DE69702911T2

DE69702911T2 - Oxydierte oligosaccharide

Info

Publication number: DE69702911T2
Application number: DE69702911T
Authority: DE
Inventors: Wilson Harvey; Nicholas Light; Lowell Saferstein; William Watt; David Wiseman
Original assignee: Johnson and Johnson Medical Ltd
Current assignee: Johnson and Johnson Medical Ltd
Priority date: 1996-06-28
Filing date: 1997-06-27
Publication date: 2001-02-22
Anticipated expiration: 2017-06-28
Also published as: PL330825A1; ATE195742T1; AU3269397A; HUP9903404A2; GB9613683D0; WO1998000446A1; GR3034853T3; GB2314840A; JP4302187B2; KR20000022286A; PL189194B1; HUP9903404A3; CA2258849C; GB2314840B; CZ294839B6; EP0907664A1; JP2000514110A; AU725296B2; EP0907664B1; ES2148991T3

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf eine pharmazeutische Zusammensetzung, die oxidierte Oligosaccharide umfaßt, wie Oligosaccharide oxidierter regenerierter Zellulose (ORZ). Diese Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung oxidierter Oligosaccharide in Wundverbänden und anderen medizinischen und pharmazeutischen Anwendungen und auf Verfahren zur Herstellung oxidierter Oligosaccharide.
ORZ ist lange hergestellt und medizinisch verwendet worden, um die Hämostase zu erzielen und als ein Sperrmaterial, um Anhaftungen im Anschluß an Operationen vorzubeugen. Eine Schlüsseleigenschaft von ORZ ist, daß sie resorbierbar ist, wenn sie in den Körper implantiert ist, wohingegen Zellulose dies nicht ist. ORZ wird durch die hydrolytische Spaltung des Polymers resorbiert, um kleine Oligosaccharide zu ergeben, die metabolisiert und aus dem Körper entfernt werden. Oxidierung der Zellulose, um 10 bis 21% Carboxylgruppen am Gewicht der Zellulose zu erhalten, erlaubt die im wesentlichen vollständige Resorption des Materials in zwei bis drei Wochen im Anschluß an die Implantation.
ORZ wird durch Aussetzen von Zellulose gegenüber einem oxidierenden Mittel wie Distickstofftetroxid hergestellt, wie in US-A-3 122 479 beschrieben ist. Die physische Form des zellulosischen Materials ist nicht kritisch. Es können zum Beispiel Zelluloseflim, -papier, -schwamm und -gewebe alle oxidiert werden, um ORZ zu ergeben. Das kommerziell bevorzugte Material ist jedoch ein gewebtes oder geknüpftes Gewebe. ORZ in Form eines geknüpften Gewebes ist unter dem Markennamen SURGICEL zur Verwendung als ein resorbierbares Hämostatikum erhältlich und ORZ ist auch unter dem Markennamen INTERCEED zur Verwendung als eine Anhaftungssperrschicht erhältlich.
Andere Polysaccharide als Zellulose können auch oxidiert werden, um medizinisch geeignete hämostatische Materialien zu ergeben. Solche anderen Polysaccharide schließen mikrobielle Polysaccharide wie Dextran, Gellangummi und Xanthangummi ein; Polysaccharide, die von Pflanzen abgeleitet sind, zum Beispiel Agar, Stärke, Konjac, Carrageenan, Guargummi, Inulin und Pektin; und Polysaccharidderivate wie Carboxymethylzellulose, Methylhydroxypropylzellulose, Zelluloseacetat, Methylzellulose und Ethylzellulose.
Es ist vorgeschlagen worden, ORZ mit anderen Materialien zur Verwendung als Wundverbände zu kombinieren. Zum Beispiel offenbart US-A-2 517 772 (Doub et al) Verbände, die aus ORZ, imprägniert mit Thrombin, gebildet sind. ORZ ist jedoch in bedeuten dem Maße sauer. Der oberflächliche pH eines vollständig wassergesättigten Stückes von ORZ-Gewebe kann so niedrig wie 1,7 sein. Viele eiweißartige Mittel, wie Thrombin, sind sehr säureempfindlich und werden sofort beim Kontakt mit einer solchen Trägermatrix inaktiviert. Entsprechend lehren Doub et al., daß ORZ vor der Imprägnierung mit Thrombin neutralisiert werden sollte. Als Beispiele geeigneter Neutralisierungsmittel werden Calciumacetat, Natriumbicarbonat, Ammonium und alkoholisches Ethylamin angegeben, jedoch warnen Doub et al. daß ORZ nicht zu einem solchen Maße neutralisiert werden sollte, daß es seine fibrösen Eigenschaften aufgrund von Lösen oder Gelieren und Zerfall verliert, wenn es in Wasser gelegt wird.
