JP2000506735A - Ｂ型肝炎感染の転帰を予測するための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、Ｂ型肝炎感染の発症の予後に関する。本発明による方法は、また、例えばα−インターフェロンのような抗ウイルス性化合物による抗ウイルス療法をモニターするためにも使用することかできる。本発明は、ＨＢｅＡｇと複合体を形成することができる特異的生体分子の存在が、さらなる急性Ｂ型肝炎感染の進展についての予後マーカーであるという知見に基づく。感染の急性期における該特異的生体分子あるいは該生体分子とＨＢｅＡｇの複合体の存在の有無に基づいて、患者が急性感染後に回復してウイルスを除去するか、あるいは慢性感染を発現するかを予測できることが認められた。本発明は、従って、急性ＨＢＶ感染を生じた患者での感染の経過を予測するための方法における、ＨＢｅＡｇと結合した特異的生体分子を含む循環複合体検出のためのアッセイの使用を含む。本発明は、抗ウイルス薬による治療をモニターし、かかる治療の効果がどのようであるかを示すためにも使用することができる、Ｂ型肝炎感染の発症の予後のための新しい方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｂ型肝炎感染の転帰を予測するための方法 本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）による感染の経過を予測及び監視する ための方法に関する。さらに本発明は、そうした方法において使用できる抗体類 及びアミノ酸配列に関する。 Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、ヒトにおいて急性及び慢性感染を引き起こす 。本感染は潜伏性であったり、軽度若しくは重度の急性肝炎に至ったりすること があるが、さらに場合によっては肝硬変及び原発性肝臓癌を引き起こす慢性感染 へ進行することがある。Ｂ型肝炎ウイルスは、脂質エンベロープとウイルスゲノ ム及びＤＮＡポリメラーゼを含有するインナーコアとから構成される小さいＤＮ Ａウイルスである。ＨＢＶコア遺伝子（ヌクレオチド１８１４−２４４９）は、 各々２９及び１８３個のコドンから構成されるプレコアとコア領域に分かれてい る。この遺伝子は、機能的に相違する２種のタンパク質、組立てられて感染細胞 の細胞質中でヌクレオカプシド粒子（ＨＢｃＡｇ）を形成する２１．５ｋＤａタ ンパク質と小胞体を指向し引き続いてＮ末端及びＣ末端がプロセシングされてｅ 抗原（ＨＢｅＡｇ） として分泌されるプレコアタンパク質、をコードしている。 ＨＢｅＡｇは１９７２年に初めて同定された。ＨＢｅＡｇはＨＢＶ感染患者の 血清中に非粒子状態で存在する。ＨＢｅＡｇの存在は、一般には感染宿主におけ る活性ウイルス複製の指標であると見なされている。これまでに行われた実験は ＨＢｅＡｇが抗原の複合体である可能性があることを示しており、ｅ１、ｅ２及 びｅ３と呼ばれる３つまでの沈降素系が個々の患者から採取した血清中に寒天ゲ ル拡散により検出されている。約３００ｋＤａの分子量をもつＩｇＧ結合ＨＢｅ Ａｇとこれより小さい約１６ｋＤａの分子量をもつＨＢｅＡｇ成分の両方がＨＢ Ｖ感染患者の血清中で検出されている。ＨＢｃＡｇは、変性及び／又は限定され たタンパク分解を受けるとＨＢｃＡｇがＨＢｅＡｇに転換され得るという事実に 基づいてＨＢｅＡｇに関連付けられている。 ＨＢｃＡｇとＨＢｅＡｇとの免疫学的識別は、どちらかの抗原に対して特異的 なモノクローナル抗体の導入によって可能になっている。ＨＢｃＡｇは、１つの 大きな不連続エピトープをもっていると提案されてきたが、さらに線状ＨＢｃＡ ｇ決定基及び内部決定基が存在することも又示唆されてきた。 相違するマウスモノクローナル抗体を使用することによって、ＨＢｅＡｇ上の ２つの別個のＢ細胞エピトープが検出されている。ＨＢｅ／α若しくはＨＢｅ１ は線状決定基であり、アミノ酸配列（７６）Ｌ−Ｅ−Ｄ−Ｐ−Ａ−Ｓ−Ｒ−Ｄ− Ｌ−Ｖ−Ｖ−Ｓ−Ｙ（８９）に存在する。ＨＢｅ１決定基は立体配座ＨＢｃ決定 基と重複しており、コア粒子表面上のＨＢｅ立体配座においても露出していると 思われる（Ｓａｌｆｅｌｄら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３，７９８−８０８，１９ ８９）。 ＨＢｅ／β若しくはＨＢｅ２は不連続決定基であって、その正確な立体配座の ためには、アミノ酸１３８付近で終了するアミノ酸配列だけでなくアミノ末端ア ミノ酸配列の間接的若しくは直接的な分子内関与を必要とする。ＨＢｅ２決定基 はコア粒子表面上では不在であるか接近不可能であるかのどちらかである（Ｓａ ｌｆｅｌｄら，１９８９）。Ｓａｌｌｂｅｒｇら（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２８，７１９−７２６，１９９１）によれば、マウスモノクローナル抗体及びヒ ト血清はＨＢｅ２エピトープをａａ１３０の付近に存在する線状決定基として認 識する可能性がある。２種の抗ＨＢｅ２モノクローナル抗体が残基１２８−１３ ３で配列Ｔ−Ｐ−Ｐ−Ａ−Ｙ−Ｒを認識する ことが発見された。置換合成により、これら２種のモノクローナル抗体により認 識されるためにはＰＰが不可欠であることが証明された。線状ＨＢｅ２エピトー プを含有しているペプチドを単一ピークとして認識したモノクローナル抗体は、 ＨＢｅ抗体ＲＩＡにおいて最も有効な阻害活性をもつ抗体であった。患者におい ては、ペプチドを含有するＨＢｅ２エピトープへの血清反応性は主としてＨＢｅ 抗体ＲＩＡにおいて強力な阻害（９５％）を生じさせた患者血清において発見さ れた。 ＨＢｅＡｇの機能は明らかではないが、感染中に細胞毒性Ｔ細胞をブロックす ることによって肝細胞に感染したウイルスを防護する可能性がある。１９９０年 にＭｉｌｉｃｈら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８７， ６５９９−６６０３，１９９０）は、ＨＢｅＡｇが子宮内で免疫耐性を引き起こ す可能性があることを示唆した。ＨＢｅＡｇの発現は出産期感染後の持続性を保 証するためのウイルス戦略を表している可能性がある。 患者らがＨＢｅ抗体への血清変換により近付いたときは、彼らはこの感染から 回復して抗ウイルス療法へ応答すると思われる。 感染の経過を決定する機序及び因子についてはほとんど分かっていない。慢性 ＨＢＶ感染患者の治療法には通常はインターフェロン療法が含まれている。しか し、インターフェロン療法に応答して完全なウイルス除去を示す患者の数は極め て限られている。感染が自己限定性であるのか慢性であるのか、そしてどの患者 が最終的にインターフェロン療法に応答するのかを予測することは困難である。 このため、Ｂ型肝炎の予後を確実に予測できる方法が必要である。そうした方法 を利用できれば、患者を抗ウイルス薬で治療すべきかどうかを確定することがで き、さらにそうした治療法の効果を予測又は監視することができる。 本発明はＢ型肝炎感染の展開の予後に関する。本発明による方法はさらに又、 例えばα−インターフェロンのような抗ウイルス薬を用いた抗ウイルス療法を監 視するために使用できる。 Ｂ型肝炎の予後に関しては既に数種の方法が記載されてきた。ＷＯ９１／１４ ７０では、Ｂ型肝炎感染の転帰を予測するのに役立たせるために患者サンプルを プレコア突然変異体の存在／不在について試験する方法が記載されている。しか し、他の研究（ＧｕｅｎｔｈｅｒらＶｉｒｏｌｏｇｙ １８７（１），２７１ −２７９，１９９２）は、プレコア領域における突然変異の存在又は不存在はウ イルスの除去とは無関係であることを証明している。慢性Ｂ型肝炎の発生の予測 のために抗ＨＢｓのＩｇＧ及びＩｇＭの比率（ＩｇＧ／ＩｇＭ）を使用するＢ型 肝炎感染の予後を予測する方法が、ＳＵ１７５１６８０に記載されている。多数 の研究者は急性及び慢性Ｂ型肝炎感染の識別に焦点を当ててきた。急性及び慢性 Ｂ型肝炎感染の識別は予後及び可能な治療様式に関して重要である。慢性ＨＢＶ 感染においてはＨＢＶ ＸＡｇに対する抗体が優先的に産生されると報告されて いる（Ｍｏｒｉａｒｔｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，４２９−４３３、１９８ ５）。 また、慢性感染と比較して急性期には一般により高レベルの抗ＨＢｃ ＩｇＭ が産生されるので、この量的相違が慢性感染の急性上昇の急性ＨＢＶ感染を識別 するための唯一の血清学的手段となっていることも記載されている（Ｇｅｒｌｉ ｃｈら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２，２２８−２９３，１９８６ ）。さらに、抗ＨＢｅ ＩｇＭを分子量によって分離することが急性ＨＢＶと慢 性Ｂ型肝炎感染とを識別するために有用であることも報告されている（Ｔｓｕｄ ａら， Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，８７，１５９−１６４，１９８４）。