JP2000514110A - 酸化オリゴ糖 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、分子量が１０００乃至５０，０００の範囲にあり、酸化再生セルロース（ＯＲＣ）などの酸化オリゴ糖の部分加水分解によって得られたオリゴ糖を提供する。このオリゴ糖は創傷ドレッシングとして、あるいは創傷ドレッシングにおいて有用であり、またペプチドもしくはタンパク質を結合するのに有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 酸化オリゴ糖 この発明は酸化再生セルロース（oxidized regenerated cellulose：ＯＲＣ） のオリゴ糖などの酸化オリゴ糖（oxidized oligosaccharides）に関する。この 発明は創傷ドレッシング（wound dressings）ならびに他の医療用途および製薬 用途における酸化オリゴ糖の使用にも関し、また酸化オリゴ糖を製造する方法に も関する。 ＯＲＣは長年にわたり製造され、止血を行うために、および手術後の癒着を防 止するためのバリア材として、医療上使用されている。ＯＲＣの鍵となる特徴は 体内に移植された時にそれか吸収されやすいことであるが、これに対し、セルロ ースはそうでない。ＯＲＣは該高分子の加水分解開裂により吸収されて小さなオ リゴ糖を生じ、これが代謝され体から排出される。セルロースの重量につき１０ ％乃至２１％のカルボキシル基を生じるセルロースの酸化によって、移植後２週 間乃至３週間以内にその材料がほぼ完全に吸収されることが可能となる。 ＯＲＣは、米国特許公報第３１２２４７９号に記載されているように四酸化二 窒素などの酸化剤にセルロースを曝すことによって製造される。セルロース材料 の物理的形態は重要でない。例えば、セルロースのフィルム、紙、スポンジ、布 地は全て酸化されてＯＲＣを生じる。しかし、商業的に好適な材料は織った布ま たは編んだ布である。編布の形態のＯＲＣは吸収性止血性材料として用いるため にSURGICEL（商標）により入手可能であり、またＯＲＣは癒着バリアとして用い るためにINTERCEED（商標）により入手可能である。 セルロース以外の多糖も、酸化されて医療上有用な止血性材料を生じ得る。こ のような他の多糖には、微生物性多糖、例えば、デキストラン、ケラン(gellan) ゴム、キサンタン(xanthan)ゴム；植物由来の多糖、例えば、寒天、デンプン 、こんにゃく、カラゲナン(carrageenan)、グアール(guar)ゴム、イヌリン、ペ クチン；および多糖誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロース、メチルヒド ロキシプロピルセルロース、酢酸セルロース、メチルセルロース、エチルセルロ ースがある。 創傷ドレッシングとして使用するため、ＯＲＣを他の材料と組み合わせること が提案されている。例えば、米国特許公報第２５１７７７２号（Doubら）はトロ ンビンで含浸したＯＲＣより形成したドレッシングを開示している。しかし、Ｏ ＲＣはかなり酸性である。十分に水で飽和したＯＲＣ布片の表面ｐＨは１．７程 度に低いことがある。多くのタンパク質薬剤、例えばトロンビン等は、酸の影響 を非常に受け易く、このようなマトリックスと接触して直ぐに不活性化される。 従って、Doubらはトロンビンで含浸する前にＯＲＣを中和すべきことを教示して いる。酢酸カルシウム、炭酸ナトリウム、アンモニアおよびアルコール性エチル アミンか適切な中和剤の例として与えられているか、Doubらは、溶液またはゲル 化と分解の理由により、水中に入れた時にＯＲＣかその繊維性を失うような程度 までＯＲＣを中和すべきでないことを警告している。 欧州特許公開第０４３７０９５号は、ＯＲＣ布地を中和するために炭酸ナトリ ウムの水溶液を使用する結果、部分的にゲル化し、その当初のサイズから歪み、 非常に弱く、ほとんど一体性がない布地が生じることを開示している。その布地 の引張強度は非常に低くて、実際の用途、例えば止血性材料等に向かないと記載 されている。強塩基性の水酸化ナトリウム水溶液、水酸化アンモニウム水溶液の 使用により、同様の結果が得られると記載されている。