EP-A-0 437 095 offenbart, daß die Verwendung wässriger Lösungen von Natriumbicarbonat, um ORZ-Tuch zu neutralisieren, zu einem Tuch führt, daß teilweise geliert ist, von seiner ursprünglichen Größe verzogen und sehr schwach mit niedriger Formstabilität ist. Die Zugfestigkeit des Tuches wird als zu niedrig für die praktische Verwendung angegeben, wie zum Beispiel als ein Hämostatikum. Es wird angegeben, daß ähnliche Ergebnisse bei Verwendung stark basischer wässriger Natriumhydroxyd- und Ammoniumhydroxydlösungen erhalten wurden. EP-A-0 437 095 lehrt demgemäß ein Verfahren zur Herstellung eines lagerstabilen, nicht reizenden und therapeutischen neutralisierten Produktes aus oxidierter Zellulose, das die Schritte des Kontaktierens eines säureoxidierten Zellulosematerials mit einer Lösung aus Alkohol und Wasser eines leicht basischen, chloridfreien Salzes einer schwachen Säure, um den pH des Zellulosematerials auf zwischen 5 und 8 anzuheben; Waschen des Zellulosematerials mit erhöhtem pH mit Alkohol, um überschüssiges Salz und Wasser zu entfernen; und Trocknen des Zellulosematerials, um Alkohol zu entfernen, umfaßt.
Es ist nun gefunden worden, daß ORZ und andere oxidierte Polysaccharide teilweise unter milden alkalischen Bedingungen hydrolysiert werden können, um Oligosaccharide zu ergeben, die eine Anzahl medizinisch geeigneter Eigenschaften aufweisen.
Entsprechend stellt die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung für die topische, orale oder parenterale Verabreichung zur Verfügung, umfassend ein oxidiertes Oligosaccharid mit einem mittleren Molekulargewicht im Bereich von 1000 bis 50.000 Dalton.
Insbesondere binden die oxidierten Oligosaccharidzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung therapeutisch geeignete Mittel und solche gebundenen Mittel können dann mit hoher Ausbeute freigesetzt werden. Die oxidierten pharmazeutischen Oligosaccharidzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können daher zum Beispiel in Wundverbänden verwendet werden, um solche Mittel an einen Wundort zu liefern. Die therapeutisch geeigne ten Mittel, die durch oxidierte Oligosaccharide gebunden werden, schließen pharmazeutisch aktive Peptide und Proteine ein, vorzugsweise Wachstumsfaktoren wie PDGF AB, PDGF BB, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, basischen FGF, sauren FGF und möglicherweise EGF und TGFα.
Ohne den Wunsch, durch eine Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, daß die anionischen Carboxylatgruppen auf den oxidierten Oligosacchariden kationische Amingruppen auf Peptiden und Proteinen komplexieren. Die Komplexierung therapeutisch aktiver Mittel, die anionische Gruppen aufweisen, kann auch zum Beispiel durch Verwendung polyvalenter Metallionen, wie Ca²&spplus; oder Zn²&spplus;, als ionische Vernetzungsmittel bereitwillig erzielt werden.
Ein weiterer Vorteil der pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung ist, daß sie innig mit anderen Materialien wie Proteinen und anderen Polysacchariden (mit oder ohne chemisches Vernetzen) zusammengestellt werden können, um Zusammensetzungen zu bilden, die neue Eigenschaften aufweisen. Zum Beispiel können oxidierte Oligosaccharide mit Hyaluronsäure, Chitosan oder einem Alginat zusammengestellt werden (insbesondere Natriumalginat, Calciumalginat oder einem gemischen Natrium/Calciumalginat) um neue hämostatische Zusammensetzungen zu bilden. Auf eine andere Weise können Verbundstoffe oxidierter Oligosaccharide mit anderen Oligosacchariden, Polysacchariden oder Proteinen als Trägermatrices für die kontrollierte Freisetzung für eine Vielzahl therapeutischer Mittel wie Antiseptika, Antibiotika, Proteinwachstumsfaktoren, entzündungshemmende Mittel, Schmerzmittel, Proteinaseinhibitoren wie Aprotinin oder Dihydroxycarbamoylcarbonsäuren verwendet werden. Die oxidierten Oligosaccharide der Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können mit einem gewünschten therapeutischen Mittel zusammengestellt werden, während sie in Lösung sind (wobei das therapeutische Mittel entweder in Lösung oder in Suspension ist) und das Oligosaccharid kann dann durch geeignete Mittel aus der Lösung entfernt werden, um ein Material zu ergeben, in dem das therapeutische Mittel im wesentlichen einheitlich verteilt ist. Auf eine andere Weise kann das Lösungsmittel entfernt werden, z. B. durch Gefriertrocknen.
Oxidierte Oligosaccharide können auch vernetzt werden, um die Bildung dreidimensionaler Strukturen zu ermöglichen. Zum Beispiel können oxidierte Oligosaccharide in Wasser gelöst werden, zu dem eine sehr niedrige Konzentration von mit Pepsin solubilisiertem Collagen zugegeben ist. Wenn dann Carbodiimid als ein Vernetzungsmittel zugegeben wird, wirkt das Collagen als eine Brückengruppe zwischen den Oligosacchariden, so daß eine dreidimensionale Struktur durch Gefriertrocknen erhalten werden kann.
