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CN111879923A - 一种可消除hama效应的试剂盒 - Google Patents

一种可消除hama效应的试剂盒 Download PDF

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CN111879923A
CN111879923A CN202010787574.3A CN202010787574A CN111879923A CN 111879923 A CN111879923 A CN 111879923A CN 202010787574 A CN202010787574 A CN 202010787574A CN 111879923 A CN111879923 A CN 111879923A
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CN
China
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antibody
kit
humanized
ser
detection
Prior art date
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Application number
CN202010787574.3A
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English (en)
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宁紫妍
朱峰
孙鸿华
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Shenzhen Cologne Biological New Materials Co ltd
Original Assignee
Shenzhen Cologne Biological New Materials Co ltd
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Publication date
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
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    • G—PHYSICS
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Abstract

本发明提供一种可消除HAMA效应的试剂盒，本发明技术方案通过使用抗抗原的人源化抗体以及带有生物催化酶标记的抗人源化抗体的检测抗体，该检测抗体与人源化抗体通用连接，人源化抗体可以消除抗原检测过程中HAMA效应带来的假阳性和假阴性，使用通用检测抗体可以减少人源化抗体的标记，使得该抗原检测试剂盒在针对不同的抗原制备方法更简单，不需要每个人源化抗体都进行标记，只需要使用通用检测抗体进行标记则可以用于所有的抗原检测中。

Description

一种可消除HAMA效应的试剂盒
技术领域
本发明涉及免疫检测领域，特别涉及一种可消除HAMA效应的试剂盒。
背景技术
双抗体夹心法是检测抗原的常用方法，该方法是在固相载体上包被捕获抗体，先捕获样本中的待测抗原，再结合标记抗体，捕获抗体和标记抗体结合不同抗原决定簇，形成“捕获抗体-抗原-标记抗体”的三明治结构。
嗜异性抗体属于免疫球蛋白，存在人血清或血浆中。其能与其他种属抗体(如鼠源抗体)结合，干扰免疫检测系统。人抗动物抗体(Human anti-animal antibodies，HAAA)是最常见的嗜异性抗体。调查发现，人群中HAAA的发生率约达80％，其诱因包括接触动物、接受单克隆抗体治疗等。此外，人抗鼠抗体(Human anti-mouse antibody，HAMA)是最常见的HAAA。在免疫检测中，HAMA与鼠源抗体结合，干扰免疫分析系统，造成实验结果偏差，称为HAMA效应。
以双抗体夹心法为例。正常情况：样本中的抗原分别与两种抗体结合(捕获抗体和标记抗体)，结合在固相上的标记抗体数量与样本中抗原的浓度成正比(图1a)。假阳性：在无抗原存在情况下，HAMA可以桥连捕获抗体和标记抗体，因而增加标记抗体的结合量，造成假阳性(图1b)。假阴性：在抗原存在情况下，HAMA优先与固相抗体结合，产生空间位阻或固相抗体构象改变，使之不能与抗原结合，造成假阴性(图1c)。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种可消除HAMA效应的试剂盒，旨在消除抗原检测过程中的HAMA效应，减少假阳性和假阴性的情况，提高检测准确率，同时使得检测过程更简便。
