JP2000513324A - 骨欠損状態を処置するための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 一つまたはそれ以上の原子を含むリンカーを介して共有結合された２つの芳香族系を含む化合物、または1.5−15Åの距離で芳香族系を隔てて共有結合されたそれ自体を含むと定義される「リンカー」は、骨欠損を伴う症状の処置に効果的である。化合物は単独で、または骨増殖を促進するか、もしくは骨吸収を阻害するさらなる薬剤と組み合わせて、脊椎動物被験体に投与され得る。これらは投与の前に、骨形態形成タンパク質に関連するプロモーターに結合されたレポーター遺伝子の転写に影響を与えるそれらの能力、および／またはモデル動物系における頭蓋冠増殖を刺激するそれらの能力を評価することによって、活性についてスクリーニングされる。

Description

【発明の詳細な説明】 骨欠損状態を処置するための組成物および方法技術的分野 本発明は、そのような骨損失の危険がある脊椎動物において、所望されない骨 損失を制限すること、所望されない骨損失によって、または骨増殖のための必要 性によって特徴付けられる症状を処置すること、骨折を処置すること、および軟 骨障害を処置することにおける使用のための組成物および方法に関する。より詳 細には、本発明は高スループットスクリーニングアッセイによって同定または特 徴づけられる、特定のクラスの化合物の使用に関する。背景技術 骨は静的な組織ではない。骨は、新しい骨を産生する骨形成原細胞と、骨を破 壊する破骨細胞とによって媒介される複雑なプロセスにおいて、常に崩壊し、そ して再合成されている。これらの細胞の活性は、多くのサイトカインおよび増殖 因子によって調節され、それらの多くが、現在同定され、そしてクローン化され ている。Mundyはこれらの因子に関する現在の知見を記載している(Mundy，G.R． Clin Orthop 324:24-28，1996;Mundy，G.R．J Bone Miner Res 8:S505-10，1993 )。 骨の破壊および再吸収に影響する因子について、有用な多量の情報が存在する が、新しい骨の形成を刺激する増殖因子についての情報はより限定されている。 研究者らはこのような活性の供給源について調査し、そして骨組織それ自体が骨 細胞を刺激する能力を有する因子の貯蔵庫であることを見出した。したがって、 屠殺場から入手したウシの骨組織の抽出物は、骨の構造の完全性の維持を担う構 造タンパク質だけでなく、また骨細胞を増殖へと刺激し得る生物学的に活性な骨 増殖因子をも含む。これらの後者の因子には、形質転換増殖因子β、ヘパリン結 合増殖因子（酸性および塩基性線維芽細胞増殖因子）、インシュリン様増殖因子 （インシュリン様増殖因子Ｉおよびインシュリン様増殖因子II）、ならびに最近 記載された、骨形態形成タンパク質（BMP）と呼ばれるタンパク質のファミリー がある。これら全ての増殖因子は、骨細胞と同様に他の型の細胞にも効果を有す る。 BMPは広範にされた形質転換増殖因子βスーパーファミリー中の新規の因子で ある。これらは、最初に、遺伝子クローニング技術を用いて、Wozney J.ら、Sci ence（1988）242:1528-34によって、先の脱鉱化された骨の抽出物中の生物学的 活性の特徴付けの記述(Urist M．Science（1965）150:893-99)に続いて同定され た。組換えBMP2およびBMP4は、局所的にラットの皮下組織に注入される場合、新 しい骨の形成を誘導し得る(Wozney J．Molec Reprod Dev（1992）32:160-67)。 これらの因子は正常な骨形成原細胞によってそれらが分化するときに発現され、 そしてインビトロでの骨形成原細胞の分化および骨小節の形成ならびにインビボ での骨の形成を刺激することが示されている(Harris S．ら、J．Bone Miner Res （1994）9:855-63)。この後者の能力は、骨損失を生じる疾患における治療剤と しての潜在的な有用性を示唆する。 骨形成を担う細胞は骨形成原細胞である。骨形成原細胞が前駆体から成熟骨形 成細胞に分化するとき、これらは多くの酵素および骨基質の構造タンパク質（Ｉ 型コラーゲン、オステオカルシン、オステオポンチン、およびアルカリフォスフ ァターゼを含む）を発現し、そして分泌する(Stein G.ら、Curr Opin Cell Biol （1990）2:1018-27;Harris S.ら、(1994),前出)。これらはまた、骨基質に貯蔵 される多くの増殖調節ペプチドを合成し、そしておそらく正常な骨形成を担う。 これらの増殖調節ペプチドはBMPを含む(Harris S.ら、(1994)、前出)。ラットの 胎児頭蓋冠骨形成原細胞の１次培養物の研究において、BMP１、２、３、４、お よび６は、鉱化された骨小節の形成の前に培養細胞から発現される(Harris S.ら (1994)、前出)。アルカリフォスファターゼ、オステオカルシン、およびオステ オポンチンと同様に、BMPは培養された骨形成原細胞によってそれらが増殖し、 そして分化するときに発現される。 BMPはインビトロおよびインビボでの骨形成の強い刺激因子であるが、骨回復 を増強させるための治療剤としてのそれらの利用には不都合が存在する。多くの 組織で骨形態形成タンパク質のレセプターが同定されており、そしてBMPそれ自 体が多くの種類の組織において特定の時期および部位の様式で発現される。この ことは、BMPが骨以外の多くの組織で効果を有し得ることを示唆し、全身投与さ れる場合、治療剤としてのその有用性を潜在的に制限する。さらに、これらはペ プチドであるため、注入によって投与されるべきである。これらの不都合が、治 療剤としてのBMPの開発に厳しい制限を与えている。 骨形成を増強させる必要性によって特徴付けられる、多血症の症状が存在する 。おそらく、骨増殖を刺激すること、および骨修復を促進し、そして完全にする ことが所望される骨折の場合が、最も明白である。骨形成を増強する薬剤は顔面 再構成手順においても有用である。他の骨欠損症状として、骨分節欠損、歯周病 、転移性骨疾患、骨溶解性骨疾患、および、軟骨欠損または創傷の、回復または 再生のような、結合組織の修復が有益である症状が挙げられる。また年齢に関連 する骨粗鬆症、および閉経後のホルモン状態に関連する骨粗鬆症を含む、骨粗鬆 症の慢性的な症状がまた、非常に重要である。骨増殖の必要性によって特徴付け られる他の症状として、一次および二次的上皮小体機能亢進症、不使用骨粗鬆症 、糖尿病関連骨粗鬆症、ならびにグルココルチコイド関連骨粗鬆症が含まれる。 さらに、あるいは選択的に、本発明の化合物は代謝、増殖、および／または正常 または異常な細胞または組織の分化を調節し得る。 現在、任意のこれらの状況を制御するために、十分な製薬的アプローチは存在 しない。骨折は専ら、ギプス包帯、装具、固定器具、およびその他の厳密な機械 的な手段を用いて未だに処置されている。閉経後以降の骨粗鬆症に伴うさらなる 骨の劣化は、エストロゲンまたはビスフォスフォネイトを用いて減少または予防 されている。 米国特許第5,280,040は化合物の１つのクラスである3,4-ジアリルクロマンを 開示する。これらの化合物は2,3,4トリフェニルブタノールの誘導体であると考 えられ得、ここで１位の水酸基は、ブタノールの４位で置換されたフェニル基の オルト位とともにエーテルを形成している。親の3,4-ジアリルクロマンは芳香環 部分またはそれらのリンカーに窒素原子を含まない。好ましい化合物であるセン トクロマン(centchroman)は、フェニル部位の一つの置換基のみに窒素置換基を 含む。これらの化合物は骨粗鬆症の処置に有用であるとして'040特許に開示され ている。 本発明は骨欠損の症状の制限または処置、および本明細書中の教示から当業者 には明らかであるべきその他の用途に有用な化合物を開示する。発明の開示 本発明は、通常の製剤として投与され得、そして骨増殖を増強する代謝的効果 を有する化合物を提供する。本発明の化合物は、これらの因子に関連する制御エ レメントを活性化するそれらの能力についてのアッセイを用いて同定され得る。 従って、本発明は骨格（骨）組織の増殖を刺激するための方法および組成物に関 し、この方法および組成物は、活性成分として化合物を使用する。ここで、２つ の芳香環システムは互いに約1.5〜約15Å隔てるように連結されている。このよ うに結合されたシステム（これらを連結するリンカーを含む）は環置換基以外に 少なくとも１つの窒素原子を含み得る。 従って、本発明に有用な化合物は式Ar¹-リンカー-Ar²を有し、ここで、各Ar¹ およびAr²は独立に芳香環システムであり、そしてこの式のリンカー部分はAr¹と Ar²とを約1.5〜15Å入の距離で隔てるとして記載され得る。Ar¹、Ar²、およびリ ンカーは、必要に応じて非干渉性置換基と置換され得る。有用な化合物には、そ れにおける全ての置換基と独立に、Ar¹、Ar²、および／またはリンカーのいずれ かに少なくとも１つの窒素原子が存在し得る。好ましくは、本発明の化合物はま た、全ての置換基と独立に、Ｎ、Ｓ、およびＯからなる群から選択される少なく とも１つのさらなるヘテロ原子を含む。 本発明の他の化合物は、電位分離を有する特定の五員環を含む。 従って、本発明は記述された化合物を用いる骨障害を処置するための方法、お よびこの用途のための製薬的組成物に関する。図面の簡単な説明 図１は、59-0008と称される化合物の用量応答曲線を示す。 図２および３は、本発明の例示的な化合物、およびインビトロ試験においてこ れらを用いて得られた結果を示す。発明の実施の形態 BMPプロモーター（内生的に産生される骨形態形成因子の産物の代理）に連結 されるレポーター遺伝子の発現を刺激し得る化合物についての迅速なスループッ トスクリーニング試験は、1995年７月２日に提出された米国出願番号第08/458,4 34に記載されており、その全ての内容が本明細書中に参考として援用される。こ のアッセイはまた、Ghosh-Choudhery，N.らEndcrinology(1996)137:331-39によ る不死化されたマウス骨形成原細胞（Ｔ-抗原の発現を駆動するBMP2プロモータ ーからなるトランスジーンを発現するマウス由来）の研究の一部としても記載さ れる。この研究において、不死化細胞は、マウスBMP2プロモーター（-2736/114b p）により駆動され、そして組換えヒトBMP2に用量依存性の様式で応答する制御 のルシフェラーゼレポーター遺伝子を含むプラスミドで安定的にトランスフェク トされた。 簡潔には、このアッセイは骨形態形成タンパク質のプロモーター（詳細には、 BMP2またはBMP4）が、レポーター遺伝子（代表的にはルシフェラーゼと連結され た）を含む構築物で、持続的または一時的に形質転換された細胞を利用する。次 いで、これらの形質転換された細胞は、レポーター遺伝子産物の産生について評 価される；BMPプロモーターを活性化する化合物が、容易にアッセイされ得るレ ポータータンパク質の産生を駆動する。