明の一酸化窒素産生抑制剤を医薬品と
して使用する場合には、経口剤や、注射剤、点滴用剤等
の非経口剤のいずれによっても投与することができる。

【００２１】これらの製剤は、適当な医薬用担体を用い
て通常の方法により調製できる。医薬用担体は、上記投
与形態および剤型に応じて選択することができ、経口剤
の場合は、例えばデンプン、乳糖、ショ糖、マンニッ
ト、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無
機塩等が利用される。また、経口剤の調製にあたって
は、更に結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性
促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を配合することができ
る。これらの具体例としては、以下に示すものが挙げら
れる。

【００２２】結合剤としては、例えば、デンプン、デキ
ストリン、アラビアゴム末、ゼラチン、ヒドロキシプロ
ピルスターチ、メチルセルロース、カルボキシメチルセ
ルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、
結晶セルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリ
ドン、マクロゴール等が挙げられる。

【００２３】崩壊剤としては、例えば、デンプン、ヒド
ロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロース
ナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、
カルボキシメチルセルロース、低置換ヒドロキシプロピ
ルセルロース等が挙げられる。

【００２４】界面活性剤としては、ラウリル硫酸ナトリ
ウム、大豆レシチン、ショ糖脂肪酸エステル等が挙げら
れる。

【００２５】滑沢剤としては、例えば、タルク、ロウ
類、水素添加植物油、ショ糖脂肪酸エステル、ステアリ
ン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリ
ン酸アルミニウム、ポリエチレングリコール等が挙げら
れる。

【００２６】流動性促進剤としては、例えば、軽質無水
ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲル、合成ケイ酸アル
ミニウム、ケイ酸マグネシウム等が挙げられる。

【００２７】また、本発明の一酸化窒素産生抑制剤は、
懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、エリキシル剤等
の経口用の液剤としても投与することができ、これらの
各種剤形には、矯味矯臭剤、着色剤を配合することがで
きる。

【００２８】一方、非経口剤の場合は、常法に従って製
造され、希釈剤として一般に注射用蒸留水、生理食塩
水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、ラッカセ
イ油、ダイズ油、トウモロコシ油、プロピレングリコー
ル、ポリエチレングリコール等を用いることができる。
さらに必要に応じて、殺菌剤、防腐剤、安定剤を加えて
もよい。また、この非経口剤は安定性の点から、バイア
ル等に充填後冷凍し、通常の凍結乾燥技術により水分を
除去し、使用直前に凍結乾燥物から液剤を再調製するこ
ともできる。さらに、必要に応じて適宜、等張化剤、安
定剤、防腐剤、無痛化剤等を配合することもできる。

【００２９】本発明の一酸化窒素産生抑制剤の投与量
は、投与する対象、投与ルート等によって変動しうる
が、通常、成人に対して経口投与の場合、本発明の化合
物の総量として、１日あたり１ｍｇ〜１０ｇ、好ましく
は１ｍｇ〜２ｇ、さらに好ましくは１ｍｇ〜２００ｍｇ
の範囲で、非経口投与の場合、本発明の化合物の総量と
して、１日あたり０．１ｍｇ〜１ｇ、好ましくは０．１
ｍｇ〜２００ｍｇ、さらに好ましくは０．１ｍｇ〜１０
０ｍｇの範囲で適宜調節して投与することができる。

【００３０】本発明の一酸化窒素産生抑制剤は、食品、
飼料等へ常法に従って添加することができ、その添加量
は製品の種類に応じて適宜選択することができる。本発
明の一酸化窒素産生抑制剤の適用製品として、具体的に
は、パスタ、チューインガム、チューイングゼリー、コ
ーヒー飲料等の食品、ドッグフード、キャットフード等
の飼料が挙げられる。

【００３１】

【実施例】以下に本発明の化合物の製造について実施例
に基づき、さらに詳細に説明するが、本発明はこれらの
例によって何ら制限されるものではない。更に、本発明
の化合物の一酸化窒素産生に対する選択的阻害作用を試
験例により示す。