为实现上述目的，本发明提出的一种可消除HAMA效应的试剂盒，包括第一抗体、第二抗体和第三抗体，所述第一抗体为特异结合抗原的捕获抗体，所述第二抗体为抗所述抗原的人源化抗体，所述第三抗体为抗所述人源化抗体的检测抗体，所述检测抗体标记有生物催化酶。
可选地，所述人源化抗体包括嵌合抗体、CDR抗体、表面重塑抗体、全人源抗体、单链抗体、双链抗体以及上述抗体的衍生物中的任一种。
可选地，所述人源化抗体的重链恒定区氨基酸为人源序列。
可选地，所述检测抗体与所述人源化抗体的重链恒定区结合。
可选地，所述生物催化酶为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。
可选地，还包括多孔板、包被缓冲液、封闭缓冲液、显色底物和终止液。
本发明提出的另一种可消除HAMA效应的试剂盒，包括：抗HBeAg的捕获抗体，抗HBeAg的人源化单抗，标记有生物催化酶的抗人源化单抗抗体，酶标板，包被缓冲液，封闭缓冲液，显色底物，终止液。
可选地，所述人源化单抗的重链恒定区氨基酸序列为SEQ ID NO.1。
可选地，所述人源化单抗的重链恒定区氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
可选地，所述显色底物为四甲基联苯胺或PNPP，所述终止液为1M硫酸。
本发明技术方案通过使用抗抗原的人源化抗体以及带有生物催化酶标记的抗人源化抗体的检测抗体，该检测抗体与人源化抗体通用连接，抗抗原的人源化抗体可以消除抗原检测过程中HAMA效应带来的假阳性和假阴性，使用通用检测抗体可以减少人源化抗体的标记，使得该抗原检测试剂盒在针对不同的抗原制备方法更简单，不需要每个人源化抗体都进行标记，只需要使用通用检测抗体进行标记则可以用于所有的抗原检测中，减少实验步骤，节约成本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1为现有技术的双抗夹心法检测抗原的示意图，其中a为正常情况，b为假阳性情况，c为假阴性情况。
图2为本发明实施例的双抗夹心法检测抗原的示意图，其中a为正常检测情况，b为存在HAMA蛋白时也不会影响抗原检测的情况。
图3为实施例1本发明方法检测反应部分结果图。
图4为对比例1检测反应部分结果图。
图5为对比例2检测反应部分结果图。
图6为对比例3检测反应部分结果图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提出一种可消除HAMA效应的试剂盒，包括第一抗体、第二抗体和第三抗体，所述第一抗体为特异结合抗原的捕获抗体，所述第二抗体为抗所述抗原的人源化抗体，所述第三抗体为抗所述人源化抗体的检测抗体，所述检测抗体标记有生物催化酶。
具体的，所述第一抗体、第二抗体和第三抗体仅用于区分作用，并不指代其顺序。参见图2a，捕获抗体和人源化抗体分别与抗原的不同抗原决定簇结合，该抗原检测试剂盒在使用的时候，先将捕获抗体包被在一固相载体上面，然后将待检测样本与固相载体孵育，使得抗原与捕获抗体先连接，然后再将抗抗原的人源化抗体与连接了捕获抗体和抗原的固相载体进行孵育，使得人源化抗体与抗原结合，最后进行检测抗体的孵育，检测抗体可以与人源化抗体结合，通过检测抗体带有的标记进行显色，从而指示抗原阳性。
本发明技术方案通过使用抗抗原的人源化抗体以及带有生物催化酶标记的抗人源化抗体的检测抗体，参见图2b，由于与抗原结合的是人源化抗体，因而该人源化抗体不会与HAMA蛋白结合，从而即使待检测样本中有HAMA蛋白能够与捕获抗体连接，但是由于其不能与人源化抗体连接，因此无法进行检测抗体的显色，从而避免了假阳性的情况，同时降低了假阴性的情况。该检测抗体与人源化抗体通用连接，抗抗原的人源化抗体可以消除抗原检测过程中HAMA效应带来的假阳性，使用通用检测抗体可以减少人源化抗体的标记，使得该抗原检测试剂盒针对不同的抗原检测制备方法更简单，不需要每个人源化抗体都进行标记，只需要使用通用检测抗体进行标记则可以用于所有的抗原检测中，减少实验步骤，节约成本。
可选地，所述人源化抗体包括嵌合抗体、CDR抗体、表面重塑抗体、全人源抗体、单链抗体、双链抗体以及上述抗体的衍生物中的任一种。
可选地，所述人源化抗体的重链恒定区氨基酸为人源序列。
可选地，所述检测抗体与所述人源化抗体的重链恒定区结合。
可选地，所述生物催化酶为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。
具体的，碱性磷酸酶(Alkaline phospharase,AP)是一种能够在碱性情况下将对应底物去磷酸化的酶。PNPP(p-Nitrophenyl phosphate disodium salt)是常用的碱性磷酸酶底物，当碱性磷酸酶与PNPP反应后，形成黄色水溶性反应产物，在λ＝405nm有光吸收，通过测定反应产物的吸光度来判断反应产物的量，从而得到碱性磷酸酶的量。
