JP2000506394A - 安定化されたタンパク質性プロテアーゼインヒビターおよびその変種 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、タンパク質プロテアーゼインヒビターおよびそれらの変種と、このような変種をコードする遺伝子に関する。本発明はこのような変種を含んでなる組成物にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】 安定化されたタンパク質性プロテアーゼインヒビターおよびその変種 技術分野 本発明は、クリーニング組成物で酵素との併用に有用なタンパク質またはタン パク質性プロテアーゼインヒビターとその新規変種に関する。本発明は洗剤中で より大きなタンパク質分解安定性をインヒビター変種に付与している。本発明は 、これらのインヒビターを含んだ様々なクリーニング組成物と、それらをコード する遺伝子にも関する。 背景 酵素は最大クラスの天然タンパク質を構成している。クリーニング組成物は、 汚れ除去を行うために、多くの異なる酵素を含有している。例えば、液体洗濯洗 剤はプロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、ペルオキシダーゼおよびセルラーゼ を含有している。タンパク質を加水分解するプロテアーゼの能力は、ペプチドま たはタンパク質汚れを除去する上で役立つ添加物としてプロテアーゼを配合する ことにより、クリーニング組成物で活用されてきた。 しかしながら、このようなプロテアーゼ含有液体水性洗剤で通常出会う問題は 、貯蔵中に組成物中に存在するプロテアーゼ自体または他の酵素（例えば、リパ ーゼ、アミラーゼおよびセルラーゼ）のプロテアーゼによる分解である。この分 解の結果として、洗剤組成物はさほどうまく働かない。したがって、クリーニン グ組成物中にプロテアーゼインヒビターを配合することは、商業的に有用である 。 有用であるために十分安定なインヒビターを提供する必要性がある。この“有 用性”は、クリーニング組成物にとり長期貯蔵寿命と、生物宿主からのプロテア ーゼの改善された収率を果たす上での必要性からみて判断される。 加えて、これらのインヒビターは、組成物タイプ、例えば液体、ゲル、顆粒ま たは固形組成物にかかわらず、クリーニング組成物に有用である。 クリーニング中組成物の希釈時またはクリーニング環境下においてプロテアー ゼはもはや阻害されず、むしろペプチド汚れを加水分解しうるような、プロテア ーゼの可逆性インヒビターを提供できれば、有利であろう。合成プロテアーゼインヒビター 様々な合成プロテアーゼインヒビターまたは安定剤がこのような使用向けに提 案された。Panandikerら（Ｕ．Ｓ．特許第５，４２２，０３０号）は洗濯洗剤で 酵素を安定化させるために芳香族ボレートエステルを開示している。例えば、Ｕ ．Ｓ．４，５６６，９８５は塩酸ベンズアミジンの使用を提起し、ＥＰ３７６， ７０５は低級脂肪族アルコールまたはカルボン酸の使用を提起し、ＥＰ３８１， ２６２はポリオールおよびホウ素化合物の混合物の使用を提起している。酵素阻 害へのこのような合成アプローチは長い貯蔵寿命を与えるが、高価であって、醗 酵槽中でタンパク質分解のために単離収率を改善できないことがある。 これらの欠点を認めて、当業者は、合成インヒビターの欠点なしにクリーニン グ組成物中で酵素を安定化させたいと望んで、タンパク質性プロテアーゼインヒ ビターで実験してきた。タンパク質性プロテアーゼインヒビター 自然界では、プロテアーゼをその天然環境下（即ち、in vivo）で調節するた めに、タンパク質性プロテアーゼインヒビターを供給している。しかしながら、 これらのタンパク質性プロテアーゼインヒビターは不安定になりがちで、したが ってプロテアーゼおよび洗剤の存在下における商業的使用はやや制限される。 タンパク質性プロテアーゼインヒビターは、典型的には、プロテアーゼの活性 部位と結合してその活性を阻害する長いペプチド（多くは２８アミノ酸より大き い）である。これらのインヒビターは一次アミノ酸配列ホモロジーに基づきいく つかのファミリー（ファミリーＩ−IX）に分類されている（Laskowski,M.,Jr.お よびI.Kato,”Protein Inhibitors of Proteinases”（プロテイナーゼのタンパ ク質インヒビター）,ANN.REV.BIOCHEMISTRY（1980）49:593-626）。これらのイ ンヒビターにはファミリーVIインヒビターと一般的に称されるものが含まれ、こ のようなインヒビターにはエグリン(eglin)および大麦キモトリプシンインヒビ ター、ファミリ−IIIインヒビター、例えばStreptomycesズブチリシンインヒビ ター（ＳＳＩ）、およびプラスミノストレプチンがある。 このようなインヒビターはとりわけ特異的プロテアーゼと結合しやすい。その ため、インヒビターを特異的プロテアーゼと一緒にして考えることが便利である 。この理由から、当業界ではそれらを“プロテアーゼ／ペプチドインヒビター対 ”としてしばしば扱っている。既知プロテアーゼ／ペプチドインヒビター対の例 は、ズブチリシンＢＰＮ’／ＳＳＩである。例えば、Y.Mitsui,Y.et al,”Cryst al Structure of ａ Bacterial Protein Proteinase Inhibitor（Streptomyces Subtilisin Inhibitor）at 2.6 A Resolution”（２．６Ａ分解度のときの細菌 タンパク質プロテイナーゼインヒビター（Streptomycesズブチリシンインヒビタ ー）の結晶構造）,J.Mol.Biol.,131:697-724(1979)およびS.Hirono,H.Akagawa,Y . Mitsui and Y.Iitaka,”Crystal Structure at 1.6 A Resolution of the Complex of Subtilisin BPN’with Streptomyces Subtilisin Inhibitor”（ ズブチリシンＢＰＮ’とStreptomycesズブチリシンインヒビターとの複合体の １．６Ａ分解度のときの結晶構造）,J.Mol.Biol.,178:389-413(1984)参照。 Mikkelsen（公開出願ＷＯ９２／０３５２９）はファミリーVIのペプチドインヒ ビターについて開示している。これらのインヒビターはタンパク質分解に対して リパーゼおよびセルラーゼを安定化させると言われている。Mikkelsenは、多く の天然インヒビターがプロテアーゼに対して高い親和性を有し、インヒビター‐ 酵素複合体が洗浄環境中への希釈時に解離しないことを認めている。Mikkelsen は、ファミリーVI Ｐ１位でのプロリンの使用について開示している。プロテア ーゼが製品中で完全に阻害されているならば、少量のプロテアーゼだけはクリー ニング環境下で希釈後にも活性であろうとみられている。 ＳＳＩは、インヒビターがすべてのプロテアーゼ活性を阻害するために十分な 量で存在しているかぎり、ズブチリシンＢＰＮ’の存在下で安定である。しかし ながら、ＳＳＩは過剰のプロテアーゼの存在下で不安定である。 Tamuraら（Biochemistry 30:5275-5286,1991）は、過剰のプロテアーゼの存在 下におけるＳＳＩの不安定さが、疎水性に形成されたＳＳＩ二量体の解離および コンホメーション変化によるものであることを示唆している。TamuraはＤＳＣを 用いて天然ＳＳＩよりも高いＴ_mを示すＳＳＩのＤ８３Ｃ変種について開示して いるが（Tamura et al.,Biochemistry 33:14512-14520,1994）、Tamuraは見たと ころでは洗剤の存在または不在下におけるプロテアーゼ抵抗性を試験していなか った。 しかしながら、インヒビターの結合定数（Ｋｉ）が酵素／インヒビター対を含 有したクリーニング組成物でわずかにプロテアーゼ活性を発揮させるならば、組 成物中のタンパク質インヒビターと酵素は加水分解されることがある。したがっ て、プロテアーゼと洗剤の存在下で適度に安定なＳＳＩの変種または他のインヒ ビターをみつけることが有利であろう。加えて、これらのインヒビターは特定の プロテアーゼが阻害される結合定数を有していることが好ましい。この結合定数 （Ｋｉ）は、クリーニング組成物中とその貯蔵中にプロテアーゼの阻害を行える べきである。しかしながら、クリーニング組成物を希釈したときまたはクリーニ ングプロセス中に、プロテアーゼおよびインヒビターは解離して、非阻害状態の プロテアーゼが活性になる。 一部のプロテアーゼインヒビターの結合性が研究されてきた。Halkierら（Ｗ Ｏ９３／２０１７５）は、インヒビターのＰ１およびＰ４‐Ｐ２位の変化のせい で、天然ファミリーVIインヒビターと比較して親和性を低下させたプロテアーゼ インヒビター（例えば、エグリンおよび大麦キモトリプシンインヒビター）を開 示している。 いかなるタンパク質またはペプチドのアミノ酸配列もその特徴を決定している ことから、そのアミノ酸配列の変化はアミノ酸変化の位置および性質に応じてタ ンパク質またはペプチドの性質を変えることがある。そのため、変異誘発が、あ るアミノ酸配列の構造または機能を調べようと試みて、一部のタンパク質プロテ アーゼインヒビターに用いられてきた。 例えば、Kojimaら(S.Kojima,Y.Nishiyama,I.Kumagai and K.Miura,J.Biochem. ,109:377-382,1991)はズブチリシンＢＰＮ’を用いて野生型ＳＳＩに対する１９ のＳＳＩ Ｐ１位変種を作って、そのＫｉを測定した。もう１つの例として、 Mikkelsenは結合親和性を低下させると言われるファミリーVIインヒビターでの 変異について開示している。Nielsenら（ＷＯ９３／１７０８６）は、結合親和 性を低下させると言われる、プラスミノストレプチンでの変化について開示して いる。 当業界では有用なタンパク質性プロテアーゼインヒビターの必要性について記 載している。例えば、FederおよびKochavi（ＦＲ２０８４７５１）は洗剤の存在 下で酵素を安定化させると言われる可逆性アルカリプロテアーゼインヒビターに ついて開示している。Estell（米国特許第５，１７８，７８９号）は、ズブチリ シンを安定化させる上で有用と言われる可逆性インヒビターとして、七面鳥オボ ムコイドの使用を開示している。 もちろん、コスト理由などから、クリーニング組成物中において非常に低いレ ベルで有用なインヒビターを提供することが有利であろう。この利点に加えて、 このようなインヒビターはプロテアーゼを含んだ組成物でタンパク質分解に対し て高度に感受的な酵素の使用にも対処できる。 この分野での研究にもかかわらず、タンパク質プロテアーゼインヒビターは、 プロテアーゼおよび洗剤の存在下で通常不安定すぎるため、商業的に有用でない 。 当業界で記載された様々なアプローチにもかかわらず、クリーニング組成物で 有用なプロテアーゼの新規でより有効な変種の必要性が継続している。 例えば、洗濯用途に用いられるならば、いかなるインヒビターも洗濯機で希釈 時にプロテアーゼから解離してプロテアーゼを活性にさせることが、望まれるで あろう。洗濯機での希釈は限定的であるため、インヒビターは製品中でプロテア ーゼを完全に不活化させておく必要はなく、クリーニング環境下でプロテアーゼ を活性にさせるべきであると、当業界では認識している。組成物中ではプロテア ーゼの約０．０１〜約１％をインヒビターから遊離させておくことが有利である 。インヒビターが液体クリーニング組成物で用いられるならば、当業者は遊離プ ロテアーゼの存在下で安定なインヒビターを望む。 発明の目的 本発明の目的は、野生型インヒビターよりも、特に洗剤中で、大きなタンパク 質分解安定性と、プロテアーゼに対して低い親和性とを有した、ペプチドまたは タンパク質性プロテアーゼインヒビター変種を提供することにある。 これらの変種を含んだクリーニング組成物を提供することも、本発明の目的と する。 要旨 本発明は野生型アミノ酸インヒビターからの修飾アミノ酸配列を有したペプチ ドまたはタンパク質性プロテアーゼインヒビター変種を提供する；その修飾位置 は大きなタンパク質分解安定性とプロテアーゼに対して低い親和性とを付与する 。本発明はこのような変種をコードする遺伝子も提供する。 本発明はクリーニング用にこのような変種を含んだ組成物も提供する。 本発明が供する他の効果は、本発明の説明が進むに従い明らかとなるであろう 。説明 我々は、洗剤を含めた界面活性剤の存在下in vitroで遊離（即ち、非阻害状態 の）プロテアーゼに対してより安定なプロテアーゼインヒビターの変種を見い出 した。加えて、このような変種はin vivoでもより安定であると考えられる。 我々は、増殖、回収、精製中とクリーニング組成物中とでプロテアーゼの適切 な阻害を行える、適切な阻害定数（Ｋｉ）のプロテアーゼインヒビターも見い出 した。これはより良い安定性とより長い貯蔵寿命（即ち、製品がその性質上実質 的に未変化のままである貯蔵期間）とを供する。より良い安定性は自己分解を減 少させ、ひいては生物からのプロテアーゼの収率を増加させると考えられる。 本発明の好ましい組成物は、３種の必須成分：（Ａ）タンパク質プロテアーゼ インヒビターまたはその混合、（Ｂ）プロテアーゼまたはその混合、および（Ｃ ）界面活性剤を含んでいる。本発明による組成物は、他の酵素を含めた任意成分 も更に含んでいてよい。 I．プロテアーゼインヒビター（即ち、変種） 本明細書で用いられる“プロテアーゼインヒビター”という用語は、プロテア ーゼ酵素のタンパク質分解活性の可逆的インヒビターを意味する。このインヒビ ターはタンパク質またはポリペプチドである。典型的には、インヒビターはタン パク質をそれ独自に命名しうるほど十分長く、これはポリペプチドが少くとも ２５アミノ酸、更に好ましくは少くとも２８アミノ酸、最も好ましくは少くとも ８０アミノ酸の長さであることを意味する。 好ましくは、インヒビター部分は対応プロテアーゼによるタンパク質分解に抵 抗性である。 本発明は、インヒビターについてコードする様々なヌクレオチド配列を変異さ せて、インヒビターのアミノ酸配列を変えることにより修飾された、ペプチドプ ロテアーゼインヒビター変種に関する。本発明の修飾されたペプチドプロテアー ゼインヒビター変種（以下、“変種”）は、プロテアーゼに対して改善された安 定性を有し、処方中でプロテアーゼを阻害するが、クリーニング環境下で希釈 （即ち、それは“薄まる”）時に解離する。 本発明はこのような変種についてコードする遺伝子にも関する。 本発明の好ましい態様は、ＳＳＩがインヒビターとなる多くのプロテアーゼに とり有用である。