40,000を超える化合物がこの迅速なスク リーニング技術に供され、そして非常に少ないパーセントのみが、ビヒクルによ り産出されるレベルより５倍多いルシフェラーゼの産出レベルを誘発し得る。BM Pプロモーターを活性化する化合物は不活性な化合物中には存在しない、特定の 構造的特性を共有する。活性な化合物（「BMPプロモーター活性化合物」または 「活性化合物」）は骨または軟骨の増殖を促進することにおいて有用であり、従 って、骨または軟骨増殖を必要とする脊椎動物の処置に有用である。 BMPプロモーター活性化合物は、種々の特異性および毒性を試験する他のアッ セイによっても試験され得る。例えば、非BMPプロモーターまたは応答エレメン トは、レポーター遺伝子に連結され得、そして適切な宿主細胞に挿入され得る。 細胞傷害性は、例えば、BMPプロモーター-および／または非-BMPプロモーター- レポーター遺伝子を含有する細胞の視覚的試験または顕微鏡試験によって決定さ れ得る。あるいは、細胞による核酸および／またはタンパク質合成がモニターさ れ得る。インビボのアッセイのために、組織が取り出され、そして視覚的または 顕微的に検査され得、そして必要に応じて組織学的試験を容易にする色素または 染料と組み合わせて試験され得る。インビボアッセイの結果を評価することにお いて、試験化合物の生分布を、従来の医化学／動物モデル技術を用いて試験する こともまた有用であり得る。 本明細書中で使用される場合、「限定」または「限定する」、および「処置す る」または「処置」は、相互変換可能な用語である。この用語は骨欠損症状の発 症の延期および／または症状を発症しているか、もしくは発症することが予想さ れるそのような症状の重篤度の軽減を含む。この用語はさらに、存在している骨 または軟骨欠損症状を改善すること、さらなる症状の予防、症状の根元にある代 謝的原因を改善または予防すること、骨吸収を予防または逆転すること、さらに ／または骨増殖を増強することを含む。したがって、この用語は軟骨、骨もしく は骨格欠損を有するか、またはそのような欠損を発症する可能性を有する脊椎動 物被験体に有益な結果が与えられることを意味する。 「骨欠損」によって、骨吸収に対する骨形成の割合の不均衡を意味し、その結 果、緩和されない場合には、被験体は所望されるよりも少量の骨を示すか、また は被験体の骨は所望されるよりもインタクトでなく、そして凝集していない。骨 欠損はまた、骨折による、外科的介入による、または歯科的もしくは歯周病の疾 患による結果であり得る。「軟骨欠損」によって、損傷を受けた軟骨、所望され るよりも少量の軟骨、もしくは所望されるよりもインタクトでなく、そして凝集 していない軟骨が意味される。 本発明の化合物の代表的な用途として以下が挙げられる：閉鎖骨折、開放骨折 および非癒合性(non-union)骨折において生じるような、骨欠損および欠乏状態 の修復；閉鎖骨折、および開放骨折の減少における予防的使用；形成外科手術に おける骨の治癒の促進；非-セメントされた人工関節および骨の移植片への骨の 内部増殖の刺激；閉経後の女性のピーク骨密度の上昇；増殖欠損の処置；歯周病 および欠損の処置、およびその他の歯修復手順；骨形成不和(distraction osteo genesis)の間の骨形成の増強；ならびに、年齢に関連する骨粗鬆症、閉経後の骨 粗鬆症、グルココルチコイド誘導性の骨粗鬆症、または不使用骨粗鬆症および関 節炎などのような、他の骨格の疾患の処置。本発明の化合物は、先天的、創傷誘 導性または手術による骨の切除（例えば、ガン処置のため）の修復、および美容 手術においてもまた有用であり得る。さらに、本発明の化合物は、軟骨損傷また は障害を制限または処置するために使用され得、そして創傷治癒または組織修復 に有用であり得る。 骨または軟骨の欠損または欠乏は、脊椎動物被験体において、特定の構造的お よび機能的特性を示す本発明の化合物の投与によって処置され得る。本発明の組 成物は全身的、または局所的に投与され得る。全身的な用途について、本明細書 中の化合物は、非経口送達（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、腹膜内、鼻腔内、 または経皮的）として、または腸内送達（例えば、経口または直腸）のために、 従来の方法に従って処方される。静脈内投与は、一連の注射によるか、または延 長された期間にわたる連続的注入により得る。注射による投与、または他の経路 の別の場所の投与は、一週間に１回から１日に３回までの範囲の間隔で実施され 得る。あるいは、本明細書中に開示される化合物は、循環的な様式（開示される 化合物の投与；次に投与せず；次に開示された化合物の投与、など）で投与され 得る。処置は所望される結果が達成されるまで続く。一般に、薬学的処方物は、 本発明の化合物を、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、水中の５％デキストロース 、微量元素を含むホウ酸緩衝化生理食塩水などのような、薬学的に受容可能なビ ヒクルと組合せて含む。処方物は、さらに一つ以上の賦形剤、保存剤、可溶化剤 、緩衝剤、バイアルの表面でのタンパク質の損失を防ぐためのアルブミン、潤滑 剤、充填剤、安定剤などを含み得る。処方の方法は当該分野で周知であり、そし て、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences，Gennaro編、Mack Publish ing Co.，Easton PA，1990（これは、本明細書中に参考として援用される）に開 示されている。本発明における使用のための薬学的組成物は、滅菌した、非発熱 性の溶液または懸濁物、コーティングされたカプセル、坐剤、凍結乾燥粉末、経 皮パッチ、または当該分野で公知の形態であり得る。局所的投与は損傷または欠 損部位での注射によって行い得、またはその部位への固体のキャリアの挿入もし くは 装着(attachment)を用い得、または粘性のある液体の直接的、局所的塗布などに より得る。局所的投与において、送達ビヒクルは、好ましくは、骨または軟骨の 増殖のための基質を提供し、そしてより好ましくは、有害な作用を伴わずに被験 体により吸収され得るビヒクルである。 本明細書の化合物の損傷部位への送達は、制御されて放出される組成物（例え ば、継続中の、米国特許出願番号第07/871,246（WIPO公開第WO 93/20859号に対 応する、その全てが本明細書中で参考として援用される）に記載される組成物） の使用によって増強され得る。この型のフィルムは、人工的なデバイスおよび外 科的移植のためのコーティングとして特に有用である。フィルムは、例えば、外 科的ねじ、棒(rod)、ピン、プレート(plate)などの外面に巻き付けられ得る。こ の型の移植可能な装具は、整形外科手術において日常的に使用される。フィルム はまた、骨充填基質（ヒドロキシアパタイトブロック(hydroxyapatite block)、 脱鉱化された骨基質のプラグ(plug)、コラーゲン基質など）をコートするために 使用され得る。一般に、本明細書中に記載されるフィルムまたは装具は、骨折部 位において骨に適用される。適用は一般に通常の外科的手順を用いて、骨への内 部移植、または表面への装着による。 上記コポリマーおよびキャリアに加えて、生分解性のフィルムおよび基質は、 他の活性または不活性な成分を含み得る。特定の目的は、増殖因子のような、組 織の増殖または侵潤を促進する試薬である。この目的のための例示的な増殖因子 として、表皮増殖因子(EGF)、線維芽細胞増殖因子(FGF)、血小板由来増殖因子(P DGF)、形質転換増殖因子(TGF)、上皮小体ホルモン(PTH)、白血病阻害因子(LIF) 、およびインシュリン様増殖因子(IGFs)などが挙げられる。骨増殖を促進する薬 剤（例えば、骨形態形成タンパク質（米国特許第4,761,471号；PCT公開第WO 90/ 11366号）、オステオジェニン(osteogenin)(Sampathら、Proc．Natl．Acad．Sci ．USA（1987）84:7109-13)、およびNaF(Tencerら、J．Biomed．Mat．Res．（198 9）23:571-89)など)もまた好ましい。生分解性のフィルムまたは基質として、硫 酸カルシウム、リン酸化三カルシウム(tricalcium phosphate)、ヒドロキシアパ タイト、ポリ酪酸、ポリ酸無水物、骨または表皮コラーゲン、純粋なタンパク質 、細胞外基質成分など、およびこれらの組合せが挙げられる。このような生分解 性 物質は、非生分解性の物質と組み合わせて使用され、所望される機能的、美容的 、あるいは組織または基質の界面の特性を提供し得る。 本発明の化合物の送達のための別の方法として、ALZET浸透圧ミニポンプ(osmo tic minipump)(Alza Corp.，Palo Alto，CA)；Wangら(PCT公開第WO 90/11366号) に開示されるような基質物質の保持された放出；Baoら(PCT公開第WO 92/03125号 )に開示されるような電荷を有するデキストランビーズ；例えば、Ksanderら(Ann .Surg.(1990)211(3):288-94)に開示される；メチルセルロースゲルシステム、Be ckら(J．Bone Min．Res．(1991)6(11):1257-65)に開示される、コラーゲンベー スの送達システム；および、Edelmanら(Biomaterials(1991)12:619-26)に開示さ れるアルギン酸塩ベース(alginate-based)のシステム、などの使用が挙げられる 。当該分野で周知の、骨の局所への維持される別の送達方法として、飽和(impre gnate)され得る多孔性のコートされた金属プロテーゼ、およびその中に組み込ま れる治療的組成物を伴う固形プラスティックロッドが挙げられる。 本発明の化合物はまた、骨の再吸収を阻害する薬剤と組み合わせて使用され得 る。エストロゲン、ビスフォスフォネートおよびカルシトニンのような、抗再吸 収薬剤は、この目的のために好ましい。より詳細には、本明細書中に開示される 化合物は、骨欠損症状の修正を得るに十分な期間（例えば、数ヶ月から数年）、 投与され得る。一旦骨欠損症状が修正されると、脊椎動物は、修正された骨の状 態を維持するために、抗再吸収化合物を投与され得る。あるいは、本明細書中に 開示される化合物は、抗再吸収化合物とともに循環的な様式（開示された化合物 の投与、次に抗再吸収剤、次に開示された化合物、など）で投与され得る。 さらなる処方として、下記のような従来の調製物が使用され得る。 水性懸濁液は、薬理学的に受容可能な賦形剤（メチルセルロースのような懸濁 剤；および保湿剤（レシチン、リソレシチン、または長鎖脂肪アルコールを含む ）との混合物中に有効成分を含み得る。この水性懸濁液はまた、産業基準に従っ て保存料、着色料、香料、さらに甘味料を含み得る。 局所および局部的適用は、低級脂肪アルコール、グリセロールのようなポリグ リコール、ポリエチレングリコール、脂肪酸エステル、油および脂肪、およびシ リコーンを含み得る薬学的に適切なビヒクルにおけるエアゾールスプレー、ロー ション、ジェル、および軟膏を含む。