具体的，辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)是一种糖蛋白，由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成。四甲基联苯胺是常用的辣根过氧化物酶底物，辣根过氧化物酶与四甲基联苯胺反应生成蓝色沉淀，反应终止后，蓝色沉淀变为黄色沉淀，反应溶液呈黄色，此时可以在λ＝450nm测定吸光度，从而判断反应产物的量，得到辣根过氧化物酶的量。
由于生物催化酶作为检测抗体的标记物，根据生物催化酶的数量可以得知检测抗体的数量，一个检测抗体连接一个抗抗原的人源化抗体，一个人源化抗体连接一个抗原，从而根据生物催化酶的数量可以得到抗原的数量，从而判断抗原的阳性和阴性。
优选地，所述生物催化酶为辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶的比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，因此最常用。
本发明还提供一种在检测抗体偶联辣根过氧化物酶的方法，包括以下步骤：
(1)将需要标记的检测抗体透析到100mM的碳酸盐缓冲液中，透析16h；
(2)活化辣根过氧化物酶，使其氧化；
(3)将透析好的检测抗体和氧化好的HRP按质量比(1:2)混合，然后透析16h；
(4)终止反应：加入4mg NaBH4，静置2h；
(5)收样。
具体的，辣根过氧化物酶的活化步骤具体包括：
称取20mg HRP干粉，溶于1mL ddH2O中，得到HRP溶液；
称取20mg NaIO4，溶于1ml ddH2O中，全部加入HRP溶液中，搅拌反应10min，得HRP混合液；
吸取20μl乙二醇，加入到HRP混合液中，搅拌反应10min，透析16h，得到氧化好的HRP。
具体的，所述收样步骤包括：
在终止反应后的反应液中按照体积比为1:1加入饱和硫酸铵，静置30min；
4℃，12000rpm，离心15min；
弃上清，沉淀用2mL 10mM PBS复溶；
4℃，12000rpm，离心15min，取上清；
-20度保存备用。
可选地，所述可消除HAMA效应的试剂盒还包括多孔板、包被缓冲液、封闭缓冲液、显色底物和终止液。具体的，所述显色底物可以为PNPP或四甲基联苯胺。所述终止液为1M硫酸。
本发明另一方面还提出一种可消除HAMA效应的试剂盒，包括：抗HBeAg的捕获抗体，抗HBeAg的人源化单抗，标记有生物催化酶的抗人源化单抗抗体，酶标板，包被缓冲液，封闭缓冲液，显色底物，终止液。
可以理解的是，该试剂盒的制备方法为分别得到试剂盒的每个组分，进行分装标记，包装即可得到。捕获抗体、人源化单抗以及抗人源化单抗抗体均可以通过购买得到，或者自己制备得到，抗体的制备方法不是本发明的发明点，因此在此不再赘述其制备方法。
具体的，所述人源化单抗的重链恒定区氨基酸序列为SEQ ID NO.1，该抗体是IgG型，所述包被缓冲液为0.01M磷酸盐缓冲液，pH7.0；封闭缓冲液为含0.05％Tween-20的0.01M磷酸盐缓冲液，pH7.0；所述生物催化酶为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶；所述显色底物为四甲基联苯胺或PNPP，所述终止液为1M硫酸。
可选地，所述人源化单抗还可以为IgM型，所述人源化单抗的重链恒定区氨基酸序列可以为SEQ ID NO.2。
下面将结合具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明实施例的抗原检测试剂盒使用的是重链恒定区氨基酸序列为SEQ ID NO.1的IgG型人源化单抗制备得到，实施例和对比例中的检测样本均为50例HBeAg阳性样本和50例HBeAg阴性样本，通过检测结果分析各个试剂盒的检测结果准确性。
实施例1本发明方法试剂盒检测HBeAg
(1)包被。用包被缓冲液稀释抗HBeAg的捕获抗体，加至酶标板，每孔100μL，4℃24h，洗板三次。
(2)封闭。加封闭液，每孔加300μL，37℃，2h，洗板三次。
(3)抗原反应。稀释样本(含待测抗原HBeAg)，加入孔内，每孔100μL，37℃，30min，洗板三次。
(4)人源化抗体反应。稀释抗HBeAg的人源化单抗，加入孔内，每孔100μL，37℃，30min，洗板三次。
(5)标记抗体反应。抗人源化单抗得到抗体(已偶联HRP)稀释成一定倍数，加入孔内，每孔100μL，37℃反应30分钟，洗板三次。
(6)显色。加入四甲基联苯胺显色液，每孔100μL，避光，37℃，10min。
(7)读数。加入终止液，每孔50μL，在450nm下检测吸光度。
对比例1商品化的双抗体夹心试剂盒检测HBeAg