これらにはSavinase、ズブチリシンＢＰＮ’、ズブチリシン Carlsbergおよびそれらの誘導体があるが、それらに限定されない。 理論に拘束されることなく、希釈時におけるこの解離は、アミノ酸配列を修飾 して、野生型タンパク質性プロテアーゼインヒビターとは異なるプロテアーゼ結 合定数（Ｋｉ）を有した変種を供することにより改善される。この改善された Ｋｉであれば、クリーニングプロセスまたは希釈時に解離を行える。 全プロテアーゼは、インヒビター結合プロテアーゼ、基質結合プロテアーゼお よび遊離プロテアーゼの合計である。インヒビターが至適Ｋｉを有しているとき 、それは貯蔵クリーニング組成物（即ち、貯蔵）中に典型的な濃度でほぼ完全な 阻害と、使用時（例えば、洗濯機中、浸漬溶液中など）に典型的な濃度でほぼ完 全な解離（即ち、阻害の欠如）を行う。このように、プロテアーゼ／インヒビタ ーは活性プロテアーゼを供するように希釈されねばならない。 本発明の好ましい変種は、プロテアーゼの阻害を変えてこれらの望ましい性質 を呈するようにデザインされる。好ましくは、この変化は、インヒビターに、貯 蔵製品中でプロテアーゼを阻害させて、希釈時に解離させることができる。これ らの結合親和性または阻害定数（Ｋｉ）は部位特異的変異誘発を用いて調整され る。更に、プロテアーゼに対するインヒビターの親和性は異なる各プロテアーゼ と各クリーニング向けに最適化される。 Ｋｉについて、本明細書で称される“適切なＫｉ”、“有利なＫｉ、望ましい Ｋｉまたは至適Ｋｉ”では、クリーニング組成物または製品中でほぼすべて（好 ましくは６０％以上、更に好ましくは約９９％）のプロテアーゼをインヒビター により阻害させるが、希釈時にはインヒビターをプロテアーゼから解離させてお ける。 例えば、１：１化学量論が用いられる場合、インヒビターは適用例に応じて１ ０^-10〜１０^-4のＫｉ値を有することが好ましい。もう１つの例として、米国で 常用されるような液体洗濯組成物では、組成物が洗濯機で６００倍希釈されると して、１０^-10〜１０^-6のＫｉ値のインヒビターを有することが好ましい。もち ろん、洗濯機の大きさまたは製品濃度が変わるとすれば、それに応じてＫｉも調 整される。有用なＫｉ範囲の予測は、使用時のクリーニング処方物の希釈倍率、 用いられるクリーニング方法の温度に対する結合定数の温度依存性、インヒビタ ー対プロテアーゼの化学量論などのようなパラメーターを考慮することにより、 過度の実験なしに当業者により容易に行われる。 好ましい態様において、好ましい化学量論は１：１〜約３：１（インヒビター ：プロテアーゼ）、好ましくは１．５：１〜約３：１（インヒビター：プロテア ーゼ）、更に好ましくは約２：１（インヒビター：プロテアーゼ）である。この 関係において、本明細書で称される“適切なＫｉ”ではクリーニング組成物また は製品中でほぼすべて（好ましくは約９９％）のプロテアーゼをインヒビターに より阻害させるが、希釈時にはインヒビターをプロテアーゼから解離させておけ る。しかしながら、化学量論の変化のせいで、インヒビターは適用例に応じて １０^-10〜１０^-4のＫｉ値を有することが好ましい。もう１つの例として、米国 で用いられる液体洗濯組成物では、上記のように、組成物が洗濯機で６００倍希 釈されるとして、１０^-10〜１０^-6のＫｉ値のインヒビターを有することが好ま しい。もちろん、洗濯機の大きさ、製品濃度または洗浄液の温度が変わるとすれ ば、それに応じてＫｉも調整される。 このため、クリーニング組成物に用いられるインヒビターの量は、クリーニン グ組成物で阻害されるプロテアーゼの量により決められる。 本明細書で用いられる“変種”とは、公知の野生型の場合とは異なるアミノ酸 配列を有した酵素を意味し、この変異は変種の配列中または末端における１以上 のアミノ酸の置換またはアミノ酸の欠失もしくは付加による。そのため、“変種 ”という用語には、たとえ変種配列が完全野生型配列を含んでいるとしても、追 加アミノ酸を有した“インヒビター様”ペプチドを含む。 本明細書で用いられる“遺伝子”、“ベクター”、“プラスミド”、“ゲノム ”または“染色体”は、それらの業界で認識されている意味を有している。しか しながら、プラスミドなどを用いて発現系をどのように使うかの開示があれば、 それらがゲノム、プラスミドベースなどであるか、それらが原核または真核生物 に用いられるのか、異種宿主が細菌、真菌、植物などであるかどうかに応じた他 の系の使い方を当業者に教えるために十分であることを、当業者はわかるであろ う。 ペプチドは究極的にはin vivoでＤＮＡによりコードされているため、ＤＮＡ はインヒビター配列を規定する上で用いることができる。インヒビターまたはそ の変種についてコードするＤＮＡは、in vitro発現系と、植物（好ましくはタバ コを含めたバイオテクノロジーに用いられるもの、菜種、大豆などのような脂肪 種子植物、トウモロコシ、大麦、オートのような穀物、トマト、ポテトなどのよ うな他の植物）および酵母のような真菌とBacillus、E.coliなどのような細菌を 含めた微生物のようなin vivo系とを含めた、いくつかのプラスミドおよび／ま たは発現系に用いることができる。好ましくは、発現系は微生物、更に好ましく は種類上の細菌、最も好ましくはE.coliまたはBacillus、更に一層好ましくはBa cillusである。 この出願の説明があれば、インヒビターまたはその変種についてコードするた めに用いられるＤＮＡが本発明の他のインヒビターと同様のプラスミド、ファー ジまたは染色体に入れられることを、当業者がわかると解される。加えて、この ようなプラスミド、ファージまたは染色体は、本発明のインヒビターにより阻害 されたりまたはされなかったりする、インヒビターおよび／またはプロテアーゼ を融合タンパク質の一部として含んだ融合タンパク質を含めて、プロテアーゼを コードしてもよい。 インヒビターまたはその変種についてコードするＤＮＡは細胞中で活性なプラ スミドまたはファージ中に組み込んでも、または本発明のインヒビターのクロー ニングまたは発現に用いられる生物のゲノム中に直接組み込んでもよい。 上記ＤＮＡがＤＮＡのＲＮＡ転写物についても想定して開示していることは、 当業者にもよく理解されている。当業者であれば、実験せずに、ＤＮＡ配列の検 索によりＲＮＡ配列を知ることができる。 本明細書で用いられる“変異遺伝子”とは変種についてコードする遺伝子を意 味する。 本明細書で用いられる“野生型インヒビター”とは、既知および天然プロテア ーゼインヒビターに関する。これらインヒビターの一例はSterptomycesズブチリ シンインヒビター（ＳＳＩ）である。ＳＳＩは１１３アミノ酸の長さであって、 Obataら（”Molecular Cloning and Nucleotide Sequence Determination of Gene Encoding Sterptomyces Subtilisin Inhibitor(SSI)”（Sterptomycesズブ チリシンインヒビター（ＳＳＩ）コード遺伝子の分子クローニングおよびヌクレ オチド配列決定）,S.Obata,S.Taguchi,I.Kumagai and K.Miura,J.Biochem., 105:367-371 (1989)）により記載されており、参考のため本明細書に組み込まれ る。我々は、B.subtilis ＤＮＡのように、アデニンおよびチミンに富むように デザインされた合成ＳＳＩ遺伝子を用いている。合成ＳＳＩ遺伝子の配列は配列 番号１で表されている。この合成遺伝子は、発現プラスミド構築法のせいで、ペ プチドのアミノ末端に４つの余分なアミノ酸残基をコードしている。これら４つ の追加アミノ酸を含んだこの修飾アミノ酸配列は配列番号２で表されている。本 明細書で用いられている“野生型アミノ酸配列”および“野生型インヒビター” という用語は配列番号１で表されている。本明細書で用いられているアミノ酸番 号付けはObataら（前掲）のものである。 ＳＳＩは二量形態で存在してもよい。そのため、理論に拘束されることなく、 二量体ＳＳＩを安定化させて、過剰のプロテアーゼに対するプロテアーゼ抵抗性 を増加させることが可能である。好ましくは、この安定化された二量体ＳＳＩ変 種は一緒に共有結合された２つのＳＳＩ変種モノマーから構成される。これはア ミノ酸およびそれらの側鎖によく存在するエステル、アミド、ジスルフィドまた は他の結合による。そのため、“共有結合二量体化”および“共有結合安定化” とは、二量体を形成するこのような共有結合モノマーに関する。好ましくは、こ の二量体化はジスルフィド結合による。 例えば、我々はアミノ酸残基８３位のシステインがＳＳＩを安定化させること を発見した。それは、プラスミノストレプチン、ＳＩＬ１、ＳＩＬ２、ＳＩＬ３ 、ＳＩＬ４、ＳＴＩ２、ＡＰＩ‐２ｃ’、ＳＬＰ１、ＳＩＬ１０、ＳＩＬ１３、 ＳＩＬ１４（”Three Novel Subtilisin-Trypsin Inhibitors from Streptomyce s:Primary Structures and Inhibitory Properties”(Streptomyces由来の３種 の新規ズブチリシン‐トリプシンインヒビター：一次構造および阻害性),M.Tera be,S.Kojima,S.Taguchi,H.Momose and K.Miura,J.Biochem.,116:1156-1163,1994 ）およびStreptomyces由来の他の相同的インヒビターのような関連インヒビター も安定化させるかもしれない。 II．プロテアーゼ 本洗剤組成物で第二の必須成分は、約０．０００１〜１．０重量％、好ましく は約０．０００５〜０．２％、最も好ましくは約０．００２〜０．１％の活性プ ロテアーゼである。プロテアーゼの混合物も含有される。プロテアーゼは動物、 植物または好ましくは微生物起源である。本発明で使用上好ましいのはズブチリ シンタイププロテアーゼである。特に好ましいのは、Bacillus subtilis、 Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus lentusおよび／またはBacillus licheniformisから得られる細菌セリンプロテアーゼ（またはその変種）である 。 もちろん、クリーニング組成物中におけるプロテアーゼの重量％は、最終組成 物の水分、ビルダー分などに応じて変わる。例えば、好ましくは、顆粒洗剤では 組成物中０．０６４〜約０．６４mg/gのプロテアーゼが望ましい。当業者であれ ば、ゲル洗剤が液体処方物と似ていることをわかるであろう。そのため、プロテ アーゼの重量％は洗剤にはない可変要素（および当業界で理解されているその他 ）を補うように調整される。 適切なプロテアーゼには、Novo Industries A/SのAlcalase^R（好ましい）、 Esperase^R、Savinase^R（Copenhagen,Denmark）、Gist-brocadesのMaxatase^R、 Maxacal^RおよびMaxapem１５^R（タンパク質工学処理Maxacal^R）（Delft, Netherlands）と、市販されているズブチリシンＢＰＮおよびＢＰＮ’（好まし い）がある。“プロテアーゼＢ”と称される１９８７年４月２８日付で出願され た欧州特許出願第８７３０３７６１．８号明細書（特に第１７、２４および９８ 頁）に記載された、および“プロテアーゼＡ”（ＢＰＮ’と同じ）と称される修 飾細菌セリンプロテアーゼ（Genencor International）に関する１９８６年１０ 月２９日付で公開されたVenegasの第１９９，４０４号明細書に記載された、 Genencor International,Inc.(San Francisco,California)製のような修飾細菌 セリンプロテアーゼも、好ましいプロテアーゼである。好ましいプロテアーゼは 、Alcalase^R（Novo Industries A/S）、ＢＰＮ’、プロテアーゼＡおよびプロテ アーゼＢ（Genencor）とそれらの混合物からなる群より選択される。プロテアー ゼＢが最も好ましい。 III.界面活性剤 約１〜８０重量％、好ましくは約５〜５０％、最も好ましくは約１０〜３０％ の界面活性剤が、本発明で第三の必須成分である。界面活性剤はアニオン性、ノ ニオン性、カチオン性、両性、双極性およびそれらの混合物からなる群より選択 できる。本発明による組成物は洗濯クリーニング関係で好ましくは用いられるが 、本発明による上記組成物は硬質表面クリーニングまたは皿洗いを含めた他の異 なるクリーニング分野にも使用できる。したがって、用いられる具体的な界面活 性剤は考えられる具体的な最終用途に応じて様々である。 本発明の効果は、ある洗浄ビルダーおよび界面活性剤のような、酵素に対して 不利な成分を含有した組成物で特に顕著である。 IV．例 下記例は請求の範囲に記載された発明を制限するためではなく、むしろ本発明 の作製および使用方法についての指針を当業者に与えている。本明細書の例と他 の開示における指針と、当業者に容易に入手しうる情報があれば、当業者は本発 明に従い作製および使用することができる。簡素化のために、技術の網羅的な列 挙と業界で知られる方法などは、これらが当業者の範囲内に属するため省略する 。 公知の出発物質がこれらの例に用いられている。これら物質の多くは市販され ている（Cf．Sigma Catalog,Sigma-Aldrich Corp.,Chicago,III.1996）。例えば 、E.coli ＣＪ２３６およびＪＭ１０１は公知株であり、ｐＵＢ１１０およびｐ ＵＣ１９は公知プラスミドであり、Kunkel法変異誘発も当業界で周知である（例 えば、Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,J.Sambrook,E. F.Fritsch and T.Maniatis,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989参照） 。 変種は、発現系によりおよび様々な宿主で様々な方法により作られる。これら の方法は、上記のような分子生物学、生化学または他のバイオテクノロジー関連 技術の点で、業者の実施範囲内にある。 当業者は、類似した変更が、公知のまたは公開されたホモロジーに基づき、S. hygroscopicus、S.virginiaeおよびその他由来のインヒビターを含めた Streptomyces由来の相同的インヒビターに加えられることもわかるであろう（Cf .M.Terabe,S.Kojima,S.Taguchi,H.Momose and K.Miura,”Three Novel Subtilis in-Trypsin Inhibitors from Streptomyces:Primary Structures and Inhibitor y Properties”,J.Biochem.,116:1156-1163,1994）。 