調製物はさらに、抗酸化剤（例えば、アス コルビン酸またはトコフェノール）、および保存剤（例えば、ｐ-ヒドロベンゼ ン酸エステル）を含み得る。 非経口調製物は特に無菌または滅菌された産物を含む。活性な化合物、および 任意の周知の注射可能なキャリアを含む注射可能な組成物が提供され得る。これ らは浸透圧を調節するために塩を含有し得る。所望される場合、骨形成剤は種々 の病原性状態の処置における使用のためにリポソームを調製する任意の報告され た調製方法によって、リポソームの中に組み込まれ得る。本組成物は、これらの 化合物がリポソーム組成物を取り込むマクロファージ、単核細胞、その他の細胞 および組織および器官に指向するために、リポソーム中に組み込まれた上記の化 合物を利用し得る。リポソームに組み込まれた本発明の化合物は、非経口投与に よって利用され得、化合物のより少ない投与量の効能のある使用を可能にする。 リガンドもまた、リポソームの特異性をさらに集中させるために組み込まれ得る 。 リポソームの調製の従来の適切な方法は、Bangham，A.D.ら、J Mol Biol（196 5）23:238-252、Olson，F.ら、Biochem Biophys Acta（1979）557:9-23、Szoka ，Fら、Proc Natl Acad Sci USA（1978）75:4194-4198、Mayhew，E.ら、 （1984）775:169175、Kim，S.ら、Biochim Biophys Acta（1983）728:339:348 、およびMayerら、Biochim Biophys Acta(1986)858:161-168に開示されるが、こ れらに制限されない。 リポソームは、任意の従来の合成もしくは天然の、リン脂質のリポソーム物質 （卵、植物、もしくは動物供給源のような天然供給源由来のリン脂質（例えば、 ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリ セロール、スフィンゴミエリン、ホスファチジルセリン、およびホスファチジル イノシトールを含む）を組み合わせて本化合物から作製され得る。使用され得る 合成リン脂質はまた、以下を含むが、これらに制限されない：ジミリストイルホ スファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホス ファチジルコリン、およびジステアロイルホスファチジルコリン、ならびに対応 する合成ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルグリセロール。 コレステロールまたは他のステロール（コレステロールヘミスクシネート、グリ コリピッド、セレブロシド、脂肪酸、ガングリオシド、スフィンゴリピッド、1, 2-ビス（オレオイロキシ）-3-（トリメチルアンモニオ）プロパン(DOTAP)、Ｎ-[ 1-(2,3-ジオレオイル)プロピル-Ｎ,Ｎ,Ｎ,-トリメチルアンモニウムクロライド( DOTMA)）、および他のカチオン性脂質が当該業者に公知のようにリポソームに組 み込まれ得る。リポソームに使用されたリン脂質および添加剤の相対量は、所望 された場合、変化し得る。好ましい範囲は約60〜90mol％のリン脂質：コレステ ロール、コレステロールヘミスクシネート、脂肪酸、もしくはカチオン性脂質は ０〜50mol％の範囲で使用され得る。リポソームの脂質層に組み込まれる本化合 物の量は、脂質の濃度で約0.01〜約50mol％の範囲で変化し得る。 従来の方法を用いて、溶液中に存在する約20〜30％の本化合物をリポソームに トラップし得る：したがって、約70〜80％の活性な化合物が浪費される。対象的 に、化合物がリポソーム中に組み込まれた場合、事実上全ての化合物がリポソー ムに組み込まれ、そして、本質的に、活性な化合物は全く浪費されない。 上記処方物を有するリポソームは、モノクローナル抗体の組み込みを用いるそ れらの意図された標的または、他の標的に特異的なリガンドにより一層特異的に 作製され得る。例えば、BMPレセプターに対するモノクローナル抗体は、Leserma n，L.ら(Nature（1980）288:602-604)の方法によってリポソームに組み込まれた 、ホスファチジルエタノールアミン(PE)との結合によって、リポソームに組み込 まれ得る。 開示された化合物の獣医学的使用もまた意図される。これらの使用は、家畜、 牧畜、および純血種の馬における、骨もしくは軟骨の欠損もしくは欠乏の制限も しくは処置を含む。本明細書に記載される化合物はまた、骨形成細胞をそのよう な細胞を必要とする環境へ引きつけるために、標的組織、もしくは器官の環境を 改変し得る。 本発明の化合物はまた、インビトロまたはエクスビボのいずれかにおいて、骨 形成細胞もしくはその前駆体の増殖を刺激するために、または骨形成細胞の前駆 細胞の分化を誘導するために使用され得る。本明細書中で使用される、用語「前 駆細胞」は、分化経路に拘束されるが、成熟し、完全に分化した細胞としてのマ ーカーまたは機能を一般に発現しない細胞をいう。本明細書中に使用される、用 語「間葉細胞」、もしくは「間葉幹細胞」は、何回も分割し得る多能性先祖細胞 で、それらの子孫は骨格組織（軟骨、骨、腱、靱帯、骨髄基質および結合組織を 含む（A．Caplan J．Orthop．Res．(1991)9:641-50)を参照のこと））を生じる 。本明細書中に使用される、用語「骨形成原細胞」は、骨形成原細胞および骨芽 前駆細胞を含む。より詳細には、開示された化合物は、骨髄間葉細胞を含む細胞 群を刺激し、それによってその細胞群内の骨形成原細胞数を増加させるのに有用 である。好ましい方法において、造血細胞は、開示された化合物による刺激の前 、もしくは後のいずれかに、細胞群から除去される。これらの方法の実施を通し て、骨形成原細胞は膨張し得る。膨張した骨形成原細胞は、これらを必要とする 脊椎動物被験体に注入（もしくは再注入）され得る。例えば、被験体自体の間葉 幹細胞が本発明の化合物にエクスビボで曝され得、さらに、結果として生じた骨 形成原細胞は、被験体内の所望される部位に注入されるか、または直接指向され 得、この場合さらなる骨形成原細胞の増殖および／または分化が免疫拒絶反応な しに起こり得る。あるいは、開示された化合物に曝された細胞群は、不死化ヒト 胎児骨形成原細胞または骨形成細胞であり得る。このような細胞が、脊椎動物被 験体に注入または移植された場合、移植および骨、または軟骨修復を増強するた めに、これらの非自己細胞の「免疫保護」、もしくは、レシピエントの免疫抑制 （好ましくは局所的に）に有益であり得る。 本発明において、組成物の「有効量」は統計的に有意な効果を生じる量である 。例えば、治療的使用における「有効量」は、本明細書中の活性な化合物を含む 組成物の、以下の骨折の治療率の臨床的に有意な増加を提供するために必要な量 である；骨粗鬆症における骨損失の逆転；軟骨欠損または障害の逆転；骨粗鬆症 の予防または発病の遅延；非結合骨折および伸延(distraction)骨形成における 骨形成の刺激および／または増強；補てつデバイスによる骨成長の増加および／ または加速；および歯科欠損の修復。これらの有効量は、慣例の視覚化技術を用 いて決定され、そして処置される特定の症状、患者の症状、投与の経路、処方、 および実施者の判断、および当業者には明らかな他の因子に依存する。本発明の 化合物の必要とされる投薬量（例えば、骨形成の増加が所望される骨粗鬆症にお いて）は、処置群とコントロール群との間での、骨量における統計的に有意な差 異 として明示される。この骨量における差異は、例えば、処置群における骨量の５ 〜20％以上の増加として見なされ得る。治療における臨床的に有意な増加の他の 測定には、例えば、破壊強度および張力、破壊強度およびねじり力、４点屈曲(4 -point bending)、骨生検における結合能(connectivity)の増加、および他の、 当業者に周知の生体力学的試験についての試験を含み得る。処置生活規則への一 般的な指導は、目的の疾患の動物モデルにおいて実施された実験から得られる。 本発明の化合物の投薬量は、処置が必要な範囲および重篤さ、投与される化合 物の活性、被験体の一般的健常度、および当業者に周知の他の考慮に応じて変化 する。一般に、これらは代表的なヒトに、毎日約0.1mg/kg〜1000mg/kg、および より好ましくは、約1mg/kg〜200mg/kgの経口投与を基本として毎日投与され得る 。非経口用量は、適切には経口投与の約20〜100％である。 スクリーニングアッセイ 本発明の方法に用いられた化合物の骨形成活性は、インビトロスクリーニング 技術（例えば、上記の、骨形態発生タンパク質結合プロモーターに連結された、 リポーター遺伝子転写物の評価）、または以下のような代替アッセイを用いて、 証明され得る： 新生マウス頭蓋冠アッセイ技術（インビトロ） このアッセイはGowen M．＆ Mundy G．J．Immunol（1986）136:2478-82によっ て記載されたものに類似する。簡潔に述べれば、生後４日のICRスイスホワイト マウス(Swiss white mouse)の子の前頭骨および頭頂骨をマイクロディセクショ ン(microdessection)によって除去し、矢状縫合に沿って分割した。骨をBGJb培 地(Irvine Scientific，Santa Ana，CA)＋0.02％（または低濃度）のβ-メチル シクロデキストリン（ここで培地はまた、検査物質またはコントロール物質を含 む）中で、５％のCO₂および95％の加湿された空気中で37℃で96時間インキュベ ートした。 これに続き、骨をインキュベーション培地から取り出し、そして10％緩衝化ホ ルマリンで24〜48時間固定し、14％のEDTAで１週間脱石灰化し、等級アルコール によって処理した；さらにパラフィンワックス中に包埋した。３μｍの頭蓋冠の 切片を調製した。代表的な切片を、骨形成と骨吸収の組織形態的評価のために選 択した。骨の変化を、200μｍに切断された切片において測定した。骨形成原細 胞および破骨細胞を、それらの特徴的形態によって同定した。 他の補足のアッセイを、試験化合物の非BMPプロモーター媒介効果を決定する ためのコントロールとして用い得る。例えば、マイトジェニック活性は、血清応 答性エレメント(SRE)をプロモーターとし、およびルシフェラーゼレポーター遺 伝子を特徴とするスクリーニングアッセイを用いて測定され得る。より詳細には 、これらのスクリーニングアッセイは、SRE媒介の経路（例えば、プロテインキ ナーゼＣ経路）を通したシグナルを検出し得る。例えば、骨形成原細胞のアクテ ィベーターに対するSRE-ルシフェラーゼスクリーニング、および疑似インスリン SRE-ルシフェラーゼスクリーニングはこの目的に有用である。同様に、cAMP応答 エレメント(CRE)媒介経路の試験化合物による刺激もまた、アッセイされ得る。 例えば、PTHおよびカルシトニン（２つの骨活性因子）に対するレセプターでト ランスフェクトした細胞は、上昇したcAMPレベルを検出するために、CRE-ルシフ ェラーゼスクリーニングに用い得る。