【００３２】実施例１一般式Ｉにおいて、Ｒ₁およびＲ₂ともにメチル基である
本発明化合物のＣａｅｓａｌｐｉｎｉａ ｓａｐｐａｎ
からの抽出により製造 Ｃａｅｓａｌｐｉｎｉａ ｓａｐｐａｎ の心材（乾燥重
量３００ｇ）を室温下でメタノール（３リットル）に浸
し３回抽出した。減圧濃縮により抽出エキスからメタノ
ールを除いてメタノールエキス１９ｇを得た。得られた
メタノールエキスに蒸留水を加え、酢酸エチルで抽出し
て、酢酸エチル可溶画分（９．３ｇ）と水可溶画分、ま
た、両者に溶出しない残査（１．３ｇ）を得た。シリカ
ゲル４５０ｇに対し、酢酸エチル可溶画分のうち９．０
ｇを付して、ｎ−ｈｅｘａｎｅおよび酢酸エチルの混合
溶媒で順次割合を変化させ溶出し、最後にメタノールで
洗い流し、Ｆｒ１（１０％酢酸エチル、４５．７ｍ
ｇ）、Ｆｒ２（２０％酢酸エチル、２．１５ｇ）、Ｆｒ
３（３０％酢酸エチル、１．１７ｇ）、Ｆｒ４（５０％
酢酸エチル、１．７１ｇ）、Ｆｒ５（７０％酢酸エチ
ル、１．７１ｇ）、Ｆｒ６（９０％酢酸エチル、１．２
０ｇ）、Ｆｒ７（メタノール、０．９０ｇ）を得た。さ
らに、一酸化窒素産生抑制効果の最も強かったＦｒ２
（１．７０ｇ）をシリカゲル８５ｇに付して、ｎ−ｈｅ
ｘａｎｅ，酢酸エチルの混合溶媒、メタノールで順次溶
出させ、Ｆｒ２−１（５０％酢酸エチル、３３９．７ｍ
ｇ）、Ｆｒ２−２（７０％酢酸エチル、１．１３ｇ）、
Ｆｒ２−３（酢酸エチル、１００．９ｍｇ）、Ｆｒ２−
４（メタノール、８６．５ｍｇ）を得た。Ｆｒ２−２を
シリカゲル５０ｇに付してクロロホルム／メタノール
（９５：５）で溶出し、Ｃｓ−１を得た。Ｃｓ−１は一
般式Ｉにおいて、Ｒ_１およびＲ_２ともにメチル基である
物質であり、これまで報告なされていない新規化合物で
ある。なお、Ｃｓ−１の諸性質を以下に示す。 ＵＶ （メタノール） λｍａｘ（ε）： ２３０
（１６００）， ３４８（７７００）¹ Ｈ−ＮＭＲ （Ｃ₅Ｄ₅Ｎ） δ： ３．３５ （３
Ｈ， ｓ）， ３．４６（３Ｈ， ｓ），６．７１
（１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝８．４， ２．１ Ｈｚ），
６．６８ （１Ｈ． ｄ， Ｊ＝２．１ Ｈｚ），
７．０９ （１Ｈ，ｄ， Ｊ＝８．４ Ｈｚ）， ７．
１３ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝８．４， ２．２ Ｈ
ｚ）， ７．５７ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝２．２ Ｈ
ｚ）， ７．７０（１Ｈ， ｄ， Ｊ＝１５．８ Ｈ
ｚ）， ７．９７ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝８．４ Ｈ
ｚ）， ７．９８ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝１５．８ Ｈ
ｚ）． ＦＡＢ−ＭＳ ｍ／ｚ ９３， １２３， １３５，
１５１， ２８６

【００３３】試験例１ＢＣＧ誘導腹腔マクロファージが産生する一酸化窒素抑
制試験 （１）ＢＣＧ誘導腹腔マクロファージの採取 ＩＣＲマウス（５週齢、雄性、熊谷）を５〜７日馴化し
た後に注射用生理食塩水（大塚）を用いて５ｍｇ／ｍＬ
の濃度に懸濁したＢＣＧ（日本ビーシージー）溶液を、
マウス１匹当たり０．２ｍＬ腹腔内投与した。その４日
後、エテール麻酔下で断頭、遮血した後、腹腔内にＲＰ
ＭＩ−１６４０培地を注入して５０回マッサージを行
い、開腹して培地とともに湿潤細胞を回収した。回収し
た細胞懸濁液を１２００ｇで５分間遠心した。上清を除
去後、再びＲＰＭＩ−１６４０培地を加え懸濁させ、１
２００ｇで５分間遠心しこれをもう一度繰り返し細胞を
洗った。最後に５％ＦＣＳ（Ｂｉｏｓｅｒｕｍ）を含
む、ＲＰＭＩ−１６４０を加え適当な濃度に調整し、血
球計算板を用い、細胞数を計測した。