欧州特許公開第０４３７ ０９５号は従って、酸で酸化したセルロース材料を、塩化物の存在しない弱酸の 僅かに塩基性の塩のアルコールと水の溶液に接触させて、セルロース材料のｐＨ を５と８の間に上げる工程；そのｐＨを上げたセルロース材料をアルコールで洗 浄して、余分な塩と水を除去する工程；およびそのセルロース材料を乾燥して、 アルコールを除去する工程を含む、貯蔵安定性、非刺激性で治療効果のある中和 した酸化セルロース製品の製造方法を教示している。 さて、ＯＲＣおよび他の酸化多糖は穏やかなアルカリ性条件下で部分加水分解 して多くの医療上有用な特性を有するオリゴ糖を生じ得ることが、今、見出され た。 従って、本発明は平均分子量が１０００ダルトン乃至５００００ダルトンの範 囲にある酸化オリゴ糖組成物を提供するものである。 特に、本発明の酸化多糖は治療上有用な薬剤を結合し、次にそのような結合薬 剤を高収率で放出することかできる。したがって、本発明の酸化オリゴ糖は、そ のような薬剤を創傷部位に送達するために、医薬組成物において、例えば創傷ド レッシングにおいて使用することができる。酸化オリゴ糖により結合される治療 上有用な薬剤には、薬理活性なペプチド及びタンパク質、好ましくは成長因子、 例えば、ＰＤＧＦ ＡＢ，ＰＤＧＦ ＢＢ，ＴＧＦ−β１，ＴＧＦ−β２，ＴＧ Ｆ−β３，塩基性ＦＧＦ，酸性ＦＧＦ、および場合によりＥＧＦおよびＴＧＦ− αがある。 いかなる理論にも拘束されることを望まないか、酸化オリゴ糖のアニオン性カ ルボキシレート基がペプチド及びタンパク質のカチオン性アミノ基と複合体形成 する(complex)と考えられる。アニオン性の基を有する治療活性薬剤との複合体 形成は、例えば、イオン性架橋剤としてＣａ²⁺またはＺｎ²⁺のような多価金属イ オンを使用することによっても容易に達成することができる。 本発明の酸化オリゴ糖の別の利点は、それらがタンパク質等の他の材料や他の 多糖と親密に組み合わさって（化学的に架橋するか架橋しないかに拘わらない） 、新規な特性を有する組成物を形成し得ることである。例えば、酸化オリゴ糖は 、ヒアルロン酸、キトサンまたはアルギン酸塩（特にアルギン酸ナトリウム、ア ルギン酸カルシウムまたはアルギン酸ナトリウム／カルシウム混合物）と組み合 わさって新規な止血性組成物を形成し得る。あるいは、酸化オリゴ糖と他のオリ ゴ糖、多糖またはタンパク質との複合体は、種々の治療薬剤、例えば防腐剤、抗 生物質、タンパク質成長因子、抗炎症剤、鎮痛剤、アプロチニン等のプロテイナ ーゼインヒビター、またはヒドロキサム酸に対し、調節された放出マトリックス として使用し得る。本発明の酸化オリゴ糖は、溶液中にある間、所望の治療薬剤 と組み合わせられ（該治療薬剤は溶液中または懸濁液中にある）、次に、その酸 化オリゴ糖は適切な手段により溶液から取り出されて、該治療薬剤がほぼ均一に 分配された材料を生じる。あるいは、溶媒を、例えば凍結乾燥により除去しても よい。 酸化オリゴ糖はまた、三次元構造の形成を可能とするように架橋結合すること もできる。例えば、酸化オリゴ糖は非常に低い濃度のペプシン可溶化コラーゲン が添加された水に溶解することができる。次にカルボジイミドを架橋剤として添 加すれば、該コラーゲンはオリゴ糖間の架橋基として作用し、そのため凍結乾燥 することにより三次元構造を得ることができる。 好ましくは、本発明の酸化オリゴ糖の分子量は少なくとも１０００ダルトンで あり、一般的に１０００００よりも小さい。分子量は５０００ダルトン乃至３０ ０００ダルトンよりも小さいことが最も通常であろう。（本発明の酸化オリゴ糖 は異なるサイズの分子が混在した集団を形成することが理解されよう。従って、 本願における特定の分子量範囲を有する酸化オリゴ糖への言及、より好ましくは 分子の少なくとも９０重量％がその特定された範囲内に該当する。） 一つの実施形態において、本発明によるオリゴ糖は不溶性の酸化多糖から誘導 され、中性およびアルカリ性ｐＨで可溶であるが酸性ｐＨでは不溶であるような 分子量のものである。そのようなオリゴ糖は、単にｐＨを下げてそれらを沈殿さ せるだけで、溶液から容易に回収することができる。あるいは、他の不揮発性成 分を含有しない溶液に移し、その溶媒を蒸発させることによって、酸化オリゴ糖 を溶液から回収することもできる。例えば、酸化オリゴ糖は、イオン交換固相抽 出カラム（例えば、予めメタノールで活性化し希酢酸で平衡化したフェニルボロ ン酸固相カラム）を使用し、次に希薄な（例えば０．