例１ 合成ＳＳＩ遺伝子の構築 成熟ＳＳＩをコードする遺伝子を標準法、例えばＰＣＲを用いて構築する（例 えば、PCR Protocols:A guide to Methods and Applications,Eds.,M.A.Innis e t al.,Academic Press Inc.,1990参照）。標準操作を用いて、これらのオリゴヌ クレオチドを最初にＰＣＲでペア方式に用いる： 配列番号３と配列番号６ 配列番号４と配列番号５ 配列番号７と配列番号１０および 配列番号８と配列番号９ 第一および第二の対をミックスし、もう１ラウンドのＰＣＲで用いて、第三お よび第四の対も同様にする。ＰＣＲオリゴマーは以下で示されている： 配列番号３ ５’ ＴＣＣ ＧＡＣ ＧＡＡ ＴＴＣ ＧＡＴ ＧＣＴ ＣＣＴ ＴＣＴ Ｇ ＣＡ ＣＴＴ ＴＡＴ ＧＣＡ ＣＣＴ ＴＣＡ ＧＣＡ ＴＴＡ ＧＴＴ Ｔ ＴＡ ＡＣＡ ＧＴＴ ３’ 配列番号４ ５’ ＣＣＴ ＧＡＡ ＡＧＡ ＧＣＡ ＧＴＡ ＡＣＴ ＣＴＴ ＡＣＡ Ｔ ＧＴ ＧＣＴ ＣＣＡ ＧＧＣ ＣＣＴ ＴＣＴ ＧＧＴ ＡＣＡ ＣＡＴ C ＣＡ ＧＣＡ ＧＣＴ ３’ 配列番号５ ５’ ＡＣＣ ＴＣＣ ＴＡＣ ＴＧＣ ＡＧＣ ＴＡＡ ＡＴＣ ＴＧＣＡＣ Ａ ＴＧＣ ＡＧＡ ＧＣＣ ＡＧＣ ＴＧＣ ＴＧＧ ＡＴＧ ＴＧＴ ３’ 配列番号６ ５’ ＴＡＣ ＴＧＣ ＴＣＴ ＴＴＣ ＡＧＧ ＴＧＣ ＡＧＣ ＴＧＴ Ｃ ＧＴ ＡＧＣ ＧＣＴ ＡＡＣ ＴＣＣ ＴＴＴ ＡＣＣ ＡＡＣ ＴＧＴ Ｔ ＡＡ ＡＡＣ ＴＡＡ ３’ 配列番号７ ５’ ＧＡＴ ＴＴＡ ＧＣＴ ＧＣＡ ＧＴＡ ＧＧＡ ＧＧＴ ＧＡＣ Ｔ ＴＡ ＡＡＣ ＧＣＡ ＴＴＡ ＡＣＡ ＣＧＴ ＧＧＴ ＧＡＡ ＧＡＣ Ｇ ＴＴ ＡＴＧ ＴＧＴ ３’ 配列番号８ ５’ ＧＴＴ ＧＡＴ ＧＧＡ ＧＴＴ ＴＧＧ ＣＡＡ ＧＧＴ ＡＡＡ Ｃ ＧＣ ＧＴＡ ＴＣＴ ＴＡＴ ＧＡＡ ＣＧＴ ＧＴＡ ＴＴＴ ＴＣＡ Ａ ＡＴ ＧＡＡ ＴＧＴ ３’ 配列番号９ ５’ ＴＧＴ ＣＣＡ ＡＡＧ ＣＴＴ ＧＧＡ ＴＣＣ ＴＴＡ ＡＡＡ Ｔ ＧＣ ＡＡＡ ＴＡＣ ＡＧＡ ＡＧＡ ＧＣＣ ＡＴＧ ＡＧＣ ＧＴＴ Ｃ ＡＴ ＴＴＣ ＡＣＡ ＴＴＣ ＡＴＴ ＴＧＡ ＡＡＡ ３’ 配列番号１０ ５’ ＣＣＡ ＡＡＣ ＴＣＣ ＡＴＣ ＡＡＣ ＡＧＴ ＣＡＧ ＴＡＡ Ｔ ＡＣ ＡＧＧ ＡＴＣ ＡＴＡ ＡＡＣ ＣＡＴ ＴＧＧ ＡＣＡ ＣＡＴ Ａ ＡＣ ＧＴＣ ＴＴＣ ３’ オリゴヌクレオチドは４つの異なるＰＣＲでぺア方式に用いる： 配列番号３と配列番号６ 配列番号４と配列番号５ 配列番号７と配列番号１０、および 配列番号８と配列番号９ 各々１０．６μlの第一の２つのＰＣＲ産物をミックスし、１００μlＰＣＲに 用いる。十分量のＤＮＡを得るために、８つのこれらＰＣＲチューブを調製する 。第三および第四ＰＣＲのＰＣＴ産物も同様に処理する。ＰＣＴ産物をプロテイ ナーゼＫで処理し、フェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールを用いて沈 降させる。 配列番号３および６の産物をＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで切断し、配列番号７ および１０の産物をＰｓｔＩおよびＨｉｎｄIIIで切断する。フェノール／クロ ロホルム抽出およびエタノール沈降後に、これらのＤＮＡを、同制限酵素で切断 されたｐＵＣ１９ＤＮＡに結合させる。その結合ミックスを用いてE.coli ＴＧ １を形質転換させ、ＸＧＡＬおよびＩＰＴＧを含有したアンピシリンプレートで 選択する。 白色コロニーをＤＮＡ調製用に培養する。ＤＮＡを制限分析およびＤＮＡ配列 決定により特徴付ける。プラスミドｐＰＧ１３６４は、オリゴヌクレオチド配列 番号１０〜１３によりコードされた合成ＳＳＩ部分遺伝子を含んでいる。プラス ミドｐＰＧ１３６６はオリゴヌクレオチド配列番号７および１０によりコードさ れたＳＳＩ部分遺伝子を含んでいる。 成熟ＳＳＩをコードする完全合成遺伝子を構築するために、ｐＰＧ１３６４を ＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩおよびＰｓｔＩで切断する。ｐＰＧ１３６６はＥｃｏＲＩ 、ＰｓｔＩおよびＸｂａＩで切断する。ＤＮＡを結合させる。プラスミドｐＰＧ １３７１は組み立てられた合成ＳＳＩ遺伝子を有して、ｐＰＧ１３６６の大きな ＰｓｔＩ ＥｃｏＲＩ断片とｐＰＧ１３６４の小さなＥｃｏＲＩ ＰｓｔＩ断片 とを含んでいる。ｐＰＧ１３７１は後の作業に用いる。発現プラスミドの構築 発現プラスミドはｐＰＧ５８０から誘導されるが、これはヒト副甲状腺ホルモ ンの３４アミノ酸残基断片の生産に用いられるプラスミドの誘導体である（ヒト 副甲状腺ホルモンの３４アミノ酸断片のBacillus subtilisからの分泌向けのシ グナル配列開裂部位の最適化、Saunders et al.,Gene,102:277-282（1991））。 ｐＰＧ５８０は４つの部分から作られている。 第一に、ｐＰＧ５８０はＨｉｎｄIII部位に隣接して Bacillus amyloliquefaciensズブチリシン遺伝子を含んでおり、下記オリゴヌク レオチドでＰＣＲを用いて作る。 配列番号１１ ５’ ＡＧＡ ＴＣＣ ＡＡＧ ＣＴＴ ＴＴＣ ＣＧＣ ＡＡＴ ＴＡＴ Ａ ＴＣ ＡＴＴ ３’ および 配列番号１２ ５’ ＧＧＡ ＴＴＣ ＡＡＧ ＣＴＴ ＴＧＣ ＴＣＡ ＧＴＴ ＴＴＧ Ｃ ＴＴ ＣＴＧ ３’ ｐＰＧ５８０は、Vasanthaらにより示されたような、第一塩基対を除くすべての ズブチリシン遺伝子配列を含んでいる（Bacillus amyloliquefaciensからのアル カリプロテアーゼおよび中性プロテアーゼの遺伝子はシグナル配列および成熟タ ンパク質についてコードする領域間に大きなオープンリーディングフレームを含 む；J.Bacteriology,159:811-819,1984）。 第二に、ズブチリシン遺伝子の３’末端には、ＨｉｎｄIII部位からｐＢＳ⁺Ｘ ｂａＩ部位への約３．２ｋｂｐにわたるｐＢＳ⁺（Stratagene,La Jolla,ＣＡ市 販）の断片（即ち、その始めの部分）が隣接している。 第三に、このＸｂａＩ部位に隣接して、ｐＵＢ１１０の大きな断片が挿入され ている（“ｐＵＢ１１０のヌクレオチド配列：複製とその調節に関する一部の顕 著な特徴”,McKenzie et al.,Plasmid,15:93-103,1986）。この断片はｐＵＢ１ １０ ＸｂａＩ部位からそのＨｉｎｄIII部位への４．３ｋｂｐにおよぶ。その ため、ＢａｍＨＩ部位からＸｂａＩ部位に戻るまでのｐＵＢ１１０の３２４ｂｐ 断片は、ｐＰＧ５８０に存在していない。 第四に、ｐＵＢ１１０のＢａｍＨＩ部位はもはや元のままでないが、Saunders らにより記載された３２ｂｐ合成配列のＢｇｌII部位に融合されている（“５ヒ ト副甲状腺ホルモンの３４アミノ酸断片のBacillus subtilisからの分泌向けの シグナル配列開裂部位の最適化”,Saunders et al.,Gene,102:277-282,1991）。 この３２ｂｐ配列は以下に示されている： 配列番号１３ ５’ ＡＡＧ ＣＴＴ ＣＡＧ ＧＡＴ ＧＴＴ ＣＡＴ ＡＡＴ ＴＴＴ Ｔ ＡＡ ＡＧＡ ＴＣ ３’ こうしてプラスミドｐＰＧ５８０を供する。 ｐＰＧ５８０を更なる使用のために修飾する。ＢａｍＨＩ部位および ＥｃｏＲＩ部位をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ切断で除去する。切断物をリガー ゼ緩衝液の存在下でＴ４ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシリボヌクレオチド三 リン酸と共にインキュベートする。得られたプラスミドは以下でｐＰＧ１３０１ と称するが、これはＢａｍＨＩまたはＥｃｏＲＩ制限部位を欠いており、E.coli ＪＭ１０１を形質転換させるために用いる。 そのプラスミドは、オリゴヌクレオチド特異性変異誘発により更に修飾し、下 記オリゴヌクレオチドを用いてシグナル配列後にＥｃｏＲＩ部位を作り： 配列番号１４ ５’ ＧＣＣ ＣＡＧ ＧＣＧ ＧＣＡ ＧＧＧ ＧＡＡ ＴＴＣ ＡＡＡ Ｔ ＣＡ ＡＡＣ ＧＧＧ ＧＡＡ ３’ および下記オリゴヌクレオチドを用いて翻訳停止配列後にＢａｍＨＩ部位を作る ： 配列番号１５ ５’ ＧＣＧ ＧＣＡ ＧＣＴ ＣＡＧ ＴＡＡ ＧＧＡ ＴＣＣ ＡＡＣ Ａ ＴＡ ＡＡＡ ＡＡＣ ＣＧＧ Ｃ ３’ このプラスミドは以下でｐＰＧ１３１５と称する。変異誘発はKunkel法を用いて 行う（Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,J.Sambrook,E. F.Fritsch and T.Maniatis,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）。 ｐＰＧ１３７１のＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片、成熟ＳＳＩをコードするＤＮ Ａ配列、およびズブチリシン遺伝子を含んだＰＧ１３１５のＥｃｏＲＩ Ｂａｍ ＨＩ断片を結合させ、結合ミックスを用いてコンピテントB.subtilis ＰＧ６３ ２を形質転換させる(Saunders et al.,Gene,102:277-282,1991)。カナマイシン 耐性形質転換株の中には、以下ｐＰＧ１３７６と称されるこの新たなプラスミド を有したＰＧ１１８１株がある。このプラスミドは、ズブチリシンシグナル配列 およびＳＳＩを含んだ融合タンパク質の発現を行わせるためのズブチリシン遺伝 子調節要素（プロモーター、翻訳開始配列）を含有している。このプラスミドは 、ＨｉｎｄIII部位のすぐ上流にあるｐＢＳ⁺部分内であって、以前はＢａｍＨＩ およびＨｉｎｄIII部位間に存在していたズブチリシン遺伝子の３’非翻訳部分 において、３３ｂｐ欠損も有している。 このプラスミドｐＰＧ１３７６を用いてE.coliを形質転換させ、部位特異的変 異誘発用の鋳型を作って新たなＳＳＩ変種を作製する。B.subtilisを、好ましく はインヒビターの発現のために、このプラスミドで形質転換させたとき、それは 以下でＰＧ１１８１と称する。E.coli株ＣＪ２３６を、好ましくは更に変異誘発 用の鋳型として、このプラスミドで形質転換させたとき、この株は以下でＰＧ１ ４０１と称する。ＳＳＩ変種の作製 Ａ．Ｍ７３Ｄ変種（変種１） Ｍ７３Ｄ変種をコードするＳＳＩ遺伝子を作製するため、下記変異誘発オリゴ ヌクレオチドを用いる： 配列番号１６ ５’ ＧＡＡ ＧＡＣ ＧＴＴ ＡＴＧ ＴＧＴ ＣＣＧ ＧＡＴ ＧＴＴ Ｔ ＡＴ ＧＡＴ ＣＣＴ ＧＴＡ ３’ ＰＧ１４０１由来のｐＰＧ１３７６で標準Kunkel法変異誘発を用いる。そのプラ スミドはｐＰＧ１３７８と称する。コンピテントB.subtilis（ＰＧ６３２株）を 、好ましくはインヒビターの発現のために、このプラスミドで形質転換させたと き、この新規な株は以下でＰＧ１１８３と称する。E.coli株ＣＪ２３６を、好ま しくは更に変異誘発用の鋳型として、このプラスミドで形質転換させたとき、こ の株は以下でＰＧ１４１０と称する。Ｂ．Ｍ７３Ｄ Ｄ８３Ｃ変種（変種２） Ｍ７３Ｄ Ｄ８３Ｃ変種をコードするＳＳＩ遺伝子を作製するため、下記変異 誘発オリゴヌクレオチドを用いる： 配列番号１７ ５’ ＧＴＡ ＴＴＡ ＣＴＧ ＡＣＴ ＧＴＴ ＴＧＴ ＧＧＡ ＧＴＴ Ｔ ＧＧ ＣＡＡ ＧＧＴ ＡＡＡ ＣＧＴ ＧＴＡ ＴＣＴ ＴＡＴ ＧＡＡ Ｃ ＧＴ ３’ ＰＧ１４１０由来の鋳型ＤＮＡ(即ち、プラスミドｐＰＧ１３７８)で標準Kunkel 法変異誘発を用いる。その新規プラスミドはｐＰＧ１５２４と称する。コンピテ ントB.subtilis（ＰＧ６３２株）をこのプラスミドで形質転換させたとき、それ は以下でＰＧ１６１０と称する。Ｃ．Ｍ７３Ｐ Ｄ８３Ｃ変種（変種３） ＳＳＩのＭ７３Ｐ Ｄ８３Ｃ変種をＤ８３Ｃ ＳＳＩ遺伝子鋳型および下記オ リゴヌクレオチドから作る： 配列番号１８ ５’ ＧＡＡ ＧＡＣ ＧＴＴ ＡＴＧ ＴＧＴ ＣＣＣ ＣＣＧ ＧＴＴ Ｔ ＡＴ ＧＡＴ ＣＣＴ ＧＴＡ ３’ 標準Kunkel法変異誘発を用いる。 下記表では本発明の例として記載されたプラスミドおよび発現系（例えば細菌 ）をまとめている。そのリストは限定的なものではなく、業者が明細書を読む上 での単なる指針である。 表１ 例におけるプラスミドおよび細菌特徴のまとめ 例３ ＳＳＩの単離 ＰＧ１１８１は、以下ＳＳＩと称される成熟ＳＳＩ様タンパク質を生産する。 ＳＳＩ様タンパク質配列は公知の配列とかなり同一である（Molecular Cloning and Nucleotide Sequence Determination of Gene Encoding Sterptomyces Subtilisin Inhibitor(SSI),J.Biochemistry（1989）105:367-371,S.Obata,S. Taguchi,I.Kumagai and K.Miura）。そのタンパク質は、発現ベクターとのＳＳ Ｉ遺伝子の融合体を作る際の産物である４つのアミノ酸残基もそのアミノ末端（ Ａｌａ‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｕ‐Ｐｈｅ）に含んでいるという点で、ＳＳＩとは異なる 。これらの余分な４つのアミノ酸残基は効果をもたないと予想される。 ＳＳＩおよびＳＳＩ変種を下記のように作製する。細胞を２×ＹＴ培地 （１．６％トリプトン、１％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム）中で一夜培 養する。細胞をペレット化し、上澄を集める。上澄にＨＣｌを加えて、ｐＨを４ にする。不溶性物質を遠心でペレット化させる。上澄をTris／Ｃｌ ｐＨ７．５ （１ｍＭ）に対して透析する。透析後に、タンパク質を懸濁させたTris／Ｃｌ ｐＨ７．５緩衝液を２０ｍＭの濃度に高める。次いで陰イオン交換（ＤＥＡＥ） クロマトグラフィーカラムを用いてＳＳＩを精製する。インヒビターを再びTris ／Ｃｌ ｐＨ７．５（１ｍＭ）に対して透析する。 例４ Ｍ７３Ｄ Ｄ８３Ｃ ＳＳＩの物理的特徴 Ｍ７３Ｄ Ｄ８３Ｃ ＳＳＩの分子質量は、質量スペクトル測定により調べた ところ、２３７１６．４である。これはタンパク質が二量体であれば予想される 値の誤差０．