従って、試験化合物のBMPプロモーター特 異性は、これらの補足アッセイの型の使用により検査され得る。 マウス頭蓋冠骨増殖に対する化合物の効果のインビボアッセイ 生後４〜６週間目で、体重13〜26gmの雄のICRスイスホワイトマウスを、各群 あたり４〜５匹使用する。頭蓋冠骨増殖アッセイをPCT出願WO 95/24211（参考と して援用される）に記載されたように行う。簡潔に述べれば、試験化合物または 適切なコントロールビヒクルを、正常マウスの右頭蓋冠を通して皮下組織に注入 する。代表的には、コントロールビヒクルは、化合物を可溶化したビヒクルであ り、および５％DMSOを含むPBSであるかまたはTween（２μｌ/10ml）を含むPBSで あるビヒクルである。動物を14日目に屠殺し、そして骨増殖を組織体型測定(his tomorphometry)によって測定する。検量のための骨サンプルを付着組織から浄化 し、10％緩衝化ホルマリンで24〜48時間固定し、14％EDTAで１〜３週間脱石灰化 し、等級アルコールによって処理する；さらにパラフィンワックス中に包埋する 。３〜５μｍの頭蓋冠切片を調製し、典型的な切片を、骨形成と骨吸収における 効 果の組織形態的評価のために選択する。切片を、デジタル化プレート上に顕微鏡 像を直接トレースするために、ルシーダ(lucida)を装着したカメラを用いて測定 する。骨の変化を、頭蓋冠の注入した側および注入しなかった側の両方における ４つの隣接する１×１mmの部分の、200μｍの間隔で切断した切片を測定する。 新しい骨を、その特徴的な波状構造によって同定し、そして破骨細胞および骨形 成原細胞を、それら特有の形態を用いて同定した。組織形態計測ソフトウェア(O steoMeasure，Osteometrix，Inc.，Atlanta)を用いて細胞数、および測定範囲、 または周辺長の決定のためのデジタルインプット処理する。 さらなるインビボアッセイ 主要(lead)化合物をインビボの投与量アッセイを用いて、インタクトの動物に おいてさらに試験され得る。基本型投与量は、皮下、腹膜内、もしくは経口投与 によって達成され得、そして注射、保持された放出もしくは他の送達技術によっ て行われ得る。試験化合物の投与期間は変化し得る（例えば、28日間ならびに35 日間が適切であり得る）。例示的に、インビボ皮下投与量アッセイは以下のよう に実施され得る： 代表的な研究において、70匹の３カ月齢の雌のスプラーグ-ドーリー(Sprague- Dawley)ラットの体重を合わせ、そして各群において10匹で７つの群に分割する 。これは、研究の開始において屠殺される動物のベースラインのコントロール群 ；ビヒクルのみを投与されるコントロール群；PBSで処置されたコントロール群 ；および、骨増殖を促進するとして知られている化合物（タンパク質もしくは非 タンパク質）を投与されるポジティブコントロール群を含む。試験されるべき化 合物の３つの投与量レベルを、残りの３群に投与する。 簡潔に述べれば、試験化合物、ポジティブコントロール化合物、PBS、または ビヒクルのみを皮下に１日１回、35日間投与する。すべての動物にカルセイン(c alcein)を９日間、および屠殺の前の２日間注射する（カルセインの２回の注射 を、各指定の日に投与した）。体重を週ごとに測定する。35日周期の最後に、動 物を体重測定し、さらに眼窩、または心臓穿刺を用いて出血させた。血清カルシ ウム、リン酸塩、オステオカルシン、およびCBCを決定した。両方の脚骨（大腿 骨および脛骨）および腰椎を取り出し、柔らかい付着組織を浄化し、評価（周縁 定量コンピューター断層撮影法（pQCT;Ferretti,J．Bone（1995）17:353S-64S） 、デュアルエナジーＸ線吸収率測定法（DEXA;Lavel-Jeantet A.ら、Calcif Tiss ue Intl（1995）56:14−18；J．Casezら、Bone and Mineral（1994）26:61-68） および／または組織体型測定などによって行う）のために70％エタノールに貯蔵 する。従って、骨のリモデリングにおける試験化合物の効果を評価し得る。 主要化合物はまた、急性卵巣摘出した動物（予防モデル）において、インビボ 投与量アッセイを用いて試験され得る。このようなアッセイはまた、コントロー ルとしてエストロゲン処置の群を含み得る。例示的な皮下投与量アッセイは下記 のように実施される： 代表的研究において、80匹の３カ月齢の雌スプラーグ-ドーリーラットの体重 を合わせ、さらに各群において10匹で８つの群に分割する。これは、研究の開始 において屠殺される動物ベースラインのコントロール群；３つのコントロール群 （シャム（sham）卵巣摘出した（シャムOVX）＋ビヒクルのみ；卵巣摘出（OVX） ＋ビヒクルのみ；PBS処置OVX）；および骨増殖を促進する化合物を投与されたコ ントロールOVX群含む。試験されるべき化合物の３つの投与量レベルを、残りの ３群のOVX動物に投与する。 卵巣摘出（OVX）は摂食亢進症を誘導するため、全てのOVX動物をシャムOVX動 物と共に、35日間の研究にわたり対摂食(pair-feed)した。簡潔に述べれば、試 験化合物、ポジティブコントロール化合物、PBS、またはビヒクルのみを、１日 １回35日間皮下投与した。あるいは、試験化合物を35日間にわたり移植される、 移植可能なペレットとして処方され得るか、または経口投与（例えば、胃管栄養 法(gastric gavage)により）され得る。シャムOVX／ビヒクル、およびOVX／ビヒ クル群を含む全ての動物に、カルセインを屠殺の前の９日間および２日間腹膜内 注射する（新しく形成された骨の適切な標識を確実にするために、カルセインの ２回の注射を各指定日に投与した）。１週間毎に体重を測定する。35日周期の最 後に、動物の血液および組織を上記のように処理した。 主要化合物は慢性OVX動物（処置モデル）においても試験され得る。同化剤の 効率の評価に使用され得る卵巣摘出された動物において確立された骨損失の処置 のための例示的プロトコールは、以下のように実施され得る。簡潔に述べれば、 80〜100匹の６カ月齢の雌スプラーグ-ドーリーラットを、０時間においてシャム 手術（シャムOVX）または卵巣摘出（OVX）に供し、そして10匹のラットをベース ラインのコントロールとして供するために屠殺する。実験の間、１週間毎に体重 を記録する。ほぼ６週間（42日間）の骨枯渇(bone depletion)の後、枯渇期間の コントロールとしての屠殺のために10匹のシャムOVX、および10匹のOVXラットを ランダムに選択する。残りの動物の、10匹のシャムOVX、および10匹のOVXラット をプラシーボ処置コントロールとして使用する。残りのOVX動物を試験薬物の３ 〜５の投与量で５週間（35日間）処置した。ポジティブコントロールとして、OV Xラットの１群を、PTH（このモデルにおいて公知の同化剤）のような薬剤で処置 され得る(Kimmelら、Endocrinology（1993）132:1577-84)。骨形成における効果 を決定するために、以下の手順に従い得る。大腿骨、脛骨、および第１〜４腰椎 を切除し、そして回集する。隣接する左および右脛骨をpQCT測定、海綿質鉱物密 （BMD）(重量測定)、および組織学に使用し、一方、各脛骨の中央骨幹を皮質のB MDまたは組織学に供する。大腿骨は、生体力学的検査の前に、中央骨幹をpQCTス キャンするために調製した。腰椎（LV）については、LV2は、BMD（pQCTもまた実 施され得る）を行う；LV3は脱石灰化していない骨の組織学のために調製する； そしてLV4は力学的試験のために処理される。本発明で有用な化合物の性質 本発明の化合物のすべては、リンカーによって1.5Å−15Åの距離で間隔を置 いて離れた２つの芳香族系Ａｒ¹およびＡｒ²を含み、そして、少なくとも１個の 窒素原子を含み得る。Ａｒ¹およびＡｒ²によって表される両方の系は、非干渉置 換基(non-interfering substituent)を含み得る。Ａｒ¹によって表される芳香族 系上の非干渉置換基およびＡｒ²によって表される芳香族系上の非干渉置換基は 、ここではそれぞれＲ^aおよびＲ^bによって本明細書の式中で表される。（しかし ながら、一方のＡｒをＡｒ¹として命名し、そして他方のＡｒをＡｒ²として命名 することは、任意であることが理解される。）参考を容易にするために、各々は 、別々に命名される。（しかしながら、下記に記述されるリンカーは、回文構造 (palindromic)でない限り、「逆の」原子の順序で化合物中にこのように存在で きることは明白である。）一般的に、非干渉置換基は、広い種類のものであり得 る。処置される被検体の骨上で本発明の化合物の有利な効果を干渉しない置換基 の中には、アルキル（１−６Ｃ、好ましくは低級アルキル１−４Ｃ）（それらの 直鎖または分枝鎖形を含む）、アルケニル（１−６Ｃ、好ましくは１−４Ｃ）、 アルキニル（１−６Ｃ、好ましくは１−４Ｃ）が含まれ、それらのすべては、直 鎖または分枝鎖であり得、そしてさらなる置換基（ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、 およびＩを含む）、シロキシ、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ₂、ＯＯＣＲ、ＣＯＯＲ、ＮＣ ＯＲ、ＮＣＯＯＲ、およびベンゾイル、ＣＦ₃、ＯＣＦ₃、ＳＣＦ₃、Ｎ（ＣＦ₃）₂ 、ＣＮ、ＳＯ、ＳＯ₂Ｒ、およびＳＯ₃Ｒ（ここでＲはアルキル（１−６Ｃ）ま たはＨである）を含み得る。２個のＲ^aまたは２個のＲ^b置換基が、芳香族系中で 隣接する位置にある場合は、それらは環を形成し得る。さらに、この可能性を供 するに十分な炭素原子およびヘテロ原子を含む置換基中に環が含まれ得る。 好ましい非干渉置換基には、１−６Ｃのヒドロカルビル基（飽和および不飽和 の直線状または分枝状ヒドロカルビルならびに環系を含むヒドロカルビル基を含 む）、ハロ基、アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、モノアルキル、およびジアル キルアミノ（ここで、アルキル基には、１−６Ｃ、ＣＮ、ＣＦ₃、およびＣＯＯ Ｒである）が挙げられる。 Ｒ^aおよびＲ^b置換基の数は、芳香族系中での利用可能な位置に依存して、典型 的には０−４または０−５であり得、好ましい実施態様には、Ｒ^aの数が、０、 １、または２であり、かつＲ^bの数が、０、１、または２である場合が挙げられ る。 リンカー基Ｌは、共有結合または少なくとも２個の原子価を有し、かつ約1.5 Å〜約15Åの直線距離を包含する任意の基であり得る（この空間的要求を満足さ せる環状部分を有するものを含む）。有用なリンカーは、本明細書中の定義では 、三つの一般的なカテゴリー：（１）フレキシブルな非共役リンカー、（２）フ レキシブルな共役リンカー、および（３）束縛された（constrained）リンカー に分けられる。好ましいリンカーの選択は、Ａｒ¹およびＡｒ²の選択に依存する 。下記で定義されるリンカーのすべてが、すべてのＡｒ¹およびＡｒ²の組み合せ に適しているとは限らない。 