１Ｍ）水酸化アンモニウム 水溶液で溶出することにより、単離することができる。 好ましくは、本発明の酸化オリゴ糖は５重量％乃至２５重量％のカルボキシル 含有量を有し、より好ましくは８重量％乃至１４重量％のカルボキシル含有量を 有する。このオリゴ糖のカルボキシル含有量は、以下のようにして決定する。 酸化オリゴ糖の試料（約０．２ｇ）を０．５Ｍ水酸化ナトリウム（５ｍｌ）に 溶解し、２，３滴の０．１％フェノールフタレイン指示薬溶液を加える。余分な 水酸化ナトリウムは、０．１ＭのＨＣｌでフェノールフタレイン終点（赤から透 明）まで逆滴定される。５ｍｌの０．１Ｍ水酸化ナトリウムを０．１ＭのＨＣｌ で滴定することにより、ブランク値を決定する。カルボキシル含有量の値は、以 下の式を用いて計算される。 式中、Ｃ＝カルボキシル含有量％ Ｂ＝ブランクを滴定するための標準ＨＣｌの量（ｍｌ） Ｓ＝試料を滴定するための標準ＨＣｌの量（ｍｌ） Ｍ＝標準ＨＣｌのモル濃度 Ｗ＝試料の乾燥重量（ｇ） （４．５＝カルボキシルのミリ当量重量×１００） 本発明はまた、分子量が少なくとも５００００（通常は少なくとも１００００ ０、例えば３００００より大きい）の酸化多糖を、前記多糖の部分加水分解を生 じさせるのに充分な時間、或る温度でアルカリ性水溶液で処理すること、および 次にその結果生じる酸化オリゴ糖を例えばｐＨを７以下に調整することにより、 溶液から回収することを含む酸化オリゴ糖の製造方法を提供する。このアルカリ 性溶液はアルカリ金属の水酸化物または炭酸塩、例えば、水酸化ナトリウムまた は炭酸ナトリウムの溶液であることが好都合であるが、他のアルカリ（例えば水 酸化アンモニウム水溶液）も用いることができる。この処理条件（特にｐＨ）は その結果生じる生成物について所望される分子量範囲に依存することが理解され るだろう。しかしながら、適当な条件は任意の特定の場合において日常的実験に より容易に決定することができる。例示すれば、酸化再生セルロースは、２Ｍ乃 至８Ｍの水酸化ナトリウム中、０℃乃至５０℃の温度で５分間乃至１２０分間で 加水分解されて分子量範囲１０００ダルトン乃至２００００ダルトンのオリゴ糖 を生じることが可能であり、あるいは０．０１Ｍ乃至１Ｍの炭酸ナトリウム中、 ０℃乃至５０℃の温度で１０時間乃至１０日間で分子量範囲７０００ダルトン乃 至５００００ダルトンのオリゴ糖を生じることが可能である。 加水分解反応は、その溶液がおよそ中性になるまで鉱酸のような酸を加えるこ とによって止めることができる。濃塩酸を用いるのが好都合である。 本発明を以下の実施例により、さらに説明する。 実施例１ ＯＲＣの溶液は、Surgicel（商標）の布を２０ｍｇ／ｍｌの濃度で６Ｍの水酸 化ナトリウム中で溶解させることによって調製した。その溶液を４５分間３７℃ でインキュベート（保温）し、その後６ＭのＨＣｌを、沈殿が生じｐＨがアルカ リ性からｐＨ７以下へ変化するまで加えることによって、反応を止めた。その沈 殿を一晩放置し、次に余分な液を除去した。その沈殿を分子量１０００カットオ フのチューブで水に対して透析し、次に凍結乾燥して粉末を得た。 ゲル電気泳動により、および高性能液体クロマトグラフィにより決定された、 そのオリゴ糖の分子サイズは、およそ１０００ダルトン乃至１５０００ダルトン にわたる範囲を示した。 実施例２ ＯＲＣの溶液は、Surgicel（商標）の布を１０ｍｇ／ｍｌの濃度で０．１Ｍの 炭酸ナトリウム中で溶解させることによって調製した。全てのＯＲＣが溶解し終 えるまで、この溶液を２日間乃至３日間３７℃でインキュベートした。沈殿が生 じｐＨがアルカリ性からｐＨ７以下へ変化するまで、６ＭのＨＣｌを加えること によって反応を止めた。この沈殿を一晩静置し、次に余分な液を除去した。この 沈殿を分子量１０００カットオフのチューブで水に対して透析し、次に凍結乾燥 して粉末を得た。 上述のようにして決定された、分子サイズは、およそ１０００ダルトン乃至３ ００００ダルトンの範囲を示した。 実施例３ 酸化カルボキシメチルセルロースのスポンジを、以下のようにして調製した。 ５００ｇの水に、アクアロン社（Aqualon Corporation）からの７．５ｇのカル ボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を攪拌しながら加える。