JP2000514290A

JP2000514290A - 組換えアデノウイルスの製造方法

Info

Publication number: JP2000514290A
Application number: JP10503872A
Authority: JP
Inventors: ブランシユ，フランシス; ギヨム，ジヤン―マルク
Original assignee: ローヌ―プーラン・ロレ・エス・アー
Priority date: 1996-07-01
Filing date: 1997-06-20
Publication date: 2000-10-31
Also published as: EP0944717A1; NO986202L; SK181098A3; HU224558B1; US6485958B2; US6905862B2; IL127692A0; HUP0001271A3; US20020028497A1; US20050287657A1; BR9710030A; AU3447097A; KR20050043996A; CA2258158A1; NO986202D0; US20030143730A1; HUP0001271A1; WO1998000524A1; CZ438398A3

Abstract

(57)【要約】本発明は、パッケージング細胞培養物にウイルスＤＮＡを導入し、産生したウイルスを上清中に放出後に回収することを特徴とする、組換えアデノウイルスの製造方法に関する。本発明は製造したウイルスとその使用にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】組換えアデノウイルスの製造方法本発明は組換えアデノウイルスの新規製造方法に関する。本発明は前記方法により製造した精製ウイルス調製物にも関する。アデノウイルスは遺伝子治療で遺伝子導入用ベクターとして使用するのに特に有利な所定の性質をもつ。特に、宿主範囲が非常に広く、休止細胞に感染させることができ、感染細胞のゲノムに取込まれず、今日までヒトで重要な疾病に関連付けられていない。従って、アデノウイルスは目的遺伝子を筋（Ｒａｇｏｔら，Ｎａｔｕｒｅ３６１（１９９３）６４７）、肝（Ｊａｆｆｅら，Ｎａｔｕｒｅｇｅｎｅｔｉｃｓ１（１９９２）３７２）、神経系（Ａｋｌｉら，Ｎａｔｕｒｅｇｅｎｅｔｉｃｓ３（１９９３）２２４）等に導入するために使用されている。アデノウイルスは約３６ｋｂ（キロベース）のサイズの直鎖状２本鎖ＤＮＡをもつウイルスである。そのゲノムは特に、各末端の逆方向反復配列（ＩＴＲ）と、パッケージング配列（Ｐｓｉ）と、初期遺伝子と、後期遺伝子を含む。主要な初期遺伝子はＥ１、Ｅ２、Ｅ３及びＥ４領域に含まれる。このうち、Ｅ１領域に含まれる遺伝子は特にウイルス増殖に必要である。主要な後期遺伝子はＬ１〜Ｌ５領域に含まれる。アデノウイルスＡｄ５のゲノムは完全に配列決定されており、データベースから入手できる（特にＧｅｎｅｂａｎｋＭ７３２６０参照）。更に、他のアデノウイルスゲノム（Ａｄ２、Ａｄ７、Ａｄ１２等）も部分的又は完全に配列決定されている。遺伝子治療で使用するために、種々の治療用遺伝子を組込んだ種々のアデノウイルス由来ベクターが作製されている。これらの構築物の各々で、アデノウイルスは感染細胞で複製できないように改変されている。例えば、従来技術に記載されている構築物は、ウイルス複製に必須のＥ１領域を欠失し、このレベルに異種ＤＮＡ配列を挿入したアデノウイルスである（Ｌｅｖｒｅｒｏら，Ｇｅｎｅ１０１（１９９１）１９５；Ｇｏｓｈ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙら，Ｇｅｎｅ５０（１９８６）１６１）。また、ベクターの性質を改良するために、アデノウイルスのゲノム内に他の欠失又は変異を形成することも提案されている。例えば、７２ｋＤａのＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）を不活化できるように、突然変異株ｔｓ１２５に感熱性点突然変異が導入されている（ＶａｎｄｅｒＶｌｉｅｔら，１９７５）。この他、ウイルス複製及び／又は増殖に必須の別の領域であるＥ４領域の欠失を含むベクターもある。Ｅ４領域は実際に後期遺伝子の発現の調節、後期核ＲＮＡの安定性、宿主細胞のタンパク質発現の減弱及びウイルスＤＮＡの複製効率に関与している。従って、Ｅ１及びＥ４領域を欠失するアデノウイルスベクターは転写バックグラウンドノイズとウイルス遺伝子発現が非常に低い。このようなベクターは例えば国際出願ＷＯ９４／２８１５２、ＷＯ９５／０２６９７、ＰＣＴ／ＦＲ９６／０００８８に記載されている。更に、ＩＶａ２遺伝子のレベルに変異をもつベクターも記載されている（ＷＯ９６／１００８８）。文献に記載されている組換えアデノウイルスは種々の血清型のアデノウイルスから製造されている。実際に、構造と性質は少しずつ異なるが、類似の遺伝子地図をもつ種々の血清型のアデノウイルスが存在する。より詳細には、組換えアデノウイルスはヒト又は動物起源であり得る。ヒト起源のアデノウイルスについては、Ｃ亜属に分類されるもの、特に２（Ａｄ２）、５（Ａｄ５）、７（Ａｄ７）又は１２（Ａｄ１２）型のアデノウイルスを好適例として挙げることができる。動物起源の種々のアデノウイルスのうちでは、イヌ起源のアデノウイルス、特に全アデノウイルスＣＡＶ２株［例えばマンハッタン株又はＡ２６／６１（ＡＴＣＣＶＲ−８００）］を挙げることができる。動物起源の他のアデノウイルスは、参考資料として本明細書の一部とする国際出願ＷＯ９４／２６９１４に特に記載されている。本発明の１好適実施態様では、組換えアデノウイルスはＣ亜属のヒトアデノウイルスである。アデノウイルスＡｄ２又はＡｄ５が特に好ましい。組換えアデノウイルスは、パッケージング系即ち組換えアデノウイルスゲノムにおける欠損機能の１個以上をトランス相補することが可能な細胞系で作製される。これらの細胞系の１例は例えば、アデノウイルスのゲノムの一部を組み込んだ２９３系である。より詳細には、２９３系はアデノウイルス血清型５（Ａｄ５）のゲノムの左側末端（約１１〜１２％）を含むヒト胎児腎細胞であり、左側ＩＴＲ、パッケージング領域、Ｅ１ａとＥ１ｂを含むＥ１領域、ｐＩＸタンパク質をコードする領域及びｐＩＶａ２タンパク質をコードする領域の一部を含む。この系はＥ１領域を欠損即ちＥ１領域の全部又は一部を欠失する組換えアデノウイルスをトランス相補することができ、高力価をもつウイルスストックを産生することができる。この系は、感熱性Ｅ２突然変異を更に含むウイルスストックを許容温度（３２℃）で産生することもできる。Ｅ１領域を相補することが可能な他の細胞系として、特にヒト肺癌細胞Ａ５４９（ＷＯ９４／２８１５２）やヒト網膜芽細胞（Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．（１９９６）２１５）に由来するものも記載されている。また、アデノウイルスの複数の機能をトランス相補することが可能な細胞系も記載されている。特に、Ｅ１及びＥ４領域を相補する系（Ｙｅｈら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０（１９９６）５５９；ＣａｎｃｅｒＧｅｎ．Ｔｈｅｒ．２（１９９５）３２２；Ｋｒｏｕｇｌｉａｋら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．６（１９９５）１５７５）と、Ｅ１及びＥ２領域を相補する系（ＷＯ９４／２８１５２、ＷＯ９５／０２６９７、ＷＯ９５／２７０７１）を挙げることができる。組換えアデノウイルスは一般に、パッケージング系にウイルスＤＮＡを導入後、約２又は３日後に細胞を溶解させることにより作製される（アデノウイルスサイクルの周期は２４〜３６時間）。細胞溶解後、組換えウイルス粒子を塩化セシウム勾配遠心分離により単離する。この方法を実施するために導入するウイルスＤＮＡとしては完全組換えウイルスゲノムが挙げられ、場合により細菌（ＷＯ９６／２５５０６）又は酵母（ＷＯ９５／０３４００）で構築し、細胞にトランスフェクトする。パッケージング系に感染させるために使用する組換えウイルスでもよい。ウイルスＤＮＡは、パッケージング細胞に導入後に種々のフラグメント間の相同組換えにより組換えウイルスゲノムを再構成することが可能な相同ゾーンと組換えウイルスゲノムの一部を各々もつフラグメントとして導入してもよい。従って、慣用アデノウイルス製造方法の１例は次の段階を含む。細胞（例えば２９３細胞）にウイルスプレストックを細胞１個当たりウイルス粒子３〜５個の割合（感染多重度（ＭＯＩ）＝３〜５）で培養器内感染させるか、又はウイルスＤＮＡをトランスフェクトする。その後、４０〜７２時間インキュベートする。次いで、一般には数回の連続融解サイクルにより、ウイルスを細胞溶解により核から放出させる。その後、得られた細胞溶解液を低速（２０００〜４０００ｒｐｍ）で遠心分離した後、 −ウイルスの密度（１．３４）を挟む１．２５及び１．４０の密度の２つの塩化セシウム層で１．５時間急速遠心分離して培地のタンパク質からウイルスを分離する第１段階と、 −ウイルスの真の固有の精製段階として、より長時間（使用するローターに応じて１０〜４０時間）勾配遠心分離する第２段階の２段階で上清（清澄化細胞溶解液）を塩化セシウムの存在下に遠心分離により精製する。一般に、第２段階の遠心分離後にウイルスのバンドは最大となる。他方、より低密度の細い２つのバンドも観察され、電子顕微鏡試験によると、密度が大きいほうのバンドは空の又は破壊したウイルス粒子であり、密度か小さいほうのバンドはウイルスサブユニット（ペントン、ヘキソン）であることが判明した。この段階後、遠心チューブに針を刺してウイルスを回収し、セシウムを透析又は脱塩により除去する。しかし、得られる純度レベルは十分であるとしても、この種の方法には所定の欠点がある。特に、この方法はヒトの治療用途に不適確な試薬である塩化セシウムの使用に基づく。このため、精製後に塩化セシウムを除去することが不可欠である。この方法は更に、後述するように工業的規模での使用を制限する所定の他の欠点もある。これらの問題を解決するために、溶解後に得られるウイルスを塩化セシウム勾配でなくクロマトグラフィーにより精製することが提案されている。例えば、Ｈｕｙｇｈｅらの論文（Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．６（１９９６）１４０３）は、組換えアデノウイルスの精製に適用される種々の型のクロマトグラフィーを検討している。この論文は特に、弱アニオン（ＤＥＡＥ）交換クロマトグラフィーを使用した組換えアデノウイルスの精製を検討している。この目的にこの種のクロマトグラフィーを使用することは既に従来の文献に記載されている（Ｋｌｅｍｐｅｒｅｒら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ９（１９５９）５３６；ＰｈｉｌｉｐｓｏｎＬ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１０（１９６０）４５９；Ｈａｒｕｎａら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１３（１９６１）２６４）。Ｈｕｙｇｈｅらの論文に記載されている結果によると、推奨されたイオン交換クロマトグラフィープロトコールの効率はかなり低い。