采用上海科华生物工程股份有限公司的乙肝e抗体ELISA检测试剂盒作为实验对照，双抗体夹心法检测HBeAg。抗-HBeAg包被反应板，加入待测样本，同时加入抗-HBeAg-HRP。如待测样本中存在HBeAg时，就与包被抗-HBeAg、抗-HBeAg-HRP结合形成复合物。加入TMB底物产生显色反应，进行读数。
对比例2自制双抗体夹心试剂盒(含阻断剂)检测HBeAg
抗-HBeAg捕获抗体包被反应板，加入已用阻断剂预处理的待测标本，阻断剂是一类添加到体外诊断试剂系统中的物质，能消除或者降低免疫分析中的内源性干扰，提高试剂盒检测系统的灵敏度与精密度。同时加入抗-HBeAg-HRP。如待测样本中存在HBeAg时，就与包被抗-HBeAg、抗-HBeAg-HRP结合形成复合物。加入TMB底物产生显色反应，进行读数。
对比例3自制双抗体夹心试剂盒(不含阻断剂)检测HBeAg
抗-HBeAg捕获抗体包被反应板，加入待测标本，同时加入抗-HBeAg-HRP。如待测样本中存在HBeAg时，就与包被抗-HBeAg、抗-HBeAg-HRP结合形成复合物，加入TMB底物产生显色反应，进行读数。
实验结果
实施例1和对比例1-3检测反应后的反应液分别如图3-6所示，图3-6分别仅示出了其中96个反应孔，使用Thermo Multiskan Sky全波长酶标仪检测，在双波长450/630测定各孔OD值。然后按照如下方法统计每个试剂盒检测50个阳性样本和50个阴性样本的检测结果，以给出的样本阴性或阳性为金标准，统计结果分别填入表1所示的表格中。
计算检测临界值，临界值(C.O.)＝空白对照孔OD×0.5。本次检测，实施例1、对比例1、对比例2、对比例3的空白对照OD值分别是0.05、0.05、0.07、0.07，则其对应的临界值分别是0.025、0.025、0.035、0.035。
样本检测结果的处理。样本OD值S/C.O.≤2.1，为阴性；样本OD值S/C.O.＞2.1，为阳性。
表1.结果统计表
Figure BDA0002621445760000071
Figure BDA0002621445760000081
试剂盒性能计算公式如下。数值越高，代表性能越好。
Figure BDA0002621445760000082
Figure BDA0002621445760000083
Figure BDA0002621445760000084
Figure BDA0002621445760000085
实施例1、对比例1、对比例2和对比例3的检测统计结果分别如表2至表5所示。不同试剂盒的性能比较结果如表6所示。
表2.发明方法(采用人源化单抗)检测结果
Figure BDA0002621445760000086
表3.科华试剂盒检测结果
Figure BDA0002621445760000087
表4.自制试剂盒(含阻断剂)检测结果
Figure BDA0002621445760000088
表5.自制试试剂盒(不含阻断剂)检测结果
Figure BDA0002621445760000091
表6.不同试剂盒/方法性能比较
试剂盒/方法 灵敏度 特异性 阳性符合率 阴性符合率
发明方法(采用人源化单抗) 96.0％ 92.0％ 88.9％ 88.5％
科华试剂盒 94.0％ 88.0％ 83.9％ 83.0％
自制试剂盒(含阻断剂) 90.0％ 80.0％ 75.0％ 72.7％
自制试剂盒(不含阻断剂) 80.0％ 50.0％ 53.3％ 41.7％
检测结果显示，人源化单抗试剂盒的阳性符合率和阴性符合率最高，发生假阳性和假阴性的概率最小，效果最优。
在不含阻断剂情况下，人源化单抗试剂盒消除假阳性和假阴性的效果是双抗夹心法试剂盒的两倍。造成有益效果的主要原因是，人源化单抗可以有效消除HAAA效应。
商品化的科华试剂盒含有阻断剂，可以消除部分HAAA效应，降低假阳性和假阴性的效果仅次于人源化单抗试剂盒。但是科华试剂盒的标记抗体仅能结合HBeAg。当检测其他抗原时，需要重新偶联抗体。而人源化单抗试剂盒采用的标记抗体可以结合人源化抗体，具有通用性，除了可以检测HBeAg，还可以检测HBsAg、HBcAg等。
以上所述仅为本发明的可选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳科隆生物新材料有限公司
<120> 一种可消除HAMA效应的试剂盒
<130> 2020-06-19
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 330
<212> PRT
<213> Hepatitis B virus
<400> 1