本明細書中で定義されるように、フレキシブルな非共役リンカーは、Ａｒ¹の 一つの位置のみをＡｒ²の一つの位置につなぐものであり、そして一つの共有結 合またはＡｒ¹とＡｒ²との間の単鎖のみを与える。鎖は、分枝を含み得るが、鎖 中にπ結合（分枝中を除いて）または環状部を含み得ない。連鎖中のリンカー原 子はそれ自身、共有単結合の回りを自由に回転するので、リンカーは、２より大 きい自由度を有する。共役結合の他に、特に有用なフレキシブルな非共役のリン カーは、式：−ＮＲ−、−ＣＲ₂−、−Ｓ−、または−Ｏ−のものである。ここ でＲは、Ｈまたはアルキル（１−６Ｃ）であり、さらに好ましくはＨまたは低級 アルキル（１−４Ｃ）であり、そしてより好ましくはＨである。同様に好ましい のは、式：−ＮＲＣＯ−、−ＣＯＮＲ−、−ＣＲ₂Ｓ−、−ＳＣＲ₂−、−ＯＣＲ₂ −、−ＣＲ₂Ｏ−、−ＮＲＮＲ−、−ＣＲ₂ＣＲ₂−、−ＮＲＳＯ₂−、−ＳＯ₂Ｎ Ｒ−、−ＣＲ₂ＣＯ−、−ＣＯＣＲ₂−、および−ＮＲ−ＮＲ−ＣＯ−ＣＲ₂−な らびにその相補体−ＣＲ₂−ＣＯ−ＮＲ−ＮＲ−である（その等配置体を含む） 。同様に好ましいのは、式：−ＮＲ（ＣＲ₂）₂ＮＲ−、−Ｏ（ＣＲ₂）₂Ｏ−、お よび−Ｓ（ＣＲ₂）₂Ｓ−のものである（その等配置体を含む）。この基の中のリ ンカーの最適な選択は、Ａｒ¹およびＡｒ²の性質に依存する。 フレキシブルな共役リンカーは、Ａｒ¹の一つの位置のみをＡｒ²の一つの位 置につなぐものであるが、少なくとも一つの二重結合または三重結合および／ま たは一つ以上の環系を組み入れるので、２だけの自由度を有する。フレキシブル な共役リンカーは、Ａｒ¹とＡｒ²との間に完全に共役したπ結合リンク系を形成 し得るので、Ａｒ¹とＡｒ²との共面性が提供される。有用なフレキシブルな共役 リンカーの例には、−ＲＣ＝ＣＲ−、−Ｎ＝Ｎ−、−Ｃ≡Ｃ−、−ＲＣ＝Ｎ−、 −Ｎ＝ＣＲ−、−ＮＲ−Ｎ＝ＣＲ−、−ＮＲ−ＮＲ−ＣＯ−ＣＲ＝ＣＲ−、など が挙げられ、ここでＲは、Ｈまたはアルキル（１−６Ｃ）であり、好ましくはＨ または低級アルキル（１−４Ｃ）であり、そしてより好ましくはＨである。 束縛されたリンカーは、Ａｒ¹とＡｒ²のいずれかまたは両方への１より多い付 加の箇所を有するものであるので、一般に、１のみの自由度を有する。束縛され たリンカーは、Ａｒ¹および／またはＡｒ²を有する融合５員環部分または６員環 部分を最も頻繁に形成する。ここでＡｒ¹またはＡｒ²のいずれかは、リンカーと 第２の共有結合を形成するべく適切に位置を決められた少なくとも一つの置換基 を有する（例えば、ここでＡｒ²は、反応性のオルト位の置換基を有するフェニ ル基であるか、またはオルト位で直接リンカーに誘導体化される）。（このよう な場合、芳香族部分は、適切にはフェニレンまたはナフチレンと呼ばれるべきで あるが、一般に用語「フェニル」または「ナフチル」が、これらの部分の１価と ２価の形態の両方を含むべく本明細書中で使用される。）特に有用な束縛された リンカーの例には、などが挙げられ、ここでＸは、Ｏ、Ｎ、Ｓ、またはＣＲであり、そしてＹは、Ｃ Ｒ₂またはＣ＝Ｏである。 本発明において有用な化合物の多くは、市販で入手可能であり、そして公知の 技術方法によって合成され得る。新しい化合物である、本発明において有用なこ れらの化合物は、当該分野で一般に公知である方法によって同様に得ることがで きる。 本発明の化合物の一組において、Ａｒ¹は、６員ヘテロ環を含む置換または非 置換の芳香族系であり、そして本発明において有用な化合物は、以下の式： を有し、 ここで、Ｒ^aは、非干渉置換基であり； ｍは、０〜４の整数であり； 各々の点線は、任意のπ−結合を表し； 各々のＺは、独立してＮ、ＮＲ、Ｏ、Ｓ、ＣＲ、またはＣＲ₂であり、 ここで、各々のＲは、独立してＨまたはアルキル（１−６Ｃ）であり； Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、またはＳＯ₂であり； Ｌは、フレキシブルなリンカーであり；そして Ａｒ²は、置換または非置換の６員芳香族環である。 実施態様の特に好ましい組は、以下の式： のものであり、 ここで、 Ｒ¹は、群：Ｎ＝ＮＡｒ、ＮＲ⁶ＣＯＡｒ、ＣＯＮＲ⁶Ａｒ、ＣＨ₂ＯＡｒ、ＣＨ₂ ＮＲ⁶Ａｒから選択され、ここで、Ａｒは、６員の（非）置換の芳香族環である 。この芳香族環上の可能な置換基には： ハロゲン、直鎖または分枝鎖の低級アルキル、アルケニル、またはアルキニル （６員の芳香族系、環状アルキル、または環状アルケニル環によって任意に置換 される）、ヒドロキシル、シロキシ、アシロキシ、直鎖または分枝鎖の低級アル コキシル、ベンゾイル、カルボアルコキシ、低級鎖アルキルまたはフェニルによ って窒素において任意に置換されたカルバモイル、またはカルボキシが挙げられ 、ここで、 Ｒ⁶は、群：水素、あるいは直鎖または分枝鎖の低級アルキルから選択され、 Ｒ²およびＲ⁵は、独立して、群：Ｈ、ヒドロキシ、シロキシ、アシロキシ、ハ ロ、シアノ、直鎖または分枝鎖の低級アルキル、あるいは直鎖または分枝鎖の低 級アルコキシルから選択され、 Ｒ³およびＲ⁴は、独立して、群：Ｈ、ハロゲン、直鎖または分枝鎖の低級アル キル、アルケニル、またはアルキニル（６員の芳香族系、環状アルキル、または 環状アルケニル環によって任意に置換される）、ヒドロキシル、シロキシ、アシ ロキシ、直鎖または分枝鎖の低級アルコキシル、ベンゾイル、カルボアルコキシ 、低級鎖アルキルまたはフェニルによって窒素で任意に置換されるカルバモイル 、およびカルボキシから選択され； ＸおよびＹはいずれも：それぞれＮＲ⁸およびＮであり、（この場合Ｘおよび Ｙは単結合している）、またはそれぞれＣＲ⁹およびＣＲ¹⁰であり（この場合Ｘ およびＹは二重結合している）、ここで Ｒ⁸は、Ｈまたは低級アルキルのいずれかであり、 Ｒ⁹およびＲ¹⁰は、独立して、群：Ｈ、ハロ、および低級アルキルから選択さ れ、 Ｚは、群：Ｏ、Ｓ、ＳＯ、およびＳＯ₂、またはその塩から選択される。 上記の一般構造Ｉの化合物は、多様な方法で調製され得、例えば： ａ）一般構造IIのチオヒドラジド、または対応するチオヒドラゾンを、大気中 で熱酢酸中で処理する工程、 ｂ）一般構造IIIの化合物を臭素と反応させる工程、 ｃ）一般構造IVの化合物をプロトン性溶媒中で加熱する工程、 ｄ）一般構造ＶまたはVIの化合物を水素化ナトリウムと反応させる工程、 ｅ）一般構造VIIの化合物を塩基と反応させる工程、 ｆ）一般構造VIIIのピリリウム化合物を適切な求核試薬と反応させる工程、 ここで、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵は、上記で定義されたようなものであり、そして Ｒは群：Ａｒ、ＮＨＡｒ、ＮＨＮＨＡｒ、ＣＯＡｒ、カルボアルコキシ、アルコ キシ、ＮＲ⁶ＣＯＡｒ、ＣＨ₂ＯＡｒ、およびＣＨ₂ＮＲ⁶Ａｒから選択され、ここ でＡｒおよびＲ⁶は上記で記述された通りであり、必要に応じて、次に、脱保護 、カップリング、付加、置換、または脱離によって、または硫黄のスルホキシド またはスルホンへの酸化によって任意の１つ以上の基Ｒ、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵を 新しい基Ｒ、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵に転化し；そして、所望ならば、一般式Ｉの化 合物をその塩へ転化するかまたはそれをその塩から遊離させる。 実施例： ジフェニルチオヒドラゾンを、空気中、還流酢酸中で30分〜90分間加熱し、ベ ンゾチアジアゼン１を得る。 一般構造Ｉの化合物の特定の代表例には、 ３−フェニルアゾ−１Ｈ−４，１，２−ベンゾチアジジン ２−フェニルアゾ−２Ｈ−ベンゾピランが挙げられる。 本発明の方法において使用に適切な化合物の別の群は、以下の式の化合物： であり、 ここで、Ｒ^aは、非干渉置換基であり； ｎは、０〜５の整数であり； Ｌは、窒素を含まないフレキシブルなリンカーであり；そして Ａｒ²は、置換または非置換のフェニルあるいは置換または非置換のナフチル である。 特に好ましいこの化合物の群の実施態様は、以下の式： のものであり、 ここで、 Ｒ³⁵は、群：Ｈ、ヒドロキシ、アルコキシル、アシロキシ、およびシリロキシ から選択され、 Ｒ³⁶は、ＡｒまたはＣＯＡｒのいずれかであり、ここで、Ａｒは、（非）置換 フェニル（ここで可能な置換基は、群：Ｈ、ヒドロキシ、（非）置換アルコキシ 、アシロキシ、シロキシ、（非）置換アルキル、（非）置換アルケニル、または （非）置換アルキニルである）、カルボキシ、カルボアルコキシ、低級鎖アルキ ルにより窒素において任意に置換されたカルバモイルおよびアリールから選択さ れ； Ｒ³⁷は、群：Ｈ、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロ、アシロキシ、およびシロキ シルから選ばれ； Ｒ³⁸は、群：Ｈ、ヒドロキシ、アルコキシ、アシロキシ、シロキシ、（非）置 換アルコキシ、アシロキシ、シロキシ、（非）置換アルキル、（非）置換アルケ ニル、および（非）置換アルキニル、またはその塩類から選択される。 一般構造ＸＸＸＶの化合物は、塩基性または酸性のいずれかの条件下で、一般 構造ＸＸＸVIのアセトフェノンを一般構造ＸＸＸVIIの適切なアルデヒドで処理 する工程によって、 あるいは、三塩化アルミニウムのような適切な触媒の存在下で、一般構造ＸＸ ＸVIIIの適切なアルキンを一般構造ＸＸＸIXの酸ハロゲン化物で処理する工程に よって、 あるいは、適切な触媒（例えば、パラジウム触媒）の存在下で、一般構造ＸＸ ＸIXの酸塩化物を、（Ｅ）−１，２−ビス（トリ−ｎ−ブチルスタニル(butyl s tanyl)）エチレンを用いて、または一般構造ＸＬのビニルスタナン(vinyl stana ne)を用いて処理する工程によって、 あるいは、一般構造ＸＬＩのアセトフェノンを、強塩基で処理する工程によっ て調製され得、 ここで、Ｒ³⁵、Ｒ³⁶、Ｒ³⁷、Ｒ³⁸は、上記で定義されたものであり、必要に 応じて、次に、脱保護、カップリング、付加、置換、または脱離によって、任意 の１つ以上の基Ｒ³⁵、Ｒ³⁶、Ｒ³⁷、Ｒ³⁷、およびＲ³⁸を、新しい基Ｒ³⁵、Ｒ³⁶、 Ｒ³⁷、およびＲ³⁸へ転化しそして所望ならば、一般構造ＸＸＸＶの化合物をその 塩へ変換するかまたはそれをその塩から遊離させる。 一般構造ＸＸＸＶの特定の代表的な化合物には、 ２，４−ジメトキシ−２’−ヒドロキシカルコン １−（２−ヒドロキシフェニル）−３−（４−メトキシフェニル）プロパン− １，３−ジオン １，４−ジオキソ−１，４−ジフェニルブト−２−エン が挙げられる。 本発明において有用な化合物のさらに別の群は、以下の式： のものであり、 ここで、Ｒ^aは、非干渉置換基であり； ｎは、０および５の整数であり； Ｌは、束縛されたリンカーであり；そして Ａｒ²は、置換または非置換のフェニルあるいは置換または非置換のナフチル である。 