即ち、得られる分離は並であり、著者らは複数のクロマトグラフィーピークにウイルス粒子が存在することを示しており、収率は低く（ウイルス粒子収率６７％；感染性粒子収率４９％）、このクロマトグラフィー段階後に得られるウイルス調製物は不純である。更に、種々の酵素／タンパク質によるウイルスの前処理が必要である。この論文は更に、ケル浸透クロマトグラフィーの使用についても検討しているが、分離が非常に不良で収率が非常に低い（１５〜２０％）としている。本発明は組換えアデノウイルスの新規製造方法に関する。本発明の方法は、産生段階のレベル及び／又は精製段階のレベルで従来方法を改変したものである。本発明の方法によると、非常に高品質の非常に多量のウイルスストックを非常に迅速且つ工業的に得ることが今や可能である。本発明の第１の側面の１つは、より詳細には、培養上清からウイルスを回収することを特徴とする組換えアデノウイルスの製造方法に関する。本発明の別の側面は、限外濾過段階を含むアデノウイルスの製造方法に関する。別の側面によると、本発明はアニオン交換クロマトグラフィー段階を含む組換えアデノウイルスの精製方法にも関する。本発明は、場合によりアニオン交換クロマトグラフィーと共に、ゲル浸透クロマトグラフィーを使用する改良精製方法にも関する。本発明の方法は、工業的要件と治療用分子の製造に関する規制に完全に合致する製造条件下で、純度、安定性、形態及び感染性の点で高品質なウイルスを非常に高収率で得ることができる。特に、工業化の観点から、本発明の方法は例えば精密濾過又は深層濾過やタンジェント限外濾過等の大規模で確実な培養上清処理方法を組換えタンパク質に利用する。更に、３７℃でウイルスが安定であるため、この方法は細胞内方法のように回収時期を半日単位で確定する必要がなく、良好な工業化が可能である。更に、ウイルスを最大限に回収できるので、複数の領域を欠損するウイルスの場合に特に重要である。他方、本発明の方法は前処理なしに上清の均質サンプルで産生速度を直接容易且つ正確に追跡できるので、産生の良好な再現性が得られる。本発明の方法は細胞溶解段階を省略することもできる。細胞溶解はいくつかの欠点がある。例えば、工業的規模で凍結−融解サイクルにより細胞を破壊しようとするのは困難であると思われる。更に、溶解代用方法（Ｄｏｕｎｃｅ、Ｘプレス、音波処理、機械的剪断等）にも欠点があり、Ｌ２又はＬ３ウイルスは空気感染する傾向があるが、これらの方法はこれらのウイルスでは閉じ込めることが困難なエアゾールを生成する可能性（ウイルスの病原性又は伝播様式に依存する閉じ込めレベル）があり、また、制御しにくい剪断力及び／又は熱放出を生じ、調製物の活性を低下させる。細胞を溶解するために洗剤を使用する方法は洗剤を評価する必要があり、更に洗剤の除去を評価する必要もある。更に、細胞溶解は培地中に多数の細胞残滓を生じるので、精製が一層困難になる。ウイルス品質の点では、本発明の方法は潜在的にウイルスの良好な成熟を可能にし、より均質な集団をもたらす。特に、ウイルスＤＮＡのパッケージングはウイルスサイクルの最終段階であるので、細胞の早期溶解は空の粒子を放出する恐れがあり、このような粒子は非複製性であるにも拘わらずアプリオリに感染性であり、ウイルスの固有毒性効果を高め、得られる調製物の比活性比を増加させる。調製物の比感染性比は、生化学的方法（ＯＤ２６０ｎｍ、ＨＰＬＣ、ＰＣＲ、酵素標識抗体法等）により測定した合計ウイルス粒子数と、生物学的効果（固体培地培養細胞土の溶菌斑形成、細胞のトランスダクション）を生じるウイルス粒子数の比として定義される。実際に、精製調製物では、この比は２６０ｎｍのＯＤにより測定した粒子の濃度と調製物のプラーク形成単位の濃度の比を計算することにより決定される。この比は１００未満でなければならない。得られた結果によると、本発明の方法は濃縮ウイルス上清から出発して前処理を必要とすることなく、塩化セシウム勾配遠心分離により精製したウイルスに少なくとも等しい純度のウイルスを１段階で得ることができる。従って、本発明の第１の目的は、パッケージング細胞培養物にウイルスＤＮＡを導入し、産生したウイルスを培養上清中に放出後に回収することを特徴とする組換えアデノウイルスの製造方法に関する。機械的又は化学的な早期細胞溶解後にウイルスを回収する従来方法とは異なり、本発明の方法では、外部因子により細胞を溶解しない。培養をより長時間続け、パッケージング細胞による自然放出後にウイルスを上清から直接回収する。従って、本発明ではウイルスを細胞上清から回収するが、従来方法のウイルスは細胞内、より詳細には核内ウイルスである。本願出願人は、培養期間の延長と多量の使用にも拘わらず、本発明の方法が良好な品質のウイルス粒子を多量に生成できることを今般実証した。更に、上述のように、本方法は工業規模では不経済で多くの不純物を生じる溶解段階を省略できる。従って、本発明の方法の原理は上清中に放出されるウイルスの回収にある。本方法は、細胞溶解に基づく従来技術の方法よりも培養時間を改善できる。上述のように、回収時期は半日単位で確定する必要がない。回収時期は培養上清へのウイルス放出速度により主に決定される。ウイルス放出速度は種々の方法で追跡することができる。特に、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＩＥ−ＨＰＬＣ、半定量的ＰＣＲ（実施例４．３）、死細胞のトリパンブルー染色、ＬＤＨ型細胞内酵素の放出の測定、Ｃｏｕｌｔｅｒ型装置又は光回折による上清中の粒子の測定、免疫（ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ等）又は比濁法、抗体の存在下の凝集による滴定等の分析方法を使用することができる。ウイルスの少なくとも５０％が上清中に放出された時点で回収を行うことが好ましい。ウイルスの５０％が放出された時点は、上記方法により速度を確認することにより容易に決定することができる。ウイルスの少なくとも７０％が上清中に放出された時点で回収を行うと一層好ましい。ウイルスの少なくとも９０％が上清中に放出された時点、即ち速度が平坦域に達した時点で回収を行うと特に好ましい。ウイルス放出速度は主にアデノウイルスの複製サイクルに依存し、所定の因子の影響を受ける。特に、使用するウイルスの型、特に組換えウイルスゲノムの欠失の型によって変動し得る。特に、Ｅ３領域の欠失はウイルスの放出を遅らせると思われる。従って、Ｅ３領域の存在下では感染後２４〜４８時間にウイルスを回収すればよい。逆にＥ３領域の不在下ではもっと長い培養時間が必要であると思われる。この点について、本願出願人はＥ１及びＥ３領域を欠損するアデノウイルスの培養上清への放出速度の実験を実施し、放出が感染後約４〜５日で開始し、約１４日まで続くことを確認した。放出は一般に８日〜１４日で平坦域に達し、力価は感染後少なくとも２０日間安定である。本発明の方法では、細胞を２〜１４日間培養することが好ましい。他方、ウイルスの放出はウイルスの放出に関与する例えばウイルス性のタンパク質をパッケージング細胞中で発現させることにより誘導することができる。例えばアデノウイルスの場合には、場合により誘導プロモーターの制御下に発現されるアデノウイルスのＥ３領域（タンパク質Ｅ３−１１．６Ｋ）によりコードされるＤｅａｔｈタンパク質の発現により放出を調節することができる。従って、ウイルス放出時間を短縮し、感染後２４〜４８時間にウイルスの＞５０％を培養上清から回収することができる。ウイルス粒子を回収するためには、培養上清を予め濾過すると有利である。アデノウイルスは約０．１μｍ（１２０ｎｍ）の寸法をもつので、ウイルスを通過させるために十分大きく且つ汚染物質を保持するために十分小さい細孔径をもつ膜を用いて濾過する。０．２μｍを上回る細孔径をもつ膜を用いて濾過すると好ましい。特に有利な実施態様によると、漸減細孔径をもつ膜で連続濾過する。１０μｍ、１．０μｍ、０．８〜０．２μｍの漸減細孔径のディープフィルターで濾過すると、特に良好な結果が得られた。別の好ましい態様によると、平膜又は中空糸でタンジェント精密濾過により濾過する。より特定的には、０．２〜０．６μｍの細孔径をもつＭｉｌｌｉｐｏｒｅ平膜又は中空糸を使用することができる。実施例に示す結果から明らかなように、この濾過段階は収率１００％であった（最小細孔径のフィルターで保持することによるウイルスの損失は観察されなかった）。本発明の別の側面によると、本願出願人は上清からウイルスを回収精製することが可能な方法を今般開発した。このためには、こうして濾過（又は清澄化）した上清を限外濾過する。この限外濾過は（ｉ）相当の容量の上清を濃縮し、（ｉｉ）第１段階のウイルス精製を実施し、（ｉｉｉ）調製物の緩衝液を後期調製段階に適合させることができる。好ましい実施態様によると、上清をタンジェント限外濾過にかける。タンジェント限外濾過は、装置の濾渣区画内に流れを形成すると共にこの区画と濾液区画の間に膜貫通圧を加えることにより、所定のカットオフ閾値の膜により分離された濾渣と濾液の２つの区画間で溶液を濃縮分画するものである。流れは一般に装置の濾渣区画内でポンプにより形成され、膜貫通圧は濾渣回路の液体流路では弁により調節され、濾液回路の液体流路では流量可調節ポンプにより調節される。流速と膜貫通圧は、膜の目詰まりを避けながら僅かな剪断力を生じるように選択される（レイノルズ数５０００ｓｅｃ−１未満、好ましくは３０００ｓｅｃ−１未満、圧力１．０ｂａｒ未満）。限外濾過を実施するためには、スパイラルメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ａｍｉｃｏｎ）、平膜又は中空糸（Ａｍｉｃｏｎ，Ｍｉｌ１ｉｐｏｒｅ，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，Ｐａｌｌ，ＧＦ，Ｓｅｐｒａｃｏｒ）等の種々のシステムを使用することができる。アデノウイルスは約１０００ｋＤａの分子量をもつので、本発明の範囲では１０００ｋＤａ未満、好ましくは１００ｋＤａ〜１０００ｋＤａのカットオフ閾値をもつ膜を使用すると有利である。実際に、１０００ｋＤａ以上のカットオフ閾値をもつ膜を使用すると、この段階で相当のウイルス損失を生じる。好ましくは２００〜６００ｋＤａ、より好ましくは３００〜５００ｋＤａのカットオフ閾値をもつ膜を使用する。実施例に記載する実験から明らかなように、３００ｋＤａのカットオフ閾値をもつ膜を使用すると、培地から汚染物質（ＤＮＡ、培地のタンパク質、細胞タンパク質等）を除去しながらウイルス粒子の＞９０％を保持することができる。５００ｋＤａのカットオフ閾値を使用しても同様の利点が得られる。実施例に記載する結果から明らかなように、この段階はウイルスの損失なしに（収率９０％）相当容量の上清を濃縮することができ、良好な品質のウイルスを生じる。特に、２０〜１００倍の濃縮倍率を容易に得ることができる。従って、この限外濾過段階はカットオフ閾値（３００又は５００ｋＤａ）未満の分子量の汚染物質を少なくとも部分的に除去するので、慣用方法の付加精製段階を構成する。両方法の最初の超速心段階後の分離様相を比較すると、ウイルス調製物の品質の改善は顕著である。溶解を用いる慣用方法では、ウイルス調製物のチューブは凝塊（脂質、タンパク質）が時折ウイルスバンドにぶつかって濁った様相を示すが、本発明の方法では、放出及び限外濾過後の調製物は培地の汚染物質から既に十分に分離されたバンドを示し、汚染物質は上層に保持される。