【００３４】（２）マクロファージ培養液上清中の一酸
化窒素量の測定 細胞濃度を１×１０⁶ｃｅ１１ｓ／ｍＬとなるようにＲ
ＰＭＩ−１６４０（５％ＦＣＳ）を用いて調整し、９６
穴平底プレートに１４０ｍＬずつまき込み、インキュベ
ーター（３７℃、５％ＣＯ₂）で培養し、２時間後、検
体とＬＰＳを加えた。検体は、１０００μｇに対し１０
０μＬのエタノールで検体を溶解させ、この溶液をＲＰ
ＭＩ−１６４０（５％ＦＣＳ）を用い２０倍希釈し５０
μｇ／ｍＬにした。これを原液としさらにＲＰＭＩ−１
６４０（５％ＦＣＳ）で必要な濃度に希釈し、２０μＬ
ずつマクロファージ培養液中に加えた。つぎに、最終濃
度が１０μｇ／ｍＬとなるようにＬＰＳ（Ｌｉｐｏｐｏ
１ｙｓａｃｃａｒｉｄｅ，Ｅｓｃｈｅｒｉｓｈｉａ ｃ
ｏｉｌ ０５５：Ｂ５， Ｓｉｇｍａ）を４０μＬ添加
し培養液の総体積が２００μＬになるようにした。２４
時間培養を行った後、マクロファージ培養液上清中の一
酸化窒素量を以下の手順で測定した。一酸化窒素濃度測
定は、ＮＯ₂塩としてＧｒｉｅｓｓ試薬を用いる呈色反
応で測定した。すなわち、培養液上清１００μＬを９６
穴プレートに取り、これに等量のＧｒｉｅｓｓ試薬（１
％ｓｕ１ｆａｎｉ１ａｍｉｄｅ、０．１％ｎａｐｈｔｙ
ｌａｅｔｈｙｌｅｎｅ ｄｉａｍｉｎｅを９７ｍＬの再
蒸留水に溶解後３ｍＬのリン酸を加える）を加えて、１
０分間室温で放置して赤色に呈色させた後、５１０ｍｍ
吸光度を測定した。同時に標準液としてＮａＮＯ₂水溶
液を呈色させて吸光度から検量線を作成し、培地中に産
生されたＮＯ₂塩濃度から一酸化窒素量を算出した。

【００３５】（３）ＭＴＴ法による細胞生存率の測定 一酸化窒素測定のため上清を取り除いたプレートの細胞
の生存率をＭＴＴ法で測定した。まず、残りの１００μ
Ｌの培地を全て取り除き新たにＲＰＭＩ−１６４０（５
％ＦＣＳ）を１００μＬ及び０．５ｗ／ｖ％ ＭＴＴ
（ＮＡＫＡＲＡＩＴＥＳＱＵＥ）２０μＬを加えた。以
後遮光下で扱った。５時間インキュベート（３７℃、５
％ＣＯ₂した後、ＳＤＳ（５０％ＤＭＦ溶液）１００μ
Ｌを加え生成したＭＴＴホルマザンを溶解し、５９０ｍ
ｍにおける吸光度を測定し、コントロールに対する吸光
度を百分率で求め、細胞生存率とした。

【００３６】（４）結果 検体としてＣｓ−１を用い、０−５０μｇ／ｍＬの範囲
で濃度を変化させて一酸化窒素産生抑制効果と細胞生存
率を測定した結果を図１および図２に示す。図１および
２に示された結果から判断されるとおり、８μｇ／ｍＬ
付近においてマクロファージ細胞に対して強い一酸化窒
素産生抑制作用を認めた。しかし、それ以上の濃度にな
ると細胞生存率が低下し、毒性が発現した。なお、本実
験に用いた新規化合物であるＣｓ−１の一酸化窒素産生
抑制効果は、高い効果を示すことが予め判明しているイ
ソフラボノイドである公知のGenisteinと同程度であっ
たが、ＩＣ₅₀の値は、Genisteinが９．６μＭであり、
Ｃｓ−１が１６．２μＭであり、Ｃｓ−１の方がＩＣ₅₀
の値が大きく、細胞毒性がより少ないと判断できた。