Die oxidierten Oligosaccharide in den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung haben vorzugsweise ein Molekulargewicht von wenigstens 1000 Dalton und im allgemeinen weniger als 50.000. Am üblichsten wird das Molekulargewicht niedriger als 5000 bis 30.000 Dalton und vorzugsweise im Bereich von 5000 bis 25.000 Dalton betragen. (Es ist verständlich, daß die oxidierten Oligosaccharide der vorliegenden Erfindung im allgemeinen eine gemischte Population von Molekülen mit verschiedener Größe bilden werden. Entsprechend bedeuten Bezugnahmen hier auf oxidierte Oligosaccharide mit einem besonderen Molekulargewichtsbereich, daß wenigstens 90 Gew.-% der Moleküle in den angegebenen Bereich fallen.)
In einer Ausführungsform sind die Oligosaccharide zur Verwendung in Zusammensetzungen gemäß der Erfindung von unlöslichen oxidierten Polysacchariden abgeleitet und sind- von einem solchen Molekulargewicht, daß sie bei neutralem und alkalischem pH löslich sind, jedoch bei saurem pH unlöslich. Solche Oligosaccharide können einfach aus Lösungen allein durch Erniedrigen des pH wiedergewonnen werden, wodurch bewirkt wird, daß sie ausfallen. Auf eine andere Weise können oxidierte Oligosaccharide jedoch aus der Lösung wiedergewonnen werden, indem sie in eine Lösung übertragen werden, die keine anderen nichtflüchtigen Bestandteile enthält, und dann Verdampfen des Lösungsmittels. Zum Beispiel können oxidierte Oligosaccharide unter Verwendung einer Festphasenionentauscherextraktionssäule isoliert werden (so wie eine Phenyl-Borsäure-Festphasensäule, zuvor mit Methanol aktiviert und mit verdünnter Essigsäure equilibriert), und dann mit verdünnter (z. B. 0,1 M) Ammoniumhydroxidlösung eluiert werden.
Vorzugsweise haben die oxidierten Oligosaccharide, die in den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, einen Carboxylgehalt von 5 bis 25 Gew.-% und bevorzugter von 8 bis 14 Gew.-%. Der Carboxylgehalt der Oligosaccharide ist folgendermaßen bestimmt:
Eine Probe oxidierten Oligosaccharides (annähernd 0,2 g) wird in 0,5 M Natriumhydroxyd (5 mL) gelöst und dann werden ein paar Tropfen einer 0,1% Phenolphthalein- Indikatorlösung zugegeben. Das überschüssige Natriumhydroxyd wird mit 0,1 M HCl bis zum Endpunkt des Phenolphthaleins zurücktitriert (rot zu farblos). Ein Nullwert wird durch Titrieren von 5 mL 0,1 M Natriumhydroxyd mit 0,1 M HCl bestimmt. Der Wert für den Carboxylgehalt wird mit der Gleichung berechnet:
wobei:
C = Prozent Carboxylgehalt
B = Volumen standardisierter HCl zum Titrieren des Nullwertes (mL).
S = Volumen standardisierter HCl zum Titrieren der Probe (mL)
M = Molarität standardisierter HCl
W = Trockengewicht der Probe (g)
(4,5 = Milliequivalentgewicht von Carboxyl · 100)
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung einer oxidierten Zellulose bereit, das das Behandeln einer oxidierten Zellulose mit einem Molekulargewicht von wenistens 50.000 (üblicher wenigstens 100.000, z. B. mehr als 300.000) mit einer wässrigen alkalischen Lösung bei einer Temperatur und für eine Zeitdauer, die ausreichen, um zur teilweisen Hydrolyse der oxidierten Zellulose zu führen, umfaßt, und dann Wiedergewinnen der erhaltenen oxidierten Zellulose aus der Lösung (z. B. durch Einstellen des pH auf 7 oder niedriger). Die alkalische Lösung ist geeigneterweise eine Lösung eines Alkalimetallhydroxyds oder bicarbonates, z. B. Natriumhydroxyd oder Natriumbicarbonat, obwohl andere Alkalien (z. B. wässriges Ammoniumhydroxyd) auch verwendet werden können. Es ist verständlich, daß die Behandlungsbedingungen (und insbesondere der pH) von dem erwünschten Molekulargewichtsbereich für das erhaltene Produkt abhängig sind. Jedoch können geeignete Bedingungen auf einfache Weise durch Routineexperimente in jedem besonderen Fall bestimmt werden. Als Beispiel kann oxidierte regenerierte Zellulose in 1 M bis 8 M Natriumhydroxyd bei einer Temperatur von 0ºC bis 50ºC für 5 bis 120 Minuten hydrolysiert werden, um Oligosaccharide im Molekulargewichtsbereich von 1000 bis 20.000 Dalton zu ergeben, oder mit 0,01 M bis 1 M Natriumbicarbonat bei 0ºC bis 50ºC für 10 Stunden bis zu 10 Tagen, um Oligosaccharide im Molekulargewichtsbereich von 7000 bis 50.000 zu ergeben.
Die hydrolytische Reaktion kann durch Zugabe einer Säure gestoppt werden, wie einer Mineralsäure, bis die Lösung annähernd neutral ist. Konzentrierte Salzsäure kann geeigneterweise verwendet werden.
Die Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele beschrieben.