この高分子が溶解し た時に、溶液を一晩脱気し、トラップ（捕捉）した気泡を除去する。この溶液を ３×４×1／4インチのトレイに注ぎ入れ、凍結乾燥機で２４時間凍結乾燥する。 この手順により、柔軟で白色で水溶性のＣＭＣスポンジが得られる。 このＣＭＣスポンジの酸化は、８ｇの四酸化二窒素を含有した小フラスコが付 いた樹脂ケトル内に、５．８ｇの乾燥スポンジを置くことによって行う。この四 酸化二窒素を小フラスコから樹脂ケトルに蒸発させ、ＣＭＣスポンジをガス雰囲 気で覆う。そのスポンジを４８時間樹脂ケトル内に置いた後、ガスを腐食性トラ ップに逃し、そのスポンジを取り出して５００ｍｌの水中につける。その酸化Ｃ ＭＣスポンジは水中で不溶である。酸化ＣＭＣスポンジを水で１５分間洗浄し、 次に新鮮な水中につけてさらに洗浄する。この酸化ＣＭＣスポンジの洗浄を、そ の洗浄水のｐＨが３より大きくなるまで繰り返す。その白色酸化カルボキシメチ ルセルローススポンジを１００％イソプロピルアルコール中に１５分間つけるこ とによって乾燥する。これを合計２回繰り返し、次にそのスポンジを空気乾燥す る。その酸化ＣＭＣスポンジは柔軟で適合性があり、また等張性食塩水中で自己 の１４倍の重量を吸収する。その酸化ＣＭＣスポンジは０．５Ｎ水酸化ナトリウ ム中で可溶であり、また、滴定により２６．３％と求められる、そのカルボキシ ル酸含有量によってキャラクタライズ（特徴付け）される。 酸化カルボキシメチルセルローススポンジの溶液は、上記スポンジ材料を１０ ｍｇ／ｍｌの濃度で０．１Ｍの水酸化アンモニウム中で溶解させることによって 調製した。その溶液を２時間３７℃でインキュベートし、そして次に、沈殿が生 じるまで６ＭのＨＣｌを加えることによって反応を止めた。その沈殿を集め、分 子量１０００カットオフのチューブで蒸留水に対して大規模に透析し、次に凍結 乾燥して粉末を得た。 その分子量は、ゲル電気泳動により１０００ダルトンと３００００ダルトンに 決定された。 実施例４ メチルセルロースを実施例３に述べた手順と類似の手順で酸化し、その酸化材 料を２０ｍｇ／ｍｌの濃度で６Ｍ水酸化アンモニウム中で溶解させ、４５分間３ ７℃でインキュベートすることによって溶液を調製した。その溶液を遠心分離し て不溶解材料を除去し、６ＭのＨＣｌを加えることによって溶液からオリゴ糖を 沈殿させた。その沈殿を集め、分子量１０００カットオフのチューブで蒸留水に 対して大規模に透析した。 その分子量は、ゲル電気泳動により１０００ダルトンと５０００ダルトンの間 にあることが決定された。 実施例５ １０ｍｌの容器に１００ｍｇの吸着剤材料を含有したフェニルボロン酸（ＰＢ Ａ）固相抽出カラム（ボンドエルト，ヴァリアンアソシエーツ（Bond Elut，Var ian Associates））を、１０ｍｌのメタノールを用いて活性化し、該カラムを濡 らした後、１０ｍｌの０．１Ｍ酢酸により該カラムを適正なｐＨで平衡化した。 ＯＲＣ溶液は、Intercreed（商標）材料の１ｇを６Ｍ水酸化ナトリウム溶液１ ００ｍｌ中で溶解させることによって調製した。そのInterceed（商標）材料が 完全に溶解した後に、その溶液をｐＨ３．０に酸性化し、沈殿を遠心分離により 除去した。その上澄を取り、２ｍｌを上記活性化ＰＢＡカラムに通した。そのカ ラムを次に０．１Ｍ酢酸２ｍｌと蒸留水４×２ｍｌポーション（部分）とで洗浄 して、塩や他の内因性物質をすべて除去した。０．１Ｍ水酸化アンモニウム２× ２ｍｌポーション（部分）を用いて、そのカラムからＯＲＣオリゴ糖を溶出させ た。それらのポーションをプール（蓄液）し、冷凍し、凍結乾燥して、粉末を得 た。その酸化オリゴ糖のイオン交換クロマトグラフィによる分離後、質量スペク トル分析ではその分子量が６００ダルトン乃至１２００ダルトンの範囲にあるこ とを示した。 実施例６ コラーゲン／ＯＲＣオリゴ糖のスポンジを、以下の方法で調製した。石灰処理 したコラーゲン繊維を０．０１のＨＣｌ（ｐＨ３．０）１６０ｍｌ中でスラリー 化し、そして実施例２（分子量１０００ダルトン乃至１５００００ダルトン）で 調製したＯＲＣオリゴ糖の０．１６ｇを加えた。その混合物を１５秒間ホモジェ ナイズ（均質化）し、ＨＭＤＩを加え（コラーゲンの１０％Ｗ／Ｗ）、そのスラ リーをさらに２×１５秒間ホモジェナイズした。