００６％以内であり、すべてのシステイン残基がジスルフィド結合 に関与している場合と一致する。これはＭ７３Ｄ Ｄ８３Ｃ ＳＳＩのＳＤＳゲ ル電気泳動により確認される。β‐メルカプトエタノールの存在下で、Ｍ７３Ｄ Ｄ８３Ｃは野生型ＳＳＩと同様の電気泳動移動度を有している。β‐メルカプ トエタノールの不在下では、Ｍ７３Ｄ Ｄ８３Ｃは共有結合二量体について予想 されるとおりにかなりゆっくり移動する。 ＳＳＩおよびＭ７３Ｄ ＳＳＩの質量は、質量スペクトル測定により調べたと ころ、予想モノマーの実験誤差内である。 例５ 変種の特徴付け Ａ．ＳＳＩはズブチリシンＢＰＮ’およびＢＰＮ’のＹ２１７Ｌ変種を阻害す る。ＳＳＩをプロテアーゼとミックスし、０．１Ｍ Tris,ｐＨ８．６、１０ｍＭ ＣａＣｌ₂の存在下室温で１５分間インキュベートする。次いでプロテアーゼ 活性をDelMar,E.G.,C.Largman,J.W.Brodrick and M.C.Geokas（Anal.Biochem.,V ol.99,pp.316-320(1979)）の方法を用いて測定する。更に１０μlのＮ‐サクシ ニル‐Ａｌａ‐Ａｌａ‐Ｐｒｏ‐Ｐｈｅ‐ｐ‐ニトロアニリドで反応を始める。 反応速度を４１０ｎｍの吸光度増加により測定する。 Ｂ．ペプチドプロテアーゼインヒビターをプロテアーゼと共に洗濯製品中に配 合することが望まれているため、製品環境での安定性も試験する。 インヒビターの安定性は、プロテアーゼ活性を経時的に測定することによりモ ニターする。インヒビターが安定であるならば、プロテアーゼ活性のレベルは一 定である。しかしながら、インヒビターが破壊されたならば、プロテアーゼ活性 は上昇する。この実験では、インヒビターを１．１nmolのＹ２１７Ｌ変化ズブチ リシンＢＰＮ’誘導体とミックスする。全サンプルの容量が同じとなるように水 を加える。複合体を形成させてから約１０分間後に、液体洗剤組成物を下記処方 に従い作る： Ｗｔ％ Ｃ_14-15アルキル（エトキシ２．２５）スルホン酸 １８．０ Ｃ_12-13アルキルエトキシレート（９） ２．０ Ｃ₁₂‐Ｎ‐メチルグルカミド ５．０ クエン酸 ４．０ エタノール ３．５ モノエタノールアミン ２．０ １，２‐プロパンジオール ７．０ ギ酸ナトリウム ０．６ テトラエチレンペンタミンエトキシレート（１６） １．１８ 汚れ放出ポリマー ０．１５ シリコーン起泡抑制剤 ０．１０ 増白剤 ０．１０水、ＮａＯＨ^***およびその他 残部１００％まで この組成物は全サンプル容量の１／３を占める。サンプル１５μlを０．１ＭT ris ＨＣｌ，ｐＨ８．６、０．０１Ｍ ＣａＣｌ₂９７５μlとミックスする。こ の希釈液を室温で３分間インキュベートする。インキュベート後に基質を加えて 、プロテアーゼの量を測定する。 Ｍ７３ＤおよびＭ７３Ｄ Ｄ８３Ｃ ＳＳＩは双方ともアッセイでタンパク質 をかなり阻害する。数日以内に、プロテアーゼ活性の増加がＭ７３Ｄ ＳＳＩ含 有サンプルで観察され、インヒビターが破壊されていることを示している。この 方法によると、Ｍ７３Ｄ Ｄ８３Ｃ ＳＳＩはこの破壊にさほど感受性でない： プロテアーゼ活性は数週間たってもＭ７３Ｄ Ｄ８３Ｃ含有サンプルで上昇しな い。プロテアーゼ活性の上昇は、Ｍ７３Ｄ ＳＳＩおよび野生型ＳＳＩでみられ る場合と比較して、Ｍ７３Ｄ Ｄ８３Ｃ ＳＳＩの存在下でかなり遅れる。 そのため、Ｍ７３Ｄ Ｄ８３Ｃ ＳＳＩは、これらの条件下でタンパク質分解 に対してＭ７３Ｄ ＳＳＩよりもかなり抵抗性である。 Ｋｉは下記のように調べる。インヒビターおよびサクシニル‐Ａｌａ‐Ａｌａ ‐Ｐｒｏ‐Ｐｈｅ‐ｐ‐ニトロアニリド６００μg/mlを５０ｍＭ Tris ｐＨ８溶 液９９０μl中でミックスする。反応をプロテアーゼの添加で開始させ、速度を ２０分間にわたり追跡する。一定の速度が最後に１０〜１５分間で観察される。 この速度は、インヒビターの不在下における速度と比較して、Goldsteinの式に 従いＫｉを計算するために用いる（酵素‐インヒビター‐基質反応のメカニズム 、J.Gen.Physiol.,27:529-580,1944）。Ｍ７３Ｐ Ｄ８３Ｃ ＳＳＩは３ｎＭの Ｋｉを有することがわかった。 例６ 他の変種 本発明の変種は下記表で例示されている。特定の変異を記載する上で、野生型 で存在する元のアミノ酸が最初に、位置番号が第二に、置換されたアミノ酸が第 三に示されている。こうすると、Ｍ７３Ｄは、天然インヒビターで７３番目のア ミノ酸（７３位）として存在するメチオニン（Ｍ）がアスパラギン酸（Ｄ）で置 き換えられたことを意味する。これらのバリエーションはインヒビターを安定化 させ、および／またはそのＫｉを最良にする。その番号付けはＳＳＩについて常 用されたものに相当し（Obata et al,前掲）、この特許出願に記載されたＳＳＩ “野生型”様変種およびＳＳＩ変種のアミノ末端に存在する４つの追加アミノ酸 残基を無視している。 これらの有用な変種は、これらの例と当業界の開示を用いて、興味あるプロテ アーゼに合わせて他の変種を作ろうとする当業者への方向づけを与える。 この目的のため、当業者が本発明のインヒビターに対する抗体を作ろうと思う ことも考えられる。これらの抗体は公知の方法を用いて作れる。 例えば、本発明のインヒビターはマウス、ウサギなどのような適切な哺乳動物 に注入される。適切なプロトコールでは、血清中で抗体の生産を増強させるスケ ジュールに従い、アジュバントの存在下で免疫原の反復注射を行う。免疫血清の 力価は、抗原として本発明化合物を用い、現在当業界の標準であるイムノアッセ イ操作を用いて、容易に測定することができる。 得られた抗血清は直接用いても、あるいは免疫動物の末梢血リンパ球または脾 臓を集めて、抗体生産細胞を不死化させ、その後標準イムノアッセイ技術を用い て適切な抗体生産株を同定することによりモノクローナル抗体を得てもよい。 ポリクローナルまたはモノクローナル調製物は、標準試験法を用いて本発明の 発現をモニターする上で有用である。そのため、発現レベルなどを調べるために 用いる分野向けに、キットがこれらの抗体を用いて製造されることも考えられる 。 このような抗体は、標準カップリング法を用いてシンチグラフィー標識、例え ばテクネチウム９９またはＩ-１３１のような標識、または蛍光標識にカップリ ングさせてもよい。標識された抗体は、Ｋｉを求めるために用いられる動力学的 アッセイのような競合アッセイでも用いることができる。 Ｖ．クリーニング組成物 本発明のもう１つの態様において、有効量の１種以上の変種がペプチド汚れ除 去の必要な様々な表面をクリーニングするために有用な組成物中に含有されてい る。このようなクリーニング組成物には、形態上制限されない、硬質表面をクリ ーニングするための洗剤組成物（例えば、液体、ゲル、固形および顆粒処方）； 形態上制限されない、布帛をクリーニングするための洗剤組成物（例えば、顆粒 、液体、ゲルおよび固形処方）；皿洗い組成物（形態上制限されない）；形態上 制限されないオーラルクリーニング組成物（例えば、歯磨剤、練歯磨剤および洗 口液処方）；形態上制限されない義歯クリーニング組成物（例えば、液体、錠剤 ）；形態上制限されないコンタクトレンズクリーニング組成物（例えば、液体、 錠剤）がある。 クリーニング組成物は、前記変種に加えて、プロテアーゼインヒビターと適合 する１種以上のクリーニング組成物物質も含んでいる。本明細書で用いられる“ クリーニング組成物物質”という用語は、望まれるクリーニング組成物の具体的 タイプおよび製品の形態（例えば、液体、顆粒、固形、スプレー、スティック、 ペースト、ゲル）について選択されるあらゆる液体、固体または気体物質を意味 し、しかもその物質は組成物で用いられる変種と適合している。クリーニング組 成物物質の具体的選択は、クリーニングされる表面物質、使用中（例えば、洗浄 洗剤使用中）のクリーニング条件にとり組成物の望ましい形態について考慮する ことにより容易に行われる。 本発明で用いられる“非布帛クリーニング組成物”には、硬質表面クリーニン グ組成物、皿洗い組成物、オーラルクリーニング組成物、義歯クリーニング組成 物およびコンタクトレンズクリーニング組成物がある。 Ａ．インヒビター変種 本明細書で用いられる“適合性”という用語は、プロテアーゼが通常の使用状 況下で望まれているほど有効でなくなる程度までには、クリーニング組成物物質 が変種のタンパク質分解活性を減少させないことを意味する。具体的なクリーニ ング組成物物質は以下で詳細に例示されている。 本明細書に記載される“変種の有効量”とは、組成物中でプロテアーゼの阻害 を行い、クリーニング環境下で特定のクリーニング組成物に必要な酵素活性を発 揮させるために必要な変種の量に関する。このような有効量は当業者により容易 に確認され、用いられる具体的な変種、クリーニング適用例、クリーニング組成 物の具体的組成と、液体または乾燥（例えば、顆粒、固形）組成物が必要かどう かなどのような多くのファクターに基づいている。好ましくは、クリーニング組 成物は約０．０００１〜約１０％、更に好ましくは約０．００１〜約１％、更に 一層好ましくは約０．０１〜約０．１％の１種以上の本発明の変種を含んでいる 。変種が用いられた様々なクリーニング組成物のいくつかの例が、以下で更に詳 細に記載されている。本明細書で用いられるすべての部、パーセンテージおよび 比率は、別記されないかぎり重量による。 本発明の変種は、高起泡性と良好な不溶性基質除去が望まれる様々な洗剤組成 物に用いることができる。このため、変種は、完全に処方された硬質表面クリー ナー、皿洗い組成物、布帛洗濯組成物などを提供するために、様々な慣用成分と 共に用いることができる。このような組成物は液体、顆粒、固形などの形態をと ることができる。このような組成物は、３０〜６０重量％もの界面活性剤を含有 した最新の“濃縮”洗剤として処方してもよい。 Ｂ．界面活性剤 本クリーニング組成物は、場合により、好ましくは、様々なアニオン性、ノニ オン性、双極性などの界面活性剤を含有することができる。このような界面活性 剤は、典型的には組成物の約５〜約３５％のレベルで存在する。 １．アニオン性界面活性剤 利用できるアニオン性界面活性剤の１タイプは、アルキルエステルスルホネー トからなる。これらは再生可能な非石油資源で作られることから望ましい。アル キルエステルスルホネート界面活性剤成分の製造は技術文献に開示された公知方 法に従い行える。例えば、Ｃ₈-Ｃ₂₀カルボン酸の直鎖エステルはThe Journal of the American Oil Chemists Society,52(1975),pp.323-329に従い気体 ＳＯ₃でスルホン化することができる。適切な出発物質には、獣脂、パームおよ びココナツ油などから誘導されるような天然脂肪物質がある。 特に洗濯適用向けに好ましいアルキルエステルスルホネート界面活性剤には、 アルキルエステルスルホネート界面活性剤がある。適切な塩には、金属塩、例え ばナトリウム、カリウムおよびリチウム塩と、置換または非置換アンモニウム塩 、例えばメチル、ジメチル、トリメチルおよび四級アンモニウムカチオン、例え ばテトラメチルアンモニウムおよびジメチルピペリジニウムと、アルカノールア ミン、例えばモノエタノールアミン、ジエタノールアミンおよびトリエタノール アミンから誘導されるカチオンがある。好ましくは、界面活性剤はＣ₁₀-Ｃ₁₆ア ルキルとメチル、エチルまたはイソプロピルを含んでいる。Ｃ₁₄-Ｃ₁₆アルキル を有するメチルエステルスルホネートが特に好ましい。 アルキルサルフェート界面活性剤が本発明で使用上重要なアニオン性界面活性 剤のもう１つのタイプである。ポリヒドロキシ脂肪酸アミド（下記参照）と併用 されたときに優れた全体的クリーニング能力を発揮することに加えて、これらの 界面活性剤は広範囲の温度、濃度および洗浄時間にわたり良好な脂肪／油クリー ニング性を示す。これらの界面活性剤とそれらの水溶性塩または酸は、式 ＲＯＳＯ₃Ｍであって、ここでＲは好ましくはＣ₁₀-Ｃ₂₄ヒドロカルビル、好まし くはＣ₁₀-Ｃ₂₀アルキル部分を有するアルキルまたはヒドロキシアルキル、更に 好ましくはＣ₁₂-Ｃ₁₈アルキルまたはヒドロキシアルキルであり、ＭはＨまたは カチオン、例えばアルカリ金属カチオン（例えばナトリウム、カリウム、リチウ ム）、置換または非置換アンモニウムカチオン、例えばメチル-、ジメチル-およ びトリメチル-アンモニウムと、四級アンモニウムカチオン、例えばテトラメチ ルアンモニウムおよびジメチルピペリジニウムと、エタノールアミン、ジエタノ ールアミン、トリエタノールアミンのようなアルカノールアミンから誘導される カチオン、およびそれらの混合物などである。典型的には、Ｃ_12-16のアルキル 鎖は低い洗浄温度（例えば約５０℃以下）で好ましく、Ｃ_16-18アルキル鎖は高 い洗浄温度（例えば約５０℃以上）で好ましい。 アルキルアルコキシル化サルフェート界面活性剤が有用なアニオン性界面活性 剤のもう１つのカテゴリーである。これらの界面活性剤は典型的には式 ＲＯ（Ａ）_mＳＯ₃Ｍの水溶性塩または酸であって、ここでＲは非置換Ｃ₁₀-Ｃ₂₄ アルキルまたはＣ₁₀-Ｃ₂₄アルキル部分を有するヒドロキシアルキル基、好まし くはＣ₁₂-Ｃ₂₀アルキルまたはヒドロキシアルキル、更に好ましくはＣ₁₂-Ｃ₁₈ア ルキルまたはヒドロキシアルキルであり、Ａはエトキシまたはプロポキシ単位で あり、ｍはゼロより大きく、典型的には約０．５〜約６、更に好ましくは約０． ５〜約３であり、ＭはＨまたはカチオン、例えば金属カチオン（例えばナトリウ ム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム等）、アンモニウム または置換アンモニウムカチオンである。アルキルエトキシル化サルフェートと アルキルプロポキシル化サルフェートが本発明では考えられる。置換アンモニウ ムカチオンの具体例には、メチル、ジメチル、トリメチル-アンモニウムおよび 四級アンモニウムカチオン、例えばテトラメチルアンモニウム、ジメチルピペリ ジニウムと、アルカノールアミン、例えばモノエタノールアミン、ジエタノール アミンおよびトリエタノールアミンから誘導されるカチオンと、それらの混合物 がある。例示される界面活性剤はＣ₁₂-Ｃ₁₈アルキルポリエトキシレート （１．０）サルフェート、Ｃ₁₂-Ｃ₁₈アルキルポリエトキシレート（２．２５） サルフェート、Ｃ₁₂-Ｃ₁₈アルキルポリエトキシレート（３．０）サルフェート およびＣ₁₂-Ｃ₁₈アルキルポリエトキシレート（４．０）サルフェートであり、 Ｍは便宜上ナトリウムおよびカリウムから選択される。 クリーニング目的にとり有用な他のアニオン性界面活性剤も本組成物中に含有 させることができる。