Beispiel 1

Eine Lösung von ORZ wurde durch Lösen von SurgicelTM-Gewebe bei einer Konzentration von 20 mg/mL in 6 M Natriumhydroxyd hergestellt. Die Lösung wurde bei 37ºC für 45 Minuten inkubiert, wonach die Reaktion durch Zugeben von 6 M HCl abgestoppt wurde, bis die Fällung auftrat und der pH sich von alkalisch auf pH 7 oder weniger veränderte. Das Präzipitat wurde über Nacht absetzen gelassen und dann wurde die überschüssige Flüssigkeit entfernt. Das Präzipitat wurde in Schläuchen mit einer Ausschlußgrenze Molekulargewicht 1000 gegen Wasser dialysiert, dann gefriergetrocknet, um ein Puder herzustellen.
Die molekulare Größe des Oligosaccharides, durch Gelelektrophorese und Hochdruckflüssigkeitschromatographie bestimmt, zeigte einen Bereich, der sich von annähernd 1000 bis 15.000 Dalton erstreckt.

Beispiel 2

Eine Lösung von ORZ wurde durch Auflösen von SurgicelTM-Gewebe bei einer Konzentration von 10 mg/mL in 0,1 M Natriumbicarbonat hergestellt. Die Lösung wurde bei 37ºC für einige wenige Tage (2-3) inkubiert, bis sich die gesamte ORZ gelöst hatte. Die Reaktion wurde durch Zugeben von 6 M HCl abgestoppt, bis die Fällung auftrat und der pH sich von alkalisch auf pH 7 oder weniger veränderte. Das Präzipitat wurde über Nacht absetzen gelassen und dann wurde die überschüssige Flüssigkeit entfernt. Das Präzipitat wurde in Schläuchen mit einer Ausschlußgrenze vom Molekulargewicht 1000 gegen Wasser dialysiert, dann gefriergetrocknet, um ein Puder herzustellen.
Die molekulare Größe, wie oben bestimmt, zeigte einen Bereich von annähernd 1000 bis 30.000 Dalton.