そのスラリーを脱気し、２つの ９ｃｍ径ペトリ皿に注ぎ入れ、冷凍し、７２時間にわたり−３０℃乃至７０℃で 運転する熱勾配(heat ramp)を用いて凍結乾燥した。 次に、このコラーゲン／ＯＲＣオリゴ糖スポンジを、その血小板由来増殖因子 （ＰＤＧＦ）結合能について試験した。比較のため、Interceed（商標）布およ び（上述のように調製したがＯＲＣオリゴ糖を加えていない）単なるコラーゲン スポンジも試験した。それぞれの場合に、試験材料の小区分（Interceed（商標 ）布のおよそ１ｃｍ²正方形、およびスポンジのおよそ１ｃｍ×０．５ｃｍ× ０．４ｃｍ区分）の重量を計り、１５０ｍＭ塩化ナトリウム含有１００ｍＭリン 酸ナトリウム二塩基性緩衝液（合計量１ｍｌ）中に室温で少なくとも１時間浸し た。次に、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ） と共に試料を２時間室温でインキュベートした。次に２５ｎｇのＰＤＧＦを、２ ％ＢＳＡ含有ＰＢＳ ２５０μｌ中の各試料に加え、次に試料をさらに１時間３ ７℃でインキュベートした。 次に、各試料を２５０μｌ ＰＢＳで３回洗浄した後、塩化ナトリウム濃度を 増加させた。最後に、各試料を４．０Ｍ尿素で洗浄した。当初(original)のＰＤ ＧＦ調製物および試料材料からの種々の洗浄物のＥＬＩＳＡ分析により、以下の 結果が得られた。 この結果は、３つの試験材料が全て類似の量のＰＤＧＦを結合するが、コラー ゲン／ＯＲＣオリゴ糖スポンジから最も高収率でＰＤＧＦを回収できることを示 す。 結合特性もまた、個々の比較材料に比べて、コラーゲン／ＯＲＣオリゴ糖材料 が特有に異っている。これらの観察結果は、該複合体か特有のＰＤＧＦ結合を有 し、これを成長因子の外因性の結合および内因性の結合と放出の双方のために適 切に利用し得ることを示す。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１０年７月７日（１９９８．７．７） 【補正内容】 さて、ＯＲＣおよび他の酸化多糖は穏やかなアルカリ性条件下で部分加水分解 して多くの医療上有用な特性を有するオリゴ糖を生じ得ることが、今、見出され た。 従って、本発明は平均分子量が１０００ダルトン乃至５００００ダルトンの範 囲にある酸化オリゴ糖を含む、局所、経口もしくは非経口投与用医薬組成物を提 供するものである。 特に、本発明の酸化オリゴ糖組成物は治療上有用な薬剤を結合し、次にそのよ うな結合薬剤を高収率で放出することができる。したがって、本発明の酸化オリ ゴ糖医薬組成物は、そのような薬剤を創傷部位に送達するために、例えば創傷ド レッシングにおいて使用することができる。酸化オリゴ糖により結合される治療 上有用な薬剤には、薬理活性なペプチド及びタンパク質、好ましくは成長因子、 例えば、ＰＤＧＦ ＡＢ，ＰＤＧＦ ＢＢ，ＴＧＦ−β１，ＴＧＦ−β２，ＴＧ Ｆ−β３，塩基性ＦＧＦ，酸性ＦＧＦ、および場合によりＥＧＦおよびＴＧＦ− αがある。 いかなる理論にも拘束されることを望まないが、酸化オリゴ糖のアニオン性カ ルボキシレート基がペプチド及びタンパク質のカチオン性アミノ基と複合体形成 する(complex)と考えられる。アニオン性の基を有する治療活性薬剤との複合体 形成は、例えば、イオン性架橋剤としてＣａ²⁺またはＺｎ²⁺のような多価金属イ オンを使用することによっても容易に達成することができる。 本発明の医薬組成物の別の利点は、それらがタンパク質等の他の材料や他の多 糖と親密に組み合わさって（化学的に架橋するか架橋しないかに拘わらない）、 新規な特性を有する組成物を形成し得ることである。例えば、酸化オリゴ糖は、 ヒアルロン酸、キトサンまたはアルギン酸塩（特にアルギン酸ナトリウム、アル ギン酸カルシウムまたはアルギン酸ナトリウム／カルシウム混合物）と組み合わ さって新規な止血性組成物を形成し得る。あるいは、酸化オリゴ糖と他のオリゴ 糖、多粧またはタンパク質との複合体は、種々の治療薬剤、例えば防腐剤、抗生 物質、タンパク質成長因子、抗炎症剤、鎮痛剤、アプロチニン等のプロテイナー ゼインヒビター、またはヒドロキサム酸に対し、調節された放出マトリックスと して使用し得る。本発明の組成物の酸化オリゴ糖は溶液中にある間、所望の治療 薬剤と組み合わせられ（該治療薬剤は溶液中または懸濁液中にある）、次に、そ の酸化オリゴ糖は適切な手段により溶液から取り出されて、該治療薬剤がほぼ均 一に分配された材料を生じる。