急性 と慢性のＨＢＶ感染の識別における抗ＨＢｃ ＩｇＭアッセイの有用性について は疑問も投げかけられてきた。しかしこれらの方法はどれも感染の経過を予測す る可能性を提供しない。 これは、感染の慢性期中のＨＢｅＡｇの循環免疫複合体の存在を調べたＭａｒ ｕｙａｍａらの研究においても当てはまる。Ｍａｒｕｙａｍａら（Ｊ．Ｉｍｍｕ ｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１５５，６５−７５，１９９２）は、慢性ＨＢＶ感染を有 する患者から採取した血清中の循環免疫複合体を検出するためのアッセイを開発 した。このアッセイは、ＨＢｅ７３−８７：ＧＶＮＬＥＤＰＡＳＲＤＬＶＶＳＣ と呼ばれるアミノ酸７３−８７（プレコア配列を除いて）を含有するＨＢｅＡｇ ／ａｙｗ由来ペプチドに対して産生した抗体を被覆した固相から構成される。Ｍ ａｒｕｙａｍａらによると、抗ペプチド抗体は天然ＨＢｅＡｇに対して産生した 抗体とは競合しない。抗体競合実験は両方向で実施され、同一成績を得た。この ため、競合の欠如は抗ペプチド抗体と天然タンパク質に対して産生された抗体と の間の抗体結合活性における相違によって引き起こされるの ではないと結論された。 Ｍａｒｕｙａｍａらによれば、選択された抗ペプチド抗体は、天然タンパク質 に対して産生された抗体による同時結合を実質的に妨げない特有な部位に結合す る。免疫複合体を検出するためのアッセイはさらにＷＯ９４／０８５９７におい ても記載されている。同一著者らのさらに別の論文（Ｍａｒｕｙａｍａら，Ｇａ ｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１０５，１１４１−１１５１，１９９３）にお いては、このアッセイの最適化が記載されている。抗ペプチド抗体は、血清抗Ｈ Ｂｅ抗体に同時に複合化されている天然ＨＢｅＡｇを効率的に結合するモノクロ ーナル抗体に取り換えられた。このアッセイは、慢性ＨＢＶ感染の患者における 無症状免疫応答を検出するときに使用された。１９９４年に、Ｍａｒｕｙａｍａ ら（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１０６，１００６−１０１５，１９９ ４）は疾患から完全に回復した急性ＨＢＶの患者及び１年間以上に渡ってＨＢｅ Ａｇ及びＨＢｓＡｇに対して持続的に陽性であった慢性ＨＢＶ患者を含めた研究 について発表した。擬似抗ＨＢｅ抗体、ＨＢｅＡｇ／抗ＨＢｅ複合体及びＨＢｓ Ａｇ／抗ＨＢｓ複合体の血清濃度は急性ＨＢＶの 患者より慢性ＨＢＶ患者における方が上昇していることが観察された。 免疫複合体が感染の慢性期中に検出されたという上記の観察所見とは対照的に 、本発明は、ＨＢｅＡｇとの複合体を形成することができる特異的生体分子の存 在が急性Ｂ型感染のさらなる展開についての予後マーカーであるとの発見を基礎 としている。感染の急性期中の前記特異的生体分子若しくは前記生体分子とＨＢ ｅＡｇとの複合体存在又は不在に基づくと、患者が急性感染後に回復してウイル スを除去するのか、又は慢性感染を発生するのかを予測することができる。この ため本発明は、急性ＨＢＶ感染の患者における感染の経過を予測するための方法 においてＨＢｅＡｇに結合した特異的生体分子を含む循環複合体を検出するため のアッセイの使用を含んでいる。全員が同一源からの同一ウイルス株で感染して おり、全員が市販で入手可能な診断検査（アボット［Ａｂｂｏｔｔ］ＨＢｅＡｇ ＥＩＡ（エンザイムイムノアッセイ）；Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ Ｈｅ ｐａｎｏｓｔｉｋａ ＨＢｅＡｇ／ＨＢｅ抗体）においてＨＢｅＡｇ陽性である 一群の患者を対象に、感染３ヶ月後に前記生体分子の存在について試験した。こ れらの患者の感染の経 過を監視したところ、感染の急性期に前記生体分子に対して陽性の患者はウイル ス除去を示したが、前記生体分子に対して陰性の患者は遅延血清変換又は慢性感 染を発生した。 これらの観察所見に基づいて、本発明は抗ウイルス薬療法を監視するためにも そうした療法によりどのような効果を得られるかを示すためにも使用できる、Ｂ 型肝炎感染の展開を予測するための新規方法を提供する。 本発明による方法を用いて検出される生体分子（その存在が感染の予後の経過 についての指標となる）はおそらくＩｇＧタイプの抗体類である。前記生体分子 類は、完全なＨＢｅＡｇアミノ酸配列のアミノ酸８５−１０９を含有する領域に 位置するＨＢｅＡｇ上のエピトープをマスキングすることができる（ナンバリン グはＨＢｅＡｇ配列の最初から開始する）。マスキングとは、生体分子がＨＢｅ Ａｇとの複合体を形成した場合に、通常はエピトープを認識する一定の抗体類が ＨＢｅＡｇが生体分子類との複合体として存在するときにはＨＢｅＡｇへの結合 が妨害されることを意味している。 本発明による方法は数種類の方法で実施することができる。生体分子類の存在 又は不在は数種類の方法で測定することがで きる。例えば、複合体類（ＨＢｅＡｇに結合した生体分子類）の存在を測定する ことによってできる。アッセイは、前記エピトープに特異的な特定の抗体類の結 合に対してＨＢｅＡｇ上のエピトープをマスキングする生体分子類の能力に基づ いてすることができる。前記抗体類は生体分子類が不在の場合にのみＨＢｅＡｇ に結合することができるであろう。生体分子類がＨＢｅＡｇに結合している場合 には、抗体類はそれらのエピトープに結合することができないであろう。従って 、前記抗体類にいずれかのＨＢｅＡｇが結合するかどうかを検出することによっ て、生体分子類の存在又は不在を測定することができる。 使用する抗体類は好ましくはモノクローナル抗体類である。本発明の方法によ り使用する抗体類は、好ましくはＨＢｅＡｇに任意的に複合された生体分子類の 親和性に比較して、サンプル中に存在するＨＢｅＡｇに対して低親和性を有する 抗体類である。ＨＢｅＡｇに対するそれらの親和性がより低い結果として、抗体 類はそれらのエピトープをマスキングできる生体分子類が不在の場合にのみＨＢ ｅＡｇへ結合する。抗体類は、例えば、固相担体上に被覆して使用することがで きる。固相上に形成された免疫複合体は、例えば全ての形態のＨＢｅＡｇを認識 する別の抗ＨＢｅ抗体又は抗ヒト抗体を用いて検出することができる。この第２ 抗体はいずれかのラベルに結合されていてもよい。 このようなアッセイにおける陰性反応は、ＨＢｅＡｇがサンプル中に複合体と して存在していること、従って固相上の抗体類へ結合することができないことを 示す。（もちろん、検査中のサンプル中において、あらゆる場合にもＨＢｅＡｇ 陽性を検出するアッセイを用いるスクリーニング方法、例えば、アボットＨＢｅ ＡｇＥＩＡ、Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ Ｈｅｐａｎｏｓｔｉｋａ ＨＢ ｅＡｇ／抗ＨＢｅ若しくはＨＢｅＭＡＢアッセイ（実施例２参照）又はＳＤＳ− ページ若しくは免疫ブロッティングのような代替方法、によってＨＢｅＡｇの存 在が確認されていることを前提条件とする）。アッセイにおける陽性反応は、サ ンプルがＨＢｅＡｇ陽性であること、及びＨＢｅＡｇエピトープに抗体類がアプ ローチできることを示す。明らかに、ＨＢｅＡｇは非複合形で、又は抗体によっ て認識されるエピトープがマスキングされていない複合体として存在している。 ＨＢｅＡｇに結合している生体分子類の存在又は不在を検出 するために本発明による方法に使用するのに好ましい抗体類は、Ｎｏ．９５０９ ０６１１としてＥＣＡＣＣに保管されている細胞系によって産生されるモノクロ ーナル抗体類と同一のＨＢｅＡｇに対する反応性を有するモノクローナル抗体類 である。Ｎｏ．９５０９０６１１としてＥＣＡＣＣに保管されている細胞系によ って産生されるモノクローナル抗体類は、配列ＲＤＬＶＶＮＹＶＮＴＮの近辺に 位置するＨＢｅＡｇ上のエピトープを認識する。このエピトープは、Ｓａｌｆｅ ｌｄら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３（２），７９８−８０８，１９８９）によって ＨＢｅ１と定義された配列に重複している。ＨＢｅ１配列に比較して、組換えＨ ＢｅＡｇ（これに対しＨＢ．ＯＴ９５Ａ抗体類が生成された）の配列は、Ｓａｌ ｆｅｌｄらによって記載されているように、ＨＢｅ１配列の第８７位のセリン（ Ｓ）残基からアスパラギン（Ｎ）残基への置換を有している。（Ｓａｌｆｅｌｄ らにより付されたナンバリングはＨＢｃＡｇ配列の最初から始まる。文献によっ て様々なナンバリングが使用されている。ナンバリングが完全なＨＢｅＡｇ配列 の最初から始まる場合には、Ｎ末端部位では１０個の追加のアミノ酸が存在して いるので、ナンバー８７（Ｓａｌｆｅｌｄによる）を有するアミノ酸はナ ンバー９７をもつようになる。