Beispiel 3

Schwamm oxidierter Carboxymethylzellulose wurde folgendermaßen hergestellt:
In 500 Gramm Wasser wird unter Rühren 7,5 Gramm Carboxymethylzellulose (CMZ) der Aqualon Corporation zugegeben. Wenn das Polymer gelöst ist, wird die Lösung über Nacht ausgasen gelassen, um eingeschlossene Luftblasen zu entfernen. Die Lösung wird in Schalen von 7,62 · 10,16 · 0,64 cm (3 · 4 · ¹/&sub4; Inch) gegossen und dann für 24 Stunden in einem Gefriertrockner gefriergetrocknet. Weiche, weiße, wasserlösliche CMZ-Schwämme werden mit diesem Verfahren erhalten.
Die Oxidierung der CMZ-Schwämme wird durch Legen von 5,8 Gramm trockenem Schwamm in einen Harzkessel erzielt, an den eine kleine Flasche angeschlossen ist, die 8 Gramm Stickstofftetroxid enthält. Das Stickstofftetroxid wird aus der kleinen Flasche in den Harzkessel verdampfen gelassen und die CMZ-Schwämme in eine Atmosphäre von Gas einhüllen gelassen. Die Schwämme werden in dem Harzkessel für 48 Stunden gehalten, nach welcher Zeit das Gas in eine Alkalifalle abgezogen wird und die Schwämme werden entfernt und in 500 mL Wasser gelegt. Die oxidierten CMZ-Schwämme sind nicht in Wasser löslich. Sie werden für 15 Minuten mit Wasser gewaschen, dann in frisches Wasser für eine andere Waschung gelegt. Dieses Waschen der oxidierten Schwämme wird wiederholt, bis der pH des Waschwassers oberhalb 3 liegt. Die weißen oxidierten Carboxymethylzelluloseschwämme werden durch ihre Plazierung in 100% Isopropylalkohol für 15 Minuten getrocknet. Dieses wird für eine Gesamtzahl von zwei Waschungen wiederholt, dann werden die Schwämme an Luft trocknen gelassen. Die oxidierten CMZ-Schwämme sind weich und anschmiegsam und werden 14mal ihr Gewicht in isotonischer Salzlösung absorbieren. Sie sind in 0,5 N Natriumhydroxyd löslich und durch ihren Carboxylsäuregehalt charakterisiert, der bei Titration zu 26,3% festgestellt wird.
Eine Lösung der oxidierten Carboxymethylzellulose wurde durch Auflösen des Schwammaterials zu einer Konzentration von 10 mg/mL in O1 M Ammoniumhydroxyd hergestellt. Die Lösung wurde bei 37ºC für 2 Stunden inkubiert und die Reaktion wurde dann durch Zugabe von 6 M HCl gestoppt, bis Ausfällung auftrat. Das Präzipitat wurde gesammelt und ausführlich gegen destilliertes Wasser in Schläuchen mit einer Ausschlußgrenze vom Molekulargewicht 1000 Dalton dialysiert, dann gefriergetrocknet, um ein Puder herzustellen.
Das Molekulargewicht wurde durch Gelelektrophorese bestimmt und gefunden, daß es 1000 und 30.000 Dalton beträgt.

Beispiel 4

Methylzellulose wurde durch ein analoges Verfahren zu dem in Beispiel 3 beschriebenen oxidiert und eine Lösung wurde durch Auflösen des oxidierten Materials zu einer Konzentration von 20 mg/mL in 6 M Natriumhydroxyd und Inkubieren bei 37ºC für 45 Minuten hergestellt. Die Lösung wurde zentrifugiert, um ungelöstes Material zu entfernen und die Oligosaccharide wurden durch die Zugabe von 6 M HCl aus der Lösung ausgefällt. Das Präzipitat wurde gesammelt und ausführlich gegen destilliertes Wasser in Schläuchen mit einer Ausschlußgrenze vom Molekulargewicht 1000 Dalton dialysiert.
Das Molekulargewicht wurde durch Gelelektrophorese bestimmt und gefunden, daß es zwischen 1000 und 5000 Dalton beträgt.