細胞溶解により得られたウイルスと、本発明で上記のように限外濾過により得られたウイルスのイオン交換クロマトグラフィープロフィルを比較しても同様に品質の改善が実証される。また、限外濾過後に濃縮液のディアフィルトレーションを実施することにより、品質を更に改善することができる。このディアフィルトレーションはタンジェント限外濾過と同一原理で実施され、精製用緩衝液中の濃縮液の平衡を保ちながら、膜のカットオフ閾値を上回る寸法の汚染物質をより完全に除去することができる。更に、本願出願人はこの限外濾過の結果、ウイルスをその後、イオン交換カラムクロマトグラフィー又はゲル浸透クロマトグラフィーにより直接精製することができ、クロマトグラフィーの前に調製物を処理する必要なしにウイルス粒子のピークの優れた分離が得られることも立証した。これは特に予想外であり、有利である。実際に、Ｈｙｕｇｈｅらの上記論文に記載されているように、ウイルス調製物のクロマトグラフィー精製では並の結果しか得られず、ベンゾナーゼやシクロデキストリンによるウイルス懸濁液の前処理も必要である。従って、より詳細には本発明の方法はウイルスを限外濾過により回収することを特徴とする。上述のように、得られる濃縮液はウイルスの精製に直接使用可能である。この精製は、塩化セシウム勾配遠心分離や、サイズ、密度又は沈降係数に応じて粒子を分離することが可能な他の超遠心法等の従来慣用技術により実施することができる。実施例４に記載する結果は実際に、こうして得られたウイルスが特筆すべき特徴を示すことを実証している。特に、本発明によると、塩化セシウムの代わりにヨージキサノール−５，５’−［（２−ヒドロキシ−１，３−プロパンジイル）ビス（アセチルアミノ）］ビス［Ｎ，Ｎ’−ビス−（２，３−ジヒドロキシプロピル−２，４，６−トリヨード−１，３−ベンゼンカルボキサミド）］溶液を使用することができ、ウイルスはこの溶液中に平衡状態で相対密度１．１６〜１．２４で沈降する。この溶液は塩化セシウムとは異なり非毒性であるので、この溶液を使用すると有利である。更に、本願出願人は、得られた濃縮液からイオン交換メカニズム又はゲル浸透によりウイルスを直接精製することができ、前処理の必要なしにウイルス粒子のクロマトグラフィーピークの優れた分離が得られるという利点も立証した。従って、好ましい実施態様によると、ウイルスはアニオン交換クロマトグラフィーにより回収精製される。アニオン交換クロマトグラフィーには、セルロース、アガロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅゲル）、デキストラン（Ｓｅｐｈａｄｅｘゲル）、アクリルアミド（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌゲル、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌゲル）、シリカ（ＴＳＫ−ｇｅｌＳＷゲル）、ポリ［スチレン−ジビニルベンゼン］（Ｓｏｕｒｃｅゲル又はＰｏｒｏｓゲル）、エチレングリコール−メタクリレートコポリマー（ＴｏｙｏｐｅａｒｌＨＷ及びＴＳＫ−ｇｅｌＰＷゲル）、又は混合物（アガロース−デキストラン：Ｓｕｐｅｒｄｅｘゲル）等の種々の型の支持体を使用することができる。また、クロマトグラフィー分離を改善するために、本発明の範囲では以下の特徴をもつビーズ形の支持体を使用することが好ましい。 −できるだけ球状。 −直径が一定（完全に等しいか又はできるだけ均質なビーズ）で、欠陥や傷がない。 −できるだけ小さい直径。１０μｍのビーズが記載されている（例えばＰｈａｒｍａｃｉａのＭｏｎｏＢｅａｄｓ又はＴｏｓｏＨａａｓのＴＳＫ−ｇｅｌ）。この値はビーズ直径の下限であり、クロマトグラフィー精製しようとする対象をビーズの内側に浸透させるためには細孔径をもっと大きくする必要があると思われる（下記参照）。 −圧力に耐えるような強度に維持する。また、非常に大きい寸法（直径＞１００ｎｍ）のアデノウイルスをクロマトグラフィー精製するためには、ウイルス粒子を相互作用させようとする官能基に接触できるように、より高い細孔径上限あるいは最大限の上限をもつゲルを使用することが重要である。支持体はアガロース、デキストラン、アクリルアミド、シリカ、ポリ［スチレン−ジビニルベンゼン］、エチレングリコール−メタクリレートコポリマーから単独又は混合物として選択すると有利である。アニオン交換クロマトグラフィーに使用する支持体は、アニオン分子と相互作用することが可能な基をグラフトすることにより官能化する必要がある。より一般的には、このような基は第３級又は第４級アミンから構成される。例えばＤＥＡＥ等の第３級アミンを使用すると、弱アニオン交換体が得られる。第４級アミンを使用すると、強アニオン交換体が得られる。本発明の範囲では、強アニオン交換体を使用すると特に有利である。従って、本発明によると第４級アミンにより官能化した上記のようなクロマトグラフィー支持体を使用することが好ましい。第４級アミンにより官能化した支持体としては、例えばＳｏｕｒｃｅＱ、ＭｏｎｏＱ、ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅ、ＰｏｒｏｓＨＱ及びＰｏｒｏｓＱＥ樹脂、ＦｒａｃｔｏｇｅｌＴＭＡＥ型樹脂並びにＴｏｙｏｐｅａｒｌＳｕｐｅｒＱ樹脂を挙げることができる。本発明の範囲で使用可能な樹脂の好ましい例はＳｏｕｒｃｅ、特にＳｏｕｒｃｅＱ(例えば１５Ｑ(Ｐｈａｒｍａｃｉａ))、ＭｏｎｏＢｅａｄｓ（例えばＱ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））、ＰｏｒｏｓＨＱ及びＰｏｒｏｓＱＥ型樹脂であるＭｏｎｏＢｅａｄｓ支持体（ビーズ直径１０±０．５μｍ）は１０年以上前から市販されており、Ｓｏｕｒｃｅ（１５μｍ）又はＰｏｒｏｓ（１０μｍ又は２０μｍ）型の樹脂は約５年前から市販されている。後者２種の支持体は内部細孔分布が非常に広い（２０ｎｍ〜１μｍ）ため、非常に大型の対象がビーズを通過できるという利点がある。更に、これらの支持体は液体のゲル循環耐性が非常に小さく（従って圧力が非常に小さい）、非常に強靭である。従って、溶質は相互作用する官能基に非常に迅速に輸送される。本願出願人は、アデノウイルスの場合には寸法が大きいために拡散に時間がかかるので、これらのパラメーターが特に重要であることを立証した。実施例に記載する結果から明らかなように、アデノウイルスはただ１回のアニオン交換段階で濃縮液から精製することができ、精製収率が優れており（ｔｄｕで表すと１４０％であるが、Ｈｕｙｇｈｅｓらにより報告されている値は４９％）、分離も優れている。更に、実施例に記載する結果から明らかなように、得られるアデノウイルスは感染性が高いため、治療用途に必要な特性をもつ。強アニオン交換体即ち第４級アミンにより官能化した交換体、特にＳｏｕｒｃｅＱ樹脂を使用すると、特に有利な結果が得られた。ＳｏｕｒｃｅＱ１５樹脂が特に好ましい。この点で、本発明の別の目的は強アニオン交換クロマトグラフィーによる精製段階を含むことを特徴とする、生物培地からの組換えアデノウイルスの精製方法に関する。この態様によると、生物培地は前記ウイルスを産生するパッケージング細胞の上清、前記ウイルスを産生するパッケージング細胞の溶解液又は前記ウイルスの予備精製溶液であり得る。クロマトグラフィーは第４級アミンで官能化した支持体で実施することが好ましい。同様に好ましい態様によると、支持体はアガロース、デキストラン、アクリルアミド、シリカ、ポリ［スチレン−ジビニルベンゼン］、エチレングリコール−メタクリレートコポリマーから単独又は混合物として選択される。特に有利な実施態様は、ＳｏｕｒｃｅＱ、好ましくはＳｏｕｒｃｅＱ１５樹脂上でクロマトグラフィーを行うことを特徴とする。更に、上記方法は産生細胞の上清から実施すると有利であり、予備限外濾過段階を含む。この段階は、上記条件下で実施すると有利であり、特に、３００〜５００ｋＤａのカットオフ閾値をもつ膜によるタンジェント限外濾過である。本発明の方法の別の実施態様によると、ゲル浸透クロマトグラフィーによりウイルスを回収精製する。ゲル浸透は上清、濃縮液、又はアニオン交換クロマトグラフィーからのウイルスで直接実施することかできる。この段階ではアニオン交換クロマトグラフィーについて上述した支持体を官能化せずに使用することができる。この点で、好ましい支持体はアガロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅゲル）、デキストラン（Ｓｅｐｈａｄｅｘゲル）、アクリルアミド(Ｓｅｐｈａｃｒｙｌゲル、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌゲル)、シリカ（ＴＳＫ−ｇｅｌＳＷゲル）、エチレングリコール−メタクリレートコポリマー（ＴｏｙｏｐｅａｒｌＨＷ及びＴＳＫ− ｇｅｌＰＷゲル）、又は混合物（アガロース−デキストラン：Ｓｕｐｅｒｄｅｘゲル）である。特に好ましい支持体はＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨＲ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−５００ＨＲ、Ｓ−１０００ＨＲ又はＳ−２０００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ＴＳＫＧ６０００ＰＷ（ＴｏｓｏＨａａｓ）である。従って、本発明による好ましい方法は限外濾過後にアニオン交換クロマトグラフィーを実施する。別の好ましい方法は、限外濾過後にアニオン交換クロマトグラフィーを実施し、更にその後にゲル浸透クロマトグラフィーを実施する。本発明の別の態様は、第１の超速心段階と、第２の希釈又は透析段階と、第３のアニオン交換クロマトグラフィー段階を含む、生物培地からのアデノウイルスの精製方法に関する。この態様によると、第１段階は塩化セシウム勾配で急速超遠心により実施することが好ましい。急速なる用語は約０．５〜４時間の超遠心を意味する。第２段階ではウイルスをバッファで希釈又は透析し、クロマトグラフィーゲルへの注入と超遠心溶媒の除去を容易にする。第３段階は上記のようなアニオン、好ましくは強アニオン交換クロマトグラフィーを使用することにより実施する。上清から回収した（又は場合により細胞内）ウイルスから出発する典型的実験では、（実施例３に記載するように）塩化セシウムを使用して第１の急速超遠心段階を実施する。次に、（例えば緩衝液１０容量で）サンプルを単に希釈後又は緩衝液で単に透析後に、（実施例５．１に記載するように）サンプルをイオン交換クロマトグラフィーにかける。本発明の方法のこの態様の利点は、２種の全く異なるウイルス分離方法（密度と表面電荷）を使用する結果、場合によりこれらの２方法の性能を兼備する品質レベルにウイルスを導くことができるという点にある。更に、クロマトグラフィー段階は超遠心に使用した溶媒（例えば塩化セシウム又は他の任意の上記等価溶媒）を同時に除去することができる。本発明の別の目的は、アデノウイルスの精製のためのヨージキサノール−５，５’−［（２−ヒドロキシ−１，３−プロパンジイル）ビス（アセチルアミノ）］ビス［Ｎ，Ｎ’−ビス−（２，３−ジヒドロキシプロピル−２，４，６−トリヨード−１，３−ベンゼンカルボキサミド）］の使用に関する。