完全なＨＢｅＡｇ配列の最初から始まるナンバリ ングを本特許出願の実施例及び特許請求の範囲において採用する）。本特許出願 の全体を通して、第９７位にセリン（Ｓ）残基を含有するＨＢｅＡｇは「Ｓタイ プ」ＨＢｅＡｇと呼ばれ、第９７位でアスパラギン（Ｎ）残基を含有するＨＢｅ Ａｇは「Ｎタイプ」のＨＢｅＡｇと呼ばれる。 ＨＢ．ＯＴ９５Ａ抗体類はＮタイプＨＢｅＡｇに対して産生されたので、第９ ７位にＳ残基を含有するＨＢｅＡｇ「ＳタイプＨＢｅＡｇ」に対する親和性は、 おそらくその位置でＮ残基を含有するＨＢｅＡｇに対する親和性より低いであろ う。これはＮタイプＨＢｅＡｇに対して産生された抗体類がなぜ生体分子類の存 在下でＳタイプのＨＢｅＡｇの同一領域へ結合することができないかの理由と考 えられる。おそらく、Ｎタイプに対して産生した抗体類は、ＳタイプＨＢｅＡｇ に対する親和性が低いために、ＳタイプのＨＢｅＡｇに結合した生体分子類と競 合できないのであろう。 同じ方法で、例えば「Ｓタイプ」のＨＢｅＡｇに対しては高いが「Ｎタイプ」 のＨＢｅＡｇに対しては低い親和性をもつ他のモノクローナル抗体を産生させる ことができることは、明白 である。 特定の患者がＨＢｅＡｇの第９７位にＮ又はＳ残基を含有するＨＢＶに感染し ているかどうかは数種類の方法で知ることができる。例えば、サンプル内に存在 するＨＢｅＡｇの、異なる「サブタイプ」（Ｓ又はＮタイプのＨＢｅＡｇ）に対 して異なる親和性をもつ抗体との反応性を比較することができる。さらに、サン プルとＨＢ．ＯＴ９５Ａのような抗体との反応性とＨＢｅＡｇの検出のために市 販で入手可能な通常のアッセイにおける抗ＨＢｅＡｇ抗体とサンプル内のＨＢｅ Ａｇの反応性との比較もまた、サンプル中にどのタイプのＨＢｅＡｇが存在する かの指標を提供する。「Ｓタイプ」のＨＢｅＡｇと「Ｎタイプ」のＨＢｅＡｇと を区別するための方法も又本発明の一部である。この方法は下記のステップ、 （ａ）ＨＢｅＡｇを含有するサンプルの一部を、ＨＢｅＡｇに対する、Ｎｏ． ９５０９０６１１としてＥＣＡＣＣに保管されている細胞系に由来するモノクロ ーナル抗体類と同一の反応性を有する抗体類を用いて被覆された固相に接触させ 、固相上に形成された免疫複合体を検出すること、及び （ｂ）サンプルの一部を、ＮタイプのＨＢｅＡｇ及びＳタイ プのＨＢｅＡｇに対して同一の反応性を有する抗ＨＢｅＡｇ抗体を用いて被覆さ れた固相と接触させ、固相上に形成された免疫複合体を検出すること、及び （ｃ）ステップ（ａ）及び（ｂ）において入手したシグナル間の比率からサン プル中に存在するＢ型肝炎ｅ抗原がＮタイプ又はＳタイプのいずれであるかを判 定すること、を含んでいる。「Ｓタイプ」のＨＢｅＡｇを含有する血清サンプル は、ステップ（ａ）において「Ｎタイプ」のＨＢｅＡｇを含有する血清サンプル より低いシグナルを産生する。従ってステップ（ａ）及び（ｂ）において入手さ れたシグナル間の比率は「Ｎタイプ」ＨＢｅＡｇを含有するサンプルにおける方 が高い。Ｓタイプ及びＮタイプＨＢｅＡｇに特徴的な比率の正確な数値は使用す るアッセイシステムのフォーマットに依存している。 （もちろん、サンプル中に存在するＨＢｅＡｇが「Ｎタイプ」であるか「Ｓタ イプ」であるかを知るには、特定ウイルスのＨＢｅＡｇ遺伝子の特定部分の核酸 塩基配列の決定によってもできる。） 本発明による感染の予後の経過の指標となる生体分子の存在を指示するその他 の方法には下記が含まれる。生体分子類は、 ペプチド、組換えタンパク質又は生体分子が結合するエピトープの最小塩基配列 を少なくとも模倣しているあらゆるその他の生体材料で被覆した固相担体と血清 とを接触させることによって測定することができる。生体分子類は解離ＨＢｅＡ ｇ複合体から、抗ＨＢｅ陽性血清から、又はウイルス除去後のＨＢＶ感染患者に 由来するあらゆるその他の血清から得ることができる。固相上に被覆されたペプ チド類と血清中に存在する生体分子類との間で形成された複合体は、診断的アッ セイの分野の当業者には周知の種々の方法で可視化することができる。 生体分子類はさらに阻害アッセイを使用することによって検出することができ る。この場合、生体分子類が存在していないＨＢｅＡｇ陽性血清又は組換えＨＢ ｅＡｇのような他の形態のＨＢｅＡｇを、陽性サンプルとして使用することがで きる。このサンプルはエピトープをマスキングしている生体分子類を含有してい るかどうかが不明なサンプルと一緒にプレインキュベートすることができる。例 えばＨＢ．ＯＴ９５Ａのような抗体に基づくＨＢｅＡｇアッセイにおけるシグナ ルの阻害は、サンプル中にマスキング生体分子類の存在を示す。 ＨＢＶ感染の臨床的転帰に関連付けることのできるＨＢｅＡ ｇと複合体を形成する生体分子類は、例えば親和性クロマトグラフィーによって 精製することができる。次いでこれらの分子類をＨＢｅＡｇアッセイにおける試 薬として使用することができる。これらの分子類は非複合ＨＢｅＡｇとしか反応 しないので、従って急性ＨＢＶ感染の患者のサンプル中における複合体の存在又 は不在を検出するためにも使用することができる。 本発明による方法に使用できる固相担体は、当分野では周知であり、例えばマ イクロテスト・ウェル若しくはキュベット、試験管若しくは毛細管、膜、フィル ター、試験ストリップの内壁、又は例えばラテックス粒子、赤血球、染料ゾル、 金属ゾル若しくはゾル粒子のような金属化合物、ＢＳＡ若しくはＫＬＨのような キャリアタンパク質のような粒子の表面である。 使用できる標識物質は、中でも放射性同位体、蛍光化合物、酵素、染料ゾル、 金属ゾル又はゾル粒子のような金属化合物である。使用するアッセイ法の性質及 びその他の特徴に依存して起こる免疫化学反応は、いわゆるサンドイッチ反応、 凝集反応、競合反応又は阻害反応である。 本発明による方法に使用できるモノクローナル抗体類も又本発明の一部である 。本発明によるモノクローナル抗体類は、 Ｎｏ．９５０９０６１１としてＥＣＡＣＣに保管されている細胞系に由来する、 ＨＢｅＡｇに対するモノクローナル抗体類と同一の反応性を有するモノクローナ ル抗体類である。 本発明によるモノクローナル抗体類を分泌できる不死化細胞系も又本発明の一 部である。 モノクローナル抗体類を産生する細胞系の調製は、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ａ ｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ法（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎはモノク ローナル抗体産生ハイブリドーマ類の形成を生じさせる技術を発明した（Ｇ．Ｋ ｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｃ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ ２５６ ：４９５−４９７；１９７６，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１ ９））、エプスタイン・バー・ウイルスを用いての形質転換、又は腫瘍原性ＤＮ Ａを用いてのＢリンパ球の直接変換法、又はヒト若しくはマウス−ヒトハイブリ ッド骨髄腫細胞系のいずれかである融合相手とヒトＢリンパ球との直接融合、又 は前記骨髄腫細胞系とＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系との直接融合によって行うことが できる。 本発明による好ましい細胞系は、寄託番号９５０９０６１１としてＥＣＡＣＣ （欧州動物細胞培養コレクション：Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、ポ ートンダウン、英国）に寄託されている細胞系である。このハイブリドーマ細胞 系は、Ｅ．ｃｏｌｉからの組換えＨＢｅＡｇを前もって接種されたマウスに由来 する脾リンパ球とマウス骨髄腫細胞との融合によって生産された。図面の簡単な説明 図１： Ａ）アボットＨＢｅＡｇＥＩＡ。臨床環境において偶発的にＨＢＶに感染した ドナーから採取された８例の血清（Ｎｏ．１６２、２１６、２５５、３３６、１ ８１、３４３、０９８、２２８）の反応性。サンプルは感染の急性期中に採取さ れた（実施例３）。全サンプルがＨＢｅＡｇ陽性であった。慢性感染に移行した 患者から入手した血清と感染から６ヶ月後（回復）又は９ヶ月後（遅延回復）の 間に回復した患者から入手した血清とを識別することはできなかった。 Ｂ）ＨＢｅ ＭＡＢアッセイ。図１Ａで言及した血清の反応性。全サンプルが ＨＢｅＡｇ陽性であった。慢性感染に移行した患者から入手した血清と感染から ６ヶ月後（回復）又は９ヶ月後（遅延回復）の間に回復した患者から入手した血 清とを識 別することはできなかった。 