Ala Ser Leu Phe Pro Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Leu Pro Ala Leu Phe Pro Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Leu His Gln Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Leu His Gln Lys Ser Cys Asp Lys Leu Phe Pro Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Leu His Gln Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Leu Phe Pro Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Leu Pro Ala Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Leu Pro
260 265 270
Ala Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
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Gln Lys Ser Leu Phe Pro Ser Pro Gly Lys
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<210> 2
<211> 453
<212> PRT
<213> Hepatitis B virus
<400> 2
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Ala Arg Glu Gln Leu Asn Leu Arg Glu Ser Ala Thr Ile Thr Cys Leu
340 345 350
Val Thr Gly Phe Ser Pro Ala Asp Val Phe Val Gln Trp Met Gln Arg
355 360 365
Gly Gln Pro Leu Ser Pro Glu Lys Tyr Val Thr Ser Ala Pro Met Pro
370 375 380
Glu Pro Gln Ala Pro Gly Arg Tyr Phe Ala His Ser Ile Leu Thr Val
385 390 395 400
Ser Glu Glu Glu Trp Asn Thr Gly Glu Thr Tyr Thr Cys Val Val Ala
405 410 415
His Glu Ala Leu Pro Asn Arg Val Thr Glu Arg Thr Val Asp Lys Ser
420 425 430
Thr Gly Lys Pro Thr Leu Tyr Asn Val Ser Leu Val Met Ser Asp Thr
435 440 445
Ala Gly Thr Cys Tyr
450

Claims (10)

1.一种可消除HAMA效应的试剂盒，其特征在于，包括第一抗体、第二抗体和第三抗体，所述第一抗体为特异结合抗原的捕获抗体，所述第二抗体为抗所述抗原的人源化抗体，所述第三抗体为抗所述人源化抗体的检测抗体，所述检测抗体标记有生物催化酶。
2.如权利要求1所述的一种可消除HAMA效应的试剂盒，其特征在于，所述人源化抗体包括嵌合抗体、CDR抗体、表面重塑抗体、全人源抗体、单链抗体、双链抗体以及上述抗体的衍生物中的任一种。
3.如权利要求2所述的一种可消除HAMA效应的试剂盒，其特征在于，所述人源化抗体的重链恒定区氨基酸为人源序列。
4.如权利要求3所述的一种可消除HAMA效应的试剂盒，其特征在于，所述检测抗体与所述人源化抗体的重链恒定区结合。
5.如权利要求1-4任一所述的一种可消除HAMA效应的试剂盒，其特征在于，所述生物催化酶为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。
6.如权利要求5所述的一种可消除HAMA效应的试剂盒，其特征在于，还包括多孔板、包被缓冲液、封闭缓冲液、显色底物和终止液。
7.一种可消除HAMA效应的试剂盒，其特征在于，包括：抗HBeAg的捕获抗体，抗HBeAg的人源化单抗，标记有生物催化酶的抗人源化单抗抗体，酶标板，包被缓冲液，封闭缓冲液，显色底物，终止液。
8.如权利要求7所述的一种可消除HAMA效应的试剂盒，其特征在于，所述人源化单抗的重链恒定区氨基酸序列为SEQ ID NO.1。
9.如权利要求7所述的一种可消除HAMA效应的试剂盒，其特征在于，所述人源化单抗的重链恒定区氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
10.如权利要求7所述的一种可消除HAMA效应的试剂盒，其特征在于，所述显色底物为四甲基联苯胺或PNPP，所述终止液为1M硫酸。
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