【００３７】実施例２一般式ＩＩにおいて、Ｒ₃がグルコース残基である本発
明化合物のＡｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ ｐａｎｉｃｕｌ
ａｔａからの抽出による製造 本発明化合物のＡｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ ｐａｎｉｃ
ｕｌａｔａからの抽出分画を図３に示し手順に従って行
った。即ち、乾燥したＡｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ ｐａ
ｎｉｃｕｌａｔａ 全草（３００ｇ）を、室温で７日間
メタノール ４Ｌで冷浸した。抽出液を濾取した後、抽
出残残査に新たに４Ｌのメタノールを加え、室温で１日
間冷浸の後、ろ過し抽出液を得た。２回の抽出で得たろ
液を合わせ、減圧下濃縮しメタノール抽出エキス（２
０．５ｇ）を得た。次いでこれを酢酸エチル−水、ｎ−
ブタノール−水で順次分配した。酢酸エチル可溶画分お
よびｎ−ブタノール可溶画分を減圧濃縮中に、結晶が析
出したため、これを濾取し粗結晶を得た。以上の操作に
より、酢酸エチル可溶画分（７．７８９ｇ）、ｎ−ブタ
ノール可溶画分（２．６７５ｇ）、水可溶画分（６．０
１０ｇ）、並びに、酢酸エチル層可溶画分粗結晶１（２
６４ｍｇ）、ｎ−ブタノール層可溶画分粗結晶２（１．
９５８ｇ）の５つの粗画分を得た。次いで可溶画分粗結
晶１（２６４ｍｇ）をシリカゲルカラム（２５ｇ）に付
し、溶出物をＴＬＣで確認しながらクロロホルム／メタ
ノール（２０：１）で溶出した。そのうち際立って含有
量の多いスポットを含むフラクションを、減圧下濃縮し
結晶（２１２ｍｇ）を得た。この結晶は、公知化合物で
あるｎｅｏａｎｄｒｏｇｒａｐｈｏ１ｉｄｅ標品とＴＬ
ＣにおけるＲｆ値が各種溶媒で一致したこと、ならびに
ｎｅｏａｎｄｒｏｇｒａｐｈｏ１ｉｄｅ標品との¹Ｈ−
ＮＭＲスペクトルが一致したことにより、ｎｅｏａｎｄ
ｒｏｇｒａｐｈｏ１ｉｄｅ（一般式ＩＩにおいてＲ₃が
グルコース残基）と同定した。同様にして、可溶画分粗
結晶２より、公知化合物であるａｎｄｒｏｇｒａｐｈｏ
１ｉｄｅを同定した。

【００３８】試験例２経口投与によりＢＣＧ誘導腹腔マクロファージが産生す
る一酸化窒素抑制試験 （１）方法 試験例１ではマウスから採取したマクロファージに対し
て試験管内で本発明の化合物の一酸化窒素産生抑制作用
を調べたが、本試験例２では、マウスに対して本発明の
化合物を予め経口投与したのち、採取したマクロファー
ジの一酸化窒素産生抑制作用を調べた。検体の調製とマ
ウスヘの投与を以下の方法により実施した。即ち、マウ
スに投与する検体のうち、非水溶性の検体についてはこ
れを０．５％のカルボキシメチルセルロースを含む生埋
食塩水に懸濁させ、乳鉢でよく研磨したものを使用し
た。マウスヘの投与は、ＢＣＧを腹腔内注射する３日前
から１日１回、合計３日間にわたって経口投与した。な
お、マウス１匹あたりの経口投与量は、実施例２で得ら
れたメタノール層、酢酸エチル層、ブタノール層、水層
については５０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、可溶画分粗結晶１
および２については３０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、ｎｅｏａ
ｎｄｒｏｇｒａｐｈｏ１ｉｄｅについては５ｍｇ／ｋｇ
／ｄａｙとした。ＢＣＧ誘導腹腔マクロファージの採
取、マクロファージ培養液上清中の一酸化窒素量の測定
およびＭＴＴ法による細胞生存率の測定は、試験例１と
同様に行い、マクロファージの産生する一酸化窒素の抑
制の程度と細胞生存率を測定した。

【００３９】（２）結果 メタノール層、酢酸エチル層、ブタノール層および水層
に移行した成分を５０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの投与量で投
与した場合の結果は、図４に示した。可溶画分粗結晶１
および２を３０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの投与量で投与した
場合の結果は、図５に示した。ｎｅｏａｎｄｒｏｇｒａ
ｐｈｏ１ｉｄｅを５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの投与量で投与
した場合の結果は、図６に示した。図４に示したとお
り、メタノール層、酢酸エチル層に移行した成分は、経
口投与において、一酸化窒素の産生を効率的に抑制し
た。図５に示したとおり、可溶画分粗結晶１は、ＬＰＳ
添加時に経口投与において、一酸化窒素の産生を効率的
に抑制した。図６に示したとおり、ｎｅｏａｎｄｒｏｇ
ｒａｐｈｏ１ｉｄｅは、５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの経口投
与において、一酸化窒素の産生を効率的に抑制した。