Ｃ）ＨＢｅ選択反応アッセイ。図１Ａ及び図１Ｂで言及した血清の反応性。感 染後６ヶ月間以内にウイルスを除去した患者から採取した血清（陰性＝Ａ４５０ ｎｍ＜０．２又はＳ／ＣＯ＜０．９）と慢性感染に移行した、又は遅延回復を示 した患者から入手した血清（陽性＝Ａ４５０ｎｍ＞０．３又はＳ／ＣＯ＞２．３ ）とを識別することができた。 図２： Ａ）アボットＨＢｅＡｇＥＩＡ及びＨＢｅ選択反応アッセイにおいて試験した ＨＢＶ感染ドナーからの血清。標準ヒト血清（ＮＨＳ）を陰性対照として使用し た。陽性対照（ＰＳ）は感染の急性期中の患者から入手した。この血清サンプル はどちらのアッセイにおいても陽性であった。血清３４３ｂは感染から４年を経 過したＨＢＶ感染ドナーから入手した。血清１６２ａは６ヶ月以内にウイルスを 除去したドナーから感染の急性期中に入手した。血清１６２ｂは血清１６２ａと 同一ドナーから一次感染から１０ヶ月後のウイルス除去後に入手されている。 Ｂ）図２Ａで言及した陽性対照（ＰＳ）の、標準ヒト血清（ＮＨＳ）、血清３ ４３ｂ、１６２ａ及び１６２ｂとのインキュベ ーション後の反応性。ＮＨＳを除いて、最初のシグナルは上記の血清の１つを添 加後に低下する。 図３：ＨＢｅ ＭＡＢアッセイ及びＨＢｅ選択反応アッセイを使用することに よるＨＢｅ−Ｓタイプ及びＨＢｅ−Ｎタイプの判定。１０００の吸光度に関連付 けた任意単位の総量（１任意単位＝希釈の逆数）を両方のアッセイにより各血清 について測定した（ＡＵ１０００）。ＨＢｅ ＭＡＢアッセイにおいて測定され たＡＵ１０００をＨＢｅ選択反応アッセイによるＡＵ１０００で割る（ｙ−ａｘ ）。比が０．０３未満であればＨＢｅ−Ｓタイプであることを示している。比が ０．１３より上である場合はＨＢｅ−Ｎタイプであることを示している。Ｓ及び Ｎタイプについては完全なＨＢｅＡｇＤＮＡ配列の決定によって確認した。実施例 実施例１ 本実施例では、本発明による抗体類がどのようにして産生させられ、 対応するエピトープがどのようにしてマッピングされたのかを例示する。 マウスモノクローナル抗体ＨＢ．ＯＴ９５Ａ マウスモノクローナル抗体類は、Ｂａｌｂ／ｃマウスに、フ ロイントの完全アジュバントに溶解させた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来組換えＨ ＢｅＡｇ又はＨＢｃＡｇを注射することによって産生させた。２ヶ月後に、マウ スをフロイントの不完全アジュバントに混合した抗原を用いて追加刺激し、これ をさらに２週間後に繰り返し実施した。最高に応答したマウスにＰＢＳ中に溶解 させた組換え抗原の静脈内投与を行った。３日後、脾臓を切除し、脾リンパ球を 、標準方法に従ってポリエチレングリコール１０００を用いて、Ｐ３×６３Ａｇ ８．６．５．３マウス骨髄腫細胞に融合させた。ハイブリドーマ細胞を、ヒト血 清及び／又は組換え抗原を用いて、ＨＢｅＡｇ又はＨＢｃＡｇ特異的抗体の産生 について検査した。反応性クローンを、単個細胞クローニングの技術によって、 １００％クローンへ再クローン化させた。 ヒトモノクローナルＨＢｅ．ＯＴＨｕ０３ 末梢血をヒト慢性ＨＢｓ抗原保有者から採取した。血液サンプル１００ｍｌに １０．９ｍｌのデキストラン（分子量２００，０００）、０．３７ｍｌのＮａＣ ｌ溶液（０．２７ｇ．ｍｌ^-1）及び１ｍｌのヘパリン溶液（５１０ ＩＵ ｍｌ^-1 ）を添加した。この混合液を室温で１時間インキュベートして赤血球を沈殿さ せた。白血球を含有する上層を分離し、２０００Ｎ ｋｇ^-1で１０分間速心した 。細胞ペレットを１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を添加した完全培地 （１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ修正イーグル培地（ＤＭＥＭ））中に再 懸濁させ、冷凍し、液体窒素中で貯蔵した。形質転換反応試験のために、白血球 を解凍し、完全培地を用いて一度洗浄し、２×１０⁶ｃｅｌｌｓ ｍｌ^-1へ再懸 濁させた。マーモセットＢ９５．８細胞系からの上清を含有するエプスタイン− バーウイルス（ＥＢＶ）を添加し、懸濁液を２４ウエル培養皿（Ｃｏｓｔａｒ） 上に配分した。３７℃での１６−２４時間のインキュベーション後、５％ＣＯ₂ 下で１×１０⁸の生存リンパ球を分離し、培地中で１×１０⁴細胞ｍｌ^-1となるよ うに希釈し、支持細胞としてヒト線維芽細胞を含有する１０枚の９６ウエル・ク ラスター皿上に配分した。その後培養を４−６週間インキュベートした。培地は 週２回新鮮なものに取り換えた。顕微鏡的に視認可能な形質転換されたリンパ球 クローンを含有するウエルから、天然ＨＢｅＡｇに対する特異的抗体の存在を試 験するための上清を採取した。陽性成績は７日後に確認された。培養を継続し、 液体窒素中に冷凍保管した。アミド化ペプチド類の合成及び精製 アミノ酸及びペプチド類に対する略語及び記号は下記に示すようなＩＵＰＡＣ −ＩＵＢ合同生化学命名法委員会の勧告に従っている：ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ合同 生化学命名法委員会（ＪＣＢＮ）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８４） ，１３８：９−３７。その他の略語：ＮＭＰ、Ｎ−メチル−ピロリドン；Ｆｍｏ ｃ、Ｎ−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル；ＰＳ、ポリスチレン。 １９８３年にＯｎｏらによって発表されたＨＢｅＡｇ配列に基づいて（ａｄｗ ）完全な遺伝子を含む２５−マーを構築した。下記のペプチド類を入手した： １）Ｈ−ＳＫＬＣＬ ＧＷＬＷＧ ＭＤＩＤＰ ＹＫＥＦＧ ＡＴＶＥＬ−ＮＨ₂ ２）Ｈ−ＬＷＧＭＤ ＩＤＰＹＫ ＥＦＧＡＴ ＶＥＬＬＳ ＦＬＰＳＤ−ＮＨ₂ ３）Ｈ−ＰＹＫＥＦ ＧＡＴＶＥ ＬＬＳＦＬ ＰＳＤＦＦ ＰＳＶＲＤ−ＮＨ₂ ４）Ｈ−ＴＶＥＬＬ ＳＦＬＰＳ ＤＦＦＰＳ ＶＲＤＬＬ ＤＴＡＳＡ−ＮＨ₂ ５）Ｈ−ＬＰＳＤＦ ＦＰＳＶＲ ＤＬＬＤＴ ＡＳＡＬＹ ＲＥＡＬＥ−ＮＨ₂ ６）Ｈ−ＳＶＲＤＬ ＬＤＴＡＳ ＡＬＹＲＥ ＡＬＥＳＰ ＥＨＣＳＰ−ＮＨ₂ ７）Ｈ−ＴＡＳＡＬ ＹＲＥＡＬ ＥＳＰＥＨ ＣＳＰＨＨ ＴＡＬＲＱ−ＮＨ₂ ８）Ｈ−ＥＡＬＥＳ ＰＥＨＣＳ ＰＨＨＴＡ ＬＲＱＡＩ ＬＣＷＧＥ−ＮＨ₂ ９）Ｈ−ＨＣＳＰＨ ＨＴＡＬＲ ＱＡＩＬＣ ＷＧＥＬＭ ＴＬＡＴＷ−ＮＨ₂ １０）Ｈ−ＡＬＲＱＡ ＩＬＣＷＧ ＥＬＭＴＬ ＡＴＷＶＧ ＮＮＬＥＤ−Ｎ Ｈ₂ １１）Ｈ−ＣＷＧＥＬ ＭＴＬＡＴ ＷＶＧＮＮ ＬＥＤＰＡ ＳＲＤＬＶ−Ｎ Ｈ₂ １２）Ｈ−ＬＡＴＷＶ ＧＮＮＬＥ ＤＰＡＳＲ ＤＬＶＶＮ ＹＶＮＴＮ−Ｎ Ｈ₂ １３）Ｈ−ＮＬＥＤＰ ＡＳＲＤＬ ＶＶＮＹＶ ＮＴＮＭＧ ＬＫＩＲＱ−Ｎ Ｈ₂ １４）Ｈ−ＲＤＬＶＶ ＮＹＶＮＴ ＮＭＧＬＫ ＩＲＱＬＬ ＷＦＨＩＳ−ＮＨ₂ １５）Ｈ−ＶＮＴＮＭ ＧＬＫＩＲ ＱＬＬＷＦ ＨＩＳＣＬ ＴＦＧＲＥ−Ｎ Ｈ₂ １６）Ｈ−ＫＩＲＱＬ ＬＷＦＨＩ ＳＣＬＴＦ ＧＲＥＴＶ ＬＥＹＬＶ−Ｎ Ｈ₂ １７）Ｈ−ＦＨＩＳＣ ＬＴＦＧＲ ＥＴＶＬＥ ＹＬＶＳＦ ＧＶＷＩＲ−Ｎ Ｈ₂ １８）Ｈ−ＦＧＲＥＴ ＶＬＥＹＬ ＶＳＦＧＶ ＷＩＲＴＰ ＰＡＹＲＰ−Ｎ Ｈ₂ １９）Ｈ−ＥＹＬＶＳ ＦＧＶＷＩ ＲＴＰＰＡ ＹＲＰＰＮ ＡＰＩＬＳ−Ｎ Ｈ₂ ２０）Ｈ−ＷＩＲＴＰ ＰＡＹＲＰ ＰＮＡＰＩ ＬＳＴＬＰ ＥＴＴＶＶ−Ｎ Ｈ₂ ペプチド類の固相合成は半自動化法で実施した。Ｆｍｏｃアミノ酸誘導体はＢ ａｃｈｅｍ社（ブーベンドルフ、スイス）から入手した。ペプチド類はＦｍｏｃ ／ｔＢｕ化学によってＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ ＲＡＭ Ｆｍｏｃ樹脂（ＲＡＰＰ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ社、チュービンゲン、ドイツ）上で合成した。リンカーは、 自動的にＣ末端がアミド化されたペプチドを産生 するＲｉｎｋ−アミドタイプのものである。ペプチドの固相合成中、アミノ酸側 鎖は酸解離保護基を用いて、すなわちリシンのε−アミノ基はＢｏｃを用いて、 アルギニンのδ−グアニジノ基は２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン− ６−スルホニル（Ｐｍｃ）を用いて、グルタミン酸のγ−カルボキシル基及びア スパラギン酸のβ−カルボキシル基は、ＯｔＢｕを用いて、グルタミン酸のγ− アミド基及びアスパラギンのβ−アミド基はトリチル（Ｔｒｔ）を用いて、ヒス チジン及びシステインはＴｒｔを用いて、セリンのβ−ヒドロキシル基及びトレ オニンはｔＢｕを用いて、そしてチロシンはｔＢｕを用いて、保護した。全反応 物はＮＭＰ中に溶解させた。