Beispiel 5

Eine Phenylborsäure (PBA)-Festphasenextraktionssäule (Bond Elut, Varian Associates), die 100 mg Absorbermaterial mit einem 10 mL Reservoir enthielt, wurde unter Verwen dung von 10 mL Methanol aktiviert, um die Säule zu benetzen, gefolgt von 10 mL 0,1 M Essigsäure, um die Säule beim korrekten pH zu equilibrieren.
ORZ-Lösung wurde durch Auflösen von 1 g InterceedTM-Material in 100 mL 6 M Natriumhydroxydlösung hergestellt. Nachdem das InterceedTM-Material vollständig gelöst war, wurde die Lösung auf pH 3,0 angesäuert und ein Präzipitat wurde durch Zentrifugieren entfernt. Der Überstand wurde genommen und 2 mL wurde durch die aktivierte PBA-Säule geschickt. Die Säule wurde dann mit 2 mL 0,1 M Essigsäure und 4 · 2 mL Portionen destillierten Wassers gewaschen, um Salz und anderes endogene Material zu entfernen. Die ORZ- Oligosaccharide wurden unter Verwendung von 2 · 2 mL Portionen von 0,1 M Ammoniumhydroxyd von der Säule eluiert. Die Portionen wurden vereinigt, gefroren und gefriergetrocknet, um ein Puder herzustellen. Nach Auftrennen der oxidierten Oligossacharide durch Ionenaustauschchromatographie zeigt die massenspektrographische Analyse, daß sie ein Molekulargewicht im Bereich von 600 bis 1200 Dalton aufweisen.

Beispiel 6

Ein Kollagen/ORZ-Oligosaccharid.-Schwamm wurde auf die folgende Art und Weise hergestellt. Gekälkte Kollagenfasern (0,8 g) wurden in 160 mL 0,01 HCl (pH 3,0) aufgeschlämt und 0,16 g ORZ-Oligosaccharid, wie in Beispiel 2 hergestellt, wurden zugegeben. Die Mischung wurde für 15 Sekunden homogenisiert, HMDI wurde zugegeben (10 Gew.-% des Kollagens) und die Aufschlämung wurde für weitere 2 · 15 Sekunden homogenisiert. Die Aufschlämmung wurde entgast, in zwei Petrischalen mit 9 cm Durchmesser gegossen, gefroren und unter Verwendung eines Wärmeanstiegs gefriergetrocknet, der von -30ºC auf 70º über 72 Stunden lief.
Der Kollagen/ORZ-Oligosaccharid-Schwann wurde dann auf seine Fähigkeit hin getestet, den Plättchenwachstumsfaktor (PDGF) zu binden. Für Vergleichszwecke wurden auch InterceedTM-Gewebe und ein einfacher Kollagenschwamm (wie oben hergestellt, jedoch ohne die Zugabe des ORZ-Oligosaccharides) getestet. In jedem Fall wurde ein kleiner Bereich des Testmaterials (annähernd 1 cm² Quadrate des InterceedTM-Gewebes und annähernd 1 cm · 0,5 cm · 0,4 cm Abschnitte des Schwammes) gewogen und in 100 mM zweibasischem Natriumphosphatpuffer mit 150 mM Natriumchlorid Gesamtvolumen 1 mL) für wenigstens ein Stunde bei Raumtemperatur getränkt. Proben wurden dann mit 2% Rinderserumalbumin (RSA) in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. 25 ng PDGF wurden dann jeder Probe in 250 uL PBS mit 2% RSA zugegeben und die Proben wurden dann für eine weitere Stunde bei 37ºC inkubiert.
Jede Probe wurde dann dreimal mit 250 uL PBS gewaschen, gefolgt von ansteigenden Konzentrationen an Natriumchlorid. Schließlich wurde jede Probe mit 4,0 M Harnstoff gewaschen. ELISA-Analysen der ursprünglichen PDGF-Präparation und die verschiedenen Waschungen der Probenmaterialien ergaben die folgenden Ergebnisse: TABELLE I
Die Ergebnisse zeigen, daß die drei Testmaterialien alle ähnliche Mengen an PDGF binden, jedoch kann PDGF vom Kollagen/ORZ/-Oligosaccharid-Schwamm mit der höchsten Ausbeute wiedergewonnen werden.
Auch die Bindungseigenschaften der Kollagen/ORZ-Oligosaccharid-Materialien sind im Vergleich mit den einzelnen Vergleichsmaterialien in einmaliger Weise verschieden. Diese Beobachtungen weisen darauf hin, daß der Komplex eine einmalige Bindung für PDGF hat, die in geeigneter Weise für sowohl exogenes Binden als auch endogenes Binden und die Freisetzung von Wachstumsfaktoren verwendet werden kann.