本発明の方法を実施するためには、アデノウイルスの種々のパッケージング細胞を使用することができる。特に、パッケージング細胞は医薬的に使用可能な種々の細胞、即ち工業的に許容可能な条件下で培養可能であり、病原性が認められていない細胞から作製することができる。このような細胞としては、樹立細胞系又は初代培養物、特にヒト網膜芽細胞、ヒト肺癌細胞又は胎児腎細胞が挙げられる。アデノウイルスにより感染可能なヒト起源の細胞が有利である。この点では、ＫＢ、ＨｅＬａ、２９３、Ｖｅｒｏ、ｇｍＤＢＰ６、ＨＥＲ、Ａ５４９、ＨＥＲ等の細胞を挙げることができる。ＫＢ系細胞はヒト表皮癌腫に由来する。この細胞とその培養条件はＡＴＣＣ（ＣＣＬ１７参照）から入手できる。ヒトＨｅＬａ細胞系はヒト上皮癌腫に由来する。この細胞とその培養条件もＡＴＣＣ（ＣＣＬ２参照）から入手できる。２９３系細胞はヒト胎児腎細胞である（Ｇｒａｈａｍら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６（１９７７）５９）。この系は特にヒトアデノウイルスＡｄ５のゲノムの左側部分（１２％）をそのゲノムに組込んでいる。ｇｍＤＢＰ６細胞系（Ｂｒｏｕｇｈら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１９０（１９９２）６２４）はＭＭＴＶのＬＴＲの制御下のアデノウイルスのＥ２遺伝子をもつＨｅＬａ細胞から構成される。細胞は、イヌ起源の細胞（ＢＨＫＮＭＤＣＫ等）でもよい。この点では、イヌＭＤＣＫ系の細胞が好ましい。ＭＤＣＫ細胞の培養条件は特にＭａｃａｔｎｅｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ４４（１９８８）９に記載されている。種々のパッケージング細胞系が文献に記載されており、これらについては実施例に記載する。アデノウイルスのＥ１機能をトランス相補する細胞が有利である。アデノウイルスのＥ１機能とＥ４機能又はＥ１機能とＥ２ａ機能トランス相補する細胞がより好ましい。これらの細胞はヒト胎児腎もしくは網膜又はヒト肺癌細胞に由来するものが好ましい。従って、本発明は特に有利な組換えアデノウイルスの製造方法を提供する。この方法は１個以上の領域を欠損する組換えウイルス、特にＥ１領域又はＥ１領域とＥ４領域を欠損するウイルスの製造に適している。また、上記のような種々の血清型のアデノウイルスの製造にも適用可能である。特に有利な態様によると、本発明の方法はアデノウイルスＡｄ５の配列上のヌクレオチド４５４〜ヌクレオチド３３２８のＰｖｕＩＩ−ＢｇｌＩＩフラグメントの欠失によりＥ１領域が不活化された組換えアデノウイルスの製造に使用される。この配列は文献に記載されており、データベース（特にＧｅｎｅｂａｎｋＮｏ．Ｍ７３２６０参照）からも入手できる。別の好適実施態様では、Ｅ１領域はヌクレオチド３８２〜ヌクレオチド３４４６のＨｉｎｆＩＩ−Ｓａｕ３Ａフラグメントの欠失により不活化される。特定態様では、本方法はＥ４領域の全部を欠失するベクターを製造することができる。これは、ヌクレオチド３５８３５〜３２７２０に対応するＭａｅＩＩ−ＭｓｃＩフラグメントの除去により実施できる。別の特定態様では、Ｅ４の機能部分のみが欠失している。この部分は少なくとも読取り枠ＯＲＦ３及びＯＲＦ６を含む。例えば、これらのコーディング領域はヌクレオチド３４８０１〜３４３２９及び３４１１５〜３３１２６に夫々対応するＰｖｕＩＩ−ＡｌｕＩ及びＢｇＩＩＩ−ＰｖｕＩＩフラグメントとしてゲノムから欠失させることができる。本発明の範囲では、ウイルスＡｄ２ｄｌ８０８又はウイルスＡｄ５ｄｌ１００４、Ａｄ５ｄｌ１００７、Ａｄ５ｄｌ１０１１又はＡｄ５ｄｌ１０１４のＥ４領域の欠失も使用することができる。この点では、本発明の細胞は不活性Ｅ１領域と、Ａｄ５ｄｌ１０１４のゲノムに存在する型のＥ４領域の欠失を含むウイルス即ち読取り枠ＯＲＦ４を保存するＥ４−ウイルスの製造に特に有利である。上述のように、Ｅ１領域の欠失はＥ１Ａ及びＥ１Ｂ領域の全部又は一部に相当すると有利である。この欠失はウイルスが細胞中で自律的に複製できなくなるために十分でなければならない。本発明によるアデノウイルスのＥ１領域の欠失部分はヌクレオチド４５４〜３３２８又は３８２〜３４４６に相当すると有利である。上記位置は、データベースから入手可能な野生型アデノウイルスＡｄ５の公知配列上の位置である。種々の血清型のアデノウイルス間には多少の相違が存在し得るが、これらの位置は任意血清型、特にアデノウイルスＡｄ２及びＡｄ７から本発明により組換えアデノウイルスを構築するのに一般に適用できる。更に、製造されるアデノウイルスはそのゲノムのレベルに他の変異をもっていてもよい。特に、ウイルスの能力を増加し、ウイルス遺伝子の発現に結び付けられるその副作用を減らすように他の領域を欠失していてもよい。例えば、特にＥ３又はＩＶａ２領域の全部又は一部を欠失していてもよい。但し、Ｅ３領域については、ｇｐ１９Ｋタンパタ質をコードする部分は保存しておくと特に有利である。このタンパク質は実際に、アデノウイルスベクターが（ｉ）その作用を制限したり、（ｉｉ）望ましくない副作用を生じたりするような免疫反応を受けないようにすることができる。特定態様によると、Ｅ３領域を欠失させ、ｇｐ１９ｋタンパク質をコードする配列を異種プロモーターの制御下に再導入する。上述のように、アデノウイルスは遺伝子及び細胞治療用として非常に有効な遺伝子導入用ベクターを構成する。このためには、細胞、臓器又は生物への導入及び／又は発現が所望される異種核酸配列をそのゲノムに挿入すればよい。この配列は、標的細胞で転写及び場合により翻訳されると治療効果をもつ物質を生成する遺伝子等の１種以上の治療用遺伝子を含み得る。治療物質としては、特に酵素、血液誘導体、ホルモン、リンホカイン（例えばインターロイキン、インターフェロン、ＴＮＦ等）（ＦＲ９２０３１２０）、成長因子、神経伝達物質又はその前駆物質もしくは合成酵素、栄養因子（例えばＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＧＦ、ＴＧＦ、ＧＭＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＮＴ３、ＮＴ５等）、アポリポタンパク質（例えばＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩＶ、ＡｐｏＥ等）（ＷＯ９４／２５０７３）、ジストロフィン又はミニジストロフィン（ＷＯ９３／０６２２３）、腫瘍抑制遺伝子（例えばｐ５３、Ｒｂ、Ｒａｐ１ａ、ＤＣＣ、ｋ−ｒｅｆ等）（ＷＯ９４／２４２９７）、因子ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ等の凝血関連因子をコードする遺伝子、自殺遺伝子（例えばチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ等）、更には天然又は人工免疫グロブリン（Ｆａｂ）ＳｃＦｖ等、ＷＯ９４／２９４４６）の全部又は一部等を挙げることができる。治療用遺伝子は標的細胞で発現されると遺伝子の発現又は細胞ｍＲＮＡの転写を制御することが可能なアンチセンス遺伝子又は配列でもよい。このような配列はヨーロッパ特許第１４０３０８号に記載の方法に従い、例えば標的細胞で細胞ｍＲＮＡの相補的ＲＮＡに転写すると、そのタンパク質翻訳を阻止することができる。治療用遺伝子はワクチン製造の目的では、ヒトで免疫応答を生じることが可能な抗原性ペプチドをコードする遺伝子でもよい。このような遺伝子としては特に、エプスタイン−バールウイルス、ＨＩＶウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＥＰ１８５５７３）、疑狂犬病ウイルスの特異抗原ペプチド、又は腫瘍特異抗原ペプチド（ＥＰ２５９２１２）が挙げられる。一般に、異種核酸配列は感染細胞で機能的な転写プロモーター領域と、目的遺伝子の３’側に配置され、転写終結シグナル及びポリアデニル化部位に相当する領域も含む。これらの要素の集合が発現カセットを構成する。プロモーター領域については、感染細胞で機能できるときに目的遺伝子の発現に天然に関与するプロモーター領域とすることができる。（合成タンパク質も含めた他のタンパク質の発現に関与する）別の起源の領域でもよい。特に、ある遺伝子の転写を特異的又は非特異的及び誘導的又は非誘導的に刺激又は抑制する真核もしくはウイルス遺伝子のプロモーター配列又は任意のプロモーター配列もしくは誘導配列を挙げることができる。例えば、感染させたい細胞のゲノム、又はウイルスのゲノムに由来するプロモーター配列、特にアデノウイルスのＥ１Ａ，ＭＬＰ遺伝子のプロモーター、ＣＭＶ、ＬＴＲ−ＲＳＶプロモーター等を挙げることができる。真核プロモーターとして、ユビキチンプロモーター（ＨＰＲＴ、ビメンチン、α−アクチン、チューブリン等）、中間フィラメント（デスミン、ニューロフィラメント、ケラチン、ＧＦＡＰ等）のプロモーター、治療用遺伝子のプロモーター（ＭＤＲ、ＣＦＴＲ、ＶＩＩＩ因子型等）、組織特異的プロモーター（ピルビン酸キナーゼ、ビリン、脂肪酸結合腸タンパク質のプロモーター、平滑筋細胞のαアクチンプロモーター、肝特異的プロモーター、ＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩＩ、ヒトアルブミン等）又は刺激応答プロモーター（ステロイドホルモンレセプター、レチノイン酸レセプター等）も挙げることができる。更に、活性化配列、調節配列又は組織特異的発現もしくは最大発現を可能にする配列を付加してこれらの発現配列を改変してもよい。また、挿入する核酸が発現配列を含まない場合には、このような配列の下流で欠損ウイルスのゲノムに挿入してもよい。更に、異種核酸配列は標的細胞の分泌経路に合成治療物質を導くシグナル配列を特に治療用遺伝子の上流に含んでいてもよい。このシグナル配列は治療物質の天然シグナル配列でもよいし、他の任意の機能的シグナル配列又は人工シグナル配列でもよい。治療用遺伝子の発現カセットは従来技術に記載の方法に従って組換えアデノウイルスのゲノムの種々の部位に挿入することができる。まず第１に、Ｅ１欠失のレベルに挿入することができる。配列の付加又は置換によりＥ３領域のレベルに挿入してもよい。また、欠失Ｅ４領域のレベルに挿入してもよい。本発明は更に、本発明の方法により得られる精製ウイルス調製物と、この方法により製造される１種以上の組換え欠損アデノウイルスを含む全医薬組成物にも関する。本発明の医薬組成物は局所、経口、非経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下、眼内、経皮等の経路で投与するように調剤することができる。医薬組成物は注射用製剤に医薬的に許容可能なキャリヤーを含むことが好ましい。キャリヤーとしては、特に滅菌等張塩類溶液（リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム等、又はこのような塩の混合物）、又は場合に応じて滅菌水もしくは生理的血清を加えて注射可能な溶質を構成し得る乾燥（特に凍結乾燥）組成物が挙げられる。例えばヒドロゲル等の他のキャリヤーも利用できる。このヒドロゲルは生体適合性で非細胞毒性の任意の（ホモ又はヘテロ）ポリマーから調製できる。このようなポリマーは例えば国際出願ＷＯ９３／０８８４５に記載されている。