Ｆｍｏｃ基の開裂は各６分間の連続３サイクルの間 に、ＮＭＰに溶解させた２５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ピペリジンを用いて実施した 。最初のＦｍｏｃアミノ酸誘導体の結合（Ｆｍｏｃ−Ａａａ−ＯＨ、２．５当量 ）は、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ、２．５当量）及び１−ヒドロキ シベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ、２．６当量）を用いてのｉｎ ｓｉｔｕ活性 化により実施した。アシル化反応はブロモフェノールブルーによって監視した（ アシル化反応のエンドポイントは黄色がかった緑色によって指示 される）。アシル化反応後に、ＮＭＰに溶解させた無水酢酸を用いてキャッピン グ・ステップを実施した。完全に保護されたペプチド類を、トリフルオロ酢酸（ ８７．５％、ｖｏｌ／ｖｏｌ）中に溶解させた５％チオアニソール（ｖｏｌ／ｖ ｏｌ）、３％エタンチオール（ｖｏｌ／ｖｏｌ）、２．５％水（ｖｏｌ／ｖｏｌ ）及び２％アニソール（ｖｏｌ／ｖｏｌ）により、窒素下で室温での２時間の反 応の間に、樹脂から開裂させ、その後にジエチルエーテル中に沈殿させた。粗ペ プチド類をジエチルエーテルを用いて２度洗浄し、空気中で乾燥させ、水／アセ トニトリル（３：１）中に溶解させて凍結乾燥させた。 ＨＰＬＣ分析及び精製（必要な場合）はベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）Ｇｏｌ ｄ ＨＰＬＣシステム上で実施した。ＨＰＬＣ分析は、アセトニトリル中に溶解 させた０．１％トリフルオロ酢酸を用いた３分間アイソクラチック溶出を使用し て流速１ｍｌ／ｍｉｎでＲＰ−Ｃ２／Ｃ１８カラム（Ｓｕｐｅｒｐａｃｋｐｒｅ ｐＳ、４×２５０ｍｍ、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製）上で実施し 、その後に水中での１００％から７５％への３０分間直線グラジェントを実施し た。ペプチド類は２０６ｎｍでのＵＶ測定によって検出した。アミド化ペプチド類ＯＴＰ−１４５及びＯＴＰ−１４６の合成及び精製 アミノ酸及びペプチド類に対する略語及び記号は下記に示すようなＩＵＰＡＣ −ＩＵＢ合同生化学命名法委員会の勧告に従っている：ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ合同 生化学命名法委員会（ＪＣＢＮ）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８４） ，１３８：９−３７。その他の略語：ＮＭＰＮＮ−メチル−ピロリドン；Ｆｍｏ ｃ、Ｎ−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル；ＰＳ、ポリスチレン。 ＯＴＰ−１４５の配列：Ｈ−ＮＬＥＤＰＡＳＲＤＬＶＶ ＮＹＶＮＴＮＭＧＬ ＫＩＲＧ−ＮＨ２ ＯＴＰ−１４６の配列：Ｈ−ＮＬＥＤＰＡＳＲＤＬＶＶ ＳＹＶＮＴＮＭＧＬ ＫＩＲＧ−ＮＨ２ これらのペプチド類の合成は、ＵＶモニタリング及びフィードバックオプショ ンを用いる標準ＦａｓｔＭｏｃ ０．２５ｍｍｏｌ方法を用いて、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ(パーキン・エルマー)／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．４３３Ａペプチドシンセサイザー（ペプチド合成機）上で実施した。Ｆ ｍｏｃアミノ酸誘導体はＢａｃｈｅｍ（ブーベンドル フ、スイス）社から入手した。ペプチド類はＦｍｏｃ／ｔＢｕ化学によってＴｅ ｎｔａＧｅｌ Ｓ ＲＡＭ Ｆｍｏｃ樹脂（ＲＡＰＰ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ社、チ ュービンゲン、ドイツ）上で合成した。リンカーは、自動的にＣ末端がアミド化 されたペプチドを産生するＲｉｎｋ−アミドタイプのものである。ペプチドの固 相合成中、アミド酸側鎖は酸解離保護基を用いて、すなわちリシンのε−アミノ 基はＢｏｃを用いて、アルギニンのδ−グアニジノ基は２，２，５，７，８−ペ ンタメチルクロマン−６−スルホニル（Ｐｍｃ）を用いて、グルタミン酸のγ− カルボキシル基及びアスパラギン酸のβ−カルボキシル基はＯｔＢｕを用いて、 グルタミン酸のγ−アミド基及びアスパラギンのβ−アミド基はトリチル（Ｔｒ ｔ）を用いて、ヒスチジン及びシステインはＴｒｔを用いて、セリンのβ−ヒド ロキシル基及びトレオニンはｔＢｕを用いて、そしてチロシンはｔＢｕを用いて 、保護した。全反応物はＮＭＰ中に溶解させた。Ｆｍｏｃ基の開裂は、各１．５ 分間の最低連続２サイクルの間に、ＮＭＰに溶解させた２５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ ）ピペリジンを用いて実施した。最初のＦｍｏｃアミノ酸誘導体の結合（Ｆｍｏ ｃ−Ａａａ−ＯＨ、４当量、１ｍｍｏｌ）は、２−（１Ｈ−ベンゾ トリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフ ルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢ ｔ、４当量、１ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を用 いてのｉｎ ｓｉｔｕ活性化により実施した。各アミノ酸誘導体の結合（最低２ ０分間）後、アシル化反応の完了についての確認は実施しなかった。アシル化反 応後にＮＭＰに溶解させた無水酢酸を用いてキャッピング・ステップを実施した 。完全に保護されたペプチド類は、トリフルオロ酢酸（８７．５％、ｖｏｌ／ｖ ｏｌ）中に溶解させた５％チオアニソール（ｖｏｌ／ｖｏｌ）、３％エタンチオ ール（ｖｏｌ／ｖｏｌ）、２．５％水（ｖｏｌ／ｖｏｌ）、及び２％アニソール （ｖｏｌ／ｖｏｌ）による窒素下で室温での２時間の反応の間に樹脂から開裂さ せ、その後にジエチルエーテル中に沈殿させた。粗ペプチド類をジエチルエーテ ルを用いて２度洗浄し、空気中で乾燥させ、水／アセトニトリル（３：１）中に 溶解させて凍結乾燥させた。 ＨＰＬＣ分析及び精製（必要な場合）はベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）Ｇｏｌ ｄ ＨＰＬＣシステム上で実施した。ＨＰＬＣ分析は、アセトニトリル中に溶解 させた０．１％トリフル オロ酢酸を用いての３分間アイソクラチック溶出を使用して流速１ｍｌ／ｍｉｎ でＲＰ−Ｃ２／Ｃ１８カラム（Ｓｕｐｅｒｐａｃｋ ｐｒｅｐＳ、４×２５０ｍ ｍ、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製）上で実施し、その後に水中での １００％から７５％への３０分間の直線グラジエントを実施した。ペプチド類は ２０６ｎｍでのＵＶ測定によって検出した。 ＨＢ．ＯＴ９５Ａのエピトープ・マッピング ペプチド類をＤＭＳＯ（最小濃度０．５ｍｇ／ｍｌ）中に溶解させ、０．０５ Ｍ Ｎａ₂ＣＯ₃（ｐＨ９．６）中に希釈させ、最終濃度を５μｇｒ／ｍｌとした 。希釈したペプチド類を室温で一晩かけてマイクロタイタープレート（９６ウエ ル）に被覆した。各ウエルは０．２％カゼインを含有する０．０５ＭＴＲＩＳ／ ＨＣＬを用いて３０分間で後被覆した。ＭＡＢ ＨＶ．ＯＴ９５ＡをｐＨ７．４ のＰＢＳ中に溶解させた２０％標準ヤギ血清及び１％トリトン中に希釈させた。 １：５００から１：１６，０００の間の一連の希釈液は１ウエル当たりに各希釈 サンプル１００μｌを添加することによって試験した。３７℃で１時間のインキ ュベーション後に、４回の充分な洗浄ステップ後にサンプルをウサギ抗マウス複 合体（ＤＡＫＯ Ｐ ０２６０）と置換した。複合体を上記と同様に１：１０００に希釈した。このペ プチドの反応性を可視化するためにはＯｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ Ｕｎｉ Ｆｏｒｍ ｒｅａｄｙ−ｆｏｒ−ｕｓｅ ＴＭＢ基質を使用した。２０分後、１ Ｍ Ｈ₂ＳＯ₄を用いて反応を終了させ、吸光度を４５０ｎｍで測定した。 試験成績は、ＨＢ．ＯＴ９５Ａがペプチド１２及び１３に対して高親和性を示 すことを示した（どちらの場合においてもＳ／ＣＯ比が３０）。ペプチド１４に ついてはＳ／ＣＯ比１６が入手された。その他の全てのペプチド類は１未満のＳ ／ＣＯ比を示した。これらの所見から、ＨＢ．ＯＴ９５Ａのエピトープは配列Ｌ ＡＴＷＶ ＧＮＮＬＥ ＤＰＡＳＲ ＤＬＶＶＮ ＶＶＮＴＮ ＴＮＭＧＬ Ｋ ＩＲＱＲの近辺に位置すると結論された。この配列はＳａｌｆｅｌｄらによって 記載されたＨＢｅ１エピトープを含有している。 同一実験においてペプチド類ＯＴＰ−１４５、ＯＴＰ−１４６及びペプチド１ ３を同時に試験した。