あるいは、溶媒を、例えば凍結乾燥により除去し てもよい。 酸化オリゴ糖はまた、三次元構造の形成を可能とするように架橋結合すること もできる。例えば、酸化オリゴ糖は非常に低い濃度のペプシン可溶化コラーゲン が添加された水に溶解することができる。次にカルボジイミドを架橋剤として添 加すれば、該コラーゲンはオリゴ糖間の架橋基として作用し、そのため凍結乾燥 することにより三次元構造を得ることができる。 好ましくは、本発明の組成物における酸化オリゴ糖の分子量は少なくとも１０ ００ダルトンであり、一般的に１０００００よりも小さい。分子量は５０００ダ ルトン乃至３００００ダルトンよりも小さいことが最も通常であろう。（本発明 における酸化オリゴ糖は異なるサイズの分子が混在した集団を形成することが理 解されよう。従って、本願における特定の分子量範囲を有する酸化オリゴ糖への 言及は、分子の少なくとも９０重量％がその特定の範囲に該当することを意味す る。） 一つの実施形態において、本発明による組成物において使用するためのオリゴ 糖は、不溶性の酸化多糖から誘導され、中性およびアルカリ性ｐＨで可溶である が酸性ｐＨでは不溶であるような分子量のものである。そのようなオリゴ糖は、 単にｐＨを下げてそれらを沈殿させるだけで、溶液から容易に回収することがで きる。あるいは、他の不揮発性成分を含有しない溶液に移し、その溶媒を蒸発さ せることによって、酸化オリゴ糖を溶液から回収することもできる。例えば、酸 化オリゴ糖は、イオン交換固相抽出カラム（例えば、予めメタノールで活性化し 希酢酸で平衡化したフェニルボロン酸固相カラム）を使用し、次に希薄な（例え ば０．１Ｍ）水酸化アンモニウム水溶液で溶出することにより、単離することが できる。 好ましくは、本発明の組成物において使用される酸化オリゴ糖は５重量％乃至 ２５重量％のカルボキシル含有量を有し、より好ましくは８重量％乃至１４重量 ％のカルボキシル含有量を有する。このオリゴ糖のカルボキシル含有量は、以下 のようにして決定する。 酸化オリゴ糖の試料（約０．２ｇ）を０．５Ｍ水酸化ナトリウム（５ｍｌ）に 溶解し、２，３滴の０．１％フェノールフタレイン指示薬溶液を加える。余分な 水酸化ナトリウムは、０．１ＭのＨＣｌでフェノールフタレイン終点（赤から透 明）まで逆滴定される。５ｍｌの０．１Ｍ水酸化ナトリウムを０．１ＭのＨＣｌ で滴定することにより、ブランク値を決定する。カルボキシル含有量の値は、以 下の式を用いて計算される。 式中、Ｃ＝カルボキシル含有量％ Ｂ＝ブランクを滴定するための標準ＨＣｌの量（ｍｌ） Ｓ＝試料を滴定するための標準ＨＣｌの量（ｍｌ） Ｍ＝標準ＨＣｌのモル濃度 Ｗ＝試料の乾燥重量（ｇ） （４．５＝カルボキシルのミリ当量重量×１００） 本発明はまた、分子量が少なくとも５００００（通常は少なくとも１００００ ０、例えば３００００より大きい）の酸化セルロースを、前記酸化セルロースの 部分加水分解を生じさせるのに充分な時間、或る温度でアルカリ性水溶液で処理 すること、および次にその結果生じる酸化セルロースを例えばｐＨを７以下に調 整することにより、溶液から回収することを含む酸化セルロースの製造方法を提 供する。このアルカリ性溶液はアルカリ金属の水酸化物または炭酸塩、例えば、 水酸化ナトリウムまたは炭酸ナトリウムの溶液であることか好都合であるが、他 のアルカリ（例えば水酸化アンモニウム水溶液）も用いることかできる。この処 理条件（特にｐＨ）はその結果生じる生成物について所望される分子量範囲に依 存することが理解されるだろう。しかしながら、適当な条件は任意の特定の場合 において日常的実験により容易に決定することができる。例示すれば、酸化再生 セルロースは、１Ｍ乃至８Ｍの水酸化ナトリウム中、０℃乃至５０℃の温度で５ 分間乃至１２０分問で加水分解されて分子量範囲１０００ダルトン乃至２０００ ０ダルトンのオリゴ糖を生じることが可能であり、あるいは０．０１Ｍ乃至１Ｍ の炭酸ナトリウム中、０℃乃至５０℃の温度で１０時間乃至１０日間で分子量範 囲７０００ダルトン乃至５００００ダルトンのオリゴ糖を生じることが可能であ る。 加水分解反応は、その溶液がおよそ中性になるまで鉱酸のような酸を加えるこ とによって止めることができる。濃塩酸を用いるのが好都合である。 本発明を以下の実施例により、さらに説明する。