【００４０】

【発明の効果】本発明により、人体及び動物に対し有害
な作用を示さず、きわめて安全性が高い一酸化窒素産生
抑制剤が提供される。本発明の一酸化窒素抑制剤を医薬
品として用いた場合、または食品及び飼料等へ配合して
用いた場合、マクロファージの一酸化窒素産生を効果的
に抑制し、従って、ショック、低血圧、慢性関節リウマ
チ、潰瘍性大腸炎、虚血性脳障害、腫瘍、インスリン依
存性糖尿病等の治療および／又は予防に有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、一般式Ｉにおいて、Ｒ₁およびＲ₂とも
にメチル基である本発明化合物（Ｃｓ−１）を用い、０
−５０μｇ／ｍＬの範囲で濃度を変化させて一酸化窒素
産生抑制効果と細胞生存率を測定した結果を示すグラフ
である。図１において、＊は有意差検定にてｐ＜０．０
５，＊＊＊は有意差検定にてｐ＜０．００５を表す。

【図２】図２は、本発明化合物（Ｃｓ−１）を用い、０
−５０μｇ／ｍＬの範囲で濃度を変化させて一酸化窒素
産生抑制効果と細胞生存率を測定した結果を示すグラフ
である。

【図３】図３は、一般式ＩＩにおいて、Ｒ_３がグルコー
ス残基である本発明化合物（ｎｅｏａｎｄｒｏｇｒａｐ
ｈｏ１ｉｄｅ）のＡｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ ｐａｎｉ
ｃｕｌａｔａからの抽出手順を示す。

【図４】図４は、実施例２で得られるメタノール層、酢
酸エチル層、ブタノール層および水層に移行した成分を
５０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの投与量で投与した場合の一酸
化窒素産生抑制効果と細胞生存率を測定した結果を示す
グラフである。図４において、＊＊は有意差検定にてｐ
＜０．０１，＊＊＊は有意差検定にてｐ＜０．００５を
表すわす。

【図５】図５は、実施例２で得られる可溶画分粗結晶１
および２を３０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの投与量で投与した
場合の一酸化窒素産生抑制効果と細胞生存率を測定した
結果を示すグラフである。図５において、＊＊＊は有意
差検定にてｐ＜０．００５を表す。

【図６】図６は、実施例２で得られるｎｅｏａｎｄｒｏ
ｇｒａｐｈｏ１ｉｄｅを５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの投与量
で投与した場合の一酸化窒素産生抑制効果と細胞生存率
を測定した結果を示すグラフである。図６において、＊
＊は有意差検定にてｐ＜０．０１，＊＊＊は有意差検定
にてｐ＜０．００５を表す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 3/10 Ａ６１Ｐ 3/10 9/10 9/10 29/00 １０１ 29/00 １０１ 35/00 35/00 43/00 １１１ 43/00 １１１ Ｃ０７Ｄ 307/58 Ｃ０７Ｄ 307/58 // Ｃ０７Ｃ 45/74 Ｃ０７Ｃ 45/74 Ｃ０７Ｈ 15/26 Ｃ０７Ｈ 15/26 (72)発明者 曽田 良 大阪府大阪市中央区北浜４丁目７番28号 住友林業株式会社内 (72)発明者 高野 文英 宮城県仙台市太白区長町８−２−31−104 (72)発明者 伏谷 眞二 宮城県仙台市青葉区五橋２−８−７−601 Ｆターム(参考） 4C037 JA04 4C057 BB02 DD01 KK02 4C086 AA01 AA02 AA03 BA03 EA11 GA17 MA01 MA04 NA14 ZA36 ZA43 ZA66 ZB15 ZB26 ZB35 ZC20 ZC35 4C206 AA01 AA02 AA03 CB19 MA01 MA04 NA14 ZA36 ZA43 ZA66 ZB15 ZB26 ZB35 ZC20 ZC35 ZC41 4H006 AA01 AA03 AB23 BJ50 BN30 BP30 BR30 GP03

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の一般式ＩまたはＩＩに示される化
   合物、それらの塩またはそれらの水和物を有効成分とし
   て含有することを特徴とする一酸化窒素産生抑制剤。 【化１】 [式中、Ｒ₁およびＲ₂は、水素または直鎖状もしくは分
   岐鎖状の炭素数１〜６の低級アルキルを表わす。] 【化２】 [式中、Ｒ₃は、水素または単糖類の残基を表わす。]
2. 【請求項２】 下記の一般式Ｉ’またはＩＩ’に示され
   る化合物。 【化３】 [式中、Ｒ’₁およびＲ’₂は、直鎖状もしくは分岐鎖状
   の炭素数１〜６の低級アルキルを表わす。] 【化４】 [式中、Ｒ’₃は、水素を表わす。]