ペプチドＯＴＰ−１４５（アミノ末端アミノ酸＝グリシン ）及びペプチド１３（アミノ末端アミノ酸＝グルタミン）はＨＢ．ＯＴ９５Ａと の反応性に おける相違を示さなかった。従って、このペプチドのアミノ末端アミノ酸はＨＢ ．ＯＴ９５Ａとの反応性について不可欠ではなく、Ｑ又はＧに取り換えることが できると結諭しなければならない。これとは反対に、ペプチドＯＴＰ−１４５及 びＯＴＰ−１４６を用いたときには反応性における重度の相違が観察された（Ｈ Ｂ．ＯＴ９５Ａ濃度１：４０００；ＯＴＰ−１４５ Ｓ／ＣＯ比１４；ＯＴＰ− １４６ Ｓ／ＣＯ比５．５）。そこでアミノ酸９７（Ｓ又はＮ）はこのペプチド の反応性に相当に大きく影響を与えると結論された。ＨＢ．ＯＴ９５Ａは第９７ 位にＳを含有するペプチドＯＴＰ−１４６に対して低親和性を示す。実施例２： 本実施例は、実施例１で述べたようにして生成された抗体に基づき、「ＨＢｅ 選択アッセイ」と称される免疫アッセイをどのようにして構築したかを例示する ものである。サンプルがＨＢｅＡｇ陽性であることを確認するための第二のアッ セイを構築した（ＨＢｅ ＭＡＢアッセイと称する）。ＨＢｅ選択アッセイ 本アッセイは２つのモノクローナル抗体に基づく。ＭＡＢ ＨＢｅ．ＯＴＨｕ０３−ＨＲＰ（ＨＲＰ＝ホースラディッシュペルオキシダーゼ ）を１：８０００希釈で複合体として使用する。ＳＰＤＰ結合手法（ファルマシ ア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））に従ってＨＲＰをＩｇＧに結合する。簡単に述べ ると、ＰＤ−１０クロマトグラフィー（ファルマシア社）を用いてＨＢｅ．ＯＴ Ｈｕ０３を脱塩した。脱塩したＭＡＢＨＢｅ．ＯＴＨｕ０３に０．０４０Ｍ Ｓ ＰＤＰ（エタノールで希釈）を加えて（モル比 ＭＡＢ−ＩｇＧ：ＳＰＤＰ＝１ ：１３）ＭＡＢ−ＰＤＰを調製した。３０分後、混合物を上述したように脱塩し た。ＨＲＰに０．０４０Ｍ ＳＰＤＰを加えて（モル比 ＳＰＤＰ：ＨＲＰ＝１ ．６：１）ＨＲＰ−ＰＤＰを調製し、３０分間インキュベートした後脱塩した。 ＨＲＰ−ＰＤＰ、１Ｍ ＨＡＣ ｐＨ４．３および１．６Ｍ ＤＴＴを２５：２ ．５：１の割合で加えてＨＲＰ−ＳＨを調製した。１５分間インキュベートした 後、混合物を上述したように脱塩した。ＩｇＧ−ＰＤＰとＨＲＰ−ＳＨを１３． ４：１ｍｏｌ／ｍｏｌの割合で混合して、２つの成分を結合させ、ＡＴで３０分 間インキュベートした後、２−８℃で一晩インキュベートした。複合体を必要な 時まで−２０℃で保存した。 マウスＭＡＢ ＨＢ．ＯＴ９５Ａ（セレクター）を固相に被覆する。簡単に述 べると、被覆緩衝液（０．０５Ｍ ＮａＨＣＯ₃ ｐＨ９．６）中でＨＢ．ＯＴ ９５Ａを最終濃度４０μｇ／ｍｌに希釈する。混合物をＡＴで固相と共に一晩イ ンキュベートする（マイクロタイタープレートＧｒｅｉｎｅｒ９６ウエル）（１ ３５μｌ／ウエル）。インキュベーション後、ＭＡＢ溶液を同じ容量の緩衝液（ ０．２Ｍトリス／ＨＣｌ、０．２Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％ツイーン２０ ｐＨ ７．４）に置き換えて、１０分間インキュベートした。次に緩衝液を、ツイーン ２０を除いた前記の緩衝液、０．２Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７．４を含む０．２Ｍ トリス／ＨＣｌ緩衝液、および０．０５Ｍ トリス／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．４で 順次置き換えた。最後に、窒素ガスを用いてプレートを乾燥する。２４時間後、 プレートを小袋に入れて４℃で保存した。 標準的な手法でＥＩＡを実施した。簡単に述べると、サンプル１００μｌを３ ７℃で１時間インキュベートし、その後ＰＢＳ−ツイーン ｐＨ７．４を用いて ４回の洗浄段階に供した。洗浄後、複合体１００μｌ（ＰＢＳ ｐＨ７．４中希 釈用２０％ヤギ血清および１％トリトンＸ１００）を加え、上述したよう にインキュベートして取り出す。その後、ＴＭＢの既製基質（Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ、ユニフォームＩＩ（ＵｎｉＦｏｒｍ ＩＩ）基質）１００μｌ を加えて室温で３０分間インキュベートする。１Ｍ硫酸（Ｈ₂ＳＯ₄）を用いて反 応を停止させる。４５０ｎｍで吸光度を測定する。ＨＢｅ ＭＡＢアッセイ このアッセイは２つのモノクローナル抗体に基づく。ＨＢｅ選択アッセイにお けるように、ＭＡＢ ＨＢｅＯＴ．Ｈｕ０３−ＨＲＰを１：８０００の希釈で複 合体として使用する。ソリン社（ＳｏｒｉｎのＭＡＢ３６４Ｃ８を固相に被覆す る（５μｇ／ｍｌ）。ソリン・ビオメディカ社（Ｓｏｒｉｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃ ａ）（イタリア）からモノクローナル３６４Ｃ８を直接入手し、実際に使用した 。選択アッセイの特異性が、複合体中に使用したモノクローナルではなく、ＨＢ ＯＴ９５Ａモノクローナル抗体によるものであることを保証するために、アッセ イがＨＢｅＯＴ．Ｈｕ０３−ＨＲＰ複合体を含む必要があったので、このアッセ イを構築した。ソリン社のモノクローナルの選択は、この特定目的のためのアッ セイの性能にとって不可欠ではない。このモノクローナルは、ＨＢｅＡｇ複合体 を認識する 他のどのような抗ＨＢｅＡｇモノクローナル抗体によっても置き換えることがで きる。 上述したように標準的な手法に従ってＥＩＡを実施する。実施例３： この実施例は、ＨＢｅ選択アッセイおよびＨＢｅ ＭＡＢアッセイを用いて、 どのようにしてＨＢｅＡｇ陽性サンプルを試験するかを述べるものである。その 結果から、ＨＢｅ選択アッセイを用いると、感染の急性期に感染の臨床的結果が 予測できると結論することができる。ＨＢｅＡｇ陽性血清 １９８７年１１月に、女性のグループが臨床環境において偶然にＨＢＶウイル スに感染した。約４ヵ月後、感染は臨床的に明白になり、最初の血液サンプルを 採取した。合計８名の女性を試験に登録した。ＨＢｅ領域の配列分析により、Ｈ ＢｅＡｇがすべての症例において同じであることを明らかにした。そのウイルス は、ＨＢｅＡｇの９７位にセリン（Ｓ）残基を持つＨＢｅＡｇをコードしていた 。ＨＢｓＡｇサブタイプ（ａｙｗ２）を定義するために、ＨＢｓＡｇの選択ゲノ ミック領域を増幅し、ノーダーら（Ｎｏｒｄｅｒら）、１９９２年（Ｊ．Ｇｅｎ ． Ｖｉｒｏｌ．７３：３１４１−３１４５）に従って配列決定した。ＨＢｅＡｇに 関する配列分析は以下に述べるようにして実施した。ＨＢｅＰＣＲ断片の配列決定 すべての血液サンプルから、完全なＨＢｅ配列の決定によってウイルス株およ び／あるいはＨＢｅの異質性について分析した。ブームのプロトコール（Ｂｏｏ ｍら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２８、４９５−５０３、１９９０） に従ってＤＮＡを単離した。簡単に述べると、溶解緩衝液９容に血清１容を加え た（各々２２５μｌと２５μｌ）。この混合物に、シリカ懸濁液７０μｌを加え た。この溶液を室温で１０分間インキュベートし、一様に渦動撹拌した。インキ ュベーション後、シリカを最高速度で少なくとも１５秒間遠心分離にかけて回転 沈澱させた。上清を取り除いた。ペレットをＬ２洗浄緩衝液（０．０５Ｍトリス ／ＨＣｌ ｐＨ６．４、４．５Ｍ ＧｕＳＣＨ）１ｍｌ中に溶解した。シリカを 再び回転沈澱させ、ペレットをＬ２洗浄緩衝液１ｍｌでもう一度洗浄した。上清 を取り除いた後、ペレットを７０％エタノールで２回洗浄し、アセトンでもう一 度洗浄した（前の段階と同様にして）。ペレットを５６℃ の加熱台で１０分間乾燥させた。水１００μｌを加えて核酸を溶出し、５６℃で １０分間インキュベートした（５分後に１回渦動撹拌）。１０，０００ｇで２分 間遠心分離にかけた後、＋／−８０μｌの核酸溶液を新しいエッペンドルフ試験 管に移した。さらにもう一度遠心分離の段階を経た後、すべてのシリカを除去す るため、＋／−７０μｌの核酸溶液を新しい試験管に移し、−２０℃で保存した 。 通常のＰＣＲプロトコールに従ってＰＣＲを実施した（総容量５０μｌ）。Ｄ ＮＡの投入量は分離した分画２μｌであった。ＰＣＲ後に生成物が得られない場 合は、より高いＤＮＡ投入量でもう一度ＰＣＲを実施した。ＰＣＲのために使用 したプライマーは、Ｍ１３の前向き配列あるいはＭ１３の逆向き配列で延長した 特異的ＨＢｅ配列の既存プライマーであった。 ４）プライマー配列： ＨＢｅ Ｍ１３の前向き５’ＣＧＡ ＣＧＴ ＴＧＴ ＡＡＡ ＡＣＧ ＧＣＣ ＡＧＴ ＡＧＧ ＡＧＧ ＣＴＧ ＴＡＧ ＧＣＡ ＴＡＡ ＡＴ３’ ＨＢｅ Ｍ１３の逆向き５’ＣＡＧ ＧＡＡ ＡＣＡ ＧＣＴ ＡＴＧ ＡＣＣ ＴＴＣ ＴＧＣ ＧＡＣ ＧＣＧ ＧＣＧ ＡＴＴ ＧＡ３’ ＰＣＲが完了した後、生成物２μｌを２％ＴＡＥアガロースゲルで定量的に検 討した。