実施例６ コラーゲン／ＯＲＣオリゴ糖のスポンジを、以下の方法で調製した。石灰処理 したコラーゲン繊維を０．０１のＨＣｌ（ｐＨ３．０）１６０ｍｌ中でスラリー 化し、そして実施例２で調製したＯＲＣオリゴ糖の０．１６ｇを加えた。その混 合物を１５秒間ホモジェナイズ（均質化）し、ＨＭＤＩを加え（コラーゲンの１ ０％Ｗ／Ｗ）、そのスラリーをさらに２×１５秒間ホモジェナイズした。そのス ラリーを脱気し、２つの９ｃｍ径ペトリ皿に注ぎ入れ、冷凍し、７２時問にわた り−３０℃乃至７０℃で運転する熱勾配(heat ramp)を用いて凍結乾燥した。 次に、このコラーゲン／ＯＲＣオリゴ糖スポンジを、その血小板由来増殖因子 （ＰＤＧＦ）結合能について試験した。比較のため、Interceed（商標）布およ び（上述のように調製したがＯＲＣオリゴ糖を加えていない）単なるコラーゲン スポンジも試験した。それぞれの場合に、試験材料の小区分（Interceed（商標 ）布のおよそ１ｃｍ²正方形、およびスポンジのおよそ１ｃｍ×０．５ｃｍ×０ ．４ｃｍ区分）の重量を計り、１５０ｍＭ塩化ナトリウム含有１００ｍＭリン酸 ナトリウムニ塩基性緩衝液（合計量１ｍｌ）中に室温で少なくとも１時間浸した 。次に、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と 共に試料を２時間室温でインキュベートした。次に２５ｎｇのＰＤＧＦを、２％ ＢＳＡ含有ＰＢＳ ２５０μｌ中の各試料に加え、次に試料をさらに１時間３７ ℃でインキュベートした。 次に、各試料を２５０μｌ ＰＢＳで３回洗浄した後、塩化ナトリウム濃度を 増加させた。最後に、各試料を４．０Ｍ尿素で洗浄した。当初(original)のＰＤ ＧＦ調製物および試料材料からの種々の洗浄物のＥＬＩＳＡ分析により、以下の 結果が得られた。 請求の範囲 １．平均分子量が１０００ダルトン乃至５００００ダルトンの範囲にある酸化 オリゴ糖を含む、局所、経口もしくは非経口投与用医薬組成物。 ２．酸化された細菌性もしくは植物性多糖から誘導された請求項１に記載の医 薬組成物。 ３．酸化された動物性多糖または酸化された合成多糖から誘導された請求項１ に記載の医薬組成物。 ４．酸化セルロースまたは酸化セルロース誘導体から誘導された請求項１に記 載の医薬組成物。 ５．デキストラン、ケランゴム、キサンタンゴム、寒天、デンプン、こんにゃ く、カラゲナン、グアールゴム、ペクチン、カルボキシメチルセルロース、メチ ルヒドロキシプロピルセルロース、酢酸セルロース、メチルセルロース、リン酸 セルロース、エチルセルロースまたはイヌリンの酸化誘導体から誘導された請求 項１に記載の医薬組成物。 ６．平均分子量が５０００ダルトン乃至２５０００ダルトンの範囲にある請求 項１乃至請求項５のいずれか１項に記載の医薬組成物。 ７．酸化オリゴ糖は薬理活性なペプチドもしくはタンパク質に結合されている 請求項１乃至請求項６のいずれか１項に記載の医薬組成物。 ８．ペプチドもしくはタンパク質は成長因子である請求項７に記載の医薬組成 物。 ９．創傷ドレッシングとして、あるいは創傷ドレッシングにおいて用いる組成 物を製造するための請求項１乃至請求項８のいずれか１項に記載の医薬組成物の 使用。 １０．薬理活性薬剤が前記創傷ドレッシング全体にわたってほぼ均一に分配さ れている請求項９に記載の使用。 １１．前記薬理活性薬剤は抗生物質、防腐剤またはタンパク質成長因子である 請求項１０に記載の使用。 １２．（ａ）平均分子量か少なくとも５０００の酸化セルロースを、前記酸化 セルロースの部分加水分解を生じさせるのに充分な時間、或る温度で、アルカリ 性水溶液で処理する工程、および （ｂ）その結果生じる酸化セルロースを前記溶液から回収する工程を含む 酸化セルロースの製造方法。 １３．アルカリ性溶液はアルカリ金属の水酸化物または炭酸塩である請求項１ ２に記載の方法。 １４．酸化セルロースは、酸を用いてｐＨを７以下に調整することにより前記 溶液から回収される請求項１２または請求項１３に記載の方法。 １５．酸は濃鉱酸である請求項１４に記載の方法。 １６．請求項１２乃至請求項１５のいずれか１項に記載の方法であって、 （ａ）前記酸化セルロースのアルカリ性溶液を供給する工程、 （ｂ）前記アルカリ性溶液に治療活性薬剤を溶解または分散させる工程、 および （ｃ）前記溶液または分散液のｐＨを下げて前記酸化セルロースを沈殿さ せる工程を含む方法。 １７．請求項１２乃至請求項１５のいずれか１項に記載の方法であって、 （ａ）前記酸化セルロースのアルカリ性溶液を供給する工程、 （ｂ）前記アルカリ性溶液に治療活性薬剤を溶解または分散させる工程、 および （ｃ）前記溶液または分散液から溶媒を除去する工程を含む方法。 １８．溶媒は工程（ｃ）において凍結乾燥により除去される請求項１７に記載 の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０８Ｂ 15/00 Ａ６１Ｌ 15/01 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 サファーシュタイン，ローウェル アメリカ合衆国、08820 ニュージャージ ー州、エディソン、ティンバー・ロード ３ (72)発明者 ロリメール，エレイン イギリス国、ジー68・９ビーピー・カンバ ーノールド、バロック、グランジェニッ ク・ガーデンズ 68 (72)発明者 ワット，ポール，ウィリアム イギリス国、ビーディー23・３イーティ ー・スキプトン、ベック・サイド ９

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．平均分子量が１０００ダルトン乃至５００００ダルトンの範囲にある酸化 オリゴ糖組成物。 ２．酸化された細菌性もしくは植物性多糖から誘導された請求項１に記載のオ リゴ糖組成物。 ３．酸化された動物性多糖または酸化された合成多糖から誘導された請求項１ に記載のオリゴ糖組成物。 ４．酸化セルロースまたは酸化セルロース誘導体から誘導された請求項１に記 載のオリゴ糖組成物。 ５．デキストラン、ゲランゴム、キサンタンゴム、寒天、デンプン、こんにゃ く、カラゲナン、グアールゴム、ペクチン、カルボキシメチルセルロース、メチ ルヒドロキシプロピルセルロース、酢酸セルロース、メチルセルロース、リン酸 セルロース、エチルセルロースまたはイヌリンの酸化誘導体から誘導された請求 項１に記載のオリゴ糖組成物。 ６．平均分子量が５０００ダルトン乃至２５０００ダルトンの範囲にある請求 項１乃至請求項５のいずれか１項に記載のオリゴ糖組成物。 ７．請求項１乃至請求項６のいずれか１項に記載の酸化オリゴ糖組成物を含む 、局所、経口もしくは非経口投与用医薬組成物。 ８．酸化オリゴ糖は薬理活性なペプチドもしくはタンパク質に結合されている 請求項７に記載の医薬組成物。 ９．ペプチドもしくはタンパク質は成長因子である請求項８に記載の医薬組成 物。 １０．創傷ドレッシングとして、あるいは創傷ドレッシングにおいて用いる組 成物を製造するための請求項１乃至請求項６のいずれか１項に記載の酸化オリゴ 糖組成物の使用。 １１．薬理活性薬剤が前記創傷ドレッシング全体にわたってほぼ均一に分配さ れている請求項８に記載の使用。 １２．前記薬理活性薬剤は抗生物質、防腐剤またはタンパク質成長因子である 請求項１１に記載の使用。 １３．（ａ）平均分子量が少なくとも５０００の酸化多糖を、前記多糖の部分 加水分解を生じさせるのに充分な時間、或る温度で、アルカリ性水溶液で処理す る工程、および （ｂ）その結果生じる酸化オリゴ糖を前記溶液から回収する工程を含む、 酸化オリゴ糖の製造方法。 １４．アルカリ性溶液はアルカリ金属の水酸化物または炭酸塩である請求項１ ３に記載の方法。 １５．酸化オリゴ糖は、酸を用いてｐＨを７以下に調整することにより前記溶 液から回収される請求項１３または請求項１４に記載の方法。 １６．酸は濃鉱酸である請求項１５に記載の方法。 １７．請求項１３乃至請求項１６のいずれか１項に記載の組成物の製造方法で あって、 （ａ）酸化オリゴ糖のアルカリ性溶液を供給する工程、 （ｂ）前記アルカリ性溶液に治療活性薬剤を溶解または分散させる工程、 および （ｃ）前記溶液または分散液のｐＨを下げて前記酸化オリゴ糖を沈殿させ る工程を含む方法。 １８．請求項１３乃至請求項１６のいずれか１項に記載の組成物の製造方法で あって、 （ａ）酸化オリゴ糖のアルカリ性溶液を供給する工程、 （ｂ）前記アルカリ性溶液に治療活性薬剤を溶解または分散させる工程、 および （ｃ）前記溶液または分散液から溶媒を除去する工程を含む方法。 １９．溶媒は工程（ｃ）において凍結乾燥により除去される請求項１８に記載 の方法。