Claims

1. Pharmazeutische Zusammensetzung zur topischen, oralen oder parenteralen Verabreichung, umfassend ein oxidiertes Oligosaccharid mit einem mittleren Molekulargewicht im Bereich von 1000 bis 50.000 Dalton.

2. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, umfassend ein oxidiertes Oligosaccharid, das von einem oxidierten bakteriellen oder pflanzlichen Polysaccharid abgeleitet ist.

3. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, umfassend ein oxidiertes Oligosaccharid, das von einem oxidierten tierischen Polysaccharid oder einem oxidierten synthetischen Polysaccharid abgeleitet ist.

4. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, umfassend ein oxidiertes Oligosaccharid, das von oxidierter Zellulose oder einem oxidierten Zellulosederivat abgeleitet ist.

5. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, umfassend in oxidiertes Oligosaccharid, das von einem oxidierten Derivat von Dextran, Gellangummi, Xanthangummi, Agar, Stärke, Konjac, Carrageenan, Guargummi, Pectin, Carboxymethylzellulose, Methylhydroxypropylzellulose, Zelluloseacetat, Methylzellulose, Zellulosephosphat, Ethylzellulose oder Inulin abgeleitet ist.

6. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche, umfassend ein oxidiertes Oligosaccharid, das ein mittleres Molekulargewicht im Bereich von 5000 bis 25.000 Dalton aufweist.

7. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei dem die Zusammensetzung oxidierten Oligosaccharids an ein pharmakologisch aktives Peptid oder Protein gebunden ist.

8. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 7, bei der das Peptid oder Protein ein Wachstumsfaktor ist.

9. Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung einer Zusammensetzung zum Gebrauch als oder für einen Wundverband.

10. Verwendung nach Anspruch 9, bei der ein pharmakologisch aktives Mittel im wesentlichen einheitlich innerhalb des Wundverbandes verteilt ist.

11. Verwendung nach Anspruch 10, bei der das pharmakologisch aktive Mittel ein Antibiotikum, ein Antiseptikum oder ein Protein-Wachstumsfaktor ist.

12. Verfahren zur Herstellung der oxidierten Zellulose nach Anspruch 1, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt von:

(a) Behandeln einer oxidierten Zellulose mit einem mittleren Molekulargewicht von wenigstens 5000 mit einer wässrigen Alkalilösung bei einer Temperatur und für eine Zeitdauer, die ausreichen, um zur teilweisen Hydrolyse der oxidierten Zellulose zu führen; und

(b) Wiedergewinnen der erhaltenen oxidierten Zellulose aus der Lösung.

13. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem die alkalische Lösung eine Lösung eines Alkalimetallhydroxides oder -bicarbonates ist.

14. Verfahren nach Anspruch 12 oder Anspruch 13, bei dem die oxierte Zellulose durch Einstellen des pH auf 7 oder weniger unter Verwendung einer Säure wiedergewonnen wird.

15. Verfahren nach Anspruch 14, bei dem die Säure eine konzentrierte Mineralsäure ist.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 15, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt von:

(a) Bereitstellen einer alkalischen Lösung der oxidierten Zellulose;

(b) Auflösen oder Dispergieren eines therapeutisch aktiven Mittels in der alkalischen Lösung; und

(c) Erniedrigen des pH der Lösung oder Dispersion um zu bewirken, daß die oxidierte Zellulose präzipitiert.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 15, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt von:

(a) Bereitstellen einer alkalischen Lösung der oxidierten Zellulose;

(c) Entfernen des Lösungsmittels aus der Lösung oder Dispersion.

18. Verfahren nach Anspruch 17, bei dem das Lösungsmittel in Schritt (c) durch Gefriertrocknen entfernt wird.