総産物（５０μｌ）を２％アガロースゲル上に置いた。適当な（ｒｉｇ ｈｔ）断片（６９８塩基対）を切り出し、キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ）からのキ エックス（Ｑｉａｅｘ）プロトコールに従って精製した。精製後、精製断片の１ ／１０を２％アガロースゲル上に置いて精製レベルを調べた。精製が正しく行わ れていれば、配列を決定した。 セキサーム（Ｓｅｑｕｉｔｈｅｒｍ）・ロング・リード・サイクル配列決定キ ット（エピセンター・テクノロジーズ社（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌ ｏｇｉｅｓ,Ｍａｄｉｓｏｎ,ＵＳＡ）に従って配列分析を実施した。約３００〜 ５００μｇの精製ＰＣＲ断片をＤＮＡ投入量として使用した。配列分析に使用し たプライマーは前向きＭ１３と逆向きＭ１３であった。反応は、標準的なプロト コールに従ってＡ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシーケンサー（ファルマシア・バイオテック 社）で実施した。結果 結果は、感染の急性期には、アボット社のＨＢｅＡｇ ＥＩＡ、オルガノン・ テクニカ社のヘパノスティカＨＢｅＡｇ／抗ＨＢｅ、 ならびにすべての形態のＨＢｅＡｇの検出に適した、新しく開発されたＭＡＢ ＨＢｅアッセイにおいて、すべてのサンプルが陽性であることを示した。結果を 図１ＡおよびＢに示す。ＨＢｅＡｇ選択アッセイを使用すると異なる結果が得ら れた。感染後６ヵ月以内にウイルスを除去した患者１６２、２１６、２５５およ び３３６からの血清は陰性のままであったのに対し、慢性的な感染に至った患者 ３４３、０９８および２２８からの血清は陽性であった。抗ＨＢｅに対して遅延 血清転換（９ヵ月以上あと）を示した患者からの血清１８１も選択アッセイで陽 性であった（図１Ｃ参照）。この結果は、ＨＢＶ感染の急性期に、選択アッセイ は、慢性感染に至る患者あるいは抗ＨＢｅに対する遅延血清転換を発現する患者 と、感染後６ヵ月以内に抗ＨＢｅ血清転換を示す患者を識別できることを示して いる。この識別は、標準アッセイに従ってすべての血清において明らかであるＨ ＢｅＡｇの免疫反応性の変動に基づく。全症例においてＨＢＶ．ＨＢｅＡｇは同 じ配列を持つことが示されているので、臨床経過の差をウイルスの変動に関連づ けることはできない。実施例４： この実施例は、阻害アッセイを用いて、ＨＢｅ選択アッセイでは陰性で、別の ＨＢｅＡｇアッセイでは陽性であった被検サンプル中に、ＨＢ．ＯＴ９５Ａのエ ピトープを覆うことができる生体分子が存在することをどのようにして確認した かを示す。阻害アッセイ 研究対象の全女性からのＨＢＶ ＨＢｅ遺伝子の配列決定により、それらが同 じウイルス株に感染していたことが明らかになった。ＨＢｅ配列から感染の経過 中配列の変化がなかったことがわかった。それ故、ＨＢｅＡｇの免疫反応性の変 動はＨＢｅＡｇ自体の変動によって生じたものではありえなかった。血清中に存 在する１またはそれ以上の宿主由来の因子が重要な役割を果たしているに違いな いことが示唆された。これを阻害実験によって検討した。 患者Ｎｏ．３４３からの血清を感染の急性期に採取した（図２Ａ参照）。この サンプルを陽性対照（ＰＳ）として使用した。最初に、正常ヒト血清を用いてＰ Ｓを２／３倍に希釈した。その後、異なる血清、３４３ｂ、１６２ａ／ｂおよび 陽性対照をＮＨＳで１：１希釈し、アボット社のＨＢｅＥＩＡとＨＢｅ選択アッ セイで測定した。結果を表２Ａに示す。血清３４３ｂ、 １６２ａおよびＰＳがアボットＨＢｅＡｇアッセイではＨＢｅＡｇ陽性とスクリ ーニングされたが、ＰＳだけが選択アッセイでも陽性であった。１６２ｂと正常 ヒト血清のサンプルはどちらのアッセイにおいても陰性であった。サンプル３４ ３ｂとＰＳは同じ患者から得た。ＰＳはＨＢＶ感染の急性期に採取したのに対し 、血清３４３ｂは感染後４年間の慢性期に採取したものであった。血清１６２ａ はＨＢＶ感染の急性期に患者から採取したが、患者１６２は６ヵ月以内にウイル スを除去した。血清１６２ｂは、回復後、一次感染から１０ヵ月目に入手した。 第二段階として、陽性対照６０μｌ（２／３希釈）に種々の血清６０μｌ（１ ００％）を加えた。混合物を室温で８時間インキュベートし、その後選択アッセ イにおいてＨＢｅＡｇを検査した。結果（図２Ｂ）は、陽性対照は正常ヒト血清 とのインキュベーションすると高い吸光度を示したが、代わりに選択アッセイで の陰性血清（生体分子が存在するＨＢｅＡｇに結合していたことを示す）あるい はアボット抗ＨＢｅアッセイで抗ＨＢｅ陽性の血清を使用した場合シグナルは低 下した。これらの結果は、アボットＨＢｅＡｇ ＥＩＡあるいはＨＢｅ ＭＡＢ アッセイでは陽性であるがＨＢｅ選択アッセイでは陰性の血清 は、ＨＢ．ＯＴ９５Ａのエピトープをブロックすることができる生体物質を含む ことを明確に示した。１６２ｂのような抗ＨＢｅ陽性血清についても同じことが 結論されるはずである。実施例５： この実施例は、アボットＨＢｅＡｇ ＥＩＡではＨＢｅＡｇ陽性であるが選択 アッセイでは陰性の血清が、ＨＢｅＡｇと生体分子の複合体を含むこと、ならび にこれらの生体分子はおそらくＩｇＧ型の抗ＨＢｅＡｇ抗体であることを示すも のである。 ＨＢｅＡｇ陽性血清からのＩｇＧとＩｇＭ分子を、従来の手法に従ってタンパ ク質Ａクロマトグラフィーを用いて精製した。溶出分画中のＨＢｅＡｇをオルガ ノン・テクニカ社（Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ）のヘパノステイカ（Ｈｅ ｐａｎｏｓｔｉｋａ）ＨＢｅＡｇ／抗ＨＢｅアッセイを用いて定量した。 つづいて、適当なＥＩＡアッセイを用いてＨＢｅＡｇに結合したＩｇＧとＩｇ Ｍ分子を検出した。このアッセイでは、ソリン社（Ｓｏｒｉｎ）から入手したモ ノクローナル３６４Ｃ８を固相に被覆した。ＨＢｅＡｇ−ＩｇＧ複合ＨＢｅＡｇ 陽性分画を１／３０あるいは１／１００倍に希釈し（希釈媒質はＰＢＳ中２０％ 正常ヤギ血清（７．２）と１％トリトン−Ｘ１００）、 サンプル１００μｌを固相と接触させた。マウス抗ヒトＩｇＧあるいはＩｇＭ ＨＲＰ複合体を第二抗体として使用した。２番目の実験では、異なるＨＢＶ感染 ドナーからの種々の希釈していない血清を、前述の精製段階を経ずに個々にＥＩ Ａで検査した。 ２つの実験の結果は、アボット社あるいはオルガノン・テクニカ社のＨＢｅＡ ｇ ＥＩＡで陽性であるが選択アッセイでは陰性の血清は、常に抗ＨＢｅに結合 したＨＢｅＡｇを含むことを示唆した。ＨＢｅＡｇに結合した抗ＨＢｅはすべて ＩｇＧサブタイプであることが認められた。実施例６： 本実施例は、ＨＢｅＡｇ複合体から得た生体分子（抗ＨＢｅ抗体）が選択アッ セイにおいてＨＢｅＡｇの反応性を阻害しうることを例証する。抗ＨＢｅ抗体の精製 ＨＢｅＡｇを親和性クロマトグラフィーによって精製した。ＭＡＢソリン３６ ４Ｃ８（セファロース５ｍｇ／ｍｌ）をファルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ） が述べている方法に従って（「親和性クロマトグラフィーの原理と方法：リガン ドをＣＮ Ｂｒ活性化セファロース４Ｂに結合するための方法」）ＣＮＢｒ−セファロース ４Ｂ（ファルマシア社）に結合させた。ＨＢｅＡｇ陽性血清（オルガノン・テク ニカ社（Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ）のヘパノスティカＨＢｅＡｇ／抗Ｈ Ｂｅアッセイ（陽性）および選択アッセイ（陰性））２０ｍｌを、ＭＡＢソリン ３６４Ｃ８を含むセファロース１ｍｌに加えてＨＢｅＡｇを精製した。混合物を 回転下に４℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、結合していな い分画をゲル物質から分離し、ＰＢＳ／ツイーンｐＨ７．２洗浄緩衝液（オルガ ノン・テクニカ社、ＰＢＳ洗浄緩衝液）を用いてゲル物質を洗浄した。５Ｍ Ｎ ａＳＣＮ（バッチワイズ５分 ＡＴ）を使用して結合分画を溶出した。溶出分画 をゲル濾過（セファデックスＧ７５ ０．５×１４ｃｍ）によってさらに精製し た。合計０．５ｍｌの溶出分画をＴＮＥ緩衝液（ｐＨ７．４、０．１Ｍトリス／ ＨＣｌ、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍ ＥＤＴＡ）を用いて精製した。流量は １ｍｌ／分であった。分画を０．５ｍｌの間隔で収集した。溶出した最初のタン パク質を含む３番目の０．５ｍｌ分画（分画３）をその後の実験に使用した。阻害実験 分画３を正常ヒト血清中で希釈するか（１：１０）、あるいはＨＢｅ選択アッ セイでＨＢｅＡｇ陽性のヒト血清（例えば血清ｎｒ３４３、実施例３参照）また は正常ヒト血清と直接１：１で混合した（陽性対照）。