この群において特に好ましい化合物は、下記のような式IX、ＸIV、およびＸＸ のものであり： ここで： Ｒ¹¹およびＲ¹²は、独立して、群： Ｈ、ヒドロキシ、Ｃ_1-6アルコキシ、アセチルオキシ、およびＣ_1-12（非） 置換アルキルから選択され、 Ｒ¹³、Ｒ¹⁴、およびＲ¹⁷は、独立して、群： Ｈ、ヒドロキシ、Ｃ_1-6直鎖または分枝鎖アルコキシ、およびアセチルオキ シから選択され、 Ｒ¹⁵は、群：ヒドロキシ、（非）置換Ｃ_1-12アルコキシ、Ｃ_1-12アルキル、（ 非）置換アルケニル、およびアセチルオキシから選択され、 Ｒ¹⁶は、群：Ｈ、ヒドロキシ、（非）置換低級アルコキシ、アセトキシ、（非 ）置換アルキル、および（非）置換アルケニルから選択され； ここで、Ｒ¹¹、Ｒ¹²は、５員〜７員（非）置換炭素環またはヘテロ環を形成し 得； ここで、Ｒ¹⁵、Ｒ¹⁶は、５員〜７員（非）置換炭素環式またはヘテロ環式環を 形成し得； Ｘ¹は、カルボニルまたはＣＨ₂のいずれかであり； そして点線は、二重結合であり得、 ここで、上記で記述された置換基の群の可能な置換基には、低級アルキル、低 級アルコキシル、ヒドロキシ、シロキシ、ハロ、カルボキシル、およびアリール 、またはその塩類が挙げられるが、ただし、以下の条件を有する： Ｘ¹がカルボニルであり、かつ Ｒ¹⁵がヒドロキシであり、かつ、もしＲ¹¹、Ｒ¹²、またはＲ¹³の１つのみがヒ ドロキシである場合、Ｒ¹⁴、Ｒ¹⁶、およびＲ¹⁷の少なくとも１つは、Ｈ以外でな ければならず、 あるいは、Ｒ¹⁵がアルコキシであり、かつ、Ｒ¹¹、Ｒ¹²、Ｒ¹³が共にＨである 場合、Ｒ¹⁷は、Ｈでもヒドロキシでもあり得ず、 あるいは、Ｒ¹⁵が（非）置換アルコキシであり、かつ、Ｒ¹¹、Ｒ¹²、およびＲ¹³ が共にＨのみ、またはＨと１または２のアルコキシとからなり、かつＲ¹⁷ がＨである場合、Ｒ¹⁴は、Ｈ、Ｍｅ、またはヒドロキシメチル以外でなければな らず； あるいは、Ｒ¹⁵が、ヒドロキシまたはアルコキシであり、かつ、Ｒ¹¹、Ｒ¹²、 Ｒ¹³が共にＨのみ、またはＨと１または２のアルコキシとからなるか、もしくは Ｈと１または２のみのアルキルからなり、かつＲ¹⁷がＣ_1-4アルキルである場合 、Ｒ¹⁴およびＲ¹⁶の少なくとも１つは、Ｈ以外でなければならず； あるいは、Ｒ¹⁵が、ヒドロキシであり、かつＲ¹¹、Ｒ¹²、Ｒ¹³、Ｒ¹⁴、および Ｒ¹⁶のすべてがＨである場合、Ｒ¹⁷は、Ｈでもヒドロキシでもないべきであり、 あるいは、Ｒ¹⁵が、イソプロポキシであり、かつＲ¹¹、Ｒ¹²、およびＲ¹³が共 に、ＨのみもしくはＨと１または２のヒドロキシとからなる場合、Ｒ¹⁴、Ｒ¹⁶、 Ｒ¹⁷の少なくとも１つは、Ｈ以外でなければならず； あるいは、Ｒ¹⁵が、１，５ジ（低級）アルキルＣ_5-10アルキルである場合、Ｒ¹¹ 、Ｒ¹²、Ｒ¹³、Ｒ¹⁴、Ｒ¹⁶、およびＲ¹⁷の少なくとも１つは、Ｈ以外でなけれ ばならない。 上記で示された一般構造の化合物は、下記で示された構造（Ｘ）のケトン：を、塩基の存在下でアルキルオルトホルメートと反応させる方法、または、ピリ ジンの存在下で、エチルオキサリルクロライドと反応させ、続いて加水 分解お よび脱カルボキシル化する方法、または、 アルカリ金属の存在下で、アルキルホルメートと反応させる方法、または、 オキシ塩化リンの存在下で、Ｎ，Ｎ−ジアルキルホルムアミドと反応させる方 法、または、 ハロゲン化水素の存在下で、シアニドと反応させる方法により、 あるいは、以下の一般構造（ＸＩ）の２−ヒドロキシイソフラバノイドを脱水 する工程により： または以下の一般構造ＸIIの化合物を、触媒水素化に供する工程により： または対応するフェニルアセテートを適切なハロゲン化ベンジルを用いてアル キル化し、続いて（ＰＦ₆）₂Ｒｈ（ＥｔＣ₅Ｍｅ₄）（Ｃ₆Ｈ₆）を用いて還元する ことにより得られる、一般構造ＸIIIの化合物：を処理する工程によって作製され得、 ここで、基Ｒ¹¹、Ｒ¹²、Ｒ¹³、Ｒ¹⁴、Ｒ¹⁵、Ｒ¹⁶、およびＲ¹⁷は、上記で定義 した通りであり、続いて、必要に応じて、脱保護、脱水素、付加、置換、または 脱離によって、任意の１つ以上の基Ｒ¹¹、Ｒ¹²、Ｒ¹³、Ｒ¹⁴、Ｒ¹⁵、Ｒ¹⁶、およ びＲ¹⁷を新しい基Ｒ¹¹、Ｒ¹²、Ｒ¹³、Ｒ¹⁴、Ｒ¹⁵、Ｒ¹⁶、およびＲ¹⁷へ変換し、 そして、所望であれば、一般構造ＩＸの化合物をその塩に変換するかまたはそれ をその塩から遊離させる。実施例 １，３，５−トリヒドロキシベンゼンを、イソペンチニルクロライドと反応さ せ、次に、触媒的水素化により、生成物２を得る。化合物２を、酸塩化物３と反 応させて、ケトン４を得る。ケトン４を、０℃においてピリジン中でエチルオキ サリルクロライドを用いて処理し、エステル（これは炭酸ナトリウムを含む水性 アセトン中で加水分解されて酸５を生じる）を得る。還流トルエン中で加熱した 場合、酸５は、脱カルボキシル化を受けて化合物６を生じ、これを２，３−ジク ロロ−５，６−ジシアノ−１，４−ベンゾキノンを用いて処理することでイソフ ラバノイド７を得る。 一般構造IXの化合物の特定の代表例には、下記のものが挙げられる： テクトリゲニン(tectorigenin) ロブストオン(robustone) ロブストオンメチルエーテル ７，２’，４’−トリヒドロキシイソフラボン ６，２’，３’−トリヒドロキシ−７，４’−ジメトキシイソフラバン ８，４’−ジメトキシ−７−ヒドロキシイソフラボン ＸIVの化合物は、以下の構造： またはその塩を有し、 ここで、 Ｒ¹⁸およびＲ¹⁹は、独立して、群： Ｈ、ヒドロキシ、（非）置換アルキル、（非）置換アルコキシ、ＣＯＲ²¹カ ルボキシ、カルボアルコキシ、ＯＲ²²、低級鎖アルキルまたはフェニルによって 窒素において任意に置換されたカルバモイル、アシルオキシ、ハロ、シアノ、お よびアジドから選択される。 Ｒ²⁰は、群：Ｈ、ヒドロキシ、ハロ、低級鎖アルキル、アシルオキシ、および シロキシから選択され； ここで、Ｒ²¹は、群：アルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、（非 ）置換フェニル、（非）置換ナフチル、チエニル、フラニル、およびピリジルか ら選択され； そして、Ｒ²²は、Ｃ_3-6炭化水素部分からなる。 一般構造ＸIVの化合物は、一般構造ＸＶのイリドを、一般構造ＸVIの酸塩化物 と、または一般構造ＸVIIの酸無水物と反応させる工程： または一般構造ＸVIIIの酸： をポリリン酸、トリフルオロ酢酸無水物、または同様の試薬と処理する工程によ って、 または一般構造ＸIXのカルコン： をいずれかの塩基を用いて処理する工程、または塩基で処理し、続いて２，３− ジクロロ−５，６−ジシアノ−１，４−ベンゾキノンを用いて処理する工程によ って、調製され得、 ここで基Ｒ¹⁸、Ｒ¹⁹、Ｒ²⁰は、上記の通りであり、続いて、必要に応じて脱保 護、カップリング、付加、置換、または脱離によって任意の１つ以上の基Ｒ¹⁸、 Ｒ¹⁹、Ｒ²⁰を新しい基、Ｒ¹⁸、Ｒ¹⁹、Ｒ²⁰へ転化し、そして、所望ならば、一般 式ＸIVの化合物をその塩へ変換するかまたはそれをその塩から遊離させる。 一般構造ＸIVの化合物の代表例は、以下である： ５，４’−ジメチル−７−アセチルフラボン ７−ベンゾイルオキシフラバノン アピインアセテート。 構造ＸＸの化合物は、以下の式： のものかまたはその塩であり、 ここで、 Ｒ²³、Ｒ²⁴、Ｒ²⁵、Ｒ²⁶は独立して、群：Ｈ、ヒドロキシ、（非）置換アルコ キシ、シロキシ、（非）置換アルキル、（非）置換アルケニル、ハロ、カルボキ シル、およびアシルオキシから選択され、そしてここで、Ｒ²³およびＲ²⁴、そし て同様にＲ²⁵およびＲ²⁶は、共に５員〜７員（非）置換の炭素環式環またはヘテ ロ環式環と同等であり得、そしてここで、上述の任意に置換された基上の置換基 は、低級鎖アルキル、低級鎖アルコキシ、ヒドロキシ、シロキシ、アシルオキシ 、ハロ、ベンゾイル、カルボキシ、カルボアルコキシ、および低級鎖アルキル、 フェニル、チエニル、フリル、またはピリジニルによって窒素において任意に置 換されたカルバモイルを含み得る。 Ｙ¹は、群：Ｏ、−ＯＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ−、−ＯＣＨ₂ＣＨ₂Ｓ−、−ＯＣＨ₂ＣＨ₂ ＣＨ₂Ｏ−、−ＳＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂Ｓ−、および−ＳＣＨ₂ＣＨ₂Ｓ−から選択され 、 Ｘ²は、群：ＣＨ₂、Ｏ、およびＳから選択されるが、ただし、以下の条件を有 する： ＸおよびＹがＯであり、かつＲ²⁴またはＲ²⁵が両方ともアルコキシであるかま たはアルコキシとアルキル（順序は関係ない）である場合、Ｒ²³およびＲ²⁶の少 なくとも１つは、Ｈ以外でなければならない。 一般構造ＸＸの化合物は、一般構造ＸＸＩのアミドをＴＨＦ中でsec−ブチル リチウムおよびテトラメチルエチレンジアミンと反応させる工程、続いて、一般 構造ＸＸIIのベンズアルデヒドを付加し、そして酸を付加する工程により、調製 し得る。 得られた一般構造ＸＸIIIのラクトンは、触媒での水素付加あるいは酸中で活 性亜鉛と処理することによって還元され得、続いてトリフルオロ酢酸無水物で脱 水素化するか、または、一般構造ＸＸIVのジアリール類を硫酸、三塩化アルミニ ウム、トリフルオロ酢酸無水物、または類似の薬剤を用いて処理する： ここで、Ｒ²³、Ｒ²⁴、Ｒ²⁵、Ｒ²⁶は、上記で定義されたものであり、続いて、 必要に応じて、脱保護、カップリング、付加、置換、または脱離によって、１つ 以上の基Ｒ²³、Ｒ²⁴、Ｒ²⁵、Ｒ²⁶を新しい基Ｒ²³、Ｒ²⁴、Ｒ²⁵、Ｒ²⁶へ変換し、 そして、所望ならば、一般構造ＸＸの化合物をその塩に変換するかまたはそれを その塩から遊離させる。 一般構造ＸＸの化合物の特定の代表例には、３−イソプロポキシアンスロンが 挙げられる。 