これらには、石鹸の塩（例えばナトリウム、カリウム、ア ンモニウムおよび置換アンモニウム塩、例えばモノ、ジおよびトリエタノールア ミン塩を含む）、Ｃ₉-Ｃ₂₀直鎖アルキルベンゼンスルホネート、Ｃ₈-Ｃ₂₂一級ま たは二級アルカンスルホネート、Ｃ₈-Ｃ₂₄オレフィンスルホネート、例えば英国 特許明細書第１，０８２，１７９号明細書に記載されたようにアルカリ土類金属 シトレートの熱分解産物のスルホン化により製造されるスルホン化ポリカルボン 酸、アルキルグリセロールスルホネート、脂肪アシルグリセロールスルホネート 、脂肪オレイルグリセロールサルフェート、アルキルフェノールエチレンオキシ ドエーテルサルフェート、パラフィンスルホネート、アルキルホスフェート、ア シルイソチオネートのようなイソチオネート、Ｎ-アシルタウレート、メチルタ ウリドの脂肪酸アミド、アルキルサクシナメートおよびスルホサクシネート、ス ルホサクシネートのモノエステル（特に飽和および不飽和Ｃ₁₂-Ｃ₁₈モノエステ ル）、スルホサクシネートのジエステル（特に飽和および不飽和Ｃ₆- Ｃ₁₄ジエステル）、Ｎ-アシルサルコシネート、アルキルポリグルコシドのサル フェートのようなアルキル多糖のサルフェート（ノニオン性非サルフェート化合 物は以下で記載されている）、分岐一級アルキルサルフェートと、式 ＲＯ（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_kＣＨ₂ＣＯＯ^-Ｍ⁺（ＲはＣ₈-Ｃ₂₂アルキルであり、ｋは０ 〜１０の整数であり、Ｍは可溶性塩形成カチオンである）のようなアルキルポリ エトキシカルボキシレート、およびイセチオン酸でエステル化されて水酸化ナト リウムで中和された脂肪酸がある。トール油中に存在するか、またはそれから誘 導される、ロジン、水素添加ロジンと、樹脂酸および水素添加樹脂酸のような、 樹脂酸および水素添加樹脂酸も適切である。更に、例は"Surface Active Agents and Detergents"(Vol.I and II,Schwartz,Perry and Berch)に示されており、 様々なこのような界面活性剤は、１９７５年１２月３０日付で発行されたLaughl inらの米国特許第３，９２９，６７８号明細書の第２３欄５８行目〜第２９欄２ ３行目でも一般的に開示されている（双方とも参考のため本明細書に組み込まれ る）。 ２．ノニオン性洗剤界面活性剤 適切なノニオン性洗剤界面活性剤は、参考のため本明細書に組み込まれた １９７５年１２月３０日付で発行されたLaughlinらの米国特許第３，９２９，６ ７８号明細書の第１３欄１４行目〜第１６欄６行目でも一般的に開示されている 。有用なノニオン性界面活性剤の例示非制限クラスは以下に掲載されている。 １．アルキルフェノールのポリエチレン、ポリプロピレンおよびポリブチレン オキシド縮合物。一般的に、ポリエチレンオキシド縮合物が好ましい。これらの 化合物には、直鎖または分岐鎖配置で炭素原子約６〜約１２のアルキル基を有す るアルキルフェノールとアルキレンオキシドとの縮合産物がある。好ましい態様 において、エチレンオキシドは、アルキルフェノール１モル当たり約５〜約２５ モルのエチレンオキシドに相当する量で存在する。このタイプの市販ノニオン性 界面活性剤には、ＧＡＦ Corporationから販売されているIgepal^RＣＯ-６３０と 、すべてRohm & Haas Companyから販売されているTriton^RＸ-４５、Ｘ-１１４、 Ｘ-１００およびＸ-１０２がある。これらの界面活性剤はアルキルフェノールア ルコキシレート（例えば、アルキルフェノールエトキシレート）と通常称される 。 ２．脂肪族アルコールと約１〜約２５モルのエチレンオキシドとの縮合産物。 脂肪族アルコールのアルキル鎖は直鎖または分岐、一級または二級であり、通常 約８〜約２２の炭素原子を有している。炭素原子約１０〜約２０のアルキル基を 有するアルコールと、アルコール１モル当たり約２〜約１８モルのエチレンオキ シドとの縮合産物が特に好ましい。このタイプの市販ノニオン性界面活性剤の例 には、双方ともUnion Carbide Corporationから販売されているTergitol^R１５- Ｓ-９（Ｃ₁₁-Ｃ₁₅直鎖二級アルコールとエチレンオキシド９モルとの縮合産物） 、Tergitol^R２４-Ｌ-６ＮＭＷ（Ｃ₁₂-Ｃ₁₄一級アルコールとエチレンオキシド６ モルとの、狭い分子量分布の縮合産物）;Shell Chemical Companyから販売され ているNeodol^R４５-９（Ｃ₁₄-Ｃ₁₅直鎖アルコールとエチレンオキシド９モルと の縮合産物）、Neodol^R２３-６．５（Ｃ₁₂-Ｃ₁₃直鎖アルコールとエチレンオキ シド６．５モルとの縮合産物）、Neodol^R４５-７（Ｃ₁₄-Ｃ₁₅直鎖アルコールと エチレンオキシド７モルとの縮合産物）、Neodol^R４５-４（Ｃ₁₄-Ｃ₁₅直鎖アル コールとエチレンオキシド４モルとの縮合産物）； The Procter & Gamble Companyから販売されているKyro^RＥＯＢ（Ｃ₁₃-Ｃ₁₅アル コールとエチレンオキシド９モルとの縮合産物）がある。このカテゴリーのノニ オン性界面活性剤は通常“アルキルエトキシレート”と称される。 ３．プロピレンオキシドとプロピレングリコールとの縮合により形成される疎 水性ベースとエチレンオキシドとの縮合産物。これら化合物の疎水性部分は好ま しくは約１５００〜約１８００の分子量を有して、非水溶性を示す。この疎水性 部分へのポリオキシエチレン部分の付加は全体的に分子の水溶性を増加させる傾 向があり、産物の液性はポリオキシエチレン含有率が縮合産物の全重量の約５０ ％のところまでに留められ、これは約４０モル以内のエチレンオキシドとの縮合 に相当する。このタイプの化合物の例には、ＢＡＳＦから販売されている、ある 種の市販Pluronic^R界面活性剤がある。 ４．プロピレンオキシドとエチレンジアミンとの反応から得られる産物とエチ レンオキシドとの縮合産物。これら産物の疎水性部分はエチレンジアミンと過剰 プロピレンオキシドとの反応産物からなり、通常約２５００〜約３０００の分子 量を有する。この疎水性部分は、縮合産物が約４０〜約８０重量％のポリオキシ エチレンを含んで、約５０００〜約１１，０００の分子量を有する程度まで、エ チレンオキシドと縮合される。このタイプのノニオン性界面活性剤の例には、Ｂ ＡＳＦから販売されている、ある種の市販Tetronic^R化合物がある。 ５．半極性ノニオン性界面活性剤は、炭素原子約１０〜約１８の１つのアルキ ル部分と炭素原子約１〜約３のアルキル基およびヒドロキシアルキル基からなる 群より選択される２つの部分とを有した水溶性アミンオキシド；炭素原子約１０ 〜約１８の１つのアルキル部分と炭素原子約１〜約３のアルキル基およびヒドロ キシアルキル基からなる群より選択される２つの部分とを有した水溶性ホスフィ ンオキシド；炭素原子約１０〜約１８の１つのアルキル部分と炭素原子約１〜約 ３のアルキルおよびヒドロキシアルキル部分からなる群より選択される部分とを 有した水溶性スルホキシドを含めた、特定カテゴリーのノニオン性界面活性剤で ある。 半極性ノニオン性洗剤界面活性剤には、炭素原子約８〜約２６のアルキル、ヒ ドロキシアルキル、アルキルフェニル基またはそれらの混合を有したアミンオキ シド界面活性剤；約１〜約３のエチレンオキシド基を有するヒドロキシアルキレ ン基またはポリエチレンオキシド基がある。このような基は、例えば酸素または 窒素原子を介して互いに結合されて、環構造を形成していてもよい。 これらのアミンオキシド界面活性剤には、特にＣ₁₀-Ｃ₁₈アルキルジメチルア ミンオキシドとＣ₈-Ｃ₁₂アルコキシエチルジヒドロキシエチルアミンオキシドが ある。 ６．約６〜約３０の炭素原子、好ましくは約１０〜約１６の炭素原子をもつ疎 水基と、約１．３〜約１０、好ましくは約１．３〜約３、最も好ましくは約１． ３〜約２．７の糖単位をもつ多糖、例えばポリグリコシド親水基とを有する、１ ９８６年１月２１日付で発行されたLlenadoの米国特許第４，５６５，６４７号 明細書に開示されたアルキル多糖。５または６つの炭素原子を有する還元糖も使 用でき、例えばグルコース、ガラクトースおよびガラクトシル部分がグルコシル 部分の代わりに使用できる（場合により、疎水基が２、３、４位などに結合され て、グルコシドまたはガラクトシドに対するものとしてグルコースまたはガラク トースを与える）。例えば、追加糖単位の１つの位置と先の糖単位の２、３、４ および／または６位との間に、糖間結合が存在していてもよい。 場合により、望ましくはないが、疎水部分と多糖部分とを結合させるポリアル キレンオキシド鎖が存在してもよい。好ましいアルキレンオキシドはエチレンオ キシドである。典型的な疎水基には、約８〜約１８、好ましくは約１０〜約１６ の炭素原子を有する、飽和または不飽和、分岐または非分岐のアルキル基がある 。好ましくは、アルキル基は直鎖飽和アルキル基である。アルキル基は約３以内 のヒドロキシ基を含み、および／またはポリアルキレンオキシド鎖は約１０以内 、好ましくは５未満のアルキレンオキシド部分を含むことができる。適切なアル キル多糖はオクチル、ノニル、デシル、ウンデシルドデシル、トリデシル、テト ラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシルおよびオクタデシル、ジ -、トリ-、テトラ-、ペンタ-およびヘキサグルコシド、ガラクトシド、ラクトシ ド、グルコース、フルクトシド、フルクトースおよび／またはガラクトースであ る。適切な混合物では、ココナツアルキル、ジ-、トリ-、テトラ-およびペンタ グルコシドと、タローアルキルテトラ-、ペンタ-およびヘキサグルコシドを含有 している。 好ましいアルキルポリグリコシドは、アルキル、アルキルフェニル、ヒドロキ シアルキル、ヒドロキシアルキルフェニルおよびそれらの混合からなる群より選 択されるキャップ基を有しており、ここでアルキル基は約１０〜約１８、好まし くは約１２〜約１４の炭素原子を有する；ｎは２または３、好ましくは２である ；ｔは０〜約１０、好ましくは０である；ｘは約１．３〜約１０、好ましくは約 １．３〜約３、最も好ましくは約１．３〜約２．７である。グリコシルは、好ま しくはグルコースから誘導される。これらの化合物を製造するためには、アルコ ールまたはアルキルポリエトキシアルコールが最初に形成され、その後グルコー スまたはグルコース源と反応させてグルコシド（１位に結合）を形成させる。追 加グリコシル単位も、それらの１位と先のグリコシル単位の２、３、４および／ または６位、好ましくは主に２位との間で結合させてよい。 ７．約７〜約２１（好ましくは約９〜約１７）の炭素原子をもつアルキル基を 好ましくは有した脂肪酸アミド界面活性剤。好ましいアミドはＣ₈-Ｃ₂₀アンモニ アアミド、モノエタノールアミド、ジエタノールアミドおよびイソプロパノール アミドである。 ３．カチオン性界面活性剤 カチオン性界面活性剤も本発明の洗剤組成物に含有させることができる。カチ オン性界面活性剤には、アルキルジメチルアンモニウムハロゲナイドのようなア ンモニウム界面活性剤と、アルキル、アルキルアリールまたはアリール側鎖、ヒ ドロキシル化または酸化側鎖を有する界面活性剤があり、好ましくは約１０００ 未満の分子量を有する他の糖または糖様部分のセルロースのポリマーを含み、Ｘ はいずれかの適合性アニオンである。 本発明で有用な他のカチオン性界面活性剤は、参考のため本明細書に組み込ま れる１９８０年１０月１４日付で発行されたCambreの米国特許第４，２２８，０ ４４号明細書にも記載されている。 ４．他の界面活性剤 両性界面活性剤も本発明の洗剤組成物中に配合できる。これらの界面活性剤は 、二級または三級アミンの脂肪族誘導体、あるいはヘテロ環式二級および三級ア ミンの脂肪族誘導体として広く記載することができるが、脂肪族基は直鎖でもま たは分岐鎖でもよい。脂肪族置換基の１つは少くとも約８つの炭素原子、典型的 には約８〜約１８の炭素原子を有し、少くとも１つはアニオン性水溶性基、例え ばカルボキシ、スルホン酸、硫酸基を有している。両性界面活性剤の例について は、１９７５年１２月３０日付で発行されたLaughlinらの米国特許第３，９２９ ，６７８号明細書の第１９欄１８〜３５行目参照（参考のため本明細書に組み込 まれる）。 双極性界面活性剤も本洗剤組成物中に配合できる。これらの界面活性剤は、二 級および三級アミンの誘導体、ヘテロ環式二級および三級アミンの誘導体、ある いは四級アンモニウム、四級ホルホニウムまたは三級スルホニウム化合物の誘導 体として広く記載することができる。双極性界面活性剤の例については、１９７ ５年１２月３０日付で発行されたLaughlinらの米国特許第３，９２９，６７８号 明細書の第１９欄３８行目〜第２２欄４８行目参照（参考のため本明細書に組み 込まれる）。 両性および双極性界面活性剤は、１種以上のアニオン性および／またはノニオ ン性界面活性剤と通常併用される。 本発明の液体洗剤組成物は、“酵素性能増強量”のポリヒドロキシ脂肪酸アミ ド界面活性剤も含有してよい。“酵素増強”とは、組成物中に配合させて洗剤組 成物の酵素クリーニング性能を改善しうるポリヒドロキシ脂肪酸アミドの量を組 成物の業者が選択しうることを意味する。一般的に、常用レベルの酵素では、約 1重量％のポリヒドロキシ脂肪酸アミドの配合が酵素性能を高める。 本洗剤組成物は少くとも約１重量％ベースのポリヒドロキシ脂肪酸アミド界面 活性剤、好ましくは少くとも約３〜約５０％、最も好ましくは約３〜約３０％の ポリヒドロキシ脂肪酸アミドを典型的に含む。 ポリヒドロキシ脂肪酸アミド界面活性剤は下記式を有する： 上記式中Ｒ¹はHN Ｃ₁-Ｃ₄ヒドロカルビル、２-ヒドロキシエチル、２-ヒドロキ シプロピルまたはそれらの混合、好ましくはＣ₁-Ｃ₄アルキル、更に好ましくは Ｃ₁またはＣ₂アルキル、最も好ましくはＣ₁アルキル（即ち、メチル）である； Ｒ²はＣ₅-Ｃ₃₁ヒドロカルビル、好ましくは直鎖Ｃ₇-Ｃ₁₉アルキルまたはアルケ ニル、更に好ましくは直鎖Ｃ₉-Ｃ₁₇アルキルまたはアルケニル、最も好ましくは 直鎖Ｃ₁₁-Ｃ₁₅アルキルまたはアルケニル、またはそれらの混合である；Ｚは直 鎖ヒドロカルビル鎖とその鎖に直接結合された少くとも３つのヒドロキシルとを 有するポリヒドロキシヒドロカルビル、またはそのアルコキシル化（好ましくは 、エトキシル化またはプロポキシル化）誘導体である。Ｚは好ましくは還元アミ ノ化反応で還元糖から誘導され、更に好ましくはＺはグリシチルである。適切な 還元糖にはグルコース、フルクトース、マルトース、ラクトース、ガラクトース 、マンノースおよびキシロースがある。原料として、高デキストロースコーンシ ロップ、高フルクトースコーンシロップおよび高マルトースコーンシロップも、 上記の個別な糖以外に利用できる。