混合物を環境温度で一晩 インキュベートし、上述したように選択アッセイで試験した。実験結果 結果は、分画３とのインキュベーションにより、選択アッセイにおいてＨＢｅ Ａｇ陽性血清のシグナルが低下することを示した。これは正常ヒト血清を使用し た陽性対照とは異なっていた。分画３を事前の希釈段階なしで使用した場合には 合計１５．３％の阻害が得られた。分画３をＨＢｅＡｇ陽性血清とのインキュベ ーション前に濃縮すれば、より高い阻害が予想できる。 この結果は、分画３が選択アッセイにおいてＨＢｅＡｇシグナルを低下させる ことができる生体分子を含むことを示した。これらの生体分子は、種々のＨＢｅ ＡｇアッセイではＨＢｅＡｇ陽性であるがＨＢｅ選択アッセイでは陰性のヒト血 清中に自然に発現するＨＢｅＡｇ複合体から誘導される。明らかに、生体分子は 部分的精製後もエピトープマスキングの能力を保持して いる。実施例７： この実施例は、どのようにしてＮａＳＣＮを用いてＨＢｅＡｇ複合体を解離す ることができるかを示す。 方法 様々なＨＢｅＡｇ陽性血清（ＨＢｅ ＭＡＢアッセイ）をＨＢＶ感染患者から 採取した。血清を５Ｍ ＮａＳＣＮあるいはＰＢＳ ｐＨ７．２で希釈した。正 常ヒト血清を陰性対照として使用した。血清を混合し、環境温度で１時間あるい は４℃で一晩、振とう装置でインキュベートした。インキュベーション後、正常 ヒト血清を用いて血清を希釈した（１：５、１：２０、１：３０および１：１０ ０）。ＨＢｅ選択アッセイを使用して、ＨＢｅ反応性に関して血清を試験した。 精製したＨＢｅＡｇ複合体を用いて同様の実験を実施した。ＨＢｅＡｇ複合体 を実施例５で述べたように精製した。精製していない血清を陽性対照として使用 した。精製後、溶出分画をＮａＳＣＮあるいはＰＢＳ ｐＨ７．２で希釈し（１ ：１）、ＨＢｅ選択アッセイにおいて試験した（１：５０）。正常ヒト血清を希 釈液として使用した。開始物質と非結合分画を同じよ うに処理した。結果 結果は、ＨＢｅ選択アッセイにおいて中等度から高度に陽性（１：２０希釈で １０００Ａ４５０ｎｍからのシグナル）である血清では、ＮａＳＣＮを加えると １：５の希釈で最初のシグナルがわずかに低下した。しかし、１：１０以上の希 釈では、ＰＢＳあるいはＮａＳＣＮ処理の間で差を認めなかった。最初にＨＢｅ 選択アッセイで軽度に陽性であった血清では、血清をＮａＳＣＮと共にインキュ ベートするとＨＢｅシグナルが大きく上昇した。この作用は１：１００の希釈で も認められた。選択アッセイでは完全に陰性で、ＨＢｅ ＭＡＢアッセイでは軽 度に陽性であった血清は、ＮａＳＣＮによる処理後も陰性のままであった。この 作用はおそらくアッセイの感受性によって生じたものであろう。 精製後、ＨＢｅＡｇ複合体がＨＢｅ ＭＡＢアッセイを用いて溶出分画中で同 定できることが認められた。これらの複合体が、ＰＢＳによる希釈後はＨＢｅ選 択アッセイで陰性のままであるが、ＮａＳＣＮによる処理後には陽性になること も認められた。結論として、ＮａＳＣＮによるＨＢｅＡｇ複合体の解離 はＨＢｅ選択アッセイにおけるＨＢｅＡｇエピトープの認識を生じさせる。実施例８： この実施例は、ＨＢｅ Ｓ型とＨＢｅ Ｎ型を識別するために使用することが できる新しい方法を示す。生物学的物質 合計２２の血清をＨＢＶ感染患者から入手し、そのうち１９は感染の慢性期、 ３は急性期に採集した。すべての血清が、アボット社のＨＢｅＡｇ ＩＭＸアッ セイおよびオルガノン・テクニカ社のＨＢｅ ＭＡＢアッセイでＨＢｅＡｇ陽性 であった。配列決定 完全なＨＢｅＡｇ配列を実施例３で述べたようにして決定した。血清をアミノ 酸９７（セリン（Ｓ）あるいはアスパラギン（Ｎ））に基づいてＨＢｅ Ｓ型と Ｎ型に分類した。二者択一サブタイピングのための方法 各々のＨＢｅＡｇ陽性血清を、オルガノン・テクニカ社のＨＢｅ ＭＡＢアッ セイとオルガノン・テクニカ社のＨＢｅ選択アッセイにおいて広汎な希釈シリー ズ（１／３、１／５、１／１０から１／１０００まで）で試験した。正常ヒト血 清（両 方のアッセイでＨＢｅＡｇ陰性）を希釈液として使用した。どちらのアッセイも 同じ条件下で実施した。 累積、用量反応あるいはＳ字形のような様々なモデルを用いて、各希釈曲線の 最適のものを決定し、その後の計算に使用した。１０００の吸光度に関連する任 意ユニットの総量（１任意ユニット＝希釈の逆数）を各々の血清について測定し た（ＡＵ１０００）。その後、各血清について、オルガノン・テクニカ社のＨＢ ｅ ＭＡＢアッセイで測定したＡＵ１０００を、オルガノン・テクニカ社のＨＢ ｅ選択アッセイで測定したＡＵ１０００で割った。結果 我々の実験から、この方法が、ＨＢｅＡｇの配列決定を行わずにＨＢｅ Ｓ型 とＨＢｅ Ｎ型を識別するのに適していると結論することができた（図３）。我 々の結果は、０．０３未満の比率はＨＢｅ Ｓ型を意味し、一方０．１３を越え る比率はＨＢｅ Ｎ型と結びつくことを示唆した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ヘエイテインク，ルドルフ・アルノルド オランダ国、エヌ・エル―4285・ウエー・ イエー・ウードリツヘム、アウデンデイ ク・67

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．完全なＨＢｅＡｇ配列のアミノ酸８５−１０９を含む領域中に存在するＨＢ ｅＡｇ上のエピトープをマスキングすることができる生体分子とＨＢｅＡｇとを 含む循環複合体の存在を、急性期のサンプルにおいて検出することによる、急性 Ｂ型肝炎感染の患者での感染の経過を予測するための方法。 ２．該サンプルを、ＥＣＡＡＣにＮｏ．９５０９０６１１として寄託されている 細胞系が産生する抗体と同じＨＢｅＡｇに対する免疫反応性を有する抗体に接触 させることを特徴とする、請求項１に記載の方法。 ３．該抗体が、ＥＣＡＡＣにＮｏ．９５０９０６１１として寄託されている細胞 系によって産生されるモノクローナル抗体である請求項１または２に記載の方法 。 ４．該抗体が固相を被覆していることを特徴とする、請求項１ないし３のいずれ かに記載の方法。 ５．固相上の抗体によって認識されるエピトープを認識しないＨＢｅＡｇに対す る標識抗体と固相を接触させることにより、固相上に形成された免疫複合体を検 出することを特徴とする、 請求項４に記載の方法。 ６．前記の標識抗体がヒトモノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項 ５に記載の方法。 ７．該サンプル中に存在するＨＢｅＡｇを含む複合体を解離させ、それによって サンプル中に存在する生体分子を遊離させ、該生体分子に特異的に結合すること ができるペプチドあるいは組換えタンパク質あるいは他の何らかの物質にサンプ ルを接触させて、結合生体分子を検出することを特徴とする、請求項１に記載の 方法。 ８．配列番号１あるいは配列番号２に記述されているアミノ酸配列の少なくとも 一部を含むペプチドを使用することを特徴とする、請求項７に記載の方法。 ９．急性ＨＢＶ感染の患者での感染経過を予測するための方法において、ＨＢｅ Ａｇに結合した特異的生体分子を含む循環複合体の検出のためのアッセイの使用 。 １０．−Ｎｏ．９５０９０６１１としてＥＣＡＣＣに寄託されている細胞系から 誘導されるモノクローナル抗体と同じＨＢｅＡｇに対する反応性を有する第一抗 体で被覆した固相、 −第一抗体とサンプル中に存在するＨＢｅＡｇの間で固相上に 形成された免疫複合体と反応することができる第二抗体を含む標識試薬 を含む、急性Ｂ型肝炎感染の経過を予測するための方法において使用することが できる試験キット。 １１．Ｎｏ．９５０９０６１１としてＥＣＡＣＣに寄託されている細胞系から誘 導されるモノクローナル抗体と同じＨＢｅＡｇに対する反応性を有するモノクロ ーナル抗体。 １２．Ｂ型肝炎感染の結果を予測するための方法において、Ｎｏ．９５０９０６ １１としてＥＣＡＣＣに寄託されている細胞系から誘導されるモノクローナル抗 体と同じＨＢｅＡｇに対する反応性を有するモノクローナル抗体の使用。 １３．請求項１１に記載のモノクローナル抗体を産生することができる細胞系。 １４．Ｎｏ．９５０９０６１１としてＥＣＡＣＣに寄託されている細胞系。 １５．（ａ）Ｎｏ．９５０９０６１１としてＥＣＡＣＣに寄託されている細胞系 から誘導されるモノクローナル抗体と同じＨＢｅＡｇに対する反応性を有する抗 体で被覆した固相とＨＢｅＡｇを含むサンプルの一部とを接触させ、固相上に形 成された免 疫複合体を検出し、 （ｂ）Ｓ型のＨＢｅＡｇとＮ型のＨＢｅＡｇとに対して同じ反応性を持つ抗ＨＢ ｅＡｇ抗体で被覆した固相とサンプルの一部を接触させ、 （ｃ）（ａ）と（ｂ）の段階で得られた反応性の割合から、サンプル中に存在す るＢｅ型肝炎抗原がＮ型であるかＳ型であるかを判定する、 段階を含む、Ｓ型のＢｅ型肝炎抗原（ＨＢｅＡｇ）とＮ型のＨＢｅＡｇを識別す るための方法。