特にエチレンオキシド及び／又はプロピレンオキシドから得られるようなポリマーは市販されている。注射に使用するウイルス用量は種々のパラメーター、特に使用する投与経路、該当疾病、発現させようとする遺伝子、又は所望の治療期間に応じて適応できる。一般に、本発明による組換えアデノウイルスは１０４〜１０１４ｐｆｕ、好ましくは１０⁶〜１０¹⁰ｐｆｕの用量形態で調剤及び投与される。ｐｆｕ（「プラーク形成単位」）なる用語はアデノウイルス溶液の感染能に対応し、適当な細胞培養物の感染により測定され、一般に１５日後の感染細胞のプラーク数を表す。ウイルス溶液のｐｆｕ力価の測定方法は文献に詳細に記載されている。治療用遺伝子に応じて、こうして製造したウイルスを遺伝病（ジストロフィー、嚢胞性線維症等）、神経変性病（アルツハイマー病、パーキンソン病、ＡＬＳ等）、癌、凝血障害又はリポタンパク異常血症に結び付けられる疾病、ウイルス感染に結び付けられる疾病（肝炎、ＡＩＤＳ等）等を含む多数の疾病の治療又は予防に使用することができる。以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、これらの実施例は単なる例示であり、発明を制限するものではない。図面の説明図１：実施例４により精製したアデノウイルスの安定性試験。図２：実施例４により精製したアデノウイルスの（逆相）ＨＰＬＣ分析。実施例３のアデノウイルスとの比較。図３：半定量的ＰＣＲ及びプラークアッセイにより測定した２９３細胞上清へのアデノウイルスＡｄ−βＧａｌの放出速度。図４：限外濾過したアデノウイルス上清（実施例５．１）のＳｏｕｒｃｅＱ１５による溶離プロフィル。図５：限外濾過したアデノウイルス上清（実施例５．１）からＳｏｕｒｃｅＱ１５樹脂クロマトグラフィーにより回収したウイルスピークのＲｅｓｓｏｕｒｃｅＱによるＨＰＬＣ分析。図６：（Ａ）限外濾過したアデノウイルスＡｄ−ＡＰＯＡ１上清（実施例５．３）のＳｏｕｒｃｅＱ１５樹脂による溶離プロフィル。（Ｂ）回収したウイルスピークのＨＰＬＣ（ＲｅｓｓｏｕｒｃｅＱ）分析。図７：（Ａ）限外濾過したアデノウイルスＡｄ−ＴＫ上清（実施例５．３）のＳｏｕｒｃｅＱ１５による溶離プロフィル。回収した種々のウイルスフラクション（ピークの始点から終点）即ちピークの中間のフラクションＦ２（Ｂ）、ピークの後部のフラクションＦ３（Ｃ）、ピークの終点のフラクションＦ４（Ｄ）のＨＰＬＣ（ＲｅｓｓｏｕｒｃｅＱ）分析。図８：アデノウイルス産生細胞培養物の濃縮上清（実施例５．４）のＭｏｎｏＱ樹脂による溶離プロフィル。ＢＧ２５Ｆ１：セシウムで精製したウイルス濃縮土清。ＢＧ２５Ｃ：濃縮感染上清。図９：アデノウイルス産生細胞培養物の濃縮上清（実施例５．４）のＰＯＲＯＳＨＱゲルによる溶離プロフィル。ＢＧ２５Ｆ１：セシウムで精製したウイルス濃縮上清。ＢＧ２５Ｃ：濃縮感染上清。図１０：限外濾過したアデノウイルス上清のＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ１０００ＨＲ／Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨＲによるケル浸透精製プロフィル。図１１：本発明により精製したアデノウイルスストックの電子顕微鏡分析。図１２：密度１．２７のウイルスバンドの電子顕微鏡分析。一般分子生物学技術プラスミドＤＮＡの分取抽出、プラスミドＤＮＡの塩化セシウム勾配遠心分離、アガロース又はアクリルアミドケル電気泳動、ＤＮＡフラグメントの電気溶離精製、タンパク質のフェノール又はフェノール−クロロホルム抽出、塩類溶媒中のＤＮＡのエタノール又はイソプロパノール沈降、大腸菌での形質転換等の分子生物学で慣用的に使用されている方法は当業者に周知であり、文献に詳細に記載されている［ＭａｎｉａｔｉｓＴ．ら，“ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ａＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ”，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８２；ＡｕｓｕｂｅｌＦ．Ｍ.ら（編）,“ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ”，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８７］。ｐＢＲ３２２型のプラスミド、ｐＵＣ及びＭ１３系ファージは市販品とする（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。連結に際しては、ＤＮＡフラグメントをアガロース又はアクリルアミドゲル電気泳動によりそのサイズに応じて分離し、フェノール又はフェノール／クロロホルム混合物で抽出し、エタノール沈降させた後、製造業者の指示に従ってＴ４ファージのＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）の存在下でインキュベートすればよい。付着５ ’末端の充填は製造業者の指示に従って大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｂｉｏｌａｂｓ）のＫｌｅｎｏｗフラグメントにより実施することができる。付着３’ 末端の破壊は、Ｔ４ファージのポリメラーゼＤＮＡ（Ｂｉｏｌａｂｓ）を製造業者の指示に従って使用することにより実施される。付着５’末端の破壊はヌクレアーゼＳ１で処理することにより実施される。合成オリゴヌクレオチドによるｉｎｖｉｔｒｏ突然変異誘発は、Ａｍｅｒｓｈａｍから市販されているキットを使用することにより、Ｔａｙｌｏｒら[ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１３（１９８５）８７４９−８７６４]により開発された方法に従って実施することができる。所謂ＰＣＲ法［Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ− ｃａｔａｌｙｚｅｄＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ，ＳａｉｋｉＲ．Ｋ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３０（１９８５）１３５０−１３５４；ＭｕｌｌｉｓＫ．Ｂ．とＦａｌｏｏｎａＦ．Ａ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１５５（１９８７）３３５−３５０］によるＤＮＡフラグメントの酵素増幅は、「ＤＮＡサーマルサイクラー」（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ）を製造業者の指示に従って使用することにより実施することができる。ヌクレオチド配列の確認は、Ａｍｅｒｓｈａｍにより市販されているキットを使用することにより、Ｓａｎｇｅｒら［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４（１９７７）５４６３−５４６７］により開発された方法により実施することができる。実施例実施例１：パッケージング細胞系本発明の範囲で使用されるパッケージング細胞は、アデノウイルスにより感染可能であり且つ治療用途に適合可能な任意細胞系から得られる。以下の細胞系から選択した細胞が特に好ましい。 −２９３系細胞２９３系はアデノウイルス血清型５（Ａｄ５）のゲノムの左側末端（約１１〜１２％）を含むヒト胎児腎細胞系であり、左側ＩＴＲ、パッケージング領域、Ｅ１ａ，Ｅ１ｂを含むＥ１領域、ｐＩＸタンパク質をコードする領域及びｐＩＶａ２タンパク質をコードする領域の一部を含む（Ｇｒａｈａｍら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６（１９７７）５９）。この系はＥ１領域を欠損即ちＥ１領域の全部又は一部を欠失する組換えアデノウイルスをトランス相補することができ、高力価をもつウイルスストックを産生することかできる。 −Ａ５４９系細胞アデノウイルスのＥ１領域を相補する細胞をＡ５４９細胞から構築した（Ｉｍｌｅｒら，ＧｅｎｅＴｈｅｒ．（１９９６）７５）。これらの細胞は、誘導プロモーターの制御下におかれたＥ１領域から左側ＩＴＲを除去したフラグメントを含む。 −ＨＥＲ系細胞ヒト胎児網膜細胞（ＨＥＲ）はアデノウイルスにより感染可能である（Ｂｙｒｄら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ２（１９８８）４７７）。これらの細胞から作製したアデノウイルスパッケージング細胞は例えば国際出願ＷＯ９４／２８１５２又はＦａｌｌａｕｘらの論文（Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．（１９９６）２１５）に記載されている。具体的には、ＨＥＲ細胞のゲノムに組み込まれたヌクレオチド７９〜ヌクレオチド５７８９のアデノウイルスＡｄ５のゲノムのＥ１領域を含む９１１系を挙げることができる。この細胞系はＥ１領域を欠損するウイルスを産生することができる。 −ＩＧＲＰ２細胞ＩＧＲＰ２細胞は誘導プロモーターの制御下のＥ４領域の機能ユニットを組み込むことにより２９３細胞から得られる細胞である。これらの細胞はＥ１及びＥ４領域を欠損するウイルスを産生することができる（Ｙｅｈら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ（１９９６）７０）。 −ＶＫ細胞ＶＫ（ＶＫ２−２０及びＶＫ１０−９）細胞は誘導プロモーターの制御下のＥ４領域全体とｐＩＸタンパク質をコードする領域を組み込むことにより２９３細胞から得られる細胞である。これらの細胞はＥ１及びＥ４領域を欠損するウイルスを産生することができる（Ｋｒｏｕｇｌｉａｋら，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．６（１９９５）１５７５）。 −２９３Ｅ４細胞２９３Ｅ４細胞はＥ４領域全体を組み込むことにより２９３細胞から得られる細胞である。これらの細胞はＥ１及びＥ４領域を欠損するウイルスを産生することができる（ＷＯ９５／０２６９７；ＣａｎｃｅｒＧｅｎｅＴｈｅｒ．（１９９５）３２２）。実施例２：使用したウイルス下記実施例の範囲で作製したウイルスは大圃菌のＬａｃＺマーカー遺伝子を含むアデノウイルス（Ａｄ−βＧａｌ）、Ｉ型ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼをコードする遺伝子を含むアデノウイルス（Ａｄ−ＴＫ）、ヒト腫瘍抑制タンパク質をコードする遺伝子ｐ５３を含むアデノウイルス、及びアポリポタンパク質Ａ１をコードするウイルス（Ａｄ−ａｐｏＡＩ）である。これらのウイルスは血清型Ａｄ５から誘導され、以下の構造をもつ。 −例えばヌクレオチド３８２（ＨｉｎｆＩ部位）〜３４４６（Ｓａｕ３ａ部位）におけるＥ１領域の欠失。 −ＲＳＶ又はＣＭＶプロモーターの制御下に前記欠失のレベルに挿入された遺伝子発現カセット。 −Ｅ３領域の欠失。これらのウイルスの構築は文献に記載されている（ＷＯ９４／２５０７３、ＷＯ９５／１４１０２、ＦＲ９５．