本発明で有用な別の基は、式： のものであるかまたはその塩であり、ここで： Ｘ³はＮＲ²⁷であり、Ｘ⁴はＣＲ³⁰であり、Ｘ⁵はＯであり、Ｘ⁶はＣＲ³¹であり 、Ｘ⁷はＯ^-であり； あるいはＸ³はＮＲ³⁰であり、Ｘ⁴はＣＲ²⁷またはＮであり、Ｘ⁵はＮＲ³¹であ り、Ｘ⁶はＣＲ²⁸であり、Ｘ⁷はＯ^-またはＳ^-であり； あるいはＸ³はＮＲ²⁷であり、Ｘ⁴はＣＲ³⁰であり、Ｘ⁵はＮＲ²⁸であり、Ｘ⁶は ＣＲ³¹であり、Ｘ⁷はＯ^-またはＳ^-であり； あるいはＸ³はＮＲ²⁷であり、Ｘ⁴はＣＲ²⁸またはＮであり、Ｘ⁵はＮＲ³⁰であ り、Ｘ⁶はＣＲ²⁹であり、Ｘ⁷はＮＲ³²であり； あるいはＸ³はＮＲ³⁰であり、Ｘ⁴はＣＲ²⁷またはＮであり、Ｘ⁵はＮＲ²⁸であ り、Ｘ⁶はＣＲ²⁹であり、Ｘ⁷はＮＲ³²であり； あるいはＸ³はＮＲ²⁷であり、Ｘ⁴はＣＲ³⁰であり、Ｘ⁵はＳであり、Ｘ⁶はＣＲ³¹ であり、Ｘ⁷はＮＲ³²であり； あるいはＸ³はＮＲ³⁰であり、Ｘ⁴はＣＲ²⁷であり、Ｘ⁵はＳであり、Ｘ⁶はＣＲ²⁸ であり、Ｘ⁷はＮＲ³²であり； あるいはＸ³はＳであり、Ｘ⁴はＣＲ³⁰であり、Ｘ⁵はＮＲ²⁷であり、Ｘ⁶はＣＲ³¹ であり、Ｘ⁷はＯ^-またはＳ^-であり； あるいはＸ³はＳであり、Ｘ⁴はＣＲ³⁰であり、Ｘ⁵はＮＲ²⁷であり、Ｘ⁶はＣＲ²⁸ であり、Ｘ⁷はＮＲ³²であり； あるいはＸ³はＳであり、Ｘ⁴はＣＲ²⁷であり、Ｘ⁵はＮＲ³⁰であり、Ｘ⁶はＣＲ²⁸ であり、Ｘ⁷はＮＲ³²であり； あるいはＸ³はＳであり、Ｘ⁴はＣＲ³⁰であり、Ｘ⁵はＳであり、Ｘ⁶はＣＲ²⁷で あり、Ｘ⁷はＮＲ³²であり； あるいはＸ³はＳであり、Ｘ⁴はＣＲ³⁰であり、Ｘ⁵はＳであり、Ｘ⁶はＣＲ³¹で あり、Ｘ⁷はＯ^-であり； あるいはＸ³はＮＲ³⁰であり、Ｘ⁴はＣＲ²⁷またはＮであり、Ｘ⁵はＮＲ³¹であ り、Ｘ⁶はＮであり、Ｘ⁷はＯ^-またはＳ^-であり； あるいはＸ³はＮＲ²⁷であり、Ｘ⁴はＣＲ³⁰であり、Ｘ⁵はＮＲ²⁸であり、Ｘ⁴ はＮであり、Ｘ⁷はＮＲ³²またはＣＺ²Ｚ³であり； あるいはＸ³はＮＲ²⁷であり、Ｘ⁴はＣＲ²⁸またはＮであり、Ｘ⁵はＮＲ³⁰であ り、Ｘ⁴はＮであり、Ｘ⁷はＮＲ³²またはＣＺ²Ｚ³であり； あるいはＸ³はＮＲ³⁰であり、Ｘ⁴はＮであり、Ｘ⁵はＳであり、Ｘ⁶はＣＲ³¹で あり、Ｘ⁷はＯ^-であり； あるいはＸ³はＳであり、Ｘ⁴はＣＲ²⁷であり、Ｘ⁵はＮＲ³⁰であり、Ｘ⁶はＮで あり、Ｘ⁷はＮＲ³²であり； あるいはＸ³はＳであり、Ｘ⁴はＣＲ³⁰であり、Ｘ⁵はＮＲ²⁷であり、Ｘ⁶はＮで あり、Ｘ⁷はＮＲ³²であり； あるいはＸ³はＯまたはＳであり、Ｘ⁴はＮであり、Ｘ⁵はＮＲ³⁰であり、Ｘ⁶は Ｎであり、Ｘ⁷はＮＲ³²であり； ここで、 Ｒ²⁷、Ｒ²⁸、およびＲ²⁹は、独立して、直鎖または分枝鎖低級アルキルであり ； Ｒ³⁰およびＲ³¹は、独立して、群：水素、直鎖または分枝鎖（非）置換アルキ ル、（非）置換芳香族系から選択され、ここで、置換基には下記が挙げられ得： ハロゲン、直鎖または分枝鎖低級アルキル、アルケニル、６員芳香族、環状アル キルまたは環状アルケニル環によって任意に置換されたアルキニル、ヒドロキシ ル、直鎖または分枝鎖アルコキシル、ベンゾイル、カルボアルコキシ、低級鎖ア ルキルまたはフェニルによって窒素において任意に置換されたカルバモイル、あ るいはカルボキシ； Ｒ³²は、群：Ａｒ、ＣＯＡｒ、ＣＯＲ³³から選択され、ここで、Ａｒは、６員 （非）置換芳香族環であり、ここでこの環上の置換基には、下記が挙げられ得： ハロゲン、直鎖または分岐鎖低級アルキル、アルケニル、任意に６員環芳香族、 環状アルキルまたは環状アルケニル環によって置換されたアルキニル、ヒドロキ シル、直鎖または分岐鎖アルコキシル、ベンゾイル、カルボアルコキシ、低級鎖 アルキルまたはフェニルによって窒素において任意に置換されたカルバモイル、 あるいはカルボキシ； Ｒ³³は、群：水素、および直鎖または分岐鎖アルキルから選択され、 Ｚ²およびＺ³は、独立して、群：ＣＮおよびＣＯ₂Ｒ³⁴から選択され； Ｒ³⁴は、群：水素、直鎖または分岐鎖アルキル、および（非）置換芳香族系か ら選択される。 上記の一般構造ＸＸＶの化合物は、一般構造ＸＸVIの化合物： （ここでＸ⁸は、ＮＲ³⁰またはＳであり、Ｘ⁹はＣＲ³⁰またはＮであり、Ｘ¹⁰は ＮＲ³⁰またはＳであり、Ｚ⁴はＣＯ₂Ｈ、ＣＯ₂Ｒ³⁰、またはＣＮである）を酸塩 化物または無水物を用いて処理する工程によって、 あるいは一般構造ＸＸVIIの化合物： （ここでＸ¹¹はＮＲ³⁰またはＳであり、Ｘ¹²はＮまたはＣＲ³⁰であり、Ｘ¹³は ハロゲン、ＳＭｅ、またはＯＥｔである）をアミン、硫黄、またはエノラートと 反応させる工程によって、 あるいは一般構造ＸＸＶIIIの化合物： （ここでＸ¹⁵はＯまたはＳである）をイソシアネート、イソチオシアネート、 または二硫化炭素と反応させる工程によって、 あるいは一般構造ＸＸIXの化合物： を水酸化ナトリウムと反応させる工程によって、 あるいは一般構造ＸＸＸの化合物： をアルキルトシラート、アリールトシラートまたはハロゲン化アルキルと反応さ せる工程によって、 あるいは一般構造ＸＸＸＩの化合物： を二塩化アリールイソシアニド、ホスゲン、チオホスゲン、または３，３−ビス （メチルチオ）アクリロニトリルと反応させる工程によって、 あるいは一般構造ＸＸＸIIの化合物： （ここでＸ¹⁶はＯ、Ｓ、またはＮＨである）を酸塩化物の存在下でナトリウム エトキシドまたはＨＣｌと、あるいは酸無水物の存在下でＨＣｌと反応させる工 程によって、 あるいは一般構造ＸＸＸIIIの化合物： （ここでＸ¹⁷はＮＨまたはＳ）を酸塩化物、酸無水物、またはＨＯＮＯと反応 させる工程によって、 または一般構造ＸＸＸIVの化合物： をＣｕ（acac）₂と反応する工程によって調製され得、 ここで、Ｒ²²、Ｒ²⁸、Ｒ²⁹、Ｒ³⁰、Ｒ³¹、Ｒ³²、Ｒ³³、およびＲ³⁴は上記で定 義の通りであり、続いて、必要に応じて、脱保護、カップリング、付加、置換、 または脱離によって、任意の１つ以上の基Ｒ²²、Ｒ²⁸、Ｒ²⁹、Ｒ³⁰、Ｒ³¹、Ｒ³² 、Ｒ³³、およびＲ³⁴を新しい基Ｒ²²、Ｒ²⁸、Ｒ²⁹、Ｒ³⁰、Ｒ³¹、Ｒ³²、Ｒ³³、お よびＲ³⁴に、変換し、そして所望ならば、一般構造ＸＸＶの化合物をその塩に変 換しまたはそれをその塩から遊離させる。 一般構造ＸＸＶの化合物の特定の代表例には、以下が挙げられる： ３−（４−クロロフェニル）−１，２，３，４−オキサトリアゾリウム−５− （４−クロロフェニル）アミニド、 １，３−ジ（４−メチルフェニル）−１，２，３，４−テトラゾリウム−５− オキシド。 以下の実施例は、本発明を例示するが制限はしないことを意図している。 実施例１ 化合物59-0008は、McDonald,W.S．ら、Chem Comm(1969)392-393、Irving,H.N. N.H.ら、Anal Chim Acta(1970)49:261-266の手順に従って合成された。簡略には 、ジチゾン10.0gをEt0H100mlとAcOH50ml中に入れて、還流下で18時間加熱した。 冷却後、これをまず水100mlで希釈し、続いて１ＮNaOH50mlを加えた。続いてこ れを６ＮNaOHを添加することによりさらに中和してｐＨを5.0にした。続いて、 この深紫色の混合物をローターベイパー上で濃縮し有機物を除去した。一旦液体 がその紫色を完全に消失すると、これを濾過して濃色の沈澱物を回収した。フラ ッシュクロマトグラフィー（4.5×25.7cm、EtAc／Hep（１：４）、R_f0.22）で精 製し、続いてEtOHから再結晶化し、濃紫色の結晶（融点＝184−185℃）2.15g（ 収率25％）を得た。 実施例２ 高スループットスクリーニング 1995年６月２日に提出され、そして、本明細書中に参考として援用される米国 第08/458.434号に記載のアッセイ系において数千の化合物を検査した。標準ポジ ティブコントロールは本発明の以下の式の化合物59-0008（OS8としても記載）で あった。： より詳細には、2T3-BMP-2-LUC細胞（安定的に形質転換された（上記で参照さ れたGhosh-Choudhuryら、Endocrinology(1996)137:331-39に記載)）を用いた。 細胞をα-MEM、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、および１％グルタミン（ 「プレート培地」）を有する10％FCSを用いて培養し、１週間に一度１：５に分 割した。アッセイのために、細胞を４％FCSを含むプレート培地に再懸濁し、マ イクロタイター(microtiter)プレートに５×10³細胞（50μｌ中）／ウェルの濃 度でプレートし、そして、５％CO²中、37℃で24時間インキュベートした。アッ セイを始めるために、DMSO中の50μｌの試験化合物もしくは、コントロールを各 ウエルに２×の濃度で加え、その結果最終容量は100μｌであった。最終血清濃 度は ２％FCSであり、そして最終DMSO濃度は１％であった。化合物59-0008（10μＭ） をポジティブコントロールとして用いた。 処理した細胞を24時間37度、５％CO²中でインキュベートした。次いで培地を 除去し、細胞をPBSで３回リンスした。余分のPBSを除去した後、25μｌの１×細 胞培養物溶解試薬(Promega #E153A)を各ウェルに加え、そして少なくとも10分間 インキュベートした。必要に応じて、プレート／サンプルをこの時点で凍結し得 る。各ウェルに50μｌのルシフェラーゼ基質(Promega #E152A；10ml Promega Lu ciferase assay bufferに付き７mg Promega luciferase assay substrate)を加 えた。蛍光を96ウェルの自動化蛍光測定器において測定し、そして蛍光を、ウェ ルあたりのルシフェラーゼ活性のピコグラム、またはタンパク質のマイクログラ ムあたりのルシフェラーゼ活性のピコグラムとして示した。 このアッセイにおいて、化合物59-0008（３-フェニルアゾ-１Ｈ-4,1,2-ベンゾ チアジアジン（3-phenylazo-1H-4,1,2-benzothiadiazine））は、図１に示すよ うな反応性のパターンを示した。化合物59-0008に対する活性はほぼ３〜10μＭ の濃度（より詳細には３μＭにおいて）で最大で、従ってほぼ175光放出単位（l ight emission unit）の反応を提供した。従って、他の試験化合物を種々の濃度 で評価し、そしてこれらの結果を、10μＭで59-0008について得られた結果（こ の値を100と標準化した）と比較した。例えば、図２と図３における10μＭの59- 0008より高い活性を示した任意の試験化合物は、100以上の値を生じた。 図２（39枚）、および図３（10枚）に示すように、いくつかの化合物は特に効 果的と見出された。 実施例３ インビボ頭蓋冠骨増殖データ 化合物59-0008を、前に記載した手順（「マウス頭蓋冠骨増殖に対する化合物 の効果のインビボアッセイ」を参照、前出）に従ってアッセイした。ビヒクルの コントロールと比較して、化合物59-0008は、新しい頭蓋冠骨の幅の増強を４倍 誘導した。実施例４ 軟骨形成活性 化合物59-008、化合物59-0102、化合物50-0197を、組換えヒトBMP-2の作用と 比較して軟骨細胞の分化における効果についてアッセイした。簡潔に述べれば、 マウスの軟骨形成細胞型であるTMC-23を、SV-40ラージＴ抗原(large T-antigen) を駆動するBMP-2遺伝子の制御領域を含むトランスジェニックマウス（Ghosh-Cho udhuryら、Endocrinology 137:331-39，1996に記載されるように生成した）の肋 骨の軟骨から単離し、さらにクローン化した。これらの細胞をDMEM/10％FCS中で 培養し、そしてこれらの細胞はＴ抗原の発現を示し、そしてまたコンフルエンス の７日後までにさらにアグリカン(aggrecan)（pH1.0でトルイジンブルー染色） およびII型コラーゲン（免疫染色）の生成を示した。 アルカリフォスファターゼ(ALP)活性の測定のために、LF Bonewaldら、J Biol Chem（1992）267:8943-49の技術を使用した。簡潔に述べれば、TMC-23細胞を、 96ウェルマイクロタイタープレート（10％FCSをふくむDMEM中）に、４×10³細胞 ／ウェルでプレートした。プレートの２日後、細胞はコンフルエントになり、そ して培地を、新しい培地（10％FCSおよび異なる濃度の化合物または組換えBMP-2 を含む）に置換した。インキュベートのさらに２もしくは５日後、プレートをPB Sで２回リンスし、次いで溶解液（0.05％TrionX-100）を加えた（100μｌ/ウェ ル）。