これらのコーンシロップはＺについて糖成分 の混合であってもよい。他の適切な原料を排除する意味では決して ないことが理解されるべきである。Ｚは好ましくは-ＣＨ₂-（ＣＨＯＨ）_n-ＣＨ₂ ＯＨ、-ＣＨ（ＣＨ₂ＯＨ）-（ＣＨＯＨ）_n-1-ＣＨ₂ＯＨ、-ＣＨ₂-（ＣＨＯＨ）₂ （ＣＨＯＲ’）（ＣＨＯＨ）-ＣＨ₂ＯＨおよびそれらのアルコキシル化誘導体か らなる群より選択され、ここでｎは３〜５の整数であり、Ｒ’はＨあるいは環式 または脂肪族単糖である。最も好ましいのは、ｎが４であるグリコシル、特に- ＣＨ₂-（ＣＨＯＨ）₄-ＣＨ₂ＯＨである。 Ｒ’には例えばＮ-メチル、Ｎ-エチル、Ｎ-プロピル、Ｎ-イソプロピル、Ｎ- ブチル、Ｎ-２-ヒドロキシエチルまたは、Ｎ-２-ヒドロキシプロピルがある。 Ｒ²-ＣＯ-ＮＲ¹Ｚには、例えばコカミド、ステアラミド、オレアミド、ラルラ ミド、ミリストアミド、カプリカミド、パルミトアミド、タローアミドなどがあ る。 Ｚには、１-デオキシグルコシル、２-デオキシフルクトシル、１-デオキシマ ルトシル、１-デオキシラクトシル、１-デオキシガラクトシル、１-デオキシマ ンノシル、１-デオキシマルトトリオトシルなどがある。 ポリヒドロキシ脂肪酸アミドの製造方法は当業界で知られている。一般的に、 それらは、還元アミノ化反応でアルキルアミンを還元糖と反応させて対応Ｎ-ア ルキルポリヒドロキシアミンを形成させ、その後縮合／アミド化ステップでＮ- アルキルポリヒドロキシアミンを脂肪脂肪族エステルまたはトリグリセリドと反 応させて、Ｎ-アルキル、Ｎ-ポリヒドロキシ脂肪酸アミド産物を形成させること により作られる。ポリヒドロキシ脂肪酸アミドを含有した組成物の製造方法は、 例えば１９５９年２月１８日付で公開されたThomas Hedley & Co.,Ltd.のＧ．Ｂ ．特許明細書第８０９，０６０号、１９６０年１２月２０日付で発行されたE.R. Wilsonの米国特許第２，９６５，５７６号、１９５５年３月８日付で発行された Anthony M.Schwartzの米国特許第２，７０３，７９８号、１９３４年１２月２５ 日付で発行されたPiggottの米国特許第１，９８５，４２４号明細書に開示され ており、それら各々が参考のため本明細書に組み込まれる。 本発明で有用な界面活性剤の非制限例には、Ｃ₁₁-Ｃ₁₈アルキルベンゼンスル ホネートと一級およびランダムアルキルサルフェート、式ＣＨ₃（ＣＨ₂）_x（Ｃ ＨＯＳＯ₃~Ｍ⁺）ＣＨ₃およびＣＨ₃（ＣＨ₂）_y（ＣＨＯＳＯ₃~Ｍ⁺）ＣＨ₂ＣＨ₃の Ｃ₁₀-Ｃ₁₈二級（２，３）アルキルサルフェート（式中ｘおよび（ｙ＋１）は少 くとも約７、好ましくは少くとも約９の整数であり、Ｍは水溶性カチオン、特に ナトリウムである）、Ｃ₁₀-Ｃ₁₈アルキルアルコキシサルフェート（特に、ＥＯ １〜５エトキシサルフェート）、Ｃ₁₀-Ｃ₁₈アルキルアルコキシカルボキシレー ト（特に、ＥＯ１〜５エトキシカルボキシレート）、Ｃ₁₀-Ｃ₁₈アルキルポリグ リコシドおよびそれらの対応サルフェート化ポリグリコシド、Ｃ₁₂-Ｃ₁₈α-スル ホネート化脂肪酸エステル、Ｃ₁₂-Ｃ₁₈アルキルおよびアルキルフェノールアル コキシレート（特に、エトキシレートおよび混合エトキシ／プロポキシ）、Ｃ₁₂ -Ｃ₁₈ベタインおよびスルホベタイン（“スルタイン”）、Ｃ₁₀-Ｃ₁₈アミンオキ シドなどがある。アルキルアルコキシサルフェート（ＡＥＳ）およびアルキルア ルコキシカルボキシレート（ＡＥＣ）が本発明では好ましい（このような界面活 性剤と前記アミンオキシドおよび／またはベタインまたはスルタイン界面活性剤 との併用も、業者の希望に応じて好ましい）。他の慣用的で有用な界面活性剤は 標準テキストに掲載されている。特に有用な界面活性剤には、参考のため本明細 書に組み込まれる１９９３年３月１６日付で発行されたConnorらの米国特許第５ ，１９４，６３９号明細書に開示されたＣ₁₀-Ｃ₁₈Ｎ-メチルグルカミドがある。 他の活性成分、キャリヤ、ヒドロトロープ、加工助剤、染料または顔料、液体 処方用溶媒などを含めて、洗剤クリーニング組成物に有用な様々な他の成分も本 組成物に含有させることができる。起泡性の一層の増加が望まれるならば、Ｃ₁₀ -Ｃ₁₆アルコールアミドのような起泡増強剤が典型的には約１〜約１０％レベル で組成物中に配合できる。Ｃ₁₀-Ｃ₁₄モノエタノールおよびジエタノールアミド がこのような起泡増強剤の典型的クラスにある。このような起泡増強剤と前記の アミンオキシド、ベタインおよびスルタインのような高起泡性補助界面活性剤と の併用も有利である。所望であれば、ＭｇＣｌ₂、ＭｇＳＯ₄などのような可溶性 マグネシウム塩が、更に起泡性を出すために、典型的には約０．１〜約２％のレ ベルで添加できる。 Ｃ．プロテアーゼおよび他の酵素 業者は、典型的には約０．００１〜約１重量％のレベルで、このような組成物 中にセルラーゼ、リパーゼ、アミラーゼおよびプロテアーゼのような様々な追加 酵素を用いようとするかもしれない。様々な布帛ケア酵素が洗濯洗剤業界で周知 である。 本発明で好ましい組成物は、性能増強量の洗剤適合性第二酵素を更に含む。“ 洗剤適合性”とは、界面活性剤および洗浄ビルダーのような、液体洗剤組成物の 他成分との適合性を意味する。これらの第二酵素は、好ましくはリパーゼ、アミ ラーゼ、セルラーゼおよびそれらの混合物からなる群より選択される。“第二酵 素”という用語には前記プロテアーゼを含まず、そのため各組成物は少くとも１ 種のプロテアーゼを含めて少くとも２種類の酵素を含有している。組成物に用い られる第二酵素の量は、酵素のタイプに応じて変わる。一般的に、 約０．０００１〜０．３、更に好ましくは約０．００１〜０．１重量％のこれら 第二酵素が用いられることが好ましい。同種の酵素（例えば、リパーゼ）または ２種以上の酵素（例えば、セルラーゼおよびリパーゼ）の混合物も用いてよい。 精製または非精製形の酵素が用いられる。 液体洗剤組成物で使用に適したいかなる脂肪分解酵素もこれらの組成物に用い ることができる。本発明で使用に適したリパーゼ酵素には細菌および真菌起源の ものがある。 適切な細菌リパーゼには、参考のため本明細書に組み込まれる英国特許第１， ３７２，０３４号明細書に開示されたPseudomonas stutzeri ＡＴＣＣ １９． １５４のようなPseudomonas属の微生物により生産されるものがある。適切なリ パーゼには、微生物Pseudomonas fluorescens ＩＡＭ１０５７により生産された リパーゼの抗体と陽性の免疫交差反応を示すものがある。このリパーゼおよびそ の精製方法は、１９７８年２月２４日付で公開された日本特許出願第５３-２０ ４８７号明細書に記載されている。このリパーゼは商品名Lipase Ｐ"Amano"とし て日本、名古屋のAmano Pharmaceutical Co.Ltd.から市販されており、以下”Am ano-P”と称される。このようなリパーゼは、0uchterlony（Acta.Med.Scan.,133 ,pages 76-79(1950)）による標準および周知の免疫拡散操作を用いると、 Amano-Ｐ抗体と陽性の免疫交差反応を示すはずである。これらのリパーゼと、 Amano-Ｐとの免疫交差反応の方法も、参考のため本明細書に組み込まれる１９８ ７年１１月１７日付で公開されたThomらの米国特許第４，７０７，２９１号明細 書に記載されている。その典型例は、Amano-Ｐリパーゼ、 リパーゼex Pseudomonas fragi FERM P1339（商品名Amano-Ｂで市販）、 リパーゼex Pseudomonas nitroreducens var.lipolyticum FERM P 1338（商品名 Amano-CESで市販）、リパーゼex Chromobacter viscosum、例えば日本、田方の 東洋醸造社から市販のChromobacter viscosum var.lipolyticum NRRLB 3673;Ｕ ＳＡのU.S.Biochemical Corp．およびオランダのDisoynth Co.からの Chromobacter viscosumリパーゼ；リパーゼex Pseudomonas gladioliである。 適切な真菌リパーゼには、Humicola lanuginosaおよびThermomyces lanuginosusにより生産されうるものがある。Humicola lanuginosaからの遺伝子 をクローニングして、欧州特許出願第０２５８０６８号明細書 （Novo Industries A/S）に記載されたようなAspergillus oryzaeでその遺伝子 を発現させることにより得られ、商品名Lipolase^RでNovo Nordisk A/Sから市販 されているリパーゼが最も好ましい。 約１０〜１８０００、好ましくは約６０〜６０００リパーゼ単位／ｇ（ＬＵ／ ｇ）のリパーゼがこれらの組成物で用いられる。リパーゼ単位とはｐＨスタット で１分間当たりに滴定しうる脂肪酸１mmolを生じるリパーゼの量のことであり、 その際にｐＨは９．０であり、温度は３０℃であり、基質は５mmol／l Tris緩衝 液中１３mmol／l Ｃａ⁺⁺および２０mmol／l ＮａClの存在下における３．３wt％ のオリーブ油および３．３％のアラビアガムのエマルジョンである。 液体洗剤組成物で使用に適したいかなるセルラーゼもこれらの組成物に用いる ことができる。本発明で使用に適したセルラーゼ酵素には、細菌または真菌起源 のものを含む。好ましくは、それらは５〜９．５の至適ｐＨを有している。約０ ．０００１〜０．１重量％のセルラーゼが使用できる。 適切なセルラーゼは、参考のため本明細書に組み込まれる１９８４年３月６日 付で発行されたBarbesgaardらの米国特許第４，４３５，３０７号明細書に開示 されており、そこではHumicola insolensから生産された真菌セルラーゼを開示 している。適切なセルラーゼはＧＢ-Ａ-２，０７５，０２８、ＧＢ-Ａ-２，０９ ５，２７５およびＤＥ-ＯＳ-２，２４７，８３２にも開示されている。 このようなセルラーゼの例は、Humicola insolensの株(Humicola grisea var. thermoidea）、特にHumicola株ＤＳＭ１８００により生産されるセルラーゼと、 Bacillus Ｎの真菌またはAeromonas属に属するセルラーゼ２１２生産真菌により 生産されるセルラーゼと、海洋軟体動物(Dolabella Auricula Solander)の肝膵 から抽出されるセルラーゼである。 液体洗剤組成物で使用に適したいかなるアミラーゼもこれらの組成物に使用で きる。アミラーゼには、例えばB.licheniformisの特定株から得られるアミラー ゼがあり、英国特許明細書第１，２９６，８３９号（Novo）で更に詳細に記載さ れている。デンプン分解タンパク質には、例えばRapidase^R,International Bio- Synthetics,Inc.およびTermamyl^R,Novo Industriesがある。 約０．０００１〜０．５５、好ましくは約０．０００５〜０．１重量％のアミ ラーゼが使用できる。 Ｄ．他の（任意）成分 本液体洗剤組成物は、キャリヤとして水および他の溶媒を含有することができ る。メタノール、エタノール、プロパノールおよびイソプロパノールで例示され る低分子量一級または二級アルコールが適切である。一価アルコールが界面活性 剤を溶解させる上で好ましいが、約２〜約６の炭素原子と約２〜約６のヒドロキ シ基を含むようなポリオール（例えば、１，３-プロパンジオール、エチレング リコール、グリセリンおよび１，２-プロパンジオール）も使用できる。組成物 は約５〜約９０％、典型的には約１０〜約５０％のこのようなキャリヤを含有し てもよい。 本洗剤組成物は、水性クリーニング操作で使用中に、洗浄水が約６．８〜約１ １．０のｐＨを有するように処方されることが好ましい。このため、最終製品は 典型的にはこの範囲で処方される。推奨される使用量レベルでｐＨをコントロー ルするための技術には緩衝剤、アルカリ、酸などの使用があり、これは当業者に 周知である。 ペルカーボネート、ペルボレートなどのような様々な漂白化合物が、典型的に は約１〜約１５重量％のレベルでこのような組成物中に使用できる。所望であれ ば、このような組成物はテトラアセチルエチレンジアミン、ノナノイルオキシベ ンゼンスルホネートなどのようなブリーチアクチベーターも含有することができ 、これらも当業界で知られている。使用レベルは、典型的には約１〜約１０重量 ％の範囲である。 様々な汚れ放出剤、特にアニオン性オリゴエステルタイプ、様々なキレート化 剤、特にアミノホスホネートおよびエチレンジアミン二コハク酸、様々な土汚れ 除去剤、特にエトキシル化テトラエチレンペンタミン、様々な分散剤、特にポリ アクリレートおよびポリアルパラテート、様々な増白剤、特にアニオン性増白剤 、様々な起泡抑制剤、特にシリコーンおよび二級アルコール、様々な布帛柔軟剤 、特にスメクタイトクレーなどはすべて約１〜約３５重量％範囲のレベルでこの ような組成物に使用できる。標準処方集と公開特許には、このような常用物質の 多数の詳細な記載を含んでいる。 酵素安定剤もクリーニング組成物に用いてよい。このような安定剤にはプロピ レングリコール（好ましくは、約１〜約１０％）、ギ酸ナトリウム（好ましくは 、約０．１〜約１％）およびギ酸カルシウム（好ましくは、約０．１〜約１％） がある。 本発明の硬質表面クリーニング組成物および布帛クリーニング組成物を処方す る場合、業者は約５〜約５０重量％のレベルで様々なビルダーを用いようとする かもしれない。典型的ビルダーには、１〜１０ミクロンゼオライト、ポリカルボ キシレート、例えばシトレートおよびオキシジサクシネート、積層シリケート、 ホスフェートなどがある。他の慣用的ビルダーは標準処方集に掲載されている。 ０〜約５０重量％の洗浄ビルダーが本発明に使用できる。無機および有機ビル ダーが使用できる。存在するとき、組成物は典型的には少くとも約１％のビルダ ーを含んでいる。液体処方物は、好ましくは約３〜約３０重量％、更に好ましく は約５〜２０％の洗剤ビルダーを含む。 無機洗剤ビルダーには、ポリホスフェート（トリポリホスフェート、ピロホス フェートおよびガラス質ポリマーメタホスフェートで例示される）、ホスホネー ト、フィチン酸、シリケート、カーボネート（ビカーボネートおよびセスキカー ボネートを含む）、サルフェートおよびアルミノシリケートのアルカリ金属、ア ンモニウムおよびアルカノールアンモニウム塩があるが、それらに限定されない 。 ボレートビルダーと、洗剤貯蔵または洗浄条件下でボレートを生じうるボレート 形成物質を含有したビルダー（以下、包括して“ボレートビルダー”）も使用で きる。