０１６３２、Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ（１９９２）ｐ６２６）。当然のことながら、本発明の方法により他の任意構築物も作製でき、特に他の異種遺伝子及び／又は他の欠失（例えばＥ１／Ｅ４又はＥ１／Ｅ２）をもつウイルスを作製することができる。実施例３：細胞溶解によるウイルスの作製本実施例は、産生されたウイルスを回収するためにパッケージング細胞を溶解する従来技術のウイルス作製を再現する。２９３細胞にＡｄ−βＧａｌ又はＡｄ−ＴＫウイルス（実施例２）のプレストックを細胞１個当たりウイルス３〜５個の割合（感染多重度ＭＯＩ＝３〜５）で８０〜９０％集密まで培養器内感染させる。インキュベーションを４０〜７２時間続け、細胞の増殖、屈折性増加、培養基接着の減弱を顕微鏡で観察することにより回収時期を判断する。文献によると、ウイルスサイクルの周期は２４〜３６時間である。実験室作製レベルでは、細胞を損失せずに回収時点で感染培地を除去するように、細胞が分離する前に回収し、その後、最小容量にとることが重要である（濃度倍率は培養寸法に応じて約１０〜１００倍である）。その後、３〜６回の連続融解サイクル（ドライアイスで−７０℃に冷却したエタノール、３７℃水浴）により核からウイルスを放出させる。その後、得られた細胞溶解液を低速（２０００〜４０００ｒｐｍ）で遠心分離した後、上清（清澄化細胞溶解液）を２段階の塩化セシウム勾配超遠心により精製する。 −第１段階はウイルスの密度（１．３４）を挟む１．２５及び１．４０の２つのセシウム層で３５０００ｒｐｍローターｓｗ４１で１．５時問急速に超遠心し、培地のタンパク質からウイルスを分離する。ローターは処理しようとする容量に応じて「スイング」ローター（Ｓｗ２８、Ｓｗ４１Ｂｅｃｋｍａｎ）でもよいし、アングルローター（Ｔｉ４５、Ｔｉ７０、Ｔｉ７０．１Ｂｅｃｋｍａｎ）でもよい。 −第２段階は、より長時間（使用するローターに応じて１０〜４０時間）、例えばローターｓｗ４１で３５０００ｒｐｍで１８時間の勾配超遠心であり、ウイルスの真の固有の精製段階を構成する。ウイルスは直線勾配中に平衡状態で密度１．３４で存在する。一般に、この段階でウイルスのバンドは最大である。他方、より低密度の細い２つのバンドも観察され、電子顕微鏡試験によると、密度が大きいほうのバンドは空の又は破壊したウイルス粒子であり、密度が小さいほうのバンドはウイルスサブユニット（ペントン、ヘキソン）であることが判明した。この段階後にチューブに針を刺してウイルスを回収し、Ｇ２５で透析又は脱塩によりセシウムを除去する。実施例４：上清中のウイルス作製本実施例は自然放出後の回収によるウイルス作製実験に関する。放出後にウイルスを限外濾過により回収後、塩化セシウムにより精製する。４．１．プロトコール本方法では実施例３と異なり、細胞を感染後４０〜７２時間で回収せず、凍結 −融解サイクルを実施する必要なしに細胞の完全溶解を得るように、インキュベーションを８〜１２日間続ける。その後、漸減細孔径（１０μｍ／１．０μｍ／０．８〜０．２μｍ）のディープフィルターで濾過して上清を清澄化する。ウイルスは０．１μｍの寸法であり、この段階で最小細孔径（０．２２μｍ）のフィルターで保持することによるウイルスの損失は全く観察されなかった。一旦清澄化した上清をその後、カットオフ閾値３００ｋＤａのＭｉｌｌｉｐｏｒｅスパイラルメンブランでタンジェント限外濾過により濃縮する。本発明で報告する実験では、濃縮倍率は１００ｍｌのシステムの死容積に基づく。このシステムで容量４〜２０リットルの上清を濃縮すると、容量１００ｍｌ〜２００ｍｌの濃縮液を難なく得ることができた（濃縮倍率２０〜１００倍に対応）。その後、濃縮液を０．２２μｍで濾過した後、実施例３に記載したように塩化セシウム遠心分離により精製し、次いで透析段階を実施した。４．２．結果純度細胞内ウイルス（実施例３）のチューブは凝塊（脂質、タンパク質）が時折ウイルスバンドにぶつかって濁った様相を示すが、本発明の方法により第１の塩化セシウム遠心分離段階後に得られたウイルス調製物は培地の汚染物質から既に十分に分離したウイルスバンドを示し、汚染物質は上層に保持される。ＲｅｓｏｕｒｃｅＱカラムによる高性能液体クロマトグラフィー分析（実施例５）も感染上清の限外濾過により得られた出発材料のこの純度利得を立証し、核酸（ＯＤ２６０／２８０比１．８以上）及びタンパク質（ＯＤ２６０／２８０比１未満）汚染物質は減少する。３７℃における上清中のウイルスの安定性感染性培養土清のアリコートを感染後３７℃で種々の時間インキュベーション後に分取し、プラークアッセイ法によりウイルスの安定性を滴定により測定した。結果は以下の通りである。ウイルスＡｄ−ＴＫ：・感染後１０日力価＝３．５×１０８ｐｆｕ／ｍｌ・感染後２０日力価＝３．３×１０８ｐｆｕ／ｍｌウイルスＡｄ−βＧａｌ：・感染後８日力価＝５．８×１０８ｐｆｕ／ｍｌ・感染後９日力価＝３．６×１０８ｐｆｕ／ｍｌ・感染後１０日力価＝３．５×１０８ｐｆｕ／ｍｌ・感染後１３日力価＝４．１×１０８ｐｆｕ／ｍｌ・感染後１６日力価＝５．５×１０８ｐｆｕ／ｍｌ得られた結果から明らかなように、感染後少なくとも２０日まで上清の力価は用量精度範囲内で安定である。更に、図１に示すように溶離用緩衝液中でウイルスは−２０℃と同様に−８０℃でも少なくとも８カ月安定である。調製物の比感染性このパラメーターはＨＰＬＣにより測定したウイルス粒子数とｐｆｕ値の比に対応し、ウイルス調製物の感染能を表す。ＦＤＡ勧告によると、このパラメーターは１００未満でなければならない。このパラメーターは次のように測定した。２９３細胞を入れた２系列の培養びんに同時に同時点で同一条件下で同一ウイルスプレストックを感染させた。この実験は組換えアデノウイルスＡｄ−βｇａｌで実施した後、アデノウイルスＡｄ−ＴＫでも実施した。各アデノウイルスで一方の系列のびんは感染後４８時間に回収し、凍結−融解後にセシウム勾配で精製した細胞内ウイルス生産サンプルとする。他方の系列は感染後１０日間インキュベートし、上清からウイルスを回収する。得られた精製調製物をプラークアッセイにより滴定し、６．４Ｍグアニジンでサンプルを変性後にＣ４Ｖｙｄａｃ４．６×５０ｍｍカラムで逆相ＨＰＬＣによりＰＶＩＩタンパク質濃度を測定することにより、合計ウイルス粒子数を定量する。ウイルス１個当たり７２０ＰＶＩＩコピーとしてＰＶＩＩタンパク質の量をウイルス粒子数に相関させる（Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第２版（１９９０））。１．０吸光度単位＝粒子１．１×１０¹²個／ｍｌを比吸光係数として２６０ｎｍでデンシトメトリー法により測定した精製調製物のウイルス粒子数に前記方法を相関させる。得られた結果によると、ウイルスＡｄ−βＧａｌではこの比は上清ウイルスで１６、細胞内ウイルスで４５である。ウイルスＡｄ−ＴＫでは、この比は上清法でウイルスを回収した場合には７８、細胞内法により回収したウイルスでは８０である。電子顕微鏡分析この方法は空の粒子又は同時に精製された遊離ウイルスサブユニットの存在を検出すると共に、精製ウイルス調製物のタンパク質汚染又はウイルス粒子の解離不能な凝集物の存在を評価することができる。プロトコール：サンプル２０μｌを炭素格子に堆積し、ネガティブ着色観察のために１．５％酢酸ウラシルで処理する。観察には５０ｋＶ〜１００ｋＶのＪｅｏｌ１０１０電子顕微鏡を使用する。結果：上清から回収したウイルスを分析すると、汚染物質も凝集物も空のウイルス粒子もない適正な調製物を示す。更に、ウイルスの繊維とその規則的な幾何構造を認めることができる。これらの結果は、本発明により得られるウイルス粒子の高品質を裏付けている。ＨＰＬＣ及びＳＤＳＰＡＧＥによるタンパク質プロフィルの分析ＳＤＳＰＡＧＥ分析：サンプル２０μｌをＬａｅｍｍｌｉバッファー（Ｎａｔｕｒｅ２２７（１９９０）６８０−６８５）で希釈し、５分問９５℃で還元した後、１ｍｍ×１０ウェル、４→２０％勾配のＮｏｖｅｘゲルに加える。泳動後、ゲルをクーマシーブルー染色し、ＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒＶＤＳＰｈａｒｍａｃｉａで分析する。分析によると、上清から回収したウェルの電気泳動プロフィルは文献のデータに一致する（ＬｅｎｎａｒｔＰｈｉｌｉｐｓｏｎ，１９８４Ｈ．ＳＧｉｎｓｂｅｒｇ編，Ｐｌｅｎｕｍｐｒｅｓｓ，３１０−３３８）。逆相ＨＰＬＣ分析：図２は、細胞内から回収した２つのウイルスサンプルと上清法により精製した１つのウイルスサンプルから得られた３種のクロマトグラムを重ねたものである。実験条件は、カラムＶｙｄａｃｒｅｆ２５４Ｔｐ５４０５，ＲＰＣ４４．６×５０ｍｍ、溶媒Ａ：Ｈ₂０＋０．０７％ＴＦＡ、溶媒Ｂ：ＣＨ₃ＣＮ＋０．０７％ＴＦＡ、直線勾配：Ｔ＝０分％Ｂ＝２５；Ｔ＝５０分％Ｂ＝５０％；流速＝１ｍｌ／分、デテクター＝２１５ｎｍである。クロマトグラムはサンプル間の完全な一致を示し、各ピークの相対強度に差はない。各ピークの種をシーケンシングにより決定すると、存在するタンパク質はすべてウイルスに由来することが判明した（下表参照）。トランスダクション効率及び細胞毒性のｉｎｖｉｔｒｏ分析２４穴プレートで培養したＨＣＴ１１６細胞にＭＯＩを漸増させながら感染させ、感染後２及び５日に非感染対照に対する生存細胞の百分率をクリスタルバイオレット染色法により測定することにより、細胞毒性分析を実施する。結果を下表に示す。トランスダクション効率の分析２４穴プレートで培養した複製に許容不能なＷ１６２細胞にウイルス粒子濃度を漸増させながら感染させることにより、アデノウイルスＡｄ−βＧａｌの調製物のトランスダクション効率を測定する。同一量のウイルス粒子を堆積し、基質としてＸ−ｇａｌと共にインキュベーション後にβ−ガラクトシダーゼ活性を発現する細胞を感染後４８時間に計数する。各青色細胞を１トランスダクション単位（ＴＤＵ）として計数し、結果にサンプルの希釈度を乗じ、サンプルのトランスダクション単位で表した濃度を得る。次に、ＴＤＵで表した濃度に対するウイルス粒子濃度の比を計算することによりトランスダクション効率を表す。得られた結果は、精製ウイルスが良好なｉｎｖｉｔｒｏトランスダクション効率を示すことを立証する。ｉｎｖｉｖｏ脳内発現の分析本発明によるアデノウイルスのｉｎｖｉｖｏ遺伝子導入及び発現効率を評価する目的で、アデノウイルスを免疫適格マウスＯＦ１の線条体に定位経路で注入した。このために、１０⁷ｐｆｕのウイルス１μｌ容量を（門歯バーを０ｍｍとして）前後方＋０．５、中外側２、深さ−３．５の定位点に注入した。注入後７日に脳を分析した。得られた結果によると、トランスダクション効率が高く、数千の細胞が導入され、非常に強い核内発現と、高頻度で強い細胞質内拡散を示す。４．３．ウイルスの放出速度本実施例はパッケージング細胞の培養上清へのアデノウイルスの放出速度試験に関する。本試験はアデノウイルスのゲノムの領域の相補的オリゴヌクレオチドを用いる半定量的ＰＣＲにより実施した。このために、直鎖化したウイルスＤＮＡ（１〜１０ｎｇ）を１０ＸＰＣＲバッファー中ｄＸＴＰ（２μｌ，１０ｍＭ）、特異的オリゴヌクレオチド対及びＴａｑＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｃｅｔｕｓ）の存在下でインキュベートし、２分間９１℃、３０サイクル（１分間９１℃、２分間アニーリング温度、３分間７２℃）、５分間７２℃、次いで４℃の条件下で３０増幅サイクルにかけた。