細胞を３回の凍結-解凍サイクル（-70℃（30分）その後37℃（振とうしな がら30分））で溶解した。20μｌの細胞溶解液を、80μｌの50mM ｐ-ニトロフェ ニルフォスフェートを有する1.5M 2-アミノ-2-メチル-プロパノール緩衝液（pH1 0.3）(Sigma ALPキット、Sigma Chemical Co.，St．Louis，MO)でアッセイした 。反応を、100μｌの0.5M NaOHの添加によって停止した。405nmでの分光吸光度 を、ｐ-ニトロフエノールの標準の吸光度と比較し、サンプル中のALP活性を評価 した。細胞溶解液のタンパク質含有量を、Bio-Radのタンパク質アッセイキット( Bio-Rad，Hercules，CA.)によって決定した。比活性を、これらの２つのパラメ ーターを使用して計算した。 ２日目に、化合物59-0008（10^-9M）、化合物59-0102（10^-7M）、および化合物 59-0197（10^-9M）は、ビヒクルコントロールと比較して、ALPレベルをそれぞれ 約 ３、２、および2.5倍に増加した。100、50、または10ng/mlで、組換えBMP2は、 ビヒクルコントロールと比較して、それぞれ約10、４、または1.5倍のALPレベル を誘導した。 前述から、本発明の特定の実施態様は例示の目的で本明細書中に記載されたが 、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、種々の改変がなされ得ること が認識される。従って、本発明は添付の請求の範囲によることを除いて制限され ない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ， ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｌ Ｃ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (71)出願人 ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバ ーシティ オブ テキサス システム アメリカ合衆国 テキサス 78701，オー スティン，ウエスト ７ティーエイチ ス トリート 201 (72)発明者 ペトリイ，チャールズ アメリカ合衆国 ワシントン 98072，ウ ッディンビル，エヌ．イー．196ティーエ イチ プレイス 18459 (72)発明者 オルメ，マーク ダブリュー. アメリカ合衆国 ワシントン 98117，シ アトル，エヌ．ダブリュー．98ティーエイ チ ストリート 636 (72)発明者 ベインドゥル，ナンド アメリカ合衆国 ワシントン 98026，エ ドモンズ，57ティーエイチ プレイス ウ エスト 13919 (72)発明者 ロビンス，カーク ジー. アメリカ合衆国 ワシントン 98055，レ ントン，グラント アベニュー サウス ナンバーワイ−304 1200 (72)発明者 ハリス，スコット エム. アメリカ合衆国 ワシントン 98815，シ アトル，31エスティー アベニュー エ ヌ．イー．6825 (72)発明者 コントイアンニ，マリア アメリカ合衆国 ワシントン 98109，シ アトル，ヘイズ ストリート ナンバー 504 769 (72)発明者 ヒューレイ，ロウレンス エイチ. アメリカ合衆国 テキサス 78731，オー スティン，ノースウェスト プレイス 5915 (72)発明者 カーウィン，シーン エム. アメリカ合衆国 テキサス 78681，ラウ ンド ロック，アイビー コート 703 (72)発明者 マンディ，グレゴリー アール. アメリカ合衆国 テキサス 78230，サン アントニオ，モーガンズ クリーク 3719

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．骨生長置換(bone growth replacement)および／または望ましくないレベル の骨吸収における欠損またはそれらに対する必要性によって特徴づけられる脊椎 動物における状態を処置する方法であって、 該方法が、このような処置を必要としている脊椎動物被検体に、有効量の以下 の式の化合物を投与する工程を包含し： ここで、Ｒ^aは、非干渉(non-interfering)置換基であり； ｍは、０〜４の整数であり； 各々の点線は、任意のπ−結合を表し； 各々のＺは、独立してＮ、ＮＲ、Ｏ、Ｓ、ＣＲ、またはＣＲ₂であり、 ここで、各々のＲは、独立してＨまたはアルキル（１−６Ｃ）であり； Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、またはＳＯ₂であり； Ｌは、フレキシブルなリンカーであり；そして Ａｒ²は、置換または非置換の６員芳香族環である、方法。 ２．前記Ｌが、フレキシブルな共役したリンカーである、請求項１に記載の方法 。 ３．前記Ｌが、共有結合、−Ｎ＝Ｎ−、−ＲＣ＝ＣＲ−、−ＲＣ＝Ｎ−、−Ｎ＝ ＣＲ−、−ＮＲＣＯ−、−ＣＯＮＲ−、−ＣＲ₂Ｏ−および−ＣＲ₂ＮＲ−からな る群から選択され、ここで、各々のＲが、独立してＨまたはアルキル（１−６Ｃ ）である、請求項１に記載の方法。 ４．前記Ａｒ²が、 であり、 ここで、Ｒ^bが、非干渉置換基であり、そして ｎが、０〜５の整数である、請求項１に記載の方法。 ５．前記Ａｒ²が、非置換フェニルである、請求項４に記載の方法。 ６．前記化合物が、５９−０００８： である、請求項１に記載の方法。 ７．骨生長置換および／または望ましくないレベルの骨吸収における欠損または それらに対する必要性によって特徴づけられる、脊椎動物における状態を処置す る方法において使用するための薬学的組成物であって、 該組成物が、薬学的に受容可能な賦形剤および有効量の以下の式の化合物を含 み： ここで、Ｒ^aは、非干渉置換基であり； ｍは、０〜４の整数であり； 各々の点線は、任意のπ−結合を表し； 各々のＺは、独立してＮ、ＮＲ、Ｏ、Ｓ、ＣＲ、またはＣＲ₂であり、 ここで、各々のＲは、独立してＨまたはアルキル（１−６Ｃ）であり、 Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、またはＳＯ₂であり、 Ｌは、フレキシブルなリンカーであり；そして Ａｒ²は、置換または非置換の６員芳香族環である、組成物。 ８．前記Ｌが、フレキシブルな共役したリンカーである、請求項７に記載の組成 物。 ９．前記Ｌが、共有結合、−Ｎ＝Ｎ−、−ＲＣ＝ＣＲ−、−ＲＣ＝Ｎ−、−Ｎ＝ ＣＲ−、−ＮＲＣＯ−、−ＣＯＮＲ−、−ＣＲ₂Ｏ、および−ＣＲ₂ＮＲ−からな る群から選択され、ここで、各々のＲが、独立してＨまたはアルキル（１−６Ｃ ）である、請求項７に記載の組成物。 １０．前記Ａｒ²が、 であり、ここで、 Ｒ^bが、非干渉置換基であり、そしてｎが、０〜５の整数である、請求項７に記 載の組成物。 １１．前記Ａｒ²が、非置換フェニルである、請求項７に記載の組成物。 １２．前記化合物が、５９−０００８： である、請求項７に記載の組成物。 １３．骨生長置換および／または望ましくないレベルの骨吸収における欠損また はそれらに対する必要性によって特徴づけられる脊椎動物における状態を処置す る方法であって、 該方法が、このような処置を必要としている脊椎動物被検体に、有効量の以下 の式の化合物を投与する工程を含有し： ここで、Ｒ^aは、非干渉置換基であり； ｎは、０〜５の整数であり； Ｌは、窒素を含まないフレキシブルなリンカーであり；そして Ａｒ²は、置換または非置換のフェニルあるいは置換または非置換のナフチル である、方法。 １４．前記Ｒ^aが、−ＮＲ₂または−ＣＯＯＲであり、ここで、Ｒが、Ｈまたはア ルキル（１−６Ｃ）である、請求項１３に記載の方法。 １５．前記Ａｒ²が、置換または非置換のフェニルである、請求項１３に記載の 方法。 １６．Ａｒ¹と前記Ａｒ²とが異なる、請求項１３に記載の方法。 １７．骨生長置換および／または望ましくないレベルの骨吸収における欠損また はそれらに対する必要性によって特徴づけられる、脊椎動物における状態を処置 する方法において使用するための薬学的組成物であって、 該組成物は、薬学的に受容可能な賦形剤および有効量の以下の式の化合物を含 み： ここで、Ｒ^aは、非干渉置換基であり； ｎは、０〜５の整数であり； Ｌは、窒素を含まないフレキシブルなリンカーであり；そして Ａｒ²は、置換または非置換のフェニルあるいは置換または非置換のナフチ ルである、組成物。 １８．前記Ｒ^aが、−ＮＲ₂または−ＣＯＯＲであり、ここで、ＲはＨまたはアル キル（１−６Ｃ）である、請求項１７に記載の組成物。 １９．前記Ａｒ²が、置換または非置換のフェニルである、請求項１７に記載の 組成物。 ２０．Ａｒ¹と前記Ａｒ²とが異なる、請求項１７に記載の組成物。 ２１．骨生長置換および／または望ましくないレベルの骨吸収における欠損また はそれらに対する必要性によって特徴づけられる脊椎動物における状態を処置す る方法であって、該方法が、このような処置を必要としている脊椎動物被検体に 、 有効量の以下の式の化合物を投与する工程を包含し： ここで、Ｒ^aは、非干渉置換基であり； ｎは、０〜５の整数であり； Ｌは、束縛された(constrained)リンカーであり；そして Ａｒ²は、置換または非置換のフェニルあるいは置換または非置換のナフチ ルである、方法。 ２２．前記Ｒ¹が、−ＮＲ²または−ＣＯＯＲであり、ここで、Ｒが、Ｈまたはア ルキル（１−６Ｃ）である、請求項２１に記載の方法。 ２３．前記Ａｒ²が、置換または非置換のフェニルである、請求項２１に記載の 方法。 ２４．骨生長置換および／または望ましくないレベルの骨吸収における欠損また はそれらに対する必要性によって特徴づけられる脊椎動物における状態を処置す る方法において使用するための薬学的組成物であって、 該組成物が、薬学的に受容可能な賦形剤および有効量の以下の式の化合物を含 み： ここで、Ｒ^aは、非干渉置換基であり； ｎは、０〜５の整数であり； Ｌは、束縛されたリンカーであり；そして Ａｒ²は、置換または非置換のフェニルあるいは置換または非置換のナフチル である、組成物。 ２５．前記Ｒ¹が、−ＮＲ₂または−ＣＯＯＲであり、ここで、Ｒは、Ｈまたはア ルキル（１−６Ｃ）である、請求項２４に記載の組成物。 ２６．前記Ａｒ²が、置換または非置換のフェニルである、請求項２４に記載の 組成物。 ２７．前記状態が、骨粗鬆症、骨折または骨の欠損、現発性または続発性の上皮 小体亢進症、歯周部の疾患または欠損、転移性の骨疾患、骨溶解性の骨疾患、形 成外科手術後、人工関節手術後、あるいは歯科インプランテーション後である、 請求項１、１３、または２１のいずれかに記載の方法。 ２８．骨の生長を促進するかまたは骨吸収を阻害する１つ以上の薬剤を、前記被 検体に投与することをさらに包含する、請求項１、１３、または２１のいずれか に記載の方法。 ２９．前記薬剤が、骨形態発生因子、抗吸収剤、骨形成因子、軟骨由来の形態発 生タンパク質、生長ホルモン、および分化因子からなる群から選ばれる、請求項 ２８に記載の方法。