好ましくは、非ボレートビルダーは、約５０℃未満、特に約４０℃未満の 洗浄条件下で用いられる本発明の組成物に用いられる。 シリケートビルダーの例は、アルカリ金属シリケート、特に１．６：１〜 ３．２：１範囲のＳｉＯ₂：Ｎａ₂Ｏ比を有するものと、参考のため本明細書に組 み込まれる１９８７年５月１２日付で発行されたH.P.Rieckの米国特許第４，６ ６４，８３９号明細書に記載された積層ナトリウムシリケートのような積層シリ ケートである。しかしながら、顆粒処方でクリスプニング(crispening)剤として 、酸素ブリーチ用の安定剤として、および起泡コントロール系の成分として働け る、例えばマグネシウムシリケートのような他のシリケートも有用である。 カーボネートビルダーの例は、１９７３年１１月１５日付で公開されたドイツ 特許出願第２，３２１，００１号明細書に開示されたような、炭酸およびセスキ 炭酸ナトリウムと、それらと超微細炭酸カルシウムとの混合物を含めた、アルカ リ土類およびアルカリ金属カーボネートであり、その開示は参考のため本明細書 に組み込まれる。 アルミノシリケートビルダーが本発明で有用である。アルミノシリケートビル ダーはほとんどの現行市販重質顆粒洗剤組成物で非常に重要であり、液体洗剤処 方で重要なビルダー成分でもある。アルミノシリケートビルダーには下記実験式 を有するものがある： Ｍ_z（ｚＡｌＯ₂・ｙＳｉＯ₂） 上記式中Ｍはナトリウム、カリウム、アンモニウムまたは置換アンモニウムであ り、ｚは約０．５〜約２であり、ｙは１であり、この物質は無水アルミノシリケ ートｇ当たり少くとも約５０ｍｇ相当のＣａＣＯ₃硬度のマグネシウムイオン交 換能を有している。好ましいアルミノシリケートは下記式を有するゼオライトビ ルダーである： Ｎａ_z〔（ＡｌＯ₂）_z（ＳｉＯ₂）_y〕・ｘＨ₂Ｏ 上記式中ｚおよびｙは少くとも６の整数であり、ｚ対ｙのモル比は１．０〜 約０．５の範囲であり、ｘは約１５〜約２６４の整数である。 有用なアルミノシリケートイオン交換物質が市販されている。これらのアルミ ノシリケートは構造上結晶でも非晶質でもよく、天然アルミノシリケートでもま たは合成で誘導してもよい。アルミノシリケートイオン交換物質の製造方法は、 参考のため本明細書に組み込まれる１９７６年１０月１２日付で発行された Krummelらの米国特許第３，９８５，６６９号明細書に開示されている。本発明 で有用な好ましい合成結晶アルミノシリケートイオン交換物質はゼオライトＡ、 ゼオライトＰ（Ｂ）およびゼオライトＸという名称で市販されている。特に好ま しい態様において、結晶アルミノシリケートイオン交換物質は下記式を有してい る: Ｎａ₁₂〔（ＡｌＯ₂）₁₂（ＳｉＯ₂）₁₂〕・ｘＨ₂Ｏ 上記式中ｘは約２０〜約３０、特に約２７である。この物質はゼオライトＡとし て知られる。好ましくは、アルミノシリケートは直径約０．１〜１０ミクロンの 粒度を有する。 ポリホスフェートの具体例は、アルカリ金属トリポリホスフェート、ナトリウ ム、カリウムおよびアンモニウムピロホスフェート、ナトリウム、カリウムおよ びアンモニウムピロホスフェート、ナトリウムおよびカリウムオルトホスフェー ト、ナトリウムポリメタホスフェート（重合度は約６〜約２１である）と、フィ チン酸の塩である。 ホスホネートビルダー塩の例は、エタン-１-ヒドロキシ-１，１-ジホスホネー トの水溶性塩、特にナトリウムおよびカリウム塩、メチレンジホスホン酸の水溶 性塩、例えば三ナトリウムおよび三カリウム塩、置換メチレンジホスホン酸 の水溶性塩、例えば三ナトリウムおよび三カリウムエチリデン、イソプロピリデ ン、ベンジルメチリデンおよびハロメチリデンホスホネートである。前記タイプ のホスホネートビルダー塩は、１９６４年１２月１日付および１９６５年１０月 １９日付で発行されたDiehlの米国特許第３，１５９，５８１号および第３，２ １３，０３０号；１９６９年１月１４日付で発行されたRoyの米国特許第３，４ ２２，０２１号；１９６８年９月３日付および１９６９年１月１４日付で発行さ れたQuimbyの米国特許第３，４００，１４８号および第３，４２２，１３７号明 細書に開示されており、上記開示は参考のため本明細書に組み込まれる。 本発明の目的にとり好ましい有機洗剤ビルダーには様々なポリカルボキシレー ト化合物がある。本発明で用いられる“ポリカルボキシレート”とは、多数のカ ルボキシレート基、好ましくは少くとも３つのカルボキシレートを有した化合物 に関する。 ポリカルボキシレートビルダーは通常酸形で組成物に加えられるが、中和塩の 形で加えてもよい。塩形で利用される場合には、ナトリウム、カリウムおよびリ チウムのようなアルカリ金属、またはアルカノールアンモニウム塩が好ましい。 ポリカルボキシレートビルダーの中には、様々なカテゴリーの有用な物質が含 まれる。ポリカルボキシレートビルダーの１つの重要なカテゴリーには、エーテ ルポリカルボキシレートを含む。いくつかのエーテルポリカルボキシレートが洗 剤ビルダー用として開示されている。有用なエーテルポリカルボキシレートの例 には、１９６４年４月７日付で発行されたBergの米国特許第３，１２８，２８７ 号および１９７２年１月１８日付で発行されたLambertiらの米国特許第３，６３ ５，８３０号明細書に開示されているようなオキシジサクシネートがあり、双方 とも参考のため本明細書に組み込まれる。 本発明でビルダーとして有用なエーテルポリカルボキシレートの特別なタイプ には、下記一般式を有するものがある： ＣＨ（Ａ）（ＣＯＯＸ）-ＣＨ（ＣｏｏＸ）-Ｏ- ＣＨ（Ｃ００Ｘ）-ＣＨ（Ｃ００Ｘ）（Ｂ） 上記式中ＡはＨまたはＯＨである；ＢはＨまたは -Ｏ-ＣＨ（ＣＯＯＸ）-ＣＨ₂（ＣＯＯＸ）である；ＸはＨまたは塩形成カチオン である。例えば、上記一般式ＡおよびＢが双方ともＨであるならば、その化合物 はオキシジコハク酸およびその水溶性塩である。ＡがＯＨおよびＢがＨであるな らば、その化合物はタートレートモノコハク酸（ＴＭＳ）およびその水溶性塩で ある。ＡがＨおよびＢが-Ｏ-ＣＨ（ＣＯＯＸ）-ＣＨ₂（ＣＯＯＸ）であるならば 、その化合物はタートレートジコハク酸（ＴＤＳ）およびその水溶性塩である。 これらビルダーの混合物も本発明で使用上特に好ましい。約９７：３〜約２０： ８０のＴＭＳ対ＴＤＳの重量比にあるＴＭＳおよびＴＤＳの混合物が特に好まし い。これらのビルダーは、１９８７年５月５日付でBushらに発行された米国特許 第４，６６３，０７１号明細書に開示されている。 適切なエーテルポリカルボキシレートには、米国特許第３，９２３，６７９号 、第３，８３５，１６３号、第４，１５８，６３５号、第４，１２０，８７４号 および第４，１０２，９０３号明細書に記載されたような環式化合物、特に脂環 式化合物もあり、それらすべてが参考のため本明細書に組み込まれる。 他の有用な洗浄ビルダーには、下記構造で表されるエーテルヒドロキシポリカ ルボキシレートがある： ＨＯ-〔Ｃ（Ｒ）（ＣＯＯＭ）-Ｃ（Ｒ）（ＣＯＯＭ）-Ｏ〕_n-Ｈ 上記式中Ｍは水素、または得られた塩が水溶性となるカチオン、好ましくはアル カリ金属、アンモニウムまたは置換アンモニウムカチオンであり、ｎは約２〜約 １５（好ましくはｎは約２〜約１０、更に好ましくはｎは平均で約２〜約４）で あり、各Ｒは同一であるかまたは異なり、水素、Ｃ_1-4アルキルまたはＣ_1-4置換 アルキルから選択される（好ましくはＲは水素である）。 更に他のエーテルポリカルボキシレートには、無水マレイン酸とエチレンまた はビニルメチルエーテルとのコポリマー、１，３，５-トリヒドロキシベンゼン- ２，４，６-トリスルホン酸およびカルボキシメチルオキシコハク酸がある。 有機ポリカルボキシレートビルダーには、ポリ酢酸の様々なアルカリ金属、ア ンモニウムおよび置換アンモニウム塩もある。例には、エチレンジアミン四酢酸 およびニトリロ三酢酸のナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウムおよび 置換アンモニウム塩がある。 メリット酸、コハク酸、オキシジコハク酸、ポリマレイン酸、ベンゼン-１， ３，５-トリカルボン酸、カルボキシメチルオキシコハク酸およびそれらの可溶 性塩のようなポリカルボキシレートも含まれる。 シトレートビルダー、例えばクエン酸およびその可溶性塩（特にナトリウム塩 ）は、重質液体洗剤処方で特に重要なポリカルボキシレートビルダーであるが、 顆粒組成物でも使用できる。 他のカルボキシレートビルダーには、参考のため本明細書に組み込まれる １９７３年３月２８日付で発行されたDiehlの米国特許第３，７２３，３２２号 明細書に開示されたカルボキシル化炭水化物がある。 本発明の洗剤組成物では、参考のため本明細書に組み込まれる１９８６年１月 ２８日付で発行されたBushの米国特許第４，５６６，９８４号明細書に開示され た３，３-ジカルボキシ-４-オキサ-１，６-ヘキサンジオエート類と関連化合物 も適している。有用なコハク酸ビルダーにはＣ₅-Ｃ₂₀アルキルコハク酸とその塩 がある。このタイプの特に好ましい化合物はドデセニルコハク酸である。アルキ ルコハク酸は、典型的には下記一般式： Ｒ-ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＣＨ₂（ＣＯＯＨ） 即ち、コハク酸の誘導体であり、上記式中Ｒは炭化水素、例えばＣ₁₀-Ｃ₂₀、好 ましくはＣ₁₂-Ｃ₁₆アルキルまたはアルケニルであるか、またはＲはヒドロキシ ル、スルホ、スルホキシまたはスルホン置換基で置換されており、すべて上記特 許に記載されたとおりである。 サクシネートビルダーは、好ましくは、ナトリウム、カリウム、アンモニウム およびアルカノールアンモニウム塩を含めた水溶性塩の形で用いられる。 サクシネートビルダーの具体例には、ラウリルサクシネート、ミリスチルサク シネート、パルミチルサクシネート、２-ドデセニルサクシネート（好ましい） 、２-ペンタデセニルサクシネート等がある。ラウリルサクシネートがこのグル ープの好ましいビルダーであり、１９８６年１１月５日付で公開された欧州特許 出願第８６２００６９０．５／０，２００，２６３号明細書に記載されている。 有用なビルダーの例には、ナトリウムおよびカリウムカルボキシメチルオキシ マロネート、カルボキシメチルオキシサクシネート、シス-シクロヘキサンヘキ サカルボキシレート、シス-シクロペンタンテトラカルボキシレート、水溶性ポ リアクリレート（約２０００以上の分子量を有するこれらのポリアクリレートも 、分散剤として有効に利用できる）と、無水マレイン酸とビニルメチルエーテル またはエチレンとのコポリマーもある。 他の適切なポリカルボキシレートは、参考のため本明細書に組み込まれる １９７９年３月１３日付で発行されたCrutchfieldらの米国特許第４，１４４， ２２６号明細書に開示されたポリアセタールカルボキシレートである。これらの ポリアセタールカルボキシレートは、重合条件下で、グリオキシル酸のエステル および重合開始剤を一緒にすることにより製造できる。次いで、得られるポリア セタールカルボキシレートエステルは、アルカリ溶液中で急速な解重合に対して ポリアセタールカルボキシレートを安定化させるために化学的に安定な末端基に 結合され、対応塩に変換されて、界面活性剤に加えられる。 ポリカルボキシレートビルダーは、参考のため本明細書に組み込まれる １９６７年３月７日付で発行されたDiehlの米国特許第３，３０８，０６７号明 細書にも開示されている。このような物質には、マレイン酸、イタコン酸および メチレンマロン酸のような脂肪族カルボン酸のホモおよびコポリマーの水溶性塩 がある。 当業界で知られる他の有機ビルダーも使用できる。例えば、長鎖ヒドロカルビ ルを有するモノカルボン酸およびその水溶性塩が利用できる。これらには“石鹸 ”と通常称される物質がある。Ｃ₁₀-Ｃ₂₀の長鎖が典型的に用いられる。ヒドロ カルビルは飽和でもまたは不飽和でもよい。 他の任意成分には、キレート化剤、土汚れ除去／再付着防止剤、ポリマー分散 剤、ブリーチ、増白剤、起泡抑制剤、溶媒およびエステチック剤がある。 VI．組成物の使用例 本洗剤組成物は、様々な組成物として、例えば洗濯洗剤と硬質表面クリーナー または皿洗い組成物として処方できる。 １．硬質表面クリーニング組成物 本発明で用いられる“硬質表面クリーニング組成物”とは、床、壁、浴室タイ ルなどのような硬質表面をクリーニングするための液体および顆粒洗剤組成物に 関する。本発明の硬質表面クリーニング組成物は、有効量の１種以上の本発明の 変種、好ましくは組成物の約０．００１〜約１０重量％、更に好ましくは約０． ０１〜約５％、更に一層好ましくは約０．０５〜約１％の変種を含有している。 １種以上の変種を含有することに加えて、このような硬質表面クリーニング組成 物は典型的には界面活性剤と水溶性金属イオン封鎖ビルダーを含有する。しかし ながら、スプレーウィンドークリーナーのようなある特殊製品では界面活性剤が 時々用いられないが、その理由はそれらがガラス表面で薄膜状／すじ状残留物を 形成することがあるためである。 界面活性剤成分は存在するとき本組成物の０．１％と少ないが、典型的には組 成物は約０．２５〜約１０％、更に好ましくは約１〜約５％の界面活性剤を含有 している。 典型的には、組成物は約０．５〜約５０％、好ましくは約１〜約１０％の洗浄 ビルダーを含有する。 好ましくは、ｐＨは約８〜１２の範囲にあるべきである。水酸化ナトリウム、 炭酸ナトリウムまたは塩酸のような慣用的ｐＨ調整剤が、調整が必要ならば使用 できる。 溶媒も組成物に含有させてよい。有用な溶媒にはグリコールエーテル、例えば ジエチレングリコールモノヘキシルエーテル、ジエチレングリコールモノブチル エーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、エチレングリコールモノヘ キシルエーテル、プロピレングリコールモノブチルエーテル、ジプロピレングリ コールモノブチルエーテルと、ジオール、例えば２，２，４-トリメチル-１，３ -ペンタンジオールおよび２-エチル-１，３-ヘキサンジオールがあるが、それら に限定されない。用いられる場合、このような溶媒は典型的には約０．５〜約１ ５％、好ましくは約３〜約１１％のレベルで存在する。 加えて、イソプロパノールまたはエタノールのような高揮発性溶媒は、表面へ の組成物の“フルストレンクス”適用後に表面が洗い落とされないとき、表面か ら組成物の速い蒸発を促進するために、本組成物で用いることができる。用いら れる場合、揮発性溶媒は典型的には組成物中に約２〜約１２％のレベルで存在す る。 本発明の適切な硬質表面クリーニング組成物態様は、下記例で示されている。 ^*Ｎ-ジエチレングリコール-Ｎ，Ｎ-イミノ二酢酸二ナトリウム^** Ｎａ₄エチレンジアミン二酢酸^*** ジエチレングリコールモノヘキシルエーテル^**** すべての処方物はｐＨ７に調整する 上記例において、列挙されたまたは特許請求の範囲に記載されたいずれの変種 も、実質上同様の結果で上記変種に置き代わる。 製品ｐＨは７に調整する。 上記例において、列挙されたまたは特許請求の範囲に記載されたいずれの変種 も、実質上同様の結果で上記変種に置き代わる。 ２．皿洗い組成物 本発明のもう１つの態様において、皿洗い組成物は１種以上の本発明の変種を 含んでいる。本発明で用いられる“皿洗い組成物”とは、限定されないが、顆粒 、ゲルおよび液体形態を含めて、皿をクリーニングするためのすべての形態の組 成物に関する。本発明の適切な皿洗い組成物態様は下記例で示されている。 製品ｐＨは７に調整する。 上記例において、列挙されたまたは特許請求の範囲に記載されたいずれの変種 も、実質上同様の結果で上記変種に置き代わる。 ３．布帛クリーニング組成物 本発明のもう１つの態様において、布帛クリーニング組成物は１種以上の本発 明の変種を含んでいる。本発明で用いられる“布帛クリーニング組成物”とは、 限定されないが、顆粒、液体および固形を含めて、布帛をクリーニングするため のすべての形態の洗剤組成物に関する。好ましい布帛クリーニング組成物は液体 形態をとるものである。 ａ．顆粒布帛クリーニング組成物 本発明の顆粒布帛クリーニング組成物は、有効量の１種以上の本発明の変種、 好ましくは組成物の約０．００１〜約１０重量％、更に好ましくは約０．００５ 〜約５％、更に好ましくは約０．０１〜約１％の活性剤を含有している。１種以 上の変種に加えて、顆粒布帛クリーニング組成物は典型的には少くとも１種の界 面活性剤、１種以上のビルダーと、一部の場合には漂白剤を含む。 本発明の適切な顆粒布帛クリーニング組成物態様は下記例で示されている。 上記例において、列挙されたまたは特許請求の範囲に記載されたいずれの変種 も、実質上同様の結果で上記変種に置き代わる。 上記例において、列挙されたまたは特許請求の範囲に記載されたいずれの変種 も、実質上同様の結果で上記変種に置き代わる。 上記例において、列挙されたまたは特許請求の範囲に記載されたいずれの変種 も、実質上同様の結果で上記変種に置き代わる。 上記例において、列挙されたまたは特許請求の範囲に記載されたいずれの変種 も、実質上同様の結果で上記変種に置き代わる。 上記例において、列挙されたまたは特許請求の範囲に記載されたいずれの変種 も、実質上同様の結果で上記変種に置き代わる。 上記例において、列挙されたまたは特許請求の範囲に記載されたいずれの変種 も、実質上同様の結果で上記変種に置き代わる。 上記例において、列挙されたまたは特許請求の範囲に記載されたいずれの変種 も、実質上同様の結果で上記変種に置き代わる。 上記例において、列挙されたまたは特許請求の範囲に記載されたいずれの変種 も、実質上同様の結果で上記変種に置き代わる。 上記例において、列挙されたまたは特許請求の範囲に記載されたいずれの変種 も、実質上同様の結果で上記変種に置き代わる。 ｂ．液体布帛クリーニング組成物 本発明の液体布帛クリーニング組成物は、有効量の１種以上の本発明の変種、 好ましくは組成物の約０．００５〜約５重量％、更に好ましくは約０．０１〜約 １％の活性剤を含有している。このような液体布帛クリーニング組成物は、典型 的にはアニオン性界面活性剤、脂肪酸、水溶性洗浄ビルダーおよび水を更に含ん でいる。 本発明の適切な液体布帛クリーニング組成物態様は下記例で示されている。 上記例において、列挙されたまたは特許請求の範囲に記載されたいずれの変種 も、実質上同様の結果で上記変種に置き代わる。 上記例において、列挙されたまたは特許請求の範囲に記載されたいずれの変種 も、実質上同様の結果で上記変種に置き代わる。 上記例において、列挙されたまたは特許請求の範囲に記載されたいずれの変種 も、実質上同様の結果で上記変種に置き代わる。 上記例において、列挙されたまたは特許請求の範囲に記載されたいずれの変種 も、実質上同様の結果で上記変種に置き代わる。 ｃ．固形布帛クリーニング組成物 手洗い汚れ布帛用に適した本発明の固形布帛クリーニング組成物は、有効量の １種以上の本発明の変種を、好ましくは組成物の約０．００１〜約１０重量％、 更に好ましくは約０．０１〜約１％で含有する。 本発明の適切な固形布帛クリーニング組成物態様は下記例で示されている。 ^*ＣａＣＯ₃、タルク、クレー、シリケートなどのような好都合な物質から選択す ることができる 上記例において、列挙されたまたは特許請求の範囲に記載されたいずれの変種 も、実質上同様の結果で上記変種に置き代わる。 ^*ＣａＣＯ₃、タルク、クレー、シリケートなどのような好都合な物質から選択す ることができる 上記例において、列挙されたまたは特許請求の範囲に記載されたいずれの変種 も、実質上同様の結果で上記変種に置き代わる。 Ｂ．追加クリーニング組成物 前記の硬質表面クリーニング、皿洗いおよび布帛クリーニング組成物に加えて 、１種以上の本発明の変種も不溶性基質の加水分解が望まれる様々な他のクリー ニング組成物中に配合してよい。このような追加クリーニング組成物にはオーラ ルクリーニング組成物、義歯クリーニング組成物およびコンタクトレンズクリー ニング組成物があるが、それらに限定されない。 １．オーラルクリーニング組成物 本発明のもう１つの態様において、製薬上許容される量の１種以上の本発明の 変種が歯または義歯からペプチド汚れを除去する上で有用な組成物中に含有され る。本発明で用いられる“オーラルクリーニング組成物”とは、歯磨剤、練歯磨 剤、歯磨ゲル、歯磨粉、洗口液、マウススプレー、マウスゲル、チューインガム 、ロゼンジ、小包、錠剤、バイオゲル、予防ペースト、デンタル処理液などに関 する。好ましくは、オーラルクリーニング組成物は組成物の約０．０００１〜 約２０重量％、更に好ましくは約０．００１〜約１０％、更に一層好ましくは約 ０．０１〜約５％の１種以上の本発明の変種と、製薬上許容されるキャリヤとを 含んでいる。本明細書で用いられる“製薬上許容される”とは、その用語が表す 薬物、薬剤または不活性成分が、妥当な利益／危険比で釣り合って、過度の毒性 、不適合性、不安定性、剌激、アレルギー反応などなく、ヒトおよびそれより下 等の動物の組織と接触させる使用に適していることを意味する。 典型的には、オーラルクリーニング組成物のオーラルクリーニング成分の製薬 上許容されるオーラルクリーニングキャリヤ成分は、通常組成物の約５０〜 約９９．９９重量％、好ましくは約６５〜約９９．９９％、更に好ましくは 約６５〜約９９％である。 本発明のオーラルクリーニング組成物に含有させてもよい製薬上許容されるキ ャリヤ成分と任意成分は当業者に周知である。オーラルクリーニング組成物で有 用な様々な組成タイプ、キャリヤ成分と任意成分は、１９９２年３月１７日付で 発行されたSeibelの米国特許第５，０９６，７００号；１９９１年７月２日付で 発行されたSampathkumarの米国特許第５，０２８，４１４号；１９９１年７月２ 日付で発行されたBenedict,BushおよびSunbergの米国特許第５，０２８，４１５ 号明細書に開示されており、それらすべてが参考のため本明細書に組み込まれる 。 本発明の適切なオーラルクリーニング組成物態様は下記例に示されている。 ^*ＰＥＧ＊６＝６００の分子量を有するポリエチレングリコール^** J.M.Huber供給のZeodent 119として特定される沈降シリカ^*** B.F.Goodrich Chemical Company供給のCarbopol^**** Hercules Chemical Company供給のIotaカラゲナン 上記例において、列挙されたまたは特許請求の範囲に記載されたいずれの変種 も、実質上同様の結果で上記変種に置き代わる。 上記例において、列挙されたまたは特許請求の範囲に記載されたいずれの変種 も、実質上同様の結果で上記変種に置き代わる。 上記例において、列挙されたまたは特許請求の範囲に記載されたいずれの変種 も、実質上同様の結果で上記変種に置き代わる。 ^*L.A.Dreyfus Company供給 上記例において、列挙されたまたは特許請求の範囲に記載されたいずれの変種 も、実質上同様の結果で上記変種に置き代わる。 ２．義歯クリーニング組成物 本発明のもう１つの態様において、口腔外で義歯をクリーニングするための義 歯クリーニング組成物は１種以上の本発明の変種を含有している。このような義 歯クリーニング組成物は、有効量の１種以上の変種、好ましくは組成物の 約０．０００１〜約５０重量％、更に好ましくは約０．００１〜約３５％、更に 一層好ましくは約０．０１〜約２０％の１種以上の変種と、義歯クリーニングキ ャリアとを含んでいる。発泡錠などのような様々な義歯クリーニング組成物フォ ーマットが当業界で周知であり（例えば、参考のため本明細書に組み込まれるYo ungの米国特許第５，０５５，３０５号明細書参照）、義歯からペプチド汚れを 除去する上で１種以上の変種の配合用に通常適している。 本発明の義歯クリーニング組成物態様は下記例で示されている。 ^*テトラアセチルエチレンジアミン 上記例において、列挙されたまたは特許請求の範囲に記載されたいずれの変種 も、実質上同様の結果で上記変種に置き代わる。 ３．コンタクトレンズクリーニング組成物 本発明のもう１つの態様において、コンタクトレンズクリーニング組成物は１ 種以上の本発明の変種を含んでいる。このようなコンタクトレンズクリーニング 組成物は、有効量の１種以上の変種、好ましくは組成物の約０．０１〜約５０重 量％、更に好ましくは約０．０１〜約２０％、更に一層好ましくは約１〜約５％ の１種以上の変種と、コンタクトレンズクリーニングキャリアとを含んでいる。 錠剤、液体などのような様々なコンタクトレンズクリーニング組成物フォーマッ トが当業界で周知であり（例えば、１９８９年９月５日付で発行されたDavies、 MeakenおよびReesの米国特許第４，８６３，６２７号、１９８８年５月２４日付 で再発行されたHuth、LamおよびKiraiの米国特許Ｒｅ．第３２，６７２号、 １９８６年９月２日付で発行されたSchaferの米国特許第４，６０９，４９３号 、１９８７年９月１日付で発行されたOgunbiyiおよびSmithの米国特許第４，６ ９0，７９３号、１９８６年９月３０日付で発行されたogunbiyi、Riedhammerお よびSmithの米国特許第4，６１４，５４９号、１９８１年８月２５日付で発行さ れたOgataの米国特許第４，２８５，７３８号明細書参照；それら各々が参考の ため本明細書に組み込まれる）、コンタクトレンズからペプチド汚れを除去する 上で１種以上の本発明の変種の配合用に通常適している。 本発明の適切なコンタクトレンズクリーニング組成物態様は下記例で示されて いる。 上記例において、列挙されたまたは特許請求の範囲に記載されたいずれの変種 も、実質上同様の結果で上記変種に置き代わる。 例９５ １×１０^-8のＫｉ値を有するインヒビターを、例４７による液体クリーニング 組成物に用いる。組成物の特徴付けでは、その組成物が１月後に８５％以上のプ ロテアーゼ活性を有することを示している。 標準量と温水を用いた標準洗濯機での使用に際して、変種ではなく野生型イン ヒビターを用いた点のみが異なる同様の組成物と比較し、それは改善された汚れ 除去性を示す。同様の結果は例２５‐６６による組成物でもみられる。 この出願で引用されたすべての参考文献は、参考のため本明細書に組み込まれ る。 本発明の具体的態様が記載されてきたが、本発明の様々な変更および修正が本 発明の精神および範囲から逸脱せずに行えることは当業者にとり明らかであろう 。本発明の範囲内に属するすべてのこのような修正を、添付された請求の範囲で は包含していると考えられる。 当業界で知られているように、ＤＮＡおよびアミノ酸配列決定法には時々誤り がある。そのため、寄託物質でコードされた配列も参考のため本明細書の開示に 含まれ、本発明の記載でみられる配列に誤りがあれば訂正される。当業者であれ ば、記載された開示から本発明者らの研究を再現しようとしたときに、ルーチン 技法を用いて配列決定エラーをみつけうることが、更に注記される。ＡＴＣＣＮ ｏ．６９９５５、６９９５６および６９９５７の寄託があったからといって、寄 託物質が本発明の実施にとり必須であることの承認としてみなされるわけではな い。

【手続補正書】 【提出日】１９９９年１２月２２日（１９９９．１２．２２） 【補正内容】 明細書第８１頁第１０〜１３行の「GAA・・・・・・・・・GTA 240」 を以下の通りに補正する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:465） (72)発明者 マイケル、ラスコウスキー、ジュニア アメリカ合衆国インディアナ州、ウェス ト、ラファイエット、パーデュー、ユニバ ーシティー、デパートメント、オブ、ケミ ストリー

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 野生型ペプチドプロテアーゼインヒビターアミノ酸配列と比較して修飾 されたアミノ酸配列を有している洗剤安定性ペプチドプロテアーゼインヒビター 変種であって、 修飾アミノ酸配列が安定化されたタンパク質プロテアーゼインヒビターを供す る、上記プロテアーゼインヒビター変種。 ２． ペプチドインヒビターがＳＳＩの変種である、請求項１に記載のプロテ アーゼインヒビター変種。 ３． 修飾アミノ酸配列が、組成物中でプロテアーゼを阻害して、クリーニン グ中に遊離プロテアーゼを供するために適したＫｉを有するペプチドプロテアー ゼインヒビターを供給する、請求項１または２に記載のプロテアーゼインヒビタ ー変種。 ４． 修飾アミノ酸配列が２以上の置換を有していて、インヒビターの共有結 合二量体化を行える、請求項１〜３のいずれか一項に記載のプロテアーゼインヒ ビター変種。 ５． 修飾が、組成物中でプロテアーゼを阻害して、クリーニング中に遊離プ ロテアーゼを供するために適した変種を供給する、請求項１〜４のいずれか一項 に記載のプロテアーゼインヒビター変種。 ６． 請求項１〜５のいずれか一項に記載のインヒビターを含んでなるクリー ニング組成物。 ７． プロテアーゼを更に含み、プロテアーゼ対インヒビター比率が約１：３ 〜約１：１である、請求項６に記載のクリーニング組成物。 ８． 請求項１〜５のいずれか一項に記載のプロテアーゼインヒビター変種を コードするＤＮＡ。 ９． 発現系が生存している、好ましくは細菌である、請求項８に記載のＤＮ Ａを含んでなる発現系。 １０． 請求項１〜５のいずれか一項に記載のインヒビターまたはそのインヒ ビターに対する抗体を含んでなる試験キット。