ＰＣＲ実験は下記配列のオリゴヌクレオチド対を用いて実施した。Ａｄ−βＧａｌを感染させた２９３細胞の上清で種々の感染後時点で上清中に放出されたアデノウイルスの量を測定した。得られた結果を図３に示す。この結果から明らかなように、細胞放出は感染後５又は６日目から開始する。当然のことながら、同じ目的で他の任意のウイルス測定方法を他の任意のパッケージング系で任意種のアデノウイルスに使用することができる。実施例５：限外濾過及びイオン交換によるウイルス精製本実施例は、濃縮液に含まれるアデノウイルスを如何にして非常に高い収率で単一イオン交換クロマトグラフィー段階で直接精製できるかを示す。５．１．プロトコール従って、本実験では、出発材料は実施例４に記載した濃縮液（又は限外濾渣）から構成する。この濾渣はＰＢＳバッファー（１５０ｍＭＮａＣｌを含有する１０ｍＭリン酸、ｐＨ７．２）中５〜５０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは１０〜３０ｍｇ／ｍｌの全タンパタ質濃度をもつ。２５０ｍＭＮａＣｌ、１．０ｍＭＭｇＣｌ₂及び１０％グリセロールを含有するＴｒｉｓ／５０ｍＭＨＣｌバッファー(ｐＨ８．０)(バッフアーＡ)で平衡化したＳｏｕｒｃｅＱ１５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を入れたカラムにウイルス調製物から得られた限外濾過上清を注入する。バッファーＡ１０カラム容量でリンスした後、直線流速６０〜３００ｃｍ／時、より好ましくは１２ｃｍ／時で２５カラム容量でＮａＣｌの直線勾配（２５０ｍＭ→１Ｍ）を用いて吸着種を溶離する。２６０ｎｍで得られた典型的溶離プロフィルを図４に示す。ウイルス粒子を含むフラクションを集める。このフラクションは対称な細いピークに対応し、その保持時間は限外濾過により精製したウイルス粒子調製物で得られる保持時間に一致する。上記条件下では、ウイルス粒子ピークの優れた分離を維持しながら、ＳｏｕｒｃｅＱ１５樹脂１ｍｌ当たり最低３０ｍｇの全タンパク質を注入することが可能である。アデノウイルスβ−ｇａｌ（実施例２）の調製物から実施した典型的実験では、全タンパク質１２．６ｍｇ、即ち５×１０¹⁰ＰＦＵ及び１．６×１０１０ＴＤＵをＲｅｓｏｕｒｃｅＱカラム（１ｍｌ）に注入した。クロマトグラフィー後に集めたウイルス粒子ピーク（３．２ｍｌ、図５）はタンパク質１７３μｇ、３．２×１０１０ＰＦＵ及び２．３×１０１０ＴＤＵを含んでいた。従って、ウイルス粒子は７０倍（タンパク質の量で表す）に精製され、精製収率はＰＦＵで６４％、ＴＤＵで１４２％である（下表参照）。５．２．純度この精製段階後に集めたフラクションを下記クロマトグラフィーシステムでＲｅｓｏｕｒｃｅＱカラム（１ｍｌ）で高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析すると、ウイルス粒子として純度≧９８％（２６０ｎｍでＵＶ検出）を示す。クロマトグラフィーシステムは、実施例５．１に記載したようにクロマトグラフィー精製したフラクション１０μｌをＴｒｉｓ／５０ｍＭＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）（バッファーＢ）で平衡化したＲｅｓｏｕｒｃｅＱ１５カラム（ゲル１ｍｌ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に注人する。バッファーＢ５ｍｌでリンスした後、流速１ｍｌ／分でバッファーＢ中ＮａＣｌ３０ｍｌの直線勾配（０→１Ｍ）を用いて吸着種を溶離する。吸着種を２６０ｎｍで検出する。このＨＰＬＣ分析（図５）は更に、限外濾渣中に存在する残留ウシ血清アルブミンが分取クロマトグラフィーの間に完全に除去されることを示す。精製フラクション中のその濃度は＜０．１％であると推定される。抗ＢＳＡポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロット分析（ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍで検出）によると、クロマトグラフィー調製物中のＢＳＡ濃度はウイルス１ｍｇ当たり１００ｎｇ未満である。クロマトグラフィー精製したアデノウイルスフラクションを変性条件下（ＳＤＳ）にポリアクリルアミドゲル（４→２０％）電気泳動分析する。その後、タンパク質バンドを硝酸銀で検出する。この分析によると、クロマトグラフィーにより得られたアデノウイルス調製物は、非アデノウイルスタンパク質による調製物の汚染に相当するような付加的タンパク質バンドを示さないので、常法で超遠心により得られた調製物に少なくとも等しい純度レベルをもつ。クロマトグラフィーにより得られたアデノウイルス調製物は１．３０±０．０５の吸光度Ａ２６０ｎｍ／Ａ２８０ｎｍ比を示す。この値は超遠心により得られる最良の調製物で得られる値に等しく、調製物が汚染性タンパク質や汚染性核酸を含んでいないことを示す。クロマトグラフィー精製したウイルスＡｄ−βｇａｌを実施例４．２に記載した条件下で電子顕微鏡分析すると、汚染物質も凝集物も空のウイルス粒子も含まない適正な調製物であることが明らかである（図１１）。更に、この調製物の塩化セシウム勾配超遠心によると密度１．３０のただ１つのバンドが検出され、クロマトグラフィー調製物が空の粒子やキャプシドフラグメントで汚染されていないことを裏付ける。精製時にはウイルスのクロマトグラフィーピークに続いてその後部にショルダー（又は二次ピーク）か検出されるが、これは主ピークに合わせない。このフラクションを塩化セシウム勾配で超遠心すると、密度１．２７のバンドが検出され、このフラクションを組成分析すると核酸を含んでない。電子顕微鏡分析によると、このフラクションは表面に穴のあいた不規則形状の粒子を含んでいる（図１２）。従って、（ＤＮＡを含まない）空の不完全粒子である。従って、アデノウイルスのクロマトグラフィー精製は精製前に調製物中に少量存在する空の粒子を除去することが明らかである。５．３．タンパク質ＡｐｏＡ１又はチミジンキナーゼをコードする遺伝子等の治療用遺伝子を含むアデノウイルスの精製本実施例は、治療用タンパタ質をコードする異種核酸配列をそのゲノム中に含むアデノウイルスを如何にして単一イオン交換クロマトグラフィー段階で直接精製できるかを示す。更に、アデノウイルスのクロマトグラフィー挙動がこのアデノウイルスに含まれる異種核酸配列から独立しているため、種々の異種核酸配列をもつ種々のアデノウイルスに同一精製方法を実施できることも示す。典型的精製実験では、感染後１０日に回収した細胞培養物の濃縮上清１８ｍｌ（タンパク質７２ｍｇ、粒子１．０８×１０¹³個）を実施例５．１に記載したシステムでクロマトグラフィー精製することにより、タンパク質ＡｐｏＡ１（実施例２、ＷＯ９４／２５０７３）をコードする異種核酸配列をそのゲノム中に含むアデノウイルスを精製する（図６Ａ）。クロマトグラフィー後に集めたウイルス粒子ピーク（１４ｍｌ、タンパク質１．４ｍｇ）は粒子９．９８×１０¹²個を含んでおり、９２％の粒子収率と５１の精製倍率を示す。この精製段階後に集めたフラクション（図６Ｂ）を５．２に記載した条件下でクロマトグラフィー分析すると、９８％を上回るウイルス粒子純度を示す。クロマトグラフィー精製したアデノウイルスフラクションを実施例５．２に記載した条件下で電気泳動分析した処、この調製物は超遠心により常法で得られた調製物に少なくとも等しい純度レベルをもち、汚染性タンパク質や汚染性核酸を含んでいないことが判明した。別の典型的精製実験では、細胞培養物の濃縮上清３６ｍｌ（タンパク質１８０ｍｇ、粒子４．６９×１０¹³個）を実施例５．１に記載したシステムでクロマトグラフィー精製することにより、１型単純ヘルペスのチミジンキナーゼタンパク質（実施例２、ＷＯ９５／１４１０２）をコードする異種核酸配列をそのゲノムに含むアデノウイルスを精製する（図７Ａ）。クロマトグラフィー後に集めたウイルス粒子ピーク（２０ｍｌ、タンパク質５．６ｍｇ）は粒子４．２８×１０¹³個を含んでおり、粒子収率９１％と精製倍率３２を示す。この精製段階後に集めたフラクション（図７Ｂ〜Ｄ）を実施例５．２に記載した条件下でクロマトグラフィー分析すると、９９％を上回るウイルス粒子純度を示し、吸光度比は１．２９であった。クロマトグラフィー精製したアデノウイルスフラクションを実施例５．２に記載した条件下で電気泳動分析した処、この調製物は超遠心により常法で得られた調製物に少なくとも等しい純度レベルをもち、汚染性タンパク質や汚染性核酸を含んでいないことが判明した。５．４．細胞内アデノウイルスの強アニオン交換による精製本実施例は、異種核酸配列をそのゲノム中に含むアデノウイルスを、該ウイルスを産生するパッケージング細胞の溶解液から如何にして単一イオン交換クロマトグラフィー段階で直接精製できるかを示す。典型的精製実験では、感染後３日に化学的溶解（１％Ｔｗｅｅｎ−２０）により回収した細胞培養物の濃縮溶解液４５０ｍｌ（即ち粒子２．５×１０¹⁴個）を実施例５．１に記載したシステム（ＦｉｎｅＬｉｎｅＰｉｌｏｔ３５カラム，Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｓｏｕｒｃｅ１５Ｑ樹脂１００ｍｌ）でクロマトグラフィー精製することにより、タンパク質β−ｇａｌをコードする異種核酸配列をそのゲノム中に含むアデノウイルスを精製する。クロマトグラフィー後に集めたウイルス粒子ピーク（１１０ｍｌ）は粒子２．１５×１０¹⁴個を含んでおり、８６％の粒子収率を示す。この精製段階後に集めたフラクションを５．２に記載した条件下でクロマトグラフィー分析すると、９８％を上回るウイルス粒子純度を示す。クロマトグラフィー精製したアデノウイルスフラクションを実施例５．２に記載した条件下で電気泳動分析した処、この調製物は超遠心により常法で得られた調製物に少なくとも等しい純度レベルをもち、汚染性タンパク質又は汚染性核酸を含まないことが判明した。５．５．限外濾過と種々のカラムでのイオン交換クロマトグラフィーによるウイルスの精製本実施例は、マトリックスの第４級アミン基との相互作用によるアニオン交換を同一分離原理で利用しながら、Ｓｏｕｒｃｅ１５Ｑ支持体と異なるゲルを使用することにより、濃縮液に含まれるアデノウイルスを如何にして単一イオン交換クロマトグラフィー段階で直接精製できるかを示す。アデノウイルスの典型的精製実験では、実施例５．１に記載したプロトコールに従い、（β−ｇａｌ、アポリポタンパク質ＡＩ及びＴＫをコードする）種々の組換えアデノウイルスをＳｏｕｒｃｅＱ３０ゲルカラムでクロマトグラフィー精製した。得られた結果によると、ＳｏｕｒｃｅＱ３０ゲルは７０〜１００％の収率で純度約８５％のウイルス調製物を得ることができる。更に、得られた結果によると、Ｑ３０はアデノウイルス精製効率１０００（理論プレート数により表す）と精製能０．５〜１×１０１２ｐｖ／ｍｌ（ピークが変化せずにクロマトグラフィー精製可能な最大ウイルス量）をもつ。従って、これらの結果から明らかなように、ＳｏｕｒｃｅＱ３０ゲルはＳｏｕｒｃｅＱ１５（純度約９９％、精製効率約８０００及び精製能約２．５〜５×１０１２ｐｖ／ｍｌ）よりも性質が劣るが、組換えアデノウイルスの精製に利用することができる。別の典型的なアデノウイルス精製実験では、実施例５．１に記載したプロトコールに従い、アデノウイルスβ−ｇａｌをＭｏｎｏＱＨＲ５／５カラムでクロマトグラフィー精製する。こうして得られた限外濾渣と精製ウイルス調製物に対応するクロマトグラフィー像を図８に示す。別の典型的なアデノウイルス精製実験では、実施例５．１に記載したプロトコールに従い、アデノウイルスβ−ｇａｌをＰｏｒｏｓＨＱ／Ｍカラムでクロマトグラフィー精製する。こうして得られた限外濾渣と精製ウイルス調製物に対応するクロマトグラフィー像を図９に示す。実施例６：限外濾過及びゲル浸透によるウイルスの精製本実施例は、濃縮液（限外濾渣）に含まれるアデノウイルスを如何にして非常に高い収率でゲル浸透クロマトグラフィーにより直接精製できるかを示す。６．１．プロトコール実施例４で得られた限外濾渣２００μｌ（即ちタンパク質１．３ｍｇ）を、例えば１５０ｍＭＮａＣｌを含有するＰＢＳバッフアー（ｐＨ７．２）（バッファーＣ）で平衡したＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−１０００ＳＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を満たしたＨＲ１０／３０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に注入する。種を分画し、流速０．５ｍｌ／分でバッファーＣで溶離し、カラムの出口で２６０ｎｍでＵＶ検出する。あるいは、１００ｎｍ〜１０００ｎｍの粒子の場合にＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−１０００ＨＲカラムよりも良好な分離を可能にするＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−２０００を満たしたカラムを同一実施条件下で使用してもよい。直列に連結した２つのＨＲ１０／３０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）（ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−１０００ＨＲ又はＳ−２０００カラムに続いてＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨＲカラムを配置）をバッファーＣで平衡したシステムで限外濾過上清（２００μｌ）をクロマトグラフィー精製することにより、上記２種のゲル浸透タロマトグラフィーシステムの分離を改善することができる。流速０．５ｍｌ／分でバッファーＣにより種を溶離し、２６０ｎｍでＵＶ検出する。このシステムでは、ウイルス粒子ピークはＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−１０００ＨＲ又はＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−２０００カラムを単独で用いたシステムよりも著しく良好に低分子量種から分離される。典型的実験では、ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−１０００ＨＲ−Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨＲ１０／３０の２つのカラムからなるシステムで限外濾渣（２００μｌ、タンパク質１．３ｍｇ）をクロマトグラフィー精製した（図１０）。ウイルス粒子を含むクロマトグラフィーピークを集めた。その保持時間は、超遠心により精製したウイルス粒子調製物で得られた保持時間に一致する。クロマトグラフィー後に集めたウイルス粒子ピーク（７ｍｌ）はタンパク質２８μｇ及び３．５×１０９ＰＦＵを含んでいた。５．２に記載した条件下で分析用イオン交換クロマトグラフィーにより分析すると、分析カラムに強く保持された汚染物質ピークの存在が判明し、その表面積はウイルスピークの表面積の約２５％に相当する。その２６０ｎｍ／２８０ｎｍ吸光度比は１．８６であり、この汚染物質ピークが核酸に対応することを示す。従って、ウイルス粒子は約５０倍(タンパク質の量として表す)に精製され、精製収率はＰＦＵで８５％である。あるいは、バッファーＣで平衡したＴＳＫＧ６０００ＰＷカラム（７．５ ×３００ｍｍ；ＴｏｓｏＨａａｓ）でウイルス粒子調製物（限外濾液又はアニオン交換クロマトグラフィーの出口のフラクション）をクロマトグラフィー精製してもよい。流速０．５ｍｌ／分でバッファーＣで種を溶離し、２６０ｎｍでＵＶ検出する。更に、直列に連結した２つのカラム［ＴＳＫＧ６０００ＰＷ（７．５×３００ｍｍ）カラムに続いてＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨＲカラムを配置］をバッファーＣで平衡したシステムで限外濾過上清（５０〜２００μｌ）をクロマトグラフィー精製することにより、クロマトグラフィーシステムの分離、特に低分子量種からのウイルス粒子ピークの分離を増加すると有利である。実施例７：限外濾過、イオン交換及びゲル浸透によるウイルスの精製例えばウイルス粒子の純度レベルを更に改善する目的だけでなく、主にウイルス調製物の後期使用（注入等）に適合可能又は適当な培地でウイルス粒子を条件付けする目的で、アニオン交換クロマトグラフィー（実施例５）からのウイルス粒子フラクションを上記ゲル浸透クロマトグラフィーシステムの１つでクロマトグラフィー精製すると有利である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ

Claims

【特許請求の範囲】１．パッケージング細胞培養物にウイルスＤＮＡを導入し、産生したウイルスを上清中に放出後に回収することを特徴とする組換えアデノウイルスの製造方法。２．ウイルスの少なくとも５０％が上清中に放出された時点で回収を行うことを特徴とする請求項１に記載の方法。３．ウイルスの少なくとも７０％が上清中に放出された時点で回収を行うことを特徴とする請求項１に記載の方法。４．ウイルスの少なくとも９０％が上清中に放出された時点で回収を行うことを特徴とする請求項１に記載の方法。５．限外濾過によりウイルスを回収することを特徴とする請求項１に記載の方法。６．限外濾過がタンジェント限外濾過であることを特徴とする請求項５に記載の方法。７．１０００ｋＤａ未満のカットオフ閾値をもつ膜で限外濾過を行うことを特徴とする請求項５又は６に記載の方法。８．アニオン交換クロマトグラフィーによりウイルスを回収することを特徴とする請求項１に記載の方法。９．アニオン交換クロマトグラフィーが強アニオン交換クロマトグラフィーであることを特徴とする請求項８に記載の方法。１０．強アニオン交換クロマトグラフィーがＳｏｕｒｃｅＱ、ＭｏｎｏＱ、ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅ、ＰｏｒｏｓＨＱ及びＰｏｒｏｓＱＥ樹脂、ＦｒａｃｔｏｇｅｌＴＭＡＥ型樹脂及びＴｏｙｏｐｅａｒｌＳｕｐｅｒＱから選択される支持体上で実施されることを特徴とする請求項９に記載の方法。１１．ゲル浸透クロマトグラフィーによりウイルスを回収することを特徴とする請求項１に記載の方法。１２．ゲル浸透クロマトグラフィーがＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−５００ＨＲ、ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−１０００ＳＦ、ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−１０００ＨＲ、ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−２０００、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨＲ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ２Ｂ、４Ｂ又は６Ｂ及びＴＳＫＧ６０００ＰＷゲルから選択される支持体上で実施されることを特徴とする請求項１１に記載の方法。１３．限外濾過後にアニオン交換クロマトグラフィーを実施することによりウイルスを回収することを特徴とする請求項１に記載の方法。１４．限外濾過後にアニオン交換クロマトグラフィーを実施し、更にその後、ゲル浸透クロマトグラフィーを実施することによりウイルスを回収することを特徴とする請求項１３に記載の方法。１５．パッケージング細胞がアデノウイルスのＥ１機能をトランス相補する細胞であることを特徴とする請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。１６．パッケージング細胞がアデノウイルスのＥ１及びＥ４機能をトランス相補する細胞であることを特徴とする請求項１５に記載の方法。１７．パッケージング細胞がアデノウイルスのＥ１及びＥ２ａ機能をトランス相補する細胞であることを特徴とする請求項１５に記載の方法。１８．細胞がヒト胎児腎細胞、ヒト網膜芽細胞又はヒト肺癌細胞であることを特徴とする請求項１５から１７のいずれか一項に記載の方法。１９．強アニオン交換クロマトグラフィーによる精製段階を含むことを特徴とする生物培地からの組換えアデノウイルスの精製方法。２０．生物培地が前記ウイルスを産生するパッケージング細胞の上清であることを特徴とする請求項１９に記載の方法。２１．生物培地が前記ウイルスを産生するパッケージング細胞の溶解液であることを特徴とする請求項１９に記載の方法。２２．生物培地が前記ウイルスから予備精製された溶液であることを特徴とする請求項１９に記載の方法。２３．第４級アミンで官能化した支持体上でクロマトグラフィーを行うことを特徴とする請求項１９に記載の方法。２４．支持体がアガロース、デキストラン、アクリルアミド、シリカ、ポリ［スチレン−ジビニルベンゼン］、エチレングリコール−メタクリレートコポリマーから単独又は混合物として選択されることを特徴とする請求項２３に記載の方法。２５．クロマトグラフィーがＳｏｕｒｃｅＱ、ＭｏｎｏＱ、ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅ、ＰｏｒｏｓＨＱ、ＰｏｒｏｓＱＥ、ＦｒａｃｔｏｇｅｌＴＭＡＥ又はＴｏｙｏｐｅａｒｌＳｕｐｅｒＱ樹脂上で実施されることを特徴とする請求項２４に記載の方法。２６．クロマトグラフィーがＳｏｕｒｃｅＱ、好ましくはＳｏｕｒｃｅＱ１５樹脂上で実施されることを特徴とする請求項２５に記載の方法。２７．予備限外濾過段階を含むことを特徴とする請求項１９に記載の方法。２８．限外濾過が３００〜５００ｋＤａのカットオフ閾値をもつ膜によるタンジェント限外濾過であることを特徴とする請求項２７に記載の方法。２９．請求項１又は１９に記載の方法により得られる精製ウイルス調製物。３０．請求項２９に記載のウイルス調製物と、医薬的に許容可能なベクターを含む医薬組成物。３１．アデノウイルスの精製のためのヨージキサノール−５，５’−［（２−ヒドロキシ−１，３−プロパンジイル）ビス（アセチルアミノ）］ビス［Ｎ，Ｎ’ −ビス−（２，３−ジヒドロキシプロピル−２，４，６−トリヨード−１，３− ベンゼンカルボキサミド）］の使用。３２．第１の超遠心段階と、第２の希釈又は透析段階と、第３のアニオン交換クロマトグラフィー段階を含む、生物培地からのアデノウイルスの精製方法。